BR112021011026A2 - Método para transferir um processo de produção por lotes para um processo de produção contínua - Google Patents

Abstract

método para transferir um processo de produção por lotes para um processo de produção contínua. é aqui descrito um método para transferir o processo de produção em lote de um anticorpo monoclonal para um processo de produção contínua para o mesmo anticorpo monoclonal.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTO- DO PARA TRANSFERIR UM PROCESSO DE PRODUÇÃO POR LO- TES PARA UM PROCESSO DE PRODUÇÃO CONTÍNUA".

[0001] O processamento contínuo para a produção de proteínas terapêuticas ganha cada vez mais importância, e foram desenvolvidas as primeiras Soluções para a realização de Sistemas verdadeiramente contínuos, totalmente automatizados, baseados em equipamento des- cartável.

[0002] No entanto, até agora, os anticorpos à escala industrial são fabricados em processos descontínuos. Consequentemente, os proto- colos de produção e os detalhes regulamentares só existam para pro- cessos de produção por lotes.

[0003] Foi, portanto, um objetivo da presente invenção fornecer um método para uma transferência fiável e eficiente de um processo de produção por lotes de um determinado anticorpo monoclonal para um processo de produção contínua do mesmo anticorpo monoclonal.

[0004] A invenção alcança este objetivo através de um método de transferência de um processo de produção em lote de um anticorpo monoclonal para um processo de produção contínua do mesmo anti- corpo monoclonal que compreende as etapas a) fornecer um fluido sem partículas (fluxo de produto) a partir de uma mistura heterogênea de fluido de cultura celular conten- do o anticorpo monoclonal, sob a forma de um fluxo de produto, b) pelo menos uma cromatografia contínua da Proteína A, caracterizada em que o processamento asséptico é assegurado no modo contínuo através da sanitização da resina da Proteína A com uma substância cáustica, c) pelo menos uma cromatografia de troca aniônica (AEX) em modo de fluxo através de fluxo, caracterizada em que o fluxo do fluxo do produto no processo de produção por lote é de 1-20 volumes de membrana por minuto, e o fluxo do fluxo do produto no processo de produção contínua para o anticorpo monoclonal é de 0,1- 0,99 volu- mes de membrana por minuto OR, d) pelo menos uma cromatografia de troca de ânions carac- terizada na medida em que o processo de produção em lote do anti- corpo monoclonal compreende um absorvedor de membrana para AEX, e que no processo de produção contínua para o mesmo anticor- po monoclonal o AEX é realizado de forma pulsátil.

[0005] Este método tem a vantagem de permitir uma transferência fiável e eficiente de um processo de produção em lote de um determi- nado anticorpo monoclonal para um processo contínuo de produção do mesmo anticorpo monoclional.

[0006] Surpreendentemente, verificou-se que todos os atributos de qualidade do produto testado e os atributos de desempenho do pro- cesso eram comparáveis entre processamento em lote e contínuo sem quaisquer outras alterações necessárias ao processo de produção.

[0007] O método descrito não se limita aos anticorpos monoclo- nais, mas também pode ser aplicado aos anticorpos em geral e, possi- velmente, a mais proteínas de interesse.

[0008] Tal como aqui utilizado, a expressão "pelo menos um" signi- fica um ou mais.

[0009] Também deve ser entendido que, como aqui utilizado os termos "o", "um", ou "uma", significam "pelo menos um," são entendi- dos como englobando o plural, bem como o singular, e não devem ser limitados a "apenas um", salvo indicação explícita em contrário.

[0010] Tal como aqui utilizado, o termo "proteína" é utilizado indis- tintamente com o termo "proteína de interesse", e refere-se a um poli- peptídeo de aminoácidos. O termo engloba proteínas que podem ser de comprimento total, do tipo selvagem, ou fragmentos das mesmas. À proteína pode ser humana, não humana, e um mimético artificial ou químico de um aminoácido natural correspondente, bem como de po- límeros de aminoácidos naturais e polímeros de aminoácidos não na- turais. O termo também engloba peptídeos, ou seja, polímeros de ami- noácidos de comprimento relativamente curto (por exemplo, menos de 50 aminoácidos). O polímero pode ser linear ou ramíificado, pode inclu- ir aminoácidos modificados, e pode ser interrompido por não aminoá- cidos. O termo também engloba um polímero de aminoácidos que foi modificado; por exemplo, por formação de ligação de dissulfureto, gli- cosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra mani- pulação, tal como conjugação com um componente de rotulagem, tais como, mas não limitados a, marcadores fluorescentes, partículas, bio- tina, contas, proteínas, etiquetas radioativas, etiquetas quimiolumines- centes, etiquetas bioluminescentes, e similares.

[0011] De preferência, a proteína é uma proteína terapêutica.

[0012] Tal como aqui utilizado, o termo "proteína terapêutica" refe- re-se a uma proteína que pode ser administrada a um organismo para obter uma resposta biológica ou médica de um tecido, um órgão ou um sistema do referido organismo.

[0013] Ainda mais de preferência, a proteína é um anticorpo.

[0014] O termo "anticorpo" aqui utilizado refere-se a uma molécula de ligação, tal como uma imunoglobulina ou porção imunologicamente ativa de uma imunoglobulina, ou seja, uma molécula que contém um sítio de ligação de antigênios.

[0015] A proteína é, de preferência, um anticorpo monoclional.

[0016] Como aqui utilizado, o termo "anticorpo monoclonal" refere- se a moléculas de anticorpos com uma única composição molecular, obtidas a partir de uma população de anticorpos essencialmente idên- ticos. Este anticorpo monoclonal mostra uma única especificidade de ligação e afinidade para um epítopo específico.

[0017] Tal como aqui utilizado, o termo "anticorpo-fármaco-

conjugado (ADC)" refere-se a um complexo que compreende pelo me- nos um anticorpo, pelo menos um fármaco e pelo menos um "ligador" que liga o anticorpo ao fármaco.

[0018] Tal como aqui utilizado, o termo "fragmento de anticorpo de ligação ao antigênio" ou "fragmento de ligação ao antigênio" refere-se a um fragmento de um anticorpo/imunoglobulina (por exemplo, os do- mínios variáveis de um IgG) que ainda compreendem os domínios de ligação ao antigênio do anticorpo/imunoglobulina. O "domínio de liga- ção de antigênios" de um anticorpo compreende tipicamente uma ou mais regiões hipervariáveis de um anticorpo.

[0019] Os termos "substância biologicamente ativa", "substância ativa", "agente ativo", "fármaco", ou "terapêutico", tal como aqui utiliza- dos, referem-se a qualquer átomo e/ou molécula, complexo molecular ou substância administrada a um organismo para fins diagnósticos ou terapêuticos, incluindo o tratamento de uma doença ou infecção, ima- giologia médica, monitorização, contraceptivos, cosméticos, nutracêu- ticos, farmacêuticos e profiláticos.

[0020] O termo "fármaco" inclui qualquer átomo e/ou molécula, complexo molecular ou substância que seja quimicamente modificado e/ou operativamente ligado a uma estrutura biológica ou biocompatí- vel. O termo "pró-fármaco" refere-se a um fármaco, precursor de fár- maco ou fármaco modificado que não está totalmente ativo ou dispo- nível até ser convertido in vivo para a sua forma terapêutica ativa ou disponível.

[0021] O termo "toxofore" como aqui utilizado refere-se a um grupo químico que produz um efeito tóxico quando administrado a uma célu- la.

[0022] Por outras palavras, a substância ativa pode, por exemplo, ser um átomo tal como um agente radioativo - por exemplo, um isóto- po de tório - ou um agente antimitótico.

[0023] Desse modo, um técnico no assunto reconhece imediata- mente que os métodos e dispositivos aqui descritos para um conjuga- do anticorpo-droga também são aplicáveis ao conjugado de tório visa- do (TTC).

[0024] Tal como aqui utilizado, o termo "fármaco de molécula pe- quena" refere-se a um composto de baixo peso molecular (<900 dal- tons) que pode ajudar a regular um processo biológico.

[0025] Como aqui utilizado, o termo "ácido nucleico" refere-se a desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e seus polímeros, quer na forma de fio simples quer na forma de fio duplo. A menos que especifi- camente limitado, os termos abrangem ácidos nucleicos contendo aná- logos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação seme- lhantes às do ácido nucleico de referência, e são metabolizados de uma forma semelhante aos nucleotídeos naturais. Salvo indicação em contrário, uma determinada sequência de ácido nucleico também en- globa implicitamente variantes modificadas de forma conservadora (por exemplo, substituições de códon degenerado) e sequências com- plementares, bem como a sequência explicitamente indicada.

[0026] Como aqui utilizado o termo "fluido sem partículas" refere- se a um fluxo de produto, ou seja, um fluido sem células de uma mistu- ra de fluido de cultura celular heterogênea que contém o anticorpo monoclonal de interesse, e do qual foram removidas partículas com mais de 0,2 pm. Em uma concretização preferida, essa remoção de partículas é conseguida através de uma filtração em profundidade em combinação com uma filtração de 0,2 pm. Alternativamente, ou além disso, outros métodos de clarificação normalmente utilizados, tais co- mo centrifugação, filtração, ATF, floculação, podem ser utilizados para remover as partículas.

[0027] Como aqui utilizado, o termo "lote" refere-se a uma técnica, ou seja, um modo, de fabricação de proteínas como os anticorpos mo-

noclonais, em que a proteína em questão é produzida fase por fase ao longo de uma série de operações unitárias. Todo o material a ser pro- cessado passa por uma dada operação unitária antes de qualquer um desses materiais ser processado na operação unitária subsequente.

[0028] Em alguns processos de produção por lotes, o produto de uma dada operação unitária, ou seja, um intermediário do processo de produção como um todo, é armazenado até que todo o material do lote tenha sido processado por essa operação unitária. Além disso, os in- termediários do processo também podem ser armazenados, por exemplo, firozen, após o material completo do lote em questão ter passado pela operação unitária até que a operação unitária subse- quente seja iniciada. O período de tempo até ao início da operação unitária subsequente não é sempre o mesmo.

[0029] Como aqui utilizado, o termo "contínuo" refere-se a um mé- todo para realizar pelo menos duas etapas de método e/ou operações unitárias em série em que o fluxo de fluido de saída (fluxo de fluido) de uma etapa a montante é transportado para uma etapa a jusante. À etapa a jusante começa a processar o fluxo de fluido antes da etapa a montante estar concluída. Consequentemente, o transporte ou transfe- rência contínua de um fluxo de fluido de uma unidade a montante para uma unidade a jusante significa que a unidade a jusante já está em funcionamento antes de o fluxo a montante ser encerrado, ou seja, que duas unidades ligadas em série processam simultaneamente o fluxo de fluido que as atravessa.

[0030] Tal como aqui utilizado, o termo "asséptico" é utilizado per- mutável com os termos "micróbio-reduzido", "micróbio-reduzido" e "germe-reduzido", e significa uma contagem de patogênicos reduzida em comparação com um Estado não higienizado e, idealmente, fogo ou disparado a partir de patogênicos tais como microrganismos e ví- rus. Por outras palavras, asséptico refere-se a um estado de contagem patogênica reduzida, ou seja, uma contagem patogênica por área ou unidade de volume próxima de zero que é atingível através de um mé- todo adequado de redução de germes, em que este método de redu- ção de germes pode ser selecionado de irradiação gama, irradiação beta, autoclavagem, tratamento com óxido de etileno (ETO), tratamen- to com ozônio, tratamento "Steam-lIn-Place" (SIP) e/ou tratamento com agente de sanitização como 1 M NaOH.

[0031] Como aqui utilizado, o termo "fluxo de fluido" ou "fluxo de fluido" refere-se a um fluxo de líquido e/ou gás, que pode conter espé- cies dissolvidas ou parcialmente dissolvidas como o anticorpo mono- clonal de interesse ou os seus precipitados, sais, açúcares e compo- nentes celulares e/ou sais, floculações, precipitações e/ou cristais.

[0032] Tal como aqui utilizado, o termo "fluxo de produto" é utiliza- do alternadamente com o termo "fluxo de produto", e refere-se a um fluido sem células de uma mistura de fluido de cultura celular hetero- gênea que contém o anticorpo monoclional de interesse. Por uma questão de clareza, o fluxo de produto é também um "fluxo de fluido" ou "fluxo de fluido" no sentido desta descrição.

[0033] Tal como aqui utilizado, o termo "cromatografia" refere-se à separação de uma mistura de dois ou mais analitos em componentes individuais com base na distribuição diferencial dos componentes entre uma fase estacionária e uma fase móvel. A fase estacionária pode ser uma resina e/ou um absorvedor de membrana.

[0034] Como aqui utilizado, o termo "fluxo através" refere-se a um modo de operação de uma unidade cromatográfica, em que muitas das impurezas ou se ligam especificamente ao meio de separação en- quanto o produto de interesse não o faz, permitindo assim a recupera- ção do produto desejado no "fluxo através", e/ou em que tanto o pro- duto de interesse como uma ou mais impurezas se ligam ao meio de separação. No segundo caso, as impurezas estão presentes em maior grau no meio de separação do que o produto de interesse e, portanto, à medida que o carregamento continua produto de interesse não liga- do pode ser recuperado no "fluxo através". Por outras palavras, o fluxo de fluido que sai da operação da unidade cromatográfica durante todo o tempo em que o produto é carregado na operação da unidade cro- matográfica constitui o fluxo do produto.

[0035] Como aqui utilizado, o termo "ligar e eluir" (ou bind-and- elute) refere-se a um modo de operação de uma unidade cromatográ- fica, em que o produto se liga diferentemente ao meio cromatográfico. Assim, uma cromatografia tipo ligar e eluir compreende pelo menos as etapas de carregamento, lavagem, eluição e regeneração de uma co- luna cromatográfica, em que o principal constituinte do fluxo de fluido que sai da coluna cromatográfica durante a eluição é o fluxo do produ- to.

[0036] Um tipo de cromatografia de ligação e eluição é a cromato- grafia de ligação e eluição contínua, onde uma operação unitária sub- sequente começa a processar o fluxo de produto antes da cromatogra- fia de ligação e eluição contínua ter terminado o processamento de todo o fluxo de produto, ou seja, duas unidades ligadas em série pro- cessam simultaneamente o fluxo de fluido que as atravessa.

[0037] Surpreendentemente, na cromatografia de troca de pelo menos um ânion (AEX), o menor fluxo do fluxo do produto no processo de produção contínua de um anticorpo monoclonal resulta em menos formação de precipitados e mais esgotamento da proteína da célula hospedeira (HCP).

[0038] Sem querer ser limitado pela teoria, a minimização da for- mação de precipitados e o aumento da depleção de HCP pode resultar de tempos de contato mais longos do fluxo do produto com a cromato- grafia de troca de ânions no processo contínuo, em comparação com o processo descontínuo que, em que, por sua vez, leva a um tempo de precipitação mais longo e a uma maior superfície de precipitação.

[0039] Desse modo, um técnico no assunto também consideraria reduzir o fluxo do produto no processo de lote, a fim de minimizar a formação de precipitação e aumentar o esgotamento do HCP.

[0040] Como aqui utilizado, o termo densidade de carga refere-se à massa de proteína de interesse que é carregada em um determinado dispositivo, por exemplo, em uma coluna cromatográfica, num absor- vedor de membrana ou em um filtro.

[0041] Em uma concretização do método aqui descrito, pelo me- nos uma cromatografia de troca de ânions (AEX) está em modo de flu- xo e caracteriza-se pelo fato de o fluxo do fluxo do produto no proces- so de produção por lotes ser de 1-20 volumes de membrana por minu- to, de preferência, 8-18 volumes de membrana por minuto, de prefe- rência, 14-16 volumes de membrana por minuto, e o fluxo do fluxo do produto no processo de produção contínua do anticorpo monoclonal é de 0,1 - 2,0 volumes de membrana por minuto, de preferência, 0,1- 0,99 volumes de membrana por minuto, de preferência, 0,3 - 0,6 volu- mes de membrana por minuto. Por razões de clareza, a combinação de 14-16 volumes de membrana por minuto no processo de produção em lote e 0,3-0,6 volumes de membrana por minuto no processo de produção contínua é aqui explicitamente revelada.

[0042] Em uma concretização do método aqui descrito, a cromato- grafia de troca de pelo menos um ânion é caracterizada na medida em que se o processo de produção por lote de um anticorpo monoclional compreender um absorvedor de membrana para AEX do que no pro- cesso de produção contínua do mesmo anticorpo monoclonal, o AEX é realizado de forma pulsátil.

[0043] Em uma concretização do método aqui descrito, a troca de ânions é realizada empregando um número de absorvedores de mem- brana paralelos. Em uma concretização alternativa, o fluxo do produto passa a etapa de troca aniônica utilizando uma forma pulsátil.

[0044] Como aqui utilizado, o termo "forma pulsátil" é utilizado al- ternadamente com o termo "forma escalonada" e refere-se a um modo de processamento em que o fluxo de produto do processo de produ- ção contínua é recolhido antes de entrar em uma determinada opera- ção unitária, a fim de permitir uma maior velocidade de fluxo de uma determinada porção do fluxo de produto assim que o fluxo de produto for recolhido em quantidade suficiente. Por outras palavras, uma dada quantidade do fluxo de produto é recolhida e quando a quantidade predeterminada é atingida, toda a parte do fluxo do processo que constitui essa quantidade entra de uma vez na operação unitária sub- sequente, permitindo assim velocidades de fluxo mais elevadas na re- ferida operação unitária subsequente.

[0045] O uso de uma forma pulsátil para a troca de ânions tem a vantagem de que o filtro de membrana já validado do processo de lote correspondente pode ser utilizado.

[0046] Alternativamente, a fim de manter uma velocidade de fluxo constante no processo de produção contínua, podem ser utilizados vários absorvedores de membrana de troca de ânions menores, que são utilizados em paralelo, os quais teriam de ser regenerados durante o processo de produção contínua. No entanto, a combinação acima descrita de adsorvente de membrana utilizado para o processo de produção descontínua com a velocidade de fluxo temporariamente mais elevada na forma pulsátil, como já foi referido, tem a vantagem de que os absorvedores de membrana já validados, por exemplo, em termos de segurança viral para o processo descontínuo, podem ser utilizados.

[0047] Em uma concretização do método aqui descrito, pelo me- nos uma filtração, desde que seja efetuada um filtrado durante o pro- cesso de produção.

[0048] Em uma concretização posterior, a cromatografia da proteí- na A - através do objetivo de uma taxa de carga constante - atinge uma taxa de produção, que é constante dentro de um intervalo de +/- 50 % em um determinado tempo, por exemplo, um tempo de ciclo, ou um tempo de processo completo, como 36 h, etc. Por outras palavras, a taxa média de produção é de +/- 50 %, por exemplo, em um tempo de ciclo, ou em um período de tempo definido, como uma hora ou um tempo de processo completo, etc.

[0049] Conforme aqui utilizado, a "taxa de produção" refere-se à massa média de proteínas de interesse, ou seja, o anticorpo monoclo- nal, presente no fluxo do produto em um determinado período de tem- po, ou seja, grama de proteína por hora, ou grama de proteína por tempo de ciclo, etc. Também a taxa de carregamento é a massa de proteína de interesse, ou seja, o anticorpo monoclonal, presente no fluxo do produto em uma determinada quantidade de tempo, ou seja, grama de proteína por hora, ou grama de proteína por tempo de ciclo, etc.

[0050] Esta concretização tem a vantagem de a concentração da proteína de interesse, ou seja, o anticorpo monoclonal, no fluxo do produto deixando a cromatografia contínua da Proteína A e, assim, o fluxo do produto de todas as operações unitárias subsequentes é, em média, constante dentro de um determinado tempo.

[0051] Em um exemplo 2000 é utilizada 1 colheita sem células de um biorreator contendo o anticorpo monoclonal de interesse, e a con- centração do anticorpo monoclional de interesse no fluxo de produto deixando a cromatografia contínua de Proteína A é de 42 g/h. Um téc- nico no assunto está ciente de que a concentração por tempo de uma dada proteína de interesse, ou seja, o anticorpo monoclonal, depende da referida proteína de interesse, ou seja, o anticorpo monoclional, en- tre outras, as suas características de estabilidade. Assim, em outro exemplo 120 1 colheita sem células de um biorreator contendo a prote- ína de interesse, isto é, o anticorpo monoclional, é utilizada, e a taxa de produção da proteína de interesse isto é, o anticorpo monoclonal, no fluxo do produto que deixa a proteína A contínua é de 9,2 g/h.

[0052] Em uma concretização do método aqui descrito, a substân- cia cáustica utilizada na proteína contínua A cromatografia é escolhida do grupo constituído por 0,01-1,0 M NaOH, 0,01-1 M KOH, 0,5-1M NaCl, 0,1-1,0 M Na2SO,, 2-6 M cloridrato de guanidina, 2-8 M ureia, 10-50% isopropanol, 10-50% etanol, 0,1-5% álcool benzílico e ácido peracético, ou combinações destes.

[0053] O uso da substância cáustica tem a vantagem de garantir a pureza de rendimento igualmente bem como a irradiação gama de 25 kGy em combinação com sanitização cíclica com 0,1M NaOH.

[0054] Em outras concretizações do método aqui descrito, a cro- matografia de pelo menos uma proteína A contínua é ainda caracteri- zada pelo fato de o fluxo em modo contínuo ser 0-8, de preferência, 0,2 - 3,8 vezes menor do que em modo descontínuo, e/ou em que os ciclos por coluna em modo contínuo é 10-20 vezes maior do que em modo descontínuo.

[0055] Uma forma de determinar o fluxo da proteína A cromatogra- fia é dividir o fluxo volumétrico pela seção transversal da coluna cro- matográfica, ou seja, a unidade do fluxo é m/s ou cm/h. Para uma pes- soa qualificada, é claro que o tempo de contato de uma cromatografia pode ser derivado de um dado fluxo e de uma dada altura de coluna.

[0056] Em outras concretizações do método aqui descrito, a cro- matografia da proteína A é monitorizada no início da cromatografia contínua da proteína A, no meio da cromatografia contínua da proteína A e no fim da cromatografia contínua da proteína A através de amos- tragem integral, a fim de determinar se o fluxo de produto que passa a cromatografia da proteína A em um determinado momento deve ser mantido ou descartado.

[0057] Tal como aqui utilizado, o termo "amostragem integral" refe- re-se a uma recolha de amostras contínua durante um período de tempo pré-determinado, ou seja, uma duração de tempo.

[0058] Em algumas concretizações, a recolha de amostras inte- grais é realizada fornecendo um Recipiente com uma solução neutrali- zante na qual a amostra integral é amostrada. Isto tem a vantagem de as características da amostra serem mantidas até a análise ser reali- zada, embora a recolha de amostras possa demorar algum tempo.

[0059] Além disso ou alternativamente, em algumas concretiza- ções, a amostra integral é arrefecida e/ou congelada de modo a man- ter as suas características até que a análise seja realizada.

[0060] Em uma outra concretização adicional ou alternativa, a re- colha de amostras integrais é realizada juntamente com a têmpera em linha, em que simultaneamente com a amostra é adicionado um agen- te estabilizador e/ou neutralizante ao Recipiente de amostras.

[0061] Em uma concretização preferencial da amostragem integral, a amostragem integral é realizada no início da cromatografia contínua da proteína A, no meio da cromatografia contínua da proteína A, e no fim da cromatografia contínua da proteína A.

[0062] Por exemplo, durante o arranque, foi realizada uma amos- tragem integral para um ciclo da cromatografia de proteínas. Em um outro exemplo, foi colhida uma amostra integral durante o tempo em que um volume específico pré-determinado, tal como volumes de 2-2,5 colunas, foi eluído de uma coluna em uma etapa de cromatografia de ligação e eluição.

[0063] Em uma outra concretização preferida, a recolha de amos- tras para a amostragem integral da proteína A contínua é efetuada após a parte do fluxo de produto a ser amostrada ter passado a cro- matografia da proteína A, por exemplo, imediatamente antes do fluxo de produto entrar na operação de unidade subsequente e a amostra recolhida ser imediatamente neutralizada.

[0064] Esta concretização tem a vantagem de a amostra represen- tar o fluxo de produto. Em um exemplo, a amostra é neutralizada utili- zando tampão citrato.

[0065] Ao contrário de uma amostra integral, uma amostra de agarrar, é uma amostra imediata também aqui denominada amostra momentânea.

[0066] Em uma outra concretização preferida do método aqui des- crito, o método compreende pelo menos uma etapa de cromatografia de troca catiônica (CEX) em modo de lote paralelo, em que o número de colunas cromatográficas utilizadas na etapa CEX para realizar o modo de lote paralelo é escolhido de modo a que o tempo necessário para regeneração e eluição de um dado número de colunas seja me- nor do que o tempo de carga de uma dada coluna, assegurando assim que pelo menos uma coluna possa ser sempre utilizada para carrega- mento e, assim, alcançar um fluxo de produto de carregamento contí- nuo.

[0067] O uso do modo de lote paralelo tem a vantagem de as con- dições do processo de lote poderem ser diretamente aplicadas ao pro- cesso contínuo.

[0068] No contexto de um lote paralelo de cromatografia, refere-se a um dispositivo de cromatografia multicoluna que permite uma carga contínua sem sobrecarregar colunas individuais. A fim de permitir que o fluxo do produto entre continuamente no referido dispositivo, o dis- positivo de cromatografia em lote paralelo multicolunas tem um núme- ro mínimo de colunas, permitindo uma carga contínua sem sobrecar- regar as colunas.

[0069] Assim, são necessárias mais colunas para processar a mesma quantidade de anticorpo monoclonal de interesse no modo de lote paralelo do que no modo de lote. Além disso, também são neces- sárias mais colunas no modo de lote paralelo do que quando se utiliza uma cromatografia contínua como um BioSMB, uma vez que no modo de lote paralelo não ocorre sobrecarga da coluna.

[0070] Em uma concretização preferida, o número de colunas cro- matográficas utilizadas na etapa CEX para realizar o modo de lote pa- ralelo está assim na faixa de 2-8, de preferência, 4.

[0071] Em uma outra concretização preferida, as dimensões da cromatografia CEX são escolhidas de modo a que o fluxo do fluxo do produto do processo contínuo esteja dentro de uma faixa de 50% - 200% do fluxo do produto do processo descontínuo.

[0072] Esta ligação das condições de processo do processo contí- nuo às condições de processo do processo de lote permite utilizar os regimes de otimização do processo desenvolvidos para um determina- do processo de lote para a produção de um anticorpo monoclonal es- pecífico de interesse também para o processo contínuo para a produ- ção do mesmo anticorpo monoclonal específico de interesse.

[0073] Em uma concretização do método aqui descrito, a cromato- grafia de pelo menos uma proteína A contínua é ainda caracterizada na medida em que não é efetuado um pico de corte durante a eluição. Em uma concretização alternativa, o corte dos picos é realizado em cromatografia contínua da Proteína A.

[0074] Em uma adicional concretização do método aqui descrito, as condições de pico de corte desenvolvidas para a etapa CEX em modo descontínuo são também aplicadas no modo contínuo.

[0075] Como aqui utilizado, o termo "pico de corte" ou "condições de pico de corte" refere-se a um método em que apenas uma determi- nada fração do eluído é capturada e o resto é descartado. Através da eliminação de frações do eluído que contenham menos produto ou produto de qualidade potencialmente inferior - como as primeiras e úl-

timas frações do eluído - a qualidade global do produto é melhorada. A fim de determinar quais as frações a descartar para monitorização, por exemplo, do eluído em um comprimento de onda em que a proteína de interesse absorve a luz que passa, por exemplo, 280 nm, podem ser utilizadas. Por exemplo, quando o pico dos sinais UV inicia a recolha dessa fração do fluxo do produto, pois esta fração do fluxo do produto contém a maior parte da proteína de interesse, e quando o pico termi- na a recolha da fração do fluxo do produto.

[0076] Desse modo, através da aplicação do critério do pico de corte do processo de lote ao processo de produção contínua da mes- ma proteína de interesse, é possível obter uma qualidade de proteína semelhante nos dois processos.

[0077] Em uma adicional concretização do método aqui descrito, o processamento asséptico da cromatografia de troca catiônica é asse- gurado no modo contínuo através da sanitização da resina CEX com uma substância cáustica. Em uma adicional concretização do método aqui descrito, o processo contínuo é realizado em um sistema fechado, utilizando equipamento descartável.

[0078] Como aqui utilizado, o termo "fechado" refere-se tanto a "funcionalmente fechado" como a "completamente fechado".

[0079] Como aqui utilizado, o termo "completamente fechado" sig- nifica que a instalação de produção é operada de modo a que o fluxo de fluido não seja exposto ao ambiente. Materiais, componentes, obje- tos, amortecedores e afins podem ser adicionados a partir do exterior, onde, no entanto, esta adição ocorre de tal forma que a exposição do fluxo de fluido ao ambiente é evitada.

[0080] O termo "funcionalmente fechado" refere-se a um processo que pode ser aberto mas é "tornado fechado" por uma limpeza, higie- nização e/ou esterilização apropriada ou consistente com os requisitos do processo, seja estéril, asséptico ou de baixa carga biológica. Estes sistemas devem permanecer fechados durante a produção dentro do sistema. As exceções incluem os recipientes de processo que podem ser CIP'd e SIP'd entre utilizações. Sistemas não estéreis como a cro- matografia ou alguns sistemas de filtração também podem ser fecha- dos em operações com baixa carga orgânica se forem tomadas medi- das apropriadas durante a instalação do sistema em particular.

[0081] Em um outro aspecto, o que aqui é descrito refere-se a um método de transferência de um processo de cromatografia em lote pa- ra uma proteína de interesse para um processo de cromatografia con- tínua para a mesma proteína de interesse, em que pelo menos uma cromatografia do tipo ligante e eluente contínua no processo contínuo é monitorizada utilizando a análise do fator de assimetria.

[0082] Em geral, o fator de assimetria (As) de uma coluna de cro- matografia é utilizado como parâmetro para a avaliação do estado de embalagem de uma coluna de cromatografia. Uma coluna bem emba- lada produz uma maior resolução e rendimento. Para o cálculo de "As", uma substância de avaliação é injetada em uma coluna de emba- lagem, e "As" é calculado a partir do cromatograma resultante. A de- tecção da substância de avaliação é possível utilizando um detector de absorção ultravioleta (UV), um detector de condutividade elétrica, um detector de índice de refração diferencial ou semelhante. O pico resul- tante é analisado e As calculado com a seguinte equação.

[0083] As = b/a Onde: a é a largura do pico (metade esquerda) a 10% da altura do pico, b é a largura do pico (metade direita) a 10% da altura do pico

[0084] Para além da determinação do fator de assimetria, a efici- ência da embalagem da coluna de cromatografia pode ser verificada calculando as Placas Teóricas Equivalentes de Altura (HETP).

[0085] Nos processos de cromatografia em lote, o fator de assime- tria é geralmente utilizado para decidir se uma dada coluna cumpre os requisitos estabelecidos para colunas cromatográficas utilizadas em um dado processo de produção.

[0086] Em um processo contínuo, as colunas cromatográficas de tipo bind-and-elute são frequentemente utilizadas durante muitos ci- clos. Exemplos para tal cenário são o uso de uma cromatografia conti- nua, por exemplo, um dispositivo BIoSMB, ou o conjunto de lotes para- lelos acima descrito. Assim, após o primeiro ciclo de carregamento, lavagem, lavagem e eluição de uma coluna cromatográfica em um processo contínuo, o fator de assimetria de uma dada coluna pode ter mudado.

[0087] A fim de poder contabilizar as alterações do fator de assi- metria durante a cromatografia contínua bind-and-elute, os inventores da invenção atual têm, pela primeira vez, monitorizado pelo menos uma cromatografia contínua do tipo bind-and-elute utilizando a análise do fator de assimetria.

[0088] Em uma concretização da análise do fator de assimetria uti- lizada para monitorizar pelo menos uma cromatografia contínua do tipo bind-and-elute, um detector mede um sinal UV, de preferência, a 280 nm ou 300 nm. O sinal é medido primeiro quando a coluna é submeti- da a um tampão com uma condutividade elevada e novamente quando depois a coluna é submetida a um tampão com baixa condutividade. Nesta concretização, estas duas aplicações dos respectivos amorte- cedores de condutividade alta e depois baixa são realizadas antes da eluição da coluna.

[0089] O fator de assimetria medido pode ser utilizado para relaci- onar qualquer descoberta de qualidade do produto com o estado de embalagem da coluna e/ou para decidir quando é necessário substituir uma dada coluna a fim de manter a qualidade do produto. Tipicamente é utilizado um fator de assimetria de cerca de 1,0.

[0090] Em uma concretização do método aqui descrito, foi surpre-

endentemente verificado que uma coluna de cromatografia bind-and- elute, de preferência, uma coluna de cromatografia bind-and-elute con- tínua com um fator de assimetria na faixa de 1,5-1,9, de preferência, de 1,7, não teve qualquer efeito adverso na qualidade do produto.

[0091] Um técnico no assunto sabe que os valores dos fatores de assimetria acima indicados podem diferir para cada tipo de cromato- grafia.

[0092] Em geral, tanto durante um lote e/ou um processo contínuo, o material inicial de colheita pode ser armazenado a 2-8ºC, e pode de- pois ser equilibrado à temperatura ambiente antes do processamento, ou pode ser processado diretamente, por exemplo, através de uma cromatografia de proteína A no material refrigerado. Além disso, é também possível equilibrar o material de colheita, ou seja, o fluxo do processo após a operação da unidade de proteína A.

[0093] Além disso, em uma variante especialmente do processo contínuo, é fornecido um módulo para adição de gás em linha, após um módulo de desembaciamento.

Breve descrição das Fiquras

[0094] A Figura 1 mostra a visão geral do processo para o DSP contínuo exemplar, incluindo pontos e técnicas de amostragem; e

[0095] As Figuras 2a e 2b mostram para um exemplo de processo que foi transferido do modo de lote para o modo contínuo as diferen- ças no DSP de lote e contínuo e possível impacto no rendimento, qua- lidade do produto e impurezas.

[0096] A Figura 3 descreve o cáculo do Fator de Assimetria (As) de uma coluna cromatográfica.

Exemplo

1. Geral

[0097] Em geral, após estabelecer o método de transferência do processo de produção por lote de um anticorpo monoclonal para um processo de produção contínua para o mesmo anticorpo monoclional, ambos os modos de processo, ou seja, lote e contínuo, foram compa- rados experimentalmente através da purificação da proteína de inte- resse, aqui um anticorpo monoclonal, a partir do mesmo material de colheita.

[0098] Para o processo contínuo foi assim utilizada uma combina- ção de um USP de lote alimentado - tal como empregado para o pro- cesso por lote - e um processo contínuo a jusante (DSP). Esta variante do modo de processo contínuo é conhecida como um chamado pro- cesso híbrido. Contudo, um método para uma transferência fiável e eficiente de um processo de produção descontínua de um determinado anticorpo monoclonal para um processo contínuo de produção descon- tínua para o anticorpo monoclonal não existia até à data.

[0099] As amostras foram retiradas em diferentes pontos de tempo e posições no processo para o modo de lote e contínuo. Foram deter- minados os atributos de qualidade do produto e os atributos de de- sempenho do processo. O material polido resultante foi transformado em substância fármaco e posteriormente avaliado relativamente à es- tabilidade de armazenamento e comportamento de degradação. Fo- ram esperadas pequenas diferenças entre amostras descontínuas e contínuas, uma vez que diferentes condições de processamento eram inevitáveis devido à diferente natureza do processamento descontínuo e contínuo. Todos os testes não revelaram diferenças significativas nos intermediários e na comparabilidade da substância fármaco entre as amostras de ambos os modos de processamento. O estudo de es- tabilidade do produto final também não mostrou diferenças no perfil de estabilidade durante o armazenamento e a degradação forçada.

[00100] Portanto, o trabalho aqui descrito não só fornece um méto- do para uma transferência fiável e eficiente de um processo de produ- ção em lote de um determinado anticorpo monoclonal para um proces-

so contínuo de produção do mesmo anticorpo monoclonal, mas tam- bém demonstrou que o modo de processo não influencia a qualidade do produto, o que é um pré-requisito essencial para a implementação bem sucedida da tecnologia em todas as fases do ciclo de vida do produto. Materiais

[00101] A colheita foi gerada em um reator de 200 L Sartorius fed- batch (Sartorius Stedim Biotech, Gôttingen, Alemanha) utilizando um ovário de hamster chinês (CHO) de cultura de células. O fermentador foi colhido utilizando um filtro de profundidade Pall Stax (Pall GmbH, Dreieich, Alemanha). O produto filtrado das 0,2 horas tinha um título IgG de 2,8 g/L.

[00102] GE MabSelect Sure foi utilizado como resina de captura de Proteína A (ProtA) (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, Reino Unido). A GE Capto SP impres foi utilizada no processo de cromato- grafia intermediária bind & elute (B/E). As cápsulas adsorventes de membrana Sartorius Sartobind Q foram instaladas como etapa final de polimento.

[00103] Foram utilizados tampões cítricos para todas as etapas de cromatografia. Em caso de processamento contínuo, os tampões fo- ram filtrados em sacos Flexboy de 200 L Sartorius. Os intermediários para processamento em lote foram filtrados às 0,2 horas utilizando fil- tros Sartorius Sartopore 2 antes de serem armazenados. Os filtros Sartorius Sartoguard NF foram utilizados como filtros intermediários em produção contínua para remover os precipitados.

[00104] Os sistemas PD Pall BioSMB (Pall Biotech, Dreieich, Ale- manha) foram utilizados para cromatografia contínua, enquanto que os sistemas de processamento Ákta (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, Reino Unido) foram utilizados para cromatografia em lote.

2.2. Analíticos

[00105] Atributos importantes do produto foram determinados off- line a partir de amostras retiradas em diferentes posições e pontos de tempo dentro do lote e do processo contínuo. A concentração do pro- duto foi determinada por cromatografia líquida de alta performance POROS-A (HPLC) ou, após a etapa de captura de ProtA, através da determinação da absorvância a 280 nm de comprimento de onda (A280). A concentração de monômero, isoformas de alto peso molecu- lar (HMW) e baixo peso molecular (LMW) foi determinada por croma- tografia de exclusão de tamanho (SEC) HPLC. Como a resolução para LMWSs não era suficiente com este método, apenas os resultados para concentração de monômero e HMWs foram ainda utilizados. A fim de avaliar o grau de fragmentação do produto em cadeias leves e pesa- das (LC e HC) durante o processo, foi realizada uma eletroforese capi- lar em gel em condições não redutoras (CGE-nr). Além disso, a CGE em condições de redução foi realizada para determinar o grau de fra- gmentação em detritos menores (CGE- r). A distribuição da variante de carga foi investigada pela focalização isoelétrica capilar (cIEF). O im- pacto do modo de processo na oxidação da proteína foi determinado por idES-HPLC. A atividade do mAb foi investigada através de um en- saio de imunoabsorção enzimática de ligação (ELISA). O perfil do n- glican foi investigado com a ajuda de HILIC uHPLC utilizando Glyko- prepO-plus Rapid N-Glycan preparação de amostras com o kit Instan- tAB (GPPNG-LB).

[00106] Além disso, foram determinadas impurezas relacionadas com o processo, tais como proteínas de células hospedeiras (HCP's), ácido desoxirribonucleico (ADN) e proteína A lixiviada. O ADN foi de- tectado pela reação em cadeia da polimerase (PCR), enquanto que os HCPs e os ProtA lixiviados foram investigados através de diferentes métodos ELISA.

[00107] Finalmente, foi determinada a carga biológica do processo em modo descontínuo e contínuo. Assim, foram medidas a contagem microbiana aeróbica total (TAMC) e a contagem total de levedu- ra/molde (TYMC). Adicionalmente, o nível de endotoxina foi identifica- do de acordo com o método de teste harmonizado de Ph.Eur., USP, JP e TGA. O kit de teste N588 Pyrogent-5000 de Lonza foi utilizado para quantificação.

2.3. Configuração das instalações

[00108] As etapas que foram transferidas de lote para contínuo fo- ram a captura (ProtA), inativação viral de baixo pH, cromatografia in- termediária por troca catiônica (CEX) e cromatografia de polimento por troca aniônica (AEX). A Figura 1 mostra a visão geral do processo pa- ra o DSP contínuo, incluindo pontos e técnicas de amostragem. Antes da primeira etapa de cromatografia, a colheita era pré-filtrada por um filtro de 0,2 pm. A cromatografia ProtA foi executada em modo B/E como no processo de lote, mas utilizando uma cromatografia BioSMB com 5 colunas é gerado um fluxo de alimentação contínua e um fluxo de eluído contínuo. Após a etapa de ProtA, o pH foi ajustado para a seguinte inativação viral de baixo pH (VI). A fim de gerar o tempo de espera necessário para a etapa, foi introduzido no sistema um inversor de fluxo enrolado (CFI). Posteriormente, o pH e a condutividade foram ajustados para o seguinte fluxo através de (FT) UO e CEX intermediá- rio. Outra etapa de filtração teve lugar antes da etapa de cromatografia intermediária. O CEX foi executado em modo de lote paralelo para permitir o pico de corte para obter a pureza do produto requerida nesta etapa. O CEX eluído foi novamente ajustado em relação ao pH e con- dutividade, e 0,2 pm filtrado antes do AEX de polimento em modo FT. O material após o polimento por cromatografia AEX de ambos os mo- dos de processo foi processado posteriormente através de VF e ultra- filtração/diafiltração (UF/DF), tudo em modo de lote.

[00109] No DSP contínuo, o pH e a condutividade foram monitoriza- dos em linha e controlados por feedback, se necessário. Os UV só eram monitorizados em linha. Todos os módulos foram altamente au- tomatizados e sincronizados utilizando um sistema de controle distribu- ído PCS7. Existia uma ligação de fluidos em estado estável entre to- dos os módulos e todo o processo era um sistema fechado. A amos- tragem para amostras de biocarga e instantâneas era executada em modo manual ou automático; a amostragem para amostras integrais era obtida em modo automático. As amostras de colheita foram colhi- das em um tempo muito curto, e são apenas representativas do estado atual, enquanto que as amostras integrais foram colhidas durante um longo período de tempo, sendo assim representativas durante este tempo prolongado.

[00110] No DSP do lote, os ajustes de pH e condutividade foram efetuados manualmente. Não existia qualquer ligação fluida entre os diferentes UOs. As amostras foram retiradas manualmente do proces- so agrupado intermediário entre os diferentes UOs. Como o processo de purificação demorou vários dias, os intermediários de processo fo- ram armazenados a 2-8 ºC entre os UOs, ao passo que não existem tempos de retenção no processo contínuo.

[00111] No processo por lotes, todas as etapas cromatográficas fo- ram higienizadas com hidróxido de sódio. No processo contínuo, a maioria das peças foram irradiadas por radiação gama com pelo me- nos 25 kGy, incluindo as colunas de cromatografia. Quando não era aplicável a irradiação gama, as peças eram tratadas com óxido de eti- leno (EO) ou autoclavadas antes da sua introdução no sistema.

3. Procedimento experimental

[00112] A fim de evitar o impacto do armazenamento no material inicial, a colheita é armazenada durante 5 dias a 2-8ºC, foi dividida em duas partes para os dois modos de processo imediatamente antes do processamento. A parte de colheita para a purificação do lote foi equi- librada à temperatura ambiente e processada na coluna ProtA dentro de aproximadamente 2 h. A produção do lote até à etapa AEX foi reali- zada em 7 dias, compreendendo armazenamento intermediário a 2- 8ºC. Os processos de cromatografia por lotes seguiram os procedi- mentos padrão para a instalação e processamento. Isto incluiu a sani- tização antes de cada etapa com hidróxido de sódio.

[00113] Durante a DSP contínua, a primeira etapa foi a calibração e ajuste em linha dos sensores de pH e condutividade em linha nos mó- dulos de acondicionamento utilizando tampões de citrato no ponto de operação. Todo o DSP foi então preparado com amortecedores de processo e controlado no que diz respeito ao fluxo, pH e condutivida- de. Uma vez atingidas as condições de estado estável, a colheita foi ligada ao primeiro módulo de filtração do DSP. Durante todo o tempo de produção contínua (40 h), a colheita foi fornecida a partir de um re- cipiente refrigerado. O material de alimentação foi equilibrado à tempe- ratura ambiente durante a filtração inicial das 0,2 h, antes de entrar no ProtA UO.

[00114] A fase de paragem foi iniciada com a substituição do saco de colheita por um tampão de equilíbrio de ProtA. A operação de cro- matografia de ProtA continuou até todas as 5 colunas terem sido eluí- das. Após a paragem do módulo ProtA, uma descarga de tampão de pH baixo na entrada do módulo VI continuou a perseguir o produto. À cromatografia CEX e AEX continuou até as concentrações de proteí- nas na entrada serem inferiores a 0,1 g/L. O processo foi totalmente automatizado, incluindo o arranque, o encerramento e a manipulação dos eventos. A estratégia de controle de parâmetros estabelecida as- segurou que apenas o produto dentro das faixas normais de funcio- namento (NORs) fosse processado posteriormente.

[00115] Os parâmetros do processo foram mantidos idênticos entre a produção por lotes e a produção contínua sempre que possível. Isto inclui tampões cromatográficos, resinas e tipos de membranas. Além disso, as condições de carga da coluna em relação à condutividade e pH eram as mesmas.

4. Controle do processo

[00116] Como foram utilizados sensores semelhantes para proces- samento em lote e contínuo, a precisão de medição em ambos os mo- dos de processo era comparável. Para os sensores de condutividade, foi assumida uma precisão de + 5%, enquanto a precisão para os me- didores de pH em geral é de + 0,1 unidades de pH. Durante o proces- so contínuo, os sensores eram ajustados a cada 72 h antes e depois do processamento, permitindo a identificação do desvio do sensor. Pa- ra os sensores de pH, o desvio máximo foi de 0,076. Os sensores de condutividade derivaram por 0,02 mS/cm no máximo.

[00117] Consequentemente, a precisão do controle do processo mostrada neste estudo garante as mesmas condições de processo para todo o material do DSP com base nos dados de medição recolhi- dos.

5. Atributos de qualidade

[00118] Afim de assegurar a comparabilidade lado a lado entre o processamento por lote e o processamento contínuo a jusante, os atri- butos de qualidade do produto devem ser semelhantes em todas as fases do processo e durante todo o tempo de produção, tendo em con- ta as diferenças esperadas. Por conseguinte, vários parâmetros tais como a concentração do produto, impurezas relacionadas com o pro- duto e impurezas relacionadas com o processo foram analisados para as amostras retiradas do lote e do processo contínuo.

[00119] Afim de avaliar a comparabilidade entre ambos os modos de processo, os produtos finais do fármaco foram extensivamente tes- tados e comparados entre si. Além disso, foi realizado um estudo de estabilidade com o fármaco final para avaliar a comparabilidade do comportamento de armazenamento e degradação. Finalmente, foi tes- tada a carga microbiana de ambos os modos de processo.

[00120] Adicionalmente, foi testada a carga microbiana de ambos os modos de processo. Finalmente, foi realizado um estudo de estabilida- de com o produto final para avaliar a comparabilidade do armazena- mento e comportamento de degradação.

6. Intermediários de processo

[00121] A amostragem teve lugar antes e depois de cada etapa cromatográfica em lote, bem como em modo contínuo.

[00122] "Comparando os resultados em modo descontínuo e contí- nuo, as diferenças na concentração de mAb eram aparentes. As maio- res diferenças foram observadas nas amostras AEX FT. Este compor- tamento do processo era esperado e a explicação reside na combina- ção de atributos CEX e AEX. As concentrações mais baixas de proteí- nas no eluído CEX são observadas devido a um maior volume de elui- ção da coluna nº 1. A menor concentração na piscina AEX foi atribuída a uma perseguição mais longa no final de um ciclo AEX, enquanto que em lote a perseguição foi fracionada de acordo com um sinal em linha A2Z8O.

[00123] Relativamente à relação monômero, foram observadas pe- quenas diferenças entre as diferentes etapas do processo. Isto pode ser explicado pela baixa resolução deste método para monômeros e LMWs. Em relação aos HMW, não existem diferenças significativas entre o lote e os processos contínuos dentro da variabilidade do en- saio.

[00124] Os resultados do CGE em condições de redução e não re- dução mostraram que a pureza IgG permanece constante durante todo o processo de purificação, e é comparável com os dados do lote. As diferenças estão dentro do desvio do ensaio.

[00125] Para além dos resultados relativos às impurezas relaciona- das com os produtos, a heterogeneidade da carga foi avaliada com a ajuda do cIEF. Não puderam ser observadas diferenças entre as dife- rentes amostras ao longo de todo o processo dos dois modos de pro- cesso. A distribuição da variante de carga foi estável.

[00126] Concentrando as impurezas relacionadas com o processo, verificou-se que a concentração inicial de ProtA era mais elevada para o processo contínuo do que para o processo por lotes. Isto podia ser causado pelos diferentes métodos de sanitização utilizados. A coluna de lote foi higienizada uma vez com 0,1 M NaOH. As colunas utiliza- das para o processo contínuo foram irradiadas uma vez e higienizadas com 0,1 M de NaOH em cada ciclo. Além disso, foram utilizados mais ciclos na DSP contínua e o volume de eluição recolhido foi superior ao da DSP descontínua. Em ambos os modos de processo, a concentra- ção de ProtA lixiviado diminuiu rapidamente devido ao FT UO antes do CEX. Posteriormente, a concentração de ProtA era estável próximo do limite de quantificação para o ensaio utilizado.

[00127] Também foi medida a concentração de DNA da célula hos- pedeira ao longo do processo (dados não mostrados). Comparando as quatro amostras contínuas e as amostras de lote entre si, as curvas eram quase idênticas. O maior esgotamento de ADN ocorreu durante a etapa de cromatografia de ProtA. O ADN restante foi depois removi- do pelo FT UO. Consequentemente, não foi detectado ADN nas amos- tras de Carga CEX e mais além.

[00128] A medição da concentração de HCP ao longo do processo mostrou que a principal redução de HCP teve lugar durante a croma- tografia de ProtA, seguida da FT UO e CEX. Os resultados da análise de ProtA Load e Eluate foram quase idênticos. A partir das amostras de Carga CEX, os resultados das quatro amostras contínuas e da amostra de lote foram diferentes. Como a carga específica de mAb e a taxa de fluxo no FT UO era mais elevada em modo descontínuo do que em modo contínuo, o avanço do HCP era também mais elevado. No entanto, as medições finais resultantes das amostras AEX FT mos- traram concentrações baixas de HCP semelhantes.

[00129] Para concluir, todos os parâmetros de produto testados e impurezas relacionadas com o processo mostraram apenas pequenas diferenças entre processamento em lote e contínuo e entre processa- mento contínuo em diferentes pontos de tempo. As alterações ocorri- das foram explicáveis por diferenças nos métodos de sanitização ou parâmetros de processo. Isto provou que o processamento em lote e contínuo a jusante do mAb resulta em um produto comparável ao lon- go de todo o curso do processo.

7. Substância final da droga

[00130] Afim de avaliar a comparabilidade da substância farmacêu- tica final, o produto final foi extensivamente testado.

[00131] Os intermediários do processo pós-AEX de ambos os mo- dos de processo foram posteriormente processados para substância farmacêutica a granel através de filtração viral, ultrafiltração e diafiltra- ção. O material resultante foi ainda analisado para atributos de quali- dade do produto, tais como variantes de carga, gama pi, perfil n- Glycan, atividade, peso molecular, idES-HPLC e pureza IgG. Além disso, as impurezas relacionadas com o produto também foram anali- sadas. Foi claramente demonstrado que a maioria dos resultados são idênticos ou apresentam apenas pequenas diferenças. A mesma qua- lidade de resultados foi alcançada também para todos os outros atribu- tos testados (dados não mostrados). Todas as amostras estavam den- tro das especificações dadas. Os testes para ADN de células hospe- deiras, endotoxinas e carga microbiana foram negativos.

[00132] Para concluir, os resultados da substância farmacêutica fi- nal para processamento descontínuo e contínuo mostram uma total comparabilidade entre ambos os modos de processamento. Conse- quentemente, a concepção e execução do estudo pode ser considera- da bem sucedida.

8. Estudos de estabilidade da substância final do fármaco

[00133] Foram realizados testes de estabilidade à temperatura am- biente (18-26 ºC) e 40 ºC durante 4 semanas cada. O produto final foi armazenado em sacos estéreis de polietileno de baixa densidade (LDPE) durante o estudo. Vários atributos de qualidade foram testados durante o estudo, incluindo concentração de proteínas (OD A2Z80), concentração de monômero e HMW via SEC-HPLC, %intact IgG atra- vés de CGE-nr, distribuição de variantes de carga (% de pico principal, % total de isoformas básicas e ácidas) com a ajuda de clEF, o impacto na oxidação de proteínas (idES-HPLC) e, finalmente, a atividade atra- vés de binding-ELISA. A título de exemplo, os resultados da distribui- ção das variantes de carga não demonstraram qualquer impacto signi- ficativo na heterogeneidade da carga. Além disso, não foi observada qualquer diferença entre a solução de mAb por lote e a de produção contínua. Também a temperaturas elevadas (40ºC), não foi observada qualquer diferença significativa entre amostras descontínuas e contí- nuas. Para concluir, o estudo de estabilidade mostrou que também o perfil de degradação do produto final era comparável entre mAb pro- duzido descontínuo e contínuo, considerando a heterogeneidade da carga.

[00134] Quanto aos outros atributos de qualidade testados, incluin- do concentração de proteínas, concentração de monômeros, HMWs, oxidação de proteínas e atividade, não foi observada qualquer diferen- ça significativa entre ambas as amostras à temperatura ambiente, bem como a 40ºC. Consequentemente, a comparabilidade do lote e da substância final do fármaco produzida continuamente foi também de- monstrada em um estudo de estabilidade, incluindo uma vasta faixa de atributos de qualidade relevantes.

9. Controle microbiano

[00135] Afim de avaliar a carga orgânica dos processos, o TAMC e o TYMC foram determinados a partir de certas amostras (ver Figura 1 para as posições de amostragem da carga orgânica). Além disso, o nível de endotoxinas foi medido. No processo contínuo, as amostras foram derivadas do lado retentado dos filtros das 0,2 pm, pois possí- veis contaminações microbianas concentrar-se-lam nestas posições. Para todas as amostras testadas, os resultados para TAMC, TYMC e endotoxina estavam abaixo dos limites de quantificação. Isto leva a valores <1 ufc/100 mF para TAMC e TYMC e <1,0 EE/mF para en- dotoxina. Consequentemente, os intermediários do lote, bem como todo o processo contínuo, podem ser considerados como isentos de biocarga durante as corridas atuais.

10. Conclusão

[00136] Em geral, os resultados acima referidos demonstram que o uso do método de transferência do processo de produção por lotes de um anticorpo monoclonal para um processo de produção contínua do mesmo anticorpo monoclonal aqui descrito conduz a resultados com- paráveis no que diz respeito aos atributos de qualidade do produto. Assim, o referido método representa uma etapa importante no proces- so de implementação rumo à produção contínua de mAbs, uma vez que os processos por lotes já existentes podem ser transferidos para o seu modo contínuo sem afetar a comparabilidade das características finais da substância do fármaco. Por conseguinte, a escolha do modo de processo individualmente e flexível independentemente do ciclo de vida do produto, desde o material dos ensaios clínicos até à produção em grande escala, deverá ser possível no futuro.

Claims (8)

REIVINDICAÇÕES

1.Método de transferência do processo de produção por lo- tes de um anticorpo monoclonal para um processo contínuo de produ- ção do mesmo anticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato de com- preender as etapas a) fornecer um fluido sem partículas (fluxo de produto) a partir de uma mistura heterogênea de fluido de cultura celular conten- do o anticorpo monoclonal, sob a forma de um fluxo de produto, b) pelo menos uma cromatografia contínua da Proteína A, caracterizada em que o processamento asséptico é assegurado no modo contínuo através da sanitização da resina da Proteína A com uma substância cáustica, c) pelo menos uma cromatografia de troca aniônica (AEX) em modo de fluxo através de fluxo, que se caracteriza pelo fluxo do fluxo do produto no processo de produção por lote é de 1-20 volumes de membrana por minuto, e o fluxo do fluxo do produto no processo de produção contínua do anticorpo monoclonal é de 0,1 - 0,99 volumes de membrana por minuto OR, d) pelo menos uma cromatografia de troca de ânions que se caracteriza na medida em que o processo de produção em lote do anticorpo monoclonal compreende um absorvedor de membrana para AEX, e que no processo de produção contínua do mesmo anticorpo monoclonal o AEX é realizado de forma pulsátil.

2.Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma filtração que fornece um filtrado é efetuada durante o processo de produção.

3.Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri- zado pelo fato de que pelo menos uma cromatografia contínua da Pro- teína A é ainda caracterizada por um fluxo em modo contínuo de 0-8, de preferência, 0,2 - 3,8 vezes menos do que em modo descontínuo,

e/ou em que os ciclos por coluna em modo contínuo é 10-20 vezes maior do que em modo descontínuo.

4 Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender, ainda, pelo menos uma etapa de cromato- grafia de troca catiônica (CEX) em modo de lote paralelo, em que o número de colunas cromatográficas utilizadas na etapa CEX para rea- lizar o modo de lote paralelo é escolhido de modo a que o tempo ne- cessário para regeneração e eluição de um dado número de colunas seja menor do que o tempo de carga de uma dada coluna, asseguran- do assim que pelo menos uma coluna possa ser sempre utilizada para carregamento e, assim, alcançar um fluxo de produto de carregamento contínuo.

B5.Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma cromatografia contínua de Proteína A se caracteriza ainda mais por não se efetuar cortes de pico durante a eluição.

6.Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as condições de pico de corte desenvolvidas para a etapa CEX em modo descontínuo são também aplicadas em modo contínuo.

7.Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o processo contínuo é realizado em um sistema fechado, utilizando equipamento descartável.

8. Método para transferir um processo de cromatografia em lote para uma proteína de interesse para um processo de cromatogra- fia contínua para a mesma proteína de interesse, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma cromatografia do tipo ligante e eluente contínua no processo contínuo é monitorizada utilizando a análise do fator de assimetria.