BR112021008953A2 - partículas de ácido nucleico-lipídio e de ácido-lipídio, composições, métodos para introduzir um ácido nucleico em uma célula, para distribuição in vivo de um ácido nucleico, para tratar uma doença ou um distúrbio e para preparar um composto, usos de uma partícula, compostos e nanopartícula de lipídio - Google Patents

partículas de ácido nucleico-lipídio e de ácido-lipídio, composições, métodos para introduzir um ácido nucleico em uma célula, para distribuição in vivo de um ácido nucleico, para tratar uma doença ou um distúrbio e para preparar um composto, usos de uma partícula, compostos e nanopartícula de lipídio Download PDF

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Abstract

PARTÍCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO E DE ÁCIDO-LIPÍDIO, COMPOSIÇÕES, MÉTODOS PARA INTRODUZIR UM ÁCIDO NUCLEICO EM UMA CÉLULA, PARA DISTRIBUIÇÃO IN VIVO DE UM ÁCIDO NUCLEICO, PARA TRATAR UMA DOENÇA OU UM DISTÚRBIO E PARA PREPARAR UM COMPOSTO, USOS DE UMA PARTÍCULA, COMPOSTOS E NANOPARTÍCULA DE LIPÍDIO. Certas modalidades da invenção fornecem um lipídio catiônico de fórmula (I): Em que R1, R2, R3 e R4 são definidos conforme descrito neste documento, bem como métodos de preparação desses lipídios. Certas modalidades da invenção também fornecem partículas de ácido nucleico-lipídio compreendendo um lipídio catiônico de fórmula (I), métodos para fazer as partículas de lipídios e métodos de distribuição e/ou administração das partículas de lipídio.

Description

“PARTÍCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO E DE ÁCIDO-LIPÍDIO, COMPOSIÇÕES, MÉTODOS PARA INTRODUZIR UM ÁCIDO NUCLEICO EM UMA CÉLULA, PARA DISTRIBUIÇÃO IN VIVO DE UM ÁCIDO NUCLEICO, PARA TRATAR UMA DOENÇA OU UM DISTÚRBIO E PARA PREPARAR UM COMPOSTO, USOS DE UMA PARTÍCULA, COMPOSTOS E NANOPARTÍCULA DE LIPÍDIO” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO(S) RELACIONADO(S)
[001] Este pedido de patente reivindica o benefício de prioridade do pedido de série U.S. 62/758.108, depositado em 09 de novembro de 2018, cujo pedido é aqui incorporado por referência.
FUNDAMENTOS
[002] Nanopartículas contendo lipídeos catiônicos têm sido utilizadas para a distribuição de uma variedade de agentes ativos e agentes terapêuticos. Atualmente, a dificuldade e o custo associado à preparação do componente lipídico catiônico dessas nanopartículas limitam sua atratividade para o desenvolvimento comercial como veículos de distribuição.
Consequentemente, há uma necessidade de lipídeos catiônicos adicionais que podem ser incorporados em nanopartículas de lipídeos. Em particular, há uma necessidade de lipídeos catiônicos que podem ser preparados usando processos mais baratos e mais eficientes. Há também uma necessidade de lipídeos catiônicos que são relativamente mais biodegradáveis, de modo que as nanopartículas de lipídeo relacionadas se degradem melhor após a administração de um agente ativo ou um agente terapêutico.
SUMÁRIO
[003] A invenção fornece lipídeos catiônicos que podem ser preparados usando processos mais baratos e mais eficientes. Além disso, os lipídeos catiônicos são eficazes para a distribuição de um agente ativo ou agente terapêutico, como um ácido nucleico, quando incorporados em nanopartículas de lipídeos. Os lipídeos catiônicos também são biodegradáveis, de modo que as nanopartículas de lipídeos associadas se degradam melhor após a administração de um agente ativo ou de um agente terapêutico.
[004] Em uma modalidade, a invenção fornece um lipídeo catiônico de fórmula (I): em que: R1 é um C2-C30 hidrocarbil; R2 é um C2-C30 hidrocarbil; R3 é um C2-C30 hidrocarbil; X é um C2-C8 alquil divalente; R4 é NRaRb; e cada Ra e Rb é independentemente selecionado do grupo que consiste em metil, etil, propil, ciclopropil e butil, cujo metil, etil, propil, ciclopropil e butil é opcionalmente substituído por hidróxi; ou Ra e Rb tomados com o nitrogênio ao qual eles estão fixados formam um anel de aziridina, azetidina, prolina, piperidina, piperazina ou morfolina, cujo anel é opcionalmente substituído por hidroxil ou com C1-C6 alquil que é opcionalmente substituído por hidróxi.
[005] A invenção também fornece uma composição que compreende 1) um composto de fórmula (I) e 2) um agente ativo ou um agente terapêutico.
[006] A invenção também fornece uma nanopartícula de lipídeo compreendendo um composto de fórmula (I).
[007] A invenção também fornece uma nanopartícula de lipídeo compreendendo: (a) um ou mais agentes ativos ou agentes terapêuticos; (b) um composto de fórmula (I); (c) um lipídeo não catiônico; e (d) um lipídeo conjugado.
Normalmente, um ou mais agentes são encapsulados dentro da nanopartícula de lipídeo.
[008] A invenção também fornece uma composição farmacêutica compreendendo, 1) um composto de fórmula (I), e 2) um ou mais agentes ativos ou agentes terapêuticos.
[009] A invenção também fornece uma composição farmacêutica compreendendo uma nanopartícula de lipídeo da invenção e um transportador farmaceuticamente aceitável.
[0010] A invenção também fornece um método para distribuir um agente ativo ou um agente terapêutico (por exemplo, um ácido nucleico) a um animal, compreendendo administrar uma nanopartícula da invenção ao animal.
[0011] A invenção também fornece um método para introduzir um ácido nucleico em uma célula, o método compreendendo contatar a célula in vivo, ex vivo ou in vitro com uma partícula de ácido nucleico-lipídeo aqui descrita.
[0012] A invenção também fornece um método para o tratamento de uma doença ou distúrbio em um animal, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma partícula de ácido nucleico-lipídeo aqui descrita ao animal.
[0013] A invenção também fornece processos e intermediários divulgados neste documento que são úteis para fazer os compostos, formulações ou nanopartículas da invenção. Por exemplo, em uma modalidade, a invenção fornece um método para a preparação de um composto de fórmula (I): ,
em que R4 é NRaRb conforme descrito neste documento, compreendendo a reação de um composto correspondente de fórmula (Ia): (Ia) em que R4a é bromo ou cloro, com uma amina de fórmula HNRaRb para fornecer o composto de fórmula (I).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições
[0014] Como utilizados neste documento, os termos a seguir têm os significados atribuídos a eles, a menos que especificado de outra forma.
[0015] O termo "RNA interferente" ou "RNAi" ou "sequência de RNA interferente" refere-se a RNA de fita simples (por exemplo, miRNA maduro) ou RNA de fita dupla (isto é, RNA duplex, como siRNA, aiRNA ou pré-miRNA) que é capaz de reduzir ou inibir a expressão de um gene ou sequência alvo (por exemplo, mediando a degradação ou inibindo a tradução de mRNAs que são complementares à sequência de RNA interferente) quando o RNA interferente está na mesma célula que o gene alvo ou sequência. O RNA interferente, portanto, refere-se ao RNA de fita simples que é complementar a uma sequência de mRNA alvo ou ao RNA de fita dupla formado por duas fitas complementares ou por uma fita única autocomplementar. O RNA interferente pode ter identidade substancial ou completa com o gene ou sequência alvo, ou pode compreender uma região de incompatibilidade (ou seja, um motivo de incompatibilidade). A sequência do RNA interferente pode corresponder ao gene alvo de comprimento total ou uma subsequência do mesmo.
[0016] O RNA interferente inclui "RNA interferente pequeno" ou "siRNA", por exemplo, RNA interferente de cerca de 15-60, 15-50 ou 15-40
(duplex) nucleotídeos de comprimento, mais tipicamente cerca de 15-30, 15-25, ou 19-25 (duplex) nucleotídeos de comprimento, e tem de preferência cerca de 20-24, 21-22 ou 21-23 (duplex) nucleotídeos de comprimento (por exemplo, cada sequência complementar do siRNA de fita dupla tem 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25 ou 19-25 nucleotídeos de comprimento, de preferência cerca de 20-24, 21-22 ou 21-23 nucleotídeos de comprimento, e o siRNA de fita dupla tem cerca de 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25 ou 19-25 pares de bases de comprimento, de preferência cerca de 18-22, 19-20 ou 19-21 pares de bases de comprimento).
Os duplexes de siRNA podem compreender saliências 3' de cerca de 1 a cerca de 4 nucleotídeos ou cerca de 2 a cerca de 3 nucleotídeos e 5' terminais de fosfato. Exemplos de siRNA incluem, sem limitação, uma molécula polinucleotídica de fita dupla montada a partir de duas moléculas de fita separadas, em que uma fita é a fita sentido e a outra é a fita antissentido complementar; uma molécula de polinucleotídeo de fita dupla montada a partir de uma molécula de fita simples, onde as regiões de sentido e antissentido são ligadas por um ligante baseado em ácido nucleico ou não baseado em ácido nucleico; uma molécula de polinucleotídeo de fita dupla com uma estrutura secundária em hairpin tendo regiões de sentido e antissentido autocomplementares; e uma molécula polinucleotídica circular de fita simples com duas ou mais estruturas de alça e uma haste com regiões de sentido e antissentido autocomplementares, onde o polinucleotídeo circular pode ser processado in vivo ou in vitro para gerar uma molécula de siRNA de fita dupla ativa.
[0017] De preferência, os siRNAs são sintetizados quimicamente.
O siRNA também pode ser gerado por clivagem de dsRNA mais longo (por exemplo, dsRNA maior que cerca de 25 nucleotídeos de comprimento) com a E.
coli RNase III ou Dicer. Essas enzimas processam o dsRNA em siRNA biologicamente ativo (ver, por exemplo, Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
99:9942-9947 (2002); Calegari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:14236 (2002); Byrom et al., Ambion TechNotes, 10(1):4-6 (2003); Kawasaki et al., Nucleic Acids Res., 31:981-987 (2003); Knight et al., Science, 293:2269-2271 (2001); e Robertson et al., J. Biol. Chem., 243:82 (1968)). De preferência, o dsRNA tem pelo menos 50 nucleotídeos a cerca de 100, 200, 300, 400 ou 500 nucleotídeos de comprimento. Um dsRNA pode ter até 1000, 1500, 2000, 5000 nucleotídeos de comprimento ou mais. O dsRNA pode codificar para um transcrito de gene inteiro ou um transcrito de gene parcial. Em certos casos, o siRNA pode ser codificado por um plasmídeo (por exemplo, transcrito como sequências que se dobram automaticamente em duplexes com alças em hairpin).
[0018] Conforme usado neste documento, o termo "motivo de incompatibilidade" ou "região de incompatibilidade" refere-se a uma porção de uma sequência de RNA interferente (por exemplo, siRNA, aiRNA, miRNA) que não tem 100% de complementaridade com sua sequência alvo. Um RNA interferente pode ter pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco, seis ou mais regiões de incompatibilidade As regiões de incompatibilidade podem ser contíguas ou podem ser separadas por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais nucleotídeos. Os motivos ou regiões de incompatibilidade podem compreender um único nucleotídeo ou podem compreender dois, três, quatro, cinco ou mais nucleotídeos.
[0019] Uma "quantidade eficaz" ou "quantidade terapeuticamente eficaz" de um agente ativo ou agente terapêutico, como um ácido nucleico (por exemplo, um RNA ou mRNA interferente) é uma quantidade suficiente para produzir o efeito desejado, por exemplo, uma inibição da expressão de um sequência alvo em comparação com o nível de expressão normal detectado na ausência de um RNA interferente; ou expressão dirigida por mRNA de uma quantidade de uma proteína que causa um efeito biológico desejável no organismo no qual a proteína é expressa. A inibição da expressão de um gene ou sequência alvo é alcançada quando o valor obtido com um RNA interferente em relação ao controle é de cerca de 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% ou 0%. Em outras modalidades, a proteína expressa é uma forma ativa de uma proteína que é normalmente expressa em um tipo de célula dentro do corpo, e a quantidade terapeuticamente eficaz do mRNA é uma quantidade que produz uma quantidade da proteína codificada que é pelo menos 50% (por exemplo, pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90%) da quantidade da proteína que é normalmente expressa no tipo de célula de um indivíduo saudável. Os ensaios adequados para medir a expressão de um gene ou sequência alvo incluem, por exemplo, o exame dos níveis de proteína ou RNA usando técnicas conhecidas pelos versados na técnica, tais como dot blots, Northern blots, hibridização in situ, ELISA, imunoprecipitação, função enzimática, bem como ensaios fenotípicos conhecidos pelos versados na técnica.
[0020] Por “diminuir”, “diminuição”, “reduzir” ou “redução” uma resposta imune por um RNA interferente pretende-se significar uma diminuição detectável de uma resposta imune a um dado RNA interferente (por exemplo, um RNA interferente modificado). A quantidade de diminuição de uma resposta imune por um RNA interferente modificado pode ser determinada em relação ao nível de uma resposta imune na presença de um RNA interferente não modificado. Uma diminuição detectável pode ser de cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ou mais abaixo da resposta imune detectada na presença do RNA interferente não modificado. Uma diminuição na resposta imune ao RNA interferente é tipicamente medida por uma diminuição na produção de citocinas (por exemplo, IFNγ, IFNα, TNFα, IL-6 ou IL-12) por uma célula respondedora in vitro ou uma diminuição na produção de citocinas no soros de um sujeito mamífero após administração do RNA interferente.
[0021] Por “diminuir”, “diminuição”, “reduzir” ou “redução” de uma resposta imune por um mRNA pretende-se significar uma diminuição detectável de uma resposta imune a um determinado mRNA (por exemplo, um mRNA modificado). A quantidade de diminuição de uma resposta imune por um mRNA modificado pode ser determinada em relação ao nível de uma resposta imune na presença de um mRNA não modificado. Uma diminuição detectável pode ser cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ou mais abaixo da resposta imune detectada na presença do mRNA não modificado. Uma diminuição na resposta imune ao mRNA é normalmente medida por uma diminuição na produção de citocinas (por exemplo, IFNγ, IFNα, TNFα, IL-6, or IL-12) por uma células respondedora in vitro ou uma diminuição na produção de citocinas no soro de um sujeito mamífero após a administração do mRNA.
[0022] Conforme usado neste documento, o termo "célula respondedora" refere-se a uma célula, de preferência uma célula de mamífero, que produz uma resposta imune detectável quando contatada com um RNA interferente imunoestimulatório, como um siRNA não modificado. Células respondedoras exemplificativas incluem, por exemplo, células dendríticas, macrófagos, células mononucleares de sangue periférico (PBMCs), esplenócitos e semelhantes. As respostas imunes detectáveis incluem, por exemplo, produção de citocinas ou fatores de crescimento, como TNF-α, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, TGF e combinações dos mesmos.
[0023] "Identidade substancial" refere-se a uma sequência que hibrida com uma sequência de referência sob condições rigorosas ou com uma sequência que tem uma identidade percentual especificada sobre uma região especificada de uma sequência de referência.
[0024] A frase "condições de hibridação rigorosas" refere-se a condições sob as quais um ácido nucleico irá hibridar com sua sequência alvo, normalmente em uma mistura complexa de ácidos nucleicos, mas nenhuma outra sequência. As condições rigorosas dependem da sequência e são diferentes em diferentes circunstâncias. As sequências mais longas se hibridizam especificamente em temperaturas mais elevadas. Um guia extenso para a hibridação de ácidos nucleicos encontra-se em Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Geralmente, condições restritivas são selecionadas para ser de cerca de 5-10°C menor que o ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência específica a um pH de resistência iônica definido. A Tm é a temperatura (sob resistência iônica, pH e concentração nucleica definidos) à qual 50% das sondas complementares ao alvo hibridizam com a sequência alvo em equilíbrio (como as sequências alvo estão presentes em excesso, a Tm, 50% das sondas estão ocupadas em equilíbrio). Também podem ser alcançadas condições rigorosas com a adição de agentes desestabilizantes, como a formamida. Para hibridação seletiva ou específica, um sinal positivo é pelo menos duas vezes o fundo, de preferência 10 vezes a hibridação de fundo.
[0025] As condições de hibridação rigorosas exemplificativas podem ser as seguintes: 50% formamida, 5 × SSC e 1% SDS, incubando a 42°C, ou 5 × SSC, 1% SDS, incubando a 65°C, com lavagem em 0,2 × SSC e SDS a 0,1% a 65°C. Para PCR, uma temperatura de cerca de 36°C é típica para amplificação de baixo rigor, embora as temperaturas de recozimento possam variar entre cerca de 32°C e 48°C, dependendo do comprimento do iniciador.
Para amplificação de PCR de alta severidade, uma temperatura de cerca de 62°C é típica, embora as temperaturas de anelamento de alta severidade possam variar de cerca de 50°C a cerca de 65°C, dependendo do comprimento do iniciador e da especificidade. As condições de ciclo típicas para amplificações de alta e baixa severidade incluem uma fase de desnaturação de 90 ° C-95 ° C por 30 seg.-2 min., uma fase de recozimento que dura 30 s.-2 min., e uma fase de extensão de cerca de 72 ° C por 1-2 min. Protocolos e diretrizes para reações de amplificação de baixo e alto rigor são fornecidos, por exemplo, em Innis et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y.
(1990).
[0026] Os ácidos nucleicos que não se hibridam entre si sob condições estritas ainda são substancialmente idênticos se os polipeptídeos que eles codificam forem substancialmente idênticos. Isso ocorre, por exemplo, quando uma cópia de um ácido nucleico é criada usando a degeneração de códon máxima permitida pelo código genético. Nesses casos, os ácidos nucleicos tipicamente hibridam sob condições de hibridação moderadamente rigorosas. Exemplos de "condições de hibridação moderadamente rigorosas" incluem uma hibridação em um tampão de formamida 40%, NaCl 1 M, SDS 1% a 37°C e uma lavagem em 1 × SSC a 45°C. Uma hibridação positiva é pelo menos duas vezes de fundo. Os versados comuns devem reconhecer facilmente que podem ser utilizadas condições alternativas de hibridação e lavagem para proporcionar condições de rigidez semelhante. Diretrizes adicionais para determinar os parâmetros de hibridação são fornecidas em numerosas referências, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds.
[0027] Os termos "substancialmente idênticos" ou "identidade substancial", no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais ou têm uma porcentagem especificada de nucleotídeos que são iguais (ou seja, pelo menos cerca de 60%, de preferência pelo menos cerca de 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade em uma região especificada), quando comparada e alinhada para correspondência máxima em uma janela de comparação, ou região designada medida usando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequência ou por alinhamento manual e inspeção visual. Esta definição, quando o contexto indica, também se refere analogamente ao complemento de uma sequência. De preferência, a identidade substancial existe sobre uma região que tem pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 nucleotídeos de comprimento.
[0028] Para comparação de sequência, tipicamente uma sequência atua como uma sequência de referência a qual as sequências de teste são comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de sequência, as sequências de teste e de referência são inseridas em um computador, as coordenadas de subsequência são designadas, se necessário, e os parâmetros do programa de algoritmo de sequência são designados. Os parâmetros do programa padrão podem ser usados, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequência calcula então as porcentagens de identidade de sequência para as sequências de teste relativas à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa.
[0029] Uma "janela de comparação", como utilizado neste documento, inclui referência a um segmento de qualquer uma de uma série de posições contíguas selecionadas do grupo que consiste em cerca de 5 a cerca de 60, geralmente cerca de 10 a cerca de 45, mais geralmente cerca de 15 a cerca de 30, em que uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas sequências estarem alinhadas de forma otimizada. Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são conhecidos na técnica. O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento por homologia de Needleman and Wunsch, J. Mol.
Biol., 48:443 (1970), pela busca por método de similaridade de Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444 (1988), por implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), ou por alinhamento manual e inspeção visual (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (1995 supplement)).
[0030] Um exemplo preferido de um algoritmo que é adequado para determinar a porcentagem de identidade de sequência e similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al., Nuc. Acids Res., 25:3389-3402 (1977) and Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990), respectivamente. BLAST e BLAST 2.0 são usados, com os parâmetros aqui descritos, para determinar a porcentagem de identidade de sequência para os ácidos nucleicos da invenção. O software para realizar análises BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
[0031] O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (ver, por exemplo, Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787 (1993)). Uma medida de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma correspondência entre duas sequências de nucleotídeos ocorreria por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado semelhante a uma sequência de referência se a menor probabilidade de soma em uma comparação do ácido nucleico de teste com o ácido nucleico de referência for menor que cerca de 0,2, mais preferencialmente menos que cerca de 0,01, e mais preferencialmente menos que cerca de 0,001.
[0032] O termo "ácido nucleico", como utilizado neste documento,
refere-se a um polímero contendo pelo menos dois desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos na forma de fita simples ou dupla e inclui DNA e RNA.
O DNA pode estar na forma de, por exemplo, moléculas antissentido, DNA de plasmídeo, DNA pré-condensado, um produto de PCR, vetores (P1, PAC, BAC,
YAC, cromossomos artificiais), cassetes de expressão, sequências quiméricas,
DNA cromossômico ou derivados e combinações desses grupos.
O RNA pode estar na forma de siRNA, RNA interferente assimétrico (aiRNA), microRNA
(miRNA), mRNA, tRNA, rRNA, tRNA, RNA viral (vRNA), RNA de autoamplificação e combinações dos mesmos.
Os ácidos nucleicos incluem ácidos nucleicos contendo análogos de nucleotídeos conhecidos ou resíduos de estrutura modificados ou ligações, que são sintéticos, de ocorrência natural e de ocorrência não natural, e que têm propriedades de ligação semelhantes às do ácido nucleico de referência.
Exemplos de tais análogos incluem, sem limitação,
fosforotioatos, fosforamidatos, metilfosfonatos, quiral-metilfosfonatos, 2'-O-metil ribonucleotídeos, e peptídeo-ácidos nucleicos (PNAs). A menos que especificamente limitado, o termo abrange ácidos nucleicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação semelhantes às do ácido nucleico de referência.
Salvo indicação em contrário,
uma sequência de ácido nucleico específica também inclui implicitamente variantes modificadas conservativamente (por exemplo, substituições de códons degeneradas), alelos, ortólogos, SNPs e sequências complementares, bem como a sequência explicitamente indicada.
Especificamente, as substituições de códons degeneradas podem ser alcançadas gerando sequências nas quais a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída com base mista e / ou resíduos de desoxinossina (Batzer et al., Nucleic Acid
Res., 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J.
Biol.
Chem., 260:2605-2608 (1985);
Rossolini et al., Mol.
Cell.
Probes, 8:91-98 (1994)). “Nucleotídeos” contêm um açúcar desoxirribose (DNA) ou ribose (RNA), uma base e um grupo fosfato.
Os nucleotídeos estão ligados entre si através dos grupos fosfato. "Bases" incluem purinas e pirimidinas, que incluem ainda compostos naturais de adenina, timina, guanina, citosina, uracil, inosina e análogos naturais e derivados sintéticos de purinas e pirimidinas, que incluem, mas não estão limitados a, modificações que colocam novos grupos reativos, tais como, mas não limitados a, aminas, álcoois, tióis, carboxilatos e alquil-haletos.
[0033] O termo "gene" refere-se a uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, DNA ou RNA) que compreende sequências de codificação de comprimento parcial ou inteiro necessárias para a produção de um polipeptídeo ou polipeptídeo precursor.
[0034] "Produto genético", conforme usado neste documento, refere-se a um produto de um gene, como um transcrito de RNA ou um polipeptídeo.
[0035] O termo "lipídeo" se refere a um grupo de compostos orgânicos que incluem, mas não estão limitados a, ésteres de ácidos graxos e são caracterizados por serem insolúveis em água, mas solúveis em muitos solventes orgânicos. Eles geralmente são divididos em pelo menos três classes: (1) “lipídeos simples”, que incluem gorduras e óleos, bem como ceras; (2) “lipídeos compostos”, que incluem fosfolipídeos e glicolipídeos; e (3) "lipídeos derivados", como esteroides.
[0036] Como utilizado neste documento, o termo "LNP" refere-se a uma partícula de ácido nucleico-lipídeo ou uma partícula de ácido nucleico-lipídeo (por exemplo, uma partícula de ácido nucleico-lipídeo estável).
Um LNP representa uma partícula feita de lipídeos (por exemplo, um lipídeo catiônico, um lipídeo não catiônico e um lipídeo conjugado que evita a agregação da partícula) e um ácido nucleico, em que o ácido nucleico (por exemplo, siRNA, aiRNA, miRNA, ssDNA, dsDNA, ssRNA, RNA em hairpin curto (shRNA), dsRNA, mRNA, RNA de autoamplificação ou um plasmídeo, incluindo plasmídeos a partir dos quais um RNA interferente ou mRNA é transcrito) é encapsulado dentro do lipídeo. Em uma modalidade, o ácido nucleico é pelo menos 50% encapsulado no lipídeo; em uma modalidade, o ácido nucleico é pelo menos 75% encapsulado no lipídeo; em uma modalidade, o ácido nucleico é pelo menos 90% encapsulado no lipídeo; e em uma modalidade, o ácido nucleico é completamente encapsulado no lipídeo. Os LNPs normalmente contêm um lipídeo catiônico, um lipídeo não catiônico e um conjugado de lipídeo (por exemplo, um conjugado PEG-lipídeo). LNP são extremamente úteis para aplicações sistêmicas, pois podem exibir tempos de vida de circulação prolongados após a injeção intravenosa (i.v.), eles podem se acumular em sítios distais (por exemplo, sítios fisicamente separados do sítio de administração) e podem mediar a expressão do gene transfectado ou silenciamento da expressão do gene alvo nesses sítios distais.
[0037] As partículas de lipídeo da invenção (por exemplo, LNP) tipicamente têm um diâmetro médio de cerca de 40 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 50 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 60 nm a cerca de 130 nm, de cerca de 70 nm a cerca de 110 nm, ou de cerca de 70 a cerca de 90 nm, e são substancialmente não tóxicas. Além disso, os ácidos nucleicos, quando presentes nas partículas de lipídeo da invenção, são resistentes em solução aquosa à degradação com uma nuclease. Partículas de ácido nucléico-lipídeo e seu método de preparação são divulgados, por exemplo, nas Publicações de Patentes U.S. 20040142025 e 20070042031, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todos os fins.
[0038] Como utilizado neste documento, "lipídeo encapsulado" pode se referir a uma partícula de lipídeo que fornece um agente ativo ou agente terapêutico, como um ácido nucleico (por exemplo, um RNA ou mRNA interferente), com encapsulação total, encapsulação parcial ou ambos. Em uma modalidade preferida, o ácido nucleico é totalmente encapsulado na partícula de lipídeo (por exemplo, para formar um SPLP, pSPLP, LNP ou outra partícula de ácido nucleico-lipídeo).
[0039] O termo "conjugado de lipídeo" refere-se a um lipídeo conjugado que inibe a agregação de partículas de lipídeo. Tais conjugados de lipídeos incluem, mas não estão limitados a, oligômeros de poliamida (por exemplo, conjugados ATTA-lipídeo), conjugados de PEG-lipídeo, como PEG acoplado a dialquiloxipropis, PEG acoplado a diacilgliceróis, PEG acoplado a colesterol, PEG acoplado a fosfatidiletanolaminas, PEG conjugado com ceramidas (ver, por exemplo, Pat. U.S. 5.885.613, cuja divulgação é incorporada neste documento por referência em sua totalidade para todos os fins), lipídeos catiônicos de PEG e misturas dos mesmos. O PEG pode ser conjugado diretamente ao lipídeo ou pode ser ligado ao lipídeo através de uma fração de ligante. Qualquer fração de ligante adequada para acoplar o PEG a um lipídeo pode ser usada incluindo, por exemplo, frações de ligante não contendo éster e frações de ligante contendo éster Em modalidades preferidas, são utilizadas frações de ligante não contendo éster.
[0040] O termo "lipídeo anfipático" refere-se, em parte, a qualquer material adequado em que a fração hidrofóbica do material lipídico se orienta para uma fase hidrofóbica, enquanto a fração hidrofílica se orienta para a fase aquosa. As características hidrofílicas derivam da presença de grupos polares ou carregados, como carboidratos, fosfato, carboxílico, sulfato, amino, sulfidril, nitro, hidroxil e outros grupos semelhantes. A hidrofobicidade pode ser conferida pela inclusão de grupos apolares que incluem, mas não estão limitados a, grupos de hidrocarbonetos alifáticos saturados e insaturados de cadeia longa e tais grupos substituídos por um ou mais grupos aromáticos, cicloalifáticos ou heterocíclicos. Exemplos de compostos anfipáticos incluem, mas não estão limitados a, fosfolipídeos, aminolipídeos e esfingolipídeos.
[0041] Os exemplos representativos de fosfolipídeos incluem, mas não estão limitados a, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, ácido fosfatídico, palmitoiloleoil fosfatidilcolina, lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, dipalmitoilfosfatidilcolina, dioleoilfosfatidilcolina, diestearoilfosfatidilcolina e dilinoleoilfosfatidilcolina.
Outros compostos com falta de fósforo, tais como esfingolipídeos, famílias de glicoesfingolipídeos, diacilgliceróis e β-aciloxiácidos, também estão dentro do grupo designado como lipídeos anfipáticos. Além disso, os lipídeos anfipáticos descritos acima podem ser misturados com outros lipídeos incluindo triglicerídeos e esteróis.
[0042] O termo "lipídeo neutro" refere-se a qualquer uma de uma série de espécies de lipídeos que existem em uma forma zwitteriônica neutra ou não carregada em um pH selecionado. Em pH fisiológico, tais lipídeos incluem, por exemplo, diacilfosfatidilcolina, diacilfosfatidiletanolamina, ceramida, esfingomielina, cefalina, colesterol, cerebrosídeos e diacilgliceróis.
[0043] O termo "lipídeo não catiônico" refere-se a qualquer lipídeo anfipático, bem como a qualquer outro lipídeo neutro ou lipídeo aniônico.
[0044] O termo "lipídeo aniônico" refere-se a qualquer lipídeo que é carregado negativamente em pH fisiológico. Estes lipídeos incluem, mas não estão limitados a, fosfatidilgliceróis, cardiolipinas, diacilfosfatidilserinas, ácidos diacilfosfatídicos, N-dodecanoil fosfatidiletanolaminas, N-succinil fosfatidiletanolaminas, N-glutarilfosfatidiletanolaminas, lisilfosfatidilgliceróis, palmitoiloleolfosfatidilglicerol (POPG), e outros grupos modificadores aniônicos ligados a lipídeos neutros.
[0045] O termo "lipídeo catiônico" refere-se a um composto de Fórmula (I) conforme descrito neste documento.
[0046] O termo "lipídeo hidrofóbico" se refere a compostos com grupos apolares que incluem, mas não estão limitados a, grupos de hidrocarbonetos alifáticos saturados e insaturados de cadeia longa e tais grupos opcionalmente substituídos por um ou mais grupos aromáticos, cicloalifáticos ou heterocíclicos. Os exemplos adequados incluem, mas não estão limitados a, diacilglicerol, dialquilglicerol, N—N-dialquilamino, 1,2-diaciloxi-3-aminopropano e 1,2-dialquil-3-aminopropano.
[0047] O termo "fusogênico" refere-se à capacidade de uma partícula de lipídeo, como um LNP, de se fundir com as membranas de uma célula. As membranas podem ser a membrana plasmática ou membranas ao redor de organelas, por exemplo, endossomo, núcleo, etc.
[0048] Como utilizado neste documento, o termo "solução aquosa" refere-se a uma composição compreendendo no todo, ou em parte, água.
[0049] Como utilizado neste documento, o termo "solução lipídica orgânica" refere-se a uma composição compreendendo no todo, ou em parte, um solvente orgânico com um lipídeo.
[0050] "Local distal", como utilizado neste documento, refere-se a um local fisicamente separado, que não está limitado a um leito capilar adjacente, mas inclui locais amplamente distribuídos por todo um organismo.
[0051] "Estável no soro" em relação às partículas de ácido nucleico-lipídeo, como LNP, significa que a partícula não é significativamente degradada após a exposição a um ensaio de soro ou nuclease que degradaria significativamente o DNA ou RNA livre. Os ensaios adequados incluem, por exemplo, um ensaio de soro padrão, um ensaio de DNAse ou um ensaio de RNAse.
[0052] "Distribuição sistêmica", como utilizado neste documento, refere-se à distribuição de partículas de lipídeo que leva a uma ampla biodistribuição de um agente ativo ou agente terapêutico, como um RNA ou mRNA interferente, dentro de um organismo. Algumas técnicas de administração podem levar à administração sistêmica de certos agentes, mas não de outros. A distribuição sistêmica significa que uma quantidade útil, de preferência terapêutica, de um agente é exposta à maioria das partes do corpo. Para obter uma ampla biodistribuição geralmente requer uma vida útil do sangue de modo que o agente não seja rapidamente degradado ou depurado (como por órgãos de primeira passagem (fígado, pulmão, etc.) ou por ligação celular inespecífica rápida) antes de atingir um local da doença distal ao local de administração. A distribuição sistêmica de partículas de lipídeo pode ser por qualquer meio conhecido na técnica incluindo, por exemplo, intravenosa, subcutânea e intraperitoneal. Numa modalidade preferida, a distribuição sistêmica de partículas de lipídeo é por distribuição intravenosa.
[0053] "Distribuição local", como utilizado neste documento, refere-se à distribuição de um agente ativo ou agente terapêutico, como um RNA ou mRNA interferente, diretamente a um sítio alvo dentro de um organismo. Por exemplo, um agente pode ser distribuído localmente por injeção direta em um sítio de doença, como um tumor ou outro sítio alvo, como um sítio de inflamação, ou um órgão alvo, como o fígado, coração, pâncreas, rim e semelhantes.
[0054] O termo "mamífero" refere-se a qualquer espécie de mamífero, como humano, camundongo, rato, cachorro, gato, hamster, porquinho-da-índia, coelho, gado e semelhantes.
[0055] O termo "câncer" refere-se a qualquer membro de uma classe de doenças caracterizadas pelo crescimento descontrolado de células aberrantes. O termo inclui todos os cânceres e condições neoplásicas conhecidos, sejam eles caracterizados como malignos, benignos, de tecidos moles ou sólidos, e cânceres de todos os estágios e graus, incluindo cânceres pré e pós-metastáticos. Exemplos de diferentes tipos de câncer incluem, mas não estão limitados a, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer retal, câncer anal, câncer de ducto biliar, câncer de intestino delgado, câncer de estômago (gástrico), câncer de esôfago; câncer de vesícula biliar, câncer de fígado, câncer de pâncreas, câncer de apêndice, câncer de mama, câncer de ovário; câncer cervical, câncer de próstata, câncer renal (por exemplo, carcinoma de células renais), câncer do sistema nervoso central, glioblastoma, câncer de pele, linfomas, coriocarcinomas, cânceres de cabeça e pescoço, sarcomas osteogênicos e cânceres do sangue. Exemplos não limitativos de tipos específicos de câncer de fígado incluem carcinoma hepatocelular (HCC), câncer de fígado secundário (por exemplo, causado por metástase de algum outro tipo de célula de câncer não hepático) e hepatoblastoma. Conforme usado neste documento, um "tumor" compreende uma ou mais células cancerígenas.
[0056] O termo "grupo precursor aniônico" inclui grupos que são capazes de formar um íon em pH fisiológico. Por exemplo, o termo inclui os grupos –CO2H, -O-P(=O)(OH)2, -OS(=O)2(OH), -O-S(=O)(OH), e -B(OH)2. Em uma modalidade, o precursor aniônico é -CO2H.
[0057] Em uma modalidade particular, PEG-C-DMA tem a seguinte estrutura: em que n é selecionado de modo que a cadeia de polímero resultante tenha um peso molecular de cerca de 1000 a cerca de 3000. Em outra modalidade, n é selecionado de modo que a cadeia de polímero resultante tenha um peso molecular de cerca de 2.000. O PEG-C-DMA pode ser preparado conforme descrito por Heyes et al, Synthesis and Characterization of Novel Poly (Ethylene Glycol)-lipid Conjugates Suitable for use in Drug Delivery,” Journal of Controlled Release, 2006, and in United States Patent Number 8.936.942.
Descrição das Modalidades
[0058] A presente invenção fornece novas partículas de lipídeo estáveis no soro compreendendo um ou mais agentes ativos ou agentes terapêuticos, métodos de produção de partículas de lipídeo e métodos de distribuição e / ou administração das partículas de lipídeo (por exemplo, para o tratamento de uma doença ou distúrbio).
[0059] Em um aspecto, a presente invenção fornece partículas de lipídeo que compreendem: (a) um ou mais agentes ativos ou agentes terapêuticos; (b) um ou mais lipídeos catiônicos compreendendo de cerca de 30% em mol a cerca de 85% em mol do lipídeo total presente na partícula; (c) um ou mais lipídeos não catiônicos compreendendo de cerca de 13% em mol a cerca de 49,5% em mol do lipídeo total presente na partícula; e (d) um ou mais lipídeos conjugados que inibem a agregação de partículas compreendendo de cerca de 0,1% em mol a cerca de 10% em mol do lipídeo total presente na partícula.
[0060] Em um aspecto, a presente invenção fornece partículas de lipídeo que compreendem: (a) um ou mais agentes ativos ou agentes terapêuticos; (b) um ou mais lipídeos catiônicos compreendendo de cerca de 50% em mol a cerca de 85% em mol do lipídeo total presente na partícula; (c) um ou mais lipídeos não catiônicos compreendendo de cerca de 13% em mol a cerca de 49,5% em mol do lipídeo total presente na partícula; e (d) um ou mais lipídeos conjugados que inibem a agregação de partículas compreendendo de cerca de 0,5% em mol a cerca de 2% em mol do lipídeo total presente na partícula.
[0061] Em certas modalidades, o agente ativo ou agente terapêutico é totalmente encapsulado na porção lipídica da partícula de lipídeo, de modo que o agente ativo ou agente terapêutico na partícula de lipídeo seja resistente em solução aquosa à degradação enzimática, por exemplo, por uma nuclease ou protease. Em certas outras modalidades, as partículas de lipídeos são substancialmente não tóxicas para mamíferos, como humanos.
[0062] Em algumas modalidades, o agente ativo ou agente terapêutico compreende um ácido nucleico. Em certos casos, o ácido nucleico compreende uma molécula de RNA interferente, como, por exemplo, um siRNA,
aiRNA, miRNA ou misturas dos mesmos. Em certos outros casos, o ácido nucleico compreende DNA de fita simples ou dupla, RNA ou um híbrido de DNA / RNA, como, por exemplo, um oligonucleotídeo antissentido, uma ribozima, um plasmídeo, um oligonucleotídeo imunoestimulatório ou misturas dos mesmos.
Em certos casos, o ácido nucleico compreende uma molécula de mRNA.
[0063] Em outras modalidades, o agente ativo ou agente terapêutico compreende um peptídeo ou polipeptídeo. Em certos casos, o peptídeo ou polipeptídeo compreende um anticorpo tal como, por exemplo, um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um fragmento de anticorpo; um anticorpo humanizado, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano recombinante, um anticorpo Primatized™ ou misturas dos mesmos. Em certos outros casos, o peptídeo ou polipeptídeo compreende uma citocina, um fator de crescimento, um fator apoptótico, um fator indutor de diferenciação, um receptor de superfície celular, um ligando, um hormônio, uma molécula pequena (por exemplo, pequena molécula orgânica ou composto), ou misturas dos mesmos.
[0064] Em uma modalidade, o agente ativo ou agente terapêutico compreende um siRNA. Em uma modalidade, a molécula de siRNA compreende uma região de fita dupla de cerca de 15 a cerca de 60 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, cerca de 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25 ou 19-25 nucleotídeos de comprimento ou 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos de comprimento). As moléculas de siRNA da invenção são capazes de silenciar a expressão de uma sequência alvo in vitro e / ou in vivo.
[0065] Em algumas modalidades, a molécula de siRNA compreende pelo menos um nucleotídeo modificado. Em certas modalidades preferidas, a molécula de siRNA compreende um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais nucleotídeos modificados na região de fita dupla.
Em certos casos, o siRNA compreende de cerca de 1% a cerca de 100% (por exemplo, cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%,
55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%) de nucleotídeos modificados na região de fita dupla. Em modalidades preferidas, menos de cerca de 25% (por exemplo, menos de cerca de 25%, 20%, 15%, 10% ou 5%) ou de cerca de 1% a cerca de 25% (por exemplo, de cerca de 1% -25%, 5% -25%, 10% -25%, 15% -25%, 20% -25% ou 10% -20%) dos nucleotídeos na região de fita dupla compreendem nucleotídeos modificados.
[0066] Em outras modalidades, a molécula de siRNA compreende nucleotídeos modificados, incluindo, mas não se limitando a, nucleotídeos 2′-O-metil (2′OMe), nucleotídeos 2′-desoxi-2′-fluoro (2′F), nucleotídeos 2′-desoxi, 2'-O-(2-metoxietil) (MOE), nucleotídeos de ácido nucleico bloqueado (LNA) e misturas dos mesmos. Em modalidades preferidas, o siRNA compreende 2′OMe nucleotídeos (por exemplo, 2′OMe purina e / ou nucleotídeos pirimidina), tais como, por exemplo, nucleotídeos 2′OMe-guanosina, nucleotídeos 2′OMe-uridina, nucleotídeos 2′OMe-adenosina, nucleotídeos 2′OMe-citosina e misturas dos mesmos. Em certos casos, o siRNA não compreende nucleotídeos 2'OMe-citosina. Em outras modalidades, o siRNA compreende uma estrutura de alça em hairpin.
[0067] O siRNA pode compreender nucleotídeos modificados em uma fita (ou seja, sentido ou antissentido) ou ambas as fitas da região de fita dupla da molécula de siRNA. De preferência, os nucleotídeos de uridina e / ou guanosina são modificados em posições seletivas na região de fita dupla do duplex de siRNA. No que diz respeito às modificações de nucleotídeos de uridina, pelo menos um, dois, três, quatro, cinco, seis ou mais dos nucleotídeos de uridina na fita sentido e / ou antissentido podem ser um nucleotídeo de uridina modificado, como um nucleotídeo de 2′OMe-uridina. Em algumas modalidades, cada nucleotídeo de uridina na fita sentido e / ou antissentido é um nucleotídeo 2′OMe-uridina. No que diz respeito às modificações de nucleotídeo de guanosina, pelo menos um, dois, três, quatro, cinco, seis ou mais dos nucleotídeos de guanosina na fita sentido e / ou antissentido podem ser um nucleotídeo de guanosina modificado, como um nucleotídeo de 2′OMe-guanosina. Em algumas modalidades, cada nucleotídeo de guanosina na fita sentido e / ou antissentido é um nucleotídeo 2′OMe-guanosina.
[0068] Em certas modalidades, pelo menos um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou mais motivos 5′-GU-3′ em uma sequência de siRNA podem ser modificados, por exemplo, pela introdução de incompatibilidades para eliminar os motivos 5′-GU-3′ e / ou pela introdução de nucleotídeos modificados, como nucleotídeos 2′OMe. O motivo 5'-GU-3' pode estar na fita sentido, na fita antissentido ou em ambas as fitas da sequência de siRNA. Os motivos 5′-GU-3′ podem ser adjacentes uns aos outros ou, alternativamente, podem ser separados por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais nucleotídeos.
[0069] Em algumas modalidades preferidas, uma molécula de siRNA modificada é menos imunoestimulatória do que uma sequência de siRNA não modificada correspondente. Em tais modalidades, a molécula de siRNA modificada com propriedades imunoestimulatórias reduzidas vantajosamente retém a atividade de RNAi contra a sequência alvo. Em outra modalidade, as propriedades imunoestimulatórias da molécula de siRNA modificada e sua capacidade de silenciar a expressão do gene alvo podem ser equilibradas ou otimizadas pela introdução de modificações mínimas e seletivas de 2′OMe dentro da sequência de siRNA, como, por exemplo, dentro da região d fita dupla do duplex de siRNA. Em certos casos, o siRNA modificado é pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% menos imunoestimulatório do que o correspondente siRNA não modificado. Será prontamente aparente para os versados na técnica que as propriedades imunoestimulatórias da molécula de siRNA modificada e a molécula de siRNA não modificada correspondente podem ser determinadas,
por exemplo, medindo os níveis de INF-α e / ou IL-6 de cerca de duas a cerca de doze horas após a administração sistêmica em um mamífero ou transfecção de uma célula respondedora de mamífero usando um sistema de distribuição baseado em lipídeos apropriado (tal como o sistema de distribuição de LNP aqui divulgado).
[0070] Em certas modalidades, uma molécula de siRNA modificada tem um IC50 (ou seja, metade da concentração inibitória máxima) menor ou igual a dez vezes que o siRNA não modificado correspondente (ou seja, o siRNA modificado tem um IC50 que é menor ou igual a dez vezes o IC50 do siRNA não modificado correspondente). Em outras modalidades, o siRNA modificado tem um IC50 menor ou igual a três vezes aquele da sequência de siRNA não modificada correspondente. Em ainda outras modalidades, o siRNA modificado tem um IC50 menor ou igual a duas vezes aquele do siRNA não modificado correspondente. Será prontamente aparente para aqueles versados na técnica que uma curva dose-resposta pode ser gerada e os valores de IC50 para o siRNA modificado e o siRNA não modificado correspondente podem ser facilmente determinados usando métodos conhecidos pelos versados na técnica.
[0071] Em ainda outra modalidade, uma molécula de siRNA modificada é capaz de silenciar pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% da expressão da sequência alvo em relação à sequência de siRNA não modificada correspondente.
[0072] Em algumas modalidades, a molécula de siRNA não compreende modificações de estrutura de fosfato, por exemplo, na fita sentido e / ou antissentido da região de fita dupla. Em outras modalidades, o siRNA compreende uma, duas, três, quatro ou mais modificações de estrutura de fosfato, por exemplo, na fita sentido e/ou antissentido da região de fita dupla. Em modalidades preferidas, o siRNA não compreende modificações na espinha dorsal de fosfato.
[0073] Em outras modalidades, o siRNA não compreende nucleotídeos 2'-desoxi, por exemplo, na fita sentido e/ou antissentido da região de fita dupla. Em ainda outras modalidades, o siRNA compreende um, dois, três, quatro ou mais nucleotídeos 2'-desoxi, por exemplo, na fita sentido e/ou antissentido da região de fita dupla. Em modalidades preferidas, o siRNA não compreende nucleotídeos 2'-desoxi.
[0074] Em certos casos, o nucleotídeo na extremidade 3' da região de fita dupla na fita sentido e / ou antissentido não é um nucleotídeo modificado. Em certos outros casos, os nucleotídeos próximos à extremidade 3' (por exemplo, dentro de um, dois, três ou quatro nucleotídeos da extremidade 3') da região de fita dupla na fita sentido e / ou antissentido não são modificados nucleotídeos.
[0075] As moléculas de siRNA aqui descritas podem ter saliências 3' de um, dois, três, quatro ou mais nucleotídeos em um ou ambos os lados da região de fita dupla, ou podem não ter saliências (ou seja, têm extremidades cegas) em um ou ambos os lados da região de fita dupla. De preferência, o siRNA tem saliências 3' de dois nucleotídeos em cada lado da região de fita dupla. Em certos casos, a saliência 3' na fita antissentido tem complementaridade com a sequência alvo e a saliência 3' na fita sentido tem complementaridade com uma fita complementar da sequência alvo.
Alternativamente, as saliências 3' não têm complementaridade com a sequência alvo ou a fita complementar da mesma. Em algumas modalidades, as saliências 3' compreendem um, dois, três, quatro ou mais nucleotídeos, como nucleotídeos 2'-desoxi (2′H). Em certas modalidades preferidas, as saliências 3' compreendem desoxitimidina (dT) e / ou nucleotídeos de uridina. Em outras modalidades, um ou mais dos nucleotídeos nas saliências 3' em um ou ambos os lados da região de fita dupla compreendem nucleotídeos modificados.
Exemplos não limitativos de nucleotídeos modificados são descritos acima e incluem nucleotídeos 2′OMe, nucleotídeos 2′-desoxi-2′F, nucleotídeos 2′-desoxi, nucleotídeos 2′-O-2-MOE, nucleotídeos LNA e misturas dos mesmos. Em modalidades preferidas, um, dois, três, quatro ou mais nucleotídeos nas saliências 3' presentes na fita sentido e / ou antissentido do siRNA compreendem nucleotídeos 2′OMe (por exemplo, nucleotídeos de purina e/ou pirimidina 2′OMe) tais como, por exemplo, 2'OMe-guanosina, nucleotídeos 2′OMe-uridina, nucleotídeos 2′OMe-adenosina, nucleotídeos 2′OMe-citosina e misturas dos mesmos.
[0076] O siRNA pode compreender pelo menos um ou um coquetel (por exemplo, pelo menos dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais) de sequências de siRNA não modificadas e / ou modificadas que silenciam a expressão do gene alvo. O coquetel de siRNA pode compreender sequências que são direcionadas para a mesma região ou domínio (por exemplo, um "ponto quente") e / ou para diferentes regiões ou domínios de um ou mais genes alvo.
Em certos casos, um ou mais (por exemplo, pelo menos dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais) siRNA modificado que silenciam a expressão do gene alvo estão presentes em um coquetel. Em certos outros casos, uma ou mais (por exemplo, pelo menos dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais) sequências de siRNA não modificadas que silenciam a expressão do gene alvo estão presentes em um coquetel.
[0077] Em algumas modalidades, a fita antissentido da molécula de siRNA compreende ou consiste em uma sequência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% complementar à sequência alvo ou uma porção da mesma. Em outras modalidades, a fita antissentido da molécula de siRNA compreende ou consiste em uma sequência que é 100% complementar à sequência alvo ou uma porção da mesma. Em outras modalidades, a fita antissentido da molécula de siRNA compreende ou consiste em uma sequência que hibrida especificamente com a sequência alvo ou uma porção da mesma.
[0078] Em outras modalidades, a fita sentido da molécula de siRNA compreende ou consiste em uma sequência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência alvo ou uma porção da mesma. Em modalidades adicionais, a fita sentido da molécula de siRNA compreende ou consiste em uma sequência que é 100% idêntica à sequência alvo ou uma porção da mesma.
[0079] Nas nanopartículas de lipídeos da invenção, o lipídeo catiônico pode ser selecionado dos compostos de Fórmula (I), conforme descrito neste documento.
[0080] Em algumas modalidades, o lipídeo catiônico pode compreender de cerca de 30% em mol a cerca de 90% em mol, de cerca de 30% em mol a cerca de 85% em mol, de cerca de 30% em mol a cerca de 80% em mol, de cerca de 30% em mol a cerca de 75% em mol, de cerca de 30% em mol a cerca de 70% em mol, de cerca de 30% em mol a cerca de 65% em mol, ou de cerca de 30% em mol a cerca de 60% em mol do lipídeo total presente na partícula.
[0081] Em algumas modalidades, o lipídeo catiônico pode compreender de cerca de 40% em mol a cerca de 90% em mol, de cerca de 40% em mol a cerca de 85% em mol, de cerca de 40% em mol a cerca de 80% em mol, de cerca de 40% em mol a cerca de 75% em mol, de cerca de 40% em mol a cerca de 70% em mol, de cerca de 40% em mol a cerca de 65% em mol, ou de cerca de 40% em mol a cerca de 60% em mol do lipídeo total presente na partícula.
[0082] Em outras modalidades, o lipídeo catiônico pode compreender de cerca de 55% em mol a cerca de 90% em mol, de cerca de 55% em mol a cerca de 85% em mol, de cerca de 55% em mol a cerca de 80% em mol, de cerca de 55% em mol a cerca de 75% em mol, de cerca de 55% em mol a cerca de 70% em mol, ou de cerca de 55% em mol a cerca de 65% em mol do lipídeo total presente na partícula.
[0083] Em ainda outras modalidades, o lipídeo catiônico pode compreender de cerca de 60% em mol a cerca de 90% em mol, de cerca de 60% em mol a cerca de 85% em mol, de cerca de 60% em mol a cerca de 80% em mol, de cerca de 60% em mol a cerca de 75% em mol, ou de cerca de 60% em mol a cerca de 70% em mol do lipídeo total presente na partícula.
[0084] Em ainda outras modalidades, o lipídeo catiônico pode compreender de cerca de 65% em mol a cerca de 90% em mol, de cerca de 65% em mol a cerca de 85% em mol, de cerca de 65% em mol a cerca de 80% em mol, ou de cerca de 65% em mol a cerca de 75% em mol do lipídeo total presente na partícula.
[0085] Em outras modalidades, o lipídeo catiônico pode compreender de cerca de 70% em mol a cerca de 90% em mol, de cerca de 70% em mol a cerca de 85% em mol, de cerca de 70% em mol a cerca de 80% em mol, de cerca de 75% em mol a cerca de 90% em mol, de cerca de 75% em mol a cerca de 85% em mol, ou de cerca de 80% em mol a cerca de 90% em mol do lipídeo total presente na partícula.
[0086] Em modalidades adicionais, o lipídeo catiônico pode compreender (pelo menos) cerca de 30, 35, 40, 45, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 ou 90% em mol (ou qualquer fração dos mesmos ou intervalo entre eles) do lipídeo total presente na partícula.
[0087] Nas partículas de lipídeos da invenção, o lipídeo não catiônico pode compreender, por exemplo, um ou mais lipídeos aniônicos e / ou lipídeos neutros. Em modalidades preferidas, o lipídeo não catiônico compreende um dos seguintes componentes lipídicos neutros: (1) colesterol ou um derivado do mesmo (2) um fosfolipídeo; ou (3) uma mistura de um fosfolipídeo e colesterol ou um derivado do mesmo.
[0088] Exemplos de derivados de colesterol incluem, mas não estão limitados a, colestanol, colestanona, colestenona, coprostanol, éter de colesteril-2'-hidroxietil, éter de colesteril-4'-hidroxibutílico e misturas dos mesmos. A síntese de éter colesteril-2'-hidroxietílico é aqui descrita.
[0089] O fosfolipídeo pode ser um lipídeo neutro incluindo, mas não limitado a, dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), distearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoil-fosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoil-fosfatidiletanolamina (POPE), palmitoiloleol-fosfatidilglicerol (POPG), dipalmitoil-fosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoil-fosfatidiletanolamina (DMPE), distearoil-fosfatidiletanolamina (DSPE), monometil-fosfatidiletanolamina, dimetil-fosfatidiletanolamina, dielaidoil-fosfatidiletanolamina (DEPE), estearoiloleoil-fosfatidiletanolamina (SOPE), fosfatidilcolina de ovo (EPC) e misturas dos mesmos. Em certas modalidades preferidas, o fosfolipídeo é DPPC, DSPC ou misturas dos mesmos.
[0090] Em algumas modalidades, o lipídeo não catiônico (por exemplo, um ou mais fosfolipídeos e / ou colesterol) pode compreender de cerca de 10% em mol a cerca de 60% em mol, de cerca de 15% em mol a cerca de 60% em mol, de cerca de 20% em mol a cerca de 60% em mol, de cerca de 25% em mol a cerca de 60% em mol, de cerca de 30% em mol a cerca de 60% em mol, de cerca de 10% em mol a cerca de 55% em mol, de cerca de 15% em mol a cerca de 55% em mol, de cerca de 20% em mol a cerca de 55% em mol, de cerca de 25% em mol a cerca de 55% em mol, de cerca de 30% em mol a cerca de 55% em mol, de cerca de 13% em mol a cerca de 50% em mol, de cerca de 15% em mol a cerca de 50% em mol ou de cerca de 20% em mol a cerca de 50% em mol do lipídeo total presente na partícula. Quando o lipídeo não catiônico é uma mistura de um fosfolipídeo e colesterol ou um derivado do colesterol, a mistura pode compreender até cerca de 40, 50 ou 60% em mol do lipídeo total presente na partícula.
[0091] Em outras modalidades, o lipídeo não catiônico (por exemplo, um ou mais fosfolipídeos e / ou colesterol) pode compreender de cerca de 10% em mol a cerca de 49,5% em mol, de cerca de 13% em mol a cerca de 49,5% em mol, de cerca de 15% em mol a cerca de 49,5% em mol, de cerca de 20% em mol a cerca de 49,5% em mol, de cerca de 25% em mol a cerca de 49,5% em mol, de cerca de 30% em mol a cerca de 49,5% em mol, de cerca de 35% em mol a cerca de 49,5% em mol, ou de cerca de 40% em mol a cerca de 49,5% em mol do lipídeo total presente na partícula.
[0092] Em ainda outras modalidades, o lipídeo não catiônico (por exemplo, um ou mais fosfolipídeos e / ou colesterol) pode compreender de cerca de 10% em mol a cerca de 45% em mol, de cerca de 13% em mol a cerca de 45% em mol, de cerca de 15% em mol a cerca de 45% em mol, de cerca de 20% em mol a cerca de 45% em mol, de cerca de 25% em mol a cerca de 45% em mol, de cerca de 30% em mol a cerca de 45% em mol, ou de cerca de 35% em mol a cerca de 45% em mol do lipídeo total presente na partícula.
[0093] Em ainda outras modalidades, o lipídeo não catiônico (por exemplo, um ou mais fosfolipídeos e / ou colesterol) pode compreender de cerca de 10% em mol a cerca de 40% em mol, de cerca de 13% em mol a cerca de 40% em mol, de cerca de 15% em mol a cerca de 40% em mol, de cerca de 20% em mol a cerca de 40% em mol, de cerca de 25% em mol a cerca de 40% em mol, ou de cerca de 30% em mol a cerca de 40% em mol do lipídeo total presente na partícula.
[0094] Em outras modalidades, o lipídeo não catiônico (por exemplo, um ou mais fosfolipídeos e / ou colesterol) pode compreender de cerca de 10% em mol a cerca de 35% em mol, de cerca de 13% em mol a cerca de 35% em mol, de cerca de 15% em mol a cerca de 35% em mol, de cerca de 20%
em mol a cerca de 35% em mol, ou de cerca de 25% em mol a cerca de 35% em mol do lipídeo total presente na partícula.
[0095] Em ainda outras modalidades, o lipídeo não catiônico (por exemplo, um ou mais fosfolipídeos e / ou colesterol) pode compreender de cerca de 10% em mol a cerca de 30% em mol, de cerca de 13% em mol a cerca de 30% em mol, de cerca de 15% em mol a cerca de 30% em mol, de cerca de 20% em mol a cerca de 30% em mol, de cerca de 10% em mol a cerca de 25% em mol, de cerca de 13% em mol a cerca de 25% em mol, ou de cerca de 15% em mol a cerca de 25% em mol do lipídeo total presente na partícula.
[0096] Em modalidades adicionais, o lipídeo não catiônico (por exemplo, um ou mais fosfolipídeos e / ou colesterol) pode compreender (pelo menos) cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60% em mol (ou qualquer fração dos mesmos ou intervalo entre eles) do lipídeo total presente na partícula.
[0097] Em certas modalidades preferidas, o lipídeo não catiônico compreende colesterol ou um derivado de cerca de 31,5% em mol a cerca de 42,5% em mol do lipídeo total presente na partícula. Como um exemplo não limitativo, uma partícula de lipídeo livre de fosfolipídeo da invenção pode compreender colesterol ou um derivado do mesmo em cerca de 37% em mol do lipídeo total presente na partícula. Em outras modalidades preferidas, uma partícula de lipídeo livre de fosfolipídeos da invenção pode compreender colesterol ou um derivado do mesmo de cerca de 30% em mol a cerca de 45% em mol, de cerca de 30% em mol a cerca de 40% em mol, de cerca de 30% em mol a cerca de 35% em mol, de cerca de 35% em mol a cerca de 45% em mol, de cerca de 40% em mol a cerca de 45% em mol, de cerca de 32% em mol a cerca de 45% em mol, de cerca de 32% em mol a cerca de 42% em mol, de cerca de 32% em mol a cerca de 40% em mol, de cerca de 34% em mol a cerca de 45% em mol, de cerca de 34% em mol a cerca de 42% em mol, de cerca de 34% em mol a cerca de 40% em mol, ou cerca de 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45% em mol (ou qualquer fração dos mesmos ou intervalo entre eles) do lipídeo total presente na partícula.
[0098] Em certas outras modalidades preferidas, o lipídeo não catiônico compreende uma mistura de: (i) um fosfolipídeo de cerca de 4% em mol a cerca de 10% em mol do lipídeo total presente na partícula; e (ii) colesterol ou um derivado de cerca de 30% em mol a cerca de 40% em mol do lipídeo total presente na partícula. Como um exemplo não limitativo, uma partícula de lipídeo compreendendo uma mistura de um fosfolipídeo e colesterol pode compreender DPPC em cerca de 7% em mol e colesterol em cerca de 34% em mol do lipídeo total presente na partícula. Em outras modalidades, o lipídeo não catiônico compreende uma mistura de: (i) um fosfolipídeo de cerca de 3% em mol a cerca de 15% em mol, de cerca de 4% em mol a cerca de 15% em mol, de cerca de 4% em mol a cerca de 12% em mol, de cerca de 4% em mol a cerca de 10% em mol, de cerca de 4% em mol a cerca de 8% em mol, de cerca de 5% em mol a cerca de 12% em mol, de cerca de 5% em mol a cerca de 9% em mol, de cerca de 6% em mol a cerca de 12% em mol, de cerca de 6% em mol a cerca de 10% em mol, ou cerca de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15% em mol (ou qualquer fração dos mesmos ou intervalo entre eles) do lipídeo total presente na partícula; e (ii) colesterol ou um derivado do mesmo de cerca de 25% em mol a cerca de 45% em mol, de cerca de 30% em mol a cerca de 45% em mol, de cerca de 25% em mol a cerca de 40% em mol, de cerca de 30% em mol a cerca de 40% em mol, de cerca de 25% em mol a cerca de 35% em mol, de cerca de 30% em mol a cerca de 35% em mol, de cerca de 35% em mol a cerca de 45% em mol, de cerca de 40% em mol a cerca de 45% em mol, de cerca de 28% em mol a cerca de 40% em mol, de cerca de 28% em mol a cerca de 38% em mol, de cerca de 30% em mol a cerca de 38% em mol, de cerca de 32% em mol a cerca de 36% em mol, ou cerca de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32,
33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, ou 45% em mol (ou qualquer fração dos mesmos ou intervalo entre eles) do lipídeo total presente na partícula.
[0099] Em outras modalidades preferidas, o lipídeo não catiônico compreende uma mistura de: (i) um fosfolipídeo de cerca de 10% em mol a cerca de 30% em mol do lipídeo total presente na partícula; e (ii) colesterol ou um derivado de cerca de 10% em mol a cerca de 30% em mol do lipídeo total presente na partícula. Como um exemplo não limitativo, uma partícula de lipídeo compreendendo uma mistura de um fosfolipídeo e colesterol pode compreender DPPC em cerca de 20% em mol e colesterol em cerca de 20% em mol do lipídeo total presente na partícula. Em outras modalidades, o lipídeo não catiônico compreende uma mistura de: (i) um fosfolipídeo de cerca de 10% em mol a cerca de 30% em mol, de cerca de 10% em mol a cerca de 25% em mol, de cerca de 10% em mol a cerca de 20% em mol, de cerca de 15% em mol a cerca de 30% em mol, de cerca de 20% em mol a cerca de 30% em mol, de cerca de 15% em mol a cerca de 25% em mol, de cerca de 12% em mol a cerca de 28% em mol, de cerca de 14% em mol a cerca de 26% em mol, ou cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30% em mol (ou qualquer fração dos mesmos ou intervalo entre eles) do lipídeo total presente na partícula; e (ii) colesterol ou um derivado do mesmo de cerca de 10% em mol a cerca de 30% em mol, de cerca de 10% em mol a cerca de 25% em mol, de cerca de 10% em mol a cerca de 20% em mol, de cerca de 15% em mol a cerca de 30% em mol, de cerca de 20% em mol a cerca de 30% em mol, de cerca de 15% em mol a cerca de 25% em mol, de cerca de 12% em mol a cerca de 28% em mol, de cerca de 14% em mol a cerca de 26% em mol, ou cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30% em mol (ou qualquer fração dos mesmos ou intervalo entre eles) do lipídeo total presente na partícula.
Lipídeo Conjugado
[00100] Nas partículas de lipídeos da invenção (por exemplo,
LNP compreendendo, por exemplo, um RNA interferente, como siRNA ou mRNA), o lipídeo conjugado pode compreender, por exemplo, um ou mais dos seguintes: um conjugado de polietilenoglicol (PEG)-lipídeo, um conjugado de poliamida (ATTA)-lipídeo ou misturas dos mesmos. Em uma modalidade preferida, as partículas de ácido nucleico-lipídeo compreendem um conjugado PEG-lipídeo ou um conjugado ATTA-lipídeo. Os lipídeos conjugados podem compreender um PEG-lipídeo incluindo, por exemplo, um PEG-diacilglicerol (DAG), um PEG dialquiloxipropil (DAA), um PEG-fosfolipídeo, um PEG-ceramida (Cer) ou misturas dos mesmos. O conjugado PEG-DAA pode ser PEG-dilauriloxipropil (C12), um PEG-dimiristiloxipropil (C14), um PEG-dipalmitiloxipropil (C16), um PEG-disteariloxipropil (C18) ou misturas dos mesmos.
[00101] Conjugados PEG-lipídeo adicionais adequados para uso na invenção incluem, mas não estão limitados a, mPEG2000-1,2-di-O-alquil-sn3-carbomoilglicerídeo (PEG-C-DOMG). A síntese de PEG-C-DOMG é descrita no Pedido PCT PCT / US08 / 88676, depositado em 31 de dezembro de 2008, cuja divulgação é aqui incorporada por referência em sua totalidade para todos os fins. No entanto, conjugados PEG-lipídeo adicionais adequados para uso na invenção incluem, sem limitação, 1-[8′-(1,2-dimiristoil-3-propanoxi)-carboxamido-3′,6′-dioxaoctanil]carbamoil-w-m etil-poli(etilenoglicol) (2 KPEG-DMG). A síntese de 2 KPEG-DMG é descrita na Pat. U.S. 7.404.969, cuja divulgação é incorporada neste documento por referência em sua totalidade para todos os fins.
[00102] A fração PEG dos conjugados PEG-lipídeo aqui descritos pode compreender um peso molecular médio variando de cerca de 550 daltons a cerca de 10.000 daltons. Em certos casos, a fração PEG tem um peso molecular médio de cerca de 750 daltons a cerca de 5.000 daltons (por exemplo, de cerca de 1.000 daltons a cerca de 5.000 daltons, de cerca de 1.500 daltons a cerca de 3.000 daltons, de cerca de 750 daltons a cerca de 3.000 daltons, de cerca de 750 daltons a cerca de 2.000 daltons, etc.). Em modalidades preferidas, a fração PEG tem um peso molecular médio de cerca de 2.000 daltons ou cerca de 750 daltons.
[00103] Em certos casos, o lipídeo conjugado (por exemplo, conjugado PEG-lipídeo) pode compreender de cerca de 0,1 a cerca de 10% (ou qualquer fração dos mesmos ou intervalo entres eles) do lipídeo total presente na partícula. Em certos casos, o lipídeo conjugado (por exemplo, conjugado PEG-lipídeo) pode compreender de cerca de 0,1% em mol a cerca de 2% em mol, de cerca de 0,5% em mol a cerca de 2% em mol, de cerca de 1% em mol a cerca de 2% em mol, de cerca de 0,6% em mol a cerca de 1,9% em mol, de cerca de 0,7% em mol a cerca de 1,8% em mol, de cerca de 0,8% em mol a cerca de 1,7% em mol, de cerca de 1% em mol a cerca de 1,8% em mol, de cerca de 1,2% em mol a cerca de 1,8% em mol, de cerca de 1,2% em mol a cerca de 1,7% em mol, de cerca de 1,3% em mol a cerca de 1,6% em mol, de cerca de 1,4% em mol a cerca de 1,5% em mol, ou cerca de 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 ou 2% em mol (ou qualquer fração dos mesmos ou intervalo entres eles) do lipídeo total presente na partícula.
[00104] Nas partículas de lipídeo da invenção, o agente ativo ou agente terapêutico pode ser totalmente encapsulado dentro da porção lipídica da partícula, protegendo assim o agente ativo ou agente terapêutico da degradação enzimática. Em modalidades preferidas, um LNP compreendendo um ácido nucleico, tal como um RNA interferente (por exemplo, siRNA) ou mRNA, é totalmente encapsulado dentro da porção lipídica da partícula, protegendo assim o ácido nucleico da degradação da nuclease. Em certos casos, o ácido nucleico no LNP não é substancialmente degradado após a exposição da partícula a uma nuclease a 37°C por pelo menos cerca de 20, 30, 45 ou 60 minutos. Em certos outros casos, o ácido nucleico no LNP não é substancialmente degradado após a incubação da partícula no soro a 37°C por pelo menos cerca de 30, 45 ou 60 minutos ou pelo menos cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 ou 36 horas. Em outras modalidades, o agente ativo ou agente terapêutico (por exemplo, ácido nucleico, como siRNA) é complexado com a porção lipídica da partícula. Um dos benefícios das formulações da presente invenção é que as composições de partículas de lipídeo são substancialmente não tóxicas para mamíferos, como humanos.
[00105] O termo "totalmente encapsulado" indica que o agente ativo ou agente terapêutico na partícula de lipídeo não é significativamente degradado após a exposição ao soro ou um ensaio de nuclease ou protease que degradaria significativamente o DNA, RNA ou proteína livre. Em um sistema totalmente encapsulado, de preferência menos que cerca de 25% do agente ativo ou agente terapêutico na partícula é degradado em um tratamento que normalmente degradaria 100% do agente ativo livre ou agente terapêutico, mais preferencialmente menos que cerca de 10%, e mais preferencialmente menos que cerca de 5% do agente ativo ou agente terapêutico na partícula é degradado. No contexto de agentes terapêuticos de ácido nucleico, a encapsulação total pode ser determinada por um ensaio Oligreen®. Oligreen® é uma coloração de ácido nucleico fluorescente ultrassensível para quantificar oligonucleotídeos e DNA ou RNA de fita simples em solução (disponível na Invitrogen Corporation; Carlsbad, Califórnia).
“Totalmente encapsulado” também indica que as partículas de lipídeo são estáveis no soro, ou seja, que não se decompõem rapidamente em suas partes componentes após a administração in vivo.
[00106] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição de partícula de lipídeo (por exemplo, LNP) compreendendo uma pluralidade de partículas de lipídeo. Em modalidades preferidas, o agente ativo ou agente terapêutico (por exemplo, ácido nucleico) é totalmente encapsulado dentro da porção lipídica das partículas de lipídeo (por exemplo, LNP), de modo que de cerca de 30% a cerca de 100%, de cerca de 40% a cerca 100%, de cerca de 50% a cerca de 100%, de cerca de 60% a cerca de 100%, de cerca de 70% a cerca de 100%, de cerca de 80% a cerca de 100%, de cerca de 90% a cerca de 100%, de cerca de 30% a cerca de 95%, de cerca de 40% a cerca de 95%, de cerca de 50% a cerca de 95%, de cerca de 60% a cerca de 95%,%, de cerca de 70% a cerca de 95%, de cerca de 80% a cerca de 95%, de cerca de 85% a cerca de 95%, de cerca de 90% a cerca de 95%, de cerca de 30% a cerca de 90%, de cerca de 40% a cerca de 90%, de cerca de 50% a cerca de 90%, de cerca de 60% a cerca de 90%, de cerca de 70% a cerca de 90%, de cerca de 80% a cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% (ou qualquer fração dos mesmos ou intervalo entre eles) das partículas de lipídeo (por exemplo, LNP) tenham o agente ativo ou agente terapêutico encapsulado nas mesmas.
[00107] Tipicamente, as partículas de lipídeos (por exemplo, LNP) da invenção têm uma razão lipídeo:agente ativo (por exemplo, lipídeo:ácido nucleico) (razão massa / massa) de cerca de 1 a cerca de 100. Em alguns casos, a razão lipídeo:agente ativo (por exemplo, lipídeo: ácido nucleico) (razão massa / massa) varia de cerca de 1 a cerca de 50, de cerca de 2 a cerca de 25, de cerca de 3 a cerca de 20, de cerca de 4 a cerca de 15, ou de cerca de 5 a cerca de 10. Em modalidades preferidas, as partículas de lipídeo da invenção têm uma razão lipídeo:agente ativo (por exemplo, lipídeo:ácido nucleico) (razão massa / massa) de cerca de 5 a cerca de 15, por exemplo, cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 (ou qualquer fração dos mesmos ou intervalo entre eles).
[00108] Normalmente, as partículas de lipídeos (por exemplo, LNP) da invenção têm um diâmetro médio de cerca de 40 nm a cerca de 150 nm.
Em modalidades preferidas, as partículas de lipídeos (por exemplo, LNP) da invenção têm um diâmetro médio de cerca de 40 nm a cerca de 130 nm, de cerca de 40 nm a cerca de 120 nm, de cerca de 40 nm a cerca de 100 nm, de cerca de 50 nm a cerca de 120 nm, de cerca de 50 nm a cerca de 100 nm, de cerca de 60 nm a cerca de 120 nm, de cerca de 60 nm a cerca de 110 nm, de cerca de 60 nm a cerca de 100 nm, de cerca de 60 nm a cerca de 90 nm, de cerca de 60 nm a cerca de 80 nm, de cerca de 70 nm a cerca de 120 nm, de cerca de 70 nm a cerca de 110 nm, de cerca de 70 nm a cerca de 100 nm, de cerca de 70 nm a cerca de 90 nm, de cerca de 70 nm a cerca de 80 nm, ou menos que cerca de 120 nm, 110 nm, 100 nm, 90 nm ou 80 nm (ou qualquer fração dos mesmos ou intervalo entre eles).
[00109] Em uma modalidade específica da invenção, o LNP compreende: (a) uma ou mais moléculas de ácido nucleico não modificadas e / ou modificadas (por exemplo, RNA interferente que silencia a expressão do gene alvo, como siRNA, aiRNA, miRNA; ou mRNA que resulta em expressão da proteína alvo); (b) um lipídeo catiônico compreendendo de cerca de 56,5% em mol a cerca de 66,5% em mol do lipídeo total presente na partícula; (c) um lipídeo não catiônico compreendendo de cerca de 31,5% em mol a cerca de 42,5% em mol do lipídeo total presente na partícula; e (d) um lipídeo conjugado que inibe a agregação de partículas compreendendo de cerca de 1% em mol a cerca de 2% em mol do lipídeo total presente na partícula. Esta modalidade específica de LNP é geralmente referida neste documento como a formulação "1:62". Em uma modalidade preferida, o lipídeo catiônico é DLinDMA ou DLin-K-C2-DMA ("XTC2"), o lipídeo não catiônico é o colesterol e o lipídeo conjugado é um conjugado PEG-DAA. Embora estas sejam modalidades preferidas da formulação 1:62, aqueles versados na técnica apreciarão que outros lipídeos catiônicos, lipídeos não catiônicos (incluindo outros derivados de colesterol) e lipídeos conjugados podem ser usados na formulação 1:62 como descrito aqui.
[00110] Em outra modalidade específica da invenção, o LNP compreende: (a) uma ou mais moléculas de ácido nucleico não modificadas e /
ou modificadas (por exemplo, RNA interferente que silencia a expressão do gene alvo, como siRNA, aiRNA, miRNA; ou mRNA que resulta em expressão da proteína alvo); (b) um lipídeo catiônico compreendendo de cerca de 52% em mol a cerca de 62% em mol do lipídeo total presente na partícula; (c) um lipídeo não catiônico compreendendo de cerca de 36% em mol a cerca de 47% em mol do lipídeo total presente na partícula; e (d) um lipídeo conjugado que inibe a agregação de partículas compreendendo de cerca de 1% em mol a cerca de 2%
em mol do lipídeo total presente na partícula.
Esta modalidade específica de LNP é geralmente referida neste documento como a formulação "1:57". Em uma modalidade preferida, o lipídeo catiônico é DLinDMA ou DLin-K-C2-DMA
("XTC2"), o lipídeo não catiônico é uma mistura de um fosfolipídeo (como DPPC)
e colesterol, em que o fosfolipídeo compreende cerca de 5% em mol a cerca de
9% em mol do lipídeo total presente na partícula (por exemplo, cerca de 7,1% em mol) e o colesterol (ou derivado do colesterol) compreende de cerca de 32% em mol a cerca de 37% em mol do total de lipídeo presente na partícula (por exemplo, cerca de 34,3% em mol), e o PEG-lipídeo é um PEG-DAA (por exemplo, PEG-cDMA). Em outra modalidade preferida, o lipídeo catiônico é
DLinDMA ou DLin-K-C2-DMA ("XTC2"), o lipídeo não catiônico é uma mistura de um fosfolipídeo (tal como DPPC) e colesterol, em que o fosfolipídeo compreende cerca de 15% em mol a cerca de 25% em mol do lipídeo total presente na partícula (por exemplo, cerca de 20% em mol) e o colesterol (ou derivado do colesterol) compreende de cerca de 15% em mol a cerca de 25% em mol do lipídeo total presente na partícula (por exemplo, cerca de 20% em mol), e o
PEG-lipídeo é um PEG-DAA (por exemplo, PEG-cDMA). Embora estas sejam modalidades preferidas da formulação 1:57, aqueles versados na técnica apreciarão que outros lipídeos catiônicos, lipídeos não catiônicos (incluindo outros fosfolipídeos e outros derivados do colesterol) e lipídeos conjugados podem ser usados na formulação 1:57 como descrito aqui.
[00111] Em modalidades preferidas, a formulação 1:62 LNP é um sistema de três componentes que é livre de fosfolipídeos e compreende cerca de 1,5% em mol de PEG-cDMA (ou PEG-IDSA), cerca de 61,5% em mol de DLinDMA (ou XTC2) e cerca de 36,9% em mol de colesterol (ou derivado dos mesmos). Em outras modalidades preferidas, a formulação de LNP 1:57 é um sistema de quatro componentes que compreende cerca de 1,4% em mol de PEG-cDMA (ou PEG-cDSA), cerca de 57,1% em mol de DLinDMA (ou XTC2), cerca de 7,1% em mol de DPPC, e cerca de 34,3% em mol de colesterol (ou derivado do mesmo). Em ainda outras modalidades preferidas, a formulação de LNP 1:57 é um sistema de quatro componentes que compreende cerca de 1,4% em mol de PEG-cDMA (ou PEG-cDSA), cerca de 57,1% em mol de DLinDMA (ou XTC2), cerca de 20% em mol de DPPC, e cerca de 20% em mol de colesterol (ou derivado do mesmo). Deve ser entendido que essas formulações de LNP são formulações alvo e que a quantidade de lipídeo (catiônico e não catiônico) presente e a quantidade de conjugado de lipídeo presente nas formulações de LNP podem variar.
[00112] A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica compreendendo uma partícula de lipídeo (por exemplo, LNP) aqui descrita e um transportador farmaceuticamente aceitável.
[00113] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método para a introdução de um ou mais agentes ativos ou agentes terapêuticos (por exemplo, ácido nucleico) em uma célula, compreendendo contatar a célula com uma partícula de lipídeo (por exemplo, LNP) aqui descrita.
Em uma modalidade, a célula está em um mamífero e o mamífero é um humano.
Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para distribuição in vivo de um ou mais agentes ativos ou agentes terapêuticos (por exemplo, ácido nucleico), compreendendo administrar a um sujeito mamífero uma partícula de lipídeo (por exemplo, LNP) aqui descrita. Em uma modalidade preferida, o modo de administração inclui, mas não está limitado a, oral, intranasal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra-articular, intralesional, intratraqueal, subcutânea e intradérmica. De preferência, o sujeito mamífero é um humano.
[00114] Em uma modalidade, pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20% ou 25% da dose total injetada das partículas de lipídeos (por exemplo, LNP) está presente no plasma a cerca de 8, 12, 24, 36 ou 48 horas após a injeção. Em outras modalidades, mais que cerca de 20%, 30%, 40% e tanto quanto cerca de 60%, 70% ou 80% da dose total injetada das partículas de lipídeos (por exemplo, LNP) está presente no plasma a cerca de 8, 12, 24, 36 ou 48 horas após a injeção. Em certos casos, mais de cerca de 10% de uma pluralidade de partículas está presente no plasma de um mamífero cerca de 1 hora após a administração. Em certos outros casos, a presença das partículas de lipídeos (por exemplo, LNP) é detectável pelo menos cerca de 1 hora após a administração da partícula. Em certas modalidades, a presença de um agente ativo ou agente terapêutico, como um RNA interferente (por exemplo, siRNA) ou mRNA é detectável em células de cerca de 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72 ou 96 horas após a administração (por exemplo, pulmão, fígado, tumor ou em um local de inflamação). Em outras modalidades, a infrarregulação da expressão de uma sequência alvo por um agente ativo ou agente terapêutico, tal como um RNA interferente (por exemplo, siRNA) é detectável em cerca de 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72 ou 96 horas após administração. Em ainda outras modalidades, a infrarregulação da expressão de uma sequência alvo por um agente ativo ou agente terapêutico, como um RNA interferente (por exemplo, siRNA) ocorre preferencialmente em células tumorais ou em células em um local de inflamação.
Em outras modalidades, a presença ou efeito de um agente ativo ou agente terapêutico, como um RNA interferente (por exemplo, siRNA) em células em um local proximal ou distal ao local de administração ou em células do pulmão, fígado ou tumor é detectável em cerca de 12, 24, 48, 72 ou 96 horas, ou em cerca de 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 22, 24, 26 ou 28 dias após a administração. Em outras modalidades, a suprarregulação da expressão de uma sequência alvo por um agente ativo ou agente terapêutico, tal como um mRNA ou RNA de autoamplificação é detectável em cerca de 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72 ou 96 horas após a administração. Em ainda outras modalidades, a suprarregulação da expressão de uma sequência alvo por um agente ativo ou agente terapêutico, como um mRNA ou RNA de autoamplificação ocorre preferencialmente em células tumorais ou em células em um local de inflamação.
Em outras modalidades, a presença ou efeito de um agente ativo ou agente terapêutico, como um mRNA ou RNA de autorreplicação em células em um local proximal ou distal ao local de administração ou em células do pulmão, fígado ou tumor é detectável em cerca de 12, 24, 48, 72 ou 96 horas, ou em cerca de 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 22, 24, 26 ou 28 dias após a administração. Em modalidades adicionais, as partículas de lipídeos (por exemplo, LNP) da invenção são administradas parenteralmente ou intraperitonealmente.
[00115] Em algumas modalidades, as partículas de lipídeos (por exemplo, LNP) da invenção são particularmente úteis em métodos para a distribuição terapêutica de um ou mais ácidos nucleicos compreendendo uma sequência de RNA interferente (por exemplo, siRNA). Em particular, é um objetivo desta invenção fornecer métodos in vitro e in vivo para o tratamento de uma doença ou distúrbio em um mamífero (por exemplo, um roedor, como um camundongo ou um primata, como um humano, chimpanzé ou macaco) por infrarregulação ou silenciamento da transcrição e / ou tradução de uma ou mais sequências de ácido nucleico alvo ou genes de interesse. Como um exemplo não limitativo, os métodos da invenção são úteis para a distribuição in vivo de RNA interferente (por exemplo, siRNA) ao fígado e / ou tumor de um sujeito mamífero. Em certas modalidades, a doença ou distúrbio está associado à expressão e / ou superexpressão de um gene e a expressão ou superexpressão do gene é reduzida pelo RNA interferente (por exemplo, siRNA). Em certas outras modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz da partícula de lipídeo (por exemplo, LNP) pode ser administrada ao mamífero. Em alguns casos, um RNA interferente (por exemplo, siRNA) é formulado em um LNP e as partículas são administradas a pacientes que necessitam de tal tratamento. Em outros casos, as células são removidas de um paciente, o RNA interferente (por exemplo, siRNA) é distribuído in vitro (por exemplo, usando um LNP aqui descrito) e as células são reinjetadas no paciente.
[00116] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece partículas de lipídeos (por exemplo, LNP) compreendendo moléculas de RNA interferente assimétrica (aiRNA) que silenciam a expressão de um gene alvo e métodos de uso de tais partículas para silenciar a expressão do gene alvo.
[00117] Em uma modalidade, a molécula de aiRNA compreende uma região de fita dupla (duplex) de cerca de 10 a cerca de 25 (pares de bases) nucleotídeos de comprimento, em que a molécula de aiRNA compreende uma fita antissentido compreendendo saliências 5′ e 3′, e em que a molécula de aiRNA é capaz de silenciar a expressão do gene alvo.
[00118] Em certos casos, a molécula de aiRNA compreende uma região de fita dupla (duplex) de cerca de 12-20, 12-19, 12-18, 13-17 ou 14-17 (pares de bases) nucleotídeos de comprimento, mais tipicamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleotídeos (pares de bases) de comprimento. Em certos outros casos, as saliências 5' e 3' na fita antissentido compreendem sequências que são complementares à sequência de RNA alvo e podem, opcionalmente, compreender ainda sequências não direcionadas. Em algumas modalidades, cada uma das saliências 5′ e 3′ na fita antissentido compreende ou consiste em um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou mais nucleotídeos.
[00119] Em outras modalidades, a molécula de aiRNA compreende nucleotídeos modificados selecionados do grupo que consiste em nucleotídeos 2'OMe, nucleotídeos 2′F, 2′-desoxinucleotídeos, nucleotídeos 2′-O-MOE, nucleotídeos LNA e misturas dos mesmos. Em uma modalidade preferida, a molécula de aiRNA compreende nucleotídeos 2'OMe. Como um exemplo não limitativo, os nucleotídeos 2′OMe podem ser selecionados do grupo que consiste em nucleotídeos 2'OMe-guanosina, nucleotídeos 2'OMe-uridina e misturas dos mesmos.
[00120] Em um aspecto relacionado, a presente invenção fornece partículas de lipídeos (por exemplo, LNP) compreendendo moléculas de microRNA (miRNA) que silenciam a expressão de um gene alvo e métodos de uso de tais composições para silenciar a expressão do gene alvo.
[00121] Em uma modalidade, a molécula de miRNA compreende cerca de 15 a cerca de 60 nucleotídeos de comprimento, em que a molécula de miRNA é capaz de silenciar a expressão do gene alvo.
[00122] Em certos casos, a molécula de miRNA compreende cerca de 15-50, 15-40 ou 15-30 nucleotídeos de comprimento, mais tipicamente cerca de 15-25 ou 19-25 nucleotídeos de comprimento e têm preferencialmente cerca de 20-24, 21-22, ou 21-23 nucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade preferida, a molécula de miRNA é uma molécula de miRNA madura direcionada a uma sequência de RNA de interesse.
[00123] Em algumas modalidades, a molécula de miRNA compreende nucleotídeos modificados selecionados do grupo que consiste em nucleotídeos 2'OMe, nucleotídeos 2′F, 2′-desoxinucleotídeos, nucleotídeos 2′-O-MOE, nucleotídeos LNA e misturas dos mesmos. Em uma modalidade preferida, a molécula de miRNA compreende nucleotídeos 2'OMe. Como um exemplo não limitativo, os nucleotídeos 2′OMe podem ser selecionados do grupo que consiste em nucleotídeos 2'OMe-guanosina, nucleotídeos 2'OMe-uridina e misturas dos mesmos.
[00124] Em algumas modalidades, as partículas de lipídeos (por exemplo, LNP) da invenção são úteis em métodos para a distribuição terapêutica de uma ou mais moléculas de mRNA. Em particular, é um objetivo desta invenção fornecer métodos in vitro e in vivo para o tratamento de uma doença ou distúrbio em um mamífero (por exemplo, um roedor, como um camundongo ou um primata, como um humano, chimpanzé ou macaco) através da expressão de uma ou mais proteínas alvo. Como um exemplo não limitativo, os métodos da invenção são úteis para a distribuição in vivo de uma ou mais moléculas de mRNA a um sujeito mamífero. Em certas outras modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz da partícula de lipídeo (por exemplo, LNP) pode ser administrada ao mamífero. Em alguns casos, uma ou mais moléculas de mRNA são formuladas em um LNP e as partículas são administradas a pacientes que requerem tal tratamento. Em outros casos, as células são removidas de um paciente, uma ou mais moléculas de mRNA são distribuídas in vitro (por exemplo, usando um LNP aqui descrito) e as células são reinjetadas no paciente.
[00125] Em outras modalidades, a molécula de mRNA compreende nucleotídeos modificados selecionados do grupo que consiste em nucleotídeos 2'OMe, nucleotídeos 2′F, 2′-desoxinucleotídeos, nucleotídeos 2′-O-MOE, nucleotídeos LNA e misturas dos mesmos. Em um aspecto relacionado, a presente invenção fornece partículas de lipídeos (por exemplo, LNP) compreendendo moléculas de microRNA (miRNA) que silenciam a expressão de um gene alvo e métodos de uso de tais composições para silenciar a expressão do gene alvo.
[00126] Como tal, as partículas de lipídeos da invenção (por exemplo, LNP) são vantajosas e adequadas para uso na administração de agentes ativos ou agentes terapêuticos, tais como ácido nucleico (por exemplo,
RNA interferente como siRNA, aiRNA e / ou miRNA; ou mRNA) para um sujeito (por exemplo, um mamífero como um ser humano) porque eles são estáveis em circulação, de um tamanho necessário para o comportamento farmacodinâmico resultando em acesso a locais extravasculares, e são capazes de atingir populações de células alvo.
Agentes Ativos
[00127] Agentes ativos (por exemplo, agentes terapêuticos) incluem qualquer molécula ou composto capaz de exercer um efeito desejado em uma célula, tecido, órgão ou sujeito. Esses efeitos podem ser, por exemplo, biológicos, fisiológicos e / ou cosméticos. Os agentes ativos podem ser qualquer tipo de molécula ou composto, incluindo, mas não se limitando a, ácidos nucleicos, peptídeos, polipeptídeos, moléculas pequenas e misturas dos mesmos. Exemplos não limitativos de ácidos nucleicos incluem moléculas de RNA interferentes (por exemplo, siRNA, aiRNA, miRNA), oligonucleotídeos antissentido, mRNA, RNA autoamplificante, plasmídeos, ribozimas, oligonucleotídeos imunoestimulatórios e misturas dos mesmos. Exemplos de peptídeos ou polipeptídeos incluem, sem limitação, anticorpos (por exemplo, anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, fragmentos de anticorpos; anticorpos humanizados, anticorpos recombinantes, anticorpos humanos recombinantes, anticorpos Primatized™), citocinas, fatores de crescimento, fatores apoptóticos, fatores indutores de diferenciação, receptores de superfície celular e seus ligandos, hormônios e misturas dos mesmos. Exemplos de moléculas pequenas incluem, mas não estão limitados a, pequenas moléculas ou compostos orgânicos, tais como qualquer agente convencional ou droga conhecida pelos versados na técnica.
[00128] Em algumas modalidades, o agente ativo é um agente terapêutico, ou um sal ou derivado do mesmo. Os derivados do agente terapêutico podem ser eles próprios terapeuticamente ativos ou podem ser pró-drogas, que se tornam ativas após modificação posterior. Assim, em uma modalidade, um derivado de agente terapêutico retém parte ou toda a atividade terapêutica em comparação com o agente não modificado, enquanto em outra modalidade, um derivado de agente terapêutico é uma pró-droga que carece de atividade terapêutica, mas se torna ativa após modificação posterior.
Ácidos Nucleicos
[00129] Em certas modalidades, as partículas de lipídeos da presente invenção estão associadas a um ácido nucleico, resultando em uma partícula de lipídeo de ácido nucleico (por exemplo, LNP). Em algumas modalidades, o ácido nucleico é totalmente encapsulado na partícula de lipídeo.
Como utilizado neste documento, o termo "ácido nucleico" inclui qualquer oligonucleotídeo ou polinucleotídeo, com fragmentos contendo até 60 nucleotídeos geralmente denominados oligonucleotídeos e fragmentos mais longos denominados polinucleotídeos. Em modalidades particulares, os oligonucleotídeos da invenção têm cerca de 15 a cerca de 60 nucleotídeos de comprimento. O ácido nucleico pode ser administrado sozinho nas partículas de lipídeos da invenção, ou em combinação (por exemplo, coadministrado) com partículas de lipídeos da invenção compreendendo peptídeos, polipeptídeos ou pequenas moléculas, tais como drogas convencionais.
[00130] No contexto desta invenção, os termos "polinucleotídeo" e "oligonucleotídeo" referem-se a um polímero ou oligômero de nucleotídeo ou monômeros de nucleosídeo consistindo em bases de ocorrência natural, açúcares e ligações interaçúcar (espinha dorsal). Os termos "polinucleotídeo" e "oligonucleotídeo" também incluem polímeros ou oligômeros compreendendo monômeros de ocorrência não natural, ou porções dos mesmos, que funcionam de forma semelhante. Esses oligonucleotídeos modificados ou substituídos são frequentemente preferidos em relação às formas nativas por causa de propriedades tais como, por exemplo, absorção celular intensificada, imunogenicidade reduzida e estabilidade aumentada na presença de nucleases.
[00131] Os oligonucleotídeos são geralmente classificados como desoxirribooligonucleotídeos ou ribo-oligonucleotídeos. Um desoxirribo-oligonucleotídeo consiste em um açúcar de 5 carbonos chamado desoxirribose unido covalentemente ao fosfato nos carbonos 5′ e 3′ desse açúcar para formar um polímero alternado não ramificado. Um ribo-oligonucleotídeo consiste em uma estrutura de repetição semelhante em que o açúcar de 5 carbonos é a ribose.
[00132] O ácido nucleico que está presente em uma partícula de lipídeo-ácido nucleico de acordo com esta invenção inclui qualquer forma de ácido nucleico que seja conhecida. Os ácidos nucleicos usados aqui podem ser DNA ou RNA de fita simples, ou DNA ou RNA de fita dupla, ou híbridos de DNA-RNA. Exemplos de DNA de fita dupla são descritos neste documento e incluem, por exemplo, genes estruturais, genes incluindo regiões de controle e de terminação e sistemas de autorreplicação, como DNA viral ou plasmídeo.
Exemplos de RNA de fita dupla são descritos neste documento e incluem, por exemplo, siRNA e outros agentes de RNAi, como aiRNA e pré-miRNA. Os ácidos nucleicos de fita simples incluem, por exemplo, oligonucleotídeos antissentido, ribozimas, miRNA maduro e oligonucleotídeos formadores de triplex.
[00133] Os ácidos nucleicos da invenção podem ter vários comprimentos, geralmente dependentes da forma particular de ácido nucleico.
Por exemplo, em modalidades particulares, plasmídeos ou genes podem ter de cerca de 1.000 a cerca de 100.000 resíduos de nucleotídeos de comprimento.
Em modalidades particulares, os oligonucleotídeos podem variar de cerca de 10 a cerca de 100 nucleotídeos de comprimento. Em várias modalidades relacionadas, os oligonucleotídeos, tanto de fita simples, dupla e tripla, podem variar em comprimento de cerca de 10 a cerca de 60 nucleotídeos, de cerca de
15 a cerca de 60 nucleotídeos, de cerca de 20 a cerca de 50 nucleotídeos, de cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos, ou de cerca de 20 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento.
[00134] Em modalidades particulares, um oligonucleotídeo (ou um filamento do mesmo) da invenção hibrida especificamente ou é complementar a uma sequência de polinucleotídeo alvo. Os termos "especificamente hibridável" e "complementar", conforme usados neste documento, indicam um grau suficiente de complementaridade, de modo que a ligação estável e específica ocorra entre o DNA ou RNA alvo e o oligonucleotídeo. Entende-se que um oligonucleotídeo não precisa ser 100% complementar à sua sequência de ácido nucleico alvo para ser especificamente hibridável. Em modalidades preferidas, um oligonucleotídeo é especificamente hibridável quando a ligação do oligonucleotídeo à sequência alvo interfere com a função normal da sequência alvo para causar uma perda de utilidade ou expressão a partir dela, e há um grau suficiente de complementaridade para evitar ligação não específica do oligonucleotídeo a sequências não alvo sob condições em que a ligação específica é desejada, isto é, sob condições fisiológicas no caso de ensaios in vivo ou tratamento terapêutico, ou, no caso de ensaios in vitro, sob condições nas quais os ensaios são conduzidos. Assim, o oligonucleotídeo pode incluir 1, 2, 3 ou mais substituições de bases em comparação com a região de um gene ou sequência de mRNA que está direcionado ou com a qual hibrida especificamente.
siRNA
[00135] O componente de siRNA das partículas de lipídeos de ácido nucleico da presente invenção é capaz de silenciar a expressão de um gene alvo de interesse. Cada fita do duplex de siRNA tem tipicamente cerca de 15 a cerca de 60 nucleotídeos de comprimento, de preferência cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento. Em certas modalidades, o siRNA compreende pelo menos um nucleotídeo modificado. O siRNA modificado é geralmente menos imunoestimulatório do que uma sequência de siRNA não modificada correspondente e retém a atividade de RNAi contra o gene alvo de interesse. Em algumas modalidades, o siRNA modificado contém pelo menos um 2′OMe purina ou nucleotídeo de pirimidina, como nucleotídeo 2′OMe-guanosina, 2′OMe-uridina, 2′OMe-adenosina e / ou 2′OMe-citosina. Em modalidades preferidas, um ou mais dos nucleotídeos de uridina e / ou guanosina são modificados. Os nucleotídeos modificados podem estar presentes em uma fita (ou seja, sentido ou antissentido) ou em ambas as fitas do siRNA. As sequências de siRNA podem ter saliências (por exemplo, saliências 3' ou 5', conforme descrito em Elbashir et al., Genes Dev., 15:188 (2001) ou Nykänen et al., Cell, 107:309 (2001)), ou podem não ter saliências (ou seja, ter extremidades cegas).
[00136] O siRNA modificado geralmente compreende de cerca de 1% a cerca de 100% (por exemplo, cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%) nucleotídeos modificados na região de fita dupla do duplex de siRNA. Em certas modalidades, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais dos nucleotídeos na região de fita dupla do siRNA compreendem nucleotídeos modificados.
[00137] Em algumas modalidades, menos de cerca de 25% (por exemplo, menos de cerca de 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1%) dos nucleotídeos na região de fita dupla do siRNA compreende nucleotídeos modificados.
[00138] Em outras modalidades, de cerca de 1% a cerca de 25% (por exemplo, de cerca de 1%-25%, 2%-25%, 3%-25%, 4%-25%, 5%-25%,
6%-25%, 7%-25%, 8%-25%, 9%-25%, 10%-25%, 11%-25%, 12%-25%, 13%-25%, 14%-25%, 15%-25%, 16%-25%, 17%-25%, 18%-25%, 19%-25%, 20%-25%, 21%-25%, 22%-25%, 23%-25%, 24%-25%, etc.) ou de cerca de 1% a cerca de 20% (por exemplo, de cerca de 1%-20%, 2%-20%, 3%-20%, 4%-20%, 5%-20%, 6%-20%, 7%-20%, 8%-20%, 9%-20%, 10%-20%, 11%-20%, 12%-20%, 13%-20%, 14%-20%, 15%-20%, 16%-20%, 17%-20%, 18%-20%, 19%-20%, 1%-19%, 2%-19%, 3%-19%, 4%-19%, 5%-19%, 6%-19%, 7%-19%, 8%-19%, 9%-19%, 10%-19%, 11%-19%, 12%-19%, 13%-19%, 14%-19%, 15%-19%, 16%-19%, 17%-19%, 18%-19%, 1%-18%, 2%-18%, 3%-18%, 4%-18%, 5%-18%, 6%-18%, 7%-18%, 8%-18%, 9%-18%, 10%-18%, 11%-18%, 12%-18%, 13%-18%, 14%-18%, 15%-18%, 16%-18%, 17%-18%, 1%-17%, 2%-17%, 3%-17%, 4%-17%, 5%-17%, 6%-17%, 7%-17%, 8%-17%, 9%-17%, 10%-17%, 11%-17%, 12%-17%, 13%-17%, 14%-17%, 15%-17%, 16%-17%, 1%-16%, 2%-16%, 3%-16%, 4%-16%, 5%-16%, 6%-16%, 7%-16%, 8%-16%, 9%-16%, 10%-16%, 11%-16%, 12%-16%, 13%-16%, 14%-16%, 15%-16%, 1%-15%, 2%-15%, 3%-15%, 4%-15%, 5%-15%, 6%-15%, 7%-15%, 8%-15%, 9%-15%, 10%-15%, 11%-15%, 12%-15%, 13%-15%, 14%-15%, etc.) dos nucleotídeos na região de fita dupla do siRNA compreendem nucleotídeos modificados.
[00139] Em outras modalidades, por exemplo, quando uma ou ambas as fitas do siRNA são modificadas seletivamente em nucleotídeos de uridina e / ou guanosina, o siRNA modificado resultante pode compreender menos de cerca de 30% de nucleotídeos modificados (por exemplo, menos de cerca de 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% de nucleotídeos modificados) ou de cerca de 1% a cerca de 30% de nucleotídeos modificados (por exemplo, de cerca de 1% -30%, 2% -30%, 3% -30%, 4% -30%, 5% -30%, 6% -30%, 7% -30%, 8% -30%, 9% -30%, 10% -30%,
11% -30%, 12% -30%, 13% -30%, 14% -30%, 15% -30%, 16% -30%, 17% -30%, 18% -30%, 19% -30%, 20% -30%, 21% -30%, 22% -30%, 23% -30%, 24% -30%, 25% - 30%, 26% -30%, 27% -30%, 28% -30% ou 29% -30% de nucleotídeos modificados).
Seleção de sequências de siRNA
[00140] Sequências de siRNA adequadas podem ser identificadas usando qualquer meio conhecido na técnica. Normalmente, os métodos descritos em Elbashir et al., Nature, 411:494-498 (2001) and Elbashir et al., EMBO J., 20:6877-6888 (2001) are combined with rational design rules set forth in Reynolds et al., Nature Biotech., 22(3):326-330 (2004).
[00141] Geralmente, a sequência de nucleotídeos 3' do códon de início AUG de um transcrito do gene alvo de interesse é varrida para sequências de dinucleotídeos (por exemplo, AA, NA, CC, GG ou UU, em que N═C, G ou U) (ver, por exemplo, Elbashir et al., EMBO J., 20:6877-6888 (2001)).
Os nucleotídeos imediatamente 3' para as sequências de dinucleotídeos são identificados como sequências de siRNA potenciais (isto é, uma sequência alvo ou uma sequência de fita de sentido). Normalmente, os 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35 ou mais nucleotídeos imediatamente 3' para as sequências de dinucleotídeos são identificados como sequências de siRNA potenciais. Em algumas modalidades, a sequência de dinucleotídeo é uma sequência AA ou NA e os 19 nucleotídeos imediatamente 3' para o dinucleotídeo AA ou NA são identificados como sequências de siRNA potenciais. As sequências de siRNA são geralmente espaçadas em diferentes posições ao longo do comprimento do gene alvo. Para aumentar ainda mais a eficiência de silenciamento das sequências de siRNA, as sequências de siRNA potenciais podem ser analisadas para identificar locais que não contêm regiões de homologia com outras sequências de codificação, por exemplo, na célula ou organismo alvo. Por exemplo, uma sequência de siRNA adequada de cerca de 21 pares de bases normalmente não terá mais de 16-17 pares de bases contíguas de homologia com as sequências de codificação na célula ou organismo alvo. Se as sequências de siRNA forem expressas a partir de um promotor de RNA Pol III, as sequências de siRNA sem mais de 4 A ou T contíguos são selecionadas.
[00142] Uma vez que uma sequência de siRNA potencial foi identificada, uma sequência complementar (ou seja, uma sequência de fita antissentido) pode ser projetada. Uma sequência de siRNA potencial também pode ser analisada usando uma variedade de critérios conhecidos na técnica.
Por exemplo, para intensificar sua eficiência de silenciamento, as sequências de siRNA podem ser analisadas por um algoritmo de projeto racional para identificar sequências que têm uma ou mais das seguintes características: (1) teor de G / C de cerca de 25% a cerca de 60% G / C; (2) pelo menos 3 A / Us nas posições 15-19 da fita de sentido; (3) sem repetições internas; (4) um A na posição 19 da fita de sentido; (5) um A na posição 3 da fita de sentido; (6) um U na posição 10 da fita de sentido; (7) nenhum G / C na posição 19 da fita de sentido; e (8) nenhum G na posição 13 da fita de sentido. Ferramentas de projeto de siRNA que incorporam algoritmos que atribuem valores adequados para cada um desses recursos e são úteis para a seleção de siRNA podem ser encontradas em, por exemplo, http://boz094.ust.hk/RNAi/siRNA. Um versado na técnica apreciará que sequências com uma ou mais das características anteriores podem ser selecionadas para posterior análise e teste como sequências de siRNA potenciais.
[00143] Além disso, sequências de siRNA potenciais com um ou mais dos seguintes critérios podem frequentemente ser eliminadas como siRNA: (1) sequências compreendendo um trecho de 4 ou mais da mesma base em uma fileira; (2) sequências compreendendo homopolímeros de Gs (isto é, para reduzir possíveis efeitos não específicos devido às características estruturais desses polímeros; (3) sequências compreendendo motivos de base tripla (por exemplo, GGG, CCC, AAA ou TTT); (4) sequências que compreendem trechos de 7 ou mais G / Cs em uma fileira; e (5) sequências que compreendem repetições diretas de 4 ou mais bases dentro dos candidatos, resultando em estruturas de dobramento internas. No entanto, um versado na técnica apreciará que as sequências com uma ou mais das características anteriores ainda podem ser selecionadas para análise e teste adicionais como sequências de siRNA potenciais.
[00144] Em algumas modalidades, as sequências de siRNA potenciais podem ser ainda analisadas com base na assimetria do duplex de siRNA conforme descrito em, por exemplo, Khvorova et al., Cell, 115:209-216 (2003); and Schwarz et al., Cell, 115:199-208 (2003). Em outras modalidades, as sequências de siRNA potenciais podem ser ainda analisadas com base na estrutura secundária no local alvo, conforme descrito em, por exemplo, Luo et al., Biophys. Res. Commun., 318:303-310 (2004). Por exemplo, a estrutura secundária no sítio alvo pode ser modelada usando o algoritmo Mfold (disponível em http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/rna/form1.cgi) para selecionar sequências de siRNA que favorecem a acessibilidade no sítio alvo onde menos estrutura secundária na forma de emparelhamento de bases e alças de haste está presente.
[00145] Uma vez que uma sequência de siRNA potencial tenha sido identificada, a sequência pode ser analisada quanto à presença de quaisquer propriedades imunoestimulatório, por exemplo, usando um ensaio de citocina in vitro ou um modelo animal in vivo. Motivos na fita sentido e / ou antissentido da sequência de siRNA, como motivos ricos em GU (por exemplo, 5′-GU-3′,5′-UGU-3′,5′-GUGU-3′,5′-UGUGU-3′, etc.) também pode fornecer uma indicação de se a sequência pode ser imunoestimulatória. Uma vez que uma molécula de siRNA é considerada imunoestimulatória, ela pode então ser modificada para diminuir suas propriedades imunoestimulatória, conforme descrito neste documento. Como um exemplo não limitativo, uma sequência de siRNA pode ser contatada com uma célula respondedora de mamífero sob condições tais que a célula produza uma resposta imune detectável para determinar se o siRNA é um siRNA imunoestimulatório ou não imunoestimulatório. A célula respondedora de mamífero pode ser de um mamífero ingênuo (isto é, um mamífero que não esteve anteriormente em contato com o produto do gene da sequência de siRNA). A célula respondedora de mamífero pode ser, por exemplo, uma célula mononuclear de sangue periférico (PBMC), um macrófago e semelhantes. A resposta imune detectável pode compreender a produção de uma citocina ou fator de crescimento, como, por exemplo, TNF-α, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-6, IL-12 ou uma combinação dos mesmos. Uma molécula de siRNA identificada como sendo imunoestimulatória pode então ser modificada para diminuir suas propriedades imunoestimulatórias substituindo pelo menos um dos nucleotídeos na fita sentido e / ou antissentido por nucleotídeos modificados. Por exemplo, menos de cerca de 30% (por exemplo, menos de cerca de 30%, 25%, 20%, 15%, 10% ou 5%) dos nucleotídeos na região de fita dupla do duplex de siRNA podem ser substituídos por nucleotídeos modificados, como nucleotídeos 2′OMe. O siRNA modificado pode então ser colocado em contato com uma célula respondedora de mamífero como descrito acima para confirmar que suas propriedades imunoestimulatórias foram reduzidas ou anuladas.
[00146] Os ensaios in vitro adequados para a detecção de uma resposta imune incluem, mas não estão limitados a, a técnica de imunoensaio em sanduíche com anticorpo monoclonal duplo de David et al. (Pat.
U.S. 4.376.110); ensaios em sanduíche de anticorpo monoclonal-policlonal (Wide et al., in Kirkham and Hunter, eds., Radioimmunoassay Methods, E. and S. Livingstone, Edinburgh (1970)); o método “Western blot” de Gordon et al. (Pat.
U.S. 4.452.901); imunoprecipitação de ligando marcado (Brown et al., J. Biol.
Chem. 255: 4980-4983 (1980)); ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA) conforme descrito, por exemplo, por Raines et al., J. Biol. Chem. 257: 5154-5160 (1982); técnicas imunocitoquímicas, incluindo o uso de fluorocromos (Brooks et al., Clin. Exp. Immunol., 39:477 (1980)); e neutralização da atividade (Bowen-Pope et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:2396-2400 (1984)). Além dos imunoensaios descritos acima, uma série de outros imunoensaios estão disponíveis, incluindo aqueles descritos na Pat. U.S. 3.817.827; 3.850.752;
3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; e 4.098.876. As divulgações dessas referências são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todos os fins.
[00147] Um exemplo não limitativo de um modelo in vivo para detectar uma resposta imune inclui um ensaio de indução de citocina de camundongo in vivo como descrito em, por exemplo, Judge et al., Mol. Ther., 13:494-505 (2006). Em certas modalidades, o ensaio pode ser realizado da seguinte forma: (1) o siRNA pode ser administrado por injeção intravenosa padrão na veia lateral da cauda; (2) o sangue pode ser coletado por punção cardíaca cerca de 6 horas após a administração e processado como plasma para análise de citocinas; e (3) as citocinas podem ser quantificadas usando kits de ELISA em sanduíche de acordo com as instruções do fabricante (por exemplo, IFN-α de camundongo e humano (PBL Biomedical; Piscataway, N.J.); IL-6 humana e TNF-α (eBioscience; San Diego, Califórnia .); e IL-6 de camundongo, TNF-α e IFN-γ (BD Biosciences; San Diego, Calif.)).
[00148] Os anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a citocinas e fatores de crescimento estão comercialmente disponíveis a partir de fontes múltiplas e podem ser gerados usando métodos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Kohler et al., Nature, 256: 495-497 (1975) and Harlow and Lane, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publication, New York (1999)). A geração de anticorpos monoclonais foi previamente descrita e pode ser realizada por qualquer meio conhecido na técnica (Buhring et al., in Hybridoma, Vol. 10, No. 1, pp. 77-78 (1991)). Em alguns métodos, o anticorpo monoclonal é marcado (por exemplo, com qualquer composição detectável por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, elétricos, ópticos ou químicos) para facilitar a detecção.
Gerando moléculas de siRNA
[00149] O siRNA pode ser fornecido em várias formas, incluindo, por exemplo, como um ou mais duplexes isolados de RNA interferente pequeno (siRNA), como RNA de fita dupla mais longo (dsRNA) ou como siRNA ou dsRNA transcrito de um cassete transcricional em um plasmídeo de DNA. As sequências de siRNA podem ter saliências (por exemplo, saliências 3' ou 5', conforme descrito em Elbashir et al., Genes Dev., 15:188 (2001) or Nykänen et al., Cell, 107:309 (2001)), ou podem não ter saliências (ou seja, ter extremidades cegas).
[00150] Uma população de RNA pode ser usada para fornecer RNAs precursores longos, ou RNAs precursores longos que têm identidade substancial ou completa com uma sequência alvo selecionada podem ser usados para fazer o siRNA. Os RNAs podem ser isolados de células ou tecido, sintetizados e / ou clonados de acordo com métodos bem conhecidos pelos versados na técnica. O RNA pode ser uma população mista (obtida de células ou tecido, transcrita de cDNA, subtraída, selecionada, etc.) ou pode representar uma única sequência alvo. O RNA pode ocorrer naturalmente (por exemplo, isolado de tecido ou amostras de células), sintetizado in vitro (por exemplo, usando polimerase T7 ou SP6 e produtos de PCR ou um cDNA clonado) ou sintetizado quimicamente.
[00151] Para formar um dsRNA longo, para RNAs sintéticos, o complemento também é transcrito in vitro e hibridado para formar um dsRNA.
Se uma população de RNA de ocorrência natural for utilizada, os complementos de RNA também são fornecidos (por exemplo, para formar dsRNA para digestão por E. coli RNAse III ou Dicer), por exemplo, pela transcrição de cDNAs correspondentes à população de RNA ou pelo uso de polimerases de RNA. Os RNAs precursores são então hibridados para formar RNAs de fita dupla para digestão. Os dsRNAs podem ser administrados diretamente a um sujeito ou podem ser digeridos in vitro antes da administração.
[00152] Métodos para isolar RNA, sintetizar RNA, hibridar ácidos nucleicos, fazer e rastrear bibliotecas de cDNA e realizar PCR são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Gubler and Hoffman, Gene, 25:263-269 (1983); Sambrook et al., supra; Ausubel et al., supra), assim como os métodos de PCR (ver, Pat. U.S. 4.683.195 e 4.683.202; Protocolos PCR: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990)). Bibliotecas de expressão também são bem conhecidas pelos versados na técnica. Textos básicos adicionais que revelam os métodos gerais de utilização nesta invenção incluem Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed.
1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994). As divulgações dessas referências são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todos os fins.
[00153] De preferência, os siRNAs são sintetizados quimicamente. Os oligonucleotídeos que compreendem as moléculas de siRNA da invenção podem ser sintetizados usando qualquer uma de uma variedade de técnicas conhecidas na técnica, tais como aquelas descritas em Usman et al., J.
Am. Chem. Soc., 109:7845 (1987); Scaringe et al., Nucl. Acids Res., 18:5433 (1990); Wincott et al., Nucl. Acids Res., 23:2677-2684 (1995); e Wincott et al., Methods Mol. Bio., 74:59 (1997). A síntese de oligonucleotídeos faz uso de grupos de proteção e acoplamento de ácido nucleico comuns, como dimetoxitritil na extremidade 5' e fosforamiditos na extremidade 3'. Como um exemplo não limitativo, sínteses em pequena escala podem ser conduzidas em um sintetizador Applied Biosystems usando um protocolo de escala de 0,2 μmol.
Alternativamente, as sínteses na escala de 0,2 μmol podem ser realizadas em um sintetizador de placa de 96 poços da Protogene (Palo Alto, Califórnia). No entanto, uma escala maior ou menor de síntese também está dentro do escopo desta invenção. Reagentes adequados para a síntese de oligonucleotídeos, métodos para desprotecção de RNA e métodos para purificação de RNA são conhecidos pelos versados na técnica.
[00154] As moléculas de siRNA também podem ser sintetizadas por meio de uma técnica de síntese em tandem, em que ambas as fitas são sintetizadas como um único fragmento de oligonucleotídeo contínuo ou fita separada por um ligante clivável que é subsequentemente clivado para fornecer fragmentos separados ou fitas que hibridam para formar o duplex de siRNA. O ligante pode ser um ligante polinucleotídico ou um ligante não nucleotídico. A síntese em tandem de siRNA pode ser prontamente adaptada para plataformas de síntese de múltiplos poços / placas múltiplas, bem como plataformas de síntese em grande escala que empregam reatores em lote, colunas de síntese e semelhantes. Alternativamente, as moléculas de siRNA podem ser montadas a partir de dois oligonucleotídeos distintos, em que um oligonucleotídeo compreende a fita sentido e o outro compreende a fita antissentido do siRNA. Por exemplo, cada fita pode ser sintetizada separadamente e unida por hibridação ou ligação após síntese e / ou desproteção. Em certos outros casos, as moléculas de siRNA podem ser sintetizadas como um único fragmento de oligonucleotídeo contínuo, onde as regiões de sentido e antissentido autocomplementares hibridam para formar um duplex de siRNA com estrutura secundária em hairpin.
Modificando Sequências de siRNA
[00155] Em certos aspectos, as moléculas de siRNA compreendem um duplex com duas fitas e pelo menos um nucleotídeo modificado na região de fita dupla, em que cada fita tem cerca de 15 a cerca de 60 nucleotídeos de comprimento. Vantajosamente, o siRNA modificado é menos imunoestimulatório do que uma sequência de siRNA não modificada correspondente, mas retém a capacidade de silenciar a expressão de uma sequência alvo. Em modalidades preferidas, o grau de modificações químicas introduzidas na molécula de siRNA atinge um equilíbrio entre a redução ou anulação das propriedades imunoestimulatórias do siRNA e a retenção da atividade de RNAi. Como um exemplo não limitativo, uma molécula de siRNA que direciona um gene de interesse pode ser minimamente modificada (por exemplo, menos de cerca de 30%, 25%, 20%, 15%, 10% ou 5% modificada) na uridina seletiva e / ou nucleotídeos de guanosina dentro do duplex de siRNA para eliminar a resposta imune gerada pelo siRNA enquanto retém sua capacidade de silenciar a expressão do gene alvo.
[00156] Exemplos de nucleotídeos modificados adequados para uso na invenção incluem, mas não estão limitados a, ribonucleotídeos tendo um grupo 2′-O-metil (2′OMe), 2′-desoxi-2′-fluoro (2′F), 2′-desoxi, 5-C-metil, 2'-O-(2-metoxietil) (MOE), 4'-tio, 2'-amino ou 2'-C-alil. Nucleotídeos modificados tendo uma conformação Northern, tais como aquelas descritas em, por exemplo, Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag Ed. (1984), também são adequados para uso em moléculas de siRNA. Esses nucleotídeos modificados incluem, sem limitação, nucleotídeos de ácido nucleico bloqueado (LNA) (por exemplo, nucleotídeos 2′-O, 4′-C-metileno-(D-ribofuranosil), nucleotídeos 2′-O-(2-metoxietil) (MOE), nucleotídeos 2′-metil-tio-etil, nucleotídeos 2′-desoxi-2′-fluoro (2′F), nucleotídeos 2′-desoxi-2′-cloro (2′Cl) e nucleotídeos 2′-azido. Em certos casos, as moléculas de siRNA aqui descritas incluem um ou mais nucleotídeos de grampo G. Um nucleotídeo de grampo G refere-se a um análogo de citosina modificado em que as modificações conferem a capacidade de ligação de hidrogênio ambas as faces Watson-Crick e Hoogsteen de um nucleotídeo guanina complementar dentro de um duplex (ver, por exemplo, Lin et al., J. Am. Chem. Soc., 120:8531-8532 (1998)). Além disso, os nucleotídeos com um análogo de base de nucleotídeo, como, por exemplo, C-fenil, C-naftil, outros derivados aromáticos, inosina, azol carboxamidas e derivados de nitroazol, como 3-nitropirrol, 4-nitroindol, 5-nitroindol e 6-nitroindol (ver, por exemplo, Loakes, Nucl. Acids Res., 29: 2437-2447 (2001)) podem ser incorporados em moléculas de siRNA.
[00157] Em certas modalidades, as moléculas de siRNA podem compreender ainda uma ou mais modificações químicas, como frações cap terminais, modificações na estrutura de fosfato e semelhantes. Exemplos de frações cap terminais incluem, sem limitação, resíduos desoxi abásicos invertidos, modificações de gliceril, 4′,5′-nucleotídeos de metileno, nucleotídeos 1-(β-D-eritrofuranosil), nucleotídeos 4′-tio, nucleotídeos carbocíclicos, nucleotídeos 1,5 -anidro-hexitol, L-nucleotídeos, α-nucleotídeos, nucleotídeos de base modificados, nucleotídeos treo-pentofuranosil, nucleotídeos acíclicos 3',4′-seco, nucleotídeos acíclicos 3,4-di-hidroxibutil, nucleotídeos acíclicos 3,5-di-hidroxipentil, nucleotídeos 3′-3′-invertidos, frações abásicas 3'-3' invertidas, frações de nucleotídeo invertido 3′-2′, frações abásicas invertidas 3′-2′, frações de nucleotídeo invertido 5′-5, frações abásicas invertidas 5′-5′, frações abásicas desoxi invertidas 3′-5′, 5′-amino-alquil fosfato, 1,3-diamino-2-propil fosfato, 3-aminopropil fosfato, 6-amino-hexil fosfato, 1,2-aminododecil fosfato, hidroxipropil fosfato, 1,4-butanodiol fosfato, 3′-fosforamidato, 5′-fosforamidato, hexilfosfato, amino-hexil fosfato, 3′-fosfato, 5′-amino, 3′-fosforotioato, 5′-fosforotioato, fosforoditioato e metilfosfonato em ponte ou sem ponte ou frações 5′-mercapto (ver, por exemplo, Pat. U.S.
5.998.203; Beaucage et al., Tetrahedron 49:1925 (1993)). Exemplos não limitativos de modificações da estrutura de fosfato (isto é, resultando em ligações internucleotídicas modificadas) incluem fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, fosfotriéster, morfolino, amidato, carbamato, carboximetil, acetamidato, poliamida, sulformaonato, sulfonamida, sulfotriéster, morfolino, amidato, carbamato, carboximetil, acetamidato, poliamida, sulformaonato, sulfonamida, sulfamato, formacetaliletal, substituições (ver, por exemplo, Hunziker et al., Nucleic Acid Analogues: Synthesis and Properties, in Modern Synthetic Methods, VCH, 331-417 (1995); Mesmaeker et al., Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides, in Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ACS, 24-39 (1994)). Essas modificações químicas podem ocorrer na extremidade 5' e / ou na extremidade 3' da fita sentido, da fita antissentido ou de ambas as fitas do siRNA. As divulgações dessas referências são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todos os fins.
[00158] Em algumas modalidades, a fita sentido e / ou antissentido da molécula de siRNA pode compreender ainda uma saliência do terminal 3' tendo cerca de 1 a cerca de 4 (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) ribonucleotídeos 2'-desoxi e / ou qualquer combinação de nucleotídeos modificados e não modificados. Exemplos adicionais de nucleotídeos modificados e tipos de modificações químicas que podem ser introduzidos em moléculas de siRNA são descritos, por exemplo, na Patente do Reino Unido GB
2.397.818 B e Publicação de Patente U.S. 20040192626, 20050282188 e 20070135372, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todos os fins.
[00159] As moléculas de siRNA aqui descritas podem compreender opcionalmente um ou mais não nucleotídeos em uma ou ambas as fitas do siRNA. Como utilizado neste documento, o termo "não nucleotídeo" refere-se a qualquer grupo ou composto que pode ser incorporado em uma cadeia de ácido nucleico no lugar de uma ou mais unidades de nucleotídeo, incluindo substituições de açúcar e / ou fosfato, e permite que as bases restantes exibam sua atividade. O grupo ou composto é básico por não conter uma base de nucleotídeo comumente reconhecida, como adenosina, guanina, citosina, uracila ou timina e, portanto, não possui uma base na posição l′.
[00160] Em outras modalidades, a modificação química do siRNA compreende anexar um conjugado à molécula de siRNA. O conjugado pode ser ligado na extremidade 5' e/ou 3' da fita sentido e / ou antissentido do siRNA por meio de uma ligação covalente como, por exemplo, um ligante biodegradável. O conjugado também pode ser ligado ao siRNA, por exemplo, através de um grupo carbamato ou outro grupo de ligação (ver, por exemplo, Publicação de Patente U.S. 20050074771, 20050043219 e 20050158727). Em certos casos, o conjugado é uma molécula que facilita a distribuição do siRNA em uma célula. Exemplos de moléculas de conjugado adequadas para ligação a siRNA incluem, sem limitação, esteroides, tais como colesterol, glicóis, tais como polietileno glicol (PEG), albumina de soro humano (HSA), ácidos graxos, carotenoides, terpenos, ácidos biliares, folatos (por exemplo, ácido fólico, análogos de folato e derivados dos mesmos), açúcares (por exemplo, galactose, galactosamina, N-acetil galactosamina, glicose, manose, frutose, fucose, etc.), fosfolipídeos, peptídeos, ligantes para receptores celulares capazes de mediar a absorção celular e combinações dos mesmos (ver, por exemplo, Publicação de Patente U.S. 20030130186, 20040110296 e 20040249178; Pat. U.S. 6.753.423).
Outros exemplos incluem a fração lipofílica, vitamina, polímero, peptídeo, proteína, ácido nucleico, molécula pequena, oligossacarídeo, grupamento de carboidrato, intercalador, aglutinante de sulco menor, agente de clivagem e moléculas de conjugado de agente de reticulação descritas na Publicação de Patente U.S. 20050119470 e 20050107325. Ainda outros exemplos incluem a 2′-O-alquil amina, 2′-β-alcoxialquil amina, poliamina, pirimidina C5-catiônica modificada, peptídeo catiônico, grupo guanidínio, grupo amidinínio, moléculas de conjugado de aminoácido catiônico descritas na Publicação de Patente U.S.
20050153337. Exemplos adicionais incluem o grupo hidrofóbico, composto ativo de membrana, composto de penetração celular, sinal de direcionamento de célula, modificador de interação e moléculas de conjugado de estabilizador estérico descrito na Publicação de Patente U.S. 20040167090. Outros exemplos incluem as moléculas de conjugado descritas na Publicação de Patente U.S.
20050239739. O tipo de conjugado usado e a extensão da conjugação com a molécula de siRNA podem ser avaliados para perfis farmacocinéticos melhorados, biodisponibilidade e / ou estabilidade do siRNA enquanto retém a atividade de RNAi. Como tal, um versado na técnica pode rastrear moléculas de siRNA com vários conjugados ligados às mesmas para identificar aquelas que têm propriedades melhoradas e total atividade de RNAi usando qualquer um de uma variedade de culturas de células in vitro bem conhecidas ou modelos animais in vivo. As divulgações dos documentos de patentes descritos acima são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todos os fins.
Genes Alvo
[00161] Em certas modalidades, o componente de ácido nucleico (por exemplo, siRNA) das partículas de lipídeos de ácido nucleico aqui descritas pode ser usado para infrarregular ou silenciar a tradução (ou seja, expressão) de um gene de interesse. Genes de interesse incluem, mas não estão limitados a, genes associados a infecção viral e sobrevivência, genes associados a doenças e distúrbios metabólicos (por exemplo, doenças e distúrbios hepáticos), genes associados a tumorigênese e transformação celular (por exemplo, câncer), genes angiogênicos, genes imunomodulatórios, tais como aqueles associados a respostas inflamatórias e autoimunes, genes de receptores de ligando e genes associados a distúrbios neurodegenerativos. Em certas modalidades, o gene de interesse é expresso em hepatócitos.
[00162] Os genes associados à infecção viral e à sobrevivência incluem aqueles expressos por um vírus para se ligar, entrar e se replicar em uma célula. De particular interesse são as sequências virais associadas a doenças virais crônicas. As sequências virais de particular interesse incluem sequências de filovírus, como o vírus Ebola e o vírus Marburg (ver, por exemplo, Geisbert et al., J. Infect. Dis., 193:1650-1657 (2006)); Arenavírus, como vírus Lassa, vírus Junin, vírus Machupo, vírus Guanarito e vírus Sabia (Buchmeier et al., Arenaviridae: the viruses and their replication, In: FIELDS VIROLOGY, Knipe et al. (eds.), 4th ed., Lippincott-Raven, Philadelphia, (2001)); Vírus da Influenza, como os vírus da Influenza A, B e C, (ver, por exemplo, Steinhauer et al., Annu Rev Genet., 36:305-332 (2002); e Neumann et al., J Gen Virol., 83:2635-2662 (2002)); Vírus da hepatite (ver, por exemplo, Hamasaki et al., FEBS Lett., 543:51 (2003); Yokota et al., EMBO Rep., 4:602 (2003); Schlomai et al., Hepatology, 37:764 (2003); Wilson et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 100:2783 (2003); Kapadia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:2014 (2003); and FIELDS VIROLOGY, Knipe et al. (eds.), 4th ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (2001)); Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) (Banerjea et al., Mol. Ther., 8:62 (2003); Song et al., J. Virol., 77:7174 (2003); Stephenson, JAMA, 289:1494 (2003); Qin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:183 (2003)); Vírus do Herpes (Jia et al., J. Virol., 77:3301 (2003)); e Vírus do Papiloma Humano (HPV) (Hall et al., J. Virol., 77:6066 (2003); Jiang et al., Oncogene, 21:6041 (2002)).
[00163] Sequências de ácido nucleico de filovírus exemplificativas que podem ser silenciadas incluem, mas não estão limitadas a, sequências de ácido nucleico que codificam proteínas estruturais (por exemplo, VP30, VP35, nucleoproteína (NP), proteína polimerase (L-pol)) e proteínas associadas à membrana (por exemplo, VP40, glicoproteína (GP), VP24). As sequências completas do genoma para o vírus Ebola são apresentadas, por exemplo, nos números de Acessão do Genbank NC—002549; AY769362; NC—006432; NC—004161; AY729654; AY354458; AY142960; AB050936;
AF522874; AF499101; AF272001; e AF086833. As sequências VP24 do vírus Ebola são apresentadas, por exemplo, nos números de Acessão do Genbank U77385 e AY058897. As sequências L-pol do vírus Ebola são apresentadas, por exemplo, no número de Acessão do Genbank X67110. As sequências VP40 do vírus Ebola são apresentadas, por exemplo, no número de Acessão do Genbank AY058896. As sequências NP do vírus Ebola são apresentadas, por exemplo, no número de Acessão do Genbank AY058895. As sequências GP do vírus Ebola são apresentadas, por exemplo, no número de Acessão do Genbank AY058898; Sanchez et al., Virus Res., 29:215-240 (1993); Will et al., J. Virol., 67:1203-1210 (1993); Volchkov et al., FEBS Lett., 305:181-184 (1992); e Pat. U.S. 6.713.069.
As sequências do vírus Ebola adicionais são apresentadas, por exemplo, nos números de Acessão do Genbank L11365 e X61274. As sequências completas do genoma para o vírus Marburg são apresentadas, por exemplo, nos números de Acessão do Genbank NC—001608; AY430365; AY430366; e AY358025. As sequências GP do vírus de Marburg são apresentadas, por exemplo, nos números de Acessão do Genbank AF005734; AF005733; e AF005732. As sequências de VP35 do vírus de Marburg são apresentadas, por exemplo, nos números de Acessão do Genbank AF005731 e AF005730. As sequências do vírus de Marburg adicionais são apresentadas, por exemplo, nos números de Acessão do Genbank X64406; Z29337; AF005735; e Z12132. Exemplos não limitativos de moléculas de siRNA direcionadas às sequências de ácido nucleico do vírus Ebola e Marburg incluem aqueles descritos na Publicação de Patente U.S. 20070135370, cuja divulgação é incorporada neste documento por referência em sua totalidade para todos os fins.
[00164] Sequências de ácido nucleico do vírus Influenza exemplificativas que podem ser silenciadas incluem, mas não estão limitadas a, sequências de ácido nucleico que codificam nucleoproteína (NP), proteínas de matriz (M1 e M2), proteínas não estruturais (NS1 e NS2), RNA polimerase (PA,
PB1, PB2), neuraminidase (NA) e hemaglutinina (HA). As sequências de Influenza A NP são apresentadas, por exemplo, nos números de acessão do Genbank NC—004522; AY818138; AB166863; AB188817; AB189046; AB189054; AB189062; AY646169; AY646177; AY651486; AY651493; AY651494; AY651495; AY651496; AY651497; AY651498; AY651499; AY651500; AY651501; AY651502; AY651503; AY651504; AY651505; AY651506; AY651507; AY651509; AY651528; AY770996; AY790308; AY818138; e AY818140. As sequências de Influenza A PA são apresentadas, por exemplo, nos números de acessão do Genbank AY818132; AY790280; AY646171; AY818132; AY818133; AY646179; AY818134; AY551934; AY651613; AY651610; AY651620; AY651617; AY651600; AY651611; AY651606; AY651618; AY651608; AY651607; AY651605; AY651609; AY651615; AY651616; AY651640; AY651614; AY651612; AY651621; AY651619; AY770995; e AY724786. Exemplos não limitativos de moléculas de siRNA direcionadas às sequências de ácido nucleico do vírus da Influenza incluem aqueles descritos na Publicação de Patente U.S. 20070218122, cuja divulgação é incorporada neste documento por referência em sua totalidade para todos os fins.
[00165] Sequências de ácido nucleico do vírus da hepatite exemplificativas que podem ser silenciadas incluem, mas não estão limitadas a, sequências de ácido nucleico envolvidas na transcrição e tradução (por exemplo, En1, En2, X, P) e sequências de ácido nucleico que codificam proteínas estruturais (por exemplo, proteínas do núcleo, incluindo proteínas relacionadas com C e C, proteínas de capsídeo e envelope incluindo proteínas S, M e / ou L, ou fragmentos dos mesmos) (ver, por exemplo, FIELDS VIROLOGY, supra).
Sequências exemplificativos de ácido nucleico do vírus da hepatite C (HCV) que podem ser silenciadas incluem, mas não estão limitadas a, a região 5' não traduzida (5'-UTR), a região 3' não traduzida (3'-UTR), a região da poliproteína do códon de iniciação da tradução, a sequência do sítio de entrada do ribossomo interno (IRES) e / ou sequências de ácido nucleico que codificam a proteína central, a proteína E1, a proteína E2, a proteína p7, a proteína NS2, a protease / helicase NS3, a proteína NS4A, a proteína NS4B, a proteína NS5A e / ou a RNA polimerase dependente de RNA NS5B. As sequências do genoma do HCV são apresentadas, por exemplo, nos números de acessão do Genbank NC—004102 (genótipo de HCV 1a), AJ238799 (genótipo de HCV 1b), NC—009823 (genótipo de HCV 2), NC—009824 (genótipo de HCV 3), NC—009825 (genótipo de HCV 4), NC—009826 (genótipo de HCV 5) e NC-009827 (genótipo 6 de HCV). As sequências de ácido nucleico do vírus da hepatite A são apresentadas, por exemplo, no número de Acessão do Genbank NC—001489; as sequências de ácido nucleico do vírus da hepatite B são apresentadas, por exemplo, no número de Acessão do Genbank NC—003977; a sequência de ácido nucleico do vírus da hepatite D é apresentada, por exemplo, no número de Acessão do Genbank NC—001653; as sequências de ácido nucleico do vírus da hepatite E são apresentadas, por exemplo, no número de Acessão do Genbank NC—001434; e as sequências de ácido nucleico do vírus da hepatite G são apresentadas, por exemplo, no número de Acessão do Genbank NC—001710. O silenciamento de sequências que codificam genes associados à infecção viral e à sobrevivência pode ser convenientemente usado em combinação com a administração de agentes convencionais usados para tratar a condição viral. Exemplos não limitativos de moléculas de siRNA direcionadas a sequências de ácido nucleico do vírus da hepatite incluem aquelas descritas na Publicação de Patente U.S.
20060281175, 20050058982 e 20070149470; Pat. U.S. 7.348.314; e o Pedido Provisório U.S. 61/162.127, depositado em 20 de março de 2009, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todos os fins.
[00166] Genes associados a doenças e distúrbios metabólicos (por exemplo, distúrbios em que o fígado é o alvo e doenças e distúrbios hepáticos) incluem, por exemplo, genes expressos em dislipidemia
(por exemplo, receptores X do fígado, como LXRα e LXRβ (número de Acessão
Genback NM—007121), receptores farnesoide X (FXR) (número de Acessão do
Genbank NM—005123), proteína de ligação do elemento regulatório de esterol
(SREBP), protease do sítio 1 (SIP), 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima-A redutase
(HMG coenzima-A redutase), apolipoproteína B (ApoB) (número de Acessão do
Genbank NM—000384), apolipoproteína CIII (ApoC3) (números de Acessão do
Genbank NM—000040 e NG—008949 REGIÃO: 5001.8164) e apolipoproteína E (ApoE) (números de Acessão do Genbank NM—000041 e NG—007084 REGIÃO:
5001,8612)); e diabetes (por exemplo, glicose 6-fosfatase) (ver, por exemplo,
Forman et al., Cell, 81:687 (1995); Seol et al., Mol.
Endocrinol., 9:72 (1995),
Zavacki et al., Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA, 94:7909 (1997); Sakai et al., Cell,
85:1037-1046 (1996); Duncan et al., J.
Biol.
Chem., 272:12778-12785 (1997);
Willy et al., Genes Dev., 9:1033-1045 (1995); Lehmann et al., J.
Biol.
Chem.,
272:3137-3140 (1997); Janowski et al., Nature, 383:728-731 (1996); e Peet et al.,
Cell, 93:693-704 (1998)). Um versado na técnica apreciará que os genes associados a doenças e distúrbios metabólicos (por exemplo, doenças e distúrbios em que o fígado é um alvo e doenças e distúrbios hepáticos) incluem genes que são expressos no próprio fígado, bem como genes expressos em outros órgãos e tecidos.
O silenciamento de sequências que codificam genes associados a doenças e distúrbios metabólicos pode ser convenientemente usado em combinação com a administração de agentes convencionais usados para tratar a doença ou distúrbio.
Exemplos não limitativos de moléculas de siRNA direcionadas ao gene ApoB incluem aqueles descritos na Publicação de
Patente U.S. 20060134189, cuja divulgação é aqui incorporada por referência em sua totalidade para todos os fins.
Exemplos não limitativos de moléculas de siRNA direcionadas ao gene ApoC3 incluem aqueles descritos no Pedido
Provisório U.S. 61/147.235, depositado em 26 de janeiro de 2009, cuja divulgação é aqui incorporada por referência em sua totalidade para todos os fins.
[00167] Exemplos de sequências de genes associadas à tumorigênese e transformação celular (por exemplo, câncer ou outra neoplasia) incluem cinesinas mitóticas, como Eg5 (KSP, KIF11; No. de Acessão do Genbank NM—004523); serina / treonina quinases, tais como polo-like quinase 1 (PLK-1) (número de Acessão do Genbank NM—005030; Barr et al., Nat. Rev.
Mol. Cell. Biol., 5: 429-440 (2004)); tirosina quinases, tais como WEE1 (números de acessão do Genbank NM—003390 e NM—001143976); inibidores da apoptose, tais como XIAP (número de Acessão do Genbank NM—001167); subunidades do sinalossomo COP9, como CSN1, CSN2, CSN3, CSN4, CSN5 (JAB1; número de Acessão do Genbank NM—006837); CSN6, CSN7A, CSN7B e CSN8; ubiquitina ligases, tais como COP1 (RFWD2; números de Acessão do Genbank NM—022457 e NM—001001740); e histona desacetilases, tais como HDAC1, HDAC2 (número de Acessão do Genbank NM—001527), HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, etc. Exemplos não limitativos de moléculas de siRNA direcionadas aos genes Eg5 e XIAP incluem aqueles descritos no pedido de patente U.S. 11/807.872, depositado em 29 de maio de 2007, cuja divulgação é aqui incorporada por referência em sua totalidade para todos os fins. Exemplos não limitativos de moléculas de siRNA direcionadas ao gene PLK-1 incluem aqueles descritos nas Publicações de Patentes U.S. 20050107316 e 20070265438; e o pedido de patente U.S.
12/343.342, depositado em 23 de dezembro de 2008, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todos os fins. Exemplos não limitativos de moléculas de siRNA direcionadas ao gene CSN5 incluem aqueles descritos no Pedido Provisório U.S. 61/045.251, depositado em 15 de abril de 2008, cuja divulgação é aqui incorporada por referência em sua totalidade para todos os fins.
[00168] Exemplos adicionais de sequências gênicas associadas à tumorigênese e transformação celular incluem sequências de translocação, tais como genes de fusão MLL, BCR-ABL (Wilda et al., Oncogene, 21:5716 (2002); Scherr et al., Blood, 101:1566 (2003)), TEL-AML1, EWS-FLI1, TLS-FUS, PAX3-FKHR, BCL-2, AML1-ETO, e AML1-MTG8 (Heidenreich et al., Blood, 101:3157 (2003)); overexpressed sequences such as multidrug resistance genes (Nieth et al., FEBS Lett., 545:144 (2003); Wu et al, Cancer Res.
63:1515 (2003)), ciclinas (Li et al., Cancer Res., 63:3593 (2003); Zou et al., Genes Dev., 16:2923 (2002)), beta-catenina (Verma et al., Clin Cancer Res., 9:1291 (2003)), genes da telomerase (Kosciolek et al., Mol Cancer Ther., 2:209 (2003)), c-MYC, N-MYC, BCL-2, receptores de fator de crescimento (por exemplo, EGFR / ErbB1 (números de Acessão do Genbank NM —005228, NM—201282, NM—201283, and NM—201284; ver também, Nagy et al. Exp. Cell Res., 285: 39-49 (2003), ErbB2 / HER-2 (números de Acessão do Genbank NM—004448 e NM—001005862), ErbB3 (números de Acessão do Genbank NM—001982 e NM—001005915) e ErbB4 (números de Acessão do Genbank NM—005235 e NM—001042599); e sequências mutadas como RAS (revisadas em Tuschl e Borkhardt, Mol. Interventions, 2:158 (2002)). Exemplos não limitativos de moléculas de siRNA direcionadas ao gene EGFR incluem aqueles descritos no pedido de patente U.S. 11/807.872, depositado em 29 de maio de 2007, cuja divulgação é aqui incorporada por referência em sua totalidade para todos os fins.
[00169] O silenciamento de sequências que codificam enzimas de reparo de DNA encontra uso em combinação com a administração de agentes quimioterápicos (Collis et al., Cancer Res., 63:1550 (2003)). Os genes que codificam proteínas associadas à migração tumoral também são sequências alvo de interesse, por exemplo, integrinas, selectinas e metaloproteinases. Os exemplos anteriores não são exclusivos. Os versados na técnica entenderão que qualquer sequência de gene total ou parcial que facilite ou promova a tumorigênese ou transformação celular, crescimento de tumor ou migração de tumor pode ser incluída como uma sequência modelo.
[00170] Genes angiogênicos são capazes de promover a formação de novos vasos. De particular interesse é o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (Reich et al., Mol. Vis., 9:210 (2003)) ou VEGFR. As sequências de siRNA que direcionam VEGFR são apresentadas em, por exemplo, GB 2396864; Publicação de Patente U.S. 20040142895; e CA 2456444, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todos os fins.
[00171] Genes anti-angiogênicos são capazes de inibir a neovascularização. Esses genes são particularmente úteis para o tratamento de cânceres nos quais a angiogênese desempenha um papel no desenvolvimento patológico da doença. Exemplos de genes anti-angiogênicos incluem, mas não estão limitados a, endostatina (ver, por exemplo, Pat. U.S. 6.174.861), angiostatina (ver, por exemplo, Pat. U.S. 5.639.725), e VEGFR2 (ver, por exemplo, Decaussin et al., J. Pathol., 188: 369-377 (1999)), cujas divulgações são aqui incorporadas por referência na sua totalidade para todos os efeitos.
Genes imunomoduladores são genes que modulam uma ou mais respostas imunológicas. Exemplos de genes imunomoduladores incluem, sem limitação, citocinas, tais como fatores de crescimento (por exemplo, TGF-α, TGF-β, EGF, FGF, IGF, NGF, PDGF, CGF, GM-CSF, SCF, etc.), interleucinas (por exemplo, IL-2, IL-4, IL-12 (Hill et al., J. Immunol., 171:691 (2003)), IL-15, IL-18, IL-20, etc.), interferons (por exemplo, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, etc.) e TNF. Os genes Fas e ligandos Fas também são sequências alvo imunomoduladoras de interesse (Song et al., Nat. Med., 9:347 (2003)). Genes que codificam moléculas de sinalização secundária em células hematopoiéticas e linfoides também estão incluídos na presente invenção, por exemplo, quinases da família Tec, tais como tirosina quinase de Bruton (Btk) (Heinonen et al., FEBS Lett., 527:274 (2002)).
[00172] Ligandos de receptores celulares incluem ligandos que são capazes de se ligar a receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de insulina, receptor de EPO, receptores acoplados à proteína G, receptores com atividade de tirosina quinase, receptores de citocina, receptores de fator de crescimento, etc.), para modular (por exemplo, inibir, ativar, etc.) a via fisiológica na qual o receptor está envolvido (por exemplo, modulação do nível de glicose, desenvolvimento de células sanguíneas, mitogênese, etc.). Exemplos de ligandos de receptores celulares incluem, mas não estão limitados a, citocinas, fatores de crescimento, interleucinas, interferons, eritropoietina (EPO), insulina, glucagon, ligandos de receptores acoplados à proteína G, etc. Os modelos que codificam para uma expansão de repetições de trinucleotídeos (por exemplo, repetições CAG) encontram uso no silenciamento de sequências patogênicas em distúrbios neurodegenerativos causados pela expansão de repetições de trinucleotídeos, como atrofia muscular espinobulbular e doença de Huntington (Caplen et al., Hum. Mol. Genet., 11:175 (2002)).
[00173] Certos outros genes alvo, que podem ser direcionados por um ácido nucleico (por exemplo, por siRNA) para infrarregular ou silenciar a expressão do gene, incluem, mas não estão limitados a, Actina, Alfa 2, Músculo Liso, Aorta (ACTA2), Álcool desidrogenase 1A (ADH1A), Álcool desidrogenase 4 (ADH4), Álcool desidrogenase 6 (ADH6), Afamina (AFM), Angiotensinogênio (AGT), Serina-piruvato aminotransferase (AGXT), Alfa-2-HS-glicoproteína (AHSG), membro C4 da famlia Aldo -ceto redutase 1 (AKR1C4), albumina sérica (ALB), alfa-1-microglobulina / precursor de bicunina (AMBP), proteína relacionada à angiopoietina 3 (ANGPTL3), componente P amiloide sérico (APCS), Apolipoproteína A-II (APOA2), Apolipoproteína B-100 (APOB), Apolipoproteína C3 (APOC3), Apolipoproteína C-IV (APOC4),
Apolipoproteína F (APOF), Beta-2-glicoproteína 1 (APOH), Aquaporina-9
(AQP9), Ácido biliar-CoA:aminoácido N-aciltransferase (BAAT), cadeia beta da proteína de ligação a C4b (C4BPB), proteína putativa não caracterizada codificada por LINC01554 (C5orf27), Fator de complemento 3 (C3), Fator de complemento 5 (C5), Componente de complemento C6 (C6), cadeia alfa do componente de complemento C8 (C8A), cadeia beta do componente de complemento C8 (C8B), cadeia gama do componente de complemento C8
(C8G), Componente de complemento C9 (C9), Ativador da transcrição de ligação de calmodulina 1 (CAMTA1), CD38 (CD38), Fator de complemento B (CFB), Proteína 1 relativa a fator de complemento H (CFHR1), Proteína 2 relativa a fator de complemento H (CFHR2), Proteína 3 relativa a fator de complemento
H (CFHR3), Receptor de canabinoide 1 (CNR1), ceruloplasmina (CP),
carboxipeptidase B2 (CPB2), Fator de crescimento de tecido conjuntivo (CTGF),
Quimiocina 2 do motivo C-X-C (CXCL2), Citocromo P450 1A2 (CYP1A2),
Citocromo P450 2A6 (CYP2A6), Citocromo P450 2C8 (CYP2C8), Citocromo
P450 2C9 (CYP2C9), Citocromo P450 Família 2 Subfamília D Membro 6
(CYP2D6), Citocromo P450 2E1 (CYP2E1), Filoquinona ômega-hidroxilase
CYP4F2 (CYP4F2), 7-alfa-hidroxicolest-4-en-3-ona 12-alfa-hidroxilase
(CYP8B1), Dipeptidil peptidase 4 (DPP4), fator de coagulação 12 (F12), fator de coagulação II (trombina) (F2), fator de coagulação IX (F9), cadeia alfa de fibrinogênio (FGA), cadeia beta de fibrinogênio (FGB), cadeia gama de fibrinogênio (FGG), semelhante a fibrinogênio 1 (FGL1), flavina contendo mono-oxigenase 3 (FMO3), flavina contendo mono-oxigenase 5 (FMO5),
componente específico do grupo (proteína de ligação à vitamina D) (GC),
Receptor do hormônio do crescimento (GHR), glicina N-metiltransferase
(GNMT), proteína de ligação de hialuronano 2 (HABP2), peptídeo antimicrobiano hepcidina (HAMP), hidroxiácido oxidase (glicolato oxidase) 1 (HAO1), ativador de HGF (HGFAC), proteína relacionada com haptoglobina; haptoglobina (HPR),
hemopexina (HPX), glicoproteína rica em histidina (HRG), hidroxisteroide
(11-beta) desidrogenase 1 (HSD11B1), hidroxisteroide (17-beta) desidrogenase
13 (HSD17B13), cadeia pesada H1 do inibidor da inter-alfa-tripsina (ITIH1),
cadeia pesada H2 do inibidor da inter-alfa-tripsina (ITIH2),cadeia pesada H3 do inibidor da inter-alfa-tripsina (ITIH3), cadeia pesada H4 do inibidor da inter-alfa-tripsina (ITIH4), Precalicreína (KLKB1), Lactato desidrogenase A
(LDHA), peptídeo antimicrobiano expresso no fígado 2 (LEAP2), quimiotaxina derivada de células leucocitárias 2 (LECT2), Lipoproteína (a) (LPA), lectina serina peptidase 2 de ligação a manana (MASP2), S-adenosilmetionina sintase isoforma tipo 1 (MAT1A), NADPH Oxidase 4 (NOX4), Poli [ADP-ribose]
polimerase 1 (PARP1), paraoxonase 1 (PON1), paraoxonase 3 (PON3), Proteína
C dependente de vitamina K (PROC), Retinol desidrogenase 16 (RDH16),
amiloide sérica A4, constitutiva (SAA4), serina desidratase (SDS), Serpina
Família A Membro 1 (SERPINA1), Serpina A11 (SERPINA11), Kalistatina
(SERPINA4), Globulina de ligação a corticosteroide (SERPINA6),
Antitrombina-III (SERPINC1), Cofator heparina 2 (SERPIND1), Serpina Família
H Membro 1 (SERPINH1), Transportador de soluto Família 5 Membro 2
(SLC5A2), Cotransportador de sódio / ácido biliar (SLC10A1), Transportador de soluto família 13 membro 5 (SLC13A5), Transportador de soluto família 22 membro 1 (SLC22A1), Transportador de soluto família 25 membro
47(SLC25A47), Família de transportador de soluto 2, membro transportador de glicose facilitado 2 (SLC2A2), Transportador de aminoácido neutro acoplado a sódio 4 (SLC38A4), Transportador de ânion orgânico do transportador de soluto
1B1 (SLCO1B1), Esfingomielina Fosfodiesterase 1 (SMPD1), Sulfotransferase de sal biliar (SULT2A1), tirosina aminotransferase (TAT), triptofano
2,3-dioxigenase (TDO2), UDP glucuronosiltransferase família 2, polipeptídeo
B10 (UGT2B10), UDP glucuronosiltransferase família 2, polipeptídeo B15
(UGT2B15), Família UDP glucuronosiltransferase 2, polipeptídeo B4 (UGT2B4)
e vitronectina (VTN).
[00174] Além de sua utilidade em silenciar a expressão de qualquer um dos genes descritos acima para fins terapêuticos, certos ácidos nucleicos (por exemplo, siRNA) aqui descritos também são úteis em aplicações de pesquisa e desenvolvimento, bem como em aplicações de diagnóstico, profilático, prognóstico, clínico, e outras aplicações de saúde. Como um exemplo não limitativo, certos ácidos nucleicos (por exemplo, siRNA) podem ser usados em estudos de validação de alvos direcionados a testar se um gene de interesse tem potencial para ser um alvo terapêutico. Certos ácidos nucleicos (por exemplo, siRNA) também podem ser usados em estudos de identificação de alvos que visam descobrir genes como potenciais alvos terapêuticos.
CRISPR
[00175] A edição direcionada do genoma deixou de ser uma tecnologia de nicho para se tornar um método usado por muitos pesquisadores biológicos. Esta progressão foi amplamente alimentada pelo surgimento da tecnologia de repetição palindrômica curta (CRISPR) agrupada, regularmente intercalada (ver, por exemplo, Sander et al., Nature Biotechnology, 32 (4), 347-355, incluindo Informações Suplementares (2014) e Números de Publicação Internacional WO 2016/197132 e WO 2016/197133). Consequentemente, são fornecidos neste documento melhorias (por exemplo, nanopartículas de lipídeos e formulações dos mesmos) que podem ser usados em combinação com a tecnologia CRISPR para tratar doenças, como o HBV. Em relação aos alvos para usar CRISPR, o RNA guia (gRNA) utilizado na tecnologia CRISPR pode ser projetado para direcionar sequências especificamente identificadas, por exemplo, genes alvo, por exemplo, do genoma do HBV. Exemplos de tais sequências alvo são fornecidos na Publicação Internacional Número WO 2016/197132. Além disso, a Publicação Internacional Número WO 2013/151665 (por exemplo, ver a Tabela 6; cujo documento é especificamente incorporado por referência, particularmente incluindo a Tabela 6 e a Lista de Sequências associada) descreve cerca de 35.000 sequências de mRNA, reivindicadas no contexto de um construto de expressão de mRNA. Certas modalidades da presente invenção utilizam tecnologia CRISPR para direcionar a expressão de qualquer uma dessas sequências. Certas modalidades da presente invenção também podem utilizar a tecnologia CRISPR para direcionar a expressão de um gene alvo aqui discutido.
aiRNA
[00176] Como o siRNA, o RNA interferente assimétrico (aiRNA) pode recrutar o complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) e levar ao silenciamento eficaz de uma variedade de genes em células de mamíferos por mediação da clivagem específica da sequência da sequência alvo entre os nucleotídeos 10 e 11 em relação à extremidade 5' da fita antissentido (Sun et al., Nat. Biotech., 26:1379-1382 (2008)). Normalmente, uma molécula de aiRNA compreende um duplex de RNA curto tendo uma fita sentido e uma fita antissentido, em que o duplex contém saliências nas extremidades 3' e 5' da fita antissentido. O aiRNA é geralmente assimétrico porque a fita sentido é mais curta em ambas as extremidades quando comparada à fita antissentido complementar. Em alguns aspectos, as moléculas de aiRNA podem ser projetadas, sintetizadas e recozidas sob condições semelhantes às usadas para as moléculas de siRNA. Como um exemplo não limitativo, as sequências de aiRNA podem ser selecionadas e geradas usando os métodos descritos acima para selecionar as sequências de siRNA.
[00177] Em outra modalidade, duplexes de aiRNA de vários comprimentos (por exemplo, cerca de 10-25, 12-20, 12-19, 12-18, 13-17 ou 14-17 pares de bases, mais tipicamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou pares de bases) podem ser projetados com saliências nas extremidades 3' e 5' da fita antissentido para direcionar um mRNA de interesse. Em certos casos, a fita sentido da molécula de aiRNA tem cerca de 10-25, 12-20, 12-19, 12-18, 13-17 ou 14-17 nucleotídeos de comprimento, mais tipicamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleotídeos de comprimento. Em certos outros casos, a fita antissentido da molécula de aiRNA tem cerca de 15-60, 15-50 ou 15-40 nucleotídeos de comprimento, mais tipicamente cerca de 15-30, 15-25 ou 19-25 nucleotídeos de comprimento, e tem de preferência cerca de 20-24, 21-22 ou 21-23 nucleotídeos de comprimento.
[00178] Em algumas modalidades, a saliência antissentido 5′ contém um, dois, três, quatro ou mais nucleotídeos não direcionados (por exemplo, “AA”, “UU”, “dTdT”, etc.). Em outras modalidades, a saliência antissentido 3′ contém um, dois, três, quatro ou mais nucleotídeos não direcionados (por exemplo, “AA”, “UU”, “dTdT”, etc.). Em certos aspectos, as moléculas de aiRNA aqui descritas podem compreender um ou mais nucleotídeos modificados, por exemplo, na região de fita dupla (duplex) e / ou nas saliências antissentido. Como um exemplo não limitativo, as sequências de aiRNA podem compreender um ou mais dos nucleotídeos modificados descritos acima para as sequências de siRNA. Em uma modalidade preferida, a molécula de aiRNA compreende nucleotídeos 2'OMe, tais como, por exemplo, nucleotídeos 2′OMe-guanosina, nucleotídeos 2′OMe-uridina ou misturas dos mesmos.
[00179] Em certas modalidades, as moléculas de aiRNA podem compreender uma fita antissentido que corresponde à fita antissentido de uma molécula de siRNA, por exemplo, uma das moléculas de siRNA aqui descritas. Em outras modalidades, as moléculas de aiRNA podem ser usadas para silenciar a expressão de qualquer um dos genes alvo apresentados acima, como, por exemplo, genes associados à infecção viral e sobrevida, genes associados a doenças metabólicas e distúrbios, genes associados à tumorigênese e transformação de células, genes angiogênicos, genes imunomodulatórios, tais como aqueles associados a respostas inflamatórias e autoimunes, genes de receptores de ligandos e genes associados a distúrbios neurodegenerativos.
miRNA
[00180] Geralmente, microRNAs (miRNA) são moléculas de RNA de fita simples de cerca de 21-23 nucleotídeos de comprimento que regulam a expressão genética. miRNAs são codificados por genes de cujo DNA são transcritos, mas miRNAs não são traduzidos em proteínas (RNA não codificante); em vez disso, cada transcrito primário (um pri-miRNA) é processado em uma estrutura de haste-alça curta chamada de pré-miRNA e, finalmente, em um miRNA maduro funcional. Moléculas de miRNA maduras são parcial ou completamente complementares a uma ou mais moléculas de RNA mensageiro (mRNA), e sua função principal é diminuir a expressão genética. A identificação de moléculas de miRNA é descrita, por exemplo, em Lagos-Quintana et al., Science, 294:853-858; Lau et al., Science, 294:858-862; and Lee et al., Science, 294:862-864.
[00181] Os genes que codificam miRNA são muito mais longos do que a molécula miRNA madura processada. Os miRNAs são primeiro transcritos como transcritos primários ou pri-miRNA com uma capa e cauda ~ poli-A e processados em estruturas curtas de haste-alça de 70 nucleotídeos conhecidas como pré-miRNA no núcleo da célula. Este processamento é realizado em animais por um complexo de proteínas conhecido como complexo de microprocessador, que consiste na nuclease Drosha e na proteína de ligação ao RNA de fita dupla Pasha (Denli et al., Nature, 432:231-235 (2004)). Estes pré-miRNA são então processados para amadurecer miRNA no citoplasma por interação com a endonuclease Dicer, que também inicia a formação do complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) (Bernstein et al., Nature, 409:363-366 (2001). Tanto a fita sentido quanto a fita antissentido de DNA podem funcionar como modelos para dar origem ao miRNA.
[00182] Quando Dicer cliva a haste-alça pré-miRNA, duas moléculas de RNA curtas complementares são formadas, mas apenas uma é integrada ao complexo RISC. Esta fita é conhecida como fita guia e é selecionada pela proteína argonauta, a RNase cataliticamente ativa no complexo RISC, com base na estabilidade da extremidade 5' (Preall et al., Curr. Biol., 16:530-535 (2006)). A fita restante, conhecida como fita anti-guia ou passageira, é degradada como um substrato complexo RISC (Gregory et al., Cell, 123:631-640 (2005)). Após a integração no complexo RISC ativo, os miRNAs emparelham com suas moléculas de mRNA complementares e induzem a degradação do mRNA alvo e / ou silenciamento da tradução.
[00183] As moléculas de miRNA de mamíferos são geralmente complementares a um sítio na 3′ UTR da sequência de mRNA alvo.
Em certos casos, o recozimento do miRNA com o mRNA alvo inibe a tradução da proteína, bloqueando a maquinaria de tradução da proteína. Em certos outros casos, o recozimento do miRNA com o mRNA alvo facilita a clivagem e a degradação do mRNA alvo por meio de um processo semelhante à interferência de RNA (RNAi). miRNA também pode direcionar a metilação de sítios genômicos que correspondem ao mRNA direcionado. Geralmente, a função miRNA em associação com um complemento de proteínas denominadas coletivamente miRNP.
[00184] Em certos aspectos, as moléculas de miRNA aqui descritas têm cerca de 15-100, 15-90, 15-80, 15-75, 15-70, 15-60, 15-50 ou 15-40 nucleotídeos de comprimento, mais tipicamente cerca de 15-30, 15-25 ou 19-25 nucleotídeos de comprimento, e têm preferencialmente cerca de 20-24, 21-22 ou 21-23 nucleotídeos de comprimento. Em certos outros aspectos, as moléculas de miRNA podem compreender um ou mais nucleotídeos modificados. Como um exemplo não limitativo, as sequências de miRNA podem compreender um ou mais dos nucleotídeos modificados descritos acima para as sequências de siRNA. Em uma modalidade preferida, a molécula de miRNA compreende nucleotídeos 2'OMe, tais como, por exemplo, nucleotídeos 2′OMe-guanosina, nucleotídeos 2′OMe-uridina ou misturas dos mesmos.
[00185] Em algumas modalidades, as moléculas de miRNA podem ser usadas para silenciar a expressão de qualquer um dos genes alvo apresentados acima, como, por exemplo, genes associados à infecção viral e sobrevida, genes associados a doenças metabólicas e distúrbios, genes associados à tumorigênese e transformação de células, genes angiogênicos, genes imunomodulatórios, tais como aqueles associados a respostas inflamatórias e autoimunes, genes de receptores de ligandos e genes associados a distúrbios neurodegenerativos.
[00186] Em outras modalidades, um ou mais agentes que bloqueiam a atividade de um miRNA direcionado a um mRNA de interesse são administrados usando uma partícula de lipídeo da invenção (por exemplo, uma partícula de ácido nucleico-lipídeo). Exemplos de agentes de bloqueio incluem, mas não estão limitados a, oligonucleotídeos de bloqueio estérico, oligonucleotídeos de ácido nucleico bloqueados e oligonucleotídeos de Morfolino. Esses agentes de bloqueio podem se ligar diretamente ao miRNA ou ao sítio de ligação do miRNA no mRNA alvo.
Oligonucleotídeos antissentido
[00187] Em uma modalidade, o ácido nucleico é um oligonucleotídeo antissentido direcionado a um gene ou sequência de interesse alvo. Os termos "oligonucleotídeo antissentido" ou "antissentido" incluem oligonucleotídeos que são complementares a uma sequência polinucleotídica direcionada. Os oligonucleotídeos antissentido são fitas simples de DNA ou RNA que são complementares a uma sequência escolhida. Os oligonucleotídeos antissentido de RNA evitam a tradução de fitas complementares de RNA ligando-se ao RNA. Os oligonucleotídeos antissentido de DNA podem ser usados para direcionar um RNA específico complementar (codificante ou não).
Se ocorrer ligação, este híbrido de DNA / RNA pode ser degradado pela enzima RNase H. Em uma modalidade particular, os oligonucleotídeos antissentido compreendem de cerca de 10 a cerca de 60 nucleotídeos, mais preferencialmente de cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos. O termo também abrange oligonucleotídeos antissentido que podem não ser exatamente complementares ao gene alvo desejado. Assim, a invenção pode ser utilizada em casos onde atividades específicas não alvo são encontradas com antissentido, ou onde uma sequência antissentido contendo uma ou mais incompatibilidades com a sequência alvo é a mais preferida para um uso particular.
[00188] Os oligonucleotídeos antissentido demonstraram ser inibidores eficazes e direcionados da síntese de proteínas e, consequentemente, podem ser usados para inibir especificamente a síntese de proteínas por um gene direcionado. A eficácia dos oligonucleotídeos antissentido para inibir a síntese de proteínas está bem apresentada. Por exemplo, a síntese de poligalactauronase e o receptor de acetilcolina muscarina tipo 2 são inibidos por oligonucleotídeos antissentido direcionados às suas respectivas sequências de mRNA (ver, Pat. U.S. 5.739.119 e 5.759.829). Além disso, exemplos de inibição antissentido foram demonstrados com a proteína nuclear ciclina, o gene de resistência a múltiplas drogas (MDR1), ICAM-1, E-selectina, STK-1, receptor GABAA estriatal e EGF humano (ver, Jaskulski et al., Science, 240:1544-6 (1988); Vasanthakumar et al., Cancer Commun., 1:225-32 (1989); Penis et al., Brain Res Mol Brain Res., 15; 57:310-20 (1998); e Pat. U.S. 5.801.154;
5.789.573; 5.718.709 e 5.610.288). Além disso, os construtos antissentido também foram descritos que inibem e podem ser usados para tratar uma variedade de proliferações celulares anormais, por exemplo, câncer (ver Pat.
U.S. 5.747.470; 5.591.317; e 5.783.683). As divulgações dessas referências são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todos os fins.
[00189] Os métodos de produção de oligonucleotídeos antissentido são conhecidos na técnica e podem ser facilmente adaptados para produzir um oligonucleotídeo antissentido que direciona qualquer sequência polinucleotídica. A seleção de sequências de oligonucleotídeos antissentido específicas para uma dada sequência alvo é baseada na análise da sequência alvo escolhida e determinação da estrutura secundária, Tm, energia de ligação e estabilidade relativa. Os oligonucleotídeos antissentido podem ser selecionados com base em sua relativa incapacidade de formar dímeros, hairpins ou outras estruturas secundárias que reduziriam ou proibiriam a ligação específica ao mRNA alvo em uma célula hospedeira. As regiões alvo altamente preferidas do mRNA incluem aquelas regiões no ou próximo ao códon de iniciação da tradução de AUG e aquelas sequências que são substancialmente complementares às regiões 5' do mRNA. Estas análises de estrutura secundária e considerações de seleção de local alvo podem ser realizadas, por exemplo, usando v.4 do software de análise de iniciador OLIGO (Molecular Biology Insights) e / ou o software de algoritmo BLASTN 2.0.5 (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-402 (1997)).
Ribozimas
[00190] De acordo com outra modalidade da invenção, as partículas de ácido nucleico-lipídeo estão associadas a ribozimas. Ribozimas são complexos de RNA-proteína com domínios catalíticos específicos que possuem atividade de endonuclease (ver Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84:8788-92 (1987); e Forster et al., Cell, 49:211-20 (1987)). Por exemplo, um grande número de ribozimas acelera as reações de transferência de fosfoéster com um alto grau de especificidade, muitas vezes clivando apenas um dos vários fosfoésteres em um substrato de oligonucleotídeo (ver, Cech et al., Cell,
27:487-96 (1981); Michel et al., J. Mol. Biol., 216:585-610 (1990); Reinhold-Hurek et al., Nature, 357:173-6 (1992)). Essa especificidade foi atribuída ao requisito de que o substrato se ligue por meio de interações de emparelhamento de bases específicas à sequência guia interna ("IGS") da ribozima antes da reação química.
[00191] Pelo menos seis variedades básicas de moléculas de RNA enzimático de ocorrência natural são conhecidas atualmente. Cada um pode catalisar a hidrólise de ligações fosfodiéster de RNA em trans (e, portanto, pode clivar outras moléculas de RNA) em condições fisiológicas. Em geral, os ácidos nucleicos enzimáticos atuam ligando-se primeiro a um RNA alvo. Tal ligação ocorre através da porção de ligação ao alvo de um ácido nucleico enzimático que é mantido em estreita proximidade com uma porção enzimática da molécula que atua para clivar o RNA alvo. Assim, o ácido nucleico enzimático primeiro reconhece e depois se liga a um RNA alvo por meio de emparelhamento de bases complementares e, uma vez ligado ao sítio correto, atua enzimaticamente para cortar o RNA alvo. A clivagem estratégica de tal RNA alvo destruirá sua capacidade de dirigir a síntese de uma proteína codificada. Depois que um ácido nucleico enzimático se liga e cliva seu RNA alvo, ele é liberado desse RNA para procurar outro alvo e pode se ligar e clivar repetidamente novos alvos.
[00192] A molécula de ácido nucleico enzimático pode ser formada em uma cabeça de martelo, hairpin, vírus da hepatite δ, íntron do grupo I ou RNA RNaseP (em associação com uma sequência guia de RNA), ou motivo Neurospora VS RNA, por exemplo. Exemplos específicos de motivos de cabeça de martelo são descritos em, por exemplo, Rossi et al., Nucleic Acids Res., 20:4559-65 (1992). Exemplos de motivos em hairpin são descritos em, por exemplo, EP 0360257, Hampel et al., Biochemistry, 28:4929-33 (1989); Hampel et al., Nucleic Acids Res., 18:299-304 (1990); e Pat. U.S. 5.631.359. Um exemplo do motivo do vírus da hepatite δ é descrito em, por exemplo, Perrotta et al., Biochemistry, 31:11843-52 (1992). Um exemplo do motivo RNaseP é descrito em, por exemplo, Guerrier-Takada et al., Cell, 35:849-57 (1983). Exemplos do motivo da ribozima Neurospora VS RNA são descritos em, por exemplo, Saville et al., Cell, 61:685-96 (1990); Saville et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8826-30 (1991); Collins et al., Biochemistry, 32:2795-9 (1993). Um exemplo do íntron do Grupo I é descrito em, por exemplo, Pat. U.S. 4.987.071.
Características importantes das moléculas de ácido nucleico enzimáticas utilizadas de acordo com a invenção são que elas têm um sítio de ligação de substrato específico que é complementar a uma ou mais das regiões de DNA ou RNA do gene alvo, e que elas têm sequências de nucleotídeos dentro ou ao redor desse sítio de ligação de substrato que conferem uma atividade de clivagem de RNA à molécula. Assim, os construtos de ribozima não precisam ser limitados a motivos específicos aqui mencionados. As divulgações dessas referências são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todos os fins.
[00193] Os métodos de produção de uma ribozima direcionada a qualquer sequência polinucleotídica são conhecidos na técnica. As ribozimas podem ser concebidas conforme descrito, por exemplo, nas Publicações PCT WO 93/23569 e WO 94/02595, e sintetizados para serem testados in vitro e / ou in vivo como aí descrito. As divulgações dessas publicações PCT são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todos os fins.
[00194] A atividade da ribozima pode ser otimizada alterando o comprimento dos braços de ligação da ribozima ou sintetizando quimicamente ribozimas com modificações que evitam sua degradação pelas ribonucleases séricas (ver, por exemplo, Publicações PCT WO 92/07065, WO 93/15187, WO 91/03162 e WO 94/13688; EP 92110298.4; e Pat. U.S. 5.334.711, que descreve várias modificações químicas que podem ser feitas nas frações de açúcar de moléculas de RNA enzimático, cujas divulgações são cada uma aqui incorporada por referência em sua totalidade para todos os fins), modificações que aumentam sua eficácia nas células e remoção de bases do caule II para encurtar os tempos de síntese de RNA e reduzir as necessidades químicas.
Oligonucleotídeos imunoestimultórios
[00195] Os ácidos nucleicos associados a partículas de lipídeos da presente invenção podem ser imunoestimulatórios, incluindo oligonucleotídeos imunoestimulatórios (ISS; fita simples ou dupla) capazes de induzir uma resposta imune quando administrada a um sujeito, que pode ser um mamífero, como um ser humano. ISS incluem, por exemplo, certos palíndromos que levam a estruturas secundárias em hairpin (ver Yamamoto et al., J.
Immunol., 148:4072-6 (1992)), ou motivos CpG, bem como outras características ISS conhecidas (tais como domínios multi-G; ver; Publicação PCT WO 96/11266, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os efeitos).
[00196] Os ácidos nucleicos imunoestimulatórios são considerados não específicos para a sequência quando não é necessário que se liguem especificamente e reduzam a expressão de uma sequência alvo para provocar uma resposta imune. Assim, certos ácidos nucleicos imunoestimulatórios podem compreender uma sequência correspondente a uma região de um gene ou mRNA de ocorrência natural, mas ainda podem ser considerados ácidos nucleicos imunoestimulatórios específicos de sequência.
[00197] Em uma modalidade, o ácido nucleico imunoestimulatório ou oligonucleotídeo compreende pelo menos um dinucleotídeo CpG. O oligonucleotídeo ou dinucleotídeo CpG pode ser não metilado ou metilado. Em outra modalidade, o ácido nucleico imunoestimulatório compreende pelo menos um dinucleotídeo CpG com uma citosina metilada. Em uma modalidade, o ácido nucleico compreende um único dinucleotídeo CpG, em que a citosina no dinucleotídeo CpG é metilada. Em uma modalidade alternativa, o ácido nucleico compreende pelo menos dois dinucleotídeos CpG, em que pelo menos uma citosina nos dinucleotídeos CpG é metilada. Em uma outra modalidade, cada citosina nos dinucleotídeos CpG presentes na sequência é metilada. Em outra modalidade, o ácido nucleico compreende uma pluralidade de dinucleotídeos CpG, em que pelo menos um dos dinucleotídeos CpG compreende uma citosina metilada. Exemplos de oligonucleotídeos imunoestimulatórios adequados para uso nas composições e métodos da presente invenção são descritos no Pedido PCT PCT / US08 / 88676, depositado em 31 de dezembro de 2008, Publicação PCT WO 02/069369 e WO 01/15726, Pat. U.S. 6.406.705 e Raney et al., J. Pharm. Exper. Ther., 298: 1185-92 (2001), cujas divulgações são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todos os fins. Em certas modalidades, os oligonucleotídeos usados nas composições e métodos da invenção têm uma estrutura fosfodiéster ("PO") ou uma estrutura fosforotioato ("PS") e / ou pelo menos um resíduo de citosina metilada em um motivo CpG.
mRNA
[00198] Em certas modalidades, o ácido nucleico é uma ou mais moléculas de mRNA (por exemplo, um coquetel de moléculas de mRNA).
Modificações no mRNA
[00199] O mRNA usado na prática da presente invenção pode incluir uma, duas ou mais de duas modificações de nucleosídeos. Em algumas modalidades, o mRNA modificado exibe degradação reduzida em uma célula na qual o mRNA é introduzido, em relação a um mRNA não modificado correspondente.
[00200] Em algumas modalidades, os nucleosídeos modificados incluem piridin-4-ona ribonucleosídeo, 5-aza-uridina,
2-tio-5-aza-uridina, 2-tiouridina, 4-tio-pseudouridina, 2-tio-pseudouridina, 5-hidroxiuridina, 3-metiluridina, 5-carboximetil-uridina, 1-carboximetil-pseudouridina, 5-propinil-uridina, 1-propinil-pseudouridina, 5-taurinometiluridina, 1-taurinometil-pseudouridina, 5-taurinometil-2-tio-uridina, I-taurinometil-4-tio-uridina, 5-metil-uridina, 1-meti-1-pseudouridina, 4-tio- 1-meti-1-pseudouridina, 2-tio- 1-meti-1-pseudouridina, 1-meti 1-1 deaza-pseudouridina, 2-tio-1 -metil-1-deaza-pseudouridina, di-hidrouridina, di-hidropseudouridina, 2-tio-di-hidrouridina, 2-tio-di-hidropseudouridina, 2-metoxiuridina, 2-metoxi-4-tio-uridina, 4-metoxi-pseudouridina e 4-metoxi-2-tio-pseudouridina.
[00201] Em algumas modalidades, os nucleosídeos modificados incluem 5-aza-citidina, pseudoisocitidina, 3-metil-citidina, N4-acetilcitidina, 5-formilcitidina, N4-metilcitidina, 5-hidroximetilcitidina, 1-metil-pseudoisocitidina, pseudoisocitidina, pirrolo-pirrolo-pirrolo, 2-tio-citidina, 2-tio-5-metil-citidina, 4-tio-pseudoisocitidina, 4-tio-1-metil-pseudoisocitidina, 4-tio-1-metil-1-desaza-pseudoisocitidina, 1-metil - 1-deaza-pseudoisocitidina, zebularina, 5-aza-zebularina, 5-metil-zebularina, 5-aza-2-tio-zebularina, 2-tio-zebularina, 2-metoxi-citidina, 2-metoxi-5-metil -citidina, 4-metoxi-pseudoisocitidina e 4-metoxi-1-metil-pseudoisocitidina.
[00202] Em outras modalidades, os nucleosídeos modificados incluem 2-aminopurina, 2, 6-diaminopurina, 7-deaza-adenina, 7-deaza-8-aza-adenina, 7-deaza-2-aminopurina, 7-deaza-8-aza-2 -aminopurina, 7-deaza-2,6-diaminopurina, 7-deaza-8-aza-2,6-diaminopurina, 1-metiladenosina, N6-metiladenosina, N6-isopenteniladenosina, N6-(cis-hidroxi-isopentenil)adenosina, 2-metiltio-N6-(cis-hidroxi-isopentenil)adenosina, N6-glicinilcarbamoiladenosina, N6-treonilcarbamoiladenina, 2-metiltio-N6-treonilcarbamoiladenosina, N6,N6-dimetiladenosina, 7-metiladenina, 2-metiltio-adenina e 2-metoxi-adenina.
[00203] Em modalidades específicas, um nucleosídeo modificado é 5'-0-(1-Tiofosfato)-Adenosina, 5'-0-(1-Tiofosfato)-Citidina, 5'-0-(1-Tiofosfato)-Guanosina, 5'-0-(1-Tiofosfato)-Uridina ou 5'-0-(1-Tiofosfato)-Pseudouridina. A fração de fosfato substituída por α-tio é fornecida para conferir estabilidade aos polímeros de RNA através das ligações da espinha dorsal de fosforotioato não naturais. O RNA fosforotioato aumentou a resistência à nuclease e, subsequentemente, uma meia-vida mais longa em um ambiente celular. Espera-se que os ácidos nucleicos ligados ao fosforotioato também reduzam a resposta imune inata por meio de uma ligação / ativação mais fraca das moléculas imunes inatas celulares.
[00204] Em certas modalidades, é desejável degradar intracelularmente um ácido nucleico modificado introduzido na célula, por exemplo, se o tempo preciso de produção da proteína for desejado. Assim, a invenção fornece um ácido nucleico modificado contendo um domínio de degradação, que é capaz de ser atuado de uma maneira dirigida dentro de uma célula.
[00205] Em outras modalidades, os nucleosídeos modificados incluem inosina, 1-metil-inosina, wiosina, wibutosina, 7-desaza-guanosina, 7-desaza-8-aza-guanosina, 6-tio-guanosina, 6-tio-7-desaza-guanosina, 6-tio-7-deaza-8-aza-guanosina, 7-metil-guanosina, 6-tio-7-metil-guanosina, 7-metilinosina, 6-metoxi-guanosina, 1-metilguanosina, N2-metilguanosina, N2,N2-dimetilguanosina, 8-oxo-guanosina, 7-metil-8-oxo-guanosina, 1-metil-6-tio-guanosina, N2-metil-6-tio-guanosina e N2,N2-dimetil-6-tio-guanosina.
Componentes opcionais dos ácidos nucleicos modificados
[00206] Em outras modalidades, os ácidos nucleicos modificados podem incluir outros componentes opcionais, que podem ser benéficos em algumas modalidades. Esses componentes opcionais incluem,
mas não estão limitados a, regiões não traduzidas, sequências de kozak, sequências de nucleotídeos intrônicos, sítio de entrada de ribossomo interno (IRES), tampas e caudas poliA. Por exemplo, uma região não traduzida (UTR) 5' e / ou uma UTR 3' pode ser fornecida, em que um ou ambos podem conter independentemente uma ou mais modificações de nucleosídeos diferentes. Em tais modalidades, as modificações de nucleosídeos também podem estar presentes na região traduzível. Também são fornecidos ácidos nucleicos contendo uma sequência Kozak.
[00207] Além disso, são fornecidos ácidos nucleicos contendo uma ou mais sequências de nucleotídeos intrônicas capazes de serem excisadas do ácido nucleico.
Regiões não traduzidas (UTRs)
[00208] As regiões não traduzidas (UTRs) de um gene são transcritas, mas não traduzidas. A UTR 5' começa no sítio de início da transcrição e continua até o códon de início, mas não inclui o códon de início; enquanto a UTR 3' começa imediatamente após o códon de parada e continua até o sinal de terminação da transcrição. Há um crescente corpo de evidências sobre os papéis regulatórios desempenhados pelas UTRs em termos de estabilidade da molécula de ácido nucleico e tradução. As características regulatórias de uma UTR podem ser incorporadas no mRNA usado na presente invenção para aumentar a estabilidade da molécula. Os recursos específicos também podem ser incorporados para garantir a infrarregulação controlada da transcrição no caso de serem direcionados para sítios indesejados de órgãos.
Cobertura de 5'
[00209] A estrutura cap 5' de um mRNA está envolvida na exportação nuclear, aumentando a estabilidade do mRNA e se liga à Proteína de ligação Cap (CBP) do mRNA, que é responsável pela estabilidade do mRNA na célula e competência de tradução através da associação de CBP com a proteína de ligação poli(A) para formar a espécie de mRNA cíclico maduro. A cobertura auxilia ainda na remoção dos íntrons 5' proximais durante a emenda do mRNA.
[00210] As moléculas de mRNA endógenas podem ser encapsuladas na extremidade 5', gerando uma ligação 5'-ppp-5'-trifosfato entre um resíduo de cobertura de guanosina terminal e o nucleotídeo em sentido transcrito no terminal 5' da molécula de mRNA. Esta cobertura 5'-guanilato pode então ser metilada para gerar um resíduo N7-metil-guanilato. Os açúcares ribose dos nucleotídeos transcritos terminais e / ou anteterminais da extremidade 5' do mRNA podem ser opcionalmente 2'-0-metilados. Tirar a cobertura 5' através da hidrólise e clivar a estrutura de cobertura de guanilato pode direcionar uma molécula de ácido nucleico, como uma molécula de mRNA, para degradação.
Sequências IRES
[00211] mRNA contendo um sítio de entrada de ribossomo interno (IRES) também são úteis na prática da presente invenção. Um IRES pode atuar como o único sítio de ligação ao ribossomo ou pode servir como um dos vários sítios de ligação ao ribossomo de um mRNA. Um mRNA contendo mais de um sítio de ligação ao ribossomo funcional pode codificar vários peptídeos ou polipeptídeos que são traduzidos independentemente pelos ribossomos ("mRNA multicistrônico"). Quando o mRNA é fornecido com um IRES, ainda opcionalmente é fornecida uma segunda região traduzível.
Exemplos de sequências IRES que podem ser usadas de acordo com a invenção incluem, sem limitação, aquelas de picornavírus (por exemplo, FMDV), vírus de praga (CFFV), vírus da poliomielite (PV), vírus da encefalomiocardite (ECMV), vírus da febre aftosa (FMDV), vírus da hepatite C (HCV), vírus da peste suína clássica (CSFV), vírus da leucemia murina (MLV), vírus da imunodeficiência símia (S1V) ou vírus da paralisia do críquete (CrPV).
Caudas Poli-A
[00212] Durante o processamento de RNA, uma longa cadeia de nucleotídeos de adenina (cauda poli-A) pode ser adicionada a um polinucleotídeo, como moléculas de mRNA, a fim de aumentar a estabilidade.
Imediatamente após a transcrição, a extremidade 3' do transcrito pode ser clivada para liberar um hidroxil 3'. Em seguida, a polimerase poli-A adiciona uma cadeia de nucleotídeos de adenina ao RNA. O processo, chamado de poliadenilação, adiciona uma cauda poli-A que pode ter entre 100 e 250 resíduos de comprimento.
[00213] Geralmente, o comprimento de uma cauda poli-A é maior do que 30 nucleotídeos de comprimento. Em outra modalidade, a cauda poli-A é maior do que 35 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, pelo menos ou maior que cerca de 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2.000, 2.500 e 3.000 nucleotídeos).
[00214] Neste contexto, a cauda poli-A pode ser 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100% maior em comprimento do que o mRNA modificado. A cauda poli-A também pode ser concebida como uma fração de ácidos nucleicos modificados aos quais pertence. Neste contexto, a cauda poli-A pode ser 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90% ou mais do comprimento total do mRNA modificado ou o comprimento total do mRNA modificado menos a cauda poli-A.
Gerando moléculas de mRNA
[00215] Métodos para isolar RNA, sintetizar RNA, hibridar ácidos nucleicos, fazer e rastrear bibliotecas de cDNA e realizar PCR são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Gubler and Hoffman, Gene, 25:263-269 (1983); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989)); assim como os métodos de PCR (ver Patentes U.S. 4.683.195 e 4.683.202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990)). Bibliotecas de expressão também são bem conhecidas pelos versados na técnica. Textos básicos adicionais que revelam os métodos gerais de utilização nesta invenção incluem Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); e Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994). As divulgações dessas referências são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todos os fins.
Polipeptídeos Codificados
[00216] O componente de mRNA de uma partícula de lipídeo de ácido nucleico aqui descrito pode ser usado para expressar um polipeptídeo de interesse. Certas doenças em humanos são causadas pela ausência ou deficiência de uma proteína funcional em um tipo de célula onde a proteína está normalmente presente e ativa. A proteína funcional pode estar completa ou parcialmente ausente devido, por exemplo, à inatividade transcricional do gene codificador ou devido à presença de uma mutação no gene codificador que torna a proteína completa ou parcialmente não funcional. Exemplos de doenças humanas que são causadas pela inativação completa ou parcial de uma proteína incluem imunodeficiência combinada grave ligada ao X (X-SCID) e adrenoleucodistrofia (X-ALD). O X-SCID é causado por uma ou mais mutações no gene que codifica a proteína da cadeia gama comum que é um componente dos receptores para várias interleucinas que estão envolvidas no desenvolvimento e maturação de células B e T no sistema imunológico. O X-ALD é causado por uma ou mais mutações em um gene da proteína transportadora da membrana peroxissomal chamada ABCD1. Os indivíduos que sofrem de X-ALD têm níveis muito altos de ácidos graxos de cadeia longa nos tecidos do corpo, o que causa uma variedade de sintomas que podem levar à deficiência mental ou morte.
[00217] Têm sido feitas tentativas de usar a terapia genética para tratar algumas doenças causadas pela ausência ou deficiência de uma proteína funcional em um tipo de célula onde a proteína está normalmente presente e ativa. A terapia genética normalmente envolve a introdução de um vetor que inclui um gene que codifica uma forma funcional da proteína afetada, em uma pessoa doente, e a expressão da proteína funcional para tratar a doença. Até agora, a terapia genética teve sucesso limitado. Além disso, certos aspectos da distribuição de mRNA usando LNPs foram descritos, por exemplo, nas Publicações Internacionais Números WO 2018/006052 e WO 2015/011633.
[00218] Como tal, existe uma necessidade contínua de melhoria para expressar uma forma funcional de uma proteína dentro de um ser humano que sofre de uma doença causada pela ausência completa ou parcial da proteína funcional, e há uma necessidade de distribuição melhorada de ácidos nucleicos (por exemplo, mRNA) por meio de métodos e composições, por exemplo, que podem desencadear menos de uma resposta imune à terapia.
Certas modalidades da presente invenção são úteis neste contexto. Assim, em certas modalidades, a expressão do polipeptídeo melhora um ou mais sintomas de uma doença ou distúrbio. Certas composições e métodos da invenção podem ser úteis para o tratamento de doenças humanas causadas pela ausência ou níveis reduzidos de um polipeptídeo funcional no corpo humano. Em outras modalidades, certas composições e métodos da invenção podem ser úteis para expressar um antígeno de vacina para o tratamento do câncer.
RNA de autoamplificação
[00219] Em certas modalidades, o ácido nucleico é uma ou mais moléculas de RNA de autoamplificação. O RNA de autoamplificação (sa-RNA) também pode ser referido como RNA de autorreplicação, RNA competente para replicação, replicons ou RepRNA. RepRNA, referido como mRNA de autoamplificação quando derivado de vírus de fita positiva, é gerado a partir de um genoma viral sem pelo menos um gene estrutural; ele pode traduzir e replicar (portanto, "autoamplificação") sem gerar vírus de progênie infecciosa. Em certas modalidades, a tecnologia RepRNA pode ser usada para inserir um cassete de gene que codifica um antígeno de interesse desejado. Por exemplo, o genoma alfaviral é dividido em duas estruturas de leitura aberta (ORFs): a primeira ORF codifica proteínas para a RNA polimerase dependente de RNA (replicase) e a segunda ORF codifica proteínas estruturais. Em construtos de vacina de sa-RNA, a ORF que codifica proteínas estruturais virais pode ser substituída por qualquer antígeno de escolha, enquanto a replicase viral permanece uma parte integrante da vacina e conduz a amplificação intracelular do RNA após a imunização.
Outros Agentes Ativos
[00220] Em certas modalidades, o agente ativo associado às partículas de lipídeos da invenção pode compreender uma ou mais proteínas terapêuticas, polipeptídeos ou pequenas moléculas ou compostos orgânicos.
Exemplos não limitativos de tais agentes ou drogas terapeuticamente eficazes incluem drogas oncológicas (por exemplo, drogas quimioterápicas, agentes terapêuticos hormonais, agentes imunoterapêuticos, agentes radioterapêuticos, etc.), agentes redutores de lipídeos, drogas antivirais, compostos anti-inflamatórios, antidepressivos, estimulantes, analgésicos, antibióticos, medicação anticoncepcional, antipiréticos, vasodilatadores, antiangiogênicos, agentes citovasculares, inibidores de transdução de sinal, drogas cardiovasculares, tais como agentes antiarrítmicos, hormônios, vasoconstritores e esteroides. Estes agentes ativos podem ser administrados sozinhos nas partículas de lipídeos da invenção, ou em combinação (por exemplo, coadministrados) com partículas de lipídeos da invenção compreendendo ácido nucleico, tais como RNA ou mRNA interferentes.
[00221] Exemplos não limitativos de drogas de quimioterapia incluem drogas à base de platina (por exemplo, oxaliplatina, cisplatina, carboplatina, espiroplatina, iproplatina, satraplatina, etc.), agentes alquilantes (por exemplo, ciclofosfamida, ifosfamida, clorambucil, bussulfano, melfalano,
mecloretamina, uramustina, tiotepa, nitrosoureias, etc.), anti-metabólitos (por exemplo, 5-fluorouracil (5-FU), azatioprina, metotrexato, leucovorina, capecitabina, citarabina, floxuridina, fludarabina, gencitabina, pemetrexed, raltitrexed, etc.), alcaloides vegetais (por exemplo, vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina, podofilotoxina, paclitaxel (taxol), docetaxel, etc.), inibidores de topoisomerase (por exemplo, irinotecano-CPT-11; Camptosar), topotecano, amsacrina, etoposídeo (VP16), fosfato de etoposídeo, teniposídeo, etc.), antibióticos antitumorais (por exemplo, doxorrubicina, adriamicina, daunorrubicina, epirrubicina, actinomicina, bleomicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, etc.), inibidores de tirosina quinase (por exemplo, gefltinibe (Iressa®), sunitinibe (Sutent®; SU11248), erlotinibe (Tarceva®; OSI-1774), lapatinibe (GW572016; GW2016), canertinibe (CI 1033), semaxinibe (SU5416), vatalanibe (PTK787/ZK222584), sorafenibe (BAY 43-9006), imatinibe (Gleevec®; STI571), dasatinibe (BMS-354825), leflunomida (SU101), vandetanibe (Zactima™; ZD6474), etc.), sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, estereoisômeros dos mesmos, derivados dos mesmos, análogos dos mesmos e combinações dos mesmos.
[00222] Exemplos de agentes terapêuticos hormonais convencionais incluem, sem limitação, esteroides (por exemplo, dexametasona), finasterida, inibidores da aromatase, tamoxifeno e goserelina, bem como outros agonistas do hormônio liberador de gonadotropina (GnRH).
[00223] Exemplos de agentes imunoterapêuticos convencionais incluem, mas não estão limitados a, imunoestimulantes (por exemplo, Bacillus Calmette-Guérin (BCG), levamisol, interleucina-2, alfa-interferon, etc.), anticorpos monoclonais (por exemplo, anticorpos monoclonais anti-CD20, anti-HER2, anti-CD52, anti-HLA-DR e anti-VEGF), imunotoxinas (por exemplo, anticorpo monoclonal conjugado anti-CD33-caliqueamicina, anticorpo monoclonal conjugado anti-CD22-exotoxina pseudomonas, etc.) e radioimunoterapia (por exemplo, anticorpo monoclonal anti-CD20 conjugado com 111In, 90Y, ou 131I, etc.).
[00224] Exemplos de agentes radioterapêuticos convencionais incluem, mas não estão limitados a, radionuclídeos, tais como 47Sc, 64Cu, 67Cu, 89Sr, 86Y, 87Y, 90Y, 105Rh, 111Ag, 111In, 117mSn, 149Pm, 153Sm, 166 177 186 188 211 212 Ho, Lu, Re, Re, At, e Bi, opcionalmente conjugado a anticorpos dirigidos contra antígenos tumorais.
[00225] Drogas oncológicas adicionais que podem ser usadas de acordo com a invenção incluem, mas não estão limitadas a, alquerano, alopurinol, altretamina, amifostina, anastrozol, araC, trióxido de arsênio, bexaroteno, biCNU, carmustina, CCNU, celecoxibe, cladribina, ciclosporina A, citosina arabinosídeo, citoxano, dexrazoxano, DTIC, estramustina, exemestano, FK506, gemtuzumabe-ozogamicina, hidreia, hidroxiureia, idarrubicina, interferon, letrozol, leustatina, leuprolida, litretinoína, megastrol, L-PAM, mesna, metoxsaleno, mitramicina, mostarda nitrogenada, pamidronato, Pegademase, pentostatina, porfímero sódico, prednisona, rituxano, estreptozocina, STI-571, taxotere, temozolamida, VM-26, toremifeno, tretinoína, ATRA, valrubicina e velbano. Outros exemplos de drogas oncológicas que podem ser utilizadas de acordo com a invenção são elipticina e análogos ou derivados da elipticina, epotilonas, inibidores da quinase intracelular e camptotecinas.
[00226] Exemplos não limitativos de agentes redutores de lipídeos para o tratamento de uma doença ou distúrbio lipídico associado a triglicerídeos elevados, colesterol e / ou glicose incluem estatinas, fibratos, ezetimiba, tiazolidinedionas, niacina, beta-bloqueadores, nitroglicerina, antagonistas de cálcio, óleo de peixe, e misturas dos mesmos.
[00227] Exemplos de drogas antivirais incluem, mas não estão limitados a, abacavir, aciclovir, aciclovir, adefovir, amantadina, amprenavir,
arbidol, atazanavir, atripla, cidofovir, combivir, darunavir, delavirdina, didanosina, docosanol, edoxudina, efavirenz, emtricitabina, enfuvirtida, entecavir, inibidores de entrada, famciclovir, combinações de dose fixa, fomivirsen, fosamprenavir, foscarnet, fosfonet, inibidores de fusão, ganciclovir, ibacitabina, imunovir, idoxuridina, imiquimod, indinavir, inosina, inibidores da integrase, interferon tipo III (por exemplo, moléculas de IFN-λ, como IFN-λ1, IFN-λ2 e IFN-λ3), interferon tipo II (por exemplo, IFN-γ), interferon tipo I (por exemplo, IFN-α tal como IFN-α, IFN-β, IFN-κ, IFN-δ, IFN-ε, IFN-τ, IFN-ω e IFN-ζ), interferon, lamivudina, lopinavir, lovirida, MK-0518, maraviroc, moroxidina, nelfinavir, nevirapina, nexavir, análogos de nucleosídeo, oseltamivir, penciclovir, peramivir, pleconaril, podofilotoxina, inibidores da protease, inibidores da transcriptase reversa, ribavirina, rimantadina, ritonavir, saquinavir, estavudina, potencializadores sinérgicos, tenofovir, tenofovir disoproxil, tipranavir, trifluridina, trizivir, tromantadina, truvada, valaciclovir, valganciclovir, vicriviroc, vidarabina, viramidina, zalcitabina, zanamivir, zidovudina, sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, estereoisômeros dos mesmos, derivados dos mesmos, análogos dos mesmos e misturas dos mesmos.
Partículas de lipídeos
[00228] As partículas de lipídeos da invenção tipicamente compreendem um agente ativo ou agente terapêutico, um lipídeo catiônico, um lipídeo não catiônico e um lipídeo conjugado que inibe a agregação de partículas. Em algumas modalidades, o agente ativo ou agente terapêutico é totalmente encapsulado na porção lipídica da partícula de lipídeo, de modo que o agente ativo ou agente terapêutico na partícula de lipídeo seja resistente em solução aquosa à degradação enzimática, por exemplo, por uma nuclease ou protease. Em outras modalidades, as partículas de lipídeos descritas aqui são substancialmente não tóxicas para mamíferos, como humanos. As partículas de lipídeos da invenção tipicamente têm um diâmetro médio de cerca de 40 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 50 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 60 nm a cerca de 130 nm, de cerca de 70 nm a cerca de 110 nm, ou de cerca de 70 a cerca de 90 nm.
[00229] Em modalidades preferidas, as partículas de lipídeos da invenção são partículas de lipídeos de ácido nucleico (LNP) estáveis no soro que compreendem uma ou mais moléculas de ácido nucleico, como um RNA interferente (por exemplo, siRNA, aiRNA e / ou miRNA) ou mRNA ; um lipídeo catiônico (por exemplo, um lipídeo catiônico de Fórmulas I, II e / ou III); um lipídeo não catiônico (por exemplo, colesterol sozinho ou misturas de um ou mais fosfolipídeos e colesterol); e um lipídeo conjugado que inibe a agregação das partículas (por exemplo, um ou mais conjugados PEG-lipídeo). O LNP pode compreender pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais moléculas de ácido nucleico não modificadas e / ou modificadas. Partículas de ácido nucleico-lipídeo e seu método de preparação são descritos em, por exemplo, Pat. U.S.
5.753.613; 5.785.992; 5.705.385; 5.976.567; 5.981.501; 6.110.745; e 6.320.017; e Publicação PCT WO 96/40964, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência na sua totalidade para todos os efeitos.
Lipídeos Catiônicos
[00230] Nas nanopartículas de lipídeos da invenção, o lipídeo catiônico pode ser selecionado de compostos de fórmula (I): em que: R1 é um C2-C30 hidrocarbil; R2 é um C2-C30 hidrocarbil; R3 é um C2-C30 hidrocarbil;
X é um C2-C8 alquil divalente; R4 é NRaRb; e cada Ra e Rb é independentemente selecionado do grupo que consiste em metil, etil, propil, ciclopropil e butil, cujo metil, etil, propil, ciclopropil e butil é opcionalmente substituído por hidróxi; ou R a e Rb tomados com o nitrogênio ao qual eles estão fixados formam um anel de aziridina, azetidina, prolina, piperidina, piperazina ou morfolina, cujo anel é opcionalmente substituído por hidroxil ou com C1-C6 alquil que é opcionalmente substituído por hidróxi.
[00231] Em uma modalidade R1 é um C2-C20 hidrocarbil.
[00232] Em uma modalidade R1 é um C2-C15 hidrocarbil.
[00233] Em uma modalidade R1 é um C2-C10 hidrocarbil.
[00234] Em uma modalidade R1 é um C5-C20 hidrocarbil.
[00235] Em uma modalidade R1 é um (C2-C20)alquil, (C2-C20)alquenil, ou (C2-C20)alquinil.
[00236] Em uma modalidade R1 é um (C8-C20)alquil.
[00237] Em uma modalidade R1 é um (C8-C20)alquenil.
[00238] Em uma modalidade R1 é um (C8-C20)alquinil.
[00239] Em uma modalidade R1 é um (C8-C20)alquenil, com apenas uma ligação dupla.
[00240] Em uma modalidade R1 é (Z)-4-decen-1-il, 1-nonil, 3-undecil, 1-decil, 6(Z), 15(Z)-enicosandieno- 11-il, 3-hexen-1-il, 9(Z)-octadeceno-1-il ou 2-butiloct-1-il, 4-(1-metiletenil)ciclo-hexen-1-ilmetil.
[00241] Em uma modalidade R2 é um C2-C20 hidrocarbil.
[00242] Em uma modalidade R2 é um C2-C15 hidrocarbil.
[00243] Em uma modalidade R2 é um C2-C10 hidrocarbil.
[00244] Em uma modalidade R2 é um C5-C20 hidrocarbil.
[00245] Em uma modalidade R2 é um (C2-C20)alquil,
(C2-C20)alquenil, ou (C2-C20)alquinil.
[00246] Em uma modalidade R2 é um (C8-C20)alquil.
[00247] Em uma modalidade R2 é um (C8-C20)alquenil.
[00248] Em uma modalidade R2 é um (C8-C20)alquinil.
[00249] Em uma modalidade R2 é um (C8-C20)alquenil, com apenas uma ligação dupla.
[00250] Em uma modalidade R2 é (Z)-4-decen-1-il, 1-nonil, 3-undecil, 1-decil, 6(Z), 15(Z)-enicosandieno- 11-il, 3-hexen-1-il, 9(Z)-octadeceno-1-il ou 2-butiloct-1-il, 4-(1-metiletenil)ciclo-hexen-1-ilmetil.
[00251] Em uma modalidade R3 é um C2-C20 hidrocarbil.
[00252] Em uma modalidade R3 é um C2-C15 hidrocarbil.
[00253] Em uma modalidade R3 é um C2-C10 hidrocarbil.
[00254] Em uma modalidade R3 é um C5-C20 hidrocarbil.
[00255] Em uma modalidade R3 é um (C2-C20)alquil, (C2-C20)alquenil, ou (C2-C20)alquinil.
[00256] Em uma modalidade R3 é um (C8-C20)alquil.
[00257] Em uma modalidade R3 é um (C8-C20)alquenil.
[00258] Em uma modalidade R3 é um (C8-C20)alquinil.
[00259] Em uma modalidade R3 é um (C8-C20)alquenil, com apenas uma ligação dupla.
[00260] Em uma modalidade R3 é (Z)-4-decen-1-il, 1-nonil, 3-undecil, 1-decil, 6(Z), 15(Z)-enicosandiene-11-il, 3-hexen-1-il, 9(Z)-octadeceno-1-il, adamantil-1-ilmetil, 2-butiloct-1-il, (Z)-2-((Z)-dec-4-en-1-il)dodec-6-en-1-il ou 4-(prop-1-eno-2-il)ciclo-hex-1-en-1-il)metil.
[00261] Em uma modalidade X é um C2-C6 alquil divalente.
[00262] Em uma modalidade X é um C3-C5 alquil divalente.
[00263] Em uma modalidade X é –CH2CH2CH2-.
[00264] Em uma modalidade X é –CH2CH2CH2CH2-.
[00265] Em uma modalidade X é –CH2CH2CH2 CH2CH2-.
[00266] Em uma modalidade cada Ra e Rb é independentemente selecionado do grupo que consiste em metil, etil, propil, ciclopropil e butil, cujo metil, etil, propil, ciclopropil e butil é opcionalmente substituído por hidróxi.
[00267] Em uma modalidade, Ra e Rb tomados com o nitrogênio ao qual eles estão fixados formam um anel aziridina, azetidina, prolina, piperidina, piperazina ou morfolina, cujo anel é opcionalmente substituído por hidroxil ou por C1-C6 alquil que é opcionalmente substituído por hidróxi.
[00268] Em uma modalidade, cada Ra e Rb é independentemente selecionado do grupo que consiste em metil e etil.
[00269] Em uma modalidade R4 é dimetilamino.
Lipídeos não catiônicos
[00270] Os lipídeos não catiônicos usados nas partículas de lipídeos da invenção (por exemplo, LNP) podem ser qualquer um de uma variedade de lipídeos neutros não carregados, zwitteriônicos ou aniônicos capazes de produzir um complexo estável.
[00271] Exemplos não limitativos de lipídeos não catiônicos incluem fosfolipídeos, tais como lecitina, fosfatidiletanolamina, lisolecitina, lisofosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, esfingomielina,ovo esfingomielina (ESM), cefalina, cardiolipina, ácido fosfatídico, cerebrosídeos, dicetilfosfato, diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoil-fosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoil-fosfatidiletanolamina (POPE), palmitoiloleol-fosfatidilglicerol (POPG), dioleoilfosfatidiletanolamina
4-(N-maleimidometil)-ciclo-hexano-1-carboxilato (DOPE-mal), dipalmitoil-fosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoil-fosfatidiletanolamina (DMPE), diestearoil-fosfatidiletanolamina (DSPE), monometil-fosfatidiletanolamina, dimetil-fosfatidiletanolamina, dielaidoil-fosfatidiletanolamina (DEPE), estearoiloleoil-fosfatidiletanolamina (SOPE), lisofosfatidilcolina, dilinoleoilfosfatidilcolina e misturas dos mesmos.
Também podem ser usados outros diacilfosfatidilcolina e fosfolipídeos de diacilfosfatidiletanolamina. Os grupos acil nestes lipídeos são preferencialmente grupos acil derivados de ácidos graxos com cadeias de C10-C24 carbono, por exemplo, lauroil, miristoil, palmitoil, estearoil ou oleoil.
[00272] Exemplos adicionais de lipídeos não catiônicos incluem esteróis, tais como colesterol e derivados dos mesmos, tais como colestanol, colestanona, colestenona, coprostanol, colesteril-2'-hidroxietil éter, colesteril-4'-hidroxibutiléter e misturas dos mesmos.
[00273] Em algumas modalidades, o lipídeo não catiônico presente nas partículas de lipídeos (por exemplo, LNP) compreende ou consiste em colesterol ou um derivado do mesmo, por exemplo, uma formulação de partícula de lipídeo livre de fosfolipídeos. Em outras modalidades, o lipídeo não catiônico presente nas partículas de lipídeos (por exemplo, LNP) compreende ou consiste em um ou mais fosfolipídeos, por exemplo, uma formulação de partícula de lipídeo sem colesterol. Em outras modalidades, o lipídeo não catiônico presente nas partículas de lipídeos (por exemplo, LNP) compreende ou consiste em uma mistura de um ou mais fosfolipídeos e colesterol ou um derivado do mesmo.
[00274] Outros exemplos de lipídeos não catiônicos adequados para uso na presente invenção incluem lipídeos contendo não fósforo, tais como, por exemplo, estearilamina, dodecilamina, hexadecilamina, palmitato de acetil, glicerolricinoleato, hexadecil estereato, miristato de isopropil,
polímeros acrílicos anfotéricos, trietanolamina-lauril sulfato, amidas de ácidos graxos polietiloxiladas de alquil-aril sulfato, brometo de dioctadecildimetil amônio, ceramida, esfingomielina e semelhantes.
[00275] Em algumas modalidades, o lipídeo não catiônico compreende de cerca de 13% em mol a cerca de 49,5% em mol, de cerca de 20% em mol a cerca de 45% em mol, de cerca de 25% em mol a cerca de 45% em mol, de cerca de 30% em mol a cerca 45% em mol, de cerca de 35% em mol a cerca de 45% em mol, de cerca de 20% em mol a cerca de 40% em mol, de cerca de 25% em mol a cerca de 40% em mol, ou de cerca de 30% em mol a cerca de 40% em mol do lipídeo total presente na partícula.
[00276] Em certas modalidades, o colesterol presente em partículas de lipídeos livres de fosfolipídeos compreende de cerca de 30% em mol a cerca de 45% em mol, de cerca de 30% em mol a cerca de 40% em mol, de cerca de 35% em mol a cerca de 45% em mol, ou de cerca de 35% em mol a cerca de 40% em mol do lipídeo total presente na partícula. Como um exemplo não limitativo, uma partícula de lipídeo livre de fosfolipídeo pode compreender colesterol em cerca de 37% em mol do lipídeo total presente na partícula.
[00277] Em certas outras modalidades, o colesterol presente em partículas de lipídeos contendo uma mistura de fosfolipídeo e colesterol compreende de cerca de 30% em mol a cerca de 40% em mol, de cerca de 30% em mol a cerca de 35% em mol, ou de cerca de 35% em mol a cerca de 40% em mol do lipídeo total presente na partícula. Como um exemplo não limitativo, uma partícula de lipídeo compreendendo uma mistura de fosfolipídeo e colesterol pode compreender colesterol em cerca de 34% em mol do lipídeo total presente na partícula.
[00278] Em outras modalidades, o colesterol presente nas partículas de lipídeos contendo uma mistura de fosfolipídeo e colesterol compreende de cerca de 10% em mol a cerca de 30% em mol, de cerca de 15%
em mol a cerca de 25% em mol, ou de cerca de 17% em mol a cerca de 23% em mol do lipídeo total presente na partícula. Como um exemplo não limitativo, uma partícula de lipídeo compreendendo uma mistura de fosfolipídeo e colesterol pode compreender colesterol em cerca de 20% em mol do lipídeo total presente na partícula.
[00279] Em modalidades em que as partículas de lipídeos contêm uma mistura de fosfolipídeo e colesterol ou um derivado do colesterol, a mistura pode compreender até cerca de 40, 45, 50, 55 ou 60% em mol do lipídeo total presente na partícula. Em certos casos, o componente fosfolipídeo na mistura pode compreender de cerca de 2% em mol a cerca de 12% em mol, de cerca de 4% em mol a cerca de 10% em mol, de cerca de 5% em mol a cerca de 10% em mol, de cerca de 5% em mol a cerca de 9% em mol, ou de cerca de 6% em mol a cerca de 8% em mol do lipídeo total presente na partícula. Como um exemplo não limitativo, uma partícula de lipídeo compreendendo uma mistura de fosfolipídeo e colesterol pode compreender um fosfolipídeo, tal como DPPC ou DSPC em cerca de 7% em mol (por exemplo, em uma mistura com cerca de 34% em mol de colesterol) do lipídeo total presente na partícula. Em certos outros casos, o componente fosfolipídeo na mistura pode compreender de cerca de 10% em mol a cerca de 30% em mol, de cerca de 15% em mol a cerca de 25% em mol, ou de cerca de 17% em mol a cerca de 23% em mol do lipídeo total presente na partícula. Como outro exemplo não limitativo, uma partícula de lipídeo compreendendo uma mistura de fosfolipídeo e colesterol pode compreender um fosfolipídeo, tal como DPPC ou DSPC em cerca de 20% em mol (por exemplo, em uma mistura com cerca de 20% em mol de colesterol) do lipídeo total presente na partícula.
Conjugado de lipídeo
[00280] Além dos lipídeos catiônicos e não catiônicos, as partículas de lipídeos da invenção (por exemplo, LNP) compreendem um conjugado de lipídeo. O conjugado de lipídeo é útil na medida em que evita a agregação de partículas. Os lipídeos conjugados adequados incluem, mas não estão limitados a, conjugados PEG-lipídeo, conjugados ATTA-lipídeo, conjugados catiônico-polímero-lipídeo (CPLs) e misturas dos mesmos. Em certas modalidades, as partículas compreendem um conjugado PEG-lipídeo ou um conjugado ATTA-lipídeo junto com um CPL.
[00281] Em uma modalidade preferida, o conjugado de lipídeo é um PEG-lipídeo. Exemplos de PEG-lipídeos incluem, mas não estão limitados a, PEG acoplado a dialquiloxipropil (PEG-DAA) como descrito em, por exemplo, Publicação PCT WO 05/026372, PEG acoplado a diacilglicerol (PEG-DAG), como descrito em, por exemplo, Publicação de Patente U.S.
20030077829 e 2005008689, PEG acoplado a fosfolipídeos, tais como fosfatidiletanolamina (PEG-PE), PEG conjugado a ceramidas como descrito em, por exemplo, Pat. U.S. 5.885.613, PEG conjugado com colesterol ou um derivado do mesmo, e misturas dos mesmos. As divulgações desses documentos são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todos os fins. PEG-lipídeos adicionais incluem, sem limitação, PEG-C-DOMG, 2 KPEG-DMG e uma mistura dos mesmos.
[00282] O PEG é um polímero linear solúvel em água de unidades de repetição de PEG de etileno com dois grupos hidroxil terminais. Os PEGs são classificados por seus pesos moleculares; por exemplo, o PEG 2000 tem um peso molecular médio de cerca de 2.000 daltons e o PEG 5000 tem um peso molecular médio de cerca de 5.000 daltons. Os PEGs estão comercialmente disponíveis na Sigma Chemical Co. e outras empresas e incluem, por exemplo, o seguinte: monometoxipolietileno glicol (MePEG-OH), monometoxipolietileno glicol-succinato (MePEG-S), monometoxipolietileno glicol-succinimidil succinato (MePEG-S-NHS), monometoxipolietilenoglicol-amina (MePEG-NH2),
monometoxipolietilenoglicol-tresilato (MePEG-TRES) e monometoxipolietilenoglicol-imidazolil-carbonil (MePEG-IM). Outros PEGs, como os descritos na Pat. U.S. 6.774.180 e 7.053.150 (por exemplo, mPEG (20 KDa) amina) também são úteis para preparar os conjugados PEG-lipídeo da presente invenção. As divulgações dessas patentes são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todos os fins. Além disso, o ácido monometoxipolietilenoglicolacético (MePEG-CH2COOH) é particularmente útil para a preparação de conjugados PEG-lipídeo incluindo, por exemplo, conjugados PEG-DAA.
[00283] A fração PEG dos conjugados PEG-lipídeo aqui descritos pode compreender um peso molecular médio variando de cerca de 550 daltons a cerca de 10.000 daltons. Em certos casos, a fração PEG tem um peso molecular médio de cerca de 750 daltons a cerca de 5.000 daltons (por exemplo, de cerca de 1.000 daltons a cerca de 5.000 daltons, de cerca de 1.500 daltons a cerca de 3.000 daltons, de cerca de 750 daltons a cerca de 3.000 daltons, de cerca de 750 daltons a cerca de 2.000 daltons, etc.). Em modalidades preferidas, a fração PEG tem um peso molecular médio de cerca de 2.000 daltons ou cerca de 750 daltons.
[00284] Em certos casos, o PEG pode ser opcionalmente substituído por um grupo alquil, alcoxi, acil ou aril. O PEG pode ser conjugado diretamente ao lipídeo ou pode ser ligado ao lipídeo através de uma fração de ligante. Qualquer fração de ligante adequada para acoplar o PEG a um lipídeo pode ser usada incluindo, por exemplo, frações de ligante não contendo éster e frações de ligante contendo éster Numa modalidades preferida, a fração de ligante é uma fração de ligante não contendo éster. Conforme usado neste documento, o termo "fração de ligante não contendo éster" refere-se a uma fração de ligante que não contém uma ligação éster carboxílico (-OC(O)-). As frações de ligantes não contendo éster adequadas incluem, mas não estão limitadas a, amido (—C(O)NH—), amino (—NR—), carbonil (—C(O)—), carbamato (—NHC(O)O—), ureia (—NHC(O)NH—), dissulfeto (—S—S—), éter (—O—), succinil (—(O)CCH2CH2C(O)—), succinamidil (—NHC(O)CH2CH2C(O)NH—), éter, dissulfeto, bem como suas combinações (tal como um ligante contendo uma fração de ligante carbamato e uma fração de ligante amido). Em uma modalidade preferida, um ligante de carbamato é usado para acoplar o PEG ao lipídeo.
[00285] Em outras modalidades, uma fração de ligante contendo éster é usada para acoplar o PEG ao lipídeo. As frações de ligante contendo éster adequadas incluem, por exemplo, carbonato (—OC(O)O—), succinoil, ésteres de fosfato (—O—(O)POH—O—), ésteres de sulfonato e combinações dos mesmos.
[00286] Conjugados PEG-lipídeo adicionais adequados para uso na invenção incluem, mas não estão limitados a, compostos de fórmula: A-B-C ou um sal do mesmo; em que: A é (C1-C6)alquil, (C3-C8)cicloalquil, (C3-C8)cicloalquil(C1-C6)alquil, (C1-C6)alcoxi, (C2-C6)alquenil, (C2-C6)alquinil, (C1-C6)alcanoil, (C1-C6)alcoxicarbonil, (C1-C6)alquiltio, ou (C2-C6)alcanoiloxi, em que qualquer (C1-C6)alquil, (C3-C8)cicloalquil, (C3-C8)cicloalquil(C1-C6)alquil, (C1-C6)alcoxi, (C2-C6)alquenil, (C2-C6)alquinil, (C1-C6)acanoil, (C1-C6)alcoxicarbonil, (C1-C6)alquiltio, e (C2-C6)alcanoiloxi é substituído por um ou mais grupos precursores aniônicos, e em que qualquer (C1-C6)alquil, (C3-C8)cicloalquil, (C3-C8)cicloalquil(C1-C6)alquil, (C1-C6)alcoxi, (C2-C6)alquenil, (C2-C6)alquinil, (C1-C6)alcanoil, (C1-C6)alcoxcarbonil, (C1-C6)alquiltio, e (C2-C6)alcanoiloxi é opcionalmente substituído por um ou mais grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em halo, hidroxil, (C 1-C3)alcoxi, (C1-C6)alcanoil, (C1-C3)alcoxicarbonil, (C1-C3)alquiltio, ou (C2-C3)alcanoiloxi;
B é uma cadeia de polietileno glicol tendo um peso molecular de cerca de 550 daltons a cerca de 10.000 daltons; C é –L-Ra L é selecionado do grupo que consiste em uma ligação direta, -C(O)O-, -C(O)NRb-, -NRb-, -C(O)-, -NRbC(O)O-, -NRbC(O)NRb-, -S-S-, -O-, -(O)CCH2CH2C(O)-, and -NHC(O)CH2CH2C(O)NH-; Ra é um (C10-C50)alquil ramificado ou (C10-C50)alquenil ramificado em que um ou mais átomos de carbono do (C10-C50)alquil ramificado ou C(10-C50)alquenil ramificado foram substituídos por -O-; e cada Rb é independentemente H ou (C1-C6)alquil.
[00287] Os lipídeos conjugados podem compreender um PEG-lipídeo incluindo, por exemplo, um composto de fórmula A-PEG-diacilglicerol (DAG), A-PEG dialquiloxipropil (DAA), A-PEG-fosfolipídeo, A-PEG-ceramida (Cer), ou misturas dos mesmos, em que A é (C1-C6)alquil, (C3-C8)cicloalquil, (C3-C8)cicloalquil(C1-C6)alquil, (C1-C6)alcoxi, (C2-C6)alquenil, (C2-C6)alquinil, (C1-C6)alcanoil, (C1-C6)alcoxicarbonil, (C1-C6)alquiltio, ou (C2-C6)alcanoiloxi, em que qualquer (C1-C6)alquil, (C3-C8)cicloalquil, (C3-C8)cicloalquil(C1-C6)alquil, (C1-C6)alcoxi, (C2-C6)alquenil, (C2-C6)alquinil, (C1-C6)alcanoil, (C1-C6)alcoxicarbonil, (C1-C6)alquiltio, e (C2-C6)alcanoiloxi é substituído por um ou mais grupos precursores aniônicos, e em que qualquer (C1-C6)alquil, (C3-C8)cicloalquil, (C3-C8)cicloalquil(C1-C6)alquil, (C1-C6)alcoxi, (C2-C6)alquenil, (C2-C6)alquinil, (C1-C6)alcanoil, (C1-C6)alcoxicarbonil, (C1-C6)alquiltio, e (C2-C6)alcanoiloxi é opcionalmente substituído por um ou mais grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em halo, hidroxil, (C1-C3)alcoxi, (C1-C6)alcanoil, (C1-C3)alcoxicarbonil, (C1-C3)alquiltio, ou (C2-C3)alcanoiloxi. O conjugado A-PEG-DAA pode ser A-PEG-dilauriloxipropil (C12), A-PEG-dimiristiloxipropil (C14), A-PEG-dipalmitiloxipropil (C16), ou A-PEG-disteariloxipropil (C18) ou misturas dos mesmos.
[00288] As fosfatidiletanolaminas possuindo uma variedade de grupos de cadeia acil de comprimentos de cadeia e graus de saturação variados podem ser conjugadas com PEG para formar o conjugado de lipídeo.
Essas fosfatidiletanolaminas estão disponíveis comercialmente ou podem ser isoladas ou sintetizadas usando técnicas convencionais conhecidas dos versados na técnica. As fosfatidiletanolaminas contendo ácidos graxos saturados ou insaturados com comprimentos de cadeia de carbono na faixa de C10 a C20 são preferidas. Fosfatidiletanolaminas com ácidos graxos mono- ou di-insaturados e misturas de ácidos graxos saturados e insaturados também podem ser usados. Fosfatidiletanolaminas adequadas incluem, mas não estão limitadas a, dimiristoil-fosfatidiletanolamina (DMPE), dipalmitoil-fosfatidiletanolamina (DPPE), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) e distearoil-fosfatidiletanolamina (DSPE).
[00289] O termo "ATTR" ou "poliamida" refere-se a, sem limitação, compostos descritos na Pat. U.S. 6.320.017 e 6.586.559, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todos os fins. Esses compostos incluem um composto com a fórmula: em que R é um membro selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, alquil e acil; R1 é um membro selecionado do grupo que consiste em hidrogênio e alquil; ou opcionalmente, R e R1 e o nitrogênio ao qual estão ligados formam uma fração azido; R2 é um membro do grupo selecionado de hidrogênio, alquil opcionalmente substituído, aril opcionalmente substituído e uma cadeia lateral de um aminoácido; R3 é um membro selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, hidroxi, alcoxi, mercapto, hidrazino, amino e NR4R5, em que R4 e R5 são independentemente hidrogênio ou alquil; n é 4 a 80; m é 2 a
6; p é 1 a 4; e q é 0 ou 1. Será evidente para os versados na técnica que outras poliamidas podem ser utilizadas nos compostos da presente invenção.
[00290] O termo "diacilglicerol" refere-se a um composto com 2 cadeias acil graxas, R1 e R2, ambas as quais têm, independentemente, entre 2 e 30 carbonos ligados às posições 1 e 2 do glicerol por ligações de éster. Os grupos acil podem ser saturados ou ter vários graus de insaturação. Os grupos acil adequados incluem, mas não estão limitados a, lauril (C 12), miristil (C14), palmitil (C16), estearil (C18), e icosil (C20). Em modalidades preferidas, R1 e R2 são os mesmos, R1 e R2 são ambos miristil (isto é, dimiristil), R1 e R2 são ambos estearil (isto é, distearil), etc. Os diacilgliceróis têm a seguinte fórmula geral:
[00291] O termo "dialquiloxipropil" refere-se a um composto com 2 cadeias de alquil, R1 e R2, ambos os quais têm, independentemente, entre 2 e 30 carbonos. Os grupos alquil podem ser saturados ou ter vários graus de insaturação. Os dialquiloxipropis têm a seguinte fórmula geral:
[00292] Em uma modalidade preferida, o PEG-lipídeo é um conjugado PEG-DAA com a seguinte fórmula: em que R1 e R2 são independentemente selecionados e são grupos alquil de cadeia longa tendo de cerca de 10 a cerca de 22 átomos de carbono;
PEG é um polietilenoglicol; e L é uma fração de ligante não contendo éster ou uma fração de ligante contendo éster como descrito acima. Os grupos alquil de cadeia longa podem ser saturados ou insaturados. Os grupos alquil adequados incluem, mas não estão limitados a, lauril (C12), miristil (C14), palmitil (C16), estearil (C18), e icosil (C20). Em modalidades preferidas, R1 e R2 são os mesmos, isto é, R1 e R2 são ambos miristil (isto é, dimiristil), R1 e R2 são ambos estearil (isto é, distearil), etc.
[00293] Na Fórmula VII acima, o PEG tem um peso molecular médio que varia de cerca de 550 daltons a cerca de 10.000 daltons. Em certos casos, o PEG tem um peso molecular médio de cerca de 500 daltons a cerca de
5.000 daltons (por exemplo, de cerca de 1.000 daltons a cerca de 5.000 daltons, de cerca de 1.500 daltons a cerca de 3.000 daltons, de cerca de 750 daltons a cerca de 3.000 daltons, de cerca de 750 daltons a cerca de 2.000 daltons, etc.).
Em modalidades preferidas, o PEG tem um peso molecular médio de cerca de
2.000 daltons ou cerca de 750 daltons. O PEG pode ser opcionalmente substituído por alquil, alcoxi, acil ou aril. Em certas modalidades, o grupo hidroxil terminal é substituído por um grupo metoxi ou metil.
[00294] Em uma modalidade preferida, "L" é uma fração de ligante não contendo éster. Os ligantes não contendo éster adequados incluem, mas não estão limitados a, uma fração de ligante amido, uma fração de ligante amino, uma fração de ligante carbonil, uma fração de ligante carbamato, uma fração de ligante de ureia, uma fração de ligante de éter, uma fração de ligante dissulfeto, uma fração de ligante de succinamidil e combinações dos mesmos.
Em uma modalidade preferida, a fração de ligante não contendo éster é uma fração de ligante carbamato (isto é, um conjugado PEG-C-DAA). Em outra modalidade preferida, a fração de ligante não contendo éster é uma fração de ligante amido (isto é, um conjugado PEG-A-DAA). Em ainda outra modalidade preferida, a fração de ligante não contendo éster é uma fração de ligante succinamidil (isto é, um conjugado PEG-S-DAA).
[00295] Em modalidades particulares, o conjugado PEG-lipídeo é selecionado de: e Em uma modalidade, n é selecionado de modo que a cadeia de polímero resultante tenha um peso molecular de cerca de 2.000.
[00296] Os conjugados PEG-DAA são sintetizados usando técnicas e reagentes padrão conhecidos dos versados na técnica. Será reconhecido que os conjugados PEG-DAA conterão várias ligações amida, amina, éter, tio, carbamato e ureia. Os versados na técnica reconhecerão que os métodos e reagentes para formar essas ligações são bem conhecidos e prontamente disponíveis. Ver, por exemplo, March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY (Wiley 1992); Larock, COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS (VCH 1989); and Furniss, VOGEL'S TEXTBOOK OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY, 5th ed. (Longman 1989). Será também apreciado que quaisquer grupos funcionais presentes podem requerer proteção e desproteção em diferentes pontos na síntese dos conjugados PEG-DAA. Os versados na técnica reconhecerão que tais técnicas são bem conhecidas. Ver, por exemplo, Green and Wuts, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS (Wiley 1991).
[00297] De preferência, o conjugado PEG-DAA é um conjugado dilauriloxipropil (C12)-PEG, conjugado dimiristiloxipropil (C14)-PEG,
um conjugado dipalmitiloxipropil (C16)-PEG, ou um conjugado disteariloxipropil (C18)-PEG. Os versados na técnica apreciarão prontamente que outros dialquiloxipropis podem ser usados nos conjugados PEG-DAA da presente invenção.
[00298] Além do anterior, será prontamente aparente para os versados na técnica que outros polímeros hidrofílicos podem ser usados no lugar do PEG. Exemplos de polímeros adequados que podem ser usados no lugar do PEG incluem, mas não estão limitados a, polivinilpirrolidona, polimetiloxazolina, polietiloxazolina, poli-hidroxipropilmetacrilamida, polimetacrilamida e polidimetilacrilamida, ácido polilático, ácido poliglicólico e celuloses derivatizadas, tais como hidroximetilcelulose ou hidroxietilcelulose.
[00299] As cargas nas frações policatiônicas podem ser distribuídas em torno de toda a fração de partícula ou, alternativamente, podem ser uma concentração distinta de densidade de carga em uma área particular da fração de partícula, por exemplo, um pico de carga. Se a densidade de carga é distribuída na partícula, a densidade de carga pode ser distribuída igualmente ou desigualmente distribuída. Todas as variações de distribuição de carga da fração policatiônica são abrangidas pela presente invenção.
[00300] O lipídeo "A" e o polímero não imunogênico "W" podem ser ligados por vários métodos e, de preferência, por ligação covalente.
Métodos conhecidos pelos versados na técnica podem ser usados para a ligação covalente de "A" e "W." As ligações adequadas incluem, mas não estão limitadas a, ligações amida, amina, carboxil, carbonato, carbamato, éster e hidrazona.
Será evidente para os versados na técnica que "A" e "W" devem ter grupos funcionais complementares para efetuar a ligação. A reação desses dois grupos, um no lipídeo e outro no polímero, proporcionará a ligação desejada. Por exemplo, quando o lipídeo é um diacilglicerol e o hidroxil terminal é ativado, por exemplo com NHS e DCC, para formar um éster ativo e, em seguida, é reagido com um polímero que contém um grupo amino, como com uma poliamida (ver, por exemplo, Pat. U.S. 6.320.017 e 6.586.559, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todos os fins), uma ligação amida se formará entre os dois grupos.
[00301] Em certos casos, a fração policatiônica pode ter um ligando ligado, como um ligando de direcionamento ou uma fração quelante para complexar o cálcio. De preferência, após o ligando ser ligado, a fração catiônica mantém uma carga positiva. Em certos casos, o ligando que está ligado tem uma carga positiva. Ligandos adequados incluem, mas não estão limitados a, um composto ou dispositivo com um grupo funcional reativo e incluem lipídeos, lipídeos anfipáticos, compostos transportadores, compostos de bioafinidade, biomateriais, biopolímeros, dispositivos biomédicos, compostos analiticamente detectáveis, compostos terapeuticamente ativos, enzimas, peptídeos, proteínas, anticorpos, estimuladores imunes, radiomarcadores, fluorogênios, biotina, drogas, haptenos, DNA, RNA, polissacarídeos, lipossomas, virossomas, micelas, imunoglobulinas, grupos funcionais, outras frações de direcionamento ou toxinas.
[00302] O conjugado de lipídeos (por exemplo, PEG-lipídeo) compreende tipicamente de cerca de 0,1% em mol a cerca de 10% em mol, de cerca de 0,5% em mol a cerca de 10% em mol, de cerca de 1% em mol a cerca de 10% em mol, de cerca de 0,6% em mol a cerca de 1,9% em mol, de cerca de 0,7% em mol a cerca de 1,8% em mol, de cerca de 0,8% em mol a cerca de 1,7% em mol, de cerca de 0,9% em mol a cerca de 1,6% em mol, de cerca de 0,9% em mol a cerca de 1,8% em mol, de cerca de 1% em mol a cerca de 1,8% em mol, de cerca de 1% em mol a cerca de 1,7% em mol, de cerca de 1,2% em mol a cerca de 1,8% em mol, de cerca de 1,2% em mol a cerca de 1,7% em mol, de cerca de 1,3% em mol a cerca de 1,6% em mol, ou de cerca de 1,4% em mol a cerca de 1,5% em mol do lipídeo total presente na partícula.
[00303] Um versado na técnica apreciará que a concentração do conjugado de lipídeo pode ser variada dependendo do conjugado de lipídeo empregado e da taxa na qual a partícula de ácido nucleico-lipídeo deve se tornar fusogênica.
[00304] Ao controlar a composição e a concentração do conjugado de lipídeo, pode-se controlar a taxa na qual o conjugado de lipídeo troca para fora da partícula de lipídeo de ácido nucleico e, por sua vez, a taxa na qual a partícula de lipídeo de ácido nucleico se torna fusogênica. Por exemplo, quando um conjugado PEG-fosfatidiletanolamina ou um conjugado PEG-ceramida é usado como o conjugado de lipídeo, a taxa na qual a partícula de lipídeo de ácido nucleico se torna fusogênica pode ser variada, por exemplo, variando a concentração do conjugado de lipídeo, variando o peso molecular do PEG, ou variando o comprimento da cadeia e o grau de saturação dos grupos da cadeia acil na fosfatidiletanolamina ou na ceramida. Além disso, outras variáveis incluindo, por exemplo, pH, temperatura, força iônica, etc. podem ser usadas para variar e / ou controlar a taxa na qual a partícula de ácido nucleico-lipídeo se torna fusogênica. Outros métodos que podem ser usados para controlar a taxa na qual a partícula de ácido nucleico-lipídeo se torna fusogênica se tornarão aparentes para aqueles versados na técnica após a leitura desta divulgação.
Preparação de partículas de lipídeos
[00305] As partículas de lipídeos da presente invenção, por exemplo, LNP, em que um agente ativo ou agente terapêutico, tal como uma molécula de ácido nucleico é encapsulado em uma bicamada lipídica e é protegido da degradação, podem ser formadas por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, mas não limitado a, um método de mistura contínua ou um processo de diluição direta.
[00306] Em modalidades preferidas, os lipídeos catiônicos são lipídeos de Fórmula I, II e III ou combinações dos mesmos. Em outras modalidades preferidas, os lipídeos não catiônicos são esfingomielina de ovo (ESM), distearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), 1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidilcolina (POPC), dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC), monometil-fosfatidiletanolamina, dimetil-fosfatidiletanolamina, 14:0 PE (1,2-dimiristoil-fosfatidiletanolamina (DMPE)), 16:0 PE (1,2-dipalmitoil-fosfatidiletanolamina (DPPE)), 18:0 PE (1,2-distearoil-fosfatidiletanolamina (DSPE)), 18:1 PE (1,2-dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE)), 18:1 trans PE (1,2-dielaidoil-fosfatidiletanolamina (DEPE)), 18:0-18:1 PE (1-estearoil-2-oleoil-fosfatidiletanolamina (SOPE)), 16:0-18:1 PE (1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidiletanolamina (POPE)), polímeros à base de polietilenoglicol (por exemplo, PEG 2000, PEG 5000, diacilgliceróis modificados por PEG ou dialquiloxipropis modificados por PEG), colesterol ou combinações dos mesmos.
[00307] Em certas modalidades, a presente invenção fornece LNP produzido por meio de um método de mistura contínua, por exemplo, um processo que inclui fornecer uma solução aquosa compreendendo um ácido nucleico, como um RNA ou mRNA interferente, em um primeiro reservatório, fornecer uma solução lipídica orgânica em um segundo reservatório, e misturar a solução aquosa com a solução lipídica orgânica de modo que a solução lipídica orgânica se misture com a solução aquosa de modo a produzir substancialmente instantaneamente um lipossoma encapsulando o ácido nucleico (por exemplo, RNA ou mRNA interferente). Este processo e o aparelho para realizar este processo são descritos em detalhes na Publicação de Patente U.S.
20040142025, cuja divulgação é aqui incorporada por referência em sua totalidade para todos os fins.
[00308] A ação de introduzir continuamente soluções lipídicas e tampão em um ambiente de mistura, tal como em uma câmara de mistura, causa uma diluição contínua da solução lipídica com a solução tampão, produzindo assim um lipossoma substancialmente instantaneamente após a mistura. Conforme usado neste documento, a frase "diluir continuamente uma solução lipídica com uma solução tampão" (e variações) geralmente significa que a solução lipídica é diluída suficientemente rapidamente em um processo de hidratação com força suficiente para efetuar a geração de vesículas. Ao misturar a solução aquosa que compreende um ácido nucleico com a solução lipídica orgânica, a solução lipídica orgânica sofre uma diluição passo a passo contínua na presença da solução tampão (isto é, solução aquosa) para produzir uma partícula de lipídeo de ácido nucleico.
[00309] O LNP formado usando o método de mistura contínua normalmente tem um tamanho de cerca de 40 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 50 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 60 nm a cerca de 130 nm, de cerca de 70 nm a cerca de 110 nm, ou de cerca de 70 nm a cerca de 90 nm. As partículas assim formadas não se agregam e são opcionalmente dimensionadas para atingir um tamanho de partícula uniforme.
[00310] Em outra modalidade, a presente invenção fornece LNP produzido por meio de um processo de diluição direta que inclui a formação de uma solução de lipossoma e a introdução imediata e direta da solução de lipossoma em um recipiente de coleta contendo uma quantidade controlada de tampão de diluição. Em aspectos preferidos, o recipiente de coleta inclui um ou mais elementos configurados para agitar o conteúdo do recipiente de coleta para facilitar a diluição. Em um aspecto, a quantidade de tampão de diluição presente no recipiente de coleta é substancialmente igual ao volume de solução de lipossoma introduzido no mesmo. Como um exemplo não limitativo, uma solução de lipossoma em etanol a 45%, quando introduzida no recipiente de coleta contendo um volume igual de tampão de diluição, resultará com vantagem em partículas menores.
[00311] Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece LNP produzido por meio de um processo de diluição direta em que um terceiro reservatório contendo tampão de diluição é acoplado hidraulicamente a uma segunda região de mistura. Nesta modalidade, a solução de lipossoma formada em uma primeira região de mistura é imediatamente e diretamente misturada com tampão de diluição na segunda região de mistura. Em aspectos preferidos, a segunda região de mistura inclui um conector T disposto de modo que a solução de lipossoma e os fluxos do tampão de diluição se encontrem como fluxos opostos de 180°; no entanto, conectores que fornecem ângulos mais rasos podem ser usados, por exemplo, de cerca de 27° a cerca de 180°.
Um mecanismo de bomba fornece um fluxo controlável de tampão para a segunda região de mistura. Em um aspecto, a taxa de fluxo do tampão de diluição fornecido à segunda região de mistura é controlada para ser substancialmente igual à taxa de fluxo da solução de lipossoma introduzida a partir da primeira região de mistura. Esta modalidade permite vantajosamente para mais controle do fluxo de mistura do tampão de diluição com a solução de lipossoma na segunda região de mistura e, portanto, também a concentração da solução de lipossoma no tampão ao longo do segundo processo de mistura. Tal controle da taxa de fluxo do tampão de diluição permite vantajosamente a formação de pequenos tamanhos de partícula em concentrações reduzidas.
[00312] Esses processos e os aparelhos para realizar esses processos de diluição direta são descritos em detalhes na Publicação de Patente U.S. 20070042031, cuja divulgação é aqui incorporada por referência em sua totalidade para todos os fins.
[00313] O LNP formado usando o processo de diluição direta normalmente tem um tamanho de cerca de 40 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 50 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 60 nm a cerca de 130 nm, de cerca de 70 nm a cerca de 110 nm, ou de cerca de 70 nm a cerca de 90 nm. As partículas assim formadas não se agregam e são opcionalmente dimensionadas para atingir um tamanho de partícula uniforme.
[00314] Se necessário, as partículas de lipídeos da invenção (por exemplo, LNP) podem ser dimensionadas por qualquer um dos métodos disponíveis para dimensionar lipossomas. O dimensionamento pode ser conduzido a fim de atingir uma faixa de tamanho desejada e distribuição relativamente estreita de tamanhos de partícula.
[00315] Várias técnicas estão disponíveis para dimensionar as partículas para um tamanho desejado. Um método de dimensionamento, usado para lipossomas e igualmente aplicável às presentes partículas, é descrito na Pat. U.S. 4.737.323, cuja divulgação é incorporada neste documento por referência em sua totalidade para todos os fins. A sonicação de uma suspensão de partículas por sonicação de banho ou sonda produz uma redução progressiva do tamanho de partículas com menos de cerca de 50 nm de tamanho. A homogeneização é outro método que depende do cisalhamento de energia para fragmentar partículas maiores em outras menores. Em um procedimento de homogeneização típico, as partículas são recirculadas através de um homogeneizador de emulsão padrão até que os tamanhos de partícula selecionados, tipicamente entre cerca de 60 e cerca de 80 nm, sejam observados. Em ambos os métodos, a distribuição de tamanho de partícula pode ser monitorada por discriminação de tamanho de partícula de feixe de laser convencional ou QELS.
[00316] A extrusão das partículas através de uma membrana de policarbonato de poros pequenos ou uma membrana de cerâmica assimétrica também é um método eficaz para reduzir o tamanho das partículas a uma distribuição de tamanho relativamente bem definida. Normalmente, a suspensão é submetida a ciclos através da membrana uma ou mais vezes até que a distribuição de tamanho de partícula desejada seja alcançada. As partículas podem ser extrudadas através de membranas de poros sucessivamente menores, para atingir uma redução gradual no tamanho.
[00317] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos no LNP são pré-condensados conforme descrito em, por exemplo, o pedido de patente U.S. 09/744.103, cuja divulgação é incorporada neste documento por referência em sua totalidade para todos os fins.
[00318] Em outras modalidades, os métodos compreenderão ainda a adição de policátions não lipídicos que são úteis para efetuar a lipofecção de células usando as presentes composições. Exemplos de policátions não lipídicos adequados incluem brometo de hexadimetrina (vendido sob a marca POLYBRENE®, da Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wis., EUA) ou outros sais de hexadimetrina. Outros policátions adequados incluem, por exemplo, sais de poli-L-ornitina, poli-L-arginina, poli-L-lisina, poli-D-lisina, polialilamina e polietilenoimina. A adição destes sais é preferencialmente após as partículas terem sido formadas.
[00319] Em algumas modalidades, as razões de ácido nucleico para lipídeos (razões de massa / massa) em um LNP formado irão variar de cerca de 0,01 a cerca de 0,2, de cerca de 0,02 a cerca de 0,1, de cerca de 0,03 a cerca de 0,1 ou de cerca de 0,01 a cerca de 0,08. A razão dos materiais de partida também está dentro desta faixa. Em outras modalidades, a preparação de LNP usa cerca de 400 μg de ácido nucleico por 10 mg de lipídeo total ou uma razão de massa de ácido nucleico para lipídeo de cerca de 0,01 a cerca de 0,08 e, mais preferencialmente, cerca de 0,04, o que corresponde a 1,25 mg de lipídeo total por 50 μg de ácido nucleico. Em outras modalidades preferidas, a partícula tem uma razão de massa de ácido nucleico:lipídeo de cerca de 0,08.
[00320] Em outras modalidades, as razões de lipídeo para ácido nucleico (razões massa / massa) em um LNP formado irão variar de cerca de 1 (1:1) a cerca de 100 (100:1), de cerca de 5 (5:1) a cerca de 100 (100:1), de cerca de 1 (1:1) a cerca de 50 (50:1), de cerca de 2 (2:1) a cerca de 50 (50:1), de cerca de 3 (3:1) a cerca de 50 (50:1), de cerca de 4 (4:1) a cerca de 50 (50:1), de cerca de 5 (5:1) a cerca de 50 (50:1), de cerca de 1 (1:1) a cerca de 25 (25:1), de cerca de 2 (2:1) a cerca de 25 (25:1), de cerca de 3 (3:1) a cerca de 25 (25:1), de cerca de 4 (4:1) a cerca de 25 (25:1), de cerca de 5 (5:1) a cerca de 25 (25:1), de cerca de 5 (5:1) a cerca de 20 (20:1), de cerca de 5 (5:1) a cerca de 15 (15:1), de cerca de 5 (5:1) a cerca de 10 (10:1), cerca de 5 (5:1), 6 (6:1), 7 (7:1), 8 (8:1), 9 (9:1), (10:1), 11 (11:1), 12 (12:1), 13 (13:1), 14 (14:1), 15 (15:1), 16 (16:1), 17 (17:1), 18 (18:1), 19 (19:1), 20 (20:1), 21 (21:1), 22 (22:1), 23 (23:1), 24 (24:1), 25 (25:1), 26 (26:1), 27 (27:1), 28 (28:1), 29 (29:1) ou 30 (30:1). A razão dos materiais de partida também está tipicamente dentro desta faixa.
[00321] Conforme discutido anteriormente, o lipídeo conjugado pode incluir ainda um CPL. Uma variedade de métodos gerais para fazer LNP-CPLs (LNP contendo CPL) são discutidos aqui. Duas técnicas gerais incluem a técnica de "pós-inserção", isto é, a inserção de um CPL em, por exemplo, um LNP pré-formado e a técnica "padrão", em que o CPL é incluído na mistura de lipídeos durante, por exemplo, as etapas de formação do LNP. A técnica pós-inserção resulta em LNP tendo CPLs principalmente na face externa da membrana de bicamada LNP, enquanto as técnicas padrão fornecem LNP tendo CPLs nas faces interna e externa. O método é especialmente útil para vesículas feitas de fosfolipídeos (que podem conter colesterol) e também para vesículas contendo PEG-lipídeos (como PEG-DAAs e PEG-DAGs). Os métodos de preparação de LNP -CPL são ensinados, por exemplo, na Pat. U.S.
5.705.385; 6.586.410; 5.981.501; 6.534.484; e 6.852.334; Publicação de Patente U.S. 20020072121; e Publicação PCT WO 00/62813, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência na sua totalidade para todos os efeitos.
[00322] Outros métodos para gerar LNP podem ser encontrados, por exemplo, na Patente U.S. 9.005.654 e na Publicação PCT WO 2007/012191, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência na sua totalidade para todos os efeitos.
Kits
[00323] A presente invenção também fornece partículas de lipídeos (por exemplo, LNP) na forma de kit. O kit pode compreender um recipiente que é compartimentado para conter os vários elementos das partículas de lipídeos (por exemplo, os agentes ativos ou agentes terapêuticos, tais como ácidos nucleicos e os componentes lipídicos individuais das partículas). Em algumas modalidades, o kit pode compreender ainda um desestabilizador de membrana endossomal (por exemplo, íons de cálcio). O kit contém tipicamente as composições de partículas de lipídeos da presente invenção, preferencialmente na forma desidratada, com instruções para sua re-hidratação e administração.
[00324] Conforme explicado neste documento, as partículas de lipídeos da invenção (por exemplo, LNP) podem ser adaptadas para direcionar preferencialmente tecidos, órgãos ou tumores de interesse específicos. Em certos casos, o direcionamento preferencial de partículas de lipídeos, como LNP, pode ser realizado controlando a composição da própria partícula. Por exemplo, conforme apresentado no Exemplo 11, verificou-se que a formulação 1:57 PEG-cDSA LNP pode ser usada para direcionar preferencialmente tumores fora do fígado, enquanto a formulação 1:57 PEG-cDMA LNP pode ser usada para direcionar preferencialmente o fígado (incluindo tumores hepáticos).
[00325] Em certos outros casos, pode ser desejável ter uma fração de direcionamento ligada à superfície da partícula de lipídeo para intensificar ainda mais o direcionamento da partícula. Os métodos de ligação de frações de direcionamento (por exemplo, anticorpos, proteínas, etc.) a lipídeos
(tais como aqueles usados nas partículas presentes) são conhecidos pelos versados na técnica.
Administração de partículas de lipídeos
[00326] Uma vez formadas, as partículas de lipídeos da invenção (por exemplo, LNP) são úteis para a introdução de agentes ativos ou agentes terapêuticos (por exemplo, ácidos nucleicos, tais como RNA interferente ou mRNA) nas células. Consequentemente, a presente invenção também fornece métodos para a introdução de um agente ativo ou agente terapêutico, tal como um ácido nucleico (por exemplo, RNA ou mRNA interferente) em uma célula. Os métodos são realizados in vitro ou in vivo formando primeiro as partículas como descrito acima e, em seguida, contatando as partículas com as células por um período de tempo suficiente para que ocorra a distribuição do agente ativo ou agente terapêutico às células.
[00327] As partículas de lipídeos da invenção (por exemplo, LNP) podem ser adsorvidas a quase qualquer tipo de célula com o qual estão misturadas ou em contato. Uma vez adsorvidas, as partículas podem ser endocitadas por uma porção das células, trocar lipídeos com as membranas celulares ou se fundir com as células. A transferência ou incorporação do agente ativo ou porção do agente terapêutico (por exemplo, ácido nucleico) da partícula pode ocorrer por meio de qualquer uma dessas vias. Em particular, quando a fusão ocorre, a membrana da partícula é integrada na membrana celular e o conteúdo da partícula se combina com o fluido intracelular.
[00328] As partículas de lipídeos da invenção (por exemplo, LNP) podem ser administradas sozinhas ou em uma mistura com um transportador farmaceuticamente aceitável (por exemplo, soro fisiológico ou tampão fosfato) selecionado de acordo com a via de administração e a prática farmacêutica padrão. Geralmente, solução salina tamponada normal (por exemplo, 135-150 mM NaCl) será empregada como o transportador farmaceuticamente aceitável. Outros transportadores adequados incluem, por exemplo, água, água tamponada, solução salina 0,4%, glicina 0,3% e semelhantes, incluindo glicoproteínas para estabilidade intensificada, tais como albumina, lipoproteína, globulina, etc. Transportadores adequados adicionais são descritos em, por exemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed. (1985).
Como usado neste documento, "transportador" inclui todo e qualquer solvente, meio de dispersão, veículos, revestimentos, diluentes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento da absorção, tampões, soluções transportadoras, suspensões, coloides e semelhantes. A frase "farmaceuticamente aceitável" refere-se a entidades e composições moleculares que não produzem uma reação indesejável alérgica ou semelhante quando administradas a um humano.
[00329] O transportador farmaceuticamente aceitável é geralmente adicionado após a formação das partículas. Assim, após a formação da partícula, a partícula pode ser diluída em transportadores farmaceuticamente aceitáveis, como solução salina tamponada normal.
[00330] A concentração de partículas nas formulações farmacêuticas pode variar amplamente, ou seja, de menos de cerca de 0,05%, geralmente em ou pelo menos cerca de 2 a 5%, a tanto quanto cerca de 10 a 90% em peso, e será selecionada principalmente por volumes de fluido, viscosidades, etc., de acordo com o modo particular de administração selecionado. Por exemplo, a concentração pode ser aumentada para diminuir a carga de fluido associada ao tratamento. Isto pode ser particularmente desejável em pacientes com insuficiência cardíaca congestiva associada a aterosclerose ou hipertensão grave. Alternativamente, as partículas compostas por lipídeos irritantes podem ser diluídas em baixas concentrações para diminuir a inflamação no local da administração.
[00331] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais e bem conhecidas. As soluções aquosas podem ser embaladas para uso ou filtradas sob condições assépticas e liofilizadas, sendo a preparação liofilizada combinada com uma solução aquosa estéril antes da administração. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme necessário para aproximar as condições fisiológicas, tais como ajuste de pH e agentes tamponantes, agentes de ajuste de tonicidade e semelhantes, por exemplo, acetato de sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio e cloreto de cálcio. Além disso, a suspensão de partículas pode incluir agentes protetores de lipídeos que protegem os lipídeos contra danos de radicais livres e peroxidativos de lipídeos no armazenamento. Supressores de radicais livres lipofílicos, como alfatocoferol e quelantes específicos de ferro solúveis em água, como ferrioxamina, são adequados.
Administração In Vivo
[00332] A distribuição sistêmica para terapia in vivo, por exemplo, a distribuição de um ácido nucleico terapêutico a uma célula alvo distal através de sistemas corporais, como a circulação, foi alcançada usando partículas de ácido nucleico-lipídeo, como aquelas descritas nas Publicações PCT WO 05/007196, WO 05/121348, WO 05/120152 e WO 04/002453, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência na sua totalidade para todos os efeitos. A presente invenção também fornece partículas de lipídeos totalmente encapsuladas que protegem o ácido nucleico da degradação da nuclease no soro, são não imunogênicas, são pequenas em tamanho e são adequadas para dosagem repetida.
[00333] Para administração in vivo, a administração pode ser de qualquer maneira conhecida na técnica, por exemplo, por injeção, administração oral, inalação (por exemplo, intranasal ou intratraqueal), aplicação transdérmica ou administração retal. A administração pode ser realizada em doses únicas ou divididas. As composições farmacêuticas podem ser administradas por via parenteral, isto é, intra-articular, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas são administradas por via intravenosa ou intraperitoneal por uma injeção em bolus (ver, por exemplo, Pat. U.S. 5.286.634).
A distribuição intracelular de ácido nucleico também foi discutida em Straubringer et al., Methods Enzymol., 101:512 (1983); Mannino et al., Biotechniques, 6:682 (1988); Nicolau et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 6:239 (1989); and Behr, Acc. Chem. Res., 26:274 (1993). Ainda outros métodos de administração de produtos terapêuticos à base de lipídeos são descritos, por exemplo, na Pat. U.S. 3.993.754; 4.145.410; 4.235.871; 4.224.179; 4.522.803; e
4.588.578. As partículas de lipídeos podem ser administradas por injeção direta no local da doença ou por injeção em um local distal do local da doença (ver, por exemplo, Culver, HUMAN GENE THERAPY, MaryAnn Liebert, Inc., Publishers, New York. pp. 70-71 (1994)). As divulgações das referências descritas acima são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todos os fins.
[00334] As composições da presente invenção, isoladamente ou em combinação com outros componentes adequados, podem ser feitas em formulações de aerossol (ou seja, podem ser "nebulizadas") para serem administradas por inalação (por exemplo, intranasal ou intratraqueal) (ver Brigham et al., Am. J. Sci., 298:278 (1989)). As formulações de aerossol podem ser colocadas em propelentes pressurizados aceitáveis, tais como diclorodifluorometano, propano, nitrogênio e semelhantes.
[00335] Em certas modalidades, as composições farmacêuticas podem ser distribuídas por sprays intranasais, inalação e / ou outros veículos de distribuição de aerossol. Métodos para distribuir composições de ácido nucleico diretamente aos pulmões através de sprays nasais de aerossol foram descritos, por exemplo, na Pat. U.S. 5.756.353 e 5.804.212. Da mesma forma, a distribuição de drogas usando resinas de micropartículas intranasais e compostos de lisofosfatidil-glicerol (Pat. U.S. 5.725.871) são também bem conhecidas nas técnicas farmacêuticas. Da mesma forma, a distribuição transmucosa da droga na forma de uma matriz de suporte de politetrafluoroetileno é descrita na Pat. U.S. 5.780.045. As divulgações das patentes descritas acima são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todos os fins.
[00336] Formulações adequadas para administração parenteral, tal como, por exemplo, por vias intra-articular (nas articulações), intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal e subcutânea, incluem soluções de injeção estéreis isotônicas aquosas e não aquosas, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do receptor pretendido e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizantes e conservantes. Na prática desta invenção, as composições são administradas de preferência, por exemplo, por infusão intravenosa, por via oral, tópica, intraperitoneal, intravesical ou intratecal.
[00337] Geralmente, quando administradas por via intravenosa, as formulações de partículas de lipídeos são formuladas com um transportador farmacêutico adequado. Muitos transportadores farmaceuticamente aceitáveis podem ser empregados nas composições e métodos da presente invenção. As formulações adequadas para utilização na presente invenção encontram-se, por exemplo, em REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed. (1985). Uma variedade de transportadores aquosos pode ser usada, por exemplo, água, água tamponada, 0,4% de solução salina, 0,3% de glicina e semelhantes, e podem incluir glicoproteínas para maior estabilidade, tais como albumina, lipoproteína, globulina, etc. Geralmente, solução salina tamponada normal (135-150 mM NaCl) será empregada como o transportador farmaceuticamente aceitável, mas outros transportadores adequados serão suficientes. Estas composições podem ser esterilizadas por técnicas convencionais de esterilização lipossômica, como filtração. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme necessário para aproximar as condições fisiológicas, tais como ajuste de pH e agentes tamponantes, agentes de ajuste de tonicidade, agentes umectantes e semelhantes, por exemplo, acetato de sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, etc. Estas composições podem ser esterilizadas usando as técnicas referidas acima ou, alternativamente, podem ser produzidas em condições estéreis. As soluções aquosas resultantes podem ser embaladas para uso ou filtradas sob condições assépticas e liofilizadas, sendo a preparação liofilizada combinada com uma solução aquosa estéril antes da administração.
[00338] Em certas aplicações, as partículas de lipídeos divulgadas neste documento podem ser distribuídas via administração oral ao indivíduo. As partículas podem ser incorporadas com excipientes e usadas na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais, trociscos, cápsulas, pílulas, pastilhas, elixires, enxaguantes bucais, suspensões, sprays orais, xaropes, bolachas e semelhantes (ver, por exemplo, Pat. U.S. 5.641.515,
5.580.579 e 5.792.451, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todos os efeitos). Estas formas de dosagem oral também podem conter o seguinte: aglutinantes, gelatina; excipientes, lubrificantes e / ou agentes aromatizantes. Quando a forma de dosagem unitária é uma cápsula, pode conter, além dos materiais descritos acima, um transportador líquido.
Vários outros materiais podem estar presentes como revestimentos ou de outro modo modificar a forma física da unidade de dosagem. Obviamente, qualquer material usado na preparação de qualquer forma de dosagem unitária deve ser farmaceuticamente puro e substancialmente não tóxico nas quantidades empregadas.
[00339] Normalmente, essas formulações orais podem conter pelo menos cerca de 0,1% das partículas de lipídeos ou mais, embora a porcentagem das partículas possa, é claro, ser variada e pode estar convenientemente entre cerca de 1% ou 2% e cerca de 60% ou 70% ou mais do peso ou volume da formulação total. Naturalmente, a quantidade de partículas em cada composição terapeuticamente útil pode ser preparada de tal maneira que uma dosagem apropriada será obtida em qualquer dose de unidade determinada do composto. Fatores como solubilidade, biodisponibilidade, meia-vida biológica, via de administração, vida de prateleira do produto, bem como outras considerações farmacológicas irão ser contempladas por uma pessoa versada na técnica para preparar tais formulações farmacêuticas, e como tal, uma variedade de doses e regimes terapêuticos pode ser desejável.
[00340] As formulações adequadas para administração oral podem consistir em: (a) soluções líquidas, como uma quantidade eficaz de um agente terapêutico embalado, como ácido nucleico (por exemplo, RNA ou mRNA interferente) suspenso em diluentes, como água, solução salina ou PEG 400; (b) cápsulas, saquetas ou comprimidos, cada um contendo uma quantidade predeterminada de um agente terapêutico, tal como ácido nucleico (por exemplo, RNA ou mRNA interferente), como líquidos, sólidos, grânulos ou gelatina; (c) suspensões em um líquido apropriado; e (d) emulsões adequadas. As formas de comprimido podem incluir um ou mais dentre lactose, sacarose, manitol, sorbitol, fosfatos de cálcio, amido de milho, amido de batata, celulose microcristalina, gelatina, dióxido de silício coloidal, talco, estearato de magnésio, ácido esteárico e outros excipientes, corantes, enchimentos, aglutinantes, diluentes, agentes tamponantes, agentes umectantes, conservantes, agentes aromatizantes, corantes, agentes desintegrantes e transportadores farmaceuticamente compatíveis. As formas de pastilha podem compreender um agente terapêutico, como ácido nucleico (por exemplo, RNA ou mRNA interferente) em um sabor, por exemplo, sacarose, bem como pastilhas que compreendem o agente terapêutico em uma base inerte, como gelatina e glicerina ou sacarose e emulsões de acácia, géis e semelhantes contendo, além do agente terapêutico, transportadores conhecidos na técnica.
[00341] Em outro exemplo de seu uso, as partículas de lipídeos podem ser incorporadas em uma ampla faixa de formas de dosagem tópicas. Por exemplo, uma suspensão contendo partículas de lipídeos de ácido nucleico, como LNP, pode ser formulada e administrada como géis, óleos, emulsões, cremes tópicos, pastas, pomadas, loções, espumas, mousses e semelhantes.
[00342] Ao preparar preparações farmacêuticas das partículas de lipídeos da invenção, é preferível usar quantidades das partículas que foram purificadas para reduzir ou eliminar partículas vazias ou partículas com agentes terapêuticos, tais como ácido nucleico associado à superfície externa.
[00343] Os métodos da presente invenção podem ser praticados em uma variedade de hospedeiros. Hospedeiros preferidos incluem espécies de mamíferos, como primatas (por exemplo, humanos e chimpanzés, bem como outros primatas não humanos), caninos, felinos, equinos, bovinos, ovinos, caprinos, roedores (por exemplo, ratos e camundongos), lagomorfos e suínos.
[00344] A quantidade de partículas administradas dependerá da razão de agente terapêutico (por exemplo, ácido nucleico) para lipídeo, o agente terapêutico particular (por exemplo, ácido nucleico) usado, a doença ou distúrbio a ser tratado, a idade, peso e condição do paciente e o julgamento do médico, mas geralmente estará entre cerca de 0,01 e cerca de 50 mg por quilograma de peso corporal, de preferência entre cerca de 0,1 e cerca de 5 mg / kg de peso corporal, ou cerca de 108-1010 partículas por administração (por exemplo, injeção).
Administração In Vitro
[00345] Para aplicações in vitro, a distribuição de agentes terapêuticos, tais como ácidos nucleicos (por exemplo, RNA ou mRNA interferente) pode ser para qualquer célula cultivada em cultura, seja de origem vegetal ou animal, vertebrado ou invertebrado, e de qualquer tecido ou tipo. Em modalidades preferidas, as células são células animais, mais preferencialmente células de mamíferos e, mais preferencialmente, células humanas.
[00346] O contato das células com as partículas de lipídeos, quando realizado in vitro, ocorre em meio biologicamente compatível. A concentração de partículas varia amplamente dependendo da aplicação particular, mas geralmente está entre cerca de 1 μmol e cerca de 10 mmol. O tratamento das células com as partículas de lipídeos é geralmente realizado a temperaturas fisiológicas (cerca de 37°C) por períodos de tempo de cerca de 1 a 48 horas, preferencialmente de cerca de 2 a 4 horas.
[00347] Em um grupo de modalidades preferidas, uma suspensão de partículas de lipídeos é adicionada a 60-80% de células plaqueadas confluentes com uma densidade celular de cerca de 103 a cerca de 105 células/ml, mais preferencialmente cerca de 2×104 células/ml. A concentração da suspensão adicionada às células é preferencialmente de cerca de 0,01 a 0,2 μg / ml, mais preferencialmente cerca de 0,1 μg / ml.
[00348] Usando um ensaio de Parâmetro de Liberação Endossômica (ERP), a eficiência de distribuição do LNP ou outra partícula de lipídeo da invenção pode ser otimizada. Um ensaio ERP é descrito em detalhes na Publicação de Patente U.S. 20030077829, cuja divulgação é aqui incorporada por referência em sua totalidade para todos os fins. Mais particularmente, o objetivo de um ensaio de ERP é distinguir o efeito de vários lipídeos catiônicos e componentes lipídicos auxiliares de LNP com base em seu efeito relativo na ligação / absorção ou fusão com / desestabilização da membrana endossômica.
Este ensaio permite determinar quantitativamente como cada componente do LNP ou outra partícula de lipídeo afeta a eficiência de distribuição, otimizando assim o LNP ou outra partícula de lipídeo. Normalmente, um ensaio de ERP mede a expressão de uma proteína repórter (por exemplo, luciferase, β-galactosidase, proteína fluorescente verde (GFP), etc.) e, em alguns casos, uma formulação de LNP otimizada para um plasmídeo de expressão também será apropriada para encapsular um RNA ou mRNA interferente. Em outros casos, um ensaio ERP pode ser adaptado para medir a infrarregulação da transcrição ou tradução de uma sequência alvo na presença ou ausência de um RNA interferente (por exemplo, siRNA). Em outros casos, um ensaio de ERP pode ser adaptado para medir a expressão de uma proteína alvo na presença ou ausência de um mRNA. Comparando os ERPs para cada um dos vários LNP ou outras partículas de lipídeos, pode-se facilmente determinar o sistema otimizado, por exemplo, o LNP ou outra partícula de lipídeo que tem a maior absorção na célula.
Células para distribuição de partículas de lipídeos
[00349] As composições e métodos da presente invenção são usados para tratar uma ampla variedade de tipos de células, in vivo e in vitro.
As células adequadas incluem, por exemplo, células precursoras hematopoiéticas (tronco), fibroblastos, queratinócitos, hepatócitos, células endoteliais, células esqueléticas e musculares lisas, osteoblastos, neurônios, linfócitos quiescentes, células terminalmente diferenciadas, células primárias lentas ou não ciclantes, células parenquimatosas, células linfoides, células epiteliais, células ósseas e semelhantes. Em modalidades preferidas, um agente ativo ou agente terapêutico, como uma ou mais moléculas de ácido nucleico (por exemplo, um RNA interferente (por exemplo, siRNA) ou mRNA) é distribuído a células cancerígenas, como, por exemplo, células de câncer de pulmão, células de câncer de cólon, células de câncer retal, células de câncer anal, células de câncer de ducto biliar, células de câncer de intestino delgado, células de câncer de estômago (gástrico), células de câncer de esôfago, células de câncer de vesícula biliar, células de câncer de fígado, células de câncer pancreático, células de câncer de apêndice, células de câncer de mama, células de câncer de ovário, células de câncer cervical, células de câncer de próstata, células de câncer renal, células de câncer do sistema nervoso central, células de tumor de glioblastoma, células de câncer de pele, células de linfoma, células de tumor de coriocarcinoma, células de câncer de cabeça e pescoço, células de tumor de sarcoma osteogênico e células cancerígenas do sangue.
[00350] A distribuição in vivo de partículas de lipídeos, como LNP encapsulando uma ou mais moléculas de ácido nucleico (por exemplo, RNA interferente (por exemplo, siRNA) ou mRNA) é adequado para células-alvo de qualquer tipo de célula. Os métodos e composições podem ser empregados com células de uma ampla variedade de vertebrados, incluindo mamíferos, tais como, por exemplo, caninos, felinos, equinos, bovinos, ovinos, caprinos, roedores (por exemplo, camundongos, ratos e porquinhos-da-índia), lagomorfos, suínos e primatas (por exemplo, macacos, chimpanzés e humanos).
[00351] Na medida em que a cultura de tecidos de células pode ser necessária, é bem conhecido na técnica. Por exemplo, Freshney, Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 3rd Ed., Wiley-Liss, New York (1994), Kuchler et al., Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Dowden, Hutchinson and Ross, Inc. (1977), e as referências aí citadas fornecem um guia geral para a cultura de células. Sistemas de células cultivadas frequentemente estarão na forma de monocamadas de células, embora suspensões de células também sejam usadas.
Detecção de partículas de lipídeos
[00352] Em algumas modalidades, as partículas de lipídeos da presente invenção (por exemplo, LNP) são detectáveis no sujeito em cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais horas. Em outras modalidades, as partículas de lipídeos da presente invenção (por exemplo, LNP) são detectáveis no sujeito em cerca de 8, 12, 24, 48, 60, 72 ou 96 horas, ou cerca de 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 22, 24, 25 ou 28 dias após a administração das partículas. A presença das partículas pode ser detectada nas células, tecidos ou outras amostras biológicas do sujeito. As partículas podem ser detectadas, por exemplo, por detecção direta das partículas, detecção de um ácido nucleico terapêutico, como uma sequência de RNA interferente (por exemplo, siRNA) ou sequência de mRNA, detecção da sequência alvo de interesse (ou seja, pela detecção da expressão ou expressão reduzida da sequência de interesse), ou uma combinação dos mesmos.
Detecção de Partículas
[00353] Partículas de lipídeos da invenção, tais como LNP, podem ser detectadas usando qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, um marcador pode ser acoplado direta ou indiretamente a um componente da partícula de lipídeo usando métodos bem conhecidos na técnica.
Uma ampla variedade de rótulos pode ser usada, com a escolha do rótulo dependendo da sensibilidade necessária, facilidade de conjugação com o componente de partícula de lipídeo, requisitos de estabilidade e instrumentação disponível e disposições de descarte. Os marcadores adequados incluem, mas não estão limitados a, marcadores espectrais, como corantes fluorescentes (por exemplo, fluoresceína e derivados, como isotiocianato de fluoresceína (FITC) e Oregon Green™; rodamina e derivados, como vermelho do Texas, isotiocinato de tetrarodimina (TRITC), etc., digoxigenina, biotina, ficoeritrina, AMCA,
CyDyes™ e semelhantes; marcadores radioativos, tais como 3H, 125I, 35S, 14C, 32P, 33P, etc.; enzimas, tais como peroxidase de rábano bravo, fosfatase alcalina, etc.; marcadores colorimétricos espectrais como ouro coloidal ou vidro colorido ou grânulos de plástico como poliestireno, polipropileno, látex, etc. O marcador pode ser detectado usando qualquer meio conhecido na técnica.
Detecção de ácidos nucleicos
[00354] Os ácidos nucleicos (por exemplo, RNA ou mRNA interferentes) são detectados e quantificados aqui por qualquer um de vários meios bem conhecidos pelos versados na técnica. A detecção de ácidos nucleicos pode prosseguir por métodos bem conhecidos, como análise Southern, análise Northern, eletroforese em gel, PCR, radiomarcação, contagem de cintilação e cromatografia de afinidade. Métodos bioquímicos analíticos adicionais, como espectrofotometria, radiografia, eletroforese, eletroforese capilar, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), cromatografia de camada fina (TLC) e cromatografia de hipodifusão também podem ser empregados.
[00355] A seleção de um formato de hibridação de ácido nucleico não é crítica. Uma variedade de formatos de hibridação de ácido nucleico são conhecidos pelos versados na técnica. Por exemplo, os formatos comuns incluem ensaios em sanduíche e ensaios de competição ou deslocamento. As técnicas de hibridação são geralmente descritas em, por exemplo, “Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach,” Eds. Hames and Higgins, IRL Press (1985).
[00356] A sensibilidade dos ensaios de hibridação pode ser aumentada através da utilização de um sistema de amplificação de ácido nucleico que multiplica o ácido nucleico alvo a ser detectado. São conhecidas técnicas de amplificação in vitro adequadas para amplificar sequências para uso como sondas moleculares ou para gerar fragmentos de ácido nucleico para subclonagem subsequente. Exemplos de técnicas suficientes para direcionar pessoas com habilidade por meio de tais métodos de amplificação in vitro, incluindo a reação em cadeia da polimerase (PCR), a reação em cadeia da ligase (LCR), amplificação de Qβ-replicase e outras técnicas mediadas por RNA polimerase (por exemplo, NASBA™) são encontrados em Sambrook et al., In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2000); and Ausubel et al., SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, eds., Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. (2002); bem como Pat. U.S. 4.683.202; PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds.) Academic Press Inc. San Diego, Calif. (1990); Arnheim & Levinson (Oct. 1, 1990), C&EN 36; The Journal Of NIH Research, 3:81 (1991); Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173 (1989); Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1874 (1990); Lomell et al., J. Clin.
Chem., 35:1826 (1989); Landegren et al., Science, 241:1077 (1988); Van Brunt, Biotechnology, 8:291 (1990); Wu and Wallace, Gene, 4:560 (1989); Barringer et al., Gene, 89:117 (1990); e Sooknanan and Malek, Biotechnology, 13:563 (1995). Métodos melhorados de clonagem de ácidos nucleicos amplificados in vitro são descritos na Pat. U.S 5.426.039. Outros métodos descritos na técnica são a amplificação baseada na sequência de ácido nucleico (NASBA™, Cangene, Mississauga, Ontario) e sistemas de replicase Qβ. Estes sistemas podem ser usados para identificar diretamente mutantes onde os iniciadores de PCR ou LCR são projetados para serem estendidos ou ligados apenas quando uma sequência selecionada está presente. Alternativamente, as sequências selecionadas podem ser geralmente amplificadas usando, por exemplo, iniciadores de PCR não específicos e a região alvo amplificada posteriormente sondada para uma sequência específica indicativa de uma mutação. As divulgações das referências descritas acima são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todos os fins.
[00357] Os ácidos nucleicos para uso como sondas, por exemplo, em métodos de amplificação in vitro, para uso como sondas de genes ou como componentes inibidores são tipicamente sintetizados quimicamente de acordo com o método de triéster de fosforamidita de fase sólida descrito por Beaucage et al., Tetrahedron Letts., 22:1859 1862 (1981), por exemplo, usando um sintetizador automatizado, conforme descrito em Needham VanDevanter et al., Nucleic Acids Res., 12:6159 (1984). A purificação de polinucleotídeos, quando necessário, é tipicamente realizada por eletroforese em gel de acrilamida nativa ou por HPLC de troca aniônica como descrito em Pearson et al., J. Chrom., 255:137 149 (1983). A sequência dos polinucleotídeos sintéticos pode ser verificada usando o método de degradação química de Maxam and Gilbert (1980) em Grossman and Moldave (eds.) Academic Press, New York, Methods in Enzymology, 65:499.
[00358] Um meio alternativo para determinar o nível de transcrição é a hibridização in situ. Os ensaios de hibridação in situ são bem conhecidos e são geralmente descritos em Angerer et al., Methods Enzymol., 152:649 (1987). Em um ensaio típico de hibridação in situ, as células são fixadas a um suporte sólido, normalmente uma lâmina de vidro. Se o DNA for sondado, as células são desnaturadas com calor ou álcali. As células são então colocadas em contato com uma solução de hibridação a uma temperatura moderada para permitir o emparelhamento de sondas específicas que são marcadas. As sondas são preferencialmente marcadas com radioisótopos ou repórteres fluorescentes.
Exemplos
[00359] A presente invenção será descrita com mais detalhes a título de exemplos específicos. Os seguintes exemplos são oferecidos para propósitos de ilustração e não se destinam a limitar a invenção de maneira alguma. Os versados na técnica irão reconhecer prontamente uma variedade de parâmetros não críticos que podem ser mudados ou modificados para render essencialmente os mesmos resultados.
EXEMPLOS
[00360] A presente invenção será descrita com mais detalhes a título de exemplos específicos. Os seguintes exemplos são oferecidos para propósitos de ilustração e não se destinam a limitar a invenção de maneira alguma. Os versados na técnica irão reconhecer prontamente uma variedade de parâmetros não críticos que podem ser mudados ou modificados para render essencialmente os mesmos resultados.
Exemplo 1. Síntese de [18-B9]
[00361] (3-Cloropropil)tris(decan-3-iloxi)silano (0,75 g, 1,21 mmol), dimetilamina (12,1 mmol (6,05 ml de 2,0 M em THF) e MeCN foram aquecidos em um micro-ondas em um reator vedado a 150°C por dez minutos.
Após o resfriamento, a reação foi particionada entre EtOAc e NaHCO 3 saturado. Os orgânicos foram lavados com água e salmoura, secos (Na2SO4) e concentrados in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna automatizada (o-100% EtOAc / hexano) para dar N,N-dimetil-3-(tris(decan-3-iloxi)silil)propan-1-amina (0,16 g, 21,6%). 1H NMR CDCl3 δ 3,85 (m, 3H), 2,23 (m, 8H), 1,5 (m 15H), 1,28 (m, 34H), 0,87 (m, 19H), 0,55 (m, 2H).
[00362] O intermediário 3-Cloropropil)tris(decan-3-iloxi)silano foi preparado como se segue:
a. Preparação de 3-Cloropropil)tris(decan-3-iloxi)silano:
[00363] Tricloro(3-cloropropil)silano (1,72 g, 8,1 mmol) foi agitado em Et2O a RT. Uma mistura de Undecan-3-ol (4,19 g, 24,3 mmol) e TEA (3,15 g, 24,34 mmol) em Et2O foram adicionados gota a gota a RT. A reação foi agitada a RT durante 16 horas. O precipitado resultante foi removido por filtração, lavando com Et2O adicional. Os orgânicos foram lavados sequencialmente com NaHCO3, água e salmoura, secos (Na2SO4) e concentrados in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia flash automática (2% EtOAc / hexano) para dar (3-cloropropil)tris(decan-3-iloxi)silano (2,48 g, 49,3%). 1H NMR CDCl3 δ 3,85 (p, 3H), 3,53 (t, 2H), 1,89 (m, 2H), 1,47 (m, 13H), 1,28 (m, 35H), 0,9 (m, 18H), 0,7 (m, 2H): Etapa 2: síntese de N,N-dimetil-3-(tris(decan-3-iloxi)silil)propan-1-amina (4) Exemplos 2-23
[00364] Usando um procedimento semelhante ao descrito no Exemplo 1, foram preparados os seguintes compostos (Exemplos 2-23).
Exemplo 2
Exemplo 3
Exemplo 4
Exemplo 5
Exemplo 6
Exemplo 7
Exemplo 8
Exemplo 9
Exemplo 10
Exemplo 11
Exemplo 12
Exemplo 13
Exemplo 14
Exemplo 15
Exemplo 16
Exemplo 17
Exemplo 18
Exemplo 19
Exemplo 20
Exemplo 21
Exemplo 22
Exemplo 23
Exemplo 24 Preparação de Formulações Lipídicas
[00365] Os estoques de lipídeos foram preparados (teor de lipídeos total de cerca de 7 mg / mL) em etanol 100%, usando as identidades de lipídeos e as razões molares descritas. O mRNA foi diluído em acetato de pH 5 e água sem nuclease para atingir uma concentração de 0,366 mg / mL de mRNA em acetato de 100 mM, pH 5. Volumes iguais de cada solução foram misturados a 400 mL / min em um conector T e diluídos com cerca de 4 volumes de PBS, pH 7,4, usando o método de diluição direta descrito na Patente dos Estados Unidos
9.404.127. As formulações foram então colocadas em unidades de diálise Slide-A-Lyzer (MWCO 10.000) e foram dialisadas durante a noite com Tris 10 mM, NaCl 500 mM pH 8 (tampão Tris / NaCl). Após a diálise, as formulações foram concentradas para cerca de 0,6 mg / mL usando unidades concentradoras VivaSpin (MWCO 100.000) e, em seguida, filtradas através de um filtro de seringa de 0,2 um.
Exemplo 24a
[00366] Os vários lipídeos da presente invenção foram formulados em composições LNP com as seguintes razões molares: DSPC (11%) : Chol (33%): PEG2000-C-DMA (1.6%): Lipídeo X (55%). Uma composição foi gerada compreendendo os seguintes componentes: (a) ácido nucleico; (b) uma mistura de colesterol e DSPC; (c) um lipídeo conjugado de fórmula: em que n é selecionado de modo que a cadeia de polímero resultante tenha um peso molecular de cerca de 2.000 daltons; e (d) um lipídeo catiônico de fórmula:
; em que o lipídeo conjugado compreendia cerca de 1,5% em mol do lipídeo total presente na partícula; DSPC compreendia cerca de 10% em mol do lipídeo total presente na partícula; o colesterol compreendia cerca de 38,5% em mol do lipídeo total presente na partícula; e o lipídeo catiônico compreendia cerca de 50% em mol do lipídeo total presente na partícula; e em que a razão de lipídeo para ácido nucleico era de cerca de 19,6.
Exemplo 24b
[00367] Uma composição foi gerada compreendendo os seguintes componentes: (a) ácido nucleico; (b) uma mistura de colesterol e DSPC; (c) um lipídeo conjugado de fórmula: em que n é selecionado de modo que a cadeia de polímero resultante tenha um peso molecular de cerca de 2.000 daltons; e (d) um lipídeo catiônico de fórmula:
; em que o lipídeo conjugado compreendia cerca de 1,6% em mol do lipídeo total presente na partícula; DSPC compreendia cerca de 11% em mol do lipídeo total presente na partícula; o colesterol compreendia cerca de 33% em mol do lipídeo total presente na partícula; e o lipídeo catiônico compreendia cerca de 55% em mol do lipídeo total presente na partícula; e em que a razão de lipídeo para ácido nucleico era de cerca de 20,5.
Exemplo 24c
[00368] Uma composição foi gerada compreendendo os seguintes componentes: (a) ácido nucleico; (b) uma mistura de colesterol e DSPC; (c) um lipídeo conjugado de fórmula: em que n é selecionado de modo que a cadeia de polímero resultante tenha um peso molecular de cerca de 2.000 daltons; e (d) um lipídeo catiônico de fórmula:
; em que o lipídeo conjugado compreendia cerca de 1,6% em mol do lipídeo total presente na partícula; DSPC compreendia cerca de 10,9% em mol do lipídeo total presente na partícula; o colesterol compreendia cerca de 32,8% em mol do lipídeo total presente na partícula; e o lipídeo catiônico compreendia cerca de 54,9% em mol do lipídeo total presente na partícula; e em que a razão de lipídeo para ácido nucleico era de cerca de 20,2.
Exemplo 25 Ensaio In Vivo
[00369] Geralmente, o LNP foi injetado por via intravenosa a 0,5 mg / kg em camundongos Balb / C fêmeas, 5-8 semanas de idade e o sangue foi coletado 4-6 horas após a dosagem; o sangue é coletado em K2EDTA e processado em plasma, e então armazenado congelado a -80oC até a análise. A atividade foi avaliada testando o plasma para expressão de EPO humana usando um kit EPO ELISA humano da StemCell (catálogo # 01630) ou R&D Systems (catálogo DEP00) seguindo as instruções do fabricante. Os dados são fornecidos na Tabela a seguir.
[00370] Como pode ser visto a partir dos dados na Tabela 1, algumas das composições são consideravelmente mais potentes do que a composição MC3 usada em patisiran (Onpattro), um produto LNP aprovado para o tratamento de amiloidose TTR.
Tabela 1. Eficácia de 0,5 mg / kg de LNP contendo os lipídeos catiônicos da presente invenção (a 55% em mol, com 1,6% em mol PEG2000-C-DMA, 33% colesterol e 11% DSPC), e EPO mRNA humano, 4h após dosagem IV em Camundongos Balb / C (n = 4-5) Composição (Lipídeo X =) EPO (mU / mL) Stdev (mU/mL) Exemplo 1 60.445 5.608 Exemplo 2 144.176 42.954 Exemplo 4 1.300.807 48.843 Exemplo 6 25.596 955 Exemplo 7 942.452 290.341 Exemplo 8 30.446 2.024 Exemplo 9 37.927 1.949 Exemplo 11 256.974 35.579 Exemplo 13 310.633 52.332 Exemplo 15 18.385 756 Exemplo 17 226.593 42.270 Exemplo 18 103.718 8.661 Exemplo 19 47.218 3.408 Exemplo 20 2.242.992 228.147 Exemplo 21 1.470.419 2.130.352 Exemplo 22 15.075 8.524 Exemplo 23 17.488 400 Composição Patisiran com MC3 (1.5: 50,0: 38,5:
42.230 2.697 10,0)

Claims (99)

REIVINDICAÇÕES
1. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, caracterizada por compreender: (a) uma ou mais moléculas de ácido nucleico; (b) um lipídio não catiônico; (c) um lipídio conjugado; e (b) um lipídio catiônico de fórmula (I): em que: R1 é um C2-C30 hidrocarbil; R2 é um C2-C30 hidrocarbil; R3 é um C2-C30 hidrocarbil; X é um C2-C8 alquil divalente; R4 é NRaRb; e cada Ra e Rb é independentemente selecionado do grupo que consiste em metil, etil, propil, ciclopropil e butil, cujo metil, etil, propil, ciclopropil e butil é opcionalmente substituído por hidróxi; ou Ra e Rb tomados com o nitrogênio ao qual eles estão fixados formam um anel de aziridina, azetidina, prolina, piperidina, piperazina ou morfolina, cujo anel é opcionalmente substituído por hidroxil ou com C1-C6 alquil que é opcionalmente substituído por hidróxi; e em que as uma ou mais moléculas de ácido nucleico são encapsuladas dentro da partícula de lipídio.
2. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo R1 ser um C2-C20 hidrocarbil.
3. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo R1 ser um C2-C15 hidrocarbil.
4. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo R1 ser um C2-C10 hidrocarbil.
5. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo R1 ser um C5-C20 hidrocarbil.
6. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo R1 ser um (C2-C20)alquil, (C2-C20)alquenil, ou (C2-C20)alquinil.
7. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo R1 ser um (C8-C20)alquil.
8. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo R1 ser um (C8-C20)alquenil.
9. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo R1 ser um (C8-C20)alquinil.
10. PATÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo R1 ser um (C8-C20)alquenil tendo apenas uma ligação dupla.
11. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo R1 ser (Z)-4-decen-1-il, 1-nonil, 3-undecil, 1- decil, 6(Z), 15(Z)-enicosandieno- 11-il, 3-hexen-1-il, 9(Z)-octadeceno-1-il ou 2- butiloct-1-il, 4-(1-metiletenil)ciclo-hexen-1-ilmetil.
12. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo R2 ser um C2-C20 hidrocarbil.
13. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo R2 ser um C2-C15 hidrocarbil.
14. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo R2 ser um C2-C10 hidrocarbil.
15. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo R2 ser um C5-C20 hidrocarbil.
16. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo R2 ser um (C2- C20)alquil, (C2-C20)alquenil, ou (C2-C20)alquinil.
17. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo R2 ser um (C8- C20)alquil.
18. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo R2 ser um (C8- C20)alquenil.
19. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo R2 ser um (C8- C20)alquinil.
20. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo R2 ser um (C8- C20)alquenil tendo apenas uma ligação dupla.
21. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo R2 ser (Z)-4-decen-1- il, 1-nonil, 3-undecil, 1-decil, 6(Z), 15(Z)-enicosandieno- 11-il, 3-hexen-1-il, 9(Z)- octadeceno-1-il ou 2-butiloct-1-il, 4-(1-metiletenil)ciclo-hexen-1-ilmetil.
22. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo R3 ser um C2-C20 hidrocarbil.
23. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo R3 ser um C2-C15 hidrocarbil.
24. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo R3 ser um C2-C10 hidrocarbil.
25. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo R3 ser um C5-C20 hidrocarbil.
26. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo R3 ser um (C2- C20)alquil, (C2-C20)alquenil, ou (C2-C20)alquinil.
27. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo R3 ser um (C8- C20)alquil.
28. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo R3 ser um (C8- C20)alquenil.
29. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo R3 ser um (C8- C20)alquinil.
30. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo R3 ser um (C8- C20)alquenil tendo apenas uma ligação dupla.
31. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo R3 ser (Z)-4-decen-1- il, 1-nonil, 3-undecil, 1-decil, 6(Z), 15(Z)-enicosandiene-11-il, 3-hexen-1-il, 9(Z)- octadeceno-1-il, adamantil-1-ilmetil, 2-butiloct-1-il, (Z)-2-((Z)-dec-4-en-1-il)dodec-6- en-1-il ou 4-(prop-1-eno-2-il)ciclo-hex-1-en-1-il)metil.
32. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizada pelo X ser um C2-C6 alquil divalente.
33. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizada pelo X ser um C3-C5 alquil divalente.
34. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizada pelo X ser –CH2CH2CH2-.
35. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizada pelo X ser - CH2CH2CH2CH2-.
36. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizada pelo X ser – CH2CH2CH2CH2CH2-.
37. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizada por cada Ra e Rb ser independentemente selecionado do grupo que consiste em metil, etil, propil, ciclopropil e butil, cujo metil, etil, propil, ciclopropil e butil é opcionalmente substituído por hidróxi.
38. PARTÍCULA DE ÁCIDO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizada pelo Ra e Rb tomados com o nitrogênio ao qual eles estão fixados formam um anel aziridina, azetidina, prolina, piperidina, piperazina ou morfolina, cujo anel é opcionalmente substituído por hidroxil ou por C1-C6 alquil que é opcionalmente substituído por hidróxi.
39. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizada por cada Ra e Rb ser independentemente selecionado do grupo que consiste em metil e etil.
40. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizada pelo R4 ser dimetilamino.
41. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizada pelo lipídio catiônico compreender de cerca de 30% em mol a cerca de 85% em mol do lipídio total presente na partícula; o lipídio não catiônico compreende de cerca de 13% em mol a cerca de 49,5% em mol do lipídio total presente na partícula; e o lipídio conjugado compreende de cerca de 0,1% em mol a cerca de 10% em mol do lipídio total presente na partícula.
42. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizada pelo lipídio catiônico compreender de cerca de 30% em mol a cerca de 85% em mol do lipídio total presente na partícula; o lipídio não catiônico compreende de cerca de 13% em mol a cerca de 49,5% em mol do lípido total presente na partícula; e o lipídio conjugado compreende de cerca de 0,1% em mol a cerca de 10% em mol do lipídio total presente na partícula.
43. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 42, caracterizada pelo ácido nucleico ser selecionado do grupo que consiste em RNA de interferência pequeno (siRNA), dsRNA de substrato Dicer, RNA de hairpin pequeno (shRNA), RNA de interferência assimétrico (aiRNA), microRNA (miRNA), mRNA, tRNA, rRNA, RNA viral (vRNA), RNA de autoamplificação e combinações dos mesmos.
44. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo ácido nucleico ser uma molécula de mRNA.
45. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo ácido nucleico compreender uma molécula de siRNA de fita dupla.
46. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pela molécula de siRNA de fita dupla compreender pelo menos um nucleotídeo modificado.
47. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo siRNA compreender pelo menos um nucleotídeo 2'-O-metil (2'OMe).
48. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 47, caracterizada pelo lipídio não catiônico compreender colesterol ou um derivado do mesmo.
49. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com a reivindicação 48, caracterizada pelo colesterol ou derivado do mesmo compreender de cerca de 31,5% em mol a cerca de 42,5% em mol do lipídio total presente na partícula.
50. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 47, caracterizada pelo lipídio não catiônico compreender um fosfolipídio.
51. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 47, caracterizada pelo lipídio não catiônico compreender uma mistuira de um fosfolipídio e colesterol ou um derivado do mesmo.
52. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com a reivindicação 51, caracterizada pelo fosfolipídio compreender dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), diestearoilfosfatidilcolina (DSPC) ou uma mistura dos mesmos.
53. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com a reivindicação 51, caracterizada pelo fosfolipídio compreender de cerca de 4% em mol a cerca de 10% em mol do lipídio total presente na partícula e o colesterol compreender de cerca de 30% em mol a cerca de 40% em mol do lípido total presente na partícula.
54. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com a reivindicação 51, caracterizada pelo fosfolipídio compreender de cerca de 10% em mol a cerca de 30% em mol do lipídio total presente na partícula e o colesterol compreende de cerca de 10% em mol a cerca de 30% em mol do lípido total presente na partícula.
55. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 54, caracterizada pelo lipídio conjugado compreender um conjugado de polietilenoglicol (PEG)-lipídio.
56. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo conjugado PEG-lipídio compreender um conjugado PEG-diacilglicerol (PEG-DAG), um conjugado PEG-dialquiloxipropil (PEG-DAA) ou uma mistura dos mesmos.
57. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com a reivindicação 56, caracterizada pelo conjugado PEG-DAA compreender um conjugado PEG-dimiristiloxipropil (PEG-DMA), um conjugado PEG- disteariloxipropil (PEG-DSA) ou uma mistura dos mesmos.
58. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo conjugado PEG-DAA compreender um conjugado PEG-dimiristiloxipropil (PEG-DMA).
59. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo conjugado de polietilenoglicol (PEG)-lipídio ser um composto de fórmula: A-B-C ou um sal do mesmo; em que: A é (C1-C6)alquil, (C3-C8)cicloalquil, (C3-C8)cicloalquil(C1-C6)alquil, (C1-C6)alcóxi, (C2-C6)alquenil, (C2-C6)alquinil, (C1-C6)alcanoil, (C1- C6)alcoxicarbonil, (C1-C6)alquiltio ou (C2-C6)alcanoiloxi, em que qualquer (C1- C6)alquil, (C3-C8)cicloalquil, (C3-C8)cicloalquil(C1-C6)alquil, (C1-C6)alcóxi, (C2- C6)alquenil, (C2-C6)alquinil, (C1-C6)alcanoil, (C1-C6)alcoxicarbonil, (C1-C6)alquiltio e
(C2-C6)alcanoiloxi é substituído por um ou mais grupos aniônicos e em que qualquer (C1-C6)alquil, (C3-C8)cicloalquil, (C3-C8)cicloalquil(C1-C6)alquil, (C1- C6)alcóxi, (C2-C6)alquenil, (C2-C6)alquinil, (C1-C6)alcanoil, (C1-C6)alcoxicarbonil, (C1-C6)alquiltio e (C2-C6)alcanoilóxi é opcionalmente substituído por um ou mais grupos independentemente selecionados do grupo consistindo em halo, hidroxil, (C1-C3)alcóxi, (C1-C6)alcanoil, (C1-C3)alcoxicarbonil, (C1-C3)alquiltio ou (C2- C3)alcanoilóxi; B é uma cadeia de polietileno glicol tendo um peso molecular de cerca de 550 daltons a cerca de 10.000 daltons; C é –L-Ra; L é selecionado do grupo que consiste em uma ligação direta, - C(O)O-, -C(O)NRb-, -NRb-, -C(O)-, -NRbC(O)O-, -NRbC(O)NRb-, -S-S-, -O-, - (O)CCH2CH2C(O)-, e -NHC(O)CH2CH2C(O)NH-; Ra é um (C10-C50)alquil ramificado ou (C10-C50)alquenil ramificado em que um ou mais átomos de carbono do (C10-C50)alquil ramificado ou C(10- C50)alquenil ramificado foram substituídos por -O-; e cada Rb é independentemente H ou (C1-C6)alquil.
60. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 59, caracterizada pelo PEG ter um peso molecular médio de cerca de 2.000 daltons.
61. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 60, caracterizada pelo lipídio conjugado compreender de cerca de 1% em mol a cerca de 2% em mol do lipídio total presente na partícula.
62. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 61, caracterizada pelo ácido nucleico na partícula de ácido nucleico-lipídio não ser substancialmente degradada após incubação da partícula em soro a 37°C por 30 minutos.
63. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 62, caracterizada pelo ácido nucleico ser totalmente encapsulado na partícula de ácido nucleico-lipídio.
64. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 63, caracterizada pela partícula de ácido nucleico-lipídio ter uma razão em massa de lipídio:ácido nucleico de cerca de 5 a cerca de 15.
65. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 63, caracterizada pela partícula de ácido nucleico-lipídio ter uma razão em massa de lipídio:ácido nucleico de cerca de 5 a cerca de 30.
66. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 65, caracterizada pela partícula de ácido nucleico-lipídio ter um diâmetro mediano de cerca de 40 nm a cerca de 150 nm.
67. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizada pelo lipídio catiônico compreender de cerca de 56,5% em mol a cerca de 66,5% em mol do lipídio total presente na partícula; o lipídio não catiônico compreende colesterol ou um derivado do mesmo compreendendo de cerca de 31,5% em mol a cerca de 42,5% em mol do lipídio total presente na partícula; e um conjugado PEG-lipídio compreende de cerca de 1% em mol a cerca de 2% em mol do lipídio total presente na partícula.
68. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com a reivindicação 67, caracterizada pela partícula de ácido nucleico-lipídio compreender cerca de 61,5% em mol de lipídio catiônico, cerca de 36,9% de colesterol ou um derivado do mesmo e cerca de 1,5% em mol de conjugado PEG- lipídio.
69. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizada pelo lipídio catiônico compreender de cerca de 52% em mol a cerca de 62% em mol do lipídio total presente na partícula; o lipídio não catiônico compreender mistura de um fosfolipídio e colesterol ou um derivado do mesmo compreendendo de cerca de 36% em mol a cerca de 47% em mol do lipídio total presente na partícula; e o conjugado PEG-lipídio compreendendo de cerca de 1% em mol a cerca de 2% em mol do lipídio total presente na partícula.
70. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com a reivindicação 69, caracterizada pela partícula de ácido nucleico-lipídio compreender cerca de 57,1% em mol de lipídio catiônico, cerca de 7,1% em mol de fosfolipídio, cerca de 34,3% em mol de colesterol ou um derivado do mesmo e cerca de 1,4% em mol de conjugado PEG-lipídio.
71. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com a reivindicação 69, caracterizada pela partícula de ácido nucleico-lipídio compreender cerca de 57,1% em mol de lipídio catiônico, cerca de 20% em mol de fosfolipídio, cerca de 20% em mol de colesterol ou um derivado do mesmo e cerca de 1,4% em mol de conjjugado PEG-lipídio.
72. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizada pelo lipídio catiônico compreender de 50% em mol a 65% em mol do lipídio total presente na partícula; o lipídio não catiônico compreender uma mistura de um fosfolipídio e colesterol ou um derivado do mesmo, em que o fosfolipídio compreende de 4% em mol a 10% em mol do lipídio total presente na partícula e o colesterol ou derivado do mesmo compreende de 30% em mol a 40% em mol do lipídio total presente na partícula; e o lípido conjugado compreende de 0,5% em mol a 2% em mol do lípido total presente na partícula.
73. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizada pelo lipídio catiônico compreender de 50% em mol a 65% em mol do lipídio total presente na partícula; o lipídio não catiônico compreendendo uma mistura de um fosfolipídio e colesterol ou um derivado do mesmo, em que o fosfolipídio compreende de 3% em mol a 15% em mol do lipídio total presente na partícula e o colesterol ou derivado do mesmo compreende de 30% em mol a 40% em mol do lipídio total presente na partícula; e o lipídio conjugado compreende de 0,5% em mol a 2% em mol do lipídio total presente na partícula.
74. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizada pelo lipídio catiônico compreender de 50% em mol a 65% em mol do lipídio total presente na partícula; o lipídio não catiônico compreende até 49,5% em mol do lipídio total presente na partícula; o colesterol ou derivado do mesmo compreende de 30% em mol a 40% em mol do lipídio total presente na partícula; e o lípido conjugado compreende de 0,5% em mol a 2% em mol do lípido total presente na partícula.
75. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizada pelo lipídio catiônico compreender de 50% em mol a 85% em mol do lipídio total presente na partícula; o lipídio não catiônico compreende de 13% em mol a 49,5% em mol do lipídio total presente na partícula; e o lípido conjugado compreende de 0,5% em mol a 2% em mol do lípido total presente na partícula.
76. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizada pelo lipídio catiônico ou um sal do mesmo compreender de cerca de 30% em mol a cerca de 50% em mol do lipídio total presente na partícula; o lipídio não catiônico compreende mistura de um fosfolipídio e colesterol ou um derivado do mesmo compreendendo de cerca de 47% em mol a cerca de 69% em mol do lipídio total presente na partícula; e o lipídio conjugado compreende de cerca de 1% em mol a cerca de 3% em mol do lipídio total presente na partícula.
77. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo lipídio não catiônico compreender uma mistura de colesterol e DSPC; o lipídio conjugado é: em que n é selecionado de modo que a cadeia de polímero resultante tenha um peso molecular de cerca de 2.000 daltons; e o lipídio catiônico é: ; e em que o lipídio conjugado compreende cerca de 2% em mol do lipídio total presente na partícula; DSPC compreende cerca de 10% em mol do lipídio total presente na partícula; colesterol compreende cerca de 48% em mol do lipídio total presente na partícula; e o lipídio catiônico compreende cerca de 40% em mol do lipídio total presente na partícula.
78. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo lipídio não catiônico compreender uma mistura de colesterol e DSPC; o lipídio conjugado é: em que n é selecionado de modo que a cadeia de polímero resultante tenha um peso molecular de cerca de 2.000 daltons; e o lipídio catiônico é: ; e em que o lipídio conjugado compreende cerca de 2% em mol do lipídio total presente na partícula; DSPC compreende cerca de 10% em mol do lipídio total presente na partícula; colesterol compreende cerca de 48% em mol do lipídio total presente na partícula; e o lipídio catiônico compreende cerca de 40% em mol do lipídio total presente na partícula.
79. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo lipídio não catiônico compreender uma mistura de colesterol e DSPC; o lipídio conjugado é: ; em que n é selecionado de modo que a cadeia de polímero resultante tenha um peso molecular de cerca de 2.000; e o lipídio catiônico é: ;
em que o lipídio conjugado compreende cerca de 1,6% em mol do lipídio total presente na partícula; DSPC compreende cerca de 10,9% em mol do lipídio total presente na partícula; colesterol compreende cerca de 32,8% em mol do lipídio total presente na partícula; e o lipídio catiônico compreende cerca de 54,9% em mol do lipídio total presente na partícula.
80. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 79, caracterizada pela razão de lipídio para ácido nucleico ser de cerca de 24.
81. COMPOSIÇÃO farmacêutica, caracterizada por compreender uma partícula de ácido nucleico-lipídio de qualquer uma das reivindicações 1 a 80 e um transportador farmaceuticamente aceitável.
82. MÉTODO PARA INTRODUZIR UM ÁCIDO NUCLEICO EM UMA CÉLULA, o método caracterizado por compreender: contatar a célula com uma partícula de ácido nucleico-lipídio de qualquer uma das reivindicações 1-80 ou a composição da reivindicação 81.
83. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pela célula estar em um mamífero.
84. MÉTODO PARA DISTRIBUIÇÃO IN VIVO DE UM ÁCIDO NUCLEICO, o método caracterizado por compreender: administrar a um sujeito mamífero uma partícula de ácido nucleico- lipídio de qualquer uma das reivindicações 1-80 ou a composição da reivindicação
81.
85. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pela administração ser selecionada do grupo que consiste em oral, intranasal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra-articular, intralesional, intratraqueal, subcutânea e intradérmica.
86. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 80, ou composição, de acordo com a reivindicação 81, caracterizada por ser para uso na distribuição in vivo de um ácido nucleico a um mamífero.
87. USO DE UMA PARTÍCULA de ácido nucleico-lipídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 80, ou uma composição da reivindicação 81, caracterizado por ser para preparar um medicamento para a distribuição in vivo de um ácido nucleico a um mamífero.
88. MÉTODO PARA TRATAR UMA DOENÇA OU UM DISTÚRBIO em um sujeito mamífero em necessidade do mesmo, o método caracterizado por compreender: administrar ao sujeito mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma partícula de ácido nucleico-lipídio de qualquer uma das reivindicações 1-80 ou da composição da reivindicação 81.
89. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pela doença ou o distúrbio ser selecionado do grupo que consiste em uma infecção viral, uma doença ou um distúrbio do fígado e câncer.
90. PARTÍCULA DE ÁCIDO NUCLEICO-LIPÍDIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 80, ou composição, de acordo com a reivindicação 81, caracterizada por ser para uso em tratar uma doença ou um distúrbio em um mamífero.
91. USO DE UMA PARTÍCULA de ácido nucleico-lipídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 80, ou uma composição, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado por ser para preparar um medicamento para tratar uma doença ou um distúrbio em um mamífero.
92. COMPOSTO de fórmula (I), caracterizado por ser como descrito em qualquer uma das reivindicações 1-40, ou um sal do mesmo.
93. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender um composto de fórmula (I), conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1-40, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um transportador farmaceuticamente aceitável.
94. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 93, caracterizada por compreender ainda um ácido nucleico.
95. NANOPARTÍCULA DE LIPÍDIO, caracterizada por compreender um lipídio catiônico de fórmula (I), conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1-40.
96. MÉTODO PARA PREPARAR UM COMPOSTO de fórmula (I): conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1-40, caracterizado por compreender reagir um composto de fórmula (Ia) correspondente: (Ia) em que R4a é bromo ou cloro, com uma amina de fórmula HNRaRb para fornecer o composto de fórmula (I) em que R4 é NRaRb.
97. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 96, caracterizado por compreender ainda preparar o composto de fórmula (Ia), em que R1, R2 e R3 são, cada um, o mesmo C2-C30 hidrocarbil, reagindo um composto correspondente de fórmula (Ib): (Ib) em que cada Z é independentemente bromo ou cloro, com um C2-C30 hidrocarbil-OH álcool. Para fornecer o composto de fórmula (Ia).
98. COMPOSTO, caracterizado por ser de fórmula (I): em que: R1 é um C2-C30 hidrocarbil; R2 é um C2-C30 hidrocarbil; R3 é um C2-C30 hidrocarbil; X é um C2-C8 alquil divalente; R4 é NRaRb; cada Ra e Rb é independentemente selecionado do grupo que consiste em metil, etil, propil, ciclopropil e butil, cujo metil, etil, propil, ciclopropil e butil é opcionalmente substituído por hidróxi; ou Ra e Rb tomados com o nitrogênio ao qual eles estão fixados formam um anel de aziridina, azetidina, prolina, piperidina, piperazina ou morfolina, cujo anel é opcionalmente substituído por hidroxil ou com C1-C6 alquil que é opcionalmente substituído por hidróxi.
99. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender um composto de fórmula (I), conforme descrito na reivindicação 98 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um transportador farmaceuticamente aceitável.
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