BR112021000455A2 - Suporte de peptídeo de automontagem - Google Patents

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Abstract

SUPORTE DE PEPTÍDEO DE AUTOMONTAGEM. A presente divulgação descreve um suporte de peptídeo para a produção de vacinas. O suporte de peptídeo inclui um peptídeo que se automonta em um carreador de hapteno (hC), incluindo alfa-hélices anfipáticas. O peptídeo inclui repetições de heptad seguindo um padrão específico. O hC inclui ainda hapteno ou um agente conjugado a ele e, opcionalmente, o hC inclui um ou mais epítopos de células T no terminal N e/ou C de uma ou mais alfa-hélices anfipáticas. A presente divulgação também descreve composições incluindo composições imunogênicas incluindo o conjugado de hapteno-hC ou agente-hC.

Description

“SUPORTE DE PEPTÍDEO DE AUTOMONTAGEM” RELATÓRIO DESCRITIVO REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS CORRELATOS
[0001] O presente Pedido reivindica o benefício do Pedido de patente Provisório US n° 62/697.132, depositado em 12 de julho de 2018, cujo Pedido é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
INFORMAÇÕES DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0002] Um arquivo de texto legível por computador, intitulado “A070-0003PCT_ST25.txt”, criado em ou por volta de 10 de julho de 2019, com um tamanho de arquivo de cerca de 7 KB, contém a listagem de sequência para este Pedido e é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
CAMPO TÉCNICO
[0003] A presente divulgação descreve suportes de peptídeos para a produção de vacinas sinteticamente.
ANTECEDENTES
[0004] A expressão de proteína recombinante em hospedeiros, como bactérias (predominantemente, E. coli), leveduras, células de insetos e células de mamíferos são atualmente o método mais comum de produção de vacinas de subunidades. Isso tem sido muito bem- sucedido e continuará sendo um método importante de produção de vacinas. Normalmente, uma proteína do agente infeccioso é identificada por análise genômica, ensaios funcionais, in silico análises (por exemplo, previsão funcional, análise estrutural, identificação de epítopo, etc.), ou uma combinação das três. Os ensaios de expressão são iniciados para avaliar o rendimento e a solubilidade dos ensaios de imunogenicidade. As subunidades que produzem anticorpos de alta titulação para o alvo da doença são então transportadas para estudos de proteção onde a vacina é testada quanto à sua capacidade de proteger os hospedeiros contra infecção e/ou manifestação e progressão da doença. As subunidades que atendem a todos esses critérios são encaminhadas para a otimização da produção da vacina, estabilidade e estudos de toxicidade/segurança/dosagem. Estudos de otimização de expressão também são importantes para determinar a escala de produção e viabilidade. É bem sabido que todo o processo é demorado, trabalhoso e muito caro.
[0005] É necessário desenvolver um método mais eficiente e econômico para a produção de vacinas.
SUMÁRIO
[0006] A presente divulgação descreve peptídeos monoméricos que compreendem dois ou mais heptâmeros que se automontam em um dímero, trímero, tetrâmero, pentâmero, hexâmero, heptâmero, octâmero, nanômero ou decâmero. Cada um dos heptads compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1-11.
[0007] Os peptídeos descritos na presente invenção se automontam em um carreador de hapteno (hC). Nas modalidades, os peptídeos descritos na presente invenção se automontam em hexâmeros e compreendem uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 12-17. Os carreadores de hapteno hexamérico (HhC) incluem ainda um ou mais haptenos conjugados a ele. O HhC também inclui epítopos de células T nos terminais N e C das hélices hexaméricas.
[0008] Nas modalidades, a presente divulgação descreve composições compreendendo os carreadores de hapteno (hC) descritos na presente invenção contendo um ou mais haptenos e epítopos de células T e um excipiente farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica é usada para tratar indivíduos que necessitam da mesma.
[0009] Nas modalidades, a presente divulgação descreve métodos de uso da composição farmacêutica descrita na presente invenção para induzir uma resposta imune robusta em um indivíduo com necessidade dos mesmos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0010] A FIG. 1 mostra a arquitetura do hexâmero de automontagem. Os resíduos hidrofóbicos estão em um lado de uma alfa-hélice anfipática, e os resíduos reativos (aqui a lisina é mostrada, mas outros resíduos ou aminoácidos não naturais contendo grupos reativos passíveis de acoplamento covalente) para acoplamento de hapteno estão no outro lado. Após a hidratação, os resíduos hidrofóbicos se associam para excluir a água, que é o complexo energeticamente mais favorável. A colocação de epítopos de células T específicos da espécie estão nos terminais N e C
[0011] A FIG. 2 mostra a imunogenicidade do HhC. Os três domínios do suporte são mostrados em um diagrama de fita à esquerda e em um diagrama de superfície à direita. O modelo foi analisado por software de predição de epítopo e os metadados são coloridos de acordo com sua pontuação de imunogenicidade potencial no modelo à direita. Vermelho = maior potencial imunogenicidade; Azul = menor potencial imunogenicidade.
[0012] A FIG. 3 mostra a síntese do HhC conjugado com hapteno. Os resíduos reativos em HhC (mostrados como ligações vermelhas) são ativados com um reticulador heterobifuncional específico de resíduo ou reagem diretamente com o peptídeo haptênico ativado (por exemplo, esterificação de EDC/NHS) para formar o hexâmero conjugado com hapteno. Esta reação é realizada com um grande excesso (> 10 equivalentes molares) de reticulador e peptídeo para garantir que o hexâmero esteja completamente carregado (12 peptídeos acoplados são mostrados aqui). Um triptofano de ocorrência natural, ou adicionado durante o SPPS, permite a quantificação da eficiência de acoplamento por espectroscopia de fluorescência. Aqui, o tamanho do monômero é de 60 resíduos.
[0013] A FIG. 4 mostra gel PAGE de um peptídeo automontado. O peptídeo (SEQ ID NO: 15) foi sintetizado por SPPS e liofilizado para armazenamento. O peptídeo foi dissolvido em 1X PBS e, em seguida, carregado em um gel PAGE nativo azul e fracionado por tamanho por eletroforese através de um gel de gradiente de acrilamida de 4 a 16% por 90 min a 150 V (constante). O gel foi fixado em metanol: ácido acético:água e, em seguida, enxaguado na mesma solução para descoloração. A pista 1 é BSA como uma proteína de referência e a pista 2 é o hexâmero automontado. Os padrões de MW (que não são mostrados) estão à direita. BSA tem 66 kDa e o hexâmero tem um tamanho esperado de 20,7 kDa.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0014] Os haptenos são moléculas pequenas que carecem de determinantes antigênicos devido ao seu pequeno tamanho. Para se tornarem antigênicos, eles devem ser acoplados a uma proteína carreadora maior para serem imunogênicos. Peptídeos pequenos (ou seja, geralmente aqueles com menos de 5.000 Daltons) também não possuem determinantes antigênicos para induzir uma resposta imune robusta, portanto, eles também devem ser acoplados a uma proteína carreadora maior para serem imunogênicos. Portanto, como usado na presente invenção, “hapteno” se refere a 1) qualquer molécula que carece de determinantes antigênicos até que seja covalentemente ou não covalentemente ligada a uma proteína carreadora maior, ou 2) uma molécula cuja antigenicidade é aumentada por acoplamento covalente ou não covalente a uma proteína carreadora maior.
[0015] A presente divulgação descreve um novo método para produzir vacinas incluindo um carreador de hapteno (hC) contendo um ou mais haptenos. O método elimina muitas das etapas mais caras e demoradas do desenvolvimento de uma vacina de subunidade tradicional. Em vez de produzir subunidades em hospedeiros de expressão recombinante, um sistema flexível e modular onde todos os componentes da vacina são produzidos sinteticamente por síntese de peptídeos em fase sólida (SPPS - “solid phase peptide synthesis”). Nas modalidades, o método descrito na presente invenção inclui o projeto de um componente de hC que automonta pequenas alfa-hélices anfipáticas de peptídeo em um complexo carreador grande o suficiente para induzir uma resposta imune robusta após um ou mais haptenos serem acoplados. Nas modalidades, o carreador de hapteno inclui seis alfa- hélices anfipáticas de peptídeos. Como exemplo, a figura 1 mostra os componentes do carreador de hapteno hexamérico (HhC) descrito na presente invenção. Existe uma região central que forma o núcleo após a hidratação, e as lisinas nesta região funcionam para a conjugação de haptenos, por exemplo, pequenos peptídeos endógenos ou peptídeos compreendendo epítopos de células B em uma proteína maior. O tamanho do HhC pode variar de acordo com o comprimento do epítopo da célula T. Após a formação do hexâmero, o hexâmero não conjugado tem 38,5 kDa (figura 1). O hexâmero conjugado será maior dependendo do comprimento e do tamanho do hapteno conjugado. Por exemplo, um peptídeo de 20 resíduos de 2.156 Daltons carregado no hexâmero aumentaria o tamanho de 38,5 kDa para 64 kDa.
[0016] A presente divulgação também descreve o uso de hC como um carreador para agentes que precisam ser fornecidos in vivo. O agente é conjugado ou ligado ao hC para fornecimento a um sítio específico in vivo.
[0017] A presente divulgação descreve uma região central do hC que inclui um peptídeo de pelo menos 14 resíduos de aminoácidos de comprimento e que compreende pelo menos duas repetições de heptad,
cada heptad tendo o padrão hwxhxyz (SEQ ID NO: 19), em que h é um resíduo hidrofóbico ou não polar; w é um resíduo alifático carregado positivamente, carregado negativamente, polar não carregado ou não polar; x é um resíduo alifático não polar, carregado negativamente, carregado positivamente, resíduo polar não carregado ou qualquer resíduo natural ou não natural para acoplamento de epítopo a um hapteno ou qualquer outra molécula; y é qualquer resíduo natural ou não natural para acoplamento de epítopo a um hapteno ou qualquer outra molécula; e z é um resíduo alifático carregado negativamente, carregado positivamente, polar não carregado, não polar ou qualquer resíduo natural ou não natural para acoplamento de epítopo a um hapteno ou qualquer outra molécula.
[0018] Nas modalidades, a região central de hC inclui um peptídeo com o padrão (hwxhxyz)n (SEQ ID NO: 20), em que h é I, L, V, F, W, Y, M, W, G ou A; w é G, R, A, N, Q, H, S, D, E, K ou T; x é R, S, N, Q, A, G, T, D, E, K, H ou C; y é K, H, C, D, E, R, W, Y, Q, N ou um aminoácido não natural ou molécula contendo grupos reativos passíveis de acoplamento covalente; Z é A, D, H, S, E, R, N, Q, K ou G; e n é um número inteiro maior que 1
[0019] Nas modalidades, os heptads exemplificadores descritos na presente invenção têm as seguintes sequências de aminoácidos: LRSIGKD (SEQ ID NO: 1); LRSIGRD (SEQ ID NO: 2); IREISRA (SEQ ID NO: 3); IREVAQS (SEQ ID NO: 4); IRDIAKA (SEQ ID NO: 5); IRDIGRA (SEQ ID NO: 6); IRDVGQS (SEQ ID NO: 7); IRDLAKG (SEQ ID NO: 8); VKDVARG (SEQ ID NO: 9); IRDIGNS (SEQ ID NO: 10); IKDLARG (SEQ ID NO: 11); ou IKKLKKK (SEQ ID NO: 12).
[0020] Nas modalidades, a região central do hC inclui um ou mais heptads descritos na presente invenção, n é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou
11.
[0021] A presente divulgação descreve uma região central do hC que inclui um peptídeo de pelo menos 14 resíduos. Nas modalidades, o peptídeo inclui 14 resíduos a 80 resíduos de comprimento e inclui duas a 11 repetições de heptads. Nas modalidades, a região central de hC inclui um peptídeo compreendendo 20 a 70 resíduos, 25 a 60 resíduos, 28 a 50 resíduos, 28 a 40 resíduos ou 28 a 30 resíduos. Os peptídeos incluindo 14 resíduos a 80 resíduos de comprimento são monômeros.
[0022] Nas modalidades, os peptídeos exemplificadores descritos na presente invenção têm as seguintes sequências de aminoácidos: LRSIGKDLRSIGKDLRSIGKDLRSIGKD (SEQ ID NO: 13) LRSIGKDLRSIGKDLRSIGKDLRSIGKDS (SEQ ID NO: 14); LRSIGKDLRSIGRDLRSIGKDLRSIGRD (SEQ ID NO: 15); IREISRAIREVAQSIRDIAKAIREIGKS (SEQ ID NO: 16); IRDIGRAIRDVGQSIRDLAKGIRDISKG (SEQ ID NO: 17); ou VKDVARGIRDIGNSIKDLARGIRDIGRG (SEQ ID NO: 18).
[0023] Os peptídeos descritos na presente invenção podem ser modificados para incluir uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções e manter o padrão de hwxhxyz (SEQ ID NO: 19), descrito acima. A modificação em cada posição dentro da repetição do heptad ou do peptídeo deve manter a estrutura alfa-helicoidal anfipática, estabilidade e estado de oligomerização do peptídeo.
[0024] Nas modalidades, os peptídeos descritos na presente invenção incluem peptídeos que compreendem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para (SEQ ID NO:1)n, (SEQ ID NO: 2)n, (SEQ ID NO: 3)n (SEQ ID NO: 4)n, (SEQ ID NO: 5)n, (SEQ ID NO: 6)n, (SEQ ID NO: 7)n, (SEQ ID NO: 8)n, (SEQ ID NO: 9)n, (SEQ ID NO: 10)n ou SEQ ID NO: 11)n, em que n é um número inteiro de 2 a 11. Nas modalidades, os peptídeos descritos na presente invenção incluem peptídeos que compreendem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, ou 17. A identidade da sequência se refere ao grau de correspondência de duas sequências em um alinhamento, geralmente expresso como uma porcentagem. As diferenças entre duas sequências podem ser determinadas por métodos rotineiramente praticados na técnica para determinar a identidade, que são concebidos para fornecer a maior correspondência entre as sequências testadas. Métodos para determinar a identidade da sequência podem ser determinados usando programas de computador disponíveis publicamente. Os métodos de programa de computador para determinar a identidade entre duas sequências incluem, por exemplo, BLASTP, BLASTN e FASTA. A família de programas BLAST está publicamente disponível no NCBI e outras fontes.
[0025] Nas modalidades, os resíduos podem ser adicionados ao terminal N ou C dos peptídeos descritos na presente invenção para aumentar a estabilidade dos peptídeos in vivo. Por exemplo, V (valina), M (metionina), G (glicina), I (isoleucina), D (ácido aspártico) ou P (prolina) podem ser adicionados ao terminal N ou C dos peptídeos. Além disso, grupos de proteção podem ser adicionados aos resíduos para aumentar a estabilidade dos peptídeos. Exemplos de tais grupos de proteção incluem acetila, acrila, 9-fluorenilmetoxicarbonila, terc- butiloxicarbonila, aliloxicarbonila, benziloxicarbonila e PEG (polietileno glicol).
[0026] Os peptídeos (incluindo os peptídeos modificados) descritos na presente invenção podem ser sintetizados quimicamente por técnicas manuais ou por procedimentos automatizados. Como exemplo, a síntese de polipeptídeos em fase sólida (SPPS) foi realizada desde o início dos anos 1960. Ao longo dos anos, foram feitas melhorias no SPPS inicial e muitos métodos foram automatizados. Produtos químicos foram desenvolvidos para proteger as extremidades terminais e outros grupos reativos.
[0027] Os peptídeos descritos na presente invenção também podem ser produzidos de forma biológica ou de forma recombinante em um sistema de expressão heterólogo. Qualquer sistema de expressão heterólogo pode ser usado para produzir os peptídeos descritos na presente invenção. Nas modalidades, o sistema de expressão compreende E. coli., que carece de maquinaria para modificação pós- tradução, tornando-o um hospedeiro adequado para a produção dos peptídeos descritos na presente invenção.
[0028] Os peptídeos descritos na presente invenção podem ser um carreador de hapteno monomérico (hC), mas uma vez que o peptídeo é um peptídeo de automontagem, ele pode se automontar em um hC que é um oligômero composto por um dímero, trímero, tetrâmero, pentâmero, hexâmero, heptâmero, octâmero, nanômero ou decâmero. Nas modalidades, o peptídeo se automonta em um hexâmero, que tem seis alfa-hélices anfipáticas.
[0029] Nas modalidades, a presente divulgação descreve um hexâmero de automontagem que é um carreador de hapteno hexamérico (HhC) incluindo um ou mais resíduos para conjugar um hapteno. O sítio ideal no HhC para conjugar com o hapteno é o resíduo y na repetição do heptad, mas o acoplamento do hapteno também pode ocorrer nos resíduos w, x e z, uma vez que são acessíveis por solvente, e o hapteno pode ser acoplado usando qualquer resíduo que pode acoplar um epítopo de um hapteno. Nas modalidades, o resíduo y é K, H, C, D, E, R, W, Y, Q, N ou um aminoácido não natural contendo grupos reativos passíveis de acoplamento covalente. Nas modalidades, existem dois a quatro resíduos y em um lado de cada uma das seis alfa-hélices anfipáticas para fornecer um local de acoplamento. Nas modalidades, o resíduo y é lisina (K).
[0030] O hC pode ser conjugado a um ou mais haptenos usando o resíduo y. O hC conjugado a um hapteno é um conjugado de peptídeo e é referido como o conjugado de hapteno-hC ou conjugado de hapteno- oligômero. Nas modalidades, o hC está ligado a um a 100, 10 a 90, 20 a 80, 30 a 70, 40 a 60 ou 50 haptenos. Os haptenos podem ser iguais ou diferentes.
[0031] O termo “haptenos” se refere a moléculas que não são bons imunogenes por si mesmas, mas se tornam imunogênicas quando ligadas a uma molécula maior. Um hapteno pode ser uma pequena molécula orgânica, um monossacarídeo, dissacarídeo, oligossacarídeo, um lipídeo, ácido nucleico, peptídeo ou um polipeptídeo, por exemplo. Embora um hapteno possa ser capaz de se ligar a um anticorpo, a imunização com um hapteno geralmente não provoca uma forte resposta de anticorpos. No entanto, a imunogenicidade pode ser alcançada quando o hapteno é covalentemente ligado por ligação ou conjugação a uma molécula carreadora maior, tal como um conjugado de hapteno-carreador que é maior que 5.000 Daltons. Os carreadores de hapteno (hCs) descritos na presente invenção são exemplos de tais conjugados de carreador de hapteno.
[0032] Os haptenos que podem ser conjugados ao hC incluem qualquer agente que pode desencadear a produção de anticorpos que são úteis para tratar, prevenir, aliviar os sintomas ou reduzir o risco de desenvolver uma doença ou distúrbio, incluindo o vício em um fármaco, em um indivíduo. Exemplos de haptenos incluem peptídeos, lipídeos, lipopeptídeos, lipoproteínas, carboidratos e moléculas pequenas. Exemplos de peptídeos que podem ser usados como haptenos incluem epítopos de células T e epítopos de células B. Os peptídeos, epítopos de células T e epítopos de células B incluem peptídeos ou proteínas nativas ou produzidas sinteticamente ou de forma recombinante compreendendo aminoácidos D ou L naturais ou não naturais. Os lipídeos que podem ser usados como haptenos incluem aqueles que induzem uma resposta imune inata e/ou adaptativa por meio da ligação aos receptores TLR e MHC I ou II. Os lipídeos também podem servir como epítopos de células B. Os carboidratos que podem servir como haptenos incluem glicose, dissacarídeos, trissacarídeos e sacarídeos maiores, incluindo carboidratos complexos.
[0033] Os haptenos podem ser acoplados ao hC usando qualquer método conhecido, incluindo química de clique ou reagente de reticulação homo ou heterobifuncional ou formação de ligação peptídica. Nas modalidades, os haptenos podem ser conjugados ao hC usando EDC cloridrato de (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodi- imida)/NHS (N-hidroxisuccinimida) ou química de reticulação de NHS/maleimida, que são rotineiramente usados para moléculas de conjugação. Os resíduos y, por exemplo, lisinas, são posicionados para fornecer colocação de hapteno bem definida e estequiometria de acoplamento.
[0034] Os haptenos também podem ser acoplados ao hC por meio de qualquer fração ligante adequada. Exemplos de ligantes incluem aqueles que formam ligações de amida, ligações de éster e ligações de dissulfeto. O ligante pode ser um ligante clivável, tal como ligante de peptídeo clivável por protease, ligante de ácido nucleico sensível a nuclease, ligante de lipídeo sensível a lipase, ligante de carboidrato sensível a glicosidase, ligante sensível a pH, ligante sensível a hipóxia, ligante fotoclivável, ligante lábil ao calor ou ligante clivável enzimático. O ligante também pode ser um ligante não clivável. Qualquer método conhecido pode ser usado para associar um ligante com o hC, por exemplo, química de clique, adsorção passiva, quelação multivalente, ligação não covalente de alta afinidade ou formação de ligação covalente. Um hapteno também pode ser anexado ao hC sem um ligante.
[0035] Além disso, um hapteno pode ser conjugado ao hC por meio de outra molécula. Por exemplo, um hapteno, como um epítopo de células B ou epítopo de células T, pode ser primeiro acoplado a um carreador para exibir um epítopo de interesse e, em seguida, ser conjugado ao hC. Exemplos de tal carreador incluem proteína, peptídeo, nanopartícula, partícula semelhante a vírus ou qualquer coisa que possa funcionar como um carreador para exibir epítopos de interesse.
[0036] Além disso, a presente divulgação descreve um hC incluindo opcionalmente um ou mais epítopos de células T ligados ao terminal N e/ou C de uma ou mais das hélices no núcleo do hC. Nas modalidades, um ou mais epítopos de células T estão ligados ao terminal N e/ou C de cada uma das hélices no núcleo do hC. Os epítopos de células T no terminal N e/ou C recrutam células T help para fornecer uma resposta imune robusta do hexâmero conjugado com hapteno. Métodos para selecionar um peptídeo de epítopo de células T são bem conhecidos. Por exemplo, um epítopo de células T pode ser selecionado por métodos experimentais conhecidos na técnica, identificados a partir da literatura científica, previstos usando ferramentas de bioinformática, projetados de novo ou uma combinação desses métodos. Nas modalidades, os epítopos de células T no terminal N e terminal C são iguais ou diferentes. Nas modalidades, os epítopos de células T são, por exemplo, epítopos de células T CD4+, que são conhecidos por potencializar o desenvolvimento de células B de memória e células plasmáticas que produzem anticorpos de alta afinidade.
[0037] Os epítopos de células T podem ser acoplados ao terminal N e/ou C usando ligação química nativa (NCL - “native chemical ligation”) em vez de síntese em fase sólida. Os epítopos de células T podem ser acoplados ao terminal N e/ou C usando reticuladores homo ou heterobifuncionais ou usando reagentes químicos de clique, que são reagentes bem conhecidos para moléculas de acoplamento.
[0038] Os epítopos de células T no terminal N ou C podem ser ligados ou conjugados ao hC através de um reagente funcional intermediário, como uma pequena molécula reativa ou uma molécula grande. Exemplos de tais moléculas pequenas incluem um catalisador, um intermediário estável ou um sal. Exemplos de tais moléculas grandes incluem um peptídeo antigênico múltiplo, proteína ou enzima.
[0039] Além disso, a conjugação de epítopos de células T nas extremidades do hC ou a conjugação de haptenos ou outras moléculas ao núcleo do hC pode ser realizada usando qualquer tipo de ligantes. Os ligantes podem ser cliváveis ou não cliváveis. Os ligantes cliváveis incluem ligantes de peptídeo cliváveis por protease, ligantes de ácido nucleico sensíveis à nuclease, ligantes de lipídeos sensíveis à lipase,
ligantes de carboidratos sensíveis à glicosidase, ligantes sensíveis ao pH, ligantes cliváveis de enzima, ligantes lábeis ao calor, ligante fotoclivável. Os reticuladores também podem ser usados pela ativação de um átomo da cadeia lateral ou átomo terminal para a reação covalente com um átomo de molécula intermediária ou final para formar uma ligação covalente.
[0040] Agentes diferentes de haptenos podem ser conjugados a hC para fornecimento in vivo. O termo “agentes” inclui moléculas, como ácidos nucleicos, peptídeos e agentes terapêuticos. Por exemplo, ácidos nucleicos ou derivados de ácidos nucleicos também podem ser conjugados ao hC por meio de ligações covalentes para fornecimento ao interior de uma célula ou organelas celulares. Um epítopo de células T pode ser conjugado, por exemplo, com um espaçador clivável ou ligante que pode ser clivado in vivo. Uma vez clivado, o epítopo de células T pode ser apresentado através da ligação ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC - “histocompatibility complex”) para desencadear a resposta imune de células T. Exemplos de agentes terapêuticos incluem pequenas moléculas como paclitaxel e doxorrubicina para tratamento de câncer.
[0041] Um ou mais dos agentes descritos na presente invenção podem ser conjugados ou ligados ao hC em um ou mais dos terminais N e/ou C ou no núcleo de hC através do resíduo y usando qualquer um dos métodos conhecidos e descritos na presente invenção para ligar um hapteno ao hC. O conjugado de agente-hC resultante não inclui um epítopo de células T. Como um exemplo, um agente terapêutico pode ser ligado ou conjugado ao hC por meio de um reticulador clivável ou não clivável para fornecimento a um sítio específico.
[0042] Nas modalidades, o conjugado de agente-hC incluindo um agente terapêutico pode incluir ainda um ou mais agentes de direcionamento (substituindo os epítopos de células T) para direcionar os sítios específicos. Os sítios específicos podem ser sítios extracelulares ou intracelulares, como organelas subcelulares. Exemplos de organelas subcelulares incluem mitocôndrias, peroxissomos, núcleos, citosol, ER ou complexo de golgi.
[0043] Nas modalidades, o agente de direcionamento é um peptídeo de penetração celular (CPP - “penetrating peptide”). Exemplos de CPPs incluem TAT (derivado de uma proteína de HIV), Penetratina (pAntp (4358)), Rn e pVEC. Estes são CPPs catiônicos. Outros exemplos de CPPs incluem CPPs anfipáticos que são peptídeos quiméricos. Estes peptídeos quiméricos incluem um domínio hidrofóbico e um sinal de localização nuclear (NLS - “nuclear localization signal”). Exemplos de tais peptídeos quiméricos incluem MPG e Pep-1.
[0044] A presente divulgação descreve composições incluindo o hC descrito na presente invenção e um ou mais excipientes. Nas modalidades, o hC é conjugado a um ou mais haptenos (conjugado de hapteno-hC) ou agentes (conjugado de agente-hC) e, opcionalmente, um ou mais epítopos de células T estão ligados (ou conjugados a) ao terminal N e/ou C do núcleo de hC. Nas modalidades, a composição é uma composição farmacêutica e o excipiente é um excipiente farmaceuticamente aceitável. Nas modalidades, o hC é HhC.
[0045] O termo “excipiente” se refere a um diluente, adjuvante ou veículo com o qual o hC é administrado. Exemplos de adjuvantes incluem adjuvante de Freund completo e incompleto, que são usados com animais, particularmente animais de pesquisa. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis podem ser líquidos estéreis, como água e óleos, incluindo os de petróleo, origem animal, vegetal ou sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e semelhantes. A água é um excipiente preferido quando a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa. Soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol também podem ser utilizadas como excipientes líquidos, particularmente, para soluções injetáveis. Excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado em pó, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e semelhantes. Adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles que são baseados em monofosforil lipídeo-A misturado com um óleo, por exemplo, esqualeno.
[0046] A composição ou composição farmacêutica, se desejado, também pode conter pequenas quantidades de agentes umectantes ou emulsificantes, ou agentes tamponantes de pH. Estas composições podem assumir a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de liberação sustentada e semelhantes. A formulação oral pode incluir excipientes padrão, tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio, etc. Tal formulação conterá uma quantidade terapeuticamente eficaz de hC, na forma purificada, juntamente com uma quantidade adequada de excipiente para fornecer a forma de administração adequada ao indivíduo. A formulação deve ser adequada ao modo de administração.
[0047] A administração das composições farmacêuticas descritas na presente invenção pode ser realizada de qualquer maneira conveniente, incluindo por inalação de aerossol, injeção, ingestão, transfusão, implantação ou transplante. As composições descritas na presente invenção também podem ser administradas a um indivíduo por via oral, tópica, intranasal, enteral, retal, bucal, vaginal, sublingual, subcutânea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, intravenosa, intracraniana, intraperitoneal ou uma combinação dos mesmos. A administração da composição farmacêutica pode ser de qualquer maneira que seja eficaz para fornecer uma quantidade terapeuticamente e/ou profilaticamente eficaz do conjugado de hapteno-hC ou de agente-hC ao indivíduo em necessidade do mesmo.
[0048] A presente divulgação descreve uma estrutura de peptídeo útil para a produção de vacina. A presente divulgação também descreve um método de preparação de uma vacina que inclui projetar e preparar um peptídeo monomérico para o núcleo do hC descrito na presente invenção, permitindo que o peptídeo monomérico se oligomerize, e conjugar um hapteno de interesse ao hC oligomerizado. Conforme descrito acima, o peptídeo monomérico pode ser sintetizado por SPPS, o que inclui o fornecimento do peptídeo monomérico preparado na forma liofilizada. A hidratação do peptídeo monomérico liofilizado permite que a oligomerização ocorra. O PBS, que inclui capacidade de tamponamento e sal, pode ser usado para hidratar o peptídeo monomérico liofilizado. Nas modalidades, o hC oligomerizado é um HhC. O método pode incluir ainda a ligação de um ou mais epítopos de células T ao terminal N ou C de uma ou mais hélices do núcleo de hC. Nas modalidades, o peptídeo monomérico é sintetizado com um ou mais epítopos de células T fixos ao seu terminal N e/ou C.
[0049] Além disso, os métodos descritos na presente invenção incluem o aumento da imunogenicidade de um hapteno. O método inclui a conjugação de um hapteno de interesse ao hC descrito na presente invenção. O método pode incluir ainda a ligação de um ou mais epítopos de células T ao terminal N ou C de uma ou mais hélices do núcleo de hC. O aumento da imunogenicidade do hapteno é comparado com a imunogenicidade do hapteno por si só, por exemplo, não ligado ou associado a um excipiente.
[0050] Nas modalidades, a presente divulgação descreve composições imunogênicas compreendendo o conjugado de hapteno-hC conforme descrito acima. O conjugado de hapteno-hC inclui opcionalmente um ou mais epítopos de células T. A composição imunogênica inclui um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. O excipiente pode ser um adjuvante que é usado para melhorar ou potencializar a resposta imune ao conjugado de hapteno- hC de uma maneira terapeuticamente eficaz. A composição imunogênica pode ser administrada a um indivíduo com necessidade do mesmo por qualquer via descrita na presente invenção para o fornecimento de uma composição farmacêutica em uma quantidade eficaz a um indivíduo com necessidade do mesmo.
[0051] A dosagem para administrar as composições farmacêuticas e imunogênicas descritas na presente invenção a um indivíduo irá variar com a natureza precisa da condição a ser tratada e o receptor do tratamento. A escala de dosagens para administração humana pode ser realizada de acordo com práticas aceitas na técnica por um médico, dependendo de vários fatores.
[0052] A composição farmacêutica ou imunogênica descrita na presente invenção pode ser uma formulação. Nas modalidades, a composição farmacêutica ou imunogênica pode ser formulada para liberação imediata ou para liberação sustentada ou lenta. Essas formulações podem ser preparadas usando tecnologia bem conhecida. As formulações de liberação sustentada podem conter o conjugado de hapteno-hC ou de agente-hC disperso em uma matriz de excipiente e/ou estar contidas dentro de um reservatório rodeado por uma membrana de controle de taxa. Excipientes para uso em tais formulações são biocompatíveis e/ou biodegradáveis. A formulação fornece um nível relativamente constante de liberação do componente ativo. A quantidade de conjugado de hapteno-hC ou de agente-hC contido em uma formulação de liberação sustentada depende do local de implantação, da taxa e da duração esperada da liberação e da natureza da condição a ser tratada ou evitada.
[0053] A presente divulgação também descreve kits com doses unitárias de conjugado de hapteno-hC ou de agente-hC descritos na presente invenção. Esses kits podem incluir um recipiente contendo a dose unitária, um folheto informativo com instruções para usar o kit para tratar ou prevenir uma doença ou distúrbio de interesse e, opcionalmente, um aparelho ou dispositivo para distribuição da composição.
[0054] Os métodos descritos na presente invenção incluem o tratamento de indivíduos como humanos, animais veterinários (cães,
gatos, répteis, pássaros, etc.), gado (cavalos, gado, cabras, porcos, galinhas, etc.) e animais de pesquisa (macacos, ratos, camundongos, peixes, etc.). Os indivíduos que precisam de um tratamento (com necessidade do mesmo) são indivíduos com doença ou distúrbios que precisam ser tratados com uma vacina ou composição imunogênica que irá induzir uma resposta imune no indivíduo que é suficiente ou terapeuticamente eficaz para tratar o indivíduo da doença ou distúrbio. O termo “doença” ou “distúrbio” também inclui drogas viciantes, como nicotina, heroína, cocaína, metanfetaminas, etc.
[0055] Os métodos descritos na presente invenção também incluem o tratamento profilático de um indivíduo com necessidade do mesmo. Os métodos descritos na presente invenção protegem um indivíduo de uma doença ou distúrbio induzindo uma resposta imune no indivíduo que é suficiente ou terapeuticamente eficaz para proteger o indivíduo da doença ou distúrbio.
[0056] Os tratamentos incluem a administração de uma quantidade eficaz do conjugado de hapteno-hC ou de agente-hC ou a composição incluindo o conjugado de hapteno-hC ou de agente-hC em uma quantidade eficaz. Uma “quantidade eficaz” é a quantidade de agente ativo, por exemplo, hapteno-hC ou agente-hC ou composição descrita na presente invenção, necessária para resultar em uma alteração fisiológica desejada in vivo ou in vitro. Uma quantidade terapeuticamente eficaz inclui aquelas que fornecem uma quantidade eficaz.
[0057] Uma vacina eficaz contém componentes capazes de induzir respostas imunes inatas e adaptativas após a imunização. Considerando que a imunidade inata é induzida usando adjuvantes, nas modalidades, o hC descrito na presente invenção é um HhC que contém os epítopos de células B e T adaptativas, conforme mostrado na figura 1. Após a conjugação do epítopo, o conjugado de hexâmero- epítopo contém sequências estranhas mínimas para uma resposta imune mais focada e robusta contra os epítopos de células B. Nas modalidades, para a ativação de células T CD4+, os terminais N- e C- de cada uma das seis hélices e/ou a região central de HhC contêm epítopos de células T CD4+ específicos da espécie necessários para o recrutamento de células T help, produzindo plasmócitos de vida longa e anticorpos de alta titulação/alta afinidade, e direcionando uma resposta de memória imune robusta. Esses epítopos são colocados nos terminais do HhC, de modo que não interfiram com o acoplamento do hapteno. Eles são escolhidos para não terem resíduos de lisina e cisteína, de modo que não sejam haptenizados ou reticulados de forma incontrolável durante o processo de acoplamento de epítopos de células B. Foi demonstrado que a haptenização da lisina em epítopos de células T reduz bastante sua atividade e função. Epítopos de células T de muitas espécies diferentes podem ser adquiridos do banco de dados de IEDB e são escolhidos com base em ensaios de células T e B positivas, incluindo ensaios de ligação ao ligante de MHC, capacidade de recrutar ajuda de células T e indução de proliferação de células B. A natureza modular da tecnologia de vacina descrita na presente invenção simplifica a transferência de construtos de vacina entre espécies, pois é uma simples questão de substituir os epítopos de células T e modificar o epítopo de células B se uma doença ou condição diferente for direcionada.
[0058] Uma vantagem distinta da região central de HhC descrita na presente invenção é a sua imunogenicidade reduzida (figura 2), que minimiza a apresentação de epítopos imunodominantes improdutivos ou não protetores. Assim, a combinação de apresentar múltiplos epítopos de células B com uma redução de epítopos imunodominantes não produtivos, e a apresentação de múltiplos epítopos de células T, produz uma vacina altamente eficaz.
[0059] Haptenos, como epítopos de células B compreendendo peptídeos curtos (8-10 resíduos), peptídeos de comprimento médio (10- 40 resíduos), peptídeos longos sintéticos (SLPs, 40-100 resíduos), ou peptídeos ou proteínas podem ser projetados usando uma abordagem de vacinologia reversa para inicialmente identificar haptenos produtores de anticorpos que se ligam ao alvo e inibem a função. Por exemplo, a ligação de um anticorpo a uma glicoproteína de envelope viral abundante tem o potencial de interferir com a ligação do vírus aos receptores da superfície da célula hospedeira, interrompendo assim a entrada viral na célula. Analogamente, a ligação de anticorpos a abundantes proteínas da superfície bacteriana patogênica (por exemplo, a parte extracelular das proteínas da membrana externa) pode inibir a função ou inibir a ligação aos receptores da superfície da célula hospedeira e prevenir a entrada celular. Proteínas antigênicas de câncer conhecidas ou aquelas proteínas cuja antigenicidade precisa ser aumentada (como aquelas reconhecidas como “autônomas” pelo sistema imunológico) são outro exemplo de peptídeos/proteínas que podem ser acoplados covalentemente ao HhC. Uma vez que o peptídeo ou proteínas candidatas são identificadas, elas são analisadas in silico para identificar epítopos lineares. Os epítopos conformacionais são identificados por análise estrutural tridimensional, modelagem de homologia e software de predição de epítopo estrutural. Muitos programas de software baseados na web e no servidor disponíveis publicamente estão disponíveis para realizar essas análises e também temos vários programas autônomos para ajustar a identificação e análises de epítopos. Uma abordagem de vacinologia reversa foi relatada como sendo bem-sucedida usando o suporte de bobina espiral trimérica para vários epítopos, incluindo haptenos de moléculas pequenas. A mesma metodologia é usada para identificar epítopos contínuos e conformacionais em proteínas de superfície celular funcionalmente relevantes, proteínas citoplasmáticas ou fatores secretados de um agente infeccioso, para projetar uma vacina capaz de não apenas induzir anticorpos de alta titulação/alta afinidade, mas produzir anticorpos capazes de neutralizar, reduzir ou eliminar o antígeno dos hospedeiros.
[0060] As vantagens de usar um suporte de vacina completamente sintético são inúmeras. O SPPS moderno produz rotineiramente peptídeos de até 70 a 75 resíduos de comprimento. O HhC descrito na presente invenção variará em tamanho de 55 a 65 resíduos com o comprimento dos epítopos de células T definindo quanto maior do que a região central de 28 a 30 resíduos o HhC será. Os epítopos de peptídeo para acoplar covalentemente ao HhC irão variar de tamanho, mas têm idealmente de 10 a 50 resíduos de comprimento, tornando a construção sintética total da vacina viável. A produção de quantidades em quilos de peptídeos de vacina em instalações de cGMP elimina a produção industrial cara, demorada e de recursos intensivo e purificação de proteínas recombinantes e não há necessidade de eliminação viral subsequente, remoção de endotoxina ou teste para a presença de agentes infecciosos. É geralmente percebido que a síntese de peptídeos é muito cara para a fabricação de vacinas em grande escala. No entanto, se doses altas de nanogramas a baixas de µg puderem ser usadas, as vacinas de peptídeos podem ser várias vezes mais econômicas do que as vacinas de subunidades recombinantes.
[0061] O conjugado de agente-hC incluindo um ou mais CPPs pode transportar e fornecer o agente ao sítio alvo. A presente divulgação também descreve um método de preparação de um agente para fornecer a um sítio alvo e um método de fornecimento de um agente a um sítio alvo. O método de preparação de um agente para fornecimento de um sítio alvo inclui a preparação de um veículo de liberação para fornecimento de um agente a um sítio alvo, que inclui a preparação de um peptídeo descrito na presente invenção, permitindo que o peptídeo se automonte em um oligômero e conjugue o agente com o oligômero. O método inclui ainda conjugar um CPP ao peptídeo antes da automontagem em um oligômero ou conjugar o CPP ao oligômero. O método de fornecimento do agente a um sítio alvo inclui o fornecimento do conjugado de agente-hC ao sítio alvo in vivo em um indivíduo com necessidade do mesmo e in vitro às células em cultura.
[0062] Os termos “resíduo” e “resíduo de aminoácido” são usados indistintamente ao longo da divulgação para se referir a “aminoácido”.
[0063] Como será entendido por aqueles versados na técnica, cada modalidade divulgada na presente invenção pode compreender, consistir essencialmente em, ou consistir em seu elemento, etapa, ingrediente ou componente particularmente indicado. Assim, os termos “inclui” ou “incluindo” devem ser interpretados para recitar: “compreende, consiste em ou consiste essencialmente em”. O termo de transição “compreendem” ou “compreende” significa inclui, mas sem limitação, e permite a inclusão de elementos, etapas, ingredientes ou componentes não especificados, mesmo em grandes quantidades. A frase de transição “consistindo em” exclui qualquer elemento, etapa, ingrediente ou componente não especificado. A frase de transição “consistindo essencialmente em” limita o escopo da modalidade aos elementos, etapas, ingredientes ou componentes especificados e àqueles que não afetam materialmente a modalidade. Nas modalidades, a falta de um efeito material é evidenciada pela falta de uma redução estatisticamente significativa na capacidade da modalidade de realizar uma função in vitro ou in vivo.
[0064] Além disso, salvo indicação em contrário, os números que expressam as quantidades de ingredientes, constituintes, condições de reação e assim por diante usados no Relatório Descritivo e Reivindicações devem ser entendidos como sendo modificados pelo termo “cerca de”. Assim, a menos que indicado em contrário, os parâmetros numéricos estabelecidos no Relatório Descritivo e nas Reivindicações anexas são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas a serem obtidas pelo assunto aqui apresentado. No mínimo, e não como uma tentativa de limitar a aplicação da doutrina de equivalentes ao escopo das Reivindicações, cada parâmetro numérico deve pelo menos ser interpretado à luz do número de dígitos significativos relatados e aplicando técnicas de arredondamento comuns. Não obstante as faixas e parâmetros numéricos que estabelecem o amplo escopo do apresentado aqui sejam aproximações, os valores numéricos estabelecidos nos exemplos específicos são relatados com a maior precisão possível. Quaisquer valores numéricos, no entanto, contêm necessariamente certos erros resultantes do desvio padrão encontrado em suas respectivas medições de teste.
[0065] Quando mais clareza é necessária, o termo “cerca de” tem o significado razoavelmente atribuído a ele por um versado na técnica quando usado em conjunto com um valor ou faixa numérica declarado, ou seja, denotando um pouco mais ou um pouco menos do que o valor ou faixa declarado, dentro de uma faixa de ± 20% do valor declarado; ± 15% do valor declarado; ± 10% do valor declarado; ± 5% do valor declarado; ± 4% do valor declarado; ± 3% do valor declarado; ± 2% do valor declarado; ± 1% do valor declarado; ou ± qualquer percentual entre 1% e 20% do valor declarado.
[0066] Os termos “um”, “uma”, “o, a” e referentes semelhantes usados no contexto da descrição da invenção (especialmente no contexto das seguintes Reivindicações) devem ser interpretados para cobrir tanto o singular quanto o plural, a menos que indicado de outra forma aqui ou claramente contradito pelo contexto.
[0067] A recitação de faixas de valores na presente invenção se destina meramente a servir como um método abreviado de referência individual a cada valor separado dentro da faixa. A menos que indicado de outra forma na presente invenção, cada valor individual é incorporado ao Relatório Descritivo como se fosse individualmente citado na presente invenção. Deve ser entendido que a descrição em formato de faixa é meramente por conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível no escopo da divulgação. Assim, a descrição de um faixa deve ser considerada como tendo divulgado especificamente todas as subfaixas possíveis, bem como valores numéricos individuais dentro dessa faixa. Por exemplo, a descrição de um faixa, como de 1 a 6 deve ser considerada como tendo subfaixas especificamente divulgadas, como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5,
de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., bem como números individuais dentro dessa faixa, por exemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 e 6. Isso se aplica independentemente da amplitude da faixa.
[0068] Todos os métodos descritos na presente invenção podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que indicado de outra forma aqui ou de outra forma claramente contradito pelo contexto.
[0069] O uso de todo e qualquer exemplo ou linguagem exemplificadora (por exemplo, “tal como”) fornecido na presente invenção se destina apenas a esclarecer melhor a invenção e não representa uma limitação no escopo da invenção reivindicada de outra forma. Nenhuma linguagem no Relatório Descritivo deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado essencial para a prática da invenção.
[0070] Os agrupamentos de elementos alternativos ou modalidades da invenção divulgados na presente invenção não devem ser interpretados como limitações. Cada membro do grupo pode ser referido e reivindicado individualmente ou em qualquer combinação com outros membros do grupo ou outros elementos aqui encontrados. Antecipa-se que um ou mais membros de um grupo podem ser incluídos ou excluídos de um grupo por razões de conveniência e/ou patenteabilidade. Quando ocorre qualquer inclusão ou exclusão, o Relatório Descritivo é considerado como contendo o grupo modificado, cumprindo assim a descrição escrita de todos os grupos Markush usados nas Reivindicações anexas.
[0071] Os exemplos a seguir ilustram métodos exemplificadores fornecidos na presente invenção. Estes exemplos não se destinam, nem devem ser interpretados, como limitando o escopo da divulgação. Será claro que os métodos podem ser praticados de outra forma que não como particularmente descrito na presente invenção. Numerosas modificações e variações são possíveis em vista dos ensinamentos deste documento e, portanto, estão dentro do escopo da divulgação.
EXEMPLOS
[0072] Exemplo 1 Síntese do Carreador de Hapteno de Automontagem (hC)
[0073] A região central de HhC tem pelo menos 28 a 30 resíduos de comprimento e contém 2 a 10 repetições de heptads com o padrão geral hwxhxyz (SEQ ID NO: 19) onde h é um resíduo hidrofóbico ou não polar (por exemplo, I, L, V, F, W, Y, G, A ou M); w é um resíduo alifático carregado positivamente, carregado negativamente, polar não carregado ou não polar (por exemplo, G, R, A, N, Q, H, S, D, K, T ou E); x é um resíduo alifático carregado negativamente, carregado positivamente, não polar, ou resíduo polar não carregado (por exemplo, R, S, N, Q, A, G, T, D, E, K, H ou C); y é o resíduo onde ocorre acoplamento de epítopo (por exemplo, K, H, C, D, E, R, W, Y, Q ou N); e z é um resíduo alifático carregado negativamente, carregado positivamente, polar não carregado ou não polar (por exemplo, A, D, H, S, E, R, N, Q, K ou G). Resíduos básicos e ácidos nas posições w e z são projetados de modo que uma ponte de sal ou interações de ligações de hidrogênio ocorram entre hélices adjacentes para aumentar a estabilidade do complexo.
[0074] A montagem correta do hexâmero é confirmada usando cromatografia de filtração em gel e/ou PAGE nativo. Essas análises mostram até que ponto as estruturas de ordem superior se formam. O dicroísmo circular é usado para confirmar que a região do núcleo do hexâmero compreende alfa-hélices. A natureza alfa helicoidal do hexâmero em diferentes temperaturas e concentrações de caotrópicos é determinada para definir a estabilidade e garantir que as lisinas sejam expostas ao solvente para as reações de conjugação.
[0075] Os espectros de CD do hexâmero são adquiridos a temperaturas de 22 °C a 95 °C e em concentrações de guanidina HCl de 0 a 6M para definir o equilíbrio de dobramento/desdobramento do peptídeo monomérico, bem como a estabilidade do hexâmero em função da temperatura e reagentes desnaturantes, ambos os quais são fatores importantes na caracterização da estabilidade de uma vacina baseada em peptídeo.
[0076] Os experimentos foram realizados para confirmar que um hexâmero se forma após a hidratação do monômero, elucidar a solubilidade de hexâmeros acoplados ao epítopo, determinar a densidade máxima de acoplamento do epítopo e confirmar que uma estrutura hexamérica é mantida após o acoplamento do epítopo. Um peptídeo representativo, SEQ ID NO: 15, foi sintetizado com o uso de protocolos descritos anteriormente. Um resíduo de metionina e ácido aspártico foi colocado no terminal N, e o resíduo de metionina foi protegido por acetilação para formar Acetil-MD- (SEQ ID NO: 15). Após SPPS, o peptídeo foi liofilizado para armazenamento. Para mostrar a automontagem, o peptídeo foi dissolvido em tampão 1X PBS, incubado à temperatura ambiente por 5 min, e carregado em um Gel Blue NativePAGE Novex Bis-Tris usando o sistema adquirido da Life Technologies. As amostras foram preparadas e submetidas à eletroforese usando os protocolos do fabricante. A Figura 4 mostra os resultados deste experimento. O tamanho do peptídeo não montado é
3.443 kDa, então o tamanho esperado de um hexâmero é 20,7 kDa. Este experimento mostra claramente a automontagem do hexâmero e não mostra estruturas ou agregados de ordem superior detectáveis. Assim, mostramos a utilidade de nossos protocolos de projeto in silico seguidos por análises experimentais para confirmar a função.
[0077] Para auxiliar na identificação de sequências de epítopos de células B, a sequência de aminoácidos das proteínas antigênicas de comprimento total é usada para modelagem de homologia e identificação conformacional de epítopos de células B. A obtenção de um modelo de homologia permite pesquisar epítopos conformacionais de células B que geralmente produzem sequências de peptídeos antigênicos mais robustas. Servidores no site IEDB (https://www.iedb.org) são usados para predição de epítopo conformacional e contínuo. Atualmente, há apenas um punhado de servidores da web capazes de analisar a estrutura 3D de proteínas para epítopos. ElliPro e Discotope no site de IEDB são usados como uma triagem inicial. Um terceiro programa autônomo chamado PTools, que prevê epítopos com base no potencial de dessolvatação eletrostática em superfícies de proteínas, é subsequentemente usado para conformação. Esses programas de software provaram ser especialmente precisos para prever epítopos no carreador de hapteno de bobina bobinado trimérico. Uma vez que as regiões mais antigênicas são identificadas na proteína, as sequências de peptídeos são identificadas e analisadas quanto à solubilidade. Como as sequências de peptídeos de 20 resíduos ou mais tendem a formar uma estrutura terciária discernível, são selecionados epítopos que têm pelo menos 10 resíduos de comprimento, mas menos de 40 resíduos de comprimento. Peptídeos mais longos estimulam o dobramento nativo e têm o maior potencial de apresentar epítopos estruturais ao sistema imunológico. Os peptídeos são sintetizados e protegidos no terminal N (por exemplo, acetilados) e têm um resíduo de terminal C passível de acoplamento covalente, como a cisteína. Os resíduos de lisina no carreador de hapteno hexamérico são derivatizados com um reticulante heterobifuncional Sulfo-SIAB (sulfosuccinimidil (4-iodoacetil)aminobenzoato) seguido pela adição do peptídeo contendo o resíduo de cisteína do terminal C. As sulfidrilas de cisteína são reduzidas pela adição de tris(2-carboxietil)fosfina à reação. A vantagem distinta de derivatizar lisinas com um grupo reativo sulfidrila (iodoacetila) é que impede a reticulação de hexâmeros entre si (os hexâmeros não contêm resíduos de cisteína).
[0078] Exemplo 2 Construindo Vacinas por Conjugação de Hexâmero-Epítopo
[0079] Existem até 24 sítios de acoplamento em cada carreador hexamérico para a conjugação do hapteno (Figura 1), mas devido ao impedimento estérico, é improvável que a conjugação ocorra em todos os sítios. Foi demonstrado anteriormente que a saturação do carreador com haptenos nem sempre produz a resposta imune mais robusta e há uma compensação entre a densidade de acoplamento, disponibilidade espacial/estérica do epítopo para a apresentação correta do epítopo das células B e titulação de anticorpo. Portanto, para cada epítopo selecionado, três reações de conjugação de hexâmero separadas são realizadas para obter conjugados com diferentes níveis de carregamento de epítopo. Por exemplo, uma reação é realizada com 3 a 5 equivalentes molares de modo que apenas 3 ou 4 peptídeos sejam conjugados, outra reação contém 8 a 10 equivalentes molares para formar um conjugado com 6 a 10 peptídeos e a terceira reação é realizada usando 25 a 50 equivalentes molares para acoplar tantos epítopos quanto possíveis (condições de saturação).
[0080] A Figura 3 ilustra o procedimento de conjugação de peptídeo. Os peptídeos são projetados de forma que o resíduo do terminal N seja acetilado para proteger a amina do terminal N da derivatização com reticulantes. O terminal C adicionou resíduos para modular o pI, se necessário (por exemplo, para regular o ponto isoelétrico), para adicionar um resíduo para quantificação de peptídeo com base em fluorescência (W), e para adicionar um grupo sulfidrila para especificidade de conjugação (C). O pI do carreador hexamérico é 10,1, de modo que a eficiência de acoplamento de peptídeos com um pI alto (por exemplo,> 8,5) provavelmente será reduzida devido à repulsão de carga. Um ou mais resíduos ácidos são adicionados ao terminal C para reduzir o pI de peptídeos básicos até que ele tenha uma carga líquida negativa e seja atraído para o hexâmero. Se o pI do peptídeo for ácido ou neutro, então os resíduos G ou S substituem os resíduos D e atuam apenas como um espaçador.
[0081] Fluorescência de triptofano, cromatografia de filtração em gel, PAGE nativo e SELDI-TOF (um instrumento de MS semelhante a MALDI idealmente equipado para determinar o peso molecular de conjugados de proteína-peptídeo) são métodos que usamos para quantificar a eficiência de acoplamento de epítopo peptídico. É relativamente simples calcular o número de peptídeos conjugados ao carreador hexamérico e ao BSA. Como KLH é muito grande, só pode ser possível confirmar a conjugação bem-sucedida sem calcular o número exato de peptídeos conjugados.
[0082] Caracterização de Construtos de Vacina de HhC
[0083] Adjuvantes: Para potencializar as respostas adaptativas das células B e T, regular a extensão da imunidade protetora e maximizar as respostas de anticorpos específicas do antígeno, são usados adjuvantes para todas as imunizações. Os melhores adjuvantes estimulam diretamente a maturação das células dendríticas e a maneira mais eficaz de orientar isso é por meio da ativação mediada por TLR. Adjuvantes sintéticos baseados em TLR4 são alguns dos mais eficazes, portanto, pelo menos dois deles são testados. Monofosforil Lipídeo A (MPL) é um potente agonista de TLR4 (PERSING et al. 2002; EVANS et al. 2003; SINGH AND SRIVASTAVA 2003; PFAAR et al. 2012; DEL GIUDICE et al. 2018) que funcionará como nosso adjuvante primário. O MPL é emulsificado com esqualeno (Sq) (CIABATTINI et al. 2018; SEYDOUX et al. 2018) para formar MPL-Sq. As emulsões ativam de forma eficiente as células T CD4, que são importantes para induzir tanto a memória quanto as respostas de anticorpos de longa duração. Também testaremos os adjuvantes E6020 e GLA, ambos aprovados para uso em humanos. Todos os adjuvantes ajudarão na captação de antígeno induzida por CD4+ em células dendríticas e induzirão células T CD4+ Th1 específicas de epítopo. Para avaliar a função adjuvante, a troca de classe de isótipo de células T CD4+ e IgG é quantificada em soros de camundongos imunizados. Outro benefício importante dos adjuvantes é a alta probabilidade de poupar a dose do antígeno, que também será testada. A preservação da dose diminuirá a quantidade de antígeno por imunização e aumentará o número de doses que podem ser obtidas de um lote de peptídeo sintético e é um fator determinante na redução dos custos de fabricação de vacinas sintéticas.
[0084] Para cada conjugado de epítopo e hexâmero, pelo menos três conjuntos de experimentos são realizados. Os camundongos recebem uma imunização de reforço primária (IM) e a função das células B e T é medida nos tempos indicados. No primeiro experimento, três níveis de dose de vacina são comparados para determinar em que nível as titulações máximas são obtidas. O hexâmero é carregado ao máximo com epítopos peptídicos e formulado com adjuvante de MPL-Sq antes da imunização. Três níveis de dose em 0,1, 1 e 10 g são testados e otimizados dependendo das titulações de IgG. Este experimento também testa a especificidade do conjugado de hexâmero-epítopo medindo a resposta de IgG ao hexâmero sozinho, ao epítopo peptídico sozinho e ao epítopo de hexâmero + peptídeo (não conjugado, mas combinado).
[0085] Imunizações de camundongos: Os camundongos consanguíneos (10/grp) recebem uma imunização inicial/reforço com o conjugado de epítopo peptídico e hexâmero com adjuvante ou controle (epítopo peptídico-KLH). O primeiro conjunto de estudos fornece a dose ideal do epítopo peptídico hexamérico e mede a titulação do anticorpo contra o carreador hexâmero não conjugado e o peptídeo livre para confirmar a especificidade. Os soros são coletados 14 dias após as imunizações primárias e de reforço (d35) e as titulações de ponto médio de anticorpos são medidas. O sangue de camundongo é usado para a realização de ensaios de células B e T.
[0086] Função da célula B: O ELISA padrão é usado para medir a eficácia da vacina medindo a titulação de anticorpo específico do antígeno no soro de camundongo coletado. As placas de ELISA são revestidas com os conjugados de epítopo peptídico-BSA e 8 diluições sequenciais de 10 vezes (de 1:103 a 1:1010) de soros em tampão de bloqueio são feitas e adicionadas aos poços da placa de ELISA. Um anticorpo secundário anti-camundongo marcado com HRP é adicionado e as placas são desenvolvidas com um substrato colorimétrico e medidas em um leitor de placas de ELISA. Os dados são plotados, ajustados por curva e analisados estatisticamente usando o software Prism Graph Pad para calcular titulações de ponto médio e final.
[0087] Função da célula T: O epítopo de célula T e as funções adjuvantes são medidas por ensaios ELISA de células T bem estabelecidos. O reagente de revestimento disponível comercialmente e os anticorpos primários/secundários são adquiridos e usados de acordo com os protocolos do fabricante. IFN-, IL-2, IL-4 e TNF- são quantificados em soros de camundongos como leituras da função das células T. Esses alvos podem ser facilmente expandidos para incluir outros marcadores da função das células T, incluindo IL-5, IL-8, IL-10, IL-12p70 e IL-13. A troca de classe de isótipo dependente de células T induzida por vacina é testada por ELISA usando reagentes específicos para IgG, IgG1 e IgG2a total
[0088] Segurança da vacina: As avaliações iniciais de segurança são realizadas em um ambiente sem GLP para garantir que os camundongos não tenham reações adversas aos componentes da vacina (peptídeos sintéticos, carreador de hexâmero, adjuvantes). Um estudo de segurança mais preciso e detalhado é realizado posteriormente em um estudo de GLP, mas esta avaliação inicial fornece algumas leituras importantes para orientar a dose da vacina, dose de adjuvante e programação de imunização. As toxicidades locais e sistêmicas potenciais são avaliadas observando-se as reações no local da injeção e os sinais de inflamação, bem como o comportamento do camundongo (por exemplo, sinais de letargia). Se for observada toxicidade, diferentes adjuvantes e/ou epítopos de células T são avaliados.
[0089] Certas modalidades desta invenção são descritas na presente invenção, incluindo o melhor modo conhecido pelos inventores para realizar a invenção. Obviamente, variações nessas modalidades descritas se tornarão evidentes para aqueles versados na técnica ao ler a descrição anterior. O inventor espera que os versados na técnica empreguem tais variações conforme apropriado, e os inventores pretendem que a invenção seja praticada de outra forma que não especificamente descrita na presente invenção. Consequentemente, esta invenção inclui todas as modificações e equivalentes do assunto recitado nas Reivindicações anexas, conforme permitido pela lei aplicável. Além disso, qualquer combinação dos elementos acima descritos em todas as variações possíveis dos mesmos é abrangida pela invenção, a menos que indicado de outra forma na presente invenção ou de outra forma claramente contradito pelo contexto.
[0090] O assunto descrito acima é fornecido apenas a título de ilustração e não deve ser interpretado como limitante. Várias modificações e alterações podem ser feitas ao assunto descrito na presente invenção sem seguir as modalidades e aplicações de exemplo ilustradas e descritas, e sem se afastar do verdadeiro espírito e escopo da presente divulgação, que é estabelecido nas seguintes Reivindicações.
[0091] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados neste Relatório Descritivo são incorporados aqui por referência em sua totalidade, como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência. Embora o anteriormente exposto tenha sido descrito em termos de várias modalidades, o versado na técnica apreciará que várias modificações, substituições, omissões e mudanças podem ser feitas sem se afastar do espírito da mesma.
REFERÊNCIAS Betakova, T., D. Svetlikova and M. Gocnik, 2013 Overview of measles and mumps vaccine: origin, present, and future of vaccine production. Acta Virol 57: 91-96.
Bill, R. M., 2015 Recombinant protein subunit vaccine synthesis in microbes: a role for yeast? J Pharm Pharmacol 67: 319-328.
Buckland, B. C., 2015 The development and manufacture of influenza vaccines. Hum Vaccin Immunother 11: 1357-1360.
Butler, M., and M. Spearman, 2014 The choice of mammalian cell host and possibilities for glycosylation engineering. Curr Opin Biotechnol 30: 107-112.
Chou, M. L., A. Bailey, T. Avory, J. Tanimoto and T. Burnouf, 2015 Removal of transmissible spongiform encephalopathy prion from large volumes of cell culture media supplemented with fetal bovine serum by using hollow fiber anion-exchange membrane chromatography. PLoS One 10: e0122300.
Ciabattini, A., E. Pettini, F. Fiorino, S. Lucchesi, G. Pastore et al., 2018 Heterologous Prime- Boost Combinations Highlight the Crucial Role of Adjuvant in Priming the Immune System. Front Immunol 9: 380.
Clark, T. G., and D. Cassidy-Hanley, 2005 Recombinant subunit vaccines: potentials and constraints. Dev Biol (Basel) 121: 153-163.
Corradin, G., N. Cespedes, A. Verdini, A. V. Kajava, M. Arevalo-Herrera et al., 2012 Malaria vaccine development using synthetic peptides as a technical platform. Adv Immunol 114: 107-149.
Corradin, G., A. V. Kajava and A. Verdini, 2010 Long synthetic peptides for the production of vaccines and drugs: a technological platform coming of age. Sci Transl Med 2: 50rv53.
Del Giudice, G., R. Rappuoli and A. M. Didierlaurent, 2018 Correlates of adjuvanticity: A review on adjuvants in licensed vaccines. Semin Immunol.
Evans, J. T., C. W. Cluff, D. A. Johnson, M. J. Lacy, D. H. Persing et al., 2003 Enhancement of antigen-specific immunity via the TLR4 ligands MPL adjuvant and Ribi.529. Expert Rev Vaccines 2: 219-229.
Fiorucci, S., and M. Zacharias, 2010 Prediction of protein-protein interaction sites using electrostatic desolvation profiles. Biophys J 98: 1921-1930.
Fiorucci, S., and M. Zacharias, 2014 Computational antigenic epitope prediction by calculating electrostatic desolvation penalties of protein surfaces. Methods Mol Biol 1184: 365-374.
Genzel, Y., 2015 Designing cell lines for viral vaccine production: Where do we stand? Biotechnol J 10: 728-740.
Grein, T. A., R. Michalsky and P. Czermak, 2014 Virus separation using membranes. Methods Mol Biol 1104: 459-491.
Haste Andersen, P., M. Nielsen and O. Lund, 2006 Prediction of residues in discontinuous B-cell epitopes using protein 3D structures. Protein Sci 15: 2558-2567.
Hermanson, G. T., 2013a Chapter 2 - Functional Targets for Bioconjugation, pp. 127-228 in Bioconjugate Techniques (Third Edition), edited by G. T. Hermanson. Academic Press, Boston.
Hermanson, G. T., 2013b Chapter 6 - Heterobifunctional Crosslinkers, pp. 299-339 in Bioconjugate Techniques (Third Edition), edited by G. T. Hermanson. Academic Press, Boston.
Hu, Y. C., 2005 Baculovirus as a highly efficient expression vector in insect and mammalian cells. Acta Pharmacol Sin 26: 405-416.
Hu, Y. C., K. Yao and T. Y. Wu, 2008 Baculovirus as an expression and/or delivery vehicle for vaccine antigens. Expert Rev Vaccines 7: 363-371.
Jespersen, M. C., B. Peters, M. Nielsen and P. Marcatili, 2017 BepiPred-
2.0: improving sequence-based B-cell epitope prediction using conformational epitopes. Nucleic Acids Res 45: W24-W29.
Josefsberg, J. O., and B. Buckland, 2012 Vaccine process technology. Biotechnol Bioeng 109: 1443-1460.
Kawakami, K., and R. K. Puri, 2004 Regulatory expectations during product development for tumour vaccines. Dev Biol (Basel) 116: 53-59; discussion 69-76.
Khan, A., S. Datta, S. C. Das, T. Ramamurthy, J. Khanam et al., 2003 Shiga toxin producing Escherichia coli infection: current progress & future challenges. Indian J Med Res 118: 1-24.
Kim, H. J., and H. J. Kim, 2017 Yeast as an expression system for producing virus-like particles: what factors do we need to consider? Lett Appl Microbiol 64: 111-123.
Kost, T. A., and C. W. Kemp, 2016 Fundamentals of Baculovirus Expression and Applications.
Adv Exp Med Biol 896: 187-197.
Legastelois, I., S. Buffin, I. Peubez, C. Mignon, R. Sodoyer et al., 2017 Non-conventional expression systems for the production of vaccine proteins and immunotherapeutic molecules. Hum Vaccin Immunother 13: 947-961.
Miller, K. D., R. Roque and C. H. Clegg, 2014 Novel Anti-Nicotine Vaccine Using a Trimeric Coiled-Coil Hapten Carrier. PLoS One 9: e114366.
Nielsen, J., 2013 Production of biopharmaceutical proteins by yeast: advances through metabolic engineering. Bioengineered 4: 207-211.
Olugbile, S., C. Habel, C. Servis, F. Spertini, A. Verdini et al., 2010 Malaria vaccines - The long synthetic peptide approach: Technical and conceptual advancements. Curr Opin Mol Ther 12: 64-76.
Perez, S. A., E. von Hofe, N. L. Kallinteris, A. D. Gritzapis, G. E. Peoples et al., 2010 A new era in anticancer peptide vaccines. Cancer 116: 2071-2080.
Persing, D. H., R. N. Coler, M. J. Lacy, D. A. Johnson, J. R. Baldridge et al., 2002 Taking toll: lipid A mimetics as adjuvants and immunomodulators. Trends Microbiol 10: S32-37.
Pfaar, O., D. Cazan, L. Klimek, D. Larenas-Linnemann and M. A. Calderon, 2012 Adjuvants for immunotherapy. Curr Opin Allergy Clin Immunol 12: 648-657.
Pietersz, G. A., D. S. Pouniotis and V. Apostolopoulos, 2006 Design of peptide-based vaccines for cancer. Curr Med Chem 13: 1591-1607.
Ponomarenko, J., H. H. Bui, W. Li, N. Fusseder, P. E. Bourne et al., 2008 ElliPro: a new structure-based tool for the prediction of antibody epitopes. BMC Bioinformatics 9: 514.
Roohvand, F., M. Shokri, M. Abdollahpour-Alitappeh and P. Ehsani, 2017 Biomedical applications of yeast- a patent view, part one: yeasts as workhorses for the production of therapeutics and vaccines. Expert Opin Ther Pat 27: 929-951.
Rowland, S. S., R. L. Mayner and L. Barker, 2005 Advancing TB vaccines to Phase I clinical trials in the US: regulatory/manufacturing/licensing issues. Tuberculosis (Edinb) 85: 39- 46.
Safdar, A., and M. M. Cox, 2007 Baculovirus-expressed influenza vaccine. A novel technology for safe and expeditious vaccine production for human use. Expert Opin Investig Drugs 16: 927-934.
Sari, D., K. Gupta, D. B. Thimiri Govinda Raj, A. Aubert, P. Drncova et al., 2016 The MultiBac Baculovirus/Insect Cell Expression Vector System for Producing Complex Protein Biologics. Adv Exp Med Biol 896: 199-215.
Seydoux, E., H. Liang, N. Dubois Cauwelaert, M. Archer, N. D. Rintala et al., 2018 Effective Combination Adjuvants Engage Both TLR and Inflammasome Pathways To Promote Potent Adaptive Immune Responses. J Immunol 201: 98-112.
Singh, M., and I. Srivastava, 2003 Advances in vaccine adjuvants for infectious diseases. Curr HIV Res 1: 309-320.
Smith, L. A., M. J. Jensen, V. A. Montgomery, D. R. Brown, S. A. Ahmed et al., 2004 Roads from vaccines to therapies. Mov Disord 19 Suppl 8: S48-52.
Tapia, F., I. Jordan, Y. Genzel and U. Reichl, 2017 Efficient and stable production of Modified Vaccinia Ankara virus in two-stage semi- continuous and in continuous stirred tank cultivation systems. PLoS One 12: e0182553.
Thomson, A. R., C. W. Wood, A. J. Burton, G. J. Bartlett, R. B. Sessions et al., 2014 Computational design of water-soluble alpha-helical barrels. Science 346: 485-488.
van Oers, M. M., 2006 Vaccines for viral and parasitic diseases produced with baculovirus vectors. Adv Virus Res 68: 193-253.
Vlak, J. M., and R. J. Keus, 1990 Baculovirus expression vector system for production of viral vaccines. Adv Biotechnol Processes 14: 91-128.
Warnock, J. N., and M. Al-Rubeai, 2006 Bioreactor systems for the production of biopharmaceuticals from animal cells. Biotechnol Appl Biochem 45: 1-12.
Wood, C. W., J. W. Heal, A. R. Thomson, G. J. Bartlett, A. A. Ibarra et al., 2017 ISAMBARD: an open-source computational environment for biomolecular analysis, modelling and design. Bioinformatics 33: 3043-
3050.
Wood, C. W., and D. N. Woolfson, 2018 CCBuilder 2.0: Powerful and accessible coiled-coil modeling. Protein Sci 27: 103-111.
Wu, Y., and J. H. Collier, 2017 alpha-Helical coiled-coil peptide materials for biomedical applications. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol 9.
Yamada, A., T. Sasada, M. Noguchi and K. Itoh, 2013 Next-generation peptide vaccines for advanced cancer. Cancer Sci 104: 15-21.
Zaccai, N. R., B. Chi, A. R. Thomson, A. L. Boyle, G. J. Bartlett et al., 2011 A de novo peptide hexamer with a mutable channel. Nat Chem Biol 7: 935-941.
Geysen et al., J. Immun. Meth. 102:259-274 (1987) Miranda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1181-86 (1999) Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)) Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1988) BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md.)

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Peptídeo, compreendendo um ou mais heptads, caracterizado por que o heptad tem a seguinte sequência de aminoácidos: hwxhxyz (SEQ ID NO: 19); em que o peptídeo compreende o seguinte padrão de sequência de aminoácidos: (hwxhxyz)n (SEQ ID NO: 20), e em que h é um resíduo hidrofóbico ou apolar; w é um resíduo alifático carregado positivamente, carregado negativamente, polar que deixa de ser carregado ou apolar; x é um resíduo alifático apolar, carregado negativamente, carregado positivamente, ou polar que deixa de ser carregado; y é um resíduo para acoplamento de epítopo; z é um resíduo alifático carregado negativamente, carregado positivamente, polar que deixa de ser carregado ou apolar; e n é um número inteiro maior que 1.
    2. Peptídeo, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que: h é I, L, V, F, W, Y, M, W, G ou A; w é G, R, A, N, Q, H, S, D, E, K ou T; x é R, S, N, Q, A, G, T, D, E, K, H ou C;
    y é K, H, C, D, E, R, W, Y, Q, N ou um aminoácido artificial ou molécula contendo grupos reativos passíveis de acoplamento covalente; z é A, D, H, S, E, R, N, Q, K ou G; e n é 2 a 10.
    3. Peptídeo, de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, caracterizado por que o heptad é SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12.
    4. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 3, caracterizado por que o peptídeo compreende a SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:
    18.
    5. Peptídeo, de acordo com a Reivindicação 4, caracterizado por que o peptídeo compreende ainda os resíduos M e D no terminal N.
    6. Oligômero, compreendendo o peptídeo, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 5, caracterizado por que o oligômero é um dímero, trímero, tetrâmero, pentâmero, hexâmero, heptâmero, octâmero, nanômero ou decâmero.
    7. Oligômero, de acordo com a Reivindicação 6, caracterizado por que o oligômero é um hexâmero.
    8. Conjugado de Peptídeo, caracterizado por que compreende o oligômero, conforme definido na Reivindicação 6 ou 7, e um ou mais haptenos ou um ou mais agentes.
    9. Conjugado de Peptídeo, de acordo com a Reivindicação 8, caracterizado por que o hapteno é conjugado ao oligômero através do resíduo y.
    10. Conjugado de Peptídeo, de acordo com a Reivindicação 8 ou 9, caracterizado por que o hapteno compreende um peptídeo, lipídeo, lipopeptídeo, ácido nucleico ou carboidrato.
    11. Conjugado de Peptídeo, de acordo com a Reivindicação 10, caracterizado por que o peptídeo é um epítopo de células T ou um epítopo de células B.
    12. Conjugado de Peptídeo, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 8 a 11, caracterizado por que o oligômero compreende ainda um ou mais epítopos de células T em um ou mais terminais N ou C das hélices do oligômero.
    13. Conjugado de Peptídeo, de acordo com a Reivindicação 12, caracterizado por que o oligômero compreende um epítopo de células T em cada um dos terminais N e C das hélices do oligômero.
    14. Conjugado de Peptídeo, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 8 a 13, caracterizado por que o hapteno é um epítopo de células B.
    15. Conjugado de Peptídeo, de acordo com a Reivindicação 8 ou 9, caracterizado por que o agente é uma molécula a ser fornecida in vivo.
    16. Conjugado de Peptídeo, de acordo com a Reivindicação 15, caracterizado por que o agente é um ácido nucleico, um peptídeo, um agente terapêutico ou um epítopo de células T.
    17. Composição, caracterizada por que compreende o peptídeo, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 5, ou o oligômero, conforme definido na Reivindicação 6 ou 7, ou o conjugado de peptídeo, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de
    8 a 16, e um excipiente.
    18. Composição, de acordo com a Reivindicação 17, caracterizada por que a composição é uma composição farmacêutica e o excipiente é um excipiente farmaceuticamente aceitável.
    19. Método Para Proteger Indivíduo de Doença, caracterizado por que o método compreende a administração ao indivíduo com necessidade do mesmo, de uma quantidade eficaz do conjugado de peptídeo, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 8 a 14, ou da composição, conforme definida na Reivindicação 18, em que o hapteno induz uma resposta para proteger um indivíduo da doença.
    20. Método de Tratamento de Indivíduo com Doença, caracterizado por que o método compreende a administração ao indivíduo com necessidade do mesmo, de uma quantidade eficaz do conjugado de peptídeo, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 8 a 14, ou da composição, conforme definida na Reivindicação 18, em que o hapteno induz uma resposta para tratar o indivíduo.
    21. Método Para Proteger Indivíduo de Doença ou Tratar Indivíduo com Doença, caracterizado por que o método compreende a administração ao indivíduo com necessidade do mesmo, de uma quantidade eficaz do conjugado de peptídeo, conforme definido na Reivindicação 15 ou 16, ou da composição, conforme definida na Reivindicação 18.
    22. Método, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 19 a 21, caracterizado por que o indivíduo é um mamífero.
    23. Método de Preparação de Vacina, sendo o método caracterizado por que compreende: obter um peptídeo, conforme definido em qualquer uma das
    Reivindicações de 1 a 5, permitindo que o peptídeo se automonte em um oligômero e conjugar um hapteno ao oligômero; ou obter um oligômero, conforme definido na Reivindicação 6 ou 7, e conjugar um hapteno ao oligômero.
    24. Método Para Potencializar Imunogenicidade de Hapteno, caracterizado por que compreende, obter um peptídeo, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 5, permitindo que o peptídeo se automonte em um oligômero e conjugar um hapteno ao oligômero; ou obter um oligômero, conforme definido na Reivindicação 6 ou 7, e conjugar um hapteno ao oligômero.
    25. Método de Preparação de Veículo de Liberação, para fornecer um agente a um sítio alvo, sendo o método caracterizado por que compreende obter um peptídeo, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 5, permitindo que o peptídeo se automonte em um oligômero e conjugue o agente com o oligômero; ou obter um oligômero, conforme definido na Reivindicação 6 ou 7, e conjugar o agente ao oligômero.
    26. Método de Preparação de Veículo de Liberação, de acordo com a Reivindicação 25, caracterizado por que o veículo de liberação compreende ainda um ou mais agentes que direcionam o veículo de liberação para um sítio específico.
    27. Método de Preparação de Veículo de Liberação, de acordo com a Reivindicação 26, caracterizado por que o sítio específico é um sítio intracelular ou extracelular.
    28. Método de Preparação de Veículo de Liberação, de acordo com a
    Reivindicação 25, caracterizado por que um ou mais agentes compreendem um peptídeo que tem como alvo o veículo de liberação a uma organela.
    29. Uso de Conjugado de Peptídeo, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 8 a 14, ou de Composição, conforme definida na Reivindicação 18, caracterizado por ser no fabrico de medicamentos para proteger indivíduo de doença.
    30. Uso de Conjugado de Peptídeo, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 8 a 14, ou de Composição, conforme definida na Reivindicação 18, caracterizado por ser no fabrico de medicamentos para tratamento de indivíduo com doença.
    31. Uso de Conjugado de Peptídeo, conforme definido na Reivindicação 15 ou 16, ou de Composição, conforme definida na Reivindicação 18, caracterizado por ser no fabrico de medicamentos para proteger indivíduo de doença ou tratar indivíduo com doença.
    32. Uso de Conjugado de Peptídeo ou de Composição, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 29 a 31, caracterizado por que o indivíduo é um mamífero.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2021050722A1 (en) * 2019-09-12 2021-03-18 Hexamer Therapeutics, Inc. An immunotherapeutic for prostate cancer treatment
US20230346920A1 (en) * 2020-05-04 2023-11-02 Hexamer Therapeutics, Inc. Vaccines against viral pathogens

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1237930B1 (en) * 1999-12-08 2006-11-08 Intellect Neurosciences, Inc. Chimeric amyloid beta peptides
DK1987178T3 (en) * 2006-02-20 2015-04-20 Phylogica Ltd Process for the construction and screening of peptide structure libraries
ATE538129T1 (de) * 2007-09-07 2012-01-15 Complix N V Nicht natürliches proteinöses gerüst aus drei nicht kovalent assoziierten peptiden
EP2537937A3 (en) * 2008-04-29 2013-04-10 Monsanto Technology LLC Genes and uses for plant enhancement
WO2013009971A1 (en) * 2011-07-12 2013-01-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Detection and screening method and materials useful in performance thereof
EP2771349B1 (en) * 2011-09-16 2020-02-26 Iogenetics, LLC. Bioinformatic processes for determination of peptide binding
WO2014126828A1 (en) * 2013-02-15 2014-08-21 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel ph-switchable peptides for membrane insertion and pore formation
WO2015035475A1 (en) * 2013-09-16 2015-03-19 The University Of Queensland Silica micro- and nano-capsules and methods for making them
EP3134104B1 (en) * 2014-04-25 2018-12-26 Tria Bioscience Corp. Synthetic hapten carrier compositions and methods
JP2019528689A (ja) * 2016-08-11 2019-10-17 ザ カウンシル オブ ザ クイーンズランド インスティテュート オブ メディカル リサーチ 免疫調節化合物

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