BR112021000443A2 - Sensor e método para quantificação de um hormônio da tireoide, métodos para diagnosticar e para monitorar um distúrbio relacionado com a tireoide e para fabricar um sensor, uso do sensor, e, dispositivo portátil para quantificação e/ou monitoramento de um hormônio da tireoide - Google Patents
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Abstract
sensor e método para quantificação de um hormônio da tireoide, métodos para diagnosticar e para monitorar um distúrbio relacionado com a tireoide e para fabricar um sensor, uso do sensor, e, dispositivo portátil para quantificação e/ou monitoramento de um hormônio da tireoide. a presente invenção se refere a um biossensor e às aplicações do mesmo para quantificação de hormônios da tireoide livres para avaliar a função da tireoide. os métodos e ferramentas para diagnóstico de doenças relacionadas com a tireoide também são aqui descritas.
Description
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UM HORMÔNIO DA TIREOIDE Campo Técnico
[001] A presente invenção se refere a um biossensor e aplicações do mesmo para quantificação de hormônios da tireoide livres para avaliar a função da tireoide. Fundamentos
[002] A tireoide é uma glândula não ductal bilobada situada na frente do pescoço atrás do pomo de Adão. A mesma está envolvida na síntese e secreção dos hormônios da tireoide contendo iodo – triiodotironina (T3) e tiroxina (T4), que afetam a taxa metabólica geral e a síntese de proteínas. A secreção dos hormônios da tireoide é governada pelo eixo hipotalâmico– pituitário–tireoide (eixo HPT), em que o hipotálamo e glândulas pituitárias estimulam a tireoide liberando-se o hormônio de liberação de tirotropina (TRH) e hormônio de estimulação da tireoide (TSH).
[003] T3, também conhecido como triiodotironina ou [o-(4-Hidróxi- 3,5-iodofenil)3,5-diiodofenil tirosina] tem um efeito no aumento da taxa metabólica basal, metabolização de proteína, lipólise, débito cardíaco e desenvolvimento fetal e infantil; enquanto T4, também conhecido como tiroxina ou [o-(4-Hidróxi-3,5-diiodofenil)3,5-diiodofenil tirosina] é o pró- hormônio que migra ao fígado e rins e serve como o substrato para a síntese específica ao local de T3.
[004] Os hormônios da tireoide agem em quase todas as células no corpo. Estes agem para aumentar a taxa metabólica basal, afetam a síntese de proteínas, ajudam a regular o crescimento de osso longo (sinergia com
2 / 63 hormônio de crescimento) e maturação neural e aumentam a sensibilidade do corpo para catecolaminas (tais como adrenalina) por permissividade. Os hormônios da tireoide são essenciais para o desenvolvimento apropriado e diferenciamento de todas as células do corpo humano. Estes hormônios também regulam o metabolismo das proteínas, gordura e carboidratos, afetando como as células humanas usam compostos energéticos. Estes também estimulam o metabolismo das vitaminas. Vários estímulos fisiológicos e patológicos influenciam a síntese do hormônio da tireoide.
[005] Tanto o excesso quanto a deficiência da tiroxina podem causar distúrbios.
[006] • Hipertireoidismo, que é frequentemente causado pela Doença de Graves, uma síndrome clínica distinguida por um excesso de tiroxina livre circulante (fT4), triiodotironina livre (fT3) ou ambas e TSH reduzido. Este é um distúrbio comum que afeta aproximadamente 2% das mulheres e 0,2% dos homens. A tirotoxicose é frequentemente usada de maneira permutável com o hipertireoidismo, mas existem diferenças sutis. Embora a tirotoxicose também se refira a um aumento nos hormônios circulantes da tireoide, esta pode ser causada pela ingestão de tabletes de tiroxina ou por uma tireoide hiperativa, considerando que o hipertireoidismo se refere somente a uma tireoide hiperativa.
[007] • Hipotireoidismo, que é frequentemente causado pela tireoidite de Hashimoto, é o caso onde há uma deficiência da tiroxina, triiodotironina ou ambos.
[008] • Depressão clínica pode às vezes ser causada por hipotireoidismo. T3 é encontrado nas sinapses das junções e regula as quantidades e a atividade da serotonina, norepinefrina e ácido γ-aminobutírico (GABA) no cérebro (Dratman M, Gordon J (1996). “Thyroid Hormones as neurotransmitters”. Thyroid. 6 (6): 639–47).
[009] • Perda de cabelo pode às vezes ser atribuída a uma má-função
3 / 63 de T3 e T4. O ciclo de crescimento capilar normal pode ser afetado rompendo o crescimento capilar.
[0010] • Nascimentos prematuros podem sofrer de distúrbios de neurodesenvolvimento devido à falta de hormônios da tireoide materna, em um momento quando sua própria tireoide é incapaz de satisfazer suas necessidades pós-natais. Além disso, em uma gravidez normal, os níveis adequados de hormônio da tireoide materna são vitais de modo a garantir a disponibilidade do hormônio da tireoide para o feto e seu cérebro em desenvolvimento. O hipotireoidismo congênito ocorre a cada 1 em 1600 a 3400 recém-nascidos com a maioria nascendo assintomático e desenvolvendo sintomas relacionados semanas após o nascimento.
[0011] Portanto, ser capaz de quantificar a quantidade de T3 e T4 em seres humanos é importante no diagnóstico dos distúrbios da tireoide. O diagnóstico convencional da disfunção da tireoide é realizado através de imunoensaios contra os hormônios da tireoide e TSH. Os presentes testes fT3 e fT4 tentam medir competitivamente os hormônios livres ou medir depois da separação física dos hormônios ligados ou através da estimativa indireta sendo frequentemente imprecisos. Desse modo, há ímpeto para encontrar novas e alternativas maneiras de quantificar os hormônios da tireoide livres.
[0012] Um biossensor é um sensor que utiliza a função de identificação de molécula de um material biológico, por exemplo, um microrganismo, enzima, anticorpo, DNA e RNA e aplica tal material biológico como um elemento que identifica molécula. Em outras palavras, o biossensor utiliza a reação que ocorre quando um material biológico imobilizado identifica um substrato alvo, oxigênio consumido pela respiração do microrganismo, reação enzimática, luminescência e outros. Entre os biossensores, o uso prático dos sensores enzimáticos está em desenvolvimento. Por exemplo, os sensores enzimáticos para glicose, ácido lático, ácido úrico e aminoácidos encontram aplicações na instrumentação
4 / 63 médica e indústria de processamento alimentício.
[0013] Em um sensor enzimático, por exemplo, os elétrons gerados pela reação de um substrato contido em um líquido de amostra, isto é, um analito, com uma enzima ou outros, reduzem um aceitador de elétrons e um dispositivo de medição mede eletroquimicamente a quantidade do aceitador de elétrons reduzida. Desse modo, a análise quantitativa do analito é realizada. Um exemplo de tal biossensor é um sensor proposto no Pedido de Patente No. PCT/JP00/08012.
[0014] Diferentes técnicas podem ser usadas para seguir a reação entre, por exemplo, uma enzima ligada a um eletrodo e o substrato alvo. Uma de tais técnicas depende da Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR). Na SPR, um parceiro molecular tal como uma proteína é imobilizada em um metal (o chip). A luz excita os plasmons de superfície no metal; quando o parceiro de ligação liga à molécula imobilizada, isto causa uma mudança detectável no sinal da superfície plasmônica. Uma outra de tais técnicas depende da transdução eletroquímica na qual o conteúdo de uma amostra biológica pode ser analisado devido à conversão direta de um evento biológico para um sinal eletrônico. As técnicas mais comuns no biossensoriamento eletroquímico compreendem voltametria cíclica, cronoamperometria, cronopotenciometria, espectroscopia de impedância e transistor de efeito de campo com base nos métodos junto com biossensoriamento com base em nanofios nanopartícula magnética. Sumário
[0015] Os presentes inventores verificaram que as enzimas envolvidas na conversão dos hormônios da tireoide podem ser utilizadas em um método para quantificação direta de T3 livre e T4 livre, através da imobilização em um eletrodo. Estas verificações permitem uma quantificação mais precisa e específica dos hormônios da tireoide considerando que os métodos anteriores quantificam T3 livre e T4 livre por etapas múltiplas, medições indiretas ou
5 / 63 meras estimativas. Neste ponto, a presente descrição provê um sistema de diagnóstico melhorado para doenças relacionadas com tireoide.
[0016] Os presentes inventores verificaram que a presença de pelo menos 2 iodotironina deiodinases selecionadas de EC 1.21.99.3 e/ou EC
1.21.99.4 no sensor, tal como em superfícies separadas do substrato, é necessária para quantificar fT3 e/ou fT4. De fato, um hormônio não pode ser quantificado sem quantificar o outro hormônio, porque as reações enzimáticas usadas para quantificação têm certa sobreposição, como pode ser visto na Fig.
2. Além disso, um terceiro hormônio da tireoide, triiodotironina reversa (rT3) desempenha um papel importante na quantificação, porque a deiodinação da rT3 também é catalisada pelas iodotironina deiodinases EC 1.21.99.4. Consequentemente, rT3 pode ser vantajosamente removido ou quantificado separadamente antes da quantificação de fT3 e fT4 com o sensor da presente invenção. Alternativamente, o sensor da presente invenção em algumas modalidades também compreende anticorpos anti-rT3 que, juntos com as pelo menos 2 iodotiroidina deiodenases selecionadas de EC 1.21.99.3 e/ou EC
1.21.99.4, permitem a quantificação específica de rT3, fT3 e fT4 em uma etapa única.
[0017] É um aspecto da presente descrição prover um sensor para quantificação de um hormônio da tireoide, o sensor compreendendo a. um substrato, b. pelo menos 2 iodotiroidina deiodenases selecionadas de EC
1.21.99.3 e/ou EC 1.21.99.4, e em que as pelo menos 2 iodotironina deiodinases são imobilizadas na superfície do substrato.
[0018] É um aspecto da presente descrição prover um sensor para quantificação de um hormônio da tireoide, o sensor compreendendo a. um substrato, b. pelo menos 2 iodotiroidina deiodenases selecionadas de EC
6 / 63
1.21.99.3 e/ou EC 1.21.99.4, e c. um anticorpo anti-rT3, em que as pelo menos 2 iodotiroidina deiodenases e o anticorpo anti-rT3 são imobilizados na superfície do substrato.
[0019] É um aspecto da presente descrição prover um sensor para quantificação de um hormônio da tireoide, o sensor compreendendo uma iodotironina deiodinase [EC 1.21.99.3 e/ou EC 1.21.99.4] ou um fragmento do mesmo, em que a iodotironina deiodinase é imobilizada no sensor.
[0020] Um outro aspecto da presente descrição é para prover um sensor para a detecção de um hormônio da tireoide, o sensor compreendendo uma iodotironina deiodinase [EC 1.21.99.3 e/ou EC 1.21.99.4] ou um fragmento da mesma, em que a iodotironina deiodinase é imobilizada no sensor.
[0021] Um outro aspecto da presente descrição é para prover um método para quantificação de um hormônio da tireoide em uma amostra, o método compreendendo as etapas de: a. prover uma amostra compreendendo ou suspeita de compreender um hormônio da tireoide, b. contatar o sensor da presente descrição, c. medir um sinal do sensor, e d. usar o sinal para determinar um nível e/ou concentração do um ou mais hormônios da tireoide na amostra detectando desse modo o hormônio da tireoide.
[0022] Um outro aspecto da presente descrição é para prover um método para diagnosticar um distúrbio relacionado com a tireoide em um sujeito compreendendo as etapas de: a. prover uma amostra obtida do sujeito, b. determinar um nível e/ou concentração do dito hormônio da tireoide na amostra usando o método da presente descrição,
7 / 63 desse modo diagnosticando um ou mais distúrbios relacionados com a tireoide.
[0023] Um outro aspecto da presente descrição é para prover um método para diagnosticar um distúrbio relacionado com a tireoide em um sujeito compreendendo as etapas de: a. prover uma amostra obtida do sujeito, b. contatar o sensor como definido na presente descrição com a dita amostra, c. detectar o um ou mais hormônios da tireoide na amostra, d. determinar um nível e/ou concentração do dito hormônio da tireoide na amostra, desse modo diagnosticando um ou mais distúrbios relacionados com a tireoide.
[0024] Um outro aspecto da presente descrição é para prover um método para monitorar um distúrbio relacionado com a tireoide em um sujeito compreendendo as etapas de: a. administrar um composto que estimula a tireoide ao sujeito, b. coletar uma amostra do sujeito depois de conduzir a etapa a., c. determinar o nível e/ou concentração do dito hormônio da tireoide na amostra usando o método aqui descrito, monitorando desse modo o distúrbio relacionado com a tireoide.
[0025] Um outro aspecto da presente descrição é para prover um método para monitorar um distúrbio relacionado com a tireoide em um sujeito compreendendo as etapas de: a. administrar um composto que estimula a tireoide ao sujeito, b. coletar uma amostra do sujeito depois de conduzir a etapa a),
8 / 63 c. contatar o sensor como definido na presente descrição com a dita amostra, d. medir um sinal, e. usando o sinal para determinar a concentração de um hormônio da tireoide na amostra, monitorando desse modo o distúrbio relacionado com a tireoide.
[0026] Ainda um outro aspecto da presente descrição é para prover um use do sensor da presente descrição para quantificação de hormônios da tireoide.
[0027] Também é um aspecto da presente descrição prover um método para a detecção de um hormônio da tireoide em uma amostra, o método compreendendo as etapas de: a. prover uma amostra compreendendo ou suspeita de compreender um hormônio da tireoide, b. contatar o sensor como definido na presente descrição com a dita amostra, c. medir um sinal do sensor, detectando desse modo o hormônio da tireoide.
[0028] É um outro aspecto da presente descrição prover um método para fabricar um sensor compreendendo pelo menos 2 iodotironina deiodinases selecionadas de EC 1.21.99.3 e/ou EC 1.21.99.4, o método compreendendo: a. prover um substrato, b. prover as pelo menos 2 iodotironina deiodinase selecionadas de EC 1.21.99.3 e/ou EC 1.21.99.4 e opcionalmente um anticorpo anti-rT3, c. imobilizar as iodotironina deiodinases e o anticorpo anti-rT3 na superfície do substrato, fabricando desse modo um sensor compreendendo pelo menos
9 / 63 2 iodotironina deiodinases selecionadas de EC 1.21.99.3 e/ou EC 1.21.99.3.
[0029] É um outro aspecto da presente descrição prover um método para fabricar um sensor compreendendo uma iodotironina deiodinase, o método compreendendo: a. prover um eletrodo, b. prover a pelo menos uma iodotironina deiodinase, c. imobilizar a iodotironina deiodinase no eletrodo, fabricando desse modo um sensor compreendendo a iodotironina deiodinase.
[0030] Um outro aspecto da presente descrição é para prover um dispositivo portátil para quantificação e/ou monitoramento de um hormônio da tireoide, o dispositivo compreendendo: a. uma entrada para uma amostra; b. um sensor compreendendo: i. um substrato, ii. uma primeira iodotironina deiodinase selecionada de EC
1.21.99.3 e EC 1.21.99.4, iii. uma segunda iodotironina deiodinase selecionada de EC
1.21.99.4, e iv. opcionalmente um anticorpo anti-rT3, c. um detector configurado para receber um sinal do sensor e transformar este em um formato legível por um usuário; d. opcionalmente, meios para separar componentes celulares da amostra.
[0031] Um outro aspecto da presente descrição é para prover um dispositivo portátil para a detecção, quantificação e/ou monitoramento de um hormônio da tireoide, o dispositivo compreendendo: a. uma entrada para uma amostra; b. um sensor compreendendo uma iodotironina deiodinase [EC
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1.21.99.3 e/ou EC 1.21.99.4] ou um fragmento da mesma, em que a iodotironina deiodinase é imobilizada no sensor e em que a entrada é configurada para colocar a amostra em contato com o sensor; c. um detector configurado para receber um sinal do sensor e transformar este em um formato legível por um usuário; d. opcionalmente, meios para separar componentes celulares da amostra. Descrição das Figuras
[0032] Figura 1. O eixo hipotalâmico–pituitário–tireoide.
[0033] Figura 2. Catálise dos hormônios da tireoide pelas três isoformas das iodotironina deiodinases.
[0034] Figura 3. Presente resposta do Biossensor amperométrico IDII com concentrações crescentes de T4.
[0035] Figura 4. Presente resposta do Biossensor voltamétrico IDII com concentrações crescentes de T4.
[0036] Figura 5. Efeito da concentração da globulina que liga à tiroxina (TBG) na detecção de T4. A concentração de T4 é constante.
[0037] Figura 6. Medições voltamétricas cíclicas em soro fetal de bezerro com concentrações de T4 crescentes. Descrição Detalhada
[0038] É aqui descrito um biossensor e aplicações do mesmo para quantificação de hormônios da tireoide livres fT3 e fT4 para avaliar a função da tireoide. Além disso, a presente descrição se refere aos métodos para diagnóstico ou monitoramento de distúrbios relacionados com a tireoide em um sujeito compreendendo determinar a concentração de um hormônio da tireoide em uma amostra obtida a partir do dito sujeito. Hormônios da tireoide
[0039] A presente descrição se refere a um dispositivo e aos métodos para a detecção e/ou quantificação de hormônios da tireoide livres fT3 e fT4 e
11 / 63 consequentemente para a avaliação da função da tireoide.
[0040] Os hormônios da tireoide são hormônios produzidos e liberados pela glândula tireoide. Estes são hormônios com base em tirosina que são principalmente responsáveis pela regulação do metabolismo.
[0041] Os hormônios da tireoide tiroxina (T4) e triiodotironina (T3) podem ser medidos como tiroxina livre (fT4) e triiodotironina livre (fT3), que são indicadores das atividades de tiroxina e triiodotironina no corpo. Estes também podem ser medidos como a tiroxina total e triiodotironina total, que dependerá da quantidade de tiroxina e triiodotironina que é ligada à globulina que liga à tiroxina. Um parâmetro relacionado é o índice de tiroxina livre, que é a tiroxina total multiplicada pela absorção do hormônio da tireoide, que, por sua vez, é uma medida das globulinas de ligação à tiroxina não ligadas. Adicionalmente, os distúrbios da tireoide podem ser detectados no pré-natal usando técnicas de imagiologia avançadas e níveis de hormônio fetal de teste.
[0042] A triiodotironina reversa (3,3’,5’-triiodotironina, T3 reversa ou rT3) é um isômero da triiodotironina (3,5,3’ triiodotironina, T3).
[0043] A T3 reversa é a terceira iodotironina mais comum que a glândula tireoide libera na corrente sanguínea, da qual 0,9 % é rT3; tetraiodotironina (levotiroxina, T4) constitui 90 % e T3 é 9 %. Não obstante, 95 % de rT3 no sangue humano é feito em outro lugar do corpo. A produção do hormônio pela glândula tireoide é controlada pelo hipotálamo e glândula pituitária. A atividade fisiológica dos hormônios da tireoide é regulada através de um sistema de enzimas que ativam, inativam ou simplesmente descartam o pró-hormônio T4 e, por sua vez, modificam funcionalmente a T3 e rT3. Estas enzimas operam sob a direção complexa dos sistemas incluindo neurotransmissores, hormônios, marcadores do metabolismo e sinais imunológicos. Os níveis de rT3 aumentam em condições tais como síndrome da doença eutireoidiana porque sua depuração diminui enquanto sua produção continua a mesma.
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[0044] Em indivíduos adultos saudáveis, também indicados como sujeitos saudáveis, os intervalos de referência para os hormônios da tireoide são: • fT3: 2,8 a 4,4 pg/ml (>= 1 ano, obtido da Mayo Clinic), • fT4: 0,8 a 2,0 ng/dl (todas as idades, obtido da Mayo Clinic), • rT3: 10-24 ng/dl (obtido da Mayo Clinic), como encontrado nas seguintes referências: Demers LM, Spencer Cl: A thyroid: pathophysiology and function of thyroid testing. In Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics. Quarta edição. Editado por CA Burtis, ER Ashwood, DE Bruns. St. Louis, Elsevier Saunders Company. 2006, pp 2053-2087; Stockigt JR: Free thyroid hormone measurement. A critical appraisal. Clin Endocrinol Metab 2001 30 de junho:265-289; e Moore WT, Eastman RC: Diagnostic Endocrinology. St. Louis, Mosby, 1990, pp 182-183.
[0045] Diferentes intervalos de referência podem ser usados para bebês e crianças. Além disso, diferentes laboratórios podem ajustar os intervalos de referência de ± 0,4 unidades.
[0046] Consequentemente, uma concentração e/ou nível do hormônio da tireoide dentro dos intervalos acima é percebido como normal, considerando que uma concentração e/ou nível abaixo dos intervalos é considerado baixo e uma concentração e/ou nível acima é considerado alto. Iodotironina deiodinases
[0047] A presente descrição se refere a um sensor para quantificação de um hormônio da tireoide, o sensor compreendendo um substrato, pelo menos 2 iodotiroidina deiodenases selecionadas de EC 1.21.99.3 e/ou EC
1.21.99.4 e opcionalmente um anticorpo anti-rT3, em que as pelo menos 2 iodotiroidina deiodenases e o anticorpo anti-rT3 são imobilizados na superfície do substrato.
[0048] A presente descrição se refere a um sensor compreendendo
13 / 63 uma iodotironina deiodinase [EC 1.21.99.3 e/ou EC 1.21.99.4] ou um fragmento da mesma, em que a iodotironina deiodinase é imobilizada no sensor, para a detecção e/ou quantificação de hormônios da tireoide.
[0049] As iodotironina deiodinases (EC 1.21.99.4 e EC 1.21.99.3) são uma subfamília das enzimas de deiodinase importantes na ativação e desativação dos hormônios da tireoide. A Tiroxina (T4), o precursor de 3,5,3’-triiodotironina (T3) é transformado em T3 pela atividade de deiodinase. T3, através da ligação de um hormônio nuclear do receptor da tireoide, influencia a expressão dos genes em praticamente toda célula de vertebrados. As iodotironina deiodinases são não usuais em que estas enzimas contém selênio, na forma de uma selenocisteína de aminoácido de outro modo rara.
[0050] As iodotironina deiodinases EC 1.21.99.4 como aqui indicado são as enzimas capazes de catalisar a seguinte reação: 3,5,3’-triiodo-L-tironina + iodeto + A + H(+) <=> L-tiroxina + AH(2)
[0051] As iodotironina deiodinases EC 1.21.99.4 demonstraram atividade enzimática somente na direção da 5’-deiodinação, que torna o hormônio da tireoide mais ativo.
[0052] As iodotironina deiodinases EC 1.21.99.4 compreendem as enzimas do tipo I e tipo II, ambas contendo selenocisteína, mas com diferentes cinéticas. Para a enzima do tipo I, a primeira reação é uma deiodinação redutiva convertendo o grupo -Se-H da enzima em um grupo -Se- I; o redutor então reconverte este em -Se-H, liberando iodeto. As seguintes enzimas são compreendidas no grupo EC 1.21.99.4: Diiodotironina 5’-deiodinase; Iodotironina 5’-deiodinase; Iodotironina monodeiodinase no anel interno L-tiroxina iodohidroxilase (reduzindo); Tiroxina 5-deiodinase; Iodotironina deiodinase Tipo I;
14 / 63 Iodotironina deiodinase Tipo II.
[0053] As iodotironina deiodinases EC 1.21.99.3 como aqui indicadas são enzimas capazes de catalisar a seguinte reação: 3,3’,5’-triiodo-L-tironina + iodeto + aceitador + H(+) <=> L-tiroxina + aceitador reduzido
[0054] As iodotironina deiodinases EC 1.21.99.3 demonstraram atividade enzimática na direção da 5-deiodinação. Esta remoção do 5-iodo, isto é, do anel interno, em grande parte inativa o hormônio tiroxina. As seguintes enzimas são compreendidas no grupo EC 1.21.99.4: Diiodotironina 5’-deiodinase; Iodotironina 5-deiodinase; Iodotironina monodeiodinase no anel interno; Iodotironina deiodinase Tipo III.
[0055] A deiodinase Tipo I, também indicada como deiodinase tipo I (DI ou D1) é comumente encontrada no fígado e rins e pode deiodinar tanto o anel interno quanto externo dos hormônios da tireoide. Os termos “anel interno” e “anel externo” são visualizados na figura 2 e se referem aos diferentes anéis de benzeno presentes nos hormônios da tireoide. A deiodinase Tipo II, também indicada como deiodinase tipo II (DII ou D2) é comumente encontrada no coração, músculo esqueletal, sistema nervoso central, gordura, tireoide e pituitário. Esta é conhecida deiodinar apenas o anel externo do pró-hormônio tiroxina e é a enzima de ativação principal (a triiodotironina reversa já inativa também é degradada novamente por DII)
[0056] A deiodinase Tipo III, também indicada como deiodinase tipo III (DIII ou D3) é comumente encontrada no tecido fetal e na placenta; também presente por todo o cérebro, exceto na glândula pituitária. Esta é conhecida deiodinar somente o anel interno da tiroxina ou triiodotironina.
[0057] Nos tecidos, as deiodinases podem ativar ou inativar os hormônios da tireoide. A ativação ocorre através da conversão do pró-
15 / 63 hormônio tiroxina (T4) para o hormônio triiodotironina ativo (T3) através da remoção de um átomo de iodo no anel externo.
[0058] A inativação dos hormônios da tireoide ocorre através da remoção de um átomo de iodo no anel interno, que converte a tiroxina para a triiodotironina reversa inativa (rT3) ou que converte a triiodotironina ativa para diiodotironina (T2).
[0059] A maior parte da deiodinação da tiroxina ocorre dentro das células.
[0060] A atividade de DII pode ser regulada através da ubiquitinação: a ligação covalente da ubiquitina inativa a DII rompendo-se a dimerização e alveja a mesma para a degradação na proteossoma. A desubiquitinação que remove a ubiquitina da DII restaura sua atividade e previne a degradação proteossômica.
[0061] A DI tanto ativa a T4 para produzir T3 quanto inativa a T4. Além de sua função aumentada na produção de extra tireoide T3 em pacientes com hipertireoidismo, sua função é menos bem entendida do que a DII ou DIII. A DII converte T4 em T3 e é uma fonte principal do agrupamento de T3 citoplásmico. A DIII previne a ativação de T4 e inativa T3. https://en.wikipedia.org/wiki/Iodotironina_deiodinase - cite_note- url_Bianco_Lab-9 DII e D3 são importantes na regulação homeostática na manutenção dos níveis de T3 no plasma e níveis celulares. No hipertireoidismo, a D2 é subregulada e a D3 é suprarregulada para limpar o T3 excedente, enquanto no hipotireoidismo D2 é suprarregulada e D3 é subregulada para aumentar os níveis de T3 citoplásmicos. Os níveis de T3 no soro permanecem razoavelmente constantes em indivíduos saudáveis, mas D2 e D3 podem regular os níveis intracelulares específicos de tecido de T3 para manter a homeostase visto que os níveis de T3 e T4 podem variar por órgão. As deiodinases também provêm um controle de desenvolvimento espacial e temporal dos níveis do hormônio da tireoide. Os níveis de D3 são
16 / 63 primeiramente maiores no desenvolvimento e diminuem com o tempo, enquanto os níveis de D2 são altos nos momentos de mudança metamórfica significante nos tecidos. Desse modo D2 permite a produção de T3 suficiente nos pontos de tempo necessários enquanto D3 pode proteger o tecido de ser superexposto à T3.
[0062] A DII também desempenha um papel significante na termogênese do tecido adiposo marrom (BAT). Em resposta ao estímulo simpático, queda de temperatura ou alimentação excedente de BAT, a DII aumenta a oxidação dos ácidos graxos e desliga a fosforilação oxidativa por intermédio da proteína de desligamento, causando a produção de calor mitocondrial. A DII aumenta durante o estresse por frio em BAT e aumenta os níveis de T3 intracelulares. Nos modelos deficientes em DII, calafrios são uma adaptação comportamental ao frio. Não obstante, a produção de calor não é muito menos eficiente do que a oxidação lipídica por desligamento.
[0063] É um aspecto da descrição prover um sensor para a detecção de um hormônio da tireoide, o sensor compreendendo uma iodotironina deiodinase [EC 1.21.99.3 e/ou EC 1.21.99.4] ou um fragmento da mesma, em que a iodotironina deiodinase é imobilizada no sensor.
[0064] Em uma modalidade, a iodotironina deiodinase é iodotironina deiodinase tipo 1 [EC 1.21.99.4] ou um fragmento da mesma.
[0065] Em uma modalidade, a iodotironina deiodinase é iodotironina deiodinase tipo 2 [EC 1.21.99.4] ou um fragmento da mesma.
[0066] Em uma modalidade, a iodotironina deiodinase é iodotironina deiodinase tipo 3 [EC 1.21.99.3] ou um fragmento da mesma.
[0067] Em uma modalidade, a iodotironina deiodinase EC 1.21.99.4 é iodotironina deiodinase tipo 2 ou iodotironina deiodinase tipo 1.
[0068] Em uma modalidade, a iodotironina deiodinase EC 1.21.99.4 é iodotironina deiodinase tipo 2.
[0069] Em uma modalidade, a iodotironina deiodinase EC 1.21.99.3 é
17 / 63 iodotironina deiodinase tipo 3.
[0070] Em algumas modalidades da presente descrição, a iodotironina deiodinase é mamífera. Em algumas modalidades da presente descrição, a iodotironina deiodinase é humana.
[0071] Em algumas modalidades da presente descrição, as pelo menos duas iodotironina deiodinases, selecionadas de EC 1.21.99.3 e/ou EC
1.21.99.4, e/ou o anticorpo anti-rT3 são mamíferas.
[0072] Em algumas modalidades da presente descrição, as pelo menos duas iodotironina deiodinases, selecionadas de EC 1.21.99.3 e/ou EC
1.21.99.4, e/ou o anticorpo anti-rT3 são humanas.
[0073] Em algumas modalidades da presente descrição, as pelo menos duas iodotironina deiodinases, selecionadas de EC 1.21.99.3 e/ou EC
1.21.99.4 e/ou o anticorpo anti-rT3 são conjugadas a uma porção adicional.
[0074] Em algumas modalidades da presente descrição, as pelo menos duas iodotironina deiodinases, selecionadas de EC 1.21.99.3 e/ou EC
1.21.99.4, e/ou o anticorpo anti-rT3 são cada uma individualmente conjugada a uma porção adicional. Por exemplo, a porção adicional pode facilitar a imobilização das iodotironina deiodinases no sensor ou a detecção dos hormônios da tireoide.
[0075] Em algumas modalidades da presente descrição, o substrato compreende múltiplas superfícies para a imobilização das pelo menos 2 iodotiroidina deiodenases, tal como uma primeira superfície do substrato e uma segunda superfície do substrato.
[0076] Em algumas modalidades da presente descrição a primeira superfície, a segunda superfície e opcionalmente a terceira superfície estão no mesmo substrato.
[0077] Em algumas modalidades da presente descrição a primeira superfície, a segunda superfície e opcionalmente a terceira superfície estão em diferentes substratos.
18 / 63
[0078] Em algumas modalidades da presente descrição as pelo menos 2 iodotiroidina deiodenases compreendem uma primeira iodotiroidina deiodenase selecionada de EC 1.21.99.3 e/ou EC 1.21.99.4 imobilizada na primeira superfície do substrato e uma segunda iodotiroidina deiodenase selecionada de EC 1.21.99.3 e/ou EC 1.21.99.4 imobilizada na segunda superfície do substrato.
[0079] Em algumas modalidades da presente descrição a primeira iodotironina deiodinase é selecionada de EC 1.21.99.4 e a segunda iodotironina deiodinase é selecionada de EC 1.21.99.3.
[0080] Em algumas modalidades da presente descrição a primeira iodotironina deiodinase e a segunda iodotironina deiodinase são ambas independentemente selecionadas de EC 1.21.99.4.
[0081] Em algumas modalidades da presente descrição a primeira iodotironina deiodinase e a segunda iodotironina deiodinase são diferentes enzimas selecionadas de EC 1.21.99.4.
[0082] Em algumas modalidades da presente descrição, a primeira iodotironina deiodinase é iodotironina deiodinase tipo 1 e/ou iodotironina deiodinase tipo 2.
[0083] Em algumas modalidades da presente descrição a segunda iodotironina deiodinase é iodotironina deiodinase tipo 1, iodotironina deiodinase tipo 2 e/ou iodotironina deiodinase tipo 3.
[0084] Em algumas modalidades da presente descrição a primeira iodotironina deiodinase é uma iodotironina deiodinase tipo 1 e a segunda iodotironina deiodinase é iodotironina deiodinase tipo 2.
[0085] Em algumas modalidades da presente descrição a primeira iodotironina deiodinase é iodotironina deiodinase tipo 1 e a segunda iodotironina deiodinase é iodotironina deiodinase tipo 3.
[0086] Em algumas modalidades da presente descrição a primeira iodotironina deiodinase é iodotironina deiodinase tipo 2 e a segunda
19 / 63 iodotironina deiodinase é iodotironina deiodinase tipo 3.
[0087] Em algumas modalidades da presente descrição t Em algumas modalidades da presente descrição t Em algumas modalidades da presente descrição t Em algumas modalidades da presente descrição t
[0088] Em algumas modalidades, a porção adicional é um peptídeo, por exemplo, uma etiqueta de polihistidina (etiqueta His).
[0089] Em algumas modalidades, a porção adicional é um rótulo, também indicado como uma etiqueta fluorescente ou uma sonda.
[0090] A etiqueta de polihistidina ser usada com sucesso para a imobilização das proteínas na superfície tais como em uma superfície metálica, por exemplo uma placa microtituladora revestida com níquel ou cobalto ou em um arranjo de proteína .
[0091] Em algumas modalidades, o sensor como definido na presente descrição compreende tanto a iodotironina deiodinase tipo 2 quanto a iodotironina deiodinase tipo 3 ou fragmentos dos mesmos. A presença tanto de DII quanto de DIII pode resultar em um diagnóstico mais preciso ou distúrbios da tireoide.
[0092] Em algumas modalidades, o sensor como definido na presente descrição compreende tanto a iodotironina deiodinase tipo 1 quanto a iodotironina deiodinase tipo 2 ou fragmentos dos mesmos. A presença tanto de DI quanto de DII podem resultar em um diagnóstico mais preciso ou distúrbios da tireoide.
[0093] Em algumas modalidades, o sensor como definido na presente descrição compreende tanto a iodotironina deiodinase tipo 1 quanto a iodotironina deiodinase tipo 3 ou fragmentos dos mesmos. A presença tanto de DI quanto de DIII podem resultar em um diagnóstico more preciso ou distúrbios da tireoide.
[0094] Em algumas modalidades, o sensor como definido na presente
20 / 63 descrição compreende uma primeira iodotironina deiodinase e uma segunda iodotironina deiodinase, ambas independentemente selecionadas de EC
1.21.99.4.
[0095] Em algumas modalidades, o sensor como definido na presente descrição compreende uma primeira iodotironina deiodinase e uma segunda iodotironina deiodinase, ambas independentemente selecionadas de EC
1.21.99.3.
[0096] Em algumas modalidades, o sensor como definido na presente descrição compreende uma primeira e uma segunda iodotironina deiodinase ambas independentemente selecionadas de EC 1.21.99.3 e EC 1.21.99.4.
[0097] Em algumas modalidades, o sensor como definido na presente descrição compreende uma primeira iodotironina deiodinase independentemente selecionada de EC 1.21.99.4 e uma segunda iodotironina deiodinase independentemente selecionada de EC 1.21.99.3 e EC 1.21.99.4.
[0098] Em algumas modalidades, o sensor como definido na presente descrição compreende a primeira iodotironina deiodinase imobilizada em uma primeira superfície do substrato e a segunda iodotironina deiodinase imobilizada em uma segunda superfície do substrato.
[0099] Em algumas modalidades, a iodotironina deiodinase tipo 1 compreende ou consiste em um polipeptídeo tendo pelo menos 95 % de identidade de sequência, tal como pelo menos 96 % de identidade de sequência, tal como pelo menos 97 % de identidade de sequência, tal como pelo menos 98 % de identidade de sequência, tal como pelo menos 99 % de identidade de sequência, tal como cerca de 100 % de identidade de sequência para a SEQ ID NO: 1 ou um fragmento da mesma.
[00100] Em algumas modalidades, a iodotironina deiodinase tipo 2 compreende ou consiste em um polipeptídeo tendo pelo menos 95 % de identidade de sequência, tal como pelo menos 96 % de identidade de sequência, tal como pelo menos 97 % de identidade de sequência, tal como
21 / 63 pelo menos 98 % de identidade de sequência, tal como pelo menos 99 % de identidade de sequência, tal como cerca de 100 % de identidade de sequência para a SEQ ID NO: 2 ou um fragmento da mesma.
[00101] Em algumas modalidades, a iodotironina deiodinase tipo 3 compreende ou consiste em um polipeptídeo tendo pelo menos 95 % de identidade de sequência, tal como pelo menos 96 % de identidade de sequência, tal como pelo menos 97 % de identidade de sequência, tal como pelo menos 98 % de identidade de sequência, tal como pelo menos 99 % de identidade de sequência, tal como cerca de 100 % de identidade de sequência para a SEQ ID NO: 3 ou um fragmento da mesma.
[00102] Em algumas modalidades, a iodotironina deiodinase é recombinantemente produzida, tal como por intermédio da expressão isenta de células.
[00103] Em algumas modalidades, a iodotironina deiodinase EC
1.21.99.3, a iodotironina deiodinase EC 1.21.99.4 e/ou o anticorpo anti-rT3 são recombinantemente produzidos, tal como por intermédio da expressão isenta de células.
[00104] A expressão isenta de células, também indicada como síntese de proteínas isenta de células ou CFPS, é a produção da proteína usando maquinaria biológica em um sistema isento de células, isto é, sem o uso de células vivas. O ambiente da síntese de proteínas in vitro não é constrangido por uma parede celular ou condições de homeostase necessárias para manter a viabilidade celular. Desse modo, a CFPS permite o acesso direto e controle do ambiente de translação que é vantajoso para várias aplicações, incluindo a solubilização cotranslacional das proteínas de membrana, otimização da produção de proteínas, incorporação de aminoácidos não naturais, rotulação seletiva e de sítio específico.
[00105] Em referência à identidade de sequência: um alto nível de identidade de sequência indica a probabilidade de que a primeira sequência é
22 / 63 derivada da segunda sequência. A identidade de sequência de aminoácidos requer as sequências de aminoácido idênticas entre as duas sequências alinhadas. Desse modo, uma sequência candidata compartilhando pelo menos 95 % de identidade de aminoácidos com uma sequência de referência, requer que, após o alinhamento, pelo menos 95 % dos aminoácidos na sequência candidata sejam idênticos aos aminoácidos correspondentes na sequência de referência. A identidade pode ser determinada pelo auxílio de análise computacional, tal como, sem limitação, o programa de alinhamento computacional ClustalW (Higgins D., Thompson J., Gibson T., Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J., 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22:4673-4680) e os parâmetros padrão nesta sugeridos. Conceito de Biossensor
[00106] A presente descrição se refere a um biossensor, que é um sensor compreendendo um substrato, pelo menos 2 iodotironina deiodinases selecionadas de EC 1.21.99.3 e/ou EC 1.21.99.4 e um anticorpo anti-rT3, em que as pelo menos 2 iodotironina deiodinases e o anticorpo anti-rT3 são imobilizados na superfície do substrato.
[00107] A presente descrição se refere a um biossensor, que é um sensor compreendendo uma iodotironina deiodinase [EC 1.21.99.3 e/ou EC
1.21.99.4] imobilizada em uma de suas superfícies.
[00108] Uma variedade de dispositivos para detectar as interações de ligando/receptor são conhecidas. A mais básica destas são os ensaios puramente químicos/enzimáticos em que a presença ou quantidade de analito é detectada medindo-se ou quantificando-se um produto de reação detectável. As interações de ligando/receptor também podem ser detectadas e quantificadas por ensaios de radiorrótulo.
[00109] Os ensaios de ligação quantitativos deste tipo envolvem dois
23 / 63 componentes separados: um substrato de reação, por exemplo, uma tira de teste no estado sólido, um chip ou um eletrodo e um dispositivo leitor ou detector separado, tal como um contador de cintilação ou espectrofotômetro. O substrato geralmente não é adequado para ensaios múltiplos ou para miniaturização, para ensaios de analito de múltiplos manuseios de uma pequena quantidade de amostra de fluido corporal.
[00110] Nos biossensores, ao contrário, o substrato de ensaio e superfície detetora são integrados em um dispositivo único. Um tipo geral de biossensores utiliza uma superfície de eletrodo em combinação com elementos de medição de corrente ou impedância para detectar uma mudança na corrente ou impedância em resposta à presença de um evento de ligação receptor de ligando. Um outro tipo de biossensor pode utilizar um chip, por exemplo, um chip de vidro, em combinação com um detector ótico, por exemplo, em combinação com Ressonância Plasmônica de Superfície.
[00111] Um “biossensor”, às vezes indicado como “sensor” aqui se refere a um sistema compreendendo um sensor e um elemento biológico. Os biossensores são praticamente substitutos de técnicas analíticas convencionais que são tediosas, custosas, complexas e não apropriadas para a supervisão in situ. Um biossensor é um dispositivo analítico químico unificando um elemento biológico com um transdutor adumbrativamente. Este consolida um elemento biológico dentro de ou em contato íntimo com um transdutor que produz um sinal eletrônico proporcional a um analito único que é novamente transportado para um detector.
[00112] Um biossensor abrange três componentes fundamentais que são biorreceptores (o elemento biológico), um transdutor e um circuito eletrônico. O biorreceptor ou elemento biológico é uma biomolécula que é embebida com o transdutor, como uma enzima, DNA, proteína, célula inteira, anticorpos etc. No presente pedido, o biorreceptor é uma iodotironina deiodinase. O transdutor é um dispositivo que renova uma forma de energia
24 / 63 em outra, como energia química em energia elétrica. Por exemplo, o transdutor é um detector. Os detectores abrangidos pelos métodos da presente descrição são detectores óticos, tal como um detector de Ressonância Plasmônica de Superfície, detectores eletroquímicos e circuitos de medição. Um circuito eletrônico compreende um sistema de processamento de sinais que converte um sinal elétrico em um sinal processável.
[00113] Os biossensores com base nos efeitos da Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR) exploram a mudança no o ângulo de reflexão da superfície de SPR que ocorre com as perturbações, por exemplo, eventos de ligação, na interface SPR. Finalmente, os biossensores também podem utilizar mudanças nas propriedades óticas em uma superfície de biossensor.
[00114] Os Biossensores eletroquímicos são normalmente baseados na catálise enzimática de uma reação que produz ou consome elétrons (enzimas de redox). O substrato do sensor geralmente contém três eletrodos; um eletrodo de referência, um eletrodo de trabalho e um eletrodo contador. O analito alvo está envolvido na reação que ocorre na superfície do eletrodo ativo e a reação pode causar uma transferência de elétrons através da camada dupla (produzindo uma corrente) ou pode contribuir para o potencial de camada dupla (produzindo uma voltagem). A corrente pode ser medida, em que a taxa de elétrons é proporcional à concentração de analito em um potencial fixo ou o potencial pode ser medido em corrente zero, que fornece uma resposta logarítmica. Além disso, a detecção elétrica isenta de rótulo e direta rótulo de peptídeos pequenos e proteínas é possível através de suas cargas intrínsecas usando um transistor de efeito de campos sensível aos íons bifuncionalizados.
[00115] Os biossensores potenciométricos, em que o potencial é produzido em corrente zero, fornece uma resposta logarítmica com uma alta faixa dinâmica. Tais biossensores são frequentemente feitos por impressão em tela dos padrões de eletrodo em um substrato plástico, revestido com um
25 / 63 polímero de condução e depois alguma proteína (enzima ou anticorpo) é ligada. Estes têm apenas dois eletrodos e são extremamente sensíveis e robustos. Estes permitem a detecção de análitos em níveis previamente apenas obteníveis por HPLC e LC/MS e sem preparação rigorosa da amostra. Todos os biossensores geralmente envolvem a preparação da amostra mínima conforme o componente de sensoriamento biológico é altamente seletivo para o analito em questão. O sinal é produzido através de mudanças eletroquímicas e físicas na camada do polímero de condução devido às mudanças que ocorrem na superfície do sensor. Tais mudanças podem ser atribuídas à força iônica, pH, hidratação e reações de redox. Os transistores de efeito de campo (FET), em que a região do portão foi modificada com uma enzima ou anticorpo, também podem detectar concentrações muito baixas de vários analitos conforme a ligação do analito à região do portão do FET causa uma mudança na corrente dreno-fonte.
[00116] Os biossensores têm várias vantagens potenciais sobre os sistemas de ensaio de ligação tendo substratos de reação separados e dispositivos leitores. Uma vantagem importante é a capacidade de fabricar unidades de biossensor de pequena escala, mas altamente reproduzíveis usando métodos de fabricação de microchip.
[00117] Existem muitas aplicações potenciais dos biossensores de vários tipos. Os requerimentos principais para um método de biossensor para ser valoroso em termos de pesquisa e aplicações comerciais são a identificação de uma molécula alvo, disponibilidade de um elemento de reconhecimento biológico adequado e o potencial para sistemas de detecção portáveis descartáveis a ser preferidos pelas técnicas sensíveis de base laboratorial em algumas situações.
[00118] Em algumas modalidades, a presente descrição se refere a um biossensor para a detecção e/ou quantificação de um hormônio da tireoide, em que o hormônio da tireoide é selecionado dentre T4 livre, T3 livre e T3
26 / 63 reverso (rT3).
[00119] Em algumas modalidades, a presente descrição se refere a um biossensor para quantificação de um hormônio da tireoide, em que o hormônio da tireoide é selecionado dentre T4 livre, T3 livre e T3 reverso (rT3).
[00120] Em algumas modalidades, a presente descrição se refere a um biossensor, em que o dito biossensor compreende um sensor, o dito sensor compreendendo um substrato, pelo menos 2 iodotironina deiodinases selecionadas de EC 1.21.99.3 e/ou EC 1.21.99.4 ou um fragmento da mesma e um anticorpo anti-rT3 ou um fragmento da mesma, em que as pelo menos 2 iodotironina deiodinases e o anticorpo anti-rT3 são imobilizados na superfície do substrato.
[00121] Em algumas modalidades, a presente descrição se refere a um biossensor, em que o dito biossensor compreende um sensor, o dito sensor compreendendo um eletrodo e uma iodotironina deiodinase [EC 1.21.99.3 e/ou EC 1.21.99.4] ou um fragmento da mesma imobilizada no eletrodo.
[00122] Em algumas modalidades, o sensor como definido na presente descrição compreende entre 10 e 100 IU de uma iodotironina deiodinase, tal como entre 10 e 15 IU, tal como entre 15 e 20 IU, tal como entre 20 e 25 IU, tal como entre 25 e 30 IU, tal como entre 30 e 35 IU, tal como entre 35 e 40 IU, tal como entre 40 e 45 IU, tal como entre 45 e 50 IU, tal como entre 50 e 55 IU, tal como entre 55 e 60 IU, tal como entre 60 e 65 IU, tal como entre 65 e 70 IU, tal como entre 70 e 75 IU, tal como entre 75 e 80 IU, tal como entre 80 e 85 IU, tal como entre 85 e 90 IU, tal como entre 90 e 95 IU, tal como entre 95 e 100 IU.
[00123] Em algumas modalidades, o sensor como definido na presente descrição compreende entre 10 e 100 IU de iodotironina deiodinase EC
1.21.99.3 e iodotironina deiodinase EC 1.21.99.4, tal como entre 10 e 15 IU, tal como entre 15 e 20 IU, tal como entre 20 e 25 IU, tal como entre 25 e 30
27 / 63 IU, tal como entre 30 e 35 IU, tal como entre 35 e 40 IU, tal como entre 40 e 45 IU, tal como entre 45 e 50 IU, tal como entre 50 e 55 IU, tal como entre 55 e 60 IU, tal como entre 60 e 65 IU, tal como entre 65 e 70 IU, tal como entre 70 e 75 IU, tal como entre 75 e 80 IU, tal como entre 80 e 85 IU, tal como entre 85 e 90 IU, tal como entre 90 e 95 IU, tal como entre 95 e 100 IU.
[00124] Em algumas modalidades, o sensor como definido na presente descrição compreende entre 10 e 100 IU de iodotironina deiodinases tipo 2 e a tipo 3, tal como entre 10 e 15 IU, tal como entre 15 e 20 IU, tal como entre 20 e 25 IU, tal como entre 25 e 30 IU, tal como entre 30 e 35 IU, tal como entre 35 e 40 IU, tal como entre 40 e 45 IU, tal como entre 45 e 50 IU, tal como entre 50 e 55 IU, tal como entre 55 e 60 IU, tal como entre 60 e 65 IU, tal como entre 65 e 70 IU, tal como entre 70 e 75 IU, tal como entre 75 e 80 IU, tal como entre 80 e 85 IU, tal como entre 85 e 90 IU, tal como entre 90 e 95 IU, tal como entre 95 e 100 IU.
[00125] A IU é determinada como unidade internacional e é uma unidade de medida para a quantidade de uma substância; a massa ou volume que constitui uma unidade internacional varia com base na qual a substância esteja sendo medida e a variação tem base na atividade ou efeito biológico, para o propósito de comparação mais fácil entre as substâncias.
[00126] Em algumas modalidades da presente descrição, é descrito um sensor para quantificação de um hormônio da tireoide compreendendo: - um primeiro eletrodo compreendendo uma primeira superfície; - um segundo eletrodo compreendendo uma segunda superfície; - uma primeira iodotironina deiodinase selecionada de EC
1.21.99.4 imobilizada na primeira superfície do primeiro eletrodo; - uma segunda iodotironina deiodinase selecionada de EC
1.21.99.3 e EC 1.21.99.3 imobilizada na segunda superfície do segundo
28 / 63 eletrodo.
[00127] Em algumas modalidades da presente descrição, é descrito um sensor para quantificação de um hormônio da tireoide compreendendo: - um primeiro eletrodo compreendendo uma primeira superfície; - um segundo eletrodo compreendendo uma segunda superfície; - um terceiro eletrodo compreendendo uma terceira superfície; - uma primeira iodotironina deiodinase selecionada de EC
1.21.99.4 imobilizada na primeira superfície do primeiro eletrodo; - uma segunda iodotironina deiodinase selecionada de EC
1.21.99.3 e EC 1.21.99.3 imobilizada na segunda superfície do segundo eletrodo, e - um anticorpo anti-rT3 imobilizado na terceira superfície do terceiro eletrodo.
[00128] É um aspecto da presente descrição prover um método para fabricar um sensor compreendendo uma iodotironina deiodinase, o método compreendendo: a. prover um eletrodo, b. prover o pelo menos uma iodotironina deiodinase, c. imobilizar a iodotironina deiodinase no eletrodo, fabricando desse modo um sensor compreendendo a iodotironina deiodinase.
[00129] Em uma modalidade particular, o eletrodo é como definido como definido nas modalidades da presente descrição. Em uma modalidade particular, a iodotironina deiodinase é como definida como definido nas modalidades da presente descrição.
[00130] A Etapa c) acima compreende a imobilização de uma iodotironina deiodinase no eletrodo, tal como no sensor. A etapa pode ser
29 / 63 vista como compreendendo uma etapa de funcionalizar o eletrodo, seguido pela imobilização da iodotironina deiodinase no eletrodo funcionalizado. Os exemplos de procedimentos que podem ser usados para imobilizar uma iodotironina deiodinase em um eletrodo são aqui descritos em detalhes na presente descrição. Imobilização enzimática
[00131] A imobilização do elemento biológico, tal como uma enzima de interesse na superfície do sensor (seja de metal, polímero ou vidro) é uma etapa necessária e crítica no projeto dos biossensores. Diferentes técnicas de imobilização existem dependendo do substrato utilizado, estas técnicas são conhecidas ao técnico habilitado na técnica.
[00132] É um aspecto da descrição prover um sensor para a detecção de um hormônio da tireoide, o sensor compreendendo um substrato, a. uma primeira iodotironina deiodinase selecionada de EC
1.21.99.4, b. uma segunda iodotironina deiodinase selecionada de EC
1.21.99.3 ou EC 1.21.99.4, e c. opcionalmente um anticorpo anti-rT3, em que a primeira iodotironina deiodinase, a segunda iodotironina deiodinase e o anticorpo anti-rT3 são imobilizados na superfície do substrato.
[00133] Em um primeiro aspecto, um sensor para quantificação de um hormônio da tireoide é provido, o sensor compreendendo uma iodotironina deiodinase [EC 1.21.99.3 e/ou EC 1.21.99.4] ou um fragmento da mesma, em que a iodotironina deiodinase é imobilizada no sensor.
[00134] É um aspecto da descrição prover um sensor para a detecção de um hormônio da tireoide, o sensor compreendendo uma iodotironina deiodinase [EC 1.21.99.3 e/ou EC 1.21.99.4] ou um fragmento da mesma, em que a iodotironina deiodinase é imobilizada no sensor.
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[00135] Em algumas modalidades, o substrato como definido na presente descrição compreende um ou mais eletrodos e/ou chips.
[00136] Em algumas modalidades, o substrato como definido na presente descrição compreende pelo menos 1 eletrodo, tal como pelo menos 2 eletrodos, tal como pelo menos 3 eletrodos.
[00137] Em algumas modalidades, o substrato como definido na presente descrição compreende pelo menos 1 chip, tal como pelo menos 2 chips, tal como pelo menos 3 chips.
[00138] Em algumas modalidades, o substrato como definido na presente descrição compreende ou consiste em 3 eletrodos e em que a primeira superfície é uma superfície de um primeiro eletrodo, a segunda superfície é uma superfície de um segundo eletrodo e a terceira superfície é uma superfície de um terceiro eletrodo.
[00139] Em algumas modalidades, o substrato como definido na presente descrição compreende ou consiste em três chips e em que a primeira superfície é uma superfície de um primeiro chip, a segunda superfície é uma superfície de um segundo chip e a terceira superfície é uma superfície de um terceiro chip.
[00140] Em algumas modalidades, o sensor como definido na presente descrição compreende um substrato tendo uma superfície modificada. O dito substrato é modificado de modo que uma iodotironina deiodinase possa ser imobilizada na sua superfície.
[00141] Em algumas modalidades, o substrato como definido na presente descrição é um eletrodo ou um chip. Em outras modalidades, o dito chip é um chip de vidro. O termo “vidro” como aqui usado é equivalente a quartzo ou sílica, compreendendo átomos de silício de oxigênio em uma estrutura contínua com uma fórmula química geral de SiO2.
[00142] Em algumas modalidades, o sensor como definido na presente descrição compreende um eletrodo, tal como dois eletrodos, tal como três
31 / 63 eletrodos, em que a primeira superfície do primeiro eletrodo é uma superfície modificada, em que a segunda superfície do segundo eletrodo é uma superfície modificada, e/ou em que a terceira superfície do terceiro eletrodo é uma superfície modificada.
[00143] Quando aqui se referindo ao “eletrodo” na presente descrição este é indicado como um primeiro eletrodo, um segundo eletrodo, um terceiro eletrodo e/ou um outro eletrodo no qual os biocomponentes do sensor, isto é, a primeira iodotironina deiodinase selecionada de EC 1.21.99.4, a segunda iodotironina deiodinase selecionada de EC 1.21.99.3 e EC 1.21.99.4 e opcionalmente o anticorpo anti-rT3 são imobilizados.
[00144] Quando aqui se referindo à “superfície” na presente descrição esta é referida a uma primeira superfície, uma segunda superfície, uma terceira superfície e/ou uma outra superfície dos substratos (isto é, dos eletrodos e/ou dos chips) nos quais os biocomponentes do sensor, isto é, a primeira iodotironina deiodinase selecionada de EC 1.21.99.4, a segunda iodotironina deiodinase selecionada de EC 1.21.99.3 e EC 1.21.99.4 e opcionalmente o anticorpo anti-rT3 são imobilizados.
[00145] Em algumas modalidades, o eletrodo é feito de carbono, ouro ou platina.
[00146] Em uma outra modalidade, o eletrodo é um eletrodo serigrafado.
[00147] Em algumas modalidades, o sensor como definido na presente descrição compreende pelo menos uma superfície do chip ou do eletrodo revestido com uma camada ou monocamada de ouro. Em outras modalidades, a superfície do chip ou do eletrodo é revestida com um material selecionado do grupo que consiste em prata, óxido de cobre, grafeno, óxido de ferro e uma combinação dos mesmos.
[00148] Em algumas modalidades como definido na presente descrição a primeira, segunda e/ou terceira superfície do substrato do sensor é uma
32 / 63 superfície modificada.
[00149] As superfícies do sensor, por exemplos, as superfícies dos eletrodos e/ou as superfícies dos chips) podem ser submetidas a qualquer tipo de tratamento antes do uso. O tratamento pode incluir a deposição de nanopartículas que podem ser realizadas através de métodos tais como revestimento, revestimento por imersão, revestimento giratório, Langmuir- Blodgett, automontagem, evaporação de solvente, revestimento de lâmina raspadora, deposição de vapor químico, impressão por transferência, deposição direta, método de deposição-precipitação, uso de uma camada aderente entre a superfície do eletrodo e a nanopartícula contendo polieletrólitos, imobilização covalente, tal como através de uma ligação amida, imobilização eletroestática, imobilização de escova polimérica, imobilização de rede de sol-gel/polímero, imobilização de van der Waals, imobilização hidrofóbica/hidrofílica, deposição por evaporação e/ou desumectação, eletrodeposição tal como eletrodeposição oticamente induzida, método de Turkevich-Frens, método de Brust-Schiffrin, camada-em-camada, deposição camada de iônica sucessiva, métodos químicos, métodos fotoquímicos, métodos sonoquímicos ou uma combinação dos mesmos.
[00150] A superfície dos sensores também pode ser submetida a um padrão, tal como através de técnicas de microfabricação, antes da deposição de nanopartículas, tal que pelo menos uma parte das nanopartículas sejam imobilizadas em um padrão específico na superfície dos sensores.
[00151] As superfícies dos sensores também podem ser tratadas para induzir as mudanças químicas, tal como a funcionalização ou ativação, por exemplo, através da funcionalização amina, funcionalização tiol, hidroxilação, silanização, oxidação e/ou ativação plasmática ou uma combinação dos mesmos. A modificação de superfície pode ser realizada em qualquer ponto no tratamento das superfícies, tal como antes da deposição das nanopartículas.
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[00152] Os sensores também podem ser montados ou tratados como definido em qualquer método disponível para a montagem dos sensores, tais como por sinterização, impressão, tal como impressão 3d, impressão em tela e/ou impressão de jato de tinta, fusão, eletrodeposição, tecnologia de película fina, formação de redes, corrosão seletiva, litografia tal como litografia ótica e/ou litografia de impressão, pulverização catódica, estampagem, anulamento térmico, eletrólise, anodização, gravura, tal como gravura eletroquímica, gravura úmida e gravura seca ou uma combinação dos mesmos.
[00153] Em algumas modalidades como definido na presente descrição, a superfície modificada é uma superfície compreendendo uma pluralidade de características topográficas no tamanho nanométrico e/ou micrométrico. Tal superfície modificada compreendendo uma pluralidade de características topográficas no tamanho nanométrico e/ou micrométrico também é indicada como uma superfície rugosa ou uma superfície áspera. Uma superfície rugosa é benéfica para a imobilização das enzimas porque esta minimiza as forças de Van der Waals que podem de outro modo fazer com que as enzimas imobilizadas entrem em colapso.
[00154] Em algumas modalidades como definido na presente descrição, a pluralidade de características topográficas no tamanho nanométrico e/ou micrométrico é selecionada do grupo que consiste em: micropartículas, nanopartículas, microfios, nanofios, microtubos, nanotubos, microbastões, nanobastões e combinações dos mesmos.
[00155] Em algumas modalidades como definido na presente descrição, a pluralidade de características topográficas no tamanho nanométrico e/ou micrométrico foi gerada na superfície do substrato montando-se a dita superfície através da sinterização.
[00156] Em algumas modalidades, como definido na presente descrição, em que a pluralidade de características topográficas no tamanho nanométrico e/ou micrométrico foi gerada na superfície do substrato através
34 / 63 da gravura de superfície. Por exemplo, a gravura de superfície pode ser uma gravura úmida ou uma gravura seca.
[00157] Em algumas modalidades como definido na presente descrição, em que a pluralidade de características topográficas no tamanho nanométrico e/ou micrométrico foi gerada na superfície do substrato através da deposição de partícula. Por exemplo, a pluralidade de características topográficas no tamanho nanométrico e/ou micrométrico pode ter sido gerada na superfície do substrato através da deposição eletroforética.
[00158] Em algumas modalidades como definido na presente descrição, em que a superfície modificada é uma superfície revestida com uma camada de ouro.
[00159] Em algumas modalidades como definido na presente descrição, em que a superfície modificada é uma superfície revestida com nanopartículas selecionadas do grupo que consiste em ouro, prata, óxido de cobre, grafeno, óxido de ferro e combinações dos mesmos.
[00160] Em algumas modalidades, o sensor como definido na presente descrição compreende pelo menos uma superfície do substrato (chip ou eletrodo) revestida com uma camada ou monocamada de ouro e a dita superfície é novamente modificada com nanopartículas selecionadas do grupo que consiste em ouro, prata, óxido de cobre, grafeno, óxido de ferro e combinações dos mesmos.
[00161] Em outras palavras, o substrato (eletrodo ou chip) pode ser revestido com uma camada ou monocamada de ouro, na dita camada ou monocamada de ouro pode haver nanopartículas, por exemplo, nanopartículas selecionadas do grupo que consiste em ouro, prata, óxido de cobre, grafeno, óxido de ferro e combinações dos mesmos e as moléculas de iodotironina deiodinase podem ser imobilizadas nas ditas nanopartículas.
[00162] Em uma modalidade, a pelo menos uma superfície do chip ou do eletrodo é modificada com as nanopartículas selecionadas do grupo que
35 / 63 consiste em ouro, prata, óxido de cobre, grafeno, óxido de ferro e combinações dos mesmos.
[00163] Em algumas modalidades como definido na presente descrição, em que a superfície modificada é uma superfície revestida com uma camada de ouro e em que a dita superfície é novamente modificada com nanopartículas selecionadas do grupo que consiste em ouro, prata, óxido de cobre, grafeno, óxido de ferro e combinações dos mesmos.
[00164] As nanopartículas como aqui descritas podem ser encapadas com um agente de encapamento. Um agente de encapamento pode ser moléculas orgânicas, tais como citrato e pode ser usado para interromper o crescimento da nanopartícula para controlar seu tamanho. Em algumas modalidades, as nanopartículas são encapadas com citrato, encapadas com amino ou encapadas tanto com citrato quanto com amino.
[00165] Em uma modalidade, o sensor compreende um chip tendo uma superfície modificada, em que o dito chip é um substrato de vidro quimicamente modificado e em que o dito chip é usado em combinação com Ressonância Plasmônica de Superfície para detectar e/ou quantificar um hormônio da tireoide.
[00166] Em uma modalidade, o sensor compreende um chip tendo uma superfície modificada, em que o dito chip é um substrato de vidro modificado com nanopartículas, em que as ditas nanopartículas podem ser selecionadas do grupo que consiste em ouro, prata, óxido de cobre, grafeno, óxido de ferro e combinações dos mesmos e em que o dito chip é usado em combinação com Ressonância Plasmônica de Superfície para detectar e/ou quantificar um hormônio da tireoide.
[00167] Em uma modalidade, o sensor compreende um chip tendo uma superfície modificada, em que o dito chip é um substrato de vidro modificado com uma camada ou monocamada, em que a dita camada ou monocamada é feita de um material selecionado do grupo que consiste em ouro, prata, óxido
36 / 63 de cobre, grafeno, óxido de ferro e combinações dos mesmos e em que o dito chip é usado em combinação com Ressonância Plasmônica de Superfície para detectar e/ou quantificar um hormônio da tireoide.
[00168] Em uma modalidade, o sensor compreende um chip tendo uma superfície modificada, em que o dito chip é um substrato de vidro modificado com nanopartículas de ouro e em que o dito chip é usado em combinação com Ressonância Plasmônica de Superfície para detectar e/ou quantificar um hormônio da tireoide.
[00169] Em uma modalidade, o sensor compreende um chip tendo uma superfície modificada, em que o dito chip compreende um substrato de vidro modificado com uma camada ou monocamada de ouro e em que o dito chip é usado em combinação com Ressonância Plasmônica de Superfície para detectar e/ou quantificar um hormônio da tireoide.
[00170] Em uma modalidade, o sensor compreende um eletrodo tendo uma superfície modificada, em que o dito eletrodo compreende uma superfície de camada ou monocamada feita de ouro e em que o dito eletrodo é usado em combinação com transdução eletroquímica para detectar e/ou quantificar um hormônio da tireoide.
[00171] Em uma outra modalidade, o eletrodo compreende uma superfície de camada ou monocamada feita de prata, em que o dito eletrodo é usado em combinação com transdução eletroquímica para detectar e/ou quantificar um hormônio da tireoide como definido na presente descrição.
[00172] Em uma outra modalidade, o eletrodo compreende uma superfície de camada ou monocamada feita de óxido de cobre, em que o dito eletrodo é usado em combinação com transdução eletroquímica para detectar e/ou quantificar um hormônio da tireoide como definido na presente descrição.
[00173] Em uma outra modalidade, o eletrodo compreende uma superfície de camada ou monocamada feita de grafeno, em que o dito eletrodo
37 / 63 é usado em combinação com transdução eletroquímica para detectar e/ou quantificar um hormônio da tireoide como definido na presente descrição.
[00174] Em uma outra modalidade, o eletrodo compreende uma superfície de camada ou monocamada feita de óxido de ferro, em que o dito eletrodo é usado em combinação com transdução eletroquímica para detectar e/ou quantificar um hormônio da tireoide como definido na presente descrição.
[00175] Em uma outra modalidade, o eletrodo compreende uma superfície de camada ou monocamada feita de uma combinação de metais, tal como ouro e prata, em que o dito eletrodo é usado em combinação com transdução eletroquímica para detectar e/ou quantificar um hormônio da tireoide como definido na presente descrição.
[00176] Em algumas modalidades, a iodotironina deiodinase como definido na presente descrição é imobilizada no substrato.
[00177] Em algumas modalidades, as iodotironina deiodinases como definido na presente descrição são imobilizadas na superfície do sensor através de um ligante compreendendo uma nanopartícula.
[00178] Em algumas modalidades, as iodotironina deiodinases como definido na presente descrição são imobilizadas na superfície do sensor através de um ligante compreendendo uma ligação coordenada covalente de níquel-histidina (Ni-His). Isto pode ser particularmente adequado quando as iodotironina deiodinases compreendem uma etiqueta de histidina.
[00179] Em algumas modalidades como definido na presente descrição, em que a nanopartícula tem um tamanho entre 1 nm e 50 nm, preferivelmente um tamanho entre 5 nm e 45 nm, preferivelmente um tamanho entre 10 nm e 40 nm, preferivelmente um tamanho entre 10 nm e 35 nm, preferivelmente um tamanho entre 10 nm e 30 nm. O tamanho das nanopartículas pode ser determinado com microscopia TEM. O uso das nanopartículas nesta faixa de tamanho como ligantes entre a superfície do
38 / 63 substrato e as iodotironina deiodinases pode ser conceder à superfície do substrato uma curvatura preferida para a imobilização das iodotironina deiodinases.
[00180] Em algumas modalidades, a iodotironina deiodinase como definido na presente descrição é imobilizada no substrato por intermédio de interações iônicas.
[00181] Em algumas modalidades, a iodotironina deiodinase como definido na presente descrição é imobilizada no substrato por intermédio de interações não covalentes.
[00182] Em algumas modalidades, a iodotironina deiodinase como definido na presente descrição é covalentemente imobilizada no substrato.
[00183] Em algumas modalidades, a iodotironina deiodinase é imobilizada no substrato através de um ligante compreendendo uma ou mais nanopartículas. A presença de pelo menos uma nanopartícula entre o substrato e a iodotironina deiodinase previne o desdobramento da proteína.
[00184] Em algumas modalidades, a iodotironina deiodinase é imobilizada no substrato através de um ligante compreendendo: uma ligação de cisteamina ao eletrodo, e uma ligação de nanopartícula à cisteamina e à iodotironina deiodinase, opcionalmente através de uma ou mais cisteaminas adicionais.
[00185] Em algumas modalidades, as pelo menos 2 iodotironina deiodinases e/ou o anticorpo anti-rT3, são imobilizadas no substrato através de um ligante compreendendo: uma ligação de cisteamina ao eletrodo, e uma ligação de nanopartícula à cisteamina e à iodotironina deiodinase, opcionalmente através de uma ou mais cisteaminas adicionais.
[00186] Em algumas modalidades, o sensor da presente descrição também compreende o anticorpo anti-rT3 imobilizado na superfície do sensor, em particular, imobilizado na superfície de um eletrodo (por exemplo, na
39 / 63 terceira superfície do terceiro eletrodo) ou na superfície de um chip (por exemplo na terceira superfície do terceiro chip).
[00187] Várias técnicas úteis na imobilização dos anticorpos na superfície de um eletrodo ou na superfície de um chip são conhecidas às pessoas habilitadas na técnica.
[00188] Em algumas modalidades da presente descrição, o anticorpo anti-rT3 é imobilizado na superfície do substrato por intermédio da química de cloridreto de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) - N- hidroxissuccinimida (NHS).
[00189] Em algumas modalidades da presente descrição, o anticorpo anti-rT3 pode ser um anticorpo modificado com azida e este pode ser imobilizado na superfície do substrato por intermédio da química click em alcino ou glicanos associados com cadeia pesada.
[00190] Em algumas modalidades da presente descrição, o anticorpo anti-rT3 é imobilizado na superfície do substrato diretamente, em que a superfície do substrato é uma superfície modificada com amina positivamente carregada.
[00191] Em algumas modalidades da presente descrição, o anticorpo anti-rT3 é imobilizado na superfície do substrato por intermédio da ligação de biotina-avidina, em tal caso, o anticorpo anti-rT3 é biotinilado.
[00192] Em algumas modalidades, a iodotironina deiodinase é ligada por intermédio do C-terminal ou N-terminal ao ligante. Em algumas modalidades, a iodotironina deiodinase é ligada através do N-terminal ao ligante através de uma ligação amida com cisteamina.
[00193] Por exemplo, a iodotironina deiodinase pode ser imobilizada na superfície do substrato utilizando-se qualquer um dos seguintes procedimentos: • Eletrodos de carbono: Os eletrodos podem ser oxidados usando H2SO4/HNO3 (aq) para introduzir grupos alquila; lavagem; introdução
40 / 63 dos grupos tióis livres por intermédio da reação com Cloridreto de Cisteamina (aq) no escuro; lavagem; Imobilização covalente de nanopartículas encapadas com citrato usando ligação de tiol/ouro; lavagem; introdução de grupos amina livre usando Dicloridreto de Cisteamina (aq); lavagem; imobilização de uma iodotironina deiodinase ou fragmento da mesma por intermédio da formação de ligação amida através de seus resíduos de carboxilato; lavagem; bloqueio com Albumina de Soro Bovino. Ver, também Sharma S, Zapatero-Rodríguez J, Saxena R, O’Kennedy R, Srivastava S 2018. Ultrasensitive direct impedimetric immunosensor for detection of serum HER2. Biosensors & Bioelectronics 106:78-85.
[00194] • Eletrodos de Ouro: A introdução de grupos amino através da reação com Cloridreto de Cisteamina (aq) explorando a ligação de Au/SH; lavagem; ligação covalente de nanopartículas encapadas com citrato através da formação de uma ligação amida; lavagem; imobilização de uma iodotironina deiodinase ou fragmento da mesma através da ligação covalente entre a amina primária e os resíduos de carboxilato nas nanopartículas. Ver, também Raghav R, Srivastava S, 2016. Imobilization Strategy for Enhancing Sensitivity of Immunosensors: L-Asparagine-AuNPs a Anus promising alternative of EDC-NHS activated citrate-AuNPs for antibody immobilization. Biosensors & Bioelectronics 15;78:396-403.
[00195] • Eletrodos de Ouro: A introdução dos grupos amino através da reação com Cloridreto de Cisteamina (aq) explorando a ligação de Au/SH; lavagem; ligação covalente de nanopartículas encapadas com citrato através da formação de uma ligação amida; lavagem; adição de solução aquosa de reticulador EDC (cloridreto de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida) e Sulfo-NHS (N-hidroxissulfossuccinimida); imobilização de uma iodotironina deiodinase ou fragmento da mesma através da ligação covalente entre sua amina primária e o intermediário de éster de NHS. Ver, também Raghav R, Srivastava S, 2016. Imobilization Strategy for Enhancing Sensitivity of
41 / 63 Immunosensors: L-Asparagine-AuNPs as a promising alternative of EDC- NHS activated citrate-AuNPs for antibody immobilization. Biosensors & Bioelectronics 15;78:396-403.
[00196] • Eletrodos de Ouro: A introdução de grupos amino através da reação com Cloridreto de Cisteamina (aq) explorando a ligação de Au/SH; lavagem; ligação covalente de amino e nanopartículas encapadas com citrato através da formação de uma ligação amida; lavagem; imobilização de uma iodotironina deiodinase ou fragmento da mesma através da ligação covalente através da formação da ligação amida. Ver também, Raghav R, Srivastava S,
2016. Imobilization Strategy for Enhancing Sensitivity of Immunosensors: L- Asparagine-AuNPs as a promising alternative of EDC-NHS activated citrate- AuNPs for Antibody immobilization. Biosensors & Bioelectronics 15;78:396-
403.
[00197] • Eletrodos de Ouro: A introdução dos grupos amino através da reação com cloridreto de cisteamina (aq) explorando a lavagem com au/sh; lavagem; ligação covalente de nanopartículas encapadas com citrato através da formação de uma ligação amida; lavagem; imobilização de proteína ou anticorpo através da ligação covalente através da formação de ligação amida. Ver também Raghav R, Srivastava S, 2015. Core–shell gold–silver nanoparticles based impedimetric immunosensor for cancer antigen CA125. Sensors and Actuators B: Chemical 220:557-564.
[00198] Embora os procedimentos acima sejam direcionados ao carbono e eletrodos de ouro, outros tipos de eletrodos também podem ser usados com procedimentos similares.
[00199] Em algumas modalidades, o sensor como definido na presente descrição é configurado tal que o eletrodo possa ser ligado a uma bancada, estação de trabalho eletroquímica portátil, um detector de Ressonância Plasmônica de Superfície ou um circuito de medição.
[00200] Em algumas modalidades, o sensor como definido na presente
42 / 63 descrição compreende um substrato, o substrato compreendendo pelo menos 3 eletrodos, em que os ditos eletrodos são configurados tal que estes podem ser ligados a uma estação de trabalho eletroquímica.
[00201] Em algumas modalidades, o sensor como definido na presente descrição compreende um substrato, o substrato compreendendo pelo menos 3 chips e em que os ditos chips são configurados tal que estes possam ser ligados a um detector de Ressonância Plasmônica de Superfície.
[00202] Em uma modalidade, o sensor é configurado para a detecção e/ou quantificação de um hormônio da tireoide. Métodos
[00203] A presente descrição se refere a um sensor para a detecção e/ou quantificação de um hormônio da tireoide, o sensor compreendendo uma iodotironina deiodinase [EC 1.21.99.3 e/ou EC 1.21.99.4] ou um fragmento da mesma, em que a iodotironina deiodinase é imobilizada no sensor e o uso do dito sensor para diagnóstico e/ou monitoramento de distúrbios relacionados com a tireoide.
[00204] A presente descrição se refere a um sensor para a detecção e/ou quantificação de um hormônio da tireoide, o sensor compreendendo um substrato, uma primeira iodotironina deiodinase selecionada de EC 1.21.99.4, uma segunda iodotironina deiodinase selecionadas de 1.21.99.3 e EC
1.21.99.4 e opcionalmente um anticorpo anti-rT3, em que as iodotironina deiodinases e o anticorpo anti-rT3 são imobilizados na superfície do substrato e os usos do dito sensor para diagnóstico e/ou monitoramento de distúrbios relacionados com a tireoide.
[00205] É um aspecto da descrição prover um método para diagnosticar um distúrbio relacionado com a tireoide em um sujeito compreendendo as etapas de: a) prover uma amostra obtida do sujeito, b) contatar aquele como aqui descrito com a dita amostra,
43 / 63 c) detectar o um ou mais hormônios da tireoide na amostra, d) determinar um nível e/ou concentração do dito hormônio da tireoide na amostra, desse modo diagnosticando um ou mais distúrbios relacionados com a tireoide.
[00206] É um outro aspecto da presente descrição prover um método para monitorar um distúrbio relacionado com a tireoide em um sujeito compreendendo as etapas de: a) administrar um composto que estimula a tireoide ao sujeito, b) coletar uma amostra do sujeito depois de conduzir a etapa a), c) contatar o sensor como definido na presente descrição com a dita amostra, d) medir um sinal, e) usar o sinal para determinar a concentração de um hormônio da tireoide na amostra, monitorando desse modo o distúrbio relacionado com a tireoide. Em uma modalidade particular do método como definido na presente descrição, as etapas b) a e) são realizadas mais do que uma vez.
[00207] Também é um aspecto da presente descrição prover um método para a detecção de um hormônio da tireoide em uma amostra, o método compreendendo as etapas de: a) prover uma amostra compreendendo ou suspeita de compreender um hormônio da tireoide, b) contatar o sensor aqui descrito com a dita amostra, c) medir um sinal do sensor, detectando desse modo o hormônio da tireoide.
[00208] Também é um aspecto da presente descrição prover um método para quantificação de um hormônio da tireoide em uma amostra, o
44 / 63 método compreendendo as etapas de: a. prover uma amostra compreendendo ou suspeita de compreender um hormônio da tireoide, b. contatar o sensor aqui descrito com a dita amostra, c. medir um sinal do sensor, e d. usar o sinal para determinar um nível e/ou concentração de um ou mais hormônios da tireoide na amostra detectando desse modo o hormônio da tireoide.
[00209] Em uma modalidade particular, o método para a detecção de um hormônio da tireoide em uma amostra como definido na presente descrição também compreende a etapa d) usando o sinal para determinar uma concentração do um ou mais hormônios da tireoide na amostra.
[00210] Em uma modalidade particular, os métodos como definido na presente descrição também compreendem a etapa de usar a concentração do hormônio da tireoide na amostra para calcular a concentração in vivo do hormônio da tireoide.
[00211] Em algumas modalidades do método como definido na presente descrição, a concentração do hormônio da tireoide na amostra é determinado a partir das cinéticas de reação entre o dito hormônio da tireoide e a iodotironina deiodinase.
[00212] Nas modalidades particulares, a concentração do hormônio da tireoide é determinada depois do sujeito ter recebido um medicamento compreendendo um composto que estimula a tireoide.
[00213] Em algumas modalidades particulares, o tempo depois do sujeito ter recebido o medicamento é entre 5 minutos e 48 horas, tal como entre 5 minutos e 45 horas, tal como entre 5 minutos e 40 horas, tal como entre 5 minutos e 36 horas, tal como entre 5 minutos e 32 horas, tal como entre 5 minutos e 30 horas, tal como entre 5 minutos e 28 horas, tal como entre 5 minutos e 24 horas, tal como entre 5 minutos e 20 horas, tal como
45 / 63 entre 5 minutos e 18 horas, tal como entre 5 minutos e 16 horas, tal como entre 5 minutos e 14 horas, tal como entre 5 minutos e 12 horas, tal como entre 5 minutos e 11 horas, tal como entre 5 minutos e 10 horas, tal como entre 5 minutos e 9 horas, tal como entre 5 minutos e 8 horas, tal como entre 5 minutos e 7 horas, tal como entre 5 minutos e 6 horas, tal como entre 5 minutos e 5 horas, tal como entre 5 minutos e 4 horas, tal como entre 5 minutos e 3 horas, tal como entre 5 minutos e 2 horas, tal como entre 5 minutos e 1 hora, tal como entre 5 minutos e 45 minutos, tal como entre 5 minutos e 30 minutos.
[00214] Nas modalidades particulares, o tempo depois do sujeito ter recebido o medicamento é entre 5 minutos e 48 horas, tal como entre 15 minutos e 48 horas, tal como entre 30 minutos e 48 horas, tal como entre 45 minutos e 48 horas, tal como entre 60 minutos e 48 horas, tal como entre 1 e 48 horas, tal como entre 2 e 48 horas, tal como entre 3 e 48 horas, tal como entre 4 e 48 horas, tal como entre 5 e 48 horas, tal como entre 6 e 48 horas, tal como entre 6 e 48 horas, tal como entre 7 e 48 horas, tal como entre 8 e 48 horas, tal como entre 9 e 48 horas, tal como entre 10 e 48 horas, tal como entre 11 e 48 horas, tal como entre 12 e 48 horas, tal como entre 14 e 48 horas, tal como entre 16 e 48 horas, tal como entre 18 e 48 horas, tal como entre 20 e 48 horas, tal como entre 24 e 48 horas, tal como entre 28 e 48 horas, tal como entre 32 e 48 horas, tal como entre 36 e 48 horas, tal como entre 40 e 48 horas, tal como entre 44 e 48 horas.
[00215] Em uma modalidade do método como definido na presente descrição, o sujeito não recebeu um medicamento compreendendo um hormônio estimulado pela tireoide antes de determinar a concentração do hormônio da tireoide.
[00216] Nas modalidades particulares, o método como definido na presente descrição também compreende a etapa de comparar o nível de e/ou concentração do dito hormônio da tireoide na amostra com um intervalo de
46 / 63 corte para diagnosticar um sujeito de um distúrbio relacionado com a tireoide, em que o dito intervalo de corte é determinado a partir da faixa de concentração de um hormônio da tireoide em indivíduos humanos saudáveis, tais como indivíduos humanos que não sofrem do distúrbio relacionado com a tireoide, em que o nível e/ou concentração que está fora do intervalo de corte indica a presença do dito distúrbio relacionado com a tireoide.
[00217] Em algumas modalidades do método como definido na presente descrição, o intervalo de corte para o T3 livre é de 2,8 a 4,4 pg/ml, o intervalo de corte para o T4 livre é de 0,8 a 2,0 ng/ml e o intervalo de corte para rT3 é de 10 a 24 ng/ml. Em algumas modalidades, uma concentração abaixo do intervalo de corte é considerada baixa, uma concentração dentro do intervalo de corte é considerada normal e uma concentração acima do intervalo de corte é considerada alta.
[00218] Em algumas modalidades do método como definido na presente descrição, o intervalo de corte para T3 livre é de 2,4 a 4,2 pg/ml, o intervalo de corte para T4 livre é de 0,8 a 1,8 ng/ml e o intervalo de corte para rT3 é de 10 a 24 ng/ml. Em algumas modalidades, uma concentração abaixo do intervalo de corte é considerada baixa, uma concentração dentro do intervalo de corte é considerada normal e uma concentração acima do intervalo de corte é considerada alta.
[00219] Em algumas modalidades do método como definido na presente descrição, o intervalo de corte para T3 livre é de 2,8 a 4,0 pg/ml, o intervalo de corte para T4 livre é de 0,8 a 2,2 ng/ml e o intervalo de corte para rT3 é de 10 a 24 ng/ml. Em algumas modalidades, uma concentração abaixo do intervalo de corte é considerada baixa, uma concentração dentro do intervalo de corte é considerada normal e uma concentração acima do intervalo de corte é considerada alta.
[00220] Em uma modalidade, o método como definido na presente descrição também compreende uma etapa de tratar o dito distúrbio
47 / 63 relacionado com a tireoide. Em uma modalidade particular, o tratamento compreende a administração de um medicamento em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Em uma outra modalidade, o dito medicamento é um composto que estimula a tireoide.
[00221] Em algumas modalidades, o composto que estimula a tireoide é selecionado do grupo que consiste em T3, T4, TSH, anticorpos de tireoide (TRAb, TPOAb e TgAb) e tiroglobulina. Sujeitos
[00222] É um aspecto da descrição prover um método como definido na presente descrição, em que o sujeito é um sujeito humano. Em algumas modalidades particulares, o sujeito humano é uma criança ou um adulto.
[00223] Em outras modalidades do método como definido na presente descrição, o sujeito é um cavalo, vaca, ovelha, porco, cabra, gato ou cão. Amostra
[00224] Em algumas modalidades particulares do método como definido na presente descrição, a amostra é uma amostra de sangue, uma amostra de soro ou uma amostra de plasma, opcionalmente em que a amostra foi tratada antes da análise.
[00225] Em algumas modalidades particulares, o tratamento antes da análise compreende a filtração, remoção de rT3 e/ou ajuste de pH. É entendido pela pessoa habilitada na técnica que a filtragem das amostras, tais como amostra de sangue, podem prover meios para remover células sanguíneas. O ajuste do pH pode ser realizada através da adição de um ácido ou base adequados para a amostra até um pH desejado ser obtido. Os ácidos e bases adequados para o ajuste do pH são conhecidos à pessoa habilitada na técnica. Tecnologias de Detecção
[00226] Em algumas modalidades dos métodos como definido na presente descrição, o hormônio da tireoide é detectado usando Ressonância
48 / 63 Plasmônica de Superfície (SPR). Em algumas modalidades particulares, a leitura da Ressonância Plasmônica de Superfície é usada para determinar a concentração de um ou mais dos hormônios da tireoide.
[00227] A Ressonância Plasmônica de Superfície é a oscilação ressonante dos elétrons de condução na interface entre o material de permissividade negativo e positivo estimulado pela luz incidente. SPR é a base de muitas ferramentas padrão para a adsorção de medição do material em superfícies de metal planar (tal como ouro ou prata) ou na superfície das nanopartículas metálicas. Este é o princípio fundamental por trás de muitas aplicações de biossensor com base em cores, sensores diferentes e fotossíntese de diátomo. A SPR pode ser usada para detectar as interações de ligação biomolecular. Na SPR, um parceiro molecular tal como uma proteína é imobilizada em uma película metálica. A luz excita os plasmons de superfície no metal; quando o parceiro de ligação liga à molécula imobilizada, este causa uma mudança detectável no sinal da superfície plasmônica.
[00228] Em algumas modalidades dos métodos como definido na presente descrição, a iodotironina deiodinase é imobilizada em uma superfície metálica ou uma camada de nanopartículas em um substrato. Em algumas modalidades, o dito substrato é um chip de vidro.
[00229] Em algumas modalidades dos métodos como definido na presente descrição, o hormônio da tireoide é detectado ou monitorado através da transdução eletroquímica.
[00230] Os biossensores eletroquímicos, também indicados como biossensores utilizando a transdução eletroquímica provêm um meio atrativo para analisar o teor de uma amostra biológica devido à conversão direta de um evento biológico a um sinal eletrônico. As técnicas mais comuns no bio- sensoriamento eletroquímico compreendem voltametria cíclica, cronoamperometria, cronopotenciometria, espectroscopia de impedância e métodos com base em transistor de efeito de campo junto com
49 / 63 biossensoriamento com base em nanopartícula magnética de nanofios. As técnicas de medição adicionais úteis em combinação com a detecção eletroquímica também podem compreender as versões eletroquímicas da Ressonância Plasmônica de Superfície, espectroscopia de modo de luz guiado por onda ótica, elipsometria, microequilíbrio de cristal de quartzo e microscopia de sonda de varredura.
[00231] A transdução eletroquímica e o desempenho geral dos sensores eletroquímicos são frequentemente determinados pelas arquiteturas de superfície que conectam o eletrodo à amostra biológica na escala nanométrica. As modificações da superfície do eletrodo, os vários mecanismos de transdução eletroquímica e a escolha do elemento biológico ligado ao eletrodo, todos influenciam a sensibilidade final do sensor. Distúrbios relacionados com a tireoide
[00232] Em algumas modalidades, o distúrbio relacionado com a tireoide é selecionado da lista; hipotireoidismo, hipertireoidismo, depressão clínica, Goitre, doença de Graves-Basedow, Tireoidite de Hashimoto, doença eutireoidiana e síndrome T3 polar.
[00233] Em algumas modalidades particulares, o hipertireoidismo é distinguido pelo alto teor de T4 livre, alto teor de T3 livre e baixo teor de TSH. Em uma modalidade, a doença eutireoidiana é distinguida por um baixo teor de T3 livre e alto teor de rT3. Em uma outra modalidade, o hipotireoidismo é primário ou secundário. Em uma modalidade, o hipotireoidismo primário é distinguido por um baixo teor de T4 livre, baixo teor ou teor normal de T3 livre e alto teor de TSH. Em uma modalidade, o hipotireoidismo secundário é distinguido por um baixo teor de T4 livre, baixo teor ou teor normal de T3 livre e baixo teor ou teor normal de TSH. Dispositivo doméstico
[00234] É um outro aspecto do presente, prover um dispositivo portátil para a detecção, quantificação e/ou monitoramento de um hormônio da
50 / 63 tireoide, em que o hormônio da tireoide é selecionado dos grupos que consistem de fT3, fT4 e rT3, o dispositivo compreendendo: a. uma entrada para uma amostra; b. um sensor compreendendo: i. um substrato, ii. uma primeira iodotironina deiodinase selecionada de EC
1.21.99.3 e EC 1.21.99.4, e iii. uma segunda iodotironina deiodinase selecionada de EC
1.21.99.4, c. um detector configurado para receber um sinal do sensor e transformar este em um formato legível por um usuário; d. opcionalmente, meios para separar componentes celulares da amostra.
[00235] É um outro aspecto do presente, prover um dispositivo portátil para a detecção, quantificação e/ou monitoramento de um hormônio da tireoide, em que o hormônio da tireoide é selecionado do grupo que consiste em fT3, fT4 e rT3, o dispositivo compreendendo: e. uma entrada para uma amostra; f. um sensor compreendendo: i. um substrato, ii. uma primeira iodotironina deiodinase selecionada de EC
1.21.99.3 e EC 1.21.99.4, iii. uma segunda iodotironina deiodinase selecionada de EC
1.21.99.4, e iv. um anticorpo anti-rT3, g) um detector configurado para receber um sinal do sensor e transformar este em um formato legível por um usuário; h) opcionalmente, meios para separar componentes celulares da amostra.
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[00236] É um outro aspecto da presente descrição prover um dispositivo portátil para a detecção, quantificação e/ou monitoramento de um hormônio da tireoide, em que o hormônio da tireoide é selecionado dos grupos que consistem de fT3, fT4 e rT3, o dispositivo compreendendo: a) uma entrada para uma amostra; b) um sensor compreendendo uma iodotironina deiodinase [EC
1.21.99.3 e/ou EC 1.21.99.4] ou um fragmento da mesma, em que a iodotironina deiodinase é imobilizada no sensor e em que a entrada é configurada para colocar a amostra em contato com o sensor; c) um detector configurado para receber um sinal do sensor e transformar este em um formato legível por um usuário; d) opcionalmente, meios para separar componentes celulares da amostra.
[00237] e) em algumas modalidades particulares, o dispositivo portátil como definido na presente descrição compreende o sensor como definido em qualquer uma das modalidades da presente descrição. Itens
[00238] 1. Um sensor para quantificação de um hormônio da tireoide, o sensor compreendendo uma iodotironina deiodinase [EC 1.21.99.3 e/ou EC
1.21.99.4] ou um fragmento da mesma, em que a iodotironina deiodinase é imobilizada no sensor.
[00239] 2. Um sensor para a detecção de um hormônio da tireoide, o sensor compreendendo uma iodotironina deiodinase [EC 1.21.99.3 e/ou EC
1.21.99.4] ou um fragmento da mesma, em que a iodotironina deiodinase é imobilizada no sensor.
[00240] 3. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, em que a iodotironina deiodinase é mamífera.
[00241] 4. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, em que a iodotironina deiodinase é humana.
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[00242] 5. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, em que a iodotironina deiodinase é conjugada a uma porção adicional.
[00243] 6. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, em que a porção adicional é um peptídeo.
[00244] 7. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, em que a porção adicional é um rótulo.
[00245] 8. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, em que o sensor compreende entre 10 e 100 IU de uma iodotironina deiodinase.
[00246] 9. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, em que a iodotironina deiodinase é iodotironina deiodinase tipo 2 [EC 1.21.99.3].
[00247] 10. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, em que a iodotironina deiodinase é iodotironina deiodinase tipo 3 [EC 1.21.99.4].
[00248] 11. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, em que o sensor compreende tanto iodotironina deiodinase tipo 2 quanto iodotironina deiodinase tipo 3.
[00249] 12. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, em que a iodotironina deiodinase tipo 1 compreende ou consiste em um polipeptídeo tendo pelo menos 95 % de identidade de sequência, tal como pelo menos 96 % de identidade de sequência, tal como pelo menos 97 % de identidade de sequência, tal como pelo menos 98 % de identidade de sequência, tal como pelo menos 99 % de identidade de sequência, tal como cerca de 100 % de identidade de sequência para a SEQ ID NO: 1 ou um fragmento da mesma.
[00250] 13. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, em que a iodotironina deiodinase tipo 2 compreende ou consiste
53 / 63 em um polipeptídeo tendo pelo menos 95 % de identidade de sequência, tal como pelo menos 96 % de identidade de sequência, tal como pelo menos 97 % de identidade de sequência, tal como pelo menos 98 % de identidade de sequência, tal como pelo menos 99 % de identidade de sequência, tal como cerca de 100 % de identidade de sequência para a SEQ ID NO: 2 ou um fragmento da mesma.
[00251] 14. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, em que a iodotironina deiodinase tipo 3 compreende ou consiste em um polipeptídeo tendo pelo menos 95 % de identidade de sequência, tal como pelo menos 96 % de identidade de sequência, tal como pelo menos 97 % de identidade de sequência, tal como pelo menos 98 % de identidade de sequência, tal como pelo menos 99 % de identidade de sequência, tal como cerca de 100 % de identidade de sequência para a SEQ ID NO: 3 ou um fragmento da mesma.
[00252] 15. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, em que a iodotironina deiodinase é recombinantemente produzida, tal como por intermédio da expressão isenta de células.
[00253] 16. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, em que o hormônio da tireoide é selecionado dentre T4 livre, T3 livre e T3 reverso (rT3).
[00254] 17. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, em que o sensor compreende um substrato e em que o substrato é um eletrodo ou um chip.
[00255] 18. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, em que o chip é um chip de vidro.
[00256] 19. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, em que o substrato tem uma superfície modificada.
[00257] 20. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, em que o eletrodo é feito de carbono, ouro ou platina.
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[00258] 21. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, em que o eletrodo é um eletrodo serigrafado.
[00259] 22. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, em que pelo menos uma superfície do substrato é revestida com uma camada de ouro.
[00260] 23. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, em que pelo menos uma superfície do substrato é modificada com nanopartículas selecionadas do grupo que consiste em ouro, prata, óxido de cobre, grafeno, óxido de ferro e combinações dos mesmos.
[00261] 24. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, em que pelo menos uma superfície do substrato é revestida com uma camada de ouro e em que a dita superfície é novamente modificada com nanopartículas selecionadas do grupo que consiste em ouro, prata, óxido de cobre, grafeno, óxido de ferro e combinações dos mesmos.
[00262] 25. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, em que a iodotironina deiodinase é imobilizada no substrato.
[00263] 26. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, em que a iodotironina deiodinase é imobilizada no substrato através de um ligante compreendendo uma nanopartícula.
[00264] 27. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, em que a iodotironina deiodinase é imobilizada no substrato através de um ligante compreendendo: a. uma ligação de cisteamina ao substrato, e b. uma ligação de nanopartícula à cisteamina e à iodotironina deiodinase, opcionalmente através de uma ou mais cisteaminas adicionais.
[00265] 28. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, configurado tal que o substrato pode ser ligado a uma bancada, estação de trabalho eletroquímica portátil, um detector de Ressonância Plasmônica de Superfície ou um circuito de medição.
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[00266] 29. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, em que o substrato é um eletrodo e em que o dito eletrodo é configurado tal que este pode ser ligado a uma estação de trabalho eletroquímica.
[00267] 30. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, em que o substrato é um chip e em que o dito chip é configurado tal que este pode ser ligado a um detector de Ressonância Plasmônica de Superfície.
[00268] 31. O sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores, em que o sensor é configurado para a detecção e/ou quantificação de um hormônio da tireoide.
[00269] 32. Um método para diagnosticar um distúrbio relacionado com a tireoide em um sujeito compreendendo as etapas de: a. prover uma amostra obtida do sujeito, b. contatar o sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores com a dita amostra, c. detectar o um ou mais hormônios da tireoide na amostra, d. determinar um nível e/ou concentração do dito hormônio da tireoide na amostra, desse modo diagnosticando um ou mais distúrbios relacionados com a tireoide.
[00270] 33. Um método para monitorar um distúrbio relacionado com a tireoide em um sujeito compreendendo as etapas de: a. administrar um composto que estimula a tireoide ao sujeito, b. coletar uma amostra do sujeito depois de conduzir a etapa a., c. contatar o sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores com a dita amostra, d. medir um sinal,
56 / 63 e. usar o sinal para determinar a concentração de um hormônio da tireoide na amostra, monitorando desse modo o distúrbio relacionado com a tireoide.
[00271] 34. O método como definido no item 32, em que as etapas b. a e. são realizadas mais do que uma vez.
[00272] 35. Um método para a detecção de um hormônio da tireoide em uma amostra, o método compreendendo as etapas de: a. prover uma amostra compreendendo ou suspeita de compreender um hormônio da tireoide, b. contatar o sensor como definido em qualquer um dos itens anteriores com a dita amostra, c. medir um sinal do sensor, detectando desse modo o hormônio da tireoide.
[00273] 36. O método como definido no item 34 também compreendendo a etapa d. usando o sinal para determinar uma concentração do um ou mais hormônios da tireoide na amostra.
[00274] 37. O método como definido no item 35 também compreendendo a etapa de usar a concentração do hormônio da tireoide na amostra para calcular a concentração in vivo do hormônio da tireoide.
[00275] 38. O método como definido em qualquer um dos itens de 31 a 36, em que a concentração do hormônio da tireoide na amostra é determinado a partir das cinéticas de reação entre o dito hormônio da tireoide e a iodotironina deiodinase.
[00276] 39. O método como definido em qualquer um dos itens de 31 a 37, em que a concentração do hormônio da tireoide é determinado depois do sujeito ter recebido um medicamento compreendendo um composto que estimula a tireoide.
[00277] 40. O método como definido em qualquer um dos itens 31 a
57 / 63 38, em que o tempo depois do sujeito ter recebido o medicamento é entre 5 minutos e 48 horas.
[00278] 41. O método como definido em qualquer um dos itens de 31 a 39, também compreendendo a etapa de comparar o nível e/ou concentração do dito hormônio da tireoide na amostra com um intervalo de corte para diagnosticar um sujeito de um distúrbio relacionado com a tireoide, em que o dito intervalo de corte é determinado a partir da faixa de concentração de um hormônio da tireoide em indivíduos humanos saudáveis, tal como indivíduos humanos que não sofrem do distúrbio relacionado com a tireoide, em que o nível e/ou concentração que está fora do intervalo de corte indica a presença do dito distúrbio relacionado com a tireoide.
[00279] 42. O método como definido em qualquer um dos itens de 31 a 40, em que o intervalo de corte para T3 livre é de 2,8 a 4,4 pg/ml.
[00280] 43. O método como definido em qualquer um dos itens de 31 a 40, em que o intervalo de corte para T4 livre é de 0,8 a 2,0 ng/ml.
[00281] 44. O método como definido em qualquer um dos itens de 31 a 40, em que o intervalo de corte para rT3 é de 10 a 24 ng/ml.
[00282] 45. O método como definido em qualquer um de qualquer um dos itens de 31 a 43, em que uma concentração abaixo do intervalo de corte é considerada baixa, uma concentração dentro do intervalo de corte é considerada normal e uma concentração acima do intervalo de corte é considerada alta.
[00283] 46. O método como definido em qualquer um dos itens de 31 a 44, também compreendendo uma etapa de tratar o dito distúrbio relacionado com a tireoide.
[00284] 47. O método como definido no item 45, em que o tratamento compreende a administração de um medicamento em uma quantidade terapeuticamente eficaz.
[00285] 48. O método como definido no item 46, em que o
58 / 63 medicamento é um composto que estimula a tireoide.
[00286] 49. O método como definido em qualquer um dos itens de 31 a 47, em que o composto que estimula a tireoide é selecionado dentre um grupo que consiste em T3, T4, TSH, autoanticorpos de tireoide (TRAb, TPOAb e TgAb) e tiroglobulina.
[00287] 50. O método como definido em qualquer um dos itens de 31 a 48, em que o sujeito é um sujeito humano.
[00288] 51. O método como definido em qualquer um dos itens de 31 a 49, em que o sujeito humano é uma criança ou um adulto.
[00289] 52. O método como definido em qualquer um dos itens de 31 a 50, em que o sujeito é um cavalo, vaca, ovelha, porco, cabra, gato ou cão.
[00290] 53. O método como definido em qualquer um dos itens de 31 a 51, em que a amostra é uma amostra de sangue, uma amostra de soro ou uma amostra de plasma, opcionalmente em que a amostra foi tratada antes da análise.
[00291] 54. O método como definido em qualquer um dos itens de 31 a 52, em que o tratamento antes da análise compreende a filtração, remoção da rT3 e/ou ajuste do pH.
[00292] 55. O método como definido em qualquer um dos itens de 31 a 53, em que o hormônio da tireoide é detectado usando Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR).
[00293] 56. O método como definido em qualquer um dos itens de 31 a 54, em que a leitura de SPR é usada para determinar a concentração de uma ou mais dos hormônios da tireoide.
[00294] 57. O método como definido em qualquer um dos itens de 31 a 55, em que a iodotironina deiodinase é imobilizada em um chip ou em um eletrodo.
[00295] 58. O método como definido em qualquer um dos itens de 31 a 56, em que o hormônio da tireoide é detectado ou monitorado pela transdução
59 / 63 eletroquímica.
[00296] 59. O método como definido em qualquer um dos itens de 31 a 57, em que o distúrbio relacionado com a tireoide é selecionado da lista; hipotireoidismo, hipertireoidismo, depressão clínica, Goitre, doença de readota Graves-Basedow, Tireoidite de Hashimoto, doença eutireoidiana e síndrome T3 Polar.
[00297] 60. O método como definido no item 58, em que o hipertireoidismo é distinguido por um alto teor de T4 livre, alto teor de T3 livre e baixo teor de TSH.
[00298] 61. O método como definido no item 58, em que a doença eutireoidiana é distinguida por um baixo teor de T3 livre e alto teor de rT3.
[00299] 62. O método como definido no item 58, em que o hipotireoidismo é primário ou secundário.
[00300] 63. O método como definido no item 61, em que o hipotireoidismo primário é distinguido por um baixo teor de T4 livre, baixo teor ou teor normal de T3 livre e alto teor de TSH.
[00301] 64. O método como definido no item 61, em que o hipotireoidismo secundário é distinguido por um baixo teor de T4 livre, baixo teor ou teor normal de T3 livre e baixo teor ou teor normal de TSH.
[00302] 65. Um método para fabricar um sensor compreendendo uma iodotironina deiodinase, o método compreendendo: a. prover um substrato, b. prover o pelo menos uma iodotironina deiodinase, c. imobilizar a iodotironina deiodinase no substrato, fabricando desse modo um sensor compreendendo a iodotironina deiodinase.
[00303] 66. O método como definido no item 64, em que o substrato é como definido em qualquer um dos itens anteriores.
[00304] 67. O método como definido em qualquer um dos itens de 64 a
60 / 63 65, em que a iodotironina deiodinase é como definida em qualquer um dos itens anteriores.
[00305] 68. Um dispositivo portátil para a detecção, quantificação e/ou monitoramento de um hormônio da tireoide, o dispositivo compreendendo: a. uma entrada para uma amostra; b. um sensor compreendendo uma iodotironina deiodinase [EC
1.21.99.3 e/ou EC 1.21.99.4] ou um fragmento da mesma, em que a iodotironina deiodinase é imobilizada no sensor e em que a entrada é configurada para colocar a amostra em contato com o sensor; c. um detector configurado para receber um sinal do sensor e transformar este em um formato legível por um usuário; d. opcionalmente, meios para separar componentes celulares da amostra.
[00306] 69. O dispositivo portátil como definido no item 67, em que o sensor é como definido em qualquer um dos itens anteriores.
[00307] 70. O dispositivo portátil como definido em qualquer um dos itens de 67 e 68, em que a iodotironina deiodinase é como definida em qualquer um dos itens anteriores. Exemplos Exemplo 1. Estimativa de T4 usando um biossensor amperométrico de
[00308] A IDII foi extraída do cérebro de um rato como fração microssômica bruta e foi usada para fabricar um biossensor amperométrico.
[00309] O Analisador Eletroquímico CH604E/Estação de Trabalho (instrumentos CH) foram utilizados para fabricar o biossensor eletroquímico. Os eletrodos de carbono foram amino-funcionalizados com 10 ul (3- Aminopropil)trietoxissilano (5mM, APTES) e incubados por 2 horas no escuro. Os eletrodos foram lavados com água duplo-destilada para remover os 3-APTES não ligados seguido pela adição de 0,5 µg de AuNPs encapado com
61 / 63 citrato. A superfície de NPs foi encapada com amino usando 20 μg de 2 mg/ml de cloridreto de cisteamina com 2 horas de incubação e lavagem seguido por 10 µL do agente de reticulação (solução aquosa a 10 % (v/v) de glutaraldeído) que foi então secada com ar. Finalmente, o extrato bruto de cérebro de rato (fração microssômica) foi adicionado ao eletrodo e deixado secar por 2 horas na temperatura ambiente. A Figura 3 mostra o efeito da concentração de T4 na presente resposta.
[00310] Resultados: Uma variação linear da corrente com uma concentração crescente de T4 foi observada. Exemplo 2. Estimativa de T4 usando um biossensor voltamétrico de IDII
[00311] As medições voltamétricas cíclicas para quantificação de T4 foram mostradas na Figura 4.
[00312] Resultados: Conforme a concentração de T4 aumenta, a corrente do pico de oxidação diminui. Exemplo 3. T4 Livre vs. ligado
[00313] Nós também estudamos a interferência da globulina de ligação à tiroxina (TBG) na detecção de T4. A Figura 5 mostra que com a concentração crescente de TBG, a presente resposta diminui.
[00314] Resultados: Os dados demonstram que a enzima catalisa somente a deiodinação de fT4 e não a forma ligada (tT4). Desse modo, esta estratégia permite a estimativa direta de fT4. Exemplo 4. Interferência das Proteínas do Soro
[00315] As medições voltamétricas cíclicas foram realizadas na presença de soro fetal de bezerro para estudar a interferência das proteínas do soro na quantificação. A Figura 6 demonstra estas medições no soro fetal de bezerro com concentrações crescentes de T4.
[00316] Resultados: Os dados demonstram que as correntes dos picos de oxidação ainda seguem uma tendência consistente, desse modo superando o efeito das proteínas do soro na medição.
62 / 63 Exemplo 5. Estimativa de fT3 e fT4 usando um Biossensor Voltamétrico de IDII-IDIII-anti-rT3
[00317] A IDII e IDIII são extraídas do cérebro do rato como fração microssômica bruta e são usadas para fabricar um biossensor amperométrico.
[00318] A IDII é diretamente ligada a uma superfície do eletrodo 1, em que a dita superfície de eletrodo 1 modificada com as nanopartículas ou em que a dita superfície do eletrodo é modificada com uma camada de ouro ou em que a dita superfície do eletrodo foi enrugada através de outros meios conhecidos às pessoas habilitadas na técnica.
[00319] A IDIII é diretamente ligada a uma superfície do eletrodo 2, em que a dita superfície do eletrodo 2 modificada com nanopartículas ou em que a dita superfície do eletrodo é modificada com uma camada de ouro ou em que a dita superfície do eletrodo foi enrugada através de outros meios conhecidos às pessoas habilitadas na técnica.
[00320] O anticorpo anti-rT3 é diretamente ligado a uma superfície de eletrodo 3, em que a dita superfície do eletrodo 3 modificada com nanopartículas ou em que a dita superfície do eletrodo é modificada com uma camada de ouro ou em que a dita superfície do eletrodo foi enrugada por outros meios conhecidos às pessoas habilitadas na técnica. Os anticorpos anti- rT3 comercialmente disponíveis são usados (por exemplo: anticorpo monoclonal anti-rT3, LifeSpan BioScience, Inc. (US); rT3 / Triiodotironina Anticorpo Policlonal Reverso, LifeSpan BioScience, Inc. (US); Anticorpo Anti-Triiodotironina reversa, MyBioSource.com (US); Triiodotironina reversa (rT3) Anticorpo Monoclonal, Biomatik (US); Triiodotironina reversa (rT3) Anticorpo Policlonal Biomatik (US)).
[00321] O analisador eletroquímico CH604E/Estação de Trabalho (instrumentos CH) utilizados para fabricar o biossensor eletroquímico.
[00322] DIO2 deiodinases T4 e rT3 na amostra no eletrodo 1 e, portanto, medem a soma de [T4 + rT3].
63 / 63
[00323] DIO3 deiodinases T4 e T3 na amostra no eletrodo 2 e, portanto, medem a soma de [T4 + T3].
[00324] Anti-rT3 ligam a rT3 e consequentemente mede [rT3].
[00325] Com base em [T4 + rT3], [T4 + T3] e [rT3] obtidos, é possível determinar matematicamente [T4] e [T3].
Claims (78)
1. Sensor para quantificação de um hormônio da tireoide, o sensor caracterizado pelo fato de que compreende: a. um substrato, e b. uma combinação de pelo menos 2 iodotironina deiodinases e opcionalmente um anticorpo anti-rT3, imobilizados em uma superfície do substrato, em que a combinação compreende: iodotironina deiodinase tipo 1, iodotironina deiodinase tipo 2 e anticorpo anti-rT3, iodotironina deiodinase tipo 2, iodotironina deiodinase tipo 3 e anticorpo anti-rT3, ou iodotironina deiodinase tipo 1, iodotironina deiodinase tipo 2 e iodotironina deiodinase tipo 3.
2. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o substrato compreende superfícies múltiplas para a imobilização das pelo menos 2 iodotironina deiodinase, tal como uma primeira superfície do substrato e uma segunda superfície do substrato.
3. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a primeira iodotironina deiodinase é imobilizada na primeira superfície do substrato e a segunda iodotironina deiodinase é imobilizada na segunda superfície do substrato.
4. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-rT3 é imobilizado em uma terceira superfície do substrato.
5. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o hormônio da tireoide é selecionado dentre T4 livre, T3 livre, T3 reverso (rT3) e combinações dos
2 / 12 mesmos.
6. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o substrato é uma ou mais eletrodos e/ou chips.
7. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o substrato compreende pelo menos 1 eletrodo, tal como pelo menos 2 eletrodos, tal como pelo menos 3 eletrodos.
8. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o substrato compreende pelo menos 1 chip, tal como pelo menos 2 chips, tal como pelo menos 3 chips.
9. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o substrato compreende ou consiste em 3 eletrodos e em que a primeira superfície é uma superfície de um primeiro eletrodo, a segunda superfície é uma superfície de um segundo eletrodo e a terceira superfície é uma superfície de um terceiro eletrodo.
10. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o substrato compreende ou consiste em 3 chips e em que a primeira superfície é uma superfície de um primeiro chip, a segunda superfície é uma superfície de um segundo chip e a terceira superfície é uma superfície de um terceiro chip.
11. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o eletrodo é feito de carbono, ouro ou platina.
12. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o eletrodo é um eletrodo serigrafado.
13. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o chip é um chip de vidro.
14. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações
3 / 12 anteriores, caracterizado pelo fato de que a primeira, segunda e/ou terceira superfícies do substrato é uma superfície modificada.
15. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a superfície modificada é uma superfície compreendendo uma pluralidade de características topográficas no tamanho nanométrico e/ou micrométrico.
16. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de características topográficas no tamanho nanométrico e/ou micrométrico são selecionadas do grupo que consiste em: micropartículas, nanopartículas, microfios, nanofios, microtubos, nanotubos, microbastões, nanobastões e combinações dos mesmos.
17. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de características topográficas no tamanho nanométrico e/ou micrométrico foram geradas na superfície do substrato montando-se a dita superfície por sinterização.
18. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de características topográficas no tamanho nanométrico e/ou micrométrico foi gerada na superfície do substrato através da gravura em superfície.
19. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de características topográficas no tamanho nanométrico e/ou micrométrico foram geradas na superfície do substrato através da deposição de partícula.
20. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a superfície modificada é uma superfície revestida com uma camada de ouro.
21. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a superfície modificada é uma
4 / 12 superfície modificada com nanopartículas selecionadas do grupo que consiste em ouro, prata, óxido de cobre, grafeno, óxido de ferro e combinações dos mesmos.
22. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a superfície modificada é uma superfície revestida com uma camada de ouro e em que a dita superfície é novamente modificada com nanopartículas selecionadas do grupo que consiste em ouro, prata, óxido de cobre, grafeno, óxido de ferro e combinações dos mesmos.
23. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as pelo menos 2 iodotironina deiodinases são imobilizadas na superfície através de um ligante compreendendo uma nanopartícula.
24. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as pelo menos 2 iodotironina deiodinases e/ou o anticorpo anti-rT3, são imobilizados no substrato através de um ligante compreendendo uma ligação coordenada covalente de níquel- histidina (Ni-His).
25. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as pelo menos 2 iodotironina deiodinases e/ou o anticorpo anti-rT3, são imobilizadas no substrato através de um ligante compreendendo: a. uma ligação de cisteamina ao substrato, e b. uma ligação de nanopartícula à cisteamina e à iodotironina deiodinase, opcionalmente através de uma ou mais cisteaminas adicionais.
26. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as pelo menos 2 iodotironina deiodinases e/ou o anticorpo anti-rT3 são mamíferas.
27. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações
5 / 12 anteriores, caracterizado pelo fato de que as pelo menos 2 iodotironina deiodinases e/ou o anticorpo anti-rT3 são humanos.
28. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as pelo menos 2 iodotironina deiodinases e/ou o anticorpo anti-rT3 são recombinantemente produzidos, tais como por intermédio da expressão isenta de células.
29. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as pelo menos 2 iodotironina deiodinases e/ou o anticorpo anti-rT3 são cada um individualmente conjugados a uma porção adicional.
30. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a porção adicional é um peptídeo, tal como uma etiqueta de peptídeo, tal como uma etiqueta de Histidina.
31. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a porção adicional é um rótulo.
32. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o sensor compreende entre 10 e 100 IU de cada uma das pelo menos 2 iodotironina deiodinases.
33. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o sensor compreende entre 10 e 100 IU de iodotironina deiodinases do tipo 1 e tipo 2.
34. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o sensor compreende entre 10 e 100 IU das iodotironina deiodinases tipo 2 e tipo 3.
35. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o sensor compreende entre 10 e 100 IU de iodotironina deiodinases tipo 1 e tipo 3.
36. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é configurado tal que o substrato
6 / 12 pode ser ligado a uma bancada, estação de trabalho eletroquímica portátil, um detector de Ressonância Plasmônica de Superfície ou um circuito de medição.
37. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o substrato compreende pelo menos 3 eletrodos e em que os ditos eletrodos são configurados tal que estes podem ser ligados a uma estação de trabalho eletroquímica.
38. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o substrato compreende pelo menos 3 chips e em que os ditos chips são configurados de modo que estes possam ser ligados a um detector de Ressonância Plasmônica de Superfície.
39. Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o sensor é configurado para quantificação de um hormônio da tireoide.
40. Método para quantificação de um hormônio da tireoide em uma amostra, caracterizado pelo fato de que o método compreende as etapas de: a. prover uma amostra compreendendo ou suspeita de compreender um hormônio da tireoide, b. contatar o sensor como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores com a dita amostra, c. medir um sinal do sensor, e d. usar o sinal para determinar um nível e/ou concentração do um ou mais hormônios da tireoide na amostra detectando desse modo o hormônio da tireoide.
41. Método para diagnosticar um distúrbio relacionado com a tireoide em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. prover uma amostra obtida do sujeito, b. determinar um nível e/ou concentração do dito hormônio da
7 / 12 tireoide na amostra usando o método como definido na reivindicação 40, desse modo diagnosticando um ou mais distúrbios relacionados com a tireoide.
42. Método para monitorar um distúrbio relacionado com a tireoide em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. administrar um composto que estimula a tireoide ao sujeito, b. coletar uma amostra do sujeito depois de conduzir a etapa a., c. determinar o nível e/ou concentração do dito hormônio da tireoide na amostra usando o método como definido na reivindicação 40, monitorando desse modo o distúrbio relacionado com a tireoide.
43. Método de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que as etapas a. a c. são realizadas mais do que uma vez.
44. Uso do sensor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, caracterizado pelo fato de que é para quantificação dos hormônios da tireoide.
45. Uso de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que a quantificação de hormônios da tireoide é conduzida conforme o método como definido na reivindicação 40.
46. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 42, caracterizado pelo fato de que também compreende a etapa de usar a concentração do hormônio da tireoide na amostra para calcular a concentração in vivo do hormônio da tireoide.
47. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 46, caracterizado pelo fato de que o nível e/ou concentração do hormônio da tireoide na amostra é determinado a partir das a cinéticas de reação entre o dito hormônio da tireoide e a iodotironina deiodinase.
8 / 12
48. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 47, caracterizado pelo fato de que a concentração do hormônio da tireoide é determinada depois do sujeito ter recebido um medicamento compreendendo um composto que estimula a tireoide.
49. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 48, caracterizado pelo fato de que o tempo depois do sujeito ter recebido o medicamento é entre 5 minutos e 48 horas.
50. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 49, caracterizado pelo fato de que também compreende uma etapa de comparar o nível e/ou concentração do dito hormônio da tireoide na amostra com um intervalo de corte para diagnosticar um sujeito de um distúrbio relacionado com a tireoide, em que o dito intervalo de corte é determinado a partir da faixa de concentração de um hormônio da tireoide em indivíduos humanos saudáveis, tal como indivíduos humanos que não sofrem do distúrbio relacionado com a tireoide, em que o nível e/ou concentração que está fora do intervalo de corte indica a presença do dito distúrbio relacionado com a tireoide.
51. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o intervalo de corte para T3 livre é de 2,8 a 4,4 pg/ml.
52. Método de acordo com a reivindicação 50 ou 51, caracterizado pelo fato de que o intervalo de corte para T4 livre é de 0,8 a 2,0 ng/ml.
53. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 52, caracterizado pelo fato de que o intervalo de corte para rT3 é de 10 a 24 ng/ml.
54. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 53, caracterizado pelo fato de que uma concentração abaixo do intervalo de corte é considerada baixa, uma concentração dentro do intervalo de corte é
9 / 12 considerada normal e uma concentração acima o intervalo de corte é considerada alta.
55. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 54, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa de tratar o dito distúrbio relacionado com a tireoide.
56. Método de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o tratamento compreende a administração de um medicamento em uma quantidade terapeuticamente eficaz.
57. Método de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o medicamento é um composto que estimula a tireoide.
58. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 57, caracterizado pelo fato de que o composto estimulador de tireoide é selecionado dentre um grupo que consiste em T3, T4, TSH, anticorpos de tireoide (TRAb, TPOAb e TgAb) e tiroglobulina.
59. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 58, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um sujeito humano.
60. Método de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o sujeito humano é uma criança ou um adulto.
61. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 60, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um cavalo, vaca, ovelha, porco, cabra, gato ou cão.
62. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 61, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra de sangue, uma amostra de soro ou um amostra de plasma, opcionalmente em que a amostra tem foi tratada antes da análise.
63. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 62, caracterizado pelo fato de que o tratamento antes da análise compreende filtração, remoção de rT3 e/ou ajuste de pH.
64. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações
10 / 12 40 a 63, caracterizado pelo fato de que o hormônio da tireoide é detectado usando Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR).
65. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 64, caracterizado pelo fato de que a leitura da SPR é usada para determinar a concentração de um ou mais dos hormônios da tireoide.
66. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 65, caracterizado pelo fato de que o hormônio da tireoide é quantificado ou monitorado pela transdução eletroquímica.
67. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 66, caracterizado pelo fato de que o distúrbio relacionado com a tireoide é selecionado da lista; hipotireoidismo, hipertireoidismo, depressão clínica, Goitre, doença de Graves-Basedow, Tireoidite de Hashimoto, doença eutireoidiana e síndrome T3 polar.
68. Método de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que o hipertireoidismo é distinguido por um alto teor de T4 livre, alto teor de T3 livre e baixo teor de TSH.
69. Método de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que a doença eutireoidiana é distinguida por um baixo teor de T3 livre e alto teor de rT3.
70. Método de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que o hipotireoidismo é primário ou secundário.
71. Método de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que o hipotireoidismo primário é distinguido por um baixo teor de T4 livre, baixo teor ou teor normal de T3 livre e alto teor de TSH.
72. Método de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que o hipotireoidismo secundário é distinguido por um baixo teor de T4 livre, baixo teor ou teor normal de T3 livre e baixo teor ou teor normal de TSH.
73. Método para fabricar um sensor compreendendo pelo
11 / 12 menos 2 iodotironina deiodinases, o método caracterizado pelo fato de que compreende: a. prover um substrato, b. prover uma combinação das pelo menos 2 iodotironina deiodinases e opcionalmente um anticorpo anti-rT3, c. imobilizando as iodotironina deiodinases e o anticorpo anti- rT3 na superfície do substrato, em que a combinação compreende: iodotironina deiodinase tipo 1, iodotironina deiodinase tipo 2 e anticorpo anti-rT3, iodotironina deiodinase tipo 2, iodotironina deiodinase tipo 3 e anticorpo anti-rT3, ou iodotironina deiodinase tipo 1, iodotironina deiodinase tipo 2 e iodotironina deiodinase tipo 3, fabricando desse modo um sensor compreendendo pelo menos 2 iodotironina deiodinases.
74. Método de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que o substrato é como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores.
75. Método de acordo com a reivindicação 73 ou 74, caracterizado pelo fato de que as pelo menos 2 iodotironina deiodinases são como definidas em qualquer uma das reivindicações anteriores.
76. Dispositivo portátil para quantificação e/ou monitoramento de um hormônio da tireoide, caracterizado pelo fato de que o dispositivo compreende: a. uma entrada para uma amostra; b. sensor compreendendo: i.um substrato, e ii. uma combinação de pelo menos 2 iodotironina deiodinases
12 / 12 e opcionalmente um anticorpo anti-rT3, em que a combinação compreende: iodotironina deiodinase tipo 1, iodotironina deiodinase tipo 2 e anticorpo anti-rT3, iodotironina deiodinase tipo 2, iodotironina deiodinase tipo 3 e anticorpo anti-rT3, ou iodotironina deiodinase tipo 1, iodotironina deiodinase tipo 2 e iodotironina deiodinase tipo 3, c. um detector configurado para receber um sinal do sensor e transformar este em um formato legível por um usuário; d. opcionalmente, meios para separar componentes celulares da amostra.
77. Dispositivo portátil de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que o sensor é como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores.
78. Dispositivo portátil de acordo com a reivindicação 76 ou 77, caracterizado pelo fato de que a primeira iodotironina deiodinase, a segunda iodotironina deiodinase e o anticorpo anti-rT3 são como definidos em qualquer uma das reivindicações anteriores.
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