BR112020026784A2

BR112020026784A2 - Anticorpo monoclonal de ocorrência não natural, ensaio, e, método para determinar um nível de imunogenicidade de uma terapia de anticorpo monoclonal em um paciente

Info

Publication number: BR112020026784A2
Application number: BR112020026784-8A
Authority: BR
Inventors: Giane Sumner; Jihua CHEN; Michael Partridge; Albert TORRI; Manoj Rajadhyaksha
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 2018-07-10
Filing date: 2019-07-10
Publication date: 2021-03-30
Also published as: IL279803A; AR115730A1; US11448651B2; SG11202012835RA; CN112543768A; WO2020014358A1; KR20210030378A; JP2021531245A; CA3104873A1; TWI838388B; EP3820891A1; US20230266333A1; AU2019302642A1; TW202428612A; US20200018754A1; MX2021000239A; TW202021984A; EA202190228A1; CN112543768B

Abstract

a presente divulgação é direcionada a modificar moléculas de ligação para minimizar as interações de ligação preexistentes, incluindo moléculas de ligação projetadas para minimizar ou mitigar a reatividade de fundo em uma matriz de amostra causada por interações de ligação não específicas de fármaco.

Description

1 / 53 ANTICORPO MONOCLONAL DE OCORRÊNCIA NÃO NATURAL, ENSAIO, E, MÉTODO PARA DETERMINAR UM NÍVEL DE

IMUNOGENICIDADE DE UMA TERAPIA DE ANTICORPO MONOCLONAL EM UM PACIENTE PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica a prioridade e o benefício do Pedido Provisório dos EUA nº 62/695.988, depositado em 10 de julho de 2018, cujo conteúdo é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi enviada em formato ASCII via EFS-Web e é aqui incorporada por referência em sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 8 de julho de 2019, é chamada de “REGE-004_SeqList.txt” e possui 32.813 bytes.

CAMPO DA DIVULGAÇÃO

[003] A presente divulgação é direcionada à modificar moléculas de ligação para minimizar as interações de ligação preexistentes, incluindo moléculas de ligação projetadas para minimizar ou mitigar a reatividade de fundo em uma matriz de amostra causada por interações de ligação não específicas de fármaco.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

[004] A terapia biológica é uma ferramenta valiosa para eliminar, suplementar ou substituir elementos do sistema imunológico de um paciente para tratar doenças. O material biológico estranho tem o potencial de induzir uma resposta imune do paciente a ser tratado. Esta resposta imune pode ser desencadeada pela administração de um terapêutico biológico. No entanto, um paciente pode ter elementos de suas proteínas séricas que produzem um sinal antes da introdução de um produto biológico, criando assim um alto nível de fundo ou ruído quando testado em um ensaio de anticorpo antifármaco (ADA).

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[005] Um ensaio padrão empregado durante o desenvolvimento e vigilância de uma terapêutica biológica é o ensaio de anticorpo antifármaco (ADA). Este ensaio é usado para detectar se o sistema imunológico de um paciente produziu anticorpos contra um agente biológico administrado. Para ter um ensaio eficaz, a relação sinal/ruído deve ser tal que dados significativos possam ser obtidos e analisados. Em certos pacientes, já existe um alto fundo (ruído), mesmo sem a administração de qualquer produto biológico, de modo que a detecção do verdadeiro ADA emergente do tratamento é ofuscado devido ao sinal de fundo e um ensaio de ADA eficaz é atenuado.

[006] As composições e métodos da presente invenção fornecem um caminho para reduzir ou eliminar a reatividade de fundo preexistente não específica do fármaco presente em algumas amostras de soro ou plasma humano que é observada em alguns ensaios de ADA. Deve também ser entendido que esta ligação não específica do fármaco pode ou não interferir com a capacidade de um terapêutico para ser ativo ou permanecer em circulação.

DESCRIÇÃO RESUMIDA

[007] A presente divulgação é direcionada a moléculas de ligação projetadas para mitigar a reatividade de fundo preexistente não específica de fármaco em uma amostra de paciente antes ou após a administração desta. A presente invenção é direcionada à modificar de moléculas de ligação para minimizar as interações de ligação preexistentes, incluindo moléculas de ligação projetadas para minimizar ou mitigar a reatividade de fundo em uma matriz de amostra causada por interações de ligação não específicas de fármaco.

[008] A presente divulgação fornece ainda moléculas de ligação específicas para um ou mais alvos particulares. Em um aspecto, a divulgação é direcionada a moléculas de ligação específicas para IL4Rα (Interleucina 4 alfa) ou IL13R (Interleucina 13). Em outro aspecto, a divulgação fornece

3 / 53 moléculas de ligação direcionadas a anticorpos IgG4 ou fragmentos destes. Uma molécula de ligação como aqui entendida é uma molécula que interage especificamente com um alvo particular. Exemplos de tais moléculas de ligação incluem, mas não estão limitados a, anticorpos (incluindo anticorpos monoclonais) e fragmentos destes, anticorpos projetados, proteínas de fusão e outras moléculas de ligação ao antígeno similares bem conhecidas dos técnicos no assunto. Em um aspecto, o alvo é IL4Rα. Em outro aspecto da presente invenção, uma molécula de ligação de ocorrência não natural compreendendo uma sequência C-terminal LSPG de cadeia pesada (SEQ ID NO: 21) ou uma porção de ligação ao antígeno desta é divulgada, a qual é projetada para minimizar ou mitigar a reatividade de fundo em um matriz de amostra causada por interações de ligação não específicas do fármaco.

[009] A presente divulgação fornece uma molécula de ligação de ocorrência não natural, compreendendo uma sequência C-terminal de cadeia pesada SEQ ID NO: 21, ou sua porção de ligação ao antígeno, em que a referida molécula de ligação mitiga a interação com proteínas séricas preexistentes e, como tal, reduz o sinal de fundo alto durante a análise ADA.

[0010] Em certas modalidades da presente invenção, a molécula de ligação compreende uma sequência de domínio CH selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 ou uma porção de ligação ao antígeno deste. Em certas modalidades, a molécula de ligação compreende uma sequência de domínio CH selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, ou uma porção de ligação ao antígeno deste. Em certas modalidades, a molécula de ligação compreende um domínio CH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.

[0011] Em certas modalidades da presente invenção, a molécula de ligação compreende um domínio CH truncado (REGN-E), em que a sequência é SEQ ID NO: 22.

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[0012] Em certas modalidades da molécula de ligação de ocorrência não natural da divulgação, a molécula de ligação compreende uma região CDR1 VH compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9; uma região CDR2 VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; uma região CDR3 de VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; uma região CDR1 VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; uma região CDR2 VL compreendendo a sequência de aminoácidos de LGS; uma região CDR3 VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, e um domínio CH3 selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7.

[0013] Em certas modalidades da invenção, a molécula de ligação compreende ainda uma região CDR1 VH compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9; uma região CDR2 VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; uma região CDR3 VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; uma região CDR1 V L compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; uma região CDR2 VL compreendendo a sequência de aminoácidos de LGS; uma região CDR3 V Lcompreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e um domínio CH3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

[0014] A divulgação fornece uma molécula de ligação de ocorrência não natural, em que a molécula de ligação compreende uma região CDR1 VH compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9; uma região CDR2 VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; uma região CDR3 de VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; uma região CDR1 VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; uma região CDR2 VL compreendendo a sequência de aminoácidos de LGS; uma região CDR3 VL compreendendo a

5 / 53 sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, e um domínio CH3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 6, ou SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 21, ou SEQ ID NO: 22.

[0015] Em certas modalidades da presente invenção, a molécula de ligação compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

[0016] Em certas modalidades da presente invenção, a molécula de ligação compreende uma região CH1 de IgG4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[0017] Em certas modalidades da invenção, a molécula de ligação compreende uma região CH2 de IgG4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

[0018] Em certas modalidades da molécula de ligação de ocorrência não natural da divulgação, a molécula de ligação compreende uma região de dobradiça. Em certas modalidades, a região de dobradiça compreende a sequência de APEFLG (SEQ ID NO: 17).

[0019] Em certas modalidades da molécula de ligação de ocorrência não natural da divulgação, a molécula de ligação compreende uma região constante de IgG4 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

[0020] A divulgação fornece um ensaio que compreende (a) um suporte sólido, em que um primeiro componente está operacionalmente ligado ao suporte sólido; (b) pelo menos um agente de captura, em que um segundo componente está operacionalmente ligado a pelo menos um agente de captura, em que o agente de captura compreende uma primeira molécula de ligação de ocorrência não natural, como um anticorpo monoclonal, em que o primeiro não naturalmente a ocorrência de molécula de ligação, como um anticorpo monoclonal, compreende uma sequência que codifica uma região CDR1 V H,

6 / 53 uma sequência que codifica uma região CDR2 VH, uma sequência que codifica uma região CDR3 V H, uma sequência que codifica uma região CDR1 V L, uma sequência que codifica uma região CDR2 VL, uma sequência que codifica uma região CDR3 VLe uma sequência que codifica uma região constante da cadeia pesada, em que a região constante da cadeia pesada compreende a sequência SEQ ID NO: 21, e (c) pelo menos um agente de detecção, em que a o marcador detectável está operacionalmente ligado ao agente de detecção, em que o agente de detecção compreende uma segunda molécula de ligação de ocorrência não natural, como um anticorpo monoclonal, em que a sequência que codifica o agente de detecção compreende a sequência codificada ing uma região CDR1 VH, a sequência que codifica uma região CDR2 VH, a sequência que codifica uma região CDR3 VH, a sequência que codifica a região CDR1 VL, a sequência que codifica uma região CDR2 V L, a sequência que codifica uma região CDR3 V L da primeira molécula de ligação de ocorrência não natural de (b), e em que o primeiro componente e o segundo componente se ligam seletivamente um ao outro.

[0021] Em certas modalidades dos ensaios divulgados, a primeira molécula de ligação de ocorrência não natural compreende uma sequência que codifica uma região variável de cadeia pesada e uma sequência que codifica uma região variável de cadeia leve e em que a segunda molécula de ligação de ocorrência não natural compreende a sequência que codifica uma região variável de cadeia pesada região variável da cadeia e a sequência que codifica uma região variável da cadeia leve da primeira molécula de ligação de ocorrência não natural.

[0022] Em certas modalidades dos ensaios divulgados, a primeira molécula de ligação de ocorrência não natural compreende uma sequência que codifica uma região constante de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 7.

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[0023] Em certas modalidades dos ensaios divulgados, a primeira molécula de ligação de ocorrência não natural compreende uma região CDR1 VH compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9; uma região CDR2 VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; uma região CDR3 V H compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; uma região CDR1 VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; uma região CDR2 V L compreendendo a sequência de aminoácidos de LGS; uma região CDR3 V L compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

[0024] Em certas modalidades dos ensaios divulgados, a primeira molécula de ligação de ocorrência não natural compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 15 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 16.

[0025] Em uma modalidade da presente invenção, o domínio CH3 de um anticorpo IgG4, tal como dupilumabe, é trocado por um domínio CH3 de IgG1. Em ainda uma outra modalidade, o domínio CH3 de um anticorpo IgG4 como dupilumab é truncado. Em um aspecto, o truncamento ocorre na Serina 444.

[0026] Em certas modalidades dos ensaios divulgados, o agente de detecção compreende dupilumab. Em certas modalidades, a segunda molécula de ligação de ocorrência não natural compreende dupilumab.

[0027] Em certas modalidades dos ensaios divulgados, o primeiro componente compreende estreptavidina. Em certas modalidades, o segundo componente compreende biotina.

[0028] A divulgação fornece um ensaio que compreende (a) um suporte sólido, em que um primeiro componente está operacionalmente ligado ao suporte sólido; (b) pelo menos um agente de captura, em que um segundo componente está operacionalmente ligado a pelo menos um agente de captura

8 / 53 e em que o agente de captura compreende a molécula de ligação de ocorrência não natural da divulgação ou uma composição da divulgação; e (c) pelo menos um agente de detecção, em que um marcador detectável está operacionalmente ligado ao agente de detecção e em que o agente de detecção compreende dupilumab; em que o primeiro componente e o segundo componente se ligam seletivamente um ao outro. Em certas modalidades, o primeiro componente compreende estreptavidina. Em certas modalidades, o segundo componente compreende biotina. Em certas modalidades, uma molécula de ligação que não se liga especificamente a uma sequência de uma região variável de dupilumabe não se liga a pelo menos um agente de captura. Em certas modalidades, uma molécula de ligação que se liga especificamente a uma sequência de uma região variável de dupilumab, se liga a pelo menos um agente de captura e a pelo menos um agente de detecção.

[0029] A divulgação fornece um método para determinar um nível de imunogenicidade de uma terapia biológica em um paciente, compreendendo (a) colocar uma amostra biológica do paciente em contato com o ensaio da divulgação sob condições adequadas para permitir a ligação de pelo menos uma molécula de ligação no amostra biológica com o pelo menos um agente de captura e ao pelo menos um agente de detecção, em que o paciente recebeu a terapia de molécula de ligação antes da etapa de contato, (b) detectar um sinal de pelo menos um agente de detecção, e c) identificar o nível de imunogenicidade do paciente como alto quando o sinal de (b) está acima de um valor limite ou (d) identificar o nível de imunogenicidade do paciente como baixo quando o sinal de (b) está abaixo do valor limite .

[0030] Certas modalidades da presente invenção são direcionadas a métodos para determinar um nível de imunogenicidade de uma terapia biológica, em que a terapia biológica compreende uma molécula de ligação aqui descrita. Em um aspecto, o biológico compreende dupilumabe.

[0031] Em modalidades particulares da presente invenção, métodos

9 / 53 para determinar um nível de imunogenicidade de uma terapia biológica são divulgados, em que o limite é um valor predeterminado. Em certos aspectos, o limite é um limite de segurança.

[0032] Em certas modalidades da presente invenção, a quantidade da terapia biológica é uma dose terapeuticamente eficaz, em que uma dose terapeuticamente eficaz é uma quantidade de agente terapêutico, por exemplo, uma molécula de ligação da presente invenção, que quando administrada a um paciente é em quantidade suficiente para atingir o objetivo pretendido.

[0033] Em algumas modalidades da presente invenção, o nível de imunogenicidade é um nível de linha de base. Em certos aspectos, o nível de imunogenicidade é um nível subsequente ou pós-tratamento.

[0034] Em outras modalidades da presente invenção, o paciente é um participante de um ensaio clínico. Em um aspecto, o paciente é um paciente submetido a um tratamento médico. Em outro aspecto, o tratamento médico está começando e o nível de imunogenicidade é um nível de linha de base. Em ainda outro aspecto, o tratamento médico está em andamento e o nível de imunogenicidade é um nível subsequente. Ainda em outro aspecto, o tratamento médico está terminando e o nível de imunogenicidade é um nível final. Em outro aspecto, o paciente é um indivíduo saudável.

[0035] Em ainda outras modalidades da presente invenção, o paciente tem uma doença ou distúrbio inflamatório, uma doença ou distúrbio autoimune, uma doença ou distúrbio alérgico, uma doença ou distúrbio imunológico ou uma doença ou distúrbio proliferativo benigno. Em um aspecto, o paciente tem dermatite atópica, asma, rinite alérgica, conjuntivite alérgica, esofagite eosinofílica, pólipos nasais, ABPA (aspergilose broncopulmonar alérgica), penfigóide bolhoso, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), HFE (eczema de mãos e pés), Prurigo Nodularis, ou qualquer resposta inflamatória do Tipo 2 ou uma combinação destes. O paciente pode ter qualquer doença ou condição médica.

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[0036] A presente divulgação fornece um anticorpo monoclonal de ocorrência não natural compreendendo uma sequência C-terminal da cadeia pesada compreendendo uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 13, ou uma porção de ligação ao antígeno destas. Uma sequência C-terminal da cadeia pesada pode ser uma sequência de domínio CH3. Uma sequência C-terminal de cadeia pesada pode compreender SEQ ID NO: 7. Uma sequência C-terminal de cadeia pesada pode compreender SEQ ID NO: 13. Uma sequência C-terminal de cadeia pesada pode compreender uma sequência de domínio C H compreendendo SEQ ID NO: 8. Uma sequência C-terminal de cadeia pesada pode compreender uma sequência de domínio C H compreendendo SEQ ID NO: 22.

[0037] Anticorpo monoclonal de ocorrência não natural compreendendo um domínio C H 3 consistindo em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 13, ou uma porção de ligação ao antígeno destes.

[0038] Anticorpo monoclonal de ocorrência não natural, compreendendo a sequência C-terminal de cadeia pesada que consiste em uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 22, ou uma porção de ligação ao antígeno destas.

[0039] Um anticorpo monoclonal de ocorrência não natural, em que o anticorpo compreende uma região CDR1 VH compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9; uma região CDR2 VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; uma região CDR3 de VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; uma região CDR1 VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; uma região CDR2 VL compreendendo a sequência de aminoácidos de LGS; uma região CDR3 VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, e um domínio CH 3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6,

11 / 53 SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 13, ou uma porção de ligação ao antígeno deste.

[0040] Os anticorpos anteriores podem compreender ainda uma região CDR1 VH compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9; uma região CDR2 V H compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; uma região CDR3 VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; uma região CDR1 VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; uma região CDR2 VL compreendendo a sequência de aminoácidos de LGS; uma região CDR3 VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

[0041] A presente divulgação fornece um anticorpo monoclonal de ocorrência não natural, em que o anticorpo compreende uma região CDR1 VH compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9; uma região CDR2 VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; uma região CDR3 VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; uma região CDR1 VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; uma região CDR2 VL compreendendo a sequência de aminoácidos de LGS; uma região CDR3 VLcompreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, e um domínio CH3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 13, ou uma porção de ligação ao antígeno destas.

[0042] Os anticorpos anteriores podem compreender uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16 ou uma porção de ligação ao antígeno desta. Os anticorpos anteriores podem compreender uma região CH1 de IgG4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Os anticorpos anteriores podem compreender uma região CH2 de IgG4

12 / 53 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Uma região CH2 de IgG4 pode compreender uma região de dobradiça. Uma região de dobradiça pode compreender a sequência de APEFLG (SEQ ID NO: 17).

[0043] Os anticorpos da presente divulgação podem mitigar alto sinal de fundo durante uma análise de imunogenicidade.

[0044] A presente divulgação fornece um ensaio que compreende: (a) um suporte sólido, em que um primeiro componente está operacionalmente ligado ao suporte sólido; (b) pelo menos um agente de captura, em que um segundo componente está operacionalmente ligado a pelo menos um agente de captura, em que o agente de captura compreende um primeiro anticorpo monoclonal de ocorrência não natural da presente divulgação, e (c) pelo menos um agente de detecção, em que um marcador detectável está operacionalmente ligado ao agente de detecção, em que o agente de detecção compreende um segundo anticorpo monoclonal de ocorrência não natural da presente divulgação e em que o primeiro componente e o segundo componente se ligam seletivamente um ao outro.

[0045] Um agente de detecção pode compreender dupilumabe. Um segundo anticorpo monoclonal de ocorrência não natural pode compreender dupilumabe. Um primeiro componente pode compreender estreptavidina. Um segundo componente pode compreender biotina.

[0046] A presente divulgação fornece um ensaio que compreende: (a) um suporte sólido, em que um primeiro componente está operacionalmente ligado ao suporte sólido; (b) pelo menos um agente de captura, em que um segundo componente está operacionalmente ligado a pelo menos um agente de captura e em que o agente de captura compreende o anticorpo monoclonal de ocorrência não natural da presente divulgação; e (c) pelo menos um agente de detecção, em que um marcador detectável está operacionalmente ligado ao agente de detecção e em que o agente de detecção compreende dupilumabe; em que o primeiro componente e o segundo componente se ligam

13 / 53 seletivamente um ao outro. Um primeiro componente pode compreender estreptavidina.

[0047] Um segundo componente pode compreender biotina.

[0048] Em alguns aspectos, pelo menos um agente de captura não se liga a um anticorpo que não se liga especificamente a uma sequência de uma região variável de dupilumabe. Em alguns aspectos, um pelo menos um agente de captura e o pelo menos um agente de detecção se ligam a um anticorpo que se liga especificamente a uma sequência de uma região variável de dupilumabe.

[0049] A presente divulgação fornece um método para determinar um nível de imunogenicidade de uma terapia de anticorpo monoclonal em um paciente, compreendendo: (a) colocar uma amostra biológica do paciente em contato com qualquer ensaio da presente divulgação sob condições adequadas para permitir a ligação de pelo menos um anticorpo na amostra biológica com o pelo menos um agente de captura e para o pelo menos um agente de detecção, em que o paciente recebeu a terapia de anticorpo monoclonal antes da etapa de contato; (b) detectar um sinal de pelo menos um agente de detecção; e (c) identificar o nível de imunogenicidade do paciente como alto quando o sinal de (b) está acima de um valor limite; ou (d) identificar o nível de imunogenicidade do paciente como baixo quando o sinal de (b) está abaixo do valor limite.

[0050] Uma terapia de anticorpo monoclonal pode compreender um anticorpo da presente divulgação.

[0051] Uma terapia com anticorpo monoclonal pode compreender dupilumabe. Um limite pode ser um valor predeterminado. Um limite pode ser um limite de segurança. Uma quantidade da terapia de anticorpo monoclonal pode ser uma dose terapeuticamente eficaz. Um nível de imunogenicidade pode ser um nível de linha de base. Um nível de imunogenicidade pode ser um nível subsequente.

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[0052] Um paciente pode ser um participante de um ensaio clínico. Um paciente pode ser um paciente em tratamento médico. Um tratamento médico pode estar começando e um nível de imunogenicidade pode ser um nível básico. Um tratamento médico pode estar em andamento e um nível de imunogenicidade pode ser um nível subsequente. Um tratamento médico pode estar terminando e um nível de imunogenicidade pode ser um nível final. Um paciente pode ser um indivíduo saudável. Um paciente pode ter uma doença ou distúrbio inflamatório, uma doença ou distúrbio autoimune, uma doença ou distúrbio alérgico, uma doença ou distúrbio imunológico ou uma doença ou distúrbio proliferativo benigno. Um paciente pode ter dermatite atópica, asma, rinite alérgica, conjuntivite alérgica, esofagite eosinofílica, pólipos nasais ou uma combinação destes.

[0053] Qualquer um dos aspectos acima pode ser combinado com qualquer outro aspecto.

[0054] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que geralmente é entendido por um técnico no assunto ao qual essa divulgação pertence. Na relatório descritivo as formas singulares também incluem o plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário; como exemplos, os termos "um", "uma" e "o", "a" são entendidos como singulares ou plural e o termo "ou" é considerado inclusivo. A título de exemplo, “um elemento” significa um ou mais elementos. Ao longo do relatório descritivo, a palavra "compreendendo" ou variações como "compreende" ou "compreendendo", serão entendidas como implicando a inclusão de um elemento declarado, inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, inteiros ou etapas. "Cerca de" pode ser entendido como dentro de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% ou 0,01% do valor declarado. A menos que esteja de outra forma claro no

15 / 53 contexto, todos os valores numéricos fornecidos neste documento são modificados pelo termo "cerca de".

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0055] A Figura 1 é um gráfico que caracteriza a especificidade da reatividade preexistente em amostras de linha de base de pacientes usando construções de anticorpos competitivos em um ensaio de anticorpo antifármaco (ADA). No eixo y, a inibição percentual de 0 a 100 em incrementos de 25. No eixo X, o construto de anticorpo competitivo específico usado no ensaio de ponte, listado da esquerda para a direita: dupilumabe, REGN-A, wt IgG4, wt IgG1, wt IgG2, wt IgG3, REGN-B e REGN-C. As seis amostras de pacientes (S1 a S6) são representadas, em ordem, como um círculo, um quadrado, um triângulo apontando para cima, um asterisco, um losango e um triângulo apontando para baixo. Os reagentes de anticorpos mencionados no gráfico foram usados a 200 µg/mL como inibidores competitivos no formato de ensaio de confirmação de ADA. A alta porcentagem de inibição no ensaio indica que o determinado competidor foi capaz de inibir os sinais preexistentes nessas amostras, sugerindo que a molécula competidora contém uma região à qual se liga a reatividade preexistente. Inibições percentuais mais baixas indicam que a molécula competidora não contém uma região à qual a reatividade preexistente pode se ligar.

[0056] A Figura 2 é um desenho que mostra uma representação esquemática das três construções principais e suas diferenças estruturais em comparação com o dupilumabe. REGN-B, REGN-C e REGN-E são análogos moleculares de dupilumabe. Todos os três construtos são construtos de IgG4k que têm a mesma especificidade e afinidade semelhante para anti-IL4R como dupilumabe e também possuem a mesma sequência de mutação da região de dobradiça de CPPC presente em dupilumabe.

[0057] A Figura 3 é um desenho que mostra uma representação

16 / 53 diagramática do alinhamento da sequência de aminoácidos e comparação do domínio CH3 dos subtipos IgG4, IgG1 e IgG2 de tipo selvagem. A Leucina na posição 445 é a terceira a partir da extremidade C terminal da sequência do domínio CH3, conforme indicado pela seta.

[0058] A Figura 4 é uma modalidade que ilustra uma representação diagramática de uma ponte específica de fármaco (painel A, ensaio de ADA #1), ponte não específica de fármaco devido à reatividade preexistente no ensaio de ADA atual (painel B) e nenhuma ponte não específica de fármaco ponte devido ao uso de REGN-C como o agente de captura (painel C, ensaio ADA #2). A estreptavidina na placa é mostrada como uma cruz cinza, a porção biotina como um pequeno quadrado preto e o rótulo Rutênio como uma estrela. O agente de captura REGN-D biotinilado (dupilumabe) (estrutura bifurcada preta) é mostrado nos painéis A e B, enquanto no painel C, REGN- C biotinilado é mostrado (estrutura bifurcada quadriculada preta e branca). A reatividade preexistente é representada nos painéis B e C como uma estrutura bifurcada delineada menor tracejada.

[0059] A Figura 5A é um gráfico que mostra os sinais de ensaio de um subconjunto de amostras de linha de base do paciente usando o ensaio ADA original (ensaio # 1) que é diagramado no painel A da Figura 4 e usa REGN-D biotinilado como o agente de captura. No eixo y, razão Sinal/Ruído na escala logarítmica de 0 a 100. No eixo x, amostras individuais de pacientes solicitadas pela relação Sinal/Ruído. O ponto de corte é fornecido como uma linha tracejada.

[0060] A Figura 5B é um gráfico que mostra os sinais de ensaio das mesmas amostras de linha de base do paciente usando um ensaio ADA revisado (ensaio # 2), que é diagramado no painel C da Figura 4 e usa REGN- C biotinilado como o agente de captura. No eixo y, razão Sinal/Ruído na escala logarítmica de 0 a 100. No eixo x, amostras individuais de pacientes na mesma ordem representada na Figura 5A. O ponto de corte é fornecido como

17 / 53 uma linha tracejada.

[0061] A Figura 6A é um gráfico que mostra o sinal de ensaio de um subconjunto de amostras de linha de base do paciente usando um ensaio de anticorpo antifármaco de ponte específico de fármaco (ADA), semelhante ao descrito na Figura 4, com dupliumaba intacto usado como reagentes de captura e detecção.

[0062] A Figura 6B é um gráfico que mostra o sinal de ensaio do mesmo subconjunto de amostras de linha de base do paciente testadas na Figura 6A, usando um ensaio de ADA em ponte revisado com REGN-B (Figura 2, um mAb IgG4 humano em que todo o CH3 de IgG4 foi trocado para um domínio CH3 de IgG1) como os reagentes de captura e detecção.

[0063] A Figura 6C é um gráfico que mostra o sinal de ensaio do mesmo subconjunto de amostras de linha de base do paciente testadas na Figura 6A, usando um ensaio de ADA em ponte revisado com REGN-E (Figura 2, um mAb IgG4 humano em que o domínio C H 3 é truncado com um códon de parada após Serina 444) como reagentes de captura e detecção.

[0064] A Figura 7 é uma série de gráficos que caracterizam a especificidade da reatividade preexistente em amostras de linha de base de pacientes usando construtos de anticorpos competitivos em um ensaio de anticorpo anti-fármaco (ADA). No eixo y, a inibição percentual de 0 a 100 em incrementos de 25. No eixo X, o construto de anticorpo competitivo específico usado no ensaio de ponte, listado da esquerda para a direita: dupilumabe, REGN-F e REGN-F (L445P) no gráfico superior ou dupilumabe, REGN-G e REGN-G ( L445P) no gráfico inferior. As seis amostras de pacientes (S1 a S6) são representadas, em ordem, como um círculo, um quadrado, um triângulo apontando para cima, um asterisco, um losango e um triângulo apontando para baixo. Os reagentes de anticorpos mencionados no gráfico foram usados a 200 µg/mL como inibidores competitivos no formato de ensaio de confirmação de ADA. A alta porcentagem de inibição no ensaio

18 / 53 indica que o determinado competidor foi capaz de inibir os sinais preexistentes nessas amostras, sugerindo que a molécula competidora contém uma região à qual se liga a reatividade preexistente. Inibições percentuais mais baixas indicam que a molécula competidora não contém uma região à qual a reatividade preexistente pode se ligar.

[0065] A Figura 8 é uma série de gráficos que mostram o sinal de ensaio de um subconjunto de amostras de linha de base do paciente usando um ensaio de anticorpo antifármaco (ADA) de ponte específico de fármaco, semelhante ao descrito na Figura 4, com REGN-F usado como reagentes de captura e detecção (topo) ou com REGN-F (L445P) usado como reagente de captura em combinação com REGN-F como reagente de detecção.

[0066] A Figura 9 é uma série de gráficos que mostram o sinal de ensaio de um subconjunto de amostras de linha de base do paciente usando um ensaio de anticorpo antifármaco de ponte específico de fármaco (ADA), semelhante ao descrito na Figura 4, com REGN-G usado como reagentes de captura e detecção (topo) ou com REGN-G usado como reagente de captura em combinação com REGN-G (L445P) como reagente de detecção.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0067] Deve ser entendido que esta divulgação não está limitada às composições e métodos descritos neste documento, bem como às condições experimentais descritas, pois tais podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada neste documento tem a finalidade de descrever certas modalidades apenas e não se destina a ser limitante, uma vez que o escopo da presente divulgação será limitado apenas pelas reivindicações anexas.

[0068] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado que geralmente é entendido por um técnico no assunto ao qual essa divulgação pertence. Embora quaisquer composições, métodos e materiais semelhantes

19 / 53 ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou no teste da presente invenção. Todas as publicações mencionadas são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade.

[0069] O termo "IL4R humano" (hIL-4R), tal como aqui usado, destina-se a referir-se a um receptor de citocina humana que se liga especificamente à interleucina-4 (IL-4), IL-4Rα (SEQ ID NO: 18). O termo "interleucina-13 humana" (hIL-13) refere-se a uma citocina que se liga especificamente ao receptor IL-13 e "complexo hIL-13/hIL-13R1" refere-se ao complexo formado pela ligação de hIL-13 a hIL-13R1 complexo, cujo complexo se liga ao receptor hIL-4 para iniciar a atividade biológica.

[0070] O termo "molécula de ligação", tal como aqui usado, destina- se a referir-se a moléculas que interagem especificamente e se ligam a um alvo específico. O alvo pode compreender uma molécula biológica ou pequena (química). A molécula alvo pode definir um antígeno ou porção antigênica. Exemplos de uma molécula de ligação incluem, mas não estão limitados a, anticorpos (incluindo anticorpos monoclonais, anticorpos biespecíficos, bem como fragmentos de anticorpos), proteínas de fusão e outra molécula de ligação ao antígeno conhecida pelos técnicos no assunto.

[0071] O termo "anticorpo", tal como aqui usado, é um exemplo de uma molécula de ligação e refere-se a uma imunoglobulina que normalmente compreende quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada compreende uma região variável da cadeia pesada (HCVR ou VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada compreende três domínios, CH 1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável da cadeia leve (LCVR ou VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve compreende um domínio (CL1). As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade

20 / 53 (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é composto por três CDRs e quatro FRs, arranjados do terminal amino ao terminal carboxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Os anticorpos podem incluir anticorpos nas subclasses IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Os anticorpos também podem compreender uma combinação de regiões de diferentes subclasses. Os anticorpos IgG4 podem incluir, mas não estão limitados a, dupilumabe e cemiplimabe.

[0072] Outros exemplos de "moléculas de ligação" incluem, mas não estão limitados a, anticorpos bi-específicos, anticorpos triespecíficos, anticorpos tetra-específicos e anticorpos penta-específicos. Em alguns aspectos, os anticorpos bi-específicos, anticorpos tri-específicos, anticorpos tetra-específicos e anticorpos penta-específicos podem compreender uma porção Fc de um anticorpo. Em alguns aspectos, os anticorpos bi-específicos, anticorpos tri-específicos, anticorpos tetra-específicos, anticorpos penta- específicos podem compreender uma estrutura de IgG4. Outro exemplo de uma "molécula de ligação" é um conjugado anticorpo-fármaco (ADC). Em alguns aspectos, um ADC pode compreender uma estrutura de IgG4. Outro exemplo de uma "molécula de ligação" é um engajador de células T bi- específico (BiTE). Em alguns aspectos, o BiTE pode compreender uma estrutura de IgG4. Outro exemplo de uma "molécula de ligação" é uma proteína de fusão TRAP. Em alguns aspectos, a proteína de fusão TRAP tem uma estrutura de IgG4. Outro exemplo de uma "molécula de ligação" é um finômero.

[0073] O termo "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de anticorpo" ou "fragmento de anticorpo"), tal como aqui usado, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno (por exemplo , hIL- 4Rα). Foi demonstrado que a função de ligação ao antígeno de um anticorpo

21 / 53 pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento total. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos pelo termo "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente compreendendo os domínios VL, VH, C L1 e CH 1; (ii) um fragmento F(ab′) 2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos F(ab)′ ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fc compreendendo os domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv compreendendo os domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al . (1989) Nature 241: 544-546), que compreende um domínio VH ; e (vi) um CDR. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite que sejam feitos como uma única cadeia contígua na qual as regiões VL e VH emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia simples (scFv); vide, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423 a 426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879 a 5883. Esses anticorpos de cadeia única também se destinam a ser abrangidos pelo termo "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo. Outras formas de anticorpos de cadeia única, como diacorpos, também estão incluídas (vide, por exemplo, Holligeret al.(1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: 6444 a 6448).

[0074] Um anticorpo de "neutralização" ou "bloqueio", conforme usado neste documento, destina-se a se referir a um anticorpo cuja ligação a hIL-4Rα resulta na inibição da atividade biológica de hIL-4 e/ou hIL-13. Esta inibição da atividade biológica de hIL-4 e/ou IL-13 pode ser avaliada medindo um ou mais indicadores de atividade biológica de hIL-4 e/ou hIL-13 conhecidos na técnica, tais como hIL-4- e/ou ativação celular induzida por IL- 13 e ligação de hIL-4 a hIL-4Rα (vide exemplos abaixo).

[0075] Um "CDR" ou região determinante de complementaridade é

22 / 53 uma região de hipervariabilidade intercalada dentro de regiões que são mais conservadas, denominadas "regiões de estrutura" (FR). Em diferentes modalidades do anticorpo anti-hIL-4Rα ou fragmento da divulgação, as FRs podem ser idênticas às sequências da linha germinativa humana ou podem ser modificadas natural ou artificialmente.

[0076] O termo "epítopo" é um determinante antigênico que interage com um sítio de ligação ao antígeno específico na região variável de uma molécula de anticorpo conhecida como paratopo. Um único antígeno pode ter mais de um epítopo. Os epítopos podem ser conformacionais ou lineares. Um epítopo conformacional é produzido por aminoácidos justapostos espacialmente de diferentes segmentos da cadeia polipeptídica linear. Um epítopo linear é aquele produzido por resíduos de aminoácidos adjacentes em uma cadeia polipeptídica. Em certas circunstâncias, um epítopo pode incluir frações de sacarídeos, grupos fosforila ou grupos sufonila no antígeno.

[0077] O termo "imunogenicidade" refere-se à capacidade de um antígeno ou imunógeno de induzir uma resposta imune no corpo de um humano ou animal. As proteínas terapêuticas têm a capacidade de provocar respostas imunológicas adversas que podem interferir na farmacocinética e na eficácia do fármaco. Essa resposta imune pode assumir a forma de produção de anticorpos antifármacos (ADAs).

[0078] O termo "identidade substancial" ou "substancialmente idêntico", quando se refere a um ácido nucleico ou fragmento deste, indica que, quando alinhado de maneira ideal com inserções ou deleções de nucleotídeos apropriadas com outro ácido nucleico (ou sua fita complementar), há identidade de sequência de nucleotídeos em pelo menos cerca de 95%, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% das bases de nucleotídeos, conforme medido por qualquer algoritmo bem conhecido de identidade de sequência, tal como FASTA, BLAST ou Gap, como discutido abaixo.

23 / 53

[0079] Conforme aplicado aos polipeptídeos, o termo "similaridade substancial" ou "substancialmente similar" significa que duas sequências de peptídeos, quando alinhadas de forma otimizada, como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de lacuna padrão, compartilham pelo menos 95% de identidade de sequência, ainda mais preferencialmente pelo menos 98% ou 99% de identidade de sequência. Normalmente, as posições dos resíduos que não são idênticas diferem por substituições conservativas de aminoácidos. Uma "substituição conservativa de aminoácido" é aquela em que um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição conservadora de aminoácidos não alterará substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Nos casos em que duas ou mais sequências de aminoácidos diferem entre si por substituições conservativas, a identidade de sequência percentual ou grau de similaridade pode ser ajustado para cima para corrigir a natureza conservativa da substituição. Os meios para fazer este ajuste são bem conhecidos dos técnicos do assunto. Vide, por exemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307 a 331, aqui incorporado por referência. Exemplos de grupos de aminoácidos que possuem cadeias laterais com propriedades químicas semelhantes incluem (1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadeias laterais de hidroxila alifática: serina e treonina; (3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; (4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; (5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadeias laterais ácidas: aspartato e glutamato, e (7) cadeias laterais contendo enxofre são cisteína e metionina. Em certas modalidades, os grupos de substituição de aminoácidos conservadores são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina- arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato e asparagina-glutamina. Alternativamente, uma substituição conservadora é qualquer mudança com

24 / 53 um valor positivo na matriz de verossimilhança logarítmica PAM250 divulgada em Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45, aqui incorporado por referência. Uma substituição “moderadamente conservadora” é qualquer alteração com um valor não negativo na matriz de probabilidade log PAM250.

[0080] A similaridade de sequência para polipeptídeos, que também é referida como identidade de sequência, é normalmente medida usando software de análise de sequência. O software de análise de proteínas combina sequências semelhantes usando medidas de similaridade atribuídas a várias substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições conservadoras de aminoácidos. Por exemplo, o software GCG contém programas como Gap e Bestfit que podem ser usados com parâmetros padrão para determinar homologia de sequência ou identidade de sequência entre polipeptídeos intimamente relacionados, como polipeptídeos homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteína de tipo selvagem e um mutante desta. Vide, por exemplo, GCG Versão 6.1. As sequências polipeptídicas também podem ser comparadas usando FASTA usando parâmetros padrão ou recomendados, um programa no GCG Versão 6.1. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) fornece alinhamentos e identidade de sequência percentual das regiões da melhor sobreposição entre as sequências de consulta e pesquisa (Pearson (2000) supra). Outro algoritmo ao comparar uma sequência da divulgação a um banco de dados contendo um grande número de sequências de diferentes organismos é o programa de computador BLAST, especialmente BLASTP ou TBLASTN, usando parâmetros padrão. Vide, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 a 410 e Altschul et al.(1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389 a 402, cada um dos quais é aqui incorporado por referência.

[0081] Métodos para gerar anticorpos humanos incluem aqueles descritos em, por exemplo, Patente US No. 6.596.541, Green et al . (1994)

25 / 53 Nature Genetics 7: 13 a 21), Patente US. Nos. 5.545.807, 6.787.637.

[0082] Os roedores podem ser imunizados por qualquer método conhecido na técnica (vide, por exemplo, Harlow e Lane (1988)Antibodies: A Laboratory Manual1988 Cold Spring Harbor Laboratory; Malik e Lillehoj (1994) Antibody Techniques, Academic Press, CA). Os anticorpos da divulgação são normalmente preparados com o uso da tecnologia VELOCIMMUNE® (Patente US No. 6.596.541). Um camundongo transgênico no qual as regiões variáveis da cadeia leve e pesada da imunoglobulina endógena são substituídas pelas regiões variáveis humanas correspondentes é desafiado com o antígeno de interesse e as células linfáticas (como células B) são recuperadas dos camundongos que expressam anticorpos. As células linfáticas podem ser fundidas com uma linha celular de mieloma para preparar linhas celulares de hibridoma imortais, e tais linhas celulares de hibridoma são rastreadas e selecionadas para identificar linhas celulares de hibridoma que produzem anticorpos específicos para o antígeno de interesse. O DNA que codifica as regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve pode ser isolado e ligado a regiões constantes isotípicas desejáveis da cadeia pesada e da cadeia leve. Essa proteína de anticorpo pode ser produzida em uma célula, como uma célula CHO. Alternativamente, o DNA que codifica os anticorpos quiméricos específicos do antígeno ou as regiões variáveis das cadeias leve e pesada podem ser isolados diretamente de linfócitos específicos do antígeno.

[0083] O DNA que codifica as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves do anticorpo pode ser isolado e operacionalmente ligado ao DNA que codifica as regiões constantes das cadeias pesadas e leves humanas. O DNA pode então ser expresso em uma célula capaz de expressar o anticorpo totalmente humano. Em uma modalidade específica, a célula é uma célula CHO.

[0084] Os anticorpos podem ser terapeuticamente úteis no bloqueio

26 / 53 de uma interação ligante-receptor ou na inibição da interação do componente receptor, em vez de matar células através da fixação do complemento (citotoxicidade dependente do complemento) (CDC) e participação da citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC). A região constante de um anticorpo é importante na capacidade de um anticorpo de fixar complemento e mediar a citotoxicidade dependente de células. Assim, o isotipo de um anticorpo pode ser selecionado com base em se é desejável que o anticorpo medie a citotoxicidade.

[0085] As imunoglobulinas humanas podem existir em duas formas que estão associadas à heterogeneidade da dobradiça. Em uma forma, uma molécula de imunoglobulina compreende uma construção de quatro cadeias estável de aproximadamente 150 a 160 kDa na qual os dímeros são mantidos juntos por uma ligação dissulfeto intercadeia de cadeia pesada. Em uma segunda forma, os dímeros não são ligados por meio de ligações dissulfeto intercadeias e uma molécula de cerca de 75 a 80 kDa é formada composta por uma cadeia leve e pesada acoplada covalentemente (semianticorpo). Essas formas têm sido extremamente difíceis de separar, mesmo após a purificação por afinidade. A frequência de aparecimento da segunda forma em vários isotipos de IgG intactos é devido a, mas não se limita a, diferenças estruturais associadas ao isotipo da região de dobradiça do anticorpo. Na verdade, uma única substituição de aminoácido na região de dobradiça da dobradiça de IgG4 humana pode reduzir significativamente o aparecimento da segunda forma (Angal et al.(1993) Molecular Immunology 30: 105) para níveis normalmente observados usando uma dobradiça de IgG1 humana. A presente divulgação abrange anticorpos com uma ou mais mutações na dobradiça, região CH2 ou CH3 que podem ser desejáveis, por exemplo, na produção, para melhorar o rendimento da forma de anticorpo desejada.

[0086] Inicialmente, os anticorpos quiméricos de alta afinidade são isolados com uma região variável humana e uma região constante de

27 / 53 camundongo. Conforme descrito abaixo, os anticorpos são caracterizados e selecionados quanto às características desejáveis, incluindo afinidade de ligação a hIL-4Rα, capacidade de bloquear a ligação de hIL-4 a hIL-4Rα e/ou seletividade para a proteína humana. As regiões constantes de camundongo são substituídas por regiões constantes humanas desejadas para gerar os anticorpos totalmente humanos da divulgação, por exemplo, tipo selvagem ou IgG4 ou IgG1 modificados (por exemplo, SEQ ID NO: 4, 19, 20 e 23). Embora a região constante selecionada possa variar de acordo com o uso específico, as características de alta afinidade de ligação ao antígeno e especificidade ao alvo residem na região variável. Ensaios de imunogenicidade

[0087] A presente divulgação fornece uma molécula de ligação de ocorrência não natural, como um anticorpo monoclonal, ou porção de ligação ao antígeno deste, compreendendo uma sequência C-terminal de cadeia pesada LSPG (SEQ ID NO: 21). Em certas modalidades, a C-terminal de cadeia pesada é um domínio CH3 humano. Em certas modalidades, o anticorpo humano é da classe IgG4. Em certas modalidades, a sequência da cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 7. Em certas modalidades, a sequência da cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 8.

[0088] A divulgação fornece ensaios de imunogenicidade compreendendo uma molécula de ligação ao anti-IL-4Rα, como um anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno deste da presente divulgação. Os ensaios de imunogenicidade da divulgação podem assumir a forma de ensaios de anticorpo antifármaco (ADA). Os ensaios de ADA da divulgação podem ser ensaios de ponte de ADA ou ensaios de imunoabsorção enzimática direta (ELISA). Em um ensaio de ponte ADA, uma forma biotinilada da molécula de ligação em questão é ligada à estreptavidina em uma placa. As moléculas de ligação, como os anticorpos presentes na amostra, se ligam à molécula de ligação biotinilada e a uma forma marcada da mesma molécula de ligação,

28 / 53 formando uma interação de ponte com um sinal detectável do marcador. Marcadores adequados serão conhecidos por um técnico no assunto. Marcadores exemplares compreendem Rutênio, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina e fluoróforos. O ensaio de ponte ADA pode incluir a titulação da amostra realizando a reação de ponte para gerar uma curva padrão e o uso de um anticorpo competidor frio, não marcado para inibir a reação.

[0089] A Figura 4 ilustra um ensaio de ponte ADA específico de fármaco no Painel A; no Painel B, um ensaio de ponte não específico para fármacos devido à reatividade preexistente no ensaio de ADA atual; e nenhum ensaio de ADA de ponte não específico para fármacos devido ao uso de REGN-C como o agente de captura visto no Painel C. A reatividade preexistente é representada nos painéis B e C como uma estrutura bifurcada delineada menor tracejada. Deve ser entendido que, para a modalidade divulgada, os análogos moleculares do reagente de ensaio REGN-A, B, C, D e E são intercambiáveis, permitindo assim que um técnico no assunto projete várias permutações do ensaio, conforme descrito. Em um aspecto, a fim de reduzir o histórico, um técnico no assunto poderia combinar REGN-D com qualquer um dos seguintes reagentes para formar novas combinações: REGN- B, REGN-C ou REGN-E (D+B, D+C, D+E ou invertido de modo que B+D, C+D ou E+D) de modo que a ordem de alinhamento seja "agente de captura" + "agente de detecção". Em outro aspecto, um técnico no assunto poderia fazer os seguintes pares a fim de reduzir o sinal de fundo: B+B, C+C ou E+E.

[0090] Em certas modalidades da presente divulgação, os níveis de imunogenicidade (ou ADA) são determinados usando moléculas de ligação de tais anticorpos (ou porções de ligação ao antígeno destes). Em certas modalidades, os níveis de imunogenicidade são avaliados para dupilumabe usando um anticorpo IgG4. Uma questão que normalmente precisa ser tratada nesses estudos de imunogenicidade é o alto sinal de fundo, que frequentemente está associado ao anticorpo IgG4 usado. A fim de mitigar este

29 / 53 fundo elevado, a presente divulgação fornece anticorpos IgG4 compreendendo uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 resultando em um sinal de fundo inferior.

[0091] Em certas modalidades da presente divulgação, uma molécula de ligação, como um anticorpo, ou sua porção de ligação ao antígeno, compreende (1) uma ou mais sequências de cadeia VL selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 12, LGS, SEQ ID NO: 14 e suas combinações, (2) uma ou mais sequências de cadeia VH selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e suas combinações, e (3) uma sequência CH3 ou CH selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, em que a molécula de ligação exibe reatividade de fundo reduzida em um ensaio de imunogenicidade (ADA) em comparação com uma molécula de ligação compreendendo (1) uma ou mais sequências de cadeia VL selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 12, LGS, SEQ ID NO: 14 e suas combinações, (2) uma ou mais sequências de cadeia VH selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e suas combinações, e (3) uma sequência CH3 ou CH não se selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8. Em certas modalidades, a sequência de domínio CH de (3) pode incluir SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6.

[0092] Em uma modalidade da presente invenção, o domínio CH3 de um anticorpo IgG4, tal como dupliumabe, é trocado por um domínio CH3 de IgG1, resultando em um sinal de fundo inferior (Figura 6B). Em ainda uma outra modalidade, o domínio CH3 de um anticorpo IgG4 como o dupliumabe é truncado. Em um aspecto, o truncamento ocorre na Serina 444, resultando em um sinal de fundo inferior (Figura 6C).

[0093] Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma

30 / 53 molécula de ligação que compreende (1) uma ou mais sequências de cadeia VL selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 12, LGS, SEQ ID NO: 14 e suas combinações, (2) uma ou mais sequências de cadeia VH selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e suas combinações, e (3) uma sequência CH3 ou CH selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

[0094] Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação que compreende (1) uma ou mais sequências de cadeia VL selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 12, LGS, SEQ ID NO: 14 e suas combinações, (2) uma ou mais sequências de cadeia VH selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e suas combinações, e (3) uma sequência CH 3 ou CH, em que o C H 3 ou a sequência C H compreende uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

[0095] Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação que compreende (1) uma ou mais sequências de cadeia VL selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 12, LGS, SEQ ID NO: 14 e suas combinações, (2) uma ou mais sequências de cadeia VH selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e suas combinações, e (3) uma sequência CH3, em que a sequência C H3 compreende um ou mais sequências selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 21.

[0096] Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação que compreende (1) uma ou mais sequências de cadeia VL selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 12, LGS, SEQ ID NO: 14 e suas combinações, (2) uma ou mais sequências de cadeia VH selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ

31 / 53 ID NO: 11 e suas combinações, e (3) uma sequência CH, em que a sequência CH compreende um ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 22.

[0097] Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo uma sequência CH, em que a sequência CH compreende uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 22 .

[0098] Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo uma sequência CH3, em que a sequência C H3 compreende uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 21.

[0099] Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo um domínio CH de IgG4 compreendendo uma substituição de aminoácido Prolina por Leucina na posição 445.

[00100] Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação que compreende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 5.

[00101] Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação que compreende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 6.

[00102] Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação que compreende (1) uma ou mais sequências de cadeia VL selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 12, LGS, SEQ ID NO: 14 e suas combinações, (2) uma ou mais sequências de cadeia VH selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e combinações das mesmas, e (3) uma sequência CH compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 5.

[00103] Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação que compreende (1) uma ou mais sequências de cadeia

32 / 53 VL selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 12, LGS, SEQ ID NO: 14 e suas combinações, (2) uma ou mais sequências de cadeia VH selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e suas combinações, e (3) uma sequência CH compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 2 e SEQ ID NO: 6.

[00104] Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:

7. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 94% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 93% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7. Em alguns

33 / 53 aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 91% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7.

[00105] Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:

8. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 94% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 93% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos

34 / 53 cerca de 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 91% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação que compreende pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8.

[00106] Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:

13. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 913% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 94% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 93% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação

35 / 53 compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 91% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13.

[00107] Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7, em que pelo menos uma sequência polipeptídica compreende a SEQ ID NO: 21. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7, em que pelo menos uma sequência polipeptídica compreende a SEQ ID NO: 21. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7, em que pelo menos uma sequência polipeptídica compreende a SEQ ID NO: 21. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7, em que pelo menos uma sequência polipeptídica compreende a SEQ ID NO: 21. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7, em que pelo menos uma sequência polipeptídica compreende a SEQ ID NO: 21. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação

36 / 53 compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 94% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7, em que pelo menos uma sequência polipeptídica compreende a SEQ ID NO: 21. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 93% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7, em que pelo menos uma sequência polipeptídica compreende a SEQ ID NO: 21. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7, em que pelo menos uma sequência polipeptídica compreende a SEQ ID NO: 21. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 91% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7, em que pelo menos uma sequência polipeptídica compreende a SEQ ID NO: 21. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7, em que pelo menos uma sequência polipeptídica compreende a SEQ ID NO: 21.

[00108] Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8, em que pelo menos uma sequência polipeptídica compreende a SEQ ID NO: 21. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8, em que pelo menos uma sequência polipeptídica compreende a SEQ ID NO: 21. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos

37 / 53 cerca de 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8, em que pelo menos uma sequência polipeptídica compreende a SEQ ID NO: 21. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8, em que pelo menos uma sequência polipeptídica compreende a SEQ ID NO: 21. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8, em que pelo menos uma sequência polipeptídica compreende a SEQ ID NO: 21. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 94% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8, em que pelo menos uma sequência polipeptídica compreende a SEQ ID NO: 21. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 93% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8, em que pelo menos uma sequência polipeptídica compreende a SEQ ID NO: 21. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8, em que pelo menos uma sequência polipeptídica compreende a SEQ ID NO: 21. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 91% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8, em que pelo menos uma sequência polipeptídica compreende a SEQ ID NO: 21. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece uma molécula de ligação compreendendo pelo menos uma sequência polipeptídica com pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8, em que pelo

38 / 53 menos uma sequência polipeptídica compreende a SEQ ID NO: 21.

[00109] Em alguns aspectos, qualquer molécula de ligação da presente divulgação pode exibir reatividade de fundo reduzida em um ensaio de imunogenicidade (ADA) em comparação com uma molécula de ligação compreendendo uma sequência CH compreendendo SEQ ID NO: 3. Em alguns aspectos, qualquer molécula de ligação da presente divulgação pode exibir reatividade de fundo reduzida em um ensaio de imunogenicidade (ADA) em comparação com uma molécula de ligação compreendendo uma sequência CH compreendendo SEQ ID NO: 4.

[00110] Administração Terapêutica e Formulações

[00111] A divulgação fornece composições terapêuticas que compreendem as moléculas de ligação anti-IL-4Rα da presente divulgação. A administração de composições terapêuticas de acordo com a divulgação será administrada com veículos, excipientes e outros agentes adequados que são incorporados em formulações para fornecer transferência, liberação, tolerância melhoradas e similares. . Uma multiplicidade de formulações apropriadas pode ser encontrada no formulário conhecido por todos os químicos farmacêuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa. Estas formulações incluem, por exemplo, pós, pastas, pomadas, geleias, ceras, óleos, lipídios, lipídios (catiônicos ou aniônicos) contendo vesículas (como LIPOFECTIN ™), conjugados de DNA, pastas de absorção anidras, óleo em água e água -em- emulsões de óleo, emulsões de carbowax (polietilenoglicóis de vários pesos moleculares), géis semissólidos e misturas semissólidas contendo carbowax. Vide também Powell et al . “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52: 238-311.

[00112] A dose pode variar dependendo da idade e do tamanho de um paciente a ser administrado, doença alvo, condições, via de administração e similares. Quando a molécula de ligação da presente divulgação é usada para

39 / 53 tratar várias condições e doenças associadas com IL-4Rα, em um paciente adulto, é vantajoso administrar por via intravenosa a molécula de ligação da presente divulgação normalmente em uma dose única de cerca de 0,01 a cerca de 20 mg/kg de peso corporal, mais normalmente cerca de 0,02 a cerca de 7, cerca de 0,03 a cerca de 5, ou cerca de 0,05 a cerca de 3 mg/kg de peso corporal. Em alguns aspectos, quando a molécula de ligação da presente divulgação é usada para tratar várias condições e doenças associadas a IL- 4Rα, o regime de dosagem pode ser 300 mg uma vez a cada duas semanas (Q2W) e pode ser estendido até a cada quatro semanas ( Q4W). Dependendo da gravidade da condição, a frequência e a duração do tratamento podem ser ajustadas.

[00113] Vários sistemas de liberação são conhecidos e podem ser usados para administrar a composição farmacêutica da divulgação, por exemplo, encapsulamento em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar os vírus mutantes, endocitose mediada por receptor (ver, por exemplo, Wu et al . ( 1987) J. Biol. Chem. 262: 4429 a 4432). Os métodos de introdução incluem, mas não estão limitados a, vias intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, epidural e oral. A composição pode ser administrada por qualquer via conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção em bolus, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.) e pode ser administrada juntamente com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser sistêmica ou local.

[00114] A composição farmacêutica também pode ser distribuída em uma vesícula, por exemplo, um lipossoma (ver Langer (1990) Science 249: 1527-1533; Treat et al . (1989) em Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein e Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365; Lopez-Berestein, ibid ., pp. 317 a 327.

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[00115] Em certas modalidades, a composição farmacêutica pode ser liberadas em um sistema de liberação controlada. Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada (ver Langer, supra ; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). Em outra modalidade, podem ser usados materiais poliméricos (vide Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974). Em ainda outra modalidade, um sistema de liberação controlada pode ser colocado na proximidade do alvo da composição, exigindo assim apenas uma fração da dose sistêmica (vide, por exemplo, Goodson, em Medical Applications of Controlled Release, supra , vol. 2, pp. 115 a 138, 1984). Outros sistemas de liberação controlada são discutidos na revisão de Langer (1990) Science 249: 1527 a 1533.

[00116] As preparações injetáveis podem incluir formas de dosagem para injeções intravenosas, subcutâneas, intracutâneas e intramusculares, infusões gota a gota, etc. Estas preparações injetáveis podem ser preparadas por métodos conhecidos publicamente. Por exemplo, as preparações injetáveis podem ser preparadas, por exemplo, por dissolução, suspensão ou emulsificação do anticorpo ou seu sal descrito acima em um meio aquoso estéril ou um meio oleoso convencionalmente usado para injeções. Como meio aquoso para injeções, existem, por exemplo, soro fisiológico, uma solução isotônica contendo glicose e outros agentes auxiliares, etc., que podem ser usados em combinação com um agente solubilizante apropriado, como um álcool (por exemplo, etanol), um poliálcool (por exemplo, propilenoglicol, polietilenoglicol), um surfactante não iônico [por exemplo, polissorbato 80, HCO-50 (aduto de polioxietileno (50 mol) de óleo de rícino hidrogenado)], etc. Como meio oleoso, são empregados, por exemplo, óleo de gergelim, óleo de soja, etc., que podem ser usados em combinação com um agente solubilizante, tal como benzoato de benzila, álcool benzílico, etc. A injeção assim preparada é preferencialmente colocada numa ampola apropriada.

41 / 53

[00117] Vantajosamente, as composições farmacêuticas para uso oral ou parenteral descritas acima são preparadas em formas de dosagem em uma dose unitária adequada para ajustar-se a uma dose dos ingredientes ativos. Essas formas de dosagem em uma dose unitária incluem, por exemplo, comprimidos, pílulas, cápsulas, injeções (ampolas), supositórios, etc. A quantidade da molécula de ligação supracitada contida é geralmente cerca de 5 a 500 mg por forma de dosagem numa dose unitária; especialmente na forma de injeção, em certas modalidades, a molécula de ligação supracitada está contida em cerca de 5 a 100 mg e em cerca de 10 a 250 mg para as outras formas de dosagem.

[00118] Terapias simples e combinadas. As moléculas de ligação da divulgação são úteis para o tratamento de doenças e distúrbios que são melhorados, inibidos ou melhorados pela redução da atividade de IL-4. Esses distúrbios incluem aqueles caracterizados por expressão anormal ou em excesso de IL-4, ou por uma resposta anormal do hospedeiro à produção de IL-4.

[00119] A divulgação abrange terapias de combinação em que a molécula de ligação anti-IL-4Rα (por exemplo, anticorpo ou fragmento de anticorpo) é administrada em combinação com um segundo agente terapêutico. A coadministração e a terapia de combinação não estão limitadas à administração simultânea, mas incluem regimes de tratamento em que uma molécula de ligação anti-IL-4Rα é administrada pelo menos uma vez durante um curso de tratamento que envolve a administração de pelo menos um outro agente terapêutico ao paciente. Um segundo agente terapêutico pode ser outro antagonista de IL-4, tal como outra molécula de ligação, ou um receptor de citocina solúvel, um antagonista de IgE, um medicamento anti-asma (corticosteróides, agentes não esteróides, β-agonistas, antagonistas de leucotrieno, xantinas, fluticasona, salmeterol, albuterol) que podem ser administrados por inalação ou outros meios apropriados. Em uma modalidade

42 / 53 específica, a molécula de ligação anti-IL-4Rα, como uma molécula de ligação da divulgação, pode ser administrada com um antagonista de IL-1, como rilonacepte, ou um antagonista de IL-13. Em alguns aspectos, uma molécula de ligação anti-IL-4Rα, como uma molécula de ligação da presente divulgação, pode ser administrada em combinação com uma molécula de ligação que tem como alvo citocinas e/ou receptores na resposta inflamatória Tipo 1 ou Tipo 2. O segundo agente pode incluir um ou mais antagonistas do receptor de leucotrieno para tratar distúrbios como doenças inflamatórias alérgicas, por exemplo, asma e alergias. Exemplos de antagonistas do receptor de leucotrieno incluem, mas não estão limitados a, montelucaste, pranlucaste e zafirlucaste. O segundo agente pode incluir um inibidor de citocina, tal como um ou mais de um TNF (etanercept, ENBREL ™), IL-9, IL-5 ou antagonista de IL-17.

[00120] Usos Terapêuticos

[00121] A divulgação fornece composições e métodos para o tratamento de uma doença ou distúrbio em um paciente em necessidade, compreendendo a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação da presente divulgação.

[00122] A divulgação fornece composições e métodos para o tratamento de uma doença ou distúrbio em um paciente em necessidade, compreendendo a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição da divulgação.

[00123] Em certas modalidades da presente divulgação, a doença ou distúrbio é uma doença ou distúrbio inflamatório Tipo 1 ou Tipo 2.

[00124] Em certas modalidades da presente divulgação, a doença ou distúrbio é uma doença ou distúrbio autoimune.

[00125] Em certas modalidades da presente divulgação, a doença ou distúrbio é uma doença ou distúrbio alérgico.

[00126] Em certas modalidades da divulgação, a doença ou distúrbio é

43 / 53 uma doença ou distúrbio imune.

[00127] Em certas modalidades da presente divulgação, a doença ou distúrbio é uma doença ou distúrbio proliferativo benigno. Em certas modalidades da presente divulgação, a doença ou distúrbio é uma doença ou distúrbio proliferativo maligno.

[00128] Em certas modalidades da presente divulgação, a doença ou distúrbio é dermatite atópica, asma, rinite alérgica, conjuntivite alérgica, esofagite eosinofílica, pólipos nasais ou uma combinação destes.

[00129] Em certas modalidades da divulgação, uma molécula de ligação da presente invenção é administrada sistemicamente. Em um aspecto, a molécula de ligação é administrada por via intravenosa ou subcutânea. Em outro aspecto, a molécula de ligação é administrada por uma injeção ou uma infusão. Em ainda outro aspecto, a molécula de ligação é administrada por uma injeção subcutânea.

[00130] Em certas modalidades da presente divulgação, a molécula de ligação é administrada sistemicamente. Em um aspecto, a molécula de ligação é administrada por uma injeção subcutânea. Em outro aspecto, uma dose terapeuticamente eficaz compreende uma injeção subcutânea de cerca de 75 mg, 150 mg, 300 mg ou 600 mg. Em ainda outro aspecto, a dose terapeuticamente eficaz compreende pelo menos uma injeção subcutânea, pelo menos duas injeções subcutâneas, pelo menos três injeções subcutâneas ou pelo menos quatro injeções subcutâneas de cerca de 75 mg, 150 mg, 300 mg ou 600 mg. Em ainda outro aspecto, a dose terapeuticamente eficaz compreende uma injeção subcutânea de cerca de 75 mg, 150 mg, 300 mg ou 600 mg uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada quatro semanas ou administrada cronicamente como uma dose de manutenção para controlar os sintomas da doença .

[00131] Em certas modalidades da divulgação, a molécula de ligação é administrada sistemicamente. Em um aspecto, a molécula de ligação é

44 / 53 administrada por uma injeção subcutânea. Em outro aspecto, a dose terapeuticamente eficaz compreende uma dose inicial de cerca de 600 mg. Em ainda outro aspecto, a dose inicial compreende um par de injeções de 300 mg cada, administradas em dois locais de injeção distintos. Em ainda outro aspecto, incluindo aqueles em que a dose terapeuticamente eficaz compreende uma dose inicial, a dose terapeuticamente eficaz compreende ainda uma dose de manutenção de cerca de 300 mg. Em outro aspecto, a dose de manutenção é administrada a cada duas semanas.

[00132] Em certas modalidades dos métodos da divulgação, a molécula de ligação é administrada sistemicamente. Em um aspecto, a molécula de ligação é administrada por via intravenosa a uma dose de cerca de 1,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, 8,0 mg/kg ou 12,0 mg/kg.

[00133] Em certas modalidades da divulgação, a molécula de ligação é administrada em combinação com um segundo agente terapêutico. Em um aspecto, o segundo agente terapêutico compreende um imunossupressor. Em um aspecto, o segundo agente terapêutico compreende um anticorpo agonístico. Em um aspecto, o segundo agente terapêutico compreende um imunoativador. Em outro aspecto, o segundo agente terapêutico compreende um inibidor de IL-1 β, um inibidor de IL-5, um inibidor de IL-9, um inibidor de IL-3, um inibidor de IL-13, um inibidor de IL-17, um inibidor de IL- 25 , um inibidor de TNFα, um inibidor de eotixina-3, um inibidor de IgE, um inibidor de prostaglandina D2, um imunossupressor, um corticosteroide, um glicocorticóide, um inibidor da bomba de prótons, um medicamento anti- inflamatório não esteroidal (NSAID) ou um combinação destes.

[00134] Em certas modalidades da divulgação, a molécula de ligação é administrada em combinação com um segundo agente terapêutico. Em um aspecto, o segundo agente terapêutico compreende um corticosteroide. Em um aspecto particular, o corticosteroide é um corticosteroide tópico.

[00135] Deve ser apreciado que as composições, formulações, kits,

45 / 53 métodos da presente divulgação não estão limitados a qualquer doença e/ou condição médica. As composições, formulações, kits e métodos da presente divulgação podem ser aplicados a qualquer doença e/ou condição médica na qual um paciente exibe reatividade preexistente a anticorpos terapêuticos. TABELA 1: SEQUÊNCIAS EXEMPLARES DA DIVULGAÇÃO.

SEQ ID Nome Sequência NO: CH1 IgG4 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTK 1

VDKRV CH2 IgG4 APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC 2

KVSNKGLPSSIEKTISKAK CH3 IgG4 GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEAL 3

HNHYTQKSLSLSLGK CH IgG4 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT

SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTK VDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC

VVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSV 4

LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS

LSLGK CH3 IgG1 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA 5

LHNHYTQKSLSLSPGK CH3 IgG2 GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQ PENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA 6

LHNHYTQKSLSLSPGK CH3 IgG4 L> P GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEAL 7

HNHYTQKSLSLSPGK CH IgG4 L> P ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT

VVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSV 8

LSPGK CDR1 de Cadeia GFTFRDYA 9 Pesada CDR2 de Cadeia ISGSGGNT 10 Pesada CDR3 de Cadeia AKDRLSITIRPRYYGL 11 Pesada CDR1 de Cadeia QSLLYSIGYNY 12 leve CDR2 de Cadeia LGS

NA leve CDR3 de Cadeia MQALQTPYT 14 leve

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SEQ ID Nome Sequência NO: Região variável de EVQLVESGGGLEQPGGSLRLSCAGSGFTFRDYAMTWVRQAPGKGL cadeia pesada EWVSSISGSGGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT 15

AVYYCAKDRLSITIRPRYYGLDVWGQGTTVTVS Região variável de DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSIGYNYLDWYLQKSGQ cadeia leve SPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGFYYCM 16

QALQTPYTFGQGTKLEIK Região de dobradiça APEFLG 17 de CH2 IgG4 IL4Rα MKVLQEPTCVSDYMSISTCEWKMNGPTNCSTELRLLYQLVFLLSEA

HTCIPENNGGAGCVCHLLMDDVVSADNYTLDLWAGQQLLWKGSF KPSEHVKPRAPGNLTVHTNVSDTLLLTWSNPYPPDNYLYNHLTYA 18

VNIWSENDPADFRIYNVTYLEPSLRIAASTLKSGISYRARVRAWAQC

YNTTWSEWSPSTKWHNSYREPFEQH CH IgG1 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL

TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP

EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR 19

VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ

KSLSLSPGK CH IgG4 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT

SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTK VDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC

VVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSV 20

LSLGK IgG4 LSPG 21 região de CH3 CH IgG4 truncado ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT

VVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSV 22

LS CH IgG2 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT

SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTK VDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC

VVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVL 23

TVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPML DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL

SPGK CH3 IgG4 truncado GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEAL 13

HNHYTQKSLSLS

EXEMPLOS Exemplo 1: A substituição das regiões constantes de CH3 IgG4 reduz a imunorreatividade preexistente em algumas amostras de pacientes.

[00136] Estudos de inibição competitiva foram conduzidos para

47 / 53 caracterizar os sinais de alta reatividade preexistentes observados em algumas amostras. Reagentes de anticorpos obtidos comercialmente ou anticorpos monoclonais especificamente construídos para este propósito foram usados nestes estudos. Uma lista de construtos de anticorpos ou reagentes que ajudaram a elucidar a especificidade desta reatividade preexistente é fornecida na Tabela 2. TABELA 2 Nome do anticorpo/reagente Isótipo Propriedades Construto de região de dobradiça Fc Dupilumabe IgG4k CPPC (sequência de dobradiça Fc) REGN-A IgG4k CPPC (sequência de dobradiça Fc) não específico para IL-4R REGN-B, C e E IgG4k CPPC (sequência de dobradiça Fc) IgG4 comercial tipo selvagem (WT) IgG4k CPSC (sequência de dobradiça Fc) wt IgG4 Fc Anticorpos de isotipos disponíveis comercialmente IgG1 Humana IgG1κ IgG2 humana IgG2λ IgG3 humana IgG3κ Dupilumabe e Anticorpos de Bioengenharia REGN-D (Dupilumabe) IgG4κ CPPC (sequência de dobradiça Fc) REGN-B IgG4κ CH 2-IgG4-CH3-IgG1 REGN-C IgG4κ C H 2-IgG4-C H 3 L445> P REGN-E IgG4κ CH2-IgG4-CH 3 truncado @ 444

[00137] Esses construtos de anticorpo foram usados a 200 µg/mL como inibidores competitivos no formato de ensaio de confirmação de anticorpo antifármaco (ADA). O formato do ensaio é mostrado na Figura 4 e os resultados do ensaio são mostrados na Figura 1 (Figura 1 e Figura 4). A alta porcentagem de inibição no ensaio indica que o determinado competidor foi capaz de inibir os sinais de reatividade preexistentes nessas amostras, sugerindo que a molécula competidora contém uma região à qual se liga a reatividade preexistente. Inibições percentuais mais baixas indicam que a molécula competidora não contém uma região à qual a reatividade preexistente pode se ligar. Os reagentes listados na Tabela 1 acima podem ser amplamente agrupados em três categorias, estrutura de IgG4/construtos de região Fc Hinge, anticorpos de isotipos comercialmente disponíveis e construtos de bioengenharia de dupilumabe. Os experimentos iniciais examinaram se esta alta reatividade do ensaio foi direcionada ao CDR ou à

48 / 53 estrutura de IgG4 do dupilumabe. REGN-A é um anticorpo monoclonal humano que possui a mesma estrutura IgG4 do dupilumabe, mas uma sequência CDR diferente e não se liga ao IL-4Rα.

[00138] Conforme mostrado na Figura 1, os experimentos de inibição competitiva usando dupilumabe e REGN-A demonstraram inibição significativa dos sinais de ensaio elevados nas seis amostras de linha de base dos pacientes examinados. Como as sequências da região CDR desses dois anticorpos são diferentes, esse resultado de inibição sugere que a alta reatividade do sinal não é direcionada à porção CDR do dupilumabe, mas sim a algumas sequências comuns da estrutura do anticorpo. Tanto o dupilumabe quanto o REGN-A contêm uma sequência da região de dobradiça IgG1 “CPPC” que estabiliza a região de dobradiça do anticorpo nessas moléculas de IgG4. Para determinar se a imunorreatividade preexistente tem como alvo esta mutação CPPC, um anticorpo comercial IgG4κ que tem a sequência CPSC de tipo selvagem (wt) na região de dobradiça foi examinado no experimento de inibição competitiva. Como pode ser visto na Figura 1, o anticorpo IgG4 de tipo selvagem também mostrou inibição significativa semelhante a dupilumabe e REGN-A. Este resultado sugere que o sinal de ensaio de alta linha de base não é direcionado para a mutação da região de dobradiça CPPC em dupilumabe, mas é mais provavelmente direcionado contra as regiões constantes de tipo selvagem da molécula de IgG4. Estes resultados indicam que os sinais elevados observados na linha de base não são específicos para dupilumabe.

[00139] Experimentos adicionais foram conduzidos para determinar se esta alta reatividade preexistente do ensaio foi direcionada para as sequências da região constante que seriam comuns entre os diferentes subtipos de IgG. Usando a mesma abordagem de inibição competitiva, examinou-se o impacto de três anticorpos IgG1κ, IgG2κ, IgG3κ humanos obtidos comercialmente nesta resposta preexistente. Nenhum desses anticorpos inibiu os altos sinais

49 / 53 de linha de base nessas amostras (vide Figura 1). Isso sugeriu que a reatividade preexistente estava provavelmente associada a uma região que é única para as sequências da região constante de IgG4 e que não era compartilhada por nenhum dos subtipos de IgG testados.

[00140] Foi construído um anticorpo monoclonal humano (REGN-B) que era semelhante ao dupilumabe, exceto que o domínio CH3 de IgG4 foi substituído por um domínio CH3 de IgG1 (vide Figura 2). Este anticorpo foi examinado em estudos de competição para determinar se a reatividade preexistente era direcionada ao domínio CH 3 de dupilumabe. REGN-B não inibiu significativamente os sinais altos nas amostras (vide Figura 1), sugerindo que a reatividade preexistente é provavelmente direcionada a alguma região dentro do domínio C H3 da molécula de IgG4.

[00141] Para identificar ainda mais a área que pode estar associada a esses sinais elevados dentro do domínio CH 3 de dupilumabe, foi realizado um alinhamento da sequência de aminoácidos do domínio CH3 dos anticorpos IgG4, IgG1 e IgG2 (vide Figura 3). Foram observadas diferenças em seis posições de aminoácidos individuais entre as sequências de domínio CH3 de IgG4 e IgG1 e cinco posições de aminoácidos individuais entre as sequências de domínio C H 3 de IgG4 e IgG2 (vide Figura 3).

[00142] A construção de IgG4 com uma substituição de leucina (L) por prolina (P) na posição 445 estava disponível e foi examinada no ensaio de inibição competitiva. Esta construção não apresentou inibição significativa destes sinais elevados de ensaio. Isso indicou que a reatividade preexistente era provavelmente específica para a região L445 do dupilumabe. Amostras adicionais com alto sinal de ensaio foram examinadas no ensaio de inibição competitiva usando esta construção com substituição de L para P na posição 445 e níveis baixos de inibição semelhantes foram observados. Isso pareceu confirmar que a reatividade preexistente tem como alvo específico a região em torno de L445. Portanto, uma mudança de Leucina (em wt IgG4) para

50 / 53 Prolina (presente na mesma posição em wt IgG1, IgG2 e IgG3) em dupilumabe anula esta resposta preexistente que leva a sinais elevados no ensaio ADA.

[00143] Uma construção de IgG4 com uma substituição de leucina (L) por prolina (P) na posição 445 estava disponível e foi examinada no ensaio de inibição competitiva. Esta construção não apresentou inibição significativa destes sinais elevados de ensaio. Isso indicou que a reatividade preexistente era provavelmente específica para a região L445 do dupilumabe. Amostras adicionais com alto sinal de ensaio foram examinadas no ensaio de inibição competitiva usando esta construção com substituição de L para P na posição 445 e níveis baixos de inibição semelhantes foram observados. Isso pareceu confirmar que a reatividade preexistente tem como alvo específico a região em torno de L445. Portanto, uma mudança de Leucina (em wt IgG4) para Prolina (presente na mesma posição em wt IgG1, IgG2 e IgG3) em dupilumabe anula esta resposta preexistente que leva a sinais elevados no ensaio ADA.

[00144] Um segundo construto de anticorpo monoclonal humano baseado em dupilumabe (REGN-C) foi gerado. Esta construção é idêntica ao dupilumabe, exceto pela inserção de uma mutação pontual no resíduo 445 na sequência do anticorpo, onde uma Leucina é alterada para Prolina (abreviado como L> P). REGN-C não pode inibir significativamente os sinais altos nas amostras de linha de base que foram testadas (vide Figura 1 e Figura 2). Isso confirmou que a reatividade preexistente tem como alvo específico a região em torno de L445 em dupilumabe e sugeriu que o uso deste dupilumabe de bioengenharia no ensaio de ADA elimina a maioria, senão todo o sinal de fundo de alto nível observado no ensaio de ADA atual.

[00145] Outras experiências foram realizadas usando dois anticorpos adicionais, REGN-F e REGN-G, para demonstrar que a modificação do resíduo 445 na sequência do anticorpo de Leucina para Prolina anula a

51 / 53 reatividade preexistente. Conforme mostrado na Figura 7, os experimentos de inibição competitiva usando Dupilumabe, REGN-F e REGN-G demonstraram inibição significativa dos sinais de ensaio elevados nas seis amostras de linha de base, mostrando assim que Dupilumabe, REGN-F e REGN-G exibem um alto nível de reatividade preexistente. No entanto, uma substituição de Leucina por Prolina na posição 445 de REGN-F e REGN-G, aqui referida como REGN-F (L445P) e REGN-G (L445P), respectivamente, anulou esta reatividade preexistente, como REGN-F e REGN-G foram incapazes de inibir os altos sinais de ensaio. REGN-F, REGN-F (L445P), REGN-G e REGN-G (L445P) também foram testados como reagentes em um ensaio de anticorpo antifármaco de ponte específico de fármaco, semelhante ao descrito na Figura

4. Como mostrado nas Figuras 8 e 9, quando REGN-F e REGN-G foram usados como os reagentes de captura e detecção demonstraram alto sinal de ensaio indicativo de alta reatividade preexistente. Em contraste, quando REGN-F (L445P) foi usado como o reagente de captura em combinação com REGN-F como o reagente de detecção (Figura 8), ou quando REGN-G foi usado como o reagente de captura em combinação com REGN-G (L445P) como o reagente de detecção (Figura 9), o sinal do ensaio foi significativamente reduzido, demonstrando que as substituições de L445P anulam a reatividade preexistente. REGN-F e REGN-G compreendem domínios variáveis distintos que também são diferentes dos domínios variáveis dos anticorpos testados nos resultados mostrados na Figura 1. Assim, os resultados mostrados nas Figuras 7 a 9 demonstram que a reatividade preexistente é independente dos domínios variáveis e dos CDRs e, em vez disso, é específica para a região em torno de L445. Além disso, demonstra que a substituição de L445P pode ser geralmente aplicada a anticorpos IgG4, independentemente da identidade de seus CDRs para reduzir a reatividade preexistente.

[00146] Uma região na sequência de dupilumabe para a qual pelo

52 / 53 menos a maior parte da reatividade preexistente é direcionada foi identificada. Os sinais elevados no ensaio de ADA parecem ter sido gerados devido a algum constituinte da matriz nessas amostras de soro que pode fazer a ponte entre as moléculas de dupilumabe marcadas no ensaio por ligação em ou próximo a L445 no domínio CH3. Isso indica que essa reatividade preexistente não é específica do dupilumabe, mas pode se ligar a qualquer molécula de IgG4. Além disso, os resultados sugerem que o uso desta versão modificada de dupilumabe com a mutação L445P no ensaio ADA elimina a maior parte, senão todo o sinal de fundo de alto nível. Exemplo 2: Desenvolvimento de um ensaio de anticorpo antifármaco (ADA) modificado que reduz a imunorreatividade de fundo em amostras de pacientes

[00147] Foi desenvolvido um ensaio de ADA modificado que usa um REGN-C biotinilado (com a mutação L445P) como o agente de captura. A Figura 4 ilustra a diferença no desenho do ensaio entre o ensaio ADA atual e o ensaio ADA modificado usando REGN-C. Para fins de clareza, o ensaio ADA atual será considerado como "ensaio de ADA número 1" e o ensaio de ADA modificado será referido como "ensaio de ADA número 2." A Figura 5 mostra uma análise comparativa dos sinais de tela de ADA obtidos usando o ensaio ADA número 1 atual versus Ensaio ADA número 2, de todas as amostras de linha de base do paciente. O painel 5A mostra um gráfico da razão sinal-ruído gerada por essas amostras de linha de base de alto sinal ADA no ensaio de tela ADA atual (Ensaio número 1), enquanto o painel 5B mostra um gráfico da razão sinal-ruído gerada pelas mesmas amostras exatas em o ensaio ADA número 2. O formato de ensaio do ensaio ADA número 2 reduz significativamente os sinais elevados observados no atual ensaio de triagem ADA. Algumas amostras ainda demonstram reatividade no ensaio de ADA número 2, mas o número de positivos de triagem cai mais em linha com a taxa de falsos positivos esperada para um ensaio de triagem e o nível de

53 / 53 resposta do sinal para essas amostras positivas é geralmente muito menor do que o observado usando a corrente Ensaio ADA. A queda observada desses altos sinais de ensaio para valores próximos à linha de base na maioria dos casos no ensaio ADA # 2, deve permitir a detecção aprimorada de ADAs emergentes de tratamento e específicos de fármacos em uma população de pacientes.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

[00148] Cada documento aqui citado, incluindo qualquer referência cruzada ou patente ou pedido relacionado, é aqui incorporado por referência em sua totalidade, a menos que expressamente excluído ou de outra forma limitado. A citação de qualquer documento não é uma admissão de que é estado da técnica com relação a qualquer divulgação divulgada ou reivindicada neste documento ou que apenas, ou em qualquer combinação com qualquer outra referência ou referências, ensina, sugere ou divulga qualquer divulgação. Além disso, na medida em que qualquer significado ou definição de um termo neste documento conflite com qualquer significado ou definição do mesmo termo em um documento incorporado por referência, o significado ou definição atribuída a esse termo neste documento prevalecerá.

OUTRAS MODALIDADES

[00149] Embora certas modalidades da divulgação tenham sido ilustradas e descritas, várias outras mudanças e modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito e do escopo da divulgação. O escopo das reivindicações anexas inclui todas as mudanças e modificações que estão dentro do escopo desta divulgação.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo monoclonal de ocorrência não natural caracterizado por compreender uma sequência C-terminal de cadeia pesada compreendendo uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 13, ou uma porção de ligação ao antígeno deste.

2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela sequência C-terminal de cadeia pesada ser uma sequência de domínio CH3.

3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, caracterizado pela sequência C-terminal de cadeia pesada compreender a SEQ ID NO: 7.

4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, caracterizado pela sequência C-terminal de cadeia pesada C- terminal compreender a SEQ ID NO: 13.

5. Anticorpo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela sequência C-terminal de cadeia pesada compreender uma sequência de domínio CH compreendendo a SEQ ID NO: 8.

6. Anticorpo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela sequência C-terminal de cadeia pesada compreender uma sequência de domínio CH compreendendo SEQ ID NO: 22.

7. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo anticorpo compreender ainda uma região CDR1 VH compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9; uma região CDR2 VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; uma região CDR3 VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; uma região CDR1 VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; uma região CDR2 VL compreendendo a sequência de aminoácidos de LGS; uma região CDR3 VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

8. Anticorpo monoclonal de ocorrência não natural, caracterizado pelo anticorpo compreender uma região CDR1 VH compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9; uma região CDR2 VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; uma região CDR3 de VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; uma região CDR1 VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; uma região CDR2 VL compreendendo a sequência de aminoácidos de LGS; uma região CDR3 VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, e um domínio CH3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 13, ou uma porção de ligação ao antígeno deste.

9. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo anticorpo compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 , ou uma porção de ligação ao antígeno deste.

10. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo anticorpo compreender uma região IgG4 CH1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

11. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo anticorpo compreender uma região IgG4 CH2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

12. Anticorpo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pela região CH2 IgG4 compreender uma região da dobradiça.

13. Anticorpo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pela região da dobradiça compreender a sequência APEFLG (SEQ ID NO: 17).

14. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo referido anticorpo mitigar alto sinal de fundo durante uma análise de imunogenicidade.

15. Ensaio, caracterizado por compreender (a) um suporte sólido, em que um primeiro componente está operacionalmente ligado ao suporte sólido; (b) pelo menos um agente de captura, em que um segundo componente está operacionalmente ligado a pelo menos um agente de captura, em que o agente de captura compreende um primeiro anticorpo monoclonal de ocorrência não natural, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, e (c) pelo menos um agente de detecção, em que um marcador detectável está operacionalmente ligado ao agente de detecção, em que o agente de detecção compreende um segundo anticorpo monoclonal de ocorrência não natural, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, e em que o primeiro componente e o segundo componente se ligam seletivamente um ao outro.

16. Ensaio de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo agente de detecção compreender dupilumabe.

17. Ensaio de acordo com a reivindicação 15 ou a reivindicação 16, caracterizado pelo segundo anticorpo monoclonal de ocorrência não natural compreender dupilumabe.

18. Ensaio de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo primeiro componente compreender estreptavidina.

19. Ensaio de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizado pelo segundo componente compreender biotina.

20. Ensaio, caracterizado por compreender

(a) um suporte sólido, em que um primeiro componente está operacionalmente ligado ao suporte sólido; (b) pelo menos um agente de captura, em que um segundo componente está operacionalmente ligado a pelo menos um agente de captura e em que o agente de captura compreende o anticorpo monoclonal de ocorrência não natural, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14; e (c) pelo menos um agente de detecção, em que um marcador detectável está operacionalmente ligado ao agente de detecção e em que o agente de detecção compreende dupilumabe; em que o primeiro componente e o segundo componente se ligam seletivamente um ao outro.

21. Ensaio de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo primeiro componente compreender estreptavidina.

22. Ensaio de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado pelo segundo componente compreender biotina.

23. Ensaio de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, caracterizado por o pelo menos um agente de captura não se ligar a um anticorpo que não se liga especificamente a uma sequência de uma região variável de dupilumabe.

24. Ensaio de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, caracterizado por o pelo menos um agente de captura e o pelo menos um agente de detecção se ligarem a um anticorpo que se liga especificamente a uma sequência de uma região variável de dupilumabe.

25. Método para determinar um nível de imunogenicidade de uma terapia de anticorpo monoclonal em um paciente, caracterizado por compreender (a) colocar uma amostra biológica do paciente em contato com o ensaio, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 24, sob condições adequadas para permitir a ligação de pelo menos um anticorpo na amostra biológica com o pelo menos um agente de captura e o pelo menos um agente de detecção, em que o paciente recebeu a terapia de anticorpo monoclonal antes da etapa de contato, (b) detectar um sinal do pelo menos um agente de detecção, e (c) identificar o nível de imunogenicidade do paciente como alto quando o sinal de (b) está acima de um valor limite ou (d) identificar o nível de imunogenicidade do paciente como baixo quando o sinal de (b) está abaixo do valor limite.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pela terapia com anticorpo monoclonal compreender um anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.

27. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pela terapia com anticorpo monoclonal compreender dupilumabe.

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27, caracterizado pelo limite ser um valor predeterminado.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo limite ser um limite de segurança.

30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 29, caracterizado pela quantidade da terapia com anticorpo monoclonal ser uma dose terapeuticamente eficaz.

31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 30, caracterizado pelo nível de imunogenicidade ser um nível de linha de base.

32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 31, caracterizado pelo nível de imunogenicidade ser um nível subsequente.

33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 32, caracterizado pelo paciente ser um participante de um ensaio clínico.

34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 33, caracterizado pelo paciente ser um paciente em tratamento médico.

35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo tratamento médico estar começando e o nível de imunogenicidade ser um nível de linha de base.

36. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo tratamento médico estar em andamento e o nível de imunogenicidade ser um nível subsequente.

37. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo tratamento médico estar terminando e o nível de imunogenicidade ser um nível final.

38. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 37, caracterizado pelo paciente ser um indivíduo saudável.

39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 37, caracterizado pelo paciente ter uma doença ou distúrbio inflamatório, uma doença ou distúrbio autoimune, uma doença ou distúrbio alérgico, uma doença ou distúrbio imune ou uma doença ou distúrbio proliferativo benigno.

40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo paciente ter dermatite atópica, asma, rinite alérgica, conjuntivite alérgica, esofagite eosinofílica, pólipos nasais ou uma combinação destes.