BR112020026363A2 - Determinação de potência de tecido através de análise histomorfológica quantitativa - Google Patents
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Abstract
são divulgados sistemas e métodos para realizar análise histopatológica quantitativa para determinar a potência do tecido. de acordo com algumas modalidades, um método para treinar um classificador de tecido é fornecido. de acordo com o método, treinar o classificador de tecido inclui gerar impressões digitais de recursos de núcleos detectados dentro de imagens de lâminas em uma biblioteca de controle e agregar as imagens de lâminas com base em suas impressões digitais de recursos correspondentes. de acordo com algumas modalidades, um método para utilizar o classificador de tecido treinado é fornecido. de acordo com o método, o classificador de tecido treinado determina se o tecido em uma imagem de lâmina desconhecida corresponde a imagens de lâmina agregadas durante o treinamento do classificador de tecido.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para:
[001] Este pedido reivindica o benefício e a prioridade do Pedido Provisório dos Estados Unidos Nº 62/694.829, depositado em 6 de julho de 2018, cujo assunto é aqui incorporado por referência.
[002] As modalidades descritas referem-se a uma abordagem quantitativa para a realização de análise histomorfológica quantitativa de imagens digitais de células em uma amostra de tecido para determinar candidatos de transplante de tecido viáveis.
[003] A invenção pode ser entendida por referência à preparação de produto derivado de tecido de timo pós-natal cultivado alogênico, embora esta divulgação e as reivindicações da invenção não estejam limitadas a tal modalidade da invenção.
[004] O produto derivado de tecido de timo pós- natal cultivado alogênico demonstrou ser útil para o tratamento de imunodeficiência de células T (imunodeficiência primária) resultante de atimia congênita, por exemplo, no tratamento de Anomalia de DiGeorge completa
(cDGA) associada à deleção 22q11.2 e Síndrome de CHARGE (coloboma, defeito cardíaco, atresia coanal, retardo mental ou de crescimento, hipoplasia genital e anomalias de ouvido ou surdez) associada a mutações no gene chd7 (proteína 7 de ligação ao cromodomínio-helicase-DNA) e em pacientes atímicos com deficiência de proteína N1 da caixa forkhead (FOXN1). A atimia congênita é uma condição fatal rara e atualmente não possui opções de tratamento com medicamentos que utilizam produtos de fármacos aprovados por regulamentação.
[005] O transplante experimental de produto derivado de um tecido tímico pós-natal alogênico cultivado que retém células epiteliais do timo (TECs) foi aplicado com sucesso no tratamento de pacientes pediátricos com atimia congênita (Markert ML, Devlin BH, McCarthy EA, 2010, "Thymus transplantation", Clin Immunol., 135(2): 236 a 246; Markert ML et al., 2004, "Postnatal thymus transplantation with immunosuppression as treatment for DiGeorge syndrome,” Blood 104(8): 2.574 a 2.581; Markert ML, et al., 1999, “Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge syndrome”, N Engl J Med 341(16):1.180 a 1.189 27).
[006] O produto derivado de tecido de timo pós- natal cultivado alogênico é um produto de tecido modificado geneticamente que é preparado, cultivado e armazenado por até 21 dias para produzir fatias de tecido de timo parcialmente esgotadas de células T e que é diferenciado do timo nativo por um processo de condicionamento. O regime de condicionamento esgota parcialmente os timócitos doadores das fatias de tecido do timo cultivado. Com base em dados in vitro (imuno-histoquímica), um período de cultura entre 12 e 21 dias preserva a rede epitelial conforme avaliada usando anticorpos de citoqueratina. A cultura é, de preferência, feita a 37 °C em uma incubadora de CO2 a 5%.
[007] O processo de cultura modifica significativamente as características biológicas do tecido do timo doador e das células constituintes nele contidas, da seguinte maneira, para otimizar as propriedades terapêuticas efetivas das fatias de produto derivado de tecido do timo pós-natal cultivado alogênico. O processo de cultura assegura que uma composição definida das células/tecido cultivado com as características biológicas pré-necessárias seja obtida de uma maneira adequada para implantação cirúrgica em um indivíduo para permitir a reconstituição do sistema imunológico do indivíduo. O processo de cultura resulta em perda de timócitos e enriquecimento relativo de células epiteliais tímicas e outras células estromais nas fatias de tecido do timo doador. O processo de cultura resulta ainda na depleção de timócitos e manutenção de TECs para permitir a reconstituição do sistema imunológico do receptor e permite que a tolerância se desenvolva no receptor para antígenos HLA no timo do doador. Em geral, o processo de fabricação é projetado para esgotar os timócitos do tecido do timo doador e preservar a arquitetura funcional do estroma do timo (células epiteliais do timo e fibroblastos).
[008] A administração cirúrgica de produto derivado de tecido tímico pós-natal alogênico e cultivado (por exemplo, “RVT-802”) em pacientes atímicos leva a uma cascata de eventos, resultando no desenvolvimento de um sistema imunológico funcional. Após a colocação cirúrgica do produto derivado de tecido tímico pós-natal alogênico e cultivado em um receptor, as células T são educadas por TECs doadoras e células dendríticas receptoras (DCs). As TECs doadoras em conjunto com as DCs receptoras permitem tolerância ao tecido do timo doador implantado, que é implantado como fatias de tecido do timo cultivadas. Esta é a mesma indução de tolerância que em um timo normal. As TECs receptoras em conjunto com as DCs receptoras levam à tolerância a si mesmas.
[009] A timopoiese foi documentada por biópsias de aloenxertos e a presença de células T virgens receptoras na periferia (Markert ML, 2010; Markert ML, et al., 2008, “Use of allograft biopsies to assess thymopoiesis after thymus transplantation”, J Immunol 180(9):6.354 a 6.364; Markert ML, et al., 2007, “Review of 54 patients with complete DiGeorge anomaly enrolled in protocols for thymus transplantation: outcome of 44 consecutive transplants”, Blood 109(10):4.539 a 454.728), que são incorporados neste documento por referência.
[010] Estudos de crianças tratadas com produtos derivados de tecido de timo pós-natal de cultura alogênica experimental mostram tolerância ao complexo de histocompatibilidade principal (MHC) do doador por reações de linfócitos mistos (Chinn IK, Devlin BH, Li YJ, & Markert ML, 2008, “Long-term tolerance to allogeneic thymus transplants in complete DiGeorge anomaly,” Clin Immunol 126(3):277 a 281). Além disso, as crianças com atimia congênita, após transplante de tecido derivado de tecido de timo pós-natal de cultura alogênico, são capazes de controlar infecções como o vírus Epstein Barr (Markert ML, 2014, Thymus Transplantation. Stiehm’s Immune Deficiencies, eds Sullivan KE & Stiehm ER (Academic Press), 1ª Ed. páginas 1.059 a
1.067.
[011] Historicamente, os critérios de liberação de produto derivado de tecido de timo pós-natal cultivados alogênicos incluíram avaliação histopatológica de H&E e seções de tecido imunocoradas no ponto médio do processo de fabricação, que foi posteriormente refinado para 5 a 9 dias do período de cultura. Esta avaliação histopatológica serviu como teste de potência e foi realizada como uma análise qualitativa por um patologista credenciado. As amostras foram preparadas para avaliação por congelamento ou fixação com formalina antes de a fatia de tecido ser seccionada e então fixada em uma lâmina. As amostras preparadas desta maneira são estáveis por longos períodos de tempo, permitindo a realização de uma reanálise.
[012] As amostras históricas disponíveis de mais de 20 anos de história de desenvolvimento podem ser vinculadas a resultados clínicos positivos e, portanto, fornecem um forte conjunto de dados para o desenvolvimento de um ensaio histológico quantitativo para avaliação da qualidade do produto.
[013] Um novo ensaio histológico digital foi desenvolvido usando imagens digitalizadas de lâminas de H&E de lotes clínicos anteriores e de lotes experimentais de produtos derivados de tecido de timo pós-natal de cultura alogênica. Estas imagens foram analisadas para desenvolvimento em um ensaio de liberação quantitativa, conforme descrito abaixo.
[014] As modalidades totalmente divulgadas neste documento descrevem um método para avaliar quantitativamente as características nucleares gerais de um tecido representado em uma imagem de lâmina.
[015] Uma aplicação das modalidades divulgadas é o desenvolvimento, por meio do treinamento de um classificador de tecido, de um ensaio que é capaz de determinar a potência ou a qualidade do tecido antes do transplante em pacientes.
Por exemplo, as abordagens descritas abaixo podem ser aplicadas para determinar a potência de fatias de produto derivado de tecido de timo pós-natal de cultura alogênica para pacientes com síndrome de DiGeorge. As modalidades descritas podem ser utilizadas como um ensaio de caracterização de tecido de fatias de produto derivado de tecido de timo pós-natal de cultura alogênica que avalia a potência do tecido do timo com base na análise de imagem de lâmina histológica e associando tecidos aprovados com uma classificação de aprovação e tecidos reprovados com uma classificação de reprovação de potência. Como mostrado na Figura 1 abaixo, um classificador recebe, como entrada, uma imagem de lâmina não classificada e determina, com base em uma análise da imagem de lâmina não classificada, se o tecido na imagem de lâmina não classificada é um candidato para transplante de tecido.
[016] Como será discutido em detalhes adicionais abaixo, as modalidades descritas descrevem uma fase de treinamento que inclui o treinamento do classificador com base em uma biblioteca de imagens de lâmina e uma fase de classificação que inclui a utilização do classificador treinado em uma imagem de lâmina não classificada para determinar a potência do tecido representado na imagem de lâmina não classificada. A fase de treinamento treina o classificador por meio de uma avaliação quantitativa das características nucleares que estão associadas à composição do tecido e à viabilidade celular. A fase de treinamento inclui a análise de imagens de lâminas de aprovação e reprovação para treinar o classificador a reconhecer as características nucleares correspondentes nas imagens de lâminas de aprovação e reprovação. O classificador resultante implementa um ensaio que reconhece a composição de aprovação e reprovação e as características de viabilidade com base nos dados históricos que resultam na reconstituição imunológica bem-sucedida após a implantação do tecido.
[017] Em uma modalidade, a fase de treinamento inclui duas partes. A primeira parte inclui a validação de um conjunto de dados de treinamento que é usado para gerar critérios de adequação para valores de metadados, valores de fundo e entropia de tecido apropriados, e pode definir faixas ou valores aceitáveis que são considerados aceitáveis para análise quantitativa. O conjunto de dados de treinamento inclui imagens de lâmina que são conhecidas por terem uma classificação de aprovação ou reprovação para transplante.
Podem ser imagens de lâminas que foram analisadas por um patologista ou outro profissional médico, por exemplo. A segunda parte inclui a aplicação de intervalos ou valores aceitáveis gerados na primeira parte para imagens dentro de uma biblioteca de controle, o que resulta na agregação das imagens em grupos de controle positivo e negativo. Como será discutido mais abaixo no relatório descritivo e nos Exemplos, cada grupo de controle inclui imagens de lâminas agrupadas com base em ter impressões digitais de recursos semelhantes.
Os grupos de controle positivo incluem imagens de lâminas com impressões digitais de recurso semelhantes determinadas como aprovadas nos critérios de transplante; os grupos de controle negativo incluem imagens de lâminas com impressões digitais de recurso semelhantes determinadas como reprovadas nos critérios para transplante.
[018] Em uma modalidade, a fase de classificação então analisa novas imagens de lâmina com base nos grupos de controle positivo e negativo e agrega as novas imagens de lâmina com base nas respectivas impressões digitais de recursos. A fase de classificação então determina a potência das novas imagens de lâmina com base no fato de as novas imagens de lâmina serem agregadas com os grupos de controle positivo ou negativo.
[019] Em uma modalidade, as impressões digitais de recurso são baseadas em quatro determinações das células do timo em cultura. Isso inclui “área”, “circularidade”, “densidade integrada” e “perímetro”. Conforme discutido abaixo, “área” mede a área nuclear que é maior para células epiteliais do timo do que para timócitos. As células em apoptose também tendem a ser menores. “Circularidade” mede o quão circulares as células são. A circularidade é medida em uma escala de 0 a 1, sendo 1 um círculo perfeito. Os timócitos têm circularidade aumentada em comparação com as células epiteliais do timo. As células não viáveis têm circularidade reduzida em comparação com as células viáveis.
Como tal, pode-se esperar que a circularidade diminua ao longo do tempo de cultura, uma vez que ambos os timócitos são reduzidos e mais células não viáveis podem ser observadas nas fatias de tecido. Também se espera que as amostras degradadas tenham uma circularidade diminuída, pois haveria mais células não viáveis, mudando assim a distribuição para uma circularidade mais baixa. “Densidade integrada” representa o quão escuro um núcleo está manchado. A densidade integrada é alta para timócitos, que apresentaram coloração escura uniforme. As células epiteliais tímicas têm bordas manchadas de escuro e principalmente nucleoplasma claro com nucléolo escuro proeminente. Finalmente, “Perímetro” representa o contorno dos núcleos que são detectados. O perímetro está relacionado à viabilidade celular; à medida que as células se degradam, o contorno nuclear torna-se irregular e seu perímetro aumenta. O perímetro também aumentaria à medida que a proporção de células TEC em relação ao total de células aumentasse com o progresso da cultura.
As mudanças de perímetro são esperadas ao longo do tempo na cultura, bem como com a degradação do tecido.
[020] As modalidades descritas são uma melhoria em relação às abordagens atuais que dependem exclusivamente da análise qualitativa direcionada por humanos, via imuno- histoquímica (IHC) e histopatologia de hematoxilina e eosina (H&E) de imagens de lâmina para determinar a potência. Essas abordagens atuais sofrem de uma série de limitações que diminuem a eficácia das análises qualitativas atuais, incluindo a incapacidade de fazer tais análises qualitativas ou semiquantitativas ou quantitativas e que, no ensaio humano, um patologista não pode avaliar todo o tecido. Em vez disso, o patologista está olhando apenas para uma parte do tecido (um campo de visão individual) em oposição a toda a fatia de tecido.
[021] Além disso, as modalidades descritas são particularmente mais eficazes do que as abordagens convencionais para analisar tecidos complexos, como o timo.
Em tecidos complexos, a orientação do tecido da amostra pode alterar significativamente as variações dos resultados. Por exemplo, duas fatias separadas com morfologias muito diferentes (por exemplo, razão corticomedular) podem ser consideradas amostras “boas” (ou seja, têm uma classificação de aprovação) com potência aceitável. As modalidades descritas evitam esta limitação e, portanto, são eficazes na classificação de todos os tecidos.
[022] As modalidades descritas baseiam-se em análise quantitativa, alavancando uma biblioteca de imagens de lâmina com potência e eficácia conhecidas. As imagens de lâminas na biblioteca incluem imagens de tecidos que foram aprovados ou reprovados nos critérios de potência desse tecido em particular, associando tais tecidos a resultados clínicos bons ou ruins (por exemplo, sobrevivência ou não).
As imagens de lâmina que foram aprovadas podem ser associadas a uma classificação de aprovação, enquanto as imagens de lâmina que reprovaram podem ser associadas a uma classificação de reprovação.
[023] As modalidades descritas podem ser implementadas em um ou mais processadores. Os um ou mais processadores podem ser colocados ou distribuídos em uma rede, como uma LAN, WAN ou a Internet (por exemplo, nuvem).
Um ou mais desses processadores podem ser uma unidade de processamento gráfico (GPU). Em uma modalidade, uma GPU pode ser um processador que é um circuito eletrônico especializado projetado para processar aplicativos matematicamente intensivos. A GPU pode ter uma estrutura paralela que é eficiente para o processamento paralelo de grandes blocos de dados, como dados matematicamente intensivos comuns a aplicativos gráficos de computador, imagens, vídeos, etc. Os um ou mais processadores podem ser acoplados a uma memória que inclui um ou mais níveis de cache, e que podem ter lógica de controle (por exemplo, software de computador) e/ou dados armazenados no mesmo.
[024] Um primeiro aspecto da presente divulgação fornece um método de treinamento de um classificador de tecido para realizar avaliação histopatológica quantitativa, que compreende: converter uma imagem de lâmina em uma imagem de lâmina binária, em que a imagem de lâmina é selecionada a partir de uma biblioteca de imagens de controle, em que cada imagem de lâmina na biblioteca de imagens de controle está associada a uma classificação de aprovação ou reprovação; detectar um ou mais núcleos dentro da imagem de lâmina binária; para cada núcleo detectado, extração de um recurso do núcleo detectado, em que o recurso representa uma propriedade do núcleo detectado dentro da imagem de lâmina binária e compreende pelo menos uma de uma área do núcleo detectado, um perímetro do núcleo detectado, uma densidade integrada do núcleo detectado, ou uma circularidade do núcleo detectado; para cada núcleo detectado, gerar, com base no recurso, uma impressão digital do recurso associada à imagem de lâmina binária, em que a impressão digital do recurso é um valor numérico calculado a partir do processamento do recurso;
incorporar a imagem de lâmina binária em um agregado, em que o agregado compreende uma pluralidade de imagens, em que cada uma da primeira pluralidade de imagens está associada a uma impressão digital de recurso correspondente, e em que a incorporação é baseada na comparação da impressão digital de recurso com a impressão digital de recurso correspondente; aplicar uma altura de corte ao agregado para formar uma pluralidade de grupos, em que a altura de corte minimiza uma série de grupos dentro da pluralidade de grupos com base na análise multivariada de análise de variância do agregado; categorizar um primeiro grupo dentro da pluralidade de grupos como um conjunto de controle positivo se o primeiro grupo compreender primeiras imagens de lâmina associadas com a classificação de aprovação; e categorizar um segundo grupo dentro da pluralidade de grupos como um conjunto de controle negativo se o segundo grupo compreender segundas imagens de lâmina associadas à classificação de reprovação.
[0025] Um segundo aspecto da presente divulgação é um método para realizar uma avaliação histopatológica quantitativa de uma imagem de lâmina não classificada de um tecido, que compreende: detectar um canal de hematoxilina a partir da imagem de lâmina não classificada, em que o canal da hematoxilina está associado a um núcleo celular dentro da imagem de lâmina não classificada de um tecido;
extrair um recurso do canal de hematoxilina detectado,
em que o recurso representa uma propriedade do núcleo dentro da imagem de lâmina binária e compreende pelo menos um dentre uma área do núcleo, um perímetro do núcleo, uma densidade integrada do núcleo ou uma circularidade do núcleo;
gerar, com base no recurso, uma impressão digital do recurso associada à imagem de lâmina não classificada, em que a impressão digital do recurso é um valor numérico calculado a partir do processamento do recurso;
coagregar a impressão digital de recurso com um primeiro conjunto de impressões digitais associadas a um ou mais conjuntos de controle positivo e um segundo conjunto de impressões digitais associadas a um conjunto de controle negativo, em que o conjunto (ou conjuntos) de controle positivo compreende um primeiro conjunto de imagens de lâmina associadas com uma classificação de aprovação e o conjunto de controle negativo compreende um segundo conjunto de imagens de lâmina associadas a uma classificação de reprovação; e determinar, com base na coagregação, se a impressão digital do recurso está associada à classificação de aprovação ou reprovação.
[0026] Um terceiro aspecto da presente divulgação é um sistema para classificar objetos dentro de imagens digitais de tecido, que compreende:
meios para converter uma imagem de lâmina em uma imagem de lâmina binária, em que a imagem de lâmina é selecionada a partir de uma biblioteca de imagens de controle, em que cada imagem de lâmina na biblioteca de imagens de controle está associada a uma classificação de aprovação ou reprovação;
meios para detectar um núcleo dentro da imagem binária da lâmina;
meios para extrair um recurso do núcleo detectado, em que o recurso representa uma propriedade do núcleo detectado dentro da imagem de lâmina binária e compreende pelo menos uma de uma área do núcleo detectado, um perímetro do núcleo detectado, uma densidade integrada do núcleo detectado, ou uma circularidade do núcleo detectado;
meios para gerar, com base no recurso, uma impressão digital do recurso associada à imagem de lâmina binária, em que a impressão digital do recurso é um valor numérico calculado a partir do processamento do recurso;
meios para incorporar a imagem de lâmina binária em um agregado, em que o agregado compreende uma pluralidade de imagens, em que cada uma da primeira pluralidade de imagens está associada a uma impressão digital de recurso correspondente, e em que a incorporação é baseada na comparação da impressão digital de recurso com a impressão digital de recurso correspondente; meios para aplicar uma altura de corte ao agregado para formar uma pluralidade de grupos, em que a altura de corte minimiza uma série de grupos dentro da pluralidade de grupos com base na análise multivariada de análise de variância do agregado; meios para categorizar um primeiro grupo dentro da pluralidade de grupos como um conjunto de controle positivo se o primeiro grupo compreender primeiras imagens de lâmina associadas com a classificação de passagem; e meios para categorizar um segundo grupo dentro da pluralidade de grupos como um conjunto de controle negativo se o segundo grupo compreender segundas imagens de lâmina associadas à classificação de reprovação.
[0027] Um quarto aspecto da presente divulgação é um classificador, que compreende: meios para detectar um canal de hematoxilina a partir da imagem de lâmina não classificada, em que o canal da hematoxilina está associado a um núcleo celular dentro da imagem de lâmina não classificada de um tecido; meios para extrair um recurso do canal de hematoxilina detectado, em que o recurso representa uma propriedade do núcleo dentro da imagem de lâmina binária e compreende pelo menos um de uma área do núcleo, um perímetro do núcleo, uma densidade integrada do núcleo ou uma circularidade do núcleo; meios para gerar, com base no recurso, uma impressão digital do recurso associada à imagem de lâmina não classificada, em que a impressão digital do recurso é um valor numérico calculado a partir do processamento do recurso; meios para coagregar a impressão digital de recurso com um primeiro conjunto de impressões digitais associadas a um conjunto de controle positivo e um segundo conjunto de impressões digitais associadas a um conjunto de controle negativo, em que o conjunto de controle positivo compreende um primeiro conjunto de imagens de lâmina associadas com uma classificação de aprovação e o conjunto de controle negativo compreende um segundo conjunto de imagens de lâmina associadas a uma classificação de reprovação; e meios para determinar, com base na coagregação, se a impressão digital do recurso está associada à classificação de aprovação ou reprovação.
[0028] Em certas modalidades do primeiro ao quarto aspectos da presente divulgação, os métodos, sistema e classificador podem compreender um classificador de tecido ou o uso de um classificador de tecido capaz de determinar a potência ou a capacidade de transplante de um tecido de um sujeito, de preferência um sujeito humano.
[0029] Em certas modalidades do primeiro ao quarto aspectos da presente divulgação, o tecido é um tecido de timo, de preferência fatias de produto derivado de tecido de timo pós-natal cultivado alogênico para implantação em um sujeito humano.
[0030] Em certas modalidades do primeiro ao quarto aspectos da presente divulgação, o humano pode estar sofrendo de síndrome de DiGeorge completa associada à deleção 22q11.2; síndrome de coloboma, defeito cardíaco, atresia coanal, retardo mental ou de crescimento, hipoplasia genital e anomalias de ouvido ou surdez (CHARGE) ou atimia associada à deficiência de proteína N1 da caixa forkhead (FOXN1).
[0031] Em certas modalidades do primeiro ao quarto aspectos da presente divulgação, o classificador de tecido determina a potência de um tecido desconhecido gerando impressões digitais de recursos de núcleos detectados dentro de imagens de lâmina em uma biblioteca de controle e agregando as imagens de lâmina com base em suas impressões digitais de recurso correspondentes, de preferência um tecido do timo.
[0032] Em certas modalidades do primeiro ao quarto aspectos da presente divulgação, o tecido do timo foi submetido a um processo de cultura em um meio de órgão do timo por um período de tempo para depleção parcial do tecido do timo de timócitos. Em algumas modalidades, o período de tempo é de até 21 dias. Em outras modalidades, o período de tempo é de cerca de 12 a cerca de 21 dias, ou de cerca de 5 a cerca de 9 dias.
[0033] Em certas modalidades do primeiro ao quarto aspectos da presente divulgação, o processo de cultura preserva a arquitetura funcional do estroma tímico, preferencialmente o estroma tímico compreende células epiteliais tímicas e fibroblastos.
[0034] Em certas modalidades do primeiro ao quarto aspectos da presente divulgação, o tecido é selecionado a partir do grupo que consiste em tecido vascular, tecido de pele, tecido hepático, tecido pancreático, tecido neural, tecido urogenital, tecido gastrointestinal, tecido esquelético incluindo osso e cartilagem, tecido adiposo, tecido conjuntivo incluindo tendões e ligamentos, tecido amniótico, tecido coriônico, dura-máter, pericárdio, tecido muscular, tecido glandular, tecido facial, tecido oftálmico.
[0035] Em certas modalidades do primeiro ao quarto aspectos da presente divulgação, a impressão digital do recurso é gerada a partir de medições que compreendem valores numéricos de uma área do núcleo detectado, um perímetro do núcleo detectado, uma densidade integrada do núcleo detectado e uma circularidade do núcleo detectado.
[0036] É ainda apreciado que certos recursos aqui descritos, que são, para clareza, descritos no contexto de diferentes aspectos da presente divulgação e/ou em modalidades separadas, também podem ser fornecidos em combinação em uma única modalidade. Inversamente, vários recursos que são, por questões de brevidade, descritos no contexto de uma única modalidade, também podem ser fornecidos separadamente ou em qualquer subcombinação adequada.
[037] Para uma compreensão mais completa dos princípios aqui divulgados e das vantagens dos mesmos, é feita referência às seguintes descrições tomadas em conjunto com os desenhos anexos, nos quais:
[038] A Figura 1 é um esquema da operação de um classificador que recebe uma entrada de uma imagem de lâmina não classificada e determina, com base em uma análise da imagem de lâmina não classificada e uma comparação com critérios de aceitação pré-estabelecidos, se o tecido na lâmina não classificada na imagem é um candidato para transplante de tecido.
[039] A Figura 2 mostra um agregado exemplar e dendrograma de agregado onde o agregado foi segregado em diferentes grupos a, b, c, d e e.
[040] As Figuras 3A a 3D abaixo mostram imagens de lâmina com quantidades variáveis de pixels de fundo. A Figura 3A representa uma imagem de lâmina que mostra uma amostra de tecido em uma quantidade apropriada de pixels de fundo. As
Figuras 3B e 3C ilustram imagens de lâmina com muitos pixels de fundo. A Figura 3D ilustra uma imagem de lâmina com um número insuficiente de pixels de fundo.
[041] As Figuras 4A a 4C ilustram imagens de lâminas com vários graus de segmentação de núcleos. A Figura 4A ilustra uma imagem de lâmina com núcleos corretamente segmentados enquanto as Figuras 4B e 4C ilustram imagens de lâminas com núcleos segmentados incorretamente.
[042] A Figura 5 mostra as etapas de processamento de imagem para analisar a imagem da hematoxilina de uma amostra de tecido do timo. A Figura 5 representa um espécime de tecido de timo corado com hematoxilina, que identifica um campo para análise como contorno na caixa, que é ampliado na imagem do meio e convertido em um canal vermelho da imagem de lâmina, que foi extraída e invertida para formar a imagem binária, na imagem à direita.
[043] As Figuras 6A a 6D ilustram resultados exemplares de extração de recursos em uma modalidade em que o tecido é tecido do timo e os recursos extraídos incluem área, perímetro, densidade integrada e circularidade. A Figura 6A ilustra as determinações de área. A Figura 6B ilustra as determinações do perímetro. A Figura 6C ilustra as determinações de densidade integrada. A Figura 6D ilustra determinações de circularidade.
[044] A Figura 7 ilustra uma representação de impressões digitais geradas para imagens de lâminas. As impressões digitais são representações quantitativas de recursos subjacentes de núcleos em uma imagem.
[045] A Figura 8 ilustra uma representação de uma saída bruta de uma etapa de agregação que inclui espécimes de timo recebidos da Duke University.
[046] A Figura 9 ilustra o resultado da etapa de agrupamento durante a fase de treinamento. Ilustrados na Figura 9 estão vários grupos de controle positivo e negativo agregados com base em imagens de lâmina de amostras experimentais de tecido do timo.
[047] A Figura 10 ilustra resultados de exemplo de uma análise estatística das diferenças entre as populações dentro de cada grupo segmentado da Tabela 2. A Figura 10 mostra que a população de imagens de lâminas dentro de cada grupo não variou significativamente, o que indica que essas imagens de lâminas compartilham impressões digitais de recursos semelhantes.
[048] A Figura 11 é um fluxograma de uma análise de exemplo de uma imagem de lâmina. Em uma modalidade, o fluxograma é implementado por um classificador que executa as etapas de processamento descritas acima. Uma imagem de lâmina pode primeiro ser avaliada para determinar se a imagem é adequada para ser analisada durante a etapa de classificação.
[049] As Figuras 12A a 12D são exemplos proféticos que mostram impressões digitais de recurso de exemplo com base em certos recursos extraídos de uma imagem de lâmina de tecido do timo. A Figura 12A ilustra uma diferença entre imagens de lâmina associadas a grupos de controle positivo e negativo em impressões digitais de recursos geradas para a área dos núcleos. A Figura 12B ilustra uma diferença entre imagens de lâmina associadas a grupos de controle positivo e negativo em impressões digitais de recursos geradas para o perímetro dos núcleos. A Figura 12C ilustra uma diferença entre imagens de lâmina associadas a grupos de controle positivo e negativo em impressões digitais de recursos geradas para a densidade integrada dos núcleos. A Figura 12D ilustra uma diferença entre imagens de lâmina associadas a grupos de controle positivo e negativo em impressões digitais de recursos geradas para a circularidade dos núcleos.
[050] As Figuras 13A a 13F ilustram impressões digitais de recursos de uma aplicação exemplar do classificador para uma imagem de lâmina de exemplo de timócitos corticais com um grupo de controle positivo e um negativo. A Figura 13A é uma imagem de lâmina exemplar de tecido do timo associado a um grupo de controle positivo. A Figura 13B é uma imagem de lâmina exemplar de tecido do timo associado a um grupo de controle negativo. A Figura 13C ilustra impressões digitais de recursos associadas a determinações de circularidade. A Figura 13D ilustra impressões digitais de recursos associadas a determinações de área. A Figura 13E ilustra impressões digitais de recursos associadas a determinações de densidade integrada. A Figura 13F ilustra impressões digitais de recursos associadas às determinações do perímetro.
[051] As Figuras 14A a 14D representam núcleos de tecido de timo cultivado clínico e degradado. As Figuras 14A a 14C são representativos de três lotes de amostras de tecido clínico de timo cultivadas. A Figura 14D é representativa de tecido de timo degradado.
[052] A Figura 15 ilustra a tendência do número de células por dia normalizadas para a área do tecido.
[053] As Figuras 16A a 16B são imagens de tecido do timo no Dia 0 do processo de cultura. A Figura 16A é uma fotografia do tecido de timo corado com H&E em cultura no Dia 0. A Figura 16B é uma ampliação vista de perto de uma porção do tecido de timo corado com H&E cultivado em uma ampliação de 40x.
[054] As Figuras 17A a 17B são imagens do tecido de timo no Dia 5 do processo de cultura. A Figura 17A é uma fotografia do tecido de timo corado com H&E em cultura no Dia 5. A Figura 17B é uma ampliação vista de perto de uma porção do tecido de timo corado com H&E em cultura com uma ampliação de 40x.
[055] As Figuras 18A a 18B são imagens de tecido do timo no Dia 9 do processo de cultura. A Figura 18A é uma fotografia do tecido de timo corado com H&E em cultura no Dia 9. A Figura 18B é uma ampliação vista de perto de uma porção do tecido de timo corado com H&E cultivado em uma ampliação de 40x.
[056] As Figuras 19A a 19B são imagens de tecido do timo no dia 12 do processo de cultura. A Figura 19A é uma fotografia do tecido de timo corado com H&E em cultura no Dia 12. A Figura 19B é uma ampliação vista de perto de uma porção do tecido de timo corado com H&E cultivado em uma ampliação de 40x.
[057] As Figuras 20A a 20B são imagens de tecido do timo no Dia 21 do processo de cultura. A Figura 20A é uma fotografia do tecido de timo corado com H&E em cultura no Dia 21. A Figura 20B é uma ampliação vista de perto de uma porção do tecido de timo corado com H&E cultivado em uma ampliação de 40x.
[058] As Figuras 21A a 21E são imagens de tecido de timo cultivado corado com H&E em 0, 5, 9, 2 e 21 dias, representando mudanças na aparência dos núcleos no Dia 0, 5, 9, 12 e 21. A Figura 21A mostra que uma alta proporção de núcleos tem uma densidade integrada mais alta, indicativa de um grande número de timócitos. À medida que os timócitos são removidos do tecido, o tecido no Dia 5 (Figura 21B), 9 (Figura 21C), 12 (Figura 21D) e 21 (Figura 21E) mostram uma diminuição acentuada na densidade integrada e um perfil mais semelhante ao perfil para células epiteliais tímicas.
[059] A Figura 22 é um gráfico que mostra o curso do tempo das determinações de densidade integrada de lotes técnicos de produto derivado de tecido de timo pós-natal cultivado alogênico. À medida que os timócitos são removidos do tecido, o tecido no Dia 5 mostra uma diminuição acentuada na densidade integrada e um perfil mais semelhante ao perfil das células epiteliais tímicas. As barras de erro estão a um DP da média.
[060] A Figura 23 é um gráfico que mostra medidas de circularidade. O número de células com circularidade muito alta diminui com o tempo ao longo do processo de cultura.
Isso provavelmente se deve à apoptose que resulta em núcleos menos circulares e também na eliminação dos timócitos muito circulares. Para amostras no Dia 0 com circularidade inferior, isso provavelmente se deve pelo fato de que a aglomeração de timócitos é medida como uma entidade única com circularidade inferior do que um único núcleo. As barras de erro estão a um DP da média.
[061] A Figura 24 é um gráfico que mostra as medições do perímetro. No Dia 0 No Dia 0, há uma grande proporção de células com perímetros altos, o que é provavelmente devido a agrupamentos de células sendo lidos no programa como uma única forma, resultando em grandes valores de perímetro. O aumento no perímetro é provavelmente uma combinação da lavagem dos timócitos, bem como das células em apoptose ao longo do tempo de cultura e um aumento resultante no perímetro a partir desse evento. As barras de erro estão a um DP da média.
[062] A Figura 25 é um gráfico que mostra a evolução da área no tempo. Essa técnica usou a distância euclidiana (a raiz quadrada do quadrado da soma do erro entre uma amostra e o grande centroide) para medir a similaridade entre duas amostras, levando em consideração todas as quatro variáveis examinadas. Para referência, quanto menor a distância euclidiana, mais semelhantes são as duas amostras.
As barras de erro estão a um DP da média.
[063] A Figura 26 é uma plotagem de efeitos principais e uma plotagem de interação dos dados. Os dados mostrados na Figura 26 confirmam que o tecido do timo cultivado se comporta de forma semelhante ao longo do tempo.
[064] A Figura 27 é um gráfico que mostra intervalos de confiança de 95% da distância do centroide pelo timo por dia.
[065] As Figuras 28A e 28B são imagens exemplares de células epiteliais do timo, que foram delineadas em vermelho por um patologista.
[066] A Figura 29 é uma imagem de células epiteliais tímicas (TECs) delineadas em vermelho por um patologista. Os timócitos são destacados em azul.
[067] A Figura 30 é uma plotagem da razão de TECs para o número total de células das lâminas de H&E.
[068] A Figura 31 é uma plotagem da razão de TECs para o número total de células normalizadas para a área de tecido selecionada.
[069] A Figura 32 é um dendrograma de agregado que mostra a distância entre os grupos "C" e "D" como exemplo.
As caixas destacadas em verde e vermelho indicam agrupamentos únicos. Isso se baseia em uma altura de corte do eixo y de 0,43. Neste exemplo, os grupos C e D estão a uma distância de 0,6 e, portanto, são considerados dois grupos separados.
As amostras dentro de cada grupo são consideradas estatisticamente semelhantes, enquanto aquelas em grupos diferentes são consideradas estatisticamente diferentes.
[070] A Figura 33 é um gráfico que mostra um conjunto de treinamento com todas as amostras clinicamente boas e más confirmadas. O agregado com a caixa são as amostras degradadas forçadas.
[071] A Figura 34 representa uma biblioteca de amostra final. Da esquerda para a direita, os grupos são referidos como Grupo 4, Grupo 3, Grupo 2 e Grupo 1. Os grupos 1, 2 e 3 estão associados a uma classificação de aprovação e o Grupo 4 está associado a uma classificação de reprovação.
[072] As Figuras 35A a 35D representam imagens representativas para cada grupo de agregado na biblioteca de amostra final. Os grupos 1 (Figura 35A), 2 (Figura 35B) e 3 (Figura 35C) são compostos por amostras com resultados clínicos positivos. O Grupo 4 (Figura 35D) é constituído por amostras degradadas confirmadas. A amostra do Grupo 1 é de LOT-345, a amostra do Grupo 2 é de LOT-160, a amostra do Grupo 3 é de LOT-194 e a amostra do Grupo 4 é de FD.SP17- 40348-C1.1 (método de degradação: Congelamento a -20 °C).
[073] As Figuras 36A a 36D são uma representação gráfica dos diferentes parâmetros, divididos por grupo. A Figura 36A é uma representação gráfica de agregados de dados em determinações de área. A Figura 36B é uma representação gráfica de agregados de dados em determinações de circularidade. A Figura 36C é uma representação gráfica de agregados de dados em determinações de densidade integrada.
A Figura 36D é uma representação gráfica de agregados de dados em determinações de perímetro.
[074] A Figura 37 é uma imagem do Grupo 1 com recursos dentro da Área-10 (vermelho), Circularidade-0,9
(verde), Perímetro-18 (azul) e Densidade Integrada-1.500 (amarelo) destacados. Esses grupos geralmente mostram a maior variação entre os grupos.
[075] A Figura 38 é um histograma que descreve medições de área das células no Grupo 1.
[076] A Figura 39 é um histograma que representa medições de circularidade de células no Grupo 1.
[077] A Figura 40 é um histograma que representa medições de densidade integrada de células no Grupo 1.
[078] A Figura 41 é um histograma que descreve as medições do perímetro das células no Grupo 1.
[079] A Figura 42 é uma imagem do Grupo 2 com recursos dentro da Área-10 (vermelho), Circularidade-0,9 (verde), Perímetro-18 (azul) e Densidade Integrada-1.500 (amarelo) destacados. Esses grupos geralmente mostram a maior variação entre os grupos.
[080] A Figura 43 é um histograma que representa as medições da área das células no Grupo 2.
[081] A Figura 44 é um histograma que representa medições de circularidade de células no Grupo 2.
[082] A Figura 45 é um histograma que descreve medições de densidade integrada de células no Grupo 2.
[083] A Figura 46 é um histograma que descreve as medições do perímetro das células no Grupo 2.
[084] A Figura 47 é uma imagem do Grupo 3 com recursos dentro da Área-10 (vermelho), Circularidade-0,9 (verde), Perímetro-18 (azul) e Densidade Integrada-1.500 (amarelo) destacados. Esses grupos geralmente mostram a maior variação entre os grupos.
[085] A Figura 48 é um histograma que descreve medições da área de células no Grupo 3.
[086] A Figura 49 é um histograma que descreve medições de circularidade de células no Grupo 3.
[087] A Figura 50 é um histograma que descreve medições de densidade integrada de células no Grupo 3.
[088] A Figura 51 é um histograma que descreve medições de perímetro das células no Grupo 3.
[089] A Figura 52 é uma imagem do Grupo 4 com recursos dentro da Área-10 (vermelho), Circularidade-0,9 (verde), Perímetro-18 (azul) e Densidade Integrada-1.500 (amarelo) destacados. Esses grupos geralmente mostram a maior variação entre os grupos.
[090] A Figura 53 é um histograma que descreve medições de área de células no Grupo 4.
[091] A Figura 54 é um histograma que representa medições de circularidade de células no Grupo 4.
[092] A Figura 55 é um histograma que descreve medições de densidade integrada de células no Grupo 4.
[093] A Figura 56 é um histograma que representa medições de perímetro de células no Grupo 4.
[094] A Figura 57 são plotagens de uma análise da variabilidade entre e dentro dos grupos em uma base de bin a bin. Os dados são mostrados no eixo x primeiro por grupo e depois por bin para o parâmetro. O gráfico superior de cada parâmetro são os indivíduos e o inferior é o desvio padrão desse grupo. Ambos podem ser usados para visualizar a disseminação dos dados.
[095] Os títulos, cabeçalhos e subtítulos aqui fornecidos não devem ser interpretados como limitantes dos vários aspectos da divulgação. Por conseguinte, os termos definidos abaixo são mais completamente definidos por referência ao relatório descritivo na sua totalidade. Todas as referências aqui citadas são incorporadas por referência na sua totalidade.
[096] A menos que definido de outra forma, os termos científicos e técnicos usados neste documento devem ter os significados que são comumente entendidos pelos versados na técnica. Além disso, a menos que de outra forma exigido pelo contexto, os termos no singular devem incluir pluralidades e os termos no plural devem incluir o singular. Neste pedido, o uso de "ou" significa "e/ou", salvo indicação em contrário.
No contexto de uma reivindicação dependente múltipla, o uso de “ou” refere-se a mais de uma reivindicação independente ou dependente precedente apenas alternativamente.
[097] Observa-se ainda que, conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma”, “o” e “a” e qualquer uso singular de qualquer palavra incluem referentes plurais, a menos que expressamente e inequivocamente limitado a um referente.
Conforme usado neste documento, o termo “incluir” e suas variantes gramaticais devem ser não limitantes, de modo que a recitação de itens em uma lista não exclua outros itens semelhantes que podem ser substituídos ou adicionados aos itens listados.
[098] A presente invenção é mais claramente entendida com referência às seguintes definições:
[099] O termo “cerca de” é usado aqui para significar aproximadamente, na região de, praticamente, ou ao redor. Quando o termo “cerca de” é usado em conjunto com um intervalo numérico, ele modifica esse intervalo estendendo os limites acima e abaixo dos valores numéricos estabelecidos. Em geral, o termo “cerca de” é usado aqui para modificar um valor numérico acima e abaixo do valor declarado por uma variação de +/- 10%. Como aqui utilizado, o termo cerca de refere-se a um valor numérico, incluindo, por exemplo, números inteiros, frações e porcentagens, indicados ou não explicitamente. O termo geralmente refere-
se a uma faixa de valores numéricos (por exemplo, +/- 5-10% da faixa recitada) que um versado na técnica consideraria equivalente ao valor recitado (por exemplo, tendo a mesma função ou resultado). Quando termos como pelo menos e sobre precedem uma lista de valores ou intervalos numéricos, os termos modificam todos os valores ou intervalos fornecidos na lista. Em alguns casos, o termo cerca de pode incluir valores numéricos arredondados para a figura significativa mais próxima.
[100] Conforme usados aqui, os termos “compreendendo” (e qualquer forma de compreender, como “compreendem”, “compreende” e “compreendido”), “tendo” (e qualquer forma de ter, como “têm” e “tem”), “incluindo” (e qualquer forma de incluindo, como “inclui” e “incluem”) ou “contendo” (e qualquer forma de contendo, como “contém” e “contêm”), são inclusivos ou abertos e não excluem elementos ou etapas do método adicionais não recitados. Além disso, um termo que é usado em conjunto com o termo “compreendendo” também é entendido como capaz de ser usado em conjunto com o termo “consistindo em” ou “consistindo essencialmente em”.
[101] O termo “tecido”, conforme aqui utilizado, refere-se a qualquer tipo de tecido em humanos ou animais e inclui, mas não está limitado a, tecido vascular, tecido cutâneo, tecido hepático, tecido pancreático, tecido neural, tecido urogenital, tecido gastrointestinal, tecido esquelético incluindo osso e cartilagem, tecido adiposo, tecido conjuntivo incluindo tendões e ligamentos, tecido amniótico, tecido coriônico, dura-máter, pericárdio, tecido muscular, tecido glandular, tecido facial, tecido oftálmico.
[102] Como descrito aqui, qualquer faixa de concentração, faixa percentual, faixa de razão ou faixa de números inteiros deve ser entendida como incluindo o valor de qualquer número inteiro dentro da faixa recitada e, quando apropriado, frações dos mesmos (como um décimo e um centésimo de um número inteiro), exceto quando indicado. As faixas são aproximadas e podem variar em mais de um número inteiro.
[103] Unidades, prefixos e símbolos são indicados em seu formulário aceito pelo Système International de Unites (SI). As faixas numéricas incluem os números que definem a faixa. Os valores medidos são entendidos como aproximados, levando em consideração dígitos significativos e o erro associado à medição.
[104] Observa-se, também, que determinados recursos descritos no presente documento, que são descritos no contexto de modalidades separadas a título de objetividade, também podem ser fornecidos combinados uma única modalidade.
Em contrapartida, vários recursos que são descritos no contexto de uma única modalidade a título de brevidade, também podem ser fornecidos separadamente ou em qualquer subcombinação adequada.
[105] “Área” – é relatada em µm2. A área nuclear é maior para células epiteliais do timo do que para timócitos.
As células em apoptose também tendem a ser menores.
[106] “Circularidade” – é uma medida de quão circulares as células são. A circularidade é medida em uma escala de 0 a 1, sendo 1 um círculo perfeito. Os timócitos têm circularidade aumentada em comparação com as células epiteliais do timo. As células não viáveis têm circularidade reduzida em comparação com as células viáveis. Como tal, pode-se esperar que a circularidade diminua ao longo do tempo de cultura, uma vez que ambos os timócitos são reduzidos e mais células não viáveis podem ser observadas nas fatias de tecido. Também se espera que as amostras degradadas tenham uma circularidade diminuída, pois haveria mais células não viáveis, mudando assim a distribuição para uma circularidade mais baixa.
[107] “Densidade integrada” – representa o quão escuro um núcleo está manchado. A densidade integrada é alta para timócitos que apresentam coloração escura uniformemente. As células epiteliais tímicas têm bordas escuras e um nucleoplasma principalmente claro com nucléolo escuro proeminente.
[108] “Perímetro” – representa o contorno dos núcleos que são detectados e é relatado em µm. O perímetro está relacionado à viabilidade celular; à medida que as células se degradam, o contorno nuclear torna-se irregular e seu perímetro aumenta. O perímetro também aumentaria à medida que a proporção de células TE em relação ao total de células aumentasse com o progresso da cultura. As mudanças de perímetro são esperadas ao longo do tempo na cultura, bem como com a degradação do tecido.
[109] O método de histologia quantitativa desenvolvido é um algoritmo baseado em imagem que agrega imagens semelhantes com base em propriedades que foram determinadas como tendo relevância estatística e biológica para produtos derivados de tecido de timo pós-natal cultivado alogênico. Lâminas de histologia H&E digitalizadas são criadas. A lâmina é carregada no software de análise de tecido do timo validado como uma imagem SCN ou TIFF. Se o arquivo carregado for uma imagem SCN, o algoritmo irá convertê-lo em uma imagem TIFF para análise. O canal vermelho da imagem é extraído e depois invertido de forma que os núcleos destacados com a mancha de eosina agora sejam formas pretas sobre fundo branco.
[110] A área, perímetro, densidade integrada (quão escura é a forma) e circularidade são então medidas para cada núcleo. As distribuições de frequência para cada um desses atributos podem então ser comparadas a amostras boas e ruins conhecidas em um banco de dados. Uma comparação de agregação estatística é então realizada para os atributos para determinar se a nova amostra de entrada é estatisticamente semelhante às amostras conhecidas e, portanto, pode ser determinada como “aprovada” ou “reprovada” de acordo com critérios previamente identificados.
[111] Uma seleção de lâminas clínicas e de P&D de H&E de produto derivado de tecido de timo pós-natal cultivado alogênico foi digitalizada com ampliação de 40x ou 20x. As imagens foram então enviadas para o desenvolvimento de um método de histologia quantitativa.
[112] Para quantificar as lâminas, as imagens foram primeiro analisadas de forma que os dados de atributos pudessem ser extraídos das imagens. Para tanto, as imagens foram convertidas para o formato TIFF FGP e depois processadas por um algoritmo de processamento de imagens até ImageJ onde as imagens foram calibradas para 1 µm/pixel, o canal vermelho é extraído e, em seguida, o canal vermelho é invertido de forma que os núcleos manchados mais escuros resultem em maior intensidade de pixel. Consultar as Figuras 5A a 5C para uma representação desta análise.
[113] Limiares foram determinados e ajustados para valores apropriados para seleção de núcleos para garantir que a análise da imagem seja consistente de imagem para imagem. As imagens foram analisadas para partículas (núcleos de células), aqui definidas como regiões contíguas de pixels, excedendo 10 µm2 de área. Os parâmetros foram extraídos para cada partícula, incluindo área, perímetro, largura, etc.
(consultar a Tabela 1 para obter a lista completa dos parâmetros avaliados).
[114] Os recursos que foram determinados como tendo significância estatística por meio da análise de componentes principais na população de tecidos inicialmente analisada foram área, perímetro, densidade integrada e circularidade.
Outros recursos foram considerados incapazes de auxiliar na distinção entre as amostras e, posteriormente, não foram mais analisados.
[115] As Figuras 14A a 14D representam três lotes de amostras de tecido de timo de cultura clínica (Figuras 14A a 14C) e uma amostra de tecido de timo degradado. Os quatro recursos de área, perímetro, densidade integrada e circularidade para a amostra representada na Figura 14A foram: área = 11,34; circularidade = 0,696; perímetro = 14,310 e densidade integrada = 1.889,2. Os quatro recursos de área, perímetro, densidade integrada e circularidade para a amostra representada na Figura 14B foram: área = 11,41; circularidade = 0,993; perímetro = 11,982 e densidade integrada = 1.912,4. Os quatro recursos de área, perímetro, densidade integrada e circularidade para a amostra representada na Figura 14C foram: área = 10,53; circularidade
= 0,846; perímetro = 12,510 e densidade integrada = 1.707,4.
Os quatro recursos de área, perímetro, densidade integrada e circularidade para a amostra representada na Figura 14D foram: área = 13,0; circularidade = 0,352; perímetro = 21,556 e densidade integrada = 1.786,0. Um único núcleo em cada imagem é identificado por um círculo.
[116] Depois que os quatro parâmetros foram registrados para cada núcleo, uma distribuição de frequência é criada para cada parâmetro para mostrar a distribuição dos núcleos em todo a lâmina. Geralmente, há mais de 100.000 pontos de dados para cada lâmina. A largura do bin e o corte para cada parâmetro dentro de uma distribuição foram determinados selecionando o menor número de bins que ainda mostrava variabilidade entre as lâminas. A proporção de núcleos em cada bin é determinada e esses valores são usados para a análise de agregação.
[117] A análise quantitativa descrita neste documento é uma abordagem imparcial/emergente da patologia digital. Tanto a fase de treinamento quanto a fase de classificação incluem a extração computadorizada de recursos para gerar uma impressão digital de recursos para cada imagem. Em uma modalidade, a impressão digital de recurso representa os recursos nucleares subjacentes de cada imagem.
A utilização da extração de recursos celulares permite a caracterização quantitativa da população de células subjacentes dentro do tecido representado em cada imagem de lâmina. Ambas as fases também incluem uma técnica de agregação aglomerativa hierárquica estatística para classificar seções de histologia por recursos quantitativos que descrevem cada célula em uma imagem de lâmina. A análise de agregação categoriza as imagens de lâmina em grupos diferentes com base nas semelhanças entre as impressões digitais geradas para cada imagem de lâmina. Em uma modalidade, a agregação aglomerativa hierárquica é usada no contexto da análise de imagem para treinar um classificador de tecido e utilizar o classificador de tecido treinado para determinar a potência de tecido desconhecido. Exemplos de modalidades de agregação da divulgação são apresentados abaixo no relatório descritivo, nas Figuras e nos Exemplos.
Por exemplo, e não como forma de limitação, as técnicas de agregação descritas em conexão com as Figuras 2, 7 a 9, 32 et seq. e o texto e tabelas que as acompanham.
[118] A agregação aglomerativa hierárquica, no contexto da classificação de tecidos, inclui agregados de montagem diretamente dos dados para revelar as propriedades emergentes do conjunto de dados subjacente. Na fase de classificação, de acordo com uma modalidade, a técnica de agregação permite a classificação de tecido desconhecido com base na similaridade de impressões digitais de recursos geradas do tecido desconhecido com impressões digitais de recursos previamente agregadas de tecido conhecido (por exemplo, de uma biblioteca de imagens de lâminas). A técnica de agregação também depende da análise da altura relativa de um dendrograma de agregado (consultar Figura 2), que indica uma distância entre os pontos centrais de agregação. A altura relativa é normalmente proporcional à diferença entre os recursos numéricos dos agregados (discutido mais abaixo).
[119] A Figura 2 mostra um agregado exemplar e dendrograma de agregado onde o agregado foi segregado em diferentes grupos a, b, c, d e e. Após a geração da agregados e/ou dendrograma de agregado, técnicas de análise estatística podem ser aplicadas para determinar os grupos que diferem entre si estatisticamente de forma significativa. Um exemplo de técnica de análise estatística é a análise multivariada de variância, ou MANOVA, que é um procedimento para determinar a variância entre conjuntos de dados com duas ou mais (isto é, múltiplas) variáveis.
[120] A fase de treinamento e classificação pode incluir uma ou mais das seguintes etapas: determinação de adequação, processamento de imagem, extração de recurso e agregação.
[121] A determinação de adequação se refere à avaliação das características de uma imagem de lâmina para determinar se a imagem de lâmina é adequada para análise quantitativa adicional, conforme descrito nas modalidades divulgadas. A determinação da adequação pode ser realizada tanto para um conjunto de imagens de treinamento quanto para novas imagens de lâmina. Em uma modalidade, a determinação de adequação de uma imagem de lâmina inclui análise de metadados, análise de pixel de fundo (por exemplo, exame da quantidade de pixels de fundo presentes na imagem de lâmina) e análise de entropia de tecido (e segmentação de núcleos) (por exemplo, exame da quantidade de entropia na imagem de lâmina).
[122] A análise de metadados de imagens de lâmina determina se uma imagem de lâmina tem as propriedades de metadados apropriadas para a análise quantitativa. Exemplos de metadados que podem ser considerados incluem, mas não estão limitados a: nome do arquivo (por exemplo, se o nome do arquivo é único), data da última modificação (data em que o arquivo foi modificado pela última vez), tamanho do arquivo (por exemplo, o tamanho do arquivo em bytes), formato (por exemplo, o tipo de arquivo como TIF), largura da imagem (por exemplo, um valor contendo a largura da imagem de lâmina em pixels), altura da imagem (por exemplo, um valor contendo a altura da imagem de lâmina em pixels), profundidade de bits (número total de bits para canais de cores na imagem de lâmina), tipo de cor (tipo de cor da imagem, por exemplo, RGB), resolução x (por exemplo, um valor que representa a resolução da imagem de lâmina na direção X), resolução y (por exemplo, um valor que representa a resolução da imagem de lâmina na direção Y), unidades de resolução (por exemplo, uma sequência contendo as unidades das propriedades de resolução x e resolução y), razão do fundo de imagem (razão da quantidade de pixels de fundo em relação ao número total de pixels), rótulo de fundo (rótulo que descreve a quantidade de pixels de fundo na imagem), entropia do tecido (entropia que descreve apenas os problemas de pixels segmentados) e rótulo de segmentação de núcleos (rótulo que descreve o sucesso da análise de segmentação de núcleos).
[123] Em uma modalidade, uma imagem de lâmina pode ser considerada adequada para análise quantitativa com base em uma análise de uma ou mais propriedades de metadados descritas acima. Por exemplo, em uma modalidade, se todos os campos acima estiverem presentes e legíveis dentro do cabeçalho da imagem de lâmina, e a imagem de lâmina tiver uma resolução x entre 0,8 µm a 1,2 µm e uma resolução y entre 0,8 µm a 1,2 µm, a imagem de lâmina é adequada para análise quantitativa. Em outra modalidade, se algum campo estiver ausente ou corrompido, a imagem de lâmina pode ser excluída da análise quantitativa.
[124] A análise de pixels de fundo é uma etapa para garantir que a imagem do tecido seja adequada para análises posteriores que requerem uma visão do tecido a ser analisado em um fundo. Em uma modalidade, a análise quantitativa utiliza uma quantidade padronizada de pixels de fundo em uma imagem de lâmina para garantir que a segmentação precisa ocorre durante a segmentação do tecido e segmentação de núcleos. Imagens com muitos pixels de fundo (imagens vazias) ou imagens com pixels de fundo insuficientes (imagens cortadas) terão um desempenho insatisfatório durante a análise de segmentação (descrita abaixo) e, portanto, o intervalo de pixels de fundo deve ser determinado de forma que as imagens fora deste intervalo sejam retiradas por triagem antes de continuar com a análise quantitativa das modalidades divulgadas.
[125] Os resultados da análise de fundo podem resultar na associação de um rótulo de fundo (por exemplo, aprovado ou reprovado) com a imagem de lâmina. Por exemplo, as Figuras 3A a 3D mostram imagens de lâminas com quantidades variáveis de pixels de fundo. A Figura 3A representa uma imagem de lâmina que mostra uma amostra de tecido em uma quantidade apropriada de pixels de fundo. Em uma modalidade, uma imagem de lâmina com a quantidade apropriada de pixels é considerada adequada para análise posterior. Este tipo de imagem pode ser considerado uma primeira classe de fundo.
[126] As Figuras 3B e 3C ilustram imagens de lâmina com muitos pixels de fundo. Em uma modalidade, uma imagem de lâmina com muitos pixels de fundo não é considerada adequada para análise posterior. Este tipo de imagem pode ser considerado uma segunda classe de fundo.
[127] A Figura 3D ilustra uma imagem de lâmina com um número insuficiente de pixels de fundo. Em uma modalidade, tal imagem de lâmina é considerada não adequada para análise posterior. Este tipo de imagem pode ser considerado uma terceira classe de fundo.
[128] Passos exemplares da análise de fundo serão agora discutidos. O fundo de imagem para imagens de lâmina será classificado usando intervalos de classificação com base na razão da quantidade de pixels de fundo para o número total de pixels. Por exemplo, imagens vazias (por exemplo, Figuras 3B, 3C) exibem uma razão de fundo de imagem muito alta (por exemplo, 95%); as imagens cortadas exibem uma razão de fundo de imagem muito baixa (por exemplo, 5%) (por exemplo, Figura 3D), e as imagens com uma quantidade normal de pixels de fundo e tecido exibem uma razão de fundo de imagem moderada (por exemplo, 20% a 80%) (por exemplo, Figura 3A). Esses valores são meramente exemplares e podem ser determinados dinamicamente com base na análise de imagens dentro de um conjunto de treinamento.
[129] A análise de fundo é realizada para imagens dentro de um conjunto de treinamento (por exemplo, para gerar as faixas apropriadas para valores que são considerados adequados para análise quantitativa), para imagens em um conjunto de controle (por exemplo, para determinar se os valores de fundo de imagens no conjunto de controle estão dentro dos intervalos apropriados gerados) e para novas imagens não especificadas. Em uma modalidade, determinar a classificação da razão de fundo de imagem para imagens de lâmina inclui, mas não está limitado às seguintes etapas.
[130] Em uma modalidade, determinar a classificação da razão de fundo de imagem para imagens de lâmina para o conjunto de treinamento inclui, mas não está limitado às seguintes etapas:
[131] 1. Calcular a razão de fundo de imagem para todas as imagens no conjunto de treinamento.
[132] a. Calcular as contagens de histograma de imagem normalizada.
[133] b. Usar uma função de inversão em todos os pixels da imagem do canal de cor vermelha para segmentar os pixels do tecido dos pixels do fundo (por exemplo, função otsu_dark na aplicação ImageJ)
[134] c. Gerar contagens de histograma de todos os pixels da imagem com N bins onde N = 2Profundidade de bits da imagem de lâmina
[135] d. Dividir todas as contagens do histograma pelo número total de pixels na imagem para normalizar os dados.
[136] e. Calcular a proporção de pixels maior que o limiar. Esta proporção representa a razão do fundo de imagem.
[137] 2. Calcular o intervalo de classificação da razão de fundo de imagem para imagens que são consideradas como tendo um número apropriado de pixels de fundo (por exemplo, aprovação).
[138] a. Calcular a razão média de fundo de imagem e o desvio padrão para cada uma dentre a primeira, a segunda e a terceira classes de fundo.
[139] b. Calcular o limite superior da faixa de classificação.
[140] i. Calcular o ponto médio entre a razão média de fundo de imagem para a primeira e a segunda classes de fundo. Este valor pode ser atribuído como o limite superior da faixa do intervalo de classificação aceito.
[141] c. Calcular o limite inferior da faixa de classificação.
[142] ii. Calcular o ponto médio entre as razões médias de fundo de imagem para a primeira, a segunda e a terceira classes de fundo. Este valor é atribuído como o limite inferior da faixa do intervalo de classificação aceito.
[143] Em uma modalidade, os resultados das etapas anteriores realizadas em uma classe de treinamento de imagens de lâmina produzem uma faixa de fundo aceitável. Imagens de lâminas com valores de fundo dentro deste intervalo de fundo aceitável podem ser consideradas adequadas para análise quantitativa posterior. O intervalo de fundo aceitável pode então ser aplicado para classificar novas imagens fora da classe de treinamento, como imagens dentro de uma biblioteca de controle. Por exemplo, novas imagens de lâmina determinadas como tendo uma razão de fundo dentro da faixa de fundo calculada para imagens com a primeira classe de fundo (por exemplo, Figura 3A) são classificadas como tendo uma quantidade apropriada de pixels de fundo e são aceitas para a próxima etapa de análise. Por outro lado, novas imagens de lâminas que estão fora da faixa de fundo calculada para imagens com uma primeira classe de fundo (por exemplo, Figuras 3B a 3D) são rejeitadas e não avançam para análise posterior.
[144] A análise de segmentação de núcleos garante que os pixels de núcleos sejam adequadamente separados de outros pixels na imagem de lâmina. As impressões digitais de recursos de imagens de lâminas são baseadas, em parte, nas características de núcleos, portanto, pixels de núcleos segmentados corretamente são necessários para a análise quantitativa em modalidades. Os resultados da análise de segmentação de núcleos podem resultar na associação de um rótulo de segmentação de núcleos (por exemplo, aprovado ou reprovado) com a imagem de lâmina.
[145] A análise de segmentação de núcleos inclui a avaliação da entropia dos pixels do tecido para garantir que existe entropia suficiente para que ocorra a segmentação precisa de núcleos. A entropia da imagem, como a entropia termodinâmica, corresponde ao número de estados em um sistema. Uma imagem que possui muitos valores de pixels diferentes uniformemente distribuídos pela imagem possui um grande número de estados e, portanto, uma alta entropia. Uma imagem com valores de pixel distribuídos desigualmente na imagem terá um baixo número de estados e, portanto, uma baixa entropia. A avaliação da entropia de pixels de tecido em uma imagem de lâmina garante contraste e nitidez adequados existentes na imagem, o que ajuda na análise quantitativa da imagem de lâmina. Imagens com baixo contraste de tecido terão menor entropia em comparação com imagens com quantidade normal de contraste de tecido. O número e a disposição dos pixels por núcleo correspondem a seus “recursos” e à geração de impressões digitais de recursos que são usadas para agregar as amostras de tecido. Esses recursos variam de núcleo a núcleo na imagem de lâmina. Em uma modalidade, as imagens que passaram pelas duas etapas anteriores (análise de metadados, imagem de fundo) irão prosseguir para esta análise de entropia do tecido.
[146] Quando aplicada a um conjunto de treinamento, a análise de entropia do tecido cria uma faixa para a entropia do tecido aceita em uma imagem. Em uma modalidade, a análise de entropia do tecido pode incluir, mas não está limitada às seguintes etapas:
[147] 1. Segmentar todos os pixels de tecido dos pixels de fundo.
[148] i. Usar uma função de inversão em todos os pixels da imagem do canal de cor vermelha para segmentar os pixels do tecido dos pixels do fundo (por exemplo, função otsu_dark na aplicação ImageJ).
[149] ii. Calcular a entropia de todos os pixels do tecido com o uso de uma equação de entropia e salvar os valores correspondentes. Um exemplo de uma equação de entropia é mostrado abaixo, onde ET é a entropia do tecido para todos os pixels do tecido, p é a contagem normalizada do histograma dos pixels do tecido em bin i, e N é o número de bins do histograma usados no histograma: $ E! = − % &" log # &" " & '
[150] iii. Criar uma máscara binária de todos os núcleos segmentados dentro da imagem de lâmina (por exemplo, aplicando a função otsu_dark com todos os pixels de tecido).
Uma máscara binária corresponde a uma determinada imagem e aponta para os pixels que serão usados. As máscaras binárias geralmente são criadas quando a segmentação é realizada. Por exemplo, uma máscara binária de núcleos que corresponde a uma imagem H&E seria uma matriz com as mesmas dimensões da imagem original, onde a máscara de núcleos tem apenas 1 bit e contém apenas valores predeterminados (por exemplo, 0 ou 1). As localizações dos pixels que correspondem à localização dos núcleos na imagem original terão um valor predeterminado (por exemplo, 1), onde os pixels de não núcleos terão um valor predeterminado de (por exemplo, 0).
[151] 2. Criar rótulos de segmentação de núcleos para todas as imagens. Este rótulo descreve o sucesso da segmentação de núcleos realizada na rotina de processamento de imagem descrita acima com relação à análise de entropia do tecido. A segmentação de núcleos é a separação dos pixels do núcleo de todos os outros pixels da imagem de lâmina original (por exemplo, H&E). A segmentação dos núcleos é realizada de forma que a análise do objeto seja realizada apenas nos núcleos das células da imagem.
[152] i. Determinar a precisão da segmentação dos núcleos. Por exemplo, esta etapa pode ser realizada usando um aplicativo e comparando com uma chave de imagem que fornece exemplos de segmentação precisa e imprecisa.
[153] 1. Sobrepor a máscara de núcleos binária na imagem do canal vermelho usando um determinado valor de opacidade (Figuras 4A a 4C abaixo).
[154] 2. Examinar um número predeterminado de núcleos (por exemplo, 50) para a segmentação correta, que é definida como máscaras sendo devidamente sobrepostas no topo dos núcleos.
[155] a. Se uma quantidade maior ou igual a um certo número de núcleos (por exemplo, 45) do número predeterminado de núcleos for corretamente segmentada, a imagem pode receber um primeiro rótulo de Segmentação de Núcleos (por exemplo, “0”) (Figura 4A).
[156] b. Se menos do que um certo número de núcleos estiver corretamente segmentado, a imagem pode receber um segundo rótulo de Segmentação de Núcleos (por exemplo, “1”) (Figuras 4B, C).
[157] 3. Calcular o intervalo de classificação da entropia do tecido para imagens com o primeiro rótulo de Segmentação de Núcleos.
[158] i. Calcular a entropia média do tecido e o desvio padrão para cada uma das imagens com o primeiro e o segundo rótulos de Segmentação de Núcleos.
[159] ii. Calcular o limite inferior da faixa de classificação.
[160] 1. Calcular o ponto médio entre a entropia média do tecido para o primeiro e o segundo rótulos de segmentação de núcleo. Este valor é atribuído como o limite inferior da faixa de entropia do tecido.
[161] 2. A faixa aceita de entropias de tecido pode abranger desde o limite inferior da faixa calculada na etapa
3.ii.1 até o infinito.
[162] Em uma modalidade, os resultados das etapas anteriores realizadas em uma classe de treinamento de imagens de lâmina produzem uma faixa de classificação aceitável para entropia de tecido em uma imagem de lâmina. A faixa de classificação aceitável pode então ser aplicada para classificar novas imagens de lâmina. Imagens de lâmina com um valor de entropia de tecido maior que o limite inferior da faixa de classificação (consultar a etapa 3.ii.1) são classificadas como tendo uma quantidade apropriada de entropia de tecido e são aceitas para análise usando este método. As imagens de lâminas com um valor de entropia do tecido menor que o limite inferior da faixa de classificação são rejeitadas e não avançam para análises quantitativas adicionais.
[163] As Figuras 4A a 4C ilustram imagens de lâminas com vários graus de segmentação de núcleos. A Figura 4A ilustra uma imagem de lâmina com núcleos corretamente segmentados enquanto as Figuras 4B e 4C ilustram imagens de lâminas com núcleos segmentados incorretamente.
[164] O recurso de processamento de imagem é discutido mais abaixo com relação à análise de canais de hematoxilina de imagens de lâmina, uma vez que este canal representa os recursos nucleares de cada célula. Em uma modalidade, a imagem da hematoxilina é separada da imagem da eosina. Em uma modalidade, a etapa de processamento de imagem também pode incluir, como mostrado nas Figuras 5A a 5C abaixo, transformando imagens de lâminas em imagens binárias para análise. Em uma modalidade, as imagens de lâmina (Figura 5A) são analisadas usando a mesma resolução e escala. Regiões contíguas de pixels são então extraídas das imagens binárias para detectar núcleos e os recursos correspondentes dos núcleos (como mostrado na Figura 5B). Em uma modalidade, o canal vermelho da imagem de lâmina é extraído e invertido para formar a imagem binária, conforme mostrado na Figura 5C. O canal vermelho da imagem, em alguns sistemas, fornece a melhor imagem dos núcleos dentro das imagens de lâmina.
[165] Em uma modalidade, a etapa de extração de recursos inclui extrair recursos para cada núcleo detectado na imagem de lâmina e gerar uma impressão digital para cada um dos recursos extraídos. Em uma modalidade, os recursos são representados como valores numéricos de recursos. A Tabela 1 abaixo lista recursos que, por exemplo e sem limitação, são detectáveis e, portanto, capazes de ser extraídos para cada núcleo. Um ou mais recursos podem ser extraídos para cada núcleo. Por exemplo, certos recursos podem ser mais relevantes para o propósito de diferentes aplicações de potência. Ou seja, certos recursos podem variar significativamente entre tecidos aprovados e reprovados.
[166] Em uma modalidade, quando o tecido a ser classificado é o tecido do timo (que pode ou pode fazer parte do ensaio), os recursos relevantes extraídos são área de cada núcleo detectado, perímetro de cada núcleo detectado, densidade integrada de cada núcleo detectado, e circularidade de cada núcleo. Com relação à área, a área nuclear é maior para células epiteliais do timo do que para timócitos. O perímetro está relacionado à viabilidade celular; à medida que as células se degradam, o contorno nuclear torna-se irregular e seu perímetro aumenta. A densidade integrada é alta para timócitos, que apresentam coloração escura uniformemente. As células epiteliais tímicas têm bordas manchadas de escuro e principalmente nucleoplasma claro com nucléolo escuro proeminente. Os timócitos têm circularidade aumentada em comparação com as células epiteliais do timo. As células não viáveis têm circularidade reduzida em comparação com as células viáveis.
[167] Em uma modalidade, a densidade integrada é representada pelo tamanho do núcleo detectado e um valor de escuridão associado ao núcleo detectado. A circularidade representa uma avaliação da forma circular do núcleo detectado e, em uma modalidade, pode ser representada por um intervalo (por exemplo, 0,0 a 1,0, onde 1,0 representa um círculo perfeito).
[168] A determinação da impressão digital de recurso para uma imagem de lâmina de acordo com uma modalidade é agora discutida. Inicialmente, uma impressão digital numérica é criada para cada um dos recursos extraídos. Por exemplo, na modalidade descrita acima, uma impressão digital de recurso é gerada para cada área, perímetro, densidade integrada e circularidade de núcleos dentro de imagens de lâmina. Em uma modalidade, os histogramas são gerados para cada um dos recursos extraídos
(por exemplo, área, perímetro, densidade integrada e circularidade). Cada histograma mostra a frequência dos resultados em faixas específicas (bins) para um recurso. Uma impressão digital do recurso é gerada a partir dos histogramas combinados para cada imagem de lâmina. A agregação (discutida abaixo e nos Exemplos apresentados abaixo) é baseada na análise estatística dos recursos extraídos. Os histogramas são mostrados nas Figuras 6A a 6D.
As Figuras 6A a 6D ilustram resultados exemplares de extração de recursos em uma modalidade em que o tecido é tecido do timo e os recursos extraídos incluem área, perímetro, densidade integrada e circularidade. A Figura 6A ilustra as determinações de área. A Figura 6B ilustra as determinações do perímetro. A Figura 6C ilustra as determinações de densidade integrada. A Figura 6D ilustra determinações de circularidade.
[169] Em uma modalidade, a agregação pode incluir montar agregados com base em impressões digitais de recursos de uma imagem de lâmina. Em uma modalidade, uma matriz de distância euclidiana para a impressão digital de recurso gerada é tabulada. A matriz de distância pode então ser usada para agregação aglomerativa hierárquica procurando o arranjo ideal de imagens de lâmina de modo que a variação dentro do grupo de imagens de lâmina seja minimizada.
[170] Em uma modalidade, as impressões digitais de recursos podem ser representadas por um valor numérico para cada imagem de lâmina gerada a partir dos histogramas combinados de recursos extraídos, conforme observado acima.
Na fase de treinamento, a agregação aglomerativa hierárquica é aplicada às impressões digitais de recursos das imagens de lâminas de uma biblioteca de imagens de controle com conjuntos de dados conhecidos, como lâminas de espécimes de Duke (Markert Lab), Degradação Forçada (CT2) e Fabricação (CT2). Em uma modalidade, a agregação também inclui a realização de análise estatística para determinar uma altura de corte na qual se segrega os agregados em grupos para garantir a significância estatística entre as imagens de lâmina dentro de cada grupo. Na fase de classificação, as amostras desconhecidas são classificadas por coagregação com as imagens de lâminas da biblioteca. As amostras desconhecidas são então classificadas com base no grupo dentro do agregado no qual as amostras desconhecidas são coagregadas.
[171] A Figura 7 abaixo ilustra uma representação exemplar de impressões digitais geradas para imagens de lâminas. Conforme observado acima, as impressões digitais são representações quantitativas de recursos subjacentes de núcleos em uma imagem.
[172] A Figura 8 abaixo ilustra uma representação exemplar de uma saída bruta de uma etapa de agregação que inclui dados de amostras de tecido fornecidas pela Duke University.
[173] Em uma modalidade, a etapa de agregação pode incluir a segregação de uma agregação em grupos. Uma altura de corte deve ser calculada para realizar a segregação de maneira estatisticamente significativa. Em uma modalidade, a altura de corte é calculada através de um aumento sistemático de uma altura de corte com correspondente análise de variância múltipla (MANOVA) entre os agrupamentos e a altura de corte selecionada minimiza o número de grupos, maximizando a significância estatística das diferenças em impressões digitais de recurso entre as populações do grupo.
Em um teste experimental de exemplo em que o tecido era tecido do timo e os recursos extraídos incluíam área, perímetro, densidade integrada e circularidade, uma altura de corte (por exemplo, 0,4) foi determinada para a segmentação de agregações que resultou na segregação dos agregados em um determinado número de grupos (por exemplo, 9).
[174] Em um exemplo de teste experimental, depois que os grupos foram formados, os grupos foram designados como um grupo de controle positivo se a população de amostras dentro do grupo consistisse em imagens de lâminas de amostras previamente determinadas como aprovadas nos critérios de potência (ou seja, amostras “boas” tendo uma classificação de aprovação). Exemplos desses grupos incluem os conjuntos de dados Duke e de fabricação. Os grupos foram designados como um grupo de controle negativo se a população de amostras dentro do grupo consistisse em lâminas previamente determinadas como reprovadas nos critérios de potência (isto é, amostras “ruins” tendo uma classificação de reprovação).
Exemplos desses grupos incluem o conjunto de dados de degradação forçada.
[175] A Figura 9 abaixo ilustra um exemplo de resultado da etapa de agrupamento durante a fase de treinamento.
[176] A Figura 9 ilustra múltiplos grupos de controle positivo e negativo agregados com base em imagens de lâmina de tecido do timo. Em tal modalidade, pode não haver um único critério de aprovação/reprovação para a potência. Em vez disso, vários recursos podem diferenciar as amostras e podem ser considerados quanto à potência. Pode haver mais variação entre os grupos de controle positivo com base na variação nas imagens das lâminas, como na região de onde a seção foi retirada e no tamanho do tecido. Por exemplo, seções retiradas de diferentes regiões de um tecido mais complexo, como um timo, terão diferentes razões corticomedulares (por exemplo, distribuição de timócitos,
células reticulares epiteliais e número de corpos de Hassall), mas ainda podem atender aos critérios de aprovação para potência.
[177] Em uma modalidade, a seguinte descrição dos grupos de controle na Figura 9 é meramente exemplar e se destina a ilustrar possíveis recursos comuns de imagens de lâmina que resultam na formação dos respectivos grupos de controle. Os grupos de controle podem ser formados com base em outros recursos ou combinação de recursos nas imagens de lâmina contidas nos mesmos. No exemplo da Figura 9, um primeiro grupo de controle negativo na Figura 9 (“neg.ctrl.1”) foi agrupado com base na presença de corpos de Hassall, regiões cortical e de medula mal definidas e extensa necrose e fibrose. Um segundo grupo de controle negativo na Figura 9 (“neg.crtl.2”) foi agrupado com base na mínima ou nenhuma presença de corpos de Hassall, fibrose e necrose e regiões cortical e de medula mal definidas. Um terceiro grupo de controle negativo na Figura 9 (“neg.crtl.3”) foi agrupado com base na presença mínima ou nenhuma de corpos de Hassall, fibrose e necrose e regiões cortical e de medula mal definidas.
[178] Em relação aos grupos de controle positivo mostrados na Figura 9, neste exemplo, um primeiro grupo de controle na Figura 9 (“pos.crtl.1”) foi agrupado com base na falta de região de medula ou córtex definida, presença de corpos de Hassall e quantidade baixa a normal de linfócitos.
Um segundo grupo de controle na Figura 9 (“pos.crtl.2”) foi agrupado com base na presença de células epiteliais normais, regiões medular e de córtex normais, presença de corpos de Hassall e linfócitos com alterações normais de células T maduras. Um terceiro grupo de controle na Figura 9 (“pos.crtl.3”) foi agrupado com base na presença de células epiteliais normais, regiões medular e de córtex normais, presença de corpos de Hassall e linfócitos com alterações normais de células T maduras. Um quarto grupo de controle na Figura 9 (“pos.crtl.4”) foi agrupado com base na baixa quantidade de linfócitos, vários graus de regiões medulares e corticais, presença de necrose que se estende da medula ao córtex para alguns tecidos e células epiteliais variáveis de nenhum ao presente. Um quinto grupo de controle na Figura 9 (“pos.crtl.5”) foi agrupado com base nas regiões normais do córtex e da medula, presença de corpos de Hassall, distribuição normal de timócitos, e linfócitos com alterações normais de células T maduras. Um sexto grupo de controle na Figura 9 (“pos.crtl.6”) foi agrupado com base na presença mínima ou nenhuma presença de corpos de Hassall, falta de identificação para áreas do córtex e medula e alto grau de tecido fibroso. As técnicas alternativas de agregação da presente divulgação podem ser encontradas nos exemplos do presente relatório descritivo.
[179] As tabelas 2 e 3 abaixo ilustram resultados de exemplo de uma análise estatística de grupos em formação após a realização de uma análise de coagregação. Em uma modalidade, a análise MANOVA é realizada. A Tabela 2 ilustra que os grupos com base em uma análise de coagregação resultaram em populações entre os agrupamentos agregados diferindo significativamente entre si.
TABELA 2
AGRUPADOS POR AGREGADOS DE ANÁLISE DE COAGREGAÇÃO TABELA 3
[180] A Figura 10 ilustra ainda os resultados de exemplo da análise estatística das diferenças entre as populações dentro de cada grupo segmentado da Tabela 2. A Figura 10 mostra que a população de imagens de lâminas dentro de cada grupo não variou significativamente, o que indica que essas imagens de lâminas compartilham impressões digitais de recursos semelhantes.
[181] A Tabela 3 ilustra que grupos de grupos gerados aleatoriamente (ou seja, sem realizar coagregação) resultaram em nenhuma significância estatística entre as populações de cada grupo.
[182] Em uma modalidade, após a fase de treinamento, o classificador estabeleceu agrupamentos segmentados das imagens de lâmina da biblioteca. Os agrupamentos são separados em grupos de controle positivo e grupos de controle negativo, onde os grupos de controle positivo incluem imagens de lâminas que foram previamente determinadas como candidatas para transplante (ou seja, aprovadas na classificação) e os grupos de controle negativo incluem imagens de lâminas que foram previamente determinadas como não candidatas para transplante (ou seja, reprovadas na classificação).
[183] Na fase de classificação, uma amostra de imagem de lâmina a ser classificada é analisada para avaliar a potência do tecido na imagem de lâmina. A imagem de lâmina é processada em preparação para a análise. Em uma modalidade, isso inclui a conversão da imagem em uma imagem binária. A detecção de recurso é executada em seguida. Em uma modalidade, um canal de hematoxilina (ou seja, núcleos) é extraído da imagem de lâmina. Os recursos são determinados para o canal extraído. Uma impressão digital do recurso é gerada com base nos recursos do canal extraído. Em uma modalidade, a impressão digital de recurso pode ser representada por um histograma como mostrado na Figura 8 acima. Em outra modalidade, a impressão digital de recurso é gerada a partir de recursos de área, perímetro, densidade integrada e circularidade do canal extraído.
[184] A impressão digital de recurso gerada pode então ser comparada com impressões digitais de recurso de grupos de controle positivo e negativo que foram gerados durante a fase de treinamento. Em uma modalidade, a etapa de comparação inclui a coagregação da impressão digital de recurso gerado com as impressões digitais de recurso dos grupos de controle positivo e negativo.
[185] Após a coagregação, a análise estatística (por exemplo, MANOVA) pode ser realizada para avaliar os agregados formados para determinar se os agregados de impressão digital de recursos gerados se correlacionam de uma maneira estatisticamente significativa com qualquer um dos grupos de controle positivo ou negativo. Se os resultados da análise estatística indicarem uma falta de agregação estatisticamente significativa ou que a impressão digital de recursos gerada se agrega com um grupo de controle negativo, a imagem de lâmina é considerada como reprovada nos critérios de potência e pode estar associada a uma classificação de reprovação ou pode ser avaliada qualitativamente para a disposição. Se os resultados da análise estatística indicarem agregação com um grupo de controle positivo, a imagem de lâmina é considerada como aprovada nos critérios de potência e pode ser associada a uma classificação de aprovação.
[186] A Figura 11 abaixo representa um fluxograma de uma análise de exemplo de uma imagem de lâmina. Em uma modalidade, o fluxograma é implementado por um classificador que executa as etapas descritas acima. Uma imagem de lâmina pode primeiro ser avaliada para determinar se a imagem é adequada para ser analisada durante a etapa de classificação.
Caso contrário, a imagem de lâmina é excluída e considerada como tendo sido reprovada nos requisitos de adequação para análise. Se a imagem de lâmina atender aos requisitos de adequação necessários, a imagem de lâmina não será excluída e será analisada. A análise inclui pelo menos uma dentre as etapas de processamento de imagem, extração de recurso e agregação discutidas acima. Os resultados do resultado do teste podem determinar se a impressão digital do recurso da imagem de lâmina está agregada com um dos grupos de controle positivo ou grupos de controle negativo. Conforme mostrado na Figura 11 abaixo, se agregada com um grupo de controle positivo, a imagem de lâmina é considerada como atendendo aos critérios de potência e, portanto, pode ser associada a uma classificação de aprovação. Se agregada com um grupo de controle negativo, a imagem de lâmina é considerada como reprovada nos critérios de potência e, portanto, pode ser associada a uma classificação de reprovação.
[187] A Tabela 4 abaixo descreve as características qualitativas correspondentes de tecido de imagens de lâmina em grupos de controle negativo e grupos de controle positivo em uma modalidade experimental quando a fase de classificação foi aplicada a uma biblioteca de imagens de lâmina de tecido do timo.
TABELA 4
[188] A Tabela 5 ilustra as características correspondentes entre os grupos de controle negativo (marcados como Negativo 1 a 5) e os grupos de controle positivo (marcados como Positivo 1 a 6).
TABELA 5
[189] Em uma modalidade, a agregação é baseada na composição e nos recursos dos núcleos para todas as células nas imagens de lâmina. Para as células do timo, os timócitos podem ser um fator contribuinte para a análise, pois compreendem a maioria dos núcleos populacionais. A medula e os timócitos corticais contribuem de maneira diferente para as impressões digitais de recursos, com base nos recursos usados para as impressões digitais. Diferenças quantitativas na população de células levam a diferenças quantitativas nas impressões digitais de recursos que levam a diferenças na agregação. A composição dos timócitos retrata a saúde do tecido, pois variações significativas na composição indicam necrose, fibrose e degradação geral. A agregação agrupa amostras que compartilham um padrão de impressão digital semelhante e, portanto, compartilham recursos semelhantes de suas populações celulares. As imagens de amostra cujas impressões digitais diferem estatisticamente significativamente serão localizadas em grupos diferentes.
[190] As modalidades divulgadas para análise quantitativa e geração de impressão digital de recurso permitem que um classificador detecte mudanças na população de células, porque a impressão digital de recurso avalia todos os núcleos detectáveis em uma imagem de lâmina. Durante a cultura, o número total de timócitos deve reduzir nos tecidos. No entanto, a proporção relativa de timócitos corticais e medulares deve permanecer consistente.
Alterações significativas nessas proporções podem indicar degradação desigual do tecido ou comprometimento da potência. Mudanças significativas na população de células serão detectadas como mudanças nas impressões digitais de recursos quantitativos. Mudança significativa na razão de timócitos corticomedulares (aumento ou diminuição) causará uma mudança nas impressões digitais de recursos em direção a grupos de controle negativo e, portanto, a amostra se agregará com as amostras de controle negativo.
[191] As Figuras 12A a 12D são exemplos proféticos que podem mostrar impressões digitais de recurso de exemplo com base em certos recursos extraídos de uma imagem de lâmina de tecido do timo. A Figura 12A ilustra uma diferença entre imagens de lâmina associadas a grupos de controle positivo e negativo em impressões digitais de recursos geradas para a área dos núcleos. A Figura 12B ilustra uma diferença entre imagens de lâmina associadas a grupos de controle positivo e negativo em impressões digitais de recursos geradas para o perímetro dos núcleos. A Figura 12C ilustra uma diferença entre imagens de lâmina associadas a grupos de controle positivo e negativo em impressões digitais de recursos geradas para a densidade integrada dos núcleos. A Figura 12D ilustra uma diferença entre imagens de lâmina associadas a grupos de controle positivo e negativo em impressões digitais de recursos geradas para a circularidade dos núcleos.
[192] A Figura 13 ilustra impressões digitais de recurso de uma aplicação exemplar do classificador para uma imagem de lâmina de exemplo de tecido do timo associado a um grupo de controle negativo e uma imagem de lâmina de exemplo de tecido do timo associado a um grupo de controle positivo.
As impressões digitais de recurso, incluindo aquelas para recursos de área e densidade integrada, ilustram diferenças nos timócitos corticais entre a imagem de lâmina do grupo de controle negativo e a imagem de lâmina do grupo de controle positivo.
[193] Em uma modalidade preferida da presente invenção, os métodos de realização de avaliação histopatológica quantitativa de uma imagem de lâmina não classificada de um tecido e métodos de treinamento de um classificador de tecido para realizar avaliações histopatológicas quantitativas podem ser realizados da seguinte maneira exemplar.
[194] Um período de cultura para o tecido a ser examinado é selecionado com base nos resultados que constituem resultados clínicos positivos após a implantação de um produto de tecido modificado geneticamente desejado.
No que diz respeito ao produto derivado de tecido de timo pós-natal cultivado alogênico, o período de tempo de cultura permite que o tecido esgote os timócitos por meio de lavagem para fora do tecido e/ou por apoptose. TECs no tecido de timo cultivado são substancialmente mantidos ao longo do tempo de cultura.
[195] Um ensaio examina uma amostra retirada entre os dias 5 a 9 de cultura para avaliar a adequação do tecido de timo cultivado para liberação e transplantabilidade. Para ajudar a compreender melhor o produto e avaliar melhor as capacidades de discernimento do ensaio, as amostras são retiradas dos dias 1 a 21 e além, cujos dados podem ser avaliados para determinar tendências aparentes.
[196] Por exemplo, lotes de amostras de tecido de timo cultivadas clinicamente e uma amostra de tecido de timo degradado podem ser examinados para recursos histopatológicos, como área, perímetro, densidade integrada e circularidade. A tendência geral no número de núcleos detectados é examinada, espera-se que diminua ao longo do tempo à medida que os timócitos saem dos tecidos ou sofrem apoptose. Esses dados são então normalizados para a área do tecido, à medida que diferentes fatias de vários lotes são examinadas em dias diferentes. O tamanho da seção de tecido pode ser diferente entre as fatias e pode causar variabilidade no conjunto de dados, mas uma tendência geral negativa pode ser vista com o aumento dos dias de cultura, com uma mudança visual em etapas nos dados em torno do dia
10. Dados anteriores mostraram que a maioria dos timócitos se esgota no início do período de cultura, em comparação com a diminuição no número total de células. As amostras de tecido cultivado podem então ser analisadas em estudos de curso de tempo para avaliar, por exemplo, a variabilidade entre tecidos. Para fins ilustrativos, o processo será descrito para avaliar a variabilidade do tecido da parte interna entre timo. Isso incluirá uma avaliação das células epiteliais tímicas e dos timócitos. Os dados obtidos na etapa de variabilidade entre timos serão submetidos à análise de agregação hierárquica. Um conjunto de dados de treinamento será estabelecido e, em seguida, uma análise grupo a grupo do tecido do timo cultivado será determinada. Esses dados serão comparados com os dados obtidos em qualquer estudo de degradação forçada do tecido e/ou por comparação da determinação de grupo a grupo com um conjunto de dados associado a amostras reprovadas e resultados clínicos negativos.
[197] A aparência geral do tecido e, consequentemente, das lâminas histológicas, muda ao longo do período de cultura selecionado, por exemplo, aos 0, 5, 9, 12 e 21 dias para o tecido do timo cultivado. Novamente, na ilustração do tecido do timo cultivado, os timócitos são removidos do tecido cultivado do timo. O tecido nos dias 5, 9, 12 e 21 mostra uma diminuição acentuada na densidade integrada e um perfil mais semelhante ao perfil das células epiteliais do timo. O número de células com circularidade muito alta diminui com o tempo ao longo do processo de cultura. Isso provavelmente se deve à apoptose que resulta em núcleos menos circulares e também na eliminação dos timócitos muito circulares. Para amostras no Dia 0 com circularidade inferior, isso provavelmente se deve pelo fato de que a aglomeração de timócitos é medida como uma entidade única com circularidade inferior do que um único núcleo. No Dia 0, há uma grande proporção de células com perímetros altos, o que é provavelmente devido a aglomerados de células sendo lidos no programa como uma única forma, resultando em grandes valores de perímetro. O aumento no perímetro é provavelmente uma combinação da lavagem dos timócitos, bem como das células em apoptose ao longo do tempo de cultura e um aumento resultante no perímetro a partir desse evento.
Em geral, as características nucleares ao longo do tempo de cultura se alinham com as expectativas teóricas para tendências. A maioria das mudanças aparentes nos dados são anteriores aos dias de liberação pretendidos dos lotes. Isso sugere que muitas das mudanças ocorrem durante os primeiros dias de cultura, após os quais o ambiente é capaz de se sustentar por até 21 dias. Isso apoia o ensaio para detectar tendências verdadeiras nas populações de células e como elas mudam ao longo do tempo.
[198] A variabilidade entre timos é examinada para entender melhor se as amostras são semelhantes entre os timos. A variabilidade entre timos pode ser avaliada de maneira semelhante à variabilidade intra-timo, onde as amostras examinadas são de um único dia, mas em vez de serem restritas a um único timo, a avaliação inclui amostras em lotes. A distância euclidiana de cada amostra pode ser calculada para o ponto central de todas as amostras dentro do conjunto de dados isolado. ANOVAs são então realizados nas distâncias ao centro pelo timo. Essa análise é realizada nas amostras dos Dias 5 e 9. A variabilidade entre timos pode ser examinada para entender melhor se as amostras são semelhantes entre os timos. Intervalos de confiança de noventa e cinco por cento em cada dia são gerados por timo.
Uma análise mais específica de apenas células epiteliais do timo é realizada para ajudar a caracterizar o produto derivado de tecido do timo pós-natal cultivado alogênico. As células epiteliais do timo são hipotetizadas como críticas para o mecanismo de ação do produto derivado do tecido do timo pós-natal cultivado alogênico. Um patologista seleciona núcleos para células identificadas como células epiteliais tímicas. Os núcleos das células epiteliais tímicas diferem de outras células na população de tecidos. As TECs são geralmente maiores e têm um nucléolo presente, que aparece como um ponto roxo mais escuro no centro do núcleo externo roxo mais claro. As células marcadas conhecidas são então extraídas do software como pontos de dados individuais.
Usando esses dados, um filtro pode ser criado para permitir que as etapas a seguir sejam realizadas em ordem sequencial.
Os filtros de dois tamanhos removem todas as células fora da janela de intervalo de tamanho, tanto antes quanto depois da divisão das células conjuntas. As seguintes etapas de filtragem foram realizadas.
[199] As células mais escuras são removidas do conjunto de dados definindo o limiar de inclusão abaixo dos pixels mais escuros. As células abaixo de 50 µm2 na área são então removidas. Os buracos são preenchidos e o divisor de águas é aplicado para dividir as células conjuntas. As células fora de um intervalo de 30 a 250 µm2 e circularidade <0,75 são então filtradas do conjunto de dados. Os filtros anteriores permitem a análise de imagens com conjuntos de dados gerados e restritos para caracterização das células TEC. Ao examinar a razão total de células no tecido ao longo do período de cultura, há um aumento geral nas TECs. O aumento das TECs ocorre porque, à medida que os timócitos são removidos do tecido, um número maior de células restantes são TECs. A análise anterior de TECs também fornece uma visão melhor das tendências de lavagem dos timócitos do tecido durante o período de cultura. Uma análise semelhante pode ser inferida dos dados, que o número de timócitos é reduzido durante o curso da cultura à medida que a razão de TECs aumenta. Os dados anteriores podem ser usados para mostrar as amostras divididas em grupos. Os grupos são gerados por meio de análise de agregado hierárquico. Esta análise identifica sistemática e estatisticamente amostras com características semelhantes agrupando dados iterativamente com base em semelhanças, resultando em agregados significativos de dados de propriedades semelhantes (referidos como “grupos”). O processo de agrupamento de células exigiu as seguintes etapas:
[200] A distância entre os grupos é calculada. A distância é uma medida de semelhança entre os grupos. O custo: de juntar dois grupos é calculado. O custo aqui é quanto erro é adicionado ao ingressar nos grupos. Os grupos que têm o menor custo de fusão são unidos. O processo é repetido até que todos os dados sejam unidos em um grupo. O conjunto de dados resultante mostra essencialmente uma árvore genealógica de como as amostras são “relacionadas” ou semelhantes entre si. A altura entre as ramificações mostra como dois grupos estão relacionados entre si. A distância no eixo x horizontal não é indicativa de qualquer relação mais próxima quando representada graficamente. As amostras em cada grupo são consideradas estatisticamente semelhantes, enquanto as de grupos diferentes são consideradas estatisticamente diferentes.
[201] Para determinar onde está a altura de corte entre os diferentes grupos, uma plotagem de Scree pode ser usada para examinar onde as distâncias entre os grupos são mais significativas. Isso garante que diferenças mínimas entre as amostras não influenciem excessivamente o algoritmo. Diferenças muito pequenas resultarão em uma fratura mais provável de amostras futuras em grupos independentes, pois as amostras devem ser semelhantes demais para agregar juntas do que é realista para produto derivado de tecido de timo pós-natal cultivado alogênico.
Alternativamente, os grupos devem ter um corte apropriado para garantir que haja diferenciação entre as amostras. No caso de produto derivado de tecido de timo pós-natal de cultivo alogênico, há alta probabilidade de heterogeneidade devido à natureza do tecido e à variabilidade de lote para lote que pode se apresentar. Ao examinar amostras que mostraram resultados clínicos positivos anteriores (aqui definidos por sobrevivência) e comparando com tecidos que foram degradados, o nível apropriado de diferenciação pode ser determinado.
[202] Um conjunto de treinamento pode ser selecionado contendo a maioria das informações relacionadas aos resultados clínicos. Inicialmente, são incluídas amostras de vários estudos representativos de P&D, bem como várias condições de degradação forçada e amostras clínicas.
Esses dados podem ser agregados em grupos bons e ruins. O conjunto de treinamento pode ser considerado mais informativo se restrito a amostras conhecidas como “boas” e conhecidas como “ruins” que são representativas de futuras amostras em processo a serem examinadas para liberação de lote. Esta etapa restringe as amostras da seguinte maneira.
[203] As amostras podem ser removidas se não forem do ponto médio ou do dia 5 a 9 do período de cultura. No exemplo de tecido derivado de tecido de timo cultivado alogênico, é neste momento que as amostras em processo para liberação de lote com base na histologia quantitativa podem ser obtidas. As amostras também podem ser removidas se forem de lotes de P&D considerados representativos, mas não há resultados clínicos associados a serem examinados. Além disso, as amostras podem ser removidas se estiverem associadas a resultados clínicos negativos. As amostras também podem ser removidas do braço de degradação forçada se os métodos ortogonais não forem capazes de confirmar a degradação.
[204] Os dados subjacentes podem ser agrupados para entender melhor quais recursos subjacentes resultam nos diversos agregados. Os grupos podem estar associados a resultados clínicos positivos e amostras degradadas forçadas e/ou tecidos associados a resultados clínicos negativos.
Parâmetros diferentes podem conduzir a diferenciação dos grupos com resultados clínicos positivos (por exemplo, área de tamanho médio, alta circularidade e perímetro alto) de amostras degradadas forçadas e/ou resultados clínicos negativos.
[205] Por exemplo, um grupo pode ser caracterizado por uma proporção maior de núcleos que possuem perímetros grandes, densidades integradas altas e área alta com circularidade inferior. Isso pode ser devido à presença de aglomerados de núcleos que não podem ser lidos como células independentes pelo software. Isso ocorreria mais provavelmente em tecidos que ainda apresentam maior número de timócitos nos primeiros dias do período de cultura.
[206] Grupos adicionais podem ser definidos com resultados clínicos positivos. Por exemplo, os grupos podem ser designados por terem um grande número de células com altos valores de circularidade e/ou área mais alta em comparação com outros grupos e/ou densidade integrada de médio alcance. Esses valores são esperados para tecidos saudáveis viáveis na faixa intermediária do período de cultura. Histogramas das medições de área, circularidade, densidade integrada e perímetro podem ser construídos a partir dos dados.
[207] Para comparação, um estudo de degradação forçada pode ser conduzido onde as amostras são colocadas de volta no meio do órgão do timo (TOM) antes de as amostras serem removidas nos dias 5 e 9. Isso mostra como o produto derivado de tecido do timo pós-natal cultivado alogênico é resistente às variações nas condições do processo. Nem todas as condições de cultivo podem causar degradação detectável por meio de qualquer uma das medidas utilizadas. Acredita- se que essas condições não danificam permanentemente o tecido a ponto de torná-lo inoperante ou inviável. Como seria de se esperar de amostras degradadas, existem grandes proporções de células com menor circularidade, área baixa e perímetros maiores. Isso mostra células que não são mais capazes de manter a viabilidade e, portanto, são alteradas na morfologia e encolhendo com bordas enrugadas. Para mostrar a similaridade dentro de um grupo, a análise da variabilidade para cada grupo é examinada; Classificações de “boa” e “ruim” (aprovação ou reprovação) podem ser determinadas. Usando as etapas anteriores, a análise de espécimes de tecido associadas às características de aprovação e reprovação pode ser avaliada.
[208] O produto derivado de tecido do timo pós- natal cultivado alogênico (por exemplo, “RVT-802”) é normalmente cultivado de 12 a 21 dias antes da implantação no receptor. Este período de tempo de cultura historicamente demonstrou resultar em resultados clínicos positivos após a implantação do produto de tecidos modificados geneticamente.
Não pretendendo ser limitado pela teoria, acredita-se que este período de tempo de cultura permite que o tecido esgote os timócitos, seja por lavagem do tecido ou por apoptose. As células epiteliais tímicas são mantidas ao longo do tempo de cultura.
[209] O ensaio validado examina uma amostra retirada entre os dias 5 a 9 de cultura para avaliar a adequação do tecido do timo cultivado para liberação. Para ajudar a compreender melhor o produto e avaliar melhor as capacidades de discernimento do ensaio, as amostras foram executadas por meio do programa de software retirado dos dias 1 a 21 e além e os dados resultantes foram comparados entre si para avaliar quais tendências eram aparentes.
[210] As Figuras 14A a 14D representam três lotes de amostras de tecido de timo de cultura clínica (Figuras 14A a 14C) e uma amostra de tecido de timo degradado. Os quatro recursos de área, perímetro, densidade integrada e circularidade para a amostra representada na Figura 14A foram: área = 11,34; circularidade = 0,696; perímetro = 14,310 e densidade integrada = 1.889,2. Os quatro recursos de área, perímetro, densidade integrada e circularidade para a amostra representada na Figura 14B foram: área = 11,41; circularidade = 0,993; perímetro = 11,982 e densidade integrada = 1.912,4. Os quatro recursos de área, perímetro, densidade integrada e circularidade para a amostra representada na Figura 14C foram: área = 10,53; circularidade = 0,846; perímetro = 12,510 e densidade integrada = 1.707,4.
Os quatro recursos de área, perímetro, densidade integrada e circularidade para a amostra representada na Figura 14D foram: área = 13,0; circularidade = 0,352; perímetro = 21,556 e densidade integrada = 1.786,0. Um único núcleo em cada imagem é identificado por um círculo.
[211] A tendência geral no número de núcleos detectados também foi examinada, a qual espera-se que diminua ao longo do tempo conforme os timócitos saem dos tecidos ou sofrem apoptose, o que pode ser observado na Figura 15. Esses dados foram normalizados para a área do tecido, uma vez que diferentes fatias de vários lotes foram examinadas nos diferentes dias; o tamanho da seção de tecido pode diferir entre as fatias e pode causar variabilidade no conjunto de dados, mas uma tendência geral negativa foi observada com o aumento dos dias de cultura, com uma mudança de etapa visual nos dados em torno do dia 10. Dados anteriores mostraram que a maior parte da depleção de timócitos ocorre no início do período de cultura, quando comparada à diminuição no número total de células mostrado abaixo.
EXEMPLO 1. ESTUDOS DE CURSO DE TEMPO DE CULTURA DE
[212] A aparência geral do tecido e, consequentemente, das lâminas histológicas, muda com o decorrer do período de cultura. As imagens apresentadas nas Figuras 16A a 16B, 17A a 17B, 18A a 18B, 19A a 19B e 20A a 20B mostram as diferenças na aparência do tecido do timo cultivado em lâminas coradas com H&E em vários intervalos de tempo, ou seja, em 0, 5, 9, 12 e 21 dias. As imagens são apresentadas com ampliação de 40x. Os dias escolhidos para essas imagens e análises posteriores são de dias que foram identificados como importantes do ponto de vista do processo de fabricação. O dia 0 representa o tecido que chega. A histologia no Dia 0 é obtida para fins de identidade. Ambas as amostras de histologia do Dia 0 e do Dia 5 a 9 foram fixadas em formalina e levadas ao laboratório de patologia para inclusão em parafina e corte. As seções foram coradas e avaliadas por um patologista certificado.
[213] As Figuras 21A a 21E são imagens de tecido de timo cultivado corado com H&E em 0, 5, 9, 2 e 21 dias,
representando mudanças na aparência dos núcleos no Dia 0, 5, 9, 12 e 21. A Figura 21A mostra que uma alta proporção de núcleos tem uma densidade integrada mais alta, indicativa de um grande número de timócitos. À medida que os timócitos são removidos do tecido, o tecido no Dia 5 (Figura 21B), 9 (Figura 21C), 12 (Figura 21D) e 21 (Figura 21E) mostram uma diminuição acentuada na densidade integrada e um perfil mais semelhante ao perfil para células epiteliais tímicas.
[214] A Figura 22 mostra o curso do tempo de determinações de densidade integrada de lotes técnicos de produto derivado de tecido de timo pós-natal cultivado alogênico. À medida que os timócitos são removidos do tecido, o tecido no Dia 5 mostra uma diminuição acentuada na densidade integrada e um perfil mais semelhante ao perfil das células epiteliais tímicas. As barras de erro estão a um DP da média.
[215] A Figura 23 mostra as medidas de circularidade. O número de células com circularidade muito alta diminui com o tempo ao longo do processo de cultura.
Isso provavelmente se deve à apoptose que resulta em núcleos menos circulares e também na eliminação dos timócitos muito circulares. Para amostras no Dia 0 com circularidade inferior, isso provavelmente se deve pelo fato de que a aglomeração de timócitos é medida como uma entidade única com circularidade inferior do que um único núcleo. As barras de erro estão a um DP da média.
[216] A Figura 24 mostra as medidas de perímetro.
No Dia 0, há uma grande proporção de células com perímetros altos, o que é provavelmente devido a aglomerados de células sendo lidos no programa como uma única forma, resultando em grandes valores de perímetro. O aumento no perímetro é provavelmente uma combinação da lavagem dos timócitos, bem como das células em apoptose ao longo do tempo de cultura e um aumento resultante no perímetro a partir desse evento. As barras de erro estão a um DP da média.
[217] A Figura 25 mostra a distância euclidiana (a raiz quadrada do quadrado da soma do erro entre uma amostra e o grande centroide) para medir a similaridade entre duas amostras, levando em consideração todas as quatro variáveis examinadas. Para referência, quanto menor a distância euclidiana, mais semelhantes são as duas amostras. As barras de erro estão a um DP da média.
[218] A Figura 26 é uma plotagem de efeitos principais e uma plotagem de interação dos dados. Os dados mostrados na Figura 26 confirmam que o tecido do timo cultivado se comporta de forma semelhante ao longo do tempo.
[219] Em geral, as características nucleares ao longo do tempo de cultura se alinham com as expectativas teóricas para tendências. A maioria das mudanças aparentes nos dados são anteriores aos dias de liberação pretendidos dos lotes. Isso sugere que muitas das mudanças ocorrem durante os primeiros dias de cultura, após os quais o ambiente é capaz de se sustentar por até 21 dias. Isso apoia o ensaio para detectar tendências verdadeiras nas populações de células e como elas mudam ao longo do tempo.
EXEMPLO 2: ESTUDO DE VARIABILIDADE ENTRE TIMOS
[220] A variabilidade entre timos foi examinada para entender melhor se as amostras são semelhantes entre os timos. A variabilidade entre timos foi avaliada de maneira semelhante à variabilidade dentro do timo, onde as amostras examinadas são de um único dia, mas em vez de serem restritas a um único timo, incluem amostras de vários lotes. A distância euclidiana de cada amostra foi calculada ao ponto central de todas as amostras dentro do conjunto de dados isolado. ANOVAs foram então realizados nas distâncias ao centro pelo timo. Esta análise foi realizada em amostras nos dias 5 e 9.
[221] A variabilidade entre timos foi examinada para entender melhor se as amostras são semelhantes entre os timos. A variabilidade entre timos foi avaliada de maneira semelhante à variabilidade dentro do timo, onde as amostras examinadas são de um único dia, mas em vez de serem restritas a um único timo, incluem amostras de vários lotes. A distância euclidiana de cada amostra foi calculada ao ponto central de todas as amostras dentro do conjunto de dados isolado. ANOVAs foram então realizados nas distâncias ao centro pelo timo. Esta análise foi realizada em amostras nos dias 5 e 9.
[222] Da Tabela 6 abaixo, não há diferenças detectáveis entre os lotes no Dia 9. Existem pequenas diferenças estatísticas entre os timos no Dia 5. É difícil determinar se isso resulta em diferenças práticas que resultam em diferenças na qualidade do produto. Para avaliar isso de uma maneira diferente, intervalos de confiança de 95% em cada dia foram gerados por timo. Como pode ser visto na Figura 27, o lote MFG- 058 não se sobrepõe aos intervalos de confiança para os outros tecidos no Dia 5, mas o faz no Dia 9. Este lote foi fabricado de maneira representativa aos outros lotes, e nenhuma diferença foi observada por meio de exame histológico bruto em nenhum dos dias. Como tal, é provável que isso seja um artefato da sensibilidade do método a pequenas diferenças nas distribuições nucleares entre os tecidos.
TABELA 6 ANÁLISE ANOVA DA VARIABILIDADE ENTRE TIMOS, ANÁLISE
REALIZADA PELO TIMO PARA O PONTO CENTRAL DO GRUPO DIURNO EXEMPLO 3: ANÁLISE DE CÉLULAS EPITELIAIS TÍMICAS
[223] Uma análise mais específica de apenas células epiteliais tímicas foi realizada para ajudar a caracterizar o produto derivado de tecido do timo pós-natal cultivado alogênico. As células epiteliais do timo são hipotetizadas como críticas para o mecanismo de ação do produto derivado do tecido do timo pós-natal cultivado alogênico. As imagens foram enviadas para um patologista. O patologista selecionou núcleos para células identificadas como células epiteliais do timo (consulte as Figuras 28A a 28B). Os núcleos das células epiteliais tímicas diferem de outras células na população de tecidos. TECS são geralmente maiores e têm um nucléolo presente, que aparece como um ponto roxo mais escuro dentro do centro do núcleo externo roxo mais claro nas Figuras 28A a 28B.
[224] AS células agora marcadas foram extraídas como pontos de dados individuais do software. Usando esses dados, um filtro foi criado para permitir que as etapas a seguir sejam realizadas em ordem sequencial. Os filtros de dois tamanhos removem todas as células fora da janela de intervalo de tamanho, tanto antes quanto depois da divisão das células conjuntas. As seguintes etapas de filtragem foram realizadas.
[225] As células mais escuras foram removidas do conjunto de dados definindo o limiar de inclusão abaixo dos pixels mais escuros (pixels incluídos entre 100 a 130 a 150 a 180 de intensidade de pixel dependendo da intensidade de coloração).
[226] As células abaixo de 50 µm2 na área foram removidas.
[227] Buracos foram preenchidos, divisor de águas aplicado para dividir células conjuntas.
[228] As células fora do intervalo de 30 a 250 µm2 e circularidade <0,75 foram filtradas do conjunto de dados.
[229] Os filtros anteriores permitiram a análise de imagens com conjuntos de dados gerados e restritos para caracterização das células TEC. Ao examinar a razão total de células no tecido ao longo do período de cultura, há um aumento geral nas TECs. O aumento das TECS ocorre porque, à medida que os timócitos são removidos do tecido, um número maior de células restantes são TECs. Esta alteração pode ser visualizada na Figura 30: Razão de TECs para o número total de células das lâminas de H&E. Essas determinações também mostram que as TECs são mantidas durante todo o período de cultura, conforme exigido para a eficácia do produto. A mesma tendência pode ser vista quando normalizada para a área de tecido, conforme exibido na Figura 31. Os dados para classificar e extrair TECs do conjunto de análise foram feitos em uma amostra por dia e sujeitos à variabilidade de amostra para amostra.
EXEMPLO 4: ANÁLISE DE TIMÓCITO
[230] A análise TEC do Exemplo 3 também dá uma visão melhor das tendências da lavagem dos timócitos do tecido ao longo do período de cultura. Uma análise semelhante não foi realizada para os timócitos, mas pode ser inferido a partir dos dados acima que o número de timócitos é reduzido durante o curso da cultura à medida que a razão de TECs aumenta.
Esta alteração também pode ser visualizada em imagens das lâminas coradas com H&E em múltiplas ampliações (consultar,
por exemplo, Figuras 16 a 21). Os timócitos nessas imagens são os núcleos roxos escuros menores. Nas imagens do dia 0 das Figuras 16A e 16B, elas são numerosas e, no dia 5, há uma diminuição acentuada, como mostrado nas Figuras 17A e 17B. Isso foi observado em vários relatórios de patologia, bem como na análise de citocinas e quimiocinas de L- Selectina, um marcador de timócitos (REP-016). As tendências gerais dos dados também concordam com esta análise usando a análise quantitativa conforme discutido anteriormente.
EXEMPLO 5: ANÁLISE DE AGREGADO HIERÁRQUICO
[231] Os dados apresentados nos Exemplos 1 a 4 mostram as amostras divididas em 4 grupos, conforme ilustrado na Figura 32. Os grupos representados na Figura 32 foram gerados por meio da análise de agregado hierárquica. Esta análise identifica sistemática e estatisticamente amostras com características semelhantes agrupando dados iterativamente com base em semelhanças, resultando em agregados significativos de dados de propriedades semelhantes (referidos como “grupos”). O processo de agrupamento de células exigiu as seguintes etapas:
[232] A distância entre os grupos é calculada. A distância é uma medida de semelhança entre os grupos.
[233] O custo: de juntar dois grupos é calculado.
O custo aqui é quanto erro é adicionado ao ingressar nos grupos.
[234] Os grupos que têm o menor custo de fusão são unidos.
[235] O processo é repetido até que todos os dados sejam unidos em um grupo.
[236] O conjunto de dados resultante mostra essencialmente uma árvore genealógica de como as amostras são “relacionadas” ou semelhantes entre si. A altura entre as ramificações mostra como dois grupos estão relacionados entre si. A distância no eixo x horizontal não é indicativa de qualquer relacionamento mais próximo. Consultar a Figura 32 para uma ilustração disso. A Figura 32 é um dendrograma de agregado que mostra a distância entre os grupos "C" e "D" como exemplo. As caixas destacadas em verde e vermelho indicam agrupamentos únicos. Isso se baseia em uma altura de corte do eixo y de 0,43. Neste exemplo, os grupos C e D estão a uma distância de 0,6 e, portanto, são considerados dois grupos separados. As amostras dentro de cada grupo são consideradas estatisticamente semelhantes, enquanto aquelas em grupos diferentes são consideradas estatisticamente diferentes.
[237] Para determinar onde está a altura de corte entre os diferentes grupos, um gráfico de tela pode ser usado para examinar onde as distâncias entre os grupos são mais significativas. Isso garante que diferenças mínimas entre as amostras não influenciem excessivamente o algoritmo.
Diferenças muito pequenas resultarão em uma fratura mais provável de amostras futuras em grupos independentes, pois as amostras devem ser semelhantes demais para agregar juntas do que é realista para produto derivado de tecido de timo pós-natal cultivado alogênico. Alternativamente, os grupos devem ter um corte apropriado para garantir que haja diferenciação entre as amostras. No caso de produto derivado de tecido de timo pós-natal de cultivo alogênico, há alta probabilidade de heterogeneidade devido à natureza do tecido e à variabilidade de lote para lote que pode se apresentar.
Ao examinar amostras que mostraram resultados clínicos positivos anteriores (aqui definidos por sobrevivência) e comparando com tecidos que foram degradados, o nível apropriado de diferenciação pode ser determinado.
EXEMPLO 6: DETERMINAÇÃO DE CONJUNTO DE TREINAMENTO
[238] Em uma modalidade preferida, um conjunto de treinamento foi selecionado que continha a maioria das informações relacionadas aos resultados clínicos.
Inicialmente, foram incluídas amostras de vários estudos representativos de P&D, bem como várias condições de degradação forçada e amostras clínicas. Isso resultou em uma análise de agregação que incluiu muitos grupos bons e ruins (consultar a Figura 33). Após o desenvolvimento do ensaio, foi decidido que o conjunto de treinamento seria mais informativo se restrito a amostras conhecidas “boas” e
“ruins” que são representativas de futuras amostras em processo a serem examinadas para liberação de lote. Isso restringe as amostras da seguinte maneira.
[239] As amostras foram removidas se não fossem do ponto médio ou do dia 5 a 9 do período de cultura. É quando as amostras em processo para liberação de lote com base na histologia quantitativa serão coletadas.
[240] As amostras foram removidas se fossem de lotes de P&D considerados representativos, mas não há resultados clínicos associados a serem examinados.
[241] As amostras foram removidas se estivessem associadas a resultados clínicos negativos. Essas amostras não foram consideradas “ruins”, pois foram liberadas daquela instalação com base no ensaio histológico qualitativo em uso e não houve casos em que se acreditou que o próprio lote fosse a causa do resultado clínico. Esses casos foram removidos porque não há prova definitiva de que funcionaram.
[242] As amostras foram removidas do braço de degradação forçada se os métodos ortogonais não forem capazes de confirmar a degradação. Essas amostras foram examinadas por um patologista, bem como amostras de meio gastas examinadas para citocinas e quimiocinas e qualquer amostra que não foi confirmada como “ruim” por outro método foi deixada de fora do conjunto de treinamento final. O produto derivado de tecido de timo pós-natal cultivado alogênico tem se mostrado resistente a uma variedade de condições, e a análise não deve ser distorcida para detectar casos que provavelmente resultam em tecido “bom”. As condições que permaneceram no conjunto de análise foram de amostras que foram congeladas a -20 oC ou onde o meio foi substituído por 10XPBS. Para obter uma lista completa das condições e resultados de degradação, consultar a Tabela 7.
TABELA 7
1O patologista determinou que essa condição provavelmente fixou o tecido. 2Resultados indeterminados fizeram com que os grupos mudassem.
[243] As demais amostras que foram utilizadas no conjunto final de treinamento são aquelas provenientes de casos clínicos com sobrevida demonstrada em 1 ano ou de casos confirmados como tecidos degradados de P&D. Os agregados resultantes são representados na Figura 33.
[244] Isso resultou em cinco agregados inicialmente, quatro agregados com amostras clinicamente boas e um agregado com amostras ruins confirmadas. Um dos bons agregados continha apenas duas amostras; não tinha alta variabilidade dentro de si e, portanto, faria com que a alavancagem do modelo causasse mudanças. Portanto, quando novas amostras forem examinadas, é mais provável que essas duas amostras façam com que os outros agregados se movam para permitir que essas amostras sejam agrupadas de forma adequada. Para testar isso, uma remoção sistemática de cada amostra e a reagregação subsequente foi examinada. Foi descoberto que qualquer uma dessas amostras, se isolada, causaria o deslocamento das amostras resultantes. Como tal, essas amostras foram removidas. Foi determinado que, embora isso possa resultar em amostras adicionais semelhantes a esses dois tecidos para agregar de forma independente, o resultado geral seria um algoritmo e um conjunto de treinamento mais robustos para comparação. Essas amostras podem ser usadas em conjunto com amostras futuras para reavaliar os recipientes em uma data posterior, quando o conjunto de dados puder ser expandido. A biblioteca de treinamento final que foi validada no software é ilustrada na Figura 34.
EXEMPLO 7: ANÁLISE GRUPO A GRUPO
[245] Os dados subjacentes para os quatro grupos representados na Figura 34 foram examinados para tentar entender melhor quais recursos subjacentes resultam nos diversos agregados. Os grupos serão chamados de grupos 1, 2, 3 e 4. O dendrograma acima na Figura 32 mapeou qual nome de grupo pertence a cada agregado, mas para referência adicional, os Grupos 1, 2 e 3 são de amostras com resultados clínicos positivos e o Grupo 4 é composto de amostras degradadas forçadas. Imagens representativas de tecidos de cada grupo são mostradas nas Figura 35A a 35D. As Figuras 35A a 35D representam imagens representativas para cada grupo de agregados na biblioteca de amostra final. Os grupos 1 (Figura 35A), 2 (Figura 35B) e 3 (Figura 35C) são compostos por amostras com resultados clínicos positivos. O Grupo 4 (Figura 35D) é constituído por amostras degradadas confirmadas. A amostra do Grupo 1 é de LOT-345, a amostra do Grupo 2 é de LOT-160, a amostra do Grupo 3 é de LOT-194 e a amostra do Grupo 4 é de FD.SP17-40348-C1.1 (método de degradação: Congelamento a -20 °C.
[246] Uma representação gráfica de todos os agregados próximos uns dos outros é mostrada nas Figuras 36A a 36D. A Figura 36A é uma representação gráfica de agregados de dados em determinações de área. A Figura 36B é uma representação gráfica de agregados de dados em determinações de circularidade. A Figura 36C é uma representação gráfica de agregados de dados em determinações de densidade integrada. A Figura 36D é uma representação gráfica de agregados de dados em determinações de perímetro.
[247] As Figuras 36A a 36D representam imagens representativas para cada grupo de agregação na biblioteca de amostra final. Os grupos 1, 2 e 3 são compostos por amostras com resultados clínicos positivos. O Grupo 4 é composto por amostras degradadas confirmadas. A amostra do Grupo 1 é de LOT-345, a amostra do Grupo 2 é de LOT-160, a amostra do Grupo 3 é de LOT-194 e a amostra do Grupo 4 é de FD.SP17-40348-C1.1 (método de degradação: Congelamento a - 20 °C).
[248] Como pode ser visto pelos dados plotados nas Figuras 36A a 36D, diferentes parâmetros conduzem a diferenciação dos grupos com resultados clínicos positivos (por exemplo, área de tamanho médio, alta circularidade e alto perímetro). As amostras degradadas forçadas também são visivelmente diferentes dos outros grupos em muitos aspectos, conforme mostrado pelas barras vermelhas nos gráficos. Esses dados demonstram que existem vários conjuntos de dados que resultam em bons resultados clínicos.
Pode haver outras maneiras pelas quais as amostras podem parecer boas ou ruins que atualmente não são capturadas nos conjuntos de dados e, portanto, não seriam agregadas em nenhum grupo.
[249] Grupo 1. O Grupo 1 é o agregado maior. O mesmo é composto por 19 tecidos diferentes com desfechos clínicos positivos. O Grupo 1 é caracterizado por uma maior proporção de núcleos com grandes perímetros, altas densidades integradas e grande área com menor circularidade.
Isso provavelmente se deve à presença de grupos de núcleos que não podem ser lidos como células independentes pelo software. Isso ocorreria mais provavelmente em tecidos que ainda apresentam maior número de timócitos nos primeiros dias do período de cultura. Quando um estudo cego foi executado, uma amostra de um tecido do Dia 0 foi agregada ao Grupo 1, dando suporte à teoria acima. Embora não pareça que este ensaio rejeite tecidos com grande número de timócitos presentes, as amostras do Grupo 1 tiveram resultados clínicos positivos quando implantadas no final do período de cultura.
[250] A Figura 37 é uma imagem do Grupo 1 com recursos dentro da Área-10 (vermelho), Circularidade-0,9
(verde), Perímetro-18 (azul) e Densidade Integrada-1.500 (amarelo) destacados. Esses grupos geralmente mostram a maior variação entre os grupos.
[251] A Figura 38 é um histograma que descreve medições de área das células no Grupo 1.
[252] A Figura 39 é um histograma que representa medições de circularidade de células no Grupo 1.
[253] A Figura 40 é um histograma que representa medições de densidade integrada de células no Grupo 1.
[254] A Figura 41 é um histograma que descreve as medições do perímetro das células no Grupo 1.
GRUPO 2.
[255] O Grupo 2 contém 10 lotes de tecidos que tiveram resultados clínicos positivos. Os grupos 2 e 3 têm grandes proporções de células com altos valores de circularidade. O grupo 2 também parece ter células com área maior em comparação aos grupos 3 e 4 e densidade integrada de média faixa. Esses valores são esperados para tecidos saudáveis viáveis na faixa intermediária do período de cultura, conforme mostrado pelas amostras que formam o Grupo
2. Histogramas das medidas de área, circularidade, densidade integrada e perímetro aparecem nas Figuras 43 a 46.
[256] A Figura 42 é uma imagem do Grupo 2 com recursos dentro da Área-10 (vermelho), Circularidade-0,9 (verde), Perímetro-18 (azul) e Densidade Integrada-1.500
(amarelo) destacados. Esses grupos geralmente mostram a maior variação entre os grupos.
[257] A Figura 43 é um histograma que representa as medições da área das células no Grupo 2.
[258] A Figura 44 é um histograma que representa medições de circularidade de células no Grupo 2.
[259] A Figura 45 é um histograma que descreve medições de densidade integrada de células no Grupo 2.
[260] A Figura 46 é um histograma que descreve as medições do perímetro das células no Grupo 2.
GRUPO 3.
[261] O Grupo 3 é composto por 6 lotes que apresentaram resultados clínicos positivos. Assim como o grupo 2, o grupo 3 possui uma grande proporção de células com alta circularidade, apresentando timócitos e viabilidade celular geral. O Grupo 3 tem a maior proporção de células na menor área e também na faixa inferior de densidade integrada (2º e 3º bins).
[262] Figura 47. É uma imagem do Grupo 3 com recursos dentro da Área-10 (vermelho), Circularidade-0,9 (verde), Perímetro-18 (azul) e Densidade Integrada-1.500 (amarelo) destacados. Esses grupos geralmente mostram a maior variação entre os grupos.
[263] Histogramas das medidas de área, circularidade, densidade integrada e perímetro aparecem nas Figuras 48 a 51.
[264] A Figura 48 é um histograma que descreve medições da área de células no Grupo 3.
[265] A Figura 49 é um histograma que descreve medições de circularidade de células no Grupo 3.
[266] A Figura 50 é um histograma que descreve medições de densidade integrada de células no Grupo 3.
[267] A Figura 51 é um histograma que descreve medições de perímetro das células no Grupo 3.
GRUPO 4.
[268] O Grupo 4 é composto por 4 amostras degradadas forçadas. As condições de degradação mostradas aqui são para amostras que foram congeladas a -20OC por 4 horas e amostras em que o meio de cultura foi substituído por 10X PBS por 24 horas. Ambas as condições mostraram degradação significativa por histologia qualitativa e mudanças significativas ao examinar CCL21, que é um biomarcador para a saúde de TEC.
Uma tabela de todas as condições degradadas forçadas e os resultados de cada método está incluída abaixo.
[269] A Figura 52 é uma imagem do Grupo 4 com recursos dentro da Área-10 (vermelho), Circularidade-0,9 (verde), Perímetro-18 (azul) e Densidade Integrada-1.500
(amarelo) destacados. Esses grupos geralmente mostram a maior variação entre os grupos.
[270] Histogramas das medidas de área, circularidade, densidade integrada e perímetro aparecem nas Figuras 53 a 56.
[271] A Figura 53 é um histograma que descreve medições de área de células no Grupo 4.
[272] A Figura 54 é um histograma que representa medições de circularidade de células no Grupo 4.
[273] A Figura 55 é um histograma que descreve medições de densidade integrada de células no Grupo 4.
[274] A Figura 56 é um histograma que representa medições de perímetro de células no Grupo 4.
EXEMPLO 8: ESTUDO DE DEGRADAÇÃO FORÇADA.
[275] Um estudo de degradação forçada foi executado onde as amostras foram colocadas de volta em meio de órgão do timo (TOM) antes de as amostras serem removidas nos dias 5 e 9. Isso mostra como o produto derivado de tecido do timo pós-natal cultivado alogênico é resistente às variações nas condições do processo. É interessante notar que o aquecimento das amostras a 55 oC não foi detectado pelo presente método de histologia tradicional. Isso provavelmente ocorre porque o aquecimento do tecido basicamente o fixou de uma perspectiva histopatológica. No entanto, a degradação foi aparente através da análise CCL21. Muitas das condições testadas não causaram degradação detectável por meio de qualquer uma das medidas utilizadas. Acredita-se que essas condições não causaram danos permanentes ao tecido, a ponto de torná-lo inoperante ou inviável. Existem controles de processo para garantir que o produto nunca seja exposto a nenhuma das condições acima. Como seria de se esperar de amostras degradadas, existem grandes proporções de células com menor circularidade, área baixa e perímetros maiores.
Isso mostra células que não são mais capazes de manter a viabilidade e, portanto, estão mudando a morfologia e encolhendo com bordas enrugadas. As condições de degradação forçada do estudo aparecem na Tabela 7.
[276] Para mostrar a semelhança dentro de um grupo, foi examinada a análise da variabilidade de cada bin. O Grupo 4 exibiu regularmente o maior desvio padrão dentro de um bin entre as amostras nele. Isso é possivelmente devido ao menor número de amostras dentro desse grupo, mas também não é inesperado para o tecido, uma vez que se degrada para ser menos consistente (consultar Figura 57).
[277] A Figura 57 é plotagens de uma análise da variabilidade entre e dentro dos grupos em uma base bin a bin. Os dados são mostrados no eixo x primeiro por grupo e depois por bin para o parâmetro. O gráfico superior de cada parâmetro são os indivíduos e o inferior é o desvio padrão desse grupo. Ambos podem ser usados para visualizar a disseminação dos dados.
[278] AE1/AE3: Um coquetel de 2 anticorpos que reagem com todas as citoqueratinas para identificar células epiteliais.
[279] CD3: Anticorpo que reage com células T, incluindo timócitos. CK14: Um anticorpo que detecta apenas a citoqueratina 14, um componente do citoesqueleto em um subconjunto de células epiteliais com a hipótese de ter potencial de repovoamento.
[280] FFPE: Seções de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina.
[281] H&E: Hematoxilina e eosina, uma coloração histológica mais comumente usada para microscopia de luz de cortes de tecido de mamíferos.
[282] Ki-67: O anticorpo de Ki-67 reconhece o antígeno Ki-67, uma proteína associada à proliferação celular.
[283] TEC: Células epiteliais tímicas.
[284] Referências discutidas no pedido, que são incorporadas por referência na íntegra, para a finalidade pretendida, o que é evidente com base em seu contexto.
[285] Todas as patentes, pedidos de patente e publicações aqui citadas são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. As divulgações dessas publicações na íntegra são aqui incorporadas por referência a este pedido.
[286] As divulgações de toda e qualquer patente, pedido de patente, publicação e número de acesso aqui mencionados são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.
[287] Deve ser entendido que, embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com a descrição detalhada da mesma, a descrição anterior pretende ilustrar e não limitar o escopo da invenção, que é definido pelo escopo das reivindicações anexas. Outros aspectos, vantagens e modificações encontram-se dentro do âmbito das reivindicações a seguir.
[288] As modalidades e vantagens anteriores são meramente exemplares e não devem ser interpretadas como limitativas da presente invenção. Os presentes ensinamentos podem ser facilmente aplicados a outros tipos de métodos, sistemas e classificadores, experimentos e procedimentos cirúrgicos. Além disso, a descrição das modalidades da presente invenção pretende ser ilustrativa e não limitar o escopo das reivindicações. Diversas alternativas, modificações e variações serão evidentes aos versados na técnica.
[289] Embora a presente divulgação tenha sido divulgada com referência a várias modalidades, é observado que outras modalidades e variações delas podem ser criadas por outros versados na técnica sem se afastar do verdadeiro espírito e escopo da divulgação. As reivindicações anexas pretendem ser interpretadas para incluir todas essas modalidades e variações equivalentes.
[290] A especificação escrita anterior é considerada suficiente para permitir que um versado na técnica pratique as modalidades. A descrição e exemplos anteriores detalham certas modalidades e descrevem o melhor modo contemplado pelos inventores. Será apreciado, no entanto, que não importa o quão detalhado o exposto possa aparecer no texto, a modalidade pode ser praticada de várias maneiras e deve ser interpretada de acordo com as reivindicações anexas e quaisquer equivalentes das mesmas.
REFERÊNCIAS Markert ML, Devlin BH, McCarthy EA, 2010, “Thymus transplantation,” Clin Immunol., 135(2): 236 a 46.
Markert ML, et al., 2004, “Postnatal thymus transplantation with immunosuppression as treatment for DiGeorge syndrome,” Blood 104(8): 2.574 a 2.581.
Markert ML, et al., 1999, “Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge syndrome,” N Engl J Med 341(16):
1.180 a 1.189 27).
Markert ML, et al., 2008, “Use of allograft biopsies to assess thymopoiesis after thymus transplantation,” J Immunol 180(9): 6.354 a 6.364.
Markert ML, et al., 2007, “Review of 54 patients with complete DiGeorge anomaly enrolled in protocols for thymus transplantation: outcome of 44 consecutive transplants,” Blood 109(10): 4.539 a 454.728).
Chinn IK, Devlin BH, Li YJ, & Markert ML, 2008, “Long- term tolerance to allogeneic thymus transplants in complete DiGeorge anomaly,” Clin Immunol 126(3): 277 a 281).
Markert ML, 2014, Thymus Transplantation. Stiehm’s Immune Deficiences, eds Sullivan KE & Stiehm ER (Academic Press), 1ª Edição, páginas 1.059 a 1.067.
Claims (60)
1. Método para treinar um classificador de tecido para realizar avaliação histopatológica quantitativa, caracterizado pelo fato de que compreende: converter uma imagem de lâmina em uma imagem de lâmina binária, em que a imagem de lâmina é selecionada a partir de uma biblioteca de imagens de controle, em que cada imagem de lâmina na biblioteca de imagens de controle está associada a uma classificação de aprovação ou reprovação; detectar um ou mais núcleos dentro da imagem de lâmina binária; para cada núcleo detectado, extrair um recurso do núcleo detectado, em que o recurso representa uma propriedade do núcleo detectado dentro da imagem de lâmina binária e compreende pelo menos um dentre uma área do núcleo detectado, um perímetro do núcleo detectado, uma densidade integrada do núcleo detectado, ou uma circularidade do núcleo detectado; para cada núcleo detectado, gerar, com base no recurso, uma impressão digital do recurso associada à imagem de lâmina binária, em que a impressão digital do recurso é um valor numérico calculado a partir do processamento do recurso; incorporar a imagem de lâmina binária em um agregado, em que o agregado compreende uma pluralidade de imagens, em que cada uma da pluralidade de imagens está associada a uma impressão digital de recurso correspondente, e em que a incorporação é baseada na comparação da impressão digital de recurso com a impressão digital de recurso correspondente; aplicar uma altura de corte para um dendrograma de agregado para formar uma pluralidade de grupos, em que a altura de corte minimiza uma série de grupos dentro da pluralidade de grupos com base na análise multivariada de análise de variância do agregado; categorizar um primeiro grupo dentro da pluralidade de grupos como um grupo de controle positivo se o primeiro grupo compreender primeiras imagens de lâmina associadas com a classificação de aprovação; e categorizar um segundo grupo dentro da pluralidade de grupos como um grupo de controle negativo se o segundo grupo compreender segundas imagens de lâmina associadas à classificação de reprovação.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o classificador de tecido é capaz de determinar a potência ou a qualidade do tecido para transplante em um sujeito.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o tecido é tecido do timo.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o tecido é fatias de produto derivado de tecido de timo pós-natal cultivado alogênico para implantação em um sujeito humano.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o sujeito humano sofre de síndrome de DiGeorge completa associada à deleção 22q11.2; síndrome de coloboma, defeito cardíaco, atresia coanal, retardo mental ou de crescimento, hipoplasia genital e anomalias de ouvido ou surdez (CHARGE) ou atimia associada à deficiência de proteína N1 da caixa forkhead (FOXN1).
6. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o classificador de tecido determina a potência ou qualidade de um tecido para transplante em um sujeito de um tecido desconhecido para transplante gerando impressões digitais de recurso de núcleos detectados em imagens de lâmina em uma biblioteca de controle e agregando as imagens de lâmina com base em suas impressões digitais de recursos correspondentes.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o tecido desconhecido é o tecido do timo.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o tecido do timo foi submetido a um processo de cultura em um meio de órgão do timo por um período de tempo para depleção parcial do tecido do timo de timócitos.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o período de tempo é de até 21 dias.
10. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o período de tempo é de cerca de 12 a cerca de 21 dias.
11. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o período de tempo é de cerca de 5 a cerca de 9 dias.
12. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o processo de cultura preserva a arquitetura funcional do estroma tímico.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o estroma tímico compreende células epiteliais tímicas e fibroblastos.
14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tecido é selecionado a partir do grupo que consiste em tecido vascular, tecido de pele, tecido hepático, tecido pancreático, tecido neural, tecido urogenital, tecido gastrointestinal, tecido esquelético incluindo osso e cartilagem, tecido adiposo, tecido conjuntivo incluindo tendões e ligamentos, tecido amniótico, tecido coriônico, dura-máter, pericárdio, tecido muscular, tecido glandular, tecido facial, tecido oftálmico.
15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a impressão digital de recurso é gerada a partir de medições que compreendem valores numéricos de uma área do núcleo detectado, um perímetro do núcleo detectado, uma densidade integrada do núcleo detectado e uma circularidade do núcleo detectado.
16. Método para realizar avaliação histopatológica quantitativa de uma imagem de lâmina não classificada de um tecido, caracterizado pelo fato de que compreende: detectar um canal de hematoxilina a partir da imagem de lâmina não classificada, em que o canal da hematoxilina está associado a um núcleo celular dentro da imagem de lâmina não classificada de um tecido; extrair um recurso do canal de hematoxilina detectado, em que o recurso representa uma propriedade do núcleo dentro da imagem de lâmina binária e compreende pelo menos um dentre uma área do núcleo, um perímetro do núcleo, uma densidade integrada do núcleo ou uma circularidade do núcleo; gerar, com base no recurso, uma impressão digital do recurso associada à imagem de lâmina não classificada, em que a impressão digital do recurso é um valor numérico calculado a partir do processamento do recurso; coagregar a impressão digital de recurso com um primeiro grupo de impressões digitais categorizado como um grupo de controle positivo ou um segundo grupo de impressões digitais categorizado como um grupo de controle negativo, em que o primeiro grupo e o segundo grupo são formados ao aplicar uma altura de corte a um dendrograma de agregado, e o grupo de controle positivo compreende um primeiro conjunto de imagens de lâmina associadas com uma classificação de aprovação e o grupo de controle negativo compreende um segundo conjunto de imagens de lâmina associadas a uma classificação de reprovação; e determinar, com base na coagregação, se a impressão digital do recurso está associada à classificação de aprovação ou à classificação de reprovação.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a impressão digital de recurso é capaz de determinar a potência ou a qualidade do tecido para transplante em um sujeito.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o tecido é tecido do timo.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o tecido é fatias de produto derivado de tecido de timo pós-natal cultivado alogênico para implantação em um sujeito humano.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o sujeito humano sofre de síndrome de DiGeorge completa associada à deleção 22q11.2;
síndrome de coloboma, defeito cardíaco, atresia coanal, retardo mental ou de crescimento, hipoplasia genital e anomalias de ouvido ou surdez (CHARGE) ou atimia associada à deficiência de proteína N1 da caixa forkhead (FOXN1).
21. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a impressão digital de recurso determina a potência ou qualidade do tecido para transplante em um sujeito de um tecido desconhecido, gerando impressões digitais de recurso de núcleos detectados dentro de imagens de lâmina em uma biblioteca de controle e agregando as imagens de lâmina com base em seus correspondentes apresentam impressões digitais.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o tecido desconhecido é o tecido do timo.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o tecido do timo foi submetido a um processo de cultura em um meio de órgão do timo por um período de tempo para depleção parcial do tecido do timo de timócitos.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o período de tempo é de até 21 dias.
25. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o período de tempo é de cerca de 12 a cerca de 21 dias.
26. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o período de tempo é de cerca de 5 a cerca de 9 dias.
27. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o processo de cultura preserva a arquitetura funcional do estroma tímico.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o estroma tímico compreende células epiteliais do timo e fibroblastos.
29. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o tecido é selecionado a partir do grupo que consiste em tecido vascular, tecido de pele, tecido hepático, tecido pancreático, tecido neural, tecido urogenital, tecido gastrointestinal, tecido esquelético incluindo osso e cartilagem, tecido adiposo, tecido conjuntivo incluindo tendões e ligamentos, tecido amniótico, tecido coriônico, dura-máter, pericárdio, tecido muscular, tecido glandular, tecido facial, tecido oftálmico.
30. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a impressão digital de recurso é gerada a partir de medições que compreendem valores numéricos de uma área do núcleo detectado, um perímetro do núcleo detectado, uma densidade integrada do núcleo detectado e uma circularidade do núcleo detectado.
31. Sistema para classificar objetos em imagens digitais de tecido caracterizado pelo fato de que compreende: meios para converter uma imagem de lâmina em uma imagem de lâmina binária, em que a imagem de lâmina é selecionada a partir de uma biblioteca de imagens de controle, em que cada imagem de lâmina na biblioteca de imagens de controle está associada a uma classificação de aprovação ou reprovação; meios para detectar um ou mais núcleos dentro da imagem binária da lâmina; meios para extrair, para cada núcleo detectado, um recurso, em que o recurso representa uma propriedade do núcleo detectado dentro da imagem de lâmina binária e compreende pelo menos uma de uma área do núcleo detectado, um perímetro do núcleo detectado, uma densidade integrada do núcleo detectado, ou uma circularidade do núcleo detectado; meios para gerar, com base no recurso, uma impressão digital do recurso associada à imagem de lâmina binária, em que a impressão digital do recurso é um valor numérico calculado a partir do processamento do recurso; meios para incorporar a imagem de lâmina binária em um agregado, em que o agregado compreende uma pluralidade de imagens, em que cada uma da pluralidade de imagens está associada a uma impressão digital de recurso correspondente, e em que a incorporação é baseada na comparação da impressão digital de recurso com a impressão digital de recurso correspondente; meios para aplicar uma altura de corte para um dendrograma de agregado para formar uma pluralidade de grupos, em que a altura de corte minimiza uma série de grupos dentro da pluralidade de grupos com base na análise multivariada de análise de variância do agregado; meios para categorizar um primeiro grupo dentro da pluralidade de grupos como um grupo de controle positivo se o primeiro grupo compreender primeiras imagens de lâmina associadas com a classificação de aprovação; e meios para categorizar um segundo grupo dentro da pluralidade de grupos como um grupo de controle negativo se o segundo grupo compreender segundas imagens de lâmina associadas à classificação de reprovação.
32. Sistema, de acordo com a reivindicação 31, em que o sistema é caracterizado pelo fato de que é capaz de determinar a potência ou a qualidade de um tecido para transplante em um sujeito.
33. Sistema, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o tecido é tecido do timo.
34. Sistema, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o tecido de timo é fatias de produto derivado de tecido de timo pós-natal cultivado alogênico para implantação em um sujeito humano.
35. Sistema, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o sujeito humano sofre de síndrome de DiGeorge completa associada à deleção 22q11.2; síndrome de coloboma, defeito cardíaco, atresia coanal, retardo mental ou de crescimento, hipoplasia genital e anomalias de ouvido ou surdez (CHARGE) ou atimia associada à deficiência de proteína N1 da caixa forkhead (FOXN1).
36. Sistema, de acordo com a reivindicação 31, em que o sistema é caracterizado pelo fato de que classifica a potência ou qualidade de um tecido para transplante em um sujeito de um tecido desconhecido, gerando impressões digitais de recurso de núcleos detectados dentro de imagens de lâminas em uma biblioteca de controle e agregando as imagens de lâminas com base em suas impressões digitais de recurso correspondentes.
37. Sistema, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o tecido desconhecido é o tecido do timo.
38. Sistema, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o tecido do timo foi submetido a um processo de cultura em um meio de órgão do timo por um período de tempo para depleção parcial do tecido do timo de timócitos.
39. Sistema, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o período de tempo é de até 21 dias.
40. Sistema, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o período de tempo é de cerca de 12 a cerca de 21 dias.
41. Sistema, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o período de tempo é de cerca de 5 a cerca de 9 dias.
42. Sistema, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o processo de cultura preserva a arquitetura funcional do estroma tímico.
43. Sistema, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o estroma tímico compreende células epiteliais tímicas e fibroblastos.
44. Sistema, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o tecido é selecionado a partir do grupo que consiste em tecido vascular, tecido de pele, tecido hepático, tecido pancreático, tecido neural, tecido urogenital, tecido gastrointestinal, tecido esquelético incluindo osso e cartilagem, tecido adiposo, tecido conjuntivo incluindo tendões e ligamentos, tecido amniótico, tecido coriônico, dura-máter, pericárdio, tecido muscular, tecido glandular, tecido facial, tecido oftálmico.
45. Sistema, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a impressão digital de recurso é gerada a partir de medições que compreendem valores numéricos de uma área do núcleo detectado, um perímetro do núcleo detectado, uma densidade integrada do núcleo detectado e uma circularidade do núcleo detectado.
46. Classificador caracterizado pelo fato de que compreende: meios para detectar um canal de hematoxilina a partir da imagem de lâmina não classificada, em que o canal da hematoxilina está associado a um núcleo celular dentro da imagem de lâmina não classificada de um tecido; meios para extrair um recurso do canal de hematoxilina detectado, em que o recurso representa uma propriedade do núcleo dentro da imagem de lâmina binária e compreende pelo menos um dentre uma área do núcleo, um perímetro do núcleo, uma densidade integrada do núcleo ou uma circularidade do núcleo; meios para gerar, com base no recurso, uma impressão digital do recurso associada à imagem de lâmina não classificada, em que a impressão digital do recurso é um valor numérico calculado a partir do processamento do recurso; meios para coagregar a impressão digital de recurso com um primeiro grupo de impressões digitais categorizado como um grupo de controle positivo e um segundo grupo de impressões digitais categorizado como um grupo de controle negativo, em que o primeiro grupo e o segundo grupo são formados ao aplicar uma altura de corte a um dendrograma de agregado, e o grupo de controle positivo compreende um primeiro conjunto de imagens de lâmina associadas com uma classificação de aprovação e o grupo de controle negativo compreendem um segundo conjunto de imagens de lâmina associadas a uma classificação de reprovação; e meios para determinar, com base na coagregação, se a impressão digital do recurso está associada à classificação de aprovação ou à classificação de reprovação.
47. Classificador, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o sistema é capaz de determinar a potência ou a qualidade de um tecido para transplante em um sujeito.
48. Classificador, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o tecido é tecido do timo.
49. Classificador, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o tecido de timo é fatias de produto derivado de tecido de timo pós-natal cultivado alogênico para implantação em um sujeito humano.
50. Classificador, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o sujeito humano sofre de síndrome de DiGeorge completa associada à deleção 22q11.2; síndrome de coloboma, defeito cardíaco, atresia coanal, retardo mental ou de crescimento, hipoplasia genital e anomalias de ouvido ou surdez (CHARGE) ou atimia associada à deficiência de proteína N1 da caixa forkhead (FOXN1).
51. Classificador, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o sistema classifica a potência de um tecido desconhecido gerando impressões digitais de recurso de núcleos detectados dentro de imagens de lâminas em uma biblioteca de controle e agregando as imagens de lâminas com base em suas impressões digitais de recurso correspondentes.
52. Classificador, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que o tecido desconhecido é o tecido do timo.
53. Classificador, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o tecido do timo foi submetido a um processo de cultura em um meio de órgão do timo por um período de tempo para depleção parcial do tecido do timo de timócitos.
54. Classificador, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o período de tempo é de até 21 dias.
55. Classificador, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o período de tempo é de cerca de 12 a cerca de 21 dias.
56. Classificador, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o período de tempo é de cerca de 5 a cerca de 9 dias.
57. Classificador, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o processo de cultura preserva a arquitetura funcional do estroma tímico.
58. Classificador, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o estroma tímico compreende células epiteliais do timo e fibroblastos.
59. Classificador, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o tecido é selecionado a partir do grupo que consiste em tecido vascular, tecido de pele, tecido hepático, tecido pancreático, tecido neural, tecido urogenital, tecido gastrointestinal, tecido esquelético incluindo osso e cartilagem, tecido adiposo, tecido conjuntivo incluindo tendões e ligamentos, tecido amniótico, tecido coriônico, dura-máter, pericárdio, tecido muscular, tecido glandular, tecido facial, tecido oftálmico.
60. Classificador, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que a impressão digital de recurso é gerada a partir de medições que compreendem valores numéricos de uma área do núcleo detectado, um perímetro do núcleo detectado, uma densidade integrada do núcleo detectado e uma circularidade do núcleo detectado.
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