KR20210024645A - 정량적 조직형태 분석을 통한 조직 효능 결정 - Google Patents
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Abstract
조직 효능을 결정하기 위한 정량적 조직병리학적 분석을 수행하기 위한 시스템 및 방법이 개시된다. 일부 구현예에 따르면, 조직 분류기(tissue classifier)를 훈련시키는 방법이 제공된다. 상기 방법에 따르면, 조직 분류기를 훈련시키는 것은 대조 라이브러리의 슬라이드 이미지 내에서 검출된 핵의 특징 지문(feature fingerprint)을 생성하고 이들의 해당 특징 지문을 기반으로 슬라이드 이미지를 클러스터링하는 것을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 훈련된 조직 분류기를 이용하는 방법이 제공된다. 상기 방법에 따르면, 훈련된 조직 분류기는 미지의 슬라이드 이미지의 조직이 조직 분류기의 훈련 동안 클러스터링된 슬라이드 이미지에 상응하는지 여부를 결정한다.
Description
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2018년 7월 6일에 출원된 미국 임시출원 제62/694,829호의 이익 및 우선권을 주장하며, 이의 주제는 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
기술된 구현예는 생존가능한 이식 조직 후보를 결정하기 위해 조직 샘플 내 세포의 디지털 이미지의 정량적 조직형태 분석을 수행하기 위한 정량적 접근법에 관한 것이다.
본 발명은 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직 유래 생성물의 제조를 참조하여 이해될 수 있지만, 본 발명의 개시 및 청구범위는 본 발명의 이러한 구현예로 제한되는 것은 아니다.
동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래 생성물은, 예를 들어 22q11.2 결실과 관련된 완전 디조지 기형(cDGA) 및 chd7(크로모도메인-헬리카제-DNA-결합 단백질 7) 유전자 돌연변이와 관련된 CHARGE(결손, 심장 결함, 후비공폐쇄, 성장 또는 정신 지체, 생식기 형성저하증 및 귀 이상 또는 청각장애) 증후군 및 포크헤드 박스 단백질(forkhead box protein) N1(FOXN1) 결핍을 갖는 무흉선 환자들의 치료에서 선천성 무흉선으로부터 야기된 T 세포 면역결핍(1차 면역 결핍)의 치료에 유용한 것으로 밝혀져 있다. 선천성 무흉선은 희귀한 치명적인 병태로, 현재 규제 승인 의약품을 이용하는 약물 치료 옵션이 없다.
흉선 상피 세포(TEC)를 보유하는 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래 생성물의 실험적 이식은 선천성 빈혈을 가진 소아 환자를 치료하기 위해 성공적으로 적용되었다(문헌[Markert ML, Devlin BH, McCarthy EA, 2010, "Thymus transplantation," Clin Immunol., 135(2): 236-46]; 문헌[Markert ML, et al., 2004, "Postnatal thymus transplantation with immunosuppression as treatment for DiGeorge syndrome," Blood 104(8):2574-2581]; 및 문헌[Markert ML, et al., 1999, "Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge syndrome," N Engl J Med 341(16):1180-1189 27]).
동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래 생성물은 부분적으로 T-세포가 고갈된 흉선 조직 슬라이스를 생성하기 위해 최대 21일 동안 제조, 배양 및 보관되고 컨디셔닝 프로세스에 의해 천연 흉선과 구별되는 조직-조작된 생성물이다. 컨디셔닝 요법은 배양된 흉선 조직 슬라이스로부터 공여자 흉선세포(thymocyte)를 부분적으로 고갈시킨다. 시험관내 데이터(면역조직화학)을 기반으로 할 때 12 내지 21일의 배양 기간은 사이토케라틴 항체를 사용하여 평가한 바와 같이 상피 네트워크를 보존한다. 배양은 바람직하게는 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 수행된다.
배양 프로세스는 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래 생성물 슬라이스의 효과적인 치료적 특성을 최적화시키기 위해 하기 방식으로 공여자 흉선 조직 및 그 안에 함유된 구성 세포의 생물학적 특징을 상당히 변형시킨다. 배양 프로세스는 전제조건이 되는 생물학적 특성을 지닌 배양된 세포/조직의 규정된 조성물이 대상체의 면역계의 재구성을 가능하게 하기 위해 대상체로의 외과적 이식에 적합한 방식으로 수득되게 보장한다. 배양 프로세스는 공여자 흉선 조직 슬라이스에서 흉선세포의 손실 및 흉선 상피 세포 및 다른 기질 세포의 상대적 농축을 초래한다. 배양 프로세스는 추가로 흉선세포의 고갈 및 TEC의 유지를 도모하여 수용자의 면역계의 재구성을 가능하게 하고, 수용자에서 공여자 흉선의 HLA 항원에 대한 내성이 발달되게 한다. 전반적으로, 제조 프로세스는 공여자 흉선 조직으로부터 흉선세포를 고갈시키고 흉선 기질(흉선 상피 세포 및 섬유모세포)의 기능적 구조를 보존하도록 설계된다.
무흉선 환자에서 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래 생성물(예를 들어, "RVT-802")의 외과적 투여는 기능성 면역계를 발달시키는 일련의 사건들을 이끈다. 수용자 내에서의 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래 생성물의 외과적 배치 후에, T 세포는 공여자 TEC 및 수용자 수지상 세포(DC)에 의해 교육된다. 수용자 DC와 함께 공여자 TEC는 배양된 흉선 조직 슬라이스로서 이식된, 이식된 공여자 흉선 조직에 대해 내성이 있게 한다. 이것은 정상적인 흉선에서와 같은 내성 유도이다. 수용자 DC와 함께 수용자 TEC는 자신에 대한 내성을 초래한다.
흉선세포발달(Thymopoiesis)은 동종이식편 생체검사와 주변부에서 수용자 순수한(naive) T 세포의 존재에 의해 기록되었다(문헌[Markert ML, 2010,; Markert ML, et al., 2008, "Use of allograft biopsies to assess thymopoiesis after thymus transplantation," J Immunol 180(9):6354-6364]; 및 문헌[Markert ML, et al., 2007, "Review of 54 patients with complete DiGeorge anomaly enrolled in protocols for thymus transplantation: outcome of 44 consecutive transplants," Blood 109(10):4539-454728]; 이들 문헌은 본원에 참조로 포함됨).
연구용 동종이형, 배양된 출생 후 흉선 조직-유래 생성물로 치료받은 아동에 대한 연구는 혼합 림프구 반응에 의한 공여자 주요 조직적합성 복합체(MHC)에 대한 내성을 보여준다(문헌[Chinn IK, Devlin BH, Li YJ, & Markert ML, 2008, "Long-term tolerance to allogeneic thymus transplants in complete DiGeorge anomaly," Clin Immunol 126(3):277-281]). 또한 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래된 이식 후 선천성 무흉선이 있는 영아는 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스와 같은 감염을 제어할 수 있다(문헌[Markert ML, 2014, Thymus Transplantation. Stiehm's Immune Deficiencies, eds Sullivan KE & Stiehm ER(Academic Press), 1st Ed, pp 1059-1067].
역사적으로, 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래된 생성물 방출 기준에는, 제조 공정의 중간 지점에서의 H&E 및 면역염색된 조직 절편의 조직병리학적 평가(이는 이후 배양 기간의 5-9일째 개량됨)가 포함되어 왔었다. 이 조직병리학적 평가는 효능 검정으로서 역할을 해왔으며, 이사회-인증 병리학자에 의해 정성 분석으로 수행되었다. 조직 슬라이스가 절편화된 다음 슬라이드 상으로 고정되기 전에 동결 또는 포르말린 고정에 의해 샘플은 평가되기 위해 준비되었다. 이러한 방식으로 준비된 샘플은 장기간에 걸쳐 안정적이므로, 재분석을 수행할 수 있다.
20년 이상의 개발 역사로부터 사용가능한 과거의 샘플은 긍정적인 임상 결과와 연결될 수 있고, 이로써 제품 품질 평가를 위한 정량적 조직분석 개발을 위한 강력한 데이터 세트를 제공한다.
이전의 임상 로트 및 동종이형 배양된 출생 후 흉선-조직 유래 생성물의 실험적 로트로부터 H&E 슬라이드의 스캔 이미지를 이용하여 새로운 디지털 조직학 검정이 개발되었다. 이들 이미지는 하기에 설명된 바와 같이 정량적 방출 검정으로 개발을 위해 분석되었다.
본원에서 완전히 개시된 구현예는 슬라이드 이미지 내에 표시된 조직의 전반적인 핵 특징을 정량적으로 평가하는 방법을 기술한다.
개시된 구현예의 한 적용은, 환자에게 이식하기 전 조직의 효능 또는 품질을 결정할 수 있는 검정의, 조직 분류기(tissue classifier)의 훈련을 통한 개발이다. 예를 들어, 하기에 기술된 접근법은 완전 디조지 증후군 환자에 대해 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래된 생성물 슬라이스의 효능을 결정하는데 적용될 수 있다. 기술된 구현예는 조직학적 슬라이드 이미지 분석에 기초하여 흉선 조직 효능을 평가하고, 효능에 대해 통과 조직을 통과 분류와 연관시키고 탈락한 조직을 탈락 분류와 연관시키는 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래된 생성물 슬라이스 조직 특징화 검정으로서 이용될 수 있다. 하기 도 1에서 나타낸 바와 같이, 분류기는 미분류된 슬라이드 이미지를 입력으로 받아 미분류 슬라이드 이미지의 분석을 바탕으로, 미분류 슬라이드 이미지 내 조직이 이식 조직 후보인지 여부를 결정한다.
하기에서 추가로 상세히 논의될 바와 같이, 기술된 구현예는 슬라이드 이미지의 라이브러리에 기초한 분류기의 훈련을 포함하는 훈련 상(phase), 및 미분류 슬라이드 이미지에서 나타낸 조직의 효능을 결정하기 위한 미분류 슬라이드 이미지에 대한 훈련된 분류기의 활용을 포함하는 분류 상을 기술한다. 훈련 상은 조직 조성 및 세포 생존력과 연관된 핵 특징의 정량적 평가를 통해 분류기를 훈련한다. 훈련 상은 통과 및 탈락 슬라이드 이미지에서 해당하는 핵 특징을 인지하도록 분류기를 훈련하기 위해 통과 및 탈락 슬라이드 이미지 양자 모두의 분석을 포함한다. 결과의 분류기는 조직 이식 후 성공적인 면역 재구성을 도모하는 과거의 데이터를 기반으로 통과 및 탈락 조성물 및 생존력 특징을 인지하는 검정을 구현한다.
일 구현예에서, 훈련 상은 두 파트를 포함한다. 제1 파트는 정량 분석에 허용가능한 것으로 간주되는 허용 범위 또는 값을 정의할 수 있고, 적절한 메타데이터 값, 백그라운드 값 및 조직 엔트로피에 대한 적합성 기준을 생성하는데 이용된 훈련 데이터세트의 검증을 포함한다. 훈련 데이터세트는 이식에 대한 통과 또는 탈락 분류가 있는 것으로 공지된 슬라이드 이미지를 포함한다. 이것들은 예를 들어 병리학자 또는 다른 의료 전문가에 의해 분석된 슬라이드 이미지일 수 있다. 제2 파트는 제1 파트에서 생성된 허용 범위 또는 값을 대조 라이브러리 내의 이미지에 적용하여, 그 결과 이미지를 양성 및 음성 대조군으로 클러스터링(clustering)하는 것을 포함한다. 본 명세서 및 실시예에서 하기에 추가로 논의되는 바와 같이, 각각의 대조군은 유사한 특징 지문(feature fingerprint)을 갖는 것을 기초로 해 그룹화된 슬라이드 이미지를 포함한다. 양성 대조군은 이식에 대한 기준을 통과한 것으로 결정된 유사한 특징 지문이 있는 슬라이드 이미지를 포함하며; 음성 대조군은 이식에 대한 기준에 탈락한 것으로 결정된 유사한 특징 지문이 있는 슬라이드 이미지를 포함한다.
일 구현예에서, 분류 상은 이때 양성 및 음성 대조군을 기반으로 하여 새로운 슬라이드 이미지를 분석하고 각각의 특징 지문을 바탕으로 해 새로운 슬라이드 이미지를 클러스터링한다. 이후, 분류 상은 새로운 슬라이드 이미지가 양성 또는 음성 대조군과 클러스터링되는지에 따라 새로운 슬라이드 이미지의 효능을 결정한다.
일 구현예에서, 특징 지문은 배양된, 흉선의 세포들의 4가지 결정에 기초한다. 이것들에는 "면적", "원형도", "통합 밀도" 및 "둘레(perimeter)"가 포함된다. 하기에 논의된 바와 같이, "면적"은 핵 면적을 측정하는데, 이는 흉선세포보다 흉선 상피 세포에 있어서 더 크다. 세포자멸사를 겪는 세포는 또한 더 작을 가능성이 있다. "원형도"는 세포가 얼마나 원형인지를 측정한다. 원형도는 0 내지 1의 척도로 측정되며, 이때 1은 완벽한 원이다. 흉선세포는 흉선 상피 세포에 비해 원형도가 증가했다. 비생존 세포는 생존 세포에 비해 원형도가 감소했다. 이와 같이, 흉선세포가 감소되고 더 많은 비생존 세포가 조직 슬라이스에서 관찰될 것으로 예상할 수 있기 때문에 배양 시간 경과에 따라 원형도가 감소될 것으로 예상될 수 있다. 분해된(degraded) 샘플은 또한 더 많은 비생존 세포가 존재하여 더 낮은 원형도로 분포를 쉬프트시키므로 원형도가 감소될 것으로 예상된다. "통합 밀도"는 핵이 얼마나 짙게(dark) 염색되는지를 나타낸다. 통합 밀도는 균일하게 짙게 염색되는 것으로 보이는 흉선세포에 있어서 높다. 흉선 상피 세포는 짙게 염색된 테두리를 갖고, 대부분은 뚜렷한 짙은 핵소체를 가진 투명한 핵질을 갖는다. 마지막으로 "둘레"는 검출된 핵의 윤곽을 나타낸다. 둘레는 세포 생존력과 관련있다; 즉 세포가 분해됨에 따라, 핵 윤곽은 불규칙해지고 이것의 둘레는 늘어난다. 둘레는 또한 배양이 진행됨에 따라 전체 세포에 대한 TEC 세포의 비율이 증가하므로 증가될 것이다. 배양 시간이 경과됨에 따라뿐 아니라 조직이 분해됨에 따라 둘레 변화가 예상된다.
기재된 구현예는 효능을 결정하기 위해 슬라이드 이미지의 면역조직화학(IHC) 및 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 조직병리학을 통한 정성적 인간-주도 분석에만 의존하는 현재의 접근법에 대한 개선이다. 이들 현재의 접근법은 상기 정성적 분석을 반-정량적 또는 정량적으로 수행할 수 없게 하는 불능, 인간 검정에서 병리학자가 전체 조직을 평가할 수 없다는 점을 포함해 현재 정성적 분석의 효험을 감소시키는 많은 한계를 겪는다. 그 대신에, 병리학자는 조직의 전체 슬라이스가 아닌 조직의 일부(개별 시야)만 보고 있다.
게다가, 기술된 구현예는 흉선과 같은 복잡한 조직을 분석하기 위한 종래의 접근법보다 특히 더 효과적이다. 복잡한 조직에서, 샘플 조직의 방향은 현저하게 결과 변화를 변경할 수 있다. 예를 들어, 매우 상이한 형태(예, 대뇌피질 비율)를 갖는 두개의 별개의 슬라이스가 모두 허용가능한 효능을 가진 "양호한" 샘플(즉, 통과 분류를 지님)로 간주될 수 있다. 기술된 구현예는 이러한 한계를 피하고 따라서 모든 조직을 분류하는데 효과적이다.
기술된 구현예는 공지된 효능 및 효험을 갖는 슬라이드 이미지의 라이브러리를 활용함으로써 정량적 분석에 의존한다. 라이브러리의 슬라이드 이미지는, 그러한 조직을 양호 또는 불량한 임상 결과(예, 생존 여부)와 연관시킴으로써 특정 조직에 대한 효능 기준을 통과하거나 탈락한 것으로 공지된 조직의 이미지를 포함한다. 통과한 슬라이드 이미지는 통과 분류와 연관될 수 있는 반면, 탈락한 슬라이드 이미지는 탈락 분류와 연관될 수 있다.
기술된 구현예는 하나 이상의 프로세서에서 구현될 수 있다. 하나 이상의 프로세서는 LAN, WAN 또는 인터넷(예, 클라우드)과 같은 네트워크를 통해 공존하거나 분포될 수 있다. 이러한 프로세서 중 하나 이상은 그래픽 처리 장치(GPU)일 수 있다. 일 구현예에서, GPU는 수학 집약적 애플리케이션을 처리하도록 고안된 특수 전자 회로인 프로세서일 수 있다. GPU는 컴퓨터 그래픽 애플리케이션, 이미지, 비디오 등에 공통적인 수학 집약적 데이터와 같은 대용량 데이터 블록의 병렬 처리에 효율적인 병렬 구조를 가질 수 있다. 하나 이상의 프로세서는 하나 이상의 레벨의 캐시를 포함하고, 제어 로직(예, 컴퓨터 소프트웨어) 및/또는 그 안에 저장된 데이터를 가질 수 있는 메모리에 연결될 수 있다.
본 개시의 제1 양태는 하기를 포함하는 정량적 조직병리학적 평가를 수행하기 위한 조직 분류기를 훈련하는 방법을 제공한다:
슬라이드 이미지를 이진(binary) 슬라이드 이미지로 변환시키는 단계로서, 이때 슬라이드 이미지는 대조 이미지의 라이브러리로부터 선택되고, 대조 이미지의 라이브러리에서 각 슬라이드 이미지는 통과 분류 또는 탈락 분류와 연관된, 단계;
이진 슬라이드 이미지 내에서 하나 이상의 핵을 검출하는 단계;
각 검출된 핵에 대해, 검출된 핵으로부터 특징을 추출하는 단계로서, 이때 특징은 이진 슬라이드 이미지 내 검출된 핵의 속성을 나타내고, 검출된 핵의 면적, 검출된 핵의 둘레, 검출된 핵의 통합 밀도, 또는 검출된 핵의 원형도 중 적어도 하나를 포함하는, 단계;
각 검출된 핵에 대해, 특징에 기초하여 이진 슬라이드 이미지와 연관된 특징 지문을 생성하는 단계로서, 이때 특징 지문은 특징 처리로부터 계산된 수치값인, 단계;
이진 슬라이드 이미지를 클러스터에 통합하는 단계로서, 이때 클러스터는 복수의 이미지를 포함하고, 여기서 제1의 복수의 이미지 각각이 상응하는 특징 지문과 연관되고, 통합하는 것은 특징 지문을 상응하는 특징 지문과의 비교를 기반으로 하는, 단계;
컷오프 높이를 클러스터에 적용하여 복수의 그룹을 형성하는 단계로서, 이때 컷오프 높이는 클러스터의 분산 분석의 다변량 분석에 기초하여 복수의 그룹 내 다수의 그룹을 최소화하는, 단계;
복수의 그룹 내 제1 그룹이 통과 분류와 연관된 제1 슬라이드 이미지를 포함하는 경우 상기 제1 그룹을 양성 대조군 세트로서 분류하고; 복수의 그룹 내 제2 그룹이 탈락 분류와 연관된 제2 슬라이드 이미지를 포함하는 경우 상기 제2 그룹을 음성 대조군 세트로 분류하는 단계.
본 개시의 제2 양태는 하기를 포함하는, 조직의 미분류 슬라이드 이미지의 정량적 조직병리학적 평가를 수행하는 방법이다:
미분류 슬라이드 이미지로부터 헤마톡실린 채널을 검출하는 단계로서, 이때 헤마톡실린 채널은 조직의 미분류 슬라이드 이미지 내 세포 핵과 연관된, 단계;
검출된 헤마톡실린 채널로부터 특징을 추출하는 단계로서, 이때 특징은 이진 슬라이드 이미지 내 핵의 속성을 나타내고, 핵의 면적, 핵의 둘레, 핵의 통합 밀도, 또는 핵의 원형도 중 적어도 하나를 포함하는, 단계;
특징에 기초하여 미분류 슬라이드 이미지와 연관된 특징 지문을 생성하는 단계로서, 이때 특징 지문은 특징 처리로부터 계산된 수치값인, 단계;
특징 지문을, 하나 이상의 양성 대조 세트와 연관된 제1 지문 세트 및 음성 대조 세트와 연관된 제2 지문 세트와 공동-클러스터링하는 단계로서, 이때 양성 대조 세트(들)는 통과 분류와 연관된 제1 슬라이드 이미지 세트를 포함하고, 음성 대조 세트는 탈락 분류와 연관된 제2 슬라이드 이미지 세트를 포함하는, 단계; 및
공동-클러스터링을 기반으로, 특징 지문이 통과 분류 또는 탈락 분류와 연관되어 있는지 결정하는 단계.
본 개시의 제3 양태는 하기를 포함하는 조직의 디지털 이미지 내에서 물체를 분류하기 위한 시스템이다:
슬라이드 이미지를 이진 슬라이드 이미지로 변환시키기 위한 수단으로서, 이때 슬라이드 이미지는 대조 이미지의 라이브러리로부터 선택되고, 대조 이미지의 라이브러리에서 각 슬라이드 이미지는 통과 분류 또는 탈락 분류와 연관된, 수단;
이진 슬라이드 이미지 내에서 핵을 검출하기 위한 수단;
검출된 핵으로부터 특징을 추출하기 위한 수단으로서, 이때 특징은 이진 슬라이드 이미지 내 검출된 핵의 속성을 나타내고, 검출된 핵의 면적, 검출된 핵의 둘레, 검출된 핵의 통합 밀도, 또는 검출된 핵의 원형도 중 적어도 하나를 포함하는, 수단;
특징에 기초하여 이진 슬라이드 이미지와 연관된 특징 지문을 생성하기 위한 수단으로서, 이때 특징 지문은 특징 처리로부터 계산된 수치값인, 수단;
이진 슬라이드 이미지를 클러스터에 통합하기 위한 수단으로서, 이때 클러스터는 복수의 이미지를 포함하고, 여기서 제1의 복수의 이미지 각각이 상응하는 특징 지문과 연관되고, 통합하는 것은 특징 지문을 상응하는 특징 지문과의 비교를 기반으로 하는, 수단;
컷오프 높이를 클러스터에 적용하여 복수의 그룹을 형성하기 위한 수단으로서, 이때 컷오프 높이는 클러스터의 분산 분석의 다변량 분석에 기초하여 복수의 그룹 내 다수의 그룹을 최소화하는, 수단;
복수의 그룹 내 제1 그룹이 통과 분류와 연관된 제1 슬라이드 이미지를 포함하는 경우 상기 제1 그룹을 양성 대조 세트로서 분류하기 위한 수단; 및
복수의 그룹 내 제2 그룹이 탈락 분류와 연관된 제2 슬라이드 이미지를 포함하는 경우 상기 제2 그룹을 음성 대조 세트로 분류하기 위한 수단.
본 개시의 제4 양태는 하기를 포함하는 분류기이다:
미분류 슬라이드 이미지로부터 헤마톡실린 채널을 검출하기 위한 수단으로서, 이때 헤마톡실린 채널은 조직의 미분류 슬라이드 이미지 내 세포 핵과 연관된, 수단;
검출된 헤마톡실린 채널로부터 특징을 추출하기 위한 수단으로서, 이때 특징은 이진 슬라이드 이미지 내 핵의 속성을 나타내고, 핵의 면적, 핵의 둘레, 핵의 통합 밀도, 또는 핵의 원형도 중 적어도 하나를 포함하는, 수단;
특징에 기초하여 미분류 슬라이드 이미지와 연관된 특징 지문을 생성하기 위한 수단으로서, 이때 특징 지문은 특징 처리로부터 계산된 수치값인, 수단;
특징 지문을, 양성 대조 세트와 연관된 제1 지문 세트 및 음성 대조 세트와 연관된 제2 지문 세트와 공동-클러스터링하기 위한 수단으로서, 이때 양성 대조 세트는 통과 분류와 연관된 제1 슬라이드 이미지 세트를 포함하고, 음성 대조 세트는 탈락 분류와 연관된 제2 슬라이드 이미지 세트를 포함하는, 수단; 및
공동-클러스터링을 기반으로, 특징 지문이 통과 분류 또는 탈락 분류와 연관되어 있는지 결정하기 위한 수단.
본 개시의 제1 내지 제4 양태의 특정 구현예에서, 방법, 시스템 및 분류기는 대상체, 바람직하게는 인간 대상체의 조직의 효능 또는 이식가능성을 결정할 수 있는 조직 분류기 또는 조직 분류기의 사용을 포함할 수 있다.
본 개시의 제1 내지 제4 양태의 특정 구현예에서, 조직은 인간 대상체에 이식하기 위한 흉선 조직, 바람직하게는 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래된 생성물 슬라이스이다.
본 개시의 제1 양태 내지 제4 양태의 특정 구현예에서, 인간은 22q11.2 결실과 연관된 완전 디조지 증후군; 결손, 심장 결함, 후비공폐쇄, 성장 또는 정신 지체, 생식기 형성저하증 및 귀 이상 또는 청각장애 증후군(CHARGE), 또는 포크헤드 박스 단백질 N1(FOXN1) 결핍과 연관된 무흉선증을 앓고 있을 수 있다.
본 개시의 제1 내지 제4 양태의 특정 구현예에서, 조직 분류기는 대조 라이브러리에서의 슬러리 이미지 내 검출된 핵의 특징 지문을 생성하고 이들의 상응하는 특징 지문을 기초하여 슬라이드 이미지를 클러스터링함으로써 알려지지 않은 조직, 바람직하게는 흉선 조직의 효능을 결정한다.
본 개시의 제1 내지 제4 양태의 특정 구현예에서, 흉선 조직은 흉선세포의 흉선 조직을 부분적으로 고갈시키기 위해 일정 기간 동안 흉선 기관 배지에서 배양 프로세스에 적용되어졌다. 일부 구현예에서, 기간은 최대 21일이다. 기타 구현예에서, 기간은 약 12 내지 약 21일, 또는 약 5 내지 약 9일이다.
본 개시내용의 제1 내지 제4 양태의 특정 구현예에서, 배양 프로세스는 흉선 간질의 기능적 구조를 보존하고, 바람직하게는 흉선 간질은 흉선 상피 세포 및 섬유모세포를 포함한다.
본 개시의 제1 내지 제4 양태의 특정 구현예에서, 조직은 혈관 조직, 피부 조직, 간 조직, 췌장 조직, 신경 조직, 비뇨생식기 조직, 위장관 조직, 뼈 및 연골을 포함하는 골격 조직, 지방 조직, 힘줄 및 인대를 포함하는 결합 조직, 양막 조직, 융모막 조직, 경막, 심낭, 근육 조직, 선 조직, 안면 조직, 안조직으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시의 제1 내지 제4 양태의 특정 구현예에서, 특징 지문은 검출된 핵의 면적, 검출된 핵의 둘레, 검출된 핵의 통합 밀도 및 검출된 핵의 원형도의 수치값을 포함하는 측정치로부터 생성된다.
명확성을 위해, 본 개시의 상이한 양태의 문맥에서 및/또는 별도의 구현예들에서 설명된, 본 명세서에 기술된 특정 특징들은 또한 단일 구현예에서 조합하여 제공될 수 있다는 것이 또한 이해된다. 반대로, 간결하게, 본 개시의 단일 양태의 문맥에서 및/또는 단일 구현예에서 설명된 다양한 특징들이 또한 개별적으로 또는 임의의 적절한 하위조합으로 제공될 수 있다.
본 명세서에 개시된 원리 및 이의 장점에 대한 보다 완전한 이해를 위해, 첨부한 도면과 함께 하기의 설명을 참조한다:
도 1은 미분류 슬라이드 이미지의 입력을 수신하고, 상기 미분류 슬라이드 이미지의 분석 및 미리 설정된 허용 기준과의 비교를 기반으로 미분류 슬라이드 이미지에서의 조직이 이식 조직 후보인지 여부를 결정하는 분류기의 작동 개략도이다.
도 2는 클러스터가 상이한 그룹 a, b, c, d 및 e로 구분되어진 예시의 클러스터 및 클러스터 덴드로그램을 나타낸다.
하기 도 3a-3d는 다양한 양의 백그라운드 픽셀을 갖는 슬라이드 이미지를 보여준다. 도 3a는 적절량의 백그라운드 픽셀 상 조직 샘플을 보여주는 슬라이드 이미지를 묘사한다. 도 3b 및 3c는 백그라운드 픽셀이 너무 많은 슬라이드 이미지를 도시한다. 도 3d는 백그라운드 픽셀 수가 불충분한 슬라이드 이미지를 도시한다.
도 4a-4c는 다양한 정도의 핵 분할을 갖는 슬라이드 이미지를 도시한다. 도 4a는 정확하게 분할된 핵을 가진 슬라이드 이미지를 도시하는 반면, 도 4b 및 4c는 부정확하게 분할된 핵을 가진 슬라이드 이미지를 도시한다.
도 5는 흉선 조직 표본의 헤마톡실린 이미지를 분석하는 이미지 처리 단계를 도시한다. 도 5는 박스에서 윤곽선으로 분석할 필드를 식별하는 헤마톡실린 염색된 흉선 조직 표본을 나타내며, 이는 중간 이미지에서 확대되고 슬라이드 이미지의 적색 채널로 변환되어 추출 및 반전되어 이진 이미지를 우측 이미지에서 형성한다.
도 6a-6d는, 조직이 흉선 조직이고, 추출된 특징은 면적, 둘레, 통합 밀도 및 원형도를 포함하는 구현예에서 특징 추출의 예시 결과를 나타낸다. 도 6a는 면적 측정을 나타낸다. 도 6b는 둘레 측정을 나타낸다. 도 6c는 통합 밀도 측정을 나타낸다. 도 6d는 원형도 측정을 나타낸다.
도 7은 슬라이드 이미지에 대해 생성된 지문의 표시를 나타낸다. 지문은 이미지 내 핵의 기본 특징의 정량적 표시이다.
도 8은 Duke 대학교로부터 수여받은 흉선 표본을 포함하는 클러스터링 단계의 원시 출력의 표시를 나타낸다.
도 9는 훈련 상 동안 그룹화 단계의 결과를 나타낸다. 도 9에는 흉선 조직의 실험 샘플의 슬라이드 이미지를 기반으로 클러스터링된 다중 양성 및 음성 대조군이 나타내어진다.
도 10은 표 2의 각 분할된 그룹 내 집단 간의 차이의 통계학적 분석의 예시 결과를 나타낸다. 도 10은 각 그룹 내의 슬라이드 이미지의 집단이 크게 변하지 않았음을 나타내며, 이는 유사한 특징 지문을 이들 슬라이드 이미지가 공유한다는 것을 지시한다.
도 11은 슬라이드 이미지의 분석 예의 순서도이다. 구현예에서, 순서도는 상기에서 기재된 처리 단계를 수행하는 분류기에 의해 구현된다. 슬라이드 이미지는 먼저 그 이미지가 분류 단계 동안 분석하기에 적합한지 여부가 결정되도록 평가될 수 있다.
도 12a-12d는 흉선 조직의 슬라이드 이미지의 특정 추출된 특징을 기반으로 예의 특징 지문을 나타내는 예언적 예이다. 도 12a는 핵 면적에 대해 생성된 특징 지문에서 양성 및 음성 대조군과 연관된 슬라이드 이미지들 사이의 차이를 나타낸다. 도 12b는 핵 둘레에 대해 생성된 특징 지문에서 양성 및 음성 대조군과 연관된 슬라이드 이미지들 사이의 차이를 나타낸다. 도 12c는 핵 통합 밀도에 대해 생성된 특징 지문에서 양성 및 음성 대조군과 연관된 슬라이드 이미지들 사이의 차이를 나타낸다. 도 12d는 핵 원형도에 대해 생성된 특징 지문에서 양성 및 음성 대조군과 연관된 슬라이드 이미지들 사이의 차이를 나타낸다.
도 13a-13f는 양성 및 음성 대조군을 갖는 피질 흉선세포의 예의 슬라이드 이미지에 대한 분류기의 예시적인 적용으로부터의 특징 지문을 나타낸다. 도 13a는 양성 대조군과 연관된 흉선 조직의 예시적인 슬라이드 이미지이다. 도 13b는 음성 대조군과 연관된 흉선 조직의 예시적인 슬라이드 이미지이다. 도 13c는 원형도 측정과 연관된 특징 지문을 나타낸다. 도 13d는 면적 측정과 연관된 특징 지문을 나타낸다. 도 13e는 통합 밀도와 연관된 특징 지문을 나타낸다. 도 13f는 둘레 측정과 연관된 특징 지문을 나타낸다.
도 14a-14d는 임상 및 분해된 배양 흉선 조직의 핵을 나타낸다. 도 14a-14c는 배양된 흉선 임상 조직 샘플의 3가지 뱃치(batch)의 대표적 사례이다. 도 14d는 분해된 흉선 조직의 대표적 사례이다.
도 15는 조직 면적에 대해 정규화된 1일 당 세포수의 경향을 도시한다.
도 16a-16b는 배양 프로세스의 제0일의 흉선 조직의 이미지이다. 도 16a는 제0일의 배양된 H&E 염색된 흉선 조직의 사진이다. 도 16b는 배양된 H&E 염색된 흉선 조직의 부분의 40배의 클로즈-업 확대이다.
도 17a-17b는 배양 프로세스의 제5일의 흉선 조직의 이미지이다. 도 17a는 배양된 H&E 염색된 흉선 조직의 제5일의 사진이다. 도 17b는 배양된 H&E 염색된 흉선 조직의 부분의 40배의 클로즈-업 확대이다.
도 18a-18b는 배양 프로세스의 제9일의 흉선 조직의 이미지이다. 도 18a는 배양된 H&E 염색된 흉선 조직의 제9일때의 사진이다. 도 18b는 배양된 H&E 염색된 흉선 조직의 부분의 40배의 클로즈-업 확대이다.
도 19a-19b는 배양 프로세스의 제12일의 흉선 조직의 이미지이다. 도 19a는 배양된 H&E 염색된 흉선 조직의 제12일의 사진이다. 도 19b는 배양된 H&E 염색된 흉선 조직의 부분의 40배의 클로즈-업 확대이다.
도 20a-20b는 배양 프로세스의 제21일의 흉선 조직의 이미지이다. 도 20a는 배양된 H&E 염색된 흉선 조직의 제21일의 사진이다. 도 20b는 배양된 H&E 염색된 흉선 조직의 부분의 40배의 클로즈-업 확대이다.
도 21a-21e는 제0일, 제5일, 제9일, 제2일 및 제21일에 H&E 염색된 배양된 흉선 조직의 이미지로, 제0일, 제5일, 제9일, 제12일 및 제21일에 핵의 모습 변화를 나타낸다. 도 21a는 높은 비율의 핵이 많은 수의 흉선세포를 내비치는 더 높은 통합 밀도를 갖는 것을 보여준다. 흉선세포가 조직에서 씻겨져 없어짐에 따라, 제5일(도 21b), 제9일(도 21c), 제12일(도 21d) 및 제21일(도 21e)에서 조직은, 흉선 상피 세포에 대한 프로파일과 더 유사한 프로파일 및 통합 밀도의 현저한 감소를 나타낸다.
도 22는 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래 생성물의 기술적 뱃치로부터 통합 밀도 측정의 시간 경과를 보여주는 그래프이다. 흉선세포가 조직에서 씻겨져 나감에 따라, 제5일에서 조직은, 흉선 상피 세포에 대한 프로파일과 더 유사한 프로파일 및 통합 밀도의 현저한 감소를 나타낸다. 오차 막대는 평균에서 하나의 S.D.이다.
도 23은 원형도의 측정을 보여주는 그래프이다. 원형도가 매우 높은 세포의 수는 배양 프로세스 전반에 걸쳐 시간이 지남에 따라 감소한다. 이는 세포자멸사로 인해 덜 원형인 핵이 초래될뿐 아니라 매우 원형인 흉선세포는 씻겨 나가기 때문일 것이다. 원형도가 더 낮은 제0일에서의 샘플의 경우에서는, 이는 단일 핵보다 원형도가 더 낮은 단일의 개체로서 측정되는 흉선 세포의 응집 때문일 수 있다. 오차 막대는 평균에서 하나의 S.D.이다.
도 24은 둘레의 측정을 보여주는 그래프이다. 제0일에, 높은 둘레를 가진 세포가 많은 비율로 존재하며, 이는 프로그램에서 단일 형상으로 읽힌 세포의 덩어리로 인해 큰 둘레값을 야기하기 때문일 수 있다. 둘레의 증가는 배양 시간에 걸쳐 세포자멸사를 겪는 세포뿐 아니라 흉선세포가 씻겨나가고 그 일로 인해 결과적으로 둘레가 증가하는 것의 조합일 가능성이 있다. 오차 막대는 평균에서 하나의 S.D.이다.
도 25은 면적의 시간 경과를 보여주는 그래프이다. 이 기술은 조사된 4가지 모든 변수를 고려할 때 2개의 샘플 간 유사성을 측정하기 위해 유클리드 거리(샘플과 대 중심(grand centroid) 사이의 오차의 제곱합의 제곱근)를 이용했다. 참고로, 유클리드 거리가 짧을수록, 두개의 샘플은 서로 더 유사하다. 오차 막대는 평균에서 하나의 S.D.이다.
도 26은 데이터의 주요 효과 플롯 및 상호작용 플롯이다. 도 26에 나타낸 데이터는 배양된 흉선 조직이 시간 경과에 따라 유사하게 행동한다는 점을 확인시킨다.
도 27은 하루에 흉선에 의한 중심으로부터의 거리의 95% 신뢰구간을 보여주는 그래프이다.
도 28a 및 28b는 병리학자에 의해 붉은색으로 윤곽선이 표시된 흉선 상피 세포의 예시적인 이미지이다.
도 29는 병리학자에 의해 붉은색으로 윤곽선이 그려진 흉선 상피 세포(TEC)의 이미지이다. 흉선세포는 청색으로 윤곽선이 표시된다.
도 30은 H&E 슬라이드로부터의 전체 세포수에 대한 TEC의 비율의 플롯이다.
도 31은 선택된 조직 영역에 대해 정규화된 총 세포 수에 대한 TEC의 비율의 플롯이다.
도 32는 그룹 "C" 및 "D" 사이의 거리를 예로서 나타낸 클러스터 덴드로그램이다. 하이라이트된 녹색 및 적색 박스는 단일 그룹을 나타낸다. 이는 컷오프 y축 높이 0.43을 기반으로 한다.이 예에서, 그룹 C 및 D는 거리가 0.6이므로, 두 개의 개별 그룹으로 간주된다. 각 그룹 내 샘플은 통계학적으로 유사한 것으로 간주되는 반면, 다른 그룹에서의 샘플은 통계학적으로 상이한 것으로 간주된다.
도 33은 모두 임상학적으로 양호하고 불량으로 확인된 샘플로의 훈련 세트를 나타내는 그래프이다. 박스가 있는 클러스터는 강제 분해된 샘플이다.
도 34는 마지막 샘플 라이브러리를 나타낸다. 왼쪽에서 오른쪽으로, 그룹은 그룹 4, 그룹 3, 그룹 2, 및 그룹 1로 지칭된다. 그룹 1, 2, 및 3은 통과 분류와 연관되고, 그룹 4는 탈락 분류와 연관된다.
도 35a-35d는 최종 샘플 라이브러리의 각 클러스터 그룹에 대한 대표 이미지를 나타낸다. 그룹 1(도 35a), 2(도 35b), 및 3(도 35c)은 임상 결과가 긍정적인 샘플을 포함한다. 그룹 4(도 35d)는 확인된 분해된 샘플을 포함한다. 그룹 1 샘플은 LOT-345의 것, 그룹 2 샘플은 LOT-160의 것, 그룹 3 샘플은 LOT-194의 것이고, 그룹 4 샘플은 FD.SP17-40348-C1.1의 것이다(분해 방법: -20℃에서 동결).
도 36a-36d는 그룹별로 구분된 상이한 매개변수의 그래픽 표현이다. 도 36a는 면적 측정에 대한 데이터 클러스터의 그래픽 표현이다. 도 36b는 원형도 측정에 대한 데이터 클러스터의 그래픽 표현이다. 도 36c는 통합 밀도 측정에 대한 데이터 클러스터의 그래픽 표현이다. 도 36d는 둘레 측정에 대한 데이터 클러스터의 그래픽 표현이다.
도 37는 하이라이트된 면적-10(적색), 원형도-0.9(녹색), 둘레-18(청색) 및 통합 밀도-1500(황색) 내 특징을 가진 그룹 1의 이미지이다. 이들 그룹은 일반적으로 그룹 간 가장 큰 변동을 보인다.
도 38은 그룹 1의 세포의 면적 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 39는 그룹 1의 세포의 원형도 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 40는 그룹 1의 세포의 통합 밀도 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 41는 그룹 1의 세포의 둘레 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 42는 하이라이트된 면적-10(적색), 원형도-0.9(녹색), 둘레-18(청색) 및 통합 밀도-1500(황색) 내 특징을 가진 그룹 2의 이미지이다. 이들 그룹은 일반적으로 그룹 간 가장 큰 변동을 보인다.
도 43은 그룹 2의 세포의 면적 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 44는 그룹 2의 세포의 원형도 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 45는 그룹 2의 세포의 통합 밀도 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 46는 그룹 2의 세포의 둘레 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 47는 하이라이트된 면적-10(적색), 원형도-0.9(녹색), 둘레-18(청색) 및 통합 밀도-1500(황색) 내 특징을 가진 그룹 3의 이미지이다. 이들 그룹은 일반적으로 그룹 간 가장 큰 변동을 보인다.
도 48은 그룹 3의 세포의 면적 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 49는 그룹 3의 세포의 원형도 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 50는 그룹 3의 세포의 통합 밀도 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 51는 그룹 3의 세포의 둘레 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 52는 하이라이트된 면적-10(적색), 원형도-0.9(녹색), 둘레-18(청색) 및 통합 밀도-1500(황색) 내 특징을 가진 그룹 4의 이미지이다. 이들 그룹은 일반적으로 그룹 간 가장 큰 변동을 보인다.
도 53은 그룹 4의 세포의 면적 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 54는 그룹 4의 세포의 원형도 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 55는 그룹 4의 세포의 통합 밀도 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 56는 그룹 4의 세포의 둘레 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 57은 빈(bin) 대 빈 기반으로 그룹 간 및 그룹 내 변동성 분석의 플롯이다. 데이터는 먼저 그룹별로 x축에 표시되고, 매개변수에 대해서는 빈 별로 표시된다. 각 매개변수에 대한 상단 그래프는 개체이고, 하단은 해당 그룹의 표준 편차이다. 양자 모두를 사용하여 데이터의 확산을 시각화할 수 있다.
도 1은 미분류 슬라이드 이미지의 입력을 수신하고, 상기 미분류 슬라이드 이미지의 분석 및 미리 설정된 허용 기준과의 비교를 기반으로 미분류 슬라이드 이미지에서의 조직이 이식 조직 후보인지 여부를 결정하는 분류기의 작동 개략도이다.
도 2는 클러스터가 상이한 그룹 a, b, c, d 및 e로 구분되어진 예시의 클러스터 및 클러스터 덴드로그램을 나타낸다.
하기 도 3a-3d는 다양한 양의 백그라운드 픽셀을 갖는 슬라이드 이미지를 보여준다. 도 3a는 적절량의 백그라운드 픽셀 상 조직 샘플을 보여주는 슬라이드 이미지를 묘사한다. 도 3b 및 3c는 백그라운드 픽셀이 너무 많은 슬라이드 이미지를 도시한다. 도 3d는 백그라운드 픽셀 수가 불충분한 슬라이드 이미지를 도시한다.
도 4a-4c는 다양한 정도의 핵 분할을 갖는 슬라이드 이미지를 도시한다. 도 4a는 정확하게 분할된 핵을 가진 슬라이드 이미지를 도시하는 반면, 도 4b 및 4c는 부정확하게 분할된 핵을 가진 슬라이드 이미지를 도시한다.
도 5는 흉선 조직 표본의 헤마톡실린 이미지를 분석하는 이미지 처리 단계를 도시한다. 도 5는 박스에서 윤곽선으로 분석할 필드를 식별하는 헤마톡실린 염색된 흉선 조직 표본을 나타내며, 이는 중간 이미지에서 확대되고 슬라이드 이미지의 적색 채널로 변환되어 추출 및 반전되어 이진 이미지를 우측 이미지에서 형성한다.
도 6a-6d는, 조직이 흉선 조직이고, 추출된 특징은 면적, 둘레, 통합 밀도 및 원형도를 포함하는 구현예에서 특징 추출의 예시 결과를 나타낸다. 도 6a는 면적 측정을 나타낸다. 도 6b는 둘레 측정을 나타낸다. 도 6c는 통합 밀도 측정을 나타낸다. 도 6d는 원형도 측정을 나타낸다.
도 7은 슬라이드 이미지에 대해 생성된 지문의 표시를 나타낸다. 지문은 이미지 내 핵의 기본 특징의 정량적 표시이다.
도 8은 Duke 대학교로부터 수여받은 흉선 표본을 포함하는 클러스터링 단계의 원시 출력의 표시를 나타낸다.
도 9는 훈련 상 동안 그룹화 단계의 결과를 나타낸다. 도 9에는 흉선 조직의 실험 샘플의 슬라이드 이미지를 기반으로 클러스터링된 다중 양성 및 음성 대조군이 나타내어진다.
도 10은 표 2의 각 분할된 그룹 내 집단 간의 차이의 통계학적 분석의 예시 결과를 나타낸다. 도 10은 각 그룹 내의 슬라이드 이미지의 집단이 크게 변하지 않았음을 나타내며, 이는 유사한 특징 지문을 이들 슬라이드 이미지가 공유한다는 것을 지시한다.
도 11은 슬라이드 이미지의 분석 예의 순서도이다. 구현예에서, 순서도는 상기에서 기재된 처리 단계를 수행하는 분류기에 의해 구현된다. 슬라이드 이미지는 먼저 그 이미지가 분류 단계 동안 분석하기에 적합한지 여부가 결정되도록 평가될 수 있다.
도 12a-12d는 흉선 조직의 슬라이드 이미지의 특정 추출된 특징을 기반으로 예의 특징 지문을 나타내는 예언적 예이다. 도 12a는 핵 면적에 대해 생성된 특징 지문에서 양성 및 음성 대조군과 연관된 슬라이드 이미지들 사이의 차이를 나타낸다. 도 12b는 핵 둘레에 대해 생성된 특징 지문에서 양성 및 음성 대조군과 연관된 슬라이드 이미지들 사이의 차이를 나타낸다. 도 12c는 핵 통합 밀도에 대해 생성된 특징 지문에서 양성 및 음성 대조군과 연관된 슬라이드 이미지들 사이의 차이를 나타낸다. 도 12d는 핵 원형도에 대해 생성된 특징 지문에서 양성 및 음성 대조군과 연관된 슬라이드 이미지들 사이의 차이를 나타낸다.
도 13a-13f는 양성 및 음성 대조군을 갖는 피질 흉선세포의 예의 슬라이드 이미지에 대한 분류기의 예시적인 적용으로부터의 특징 지문을 나타낸다. 도 13a는 양성 대조군과 연관된 흉선 조직의 예시적인 슬라이드 이미지이다. 도 13b는 음성 대조군과 연관된 흉선 조직의 예시적인 슬라이드 이미지이다. 도 13c는 원형도 측정과 연관된 특징 지문을 나타낸다. 도 13d는 면적 측정과 연관된 특징 지문을 나타낸다. 도 13e는 통합 밀도와 연관된 특징 지문을 나타낸다. 도 13f는 둘레 측정과 연관된 특징 지문을 나타낸다.
도 14a-14d는 임상 및 분해된 배양 흉선 조직의 핵을 나타낸다. 도 14a-14c는 배양된 흉선 임상 조직 샘플의 3가지 뱃치(batch)의 대표적 사례이다. 도 14d는 분해된 흉선 조직의 대표적 사례이다.
도 15는 조직 면적에 대해 정규화된 1일 당 세포수의 경향을 도시한다.
도 16a-16b는 배양 프로세스의 제0일의 흉선 조직의 이미지이다. 도 16a는 제0일의 배양된 H&E 염색된 흉선 조직의 사진이다. 도 16b는 배양된 H&E 염색된 흉선 조직의 부분의 40배의 클로즈-업 확대이다.
도 17a-17b는 배양 프로세스의 제5일의 흉선 조직의 이미지이다. 도 17a는 배양된 H&E 염색된 흉선 조직의 제5일의 사진이다. 도 17b는 배양된 H&E 염색된 흉선 조직의 부분의 40배의 클로즈-업 확대이다.
도 18a-18b는 배양 프로세스의 제9일의 흉선 조직의 이미지이다. 도 18a는 배양된 H&E 염색된 흉선 조직의 제9일때의 사진이다. 도 18b는 배양된 H&E 염색된 흉선 조직의 부분의 40배의 클로즈-업 확대이다.
도 19a-19b는 배양 프로세스의 제12일의 흉선 조직의 이미지이다. 도 19a는 배양된 H&E 염색된 흉선 조직의 제12일의 사진이다. 도 19b는 배양된 H&E 염색된 흉선 조직의 부분의 40배의 클로즈-업 확대이다.
도 20a-20b는 배양 프로세스의 제21일의 흉선 조직의 이미지이다. 도 20a는 배양된 H&E 염색된 흉선 조직의 제21일의 사진이다. 도 20b는 배양된 H&E 염색된 흉선 조직의 부분의 40배의 클로즈-업 확대이다.
도 21a-21e는 제0일, 제5일, 제9일, 제2일 및 제21일에 H&E 염색된 배양된 흉선 조직의 이미지로, 제0일, 제5일, 제9일, 제12일 및 제21일에 핵의 모습 변화를 나타낸다. 도 21a는 높은 비율의 핵이 많은 수의 흉선세포를 내비치는 더 높은 통합 밀도를 갖는 것을 보여준다. 흉선세포가 조직에서 씻겨져 없어짐에 따라, 제5일(도 21b), 제9일(도 21c), 제12일(도 21d) 및 제21일(도 21e)에서 조직은, 흉선 상피 세포에 대한 프로파일과 더 유사한 프로파일 및 통합 밀도의 현저한 감소를 나타낸다.
도 22는 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래 생성물의 기술적 뱃치로부터 통합 밀도 측정의 시간 경과를 보여주는 그래프이다. 흉선세포가 조직에서 씻겨져 나감에 따라, 제5일에서 조직은, 흉선 상피 세포에 대한 프로파일과 더 유사한 프로파일 및 통합 밀도의 현저한 감소를 나타낸다. 오차 막대는 평균에서 하나의 S.D.이다.
도 23은 원형도의 측정을 보여주는 그래프이다. 원형도가 매우 높은 세포의 수는 배양 프로세스 전반에 걸쳐 시간이 지남에 따라 감소한다. 이는 세포자멸사로 인해 덜 원형인 핵이 초래될뿐 아니라 매우 원형인 흉선세포는 씻겨 나가기 때문일 것이다. 원형도가 더 낮은 제0일에서의 샘플의 경우에서는, 이는 단일 핵보다 원형도가 더 낮은 단일의 개체로서 측정되는 흉선 세포의 응집 때문일 수 있다. 오차 막대는 평균에서 하나의 S.D.이다.
도 24은 둘레의 측정을 보여주는 그래프이다. 제0일에, 높은 둘레를 가진 세포가 많은 비율로 존재하며, 이는 프로그램에서 단일 형상으로 읽힌 세포의 덩어리로 인해 큰 둘레값을 야기하기 때문일 수 있다. 둘레의 증가는 배양 시간에 걸쳐 세포자멸사를 겪는 세포뿐 아니라 흉선세포가 씻겨나가고 그 일로 인해 결과적으로 둘레가 증가하는 것의 조합일 가능성이 있다. 오차 막대는 평균에서 하나의 S.D.이다.
도 25은 면적의 시간 경과를 보여주는 그래프이다. 이 기술은 조사된 4가지 모든 변수를 고려할 때 2개의 샘플 간 유사성을 측정하기 위해 유클리드 거리(샘플과 대 중심(grand centroid) 사이의 오차의 제곱합의 제곱근)를 이용했다. 참고로, 유클리드 거리가 짧을수록, 두개의 샘플은 서로 더 유사하다. 오차 막대는 평균에서 하나의 S.D.이다.
도 26은 데이터의 주요 효과 플롯 및 상호작용 플롯이다. 도 26에 나타낸 데이터는 배양된 흉선 조직이 시간 경과에 따라 유사하게 행동한다는 점을 확인시킨다.
도 27은 하루에 흉선에 의한 중심으로부터의 거리의 95% 신뢰구간을 보여주는 그래프이다.
도 28a 및 28b는 병리학자에 의해 붉은색으로 윤곽선이 표시된 흉선 상피 세포의 예시적인 이미지이다.
도 29는 병리학자에 의해 붉은색으로 윤곽선이 그려진 흉선 상피 세포(TEC)의 이미지이다. 흉선세포는 청색으로 윤곽선이 표시된다.
도 30은 H&E 슬라이드로부터의 전체 세포수에 대한 TEC의 비율의 플롯이다.
도 31은 선택된 조직 영역에 대해 정규화된 총 세포 수에 대한 TEC의 비율의 플롯이다.
도 32는 그룹 "C" 및 "D" 사이의 거리를 예로서 나타낸 클러스터 덴드로그램이다. 하이라이트된 녹색 및 적색 박스는 단일 그룹을 나타낸다. 이는 컷오프 y축 높이 0.43을 기반으로 한다.이 예에서, 그룹 C 및 D는 거리가 0.6이므로, 두 개의 개별 그룹으로 간주된다. 각 그룹 내 샘플은 통계학적으로 유사한 것으로 간주되는 반면, 다른 그룹에서의 샘플은 통계학적으로 상이한 것으로 간주된다.
도 33은 모두 임상학적으로 양호하고 불량으로 확인된 샘플로의 훈련 세트를 나타내는 그래프이다. 박스가 있는 클러스터는 강제 분해된 샘플이다.
도 34는 마지막 샘플 라이브러리를 나타낸다. 왼쪽에서 오른쪽으로, 그룹은 그룹 4, 그룹 3, 그룹 2, 및 그룹 1로 지칭된다. 그룹 1, 2, 및 3은 통과 분류와 연관되고, 그룹 4는 탈락 분류와 연관된다.
도 35a-35d는 최종 샘플 라이브러리의 각 클러스터 그룹에 대한 대표 이미지를 나타낸다. 그룹 1(도 35a), 2(도 35b), 및 3(도 35c)은 임상 결과가 긍정적인 샘플을 포함한다. 그룹 4(도 35d)는 확인된 분해된 샘플을 포함한다. 그룹 1 샘플은 LOT-345의 것, 그룹 2 샘플은 LOT-160의 것, 그룹 3 샘플은 LOT-194의 것이고, 그룹 4 샘플은 FD.SP17-40348-C1.1의 것이다(분해 방법: -20℃에서 동결).
도 36a-36d는 그룹별로 구분된 상이한 매개변수의 그래픽 표현이다. 도 36a는 면적 측정에 대한 데이터 클러스터의 그래픽 표현이다. 도 36b는 원형도 측정에 대한 데이터 클러스터의 그래픽 표현이다. 도 36c는 통합 밀도 측정에 대한 데이터 클러스터의 그래픽 표현이다. 도 36d는 둘레 측정에 대한 데이터 클러스터의 그래픽 표현이다.
도 37는 하이라이트된 면적-10(적색), 원형도-0.9(녹색), 둘레-18(청색) 및 통합 밀도-1500(황색) 내 특징을 가진 그룹 1의 이미지이다. 이들 그룹은 일반적으로 그룹 간 가장 큰 변동을 보인다.
도 38은 그룹 1의 세포의 면적 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 39는 그룹 1의 세포의 원형도 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 40는 그룹 1의 세포의 통합 밀도 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 41는 그룹 1의 세포의 둘레 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 42는 하이라이트된 면적-10(적색), 원형도-0.9(녹색), 둘레-18(청색) 및 통합 밀도-1500(황색) 내 특징을 가진 그룹 2의 이미지이다. 이들 그룹은 일반적으로 그룹 간 가장 큰 변동을 보인다.
도 43은 그룹 2의 세포의 면적 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 44는 그룹 2의 세포의 원형도 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 45는 그룹 2의 세포의 통합 밀도 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 46는 그룹 2의 세포의 둘레 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 47는 하이라이트된 면적-10(적색), 원형도-0.9(녹색), 둘레-18(청색) 및 통합 밀도-1500(황색) 내 특징을 가진 그룹 3의 이미지이다. 이들 그룹은 일반적으로 그룹 간 가장 큰 변동을 보인다.
도 48은 그룹 3의 세포의 면적 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 49는 그룹 3의 세포의 원형도 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 50는 그룹 3의 세포의 통합 밀도 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 51는 그룹 3의 세포의 둘레 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 52는 하이라이트된 면적-10(적색), 원형도-0.9(녹색), 둘레-18(청색) 및 통합 밀도-1500(황색) 내 특징을 가진 그룹 4의 이미지이다. 이들 그룹은 일반적으로 그룹 간 가장 큰 변동을 보인다.
도 53은 그룹 4의 세포의 면적 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 54는 그룹 4의 세포의 원형도 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 55는 그룹 4의 세포의 통합 밀도 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 56는 그룹 4의 세포의 둘레 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 57은 빈(bin) 대 빈 기반으로 그룹 간 및 그룹 내 변동성 분석의 플롯이다. 데이터는 먼저 그룹별로 x축에 표시되고, 매개변수에 대해서는 빈 별로 표시된다. 각 매개변수에 대한 상단 그래프는 개체이고, 하단은 해당 그룹의 표준 편차이다. 양자 모두를 사용하여 데이터의 확산을 시각화할 수 있다.
본원에 제공된 표제, 제목 및 부제목은 본 개시내용의 다양한 양태들을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 따라서, 아래에서 정의된 용어들은 그 전체가 명세서를 참조하여 더 완전하게 정의된다. 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 과학 및 기술 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥 상 달리 요구되지 않는 한, 단수형은 복수를 포함하고 복수형은 단수를 포함해야 한다. 본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 다수의 종속 청구항의 맥락에서, "또는"의 사용은 대안의 경우에만 하나 이상의 이전의 독립 또는 종속 청구항을 의미한다.
또한, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 및 임의의 단어의 임의의 단수형 사용은 명확하고 명백하게 언급되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다는 점에 유의한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하다" 및 이의 문법적 변형은 비-제한적인 것으로 의도되며, 목록의 항목의 언급이 나열된 항목에 대체되거나 추가될 수 있는 다른 유사한 항목의 배제가 아니다.
본 발명은 하기 정의들을 참조하여 가장 명확하게 이해된다:
용어 "약"은 본 명세서에서 대략, ~정도, 거의 또는 ~즘을 의미하는 것으로 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 관련하여 사용될 때, 그것은 제시된 수치 값의 상하한으로 경계를 확장함으로써 그 범위를 수정한다. 일반적으로, 용어 "약"은 본원에서 +/- 10%의 분산에 의해 언급된 값의 상하한의 수치를 수정하기 위해 사용된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 약이라는 용어는 명시적으로 표시되는지 여부에 관계없이, 예를 들어 정수, 분수 및 백분율을 포함하는 숫자 값을 의미한다. 약이라는 용어는 일반적으로 당업자가 인용된 값과 동등한 것으로 간주할 수 있는 수치 범위(예를 들어, 인용된 범위의 +/-5 내지 10%)를 지칭한다(예를 들어, 동일한 기능 또는 결과를 가짐). 적어도 및 약과 같은 용어가 숫자 값 또는 범위 목록보다 앞에 오면, 용어는 목록에 제공된 모든 값 또는 범위를 수식한다. 일부 경우에, 약이라는 용어는 가장 가까운 유효 숫자로 반올림된 수치를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는"(및 "포함하는"의 임의의 형태, 예컨대 "포함한다", "포함하는", 및 "포함하였다"), "가지는"(및 "가지는"의 임의의 형태, 예컨대 "가지다" 및 "가진다"), "포함시키는"(및 "포함시키는"의 임의의 형태, 예컨대 "포함시킨다" 및 "포함시키는"), 또는 "함유하는"(및 "함유하는"의 임의의 형태, 예컨대 "함유한다" 및 "함유하는")은 포괄적이거나, 개방형이며, 인용되지 않은 추가의 요소 또는 방법 단계들을 제외하지 않는다. 또한, "포함하는"이라는 용어와 함께 사용되는 용어는 "이루어진" 또는 "본질적으로 이루어진"이라는 용어와 함께 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
본 명세서에 사용된 용어 "조직"은 인간 또는 동물에서 임의의 유형의 조직을 지칭하고, 혈관 조직, 피부 조직, 간 조직, 췌장 조직, 신경 조직, 비뇨생식기 조직, 위장관 조직, 뼈 및 연골을 포함하는 골격 조직, 지방 조직, 힘줄 및 인대를 포함하는 결합 조직, 양막 조직, 융모막 조직, 경막, 심낭, 근육 조직, 선 조직, 안면 조직, 안조직을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는 달리 명시되지 않는 한 언급된 범위 내의 임의의 정수의 값, 및 적절한 경우 이들의 분율(예컨대, 정수의 10분의 1 및 100분의 1)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 범위는 대략적인 것이며, 정수 이상으로 달라질 수 있다.
단위, 접두사 및 기호는 그들의 Systeme International de Unites(SI) 승인 양식으로 표시된다. 숫자 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 측정 값은 유효 자릿수와 측정과 관련된 오류를 고려하여 대략적인 것으로 이해된다.
나아가, 명료성을 위해 개별 구현예의 맥락에서 기재된 본원에 기재된 소정의 특징부 또한, 단일 구현예에서 조합되어 제공될 수 있는 것으로 이해된다. 대조적으로, 간결성을 위해 단일 구현예의 맥락에서 기재된 다양한 특징부 또한, 개별적으로 또는 임의의 적합한 하위조합으로 제공될 수 있다.
"면적" -은 μm2로 보고된다. 핵 면적은 흉선 세포보다 흉선 상피 세포에 있어서 더 크다. 세포자멸사를 겪는 세포는 또한 더 작을 가능성이 있다.
"원형도"-는 세포가 얼마나 원형인지를 측정한다. 원형도는 0 내지 1의 척도로 측정되며, 이때 1은 완벽한 원이다. 흉선세포는 흉선 상피 세포에 비해 원형도가 증가했다. 비생존 세포는 생존 세포에 비해 원형도가 감소했다. 이와 같이, 흉선세포가 감소되고 더 많은 비생존 세포가 조직 슬라이스에서 관찰될 것으로 예상할 수 있기 때문에 배양 시간 경과에 따라 원형도가 감소될 것으로 예상될 수 있다. 분해된 샘플은 또한 더 많은 비생존 세포가 존재하여 더 낮은 원형도로 분포를 쉬프트시키므로 원형도가 감소될 것으로 예상된다.
"통합 밀도" - 는 얼마나 짙게 핵이 염색되는지를 나타낸다. 통합 밀도는 균일하게 짙은 염색을 보이는 흉선 세포의 경우 높다. 흉선 상피 세포는 짙은-염색의 테두리 및 뚜렷한 짙은 핵소체를 가진 대부분 투명한 핵질을 갖는다.
"둘레"는 - 검출되어 μm로 보고된 핵의 윤곽을 나타낸다. 둘레는 세포 생존력과 관련있다; 즉 세포가 분해됨에 따라, 핵 윤곽은 불규칙해지고 이것의 둘레는 늘어난다. 둘레는 또한 배양이 진행됨에 따라 전체 세포에 대한 TE 세포의 비율이 증가함에 따라 증가한다. 배양 시간이 경과됨에 따라뿐 아니라 조직이 분해됨에 따라 둘레 변화가 예상된다.
정량적 조직학 방법의 개요
개발된 정량적 조직학 방법은 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래된 생성물과 통계적 및 생물학적 관련성이 있는 것으로 결정되어진 특성을 바탕으로 하여 이미지처럼 클러스터링하는 이미지 기반의 알고리즘이다. 스캔한 H&E 조직학 슬라이드가 생성된다. 슬라이드는 검증된 흉선 조직 분석 소프트웨어에 SCN 또는 TIFF 이미지로 업로드된다. 업로드된 파일이 SCN 이미지인 경우, 알고리즘은 이것을 분석을 위해 TIFF 이미지로 변환할 것이다. 이미지의 적색 채널이 추출되고 그 다음 에오신 염색으로 하이라이트된 핵이 이제 흰색 백그라운드에 흑색 모양이 되도록 반전된다.
이어서 각 핵에 대해, 면적, 둘레, 통합 밀도(형상이 얼마나 짙은지) 및 원형도가 측정된다. 그런 다음 이들 각 속성에 대한 빈도 분포는 데이터베이스의 알려진 양호 및 불량 샘플과 비교될 수 있다. 이어서 새로운 입력 샘플이 공지된 샘플과 통계적으로 유사한지 여부를 확인하기 위해 속성에 대해 통계 클러스터링 비교가 수행되고, 그에 따라 이전에 식별된 기준에 따라 "통과" 또는 "탈락"으로 판정될 수 있다.
동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래된 생성물의 엄선된 임상 및 R&D H&E 슬라이드를 40x 또는 20x 확대로 스캔하였다. 이어서, 이미지를 정량적 조직학 방법의 개발을 위해 업로드하였다.
슬라이드를 정량화하기 위해, 속성 데이터가 이미지에서 추출될 수 있도록 먼저 이미지를 분석했다. 이를 달성하기 위해, 이미지를 TIFF FGP 포맷으로 변환한 다음, 이미지를 1 μm/픽셀로 보정하는 ImageJ를 통해 이미지 처리 알고리즘으로 처리하고, 적색 채널을 추출한 다음, 더 짙게 염색된 핵이 더 높은 픽셀 강도를 초래하도록 적색 채널을 반전시켰다. 이 분석의 설명을 위해 도 5a-c를 참조한다.
임계값을, 핵 선택을 위한 적절한 값으로서 결정 및 설정하여 이미지 분석이 이미지 간에 일관되게 한다. 이미지를, 면적 10 μm2를 초과하는 인접 픽셀 영역으로서 정의된 입자(세포 핵)에 대해 분석하였다. 이어서, 매개변수를 면적, 둘레, 너비 등을 포함해 각 입자에 대해 추출했다(평가된 매개변수 전체 목록에 대해서는 표 1을 참조한다).
초기 분석된 조직 집단에서 주성분 분석을 통해 통계적으로 유의미한 것으로 결정된 특징은 면적, 둘레, 통합 밀도 및 원형도였다. 다른 특징들은 샘플을 구별하는데 도움되지 않는 것으로 확인되어 더이상 후속해서 분석되지 않았다.
도 14a-14d는 임상 배양된 흉선 조직 샘플(도 14a-14c)의 3개의 뱃치 및 분해된 흉선 조직 샘플을 나타낸다. 도 14a에 나타낸 샘플에 대한 면적, 둘레, 통합 밀도 및 원형도의 네가지 특징은 하기였다: 면적=11.34; 원형도 = 0.696; 둘레 = 14.310 및 통합 밀도 = 1889.2. 도 14b에 나타낸 샘플에 대한 면적, 둘레, 통합 밀도 및 원형도의 네가지 특징은 하기였다: 면적=11.41; 원형도 = 0.993; 둘레 = 11.982 및 통합 밀도 = 1912.4. 도 14c에 나타낸 샘플에 대한 면적, 둘레, 통합 밀도 및 원형도의 네가지 특징은 하기였다: 면적=10.53; 원형도 = 0.846; 둘레 = 12.510 및 통합 밀도 = 1707.4. 도 14d에 나타낸 샘플에 대한 면적, 둘레, 통합 밀도 및 원형도의 네가지 특징은 하기였다: 면적=13.0; 원형도 = 0.352; 둘레 = 21.556 및 통합 밀도 = 1786.0. 각 이미지에서 단일 핵은 원으로 식별된다.
네 개의 매개변수가 각 핵에 대해 기록되면, 빈도 분포가 각 매개변수에 대해 생성되어 전체 슬라이드에 대한 핵 분포를 보여준다. 일반적으로 각 슬라이드에 대해 100,000개 초과의 데이터 포인트가 존재한다. 분포 내 각 매개변수에 있어서 빈 너비 및 컷-오프는 슬라이드 간에 여전히 변동성을 보이는 가장 적은 빈을 선택함으로써 결정되었다. 각 빈의 핵 비율이 결정되고 이들 값은 클러스터링 분석에 사용된다.
정량적 분석 및 클러스터링 개요
본원에 기술된 정량적 분석은 디지털 병리학에 대한 편향되지 않은/신생의 접근법이다. 훈련 상과 분류 상 모두는 컴퓨터화된 특징 추출을 포함해 각 이미지에 대한 특징 지문을 생성한다. 일 구현예에서, 특징 지문은 각 이미지의 근본적인 핵 특징을 나타낸다. 세포 특징 추출을 활용하면 각 슬라이드 이미지에 나타난 조직 내 근본적인 세포 집단의 정량적 특성화가 가능하다. 두 상(phase) 모두는 또한 슬라이드 이미지 내 각 세포를 설명하는 정량적 특징에 의해 조직학 절편을 분류하는 통계적 계층적 응집 클러스터링 기술도 포함한다. 클러스터링 분석은 각 슬라이드 이미지에 대해 생성된 지문 사이의 유사성을 기반으로 슬라이드 이미지를 상이한 그룹으로 분류한다. 일 구현예에서, 계층적 응집 클러스터링은 조직 분류기를 훈련하고 알려지지 않은 조직의 효능을 확인하기 위한 훈련된 조직 분류기를 활용하는 이미지 분석의 맥락에서 이용된다. 본 개시의 클러스터링 구현예의 예는 본 명세서, 도면 및 실시예에서 하기에서 설명된다. 예를 들어, 제한이 아닌, 도면 2, 7-9, 32 그 이하 및 수반된 텍스트 및 표와 관련되어 기술된 클러스터링 기술이 있다.
조직 분류의 맥락에서 계층적 응집 클러스터링은 기본 데이터세트의 신생 특성을 드러내기 위해 데이터에서 직접 클러스터를 어셈블리하는 것을 포함한다. 분류 상에서, 구현예에 따르면, 클러스터링 기술은 알려지지 않은 조직의 생성된 특징 지문과 알려진 조직의 이전에 클러스터링된 특징 지문(예, 슬라이드 이미지의 라이브러리로부터)과의 유사성을 기반으로 알려지지 않은 조직의 분류를 허용한다. 클러스터링 기술은 또한 클러스터 중심 점들 간의 거리를 나타내는 클러스터 덴드로그램(도 2 참조)의 상대적 높이의 분석에 의존한다. 상대적 높이는 전형적으로 클러스터의 수치적 특징 간 차이에 비례한다(이하에서 추가로 논의됨).
도 2는 클러스터가 상이한 그룹 a, b, c, d 및 e로 구분되어진 예시의 클러스터 및 클러스터 덴드로그램을 나타낸다. 클러스터 및/또는 클러스터 덴드로그램 생성 후, 통계적 분석 기술이 적용되어 통계학적으로 유의미하게 서로 상이한 그룹들을 결정할 수 있다. 통계적 분석 기술의 한 예는 다변량 분산 분석, 또는 MANOVA로, 이는 둘 이상(즉, 다중)의 변수를 갖는 데이터세트간 분산을 결정하는 절차이다.
훈련 및 분류 상은 하기의 단계 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 적합성 결정, 이미지 처리, 특징 추출, 및 클러스터링.
적합성 결정
적합성 결정은 슬라이드 이미지가 개시된 구현예에서 기재된 바와 같이 추가 정량적 분석에 적합한지 여부를 결정하기 위해 슬라이드 이미지의 특징을 평가하는 것을 지칭한다. 적합성 결정은 새로운 슬라이드 이미지에 대한 것뿐 아니라 이미지의 훈련 세트 양자 모두에 대해서 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 슬라이드 이미지의 적합성 결정은 메타데이터 분석, 백그라운드 픽셀 분석(예, 슬라이드 이미지에 존재하는 백그라운드 픽셀의 양의 검사) 및 조직 엔트로피(및 핵 분할) 분석(예, 슬라이드 이미지에서 엔트로피 양의 검사)을 포함한다.
메타데이터 분석
슬라이드 이미지의 메타데이터 분석은 슬라이드 이미지가 정량적 분석에 적절한 메타데이터 특성을 갖는지 여부를 결정한다. 고려될 수 있는 메타데이터의 예는 이에 제한되는 것은 아니나 하기를 포함한다: 파일명(예, 파일명이 고유한지 여부), 마지막 수정된 날짜(파일이 마지막으로 수정된 날짜), 파일 크기(예, 바이트로의 파일 크기), 포맷(예, 파일 유형, 예컨대 TIF), 이미지 너비(예, 슬라이드 이미지의 너비를 픽셀로 포함하는 값), 이미지 높이(예, 픽셀로 슬라이드 이미지의 높이를 포함하는 값), 비트 깊이(슬라이드 이미지에서 컬러 채널에 대한 총 비트수), 컬러 타입(이미지의 컬러 타입, RGB), x-해상도(예, X-방향에서 슬라이드 이미지의 해상도를 나타내는 값), y-해상도(예, Y 방향으로 슬라이드 이미지의 해상도를 나타내는 값), 해상도 단위(예, x-해상도 및 y-해상도 특성의 단위를 포함하는 열(string)), 이미지 백그라운드 비율(픽셀의 총수에 대한 백그라운드 픽셀의 양의 비율), 백그라운드 레이블(이미지에서 백그라운드 픽셀 양을 기술하는 레이블), 조직 엔트로피(분할된 이슈 픽셀만 기술하는 엔트로피), 및 핵 분할 레이블(핵 분할 분석의 성공을 기술하는 레이블).
일 구현예에서, 슬라이드 이미지는 상기에 기술된 하나 이상의 메타데이터 특성의 분석을 기반으로 정량적 분석에 적합한 것으로 간주될 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 상기의 모든 필드가 존재하고 슬라이드 이미지의 헤더 내에서 판독가능하고, 슬라이드 이미지의 x-해상도가 0.8 μm-1.2 μm 사이이고, y-해상도는 0.8 μm-1.2 μm 사이인 경우, 이때에는 슬라이드 이미지는 정량적 분석에 적합하다. 다른 구현예에서, 임의의 필드가 누락되거나 손상된 경우, 슬라이드 이미지는 정량적 분석에서 제외될 수 있다.
백그라운드 분석
백그라운드 픽셀 분석은, 조직의 이미지가 백그라운드에서 분석될 조직의 시각을 요구하는 추가 분석에 적합하다는 점을 확실하게 하기 위한 단계이다. 일 구현예에서, 정량적 분석은 조직 분할 및 핵 분할 동안 정확한 분할이 발생하는 것을 보장하기 위해 슬라이드 이미지에서 백그라운드 픽셀의 표준화된 양을 이용한다. 너무 많은 백그라운드 픽셀을 가진 이미지(빈 이미지) 또는 충분하지 못한 백그라운드 픽셀을 가진 이미지(잘린 이미지)는 분할 분석(하기 기재) 동안 열악하게 수행될 것이며, 그에 따라 백그라운드 픽셀에 대한 범위는, 개시된 구현예의 정량적 분석을 지속하기 이전에 이 범위를 벗어나는 이미지가 선별 배제되도록 결정되어야 한다.
백그라운드 분석 결과는 백그라운드 레이블(예, 통과 또는 탈락)을 슬라이드 이미지와 연관시킬 수 있다. 예를 들어, 도 3a-3d는 다양한 양의 백그라운드 픽셀을 갖는 슬라이드 이미지를 보여준다. 도 3a는 적절량의 백그라운드 픽셀 상 조직 샘플을 보여주는 슬라이드 이미지를 묘사한다. 일 구현예에서, 적절량의 픽셀을 가진 슬라이드 이미지는 추가 분석에 적합한 것으로 간주된다. 이런 유형의 이미지는 제1의 백그라운드 클래스로 간주될 수 있다.
도 3b 및 3c는 백그라운드 픽셀이 너무 많은 슬라이드 이미지를 도시한다. 일 구현예에서, 너무 많은 백그라운드 픽셀을 가진 슬라이드 이미지는 추가 분석에 적합하지 않은 것으로 간주된다. 이런 유형의 이미지는 제2의 백그라운드 클래스로 간주될 수 있다.
도 3d는 백그라운드 픽셀 수가 불충분한 슬라이드 이미지를 도시한다. 일 구현예에서, 이러한 슬라이드 이미지는 추가 분석에 적합하지 않은 것으로 간주된다. 이런 유형의 이미지는 제3의 백그라운드 클래스로 간주될 수 있다.
백그라운드 분석의 예시 단계를 이제 논의할 것이다. 슬라이드 이미지에 대한 이미지 백그라운드는 전체 픽셀수에 대한 백그라운드 픽셀의 양의 비율을 바탕으로 분류 간격을 이용하여 분류될 것이다. 예를 들어, 빈 이미지(예, 도 3b, 3c)는 매우 높은 이미지 백그라운드 비율(예, 95%)을 나타내고; 잘린 이미지는 매우 낮은 이미지 백그라운드 비율(예, 5%)(예, 도 3d)을 나타내고, 정상적인 양의 백그라운드 픽셀 및 조직을 가진 이미지는 보통의 이미지 백그라운드 비율(예, 20% 내지 80%)(예, 도 3a)를 보인다. 이들 값은 예시일뿐이며, 훈련 세트 내 이미지 분석을 기반으로 역동적으로 결정될 수 있다.
백그라운드 분석은 훈련 세트 내의 이미지에 대해(예, 정량적 분석에 적합한 것으로 고려되는 적절한 범위의 값을 생성하기 위함), 대조 세트의 이미지에 대해(예, 대조 세트에서 이미지의 백그라운드 값이 생성된 적절한 범위내에 속하는지 여부를 결정하기 위함) 및 새로운 지정되지 않은 이미지에 대해 수행된다. 일 구현예에서, 슬라이드 이미지에 대한 이미지 백그라운드 비율 분류를 결정하는 것은 이에 제한되는 것은 아니나 하기의 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 훈련 세트용 슬라이드 이미지에 대한 이미지 백그라운드 비율 분류를 결정하는 것은 이에 제한되는 것은 아니나 하기의 단계를 포함한다:
1. 훈련 세트에서 모든 이미지에 대한 이미지 백그라운드 비율을 계산한다.
a. 정규화된 이미지 히스토그램 카운트를 계산한다.
b. 적색 채널의 모든 이미지 픽셀에서 반전 기능을 사용하여 백그라운드 픽셀에서 조직 픽셀을 분할한다(예, 애플리케이션 ImageJ에서 otsu_dark 함수)
c. N개의 빈(이때, N=2슬라이드 이미지의 비트 깊이)으로 모든 이미지 픽셀로부터 히스토그램 카운트를 생성한다.
d. 모든 히스토그램 카운트를 이미지의 총 픽셀수로 나누어 데이터를 정규화한다.
e. 임계값보다 더 큰 픽셀의 비율을 계산한다. 상기 비율은 이미지 백그라운드 비율을 나타낸다.
2. 적절한 백그라운드 픽셀수(예, 통과)를 갖는 것으로 간주되는 이미지에 대한 이미지 백그라운드 비율의 분류 간격을 계산한다
a. 제1, 제2 및 제3 백그라운드 클래스 각각에 대한 평균 이미지 백그라운드 비율 및 표준 편차를 계산한다.
b. 분류 범위의 상한을 계산한다.
i. 제1 및 제2 백그라운드 클래스에 대한 평균 이미지 백그라운드 비율 사이의 중간점을 계산한다. 이 값은 허용된 분류 간격의 상한 범위로 할당될 수 있다.
c. 분류 범위의 하한을 계산한다.
ii. 제1, 제2, 및 제3 백그라운드 클래스에 대한 평균 이미지 백그라운드 비율 사이의 중간점을 계산한다. 이 값은 허용된 분류 간격의 하한 범위로 할당된다.
일 구현예에서, 슬라이드 이미지의 훈련 클래스에 대해 수행된 상기의 단계의 결과는 허용가능한 백그라운드 범위를 생성한다. 이 허용가능한 백그라운드 범위 내 백그라운드 값을 가진 슬라이드 이미지는 추가 정량적 분석에 적합한 것으로 간주될 수 있다. 이어서 허용가능한 백그라운드 범위가 적용되어, 대조 라이브러리 내 이미지와 같이 훈련 클래스 이외의 새 이미지를 분류할 수 있다. 예를 들어, 제1 백그라운드 클래스를 갖는 이미지에 대해 계산된 백그라운드 범위 내에서 백그라운드 비율을 갖는 것으로 결정된 새 슬라이드 이미지(예, 도 3a)는 적절량의 백그라운드 픽셀을 가진 것으로 분류되어 분석의 다음 단계에 허용된다. 반대로, 제1 백그라운드 클래스를 갖는 이미지에 대해 계산된 백그라운드 범위 밖에 있는 새 슬라이드 이미지(예, 도 3b-d)는 거부되어 추가 분석을 위해 진행되지 않을 것이다.
조직 엔트로피 분석
핵 분할 분석은 핵 픽셀이 슬라이드 이미지에서 다른 픽셀과 적절하게 분리되도록 보장한다. 슬라이드 이미지의 특징 지문은 부분적으로 핵 특징을 기반으로 하므로, 정확하게 분할된 핵 픽셀이 구현예에서 정량 분석을 위해 필수적이다. 핵 분할 분석 결과는 핵 분할 레이블(예, 통과 또는 탈락)을 슬라이드 이미지와 연관시킬 수 있다.
핵 분할 분석은 정확한 핵 분할이 발생하도록 충분한 엔트로피가 존재하는 것을 확보하기 위해 조직 픽셀의 엔트로피를 평가하는 것을 포함한다. 열역학적 엔트로피와 같은 이미지 엔트로피는 시스템에서 상태 수에 해당한다. 이미지 사이에 고르게 분포된 많은 상이한 픽셀 값을 갖는 이미지는 높은 수의 상태를 가지므로 엔트로피가 높다. 이미지 간에 픽셀 값이 고르지 않게 분포된 이미지는 적은 수의 상태를 가지므로 엔트로피가 낮다. 슬라이드 이미지에서 조직 픽셀의 엔트로피 평가는 이미지에서 적절한 대비 및 선명도가 존재하여, 슬라이드 이미지의 정량 분석에 도움이 된다는 것을 보장한다. 낮은 조직 대비를 가진 이미지는, 보통의 양의 조직 대비를 가진 이미지에 비해 엔트로피가 더 낮을 것이다. 핵 당 픽셀의 배열 및 수는 조직 샘플을 클러스터링하는데 이용된 특징 지문의 생성 및 이들의 "특징"에 해당된다. 이들 특징은 슬라이드 이미지에서 핵마다 가변적일 것이다. 일 구현예에서, 2개의 이전 단계(메타데이터 분석, 이미지 백그라운드)를 통과한 이미지는 이 조직 엔트로피 분석으로 진행될 것이다.
훈련 세트에 적용할 때, 조직 엔트로피 분석은 이미지 내 허용되는 조직 엔트로피에 대한 범위를 생성한다. 일 구현예에서, 조직 엔트로피 분석은 이에 제한되는 것은 아니나 하기의 단계를 포함할 수 있다:
1. 백그라운드 픽셀로부터 모든 조직 픽셀을 분할한다.
i. 적색 채널로부터 모든 이미지 픽셀에 반전 기능을 사용하여 백그라운드 픽셀로부터 조직 픽셀을 분할한다(예, 애플리케이션 ImageJ에서 otsu_dark 함수).
ii. 엔트로피 방정식을 이용하여 모든 조직 픽셀의 엔트로피를 계산하고 해당 값을 저장한다. 엔트로피 등식의 예는 하기에 나타내며, 여기서 ET는 모든 조직 픽셀에 대한 조직 엔트로피이고, p는 빈(bin) i로 조직 픽셀의 정규화된 히스토그램 카운트이고, N은 히스토그램에 사용된 히스토그램 빈의 수이다:
iii. 슬라이드 이미지 내 모든 분할된 핵의 이진 마스크를 생성한다(예, 모든 조직 픽셀로 함수 otsu_dark 적용). 이진 마스크는 특정 이미지에 해당하고, 사용될 픽셀을 가리킨다. 이진 마스크는 통상적으로 분할이 행해질 때 생성된다. 예를 들어, H&E 이미지에 해당하는 이진 핵 마스크는, 핵 마스크가 오직 1-비트이고 단지 소정의 값(예, 0 또는 1)만 포함하는 원본 이미지와 동일한 차원의 행렬일 것이다. 원본 이미지에서 핵의 위치와 일치하는 픽셀 위치는 소정의 값(예, 1)을 가질 것이며, 이때 비핵 픽셀은 (예, 0의) 소정의 값을 가질 것이다.
2. 모든 이미지에 대한 핵 분할 레이블을 생성한다. 이 레이블은 조직 엔트로피 분석과 관련하여 상기 기재된 이미지 처리 루틴에서 수행된 핵 분할의 성공을 기재한다. 핵 분할은 원본 슬라이드(예, H&E) 이미지에서 다른 모든 픽셀로부터 핵 픽셀의 분리이다. 핵 분할이 수행되어 개체 분석이 이미지의 핵 세포에서만 수행된다.
i. 핵 분할의 정확도를 결정한다. 예를 들어, 이 단계는 애플리케이션을 이용하고, 정확하고 부정확한 분할의 예를 제공하는 이미지 키와 비교하여 수행될 수 있다.
1. 특정 불투명 값을 사용하여 적색 채널 이미지에 이진 핵 마스크를 오버레이한다(하기 도 4a-c).
2. 핵 위에 적절하게 오버레이되는 마스크로서 정의되는 올바른 분할을 확인하기 위해 소정의 수의 핵(예, 50개)을 조사한다.
a. 소정의 수의 핵 중 특정 수 이상의 핵(예, 45개)이 올바르게 분할된다면, 이미지에 제1 핵 분할 레이블(예, "0")이 제공될 수 있다(도, 4a).
b. 특정 수 미만의 핵이 올바르게 분할된다면, 이미지에 제2 핵 분할 레이블(예, "1")이 제공될 수 있다(도, 4b, c).
3. 제1 핵 분할 레이블이 있는 이미지에 대한 조직 엔트로피의 분류 간격을 계산한다.
i. 제1 및 제2 핵 분할 레이블을 가진 각각의 이미지에 대한 평균 조직 엔트로피 및 표준 편차를 계산한다.
ii. 분류 범위의 하한을 계산한다.
1. 제1 및 제2 핵 분할 레이블에 대한 평균 조직 엔트로피 사이의 중간점을 계산한다. 이 값은 조직 엔트로피 범위의 하한으로서 할당된다.
2. 조직 엔트로피의 허용된 범위는 3.ii.1 단계에서 계산된 범위의 하한에서 무한대까지 이어질 수 있다.
일 구현예에서, 슬라이드 이미지의 훈련 클래스에 대해 수행된 상기의 단계의 결과는 슬라이드 이미지에서 조직 엔트로피의 허용가능한 분류 범위를 생성한다. 이어서 허용가능한 분류 범위가 적용되어 새 슬라이드 이미지를 분류할 수 있다. 분류 범위의 하한(단계 3.ii.1 참조)보다 더 큰 조직 엔트로피 값을 갖는 슬라이드 이미지는 적절량의 조직 엔트로피를 갖는 것으로서 분류되고 이 방법을 이용하여 분석에 허용된다. 분류 범위의 하한 미만인 조직 엔트로피 값을 갖는 슬라이드 이미지는 거부되며 추가 정량 분석을 위해 진행되지 않을 것이다.
도 4a-4c는 다양한 정도의 핵 분할을 갖는 슬라이드 이미지를 도시한다. 도 4a는 정확하게 분할된 핵을 가진 슬라이드 이미지를 도시하는 반면, 도 4b 및 4c는 부정확하게 분할된 핵을 가진 슬라이드 이미지를 도시한다.
이미지 처리
이미지 처리 특성은 슬라이드 이미지의 헤마톡실린 채널이 각 세포의 핵 특성을 설명하기 때문에, 이 채널 분석과 관련하여 하기에 더 논의된다. 일 구현예에서, 헤마톡실린 이미지는 에오신 이미지로부터 분리된다. 일 구현예에서, 이미지 처리 단계는 또한 하기 도 5a-c에 나타낸 바와 같이 분석을 위해 슬라이드 이미지를 이진 이미지로 변환하는 것을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 슬라이드 이미지(도 5a)는 동일 해상도 및 스케일을 이용해 분석된다. 이어서, 픽셀의 인접한 영역이 핵 및 핵의 해당 특징을 검출하기 위해 이진 이미지로부터 추출된다(도 5b에 나타냄). 일 구현예에서, 슬라이드 이미지의 적색 채널은 추출되고 반전되어 도 5c에 나타낸 바와 같이 이진 이미지를 형성한다. 일부 시스템에서, 이미지의 적색 채널은 슬라이드 이미지 내 핵의 최상의 이미지를 제공한다.
특징 추출
일 구현예에서, 특징 추출 단계는 슬라이드 이미지에서 검출된 각 핵에 대한 특징을 추출하고 추출된 특징 각각에 대한 지문을 생성하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 특징은 수치적인 특징값으로서 나타내어진다. 하기의 표 1은 예를 들고 제한 없이 검출할 수 있고 따라서 각 핵에 대해 추출할 수 있는 특징을 나열한다. 하나 이상의 특징이 각 핵에 대해서 추출될 수 있다. 예를 들어, 특정 특징은 상이한 효능 적용의 목적에 더 관련있을 수 있다. 즉, 특정 특징은 통과 및 탈락 조직 사이에서 현저하게 달라지는 것으로 결정될 수 있다.
일 구현예에서, 분류될 조직이 흉선 조직인 경우(검정의 일부일 수 있거나 그럴 수 있음), 추출된 관련 특징들은 각 검출된 핵의 면적, 각 검출된 핵의 둘레, 각 검출된 핵의 통합 밀도 및 각 핵의 원형도이다. 면적에 있어서, 핵 면적은 흉선 세포보다 흉선 상피 세포에 있어서 더 크다. 둘레는 세포 생존력과 관련있다; 즉 세포가 분해됨에 따라, 핵 윤곽은 불규칙해지고 이것의 둘레는 늘어난다. 통합 밀도는 균일하게 짙은 염색을 보이는 흉선 세포의 경우 높다. 흉선 상피 세포는 짙게 염색된 테두리를 갖고, 대부분은 뚜렷한 짙은 핵소체를 가진 투명한 핵질을 갖는다. 흉선세포는 흉선 상피 세포에 비해 원형도가 증가했다. 비생존 세포는 생존 세포에 비해 원형도가 감소했다.
일 구현예에서, 통합 밀도는 검출된 핵의 크기 및 검출된 핵과 연관된 짙음 값으로 나타내어진다. 원형도는 검출된 핵의 원형 모양에 대한 평가를 나타내고, 일 구현예에서 범위(예, 0.0 내지 1.0, 여기서 1.0은 완벽한 원을 나타냄)로 나타내어질 수 있다.
구현예에 따른 슬라이드 이미지에 대한 특징 지문의 결정이 이제 논의된다. 처음에는, 숫자 지문이 추출된 특징 각각에 대해 생성된다. 예를 들어, 상기 기재된 구현예에서, 특징 지문은 슬라이드 이미지 내 핵의 면적, 둘레, 통합 밀도 및 원형도 각각에 대해 생성된다. 일 구현예에서, 히스토그램은 추출된 특징(예, 면적, 둘레, 통합 밀도 및 원형도) 각각에 대해 생성된다. 각 히스토그램은 특징에 대한 특정 범위(빈)에서 결과의 빈도를 나타낸다. 특징 지문은 각 슬라이드 이미지에 대해 조합된 히스토그램들로부터 생성된다. 클러스터링(이하 및 하기에 설명된 실시예에서 논의됨)은 추출된 특징의 통계학적 분석을 기반으로 한다. 히스토그램은 도 6a-6d에 나타내어진다. 도 6a-d는 조직이 흉선 조직이고, 추출된 특징은 면적, 둘레, 통합 밀도 및 원형도를 포함하는 구현예에서 특징 추출의 예시 결과를 나타낸다. 도 6a는 면적 측정을 나타낸다. 도 6b는 둘레 측정을 나타낸다. 도 6c는 통합 밀도 측정을 나타낸다. 도 6d는 원형도 측정을 나타낸다.
클러스터링
일 구현예에서, 클러스터링은 슬라이드 이미지의 특징 지문을 기반으로 클러스터를 어셈블리하는 것을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 생성된 특징 지문에 대한 유클리드 거리 행렬을 표로 작성한다. 이어서 거리 행렬은 슬라이드 이미지의 그룹 내 분산이 최소화되도록 슬라이드 이미지의 최적 배열을 찾음으로써 계층적 응집 클러스터링에 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 특징 지문은 전술한 바와 같이 추출된 특징의 조합된 히스토그램으로부터 생성된 각 슬라이드 이미지에 대한 수치로 나타내어질 수 있다. 훈련 상에서, 계층적 응집 클러스터링이 Duke(Markert Lab), 강제 분해(Forced Degradation; CT2), 및 제작 (Manufacturing; CT2) 표본 슬라이드와 같은 공지된 데이터세트를 가진 대조 이미지의 라이브러리로부터의 슬라이드 이미지의 특징 지문에 적용된다. 일 구현예에서, 클러스터링은 또한 각 그룹 내 슬라이드 이미지들 사이의 통계적 유의성을 보장하기 위해 클러스터를 그룹으로 분리하는 컷오프 높이를 결정하기 위한 통계적 분석을 수행하는 것을 포함한다. 분류 상에서, 미공지된 샘플은 라이브러리로부터의 슬라이드 이미지와 공동 클러스터링함으로써 분류된다. 미공지된 샘플은 이어서 미공지된 샘플이 공동 클러스터링된 클러스터 내 그룹을 바탕으로 분류된다.
하기 도 7은 슬라이드 이미지에 대해 생성된 지문의 예시적인 표시를 나타낸다. 상기 언급된 바와 같이, 지문은 이미지 내 핵의 기본 특징의 정량적 표시이다.
하기 도 8은 Duke 대학교에 의해 공급된 조직 샘플의 데이터를 포함하는 클러스터링 단계의 원시 출력의 예시적인 표시를 나타낸다.
일 구현예에서, 클러스터링 단계는 클러스터의 그룹으로의 분리를 포함할 수 있다. 컷오프 높이는 통계학적으로 유의미한 방식으로 분리를 수행하는 방식으로 계산되어야 한다. 일 구현예에서, 컷오프 높이는 그룹간 및 그룹 중에서 상응하는 다원변량분석(MANOVA)를 사용하여 컷-오프 높이의 체계적인 증가를 통해 계산되며, 선택된 컷오프 높이는 그룹 수를 최소화하면서 그룹 집단간 특징 지문의 차이의 통계적 유의성을 최대화한다. 조직이 흉선 조직이고, 추출된 특징이 면적, 둘레, 통합 밀도 및 원형도를 포함하는 예시적인 실험 테스트에서, 컷오프 높이(예, 0.4)가 클러스터를 특정 수의 그룹(예, 9)으로 분리하는 클러스터 분할에 있어서 결정된다.
예시적인 실험 테스트에서, 그룹이 형성된 후, 그룹은 그룹 내 샘플 집단이 효능 기준을 통과한 것으로 앞서 결정된 샘플(즉, 통과 분류를 가진 "양호한" 샘플)의 슬라이드 이미지로 이루어진 경우 양성 대조군으로 할당되었다. 이들 그룹의 예는 Duke 및 제작 데이터세트를 포함한다. 그룹 내 샘플 집단이 효능 기준에 탈락한 것으로 앞서 결정된 슬라이드(즉, 탈락 분류를 가진 "불량" 샘플)로 이루어진 경우 그 그룹은 음성 대조군으로 할당되었다. 이들 그룹의 예는 강제 분해 데이터세트를 포함했다.
하기 도 9는 훈련 상 동안 그룹화 단계의 예시적인 결과를 나타낸다.
도 9는 흉선 조직의 슬라이드 이미지를 기반으로 클러스터링된 다중 양성 및 음성 대조군을 나타낸다. 이러한 구현예에서, 효능에 대한 단일의 통과/탈락 기준은 없을 수 있다. 오히려, 다수의 특징이 샘플을 구별할 수 있으며, 효능에 대해 고려될 수 있다. 조직의 크기, 및 절편을 취해온 영역에서와 같이 슬라이드 이미지에서의 변화에 따라 양성 대조군 사이에 더 많은 변화가 존재할 수 있다. 예를 들어, 흉선과 같은 더 복잡한 조직의 상이한 영역에서 취한 절편은 상이한 피질수질 비율(예, 흉선세포의 분포, 상피 망상 세포 및 Hassall 소체의 수)를 갖지만 여전히 효능에 대한 통과 기준을 충족할 수 있다.
일 구현예에서, 도 9의 대조군의 하기의 설명은 단지 예시적이며, 각 대조군의 형성을 도모하는 슬라이드 이미지의 가능한 공통적인 특징을 설명하기 위한 것이다. 대조군은 이들에 함유된 슬라이드 이미지 내의 다른 특징 또는 특징의 조합을 기반으로 형성될 수 있다. 도 9의 예에서, 도 9의 제1의 음성 대조군("neg.ctrl.1")은 Hassall 소체, 열악하게 정의된 수질 및 피질 영역, 및 광범위한 괴사 및 섬유증의 존재를 기반으로 그룹화되었다. 도 9의 제2의 음성 대조군("neg.ctrl.2")은 Hassall 소체, 섬유증 및 괴사, 및 열악하게 정의된 수질 및 피질 영역의 최소 존재 또는 부재를 기반으로 그룹화되었다. 도 9의 제3의 음성 대조군("neg.crtl.3")은 Hassall 소체, 섬유증 및 괴사, 및 열악하게 정의된 수질 및 피질 영역의 최소 존재 또는 부재를 기반으로 그룹화되었다.
도 9에 나타낸 양성 대조군과 관련하여, 본 실시예에서, 도 9의 제1 대조군("pos.crtl.1")은 정의된 피질 또는 수질 영역의 부족, Hassall 소체 존재, 및 적은 양 내지 보통 양의 림프구를 기반으로 그룹화되었다. 도 9의 제2 대조군("pos.crtl.2")은 정상 상피 세포의 존재, 정상 피질 및 수질 영역, Hassall 소체 존재, 및 정상적인 성숙 T 세포 변화를 가진 림프구를 기반으로 그룹화된다. 도 9의 제3 대조군("pos.crtl.3")은 정상 상피 세포의 존재, 정상 피질 및 수질 영역, Hassall 소체 존재, 및 정상적인 성숙 T 세포 변화를 가진 림프구를 기반으로 그룹화되었다. 도 9의 제4 대조군("pos.crtl.4")은 적은 양의 림프구, 다양한 정도의 수질 및 피질 영역, 일부 조직의 경우 수질에서 피질로 확장되는 괴사의 존재, 및 없는 것부터 존재하는 것까지의 다양한 상피 세포를 기반으로 그룹화되었다. 도 9의 제5 대조군("pos.crtl.5")은 정상 피질 및 수질 영역, Hassall 소체 존재, 정상 흉선 세포 분포 및 정상적인 성숙 T 세포 변화를 갖는 림프구를 기반으로 그룹화되었다. 도 9의 제6의 대조군("pos.crtl.6")은 Hassall 소체의 최소 존재 또는 부재, 수질 및 피질 영역에 대한 식별 부족, 및 높은 수준의 섬유 조직을 기반으로 그룹화되었다. 본 개시의 대안적인 클러스터링 기술은 본 명세서의 실시예에서 찾을 수 있다.
하기의 표 2 및 3은 공동-클러스터링 분석을 수행한 후 그룹 형성에 대한 통계학적 분석의 예시 결과를 나타낸다. 일 구현예에서, MANOVA 분석이 수행된다. 표 2는 공동-클러스터링 분석을 기반으로 한 그룹이 서로 유의미하게 상이한 클러스터링된 그룹간의 집단을 초래함을 보여준다.
도 10은 표 2의 각 분할된 그룹 내 집단 간의 차이의 통계학적 분석의 예시 결과를 추가로 나타낸다. 도 10은 각 그룹 내의 슬라이드 이미지의 집단이 크게 변하지 않았음을 나타내며, 이는 유사한 특징 지문을 이들 슬라이드 이미지가 공유한다는 것을 지시한다.
표 3은 랜덤으로 생성된 그룹의 그룹(즉, 공동-클러스터링을 수행하지 않음)이 각 그룹의 집단 간 통계학적 유의성이 없음을 나타낸다.
일 구현예에서, 훈련 상 후, 분류기는 라이브러리로부터 슬라이드 이미지의 분할된 그룹을 확립하였다. 그룹은 양성 대조군 및 음성 대조군으로 분리되고, 여기서 양성 대조군은 이전에 이식 후보로 결정된 슬라이드 이미지(즉, 통과 분류)를 포함하고, 음성 대조군은 이전에 이식 후보로 결정되지 않은 슬라이드 이미지(즉, 탈락 분류)를 포함한다.
분류 상에서, 분류할 샘플 슬라이드 이미지가 분석되어 슬라이드 이미지에서 조직의 효능이 평가된다. 슬라이드 이미지는 분석 준비에서 처리된다. 일 구현예에서, 이것은 이미지의 이진 이미지로의 변환을 포함한다. 특징 검출이 다음으로 수행된다. 일 구현예에서, 헤마톡실린 채널(즉, 핵)이 슬라이드 이미지로부터 추출된다. 특징이 추출된 채널에 대해 결정된다. 특징 지문이 추출된 채널의 특징을 기반으로 생성된다. 일 구현예에서, 특징 지문은 상기 도 8에 나타낸 바와 같이 히스토그램에 의해 나타내어질 수 있다. 다른 구현예에서, 특징 지문은 추출된 채널의 면적, 둘레, 통합 밀도 및 원형도 특징으로부터 생성된다.
생성된 특징 지문은 이어서 훈련 상 동안 생성되어진 양성 및 음성 대조군의 특징 지문과 비교될 수 있다. 일 구현예에서, 비교 단계는 생성된 특징 지문을 양성 및 음성 대조군의 특징 지문과 공동-클러스터링하는 것을 포함한다.
공동-클러스터링 후, 통계 분석(예, MANOVA)을 수행하여, 형성된 클러스터를 평가하고, 생성된 특징 지문 클러스터가 통계학적으로 유의미한 방식으로 양성 또는 음성 대조군 중 어느 것과 상관하는지 여부를 판단할 수 있다. 통계 분석의 결과가, 통계적으로 유의미한 클러스터링의 부재 또는 음성 대조군과의 특징 지문 클러스터를 생성한 것으로 나타나면, 슬라이드 이미지는 효능 기준에 탈락한 것으로 여겨져 탈락 분류와 연관될 수 있거나, 이것은 처분을 위해 질적으로 평가될 수 있다. 통계 분석의 결과가 양성 대조군과의 클러스터링을 나타내면, 슬라이드 이미지는 효능 기준을 통과한 것으로 여겨지고 통과 분류와 연관될 수 있다.
하기 도 11은 슬라이드 이미지의 예시 분석의 순서도를 나타낸다. 일 구현예에서, 순서도는 상기에서 기재된 단계를 수행하는 분류기에 의해 구현된다. 슬라이드 이미지는 먼저 그 이미지가 분류 단계 동안 분석하기에 적합한지 여부가 결정되도록 평가될 수 있다. 그렇지 않은 경우, 슬라이드 이미지는 제외되고 분석 적합성 요구 사항에 탈락한 것으로 결정된다. 슬라이드 이미지가 필수적인 적합한 요구 사항을 충족한다면, 슬라이드 이미지는 배제되지 않고 분석된다. 분석에는 상기에서 논의된 이미지 처리, 특징 추출 및 클러스터링 단계 중 적어도 하나가 포함된다. 테스트 결과의 결과는 슬라이드 이미지의 특징 지문이 양성 대조군 또는 음성 대조군 중 하나와 클러스터링되는지 여부의 결정으로 이어지게 할 수 있다. 하기 도 11에 나타낸 바와 같이, 양성 대조군과 클러스터링된 경우, 슬라이드 이미지는 효능 기준을 충족한 것으로 여겨지고 따라서 통과 분류와 연관될 수 있다. 음성 대조군과 클러스터링된 경우, 슬라이드 이미지는 효능 기준을 충족하지 못한 것으로 여겨지고 따라서 탈락 분류와 연관될 수 있다.
하기의 표 4는 분류 상을 흉선 조직의 슬라이드 이미지의 라이브러리에 적용했을 때 실험 구현예에서 음성 대조군 및 양성 대조군의 슬라이드 이미지로부터 조직의 상응하는 정성적 특징을 설명한다.
표 5는 음성 대조군(음성 1-5로 레이블) 및 양성 대조군(양성 1-6으로 레이블) 사이에 해당하는 특징을 나타낸다.
일 구현예에서, 클러스터링은 슬라이드 이미지 내 모든 세포에 대한 핵의 특징 및 조성을 바탕으로 한다. 흉선의 세포들(thymus cells)에 있어서, 흉선세포(thymocyte)가 모집단 핵의 대부분을 포함하기 때문에 분석에 기여하는 요인이 될 수 있다. 수질 및 피질 흉선세포는 지문에 사용된 특징에 따라 특징 지문에 다르게 기여한다. 세포 집단의 정량적 차이는 클러스터링의 차이로 이어지는 특징 지문의 정량적 차이로 이어진다. 흉선세포 조성은 조성의 현저한 변화가 괴사, 섬유증 및 일반적인 분해를 지시하므로 조직 건강을 묘사한다. 클러스터링은 유사한 지문 패턴을 공유하고, 따라서 이들의 세포 집단의 유사한 특징을 공유하는 샘플을 그룹화한다. 지문이 통계학적으로 유의미하게 상이한 샘플 이미지는 상이한 그룹에 위치될 것이다.
특징 지문은 슬라이드 이미지에서 모든 검출가능한 핵을 평가하기 때문에, 정량적 분석 및 특징 지문 생성을 위한 개시된 구현예는 분류기가 세포 집단의 쉬프트를 검출할 수 있게 한다. 배양 동안, 전체 흉선 세포수는 조직에서 감소되어야 한다. 그러나, 수질 흉선세포에 대한 피질의 상대적 비율은 일정하게 유지되어야 한다. 이들 비율의 상당한 변경은 고르지 않은 조직 분해 또는 효능 저하를 나타낼 수 있다. 유의미한 세포 집단의 변화가 정량적 특징 지문에서의 쉬프트로 검출될 것이다. 피질수질 흉선세포 비율의 유의미한 변화(증가 또는 감소)는 특징 지문에서 음성 대조군으로의 쉬프트를 야기하므로 샘플은 음성 대조군 샘플과 클러스터링된다.
도 12a-12d는 흉선 조직의 슬라이드 이미지의 특정 추출된 특징을 기반으로 예의 특징 지문을 나타낼 수 있는 예언적 예이다. 도 12a는 핵 면적에 대해 생성된 특징 지문에서 양성 및 음성 대조군과 연관된 슬라이드 이미지들 사이의 차이를 나타낸다. 도 12b는 핵 둘레에 대해 생성된 특징 지문에서 양성 및 음성 대조군과 연관된 슬라이드 이미지들 사이의 차이를 나타낸다. 도 12c는 핵 통합 밀도에 대해 생성된 특징 지문에서 양성 및 음성 대조군과 연관된 슬라이드 이미지들 사이의 차이를 나타낸다. 도 12d는 핵 원형도에 대해 생성된 특징 지문에서 양성 및 음성 대조군과 연관된 슬라이드 이미지들 사이의 차이를 나타낸다.
도 13은 음성 대조군과 연관된 흉선 조직의 예시 슬라이드 이미지 및 양성 대조군과 연관된 흉선 조직의 예시 슬라이드 이미지에 대한 분류기의 예시적인 적용으로부터 특징 지문을 나타낸다. 면적 및 통합 밀도 특징에 대한 것을 포함해 특징 지문은 음성 대조군 슬라이드 이미지와 양성 대조군 슬라이드 이미지 사이의 피질 흉선 간 차이를 보여준다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 조직의 미분류된 슬라이드 이미지의 정량적 조직병리학적 평가를 수행하는 방법 및 정량적 조직병리학적 평가를 수행하기 위한 조직 분류기의 훈련 방법이 하기의 예시적인 방식으로 수행될 수 있다.
조사될 조직의 배양 기간은 원하는 조직-조작 생성물의 이식 후 긍정적인 임상 결과를 구성하는 결과를 바탕으로 선택된다. 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래 생성물과 관련하여, 배양 기간은 세포자멸사를 통해 및/또는 조직 밖으로 흉선세포를 씻겨냄으로써 조직에서 흉선세포를 고갈시킬 수 있다. 배양된 흉선 조직의 TEC는 배양 시간 전반에 걸쳐 실질적으로 유지된다.
검정은 배양 5-9일 사이에 채취된 샘플을 조사하여 배양된 흉선 조직의 방출 및 이식가능성에 대한 적합성을 평가한다. 생성물을 더 잘 이해하고 검정의 식별 능력을 더 잘 평가하는 것을 돕기 위해, 샘플을 제1일 내지 제21일 이후까지 취하여 그 데이터를 명백한 추세를 파악하기 위해 평가할 수 있다.
예를 들어, 임상 배양된 흉선 조직 샘플의 뱃치 및 분해된 흉선 조직 샘플은 면적, 둘레, 통합 밀도 및 원형도와 같은 조직병리학적 특징에 대해 검사될 수 있다. 검출된 핵 수의 전반적인 추세는 조사되며, 이는 흉선세포가 조직에서 씻겨나가거나 세포자멸사를 겪으면서 시간이 지남에 따라 감소될 것으로 예상된다. 이어서 이들 데이터는, 다수의 로트로부터 상이한 슬라이스가 다른 날에 검사되므로 조직 면적에 대해 정규화된다. 조직 절편 크기는 슬라이스 간에 다를 수 있고, 데이터 세트의 변동성을 야기할 수 있지만, 일반적인 부정적인 추세가 배양 일수가 증가함에 따라 약 10일에 데이터의 시각적 단계 변화와 함께 보일 수 있다. 이전의 데이터는, 대부분의 흉선세포가 총세포수의 감소와 비교할 때 배양 기간 초기에 고갈된다는 점을 보였다. 배양된 조직 샘플은 이어서 예를 들어 조직간 변동성을 평가하기 위해 시간 경과 연구에서 분석될 수 있다. 설명의 목적으로, 흉선 조직간 변동성을 평가하기 위해 프로세스가 설명될 것이다. 이는 흉선 상피 세포 및 흉선세포의 평가를 포함할 것이다. 흉선 간 변동성 단계에서 수득된 데이터는 계층적 클러스터 분석을 받게 될 것이다. 데이터의 훈련 세트가 설정되고 이어서 배양된 흉선 조직의 그룹 별 분석이 결정될 것이다. 이러한 데이터는 조직의 강제 분해 연구 및/또는 부정적 임상적 결과를 갖는 탈락 표본과 연관된 데이터 세트와의 그룹별 측정을 비교함으로써 수득된 데이터와 비교될 것이다.
조직의 일반적인 외관 및 그 결과 조직학 슬라이드는 배양된 흉선 조직에 대한 선택된 배양 기간의 경과에 따라, 예를 들어 제0일, 제5일, 제9일, 제12일 및 제21일에서 변경된다. 다시, 배양된 흉선 조직의 예시에서, 흉선세포가 배양된 흉선 조직으로부터 씻겨 나감에 따라 그러하다. 제5일, 제9일, 제12일 및 제21일에서 조직은, 흉선 상피 세포에 대한 프로파일과 더 유사한 프로파일 및 통합 밀도의 현저한 감소를 나타낸다. 원형도가 매우 높은 세포의 수는 배양 프로세스 전반에 걸쳐 시간이 지남에 따라 감소한다. 이는 세포자멸사로 인해 덜 원형인 핵이 초래될뿐 아니라 매우 원형인 흉선세포는 씻겨 나가기 때문일 것이다. 원형도가 더 낮은 제0일에서의 샘플의 경우에서는, 이는 단일 핵보다 원형도가 더 낮은 단일의 개체로서 측정되는 흉선 세포의 응집 때문일 수 있다. 제0일에, 높은 둘레를 가진 세포가 많은 비율로 존재하며, 이는 프로그램에서 단일 형상으로 읽힌 세포의 덩어리로 인해 큰 둘레값을 야기하기 때문일 수 있다. 둘레의 증가는 배양 시간에 걸쳐 세포자멸사를 겪는 세포뿐 아니라 흉선세포가 씻겨나가고 그 일로 인해 결과적으로 둘레가 증가하는 것의 조합일 가능성이 있다. 전반적으로, 배양 시간에 걸친 핵 특징은 추세에 대한 이론적인 기대와 일치한다. 대부분의 명백한 데이터 쉬프트는 예정된 로트 출시일 이전이다. 이는 배양 초기 동안 많은 변화가 발생하고, 그 후 환경이 최대 21일 동안 지속될 수 있음을 시사한다. 이는 세포 집단에서 진정한 추세 및 시간에 따른 이들의 변화 방식을 검출하는 검정을 지원한다.
흉선 간 변동성은 샘플이 흉선 사이에 유사한지 더 잘 이해하기 위해 검사된다. 흉선 간 변동성은 검사된 샘플이 하루에 나오는 흉선내 변동성과 유사한 방식으로 평가될 수 있지만, 단일 흉선으로 제한되는 대신 평가는 로트 전체의 샘플을 포함한다. 각 샘플의 유클리드 거리는 단리된 데이터 세트 내 모든 샘플의 중심점까지 계산될 수 있다. ANOVA가 이어서 흉선 중심까지의 거리에서 수행된다. 이러한 분석은 제5일 및 제9일에 샘플에서 수행된다. 흉선 간 변동성은 샘플이 흉선 사이에 유사한지 더 잘 이해하기 위해 검사될 수 있다. 흉선 당, 매일 95퍼센트 신뢰구간이 생성된다. 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직 유래 생성물을 특징화하는 것을 돕도록 흉선 상피 세포만의 더 구체적인 분석이 수행된다. 흉선 상피 세포는 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래 생성물의 작용 메커니즘에 중요한 것으로 가정된다. 병리학자는 흉선 상피 세포로서 동정된 세포의 핵을 선택한다. 흉선 상피 세포의 핵은 조직 집단의 다른 세포와 상이하다. TEC는 일반적으로 더 크고, 핵소체가 존재하며, 이는 밝은 보라색 외부핵의 중심 내에 더 짙은 보라색 점으로서 나타난다. 알려진 표시된 세포는 이어서 소프트웨어에서 개별 데이터 포인트로서 추출된다. 이 데이터를 이용하여, 다음 단계를 순차적으로 수행할 수 있도록 필터를 고안할 수 있다. 2개의 크기 필터는 결합된 세포의 분할 전과 후 모두 크기 범위 창 밖에 있는 임의 세포를 제거한다. 하기의 필터링 단계가 수행되었다.
가장 어두운 세포는 가장 어두운 픽셀 아래의 포함 임계값을 정의함으로써 데이터세트에서 제거된다. 이어서, 면적이 50 μm2 미만인 세포는 제거된다. 구멍이 채워지고, 결합된 세포들을 분할하기 위해 유역이 적용된다. < 0.75의 원형도 및 30-250 μm2의 범위를 벗어난 세포가 이어서 데이터세트에서 필터링된다. 상기의 필터는 TEC 세포를 특성화하기 위해 생성되고 제한된 데이터 세트로 이미지의 분석을 허용한다. 배양 기간 동안 조직에 있는 세포의 총 비율을 검사할 때, TEC는 일반적으로 증가한다. TEC의 증가는 흉선세포가 조직에서 씻겨 나감에 따라 더 많은 수의 잔류 세포는 TEC이기 때문이다. 전술한 TEC 분석은 또한 배양 기간 동안 조직에서 씻겨져 나간 흉선 세포의 더 나은 경향을 제공한다. 유사 분석은, TEC의 비율이 증가함에 따라 배양 과정 동안 흉선세포 수가 감소한다는 데이터로부터 추론될 수 있다. 전술한 데이터이 그룹으로 쪼개진 샘플을 나타내는데 사용될 수 있다. 그룹은 계층적 클러스터 분석을 통해 생성된다. 이 분석은 유사성을 기반으로 한 데이터를 반복적으로 그룹화하여 유사한 특성의 의미있는 데이터 클러스터("그룹"으로 칭함)를 도모함으로써 유사한 특징을 가진 샘플을 체계적이고 통계적으로 식별한다. 세포의 그룹화 프로세스는 하기의 단계를 필요로 하였다:
그룹 간의 거리가 계산된다. 거리는 그룹간 유사성의 척도이다. 두 그룹을 결합하는 비용이 계산된다. 여기에서 비용은 그 그룹에 가입하는 것에 의한 추가되는 오류의 양이다. 가장 적은 병합 비용을 가진 그룹이 결합된다. 모든 데이터가 하나의 그룹으로 결합될 때까지 프로세스는 반복된다. 결과 데이터 세트는 필수적으로 샘플이 서로 얼마나 "관련되어 있는지" 또는 유사한지에 대한 가계도를 보여준다. 가지 사이의 높이는 두 그룹이 서로 얼마나 관련되어 있는지를 보여준다. 가로 x축의 거리는 그래프로 표시될 때 더 가까운 관계를 나타내지 않는다. 각 그룹 내 샘플은 통계학적으로 유사한 것으로 간주되는 반면, 다른 그룹에서의 샘플은 통계학적으로 상이한 것으로 간주된다.
상이한 그룹들 사이에 컷 높이의 위치를 확인하기 위해, Scree 플롯이 이용되어 그룹 간의 거리가 가장 중요한 위치를 조사할 수 있다. 이는 샘플 간의 최소 차이가 알고리즘에 과도한 영향을 미치지 않음을 보증한다. 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래 생성물에 있어서 샘플은 실제보다 함께 클러스터링하기에는 너무 유사해야 하기 때문에, 차이가 너무 적으면 미래 샘플이 독립적인 그룹으로 분리될 가능성이 더 커진다. 대안적으로, 샘플 간 차이가 존재하는 것을 확보하기 위해 그룹에 적절한 컷 오프가 있어야 한다. 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래 생성물의 경우, 조직의 특성 및 그 자체로 나타날 수 있는 로트-대-로트 변동성으로 인해 비균질성이 높을 가능성이 있다. 이전에 긍정적인 임상 결과(여기서는 생존에 의해 정의됨)를 나타낸 샘플을 검사하고, 분해된 조직과 비교함으로써, 적절한 수준의 분화를 결정할 수 있다.
임상 결과에 관한 대부분의 정보를 포함하는 훈련 세트가 선택될 수 있다. 처음에는, 다양한 대표적인 R&D 연구와 여러 강제 분해 조건 및 임상 샘플로부터의 샘플이 포함된다. 이들 데이터는 양호 그룹 및 불량 그룹으로 클러스터링될 수 있다. 훈련 세트는 로트 출시를 위해 검사되는 향후의 프로세스 중인 샘플을 대표하는 공지의 "양호" 및 공지의 "불량" 샘플로 제한되는 경우 가장 유용한 정보를 주는 것으로 여겨질 수 있다. 이 단계는 하기의 방식으로 샘플을 제한한다.
샘플은 배양 기간의 중간 지점 또는 제5일-제9일로부터의 것이 아닌 경우 제거될 수 있다. 동종이형 배양된 흉선 조직-유래 조직의 예에서, 이는 정량적 조직학에 기반한 로트 출시를 위한 프로세스 중인 샘플이 취해질 수 있는 경우이다. 샘플은 또한 대표적인 것이라고 여겨지지만 검사할 관련 임상 결과가 없는 R&D 로트의 것인 경우 제거될 수 있다. 더욱이, 샘플은 부정적인 임상 결과와 관련되는 경우 제거될 수 있다. 샘플은 또한 직교 방법으로 분해를 확인할 수 없는 경우 강제 분해 부문으로부터 제거될 수 있다.
기본 데이터는 그룹화되어 다양한 클러스터에서 어떤 기본 특징이 일어나는지 더 잘 이해할 수 있다. 그룹이 긍정적인 임상 결과, 및 부정적 임상 결과와 연관된 강제 분해 샘플 및/또는 조직과 연관될 수 있다. 상이한 매개변수는 강제 분해된 샘플 및/또는 부정적인 임상 결과로부터 긍정적인 임상 결과(예, 중간 크기의 영역, 높은 원형도, 및 높은 둘레)를 가진 그룹의 차별화를 유도할 수 있다.
예를 들어, 그룹은 큰 둘레, 높은 통합 밀도, 및 높은 면적과 낮은 원형도를 가진 핵의 큰 비율을 특징으로 할 수 있다. 이는 소프트웨어에 의해 독립적인 세포로서 판독할 수 없는 핵의 덩어리의 존재 때문일 수 있다. 이는 배양 기간 초기에 더 많은 수의 흉선세포가 존재하는 조직에서 더 많이 발생할 수 있다.
긍정적인 임상적 결과를 갖는 추가의 그룹이 정의될 수 있다. 예를 들어, 상기 그룹은 다른 그룹 및/또는 중간-범위의 통합 밀도와 비교시, 원형도 값이 더 높고 및/또는 면적이 더 높은 많은 수의 세포를 갖는 것으로 지정될 수 있다. 이들 값은 배양 기간의 중간-범위에서 건강한 생존가능한 조직에 있어서 기대된다. 면적, 원형도, 통합 밀도 및 둘레의 측정의 히스토그램이 데이터로부터 구성될 수 있다.
비교를 위해, 제5일 및 제9일에 샘플을 제거하기 전에 샘플을 다시 흉선 기관 배지(TOM)에 넣은 강제 분해 연구가 수행될 수 있다. 이는 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래 생성물이 프로세스 조건의 변화에 얼마나 강건한지 보여준다. 모든 배양 조건이 사용된 임의의 측정을 통해 검출될 수 있는 분해를 야기할 수 있는 것은 아니다. 이러한 조건은 조직이 기능하지 않거나 생존하지 않는 지점까지 영구적으로 손상을 입히지 않는다고 여겨진다. 분해된 샘플에서 예상되는 바와 같이, 원형도가 낮고 면적이 작고 둘레가 높은 세포가 많은 비율로 존재한다. 이것은 더이상 생존력을 유지할 수 없기 때문에 형태가 변하고 가장자리가 주름지면서 축소되는 세포를 나타낸다. 그룹 내 유사성을 보여주기 위해, 각 그룹의 변동성 분석을 조사한다; "양호" 및 "불량"(통과 대 탈락) 분류가 결정될 수 있다. 상기의 단계를 이용하여, 통과 및 탈락 특징과 연관된 조직 표본의 분석이 평가될 수 있다.
실시예
동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래 생성물(예, "RVT-802")는 전형적으로 수용자에게 이식 전 12일 내지 21일 전에 배양된다. 이 배양 기간은 역사적으로 조직 조작 생성물의 이식 후 긍정적인 임상 결과를 도모하는 것으로 입증되었다. 이론에 얽매이지 않고, 이 배양 기간은 세포자멸사를 통해 또는 조직 밖으로 흉선세포를 씻겨냄으로써 조직에서 흉선세포를 고갈시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 흉선 상피 세포는 배양 기간 동안 유지된다.
검증된 검정은 배양 5-9일 사이에 채취된 샘플을 조사하여 배양된 흉선 조직의 방출에 대한 적합성을 평가한다. 생성물을 더 잘 이해하고 검정의 식별 능력을 더 잘 평가하는 것을 돕기 위해, 샘플은 제1일 내지 제21일 이후까지 수집한 소프트웨어 프로그램을 통해 작동시키고, 결과 데이터를 서로 비교하여 어떤 경향이 명백했는지 평가했다.
도 14a-14d는 임상 배양된 흉선 조직 샘플(도 14a-14c)의 3개의 뱃치 및 분해된 흉선 조직 샘플을 나타낸다. 도 14a에 나타낸 샘플에 대한 면적, 둘레, 통합 밀도 및 원형도의 네가지 특징은 하기였다: 면적=11.34; 원형도 = 0.696; 둘레 = 14.310 및 통합 밀도 = 1889.2. 도 14b에 나타낸 샘플에 대한 면적, 둘레, 통합 밀도 및 원형도의 네가지 특징은 하기였다: 면적=11.41; 원형도 = 0.993; 둘레 = 11.982 및 통합 밀도 = 1912.4. 도 14c에 나타낸 샘플에 대한 면적, 둘레, 통합 밀도 및 원형도의 네가지 특징은 하기였다: 면적=10.53; 원형도 = 0.846; 둘레 = 12.510 및 통합 밀도 = 1707.4. 도 14d에 나타낸 샘플에 대한 면적, 둘레, 통합 밀도 및 원형도의 네가지 특징은 하기였다: 면적=13.0; 원형도 = 0.352; 둘레 = 21.556 및 통합 밀도 = 1786.0. 각 이미지에서 단일 핵은 원으로 식별된다.
검출된 핵 수의 전반적인 추세는 조사되며, 이는 흉선세포가 조직에서 씻겨나가거나 세포자멸사를 겪으면서 시간이 지남에 따라 감소될 것으로 예상된다. 이들 데이터는 다수의 로트로부터의 다른 슬라이스가 다른 날에 조사되었으므로 조직 면적에 대해 정규화되었고; 조직 섹션 크기는 슬라이스 간에 다를 수 있고, 데이터 세트의 변동성을 야기할 수 있지만, 일반적인 부정적인 추세가 배양 일수가 증가함에 따라 약 10일에 데이터의 시각적 단계 변화와 함께 보였다. 이전의 데이터는, 대부분의 흉선세포 고갈이 하기에 나타낸 총세포수의 감소와 비교할 때 배양 기간 초기라는 점을 보였다.
실시예 1: 배양된 흉선 조직의 시간 경과 연구
조직의 일반적인 외관 및 그 결과 조직학 슬라이드는 배양 기간의 경과에 따라 변한다. 도 16a-b, 17a-b, 18a-b, 19a-b, 및 20a-b에 제시된 이미지는 다양한 시간 간격에서 즉, 제0일, 제5일, 제9일, 제12일 및 제21일에서 H&E 염색된 슬라이드에서 배양된 흉선 조직의 외관 차이를 보여준다. 이미지는 40배 확대로 제시된다. 이들 이미지 및 추가 분석을 위해 선택된 날들은 제작 공정 관점에서 중요한 것으로 확인된 날이다. 제0일은 들어오는 조직을 나타낸다. 제0일에서의 조직학은 신원 확인 목적으로 취해진다. 제0일 및 제5일-제9일 조직학 샘플 모두는 포르말린으로 고정하고, 파라핀 포매 및 절개를 위해 병리학 실험실로 가져간다. 절편을 염색하고 위원회 인증 병리학자에 의해 평가되었다.
도 21a-21e는 제0일, 제5일, 제9일, 제2일 및 제21일에 H&E 염색된 배양된 흉선 조직의 이미지로, 제0일, 제5일, 제9일, 제12일 및 제21일에 핵의 모습 변화를 나타낸다. 도 21a는 높은 비율의 핵이 많은 수의 흉선세포를 내비치는 더 높은 통합 밀도를 갖는 것을 보여준다. 흉선세포가 조직에서 씻겨져 없어짐에 따라, 제5일(도 21b), 제9일(도 21c), 제12일(도 21d) 및 제21일(도 21e)에서 조직은, 흉선 상피 세포에 대한 프로파일과 더 유사한 프로파일 및 통합 밀도의 현저한 감소를 나타낸다.
도 22는 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래 생성물의 기술적 뱃치로부터 통합 밀도 측정의 시간 경과를 보여준다. 흉선세포가 조직에서 씻겨져 나감에 따라, 제5일에서 조직은, 흉선 상피 세포에 대한 프로파일과 더 유사한 프로파일 및 통합 밀도의 현저한 감소를 나타낸다. 오차 막대는 평균에서 하나의 S.D.이다.
도 23은 원형도의 측정을 보여준다. 원형도가 매우 높은 세포의 수는 배양 프로세스 전반에 걸쳐 시간이 지남에 따라 감소한다. 이는 세포자멸사로 인해 덜 원형인 핵이 초래될뿐 아니라 매우 원형인 흉선세포는 씻겨 나가기 때문일 것이다. 원형도가 더 낮은 제0일에서의 샘플의 경우에서는, 이는 단일 핵보다 원형도가 더 낮은 단일의 개체로서 측정되는 흉선 세포의 응집 때문일 수 있다. 오차 막대는 평균에서 하나의 S.D.이다.
도 24은 둘레의 측정을 보여준다. 제0일에, 높은 둘레를 가진 세포가 많은 비율로 존재하며, 이는 프로그램에서 단일 형상으로 읽힌 세포의 덩어리로 인해 큰 둘레값을 야기하기 때문일 수 있다. 둘레의 증가는 배양 시간에 걸쳐 세포자멸사를 겪는 세포뿐 아니라 흉선세포가 씻겨나가고 그 일로 인해 결과적으로 둘레가 증가하는 것의 조합일 가능성이 있다. 오차 막대는 평균에서 하나의 S.D.이다.
도25는 조사된 4가지 모든 변수를 고려할 때 2개의 샘플 간 유사성을 측정하기 위해 유클리드 거리(샘플과 대 중심 사이의 오차의 제곱합의 제곱근)를 나타낸다. 참고로, 유클리드 거리가 짧을수록, 두개의 샘플은 서로 더 유사하다. 오차 막대는 평균에서 하나의 S.D.이다.
도 26은 데이터의 주요 효과 플롯 및 상호작용 플롯이다. 도 26에 나타낸 데이터는 배양된 흉선 조직이 시간 경과에 따라 유사하게 행동한다는 점을 확인시킨다.
전반적으로, 배양 시간에 걸친 핵 특징은 추세에 대한 이론적인 기대와 일치한다. 대부분의 명백한 데이터 쉬프트는 예정된 로트 출시일 이전이다. 이는 많은 변화가 배양 초기 일 동안 발생하고, 그 후 환경이 최대 21일 동안 지속될 수 있음을 시사한다. 이는 세포 집단에서 진정한 추세 및 시간에 따른 이들의 변화 방식을 검출하는 검정을 지원한다.
실시예 2: 흉선 간 변동성 연구
흉선 간 변동성을 샘플이 흉선 사이에 유사한지 더 잘 이해하기 위해 검사하였다. 흉선 간 변동성을 검사된 샘플이 하루에 나오는 흉선내 변동성과 유사한 방식으로 평가하였지만, 단일 흉선으로 제한되는 대신 평가는 로트 전체의 샘플을 포함한다. 각 샘플의 유클리드 거리는 단리된 데이터 세트 내 모든 샘플의 중심점까지 계산되었다. ANOVA가 이때 흉선 중심까지의 거리에서 수행되었다. 이러한 분석은 제5일 및 제9일에 샘플에서 수행되었다.
흉선 간 변동성을 샘플이 흉선 사이에 유사한지 더 잘 이해하기 위해 검사하였다. 흉선 간 변동성을 검사된 샘플이 하루에 나오는 흉선내 변동성과 유사한 방식으로 평가하였지만, 단일 흉선으로 제한되는 대신 평가는 로트 전체의 샘플을 포함한다. 각 샘플의 유클리드 거리는 단리된 데이터 세트 내 모든 샘플의 중심점까지 계산되었다. ANOVA가 이때 흉선 중심까지의 거리에서 수행되었다. 이러한 분석은 제5일 및 제9일에 샘플에서 수행되었다.
하기 표6으로부터, 제9일에 로트들 간에 검출가능한 차이는 존재하지 않는다. 제5일에 흉선 간에 약간의 통계학적 차이가 존재한다. 이들이 제품 품질에 차이를 초래하는 실제적인 차이를 유발하는지 여부를 판단하기는 어렵다. 이를 다른 방식으로 평가하기 위해, 흉선 당, 매일 95퍼센트 신뢰구간이 생성되었다. 도 27에서 볼 수 있듯이, 뱃치 MFG-058은 제5일에 다른 조직에 대한 신뢰 구간과 겹치지 않지만, 제9일쯤 겹친다. 이 로트는 다른 로트의 대표적인 방식으로 제작되었으며, 어느 날에도 전체 조직학적 검사를 통해 관찰되지 않았다. 이와 같이, 이것은 조직 간 핵 분포에서의 약간의 차이에 대한 방법의 민감성의 인공물일 가능성이 있다.
실시예 3: 흉선 상피 세포 분석
동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직 유래 생성물을 특징화하는 것을 돕도록 흉선 상피 세포만의 더 구체적인 분석이 수행되었다. 흉선 상피 세포는 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래 생성물의 작용 메커니즘에 중요한 것으로 가정된다. 이미지를 병리학자에게 보냈다. 병리학자는 흉선 상피 세포로서 동정된 세포의 핵을 선택하였다(도 28a-b 참조). 흉선 상피 세포의 핵은 조직 집단의 다른 세포와 상이하다. TEC는 일반적으로 더 크고, 핵소체가 존재하며, 이는 도 28a-b에서 밝은 보라색 외부핵의 중심 내에 더 짙은 보라색 점으로서 나타난다.
알려진 표시된 세포는 이어서 소프트웨어에서 개별 데이터 포인트로서 추출되었다. 이 데이터를 이용하여, 다음 단계를 순차적으로 수행할 수 있도록 필터를 고안했다. 2개의 크기 필터는 결합된 세포의 분할 전과 후 모두 크기 범위 창 밖에 있는 임의 세포를 제거한다. 하기의 필터링 단계가 수행되었다.
가장 짙은 세포를 가장 짙은 픽셀(염색 강도에 따라 100-130 내지 150-180 픽셀 강도의 픽셀을 포함) 미만의 포함 임계값을 정의함으로써 데이터세트로부터 제거하였다.
이어서, 면적이 50 μm2 미만인 세포는 제거되었다.
구멍을 채웠고, 결합된 세포들을 분할하기 위해 유역이 적용되었다.
< 0.75의 원형도 및 30-250 μm2의 범위를 벗어난 세포가 데이터세트에서 필터링된다.
상기의 필터는 TEC 세포를 특성화하기 위해 생성되고 제한된 데이터 세트로 이미지의 분석을 허용하였다. 배양 기간 동안 조직에 있는 세포의 총 비율을 검사할 때, TEC는 일반적으로 증가한다. TEC의 증가는 흉선세포가 조직에서 씻겨 나감에 따라 더 많은 수의 잔류 세포는 TEC이기 때문이다. 이러한 변화는 도 30(H&E 슬라이드로부터의 전체 세포수에 대한 TEC의 비율)에서 시각화될 수 있다. 이러한 결정은 또한 TEC가 생성물의 효능에 필요한 것처럼 배양 기간 동안 내내 유지된다는 점을 보여준다. 동일 경향이 도 31에 나타낸 바와 같이 조직 면적에 대해 정규화했을 때 보일 수 있다. 분석 세트에서 TEC를 분류하고 추출하기 위한 데이터는 하루에 하나의 샘플에서 수행되었으며, 샘플간 변동성에 따라 달라진다.
실시예 4: 흉선세포 분석
실시예 3의 TEC 분석은 또한 배양 기간 동안 조직에서 씻겨져 나간 흉선 세포의 더 나은 경향을 제공한다. 흉선세포에 대해서 유사한 분석을 수행하지 않았지만, 위의 데이터로부터 TEC의 비율이 증가함에 따라 배양 과정 동안 흉선세포수가 감소됨을 유추할 수 있다. 이러한 변화는 또한 여러 배율로 H&E 염색된 슬라이드의 이미지에서도 시각화될 수 있다(예, 도 16 내지 21 참조). 이들 이미지에서 흉선세포는 더 작은 짙은 보라색 핵이다. 도 16a 및 16b의 제0일 이미지에서, 수많은 이미지가 존재하고, 제5일즈음에는 도 17a 및 17b에서 나타낸 바와 같이 현저한 감소가 존재한다. 이는 L-Selectin, 흉선세포 마커(REP-016)의 사이토카인 및 케모카인 분석에서뿐 아니라 수많은 병리학 보고서에서 언급되어져 있다. 전반적인 데이터 경향은 또한 앞서 논의된 바와 같은 정량적 분석을 이용한 이 분석에 동의한다.
실시예 5: 계층적 클러스터 분석
실시예 1-4에 제시된 데이터는 도 32에 나타낸 바와 같이 4개의 그룹으로 분할된 샘플을 보여준다. 도 32에 나타낸 그룹은 계층적 클러스터 분석을 통해 생성되었다. 이 분석은 유사성을 기반으로 한 데이터를 반복적으로 그룹화하여 유사한 특성의 의미있는 데이터 클러스터("그룹"으로 칭함)를 도모함으로써 유사한 특징을 가진 샘플을 체계적이고 통계적으로 식별한다. 세포의 그룹화 프로세스는 하기의 단계를 필요로 하였다:
그룹 간의 거리가 계산된다. 거리는 그룹간 유사성의 척도이다.
두 그룹을 결합하는 비용이 계산된다. 여기에서 비용은 그 그룹에 가입하는 것에 의한 추가되는 오류의 양이다.
가장 적은 병합 비용을 가진 그룹이 결합된다.
모든 데이터가 하나의 그룹으로 결합될 때까지 프로세스는 반복된다.
결과 데이터 세트는 필수적으로 샘플이 서로 얼마나 "관련되어 있는지" 또는 유사한지에 대한 가계도를 보여준다. 가지 사이의 높이는 두 그룹이 서로 얼마나 관련되어 있는지를 보여준다. 가로 x축의 거리는 더 가까운 관계를 나타내지 않는다. 이에 대한 설명을 위해 도 32를 참조한다. 도 32는 그룹 "C" 및 "D" 사이의 거리를 예로서 나타낸 클러스터 덴드로그램이다. 하이라이트된 녹색 및 적색 박스는 단일 그룹을 나타낸다. 이는 컷오프 y축 높이 0.43을 기반으로 한다. 이 예에서, 그룹 C 및 D는 거리가 0.6이므로, 두 개의 개별 그룹으로 간주된다. 각 그룹 내 샘플은 통계학적으로 유사한 것으로 간주되는 반면, 다른 그룹에서의 샘플은 통계학적으로 상이한 것으로 간주된다.
상이한 그룹들 사이에 컷 높이의 위치를 확인하기 위해, 스크린 플롯이 이용되어 그룹 간의 거리가 가장 중요한 위치를 조사할 수 있다. 이는 샘플 간의 최소 차이가 알고리즘에 과도한 영향을 미치지 않음을 보증한다. 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래 생성물에 있어서 샘플은 실제보다 함께 클러스터링하기에는 너무 유사해야 하기 때문에, 차이가 너무 적으면 미래 샘플이 독립적인 그룹으로 분리될 가능성이 더 커진다. 대안적으로, 샘플 간 차이가 존재하는 것을 확보하기 위해 그룹에 적절한 컷 오프가 있어야 한다. 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래 생성물의 경우, 조직의 특성 및 그 자체로 나타날 수 있는 로트-대-로트 변동성으로 인해 비균질성이 높을 가능성이 있다. 이전에 긍정적인 임상 결과(여기서는 생존에 의해 정의됨)를 나타낸 샘플을 검사하고, 분해된 조직과 비교함으로써, 적절한 수준의 분화를 결정할 수 있다.
실시예 6: 훈련 세트 결정
바람직한 구현예에서, 임상 결과에 관한 대부분의 정보를 포함하는 훈련 세트가 선택되었다. 처음에는, 다양한 대표적인 R&D 연구와 여러 강제 분해 조건 및 임상 샘플로부터의 샘플이 포함되었다. 이는 많은 양호 및 불량 그룹이 포함된 클러스터링 분석을 도모하였다(도 33 참조). 검정의 추가 개발 후, 훈련 세트는 로트 출시를 위해 검사되는 향후의 프로세스 중인 샘플을 대표하는 공지의 "양호" 및 공지의 "불량" 샘플로 제한되는 경우 가장 유용한 정보를 주는 것으로 결정되었다. 이는 하기의 방식으로 샘플을 제한한다.
샘플은 배양 기간의 중간 지점 또는 제5일-제9일로부터의 것이 아닌 경우 제거되었다. 이는 정량적 조직학에 기반한 로트 출시를 위한 프로세스 중인 샘플이 취해지는 경우이다.
샘플은 또한 대표적인 것이라고 여겨지지만 검사할 관련 임상 결과가 없는 R&D 로트의 것인 경우 제거되었다.
샘플은 부정적인 임상 결과와 관련되는 경우 제거되었다. 이 샘플은 사용 중인 정성적 조직 검정을 기반으로 시설로부터 방출되었기 때문에 "불량"인 것으로서 여겨지지 않았으며, 로트 자체가 임상 결과의 원인이라고 여겨지는 사례는 없다. 이러한 사례는 이것들이 작동했다는 확실한 증거가 존재하지 않기 때문에 제거되었다.
샘플은 또한 직교 방법으로 분해를 확인할 수 없는 경우 강제 분해 부문으로부터 제거되었다. 이들 샘플은 사이토카인 및 케모카인에 대해 조사된 소비된 배지 샘플뿐 아니라 병리학자에 의해 조사되었고, 다른 방법에 의해 "불량"으로 확인되지 않은 임의의 샘플은 최종 훈련 세트에서 제외되었다. 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래 생성물은 다양한 조건에 견디는 것으로 나타났으며, 여전히 "양호" 조직을 도모할 가능성이 있는 경우에 대해 검출하기 위해 분석이 왜곡되어서는 안된다. 분석 세트에 남아 있는 조건은 -20℃에서 동결되거나, 배지를 10XPBS로 대체한 샘플로부터의 것이었다. 분해 조건 및 결과의 전체 목록은 표 7을 참조한다.
최종 훈련 세트에 사용된 나머지 샘플은 1년 생존율을 보인 임상 사례의 샘플이거나 분해된 R&D 조직인 것으로 확인된 사례의 샘플이었다. 결과의 클러스터는 도 33에 나타내어진다.
이는 처음에는 5개의 클러스터, 임상적으로 양호한 샘플이 있는 4개의 클러스터, 및 확인된 불량 샘플이 있는 1개의 클러스터를 야기하였다. 양호 클러스터 중 하나는 2개의 샘플만 함유하였다; 이것은 그 자체 내에서 높은 변동성을 가지지 않았기 때문에, 따라서 모델에 대한 레버리지는 쉬프트를 유발할 수 있었다. 따라서, 새 샘플이 검사될 때, 이들 두 개의 샘플은 다른 클러스터를 이동시켜 해당 샘플을 적절하게 그룹화할 수 있게 할 것이다. 이를 테스트하기 위해, 각 샘플의 체계적인 제거 및 후속적인 재-클러스터링을 조사하였다. 이들 샘플 중 하나가 단리되면, 결과의 샘플이 쉬프트하게 되는 것으로 밝혀졌다. 이와 같이, 이들 샘플은 제거되었다. 이것에 의해, 이들 두 조직과 유사한 추가적인 샘플을 독립적으로 클러스터링할 수 있지만, 전체적인 결과는 비교할 수 있는, 보다 강력한 알고리즘 및 훈련 세트가 될 것으로 판단되었다. 이들 샘플은 데이터 세트가 확장할 수 있을 때 나중에 버킷을 재평가하기 위해 향후의 샘플과 함께 사용될 수 있다. 소프트웨어에서 검증된 최종 훈련 라이브러리는 도 34에 묘사되어 있다.
실시예 7: 그룹별 분석
도 34에 묘사된 네 그룹에 대한 기본 데이터를 조사하여, 기본 특징이 다양한 클러스터에서 무엇을 도모하는지 더 잘 이해하고자 했다. 그룹은 그룹 1, 2, 3 및 4로서 지칭될 것이다. 도 32의 상기 덴드로그램은 각 클러스터에 속한 그룹 명을 맵핑하였지만, 추가 참조를 위해 그룹 1, 2 및 3은 긍정적인 임상 결과를 가진 샘플의 것이고, 그룹 4는 강제 분해 샘플을 포함한다. 각 그룹의 조직으로부터의 대표적인 이미지를 도 35a-35d에 나타낸다. 도 35a-35d는 최종 샘플 라이브러리의 각 클러스터 그룹에 대한 대표 이미지를 나타낸다. 그룹 1(도 35a), 2(도 35b), 및 3(도 35c)은 임상 결과가 긍정적인 샘플을 포함한다. 그룹 4(도 35d)는 확인된 분해된 샘플을 포함한다. 그룹 1 샘플은 LOT-345의 것, 그룹 2 샘플은 LOT-160의 것, 그룹 3 샘플은 LOT-194의 것이고, 그룹 4 샘플은 FD.SP17-40348-C1.1의 것이다(분해 방법: -20℃에서 동결).
서로 옆에 있는 모든 클러스터의 그래픽 표현은 도 36a-36d에 나타낸다. 도 36a는 면적 측정에 대한 데이터 클러스터의 그래픽 표현이다. 도 36b는 원형도 측정에 대한 데이터 클러스터의 그래픽 표현이다. 도 36c는 통합 밀도 측정에 대한 데이터 클러스터의 그래픽 표현이다. 도 36d는 둘레 측정에 대한 데이터 클러스터의 그래픽 표현이다.
도 36a-36d는 최종 샘플 라이브러리의 각 클러스터 그룹에 대한 대표 이미지를 나타낸다. 그룹 1, 2, 및 3은 임상 결과가 긍정적인 샘플을 포함한다. 그룹 4는 확인된 분해된 샘플을 포함한다. 그룹 1 샘플은 LOT-345의 것, 그룹 2 샘플은 LOT-160의 것, 그룹 3 샘플은 LOT-194의 것이고, 그룹 4 샘플은 FD.SP17-40348-C1.1의 것이다(분해 방법: -20℃에서 동결).
도 36a-36d에 플롯팅된 데이터에 의해 알 수 있듯이, 상이한 매개변수는 긍정적인 임상 결과(예, 중간 크기의 영역, 높은 원형도, 및 높은 둘레)를 가진 그룹의 차별화를 유도할 수 있다. 강제 분해 샘플은 또한 그래프의 적색 바로 나타내어진 것처럼 많은 방식으로 다른 그룹과 현저하게 상이하다. 이 데이터는 양호한 임상 결과를 도모하는 다수의 데이터 세트가 존재한다는 점을 입증한다. 현재 데이터 세트에 캡처되지 않아 어떠한 그룹에도 클러스터링되지 않는 샘플이 양호 또는 불량으로 나타날 수 있는 다른 방법이 존재할 수 있다.
그룹 1. 그룹 1은 가장 큰 클러스터이다. 이것은 긍정적인 임상 결과를 갖는 19가지의 상이한 조직을 포함한다. 그룹 1은 큰 둘레, 높은 통합 밀도, 및 높은 면적과 낮은 원형도를 가진 핵의 큰 비율을 특징으로 한다. 이는 소프트웨어에 의해 독립적인 세포로서 판독할 수 없는 핵의 덩어리의 존재 때문일 수 있다. 이는 배양 기간 초기에 더 많은 수의 흉선세포가 존재하는 조직에서 더 많이 발생할 수 있다. 블라인드 연구를 실행하였을 때, 제0일 조직의 샘플은 그룹 1로 클러스터링되어 상기 이론을 뒷받침한다. 이 분석이 많은 수의 흉선 세포가 존재하는 조직을 거부하는 것으로 보이지는 않지만, 그룹 1의 샘플은 배양 기간 말미에 이식했을 때 긍정적인 임상 결과를 보였다.
도 37는 하이라이트된 면적-10(적색), 원형도-0.9(녹색), 둘레-18(청색) 및 통합 밀도-1500(황색) 내 특징을 가진 그룹 1의 이미지이다. 이들 그룹은 일반적으로 그룹 간 가장 큰 변동을 보인다.
도 38은 그룹 1의 세포의 면적 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 39는 그룹 1의 세포의 원형도 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 40는 그룹 1의 세포의 통합 밀도 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 41는 그룹 1의 세포의 둘레 측정을 나타내는 히스토그램이다.
그룹 2.
그룹 2는 긍정적인 임상 결과를 갖는 조직의 10개의 로트를 함유한다. 그룹 2 및 3은 모두는 높은 원형도 값을 가진 세포 비율이 높다. 그룹 2는 또한 그룹 3 및 4와 비교시 면적이 더 높고, 통합 밀도는 중간 범위인 세포를 갖는 것으로 보인다. 이들 값은 그룹 2를 형성하는 샘플에 의해 나타내어진 것과 같이 배양 기간의 중간-범위에서 건강한 생존가능한 조직에 대해서 기대된다. 면적, 원형도, 통합 밀도 및 둘레의 측정의 히스토그램을 도 43-46에 나타낸다.
도 42는 하이라이트된 면적-10(적색), 원형도-0.9(녹색), 둘레-18(청색) 및 통합 밀도-1500(황색) 내 특징을 가진 그룹 2의 이미지이다. 이들 그룹은 일반적으로 그룹 간 가장 큰 변동을 보인다.
도 43은 그룹 2의 세포의 면적 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 44는 그룹 2의 세포의 원형도 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 45는 그룹 2의 세포의 통합 밀도 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 46는 그룹 2의 세포의 둘레 측정을 나타내는 히스토그램이다.
그룹 3.
그룹 3은 긍정적인 임상 결과를 보인 6개의 로트를 포함한다. 그룹 2와 마찬가지로, 그룹 3은 흉선세포 및 전반적인 세포 생존력을 모두 보여주는, 원형도가 높은 세포의 비율이 크다. 그룹 3은 가장 적은 면적의 세포 비율이 가장 높고, 또한 통합 밀도 범위가 더 낮다(두번째 및 세번째 빈).
도 47. 하이라이트된 면적-10(적색), 원형도-0.9(녹색), 둘레-18(청색) 및 통합 밀도-1500(황색) 내 특징을 가진 그룹 3의 이미지이다. 이들 그룹은 일반적으로 그룹 간 가장 큰 변동을 보인다.
면적, 원형도, 통합 밀도 및 둘레의 측정의 히스토그램을 도 48-51에 나타낸다.
도 48은 그룹 3의 세포의 면적 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 49는 그룹 3의 세포의 원형도 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 50는 그룹 3의 세포의 통합 밀도 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 51는 그룹 3의 세포의 둘레 측정을 나타내는 히스토그램이다.
그룹 4.
그룹 4는 4개의 강제 분해된 샘플을 포함한다. 여기에 나타낸 분해 조건은 -20℃에서 4시간 동안 동결시킨 샘플 및 배양 배지를 24시간 동안 10X PBS로 대체한 샘플에 대한 것이다. 이들 조건 양자 모두는 TEC 건강에 대한 바이오마커인 CCL21을 조사할 때 정성적 조직학 당 유의미한 분해 및 유의미한 변화를 나타냈다. 각 방법에 대한 결과 및 모든 강제 분해 조건의 표가 하기에 포함된다.
도 52는 하이라이트된 면적-10(적색), 원형도-0.9(녹색), 둘레-18(청색) 및 통합 밀도-1500(황색) 내 특징을 가진 그룹 4의 이미지이다. 이들 그룹은 일반적으로 그룹 간 가장 큰 변동을 보인다.
면적, 원형도, 통합 밀도 및 둘레의 측정의 히스토그램을 도 53-56에 나타낸다.
도 53은 그룹 4의 세포의 면적 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 54는 그룹 4의 세포의 원형도 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 55는 그룹 4의 세포의 통합 밀도 측정을 나타내는 히스토그램이다.
도 56는 그룹 4의 세포의 둘레 측정을 나타내는 히스토그램이다.
실시예 8: 강제 분해 연구.
제5일 및 제9일에 샘플을 제거하기 전에 샘플을 다시 흉선 기관 배지(TOM)에 넣은 강제 분해 연구를 수행했다. 이는 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래 생성물이 프로세스 조건의 변화에 얼마나 강건한지 보여준다. 샘플을 55℃로 가열하는 것이 현재의 전통적인 조직학 방법에 의해서는 검출될 수 없다는 점을 주목하는 것이 흥미롭다. 이는 조직을 가열하는 것이 조직병리학적 관점에서 본질적으로 이것을 고정시키기 때문일 수 있다. 그러나, 분해는 CCL21 분석을 통해 자명하였다. 테스트된 조건의 대부분은 사용된 임의의 측정을 통해 검출가능할 수 있는 분해를 야기하지 않았다. 이러한 조건은 조직이 기능하지 않거나 생존하지 않는 지점까지 영구적으로 손상을 입히지 않았다고 여겨진다. 생성물이 상기 조건 중 어디에도 노출되지 않도록 하는 프로세스 제어가 존재한다. 분해된 샘플에서 예상되는 바와 같이, 원형도가 낮고 면적이 작고 둘레가 높은 세포가 많은 비율로 존재한다. 이것은 더이상 생존력을 유지할 수 없기 때문에 형태가 변하고 가장자리가 주름지면서 축소되는 세포를 나타낸다. 연구의 강제 분해 조건은 표 7에 나와 있다.
그룹 내 유사성을 보여주기 위해, 각 빈에 대한 변동성 분석을 조사하였다. 그룹 4는 이것 내 샘플 전체에서 빈 내 가장 높은 표준 편차를 정기적으로 보였다. 이는 그 그룹 내 샘플 수가 적기 때문일 수 있는데, 조직이 덜 일관적으로 분해되기 때문에 이것은 예상치 못한 것은 아니다(도 57 참조).
도 57은 빈 별 기반으로 그룹 간 및 그룹 내 변동성 분석의 플롯이다. 데이터는 먼저 그룹별로 x축에 표시되고, 매개변수에 대해서는 빈 별로 표시된다. 각 매개변수에 대한 상단 그래프는 개체이고, 하단은 해당 그룹의 표준 편차이다. 양자 모두를 사용하여 데이터의 확산을 시각화할 수 있다.
약어:
AE1/AE3: 모든 사이토케라틴과 반응하여 상피 세포를 식별하는 2개의 항체의 칵테일.
CD3: 흉선세포를 포함하는 T 세포와 반응하는 항체. CK14: 재증식 가능성이 있는 것으로 가정된 상피 세포의 서브세트에서 세포골격의 성분인 사이토케라틴 14만을 검출하는 항체.
FFPE: 포르말린-고정된 파라핀 포매 조직 절편.
H&E: 포유동물 조직 절편의 광학 현미경에 가장 일반적으로 사용되는 조직학적 염색인 헤마톡실린 및 에오신.
Ki-67: Ki-67 항체는 세포 증식과 연관된 단백질인 Ki-67을 인지한다.
TEC: 흉선 상피 세포.
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전술한 구현예 및 장점은 단지 예시적인 것이며 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 교시내용은 다른 유형의 방법, 시스템 및 분류기, 실험 및 수술 절차에 쉽게 적용될 수 있다. 또한, 본 발명의 구현예에 대한 설명은 예시적인 것이며 청구범위의 범위를 제한하지 않는다. 많은 대안, 수정 및 변형이 당업자에게 명백할 것이다.
본 개시내용이 다양한 구현예를 참조하여 개시되었지만, 이들의 다른 구현예 및 변형은 본 개시내용의 진정한 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 당업자에 의해 고안될 수 있음이 명백하다. 첨부된 청구범위는 모든 이러한 구현예 및 동등한 변형을 포함하는 것으로 해석되도록 의도된다.
전술한 명세서는 당업자가 구현예를 실시할 수 있을 정도로 충분한 것으로 간주된다. 전술한 설명 및 실시예는 특정 구현예를 상세하게 하고, 본 발명자들이 고려한 최상의 모드를 설명한다. 그러나, 전술한 내용이 텍스트로 얼마나 상세하게 나타날지라도, 구현예는 많은 방식으로 실시될 수 있으며 첨부된 청구범위 및 그의 등가물에 따라 해석되어야 한다는 것이 이해될 것이다.
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Claims (60)
- 정량적 조직병리학적 평가를 수행하기 위한 조직 분류기(tissue classifier)를 훈련하는 방법으로서,
슬라이드 이미지를 이진(binary) 슬라이드 이미지로 변환시키는 단계로서, 이때 슬라이드 이미지는 대조 이미지의 라이브러리로부터 선택되고, 대조 이미지의 라이브러리에서 각 슬라이드 이미지는 통과 분류 또는 탈락 분류와 연관된, 단계;
이진 슬라이드 이미지 내에서 하나 이상의 핵을 검출하는 단계;
각 검출된 핵에 대해, 검출된 핵으로부터 특징을 추출하는 단계로서, 이때 특징은 이진 슬라이드 이미지 내 검출된 핵의 속성을 나타내고, 검출된 핵의 면적, 검출된 핵의 둘레(perimeter), 검출된 핵의 통합 밀도, 또는 검출된 핵의 원형도 중 적어도 하나를 포함하는, 단계;
각 검출된 핵에 대해, 특징에 기초하여 이진 슬라이드 이미지와 연관된 특징 지문(feature fingerprint)을 생성하는 단계로서, 이때 특징 지문은 특징 처리로부터 계산된 수치값인, 단계;
이진 슬라이드 이미지를 클러스터에 통합하는 단계로서, 이때 클러스터는 복수의 이미지를 포함하고, 여기서 제1의 복수의 이미지 각각은 상응하는 특징 지문과 연관되고, 통합하는 것은 특징 지문을 상응하는 특징 지문과의 비교를 기반으로 하는, 단계;
컷오프 높이를 클러스터에 적용하여 복수의 그룹을 형성하는 단계로서, 이때 컷오프 높이는 클러스터의 분산 분석의 다변량 분석에 기초하여 복수의 그룹 내 다수의 그룹을 최소화하는, 단계;
복수의 그룹 내 제1 그룹이 통과 분류와 연관된 제1 슬라이드 이미지를 포함하는 경우 상기 제1 그룹을 양성 대조 세트로서 분류하는 단계; 및
복수의 그룹 내 제2 그룹이 탈락 분류와 연관된 제2 슬라이드 이미지를 포함하는 경우 상기 제2 그룹을 음성 대조 세트로 분류하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 조직 분류기가 대상체로의 이식을 위한 조직의 효능 또는 품질을 결정할 수 있는, 방법.
- 제2항에 있어서, 조직이 흉선 조직인, 방법.
- 제3항에 있어서, 조직이 인간 대상체로의 이식을 위한 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래 생성물 슬라이스인, 방법.
- 제4항에 있어서, 인간 대상체가 22q11.2 결실과 연관된 완전 디조지 증후군; 결손, 심장 결함, 후비공폐쇄, 성장 또는 정신 지체, 생식기 형성저하증 및 귀 이상 또는 청각장애 증후군(CHARGE), 또는 포크헤드 박스 단백질 N1(FOXN1) 결핍과 연관된 무흉선증을 앓고 있는, 방법.
- 제2항에 있어서, 조직 분류기가 대조 라이브러리에서의 슬라이드 이미지 내 검출된 핵의 특징 지문을 생성하고 이들의 상응하는 특징 지문을 기초하여 슬라이드 이미지를 클러스터링함으로써 이식을 위해 미지의 조직의 대상체로의 이식을 위한 조직의 효능 또는 품질을 결정하는, 방법.
- 제6항에 있어서, 미지의 조직이 흉선 조직인, 방법.
- 제7항에 있어서, 흉선 조직이 흉선세포의 흉선 조직을 부분적으로 고갈시키기 위해 일정 기간 동안 흉선 기관 배지에서 배양 프로세스에 적용되어진, 방법.
- 제8항에 있어서, 기간이 최대 21일인, 방법.
- 제8항에 있어서, 기간이 약 12일 내지 약 21일인, 방법.
- 제8항에 있어서, 기간이 약 5일 내지 약 9일인, 방법.
- 제8항에 있어서, 배양 프로세스가 흉선 기질의 기능적 구조를 보존하는, 방법.
- 제12항에 있어서, 흉선 기질이 흉선 상피 세포 및 섬유모세포를 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 조직이 혈관 조직, 피부 조직, 간 조직, 췌장 조직, 신경 조직, 비뇨생식기 조직, 위장관 조직, 뼈 및 연골을 포함하는 골격 조직, 지방 조직, 힘줄 및 인대를 포함하는 결합 조직, 양막 조직, 융모막 조직, 경막, 심낭, 근육 조직, 선 조직, 안면 조직, 안조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 특징 지문이 검출된 핵의 면적, 검출된 핵의 둘레, 검출된 핵의 통합 밀도 및 검출된 핵의 원형도의 수치값을 포함하는 측정치로부터 생성되는, 방법.
- 조직의 미분류 슬라이드 이미지의 정량적 조직병리학적 평가를 수행하는 방법으로서,
미분류 슬라이드 이미지로부터 헤마톡실린 채널을 검출하는 단계로서, 이때 헤마톡실린 채널은 조직의 미분류 슬라이드 이미지 내 세포 핵과 연관된, 단계;
검출된 헤마톡실린 채널로부터 특징을 추출하는 단계로서, 이때 특징은 이진 슬라이드 이미지 내 핵의 속성을 나타내고, 핵의 면적, 핵의 둘레, 핵의 통합 밀도, 또는 핵의 원형도 중 적어도 하나를 포함하는, 단계;
특징에 기초하여 미분류 슬라이드 이미지와 연관된 특징 지문을 생성하는 단계로서, 이때 특징 지문은 특징 처리로부터 계산된 수치값인, 단계;
특징 지문을, 하나 이상의 양성 대조 세트와 연관된 제1 지문 세트 및 음성 대조 세트와 연관된 제2 지문 세트와 공동-클러스터링하는 단계로서, 이때 양성 대조 세트(들)는 통과 분류와 연관된 제1 슬라이드 이미지 세트를 포함하고, 음성 대조 세트는 탈락 분류와 연관된 제2 슬라이드 이미지 세트를 포함하는, 단계; 및
공동-클러스터링을 기반으로, 특징 지문은 통과 분류 또는 탈락 분류와 연관되어 있는지 결정하는, 단계를 포함하는, 방법. - 제16항에 있어서, 특징 지문이 대상체로의 이식을 위한 조직의 효능 또는 품질을 결정할 수 있는, 방법.
- 제17항에 있어서, 조직이 흉선 조직인, 방법.
- 제18항에 있어서, 조직이 인간 대상체로의 이식을 위한 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래 생성물 슬라이스인, 방법.
- 제19항에 있어서, 인간 대상체가 22q11.2 결실과 연관된 완전 디조지 증후군; 결손, 심장 결함, 후비공폐쇄, 성장 또는 정신 지체, 생식기 형성저하증 및 귀 이상 또는 청각장애 증후군(CHARGE), 또는 포크헤드 박스 단백질 N1(FOXN1) 결핍과 연관된 무흉선증을 앓고 있는, 방법.
- 제17항에 있어서, 특징 지문이, 대조 라이브러리에서의 슬라이드 이미지 내 검출된 핵의 특징 지문을 생성하고 이들의 상응하는 특징 지문을 기초하여 슬라이드 이미지를 클러스터링함으로써 미지의 조직의 대상체로의 이식을 위한 조직의 효능 또는 품질을 결정하는, 방법.
- 제21항에 있어서, 미지의 조직이 흉선 조직인, 방법.
- 제22항에 있어서, 흉선 조직이 흉선세포의 흉선 조직을 부분적으로 고갈시키기 위해 일정 기간 동안 흉선 기관 배지에서 배양 프로세스에 적용되어진, 방법.
- 제23항에 있어서, 기간이 최대 21일인, 방법.
- 제23항에 있어서, 기간이 약 12일 내지 약 21일인, 방법.
- 제23항에 있어서, 기간이 약 5일 내지 약 9일인, 방법.
- 제23항에 있어서, 배양 프로세스가 흉선 기질의 기능적 구조를 보존하는, 방법.
- 제27항에 있어서, 흉선 기질이 흉선 상피 세포 및 섬유모세포를 포함하는, 방법.
- 제16항에 있어서, 조직이 혈관 조직, 피부 조직, 간 조직, 췌장 조직, 신경 조직, 비뇨생식기 조직, 위장관 조직, 뼈 및 연골을 포함하는 골격 조직, 지방 조직, 힘줄 및 인대를 포함하는 결합 조직, 양막 조직, 융모막 조직, 경막, 심낭, 근육 조직, 선 조직, 안면 조직, 안조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제17항에 있어서, 특징 지문이, 검출된 핵의 면적, 검출된 핵의 둘레, 검출된 핵의 통합 밀도 및 검출된 핵의 원형도의 수치값을 포함하는 측정치로부터 생성되는, 방법.
- 조직의 디지털 이미지 내에서 물체를 분류하기 위한 시스템으로서,
슬라이드 이미지를 이진 슬라이드 이미지로 변환시키기 위한 수단으로서, 이때 슬라이드 이미지는 대조 이미지의 라이브러리로부터 선택되고, 대조 이미지의 라이브러리에서 각 슬라이드 이미지는 통과 분류 또는 탈락 분류와 연관된, 수단;
이진 슬라이드 이미지 내에서 핵을 검출하기 위한 수단;
검출된 핵으로부터 특징을 추출하기 위한 수단으로서, 이때 특징은 이진 슬라이드 이미지 내 검출된 핵의 속성을 나타내고, 검출된 핵의 면적, 검출된 핵의 둘레, 검출된 핵의 통합 밀도, 또는 검출된 핵의 원형도 중 적어도 하나를 포함하는, 수단;
특징에 기초하여 이진 슬라이드 이미지와 연관된 특징 지문을 생성하기 위한 수단으로서, 이때 특징 지문은 특징 처리로부터 계산된 수치값인, 수단;
이진 슬라이드 이미지를 클러스터에 통합하기 위한 수단으로서, 이때 클러스터는 복수의 이미지를 포함하고, 여기서 제1의 복수의 이미지 각각은 상응하는 특징 지문과 연관되고, 통합하는 것은 특징 지문을 상응하는 특징 지문과의 비교를 기반으로 하는, 수단;
컷오프 높이를 클러스터에 적용하여 복수의 그룹을 형성하기 위한 수단으로서, 이때 컷오프 높이는 클러스터의 분산 분석의 다변량 분석에 기초하여 복수의 그룹 내 다수의 그룹을 최소화하는, 수단;
복수의 그룹 내 제1 그룹이 통과 분류와 연관된 제1 슬라이드 이미지를 포함하는 경우 상기 제1 그룹을 양성 대조 세트로서 분류하기 위한 수단; 및
복수의 그룹 내 제2 그룹이 탈락 분류와 연관된 제2 슬라이드 이미지를 포함하는 경우 상기 제2 그룹을 음성 대조 세트로 분류하기 위한 수단을 포함하는, 시스템. - 제31항에 있어서, 시스템이 대상체로의 이식을 위한 조직의 효능 또는 품질을 결정할 수 있는, 시스템.
- 제32항에 있어서, 조직이 흉선 조직인, 시스템.
- 제33항에 있어서, 흉선 조직이 인간 대상체로의 이식을 위한 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래 생성물 슬라이스인, 시스템.
- 제34항에 있어서, 인간 대상체가 22q11.2 결실과 연관된 완전 디조지 증후군; 결손, 심장 결함, 후비공폐쇄, 성장 또는 정신 지체, 생식기 형성저하증 및 귀 이상 또는 청각장애 증후군(CHARGE), 또는 포크헤드 박스 단백질 N1(FOXN1) 결핍과 연관된 무흉선증을 앓고 있는, 시스템.
- 제31항에 있어서, 시스템이 대조 라이브러리에서 슬라이드 이미지 내 검출된 핵의 특징 지문을 생성하고 이들의 상응하는 특징 지문을 기초하여 슬라이드 이미지를 클러스터링함으로써 미지의 조직의 대상체로의 이식을 위한 조직의 효능 또는 품질을 분류하는, 시스템.
- 제36항에 있어서, 미지의 조직이 흉선 조직인, 시스템.
- 제37항에 있어서, 흉선 조직이 흉선세포의 흉선 조직을 부분적으로 고갈시키기 위해 일정 기간 동안 흉선 기관 배지에서 배양 프로세스에 적용되어진, 시스템.
- 제38항에 있어서, 기간이 최대 21일인, 시스템.
- 제38항에 있어서, 기간이 약 12일 내지 약 21일인, 시스템.
- 제38항에 있어서, 기간이 약 5일 내지 약 9일인, 시스템.
- 제38항에 있어서, 배양 프로세스가 흉선 기질의 기능적 구조를 보존하는, 시스템.
- 제42항에 있어서, 흉선 기질이 흉선 상피 세포 및 섬유모세포를 포함하는, 시스템.
- 제31항에 있어서, 조직이 혈관 조직, 피부 조직, 간 조직, 췌장 조직, 신경 조직, 비뇨생식기 조직, 위장관 조직, 뼈 및 연골을 포함하는 골격 조직, 지방 조직, 힘줄 및 인대를 포함하는 결합 조직, 양막 조직, 융모막 조직, 경막, 심낭, 근육 조직, 선 조직, 안면 조직, 안조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 시스템.
- 제36항에 있어서, 특징 지문이 검출된 핵의 면적, 검출된 핵의 둘레, 검출된 핵의 통합 밀도 및 검출된 핵의 원형도의 수치값을 포함하는 측정치로부터 생성되는, 시스템.
- 분류기로서,
미분류 슬라이드 이미지로부터 헤마톡실린 채널을 검출하기 위한 수단으로서, 이때 헤마톡실린 채널은 조직의 미분류 슬라이드 이미지 내 세포 핵과 연관된, 수단;
검출된 헤마톡실린 채널로부터 특징을 추출하기 위한 수단으로서, 이때 특징은 이진 슬라이드 이미지 내 핵의 속성을 나타내고, 핵의 면적, 핵의 둘레, 핵의 통합 밀도, 또는 핵의 원형도 중 적어도 하나를 포함하는, 수단;
특징에 기초하여 미분류 슬라이드 이미지와 연관된 특징 지문을 생성하기 위한 수단으로서, 이때 특징 지문은 특징 처리로부터 계산된 수치값인, 수단;
특징 지문을, 양성 대조 세트와 연관된 제1 지문 세트 및 음성 대조 세트와 연관된 제2 지문 세트와 공동-클러스터링하기 위한 수단으로서, 이때 양성 대조 세트는 통과 분류와 연관된 제1 슬라이드 이미지 세트를 포함하고, 음성 대조 세트는 탈락 분류와 연관된 제2 슬라이드 이미지 세트를 포함하는, 수단; 및
공동-클러스터링을 기반으로, 특징 지문이 통과 분류 또는 탈락 분류와 연관되어 있는지 결정하기 위한 수단을 포함하는, 분류기. - 제46항에 있어서, 시스템이 대상체로의 이식을 위한 조직의 효능 또는 품질을 결정할 수 있는, 분류기.
- 제47항에 있어서, 조직이 흉선 조직인, 분류기.
- 제48항에 있어서, 흉선 조직이 인간 대상체로의 이식을 위한 동종이형 배양된 출생 후 흉선 조직-유래 생성물 슬라이스인, 분류기.
- 제49항에 있어서, 인간 대상체가 22q11.2 결실과 연관된 완전 디조지 증후군; 결손, 심장 결함, 후비공폐쇄, 성장 또는 정신 지체, 생식기 형성저하증 및 귀 이상 또는 청각장애 증후군(CHARGE), 또는 포크헤드 박스 단백질 N1(FOXN1) 결핍과 연관된 무흉선증을 앓고 있는, 분류기.
- 제46항에 있어서, 시스템이 대조 라이브러리에서 슬라이드 이미지 내 검출된 핵의 특징 지문을 생성하고 이들의 상응하는 특징 지문을 기초하여 슬라이드 이미지를 클러스터링함으로써 미지의 조직의 효능을 분류하는, 분류기.
- 제51항에 있어서, 미지의 조직이 흉선 조직인, 분류기.
- 제52항에 있어서, 흉선 조직이 흉선세포의 흉선 조직을 부분적으로 고갈시키기 위해 일정 기간 동안 흉선 기관 배지에서 배양 프로세스에 적용되어진, 분류기.
- 제53항에 있어서, 기간이 최대 21일인, 분류기.
- 제53항에 있어서, 기간이 약 12일 내지 약 21일인, 분류기.
- 제53항에 있어서, 기간이 약 5일 내지 약 9일인, 분류기.
- 제53항에 있어서, 배양 프로세스가 흉선 기질의 기능적 구조를 보존하는, 분류기.
- 제57항에 있어서, 흉선 기질이 흉선 상피 세포 및 섬유모세포를 포함하는, 분류기.
- 제46항에 있어서, 조직이 혈관 조직, 피부 조직, 간 조직, 췌장 조직, 신경 조직, 비뇨생식기 조직, 위장관 조직, 뼈 및 연골을 포함하는 골격 조직, 지방 조직, 힘줄 및 인대를 포함하는 결합 조직, 양막 조직, 융모막 조직, 경막, 심낭, 근육 조직, 선 조직, 안면 조직, 안조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 분류기.
- 제46항에 있어서, 특징 지문이 검출된 핵의 면적, 검출된 핵의 둘레, 검출된 핵의 통합 밀도 및 검출된 핵의 원형도의 수치값을 포함하는 측정치로부터 생성되는, 분류기.
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