BR112020025891A2

BR112020025891A2 - Resistência equilibrada e expressão de gene de avirulência

Info

Publication number: BR112020025891A2
Application number: BR112020025891-1A
Authority: BR
Inventors: Dietmar Stahl; Gabor Miklos Gyetvai; Daniel Fabian Stirnweis
Original assignee: KWS SAAT SE & Co. KGaA
Priority date: 2018-06-18
Filing date: 2019-06-18
Publication date: 2021-03-16
Also published as: WO2019243370A2; EP3584253A1; US20210246463A1; WO2019243370A3

Abstract

a invenção se refere a ácidos nucleicos que codificam proteínas de resistência, proteínas de avirulência, ou ambos, em que pelo menos uma das proteínas inclui uma substituição de aminoácido comparado com a sequência de aminoácidos de tipo selvagem da proteína de resistência e/ou avirulência, a dita substituição levando a uma diminuição na morte celular durante uma reação de hipersensibilidade. além disso, a invenção também abrange um cassete de expressão, um vetor, uma célula, uma planta, tecido de planta ou semente de planta que compreende os ácidos nucleicos ou uma das proteínas. por fim, a invenção fornece um método para aumentar a resistência de uma planta contra pelo menos um patógeno de planta.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "RESISTÊNCIA EQUILIBRADA E EXPRESSÃO DE GENE DE AVIRULÊNCIA". Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se a um ácido nucleico para aumentar a resistência de uma planta ou uma parte da mesma a pelo menos um patógeno, bem como a métodos de uso do ácido nucleico. Antecedentes da Invenção

[002] As plantas possuem um sistema imune inato de duas camadas altamente eficiente que as torna resistentes à maioria dos patógenos microbianos (Jones e Dangl, 2006).

[003] A primeira camada de defesa depende do reconhecimento de padrões moleculares evolutivamente conservados de patógenos ou microbianos (Pathogen-Associated Molecular Patterns, PAMPs ou Microbial-Associated Molecular Patterns, MAMPs) por receptores de reconhecimento de padrões (Pattern Recognition Receptors, PRRs). PAMPs ou MAMPs são estruturas invariantes amplamente representadas entre as taxonomias microbianas e têm papéis essenciais na fisiologia microbiana. Descobriu-se que apenas um grupo extremamente seleto de moléculas funciona como PAMPs (Gaudet e Gray-Owen, 2016). Os PRRs são, de modo geral, receptores na membrana plasmática os quais, muitas vezes, são acoplados a domínios de quinase intracelulares ou requerem um correceptor para fornecer função de sinalização (Dangl et al., 2013). Dependendo da presença do domínio de transdução de sinal, os PRRs de plantas são classificados como quinases de tipo receptor (Receptor-Like Kinases, RLKs) ou como proteínas de tipo receptor (Receptor-Like Proteins, RLPs), conforme descrito por Macho e Zipfel (2014). O reconhecimento de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) no apoplasto por receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) inicia uma cascata de sinalização complexa que leva à imunidade desencadeada por PRR (PRR-Triggered Immunity, PTI). Patógenos adaptados são capazes de suprimir a primeira camada de defesa por meio da secreção de proteínas efetoras que interferem na sinalização (Jones e Dangl, 2006, Césari et al., 2014).

[004] A segunda camada de defesa da planta, a imunidade desencadeada por efetores (Effector Triggered Immunity, ETI), depende do reconhecimento específico de efetores por genes de resistência a doenças (Jones e Dangl, 2006). Este reconhecimento leva a uma forte resposta de defesa que está, de modo geral, associada a uma morte celular programada local, a reação de hipersensibilidade. Uma vez que os efetores normalmente são específicos para a espécie ou isolado, esta segunda camada de imunidade só é eficiente contra isolados que carregam o efetor reconhecido o qual é, então, denominado de gene de avirulência (Césari et al., 2014). O gene de avirulência de ocorrência natural compreende uma sequência sinalizadora que permite o processamento intracelular dentro do patógeno.

[005] A coexpressão de um gene de resistência e do gene de avirulência correspondente em uma célula de planta é um conceito promissor para projetar plantas geneticamente modificadas com ampla resistência a fungos. A ativação de reações de defesa dependentes de genes de resistência está frequentemente associada à morte celular, a marca registrada da imunidade inata.

[006] As proteínas de resistência de plantas (proteínas R) são classificadas em cinco classes principais (Figura 1), com base em sua estrutura e localização (Dangl e Jones 2001). A maioria das proteínas de resistência pertencem à família de repetição rica em leucina no sítio de ligação de nucleotídeos (Nucleotide-Binding-Site Leucine-Rich Repeat, NBS-LRR) e está localizada intracelularmente. Os domínios LRR são encontrados em diversas proteínas e funcionam como sítios de interação proteína-proteína e ligação proteína-ligante. A especificidade de reconhecimento de uma proteína R NBS-LRR é, de modo geral, determinada pelo domínio LRR C-terminal. O domínio do sítio de ligação de nucleotídeo (Nucleotide-Binding-Site, NBS) conservado faz parte do domínio NBS-ARC maior, que funciona como um comutador molecular que está envolvido na mudança de conformação dependente de Avr da proteína R (Takken et al., 2006).

[007] Dependendo do domínio N-terminal, as proteínas de resistência NBS-LRR podem ser subdivididas em proteínas CC-NBS- LRR e TIR-NBS-LRR. As proteínas CC-NBS-LRR carregam um domínio enrolado em espiral (Coiled-Coil, CC) em seu N-término e as proteínas TIR-NBS-LRR possuem um N-término com homologia ao receptor TOLL/interleucina 1 (TOLL/Interleukin Receptor 1, TIR), conforme revisado por Dangl e Jones, 2001. As proteínas TIR-NBS-LRR estão completamente ausentes das espécies de cereais (McHale et al., 2006). Os domínios N-terminais estão envolvidos na sinalização a jusante.

[008] O domínio CC das proteínas de resistência CC-NBS-LRR são classificados em 2 grupos de acordo com Collier e Moffet (2009) e Collier et al. (2011). A maioria dos domínios CC possui um pequeno motivo de consenso "EDVID" e foi denominado subtipo CCEDVID. O motivo ou variações de EDVID são necessários para a indução dependente de Avr de uma reação de hipersensibilidade, conforme mostrado pela substituição de aminoácidos da proteína Rx (Rairdan et al. 2008).

[009] O motivo EDVID está ausente no domínio CCRPW8 ou CCR, uma subclasse menos abundante do domínio CC. Poucas proteínas CCR-NB-LRR foram clonadas até o momento. Os membros deste grupo mais bem estudados incluem o gene 1 N-requerido (N-Required Gene 1, NRG1) de Nicotiana benthamiana e o gene 1 de resistência a doenças ativado (Activated Disease Resistance 1, ADR1) de

Arabidopsis thaliana (Collier et al., 2011). Foi assumido que a superexpressão de um domínio CCEDVID isolado não é suficiente para induzir a respostas de defesa, ao contrário do domínio CCR de NRG1 ou determinados domínios TIR (Collier et al., 2011). No entanto, uma subclasse do domínio CCEDVID é suficiente para a indução de morte celular (documento WO/2006/128444). Esta subclasse é denominada subtipo CCDAE ou CCDAE+EDVID, com base na presença de um motivo DAE conservado típico além do motivo EDVID. Seguindo esta classificação, as proteínas CC-NBS-LRR podem ser divididas em 3 subclasses (Figura 1).

[010] A funcionalidade de um único gene R, de modo geral, está restrita a uma família de plantas ou mesmo a uma espécie. Este fenômeno é denominado "funcionalidade taxonômica restrita". A expressão heteróloga de genes NB-LRR de tipo R em uma família taxonomicamente distinta não desencadeia nenhuma resposta ou desencadeia imunidade inadequada, sugerindo que os componentes regulatórios ou de sinalização associados à resistência com base em proteínas NB-LRR são específicos para a família (Brutus et al., 2010). A transferência de genes de resistência entre espécies pode ser limitada não apenas pela divergência de moléculas efetoras de sinalização e ligantes de avirulência de patógenos, mas potencialmente também pela expressão gênica mais fundamental e limitações de processamento de transcrição (Ayliffe et al., 2004).

[011] Uma ruptura da funcionalidade taxonômica restrita foi relatada pela transferência de um par de genes R de tipo NB-LRR, RPS4 e RRS1 (Narusaka et al., 2013) de uma planta Brassicaceae (Arabidopsis thaliana) para duas plantas Solanaceae (Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum). Uma transferência interfamiliar de uma planta Solanaceae (Solanum lycopersicum) para uma planta Brassicaceae (Arabidopsis thaliana) foi descrita para a proteína R de tipo RLP Ve1 (Fradin et al., 2011). No entanto, embora a Ve1 seja considerada codificadora de uma proteína de resistência específica para a raça, várias observações sustentam a hipótese de que a Ve1 é um receptor de patógeno antigo com traços de PRRs típicos (Fradin et al., 2011). Sabe-se que os receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) podem ser transferidos através dos limites das espécies, conforme exemplificado pela transferência dos PRRs EF-Tu e FLS2 de A. thaliana para N. benthamiana e S. lycopersicum. Até agora, apenas alelos de determinados genes NB-LRR R únicos, bem como um par de genes de resistência NB-LRR de dois componentes, foram considerados adequados para uma transferência interfamiliar da família Poaceae ou Gramineae para as famílias de plantas Solanaceae e Brassicaceae. O gene de resistência ao oídio da cevada Mla1 desencadeia a morte celular em A. thaliana após coexpressão com o gene de avirulência AVRa1 correspondente (Lu et al., 2016). Seus ortólogos de trigo Sr33 e Sr50 desencadeiam a morte celular quando superexpressos em folhas de N. benthamiana (Cesari et al., 2016). Os genes de resistência ao oídio do trigo Pm3a e Pm3f desencadeiam a morte celular após coexpressão com o gene de avirulência correspondente AvrPm3a2/f2 em N. benthamiana (Bourras et al., 2015). O gene de avirulência AvrPia de Magnaporthe grisea foi reconhecido em N. benthamiana através de coexpressão com o par de genes de resistência de dois componentes NB-LRR Pia_Rga4/Rga5 de arroz. Em geral, a relação distante entre plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas torna difícil prever se um gene de resistência originado de um grupo é capaz de desencadear uma resposta imune no outro grupo.

[012] O gene de resistência NBS-LRR R3a da batata foi clonado por meio de uma abordagem genômica comparativa usando sintenia entre o complexo do locus R3a de batata e o complexo do locus I2 de tomate (Huang et al., 2005). Até o momento, a função de R3a foi mostrada apenas para dois membros da família Solanaceae (Solanum tuberosum, N. benthamiana). O efetor Avr3a de Phytophthora infestans, o gene de avirulência correspondente de R3a, foi identificado com a genética de associação. Avr3a codifica uma proteína que é reconhecida no citoplasma do hospedeiro, onde desencadeia a morte celular dependente de R3a (Amstrong et al., 2005). O gene de avirulência Avr3a ocorre em P. infestans em duas formas, o alelo Avr3a_K80I103 (Avr3aKI) ou como Avr3a_E80M103 (Avr3aEM). O alelo Avr3aKI ativa a imunidade inata dependente do gene de resistência R3a, enquanto que o Avr3aEM não será reconhecido pelo gene R3a (Amstrong et al. 2005). O Avr3a é essencial para a virulência de P. infestans e manipula a imunidade da planta ao estabilizar a ligase E3 de batata CMPG1 (Bos et al., 2010). Além disso, a proteína AVR3a se associa em células de batata com a proteína 2 relacionada à dinamina e suprime as respostas de defesa desencadeadas por flg22 e reduz a internalização do PRR FLS2 ativado (Chaparro-Garcia et al., 2015).

[013] Uma abordagem alternativa é a expressão do gene de avirulência sob o controle de um promotor indutível por patógenos. Na presença de um gene R expresso constitutivamente, o gene de avirulência só deve ser expresso no momento e local da infecção do patógeno (De Wit, 1992; Joosten e de Wit, 1999). Esta estratégia foi aplicada ao par de genes Cf-9/Avr9 usando um fragmento de 273 pares de bases do promotor indutível por patógeno Gst1 de batata (Martini et al., 1993). Embora os resultados preliminares tenham mostrado maior resistência do tomate contra dois patógenos fúngicos, foi sugerida uma otimização adicional da regulação restrita do promotor, uma vez que a especificidade do promotor não foi totalmente restrita aos locais de infecção (Strittmatter et al., 1996; Joosten e de Wit, 1999).

[014] Algumas plantas transgênicas que expressaram o gene de avirulência p50 sob controle do promotor indutível por patógeno 2xS- 2xD mostraram resistência à bactéria indutora de tumor Agrobacterium tumefaciens. As plantas resistentes a bactérias desenvolveram fenótipos menores sob condições estéreis. Porém, após transferência para o solo, todas as linhagens apresentaram necrose espontânea de caules e folhas. A necrose apareceu principalmente em caules e folhas de plantas mais velhas. A necrose foliar começou na ponta da folha, espalhou-se concentricamente e finalmente cobriu toda a folha. A necrose do caule começou próximo ao solo e aos locais de fixação das folhas (Niemeyer 2012).

[015] Outro cenário discutido foi a dissecção da reação de morte celular e resistência à doença (Niemeyer et al., 2013).

[016] No entanto, até hoje nenhuma abordagem agronomicamente atraente para resolver o problema subjacente está disponível. Portanto, ainda há uma demanda por plantas com maior resistência ou imunidade (principalmente a fungos patogênicos) que não apresentem morte celular ou necrose abundante. Sumário da Invenção

[017] A presente invenção foi feita tendo em vista o estado da técnica descrito acima, e o objetivo da presente invenção é fornecer plantas que têm resistência a um ou mais patógenos, evitando necrose indesejada ou retardo de crescimento, bem como fornecer um método para a produção destas plantas e a aplicação agrícola destas plantas.

[018] A presente invenção fornece uma molécula de ácidos nucleicos para aumentar a resistência de uma planta ou uma parte da mesma em relação a pelo menos um patógeno de planta, em que a molécula de ácidos nucleicos compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em:

[019] uma sequência de nucleotídeos que codifica i) uma proteína de resistência de planta da classe de proteínas de resistência CC-NBS-

LRR e ii) uma proteína de avirulência;

[020] uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de resistência de planta da classe de proteínas de resistência CC-NBS- LRR;

[021] uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de avirulência;

[022] uma sequência de nucleotídeos que hibridiza sob condições rigorosas com uma sequência que é complementar a uma sequência de nucleotídeos de acordo com (a), (b) ou (c); e

[023] uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 % idêntica a uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 93;

[024] em que a proteína de resistência codificada, a proteína de avirulência codificada ou ambas incluem pelo menos uma substituição de aminoácido comparado com a sequência de aminoácidos de tipo selvagem da proteína de resistência e/ou avirulência, a dita substituição levando a uma diminuição da morte celular durante uma reação de hipersensibilidade.

[025] Um ácido nucleico que codifica uma proteína de resistência, bem como uma proteína de avirulência, é uma sequência artificial que é feita pelo homem e que não ocorre na natureza. As proteínas de resistência são de origem vegetal e as proteínas de avirulência são provenientes de patógenos de planta. Portanto, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína de resistência e uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína de avirulência são heterólogas entre si.

[026] Uma proteína de resistência ou uma proteína de avirulência que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos conforme definido no presente documento são produtos artificiais que não ocorrem na natureza. Além disso, os ácidos nucleicos que codificam estas proteínas são artificiais e não são encontrados na natureza.

[027] A presente invenção também fornece uma molécula de ácidos nucleicos para aumentar a resistência de uma planta ou uma parte da mesma em relação a pelo menos um patógeno de planta, em que a molécula de ácidos nucleicos compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em:

[028] uma sequência de nucleotídeos que codifica i) uma proteína de resistência de planta da classe de proteínas de resistência CC-NBS- LRR e ii) uma proteína de avirulência;

[029] uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de resistência de planta da classe de proteínas de resistência CC-NBS- LRR;

[030] uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de avirulência;

[031] uma sequência de nucleotídeos que hibridiza sob condições rigorosas com uma sequência que é complementar a uma sequência de nucleotídeos de acordo com (a), (b) ou (c); e

[032] uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 % idêntica a uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 93;

[033] em que a proteína de resistência codificada, a proteína de avirulência codificada ou ambas incluem pelo menos uma substituição de aminoácido, em que a substituição leva a uma diminuição da morte celular durante uma reação de hipersensibilidade comparado com uma proteína de resistência, proteína de avirulência ou ambas sem a substituição de aminoácido. A pelo menos uma substituição de aminoácido pode ser uma substituição comparado com a sequência de aminoácidos de tipo selvagem da proteína de resistência e/ou avirulência.

[034] Em uma modalidade, a proteína de resistência de planta é selecionada a partir do grupo que consiste em: R3a de acordo com SEQ ID NO: 94 conforme codificada, de forma exemplificativa, pelo cDNA de SEQ ID NO: 93 ou o DNA genômico de SEQ ID NO: 268, Rpi-blb3 de acordo com SEQ ID NO: 45 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 44, R2 de acordo com SEQ ID NO: 49 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 48, Rpi- abpt de acordo com SEQ ID NO: 51 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 50, Rpi-edn1 de acordo com SEQ ID NO: 53 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 52, R1 de acordo com SEQ ID NO: 55 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 54, Rpi-blb2 de acordo com SEQ ID NO: 60 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 59, Rpi-blb1 de acordo com SEQ ID NO: 65 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 64, Rpi-pta1 de acordo com SEQ ID NO: 70 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 69, Rpi-sto1 de acordo com SEQ ID NO: 73 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 72, Rpi-vnt1.1 de acordo com SEQ ID NO: 76 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 75, Rpi-edn2 de acordo com SEQ ID NO: 80 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 79, R9a de acordo com SEQ ID NO: 266, R8 de acordo com SEQ ID NO: 86 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 85, Rpi-chc1 de acordo com SEQ ID NO: 90 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 89, R3b de acordo com SEQ ID NO: 98 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 97, Mla1_Barley de acordo com SEQ ID NO: 102 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 101, Mla13_Barley de acordo com SEQ ID NO: 106 conforme codificada, de forma exemplificativa, por

SEQ ID NO: 105, Rpg1-b_Soybean de acordo com SEQ ID NO: 111 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 110, RPM1 de acordo com SEQ ID NO: 119 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 118, RPS2 de acordo com SEQ ID NO: 121 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 120, RPS5 de acordo com SEQ ID NO: 125 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 124, BS2 de acordo com SEQ ID NO: 129 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 128, Rxo1 de acordo com SEQ ID NO: 133 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 132, I-2_Tomato de acordo com SEQ ID NO: 137 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 136, Pi-ta de acordo com SEQ ID NO: 144 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 143, Piz-t de acordo com SEQ ID NO: 150 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 149, Pia Rga4 de acordo com SEQ ID NO: 155 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 154, Pia Rga5 de acordo com SEQ ID NO: 157 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 156, Pii-1 de acordo com SEQ ID NO: 163 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 162, Pik-1 de acordo com SEQ ID NO: 167 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 166, Pik-2 de acordo com SEQ ID NO: 170 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 169, Pikh-1 de acordo com SEQ ID NO: 173 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 172, Pikm1-TS de acordo com SEQ ID NO: 179 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 178, Pikm2-TS de acordo com SEQ ID NO: 182 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 181, Pikp-1 de acordo com SEQ ID NO: 187 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 186, Pikp-2 de acordo com SEQ ID NO: 190 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 189, Piks-1 de acordo com

SEQ ID NO: 193 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 192, Piks-2 de acordo com SEQ ID NO: 196 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 195, Rps1k- 1_soybean de acordo com SEQ ID NO: 199 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 198, Rps1k-2_soybean de acordo com SEQ ID NO: 205 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 204, L3 de acordo com SEQ ID NO: 207 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 206, N'_Tobacco de acordo com SEQ ID NO: 211 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 210, RX1 de acordo com SEQ ID NO: 213 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 212, RX2 de acordo com SEQ ID NO: 218 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 217, Pvr4_Pepper de acordo com SEQ ID NO: 221, Pvr9_Pepper de acordo com SEQ ID NO: 225 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 224, Tm2_Tomato conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 228 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 227, Tm2^2_Tomato de acordo com SEQ ID NO: 232 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 231, Tsw_Pepper de acordo com SEQ ID NO: 234 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 233, Sw-5b_Tomato de acordo com SEQ ID NO: 238 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 237, Rsv1_3gG2 de acordo com SEQ ID NO: 242 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 241, Pm2 de acordo com SEQ ID NO: 246 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 245, PM3A de acordo com SEQ ID NO: 252 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 251 e PM3F de acordo com SEQ ID NO: 258 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 257.

[035] De acordo com uma modalidade, a proteína de resistência não é a proteína de resistência Rx de batata ou uma forma mutante da mesma e/ou não é a proteína de resistência Cf-9 de tomate ou uma forma mutante da mesma.

[036] Em uma modalidade específica, o ácido nucleico de acordo com a invenção codifica uma proteína de resistência, em que a molécula de ácidos nucleicos codifica uma proteína de resistência de planta que tem pelo menos uma substituição de aminoácido dentro do domínio CC comparado com a sequência de aminoácidos do domínio CC de tipo selvagem. Alternativamente, a proteína de resistência de planta codificada pode incluir pelo menos uma substituição de aminoácido dentro do domínio CC, em que a substituição leva a uma diminuição da morte celular durante uma reação de hipersensibilidade comparado com uma proteína de resistência sem a substituição de aminoácido dentro do domínio CC.

[037] De acordo com um outro aspecto da invenção, as substituições de aminoácidos dentro da proteína de resistência ou da proteína de avirulência ou ambas não é uma substituição/não são substituições que resulta(m) em uma variante de proteína que existe na natureza. Portanto, uma substituição que transforma a proteína Avr3a- KI de ocorrência natural (incluindo a sequência sinalizadora) na proteína Avr3a-KM de ocorrência natural (incluindo a sequência sinalizadora) ou o contrário seria excluída de acordo com este aspecto.

[038] Em uma modalidade, o domínio NBS da proteína de resistência pode compreender um motivo NBS.

[039] Em uma modalidade, o domínio LRR da proteína de resistência pode compreender um motivo Leu-xx-Leu-xx-Leu-x-Leu-xx- Cys/Asn-xx de acordo com SEQ ID NO: 272 (onde x é qualquer aminoácido).

[040] Em outra modalidade, a proteína de resistência é uma proteína de resistência que compreende o motivo de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 273, conforme representado na Figura 3.

[041] Em uma modalidade, a proteína de avirulência é selecionada a partir do grupo que consiste em: Avr3a_Phytophthora de acordo com SEQ ID NO: 96 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 95, Avr2_Phytophthora_infestans de acordo com SEQ ID NO: 139 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 138, Avr1_Phytophthora_infestans de acordo com SEQ ID NO: 58 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 57, Avrblb2 de acordo com SEQ ID NO: 63 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 62, Avr-blb1=Avr-sto1 de acordo com SEQ ID NO: 68 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 67, Avr-vnt1 de acordo com SEQ ID NO: 78 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 77, Avrblb2 de acordo com SEQ ID NO: 82 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 81, Avr8_Phytophthora_infestans de acordo com SEQ ID NO: 88 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 87, PITG_16245 de acordo com SEQ ID NO: 92 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 91, Avr3b de acordo com SEQ ID NO: 100 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 99, Avra1_(AvrMla1)_Blumeria de acordo com SEQ ID NO: 104 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 103, Avra13_(AvrMla13)_Blumeria de acordo com SEQ ID NO: 109 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 108, AvrB_Pseudomonas de acordo com SEQ ID NO: 113 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 112, AvrRpm1 de acordo com SEQ ID NO: 115 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 114, AvrPpiA1_Pseudomonas de acordo com SEQ ID NO: 117 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 116, AvrRpt2_Pseudomonas de acordo com SEQ ID NO: 123 conforme codificada, de forma exemplificativa, por

SEQ ID NO: 122, AvrPphB de acordo com SEQ ID NO: 127 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 126, AvrBs2_Xanthomonas de acordo com SEQ ID NO: 131 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 130, AvrRxo1 de acordo com SEQ ID NO: 135 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 134, Avr2 (SIX3)_Fusarium oxysporum de acordo com SEQ ID NO: 139 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 138, SIX5_Fusarium oxysporum de acordo com SEQ ID NO: 141 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 140, AVR Pita de acordo com SEQ ID NO: 147 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 146, AvrPiz-t de acordo com SEQ ID NO: 153 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 152, AVR1-CO39 de acordo com SEQ ID NO: 159 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 158, AVR-Pia de acordo com SEQ ID NO: 161 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 160, Avr-Pii de acordo com SEQ ID NO: 165 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 164, alelo D de Avr Pik_km_kp de acordo com SEQ ID NO: 185 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 184, Avr1k_Phytophthora sojae de acordo com SEQ ID NO: 201 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 200, vírus do mosqueado suave de pimentão CP_Pepper de acordo com SEQ ID NO: 209 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 208, vírus X de batata CP_Potato de acordo com SEQ ID NO: 216 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 215, vírus do mosqueado Nlb_Pepper de acordo com SEQ ID NO: 223 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 222, vírus mosaico de tabaco MP_Tobacco de 30kDa de acordo com SEQ ID NO: 230 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 229, vírus da murcha manchada de tomate NSs_Tomato (AvrTsw) de acordo com SEQ ID NO: 236 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 235, vírus da murcha manchada de tomate NSm_Tomato de acordo com SEQ ID NO: 240 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 239, vírus mosaico de soja P3 cistron_Soybean de acordo com SEQ ID NO: 244 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 243, AvrPm2 de acordo com SEQ ID NO: 249 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 248 e AvrPm3a2_f2 de acordo com SEQ ID NO: 255 conforme codificada, de forma exemplificativa, por SEQ ID NO: 254 em que, de preferência, pelo menos um dos aminoácidos de tal proteína é substituído.

[042] Em uma modalidade preferida, a molécula de ácidos nucleicos compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de resistência de planta da classe de proteínas de resistência CC-NBS-LRR e uma proteína de avirulência, em que a proteína de resistência de planta e a proteína de avirulência são uma combinação selecionada a partir das seguintes combinações: R3a (CC; AAW48299) e Avr3a_Phytophthora, Rpi-blb3 e Avr2 _Phytophthora_infestans, R2 e Avr2 _Phytophthora_infestans, Rpi-abpt e Avr2 _Phytophthora_infestans, pi-edn1 e Avr2 _Phytophthora_infestans, R1 e Avr1 _Phytophthora_infestans, Rpi-blb2 e Avrblb2, Rpi-blb1 e Avr-blb1=Avr-sto1, Rpi-pta1 e Avr-blb1=Avr-sto1, Rpi-sto1 e Avr-blb1=Avr-sto1, Rpi-vnt1.1 e Avr-vnt1 (PITG_16294)_Phytophthora, Rpi-edn2 e Avrblb2, R9a e Avrblb2, R8 e Avr8_Phytophthora_infestans, Rpi-chc1 e PITG_16245 (Avr- chc1)_Phytophthora, R3b (CC; AEC47890) e Avr3b (PITG_18215)_Phytophthora, Mla1_Barley e Avra1_(AvrMla1)_Blumeria, Mla13_Barley e Avra13_(AvrMla13)_Blumeria, Rpg1-b_Soybean e

AvrB_Pseudomonas, RPM1 (CC; CAA61131) e AvrB_Pseudomonas, RPM1 (CC; CAA61131) e AvrRpm1, RPM1 (CC; CAA61131) e AvrPpiA1_Pseudomonas, RPS2 (CC; AEE85156) e AvrRpt2_Pseudomonas, RPS5 (CC; AEE28852) e AvrPphB (HopAR1)_Pseudomonas, BS2 (CC; AAF09256) e AvrBs2_Xanthomonas, Rxo1 (AAX31149) e AvrRxo1, I-2_Tomato e Avr2 (SIX3)_Fusarium oxysporum, I-2_Tomato e SIX5_Fusarium oxysporum, Pi-ta (AF207842) e AVR Pita (AF207841), Piz-t (ABC73398) e AvrPiz-t (ACF39937), Pia Rga4 (BAK39922) e AVR1-CO39 (AF463528_3), Pia Rga4 (BAK39922) e AVR-Pia (BAH59484), Pia Rga5 (BAK39930) e AVR1-CO39 (AF463528_3), Pia Rga5 (BAK39930) e AVR-Pia (BAH59484), Pii-1 (BAN59294) e Avr-Pii (BAH59485), Pik-1 (ADZ48537) e alelo D de Avr Pik_km_kp (alelo pex31-D) (BAH59486), Pik-2 (ADZ48538) e alelo D de Avr Pik_km_kp (alelo pex31-D) (BAH59486), Pikh-1 (AET36549) e alelo D de Avr Pik_km_kp (alelo pex31-D) (BAH59486), Pikh-2 (AET36550) e alelo D de Avr Pik_km_kp (alelo pex31-D) (BAH59486), Pikm1-TS (BAG71909) e alelo D de Avr Pik_km_kp (alelo pex31-D) (BAH59486), Pikm2-TS (BAG71908) e alelo D de Avr Pik_km_kp (alelo pex31-D) (BAH59486), Pikp-1 (ADV58352) e alelo D de Avr Pik_km_kp (alelo pex31-D) (BAH59486), Pikp-2 (ADV58351) e alelo D de Avr Pik_km_kp (alelo pex31-D) (BAH59486), Piks-1 (AET36547) e alelo D de Avr Pik_km_kp (alelo pex31-D) (BAH59486), Piks-2 (AET36548) e alelo D de Avr Pik_km_kp (alelo pex31-D) (BAH59486), Rps1k-1_Soybean e Avr1k_Phytophthora sojae, Rps1k-2_Soybean e Avr1k_Phytophthora sojae, L3 (CC; BAJ33559) e vírus do mosqueado suave de pimentão CP_Pepper (Avr L3&4), N'_Tobacco e vírus do mosqueado suave de pimentão CP_Pepper (Avr L3&4), RX1 (CC; CAB50786) e vírus X de batata CP_Potato, RX2 (CC; CAB56299) e vírus X de batata CP_Potato, Pvr4_Pepper e vírus do mosqueado de pimentão Nlb_Pepper (Avr Pvr4&9), Pvr9_Pepper e vírus do mosqueado de pimentão Nlb_Pepper (Avr Pvr4&9), Tm2_Tomato e vírus mosaico de tabaco MP_Tobacco de 30 kDa (AvrTm2), Tm2^2_Tomato e vírus mosaico de tabaco MP_Tobacco de 30 kDa (AvrTm2), Tsw_Pepper e vírus da murcha manchada de tomate NSs_Tomato (AvrTsw), Sw-5b_Tomato e vírus da murcha manchada de tomate NSm_Tomato (AvrSw-5b), Rsv1_3gG2 e vírus mosaico de soja P3 cistron_Soybean (AvrRsv1_ 3gG2), Pm2 e AvrPm2, PM3A (CC; AAY21626) e AvrPm3a2_f2, e PM3F e AvrPm3a2_f2.

[043] Em uma modalidade, a molécula de ácidos nucleicos compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de avirulência Avr3a sem a sequência sinalizadora da proteína e que tem pelo menos uma substituição de aminoácido na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, em que a pelo menos uma substituição de aminoácido é selecionada a partir do grupo que consiste em: K59/M82, R59/M82, H59/M82, C59/M82, N59/M82, Q59/M82, T59/M82, S59/M82, M59/M82, G59/M82, A59/M82, L59/M82, V59/M82, I59/M82. A este respeito, uma substituição de aminoácido "R59/M82" significa que o aminoácido na posição 59 é substituído pelo aminoácido arginina ("R") e o aminoácido na posição 82 é substituído por metionina ("M"). A este respeito, as posições 59 e 82 também podem corresponder à respectiva posição em uma variante da proteína de acordo com SEQ ID NO: 2. Um exemplo para uma sequência que codifica uma proteína de acordo com SEQ ID NO: 2 é fornecido pela molécula de ácidos nucleicos de acordo com SEQ ID NO: 1. Portanto, as seguintes sequências artificiais de Avr3a com substituições de aminoácidos são parte da invenção:

SEQ ID NO

SEQ ID NO Sequência de ácidos nucleicos que codifica a Sequência da proteína proteína K59/I82 1 2 K59/M82 4 5

SEQ ID NO

SEQ ID NO Sequência de ácidos nucleicos que codifica a Sequência da proteína proteína R59/M82 6 7 H59/M82 8 9 D59/M82 10 11 E59/M82 12 13 F59/M82 14 15 Y59/M82 16 17 W59/M82 18 19 P59/M82 20 21 C59/M82 22 23 N59/M82 24 25 Q59/M82 26 27 T59/M82 28 29 S59/M82 30 31 M59/M82 32 33 G59/M82 34 35 A59/M82 36 37 L59/M82 38 39 V59/M82 40 41 I59/M82 42 43

[044] As proteínas de avirulência que ocorrem na natureza são proteínas secretadas (normalmente a partir do patógeno para a planta infestada) e, portanto, as proteínas de avirulência que ocorrem naturalmente têm uma sequência sinalizadora. As proteínas de avirulência às quais falta a sequência sinalizadora e os ácidos nucleicos que codificam estas proteínas são feitas pelo homem e não ocorrem na natureza.

[045] Em uma modalidade, a molécula de ácidos nucleicos compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de avirulência de tipo selvagem Avr3a que inclui a sequência sinalizadora e que tem pelo menos uma substituição de aminoácido na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 267, em que a pelo menos uma substituição de aminoácido é selecionada a partir do grupo que consiste em: K80/I103 (já incluída em SEQ ID NO: 267), K80/M103, R80/M103, H80/M103, C80/M103, N80/M103, Q80/M103, T80/M103, S80/M103, M80/M103, G80/M103, A80/M103, L80/M103, V80/M103, I80/M103. Um exemplo de uma sequência que codifica uma proteína de acordo com SEQ ID NO: 267 é fornecido pela molécula de ácidos nucleicos de acordo com SEQ ID NO: 3.

[046] Em uma modalidade, a molécula de ácidos nucleicos compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de resistência de planta que tem pelo menos uma substituição de aminoácido dentro do domínio CC da proteína de tipo selvagem. De preferência, a pelo menos uma substituição de aminoácido na proteína de resistência de planta é selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma substituição de aminoácido dentro do motivo DAE da proteína de resistência BvKWS3_165 codificada pela sequência de ácidos nucleicos de acordo com SEQ ID NO: 274 em que o motivo DAE se expande da posição de aminoácido 56 para a posição de aminoácido 58 na sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 263; (b) uma substituição de aminoácido dentro do motivo DAE da proteína de resistência Bv123 codificada pela sequência de ácidos nucleicos de acordo com SEQ ID NO: 276, em que o motivo DAE se expande da posição de aminoácido 57 para a posição de aminoácido 59 de SEQ ID NO: 261 e (c) uma substituição de aminoácido dentro do motivo DAE da proteína de resistência R3a, em que o motivo DAE se expande da posição de aminoácido 59 para a posição de aminoácido 61 de SEQ ID NO: 265. A sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 263 é codificada, de forma exemplificativa, pela molécula de ácidos nucleicos de acordo com SEQ ID NO: 262. Mais preferivelmente, a pelo menos uma substituição de aminoácido está dentro do D ou E do motivo DAE de BvKWS3_165, Bv123 ou R3a. A sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 261 é codificada, de forma exemplificativa, pela molécula de ácidos nucleicos de acordo com SEQ ID NO: 260. A sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 265 é codificada, de forma exemplificativa, pela molécula de ácidos nucleicos de acordo com SEQ ID NO: 264.

[047] Em uma modalidade preferida, a proteína de resistência de planta é R3a que tem a sequência de aminoácidos de tipo selvagem de SEQ ID NO: 269, em que a dita sequência de aminoácidos de tipo selvagem tem pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo que consiste em: K35E, K37M, E61V, E61K, E135N e E136N. No caso de "K35E", isto significa, por exemplo, que o aminoácido K na posição 35 é substituído por E.

[048] Além disso, é fornecida uma célula que compreende a molécula de ácidos nucleicos, o polipeptídeo ou o vetor ou cassete de expressão da presente invenção. De preferência, a célula compreende a molécula de ácidos nucleicos da presente invenção como um transgene ou como um endogene. A célula pode ser, por exemplo, uma célula eucariota, tal como uma célula vegetal ou uma célula de levedura. No entanto, a célula também pode ser, por exemplo, uma célula procariota, tal como uma célula bacteriana, em que a célula bacteriana pode ser, por exemplo, uma célula de E. coli ou Agrobacterium tumefaciens.

[049] É ainda fornecida uma planta ou parte da mesma que compreende a molécula de ácidos nucleicos da presente invenção ou compreende a célula da presente invenção e uma planta ou parte da mesma regenerada a partir da dita célula.

[050] Também é fornecida uma semente ou progênie da planta da presente invenção, em que a semente ou a progênie compreende a molécula de ácidos nucleicos da presente invenção como um transgene ou um endogene.

[051] A presente invenção também fornece um método para aumentar a resistência de uma planta a pelo menos um patógeno de planta. Em uma modalidade, o dito método compreende as etapas de integrar a molécula de ácidos nucleicos da presente invenção no genoma de pelo menos uma célula da planta e regenerar uma planta a partir desta célula. Alternativamente, o dito método compreende as etapas de transformar uma célula de planta com uma molécula de ácidos nucleicos da presente invenção, ou o vetor ou o cassete de expressão da presente invenção, e regenerar uma planta a partir desta célula.

[052] Além disso, a presente invenção fornece um método para a identificação de uma planta que compreende a molécula de ácidos nucleicos da presente invenção, o dito método compreendendo as etapas de isolar o DNA da planta da presente invenção ou parte da mesma e realizar uma reação em cadeia de polimerase usando o DNA isolado como um modelo, deste modo, amplificando a molécula de ácidos nucleicos da presente invenção ou uma parte da mesma. De preferência, o método para identificação detectará não apenas a presença de uma molécula de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção, mas também detectará pelo menos uma das substituições de aminoácidos codificadas pela molécula de ácidos nucleicos. Breve Descrição dos Desenhos

[053] Figura 1: Classificação dos genes de resistência de plantas em cinco grupos (modificado após Dangl e Jones, 2001). As proteínas TIR-NBS-LRR e CC-NBS-LRR estão localizadas no citoplasma das células de planta. Elas têm um domínio NBS (sítio de ligação de nucleotídeos) e um domínio LRR (repetição rica em leucina) em comum. Elas diferem quanto ao N-término pelo domínio TIR (Receptor Toll/interleucina) e CC (Enrolado em Espiral). A CC-NBS-LRR será subdividida nos tipos CCEDVID-NBS-LRR, CCDAE-NBS-LRR e CCR-NBS- LRR de acordo com a descrição da presente patente. RLK (Quinase de

Tipo Receptor) e RLP (Proteínas de Tipo Receptor) são receptores ligados à membrana. Um receptor RLK tem um LRR no N-término, seguido por um domínio transmembrana e um domínio de quinase no C-término. O receptor RLP consiste em um domínio LRR, seguido por um domínio transmembrana. A quinase de tipo Pto consiste em um domínio de quinase.

[054] Figura 2: Efeito prejudicial da coexpressão de R3a-Avr3a em plantas adultas, mas não em plantas jovens. As linhagens transgênicas T-047, T-036, T-029 e T-071, as quais foram transformadas com os genes R3a-Avr3aKI, apresentaram aborto foliar e crescimento atrofiado na fase adulta, mas não na planta jovem. Análise de expressão por qRT- PCR mostrou que o gene Avr3a é mais fortemente expresso em plantas jovens do que em plantas adultas. O fenótipo negativo de linhagens R3a-Avr3aKI adultas se correlaciona com a expressão de Avr3aKI. A expressão de Avr3aKI foi normalizada contra a expressão do gene house-keeping de batata StMCB75. n = 4, ± indica derivação padrão.

[055] Figura 3: Comparação dos domínios CCDAE das proteínas R BvKWS3_165 de acordo com SEQ ID NO: 263 codificada, de forma exemplificativa, pela sequência de ácidos nucleicos de acordo com SEQ ID NO: 262, proteína Bv123 de acordo com SEQ ID NO: 261 codificada, de forma exemplificativa, pela sequência de ácidos nucleicos de acordo com SEQ ID NO: 260 e proteína StR3a de acordo com SEQ ID NO: 265 codificada, de forma exemplificativa, pela sequência de ácidos nucleicos de acordo com SEQ ID NO: 264. Aminoácidos idênticos das proteínas de resistência de beterraba (BvKWS3_165, Bv123) e batata (StR3a) são destacados com fundo preto. O motivo DAE, o qual foi usado para a classificação do tipo de CC, é altamente conservado e localizado nas posições 56-58 (BvKWS3_165), 57-59 (Bv123) e 59-61 (StR3a). O motivo EDVID é conservado como a sequência de consenso EDILD e localizado nas posições 82-86 (BvKWS3_165), 83-87 (Bv123) e 85-89

(StR3a). O tamanho dos domínios CC é fornecido como números, por exemplo, #175 = 175 aminoácidos. Também é descrito um motivo de consenso de acordo com SEQ ID NO: 273 deduzido a partir das três sequências.

[056] Figura 4a e Figura 4b: Geração de variantes do gene R3a com atividade de morte celular reduzida por trocas de um único aminoácido do domínio CCDAE (Figura 4a). Alelos de R3a gerados mostraram morte celular reduzida após coexpressão com o gene Avr3aKI. Em cada construção (as últimas seis colunas), um aminoácido do domínio CCDAE foi trocado na proteína CC-NBS-LRR (por exemplo, K35E = K na posição 35 foi substituído por E). A morte celular mais forte foi observada para o gene R3a nativo (3ª coluna mostrando resultados para "AVR3a + R3a"). O número descreve o nível de morte celular após transformação balística de folhas de batata (0 = morte celular máxima, 100 = morte celular não detectada). pCaMV-2 = vetor vazio (controle negativo). A derivação padrão da média de 3 experimentos com 6 réplicas é fornecida pelas barras de erro (Figura 4b).

[057] Figura 5 à Figura 8: Variantes alélicas do gene Avr3a desencadeiam diferentes níveis de morte celular em folhas de batata. Variantes de Avr3a sob o controle do promotor 35S duplicado desencadeiam diferentes níveis de morte celular após expressão transitória em folhas de batata do cultivar Hermes de R3a. A média de três experimentos independentes é mostrada (n = 18). O vetor vazio (vetor de expressão sem gene Avr3a) foi definido como 100, Avr3aKI (alelo avirulento nativo). O teste de Shapiro Wilk foi realizado para distribuição de normalidade dos dados. Dados com letras diferentes são significativamente diferentes de acordo com ANOVA e teste de Tukey (t-teste múltiplo, p < 0,05).

[058] Figura 9: Comparação da resistência à morte celular induzida por variantes alélicas do gene Avr3a (s. Figuras 5-8) em folhas de batata.

[059] Figura 10: Fenótipo das linhagens de batata Avr3aGM-T-024 e Avr3aIM-T-112 comparado com o cultivar de batata Hermes. Plantas adultas de linhagens transformadas com os genes Avr3aGM e Avr3aIM sob o controle do promotor fúngico sintético indutível 2xS-4xD-NpCABE mostraram o mesmo fenótipo do cultivar Hermes, o qual foi usado para transformação.

[060] Figura 11a e Figura 11b: Resistência aumentada à requeima da linhagem Avr3aGM-T-024 comparado com Hermes e um controle transgênico (RNAi-GFP). Os 5 primeiros folíolos de cada folha de batata foram inoculados localmente com uma gota de esporângio (20 µl com 600 esporângios). As fotos foram tiradas a 5 dpi.

[061] Figura 12a e Figura 12b: Análise de expressão do gene Avr3a em folhas de batata infectadas com P. infestans e de controle por qRT-PCR. A linhagem transgênica com melhor resistência à requeima, Avr3aGM-T-024, mostrou a maior expressão do gene Avr3a recombinante após infecção a 2, 3 e 4 dpi. Os iniciadores selecionados S3169 e S3170 permitiram a detecção específica da expressão do gene Avr3a recombinante na presença de P. infestans. A expressão de Avr3a foi normalizada contra o gene da batata StMCB75. Coluna preta = folhas infectadas, coluna cinza = folhas de controle. n = 4. dpi = dias após a inoculação, ko = folhas não infectadas. ± indica a derivação padrão.

[062] Figura 13: O limite de indução da morte celular é aumentado pela aplicação de Avr3aGM comparado com o gene Avr3aKI nativo. A expressão dos genes Avr3aKI e Avr3aGM em folhas de plantas adultas na estufa foi determinada por qRT-PCR usando os iniciadores específicos para gene S3169 e S3170. As linhagens transgênicas T- 047, T-036, T-029 e T-071, as quais foram transformadas com os genes R3a-Avr3aKI, mostraram aborto de folhas e crescimento atrofiado (consulte Figura 2). O nível de dano foliar se correlacionou com a expressão de Avr3aKI. Mesmo a linhagem de baixa expressão de Avr3aKI, T-047, mostrou aborto de folhas visível. Isto indicou que o limite para a indução de morte celular é menor do que 1,8 unidades relativas para as linhagens que expressam Avr3aKI. Em contraste, a linhagem de coexpressão de R3a-Avr3aGM, Avr3aGM-T024, não mostrou um fenótipo negativo e revelou uma expressão de Avr3aGM de 146,5 ± 30,1 unidades relativas. Este resultado demonstrou que o limite para indução de morte celular é maior do que 200 unidades relativas para o gene Avr3a modificado na linhagem Avr3aGM-T-024. A expressão de Avr3a foi normalizada contra a expressão do gene house-keeping de batata StMCB75 n = 4, ± indica derivação padrão.

[063] Figura 14a e Figura 14b: Resistência aumentada à pinta preta (Alternaria solani) da linhagem Avr3aGM-T-024 comparado com Hermes e um controle transgênico (RNAi-GFP). As plantas de estufa foram avaliadas quanto à infecção natural por A. solani (n = 8 linhagens com 3 plantas cada). 0 = folhas saudáveis, 100 = folhas completamente destruídas. As diferenças entre as amostras foram avaliadas por meio de análise de variância (ANOVA). * Diferença significativa de acordo com ANOVA para Hermes, RNAi-GFP e Avr3aGM-T-024, p < 0,05.

[064] Figura 15a, Figura 15b e Figura 15c: A coexpressão de R3a-Avr3aKI ativa a morte celular, a marca registrada da imunidade inata, em folhas de milho, soja e trigo. O gene de resistência R3a de batata e o gene Avr3aKI de P. infestans foram coexpressos transitoriamente em folhas de milho, soja e trigo. A indução da morte celular foi medida pela atividade de dois genes repórter de luciferase cobombardeados 16h após transformação. Um gene de resistência de trigo autoativado e um gene de resistência de soja autoativado foram usados como "controles positivos" para trigo, milho e soja.

[065] Figura 16a, Figura 16b e Figura 16c: Em contraste com a coexpressão de R3a-Avr3aKI, a coexpressão de R1-Avr1 não ativa a morte celular em folhas de milho, soja e trigo. O gene de resistência R1 de batata e o gene Avr1 de P. infestans foram coexpressos transitoriamente em folhas de milho, soja e trigo. A indução da morte celular foi medida pela atividade de dois genes repórter de luciferase cobombardeados 16h após transformação; um gene de resistência de trigo autoativado e um gene de resistência de soja autoativado foram usados como "controles positivos" para trigo, milho e soja.

[066] Figura 17a, Figura 17b e Figura 17c: Em contraste com a coexpressão de R3a-Avr3aKI, a coexpressão de Rx1-PVX-CP não ativa a morte celular em folhas de milho, soja e trigo. O gene de resistência Rx1 de batata e o gene que codifica a proteína capsidial do vírus X de batata (PVX-CP) foram coexpressos transitoriamente em folhas de milho, soja e trigo. A indução da morte celular foi medida pela atividade de dois genes repórter de luciferase cobombardeados 16h após transformação. Um gene de resistência de trigo autoativado e um gene de resistência de soja autoativado foram usados como "controles positivos" para trigo, milho e soja.

[067] Figura 18: Mapa vetorial do vetor pBIN. O vetor compreende o gene AVR3a como gene de avirulência e R3a como gene de resistência. O gene de avirulência está sob controle de uma construção de promotor que compreende o promotor mínimo NpCABE e os elementos cis reguladores 2xS-4xD. O gene de resistência está sob controle do promotor R3a. Os genes NPTII, NPTIII e tetR estão incluídos no vetor para conferir resistência a agentes seletivos. LB = borda esquerda do T-DNA (DNA de transferência); RB = borda direita do T- DNA; o vetor é adequado para integração estável do gene de avirulência e do gene de resistência em um genoma de planta e subsequente expressão dos genes.

[068] Figura 19: Construção esquemática de um cassete de expressão que inclui o gene de resistência R3a e o gene de avirulência

Avr3aKI. O cassete de expressão é utilizável para expressão dos genes incluídos. Descrição Detalhada da Invenção

[069] A presente invenção se baseia na descoberta de que genes geneticamente modificados envolvidos na interação gene-para-gene podem ser usados para diminuir a morte celular e prevenir a ativação indesejada de reações de defesa na ausência de patógenos. Versões mutantes de genes de resistência nativos ou genes Avr com atividade reduzida de indução de morte celular foram geradas e aplicadas a fim de diminuir a morte celular, por exemplo, ao aumentar o limite para indução de morte celular. Os elementos genéticos da interação gene- para-gene com redução da atividade de indução de morte celular diminuem a morte celular e evitam a ativação indesejada de reações de defesa na ausência de patógenos. Ao mesmo tempo, os genes modificados ainda eram capazes de ativar a imunidade inata durante a infecção pelo patógeno. A tecnologia da invenção foi testada com sucesso para o gene de resistência CC-NBS-LRR, R3a, de batata e o gene Avr3a de P. infestans. A mesma tecnologia pode ser aplicada a qualquer gene de resistência CC-NBS-LRR de uma cultura e o gene de avirulência correspondente. Além disso, foi demonstrado que a combinação do gene R3a-Avr3a induz à morte celular em milho, soja e trigo. Portanto, as descobertas da presente invenção foram transferidas com sucesso para estas outras colheitas. É fornecida uma lista de genes de resistência CC-NBS-LRR adicionais e seus genes AVR correspondentes que podem ser usados nos métodos da invenção.

[070] Consequentemente, a presente invenção fornece uma molécula de ácidos nucleicos para aumentar a resistência de uma planta ou uma parte da mesma em relação a pelo menos um patógeno de planta, em que a molécula de ácidos nucleicos compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em:

[071] uma sequência de nucleotídeos que codifica i) uma proteína de resistência de planta da classe de proteínas de resistência CC-NBS- LRR e ii) uma proteína de avirulência;

[072] uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de resistência de planta da classe de proteínas de resistência CC-NBS- LRR;

[073] uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de avirulência;

[074] uma sequência de nucleotídeos que hibridiza sob condições rigorosas com uma sequência que é complementar a uma sequência de nucleotídeos de acordo com (a), (b) ou (c); e

[075] uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 % idêntica a uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 93 ou 271;

[076] em que a proteína de resistência codificada, a proteína de avirulência codificada ou ambas incluem pelo menos uma substituição de aminoácido comparado com a sequência de aminoácidos de tipo selvagem da proteína de resistência e/ou avirulência, a dita substituição levando a uma diminuição da morte celular durante uma reação de hipersensibilidade.

[077] De preferência, a pelo menos uma substituição de aminoácido é uma substituição de aminoácido fora da sequência sinalizadora da proteína de resistência codificada ou da proteína de avirulência codificada.

[078] A expressão "resistência" ou "resistente", em relação a um patógeno, deve ser entendida como significando a capacidade de uma planta ou célula de planta de resistir aos efeitos prejudiciais do patógeno e se estende desde um retardo no desenvolvimento da doença até supressão completa do desenvolvimento da doença. A resistência pode ser completa ou parcial e pode ser específica ou não específica para a raça do patógeno. Uma resistência conferida pode ser uma resistência herdada recentemente ou um aumento em uma resistência parcial que já existe.

[079] A resistência pode ser quantificada por meio de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a resistência pode ser quantificada por uma biomassa fúngica reduzida na planta hospedeira; para isto, o DNA fúngico pode ser determinado com o auxílio de PCR quantitativa comparado com o DNA da planta no tecido da planta infestado. Uma abordagem adicional para medição de resistência é a classificação óptica, na qual pontuações de classificação de 1 (não suscetível) a 9 (muito suscetível) são concedidas. Um aumento da resistência pode ser medido, por exemplo, ao inocular uma folha saudável com um isolado do patógeno e determinar a superfície infestada após um determinado número de dias (por exemplo, 15 dias). Uma redução de 5 % da superfície infestada corresponde a um aumento da resistência de 5 %.

[080] Planta: Uma planta pode ser uma dicotiledônea ou monocotiledônea. Plantas que podem ser exploradas agronomicamente são preferidas. Exemplos de plantas que podem ser usadas no contexto da invenção são a beterraba sacarínica ou a beterraba vermelha; batata; milho; algodão, colza; Poaceae, incluindo cereais tais como trigo, cevada, centeio, arroz, aveia, painço; cana-de-açúcar, girassol; Fabaceae, tais como soja, feijão, amendoim, lentilha e tremoço.

[081] Parte de uma planta: Em geral, cada órgão ou tecido de uma planta faz parte de uma planta. Uma parte de uma planta pode ser folhas, caules, raízes, radículas emergidas, flores, partes de flores, pétalas, frutas, pólen, tubos polínicos, filamentos de anteras, óvulos, sacos embrionários, óvulos, ovários, zigotos, embriões, embriões zigóticos, embriões somáticos, meristemas apicais, feixes vasculares,

periciclos, sementes, raízes e estacas.

[082] Patógeno: Um "patógeno", conforme usado no presente documento, se refere a um organismo que pode infectar uma planta ou que pode causar uma doença em uma planta. Os patógenos que podem infectar uma planta ou que podem causar uma doença em uma planta incluem fungos, oomicetos, bactérias, vírus, viroides, organismos de tipo vírus, fitoplasmas, protozoários, nematoides e plantas parasíticas. Os parasitas de plantas podem causar danos ao se alimentarem de uma planta e podem ser selecionados a partir de ectoparasitas, tais como insetos, incluindo pulgões e outros insetos sugadores de seiva, ácaros e vertebrados. Exemplos de patógenos fúngicos que são especialmente adequados para serem combatidos pela presente invenção são Alternaria solani, Phytophthora infestans, Blumeria graminis ou fungos pertencentes ao gênero Fusarium.

[083] Proteína de resistência de planta: As proteínas de resistência de planta são moléculas chave para a ativação dos mecanismos de defesa induzidos. De acordo com o postulado gene- para-gene, uma resistência interage direta ou indiretamente com uma proteína correspondente codificada pelo gene de avirulência do patógeno (gene Avr) e, assim, desencadeia a reação defensiva induzida. As proteínas CC-NBS-LRR podem compreender três domínios: Um domínio enrolado em espiral (CC), um domínio NBS (sítio de ligação de nucleotídeo) e um domínio LRR (repetição rica em leucina). No contexto da presente invenção, as proteínas CC-NBS-LRR também podem ser proteínas que compreendem a sequência de aminoácidos VLSDAE ou o motivo VLSDAEXKQ conforme descrito na Figura 3 (em que X pode ser todos os aminoácidos geneticamente codificáveis). Este motivo também é adequado para caracterizar ou identificar o domínio CC, em que o domínio CC começa com 56 aminoácidos na direção do N-término a partir da posição da sequência de aminoácidos VLSDAE de acordo com SEQ ID NO: 282 ou o motivo VLSDAEXKQ (com V sendo a posição 0) de acordo com SEQ ID NO:

283. Além disso, o domínio CC pode se estender em 129 aminoácidos em direção ao C-término a partir da posição da sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 282 (com E sendo a posição 0) ou 127 aminoácidos a partir da posição do motivo de acordo com SEQ ID NO: 283 (com Q sendo a posição 0).

[084] Proteína de avirulência: Uma proteína de avirulência é produzida por um patógeno de planta e é capaz de interação química direta ou indireta com uma proteína de resistência de planta correspondente, em que esta interação desencadeia uma reação de hipersensibilidade (reação de defesa) dentro de uma célula de planta.

[085] Variante: As variantes de proteínas ou de ácidos nucleicos abrangem, por exemplo, homólogos, ortólogos ou variantes alélicas.

[086] Hibridizar: O termo "hibridizar" ou "hibridização" deve ser entendido como significando um procedimento no qual uma molécula de ácidos nucleicos fita simples se aglomera com uma fita de ácido nucleico que é tão complementar quanto possível, ou seja, forma pares de bases com a mesma. Exemplos de métodos padrão para hibridização foram descritos em 2001 por Sambrook et al. De preferência, isto deve ser entendido como significando que pelo menos 60 %, mais preferivelmente pelo menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 % ou 85 %, particularmente de preferência 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % das bases da molécula de ácidos nucleicos sofrem emparelhamento de base com a fita de ácido nucleico que é tão complementar quanto possível. A possibilidade de tal aglomeração depende do rigor das condições de hibridização. O termo "rigor" se refere às condições de hibridização. Rigor elevado é quando o emparelhamento de bases é mais difícil, baixo rigor é quando o emparelhamento de bases é mais fácil. O rigor das condições de hibridização depende, por exemplo, da concentração de sal ou intensidade iônica e da temperatura. Em geral, o rigor pode ser aumentado ao aumentar a temperatura e/ou reduzir o teor de sal. O termo "condições de hibridização rigorosas" deve ser entendido como significando aquelas condições sob as quais uma hibridização ocorre principalmente entre moléculas de ácidos nucleicos homólogas. O termo "condições de hibridização", a este respeito, se refere não apenas às condições reais que prevalecem durante a aglomeração real dos ácidos nucleicos, mas também às condições que prevalecem durante as etapas de lavagem subsequentes. Exemplos de condições de hibridização de rigor elevado são condições sob as quais principalmente moléculas de ácido nucleico que têm pelo menos 90 % ou pelo menos 95 % de identidade de sequência sofrem hibridização. Tais condições de hibridização de rigor elevado são, por exemplo: 4 x SSC a 65 °C e lavagens múltiplas subsequentes em 0,1 x SSC a 65 °C durante aproximadamente 1 hora. O termo "condições de hibridização de rigor elevado", conforme usado no presente documento, também pode significar: hibridização a 68 °C em fosfato de sódio a 0,25 M, pH de 7,2, SDS a 7 %, EDTA a 1 mM e BSA a 1 % durante 16 horas e subsequentemente lavando duas vezes com 2 x SSC e SDS a 0,1 % a 68 °C. De preferência, a hibridização ocorre sob condições rigorosas. Condições de hibridização menos rigorosas são, por exemplo: hibridização em 4 x SSC a 37 °C e subsequentes lavagens múltiplas em 1 x SSC em temperatura ambiente.

[087] Reação de hipersensibilidade: Uma reação de defesa da planta que inclui morte celular controlada do tecido do hospedeiro no local da infecção, fortalecimento da parede celular da planta por meio de lignificação e formação calosa, formação de fitoalexinas e produção de proteínas relacionadas à patogênese (Pathogenesis-Related, PR).

[088] Diminuição/redução de morte celular e redução da atividade indutora de morte celular: Característica de uma proteína que compreende pelo menos uma substituição de aminoácido e é adequada para aumentar a resistência a pelo menos um patógeno. A diminuição ou redução da morte celular é evidente em virtude de um número reduzido de aborto de folhas durante o desenvolvimento de uma planta comparado com uma planta que compreende a proteína que tem a sequência de aminoácidos de tipo selvagem correspondente sem substituição de pelo menos um aminoácido.

[089] Uma abordagem alternativa para provar que uma proteína indutora de resistência leva à morte celular diminuída ou reduzida é a transformação biolística de uma folha com um cassete de expressão que compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína de acordo com a invenção e uma segunda folha tratada da mesma maneira usando uma sequência que codifica uma proteína sem substituição de aminoácido, em que ambas as folhas são cotransformadas com um gene repórter de luciferase. Após 16h, a indução da morte celular é medida pela atividade de luciferase expressa. Um ácido nucleico que leva a mais atividade de luciferase do que o ácido nucleico da folha comparativa mostra redução da indução de morte celular.

[090] Sequência sinalizadora de uma proteína: Uma sequência de aminoácidos dentro de uma proteína que geralmente está localizada na parte n-terminal de uma proteína e pode, por exemplo, começar após o primeiro aminoácido n-terminal. As sequências sinalizadoras geralmente consistem em 13-36 aminoácidos. Na maioria dos casos, elas possuem uma parte central hidrofóbica forte que se estende por 10-15 aminoácidos ao longo dos quais frequentemente podem ser encontrados: alanina, leucina, valina, isoleucina e fenilalanina. A sequência sinalizadora é, de modo geral, responsável pelo transporte da proteína até seu local final dentro da célula. No entanto, a sequência sinalizadora nem sempre é necessária para a função de uma proteína e muitas vezes é removida depois que a proteína atingiu sua localização final. Por exemplo, o sistema imune de uma planta geralmente pode reconhecer proteínas Avr patogênicas, mesmo que estas proteínas Avr não tenham sua sequência sinalizadora de ocorrência natural.

[091] Sequência de aminoácidos de tipo selvagem ou proteína de tipo selvagem: Uma sequência de aminoácidos que constrói um composto de proteína que existe na natureza.

[092] Substituição que leva a uma diminuição da morte celular durante uma reação de hipersensibilidade: É uma substituição na sequência de aminoácidos de uma proteína de resistência e/ou proteína de avirulência. A taxa de morte celular durante ou como consequência de uma reação de hipersensibilidade (na qual o desencadeamento ou manutenção da reação de hipersensibilidade é afetado pela proteína de resistência ou pela proteína de avirulência ou ambas) é reduzida comparado com uma reação de hipersensibilidade (que ocorre sob circunstâncias comparáveis) cujo desencadeamento ou manutenção é afetado pela proteína de resistência ou proteína de avirulência ou ambas sem a substituição. No entanto, as proteínas que compreendem a substituição ainda são capazes de afetar o desencadeamento ou manutenção de uma reação de hipersensibilidade e são, portanto, proteínas funcionais nas quais a substituição que leva a uma perda completa de função não está incluída.

[093] Em uma modalidade, a proteína de resistência de planta é selecionada a partir do grupo que consiste em: R3a (CC; AAW48299), Rpi-blb3, R2, Rpi-abpt, Rpi-edn1, R1, Rpi-blb2, Rpi-blb1, Rpi-pta1, Rpi- sto1, Rpi-vnt1.1, Rpi-edn2, R9a, R8, Rpi-chc1, R3b (CC; AEC47890), Mla1_Barley, Mla13_Barley, Rpg1-b_Soybean, RPM1 (CC; CAA61131), RPS2 (CC; AEE85156), RPS5 (CC; AEE28852), BS2 (CC; AAF09256), Rxo1 (AAX31149), I-2_Tomato, Pi-ta (AF207842), Piz-t (ABC73398), Pia Rga4 (BAK39922), Pia Rga5 (BAK39930), Pii-1 (BAN59294), Pik-1

(ADZ48537), Pik-2 (ADZ48538), Pikh-1 (AET36549), Pikm1-TS (BAG71909), Pikm2-TS (BAG71908), Pikp-1 (ADV58352), Pikp-2 (ADV58351), Piks-1 (AET36547), Piks-2 (AET36548), Rps1k- 1_Soybean, Rps1k-2_Soybean, L3 (CC; BAJ33559), N'_Tobacco, RX1 (CC; CAB50786), RX2 (CC; CAB56299), Pvr4_Pepper, Pvr9_Pepper, Tm2_Tomato, Tm2^2_Tomato, Tsw_Pepper, Sw-5b_Tomato, Rsv1_3gG2, Pm2, PM3A (CC; AAY21626) e PM3F.

[094] Em outra modalidade, a proteína de avirulência é selecionada a partir do grupo que consiste em: Avr3a_Phytophthora, Avr2_Phytophthora_infestans, Avr1 _Phytophthora_infestans, Avrblb2, Avr-blb1=Avr-sto1, Avr-vnt1 (PITG_16294)_Phytophthora, Avrblb2, Avr8_Phytophthora_infestans, PITG_16245 (Avr-chc1)_Phytophthora, Avr3b (PITG_18215)_Phytophthora, Avra1_(AvrMla1)_Blumeria, Avra13_(AvrMla13)_Blumeria, AvrB_Pseudomonas, AvrRpm1, AvrPpiA1_Pseudomonas, AvrRpt2_Pseudomonas, AvrPphB (HopAR1)_Pseudomonas, AvrBs2_Xanthomonas, AvrRxo1, Avr2 (SIX3)_Fusarium oxysporum, SIX5_Fusarium oxysporum, AVR Pita (AF207841), AvrPiz-t (ACF39937), AVR1-CO39 (AF463528_3), AVR- Pia (BAH59484), Avr-Pii (BAH59485), alelo D de Avr Pik_km_kp (alelo pex31-D) (BAH59486), Avr1k_Phytophthora sojae, vírus do mosqueado suave de pimentão CP_Pepper (Avr L3&4), vírus X de batata CP_Potato, vírus do mosqueado de pimentão Nlb_Pepper (Avr Pvr4&9), vírus mosaico de tabaco MP_Tobacco de 30 kDa (AvrTm2), vírus da murcha manchada de tomate NSs_Tomato (AvrTsw), vírus da murcha manchada de tomate NSm_Tomato (AvrSw-5b), vírus mosaico de soja P3 cistron_Soybean (AvrRsv1_ 3gG2), AvrPm2 e AvrPm3a2_f2.

[095] Em ainda outra modalidade, a molécula de ácidos nucleicos compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de resistência de planta da classe de proteínas de resistência CC-NBS- LRR e uma proteína de avirulência, em que a proteína de resistência de planta e a proteína de avirulência são uma combinação selecionada a partir das seguintes combinações: R3a (CC; AAW48299) e Avr3a_Phytophthora, Rpi-blb3 e Avr2 _Phytophthora_infestans, R2 e Avr2 _Phytophthora_infestans, Rpi-abpt e Avr2 _Phytophthora_infestans, pi-edn1 e Avr2 _Phytophthora_infestans, R1 e Avr1 _Phytophthora_infestans, Rpi-blb2 e Avrblb2, Rpi-blb1 e Avr- blb1=Avr-sto1, Rpi-pta1 e Avr-blb1=Avr-sto1, Rpi-sto1 e Avr-blb1=Avr- sto1, Rpi-vnt1.1 e Avr-vnt1 (PITG_16294)_Phytophthora, Rpi-edn2 e Avrblb2, R9a e Avrblb2, R8 e Avr8_Phytophthora_infestans, Rpi-chc1 e PITG_16245 (Avr-chc1)_Phytophthora, R3b (CC; AEC47890) e Avr3b (PITG_18215)_Phytophthora, Mla1_Barley e Avra1_(AvrMla1)_Blumeria, Mla13_Barley e Avra13_(AvrMla13)_Blumeria, Rpg1-b_Soybean e AvrB_Pseudomonas, RPM1 (CC; CAA61131) e AvrB_Pseudomonas, RPM1 (CC; CAA61131) e AvrRpm1, RPM1 (CC; CAA61131) e AvrPpiA1_Pseudomonas, RPS2 (CC; AEE85156) e AvrRpt2_Pseudomonas, RPS5 (CC; AEE28852) e AvrPphB (HopAR1)_Pseudomonas, BS2 (CC; AAF09256) e AvrBs2_Xanthomonas, Rxo1 (AAX31149) e AvrRxo1, I-2_Tomato e Avr2 (SIX3)_Fusarium oxysporum, I-2_Tomato e SIX5_Fusarium oxysporum, Pi-ta (AF207842) e AVR Pita (AF207841), Piz-t (ABC73398) e AvrPiz-t (ACF39937), Pia Rga4 (BAK39922) e AVR1-CO39 (AF463528_3), Pia Rga4 (BAK39922) e AVR-Pia (BAH59484), Pia Rga5 (BAK39930) e AVR1-CO39 (AF463528_3), Pia Rga5 (BAK39930) e AVR-Pia (BAH59484), Pii-1 (BAN59294) e Avr-Pii (BAH59485), Pik-1 (ADZ48537) e alelo D de Avr Pik_km_kp (alelo pex31-D) (BAH59486), Pik-2 (ADZ48538) e alelo D de Avr Pik_km_kp (alelo pex31-D) (BAH59486), Pikh-1 (AET36549) e alelo D de Avr Pik_km_kp (alelo pex31-D) (BAH59486), Pikh-2 (AET36550) e alelo D de Avr Pik_km_kp (alelo pex31-D) (BAH59486), Pikm1-TS (BAG71909) e alelo D de Avr

Pik_km_kp (alelo pex31-D) (BAH59486), Pikm2-TS (BAG71908) e alelo D de Avr Pik_km_kp (alelo pex31-D) (BAH59486), Pikp-1 (ADV58352) e alelo D de Avr Pik_km_kp (alelo pex31-D) (BAH59486), Pikp-2 (ADV58351) e alelo D de Avr Pik_km_kp (alelo pex31-D) (BAH59486), Piks-1 (AET36547) e alelo D de Avr Pik_km_kp (alelo pex31-D) (BAH59486), Piks-2 (AET36548) e alelo D de Avr Pik_km_kp (alelo pex31-D) (BAH59486), Rps1k-1_Soybean e Avr1k_Phytophthora sojae, Rps1k-2_Soybean e Avr1k_Phytophthora sojae, L3 (CC; BAJ33559) e vírus do mosqueado suave de pimentão CP_Pepper (Avr L3&4), N'_Tobacco e vírus do mosqueado suave de pimentão CP_Pepper (Avr L3&4), RX1 (CC; CAB50786) e vírus X de batata CP_Potato, RX2 (CC; CAB56299) e vírus X de batata CP_Potato, Pvr4_Pepper e vírus do mosqueado de pimentão Nlb_Pepper (Avr Pvr4&9), Pvr9_Pepper e vírus do mosqueado de pimentão Nlb_Pepper (Avr Pvr4&9), Tm2_Tomato e vírus mosaico de tabaco MP_Tobacco de 30 kDa (AvrTm2), Tm2^2_Tomato e vírus mosaico de tabaco MP_Tobacco de 30 kDa (AvrTm2), Tsw_Pepper e vírus da murcha manchada de tomate NSs_Tomato (AvrTsw), Sw-5b_Tomato e vírus da murcha manchada de tomate NSm_Tomato (AvrSw-5b), Rsv1_3gG2 e vírus mosaico de soja P3 cistron_Soybean (AvrRsv1_ 3gG2), Pm2 e AvrPm2, PM3A (CC; AAY21626) e AvrPm3a2_f2, e PM3F e AvrPm3a2_f2.

[096] Em uma modalidade, a molécula de ácidos nucleicos de acordo com a invenção codifica:

[097] uma proteína de resistência de planta da classe de proteínas de resistência CC-NBS-LRR e

[098] uma proteína de avirulência;

[099] e em que a proteína de resistência de planta e a proteína de avirulência são uma combinação selecionada a partir do grupo que consiste em:

[100] SEQ ID NO: 94 e SEQ ID NO: 96,

[101] SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 47,

[102] SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 47,

[103] SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 47,

[104] SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 47,

[105] SEQ ID NO: 55 e SEQ ID NO: 58,

[106] SEQ ID NO: 60 e SEQ ID NO: 63,

[107] SEQ ID NO: 65 e SEQ ID NO: 68,

[108] SEQ ID NO: 70 e SEQ ID NO: 68,

[109] SEQ ID NO: 73 e SEQ ID NO: 68,

[110] SEQ ID NO: 76 e SEQ ID NO: 78,

[111] SEQ ID NO: 80 e SEQ ID NO: 82,

[112] SEQ ID NO: 266 e SEQ ID NO: 82,

[113] SEQ ID NO: 86 e SEQ ID NO: 88,

[114] SEQ ID NO: 90 e SEQ ID NO: 92,

[115] SEQ ID NO: 98 e SEQ ID NO: 100,

[116] SEQ ID NO: 102 e SEQ ID NO: 104,

[117] SEQ ID NO: 106 e SEQ ID NO: 109,

[118] SEQ ID NO: 111 e SEQ ID NO: 113,

[119] SEQ ID NO: 119 e SEQ ID NO: 113,

[120] SEQ ID NO: 119 e SEQ ID NO: 115,

[121] SEQ ID NO: 119 e SEQ ID NO: 117,

[122] SEQ ID NO: 121 e SEQ ID NO: 123,

[123] SEQ ID NO: 125 e SEQ ID NO: 127,

[124] SEQ ID NO: 129 e SEQ ID NO: 131,

[125] SEQ ID NO: 133 e SEQ ID NO: 135,

[126] SEQ ID NO: 137 e SEQ ID NO: 139,

[127] SEQ ID NO: 137 e SEQ ID NO: 141,

[128] SEQ ID NO: 144 e SEQ ID NO: 147,

[129] SEQ ID NO: 150 e SEQ ID NO: 153,

[130] SEQ ID NO: 155 e SEQ ID NO: 159,

[131] SEQ ID NO: 155 e SEQ ID NO: 161,

[132] SEQ ID NO: 157 e SEQ ID NO: 159,

[133] SEQ ID NO: 157 e SEQ ID NO: 161,

[134] SEQ ID NO: 163 e SEQ ID NO: 165,

[135] SEQ ID NO: 167 e SEQ ID NO: 185,

[136] SEQ ID NO: 176 e SEQ ID NO: 185,

[137] SEQ ID NO: 173 e SEQ ID NO: 185,

[138] SEQ ID NO: 176 e SEQ ID NO: 185,

[139] xI) SEQ ID NO: 179 e SEQ ID NO: 185,

[140] xIi) SEQ ID NO: 182 e SEQ ID NO: 185,

[141] xOii) SEQ ID NO: 187 e SEQ ID NO: 185,

[142] xIiii) SEQ ID NO: 190 e SEQ ID NO: 185,

[143] xIiv) SEQ ID NO: 193 e SEQ ID NO: 185,

[144] xIv) SEQ ID NO: 196 e SEQ ID NO: 185,

[145] xIvi) SEQ ID NO: 199 e SEQ ID NO: 201,

[146] xIvii) SEQ ID NO: 205 e SEQ ID NO: 201,

[147] xIviii) SEQ ID NO: 207 e SEQ ID NO: 209,

[148] xIix) SEQ ID NO: 211 e SEQ ID NO: 209,

[149] SEQ ID NO: 213 e SEQ ID NO: 216,

[150] Ii) SEQ ID NO: 218 e SEQ ID NO: 216,

[151] Iii) SEQ ID NO: 221 e SEQ ID NO: 223,

[152] Iiii) SEQ ID NO: 225 e SEQ ID NO: 223,

[153] Iiv) SEQ ID NO: 228 e SEQ ID NO: 230,

[154] Iv) SEQ ID NO: 232 e SEQ ID NO: 230,

[155] Ivi) SEQ ID NO: 234 e SEQ ID NO: 236,

[156] Ivii) SEQ ID NO: 238 e SEQ ID NO: 240,

[157] Iviii) SEQ ID NO: 242 e SEQ ID NO: 244,

[158] Iix) SEQ ID NO: 246 e SEQ ID NO: 249,

[159] Ix) SEQ ID NO: 252 e SEQ ID NO: 255, e

[160] Ixi) SEQ ID NO: 258 e SEQ ID NO: 255.

[161] De preferência, a combinação de genes é R3a (CC; AAW48299) e Avr3a_Phytophthora.

[162] A tabela a seguir fornece informações adicionais sobre genes de resistência CC-NBS-LRR de diferentes culturas e seus genes Avr correspondentes adequados para serem usados na invenção, em que o uso como uma combinação de gene de resistência e gene Avr correspondente é preferido: Tabela 1: Lista de proteínas de resistência CC-NBS-LRR com proteínas de avirulência correspondentes.

[163] As informações detalhadas da sequência são fornecidas em uma lista adicional. Nem todas as variantes conhecidas de proteínas funcionais codificadas por diferentes alelos estão listadas. SEQ ID NO: = sequência de nucleotídeos como cDNA; (SEQ ID NO: entre parênteses curvos = sequência de aminoácidos); [SEQ ID NO: entre colchetes = sequência genômica]. Proteínas de Proteínas de Avirulência Correspondentes Resistência: Rpi-blb3 Avr2 _Phytophthora_infestans SEQ ID NO 44 SEQ ID NO 46 (SEQ ID NO 45) (SEQ ID NO 47) R2 Avr2 _Phytophthora_infestans SEQ ID NO 48 SEQ ID NO 46 (SEQ ID NO 49) (SEQ ID NO 47) Rpi-abpt Avr2 _Phytophthora_infestans SEQ ID NO 50 SEQ ID NO 46 (SEQ ID NO 51) (SEQ ID NO 47) Rpi-edn1 Avr2 _Phytophthora_infestans SEQ ID NO 52 SEQ ID NO 46 (SEQ ID NO 53) (SEQ ID NO 47) R1 Avr1 _Phytophthora_infestans SEQ ID NO 54 SEQ ID NO 57 (SEQ ID NO 55) (SEQ ID NO 58) [SEQ ID NO 56] Rpi-blb2 Avrblb2 SEQ ID NO 59 SEQ ID NO 62

Proteínas de Proteínas de Avirulência Correspondentes Resistência: (SEQ ID NO 60) (SEQ ID NO 63) [SEQ ID NO 61] Rpi-blb1 Avr-blb1=Avr-sto1 SEQ ID NO 64 SEQ ID NO 67 (SEQ ID NO 65) (SEQ ID NO 68) [SEQ ID NO 66] Rpi-pta1 Avr-blb1=Avr-sto1 SEQ ID NO 69 SEQ ID NO 67 (SEQ ID NO 70) (SEQ ID NO 68) [SEQ ID NO 71] Rpi-sto1 Avr-blb1=Avr-sto1 SEQ ID NO 72 SEQ ID NO 67 (SEQ ID NO 73) (SEQ ID NO 68) [SEQ ID NO 74] Rpi-vnt1.1 Avr-vnt1 (PITG_16294)_Phytophthora SEQ ID NO 75 SEQ ID NO 77 (SEQ ID NO 76) (SEQ ID NO 78)

Rpi-edn2 Avrblb2 SEQ ID NO 79 SEQ ID NO 81 (SEQ ID NO 80) (SEQ ID NO 82) Avrblb2 R9a SEQ ID NO 81 (SEQ ID NO 266) (SEQ ID NO 82) R8 Avr8_Phytophthora_infestans SEQ ID NO 85 SEQ ID NO 87 (SEQ ID NO 86) (SEQ ID NO 88) Rpi-chc1 PITG_16245 (Avr-chc1)_Phytophthora SEQ ID NO 89 SEQ ID NO 91 (SEQ ID NO 90) (SEQ ID NO 92) R3a (CC; Avr3a_Phytophthora AAW48299) SEQ ID NO 95 SEQ ID NO 93 (SEQ ID NO 96) (SEQ ID NO 94) R3b (CC; Avr3b (PITG_18215)_Phytophthora AEC47890) SEQ ID NO 99 SEQ ID NO 97 (SEQ ID NO 100)

Proteínas de Proteínas de Avirulência Correspondentes Resistência: (SEQ ID NO 98) Mla1_Barley Avra1_(AvrMla1)_Blumeria SEQ ID NO 101 SEQ ID NO 103 (SEQ ID NO 102) (SEQ ID NO 104) Mla13_Barley Avra13_(AvrMla13)_Blumeria SEQ ID NO 105 SEQ ID NO 108 (SEQ ID NO 106) (SEQ ID NO 109) [SEQ ID NO 107] Rpg1-b_Soybean AvrPpiA1_ SEQ ID NO 110 Pseudomon (SEQ ID NO 111) AvrB_Pseudomonas AvrRpm1 as RPM1 (CC; SEQ ID NO 112 SEQ ID NO 114 SEQ ID NO CAA61131) (SEQ ID NO 113) (SEQ ID NO 115) 116 SEQ ID NO 118 (SEQ ID NO (SEQ ID NO 119) 117) RPS2 (CC; AvrRpt2_Pseudomonas AEE85156) SEQ ID NO 122 SEQ ID NO 120 (SEQ ID NO 123) (SEQ ID NO 121) RPS5 (CC; AvrPphB (HopAR1)_Pseudomonas AEE28852) SEQ ID NO 126 SEQ ID NO 124 (SEQ ID NO 127) (SEQ ID NO 125) BS2 (CC; AvrBs2_Xanthomonas AAF09256) SEQ ID NO 130 SEQ ID NO 128 (SEQ ID NO 131) (SEQ ID NO 129) Rxo1 (AAX31149) AvrRxo1 SEQ ID NO 132 SEQ ID NO 134 (SEQ ID NO 133) (SEQ ID NO 135) SIX5_Fusarium I-2_Tomato Avr2 (SIX3)_Fusarium oxysporum oxysporum SEQ ID NO 136 SEQ ID NO 138 SEQ ID NO 140 (SEQ ID NO 137) (SEQ ID NO 139) (SEQ ID NO 141) [SEQ ID NO 142] Pi-ta (AF207842) AVR Pita (AF207841) SEQ ID NO 143 SEQ ID NO 146

Proteínas de Proteínas de Avirulência Correspondentes Resistência: (SEQ ID NO 144) (SEQ ID NO 147) [SEQ ID NO 145] [SEQ ID NO 148] Piz-t (ABC73398) AvrPiz-t (ACF39937) SEQ ID NO 149 SEQ ID NO 152 (SEQ ID NO 150) (SEQ ID NO 153) (SEQ ID NO 151) Pia Rga4 AVR1-CO39 (AF463528_3) (BAK39922) SEQ ID NO 158 SEQ ID NO 154 (SEQ ID NO 159) (SEQ ID NO 155) AVR-Pia (BAH59484) Pia Rga5 SEQ ID NO 160 (BAK39930) (SEQ ID NO 161) SEQ ID NO 156 (SEQ ID NO 157) Pii-1 (BAN59294) Avr-Pii (BAH59485) SEQ ID NO 162 SEQ ID NO 164 (SEQ ID NO 163) (SEQ ID NO 165) Pik-1 (ADZ48537) alelo D de Avr Pik_km_kp (alelo pex31-D) SEQ ID NO 166 (BAH59486) (SEQ ID NO 167) SEQ ID NO 184 Pik-2 (ADZ48538) (SEQ ID NO 185) SEQ ID NO 169 (SEQ ID NO 170) [SEQ ID NO 171] Pikh-1 (AET36549) SEQ ID NO 172 (SEQ ID NO 173) [SEQ ID NO 174] Pikh-2 (AET36550) SEQ ID NO 175 (SEQ ID NO 176) [SEQ ID NO 177] Pikm1-TS (BAG71909) SEQ ID NO 178 (SEQ ID NO 179) [SEQ ID NO 180]

Proteínas de Proteínas de Avirulência Correspondentes Resistência: Pikm2-TS (BAG71908) SEQ ID NO 181 (SEQ ID NO 182) alelo D de Avr Pik_km_kp (alelo pex31-D) [SEQ ID NO 183] (BAH59486) Pikp-1 (ADV58352) SEQ ID NO 184 SEQ ID NO 186 (SEQ ID NO 185) (SEQ ID NO 187) [SEQ ID NO 188] Pikp-2 (ADV58351) SEQ ID NO 189 (SEQ ID NO 190) [SEQ ID NO 191] Piks-1 (AET36547) SEQ ID NO 192 (SEQ ID NO 193) [SEQ ID NO 194] Piks-2 (AET36548) SEQ ID NO 195 (SEQ ID NO 196) [SEQ ID NO 197] Rps1k-1_Soybean SEQ ID NO 198 Avr1b_Phytophthor Avr1k_Phytophthora sojae (SEQ ID NO 199) a sojae SEQ ID NO 200 Rps1k-2_Soybean SEQ ID NO 202 (SEQ ID NO 201) SEQ ID NO 204 (SEQ ID NO 203) (SEQ ID NO 205) vírus do mosqueado suave de pimentão L3 (CC; BAJ33559) CP_Pepper (Avr L3&4) SEQ ID NO 206 SEQ ID NO 208 (SEQ ID NO 207) (SEQ ID NO 209) vírus do mosqueado suave de pimentão N'_Tobacco CP_Pepper (Avr L3&4) SEQ ID NO 210 SEQ ID NO 208 (SEQ ID NO 211) (SEQ ID NO 209) RX1 (CC; vírus X de batata CP_Potato CAB50786) SEQ ID NO 215

Proteínas de Proteínas de Avirulência Correspondentes Resistência: SEQ ID NO 212 (SEQ ID NO 216) (SEQ ID NO 213) [SEQ ID NO 214] RX2 (CC; CAB56299) SEQ ID NO 217 (SEQ ID NO 218) [SEQ ID NO 219] Pvr4_Pepper SEQ ID NO 220 vírus do mosqueado de pimentão Nlb_Pepper (SEQ ID NO 221) (Avr Pvr4&9) Pvr9_Pepper SEQ ID NO 222 SEQ ID NO 224 (SEQ ID NO 223) (SEQ ID NO 225) [SEQ ID NO 226] Tm2_Tomato SEQ ID NO 227 vírus mosaico de tabaco MP_Tobacco de 30 (SEQ ID NO 228) kDa (AvrTm2) Tm2^2_Tomato SEQ ID NO 229 SEQ ID NO 231 (SEQ ID NO 230) (SEQ ID NO 232) vírus da murcha manchada de tomate Tsw_Pepper NSs_Tomato (AvrTsw) SEQ ID NO 233 SEQ ID NO 235 (SEQ ID NO 234) (SEQ ID NO 236) vírus da murcha manchada de tomate Sw-5b_Tomato NSm_Tomato (AvrSw-5b) SEQ ID NO 237 SEQ ID NO 239 (SEQ ID NO 238) (SEQ ID NO 240) vírus mosaico de soja P3 cistron_Soybean - Rsv1_3gG2 AvrRsv1_ 3gG2 SEQ ID NO 241 SEQ ID NO 243 (SEQ ID NO 242) (SEQ ID NO 244) Pm2 AvrPm2 SEQ ID NO 245 SEQ ID NO 248 (SEQ ID NO 246) (SEQ ID NO 249) [SEQ ID NO 247] [SEQ ID NO 250]

Proteínas de Proteínas de Avirulência Correspondentes Resistência: PM3A (CC; AAY21626) SEQ ID NO 251 AvrPm3a2_f2 (SEQ ID NO 252) SEQ ID NO 254 [SEQ ID NO 253] (SEQ ID NO 255) PM3F [SEQ ID NO 256] SEQ ID NO 257 (SEQ ID NO 258) [SEQ ID NO 259]

[164] Conforme fica evidente a partir da Tabela 1, por exemplo, a combinação da proteína de resistência RPM1 (ou o gene que codifica a proteína) com uma das proteínas de avirulência AvrB_Pseudomonas ou AvrRpm1 ou AvrPpiA1_Pseudomonas (ou com os genes que codificam estas proteínas) dentro de uma célula de planta pode desencadear (direta ou indiretamente) uma resposta imune de hipersensibilidade. Cada um dos genes pode ser modificado conforme descrito em outra parte no presente documento para reduzir ou diminuir a morte celular durante a reação de hipersensibilidade.

[165] A proteína de resistência de planta e/ou a proteína de avirulência da presente invenção compreende pelo menos uma substituição de aminoácido comparado com a respectiva sequência de aminoácidos de tipo selvagem, resultando em uma redução ou diminuição da morte celular durante uma reação de hipersensibilidade.

[166] Em uma modalidade, a molécula de ácidos nucleicos de acordo com a invenção codifica uma proteína de avirulência que compreende pelo menos uma substituição de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em: K59/M82, R59/M82, H59/M82, C59/M82, N59/M82, Q59/M82, T59/M82, S59/M82, M59/M82, G59/M82, A59/M82, L59/M82, V59/M82, I59/M82 dentro da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Isto significa que a molécula de ácidos nucleicos codifica uma proteína de avirulência que compreende essencialmente o aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 2, mas esta sequência é modificada por uma ou mais das substituições de aminoácidos fornecidas acima. Esta proteína de avirulência pode ser a proteína de avirulência Avr3a, em que a proteína de avirulência opcionalmente carece de uma sequência sinalizadora.

[167] Também é possível usar a proteína de avirulência nativa Avr3a que inclui a sequência sinalizadora e substituindo os aminoácidos de acordo com a tabela a seguir: Tabela 2: Variantes de Avr3a que compreendem diferentes substituições de acordo com a invenção

[168] Vinte variantes Avr3aE59X/M82 e o alelo Avr3aK59/I82 nativo são listados juntamente com as posições de substituição correspondentes e SEQ ID NOs. Além disso, é fornecida a propriedade química do aminoácido na posição 59.

SEQ ID NO SEQ ID NO Propriedade química Sequência de ácidos nucleicos Sequência de proteína do aminoácido na posição 59 que codifica a proteína K59/I82 1 2 básico K59/M82 4 5 básico R59/M82 6 7 básico H59/M82 8 9 básico D59/M82 10 11 ácido E59/M82 12 13 ácido F59/M82 14 15 aromático Y59/M82 16 17 aromático W59/M82 18 19 aromático P59/M82 20 21 não polar C59/M82 22 23 polar N59/M82 24 25 polar Q59/M82 26 27 polar T59/M82 28 29 polar S59/M82 30 31 polar M59/M82 32 33 não polar G59/M82 34 35 não polar A59/M82 36 37 não polar

SEQ ID NO SEQ ID NO Propriedade química Sequência de ácidos nucleicos Sequência de proteína do aminoácido na posição 59 que codifica a proteína L59/M82 38 39 alifático V59/M82 40 41 alifático I59/M82 42 43 alifático

[169] Em uma modalidade, a molécula de ácidos nucleicos de acordo com a invenção codifica uma proteína de resistência que compreende pelo menos uma substituição de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em: K35E, K37M, E61V, E61K, E135N e E136N dentro da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 269. Isto significa que a molécula de ácidos nucleicos codifica uma proteína de resistência de planta que compreende essencialmente o aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 269, mas que esta sequência é modificada por uma ou mais das substituições de aminoácidos fornecidas acima. Esta proteína de resistência pode ser R3a.

[170] Além disso, é fornecido um polipeptídeo codificado pela molécula de ácidos nucleicos da presente invenção. O polipeptídeo pode ser uma proteína de resistência de planta ou uma proteína de avirulência. A proteína de avirulência pode não ter a sequência sinalizadora de ocorrência natural que é responsável pelo processamento intracelular da proteína de avirulência na célula do patógeno. Uma proteína de avirulência sem a sequência sinalizadora é uma proteína que não ocorre na natureza. A invenção também abrange uma combinação de pelo menos uma proteína de resistência e pelo menos uma proteína de avirulência, em que pelo menos uma das proteínas compreende pelo menos uma substituição de aminoácido conforme descrito em outra parte no presente documento. Combinações potenciais de genes de resistência e genes de avirulência são descritas em outra parte no presente documento. A invenção também abrange uma solução que compreende pelo menos uma proteína ou pelo menos uma combinação de proteínas de acordo com a invenção. A solução pode ser uma solução aquosa e pode compreender outros compostos como um tampão de pH e estabilizantes. Parte da invenção é também um método para a aplicação externa ou interna da solução a uma planta ou a uma parte da planta. O método compreende as etapas de fornecer uma planta ou parte da planta e aplicar a solução ao tecido externo ou interno da planta ou parte da mesma. A solução pode ser pulverizada ou injetada.

[171] Também é fornecido um vetor ou cassete de expressão que compreende a molécula de ácidos nucleicos da presente invenção. Um exemplo de um vetor de acordo com a invenção é ilustrado pela Figura

18. O vetor ilustrado inclui sequências codificadoras para as proteínas R3a e Avr3a. A estrutura destas duas proteínas pode ser adaptada para incluir substituições de aminoácidos conforme descrito no presente documento. Um exemplo de um cassete de expressão é fornecido por SEQ ID NO: 270. Além disso, a Figura 19 fornece uma ilustração de um cassete de expressão adequado.

[172] O ácido nucleico de acordo com a invenção que codifica uma proteína de resistência ou uma proteína de avirulência ou ambas pode estar sob o controle de um promotor indutível por patógeno ou um promotor heterólogo para a proteína de resistência ou a proteína de avirulência ou ambos. O promotor indutível por patógeno pode ser um promotor indutível por patógeno sintético. Os promotores indutíveis por patógeno sintéticos são feitos pelo homem e não ocorrem na natureza.

[173] O vetor pode ser um plasmídeo, um cosmídeo, um fago ou um vetor de expressão, um vetor de transformação, vetor de transporte ou vetor de clonagem, pode ser fita simples ou dupla, linear ou circular ou pode ser um hospedeiro procariota ou eucariota através de integração em seu genoma ou transformação extracromossômica. O vetor pode ser heterólogo à proteína de resistência ou à proteína de avirulência ou ambas. Os vetores são construções sintéticas feitas pelo homem e que não ocorrem na natureza. De preferência, a sequência de nucleotídeos da invenção é operativamente ligada em um vetor de expressão a uma ou mais sequências regulatórias que permitem a transcrição e, opcionalmente, a expressão em uma célula hospedeira procariota ou eucariota. Como um exemplo, a sequência de nucleotídeos pode estar sob o controle de um promotor ou terminador adequado. Promotores adequados podem ser promotores que são induzidos constitutivamente (consulte, por exemplo, o promotor 35S do "vírus mosaico da couve-flor" (Odell et al. 1985)); promotores particularmente adequados são aqueles promotores que são indutíveis por patógenos (consulte, por exemplo, o promotor PR1 da salsa (Rushton et al., 1996)). Promotores indutíveis por patógenos particularmente adequados são promotores sintéticos ou quiméricos que não ocorrem na natureza, são compostos por vários elementos e contêm um promotor mínimo bem como, a montante do promotor mínimo, pelo menos um elemento cis regulador que atua como o sítio de ligação para fatores de transcrição especiais. Os promotores quiméricos são concebidos de forma personalizada e são induzidos por vários fatores ou reaproveitados. Exemplos de tais promotores podem ser encontrados nos documentos WO2000/29592 e WO2007/147395. Um exemplo de um terminador adequado é o terminador nos (Depicker et al., 1982).

[174] Além disso, é fornecida uma célula ou célula hospedeira que compreende a molécula de ácidos nucleicos, o polipeptídeo ou o vetor ou cassete de expressão da presente invenção. De preferência, a célula compreende a molécula de ácidos nucleicos da presente invenção como um transgene ou como um elemento endógeno, em que a molécula de ácidos nucleicos presente como um elemento endógeno é, de preferência, uma proteína de resistência. A este respeito, a invenção também abrange células cujo genoma foi modificado para codificar uma ou mais substituições de acordo com a invenção em um endogene, em que o endogene codifica uma proteína de resistência. As modificações podem ser alcançadas pelo uso de tecnologias de edição genômica, conforme descrito em outra parte no presente documento. Também está incluída uma planta que compreende uma ou mais destas células ou que é regenerada a partir de tal célula.

[175] O vetor ou cassete de expressão pode, por exemplo, ser introduzido na célula (hospedeira) por meio de conjugação, mobilização, transformação biolística, transformação conferida por Agrobacterium, transfecção, transdução, infiltração a vácuo ou eletroporação. Métodos para a introdução do vetor, bem como métodos para a preparação dos vetores e cassetes de expressão, são familiares para aqueles versados na técnica (consulte, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 3ª Ed., 2001).

[176] Em uma modalidade, a célula hospedeira pode ser uma célula procariota, por exemplo, uma célula bacteriana. Em outra modalidade, a célula hospedeira pode ser uma célula eucariota (por exemplo, uma célula de planta ou uma célula de levedura). Células hospedeiras bacterianas particularmente preferidas são Agrobacterium tumefaciens, A. rhizogenes e E. coli.

[177] É fornecida ainda uma planta ou parte da mesma que compreende a molécula de ácidos nucleicos da presente invenção ou compreende a célula da presente invenção e uma planta ou parte da mesma regenerada a partir da dita célula.

[178] Também é fornecida uma semente ou progênie da planta da presente invenção, em que a semente ou a progênie compreende a molécula de ácidos nucleicos da presente invenção como um transgene ou um endogene.

[179] Um aspecto adicional da invenção é um estoque de sementes que compreende sementes que contêm o ácido ou ácidos nucleicos de acordo com a invenção.

O ácido ou ácidos nucleicos de acordo com a invenção podem estar presentes transgênica ou endogenamente.

O estoque de sementes e as sementes podem ser tratadas tecnicamente.

A invenção, portanto, também compreende um estoque de sementes tratadas tecnicamente e sementes tratadas tecnicamente.

As várias modalidades de estoque de sementes tratadas tecnicamente são explicadas em detalhes a seguir, em que o termo estoque de sementes também inclui sementes: o estoque de sementes tratadas tecnicamente pode estar presente na forma polida.

A camada mais externa da semente é removida, de modo que a semente assume um formato mais arredondado.

Isto é útil quando de semeadura.

Um formato perfeitamente uniforme leva a uma distribuição uniforme dos grãos a partir do estoque de sementes.

Além disso, o estoque de sementes tecnicamente tratadas abrange o estoque de sementes em pílulas.

O estoque de sementes é, assim, colocado em uma massa de pílula que protege o estoque de sementes contido na mesma e leva a uma massa maior, de modo que o estoque de sementes empilhadas mostra uma maior capacidade de resistência em relação à deriva pelo vento e é, portanto, menos suscetível a ser soprado pelo vento e, ao mesmo tempo, permite um posicionamento mais preciso durante a semeadura.

Em uma modalidade preferida da invenção, todos os grãos de estoque de sementes empilhadas de um lote ou unidade designada para venda têm essencialmente o mesmo formato e a mesma massa.

Desvios de 5 % no diâmetro e na massa são possíveis.

No entanto, de preferência, os desvios não ultrapassam 1 %. Como um dos componentes principais, a massa de pílula pode conter, por exemplo, um composto mineral tal como argila e/ou turfa, por exemplo.

Outros componentes possíveis são citados no documento US 4.067.141. Além disso, a massa de pílula pode conter agentes químicos adicionais que influenciam positivamente a semeadura na prática.

Estas podem ser substâncias que são consideradas dentre os agentes fertilizantes. Além disso, podem ser fungicidas, inseticidas e/ou agentes antialimentação. Os fungicidas podem ser thiram e/ou himexazol e/ou outros fungicidas. O inseticida pode ser uma substância do grupo dos neonicotinoides. A substância do grupo dos neonicotinoides é, de preferência, imidacloprida (Código ATC: QP53AX17) e/ou clotianidina (número CAS 210880-92-5). Além disso, o inseticida também pode ser a ciflutrina (número CAS 68359-37-5) ou beta-ciflutrina.

[180] O estoque de sementes em pílula é uma modalidade específica do estoque de sementes tratadas. Neste contexto, o estoque de sementes tecnicamente tratadas abrange também o estoque de sementes tratadas. No entanto, a invenção não se limita ao estoque de sementes em pílulas, porém, em vez disso, pode ser aplicada com qualquer forma de estoque de sementes revestidas. A invenção, portanto, também se refere a um estoque de sementes tratadas que inclui o estoque de sementes em pílulas, mas não está limitada ao mesmo. O curativo seco, o curativo úmido e o curativo em suspensão também estão incluídos. O curativo pode, assim, conter pelo menos um corante, de modo que o estoque de sementes tratadas possa ser rapidamente diferenciado do estoque de sementes não tratadas e, além disso, boa visibilidade da qualidade no meio ambiente é assegurada após a semeadura. O curativo também pode conter aqueles agroquímicos que são descritos no contexto de uma massa de pílula. A invenção inclui, assim, tal estoque de sementes tratadas em que o curativo contém pelo menos um agente antialimentação, tal como um inseticida e/ou pelo menos um fungicida. Opcionalmente, podem ser aplicados os assim denominados curativos eletrônicos (curativos por aplicação de energia elétrica). No entanto, o curativo eletrônico não é um curativo no sentido estrito da palavra.

[181] Uma forma adicional de estoque de sementes tecnicamente tratadas é o estoque de sementes incrustadas.

O que é conhecido como revestimento também está incluído neste contexto, bem como o estoque de sementes tratadas com revestimento.

A diferença em relação ao estoque de sementes empilhadas é que os grãos mantêm seu formato original, este método sendo especialmente econômico.

O método é descrito no documento EP 0 334 258 A1, por exemplo.

Uma forma adicional de estoque de sementes tecnicamente tratadas é o estoque de sementes germinadas ou com primer.

O estoque de sementes germinadas é pré-tratado por meio de uma pré-germinação, enquanto que o estoque de sementes com primer foi pré-tratado por meio de um primer ("germinação"). O estoque de sementes pré-germinadas e preparadas tem a vantagem de um tempo de emergência mais curto.

O ponto no tempo de emergência após a semeadura é, ao mesmo tempo, mais sincronizado.

Isto permite um melhor processamento agrotécnico durante o cultivo e principalmente durante a colheita e, adicionalmente, aumenta a quantidade de rendimento.

Na pré-germinação, o estoque de sementes é germinado até que a radícula saia da casca do estoque de sementes, e o processo é subsequentemente interrompido.

No priming, o processo é interrompido antes que a radícula saia da casca do estoque de sementes.

Comparado com o estoque de sementes pré- germinadas, o estoque de sementes que foi submetido a um priming é insensível ao estresse por uma ressecagem e, após tal ressecagem, tem um tempo de armazenamento mais longo comparado com o estoque de sementes pré-germinadas, para os quais uma ressecagem geralmente não é recomendada.

Neste contexto, o estoque de sementes tecnicamente pré-tratadas também inclui o estoque de sementes com primer e ressecadas.

O processo de pré-germinação é explicado no documento US 4.905.411 A.

Várias modalidades de priming são explicadas no documento EP 0 686 340 A1. Além disso, também é possível usar simultaneamente os processos de pílula e priming do estoque de sementes. Este método é descrito no documento EP 2 002 702 B1. O estoque de semente tratado com primer o qual, além disso, está em pílulas, é abrangido pela presente invenção.

[182] O estoque de sementes tecnicamente tratadas pode ser fornecido adicionalmente com uma ou mais das resistências a herbicidas explicadas acima. Isto permite um cultivo agrotécnico ainda mais aprimorado, uma vez que o estoque de sementes tecnicamente tratadas pode ser implantado em um campo que já foi tratado com herbicida e que, portanto, está livre de ervas daninhas.

[183] Além disso, a invenção também abrange uma mistura que contém o estoque de sementes de acordo com a invenção ou as sementes de acordo com a invenção, e uma massa de pílula conforme definido acima. A massa de pílula é, portanto, de preferência, concretizada como uma massa de pílula conforme definido acima.

[184] Com o armazenamento do estoque de sementes de acordo com a invenção, de preferência, devem ser escolhidas condições de armazenamento que não afetem negativamente a estabilidade ou o tempo de armazenamento do estoque de sementes. Flutuações na umidade podem, especialmente, ter um efeito desvantajoso aqui. Parte da invenção é um método para o armazenamento do estoque de sementes em um recipiente que é simultaneamente repelente de água e respirável. Este recipiente pode ser concebido como uma caixa de papelão. Tal embalagem pode opcionalmente possuir uma barreira interna ao vapor. Se a caixa for concebida como uma caixa duplex, sua estabilidade aumentará. Um estoque de sementes de acordo com a invenção que inclui tal recipiente e tal caixa de papelão o ou estoque de sementes tecnicamente tratadas de acordo com a invenção é igualmente parte da invenção. É igualmente parte da invenção conter o estoque de sementes de acordo com a invenção ou estoque de sementes tecnicamente tratadas de acordo com a invenção em tal embalagem.

[185] Em uma modalidade, a planta de acordo com a invenção é uma planta híbrida ou uma planta haploide dupla. Plantas híbridas e plantas haploides duplas não ocorrem na natureza e não podem ser isoladas da natureza. Em uma outra modalidade da planta de acordo com a invenção, a molécula de ácidos nucleicos de acordo com a invenção está presente na forma heterozigótica ou homozigótica. No caso de uma planta híbrida, a molécula de ácidos nucleicos também pode estar presente na forma hemizigótica. A invenção também abrange sementes híbridas e sementes haploides duplas que contêm um ácido nucleico de acordo com a invenção ou um polipeptídeo de acordo com a invenção.

[186] O termo "transgene" (ou "transgênico") deve ser entendido como significando que o respectivo gene é um gene exógeno que foi introduzido na planta. O gene exógeno pode ser derivado de uma espécie diferente da espécie de planta na qual ele foi introduzido. Alternativamente, o respectivo gene pode ser um gene já presente na espécie de planta na qual é introduzido, de modo que uma ou mais cópias adicionais do dito gene estejam presentes como um resultado da introdução do transgene.

[187] A presente invenção também fornece um método para aumentar a resistência de uma planta a pelo menos um patógeno de planta. Em uma modalidade, o dito método compreende as etapas de introduzir a molécula de ácidos nucleicos da presente invenção no genoma de pelo menos uma célula de uma planta e regenerar uma planta a partir desta célula. Isto pode ser feito por meio de reparo direcionado por homologia ou recombinação homóloga, por exemplo, mediante uso da tecnologia de edição gênica, conforme indicado em outra parte no presente documento. Alternativamente, o dito método compreende as etapas de transformar uma célula de planta com uma molécula de ácidos nucleicos da presente invenção, ou o vetor ou o cassete de expressão da presente invenção, e regenerar uma planta a partir desta célula. Os métodos para aumentar a resistência de uma planta a pelo menos um patógeno de planta podem compreender ainda a etapa de expressar a molécula de ácidos nucleicos na planta.

[188] "Introdução", no significado da presente invenção, inclui integração estável por meio de transformação, incluindo transformação mediada por Agrobacterium, transfecção, microinjeção, bombardeio biolístico, inserção usando a tecnologia de edição gênica, tal como sistemas CRISPR, TALENs, nucleases de dedo de zinco ou meganucleases, recombinação homóloga, modificação do gene endógeno usando mutagênese aleatória ou direcionada, tal como TILLING ou edição gênica, introgressão usando métodos de cruzamento, etc.

[189] Além disso, a invenção compreende um método para a produção de uma planta que compreende um gene que codifica uma proteína de resistência, em que a proteína de resistência tem uma diminuição ou redução da indução de morte celular ou redução da atividade de indução de morte celular durante uma resposta de hipersensibilidade que compreende as seguintes etapas:

[190] fornecer uma planta ou célula da mesma que compreende um gene endogênico que codifica uma proteína de resistência,

[191] modificar a sequência codificadora do gene endogênico para codificar uma ou duas ou três ou mais substituições de aminoácidos dentro da sequência de aminoácidos da proteína de resistência, deste modo, codificando uma proteína de resistência com uma diminuição ou redução da indução de morte celular ou redução da atividade de indução de morte celular durante uma resposta de hipersensibilidade,

[192] opcionalmente, regenerar uma planta a partir da célula.

[193] A modificação pode ser alcançada pelo uso de sistemas

CRISPR, TALENs, nucleases de dedo de zinco ou meganucleases, recombinação homóloga, modificação do gene endógeno usando mutagênese aleatória ou direcionada, tal como TILLING. O gene de resistência pode ser um dos genes de resistência fornecidos em outra parte no presente documento e/ou um gene de resistência estruturalmente definido pela descrição da listagem de sequências. A substituição de aminoácido codificado. A modificação pode codificar uma substituição de aminoácido, conforme indicado em outra parte no presente documento. Especialmente, a substituição de aminoácidos pode codificar uma das substituições de aminoácidos conforme descrito no presente documento para o gene de resistência R3a. Além disso, se os genes de resistência pertencerem à classe de genes de resistência CCDAE-NBS-LRR, a substituição de aminoácidos pode ser uma substituição conforme descrito no presente documento no contexto do método para a modificação de um gene R pertencente à classe de genes de resistência CCDAE-NBS-LRR. A invenção também está relacionada a uma planta que pode ser obtida por meio deste método.

[194] A regeneração de organismos fora das células é explicada em várias referências padrão de biologia celular relacionada. A regeneração de plantas é, por exemplo, descrita na referência padrão "Plant Biotechnology: Comprehensive Biotechnology, Second Supplement" (Michael W. Fowler, Graham Warren, Murray Moo-Young - Pergamon Press - 1992). Um exemplo concernente especialmente à regeneração de Beta vulgaris é fornecido em Lindsey, K. e P. Gallois. "Transformation of Sugarbeet (Beta vulgaris) by Agrobacterium tumefaciens". Journal of Experimental Botany 41.5 (1990): 529-536.

[195] Uma vez que a invenção está relacionada a processos biológicos, o efeito exato pode ser dependente da proteína de avirulência e/ou resistência escolhida, das substituições incluídas na(s) proteína(s) e da espécie de planta na qual a invenção é colocada em prática. Para obter os melhores resultados possíveis, pode valer a pena testar várias proteínas de avirulência e/ou resistência em uma espécie de planta específica e testar diferentes substituições ou combinações de substituições dentro da proteína de avirulência e/ou resistência. Portanto, a invenção também compreende um método para testar a resistência e/ou avirulência com diferentes substituições em uma planta que compreende as seguintes etapas:

[196] fornecer uma planta,

[197] transformar a planta de forma estável ou transitória com:

[198] uma sequência de ácidos nucleicos que codifica pelo menos duas proteínas, em que as proteínas são proteínas de resistência e/ou avirulência,

[199] pelo menos duas sequências de ácidos nucleicos, cada uma codificando uma proteína, em que a proteína é uma proteína de resistência e/ou avirulência,

[200] em que cada proteína compreende diferentes substituições de acordo com a invenção,

[201] 3) avaliar a resistência resultante da transformação de uma das proteínas na etapa 2),

[202] 4) opcionalmente selecionar a planta que compreende a proteína que compreende a(s) substituição(ões) que mostrou/mostraram a melhor resistência ou opcionalmente selecionar a proteína que compreende a(s) substituição(ões) que mostrou/mostraram a melhor resistência.

[203] A avaliação da resistência pode ser feita ao infectar a planta com um patógeno e quantificar a quantidade de morte celular e detectar a presença de uma reação de hipersensibilidade. O patógeno a ser usado no teste é, de preferência, um fungo e, particularmente de preferência, o patógeno do qual a proteína de avirulência (se uma proteína de avirulência foi testada) se origina. A invenção também se refere à proteína que é selecionada ou selecionável por meio do método de teste fornecido acima.

[204] Além disso, a presente invenção fornece um método para a identificação de uma planta que compreende a molécula de ácidos nucleicos da presente invenção, o dito método compreendendo as etapas de isolar o DNA da planta da presente invenção ou parte da mesma e realizar uma reação em cadeia de polimerase usando o DNA isolado como um modelo, deste modo, amplificando a molécula de ácidos nucleicos da presente invenção ou uma parte da mesma. O método pode compreender ainda a etapa de detectar a presença da molécula de ácidos nucleicos ou uma parte da mesma e, assim, identificar a planta. Para esta abordagem, é adequado realizar a reação em cadeia de polimerase na presença de pelo menos um marcador molecular que permita, em virtude de sua estrutura química, a diferenciação de polimorfismos de um único nucleotídeo (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs).

[205] A presente invenção fornece ainda um oligonucleotídeo que pode ser usado, por exemplo, como um iniciador no método de identificação da presente invenção, em que o oligonucleotídeo é capaz de hibridizar com uma molécula de ácidos nucleicos da presente invenção. De preferência, a sequência de nucleotídeos do oligonucleotídeo é idêntica a uma parte da molécula de ácidos nucleicos da presente invenção e tem um comprimento de pelo menos 15 nucleotídeos.

[206] Além disso, o oligonucleotídeo ou marcador molecular de acordo com a invenção pode ser conectado a um corante fluorescente a fim de gerar um sinal de fluorescência, por exemplo, sob excitação por meio de luz do comprimento de onda correspondente. O corante fluorescente pode ser um fluorocromo. Os oligonucleotídeos de acordo com a invenção podem ser acoplados a outros compostos que são adequados para gerar um sinal.

Estes oligonucleotídeos ou marcadores moleculares não ocorrem na natureza e não podem ser isolados da natureza.

O seguinte é executado para produzir tais oligonucleotídeos marcados: o DNA pode ser bio-ortogonalmente marcado.

Para isto, o DNA pode ser marcado in vivo ou in vitro com análogos de nucleosídeos os quais, por exemplo, podem ser subsequentemente acoplados com um fluoroforo por meio da reação de Staudinger.

Além disso, o DNA também pode ser suprido quimicamente com fluoroforos.

Os oligonucleotídeos podem ser marcados por meio de uma síntese de fosforamidita com fluoroforos os quais, por exemplo, são usados em QPCR, sequenciamento de DNA e hibridização in situ.

Além disso, o DNA pode ser gerado enzimaticamente no decorrer de uma reação em cadeia de polimerase com nucleotídeos fluorescentes ou ser marcado com uma ligase ou uma desoxinucleotidil transferase terminal.

O DNA também pode ser detectado indiretamente por meio de uma biotinilação e avidina fluorescente.

Para acoplamentos, fluoresceína, lantanídeos fluorescentes, nanopartículas de ouro, nanotubos de carbono ou pontos quânticos, dentre outras coisas, são usados como fluoroforos.

Uma das substâncias fluorescentes mais comumente usadas é FAM (carboxifluoresceína). Consequentemente, os oligonucleotídeos e, em particular, os iniciadores que possuem um marcador FAM, são abrangidos pela invenção.

A FAM está, de preferência, presente como 6-FAM, em que - dependendo do comprimento de onda desejado da emissão e excitação - outras variantes de FAM, por exemplo, 5-FAM, também podem, no entanto, ser usadas.

Exemplos de marcadores de fluorescência adicionais são AlexaFluor, ATTO, Dabcyl, HEX, Rox, TET, Texas Red e Yakima Yellow.

Dependendo do campo de uso, os oligonucleotídeos podem ser fornecidos com modificações das bases ou do esqueleto de fosfato de açúcar.

Dentre estes estão, inter alia, amino-dT, azida-dT, 2-aminopurina, 5-Br-dC, 2'-desoxi-inosina (INO),

3'-desoxi-A, C, G, 5-Met-dC, 5-OH-Met-dCN6-Met-dA e outros.

[207] Um kit que compreende pelo menos um dos oligonucleotídeos da presente invenção também é fornecido. O kit também pode conter um par de oligonucleotídeos da presente invenção.

[208] Além disso, a presente invenção também se refere a um chip marcador ("chip de DNA" ou microarray) que contém pelo menos um oligonucleotídeo de acordo com a invenção que é adequado para detecção. O chip marcador é adequado para aplicação em um ou mais métodos de detecção de acordo com a invenção.

[209] Além disso, é fornecido um método para a redução da infestação de patógenos de plantas ou a formação de lesões necróticas durante o cultivo de plantas que compreende as etapas de (i) plantar a planta ou parte da mesma da presente invenção, ou a semente da presente invenção em uma área de cultivo, e (ii) cultivar a planta ou linhagem germinativa resultante da semente.

[210] O ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode ser usado para conferir ou aumentar a resistência a pelo menos um patógeno de planta a uma planta ou uma parte da mesma.

[211] Além disso, a presente invenção pode ser usada para manipular qualquer gene de resistência CC-NBS-LRR e/ou seu gene de avirulência correspondente usando a estratégia de coexpressão induzida por promotor para o desenvolvimento de plantas resistentes a patógenos. A aplicação técnica da invenção não se restringe a doenças fúngicas, mas também pode ser usada para desenvolver plantas resistentes a insetos, bactérias, nematoides e/ou vírus se um promotor indutível por patógeno apropriado for selecionado. Proteínas de resistência e proteínas de avirulência correspondentes adequadas estão listadas na Tabela 1.

[212] A presente invenção também compreende o uso de um ácido nucleico de acordo com a invenção para conferir ou aumentar a resistência a pelo menos um patógeno de planta a uma planta ou uma parte dela.

[213] A presente invenção também compreende um oligonucleotídeo para uso como um iniciador em um método para a identificação de uma planta de acordo com a presente invenção conforme descrito acima, em que o oligonucleotídeo é capaz de hibridizar com uma molécula de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção. A sequência de nucleotídeos do oligonucleotídeo pode ser idêntica a uma parte da molécula de ácidos nucleicos de acordo com a invenção e pode ter um comprimento de pelo menos 15 nucleotídeos.

[214] Além disso, a presente invenção também está relacionada a um método para modificação de um gene R pertencente à classe de genes de resistência CCDAE-NBS-LRR (Figura 1). O método é adequado para a produção de um gene que codifica uma proteína de resistência modificada, em que a proteína de resistência modificada leva a uma morte celular reduzida comparado com a proteína de resistência sem a modificação. O método compreende as seguintes etapas:

[215] fornecer um gene que codifica um gene R pertencente à classe de genes de resistência CCDAE-NBS-LRR,

[216] modificar a sequência de ácidos nucleicos para gerar uma substituição de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em:

[217] substituição de um aminoácido básico positivamente carregado por um aminoácido ácido negativamente carregado ou um aminoácido alifático no domínio CC da proteína;

[218] substituição de D ou E no motivo DAE por um aminoácido básico positivamente carregado, tal como K ou R, ou por um aminoácido alifático, tal como V, I ou L;

[219] substituição de um dos dois aminoácidos ácidos conservados negativamente carregados no C-término do domínio CC por um aminoácido polar, tal como N ou Q.

[220] Exemplos de aminoácidos ácidos negativamente carregados são, por exemplo, ácido aspártico (D) ou glutamato (E). Exemplos de aminoácidos básicos positivamente carregados são, por exemplo, histidina, lisina ou arginina.

[221] Em uma modalidade preferida deste método, a substituição é uma substituição de acordo com I) em que a substituição é selecionada a partir de: K30E, R31G e/ou K119D na SEQ ID NO: 263; K35E e/ou K37M dentro de SEQ ID NO: 269 ou a substituição é uma substituição de acordo com II) em que a substituição é selecionada a partir de: E61V e/ou E61K dentro de SEQ ID NO: 269 ou a substituição é uma substituição de acordo com III) em que a substituição é selecionada a partir de E135N e/ou E136N dentro de SEQ ID NO: 269. A presente invenção também está relacionada a uma proteína que pode ser obtida por meio deste método. A substituição de acordo com a etapa b) pode ser feita in vitro. Além disso, é possível realizar esta etapa por meio de abordagens de edição gênica, tal como TALENS, Nucleases de dedo de zinco e nuclease CRISPR, incluindo Cas9, CasX, CasY ou nuclease Cpf1.

[222] Em um outro aspecto da presente invenção, o seguinte método é fornecido:

[223] um método para aumentar a resistência de uma planta a pelo menos um patógeno de planta que compreende:

[224] integrar a molécula de ácidos nucleicos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 3-8 no genoma de pelo menos uma célula de planta e regenerar uma planta a partir desta célula; ou

[225] transformar uma célula de planta com uma molécula de ácidos nucleicos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 3- 8, ou o vetor ou o cassete de expressão de acordo com a reivindicação

2, e regenerar uma planta a partir desta célula,

[226] em que a molécula de ácidos nucleicos de acordo com a etapa (i) ou (ii) codifica uma proteína de resistência que compreende a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 269 e/ou uma proteína de avirulência que compreende a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 2 ou de acordo com SEQ ID NO: 267. Opcionalmente, a célula de planta de acordo com a etapa (i) ou (ii) é a célula de uma planta pertencente à família Poaceae ou Fabaceae. Exemplos

[227] Os exemplos a seguir são fornecidos apenas para fins ilustrativos e não são considerados como limitativos da presente invenção. Exemplo 1: Pilha molecular do gene de resistência R3a e gene de avirulência Avr3aKI

[228] Uma pilha molecular do gene de resistência R3a nativo da batata e do gene Avr3aKI foi construída (Figura 19) e transformada no cultivar de batata "Russet Burbank". A expressão do gene R3a estava sob controle do promotor R3a endógeno e a expressão de Avr3a foi controlada pelo promotor sintético indutível por patógeno 2xS-4xD- NpCABE o qual está compreendido em SEQ ID NO: 270. Linhagens transgênicas R3a-Avr3aKI foram geradas e transferidas para a estufa como plantas enraizadas in vitro. A princípio, as plântulas se desenvolveram bem no solo, não apresentando diferenças em relação ao cultivar Russet Burbank não transgênico. No entanto, 3-4 semanas após a transferência para a estufa, foram observadas necrose espontânea do tecido foliar, aborto das folhas e crescimento atrofiado das plantas. Tabela 3: Folhas de batata infectadas de T-047, T-036, T-029 e T-071 mostram produção reduzida de esporângios de P. infestans comparado com Russet Burbank, mas com um transtorno severo do desenvolvimento da planta

[229] Os esporângios foram lavados das folhas de batata infectadas (n = 8) a 6 dpi e os números dos esporângios foram determinados por meio de um contador de partículas. O número de esporângios de Russet Burbank foi estabelecido em 100. No total, foram realizados 3 ensaios de resistência independentes. As diferenças entre as amostras foram avaliadas por meio de análise de variância (ANOVA). (* = Diferença significativa de acordo com ANOVA para Russet Burbank p < 0,05. N.d. = não determinado).

Esporângios (%) Esporângios (%) Fenótipo Ensaio: Média de da planta 1 2 3 3 ensaios Russet Burbank 100 100 100 100 ± 0 normal (controle) Redução no tamanho de 30 % T-047 61 n.d. n.d. 61 Necrose foliar espontânea Redução no tamanho de 50 % T-036 n.d. 16* 59 37 Queda de uma única folha Redução no tamanho de 50 % T-029 21* 11* 43* 25 Queda de uma única folha Redução no tamanho de 80 % T-071 n.d. n.d. n.d. n.d. Queda foliar severa

[230] Quatro linhagens R3a-Avr3aKI, as quais foram analisadas em detalhes, mostraram um gradiente reprodutível de desintegração (Figura 2). Uma análise de qRT-PCR revelou que o nível do fenótipo negativo de plantas adultas se correlacionava com a expressão do gene Avr3aKI. A expressão do gene Avr3aKI também foi detectável em plantas jovens saudáveis, e a expressão de Avr3a foi ainda maior do que em plantas adultas (Figura 2). Isto indicou que o gene de resistência R3a é regulado pelo desenvolvimento e o mecanismo de resistência não está ativo em plantas jovens.

[231] Portanto, com base nestes resultados, pode-se concluir que a transferência direta do gene R3a de resistência à requeima, de ocorrência natural, da batata (sem substituição) e do gene Avr3aKI de Phytophthora infestans (sem substituição), de ocorrência natural, sob o controle de um promotor indutível por patógeno sintético leva a um grave retardo de crescimento e danos à folha da planta, mesmo na ausência do patógeno. Durante o cultivo em uma estufa, o promotor indutível por patógenos é ativado por fatores de desenvolvimento desconhecidos e a proteína Avr3aKI altamente ativa induz à morte celular. Os resultados mostram que a abordagem de transferência direta é agronomicamente impraticável. Exemplo 2: Modificação da atividade do gene R3a

[232] Para encontrar um nível equilibrado de expressão gênica, que não prejudique a planta na ausência do patógeno, versões mutantes do gene R3a foram desenvolvidas e testadas com sucesso em um ensaio transitório.

[233] Uma comparação do domínio CC de R3a com os domínios CCDAE dos genes R de beterraba sacarínica BvKWS3_165 e Bv123 revelou que os motivos DAE e EDVID são conservados (Figura 3). O gene R3a é, portanto, um membro da classe de genes de resistência CCDAE-NBS-LRR (Figura 1). Uma análise de perda de função do domínio CCDAE do gene R BvKWS3_165 de acordo com SEQ ID NO: 263 mostrou que a modificação K30E, R31G, E96V, K119D, L153P, uma troca de D e E no motivo DAE e as modificações E143N e E144N de dois aminoácidos ácidos conservados no C-término prejudicou a atividade de indução de morte celular. Com base neste conhecimento, variantes alélicas de R3a com atividade de indução de morte celular reduzida foram geradas no domínio CCDAE do gene de resistência CC- NBS-LRR.

[234] Como uma primeira regra, a substituição de um aminoácido básico positivamente carregado por um aminoácido ácido,

negativamente carregado ou um aminoácido alifático no domínio CC prejudica a atividade indutora de HR, conforme mostrado para K30E, R31G e K119D de BvKWS_165 (compare com SEQ ID NO: 263) (Figura 4a). Esta regra foi aplicada para reduzir a atividade de R3a através de uma troca de K35E e K37M na proteína R3a (compare com SEQ ID NO: 265) (Figura 4b).

[235] Como uma segunda regra, a substituição de D ou E no motivo DAE por um aminoácido básico positivamente carregado (K, R) ou um aminoácido alifático (V, I, L) reduz a atividade do gene R, conforme mostrado por uma troca E61V e E61K para R3a (compare com SEQ ID NO: 265) (Figura 4b).

[236] Como uma terceira regra, a substituição de um dos dois aminoácidos ácidos conservados, negativamente carregados no C- término do domínio CC por um aminoácido polar (N, Q) reduz a morte celular, conforme mostrado para E135N e E136N para R3a (compare com SEQ ID NO: 265) (Figura 4b).

[237] Estas versões mutantes podem ser usadas para gerar linhagens de coexpressão sem um fenótipo prejudicial. Exemplo 3: Modificação da atividade de Avr3a

[238] O gene Avr3a de P. infestans é essencial para a virulência (Bos et al., 2009). Dentre outros alelos existentes, duas variantes parecem ter uma função notável. Eles estão presentes como um alelo Avr3a_K59I82 (Avr3aKI) de acordo com SEQ ID NO: 1 ou como um alelo Avr3a_E59M82 (Avr3aEM) de acordo com SEQ ID NO: 12 em todas as cepas examinadas. O alelo Avr3aKI ativa a imunidade inata dependente do gene de resistência R3a, enquanto que o alelo Avr3aEM não foi reconhecido pelo gene R3a (Amstrong et al. 2005).

[239] Testaram os 20 alelos Avr3aXM (x = cada um dos 20 aminoácidos naturais) conforme fornecido na Tabela 2 por meio de ensaios balísticos transitórios em folhas de batata que expressam o gene R3a. Quatorze alelos - Avr3aHM, Avr3aKM, Avr3aRM, Avr3aCM, Avr3aNM, Avr3aPM, Avr3aQM, Avr3aTM, Avr3aAM, Avr3aGM, Avr3aIM, Avr3aLM, Avr3aMM, Avr3aVM - mostraram indução de morte celular estatisticamente significativa comparado com o controle de vetor (Figuras 5-8). Doze destes alelos - Avr3aHM, Avr3aCM, Avr3aNM, Avr3aPM Avr3aQM, Avr3aTM, Avr3aAM, Avr3aGM, Avr3aIM, Avr3aLM, Avr3aMM, Avr3aVM – induziram à morte celular estatisticamente menos significativa comparado com o alelo avirulento Avr3aKI (Figuras 5-8). Este resultado mostrou que foram identificados alelos de Avr3a que desencadeiam menos morte celular em batata do que o alelo avirulento Avr3aKI, e que estes alelos diferem quanto ao nível de indução de morte celular.

[240] As sequências fornecidas na Tabela 2 foram testadas em folhas de batata (Figura 9). Os alelos Avr3aKI, Avr3aKM e Avr3aRM desencadearam uma forte morte celular em batata, enquanto que os alelos Avr3aDM, Avr3aFM, Avr3aYM e Avr3aWM não foram reconhecidos por R3a. No entanto, outros alelos (tais como Avr3aHM, Avr3aCM, Avr3aNM, Avr3aPM Avr3aSM, Avr3aTM, Avr3aAM, Avr3aIM, Avr3aLM, Avr3aMM e Avr3aVM) induziram à morte celular surpreendentemente baixa em batata, e os alelos Avr3aPM e Avr3aGM revelaram uma indução de morte celular surpreendentemente forte. Exemplo 4: Aumento de resistência à requeima

[241] Selecionaram três mutantes de ganho de função com nível moderado de atividade indutora de morte celular. Comparado com o alelo avirulento Avr3aKI (94 % de morte celular), a atividade de indução de morte celular de Avr3aIM, Avr3aLM e Avr3aGM foi de 41 %, 40 % e 42 %, respectivamente. Os três alelos de AVR3a foram, cada um, combinados com o promotor 2xS-4xD-NpCABE sintético. Os cassetes de promotor-Avr3a foram transformados no cultivar de batata Hermes, o qual continha o gene de resistência R3a correspondente.

[242] Oito linhagens de batata transgênica independentes de cada gene Avr3a modificado foram transferidas duas vezes para a estufa. As linhagens foram analisadas quanto à alteração do fenótipo e resistência fúngica. Com exceção de duas linhagens, todas as linhagens mostraram o mesmo fenótipo de crescimento vegetativo que o Hermes. Uma linhagem Avr3aIM mostrou algum retardo de crescimento e as folhas de uma linhagem Avr3aLM revelaram algumas lesões micro-necróticas. No entanto, também estas plantas eram viáveis. Um fenótipo negativo não foi detectável para as linhagens onde Avr3aGM estava presente (Figura 10).

[243] Ambos os conjuntos de plantas foram testados várias vezes quanto à resistência à requeima em um ensaio de folha solta (Detached Leaf Assay, DLA). A resistência fúngica foi determinada pela pontuação visual dos sintomas (5 dpi) e pela medida dos esporângios produzidos nas lesões (6 dpi). Especialmente, a produção de esporângios é importante em relação à epidemiologia de P. infestans. O maior nível de aprimoramento da resistência foi observado para a linhagem Avr3aGM- T-024. Esta linhagem mostrou uma redução visível dos sintomas da doença (Figuras 11a + 11b) e apenas 40 % da produção de esporângios comparado com o cultivar não transgênico Hermes e um controle transgênico em 5 ensaios de resistência independentes com dois conjuntos diferentes de plantas (Tabela 4). A linhagem Avr3aGM-T-014 e a linhagem Avr3aIM-T-112 também mostraram maior resistência à requeima, conforme determinado pela produção de esporângios de 66 % e 71 % (Tabela 4). Nenhum aprimoramento da resistência reproduzível sem um fenótipo negativo foi detectado para as linhagens Avr3aLM. Este resultado indica que uma redução da atividade de indução de morte celular do gene Avr é uma estratégia promissora para contornar os efeitos prejudiciais da expressão não controlada do gene R-Avr. O nível máximo possível de aprimoramento da resistência não é conhecido, uma vez que a análise foi confinada a 8 linhagens selecionadas aleatoriamente. Tabela 4: Folhas de batata infectadas de Avr3aIM-T-112, Avr3aGM–T- 014 e Avr3aGM–T-024 mostram produção reduzida de esporângios de P. infestans comparado com Hermes e um controle transgênico (RNAi-GFP).

[244] Os esporângios foram lavados das folhas de batata infectadas (n = 8) a 6 dpi e os números dos esporângios foram determinados por meio de um contador de partículas. O número de esporângios de Hermes foi estabelecido em 100. No total, 5 ensaios de resistência independentes foram realizados com 2 conjuntos diferentes de plantas. A linhagem destacada em preto Avr3aGM-T-024 mostrou o nível mais alto de redução de esporângios em todos os 5 ensaios. As diferenças entre as amostras foram avaliadas por meio de análise de variância (ANOVA). (* = Diferença significativa de acordo com ANOVA para Hermes p < 0,05. n.d. = não determinado). Conjunto de Conjunto de Conjunto de plantas 1 plantas 1 Conjunto de plantas 2 plantas 2 Esporângios (%) Esporângios (%) Esporângios (%) Esporângios (%) Ensaio: Média de Ensaio 1 Ensaio 2 Média de 1 2 3 3 ensaios 2 ensaios Hermes (controle) 100 100 100 100 ± 0 100 100 100 ± 0 RNAi-GFP (controle n.d. n.d. n.d. n.d. 102 112 107 ± 5 transgênico) Avr3aIM-T-097 22 89 71 61 ± 28 105 86 95 ± 10 91 Avr3aIM-T-112 30 59 96 62 ± 27 76 ± 15 62 87 Avr3aGM-T-014 26 65 77 56 ± 22 76± 31 26* 54 Avr3aGM-T-024 25 31* 63* 40 ± 17 41 ± 13 28* 88 Avr3aLM-T-013 44 39 81 52 ± 19 109 ± 21 130 Avr3aLM-T-082 96 153 126 ± 29 159 82 120 ± 39 Exemplo 5: Expressão do gene Avr3a se correlaciona com a resistência

[245] A expressão do gene Avr3a recombinante de 6 linhagens transgênicas e Hermes foi medida por meio de análise qRT-PCR usando os iniciadores S3169 de acordo com SEQ ID NO: 278 e S3170 de acordo com SEQ ID NO: 279. A expressão de Avr3a foi normalizada contra a expressão do gene da batata StMCB75 usando os iniciadores S1494 de acordo com SEQ ID NO: 280 e S1495 de acordo com SEQ ID NO: 281. As folhas foram infectadas por P. infestans conforme descrito para o DLA, e o RNA foi extraído das folhas inoculadas e do controle 0, 1, 2, 3 e 4 dias após a inoculação (days after inoculation, dpi). A análise de expressão mostrou uma correlação entre a expressão do gene Avr3a e o aprimoramento na resistência. A expressão mais forte de Avr3a pode ser detectada para a linhagem resistente Avr3aGM-T-024. A expressão absoluta do gene Avr3aGM na linhagem resistente foi superior às outras linhagens em 2, 3 e 4 dpi (Figuras 12a e 12b). A expressão do gene Avr3a foi quase indetectável para a linhagem Avr3aLM-T-082, a qual não mostrou aprimoramento na resistência em nenhum ensaio. Exemplo 6: Modificação do gene Avr3a aumenta o limite para indução de morte celular

[246] As linhagens transgênicas T-047, T-036, T-029 e T-071, as quais foram transformadas com os genes R3a-Avr3aKI, mostraram aborto de folhas e crescimento atrofiado diferente na estufa dependente do nível de expressão de Avr3aKI (Figura 2). Análise de expressão por qRT-PCR mostrou que mesmo a expressão do gene Avr3aKI mais baixa detectada de 1,8 unidades relativas nas folhas de T-047 desencadeia a morte celular espontânea na ausência de um patógeno.

[247] A linhagem resistente à requeima Avr3aGM-T-024 mostrou um nível de expressão de base de 146,5 unidades relativas na ausência de um patógeno, sem qualquer efeito prejudicial para o crescimento vegetativo (Figuras 10, 12a, 12b). Estes resultados demonstraram que o limite para a indução da morte celular foi aumentado em pelo menos 100 vezes pela aplicação do gene Avr3aGM modificado (Figura 13). Exemplo 7: Aumento de resistência à pinta preta

[248] O cultivar de batata Hermes é muito suscetível a Alternaria solani, o agente causador da pinta preta, conforme observado em ensaios de campo nos EUA. Plantas adultas de ambos os conjuntos de plantas também mostraram sintomas de pinta preta sob condições na estufa. Em ambos os experimentos, a linhagem resistente à requeima Avr3aGM-T-024 revelou maior resistência à requeima. Finalmente, uma pontuação da doença pinta preta foi feita para o segundo conjunto de plantas. Avr3aGM-T-024 mostrou apenas 40 % dos sintomas da doença comparado com Hermes e o controle transgênico, o qual foi transformado com uma construção de RNAi direcionada contra o gene GFP (Figuras 14a + 14b). Exemplo 8: Indução de imunidade inata em milho, soja e trigo por R3a e Avr3a

[249] A atividade dos genes de resistência está confinada aos membros de uma família de plantas, fenômeno denominado "funcionalidade taxonômica restrita". Em ensaios transitórios, a combinação do gene R3a-Avr3aKI foi testada quanto à atividade de indução de morte celular em outras culturas não solanáceas. Após transformação balística em folhas de milho, soja e trigo, uma forte indução de morte celular foi inesperadamente detectada como uma característica da imunidade inata (Figuras 15a, 15b, 15c). Outros genes de resistência de batata e seus genes Avr correspondentes (R1-Avr1, proteína de revestimento X do vírus da batata Rx1) não induziram à morte celular (Figuras 16a, 16b, 16c e 17a, 17b e 17c). Isto significa que a tecnologia desenvolvida também pode ser transferida para outras culturas para a geração de ampla resistência a patógenos. Documentos Citados

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de ácidos nucleicos para aumentar a resistência de uma planta ou uma parte da mesma em relação a pelo menos um patógeno de planta, em que a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma sequência de nucleotídeos que codifica i) uma proteína de resistência de planta da classe das proteínas de resistência CC-NBS-LRR e ii) uma proteína de avirulência; (b) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de resistência de planta da classe de proteínas de resistência CC-NBS-LRR; (c) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de avirulência; e (d) uma sequência de nucleotídeos que hibridiza, sob condições rigorosas, com uma sequência que é complementar a uma sequência de nucleotídeos de acordo com (a), (b) ou (c); caracterizada pelo fato de que a proteína de resistência codificada, a proteína de avirulência codificada ou ambas incluem pelo menos uma substituição de aminoácido, em que a substituição leva a uma diminuição da morte celular durante uma reação de hipersensibilidade comparado com uma proteína de resistência, proteína de avirulência ou ambas sem a substituição de aminoácido.

2. Vetor ou um cassete de expressão, caracterizado pelo fato de que que compreende a molécula de ácidos nucleicos como definida na reivindicação 1, de preferência operativamente ligada a um promotor indutível por patógeno.

3. Molécula de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que uma sequência de nucleotídeos codifica i) uma proteína de resistência de planta da classe de proteínas de resistência CC-NBS-LRR e ii) uma proteína de avirulência.

4. Molécula de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácidos nucleicos codifica uma proteína de resistência de planta que tem pelo menos uma substituição de aminoácido dentro do domínio CC que leva a uma diminuição da morte celular durante uma reação de hipersensibilidade comparado com uma proteína de resistência que carece da substituição de aminoácido no interior do domínio CC.

5. Molécula de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 3 a 4, caracterizada pelo fato de que a pelo menos uma substituição de aminoácido é uma substituição em uma proteína de resistência de planta e em que a substituição é a troca de I) um aminoácido básico positivamente carregado por um aminoácido ácido negativamente carregado ou alifático ou II) D ou E em um motivo DAE por um aminoácido básico positivamente carregado ou um aminoácido alifático.

6. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que é codificado pela molécula de ácidos nucleicos como definida em qualquer uma das reivindicações 1 ou 3 a 5.

7. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácidos nucleicos como definida em qualquer uma das reivindicações 1 e 3 a 6, o polipeptídeo como definido na reivindicação 6 ou o vetor ou cassete de expressão como definido na reivindicação 2.

8. Planta ou parte da mesma, caracterizada pelo fato de que compreende a célula como definida na reivindicação 7 ou uma planta ou parte da mesma regenerada a partir como definida na reivindicação 7.

9. Semente ou progênie da planta, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a semente ou progênie compreende a molécula de ácidos nucleicos como definida em qualquer uma das reivindicações 1 ou 3 a 5, o polipeptídeo como definido na reivindicação 6 ou o vetor ou cassete de expressão como definido na reivindicação 2.

10. Método para aumentar a resistência de uma planta a pelo menos um patógeno de planta, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) integrar a molécula de ácidos nucleicos como definida em qualquer uma das reivindicações 1 e 3 a 5 no genoma de pelo menos uma célula de proveniente e regenerar uma planta a partir desta célula; ou (ii) transformar uma célula de planta com uma molécula de ácidos nucleicos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 3- 5 ou o vetor ou o cassete de expressão de acordo com a reivindicação 2, e regenerar uma planta a partir desta célula.

11. Planta ou parte da mesma, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a planta ou parte da mesma pertence a espécies que são selecionadas a partir do grupo que consiste em: Beta vulgaris, Solanum tuberosum, Triticum aestivum, Hordeum vulgare, Secale cereal, Zea mays, Beta vulgaris, Helianthus annuus, Sorghum bicolor, Brassica napus.

12. Método para aumentar o rendimento produzido por uma planta que está sendo cultivada em uma área que compreende um organismo que é patogênico para a planta que compreende: a) fornecer uma planta como definida na reivindicação 8 b) cultivar a planta em uma área que compreende um organismo que é patógeno para a planta c) colher a planta caracterizado pelo fato de que a planta compreende uma molécula de ácidos nucleicos de acordo com a reivindicação 1 para aumentar a resistência em relação ao organismo que é patogênico para a planta.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o organismo que é patogênico para a planta é selecionado a partir do grupo que consiste em: Alternaria solani, Phytophthora infestans, Blumeria graminis, fungi belonging to the genus of Fusarium, Cercospora beticola and Helminthosporium turcicum.