BR112020024748A2 - peptídeo isolado, e, composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

É provida uma droga que permite o salto de éxon 51 altamente eficiente no gene da distrofia humana. A presente invenção provê um oligômero antissentido que permite que o éxon 51 no gene da distrofia humana seja saltado.

Description

1 / 42 PEPTÍDEO ISOLADO, E, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

PEDIDO RELACIONADO

[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Israel No. 260555 depositado em 11 de julho de 2018, o conteúdo do qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

DECLARAÇÃO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[002] O arquivo ASCII, intitulado 77809 Sequence Listing.txt, criado em 7 de julho de 2019, compreendendo 8,069,120 bites, submetido simultaneamente com o depósito deste pedido é incorporado aqui por referência.

CAMPO E FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] A presente invenção, em algumas modalidades da mesma, refere-se a composições e métodos de uso da mesma para tratar doenças inflamatórias e autoimunes.

[004] Existe uma necessidade não satisfeita de novas composições que podem servir para atenuar a resposta ao estresse celular e no tecido normal, de uma maneira que seja específica, segura e eficaz, reduzindo assim a gravidade de doenças degenerativas associadas ao estresse e inflamação induzida por estresse.

[005] O peptídeo LPPLPYP (SEQ ID NO: 2, também conhecido como Astressin-1 e IPL344) é um peptídeo curto de 7 aminoácidos que protege as células de vários tipos de pressões pró-apoptóticas e ativa o sistema de sinalização Akt. A estrutura de IPL344 se assemelha aos sítios de ligação de proteínas adaptadoras. Foi proposto ter um mecanismo de ação que compreende a mimetização de tais proteínas e ativação de processos de proteção celular através de Akt e possivelmente outras vias.

[006] As Publicações de Pedido de Patente Internacional Nos: WO 2006/021954 e WO2012/160563 descrevem o uso do peptídeo LPPLPYP (SEQ ID NO: 2) para tratar doenças tal como ALS.

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SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] De acordo com um aspecto da presente invenção é provido um peptídeo isolado não sendo mais longo do que dez aminoácidos que compreende uma sequência de aminoácidos representada pela fórmula X1-X2- X3-X4-X5-X6 (SEQ ID NO: 17), (i) em que X1 é prolina, ou um análogo ou derivado do mesmo; (ii) em que X2 é prolina, ou um análogo do mesmo; (iii) em que X3 é selecionado dentre o grupo de alanina, valina, leucina, cisteína, isoleucina, metionina e um derivado ou análogo do mesmo; (iv) em que X4 é selecionado dentre o grupo consistindo em alanina, valina, serina e um derivado ou análogo do mesmo; (v) em que X5 é um aminoácido; (vi) em que X6 prolina ou um análogo ou derivado do mesmo; e vii) em que o peptídeo é capaz de reduzir a quantidade de perda de peso no baço e/ou timo induzida por dexametasona em um camundongo.

[008] De acordo com um aspecto da presente invenção é provido um peptídeo isolado não sendo mais longo do que seis aminoácidos que compreende uma sequência de aminoácidos representada pela fórmula X1-X2- X3-X4-X5 (SEQ ID NO: 1), (i) em que X1 é prolina ou um análogo ou derivado do mesmo; (ii) em que X2 é prolina ou um análogo ou derivado do mesmo; (iii) em que X3 é selecionado dentre o grupo de alanina, valina, leucina, cisteína, isoleucina, metionina e um derivado ou análogo do mesmo; (iv) em que X4 é selecionado dentre o grupo consistindo em alanina, valina, serina, prolina e um derivado ou análogo do mesmo; (v) em que X5 é um aminoácido; e

3 / 42 (vi) em que o peptídeo é capaz de reduzir a quantidade de perda de peso no baço e/ou timo induzida por dexametasona em um camundongo.

[009] De acordo com um aspecto da presente invenção é provido um peptídeo isolado tendo cinco aminoácidos que consiste de uma sequência de aminoácidos representada pela fórmula X1-X2-X3-X4-X5 (SEQ ID NO: 5), em que (i) X1 e X3 são quaisquer aminoácidos; (ii) X2 é prolina ou um análogo ou derivado do mesmo; (iii) X4 não é prolina; (iv) o peptídeo é capaz de reduzir a quantidade de perda de peso no baço e/ou timo induzida por dexametasona em um camundongo.

[0010] De acordo com um aspecto da presente invenção é provido um peptídeo isolado sendo sete aminoácidos que consiste de uma sequência de aminoácidos representada pela fórmula X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 (SEQ ID NO: 6), em que (i) X1, X5 e X6 são quaisquer aminoácidos; (ii) X2, X3 e X7 são prolina ou um análogo ou derivado do mesmo; (iii) X4 não é prolina; e (iv) o peptídeo é capaz de reduzir a quantidade de perda de peso no baço e/ou timo induzida por dexametasona em um camundongo.

[0011] De acordo com um aspecto da presente invenção é provida uma composição farmacêutica compreendendo o peptídeo de qualquer uma das reivindicações 1-27 como um agente ativo e um carreador fisiologicamente aceitável.

[0012] De acordo com modalidades da presente invenção, o derivado de prolina é selecionado dentre o grupo consistindo em N-metil prolina, alfa- metil prolina e ácido α-aminobutírico.

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[0013] De acordo com modalidades da presente invenção, o peptídeo é 6 aminoácidos longo.

[0014] De acordo com modalidades da presente invenção, o peptídeo compreende um aminoácido que é fixado ao N terminal de X1, o aminoácido sendo selecionado dentre o grupo consistindo em alanina, valina, leucina, cisteína, isoleucina, metionina e um derivado ou análogo do mesmo.

[0015] De acordo com modalidades da presente invenção, o aminoácido que é fixado ao N terminal de X1 é leucina ou um derivado ou análogo do mesmo.

[0016] De acordo com modalidades da presente invenção, o aminoácido que é fixado ao N terminal de X1 é um aminoácido D.

[0017] De acordo com modalidades da presente invenção, o peptídeo tem 7 aminoácidos de comprimento.

[0018] De acordo com modalidades da presente invenção, o X4 é alanina ou um análogo ou derivado do mesmo.

[0019] De acordo com modalidades da presente invenção, o X5 é selecionado dentre o grupo consistindo em tirosina, fenilalanina, triptofano e um derivado ou análogo do mesmo.

[0020] De acordo com modalidades da presente invenção, o X5 é tirosina.

[0021] De acordo com modalidades da presente invenção, o peptídeo isolado compreende uma sequência de aminoácidos como definida em SEQ ID NO: 4.

[0022] De acordo com modalidades da presente invenção, o peptídeo isolado consiste de uma sequência de aminoácidos como definida em SEQ ID NO: 4.

[0023] De acordo com modalidades da presente invenção, o peptídeo compreende a sequência de aminoácidos como definida em SEQ ID NO: 18.

[0024] De acordo com modalidades da presente invenção, o peptídeo

5 / 42 consiste da sequência de aminoácidos como definida em SEQ ID NO: 18.

[0025] De acordo com modalidades da presente invenção, o peptídeo isolado tem 5 aminoácidos.

[0026] De acordo com modalidades da presente invenção, o X4 é selecionado dentre o grupo consistindo em alanina, prolina, um derivado ou análogo de alanina e um derivado ou análogo de prolina.

[0027] De acordo com modalidades da presente invenção, o derivado ou análogo de prolina é selecionado dentre o grupo consistindo em N-metil prolina, alfa-metil prolina e ácido α-aminobutírico.

[0028] De acordo com modalidades da presente invenção, a sequência de aminoácidos compreende a sequência como definida em SEQ ID NO: 3.

[0029] De acordo com modalidades da presente invenção, o peptídeo isolado consiste da sequência de aminoácidos como definida em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 18.

[0030] De acordo com modalidades da presente invenção, o X3 é leucina.

[0031] De acordo com modalidades da presente invenção, o X1 e/ou X3 são aminoácidos D.

[0032] De acordo com modalidades da presente invenção, o peptídeo é um peptídeo grampeado.

[0033] De acordo com modalidades da presente invenção, o peptídeo é um peptídeo cíclico.

[0034] De acordo com modalidades da presente invenção, a ordem da sequência é invertida e todos os aminoácidos são do tipo D.

[0035] De acordo com modalidades da presente invenção, o peptídeo é fixado a uma porção de penetração celular.

[0036] De acordo com modalidades da presente invenção, a porção de penetração celular é fixada a um N-terminal do peptídeo.

[0037] De acordo com modalidades da presente invenção, o peptídeo

6 / 42 é para uso no tratamento de doença inflamatória ou degenerativa.

[0038] De acordo com modalidades da presente invenção, a doença associada com apoptose é uma doença inflamatória ou degenerativa.

[0039] De acordo com modalidades da presente invenção, a doença inflamatória é uma doença autoimune.

[0040] De acordo com modalidades da presente invenção, a doença degenerativa é uma doença neurodegenerativa.

[0041] De acordo com modalidades da presente invenção, a doença associada com apoptose é selecionada dentre o grupo consistindo em degeneração macular relacionada à idade (AMD), retinite pigmentosa, acidente vascular cerebral e infarto do miocárdio.

[0042] A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e/ou científicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido pelos versados na técnica a qual a invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui possam ser usados na prática ou teste de modalidades da invenção, métodos e/ou materiais exemplares são descritos abaixo. No caso de conflito, o relatório de patente, incluindo definições, controlará. Além disso, os materiais, métodos, e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitantes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0043] Algumas modalidades da invenção são descritas aqui, apenas como forma de exemplo, com referência aos desenhos que acompanham. Com referência específica agora aos desenhos em detalhes, é enfatizado que os detalhes são mostrados como forma de exemplo e para fins de discussão ilustrativa de modalidades da invenção. A este respeito, a descrição feita com os desenhos torna aparente para os versados na técnica como da invenção podem ser praticadas.

[0044] Nos desenhos: FIG. 1 é um gráfico ilustrando o efeito de peptídeos

7 / 42 exemplares no peso do baço, número de células do baço, peso do timo e número de células do timo.

[0045] Peptídeos usados na triagem eram como a seguir: PPLPY - SEQ ID NO: 3 LPPLAYP - SEQ ID NO: 4 PLPYP - SEQ ID NO: 9 PPL - SEQ ID NO: 10 PLP - SEQ ID NO: 11 PYP - SEQ ID NO: 12 LPGLPYP - SEQ ID NO: 13 LPPLGYP - SEQ ID NO: 14 LAPLPYP - SEQ ID NO: 15 LPALPYP - SEQ ID NO: 16

[0046] FIG. 2 é um gráfico ilustrando o efeito de peptídeos exemplares no peso do baço, número de células do baço, peso do timo e número de células do timo.

[0047] Peptídeos usados na triagem eram como a seguir: LPPLPYP – SEQ ID NO: 2 (controle) PPLAYP – SEQ ID NO: 18 LPPLPY- SEQ ID NO: 7 LPPLAYP - SEQ ID NO: 4 PPLPY-NH2 - SEQ ID NO: 19 PPLPY - SEQ ID NO: 3

DESCRIÇÃO DE MODALIDADES ESPECÍFICAS DA INVENÇÃO

[0048] A presente invenção, em algumas modalidades da mesma, refere-se a composições e métodos de uso da mesma para tratar doenças inflamatórias e autoimunes.

[0049] Antes de explicar pelo menos uma modalidade da invenção em detalhes, deve ser entendido que a invenção não está necessariamente limitada

8 / 42 em sua aplicação aos detalhes definidos na descrição seguinte ou exemplificados pelos exemplos. A invenção é capaz de outras modalidades ou de ser praticada ou realizada de várias maneiras.

[0050] Ligações peptídicas são encontradas quase exclusivamente em uma conformação com um ângulo de torção ômega próximo a 180° enquanto apenas uma porção muito limitada é observada na conformação cis, com um ângulo ômega de em torno de 0°. A barreira energética entre as configurações trans/cis é aproximadamente 20 [kcal/mol] e o isômero trans é energeticamente favorecido por ∼2,5 [kcal/mol]. Entre os 20 aminoácidos canônicos, prolina desempenha um papel especial. A ligação peptídica de prolina com o resíduo de aminoácido precedente (Xaa-Pro, Xaa denotando qualquer aminoácido) tem falta de amida hidrogênio, de modo que esta ligação peptídica não pode agir como doadora de ligação hidrogênio e a barreira de energia, assim como o espaço energético é significativamente reduzida para ∼13 e ~0,5 [kcal/mol] respectivamente [2], deslocando o equilíbrio trans/cis para a configuração cis. As grandes mudanças no ângulo ômega associadas com o processo de isomerização trans/cis da prolina (0 a 180) são moduladas tanto por interações intra como intermoleculares, e têm uma influência dramática na relação de atividade estrutural da cadeia polipeptídica. Assim, a isomerização de prolina está surgindo como um componente crítico no controle da atividade de muitos processos biológicos. Isto é especificamente relevante para peptídeos curtos em que a configuração cis pode ocupar mais do que 30% da população conformacional, dependendo do resíduo precedente.

[0051] O efeito multi-conformacional da prolina, é conhecido adicionalmente por se manifestar em resíduos de prolina localizados como o segundo resíduo do N-terminal do peptídeo (penúltima prolina). O truncamento do 1o resíduo N-terminal no peptídeo contendo a penúltima prolina usualmente resulta em mudança conformacional do peptídeo. Em um

9 / 42 conjunto de dados de 58 peptídeos foi verificado que quase 80% dos peptídeos mostraram este efeito [ Glover, M.S., et al., 2014 J Am Soc Mass Spectrom. 26(3): página. 444-5].

[0052] O peptídeo de múltiplas prolinas LPPLPYP (SEQ ID NO: 2), também conhecido como IPL344 e astressin-1) é um polipeptídeo curto de 7 aminoácidos que protege as células de vários tipos de pressões pró- apoptóticas e ativa o sistema de sinalização Akt. Ele é um candidato para o tratamento de doenças inflamatórias e autoimunes.

[0053] Considerando a natureza conformacional delicada de prolinas, os presentes inventores determinaram se a configuração trans da prolina domina a funcionalidade de todos os quatro resíduos de prolina do peptídeo LPPLPYP (SEQ ID NO: 2). Os presentes inventores verificaram surpreendentemente que a substituição dapenúltima prolina por uma alanina resultou em um peptídeo (SEQ ID NO: 4) que reduziu significativamente a quantidade de perda de peso no baço e/ou timo induzida por dexametasona em um camundongo (Figura 1). Em nítido contraste, a substituição da penúltima prolina por uma glicina resultou em um peptídeo sem esta atividade.

[0054] Embora reduzindo adicionalmente a presente invenção à prática, os presentes inventores verificaram que a remoção do primeiro e último aminoácido de SEQ ID NO: 2, também resultou em um peptídeo (tendo uma sequência como definida em SEQ ID NO: 3) que reduziu significativamente a quantidade de perda de peso no baço e/ou timo induzida por dexametasona em um camundongo.

[0055] Os presentes inventores concluem que peptídeos curtos com base nas SEQ ID NOs: 3 e 4 são promissores para o tratamento de doenças inflamatórias e autoimunes.

[0056] Embora reduzindo adicionalmente a presente invenção à prática, os presentes inventores verificaram que um peptídeo adicional (SEQ

10 / 42 ID NO: 18) que de acordo com a fórmula como definida em SEQ ID NO: 17 mostrou um melhoramento significativo na redução da quantidade de perda de peso no baço e/ou timo induzida por dexametasona em camundongos (ver Figura 2).

[0057] Os presentes inventores mostraram adicionalmente que peptídeos exemplares que se enquadram em qualquer uma das formulas gerais descritas exibem um melhoramento significativo em comparação com o peptídeo base (SEQ ID NO: 2) para reduzir a quantidade de perda de peso no baço e/ou timo induzida por dexametasona em camundongos.

[0058] O termo “peptídeo” como usado aqui refere-se a um polímero de aminoácidos naturais ou sintéticos, abrangendo peptídeos nativos (ou produtos da degradação, polipeptídeos sinteticamente sintetizados ou polipeptídeos recombinantes) e peptidomiméticos (tipicamente, peptídeos sinteticamente sintetizados), assim como peptoides e semipeptoides que são análogos de polipeptídeo, que podem ter, por exemplo, modificações que tornam os peptídeos ainda mais estáveis enquanto em um corpo ou mais capazes de penetrar nas células.

[0059] A presente invenção também cobre derivados (com modificação e/ou adição de uma função à cadeia lateral do aminoácido, sem uma mudança química na estrutura dorsal peptídica) e análogos (com modificação e/ou adição de uma função química na estrutura dorsal peptídica, por exemplo, uma modificação N-terminal ou C-terminal, uma modificação na ligação peptídica, uma modificação no aminoácido não definida como “derivado”), complexos com outras espécies tal como íon de metal (por exemplo, cobre, zinco, manganês, magnésio, e outros).

[0060] Tais modificações incluem, mas não estão limitadas a modificação N terminal, modificação C terminal, modificação de ligação polipeptídica, incluindo, mas não limitada a, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH ou CF=CH, modificações

11 / 42 na estrutura dorsal, e modificações do resíduo. Métodos para preparar compostos peptidomiméticos são bem conhecidos na técnica e são especificados, por exemplo, em Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., capítulo 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992), que é incorporado aqui como referência como se fosse completamente apresentado aqui. Detalhes adicionais a este respeito são fornecidos abaixo.

[0061] Ligações polipeptídicas (-CO-NH-) com o polipeptídeo podem ser substituídas, por exemplo, por ligações N-metiladas (-N(CH3)-CO-), ligações éster (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-), ligações cetometileno (-CO-CH2-), ligações α-aza (-NH-N(R)-CO-), em que R é qualquer alquila, por exemplo, metila, ligações carba (-CH2-NH-), ligações hidroxietileno (-CH(OH)-CH2-), ligações tioamida (-CS-NH-), ligações duplas olefínicas (-CH=CH-), ligações retro-amida (-NH-CO-), derivados de polipeptídeo (-N(R)-CH2-CO-), em que R é a cadeia lateral “normal”, apresentada naturalmente no átomo de carbono.

[0062] Estas modificações podem ocorrer em qualquer uma das ligações ao longo da cadeia polipeptídica e mesmo em várias (2-3) ao mesmo tempo.

[0063] Aminoácidos aromáticos naturais, Trp, Tyr e Phe, podem ser substituídos por ácidos não naturais sintéticos tais como o análogo fenilglicina, TIC, naftilelanina (Nol), derivados metilados em anel de Phe, derivados halogenados de Phe ou o-metil-Tyr.

[0064] Prolina pode ser substituída por ácidos não naturais sintéticos tais como os derivados de N-metil prolina, alfa-metil prolina e o análogo ácido α-aminobutírico.

[0065] Outros aminoácidos não naturais são resumidos em 2, abaixo.

[0066] Além dos acima, os polipeptídeos da presente invenção podem incluir também um ou mais aminoácidos modificados ou um ou mais monômeros de não aminoácido (por exemplo, ácidos graxos, carboidratos complexos etc.).

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[0067] Como usado aqui no relatório e na seção de reivindicações abaixo o termo “aminoácido” ou “aminoácidos” é entendido como incluindo os 20 aminoácidos de ocorrência natural; aqueles aminoácidos modificados frequentemente após tradução in vivo, incluindo, por exemplo, hidroxiprolina, fosfoserina e fosfothreonina; e outros aminoácidos não usuais incluindo, mas não limitados a, ácido 2-aminoadípico, hidroxilisina, isodesmosina, nor- valina, nor-leucina e ornitina. Além disso, o termo “aminoácido” inclui tanto aminoácidos D- como L- (estereoisômeros).

[0068] Tabelas 1 e 2 abaixo listam aminoácidos de ocorrência natural (Tabela 1) e aminoácidos não convencionais ou modificados (Tabela 2) que podem ser usados com a presente invenção. Tabela 1 Aminoácido Abreviação de três letras Símbolo de uma letra Alanina Ala A Arginina Arg R Asparagina Asn N Ácido aspártico Asp D Cisteína Cys C Glutamina Gln Q Ácido glutâmico Glu E Glicina Gly G Histidina His H Isoleucina Ile I Leucina Leu L Lisina Lys K Metionina Met M Fenilalanina Phe F Prolina Pro P Serina Ser S Treonina Thr T Triptofano Trp W Tirosina Tyr Y Valina Val V Qualquer aminoácido como acima Xaa X Tabela 2 Aminoácido não convencional Código Aminoácido não convencional Código ornitina Orn hidroxiprolina Hyp ácido α-aminobutírico Abu carboxilato de aminonorbornila Norb D-alanina Dala carboxilato de aminociclopropano Cpro D-arginina Darg N-(3-guanidinopropil)glicina Narg D-asparagina Dasn N-(carbamilmetil)glicina Nasn ácido D-aspártico Dasp N-(carboximetil)glicina Nasp D-cisteína Dcys N-(tiometil)glicina Ncys D-glutamina Dgln N-(2-carbamiletil)glicina Ngln ácido D-glutâmico Dglu N-(2-carboxietil)glicina Nglu D-histidina Dhis N-(imidazoliletil)glicina Nhis

13 / 42 D-isoleucina Dile N-(1-metilpropil)glicina Nile D-leucina Dleu N-(2-metilpropil)glicina Nleu D-lisina Dlys N-(4-aminobutil)glicina Nlys D-metionina Dmet N-(2-metiltioetil)glicina Nmet D-ornitina Dorn N-(3-aminopropil)glicina Norn D-fenilalanina Dphe N-benzilglicina Nphe D-prolina Dpro N-(hidroximetil)glicina Nser D-serina Dser N-(1-hidroxietil)glicina Nthr D-treonina Dthr N-(3-indolyletil) glicina Nhtrp D-triptofano Dtrp N-(p-hidroxifenil)glicina Ntyr D-tirosina Dtyr N-(1-metiletil)glicina Nval D-valina Dval N-metilglicina Nmgly D-N-metilalanina Dnmala L-N-metilalanina Nmala D-N-metilarginina Dnmarg L-N-metilarginina Nmarg D-N-metilasparagina Dnmasn L-N-metilasparagina Nmasn D-N-metilasparatato Dnmasp ácido L-N-metilaspártico Nmasp D-N-metilcisteína Dnmcys L-N-metilcisteína Nmcys D-N-metilglutamina Dnmgln L-N-metilglutamina Nmgln D-N-metilglutamate Dnmglu ácido L-N-metilglutâmico Nmglu D-N-metil-histidina Dnmhis L-N-metil-histidina Nmhis D-N-metilisoleucina Dnmile L-N-metilisoleucina Nmile D-N-metil-leucina Dnmleu L-N-metil-leucina Nmleu D-N-metil-lisina Dnmlys L-N-metil-lisina Nmlys D-N-metilmetionina Dnmmet L-N-metilmetionina Nmmet D-N-metilornitina Dnmorn L-N-metilornitina Nmorn D-N-metilfenilalanina Dnmphe L-N-metilfenilalanina Nmphe D-N-metilprolina Dnmpro L-N-metilprolina Nmpro D-N-metilserina Dnmser L-N-metilserina Nmser D-N-metiltreonina Dnmthr L-N-metiltreonina Nmthr D-N-metiltriptofano Dnmtrp L-N-metiltriptofano Nmtrp D-N-metiltirosina Dnmtyr L-N-metiltirosina Nmtyr D-N-metilvalina Dnmval L-N-metilvalina Nmval L-norleucina Nle L-N-metilnorleucina Nmnle L-norvalina Nva L-N-metilnorvalina Nmnva L-etilglicina Etg L-N-metil-etilglicina Nmetg L-t-butilglicina Tbug L-N-metil-t-butilglicina Nmtbug L-homofenilalanina Hphe L-N-metil-homofenilalanina Nmhphe α-naftilalanina Anap N-metil-α-naftilalanina Nmanap penicilamina Pen N-metilpenicilamina Nmpen ácido γ-aminobutírico Gabu N-metil-γ-aminobutirato Nmgabu ciclo-hexilalanina Chexa N-metil-ciclo-hexilalanina Nmchexa ciclopentilalanina Cpen N-metil-ciclopentilalanina Nmcpen α-amino-α-metilbutirato Aabu N-metil-α-amino-α-metilbutirato Nmaabu ácido α-aminoisobutírico Aib N-metil-α-aminoisobutirato Nmaib D-α-metilarginina Dmarg L-α-metilarginina Marg D-α-metilasparagina Dmasn L-α-metilasparagina Masn D-α-metilaspartato Dmasp L-α-metilaspartato Masp D-α-metilcisteína Dmcys L-α-metilcisteína Mcys D-α-metilglutamina Dmgln L-α-metilglutamina Mgln ácido D-α-metil glutâmico Dmglu L-α-metilglutamato Mglu D-α-metil-histidina Dmhis L-α-metil-histidina Mhis D-α-metilisoleucina Dmile L-α-metilisoleucina Mile D-α-metileucina Dmleu L-α-metileucina Mleu D-α-metil-lisina Dmlys L-α-metil-lisina Mlys D-α-metilmetionina Dmmet L-α-metilmetionina Mmet

14 / 42 D-α-metilornitina Dmorn L-α-metilornitina Morn D-α-metilfenilalanina Dmphe L-α-metilfenilalanina Mphe D-α-metilprolina Dmpro L-α-metilprolina Mpro D-α-metilserina Dmser L-α-metilserina Mser D-α-metiltreonina Dmthr L-α-metiltreonina Mthr D-α-metiltriptofano Dmtrp L-α-metiltriptofano Mtrp D-α-metiltirosina Dmtyr L-α-metiltirosina Mtyr D-α-metilvalina Dmval L-α-metilvalina Mval N-ciclobutilglicina Ncbut L-α-metilnorvalina Mnva N-ciclo-heptilglicina Nchep L-α-metiletilglicina Metg N-ciclo-hexilglicina Nchex L-α-metil-t-butilglicina Mtbug N-ciclodecilglicina Ncdec L-α-metil-homofenilalanina Mhphe N-ciclododecilglicina Ncdod α-metil-α-naftilalanina Manap N-ciclo-ocilglicina Ncoct α-metilpenicilamina Mpen N-ciclopropilglicina Ncpro α-metil-γ-aminobutirato Mgabu N-cicloundecilglicina Ncund α-metil-ciclo-hexilalanina Mchexa N-(2-aminoetil)glicina Naeg α-metil-ciclopentilalanina Mcpen N-(2,2-difeniletil)glicina Nbhm N-(N-(2,2-difeniletil) Nnbhm carbamilmetil-glicina N-(3,3-difenilpropil)glicina Nbhe N-(N-(3,3-difenilpropil) Nnbhe carbamilmetil-glicina 1-carboxi-1-(2,2-difenil Nmbc ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina- Tic etilamino)ciclopropano 3-carboxílico fosfoserina pSer fosfotreonina pThr fosfotirosina pTyr O-metil-tirosina ácido 2-aminoadípico hidroxilisina Tabela 2 Cont.

[0069] Os aminoácidos dos peptídeos da presente invenção podem ser substituídos tanto de modo conservativo como não conservativo.

[0070] O termo “substituição conservativa” como usado aqui, refere- se a substituição de um aminoácido presente na sequência nativa no peptídeo com um amino de ocorrência natural ou não natural ou um peptidomimético tendo propriedades estereoquímicas similares. Onde a cadeia lateral do aminoácido nativo a ser substituída é ou polar ou hidrofóbica, a substituição conservativa deve ser com um aminoácido de ocorrência natural, um aminoácido de ocorrência não natural ou com uma porção peptidomimética que é também polar ou hidrofóbica (além de ter as mesmas propriedades estereoquímicas que a cadeia lateral do aminoácido substituído).

[0071] Como aminoácidos de ocorrência natural são tipicamente agrupados de acordo com suas propriedades, substituições conservativas por

15 / 42 aminoácidos de ocorrência natural podem ser facilmente determinadas tendo em mente o fato que de acordo com a invenção, a substituição de aminoácidos carregados por aminoácidos não carregados estereoquimicamente similares é considerada como substituições conservativas.

[0072] Para produzir substituições conservativas por aminoácidos de ocorrência não natural também é possível usar análogos de aminoácidos (aminoácido sintético) bem conhecidos na técnica. Um peptidomimético do aminoácido de ocorrência natural é bem documentado na literatura conhecida pelos versados na técnica.

[0073] Quando afetando substituições conservativas o aminoácido substituído deve ter o mesmo ou um grupo funcional similar na cadeia lateral do aminoácido original.

[0074] A frase “substituições não conservativas” como usada aqui refere-se a substituições do aminoácido como presente na sequência parental por outro aminoácido de ocorrência natural ou não natural, tendo diferentes propriedades eletroquímicas e/ou estereoquímicas. Assim, a cadeia do aminoácido substituído pode ser significativamente maior (ou menor) do que a cadeia do aminoácido nativo sendo substituído e/ou pode ter grupos funcionais com propriedades eletrônicas significativamente diferentes do aminoácido sendo substituído. Exemplos de substituições não conservativas deste tipo incluem a substituição de fenilalanina ou ciclo-hexilmetil glicina por alanina, isoleucina por glicina, ou -NH-CH[(-CH2)5-COOH]-CO- por ácido aspártico. As substituições não conservativas que estão dentro do escopo da presente invenção são aquelas que ainda constituem um peptídeo tendo propriedades antibacterianas.

[0075] Como mencionado, os N e C terminas dos peptídeos da presente invenção podem ser protegidos por grupos funcionais. Grupos funcionais apropriados são descritos em Green and Wuts, “Protecting Groups in Organic Synthesis”, John Wiley and Sons, capítulos 5 e 7, 1991, cujas

16 / 42 técnicas são incorporadas aqui por referência. Grupos protetores preferidos são os que facilitam o transporte do composto fixado a eles na célula, por exemplo, reduzindo a hidrofilicidade e aumentando a lipofilicidade dos compostos.

[0076] Estas porções podem ser clivadas in vivo, ou por hidrólise ou enzimaticamente, dentro da célula. Grupos protetores hidroxila incluem grupos protetores éster, carbonatos e carbamato. Grupos protetores amina incluem grupos alcóxi e ariloxi carbonila, como descrito acima para grupos protetores N-terminais. Grupos protetores de ácido carboxílico incluem ésteres alifáticos, benzílicos e arílicos, como descrito acima para grupos protetores C-terminal. Em uma modalidade, o grupo ácido carboxílico na cadeia lateral de um ou mais resíduo de ácido glutâmico ou ácido aspártico em um peptídeo da presente invenção é protegido, preferivelmente com um éster metílico, etílico, benzílico ou benzílico substituído.

[0077] Exemplos de grupos protetores N-terminal incluem grupos acila (-CO-R1) e grupos alcóxi carbonila ou arilóxi carbonila (-CO-O-R1), em que R1 é um grupo alifático, alifático substituído, benzila, benzila substituído, aromático ou um aromático substituído. Exemplos específicos de grupos acila incluem acetila, (etil)-CO-, n-propil-CO-, iso-propil-CO-, n-butil-CO-, sec-butil-CO-, t-butil-CO-, hexila, lauroíla, palmitoíla, miristoíla, estearila, oleil fenil-CO-, fenil-CO- substituído, benzil-CO- e (benzila substituído)-CO-. Exemplos de grupos alcóxi carbonila e arilóxi carbonila incluem CH3-O-CO-, (etil)-O-CO-, n-propil-O-CO-, iso-propil-O-CO-, n-butil-O-CO-, sec-butil-O-CO-, t-butil-O-CO-, fenil-O- CO-, fenil-O-CO- substituído e benzil-O-CO-, (benzila substituído)- O-CO-. Adamantano, naftaleno, miristoleíla, tulueno, bifenila, cinamoíla, nitrobenzoíla, toluoíla, furoíla, benzoíla, ciclo-hexano, norbornano, Z-caproico. A fim de facilitar a N-acilação, um a quatro resíduos de glicina podem estar presentes no N- terminal da molécula.

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[0078] O grupo carboxila no C-terminal do composto pode ser protegido, por exemplo, por uma amida (isto é, o grupo hidroxila no C- terminal é substituído com -NH 2, -NHR2 e -NR2R3) ou éster (isto é, o grupo hidroxila no C-terminal é substituído com -OR2). R2 e R3 são independentemente um grupo alifático, alifático substituído, benzila, benzila substituída, arila ou uma arila substituída. Além disso, juntos com o átomo de nitrogênio, R2 e R3 podem formar um anel heterocíclico C4 a C8 com de cerca de 0-2 heteroátomos adicionais tais como nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Exemplos de anéis heterocíclicos apropriados incluem piperidinila, pirrolidinila, morfolino, tiomorfolino ou piperazinila. Exemplos de grupos protetores C-terminal incluem -NH2, -NHCH3, -N(CH3)2, -NH(etil), -N(etil) 2, -N(metil) (etil), -NH(benzil), -N(C1-C4 alquil)(benzil), -NH(fenil), -N(C1-C4 alquil) (fenil), -OCH3, -O-(etil), -O-(n-propil), -O-(n-butil), -O-(iso-propil), -O-(sec- butil), -O-(t-butil), -O-benzil e -O-fenil.

[0079] Os peptídeos da presente invenção também podem compreender porções não aminoácido, tais como, por exemplo, porções hidrofóbicas (vários hidrocarbonetos lineares, ramificados, cíclicos, policíclicos ou heterocíclicos e derivados de hidrocarboneto) fixadas aos peptídeos; agentes de penetração não peptídicos; vários grupos protetores, especialmente onde o composto é linear, que são fixados aos compostos terminais para diminuir a degradação. Grupos químicos (não aminoácido) presentes no composto podem ser incluídos a fim de melhorar várias propriedades fisiológicas como; degradação ou depuração diminuídas; repulsão diminuída por várias bombas celulares, melhorar as atividades imunogênicas, melhorar vários modos de administração (tal como fixação de várias sequências que permitem a penetração através de várias barreiras, através do intestino, etc.); especificidade aumentada, afinidade aumentada, toxidade diminuída e similares.

[0080] A fixação do componente da sequência de aminoácidos dos

18 / 42 peptídeos da invenção em outros agentes não aminoácido pode ser por ligação covalente, por complexação não covalente, por exemplo, por complexação em um polímero hidrofóbico, que pode ser degradado ou clivado produzindo um composto capaz de liberação sustentada; aprisionando a parte aminoácido do peptídeo em lipossomas ou micelas para produzir o peptídeo final da invenção. A associação pode ser pelo aprisionamento da sequência de aminoácidos dentro do outro componente (lipossoma, micela) ou a impregnação da sequência de aminoácidos dentro de um polímero para produzir o peptídeo final da invenção.

[0081] De acordo com uma modalidade particular, o peptídeo é fixado em uma porção de penetração celular.

[0082] Como usado aqui, o termo “porção de penetração celular” refere-se a uma porção (por exemplo, um lipídeo, tal como ácido palmítico) que intensifica a translocação de um peptídeo fixado através de uma membrana celular. Em uma modalidade particular, a porção de penetração celular não é uma porção peptídeo. A porção pode ser fixada ao N ou ao C terminal.

[0083] Os peptídeos da invenção podem ser lineares ou cíclicos (ciclização pode melhorar a estabilidade). Ciclização pode acontecer por qualquer meio conhecido na técnica. Onde o composto é composto predominantemente de aminoácidos, ciclização pode ser através de N- a C- terminal, N-terminal para cadeia lateral e N-terminal para estrutura dorsal, C- terminal para cadeia lateral, C-terminal para estrutura dorsal, cadeia lateral para estrutura dorsal e cadeia lateral para cadeia lateral, assim como ciclização de estrutura dorsal para estrutura dorsal. Ciclização do peptídeo também pode acontecer através de porções orgânicas não aminoácido compreendidas no peptídeo.

[0084] Os presentes inventores também conceberam peptídeos grampeados.

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[0085] O termo “peptídeo grampeado” como usado aqui refere-se a um peptídeo tendo um número selecionado de aminoácidos padrão ou não padrão, e tendo adicionalmente pelo menos duas porções capazes de sofrer reação para promover formação de ligação carbono-carbono, que foi colocado em contado com um reagente para gerar pelo menos um reticulador entre as pelo menos duas porções, que modula, por exemplo, a estabilidade do peptídeo.

[0086] O termo “grampeamento” como usado aqui introduz em um peptídeo pelo menos duas porções capazes de sofrer reação para promover formação de ligação carbono-carbono que pode ser colocada em contato com um reagente para gerar pelo menos um reticulador entre as pelo menos duas porções. O grampeamento provê uma restrição em uma estrutura secundária, tal como uma estrutura .alfa.-hélice. O comprimento e geometria do reticulador pode ser otimizado para melhorar o rendimento do conteúdo de estrutura secundária desejada. A restrição provida, por exemplo, pode evitar que a estrutura secundária se desdobre e/ou pode reforçar o formato da estrutura secundária. Uma estrutura secundária que é impedida de se desdobrar é, por exemplo, mais estável.

[0087] Os peptídeos da presente invenção podem ser bioquimicamente sintetizados tal como pelo uso de técnicas padrão na fase sólida. Estes métodos incluem métodos de síntese exclusiva em fase sólida, síntese parcial em fase sólida, condensação de fragmentos, síntese em solução clássica. Procedimentos de síntese de polipeptídeo em fase sólida são bem conhecidos na técnica e descritos adicionalmente por John Morrow Stewart e Janis Dillaha Young, Solid Phase Polypeptídeo Syntheses (2a Edição, Pierce Chemical Company, 1984).

[0088] Síntese de peptídeo em grande escala é descrita por Andersson Biopolimers 2000;55(3):227-50.

[0089] Peptídeos sintéticos podem ser purificados por cromatografia

20 / 42 líquida preparativa de alto desempenho [Creighton T. (1983) Proteins, structures and molecular principles. WH Freeman and Co. N.Y.] e cuja composição pode ser confirmada por sequenciamento de aminoácidos.

[0090] Técnicas recombinantes também podem ser usadas para gerar os peptídeos da presente invenção. Para produzir um peptídeo da presente invenção usando tecnologia recombinante, um polinucleotídeo codificando o peptídeo da presente invenção é ligado em um vetor de expressão de ácido nucleico, que compreende a sequência de polinucleotídeo sob o controle transcricional de uma sequência reguladora cis - (por exemplo, sequência promotora) apropriada para direcionar a transcrição constitutiva, específica de tecido ou induzível dos polipeptídeos da presente invenção nas células hospedeiras.

[0091] Além de serem sintetizáveis em células hospedeiras, os peptídeos da presente invenção também podem ser sintetizados usando sistemas de expressão in vitro. Estes métodos são bem conhecidos na técnica e os componentes do sistema estão comercialmente disponíveis.

[0092] Os peptídeos descritos aqui são capazes de reduzir a quantidade de perda de peso no baço e/ou timo induzida por dexametasona em um camundongo - por exemplo, seguinte a injeção (IP) com 100 g de dexametasona.

[0093] Em outra modalidade, os peptídeos descritos aqui são capazes de interferir e bloquear a secreção tanto de TNF-α como IL-6 por células de macrófagos em resposta a ativadores inatos tais como lipopolissacarídeo (LPS) e oligonucleotídeos CpG.

[0094] Adicionalmente ou alternativamente, os peptídeos descritos aqui são capazes de reduzir, evitar ou inibir apoptose em células eucarióticas. Independentemente do mecanismo pelo qual os peptídeos da invenção mediam respostas ao estresse, e sem desejar ser limitado por qualquer teoria ou mecanismo de ação, é postulado que os peptídeos podem ser capazes de se

21 / 42 ligar a p53 evitando, portanto, que p53 se ligue ao DNA danificado. O peptídeo pode ser testado analisando sua capacidade para inibir a resposta à hipertermia da linhagem de células L12 (que não possui atividade de p53 endógena e foi transfectada de modo estável com o gene p53 ou um vetor de controle. Nestas células, atividade de p53 induz a parada de crescimento e sobrevivência da célula em vez de apoptose em resposta à hipertermia (como descrito em WO2012/160563, o conteúdo do qual é incorporado aqui por referência).

[0095] Métodos de medição apoptose: Apoptose é um processo ativo de autodestruição da célula dirigido por genes e está associado com características morfológicas e mudanças bioquímicas. Condensação nuclear e citoplasmática e fragmentação da célula morta em corpos apoptóticos ligados à membrana são características típicas de apoptose. Outro aspecto da morte da célula por apoptose é a degradação do DNA cromossômico em fragmentos oligonucleossômicos após a ativação de nucleases específicas.

[0096] Por “inibição de apoptose” ou “inibir a atividade apoptótica” entende-se qualquer diminuição no número de células que sofrem apoptose em relação a um controle não tratado (isto é, células não expostas aos peptídeos da invenção). Preferivelmente, a diminuição é pelo menos 25%, mais preferivelmente a diminuição é pelo menos 50%, e o mais preferivelmente a diminuição é pelo menos uma dobra.

[0097] Citometria de fluxo oferece uma ampla variedade de possibilidades para medir apoptose. Diferentes métodos foram estabelecidos e implementados, alguns dos quais coram a superfície celular e alguns que coram intracelularmente.

[0098] Uma das primeiras abordagens foi, além da observação de que células apoptóticas encolhem e têm maior granulidade intracelular, corar com fluorocromos específicos de DNA (por exemplo, iodeto de propídeo [PI], brometo de etídio [EtBr]). Assim que um golpe letal é induzido, o DNA

22 / 42 começa a mudar seu perfil. DNA apoptótico não consiste de apenas de DNA fragmentado (visualizado como bandas mais curtas, chamadas ladeira de DNA, em um gel de agarose), mas também é parcialmente digerido em nucleotídeos únicos, de modo que fluorocromos, como PI ou EtBr, têm menos DNA para corar (Nicoletti et al., 1991). Isto é tipicamente observado por um deslocamento para a esquerda, chamado pico sub-G1, no canal de detecção de fluorocromo específico no FACScanTM (de Becton Dickinson, USA).

[0099] Outro método é a marcação final mediada por deoxinucleotidil transferase (TdT) das rupturas da fita de DNA (TUNEL). O método TUNEL detecta rupturas na fita de DNA em células sofrendo de apoptose. TdT é uma enzima que catalisa a adição de trifosfato de desoxirribonucleotídeo nas extremidades 3’-OH de DNA de fita dupla ou simples. Ao contrário das células normais, os núcleos das células apoptóticas incorporam nucleotídeos exógenos (dUTP)-DIG na presença de TdT. Um fragmento de anticorpo anti- DIG com um fluorocromo conjugado permite a visualização de células apoptóticas. Um aumento de células apoptóticas causa um número maior de fragmentos de DNA e, consequentemente uma fluorescência mais brilhante. Uma vantagem deste método é a especificidade muito alta (Gavrieli et al., 1992). Uma desvantagem deste método é que ele é caro e pode ser usado apenas para um pequeno conjunto de amostras, porque exige muito tempo. Portanto, não é aplicável em programas grandes de triagem.

[00100] A perda de polaridade da membrana celular e a apresentação de quantidades aumentadas de fosfatidil serina (PS) na parte externa da membrana celular durante a fase inicial de apoptose levou ainda a uma nova abordagem. Anexina V é uma proteína de ligação de fosfolipídeo dependente de cálcio com alta afinidade para PS. A integridade da membrana celular é mantida nas fases precoces e intermediárias de apoptose. Células apoptóticas precoces e intermediárias mostram ligação aumentada de anexina-FITC e são principalmente negativas para coloração com PI. Estágios apoptóticos tardios

23 / 42 e células necróticas se tornam duplo positivos, devido à apresentação PS na superfície e à coloração com PI de ácidos nucleicos intracelulares devido à desintegração da membrana. Este método também é caro e exige muito tempo.

[00101] Outros métodos para a medição de apoptose in vivo e in vitro são descritos em Pat US Nos. 6.726.895 e 6.723.567.

[00102] Assim, de acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, é provido um peptídeo isolado não sendo mais longo do que seis aminoácidos que compreende uma sequência de aminoácidos representada pela fórmula X1-X2-X3-X4-X5 (SEQ ID NO: 1), (i) em que X1 é prolina ou um análogo ou derivado do mesmo; (ii) em que X2 é prolina ou um análogo ou derivado do mesmo; (iii) em que X3 é selecionado dentre o grupo de alanina, valina, leucina, cisteína, isoleucina, metionina e um derivado ou análogo do mesmo; (iv) em que X4 é selecionado dentre o grupo consistindo em alanina, valina, serina, prolina e um derivado ou análogo do mesmo; (v) em que X5 é um aminoácido; e (vi) em que o peptídeo é capaz de reduzir a quantidade de perda de peso no baço e/ou timo induzida por dexametasona em um camundongo.

[00103] O peptídeo de acordo com este aspecto da presente invenção pode ter cinco ou seis aminoácidos de comprimento.

[00104] Preferivelmente, os aminoácidos são selecionados de modo que a ligação peptídica entre X1 e X2 (pelo menos 50% do tempo, pelo menos 60% do tempo, pelo menos 70% do tempo, pelo menos 80% do tempo ou mesmo 90% do tempo) está na configuração cis - isto é, o equilíbrio é deslocado para uma configuração cis; e a ligação peptídica entre X3 e X4 (pelo menos 50% do tempo, pelo menos 60% do tempo, pelo menos 70% do tempo,

24 / 42 pelo menos 80% do tempo ou mesmo 90% do tempo) está na configuração trans - isto é, o equilíbrio é deslocado para uma configuração trans.

[00105] Métodos de testar a configuração cis/trans de uma ligação peptídica são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo RMN.

[00106] Em uma modalidade, X4 é selecionado dentre o grupo consistindo em alanina, prolina, um derivado ou análogo de alanina e um derivado ou análogo de prolina.

[00107] De acordo com uma modalidade particular, o derivado ou análogo de prolina é N-metil prolina, alfa-metil prolina ou ácido α- aminobutírico.

[00108] Em uma modalidade, o peptídeo compreende a sequência como definida em SEQ ID NO: 3 (PPLPY).

[00109] Em outra modalidade, o peptídeo consiste da sequência como definida em SEQ ID NO: 3 (PPLPY).

[00110] Em outra modalidade, o peptídeo consiste da sequência como definida em SEQ ID NO: 7 (LPPLPY).

[00111] Em uma modalidade particular, X1 e/ou X3 podem ser D aminoácidos, tal como o peptídeo como definido em SEQ ID NO: 20 (d- LPPLPY).

[00112] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido um peptídeo isolado não sendo mais longo do que dez aminoácidos que compreende uma sequência de aminoácidos representada pela fórmula X1-X2- X3-X4-X5-X6 (SEQ ID NO: 17), (i) em que X1 é prolina, ou um análogo ou derivado do mesmo; (ii) em que X2 é prolina, ou um análogo do mesmo; (iii) em que X3 é selecionado dentre o grupo de alanina, valina, leucina, cisteína, isoleucina, metionina e um derivado ou análogo do mesmo; (iv) em que X4 é selecionado dentre o grupo consistindo em alanina, valina, serina e um derivado ou análogo do mesmo;

25 / 42 (v) em que X5 é um aminoácido; (vi) em que X6 prolina ou um análogo ou derivado do mesmo; e (vii) em que o peptídeo é capaz de reduzir a quantidade de perda de peso no baço e/ou timo induzida por dexametasona em um camundongo.

[00113] Preferivelmente, os aminoácidos são selecionados de modo que a ligação peptídica entre X1 e X2 (pelo menos 50% do tempo, pelo menos 60% do tempo, pelo menos 70% do tempo, pelo menos 80% do tempo ou mesmo 90% do tempo) está na configuração cis - isto é, o equilíbrio é deslocado para uma configuração cis; e a ligação peptídica entre X3 e X4 (pelo menos 50% do tempo, pelo menos 60% do tempo, pelo menos 70% do tempo, pelo menos 80% do tempo ou mesmo 90% do tempo) está na configuração trans - isto é, o equilíbrio é deslocado para uma configuração trans; e a ligação peptídica entre X5 e X6 (pelo menos 50% do tempo, pelo menos 60% do tempo, pelo menos 70% do tempo, pelo menos 80% do tempo ou mesmo 90% do tempo) está na configuração cis - isto é, o equilíbrio é deslocado para uma configuração cis.

[00114] Em uma modalidade, o peptídeo deste aspecto da presente invenção tem 6 aminoácidos de comprimento.

[00115] Um exemplo da tal peptídeo é o definido em SEQ ID NO: 18 (PPLAYP).

[00116] Aminoácidos de ocorrência não natural preferidos que podem ser usados para substituir prolina incluem, mas não estão limitados a N-metil prolina, alfa-metil prolina e ácido α-aminobutírico.

[00117] Os presentes inventores contemplaram um aminoácido adicional fixado ao N-terminal de X1 de SEQ ID NO: 17.

[00118] O aminoácido adicional é preferivelmente selecionado de modo que a ligação peptídica entre e X1 (pelo menos 50% do tempo, pelo

26 / 42 menos 60% do tempo, pelo menos 70% do tempo, pelo menos 80% do tempo ou mesmo 90% do tempo) está na configuração cis - isto é, o equilíbrio é deslocado para uma configuração cis.

[00119] Aminoácidos candidatos incluem, mas não estão limitados a alanina, valina, leucina, cisteína, isoleucina, metionina e um derivado ou análogo do mesmo.

[00120] Em uma modalidade particular o aminoácido adicional fixado ao N terminal de X1 é leucina ou um derivado ou análogo do mesmo.

[00121] Em uma modalidade adicional, o aminoácido adicional fixado ao N terminal de X1 é um D-aminoácido.

[00122] Assim, os presentes inventores conceberam peptídeos tendo 7 aminoácidos e compreendendo a fórmula como definida em SEQ ID NO: 17.

[00123] De acordo ainda com outra modalidade X5 é selecionado dentre o grupo consistindo em tirosina, fenilalanina, triptofano e um derivado ou análogo do mesmo.

[00124] Um exemplo de um aminoácido que é contemplado para X5 is tirosina.

[00125] Um exemplo de um aminoácido que é contemplado para X3 é leucina.

[00126] O peptídeo deste aspecto da presente invenção pode compreender uma sequência de aminoácidos como definida em SEQ ID NO: 4 (LPPLAYP). Tal peptídeo pode ter 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos.

[00127] O peptídeo deste aspecto da presente invenção pode consistir de uma sequência de aminoácidos como definida em SEQ ID NO: 4.

[00128] Para os peptídeos deste aspecto da presente invenção X1 e/ou X3 e/ou X5 podem ser D aminoácidos, tal como, por exemplo, d-LPPLAYP (SEQ ID NO: 21).

[00129] Para quaisquer dos peptídeos descritos aqui, a presente invenção também contempla peptídeos retro-inversos. Tais peptídeos são

27 / 42 resistentes à proteases e consistem de D-aminoácidos em ordem reversa, resultando em uma estrutura dorsal do peptídeo alterada, mas orientação inalterada das cadeias laterais.

[00130] De acordo ainda com outro aspecto da presente invenção é provido um outro peptídeo isolado tendo cinco aminoácidos que consiste de uma sequência de aminoácidos representada pela fórmula X1-X2-X3-X4-X5 (SEQ ID NO: 5), em que (i) X1 e X3 são quaisquer aminoácidos; (ii) X2 é prolina ou um análogo ou derivado do mesmo; (iii) X4 não é prolina; (iv) o peptídeo é capaz de reduzir a quantidade de perda de peso no baço e/ou timo induzida por dexametasona em um camundongo.

[00131] Preferivelmente os aminoácidos são selecionados de modo que a ligação peptídica entre X1-X2 (pelo menos 50% do tempo, pelo menos 60% do tempo, pelo menos 70% do tempo, pelo menos 80% do tempo ou mesmo 90% do tempo) está na configuração cis - isto é, o equilíbrio é deslocado para uma configuração cis; e a ligação peptídica entre X3-X4 (pelo menos 50% do tempo, pelo menos 60% do tempo, pelo menos 70% do tempo, pelo menos 80% do tempo ou mesmo 90% do tempo) está na configuração trans- isto é, o equilíbrio é deslocado para uma configuração trans.

[00132] De acordo ainda com outro aspecto da presente invenção é provido um peptídeo isolado tendo sete aminoácidos que consiste de uma sequência de aminoácidos representada pela fórmula X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 (SEQ ID NO: 6), em que (i) X1, X5 e X6 são quaisquer aminoácidos; (ii) X2, X3 e X7 são prolina ou um análogo ou derivado do mesmo; (iii) X4 não é prolina; e (iv) o peptídeo é capaz de reduzir a quantidade de perda de

28 / 42 peso no baço e/ou timo induzida por dexametasona em um camundongo.

[00133] Preferivelmente os aminoácidos são selecionados de modo que a ligação peptídica entre X1-X2 (pelo menos 50% do tempo, pelo menos 60% do tempo, pelo menos 70% do tempo, pelo menos 80% do tempo ou mesmo 90% do tempo) está na configuração cis - isto é, o equilíbrio é deslocado para uma configuração cis; a ligação peptídica entre X2-X3 (pelo menos 50% do tempo, pelo menos 60% do tempo, pelo menos 70% do tempo, pelo menos 80% do tempo ou mesmo 90% do tempo) está na configuração cis - isto é, o equilíbrio é deslocado para uma configuração cis; a ligação peptídica entre X6-X7 (pelo menos 50% do tempo, pelo menos 60% do tempo, pelo menos 70% do tempo, pelo menos 80% do tempo ou mesmo 90% do tempo) está na configuração cis - isto é, o equilíbrio é deslocado para uma configuração cis; and a ligação peptídica entre X4-X5 (pelo menos 50% do tempo, pelo menos 60% do tempo, pelo menos 70% do tempo, pelo menos 80% do tempo ou mesmo 90% do tempo) está na configuração trans - isto é, o equilíbrio é deslocado para uma configuração trans.

[00134] O peptídeos descritos aqui podem ser usados para tratar uma variedade de doenças incluindo as associadas com respostas associadas ao estresse. Estas incluem condições patológicas tais como doenças neurodegenerativas (por exemplo, acidente vascular cerebral, doença de Parkinson e Alzheimer, infarto do miocárdio, exposição à radiação ou agentes quimioterapêuticos, inflamação, lesões (por exemplo, queimaduras e lesões no sistema nervoso central), envelhecimento das células, hipertermia, convulsões, hipóxias (por exemplo, isquemia e acidente vascular cerebral), e em tecidos e órgãos de transplante antes do transplante.

[00135] Estas condições também incluem doenças autoimunes, caracterizadas por um estado de imunização de um indivíduo contra pelo menos um dos constituintes normais do corpo. Estes fenômenos são observados, em particular, em patologias incluindo, mas não limitadas a

29 / 42 infecções associadas com SLE (doença de lúpos sistêmico eritematoso), sínbdrome de Gougerot-Sjogren (ou doença de Sjogren’s) e poliartrite reumatoide, assim como patologias tais como sarcoidose e osteopenia, espondiloartrite, esclerodermia, esclerose múltipla, esclerose lateral aminotrópica (ALS), hipertireoidismo, doença de Addison, anemia hemolítica autoimune, doença de Crohn, síndrome de Goodpasture, doença de Graves, tireoidite de Hashimoto, hemorragia de púrpura idiopática, diabetes dependente de insulina, miastenia, pênfigo vulgar, anemia perniciosa, glomerulonefrite pós-estreptocócica, psoríase e esterilidade espontânea, assim como fenômenos de rejeição imediatos ou retardados observados durante rejeição de enxerto e doença de hospedeiro versus enxerto. Em uma modalidade particular, os peptídeos da invenção são úteis para o tratamento de esclerose múltipla. Em outra modalidade, os peptídeos da invenção são úteis para o tratamento de isquemia ou infarto do miocárdio.

[00136] Outras doenças contempladas pela presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, degeneração secundária após trauma, acidente vascular cerebral, intoxicação do CNS, glaucoma, degeneração macular, diabetes tipo 1, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico, uveíte autoimune, doença de enxerto versus hospedeiro, rejeição de enxerto, artrite, síndrome de resposta inflamatória sistêmica (SIRS), doença inflamatória intestinal (IBD), síndrome do desconforto respiratório do adulto (ARDS), psoríase, aterosclerose, infarto do miocárdio, doença por radiação, hipertermia, hipóxia, fígado tóxico, insuficiência renal, infertilidade e muitas outras.

[00137] O fenômeno de rejeição de enxerto é um estado de imunização de um indivíduo contra constituintes estranhos (fluidos corporais tais como sangue, fluido cerebrospinal, etc., células, tecidos, órgãos, anticorpos, etc.) deliberadamente implantados no paciente.

[00138] Como usado aqui, os termos “distúrbio degenerativo” “doença

30 / 42 degenerativa” e “condição degenerativa” são dirigidos a qualquer distúrbio, doença ou condição caracterizada por proliferação de células inapropriada ou morte de células inapropriada ou, em alguns casos ambos, ou apoptose aberrante ou desregulada. Estas condições também incluem condições nas quais, embora regulada e apropriada no nível de uma única célula, apoptose excessiva está associada com disfunção ou falência dos órgãos.

[00139] Em uma modalidade, os peptídeos são úteis para prevenir a morte em tecidos ou células não malignos em um sujeito tendo um distúrbio neoplástico e passando por quimioterapia e/ou radioterapia para o tratamento de câncer.

[00140] Os termos “doença inflamatória” e “condição inflamatória”, como usados aqui, significam qualquer doença ou condição em que uma resposta inflamatória excessiva ou desregulada levam a sintomas inflamatórios excessivos, danos no tecido do hospedeiro, ou perda de função de tecido.

[00141] Em uma modalidade, a doença ou condição inflamatória é uma doença autoimune.

[00142] Em outra modalidade, a doença ou condição inflamatória tem uma etiologia associada com à produção de pelo menos uma citocina pró- inflamatória selecionada dentre IL-6 e TNF-α.

[00143] Em outra modalidade, a doença ou condição é selecionada dentre o grupo consistindo em: doença de Alzheimer, doença de Parkinson, degeneração secundária após trauma, acidente vascular cerebral, intoxicação do CNS, glaucoma, degeneração macular, infarto do miocárdio, doença por radiação, hipertermia, hipóxia, fígado tóxico fulminante, insuficiência renal e infertilidade.

[00144] Em ainda outra modalidade, a doença inclui retinite pigmentosa e degeneração macular.

[00145] Em outra modalidade, a doença inclui acidente vascular

31 / 42 cerebral ou infarto do miocárdio.

[00146] Os peptídeos podem ser providos por si ou como parte de uma composição farmacêutica, onde ele é misturado com carreadores ou excipientes apropriados.

[00147] Como usado aqui uma “composição farmacêutica” refere-se a uma preparação de um ou mais dos ingredientes ativos descritos aqui com outros componentes químicos tais como carreadores e excipientes fisiologicamente apropriados. O propósito de uma composição farmacêutica é facilitar a administração de um composto para um organismo.

[00148] Aqui o termo “ingrediente ativo” refere-se aos peptídeos responsáveis pelo efeito biológico.

[00149] Nas partes que se seguem, as frases “carreador fisiologicamente aceitável” e “carreador farmaceuticamente aceitável” que podem ser usadas de modo intercambiável referem-se a um carreador ou um diluente que não causa irritação significativa em um organismo e não anula a atividade biológica e propriedades do composto administrado. Um adjuvante está incluído nestas frases.

[00150] A preparação de composições farmacêuticas, que contém peptídeos ou polipeptídeos como ingrediente ativos é bem conhecida na técnica. Tipicamente, tais composições são preparáveis como indicáveis, ou como soluções ou suspensões líquidas, no entanto, formas sólidas, que podem ser colocadas em suspensão ou solubilizadas antes da injeção, também podem ser preparadas. A preparação também pode ser emulsificada. O ingrediente terapêutico ativo é misturado com carreadores inorgânicos e/ou orgânicos, que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente ativo. Carreadores são excipientes farmaceuticamente aceitáveis (veículos) compreendendo mais ou menos substâncias inertes quando adicionados a uma composição farmacêutica para conferir consistência ou forma apropriada para a composição. Carreadores apropriados são, por exemplo, água, solução

32 / 42 salina, dextrose, glicerol, etanol, ou similares e combinações dos mesmos. Além disso, se desejado, a composição pode conter quantidades menores de substâncias auxiliares tais como agentes de umedecimento ou emulsificantes e agentes de tamponamento de pH, que intensificam a efetividade do ingrediente ativo.

[00151] Toxidade e eficácia terapêutica dos peptídeos descritos aqui podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, determinado o IC50 (a concentração que provê 50% de inibição) e o LD50 (dose letal que causa a morte em 50% dos animais testados) para um composto objeto. Os dados obtidos a partir destes ensaios de cultura de células e estudos com animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem para uso em humanos. A dosagem pode variar dependendo da forma de dosagem empregada e a via de administração utilizada. A formulação exata, via de administração e dosagem pode ser escolhida pelo médico individual tendo em vista a condição do paciente. (Ver, por exemplo, Fingl et al., 1975).

[00152] A quantidade de agente ativo usado em uma composição de administração da presente invenção é uma quantidade eficaz para realizar o propósito do agente ativo particular para a indicação alvo. A quantidade de agente ativo nas composições é tipicamente é uma quantidade farmacologicamente, biologicamente, terapeuticamente, ou quimicamente eficaz. No entanto, a quantidade pode ser menor do que a quantidade quando a composição é usada em uma forma de dosagem unitária porque a forma de dosagem unitária pode conter uma a pluralidade de compostos ou agente ativos em uma única composição ou pode conter uma quantidade dividida farmacologicamente, biologicamente, terapeuticamente, ou quimicamente eficaz. A quantidade total eficaz pode ser então administrada em unidades cumulativas contendo, no total, uma quantidade eficaz do agente ativo.

[00153] Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo da

33 / 42 invenção é uma quantidade que quando administrada em um paciente é capaz de exercer uma atividade anti-apoptótica e/ou uma atividade anti-inflamatória. Ensaios para detectar a atividade anti-apoptótica do peptídeo da invenção incluem, mas não estão limitados a, coloração de DNA com fluorocromos específicos tais como iodeto de propídeo e brometo de etídio, ensaios com anexina V, ensaios TUNEL e similares; e exemplos não limitativos de tais ensaios são apresentados nos exemplos abaixo. Ensaios para detectar a atividade anti-inflamatória dos peptídeos são bem conhecidos na técnica.

[00154] Embora uma dosagem apropriada de um peptídeo da invenção varie dependendo da via de administração, idade, peso corporal, sexo ou condições do paciente, e deva ser determinada pelo médico no final, a dose apropriada para humanos adultos pode ser geralmente entre cerca de 0,2-2000 mg/kg de peso corporal, preferivelmente entre cerca de 2-200 mg/kg.

[00155] As composições farmacêuticas da presente invenção compreendem um ou mais compostos da presente invenção, e um ou mais excipientes ou diluentes. Em uma modalidade, um ou mais dos compostos, ou solvatos, ou sai9s destes compostos.

[00156] O termo “sal farmaceuticamente aceitável” como usado aqui, refere-se aos sais que são substancialmente não tóxicos para organismos vivos. Sais farmaceuticamente aceitáveis típicos incluem os sais preparados pela reação dos compostos da presente invenção com um mineral ou ácido orgânico farmaceuticamente aceitável. Tais sais são conhecidos como sais de adição de ácido.

[00157] As composições compreendendo os compostos e agentes ativos têm utilidade na entrega de agentes ativos para sistemas biológicos selecionados e com uma biodisponibilidade aumentada ou melhorada do agente ativo em comparação com a administração do agente ativo sem o agente de entrega. A entrega pode ser melhorada entregando mais agente ativo ao longo de um período de tempo, ou entregando agente ativo em um

34 / 42 período de tempo particular (tal como para efetuar uma entrega mais rápida ou retardada) ou ao longo de um período de tempo (tal como entrega sustentada).

[00158] Composições farmacêuticas para uso de acordo com a presente invenção podem assim, ser formuladas de maneira convencional usando um ou mais carreadores fisiologicamente aceitáveis compreendendo excipientes e auxiliares, que facilitam o processamento dos compostos ativos em preparações que podem ser usadas farmaceuticamente. A formulação apropriada é dependente da via de administração escolhida.

[00159] As composições farmacêuticas podem ser administradas localmente ou sistemicamente por qualquer via convencional e apropriada incluindo, mas não limitado a, oral, intraperitoneal, parenteral, intravenosa, intramuscular, subcutânea, transdérmica, intratecal, tópica, retal, bucal, inalatória ou intranasal.

[00160] Para injeção, os compostos da invenção podem ser formulados em soluções aquosas, preferivelmente em tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hank, solução de Ringer, ou tampão de solução salina fisiológica. Para administração transmucosa, penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada são usados na formulação. Tais penetrantes, por exemplo, DMSO, ou polietileno glicol são geralmente conhecidos na técnica.

[00161] Composições farmacêuticas, que podem ser usadas oralmente, incluem cápsulas de encaixa feitas de gelatina, assim como cápsulas moles, vedadas feitas de gelatina e um plastificante, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de encaixe podem conter os ingrediente ativos em mistura com enchimento tal como lactose, aglutinantes tais como amidos, lubrificantes tais como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizadores.

[00162] Em cápsulas moles os compostos ativos podem ser dissolvidos ou colocados em suspensão em líquidos apropriados, tais como óleos graxos,

35 / 42 parafina líquida, ou polietileno glicóis líquidos. Além disso, estabilizadores podem ser adicionados. Todas as formulações para administração oral devem ser em dosagens apropriadas para a via de administração escolhida.

[00163] Alternativamente, os compostos da presente invenção podem ser incorporados em preparações orais líquidas tais como suspensões aquosas ou oleosas, soluções, emulsões, xaropes, ou elixires, por exemplo. Além disso, formulações contendo estes compostos podem ser apresentadas ou outro veículo apropriado antes do uso. Tais preparações líquidas podem conter aditivos convencionais, como agentes de suspensão, tais como xarope de sorbitol, metil celulose, glicose/xarope de açúcar, gelatina, hidroxietilcelulose, carboximetil celulose, gel de estearato de alumínio, e gorduras comestíveis hidrogenadas; agentes emulsificantes, tais como lecitina, mono-oleato de sorbitano, ou acácia; veículos não aquosos (que podem incluir óleos comestíveis), tais como óleo de amêndoa, óleo de coco fracionado, ésteres oleosos, propileno glicol, e álcool etílico; e conservantes, tais como metil ou propil p-hidroxibenzoato e ácido sórbico.

[00164] Para administração por inalação, os peptídeos para uso de acordo com a presente invenção são entregues convenientemente na forma de uma apresentação com pulverizador com aerossol de uma embalagem pressurizada ou um nebulizador com o uso de um propulsor apropriado, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, dicloro- tetrafluoroetano ou dióxido de carbono. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada provendo uma válvula para a entrega da quantidade medida. Cápsulas e cartuchos de, por exemplo, gelatina para uso em um inalador ou insuflador podem ser formulados contendo uma mistura de pó do peptídeo e uma base de pó apropriado tal como lactose ou amido.

[00165] As composições farmacêuticas da invenção também são úteis para aplicação tópica e intralesional. Como usado aqui, o termo “tópica”

36 / 42 significa “pertencendo a uma área de superfície particular”, por exemplo, pele e mucosa, e o agente tópico aplicado em uma determinada área da superfície afetará apenas a área na qual é aplicado. As formulações dos peptídeos/análogos de peptídeo podem ser administradas topicamente como um gel, unguento, creme, emulsão, formulação de liberação sustentada incluindo um adesivo transdérmico, e pode compreender lipossomas e qualquer outro carreador farmaceuticamente aceitável apropriado para administração do fármaco topicamente. As composições farmacêuticas descritas aqui também podem compreender carreadores ou excipientes sólidos apropriados da fase gel. Exemplos de tais carreadores ou excipientes incluem, mas não estão limitados a, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares, amidos, derivados de celulose, gelatina e polímeros tais como polietileno glicóis.

[00166] Composições da presente invenção podem, se desejado, ser apresentadas em uma embalagem ou dispositivo dispensador, tal como um kit aprovado por FDA, que pode conter uma ou mais formas de dosagem unitária contendo o ingrediente ativo. A embalagem pode, por exemplo, compreender uma folha de metal ou plástico, tal como uma embalagem do tipo bolha. A embalagem ou dispositivo dispensador pode ser acompanhado por instruções para administração. A embalagem ou dispensador também pode ser acomodado por um aviso associado com o recipiente em uma forma prescrita por uma agência governamental que regulamenta a fabricação, uso ou venda de farmacêuticos, aviso que reflete a aprovação pela agência da forma das composições ou administração em humanos ou veterinária. Tal aviso, por exemplo, pode ser de rotulação aprovada pela Food and Drug Administration dos Estados Unidos para fármacos prescritos ou de um inserto de produto aprovado. Composições compreendendo uma preparação da invenção formuladas em um carreador farmaceuticamente compatível também podem ser preparadas, colocadas em um recipiente apropriado, e rotuladas para

37 / 42 tratamento de uma condição indicada, como é adicionalmente detalhado abaixo.

[00167] Como usado aqui o termo “cerca de” refere-se a ± 10%.

[00168] Os termos “compreende”, “compreendendo”, “inclui”, “incluindo”, “tendo” e seus conjugados significam “incluindo, mas não limitado a”.

[00169] O termo “consistindo essencialmente de” significa que a composição, método ou estrutura pode incluir ingredientes, etapas e/ou partes adicionais, mas apenas se os ingredientes, etapas e/ou partes adicionais não alteram materialmente as características básicas e novas da composição, método ou estrutura reivindicada.

[00170] Como usado aqui, a forma singular “um”, “uma” e “o, a” inclui referências no plural a menos que o contexto dite claramente em contrário. Por exemplo, o termo “um composto” ou “pelo menos um composto” pode incluir uma pluralidade de compostos, incluindo misturas dos mesmos.

[00171] Do início ao fim deste pedido, várias modalidades desta invenção podem ser apresentadas em um formato de faixa. Deve ser entendido que a descrição em formato de faixa e meramente por conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível no escopo da invenção. Consequentemente, a descrição de uma faixa deve ser considerada como tendo descrito especificamente todas as subfaixas possíveis, assim como valores numéricos individuais dentro daquela faixa. Por exemplo, a descrição de uma faixa tal como de 1 a 6 deve ser considerada como tendo descrito especificamente subfaixas tal como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., assim como números individuais dentro daquela faixa, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, e 6. Isto se aplica independentemente da amplitude da faixa.

[00172] Onde uma faixa numérica é indicada aqui, ela destina-se a

38 / 42 incluir qualquer numeral citado (fracionário ou integral) dentro da faixa indicada. As frases “na faixa/na faixa entre” um primeiro número indicado e um segundo número indicado e “na faixa/na faixa de” um primeiro número indicado “a” um segundo número indicado são usadas aqui de modo intercambiável e destinam-se a incluir o primeiro e segundo números indicados e todos os numerais fracionários e integrais entre as mesmas.

[00173] Como usado aqui o termo “método” refere-se a maneiras, meios, técnicas e procedimentos para realizar uma dada tarefa incluindo, mas não limitado as, maneiras, meios, técnicas ou procedimentos ou conhecidos para, ou rapidamente desenvolvidos por maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos pelos versados nas técnicas químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas e médicas.

[00174] Como usado aqui, o termo “tratar” inclui anular, inibir substancialmente, retardar ou reverter a progressão de uma condição, melhorar substancialmente sintomas clínicos e estéticos de uma condição ou prevenir substancialmente a aparência de sintomas clínicos ou estéticos de uma condição.

[00175] É reconhecido que certos aspectos da invenção, que são, por clareza, descritos no contexto de modalidades separadas, também podem ser providos em combinação em uma única modalidade. Inversamente, vários aspectos da invenção, que são, por brevidade, descritos no contexto de uma única modalidade, também podem ser providos separadamente ou em qualquer sub-combinação apropriada, ou como apropriado em qualquer outra modalidade descrita da invenção. Certos aspectos descritos no contexto de várias modalidades não devem ser considerados aspectos essenciais daquelas modalidades, a menos que a modalidade seja inoperante sem elementos.

[00176] Várias modalidades e aspectos da presente invenção como delineados acima e como reivindicados na seção de reivindicações abaixo encontram suporte experimental nos exemplos seguintes.

39 / 42

EXEMPLOS

[00177] É feita agora referência aos exemplos seguinte, que junto com as descrições acima ilustram algumas modalidades da invenção de um modo não limitante.

[00178] Geralmente, a nomenclatura usada aqui e os procedimentos de laboratório utilizados na presente invenção incluem técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas e de DNA recombinante. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura. Ver, por exemplo, “Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrook et al., (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologias como definidas em Pat. U.S. Nos. 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 e

5.272.057; “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); “Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique” by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Terceira edição; “Current Protocols in Immunology” Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8a edição), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., New York (1980); imuno ensaios disponíveis extensivamente descritos na patente e literatura científica, ver, por exemplo, Pat. U.S. Nos. 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578;

3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533;

3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 e 5.281.521; “Oligonucleotídeo Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid

40 / 42 Hybridization” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); “Transcription and Translation” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); “Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) and “Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996); todas as quais são incorporadas por referência como se completamente definidas aqui. Outras referências gerais são providas do início ao fim deste documento. Acredita-se que os procedimentos aqui são bem conhecidos na técnica e são providos para conveniência do leitor. Toda a informação contida aqui é incorporada aqui por referência. EXEMPLO 1

[00179] Dexametasona é um medicamento corticosteroide que induz apoptose de células imunes e tecidos linfomieloides. Camundongos BALB/c foram usados para examinar a capacidade de peptídeos candidatos para resgatar células de linfócitos de apoptose. Camundongos foram injetados IP com 100 g de dexametasona. Camundongos tratados com dexametasona receberam imediatamente seguinte e 24 -horas após o tratamento com dexametasona IV injeção de peptídeos candidatos (250 ou 400 g peptídeo/camundongo). Os camundongos foram sacrificados 48 após o primeiro tratamento. O baço e o timo foram pesados e contagem total de células de ambos os órgãos foi avaliada.

[00180] Peptídeos usados na triagem eram como a seguir: PPLPY - SEQ ID NO: 3 LPPLAYP - SEQ ID NO: 4 PLPYP - SEQ ID NO: 9 PPL - SEQ ID NO: 10

41 / 42 PLP - SEQ ID NO: 11 PYP - SEQ ID NO: 12 LPGLPYP - SEQ ID NO: 13 LPPLGYP - SEQ ID NO: 14 LAPLPYP - SEQ ID NO: 15 LPALPYP - SEQ ID NO: 16 Resultados:

[00181] Dexametasona induziu perda de peso do baço e do timo e redução de contagem de células de cerca de 50%. Contagem de células do timo foi reduzida em quase 80% em comparação com camundongos normais. Dois dos peptídeos tiveram efeito significativo na redução da perda de peso do baço e timo, assim como redução de perda de contagem de células - SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 (ver, Figura 1). Não houveram diferenças entre as 2 doses de tratamento (250 ou 400 µg/mouse). EXEMPLO 2

[00182] Camundongos BALB/c foram usados para examinar a capacidade de peptídeos candidatos para resgatar células de linfócitos de apoptose. Camundongos foram injetados IP com 100 g de dexametasona. Camundongos tratados com dexametasona receberam imediatamente seguinte e 24 horas após tratamento com dexametasona IV injeção de peptídeos candidatos (200 g peptídeo/camundongo). Os camundongos foram sacrificados 48 após o primeiro tratamento. O baço e o timo foram pesados e contagem total de células de ambos os órgãos foi avaliada.

[00183] Peptídeos usados na triagem eram como a seguir: LPPLPYP – SEQ ID NO: 2 (controle) PPLAYP – SEQ ID NO: 18 LPPLPY - SEQ ID NO: 7 LPPLAYP - SEQ ID NO: 4 PPLPY - SEQ ID NO: 3

42 / 42 PPLPY-NH2 - SEQ ID NO: 19

RESULTADOS

[00184] Os resultados são providos na Figura 2. Cada dos peptídeos testados mostrou um melhoramento em relação ao peptídeo de controle (SEQ ID NO: 2).

[00185] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com modalidades específicas da mesma, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão aparentes para os versados na técnica. Consequentemente, pretende-se abranger todas as alternativas, modificações e variações que estão dentro do espírito e amplo escopo das reivindicações anexas.

[00186] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados neste relatório são incorporados aqui em sua totalidade por referência no relatório, na mesma extensão como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado como sendo incorporado aqui por referência. Além disso, citação ou indicação de qualquer referência neste pedido não deve ser interpretada como uma admissão que tal referência está disponível como técnica antecedente para a presente invenção. Na extensão em que os títulos das seções são usados, eles não devem ser interpretados como necessariamente limitantes.

[00187] Além disso, o documento de prioridade deste pedido é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

Claims (35)

REIVINDICAÇÕES

1. Peptídeo isolado não sendo mais longo do que dez aminoácidos, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos representada pela fórmula X1-X2-X3-X4-X5-X6 (SEQ ID NO: 17), (i) em que X1 é prolina, ou um análogo ou derivado do mesmo; (ii) em que X2 é prolina, ou um análogo do mesmo; (iii) em que X3 é selecionado dentre o grupo de alanina, valina, leucina, cisteína, isoleucina, metionina e um derivado ou análogo do mesmo; (iv) em que X4 é selecionado dentre o grupo consistindo em alanina, valina, serina e um derivado ou análogo das mesmas; (v) em que X5 é um aminoácido; (vi) em que X6 é prolina ou um análogo ou derivado do mesmo; e (vii) em que o peptídeo é capaz de reduzir a quantidade de perda de peso no baço e/ou timo induzida por dexametasona em um camundongo.

2. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dito derivado de prolina é selecionado dentre o grupo consistindo em N-metil prolina, alfa-metil prolina e ácido α- aminobutírico.

3. Peptídeo isolado de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ter 6 aminoácidos de comprimento.

4. Peptídeo isolado de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende um aminoácido que é fixado ao N terminal de X1, dito aminoácido sendo selecionado dentre o grupo consistindo em alanina, valina, leucina, cisteína, isoleucina, metionina e um derivado ou análogo do mesmo.

5. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 4,

caracterizado pelo fato de que dito aminoácido que é fixado ao N terminal de X1 é leucina ou um derivado ou análogo do mesmo.

6. Peptídeo isolado de acordo com as reivindicações 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que dito aminoácido que é fixado ao N terminal de X1 é um D aminoácido.

7. Peptídeo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 4 a 6, caracterizado pelo fato de que tem 7 aminoácidos de comprimento.

8. Peptídeo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que X4 é alanina ou análogo ou derivado da mesma.

9. Peptídeo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que X5 é selecionado dentre o grupo consistindo em tirosina, fenilalanina, triptofano e um derivado ou análogo dos mesmos.

10. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que X5 é tirosina.

11. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos como definida em SEQ ID NO: 4.

12. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que consiste de uma sequência de aminoácidos como definida em SEQ ID NO: 4.

13. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos como definida em SEQ ID NO: 18.

14. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que consiste de uma sequência de aminoácidos como definida em SEQ ID NO: 18.

15. Peptídeo isolado não sendo mais longo do que seis aminoácidos, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos representada pela fórmula X1-X2-X3-X4-X5 (SEQ ID NO: 1), (i) em que X1 é prolina ou um análogo ou derivado do mesmo; (ii) em que X2 é prolina ou um análogo ou derivado do mesmo; (iii) em que X3 é selecionado dentre o grupo de alanina, valina, leucina, cisteína, isoleucina, metionina e um derivado ou análogo dos mesmos; (iv) em que X4 é selecionado dentre o grupo consistindo em alanina, valina, serina, prolina e um derivado ou análogo dos mesmos; (v) em que X5 é um aminoácido; e (vi) em que o peptídeo é capaz de reduzir a quantidade de perda de peso no baço e/ou timo induzida por dexametasona em um camundongo.

16. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que ter 5 aminoácidos.

17. Peptídeo isolado de acordo com as reivindicações 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que X4 é selecionado dentre o grupo consistindo em alanina, prolina, um derivado ou análogo de alanina e um derivado ou análogo de prolina.

18. Peptídeo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que dito derivado ou análogo de prolina é selecionado dentre o grupo consistindo em N-metil prolina, alfa-metil prolina e ácido α-aminobutírico.

19. Peptídeo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos como definida em SEQ ID NO: 3.

20. Peptídeo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que consiste da sequência de aminoácidos como definida em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 18.

21. Peptídeo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que X3 é leucina.

22. Peptídeo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que X1 e/ou X3 são D aminoácidos.

23. Peptídeo isolado tendo cinco aminoácidos, caracterizado pelo fato de que consiste de uma sequência de aminoácidos representada pela fórmula X1-X2-X3-X4-X5 (SEQ ID NO: 5); em que (i) X1 e X3 são quaisquer aminoácidos; (ii) X2 é prolina ou um análogo ou derivado do mesmo; (iii) X4 não é prolina; (iv) o peptídeo é capaz de reduzir a quantidade de perda de peso no baço e/ou timo induzida por dexametasona em um camundongo.

24. Peptídeo isolado tendo sete aminoácidos, caracterizado pelo fato de que consiste de uma sequência de aminoácidos representada pela fórmula X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 (SEQ ID NO: 6), em que (i) X1, X5 e X6 são quaisquer aminoácidos; (ii) X2, X3 e X7 é prolina ou um análogo ou derivado do mesmo; (iii) X4 não é prolina; e (iv) o peptídeo é capaz de reduzir a quantidade de perda de peso no baço e/ou timo induzida por dexametasona em um camundongo.

25. Peptídeo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é um peptídeo grampeado.

26. Peptídeo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é um peptídeo cíclico.

27. Peptídeo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que a ordem da sequência é invertida e todos os aminoácidos são do tipo D.

28. Peptídeo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é fixado a uma porção de penetração na célula.

29. Peptídeo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que dita porção de penetração na célula é fixada a um N-terminal do peptídeo.

30. Peptídeo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de doença inflamatória ou degenerativa.

31. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que dita doença associada com apoptose é uma doença inflamatória ou degenerativa.

32. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a doença inflamatória é uma doença autoimune.

33. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que dita doença degenerativa é uma doença neurodegenerativa.

34. Peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que dita doença associada com apoptose é selecionada dentre o grupo consistindo em degeneração macular relacionada à idade (AMD), retinite pigmentosa, acidente vascular cerebral e infarto do miocárdio.

35. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 29, como um agente ativo e um carreador fisiologicamente aceitável.

Petição 870200152309, de 03/12/2020, pág. 55/60 1/2

Número de células Peso do baço Peso do timo Número de células do timo do baço

Petição 870200152309, de 03/12/2020, pág. 56/60 2/2

Peso do baço Número de células Peso do timo Número de células do timo do baço