BR112020023086A2 - composições de controle de patógenos e seus usos - Google Patents

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BR112020023086A2
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Maria Helena Christine Van Rooijen
Andrew Martin Barry
Hei Tam Hok
Ignacio Martinez
Vladimirovna Nukolova Nataliya
Simon Schwizer
Daniel Garcia Cabanillas
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Abstract

"COMPOSIÇÕES DE CONTROLE DE PATÓGE-NOS E SEUS USOS". A presente invenção refere-se a composições de controle de patógenos incluindo uma pluralidade de pacotes de mensageiros de plantas (por exemplo, incluindo uma vesícula extracelular (EV) de planta, ou segmento, porção ou extrato dos mesmos), que são úteis em métodos para tratar ou prevenir uma infeção em um animal e/ou diminuir a aptidão de patógenos (por exemplo, patógenos de animais) ou seus vetores.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPO- SIÇÕES DE CONTROLE DE PATÓGENOS E SEUS USOS".
ANTECEDENTES
[0001] Os patógenos, incluindo patógenos de animais (por exemplo, bactérias, fungos, parasitas ou vírus), causam doença grave em huma- nos e animais. Embora uma multitude de meios tenha sido utilizada para tentar controlar patógenos de animais, ou seus vetores, a demanda por estratégias seguras e eficazes de controle de patógenos está aumen- tando. Assim existe necessidade na técnica de novos métodos e com- posições para controlar patógenos de animais.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0002] A presente invenção refere-se a composições de controle de patógenos incluindo uma pluralidade de pacotes de mensageiros de plantas que são úteis em métodos para tratar infeções em um animal com sua necessidade, prevenir uma infeção em um animal em seu risco ou diminuir a aptidão de patógenos (por exemplo, patógenos de ani- mais) ou seus vetores.
[0003] Em um aspecto, a descrição apresenta uma composição de controle de patógenos incluindo uma pluralidade de pacotes de mensa- geiros de plantas (PMPs), em que a composição é formulada para ad- ministração a um animal, e em que a composição inclui pelo menos 5% de PMPs como medido por peso/vol, percentagem de composição de proteína PMP e/ou percentagem de composição de lipídeos (por exem- plo, por medição de lipídeos fluorescentemente marcados).
[0004] Em outro aspecto, a descrição apresenta uma composição de controle de patógenos incluindo uma pluralidade de PMPs, em que a composição é formulada para entrega a um patógeno de animais, e em que a composição inclui pelo menos 5% de PMPs.
[0005] Ainda em outro aspecto, a descrição apresenta uma compo- sição de controle de patógenos incluindo uma pluralidade de PMPs, em que a composição é formulada para entrega a um vetor de patógeno de animais, e em que a composição inclui pelo menos 5% de PMPs.
[0006] Ainda em outro aspecto, a descrição apresenta uma compo- sição de controle de patógenos incluindo uma pluralidade de PMPs, em que a composição é estável durante pelo menos um dia à temperatura ambiente e/ou estável durante pelo menos uma semana a 4 ºC.
[0007] Em algumas modalidades da composição de controle de pa- tógenos, a pluralidade de PMPs na composição está a uma concentra- ção eficaz para diminuir a aptidão de um patógeno de animais ou um vetor de patógeno de animais. Em algumas modalidades, a pluralidade de PMPs na composição está a uma concentração eficaz para tratar uma infeção em um animal infectado com um patógeno. Em outras mo- dalidades, a pluralidade de PMPs na composição está a uma concen- tração eficaz para prevenir uma infeção em um animal em risco de uma infeção com um patógeno.
[0008] Em outro aspecto, a descrição apresenta uma composição de controle de patógenos incluindo uma pluralidade de PMPs, em que a pluralidade de PMPs na composição está a uma concentração eficaz para diminuir a aptidão de um patógeno de animais.
[0009] Ainda em outro aspecto, a descrição apresenta uma compo- sição de controle de patógenos incluindo uma pluralidade de PMPs, em que a pluralidade de PMPs na composição está a uma concentração eficaz para diminuir a aptidão de um vetor de patógeno de animais.
[0010] Ainda em outro aspecto, a descrição apresenta uma compo- sição de controle de patógenos incluindo uma pluralidade de PMPs, em que a pluralidade de PMPs na composição está a uma concentração eficaz para tratar uma infeção em um animal infectado com um pató- geno.
[0011] E, ainda em outro aspecto, a descrição apresenta uma com- posição de controle de patógenos incluindo uma pluralidade de PMPs,
em que a pluralidade de PMPs na composição está a uma concentração eficaz para prevenir uma infeção em um animal em risco de uma infeção com um patógeno.
[0012] Em algumas modalidades da composição de controle de pa- tógenos, a pluralidade de PMPs na composição está a uma concentra- ção de pelo menos 0,01 ng, 0,1 ng, 1 ng, 2 ng, 3 ng, 4 ng, 5 ng, 10 no, 50 ng, 100 ng, 250 ng, 500 ng, 750 ng, 1 ug, 10 ug, 50 ug, 100 ug ou 250 ug de proteína PMP/mL. Em algumas modalidades, a pluralidade de PMP's inclui ainda um agente de controle de patógenos adicional.
[0013] Em outro aspecto, a descrição apresenta uma composição de controle de patógenos incluindo uma pluralidade de PMPs, em que cada um da pluralidade de PMP's inclui um agente de controle de pató- genos heterólogo e em que a composição é formulada para entrega a um patógeno de animais agrícola ou veterinário ou um seu vetor.
[0014] Em algumas modalidades da composição de controle de pa- tógenos, o agente de controle de patógenos heterólogo é um agente antibacteriano, por exemplo, doxorrubicina, um agente antifúngico, um agente virucida, um agente antiviral, um agente inseticida, um agente nematicida, um agente antiparasitário ou um repelente de insetos. Em algumas modalidades, o agente antibacteriano é um antibiótico, por exemplo, vancomicina, uma penicilina, uma cefalosporina, uma mo- nobactam, um carbapenem, um macrolídeo, um aminoglicosídeo, uma quinolona, uma sulfonamida, uma tetraciclina, um glicopeptídeo, uma lipoglicopeptídeo, uma oxazolidinina, uma rifamicina, uma tuberactino- micina, cloranfenicol, metronidazol, tinidazol, nitrofurantoína, teicopla- nina, telavancina, linezolida, ciclosserina 2, bacitracina, polimixina B, vi- omicina ou capreomicina.
[0015] Em algumas modalidades da composição de controle de pa- tógenos, o agente antifúngico é uma alilamina, um imidazol, um triazol, um tiazol, um polieno ou uma equinocandina.
[0016] Em algumas modalidades da composição de controlo de pa- tógenos, o agente inseticida é um cloronicotinil, um neonicotinoide, um carbamato, um organofosfato, um piretroide, uma oxadiazina, uma es- pinosina, um ciclodieno, um organocloro, um fiprol, uma mectina, uma diacil-hidrazina, uma benzoilureia, um organoestanho, um pirrol, um di- nitroterpenol, um METI, um ácido tetrônico, um ácido tetrâmico ou uma ftalamida.
[0017] Em algumas modalidades da composição de controle de pa- tógenos, o agente de controle de patógenos heterólogo é uma molécula pequena (por exemplo, um antibiótico ou um metabolito secundário), um ácido nucleico (por exemplo, um RNA inibidor) ou um polipeptídeo.
[0018] Em algumas modalidades da composição de controle de pa- tógenos, o agente de controle de patógenos heterólogo é encapsulado por cada um da pluralidade de PMPs; embebido na superfície de cada um da pluralidade de PMPs; ou conjugado à superfície de cada um da pluralidade de PMPs. Em algumas modalidades, cada um da pluralidade de PMP's inclui ainda um agente de controle de patógenos adicional.
[0019] Em algumas modalidades, o patógeno é uma bactéria (por exemplo, uma espécie de Pseudomonas (por exemplo, Pseudomonas aeruginosa), uma espécie de Escherichia (por exemplo, Escherichia coli), uma espécie de Streptococcus, uma espécie de Pneumococcus, uma espécie de Shigella, uma espécie de Salmonella ou uma espécie de Campylobacter), um fungo (por exemplo, uma espécie de Saccha- romyces ou uma espécie de Candida), um inseto parasitário (por exem- plo, uma espécie de Cimex), um nematódeo parasitário (por exemplo, uma espécie de Heligmosomoides) ou um protozoário parasitário (por exemplo, uma espécie de Trichomonas).
[0020] Em algumas modalidades da composição de controle de pa- tógenos, o vetor é um mosquito, um carrapato, um ácaro ou um piolho.
[0021] Em algumas modalidades da composição de controle de pa- tógenos, a composição é estável durante pelo menos um dia à tempe- ratura ambiente e/ou estável durante pelo menos uma semana a 4 ºC; estável durante pelo menos 24 horas, 48 horas, sete dias ou 30 dias a 4 ºC; ou estável a uma temperatura de pelo menos 20 ºC, 24 ºC ou 37 ºC.
[0022] Em algumas modalidades da composição de controle de pa- tógenos, a pluralidade de PMPs na composição está a uma concentra- ção eficaz para diminuir a aptidão de um patógeno de animais ou um vetor de patógeno de animais; eficaz para tratar uma infeção em um animal infectado com um patógeno; ou eficaz para prevenir uma infeção em um animal em risco de uma infeção com um patógeno.
[0023] Em algumas modalidades, a pluralidade de PMPs na com- posição está a uma concentração de pelo menos 0,01 ng, 0,1 ng, 1 ng, 2 ng, 3 ng, 4 ng, 5 ng, 10 ng, 50 ng, 100 ng, 250 ng, 500 ng, 750 ng, 1 ug, 10 ug, 50 ug, 100 ug ou 250 ug de proteína PMP/mL.
[0024] Em algumas modalidades, a composição inclui um transpor- tador agricolamente aceitável ou um transportador farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição é formulada para estabilizar os PMPs. Em algumas modalidades, a composição é formu- lada como um líquido, um sólido, um aerossol, uma pasta, um gel ou uma composição gasosa. Em algumas modalidades, a composição in- clui pelo menos 5% de PMPs.
[0025] Em outro aspecto, a descrição apresenta uma composição de controle de patógenos incluindo uma pluralidade de PMPs, em que os PMPs são isolados de uma planta por um processo que inclui os passos de (a) proporcionar uma amostra inicial de uma planta, ou uma sua parte, em que a planta ou sua parte inclui EVs; (b) isolar uma fração de PMP em bruto da amostra inicial, em que a fração de PMP em bruto tem um nível diminuído de pelo menos um contaminante ou componente indesejado da planta ou sua parte em relação ao nível na amostra inicial; (c) purificar a fração de PMP em bruto, produzindo deste modo uma pluralidade de PMPs puros, em que a pluralidade de PMPs puros tem um nível diminuído de pelo menos um contaminante ou componente in- desejado da planta ou sua parte em relação ao nível na fração de EV em bruto; (d) carregar a pluralidade de PMPs do passo (c) com um agente de controle de patógenos; e (e) formular os PMPs do passo (d) para entrega a um patógeno de animais agrícola ou veterinário ou um seu vetor.
[0026] Em outro aspecto, a descrição apresenta um patógeno de animais incluindo qualquer uma das composições de controle de pató- genos descritas aqui.
[0027] Em outro aspecto, a descrição apresenta um vetor de pató- geno de animais incluindo qualquer uma das composições de controle de patógenos descritas aqui.
[0028] Ainda em outro aspecto, a descrição apresenta um método de entregar uma composição de controle de patógenos a um animal in- cluindo administrar ao animal qualquer uma das composições de con- trole de patógenos descritas aqui.
[0029] Ainda em outro aspecto, a descrição apresenta um método de tratar uma infeção em um animal com sua necessidade, incluindo o método administrar ao animal uma quantidade eficaz de qualquer uma das composições de controle de patógenos descritas aqui.
[0030] Ainda em outro aspecto, a descrição apresenta um método de prevenir uma infeção em um animal em seu risco, incluindo o método administrar ao animal uma quantidade eficaz de qualquer uma das com- posições de controle de patógenos descritas aqui, em que o método diminui a probabilidade da infeção no animal em relação a um animal não tratado.
[0031] Em algumas modalidades dos métodos acima, a infeção é causada por um patógeno, e o patógeno é uma bactéria (por exemplo, uma espécie de Pseudomonas, uma espécie de Escherichia, uma es- pécie de Streptococcus, uma espécie de Pneumococcus, uma espécie de Shigella, uma espécie de Salmonella ou uma espécie de Campylo- bacter), um fungo (por exemplo, uma espécie de Saccharomyces ou uma espécie de Candida), um vírus, um inseto parasitário (por exemplo, uma espécie de Cimex), um nematódeo parasitário (por exemplo, uma espécie de Heligmosomoides) ou um protozoário parasitário (por exem- plo, uma espécie de Trichomonas).
[0032] Em algumas modalidades, a composição de controle de pa- tógenos é administrada ao animal oralmente, intravenosamente ou sub- cutaneamente.
[0033] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método de en- tregar uma composição de controle de patógenos a um patógeno inclu- indo contatar o patógeno com qualquer uma das composições de con- trole de patógenos descritas aqui.
[0034] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método de di- minuir a aptidão de um patógeno, incluindo o método entregar ao pató- geno qualquer uma das composições de controle de patógenos descri- tas aqui, em que o método diminui a aptidão do patógeno em relação a um patógeno não tratado.
[0035] Em algumas modalidades, o método inclui entregar a com- posição a pelo menos um habitat onde o patógeno cresce, vive, se re- produz, se alimenta ou infesta. Em algumas modalidades, a composição é entregue como uma composição comestível pelo patógeno para in- gestão pelo patógeno.
[0036] Em algumas modalidades dos métodos acima, o patógeno é uma bactéria (por exemplo, uma espécie de Pseudomonas, uma espé- cie de Escherichia, uma espécie de Streptococcus, uma espécie de Pneumococcus, uma espécie de Shigella, uma espécie de Salmonella ou uma espécie de Campylobacter), um fungo (por exemplo, uma espé- cie de Saccharomyces ou uma espécie de Candida), um inseto parasi- tário (por exemplo, uma espécie de Cimex), um nematódeo parasitário (por exemplo, uma espécie de Heligmosomoides) ou um protozoário pa- rasitário (por exemplo, uma espécie de Trichomonas).
[0037] Em algumas modalidades, a composição é entregue como um líquido, um sólido, um aerossol, uma pasta, um gel ou um gás.
[0038] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método de di- minuir a aptidão de um vetor de patógeno de animais, incluindo o mé- todo entregar ao vetor uma quantidade eficaz de qualquer uma das com- posições de controle de patógenos descritas aqui, em que o método diminui a aptidão do vetor em relação a um vetor não tratado.
[0039] Em algumas modalidades, o método inclui entregar a com- posição a pelo menos um habitat onde o vetor cresce, vive, se reproduz, se alimenta ou infesta. Em algumas modalidades, a composição é en- tregue como uma composição comestível para ingestão pelo vetor. Em algumas modalidades, o vetor é um inseto, por exemplo, mosquito, um carrapato, um ácaro ou um piolho. Em algumas modalidades, a compo- sição é entregue como um líquido, um sólido, um aerossol, uma pasta, um gel ou um gás.
[0040] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método de tra- tar um animal tendo uma infeção fúngica, em que o método inclui admi- nistrar ao animal uma quantidade eficaz de uma composição de controle de patógenos incluindo uma pluralidade de PMPs.
[0041] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método de tra- tar um animal tendo uma infeção fúngica, em que o método inclui admi- nistrar ao animal uma quantidade eficaz de uma composição de controle de patógenos incluindo uma pluralidade de PMPs, e em que a plurali- dade de PMPs inclui um agente antifúngico.
[0042] Em algumas modalidades, o agente antifúngico é um ácido nucleico que inibe a expressão de um gene em um fungo que causa a infeção fúngica. Em algumas modalidades, o gene é Proteína de Cres- cimento Filamentoso Intensificado (EFG1). Em algumas modalidades, a infeção fúngica é causada por Candida albicans.
[0043] Em algumas modalidades, a composição inclui um PMP de- rivado de Arabidopsis.
[0044] Em algumas modalidades, o método diminui ou elimina subs- tancialmente a infeção fúngica.
[0045] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método de tra- tar um animal tendo uma infeção bacteriana, em que o método inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz de uma composição de controle de patógenos incluindo uma pluralidade de PMPs.
[0046] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método de tra- tar um animal tendo uma infeção bacteriana, em que o método inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz de uma composição de controle de patógenos incluindo uma pluralidade de PMPs, em que a pluralidade de PMPs inclui um agente antibacteriano.
[0047] Em algumas modalidades, o agente antibacteriano é Anfote- ricina B.
[0048] Em algumas modalidades, a bactéria é uma espécie de Pseudomonas, uma espécie de Escherichia, uma espécie de Strepto- coccus, uma espécie de Pneumococcus, uma espécie de Shigella, uma espécie de Salmonella ou uma espécie de Campylobacter.
[0049] Em algumas modalidades, a composição inclui um PMP de- rivado de Arabidopsis.
[0050] Em algumas modalidades, o método diminui ou elimina subs- tancialmente a infeção bacteriana.
[0051] Em algumas modalidades, o animal é um animal veterinário ou um animal de criação.
[0052] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método de di- minuir a aptidão de um inseto parasitário, em que o método inclui entre- gar ao inseto parasitário uma composição de controle de patógenos in- cluindo uma pluralidade de PMPs.
[0053] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método de di- minuir a aptidão de um inseto parasitário, em que o método inclui entre- gar ao inseto parasitário uma composição de controle de patógenos in- cluindo uma pluralidade de PMPs, e em que a pluralidade de PMPs in- clui um agente inseticida.
[0054] Em algumas modalidades, o agente inseticida é um ácido nucleico de peptídeos.
[0055] Em algumas modalidades, o inseto parasitário é um perce- vejo.
[0056] Em algumas modalidades, o método diminui a aptidão do in- seto parasitário em relação a um inseto parasitário não tratado.
[0057] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método de di- minuir a aptidão de um nematódeo parasitário, em que o método inclui entregar ao nematódeo parasitário uma composição de controle de pa- tógenos incluindo uma pluralidade de PMPs.
[0058] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método de di- minuir a aptidão de um nematódeo parasitário, em que o método inclui entregar ao nematódeo parasitário uma composição de controle de pa- tógenos incluindo uma pluralidade de PMPs, e em que a pluralidade de PMP's inclui um agente nematicida.
[0059] Em algumas modalidades, o nematódeo parasitário é Helig- mosomoides polygyrus.
[0060] Em algumas modalidades, o método diminui a aptidão do ne- matódeo parasitário em relação a um nematódeo parasitário não tra- tado.
[0061] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método de di- minuir a aptidão de um protozoário parasitário, em que o método inclui entregar ao protozoário parasitário uma composição de controle de pa- tógenos incluindo uma pluralidade de PMPs.
[0062] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método de di- minuir a aptidão de um protozoário parasitário, em que o método inclui entregar ao protozoário parasitário uma composição de controle de pa- tógenos incluindo uma pluralidade de PMPs, e em que a pluralidade de PMP's inclui um agente antiparasitário.
[0063] Em algumas modalidades, o protozoário parasitário é T. va- ginalis.
[0064] Em algumas modalidades, o método diminui a aptidão do protozoário parasitário em relação a um protozoário parasitário não tra- tado.
[0065] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método de di- minuir a aptidão de um vetor de insetos de um patógeno de animais, em que o método inclui entregar ao vetor uma composição de controle de patógenos incluindo uma pluralidade de PMPs.
[0066] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método de di- minuir a aptidão de um vetor de insetos de um patógeno de animais, em que o método inclui entregar ao vetor uma composição de controle de patógenos incluindo uma pluralidade de PMPs, e em que a pluralidade de PMP's inclui um agente inseticida.
[0067] Em algumas modalidades, o método diminui a aptidão do ve- tor em relação a um vetor não tratado.
[0068] Em algumas modalidades, o inseto é um mosquito, carra- pato, ácaro ou piolho.
[0069] Outras características e vantagens da invenção serão apa- rentes a partir da seguinte Descrição Detalhada e das Reivindicações. Definições
[0070] Como usado aqui, o termo "animal" se refere a humanos, gado, animais de quinta ou animais veterinários mamíferos (por exem- plo, incluindo, por exemplo, cães, gatos, cavalos, coelhos, animais de ZOO, vacas, porcos, ovelhas, galinhas e primatas não humanos).
[0071] Como usado aqui, "diminuir a aptidão de um patógeno" se refere a qualquer interrupção da fisiologia do patógeno em consequên- cia da administração de uma composição de controle de patógenos des- crita aqui, incluindo, mas não se limitando a, qualquer um ou mais dos seguintes efeitos desejados: (1) diminuir a população de um patógeno em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; (2) diminuir a taxa reprodutiva de um patógeno em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; (3) diminuir a mobilidade de um patógeno em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; (4) diminuir o peso ou massa corporal de um patógeno em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; (5) diminuir a taxa ou atividade metabólica de um patógeno em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; ou (6) diminuir a transmissão do patógeno (por exemplo, transmissão vertical ou horizontal de um patógeno de um inseto para outro) por um patógeno em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais. Uma diminuição na aptidão do patógeno pode ser determinada, por exemplo, em comparação com um patógeno não tratado.
[0072] Como usado aqui, "diminuir a aptidão de um vetor" se refere a qualquer interrupção da fisiologia do vetor, ou qualquer atividade le- vada a cabo pelo referido vetor, em consequência da administração de uma composição de controle de patógenos descrita aqui, incluindo, mas não se limitando a, qualquer um ou mais dos seguintes efeitos deseja- dos: (1) diminuir a população de um vetor em cerca de 10%, 20%, 30%,
40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; (2) diminuir a taxa reprodutiva de um vetor (por exemplo, inseto, por exemplo, mos- quito, carrapato, ácaro, piolho) em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; (3) diminuir a mobili- dade de um vetor (por exemplo, inseto, por exemplo, mosquito, carra- pato, ácaro, piolho) em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; (4) diminuir o peso corporal de um vetor (por exemplo, inseto, por exemplo, mosquito, carrapato, ácaro, piolho) em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; (5) aumentar a taxa ou atividade metabólica de um vetor (por exemplo, inseto, por exemplo, mosquito, carrapato, ácaro, piolho) em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; (6) diminuir a transmissão de patógeno vetor-vetor (por exemplo, transmissão vertical ou horizontal de um vetor de um inseto para outro) por um vetor (por exemplo, inseto, por exem- plo, mosquito, carrapato, ácaro, piolho) por cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; (7) diminuir a transmissão do patógeno vetor-animal em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; (8) diminuir a expectativa de vida do vetor (por exemplo, inseto, por exemplo, mos- quito, carrapato, ácaro, piolho) em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; (9) aumentar a sus- cetibilidade do vetor (por exemplo, inseto, por exemplo, mosquito, car- rapato, ácaro, piolho) a pesticidas (por exemplo, inseticidas) em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; ou (10) diminuir a competência do vetor por um vetor (por exemplo, inseto, por exemplo, mosquito, carrapato, ácaro, piolho) em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais.
Uma diminuição na aptidão do vetor pode ser determi- nada, por exemplo, em comparação com um vetor não tratado.
[0073] Como usado aqui, o termo "formulado para entrega a um ani- mal" se refere a uma composição de controle de patógenos que inclui um transportador farmaceuticamente aceitável.
[0074] Como usado aqui, o termo "formulado para entrega a um pa- tógeno" se refere a uma composição de controle de patógenos que in- clui um transportador farmaceuticamente ou agricolamente aceitável.
[0075] Como usado aqui, o termo "formulado para entrega a um ve- tor" se refere a uma composição de controle de patógenos que inclui um transportador agricolamente aceitável.
[0076] Como usado aqui, o termo "infeção" se refere à presença ou colonização de um patógeno em um animal (por exemplo, em uma ou mais partes do animal), sobre um animal (por exemplo, sobre uma ou mais partes do animal) ou no habitat rodeando um animal, particular- mente onde a infeção diminui a aptidão do animal, por exemplo, cau- sando uma doença, sintomas de doença ou uma resposta imunitária (por exemplo, inflamatória).
[0077] Como definido aqui, os termos "ácido nucleico" e "polinucle- otídeo" são permutáveis e se referem a RNA ou DNA que é linear ou ramificado, de fita simples ou dupla, ou um seu híbrido, independente- mente do comprimento (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6,7,8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 500, 1000 ou mais ácidos nuclei- cos). O termo engloba também híbridos de RNA/DNA. Os nucleotídeos são tipicamente ligados em um ácido nucleico por ligações de fosfodié- ster, embora o termo "ácido nucleico" englobe também análogos de áci- dos nucleicos tendo outros tipos de ligações ou esqueletos (por exem- plo, ligações ou esqueletos de fosforamida, fosforotioato, fosforoditio- ato, O-metilfosforoamidato, morfolino, ácido nucleico trancado (LNA), ácido nucleico de glicerol (GNA), ácido nucleico de treose (TNA) e ácido nucleico de peptídeo (PNA), entre outros). Os ácidos nucleicos podem ter fita simples, fita dupla ou conter porções de sequência de fita simples e fita dupla. Um ácido nucleico pode conter qualquer combinação de desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos, bem como qualquer combi- nação de bases, incluindo, por exemplo, adenina, timina, citosina, gua- nina, uracila, e bases modificadas ou não canônicas (incluindo, por exemplo, hipoxantina, xantina, 7-metilguanina, 5,6-di-hidrouracila, 5- metilcitosina, e 5-hidroximetilcitosina).
[0078] Como usado aqui, o termo "patógeno" se refere a um orga- nismo, tal como um microrganismo ou um invertebrado, que causa do- ença ou sintomas de doença em um animal por, por exemplo, (i) infeção direta do animal, (ii) por produção de agentes que causam doença ou sintomas de doença em um animal (por exemplo, bactérias que produ- zem toxinas patogênicas e similares) e/ou (iii) que provocam uma res- posta imunitária (por exemplo, inflamatória) em animais (por exemplo, insetos mordedores, por exemplo, percevejos). Como usado aqui, os patógenos incluem, mas não estão limitados a, bactérias, protozoários, parasitas, fungos, nematódeos, insetos, viroides e vírus, ou qualquer sua combinação, em que cada patógeno é capaz, por si próprio ou em conjunto com outro patógeno, de provocar doença ou sintomas em hu- manos.
[0079] Como usado aqui, o termo "composição de controle de pató- genos" se refere a uma composição antibacteriana, antifúngica, viru- cida, antiviral, antiparasitária (por exemplo, anti-helmíntica), parasiti- cida, antiparasitária, inseticida, nematicida ou repelente de vetores que inclui uma pluralidade de pacotes de mensageiros de plantas (PMP). Cada um da pluralidade de PMPs pode compreender um agente de con- trole de patógenos, por exemplo, um agente de controle de patógenos heterólogo.
[0080] Como usado aqui, o termo "peptídeo", "proteína" ou "polipep- tídeo" engloba qualquer cadeia de aminoácidos ocorrendo naturalmente ou não naturalmente (D- ou L-aminoácidos), independentemente do comprimento (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 40, 50, 100 ou mais aminoácidos), da presença ou au- sência de modificações pós-translacionais (por exemplo, glicosilação ou fosforilação) ou da presença de, por exemplo, um ou mais grupos de acila diferentes de amino (por exemplo, açúcar, lipídeo, etc.) covalente- mente ligados ao peptídeo, e inclui, por exemplo, proteínas naturais, po- lipeptídeos e peptídeos sintéticos ou recombinantes, moléculas híbri- das, peptoides ou peptidomiméticos.
[0081] Como usado aqui, a "percentagem de identidade" entre duas sequências é determinada pelo algoritmo BLAST 2.0, que é descrito em Altschul et a/., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. Software para realizar análises BLAST está publicamente disponível através do National Cen- ter for Biotechnology Information.
[0082] Como usado aqui, o termo "agente de controle de patóge- nos" ou se refere a um agente, composição ou substância nele, que controla ou diminui a aptidão (por exemplo, mata ou inibe o crescimento, proliferação, divisão, reprodução ou propagação) de um patógeno ou vetor de patógeno agrícola, ambiental ou doméstico/caseiro, tal como um inseto, molusco, nematódeo, fungo, bactéria ou vírus. Os agentes de controle de patógenos são entendidos como englobando inseticidas ocorrendo naturalmente ou sintéticos (larvicidas ou adulticidas), regula- dores do crescimento de insetos, acaricidas (miticidas), moluscicidas, nematicidas, ectoparasiticidas, bactericidas, fungicidas ou herbicidas. O termo "agente de controle de patógenos" pode englobar ainda outras moléculas bioativas tais como antibióticos, antivirais, pesticidas, antifún- gicos, anti-helmínticos, nutrientes e/ou agentes que atordoam ou abran- dam o movimento do patógeno ou vetor de patógeno. Em alguns casos, o agente de controle de patógenos é um aleloquímico. Como usado aqui, "aleloquímico" ou "agente aleloquímico" é uma substância produ- zida por um organismo (por exemplo, uma planta) que pode efetivar uma função fisiológica (por exemplo, a germinação, crescimento, sobrevivên- cia ou reprodução) de outro organismo (por exemplo, um patógeno ou um vetor de patógeno).
[0083] O agente de controle de patógenos pode ser heterólogo. Como usado aqui, o termo "heterólogo" se refere a um agente (por exemplo, um agente pesticida) que é (1) exógeno à planta (por exemplo, tendo origem em uma fonte que não é a planta ou parte da planta a partir da qual o PMP é produzido) (por exemplo, adicionado ao PMP usando abordagens de carga descritas aqui) ou (2) endógeno à célula ou tecido da planta a partir do qual o PMP é produzido, mas presente no PMP (por exemplo, adicionado ao PMP usando abordagens de carga descritas aqui, engenharia genética, abordagens in vitro ou in vivo) a uma concentração que é mais elevada do que aquela encontrada na natureza (por exemplo, mais elevada do que uma concentração encon- trada em uma vesícula extracelular da planta ocorrendo naturalmente).
[0084] Como usado aqui, o termo "planta" se refere a plantas intei- ras, órgãos de plantas, tecidos de plantas, sementes, células de plantas, sementes e descendência das mesmas. As células de plantas incluem, sem limitação, células de sementes, culturas em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calos, folhas, raízes, rebentos, game- tófitos, esporófitos, pólen e microesporos. As partes de plantas incluem tecidos diferenciados e indiferenciados incluindo os, mas não se limi- tando aos, seguintes: raízes, caules, brotos, folhas, pólen, sementes, frutos, produtos coletados, tecido tumoral e várias formas de células e cultura (por exemplo, células individuais, protoplastos, embriões e te- cido caloso). O tecido de planta pode estar em uma planta ou em um órgão, tecido ou cultura de células de planta. Adicionalmente, uma planta pode ser geneticamente manipulada para produzir uma proteína ou RNA heterólogo, por exemplo, de qualquer uma das composições de controle de patógenos nos métodos ou composições descritas aqui.
[0085] Como usado aqui, o termo "vesícula extracelular da planta", "EV da planta" ou "EV" se refere a uma estrutura de bicamada de lipí- deos encerrada ocorrendo naturalmente em uma planta. Opcional- mente, a EV da planta inclui um ou mais marcadores de EV da planta. Como usado aqui, o termo "marcador de EV da planta" se refere a um componente que está naturalmente associado a uma planta, tal como uma proteína da planta, um ácido nucleico da planta, uma molécula pe- quena da planta, um lipídeo da planta, ou uma sua combinação inclu- indo, mas não se limitando a qualquer um dos marcadores de EV da planta listados no Apêndice. Em alguns casos, o marcador de EV da planta é um marcador de identificação de uma EV da planta mas não é um agente pesticida. Em alguns casos, o marcador de EV da planta é um marcador de identificação de uma EV da planta e também um agente pesticida (por exemplo, associado à ou encapsulado pela plura- lidade de PMPs ou não diretamente associado à ou encapsulado pela pluralidade de PMPs).
[0086] Como usado aqui, o termo "pacote de mensageiro de plan- tas" ou "PMP" se refere a uma estrutura de lipídeos (por exemplo, uma estrutura em bicamada de lipídeos, unilamelar, multilamelar; por exem- plo, uma estrutura vesicular de lipídeos), que tem cerca de 5-2000 nm (por exemplo, pelo menos 5-1000 nm, pelo menos 5-500 nm, pelo me- nos 400-500 nm, pelo menos 25-250 nm, pelo menos 50-150 nm ou pelo menos 70-120 nm) em diâmetro, que é derivada de (por exemplo, enri- quecida, isolada ou purificada a partir de) uma fonte ou segmento, por- ção, ou seu extrato, de plantas, incluindo componentes de lipídeos ou não lipídeos (por exemplo, peptídeos, ácidos nucleicos ou moléculas pequenas) associados a elas e que foi enriquecida, isolada ou purificada a partir de uma planta, uma parte da planta ou uma célula da planta, removendo o enriquecimento ou o isolamento um ou mais contaminan- tes ou componentes indesejados da planta de fonte. Os PMPs podem ser preparações altamente purificadas de EVs ocorrendo naturalmente. Preferencialmente, pelo menos 1% dos contaminantes ou componentes indesejados da planta de fonte são removidos (por exemplo, pelo menos 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99%, ou 100%) de um ou mais contami- nantes ou componentes indesejados da planta de fonte, por exemplo, componentes da parede celular da planta; pectina; organelas da planta (por exemplo, mitocôndrias; plastídeos tais como cloroplastos, leuco- plastos ou amiloplastos; e núcleos); cromatina da planta (por exemplo, um cromossomo de planta); ou agregados moleculares da planta (por exemplo, agregados de proteína, agregados de proteína-ácido nucleico, agregados de lipoproteína ou estruturas lipido-proteicas). Preferencial- mente, um PMP é pelo menos 30% puro (por exemplo, pelo menos 40% puro, pelo menos 50% puro, pelo menos 60% puro, pelo menos 70% puro, pelo menos 80% puro, pelo menos 90% puro, pelo menos 99% puro ou 100% puro) em relação ao um ou mais contaminantes ou com- ponentes indesejados da planta de fonte como medido por peso (p/p), visualização espectral (% de transmitância) ou condutividade (S/m).
[0087] Os PMPs podem incluir opcionalmente agentes adicionais, tais como agentes funcionais heterólogos, por exemplo, agentes de con- trole de patógenos, agentes repelentes, polinucleotídeos, polipeptídeos ou moléculas pequenas. Os PMPs podem transportar ou se associar a agentes adicionais (por exemplo, agentes funcionais heterólogos) em uma variedade de modos para permitir a entrega do agente a uma planta alvo, por exemplo, por encapsulação do agente, incorporação do agente na estrutura em bicamada de lipídeos ou associação do agente (por exemplo, por conjugação) à superfície da estrutura em bicamada de lipídeos. Os agentes funcionais heterólogos podem ser incorporados nos PMPs in vivo (por exemplo, in planta) ou in vitro (por exemplo, em cultura de tecidos, em cultura de células ou sinteticamente incorpora- dos). Como usado aqui, o termo "repelente" se refere a um agente, com- posição ou substância nele, que impede os vetores de patógeno (por exemplo, insetos, por exemplo, mosquitos, carrapatos, ácaros ou pio- lhos) de se aproximarem de ou permanecerem em um animal. Um re- pelente pode, por exemplo, diminuir o número de vetores de patógeno sobre ou na vizinhança de um animal, mas pode não necessariamente matar ou diminuir a aptidão do vetor de patógeno.
[0088] Como usado aqui, o termo "tratamento" se refere a adminis- trar uma composição farmacêutica a um animal para propósitos profilá- ticos e/ou terapêuticos. "Prevenir uma infeção" se refere ao tratamento profilático de um animal que ainda não está doente, mas que é suscetí- vel de, ou de outro modo em risco de, uma doença particular. "Tratar uma infeção" se refere a administrar tratamento a um animal já está so- frendo de uma doença para melhorar ou estabilizar a condição do ani- mal.
[0089] Como usado aqui, o termo "tratar uma infeção" se refere a administrar tratamento a um indivíduo já está sofrendo de uma doença para melhorar ou estabilizar a condição do indivíduo. Isto pode envolver reduzir a colonização de um patógeno em, sobre ou em torno de um animal por um ou mais patógenos (por exemplo em, cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100%) em relação a uma quantidade inicial e/ou permitir benefício para o indivíduo (por exemplo, reduzir a colonização em uma quantidade suficiente para resolver os sintomas). Em tais casos, uma infeção tratada pode se ma- nifestar como uma diminuição nos sintomas (por exemplo, em cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100%). Em alguns casos, uma infeção tratada é eficaz para aumentar a probabilidade de sobrevivência de um indivíduo (por exemplo, um au- mento na probabilidade de sobrevivência em cerca de 1%, 2%, 5%,
10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100%) ou au- mentar a sobrevivência global de uma população (por exemplo, um au- mento na probabilidade de sobrevivência em cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100%). Por exemplo, as composições e métodos podem ser eficazes para "eliminar substancialmente" uma infeção, que se refere a uma diminuição na in- feção em uma quantidade suficiente para resolver sustentavelmente os sintomas (por exemplo, durante pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 meses) no animal.
[0090] Como usado aqui, o termo "prevenir uma infeção" se refere a prevenir um aumento na colonização em, sobre ou em torno de um animal por um ou mais patógenos (por exemplo, em 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% em relação a um animal não tratado) em uma quantidade sutfici- ente para manter uma população de patógenos inicial (por exemplo, aproximadamente a quantidade encontrada em um indivíduo saudável), prevenir o início de uma infeção e/ou prevenir sintomas ou condições associadas à infeção. Por exemplo, os indivíduos podem receber trata- mento profilático para prevenir uma infeção fúngica enquanto estão sendo preparados para um procedimento médico invasivo (por exemplo, preparação para cirurgia, tal como receber um transplante, terapia com células-tronco, um enxerto, uma prótese, receber um tratamento de longo prazo ou cateterismo intravenoso frequente ou receber tratamento em uma unidade de cuidados intensivos), em indivíduos imunocompro- metidos (por exemplo, indivíduos com câncer, com HIV/AIDS ou to- mando agentes imunossupressores) ou em indivíduos submetidos a te- rapia com antibióticos a longo prazo.
[0091] Como usado aqui, o termo "composição de PMP estável" (por exemplo, uma composição incluindo PMPs carregados ou não car-
regados) se refere a uma composição de PMP que ao longo de um pe- ríodo de tempo (por exemplo, pelo menos 24 horas, pelo menos 48 ho- ras, pelo menos 1 semana, pelo menos 2 semanas, pelo menos 3 se- manas, pelo menos 4 semanas, pelo menos 30 dias, pelo menos 60 dias ou pelo menos 90 dias) retém pelo menos 5% (por exemplo, pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100%) do número inicial de PMPs (por exemplo, PMPs por mL de solução) em relação ao número de PMP's na composição de PMP (por exemplo, aquando da produção ou formulação) opcionalmente a uma gama de temperaturas definida (por exemplo, uma temperatura de pelo menos 24 ºC (por exemplo, pelo me- nos 24 ºC, 25 ºC, 26 ºC, 27 ºC, 28 ºC, 29 ºC ou 30 ºC), pelo menos 20 ºC (por exemplo, pelo menos 20 ºC, 21 ºC, 22ºC ou 23 ºC), pelo menos 4 ºC (por exemplo, pelo menos 5 ºC, 10 ºC ou 15 ºC), pelo menos -20 ºC (por exemplo, pelo menos -20 ºC, -15 ºC, -10 ºC, -5ºC ou 0 ºC) ou - 80 ºC (por exemplo, pelo menos -80 ºC, -70 ºC, -60 ºC, -50 ºC, -40 “C ou -30 ºC)); ou retém pelo menos 5% (por exemplo, pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100%) de sua atividade (por exem- plo, atividade de controle de patógenos ou repelente) em relação à ati- vidade inicial do PMP (por exemplo, aquando da produção ou formula- ção) opcionalmente a uma gama de temperaturas definida (por exem- plo, uma temperatura de pelo menos 24 “C (por exemplo, pelo menos 24 ºC, 25 ºC, 26 ºC, 27 ºC, 28 ºC, 29 “ºC ou 30 ºC), pelo menos 20 ºC (por exemplo, pelo menos 20 ºC, 21 ºC, 22 ºC ou 23 ºC), pelo menos 4 ºC (por exemplo, pelo menos 5 ºC, 10 ºC ou 15 ºC), pelo menos -20 “C (por exemplo, pelo menos -20 ºC, -15 ºC, -10 ºC, -5 ºC ou 0 ºC) ou -80 ºC (por exemplo, pelo menos -80 ºC, -70 ºC, -60 ºC, -50 ºC, -40 ºC ou - 30ºC)).
[0092] Como usado aqui, o termo "não tratado" se refere a um ani- mal ou vetor de patógeno que não foi contatada com ou à qual não foi entregue uma composição de controle de patógeno, incluindo um ani- mal separado ao qual não foi entregue a composição de controle de patógenos, o mesmo animal sofrendo tratamento avaliado em um ponto temporal antes da entrega das composições de controle de patógenos ou o mesmo animal submetido a tratamento avaliado em uma parte não tratada do animal.
[0093] Como usado aqui, o termo "vetor" se refere a um inseto que pode transportar ou transmitir um patógeno de animais de um reserva- tório para um animal. Vetores exemplificativos incluem insetos, como aqueles com partes bucais perfuradoras-sugadoras, como as presentes em Hemiptera e alguns Hymenoptera e Diptera como mosquitos, abe- Ilhas, vespas, cecidomídeos, piolhos, mosca tsé-tsé, pulgas e formigas, bem como membros de Arachnidae como carrapatos e ácaros.
[0094] Como usado aqui, o termo "saco de suco" ou "vesícula de suco" se refere a um componente ligado à membrana contendo suco do endocarpo (carpelo) de um hesperídio, por exemplo, uma fruta cítrica. Em alguns aspectos, os sacos de suco são separados de outras por- ções da fruta, por exemplo, a casca (exocarpo ou flavedo), a casca in- terna (mesocarpo, albedo ou medula), a coluna central (placenta), as paredes do segmento ou as sementes. Em alguns aspectos, os sacos de suco são sacos de suco de uma toranja, um limão, uma lima ou uma laranja.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0095] A Fig. 1A é um diagrama esquemático mostrando um proto- colo para a produção de PMP de toranja usando um passo destrutivo de suco envolvendo o uso de um liquidificador, seguido por ultracentri- fugação e purificação com gradiente de sacarose. Estão incluídas ima- gens do suco de toranja após centrifugação a 1000x g durante 10 min e o padrão de banda do gradiente de sacarose após ultracentrifugação a
150.000 x g durante 2 horas.
[0096] A Fig. 1B é uma representação gráfica da distribuição de partículas de PMP medida pelo Spectradyne NCS1.
[0097] A Fig. 2 é um diagrama esquemático mostrando um proto- colo para a produção de PMP de toranja usando um passo ligeiro de suco envolvendo uso de um filtro de malha, seguido por ultracentrifuga- ção e purificação com gradiente de sacarose. Estão incluídas imagens do suco de toranja após centrifugação a 1000x g durante 10 min e o padrão de banda do gradiente de sacarose após ultracentrifugação a
150.000 x g durante 2 horas.
[0098] A Fig. 3A é um diagrama esquemático mostrando um proto- colo para a produção de PMP de toranja usando ultracentrifugação, se- guida por cromatografia por exclusão de tamanhos (SEC) para se isola- rem as frações contendo PMP. As frações de SEC eluídas são analisa- das quanto à concentração de partícula (NanoFCM), tamanho mediano das partículas (NanoFCM) e concentração de proteína (BCA).
[0099] A Fig. 3B é um gráfico mostrando a concentração de partí- culas por mL em frações eluídas de cromatografia por exclusão de ta- manhos (SEC) (NanoFCM). As frações contendo a maioria dos PMPs ("fração de PMP") são indicadas com uma seta. Os PMPs são eluídos nas frações 2-4.
[00100] AFig.3C é um conjunto de gráficos e uma tabela mostrando o tamanho das partículas em nm para frações de SEC selecionadas, como medido usando NanoFCM. Os gráficos mostram a distribuição de tamanhos de PMP nas frações 1,3,5e8.
[00101] AFig.3D é um gráfico mostrando a concentração de prote- ína em ug/mL em frações de SEC, como medido usando um ensaio BCA. A fração contendo a maioria dos PMPs ("fração de PMP") é mar- cada, e uma seta indica uma fração contendo contaminantes.
[00102] AFig.4Aé um diagrama esquemático mostrando um proto- colo para a produção de PMP em escala a partir de 1 litro de suco de toranja (-7 toranjas) usando uma prensa de suco, seguida por centrifu- gação diferencial para se removerem grandes detritos, concentração 100x do suco usando TFF e cromatografia por exclusão de tamanhos (SEC) para se isolarem as frações contendo PMP. As frações de eluição de SEC são analisadas quanto à concentração de partícula (NanoFCM), tamanho mediano das partículas (NanoFCM) e concentração de prote- ína (BCA).
[00103] AFig.4Bé um par de gráficos mostrando a concentração de proteína (ensaio BCA, painel superior) e concentração das partículas (NanoFCM, painel inferior) do volume de eluato de SEC (mL) a partir de um material de partida escalonado de 1000 mL de suco de toranja, mos- trando uma elevada quantidade de contaminantes nos volumes de elui- ção de SEC tardios.
[00104] AFig.4C é um gráfico mostrando que a incubação da fração de PMP de toranja em bruto com uma concentração final de EDTA a 50 mM, pH 7,15 seguida por diálise durante a noite usando uma membrana de 300 kDa, removeu com sucesso contaminantes presentes nas fra- ções de eluição de SEC tardias, como mostrado pela absorvância a 280 nm. Não existiu diferença nos tampões de diálise usados (PBS sem cál- cio/magnésio pH 7,4, MES pH 6, Tris pH 8,6).
[00105] AFig.4Dé um gráfico mostrando que a incubação da fração de PMP de toranja em bruto com uma concentração final de EDTA a 50 mM, pH 7,15 seguida por diálise durante a noite usando uma membrana de 300 kDa, removeu com sucesso contaminantes presentes nas fra- ções de eluição tardias após SEC, como mostrado pela Análise de pro- teínas BCA, que, para além de detectar proteínas, é sensível à presença de açúcares e pectinas. Não existiu diferença nos tampões de diálise usados (PBS sem cálcio/magnésio pH 7,4, MES pH 6, Tris pH 8,6).
[00106] AFig.5Aé um diagrama esquemático mostrando um proto- colo para a produção de PMP a partir de suco de toranja usando uma prensa de suco, seguida por centrifugação diferencial para se remove- rem grandes detritos, incubação com EDTA para se reduzir a formação de macromoléculas de pectina, filtração sequencial para se removerem partículas grandes, concentração 5x/lavagem por TFF, diálise durante a noite para se removerem contaminantes, concentração adicional por TFF (20x final) e SEC para se isolarem as frações contendo PMP.
[00107] AFig.5Bé um gráfico mostrando a absorvância a 280 nm (A.U.) de frações de SEC de toranja eluídas usando múltiplas colunas de SEC. Os PMPs são eluídos nas frações iniciais 4-6, e os contami- nantes são eluídos nas frações tardias.
[00108] AFig.5C é um gráfico mostrando a concentração de prote- ína (ug/mL) de frações de SEC de toranja eluídas usando múltiplas co- lunas de SEC. Os PMPs são eluídos nas frações iniciais 4-6, e os con- taminantes são eluídos nas frações tardias.
[00109] A Fig. 5D é um gráfico mostrando a absorvância a 280 nm (A.U.) de frações de SEC de limão eluídas usando múltiplas colunas de SEC. Os PMPs são eluídos nas frações iniciais 4-6, e os contaminantes são eluídos nas frações tardias.
[00110] A Fig.5Eé um gráfico mostrando a concentração de prote- ína (ug/mL) de frações de SEC de limão eluídas usando múltiplas colu- nas de SEC. Os PMPs foram eluídos nas frações iniciais 4-6, e os con- taminantes foram eluídos nas frações tardias.
[00111] A Fig. 5F é uma representação gráfica de dispersão e um gráfico mostrando o tamanho das partículas em frações de SEC con- tendo PMP de toranja após esterilização por filtro de 0,22 um. O painel superior é uma representação gráfica de dispersão de partículas nas frações de SEC combinadas, como medido por citometria de nano-fluxo (NanoFCM). O painel inferior é um gráfico de distribuição dos tamanhos
(nm) das partículas bloqueadas (fundo subtraído). A concentração de PMP (partículas/mL) e o tamanho médio (nm) foram determinados usando padrões de esférula de acordo com as instruções do NanoFCM.
[00112] A Fig. 5G é uma representação gráfica de dispersão e um gráfico mostrando o tamanho das partículas em frações de SEC con- tendo PMP de limão após esterilização por filtro de 0,22 um. O painel superior é uma representação gráfica de dispersão de partículas nas frações de SEC combinadas, como medido por citometria de nano-fluxo (NanoFCM). O painel inferior é um gráfico de distribuição dos tamanhos (nm) das partículas bloqueadas (fundo subtraído). A concentração de PMP (partículas/mL) e o tamanho médio (nm) foram determinados usando padrões de esférula de acordo com as instruções do NanoFCM.
[00113] AFig.5Hé um gráfico mostrando a estabilidade de PMP de toranja e limão a 4º Celsius, determinada pela concentração de PMP (partículas de PMP/mL) a diferentes pontos temporal (dias após produ- ção), como medido por NanoFCM.
[00114] AFig.5lé um gráfico de barras mostrando a estabilidade de PMP's de limão (LM) após um ciclo de congelamento-descongelamento a -20º Celsius e -20º Celsius em comparação com PMP's de limão ar- mazenados a 4º Celsius, como determinado pela concentração de PMP (partículas de PMP/mL) após uma semana de armazenamento às tem- peraturas indicadas, como medido por NanoFCM.
[00115] A Fig.6A é um gráfico mostrando a concentração de partí- culas (partículas/mL) em frações de SEC de cultura de células de planta BMS eluídas, como medido por citometria de nano-fluxo (NanoFCM). Os PMP's foram eluídos nas frações de SEC 4-6.
[00116] AFig.6Bé um gráfico mostrando a absorvância a 280 nm (A.U.) em frações de SEC de BMS eluídas, medida em um espectrofo- tômetro SpectraMaxº. Os PMPs foram eluídos nas frações 4-6; as fra- ções 9-13 continham contaminantes.
[00117] AFig.6C é um gráfico mostrando a concentração de prote- ína (ug/mL) em frações de SEC de BMS eluídas, como determinado por análise BCA. Os PMPs foram eluídos nas frações 4-6; as frações 9-13 continham contaminantes.
[00118] A Fig. 6D é uma representação gráfica de dispersão mos- trando partículas nas frações de SEC contendo PMP de BMS combina- das como medido por citometria de nano-fluxo (NanoFCM). A concen- tração de PMP (partículas/mL) foi determinada usando um padrão de esférulas de acordo com as instruções do NanoFCM.
[00119] A Fig.6E é um gráfico mostrando a distribuição dos tama- nhos de PMPs de BMS (nm) para as partículas bloqueadas (fundo sub- traído) da Fig. 6D. O tamanho mediano de PMP (nm) foi determinado usando padrões de esférulas Exo de acordo com as instruções do Na- noFCM.
[00120] A Fig.7A é uma representação gráfica de dispersão e um gráfico mostrando PMP's de toranja marcados com DyLight800nm como medido por citometria de Nano fluxo (NanoFCM). O painel superior é uma representação gráfica de dispersão de partículas nas frações de SEC combinadas. A concentração de PMP (4,44x10*? PMPs/mL) foi de- terminada usando um padrão de esférulas de acordo com as instruções do NanoFCM. O painel inferior é um gráfico da distribuição dos tama- nhos (nm) de DyLight800-PMPs de toranja. O tamanho mediano de PMP foi determinado usando padrões de esférulas Exo de acordo com as instruções do NanoFCM. O tamanho mediano de DyLight800-PMPs de toranja foi 72,6 nm +/- 14,6 nm (SD).
[00121] AFig.7Bé uma representação gráfica de dispersão e um gráfico mostrando PMPs de limão marcados com DyLight800nm como medido por citometria de Nano fluxo (NanoFCM). A concentração medi- ana de PMP (5,18Ex102? PMPs/mL) foi determinada usando um padrão de esférulas de acordo com as instruções do NanoFCM. O painel inferior é um gráfico da distribuição dos tamanhos (nm) de DyLight800-PMPs de toranja. O tamanho de PMP foi determinado usando padrões de es- férulas Exo de acordo com as instruções do NanoFCM. O tamanho me- diano de DyLight800-PMPs de limão foi 68,5 nm +/- 14 nm (SD).
[00122] AFig.7C é um gráfico de barras mostrando a captação de PMPs marcados com DyL800nm derivados de toranja e limão por bac- térias (E. coli e P. aeruginosa) e levedura (S. cerevisiae) 2 horas pós- tratamento. A captação é definida na intensidade de fluorescência rela- tiva (A.U.), normalizada para a intensidade de fluorescência relativa de controles de micróbios tratados somente com corante.
[00123] AFig.8Aé uma representação gráfica de dispersão e um gráfico mostrando PMPs de limão purificados (frações de SEC de PMP combinadas e peletizadas), como medido por citometria de nano fluxo (NanoFCM). O painel superior é uma representação gráfica de disper- são de partículas nas frações de SEC combinadas. A concentração final de PMP de limão (1,53x10*? PMPs/mL) foi determinada usando um pa- drão de esférulas de acordo com as instruções do NanoFCM. O painel inferior é um gráfico da distribuição dos tamanhos (nm) de PMPs de limão purificados. O painel inferior é um gráfico de distribuição dos ta- manhos (nm) das partículas bloqueadas. O tamanho mediano de PMP foi determinado usando padrões de esférulas Exo de acordo com as instruções do NanoFCM. O tamanho mediano de PMP de limão foi 72,4 nm +/- 19,8 nm (SD).
[00124] AFig.8Bé uma representação gráfica de dispersão e um gráfico mostrando PMPs de limão marcados com Alexa Fluor? 488- (AF488) como medido por citometria de nano fluxo (NanoFCM). O painel superior é uma representação gráfica de dispersão. As partículas foram bloqueadas no sinal de fluorescência de FITC, em relação às partículas não marcadas e sinal de fundo. A eficiência da marcação foi 99%, como determinado pelo número de partículas fluorescentes em relação ao nú- mero total de partículas detectadas. A concentração final de AF488- PMP (1,34x10*? PMPs/mL) foi determinada a partir do número de partí- culas fluorescentes e usando um padrão de esférulas com uma concen- tração conhecida de acordo com as instruções do NanoFCM. O painel inferior é um gráfico da distribuição dos tamanhos (nm) de PMPs de limão marcados com AF488. O tamanho mediano de PMP foi determi- nado usando padrões de esférulas Exo de acordo com as instruções do NanoFCM. O tamanho mediano de PMPs de limão foi 72,1 nm +/- 15,9 nm (SD).
[00125] AFig.9A é um gráfico mostrando a absorvância a 280 nm (A.U.) em frações de SEC de toranja eluídas produzidas a partir de di- ferentes colunas de SEC (Colunas A, B, C, D e E) medida em um es- pectrofotômetro SpectraMaxº. Os PMPs foram eluídos nas frações 4-6.
[00126] A Fig. 9B é uma representação gráfica de dispersão mos- trando PMPs de toranja purificados (frações de SEC de PMP combina- das e peletizadas), como medido por citometria de nano fluxo (Na- noFCM). A concentração final de PMP de toranja (6,34x10º? PMPs/mL) foi determinada usando um padrão de esférulas de acordo com as ins- truções do NanoFCM.
[00127] AFig.9C é um gráfico mostrando a distribuição dos tama- nhos (nm) de PMPs de toranja purificados. O tamanho mediano de PMP foi determinado usando padrões de esférulas Exo de acordo com as instruções do NanoFCM. O tamanho mediano de PMPs de toranja foi 63,7 nm +/- 11,5 nm (SD).
[00128] AFig.9Dé um gráfico mostrando a absorvância a 280 nm (A.U.) em frações de SEC de limão eluídas de diferentes colunas de SEC usadas, medida em um espectrofotômetro SpectraMaxº. Os PMPs foram eluídos nas frações 4-6.
[00129] A Fig. 9E é uma representação gráfica de dispersão mos- trando PMPs de limão purificados (frações de SEC de PMP combinadas e peletizadas), como medido por citometria de nano fluxo (NanoFCM). A concentração final de PMP de limão (7,42x10*? PMPs/mL) foi deter- minada usando um padrão de esférulas de acordo com as instruções do NanoFCM.
[00130] A Fig.9F é um gráfico mostrando a distribuição dos tama- nhos (nm) de PMPs de limão purificados. O tamanho mediano de PMP foi determinado usando padrões de esférulas Exo de acordo com as instruções do NanoFCM. O tamanho mediano de PMPs de limão foi 68 nm +/- 17,5 nm (SD).
[00131] A Fig. 9G é um gráfico de barras mostrando a capacidade de carga de DOX (pg de DOX por 1000 de PMPs) de PMPs de limão (LM) e toranja (GF) que foram ativamente (sonicação/extrusão) ou pas- sivamente (incubação) carregados com doxorrubicina. A capacidade de carga foi calculada por divisão da concentração total de DOX (pg/mL) na amostra de PMP-DOX (avaliada por medição de intensidade de flu- orescência (EX/Em = 485/550 nm) usando um espectrofotômetro Spec- traMaxº) pela concentração total de PMP (PMPs/mL) na amostra.
[00132] A Fig. 9H é um gráfico mostrando a estabilidade de PMP carregados com DOX de toranja e limão a 4º Celsius, como determinado pela concentração de PMP (partículas de PMP/mL) a diferentes pontos temporal (dias após carga), como medido por NanoFCM.
[00133] A Fig.10Aé um diagrama esquemático mostrando um pro- tocolo de produção de PMPs a partir de 4 litros de suco de toranja tra- tado com pectinase e EDTA, concentrado 5x usando um TFF de 300 kDa, lavado por 6 trocas de volume de PBS e concentrado até uma con- centração final de 20x. A cromatografia por exclusão de tamanhos foi usada para eluir as frações contendo PMP.
[00134] AFig.10B é um gráfico mostrando a absorvância a 280 nm
(A.U.) de frações de SEC eluídas ao longo de 9 colunas de SEC dife- rentes usadas (colunas de SEC A-J). Os PMPs são eluídos nas frações de SEC 3-7.
[00135] A Fig.10C é um gráfico mostrando a concentração de pro- teína (ug/mL) de frações de SEC eluídas ao longo de 9 colunas de SEC diferentes usadas (colunas de SEC A-J). Os PMPs são eluídos nas fra- ções de SEC 3-7. Uma seta indica uma fração contendo contaminantes.
[00136] AFig.10D é uma representação gráfica de dispersão mos- trando PMPs de toranja purificados (frações de SEC de PMP combina- das e peletizadas), como medido por citometria de nano fluxo (Na- noFCM). A concentração final de PMP de toranja (7,56x10? PMPs/mL) foi determinada usando um padrão de esférulas de acordo com as ins- truções do NanoFCM.
[00137] AFig.10E é um gráfico mostrando a distribuição dos tama- nhos (nm) de PMPs de toranja purificados. O tamanho mediano de PMP foi determinado usando padrões de esférulas Exo de acordo com as instruções do NanoFCM. O tamanho mediano de PMPs de toranja foi 70,3 nm +/- 12,4 nm (SD).
[00138] AFig.10F é um gráfico mostrando o efeito citotóxico do tra- tamento com PMP de toranja carregados com doxorrubicina (DOX) de P. aeruginosa. As bactérias foram tratadas em duplicado com PMP- DOX até uma concentração eficaz de DOX de 0 (controle negativo), 5 UM, 10 UM, 25 uM, 50 uM e 100 uM. Uma medição de Absorvância ci- nética a 600 nm foi realizada (espectrofotômetro SpectraMaxº) para se monitorizar a DO das culturas nos pontos temporais indicados. Todos os valores de DO por dose de tratamento foram em primeiro lugar nor- malizados para a DO do primeiro ponto temporal a essa dose, para nor- malizar quanto ao sangramento da fluorescência de DOX a 600 nm a elevada concentração. Para se determinar o efeito citotóxico de PMP- DOX em bactérias, a OD relativa foi determinada dentro de cada grupo de tratamento em comparação com o controle não tratado (definido para 100%).
[00139] AFig.10G é um gráfico mostrando o efeito citotóxico do tra- tamento com PMP de toranja carregados com doxorrubicina (DOX) de E. coli. As bactérias foram tratadas em duplicado com PMP-DOX até uma concentração eficaz de DOX de O (controle negativo), 5 uM, 10 UM, UM, 50 UM e 100 UM. Uma medição de Absorvância cinética a 600 nm foi realizada (espectrofotômetro SpectraMaxº) para se monitorizar a DO das culturas nos pontos temporais indicados. Todos os valores de DO por dose de tratamento foram em primeiro lugar normalizados para a DO do primeiro ponto temporal a essa dose, para normalizar quanto ao sangramento da fluorescência de DOX a 600 nm a elevada concen- tração. Para se determinar o efeito citotóxico de PMP-DOX em bacté- rias, a OD relativa foi determinada dentro de cada grupo de tratamento em comparação com o controle não tratado (definido para 100%).
[00140] AFig. 10H é um gráfico mostrando o efeito citotóxico do tra- tamento com PMP de toranja carregados com doxorrubicina (DOX) de S. cerevisiae. As células de levedura foram tratadas em duplicado com PMP-DOX até uma concentração eficaz de DOX de O (controle nega- tivo), 5 UM, 10 uM, 25 uM, 50 UM e 100 UM. Uma medição de Absor- vância cinética a 600 nm foi realizada (espectrofotômetro SpectraMaxº) para se monitorizar a DO das culturas nos pontos temporais indicados. Todos os valores de DO por dose de tratamento foram em primeiro lugar normalizados para a DO do primeiro ponto temporal a essa dose, para normalizar quanto ao sangramento da fluorescência de DOX a 600 nm a elevada concentração. Para se determinar o efeito citotóxico de PMP- DOX em leveduras, a OD relativa foi determinada dentro de cada grupo de tratamento em comparação com o controle não tratado (definido para 100%).
[00141] AFig.11é um gráfico mostrando a luminescência (R.L.U.,
unidade de luminescência relativa) de bactérias Pseudomonas aerugi- nosa que foram tratadas com água Ultrapura (controle negativo), 3 ng de proteína luciferase livre (controle somente de proteína) ou com uma dose eficaz de proteína luciferase de 3 ng por PMPs carregados com proteína luciferase (PMP-Luc) em amostras em duplicado durante 2 hrs à TA. A proteína luciferase no sobrenadante e bactérias peletizadas foi medida por luminescência usando o kit de ensaio de luciferase ONE- Glo'"Y (Promega) e medida em um espectrofotômetro SpectraMaxº.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00142] São apresentadas aqui composições e métodos relaciona- dos para controlar patógenos com base em composições de controle de patógenos que incluem pacotes de mensageiros de plantas (PMPs), montagens de lipídeos produzidas inteiramente ou em parte a partir de vesículas extracelulares (EVs) de plantas ou seus segmentos, porções ou extratos. Os PMPs podem ter atividade antipatogênica (por exemplo, um agente adequado para administração a animais para tratar infeção, por exemplo, um agente antibacteriano, agente virucida, agente antivi- ral, agente antiparasitário ou um agente nematicida), pesticida ou repe- lente de insetos sem a inclusão de agentes adicionais, mas podem ser opcionalmente modificados para incluir agentes antipatogênicos, pesti- cidas ou repelentes de pragas adicionais. São também incluídas formu- lações nas quais os PMPs são proporcionados em forma substancial- mente pura ou formas concentradas. As composições e formulações de controle de patógenos descritas aqui podem ser entregues diretamente a um animal para tratar ou prevenir infeções por patógenos. Adicional- mente, ou alternativamente, as composições de controle de patógenos podem ser entregues a uma variedade de patógenos de animais ou ve- tores de patógenos de animais para diminuir a aptidão do patógeno, ou seu vetor, e deste modo controlar a propagação de patógenos prejudi- ciais.
|. Composições de Controle de Patógenos
[00143] As composições de controle de patógenos descritas aqui in- cluem uma pluralidade de pacotes de mensageiros de plantas (PMPs). Um PMP é uma estrutura de lipídeos (por exemplo, estrutura em bica- mada de lipídeos, unilamelar ou multilamelar) que inclui uma EV de planta ou seu segmento, porção ou extrato (por exemplo, extrato de li- pídeos). As EVs de planta se referem a uma estrutura em bicamada de lipídeos encerrada que ocorre naturalmente em uma planta. Os PMPs podem ter cerca de 5-2000 nm em diâmetro. As EVs de planta podem ter origem em uma variedade de vias de biogênese de plantas. Na na- tureza, as EVs de planta podem ser encontradas nos compartimentos intracelulares e extracelulares das plantas, tais como o apoplasto da planta, o compartimento localizado fora da membrana plasmática e for- mado por um contínuo de paredes celulares e o espaço extracelular. Alternativamente, os PMPs podem ser EVs de planta enriquecidos en- contrados em meios de cultura de células após secreção a partir de cé- lulas de plantas. As EVs de planta podem ser separadas das plantas (por exemplo, do fluido apoplástico), proporcionando deste modo PMPs, por uma variedade de métodos ainda descritos aqui.
[00144] As composições de controle de patógenos podem incluir PMP's que têm atividade antipatogênica (por exemplo, atividade antibac- teriana, antifúngica, antinematicida, antiparasitária ou antiviral), ativi- dade pesticida ou atividade repelente contra patógenos, sem a inclusão adicional de agentes antipatogênicos, pesticidas ou repelentes adicio- nais. No entanto, os PMPs podem incluir adicionalmente um agente de controle de patógenos heterólogo, por exemplo, agente antipatogênico (por exemplo, antibacteriano, antifúngico, antinematicida, antiparasitário ou antiviral), um agente pesticida ou agente repelente, que pode ser in- troduzido in vivo ou in vitro. Como tal, os PMPs podem incluir uma subs- tância com atividade antipatogênica, pesticida que é carregada no ou sobre o PMP pela planta a partir da qual o PMP é produzido. Por exem- plo, um agente funcional heterólogo carregado no PMP in vivo pode ser um fator endógeno a um planta ou um fator exógeno a uma planta (por exemplo, como expresso por um construto genético heterólogo em uma planta geneticamente manipulada). Alternativamente, os PMPs podem ser carregados com um agente funcional heterólogo in vitro (por exem- plo, após produção por uma variedade de métodos ainda descritos aqui).
[00145] — PMPs podem incluir EVs de planta, ou seus segmentos, por- ções ou extratos, nas quais as EVs de planta têm cerca de 5-2000 nm em diâmetro. Por exemplo, o PMP pode incluir uma EV de planta, ou seu segmento, porção ou extrato, que tem um diâmetro médio de cerca de 5-50 nm, cerca de 50-100 nm, cerca de 100-150 nm, cerca de 150- 200 nm, cerca de 200-250 nm, cerca de 250-300 nm, cerca de 300-350 nm, cerca de 350-400 nm, cerca de 400-450 nm, cerca de 450-500 nm, cerca de 500-550 nm, cerca de 550-600 nm, cerca de 600-650 nm, cerca de 650-700 nm, cerca de 700-750 nm, cerca de 750-800 nm, cerca de 800-850 nm, cerca de 850-900 nm, cerca de 900-950 nm, cerca de 950-1000 nm, cerca de 1000-1250 nm, cerca de 1250-1500 nm, cerca de 1500-1750 nm ou cerca de 1750-2000 nm. Em alguns ca- sos, o PMP inclui uma EV de planta, ou seu segmento, porção ou ex- trato, que tem um diâmetro médio de cerca de 5-950 nm, cerca de 5- 900 nm, cerca de 5-850 nm, cerca de 5-800 nm, cerca de 5-750 nm, cerca de 5-700 nm, cerca de 5-650 nm, cerca de 5-600 nm, cerca de 5- 550 nm, cerca de 5-500 nm, cerca de 5-450 nm, cerca de 5-400 nm, cerca de 5-350 nm, cerca de 5-300 nm, cerca de 5-250 nm, cerca de 5- 200 nm, cerca de 5-150 nm, cerca de 5-100 nm, cerca de 5-50 nm ou cerca de 5-25 nm. Em certos casos, a EV de planta, ou seu segmento, porção ou extrato, tem um diâmetro médio de cerca de 50-200 nm. Em certos casos, a EV de planta, ou seu segmento, porção ou extrato, tem um diâmetro médio de cerca de 50-300 nm. Em certos casos, a EV de planta, ou seu segmento, porção ou extrato, tem um diâmetro médio de cerca de 200-500 nm. Em certos casos, a EV de planta, ou seu seg- mento, porção ou extrato, tem um diâmetro médio de cerca de 30-150 nm.
[00146] Em alguns casos, o PMP pode incluir uma EV de planta, ou seu segmento, porção ou extrato, que tem um diâmetro médio de pelo menos 5 nm, pelo menos 50 nm, pelo menos 100 nm, pelo menos 150 nm, pelo menos 200 nm, pelo menos 250 nm, pelo menos 300 nm, pelo menos 350 nm, pelo menos 400 nm, pelo menos 450 nm, pelo menos 500 nm, pelo menos 550 nm, pelo menos 600 nm, pelo menos 650 nm, pelo menos 700 nm, pelo menos 750 nm, pelo menos 800 nm, pelo me- nos 850 nm, pelo menos 900 nm, pelo menos 950 nm ou pelo menos 1000 nm. Em alguns casos, o PMP inclui uma EV de planta, ou seu segmento, porção ou extrato, que tem um diâmetro médio menor do que 1000 nm, menor do que 950 nm, menor do que 900 nm, menor do que 850 nm, menor do que 800 nm, menor do que 750 nm, menor do que 700 nm, menor do que 650 nm, menor do que 600 nm, menor do que 550 nm, menor do que 500 nm, menor do que 450 nm, menor do que 400 nm, menor do que 350 nm, menor do que 300 nm, menor do que 250 nm, menor do que 200 nm, menor do que 150 nm, menor do que 100 nm ou menor do que 50 nm. Uma variedade de métodos (por exem- plo, um método de dispersão de luz dinâmica) padrão na técnica pode ser usada para medir o diâmetro das partículas da EV de planta ou seu segmento, porção ou extrato.
[00147] Em alguns casos, o PMP pode incluir uma EV de planta, ou seu segmento, porção ou extrato, que tem uma área superficial média de 77 nm? a 3,2x10º nm? (por exemplo, 77-100 nm?, 100-1000 nm?, 1000-1x10º nm?, 1xX10º-1x10º nm2, 1x105-1x106 nm? ou 1x106º-3,2x106 nm?). Em alguns casos, o PMP pode incluir uma EV de planta, ou seu segmento, porção ou extrato, que tem um volume médio de 65 nm? a 5,3x10º nm? (por exemplo, 65-100 nm?3, 100-1000 nm3, 1000-1x10º nm?, 1xX10%-1x105 nm?, 1x105-1x1086 nm3, 1x106-1x107 nm3, 1x107-1x108 nm?3, 1x108-5,3x108 nmº). Em alguns casos, o PMP pode incluir uma EV de planta, ou seu segmento, porção ou extrato, que tem uma área superfi- cial média de pelo menos 77 nm? (por exemplo, pelo menos 77 nm?, pelo menos 100 nm?, pelo menos 1000 nm?, pelo menos 1x10º nm?, pelo menos 1x10º nm?, pelo menos 1x10º nm? ou pelo menos 2x10º nm?). Em alguns casos, o PMP pode incluir uma EV de planta, ou seu segmento, porção ou extrato, que tem um volume médio de pelo menos 65 nm? (por exemplo, pelo menos 65 nm?, pelo menos 100 nm?, pelo menos 1000 nm?, pelo menos 1x10º nmº?, pelo menos 1x10º nmº?, pelo menos 1x10º nm?, pelo menos 1x107 nm?, pelo menos 1x10º nm?, pelo menos 2x108 nm3, pelo menos 3x108 nm3, pelo menos 4x10º nm? ou pelo menos 5x10º nmº).
[00148] Em alguns casos, o PMP pode ter o mesmo tamanho que a EV de planta ou seu segmento, extrato ou porção. Alternativamente, o PMP pode ter um tamanho diferente da EV de planta inicial a partir da qual o PMP é produzido. Por exemplo, o PMP pode ter um diâmetro de cerca de 5-2000 nm em diâmetro. Por exemplo, o PMP pode ter um diâmetro médio de cerca de 5-50 nm, cerca de 50-100 nm, cerca de 100-150 nm, cerca de 150-200 nm, cerca de 200-250 nm, cerca de 250- 300 nm, cerca de 300-350 nm, cerca de 350-400 nm, cerca de 400-450 nm, cerca de 450-500 nm, cerca de 500-550 nm, cerca de 550-600 nm, cerca de 600-650 nm, cerca de 650-700 nm, cerca de 700-750 nm, cerca de 750-800 nm, cerca de 800-850 nm, cerca de 850-900 nm, cerca de 900-950 nm, cerca de 950-1000 nm, cerca de 1000-1200 nm, cerca de 1200-1400 nm, cerca de 1400-1600 nm, cerca de 1600-1800 nm ou cerca de 1800-2000 nm. Em alguns casos, o PMP pode ter um diâmetro médio de pelo menos 5 nm, pelo menos 50 nm, pelo menos
100 nm, pelo menos 150 nm, pelo menos 200 nm, pelo menos 250 nm, pelo menos 300 nm, pelo menos 350 nm, pelo menos 400 nm, pelo me- nos 450 nm, pelo menos 500 nm, pelo menos 550 nm, pelo menos 600 nm, pelo menos 650 nm, pelo menos 700 nm, pelo menos 750 nm, pelo menos 800 nm, pelo menos 850 nm, pelo menos 900 nm, pelo menos 950 nm, pelo menos 1000 nm, pelo menos 1200 nm, pelo menos 1400 nm, pelo menos 1600 nm, pelo menos 1800 nm ou cerca de 2000 nm. Uma variedade de métodos (por exemplo, um método de dispersão de luz dinâmica) padrão na técnica pode ser usada para medir o diâmetro das partículas dos PMPs. Em alguns casos, o tamanho do PMP é de- terminado após carga de agentes funcionais heterólogos ou após outras modificações aos PMPs.
[00149] Em alguns casos, o PMP pode ter uma área superficial mé- dia de 77 nm? a 1,3x107 nm? (por exemplo, 77-100 nm?, 100-1000 nm?, 1000-1x10º nm?, 1xX10º-1x10º nm2, 1x105-1x106 nm? ou 1x106-1,3x107 nm?). Em alguns casos, o PMP pode ter um volume médio de 65 nm? a 4,2 x10º nm? (por exemplo, 65-100 nm?, 100-1000 nm?, 1000-1x10º nmº, 1xX10%-1x105 nm?, 1x105-1x1086 nm3, 1x106-1x107 nm3, 1x107-1x108 nm?3, 1X108-1x10º nm? ou 1x10º-4,2x10º nm?). Em alguns casos, o PMP tem uma área superficial média de pelo menos 77 nm? (por exemplo, pelo menos 77 nm?, pelo menos 100 nm?, pelo menos 1000 nm?, pelo menos 1x10º nm?, pelo menos 1x105 nm?, pelo menos 1x10º nm? ou pelo me- nos 1x107 nm?). Em alguns casos, o PMP tem um volume médio de pelo menos 65 nm? (por exemplo, pelo menos 65 nm?, pelo menos 100 nm?, pelo menos 1000 nm?3, pelo menos 1x10º nm3, pelo menos 1x10º nm?, pelo menos 1x10º nm3, pelo menos 1x107 nm3, pelo menos 1x10º nm?3, pelo menos 1x10º nm?, pelo menos 2x10º nm3, pelo menos 3x10º nm? ou pelo menos 4x10º nm?).
[00150] Em alguns casos, o PMP pode incluir uma EV de planta in- tacta. Alternativamente, o PMP pode incluir um segmento, porção ou extrato da área superficial total da vesícula (por exemplo, um segmento, porção ou extrato incluindo menos do que 100% (por exemplo, menos do que 90%, menos do que 80%, menos do que 70%, menos do que 60%, menos do que 50%, menos do que 40%, menos do que 30%, me- nos do que 20%, menos do que 10%, menos do que 10%, menos do que 5% ou menos do que 1%) da área superficial total da vesícula) de uma EV de planta. O segmento, porção ou extrato pode ter qualquer forma, tal como um segmento circunferencial, segmento esférico (por exemplo, hemisfério), segmento curvilíneo, segmento linear ou seg- mento plano. Nos casos onde o segmento é um segmento esférico da vesícula, o segmento esférico pode representar um que surge da divisão de uma vesícula esférica ao longo de um par de linhas paralelas ou um que surge da divisão de uma vesícula esférica ao longo de um par de linhas não paralelas. Conformemente, a pluralidade de PMPs pode in- cluir uma pluralidade de EVs de planta intactas, uma pluralidade de seg- mentos, porções ou extratos de EV de planta ou uma mistura de seg- mentos de EVs de planta e EVs de planta intactas. Um perito na técnica apreciará que a razão entre EVs de planta intactos e segmentados de- penderá do método de isolamento particular usado. Por exemplo, triturar ou combinar uma planta, ou sua parte, pode produzir PMPs que contêm uma percentagem mais elevada de segmentos, porções ou extratos de EV de planta do que um método de extração não destrutivo, tal como infiltração a vácuo.
[00151] Nos casos onde o PMP inclui um segmento, porção ou ex- trato de uma EV de planta, o segmento, porção ou extrato de EV pode ter uma área superficial média menor do que aquela de uma vesícula intacta, por exemplo, uma área superficial média menor do que 77 nm?, 100 nm?, 1000 nm?, 1x10º nm?, 1x105º nm?, 1x106 nm? ou 3,2x106 nm?). Em alguns casos, o segmento, porção ou extrato de EV tem uma área superficial de menos do que 70 nm?, 60 nm?, 50 nm?, 40 nm?, 30 nm?,
nm? ou 10 nm?). Em alguns casos, o PMP pode incluir uma EV de planta, ou seu segmento, porção ou extrato, que tem um volume médio menor do que aquele de uma vesícula intacta, por exemplo, um volume médio de menos do que 65 nm3, 100 nm3, 1000 nm3?, 1x10º nm3, 1x105 nmº, 1x106 nm?, 1x107 nm?, 1x10º nmº ou 5,3x10º nm?).
[00152] Nos casos onde o PMP inclui um extrato de uma EV de planta, por exemplo, nos casos onde o PMP inclui lipídeos extraídos (por exemplo, com clorofórmio) de uma EV de planta, o PMP pode incluir pelo menos 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% ou mais de lipídeos extraídos (por exemplo, com clorofórmio) de uma EV de planta. Os PMP'ss na pluralidade podem incluir segmentos de EV de planta e/ou lipídeos extraídos de EV de planta ou uma sua mistura.
[00153] São delineados ainda aqui detalhes dizendo respeito a mé- todos de produção de PMPs, marcadores de EV de planta que podem ser associados a PMPs e formulações para composições incluindo PMPs. A. Métodos de Produção
[00154] Os PMPs podem ser produzidos a partir de EVs de planta, ou um seu segmento, porção ou extrato (por exemplo, extrato de lipí- deos), que ocorrem naturalmente nas plantas, ou suas partes, incluindo tecidos de plantas ou células de plantas. Um método exemplificativo para produzir PMPs inclui (a) proporcionar uma amostra inicial de uma planta, ou uma sua parte, em que a planta ou sua parte compreende EVs; e (b) isolar uma fração de PMP em bruto da amostra inicial, em que a fração de PMP em bruto tem um nível diminuído de pelo menos um contaminante ou componente indesejado da planta ou sua parte em relação ao nível na amostra inicial. O método pode incluir ainda um passo adicional (c) compreendendo purificar a fração de PMP em bruto, produzindo deste modo uma pluralidade de PMPs puros, em que a plu-
ralidade de PMPs puros tem um nível diminuído de pelo menos um con- taminante ou componente indesejado da planta ou sua parte em relação ao nível na fração de EV em bruto. . Cada passo de produção é discutido em detalhe adicional, em baixo. Métodos exemplificativos dizendo res- peito ao isolamento e purificação de PMPs são encontrados, por exem- plo, em Rutter e Innes, Plant Physiol. 173 (1): 728-741, 2017; Rutter et al., Bio. Protoc. 7 (17): e2533, 2017; Regente et al., J of Exp. Biol. 68 (20): 5485-5496, 2017; Mu et al., Mol. Nutr. Food Res., 58, 1561-1573, 2014 e Regente et al., FEBS Letters. 583: 3363-3366, 2009, cada um dos quais é aqui incorporado por referência.
[00155] Por exemplo, uma pluralidade de PMPs pode ser isolada de uma planta por um processo que inclui os passos de: (a) proporcionar uma amostra inicial de uma planta, ou uma sua parte, em que a planta ou sua parte compreende EVs; (b) isolar uma fração de PMP em bruto da amostra inicial, em que a fração de PMP em bruto tem um nível di- minuído de pelo menos um contaminante ou componente indesejado da planta ou sua parte em relação ao nível na amostra inicial (por exemplo, um nível que é diminuído em pelo menos 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99%, ou 100%); e (c) purificar a fração de PMP em bruto, produ- zindo deste modo uma pluralidade de PMPs puros, em que a pluralidade de PMP's puros tem um nível diminuído de pelo menos um contaminante ou componente indesejado da planta ou sua parte em relação ao nível na fração de EV em bruto (por exemplo, um nível que é diminuído em pelo menos 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99%, ou 100%).
[00156] Os PMPs proporcionados aqui podem incluir uma EV de planta, ou seu segmento, porção ou extrato, isolado de uma variedade de plantas. PMPs podem ser isolados de qualquer gênero de plantas
(vasculares ou não vasculares) incluindo, mas não se limitando a an- giospermas (plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas), gimnosper- mas, samambaias, selaginelas, cavalinhas, psilófitas, licófitas, algas (por exemplo, unicelulares ou multicelulares, por exemplo, archaeplas- tida) ou briófitas. Em certos casos, os PMPs podem ser produzidos a partir de uma planta vascular, por exemplo, monocotiledôneas ou dico- tiledôneas ou gimnospermas. Por exemplo, os PMPs podem ser produ- zidos a partir de alfafa, maçã, Arabidopsis, banana, cevada, canola, ma- mona, chicória, crisântemo, trevo, cacau, café, algodão, semente de al- godão, milho, crambe, oxicoco, pepino, dendróbio, dióscoreia, eucalipto, festuca, linho, gladíolo, liliácea, linhaça, painço, meloa, mostarda, aveia, dendê, colza, mamão, amendoim, abacaxi, plantas ornamentais, Phase- olus, batata, colza, arroz, centeio, azevém, cártamo, gergelim, sorgo, soja, beterraba-sacarina, cana-de-açúcar, girassol, morango, tabaco, tomate, grama, trigo ou culturas vegetais tais como alface, aipo, bróco- lis, couve-flor, cucurbitáceas; árvores de fruta e nozes, tais como maçã, pera, pêssego, laranja, toranja, limão, lima, amêndoa, noz-pecã, nozes, avelã; videiras, tais como uvas, quiuí, lúpulo; arbustos de frutas e silvas, tais como framboesa, amora-preta, groselha; árvores florestais, tais como freixo, pinheiro, abeto, bordo, carvalho, castanheiro, álamo; com alfafa, canola, mamona, milho, algodão, crambe, linho, linhaça, mos- tarda, dendê, colza, amendoim, batata, arroz, cártamo, gergelim, soja, beterraba, girassol, tabaco, tomate ou trigo.
[00157] OsPMPs podem ser produzidos a partir de uma planta inteira (por exemplo, uma roseta inteira ou plântulas) ou alternativamente a partir de uma ou mais partes da planta (por exemplo, folha, semente, raiz, fruta, vegetal, pólen, seiva do floema ou seiva do xilema). Por exemplo, os PMPs podem ser produzidos a partir de órgãos/estruturas vegetativas de rebentos (por exemplo, folhas, caules ou tubérculos), ra-
ízes, flores e órgãos/estruturas florais (por exemplo, pólen, brácteas, sé- palas, pétalas, estames, carpelos, anteras ou óvulos), semente (inclu- indo embrião, endosperma ou tegumento), fruta (o ovário maduro), seiva (por exemplo, seiva do floema ou xilema), tecido de planta (por exemplo, tecido vascular, tecido do solo, tecido tumoral ou similares) e células (por exemplo, células individuais, protoplastos, embriões, tecido caloso, células guarda, óvulos ou similares) ou descendência dos mesmos. Por exemplo, o passo de isolamento pode envolver (a) proporcionar uma planta ou uma sua parte. Em alguns exemplos, a parte de planta é uma folha de Arabidopsis. A planta pode estar em qualquer etapa de desen- volvimento. Por exemplo, o PMP pode ser produzido a partir de plântu- las, por exemplo, plântulas de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 se- manas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas ou 8 semanas de idade (por exemplo, plântulas de Arabidopsis). Outros PMPs exemplificativos po- dem incluir PMPs produzidos a partir de raízes (por exemplo, raízes de gengibre), suco de fruta (por exemplo, suco de toranja), legumes e hor- taliças (por exemplo, brócolis), pólen (por exemplo, pólen de oliveira), seiva do floema (por exemplo, seiva do floema de Arabidopsis) ou seiva do xilema (por exemplo, seiva do xilema de tomate).
[00158] Os PMPs podem ser produzidos a partir de uma planta, ou sua parte, por uma variedade de métodos. Qualquer método que per- mita a liberação da fração apoplástica contendo EV de uma planta, ou uma fração de outro modo extracelular que contenha PMPs compreen- dendo EVs secretadas (por exemplo, meio de cultura de células), é ade- quado nos presentes métodos. As EVs podem ser liberadas por méto- dos destrutivos (por exemplo, trituração ou combinação de uma planta ou qualquer parte da planta) ou não destrutivos (lavagem ou infiltração a vácuo de uma planta ou qualquer parte da planta). Por exemplo, a planta, ou sua parte, pode ser infiltrada a vácuo, triturada, combinada ou uma sua combinação para se isolarem EVs da planta ou parte da planta, produzindo deste modo PMPs. Por exemplo, o passo de isola- mento pode envolver (b) isolar uma fração de PMP em bruto da amostra inicial (por exemplo, uma planta, uma parte da planta ou uma amostra derivada de uma planta ou parte da planta), em que o passo de isola- mento envolve infiltrar a vácuo a planta (por exemplo, com um tampão de isolamento de vesícula) para liberar e se coletar a fração apoplástica. Alternativamente, o passo de isolamento pode envolver (b) proporcionar uma planta, ou uma sua parte, em que o passo de liberação envolve triturar ou combinar a planta para liberar as EVs, produzindo deste modo PMPs.
[00159] Após se isolarem as EVs da planta, produzindo deste modo PMP's, os PMPs podem ser separados ou coletados em uma fração de PMP em bruto (por exemplo, uma fração apoplástica). Por exemplo, o passo de separação pode envolver separar a pluralidade de PMPs em uma fração de PMP em bruto usando centrifugação (por exemplo, cen- trifugação diferencial ou ultracentrifugação) e/ou filtração para separar a fração contendo PMP de grandes contaminantes, incluindo restos de tecido de plantas, células de plantas ou organelas de células de plantas (por exemplo, núcleos ou cloroplastos). Como tal, a fração de EV de planta em bruto terá um número diminuído de grandes contaminantes, incluindo, por exemplo, detritos de tecido de plantas, células de plantas ou organelas de células de plantas (por exemplo, núcleos, mitocôndrias ou cloroplasto), em comparação com a amostra inicial da planta ou parte da planta de fonte.
[00160] A fraçãode PMP em bruto pode ser ainda purificada por mé- todos de purificação adicionais para produzir uma pluralidade de PMPs puros. Por exemplo, a fração de PMP em bruto pode ser separada de outros componentes da planta por ultracentrifugação, por exemplo, usando um gradiente de densidade (iodixanol ou sacarose), exclusão por tamanhos e/ou uso de outras abordagens para se removerem com- ponentes agregados (por exemplo, precipitação ou cromatografia por exclusão de tamanhos). Os PMPs puros resultantes podem ter um nível diminuído de contaminantes (por exemplo, um ou mais componentes diferentes de PMP, tais como agregados de proteína, agregados de ácido nucleico, agregados de proteína-ácido nucleico, lipoproteínas |i- vres, estruturas lipido-proteicas), núcleos, componentes da parede ce- lular, organelas de células ou uma sua combinação) em relação a uma ou mais frações geradas durante os passos de separação precoces ou em relação a um nível de limiar pré-estabelecido, por exemplo, uma es- pecificação de liberação comercial. Por exemplo, os PMPs puros podem ter um nível diminuído (por exemplo, em cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, ou mais do que 100%; ou em cerca de 2x vezes, 4x vezes, 5x vezes, 10x vezes, 20x vezes, 25x vezes, 50x vezes, 75x vezes, 100x vezes ou mais do que 100x ve- zes) de organelas de plantas ou componentes da parede celular em re- lação ao nível na amostra inicial. Em alguns casos, os PMPs puros são substancialmente isentos (por exemplo, têm níveis indetectáveis) de um ou mais componentes diferentes de PMP, tais como agregados de pro- teína, agregados de ácido nucleico, agregados de proteína-ácido nu- cleico, lipoproteínas livres, estruturas lipido-proteicas), núcleos, compo- nentes da parede celular, organelas de células ou uma sua combinação. Exemplos adicionais dos passos de liberação e separação podem ser encontrados no Exemplo 1. Os PMPs podem estar a uma concentração de, por exemplo, 1x10º%, 5x10º, 1x10%, 5x10%, 5x107º, 1x107!, 2x10!, 3x101!, 4x10, 5x10%, 6x107!, 7x10, 8x107, 9x107!, 1x1072, 2x10?, 3x10?, 4x102, 5x1072, 6x1072, 7x107?, 8x107?, 9x1072, 1x103 ou mais do que 1x10º? PMPs/mL.
[00161] Por exemplo, os agregados de proteína podem ser removi- dos de PMPs isolados. Por exemplo, a solução de PMP isolada pode ser levada através de uma gama de pHs (por exemplo, como medido usando uma sonda de pH) para separar por precipitação os agregados de proteína em solução. O pH pode ser ajustado até, por exemplo, pH 3, pH 5, pH 7, pH 9 ou pH 11 com a adição de, por exemplo, hidróxido de sódio ou ácido clorídrico. Logo que a solução esteja ao pH especifi- cado, ela pode ser filtrada para se removerem os particulados. Alterna- tivamente, a solução de PMP isolada pode ser floculada usando a adi- ção de polímeros carregados, tais como Polymin-P ou Praestol 2640. Brevemente, Polymin-P ou Praestol 2640 é adicionado à solução e mis- turado com um impulsor. A solução pode ser depois filtrada para se re- moverem os particulados. Alternativamente, os agregados podem ser solubilizados por aumento da concentração de sal. Por exemplo, NaCl pode ser adicionado à solução de PMP isolada até estar a, por exemplo, 1 mol/L. A solução pode ser depois filtrada para se isolarem os PMPs. Alternativamente, os agregados são solubilizados por aumento da tem- peratura. Por exemplo, os PMP's isolados podem ser aquecidos sob mis- tura até a solução ter alcançado uma temperatura uniforme de, por exemplo, 50 ºC durante 5 minutos. A mistura de PMP pode ser depois filtrada para se isolarem os PMPs. Alternativamente, os contaminantes solúveis de soluções de PMP podem ser separados por coluna de cro- matografia por exclusão de tamanhos de acordo com procedimentos padrão, onde os PMPs eluem nas primeiras frações, ao passo que as proteínas e as ribonucleoproteínas e algumas lipoproteínas são eluídas mais tarde. A eficiência da remoção de agregados de proteína pode ser determinada por medição e comparação da concentração de proteína antes da e após remoção de agregados de proteína através da quanti- ficação de proteínas BCA/Bradford.
[00162] Qualquer um dos métodos de produção descritos aqui pode ser suplementado com quaisquer métodos quantitativos ou qualitativos conhecidos na técnica para caracterizar ou identificar os PMPs em qual- quer passo do processo de produção. Os PMPs podem ser caracteriza- dos por uma variedade de métodos de análise para se estimar o rendi- mento de PMP, a concentração de PMP, a pureza de PMP, a composi- ção de PMP ou os tamanhos de PMP. Os PMPs podem ser avaliados por um número de métodos conhecidos na técnica que permitem a vi- sualização, quantificação ou caracterização qualitativa (por exemplo, identificação da composição) dos PMPs, tais como microscopia (por exemplo, microscopia eletrônica de transmissão), dispersão de luz di- nâmica, rastreamento de nanopartículas, espectroscopia (por exemplo, análise de infravermelhos com transformada de Fourier) ou espectro- metria de massa (análise de proteínas e lipídeos). Em certos casos po- dem ser usados métodos (por exemplo, espectroscopia de massa) para se identificarem marcadores de EV da planta presentes no PMP, tais como marcadores divulgados no Apêndice. Para auxiliar na análise e caracterização da fração de PMP, os PMPs podem ser ainda marcados ou corados. Por exemplo, os PMPs podem ser corados com iodeto de 3,3'-di-hexiloxacarbocianina (DIOCs), um corante lipofílico fluorescente, PKH67 (Sigma Aldrich); Alexa Fluorº 488 (Thermo Fisher Scientific) ou DyLight"Y 800 (Thermo Fisher). Na ausência de formas sofisticadas de rastreamento de nanopartículas, esta abordagem relativamente simples quantifica o conteúdo total da membrana e pode ser usada para medir indiretamente a concentração de PMPs (Rutter e Innes, Plant Physiol. 173 (1): 728-741, 2017; Rutter et al., Bio. Protoc. 7 (17): e2533, 2017). Para medições mais precisas, e para se avaliarem as distribuições dos tamanhos de PMPs, pode ser usado rastreamento de nanopartículas ou Sensor de Pulso Resistente Ajustável.
[00163] Durante o processo de produção, os PMPs podem ser opci- onalmente preparados tal que os PMPs estejam a uma concentração aumentada (por exemplo, em cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%,
50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, ou mais do que 100%; ou em cerca de 2x vezes, 4x vezes, 5x vezes, 10x vezes, 20x vezes, 25x vezes, 50x vezes, 75x vezes, 100x vezes ou mais do que 100x vezes) em relação ao nível de EV em uma amostra de controle ou inicial. Os PMPs isolados podem constituir cerca de 0,1% a cerca de 100% da composição de controle de patógenos, tal como qualquer um de cerca de 0,01% a cerca de 100%, cerca de 1% a cerca de 99,9%, cerca de 0,1% a cerca de 10%, cerca de 1% a cerca de 25%, cerca de 10% a cerca de 50%, cerca de 50% a cerca de 99% ou cerca de 75% a cerca de 100%. Em alguns casos, a composição inclui pelo menos qualquer 0,1%, 0,5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%,0u mais PMPs, por exemplo, como medido por peso/vol, percentagem da composição da proteína PMP e/ou percentagem da composição de lipídeos (por exemplo, por medição de lipídeos fluorescentemente marcados); Ver, por exemplo, Exemplo 3). Em alguns casos, os agentes concentrados são usados como produtos comerciais, por exemplo, o usuário final pode usar agentes diluídos, que têm uma concentração substancial- mente mais baixa de ingrediente ativo. Em algumas modalidades, a composição é formulada como uma formulação de concentrado de con- trole de patógenos, por exemplo, uma formulação de concentrado de volume ultrabaixo.
[00164] Conforme ilustrado pelo Exemplo 1, os PMPs podem ser pro- duzidos a partir de uma variedade de plantas, ou suas partes (por exem- plo, o apoplasto da folha, apoplasto da semente, raiz, fruta, vegetal, pó- len, seiva do floema ou xilema). Por exemplo, os PMPs podem ser iso- lados da fração apoplástica de uma planta, tal como o apoplasto de uma folha (por exemplo, folhas de apoplasto de Arabidopsis thaliana) ou o apoplasto de sementes (por exemplo, apoplasto de sementes de giras- sol). Outros PMPs exemplificativos são produzidos a partir de raízes (por exemplo, raízes de gengibre), suco de frutas (por exemplo, suco de toranja), legumes e hortaliças (por exemplo, brócolis), pólen (por exem- plo, pólen de oliveira), seiva do floema (por exemplo, seiva do floema de Arabidopsis), seiva do xilema (por exemplo, seiva do xilema de to- mate) ou sobrenadante de cultura de células (por exemplo, sobrena- dante de cultura de células de tabaco BY2). Este exemplo demonstra ainda a produção de PMP's a partir destas várias fontes de plantas.
[00165] Como ilustrado pelo Exemplo 2, os PMPs podem ser purifi- cados por uma variedade de métodos, por exemplo, por uso de um gra- diente de densidade (iodixanol ou sacarose) em conjunção com ultra- centrifugação e/ou métodos para se removerem contaminantes agrega- dos, por exemplo, precipitação ou cromatografia por exclusão de tama- nhos. Por exemplo, o Exemplo 2 ilustra a purificação de PMPs que fo- ram obtidos através dos passos de separação delineados no Exemplo
1. Ainda, os PMPs podem ser caracterizados de acordo com os métodos ilustrados no Exemplo 3.
[00166] Em alguns casos, os PMPs das presentes composições e métodos podem ser isolados de uma planta, ou sua parte, e usados sem modificação adicional ao PMP. Em outros casos, o PMP pode ser mo- dificado antes do uso, como delineado ainda aqui. B. Marcadores de EV de Plantas
[00167] Os PMPs das presentes composições e métodos podem ter uma gama de marcadores que identificam o PMP como sendo produ- zido a partir de uma EV de planta e/ou incluindo um seu segmento, por- ção ou extrato. Como usado aqui, o termo "marcador de EV de planta" se refere a um componente que está naturalmente associado a uma planta e incorporado na ou sobre a EV de planta in planta, tal como uma proteína de planta, um ácido nucleico de planta, uma molécula pequena de planta, um lipídeo de planta ou uma sua combinação. Exemplos de marcadores de EV de planta podem ser encontrados, por exemplo, em Rutter e Innes, Plant Physiol. 173 (1): 728-741, 2017; Raimondo et al.,
Oncotarget. 6 (23): 19514, 2015; Ju et al., Mol. Therapy. 21 (7): 1345- 1357, 2013; Wang et al., Molecular Therapy. 22 (3): 522-534, 2014; e Regente et al., J of Exp. Biol. 68 (20): 5485-5496, 2017; cada um dos quais é incorporado aqui por referência. Exemplos adicionais de marca- dores de EV de planta estão listados no Apêndice e são ainda delinea- dos aqui.
[00168] O marcador de EV de planta pode incluir um lipídeo de planta. Exemplos de marcadores de lipídeos de planta que podem ser encontrados no PMP incluem fitosterol, campesterol, B-sitosterol, estig- masterol, avenasterol, glicosil inositol fosforil ceramidas (GIPCs), glico- lipídeos (por exemplo, monogalactosildiacilglicerol (MGDG) ou digalac- tosildiacilglicero! (DGDG)) ou uma sua combinação. Por exemplo, o PMP pode incluir GIPCs, que representam a principal classe de esfin- golipídeos em plantas e são um dos lipídeos de membrana mais abun- dantes em plantas. Outros marcadores de EV de planta podem incluir lipídeos que se acumulam em plantas em resposta a estressores abió- ticos ou bióticos (por exemplo, infeção bacteriana ou fúngica), tais como ácido fosfatídico (PA) ou fosfatidilinositol-4-fosfato (PI4P).
[00169] —Alternativamente, o marcador de EV de planta pode incluir uma proteína de planta. Em alguns casos, o marcador de EV de planta de proteína pode ser uma proteína antimicrobiana naturalmente produ- zida pelas plantas, incluindo proteínas de defesa que as plantas secre- tam em resposta a estressores abióticos ou bióticos (por exemplo, infe- ção bacteriana ou fúngica). As proteínas de defesa de patógenos de plantas incluem proteínas receptoras de proteínas de associação a fa- tores sensíveis a N -etilmalemida (SNARE) (por exemplo, Sintaxina-121 (SYP121; No. de Acesso do GenBank: NP 187788.1 ou NP 974288.1), Penetração1 (PEN1; No. de Acesso do GenBank: NP 567462.1)) ou Penetração3 do transportador ABC (PEN3; No. de Acesso do GenBank:
NP 191283.2). Outros exemplos de marcadores de EV de planta in- cluem proteínas que facilitam o transporte de longa distância de RNA em plantas, incluindo proteínas do floema (por exemplo, Proteína do flo- ema 2-A1 (PP2-A1), No. de Acesso do GenBank: NP 193719.1), prote- ínas de ligação a lipídeos dependentes de cálcio ou lectinas (por exem- plo, lectinas relacionadas com Jacalina, por exemplo, jacalina de Heli- anthus annuus (Helja; GenBank: AHZ86978.1). Por exemplo, a proteína de ligação a RNA pode ser Proteína-7 de Ligação a RNA Rica em Gli- cina (GRP7; Número de Acesso do GenBank: NP. 179760.1). Adicional- mente, as proteínas que regulam a função dos plasmodesmos podem em alguns casos ser encontradas em EVs de planta, incluindo proteínas tais como Synap-Totgamina A A (No. de Acesso do GenBank: NP 565495.1). Em alguns casos, o marcador de EV de planta pode in- cluir uma proteína envolvida no metabolismo de lipídeos, tais como fos- folipase C ou fosfolipase D. Em alguns casos, o marcador de EV de proteína de planta é uma proteína de tráfego celular em plantas. Em certos casos onde o marcador de EV de planta é uma proteína, o mar- cador de proteína pode não ter um peptídeo sinal que está tipicamente associado a proteínas secretadas. As proteínas secretoras não conven- cionais parecem partilhar várias características comuns como (i) ausên- cia de uma sequência líder, (ii) ausência de PTMs específicos de ER ou aparelho de Golgi e/ou (iii) secreção não afetada pela brefeldina A que bloqueia a via de secreção clássica dependente de ER/Golgi. Um perito na técnica pode usar uma variedade de ferramentas livremente acessí- veis ao público (por exemplo, Base de Dados SecretomeP; SUBA3 (SUBcellular localization database for Arabidopsis proteins)) para se avaliar uma proteína quanto a uma sequência sinal ou sua ausência.
[00170] Nos casos onde o marcador de EV de planta é uma proteína, a proteína pode ter uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%,
95%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequências com um marca- dor de EV de planta, tal como qualquer um dos marcadores de EV de planta listados no Apêndice. Por exemplo, a proteína pode ter uma se- quência de aminoácidos tendo pelo menos 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequências com PEN1 de Arabidopsis thaliana (Número de Acesso do GenBank: NP 567462.1).
[00171] Em alguns casos, o marcador de EV de planta inclui um ácido nucleico codificado em plantas, por exemplo, um RNA de planta, um DNA de planta ou um PNA de planta. Por exemplo, o PMP pode incluir dsRNA, mRNA, um RNA viral, um microRNA (miRNA) ou um pe- queno RNA de interferência (siRNA) codificado por uma planta. Em al- guns casos, o ácido nucleico pode ser um que esteja associado a uma proteína que facilite o transporte de longa distância de RNA em plantas, como discutido aqui. Em alguns casos, o marcador de EV de planta de ácido nucleico pode ser um envolvido no silenciamento gênico induzido pelo hospedeiro (HIGS), que é o processo pelo qual as plantas silenciam os transcritos estranhos de pragas de plantas (por exemplo, patógenos tais como fungos). Por exemplo, o ácido nucleico pode ser um que si- lencie genes bacterianos ou fúngicos. Em alguns casos, o ácido nu- cleico pode ser um microRNA, tal como miR159 ou miR166, que visa genes em um patógeno fúngico (por exemplo, Verticillium dahliae). Em alguns casos, a proteína pode ser uma envolvida no transporte de com- postos de defesa de plantas, tais como proteínas envolvidas no trans- porte e metabolismo de glucosinolato (GSL), incluindo Transportador de Glucosinolato-1 -1 (GTR1; No. de Acesso do GenBank: NP 566896.2), Transportador de Glucosinolato-2 (GTR2; NP 201074.1) ou Modificador Epitioespecífico 1 (ESM1; NP 188037.1).
[00172] Nos casos onde o marcador de EV de planta é um ácido nu- cleico, o ácido nucleico pode ter uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequências com um marcador de EV de planta, por exemplo, tal como aqueles codifi- cando os marcadores de EV de planta listados no Apêndice. Por exem- plo, o ácido nucleico pode ter uma sequência de polinucleotídeos tendo pelo menos 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequências com MIR159 ou miR166.
[00173] Em alguns casos,o marcador de EV de planta inclui um com- posto produzido pelas plantas. Por exemplo, o composto pode ser um composto de defesa produzido em resposta a estressores abióticos ou bióticos, tais como metabolitos secundários. Um tal metabolito secun- dário que é encontrado em PMPs são os glucosinolatos (GSLs), que são metabolitos secundários contendo nitrogênio e enxofre encontrados maioritariamente em plantas Brassicaceae. Outros metabolitos secun- dários podem incluir aleloquímicos.
[00174] Emalgunscasos,oPMP pode ser também identificado como sendo produzido a partir de uma EV de planta com base na ausência de certos marcadores (por exemplo, lipídeos, polipeptídeos ou polinucleo- tídeos) que não são tipicamente produzidos por plantas, mas estão ge- ralmente associados a outros organismos (por exemplo, marcadores de EVs animais, EVs bacterianas ou EVs fúngicas). Por exemplo, em al- guns casos, o PMP não tem lipídeos tipicamente encontrados em EVs animais, EVs bacterianas ou EVs fúngicas. Em alguns casos, o PMP não tem lipídeos típicos de EVs animais (por exemplo, esfingomielina). Em alguns casos, o PMP não contém lipídeos típicos de EVs bacteria- nas ou membranas bacterianas (por exemplo, LPS). Em alguns casos, o PMP não tem lipídeos típicos de membranas fúngicas (por exemplo, ergosterol).
[00175] Os marcadores de EV de planta podem ser identificados usando quaisquer abordagens conhecidas na técnica que permitam a identificação de moléculas pequenas (por exemplo, espectroscopia de massa, espectrometria de massa), lipídeos (por exemplo, espectrosco- pia de massa, espectrometria de massa), proteínas (por exemplo, es- pectroscopia de massa, imunotransferência) ou ácidos nucleicos (por exemplo, análise de PCR). Em alguns casos, uma composição de PMP descrita aqui inclui uma quantidade detectável, por exemplo, uma quan- tidade limiar pré-determinada, de um marcador de EV de planta descrito aqui. C. Carga de Agentes
[00176] O PMP pode ser modificado para incluir um agente funcional heterólogo, por exemplo, um agente de controle de patógenos ou agente repelente, tais como aqueles descritos aqui. O PMP pode trans- portar ou se associar a tais agentes por uma variedade de meios para permitir a entrega do agente a uma planta ou praga de plantas alvo, por exemplo, por encapsulação do agente, incorporação do componente na estrutura em bicamada de lipídeos ou associação do componente (por exemplo, por conjugação) à superfície da estrutura em bicamada de |i- pídeos do PMP.
[00177] O agente funcional heterólogo pode ser incorporado ou car- regado no ou sobre o PMP por quaisquer métodos conhecidos na téc- nica que permitam a associação, diretamente ou indiretamente, entre o PMP e o agente. Os agentes funcionais heterólogos podem ser incor- porados no PMP por um método in vivo (por exemplo, in planta, por exemplo, através da produção de PMPs a partir de uma planta transgê- nica que compreende o agente heterólogo) ou in vitro (por exemplo, em cultura de tecidos ou em cultura de células) ou métodos tanto in vivo como in vitro.
[00178] Nos casos onde os PMPs são carregados com um agente funcional heterólogo (por exemplo, um agente de controle de patógenos ou repelente) in vivo, o PMP pode ser produzido a partir de uma EV, ou seu segmento, porção ou extrato, que foi carregado in planta, em cultura de tecidos ou em cultura de células. Os métodos in planta incluem ex- pressão do agente funcional heterólogo (por exemplo, agente de con- trole de patógenos ou agente repelente) em uma planta que foi geneti- camente modificada para expressar o agente funcional heterólogo. Em alguns casos, o agente funcional heterólogo é exógeno à planta. Alter- nativamente, o agente funcional heterólogo pode ser naturalmente en- contrado na planta, mas expresso a um nível elevado em relação ao nível daquele encontrado em uma planta não geneticamente modifi- cada.
[00179] Em alguns casos,oPMP pode ser carregado in vitro. A subs- tância pode ser carregada sobre os ou nos (por exemplo, pode ser en- capsulada pelos) PMPs usando, mas não se limitando a, métodos físi- cos, químicos e/ou biológicos. Por exemplo, o agente funcional heteró- logo pode ser introduzido em PMP por uma ou mais de eletroporação, sonicação, difusão passiva, agitação, extração de lipídeos ou extrusão. Os PMPs carregados podem ser avaliados para se confirmar a presença ou nível do agente carregado usando uma variedade de métodos, tais como HPLC (por exemplo, para se avaliarem moléculas pequenas); imunotransferência (por exemplo, para se avaliarem proteínas); e POR quantitativa (por exemplo, para se avaliarem nucleotídeos). No entanto deve ser apreciado pelos peritos na técnica que a carga de uma subs- tância de interesse em PMPs não está limitada aos métodos ilustrados acima.
[00180] Em alguns casos, o agente funcional heterólogo pode ser conjugado ao PMP, no qual o agente funcional heterólogo está conec- tado ou unido, indiretamente ou diretamente, ao PMP. Por exemplo, um ou mais agentes de controle de patógenos podem ser quimicamente ligados a um PMP, tal que o um ou mais agentes de controle de pató- genos sejam unidos (por exemplo, por ligações covalentes ou iônicas) diretamente à bicamada de lipídeos do PMP. Em alguns casos, a con- jugação de vários agentes de controle de patógenos aos PMPs pode ser alcança por mistura em primeiro lugar do um ou mais agentes funci- onais heterólogos com um agente de reticulação apropriado (por exem- plo, N-etilcarbo-di-imida ("EDC"), que é geralmente utilizado como um agente de ativação de carboxila para ligação de amida com aminas pri- márias e também reage com grupos fosfato) em um solvente adequado. Após um período de incubação suficiente para permitir que o agente funcional heterólogo se anexe ao agente de reticulação, a mistura de agente de reticulação/agente funcional heterólogo pode ser depois com- binada com os PMPs e, após outro período de incubação, sujeita a um gradiente de sacarose (por exemplo, gradiente de sacarose a 8, 30, 45 e 60%) para separar o agente funcional heterólogo livre e os PMP's livres dos agentes de controle de patógenos conjugados aos PMPs. Como parte da combinação da mistura com um gradiente de sacarose, e um passo de centrifugação acompanhante, os PMPs conjugados aos agen- tes de controle de patógenos são depois vistos como uma banda no gradiente de sacarose, tal que os PMPs conjugados possam ser depois coletados, lavados e dissolvidos em uma solução adequada para uso como descrito aqui.
[00181] Em alguns casos, o PMP está estavelmente associado ao agente funcional heterólogo antes da e após entrega do PMP, por exem- plo, a uma planta ou a uma praga. Em outros casos, o PMP está asso- ciado ao agente funcional heterólogo tal que o agente funcional heteró- logo se torne dissociado do PMP após entrega do PMP, por exemplo, a uma planta ou a uma praga.
[00182] O PMP pode ser ainda modificado com outros componentes (por exemplo, lipídeos, por exemplo, esteróis, por exemplo, colesterol;
ou moléculas pequenas) para alterar ainda as características funcionais e estruturais do PMP. Por exemplo, os PMPs podem ser ainda modifi- cados com moléculas de estabilização que aumentam a estabilidade do PMP (por exemplo, durante pelo menos um dia à temperatura ambiente e/ou estável durante pelo menos uma semana a 4 ºC).
[00183] Os PMPs podem ser carregados com várias concentrações do agente funcional heterólogo, dependendo do agente ou uso particu- lar. Por exemplo, em alguns casos, os PMPs são carregados tal que a composição de controle de patógenos descrita aqui inclua cerca de 0,001, 0,01, 0,1, 1,0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 95 (ou qualquer gama entre cerca de 0,001 e 95) ou mais % em peso de um agente controle de patógenos e/ou um agente repelente. Em alguns casos, os PMPs são carregados tal que a composição de controle de patógenos inclua cerca de 95, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10,9,8,7,6,5,4,3,2,1,0,0,1,0,01, 0,001 (ou qualquer gama entre cerca de 95 e 0,001) ou menos % em peso de um agente controle de patógenos e/ou um agente repelente. Por exemplo, a composição de controle de patógenos pode incluir cerca de 0,001 a cerca de 0,01% em peso, cerca de 0,01 a cerca de 0,1% em peso, cerca de 0,1 a cerca de 1% em peso, cerca de 1 a cerca de 5% em peso ou cerca de 5 a cerca de 10% em peso, cerca de 10 a cerca de 20% em peso do agente de controle de patógenos e/ou um agente repelente. Em alguns casos, o PMP pode ser carregado com cerca de 1, 5, 10, 50, 100, 200, ou 500, 1,000, 2,000 (ou qualquer gama entre cerca de 1 e 2.000) ou mais upg/mL de um agente de controle de patógenos e/ou um agente repe- lente. Um lipossomo da invenção pode ser carregado com cerca de 2,000, 1,000, 500, 200, 100, 50, 10, 5, 1 (ou qualquer gama entre cerca de 2.000 e 1) ou menos upg/mL de um agente de controle de patógenos e/ou um agente repelente.
[00184] Em alguns casos, osPMPs são carregados tal que a compo- sição de controle de patógenos descrita aqui inclui pelo menos 0,001% em peso, pelo menos 0,01% em peso, pelo menos 0,1% em peso, pelo menos 1,0% em peso, pelo menos 2% em peso, pelo menos 3% em peso, pelo menos 4% em peso, pelo menos 5% em peso, pelo menos 6% em peso, pelo menos 7% em peso, pelo menos 8% em peso, pelo menos 9% em peso, pelo menos 10% em peso, pelo menos 15% em peso, pelo menos 20% em peso, pelo menos 30% em peso, pelo menos 40% em peso, pelo menos 50% em peso, pelo menos 60% em peso, pelo menos 70% em peso, pelo menos 80% em peso, pelo menos 90% em peso ou pelo menos 95% em peso de um agente de controle de patógenos e/ou um agente repelente. Em alguns casos, o PMP pode ser carregado com pelo menos 1 ug/mL, pelo menos 5 ug/mL, pelo me- nos 10 ug/mL, pelo menos 50 ug/mL, pelo menos 100 ug/mL, pelo me- nos 200 ug/mL, pelo menos 500 ug/mL, pelo menos 1.000 pg/mL, pelo menos 2.000 ug/mL de um agente de controle de patógenos e/ou um agente repelente.
[00185] “Exemplos de agentes de controle de patógenos ou agentes repelentes particulares que podem ser carregados no PMP são ainda delineados na seção intitulada "Agentes Funcionais Heterólogos". D. Formulações Farmacêuticas
[00186] Estão incluídas aqui composições de controle de patógenos que podem ser formuladas em composições farmacêuticas, por exem- plo, para administração a um animal. A composição farmacêutica pode ser administrada a um animal com um diluente, transportador e/ou exci- piente farmaceuticamente aceitáveis. Dependendo do modo de admi- nistração e da dosagem, a composição farmacêutica dos métodos des- critos aqui será formulada em composições farmacêuticas adequadas para permitir entrega fácil. A dose única pode ser em uma forma de dose unitária como necessário.
[00187] Uma composição de controle de patógenos pode ser formu- lada para, por exemplo, administração oral, administração intravenosa (por exemplo, injeção ou infusão) ou administração subcutânea a um animal. Para formulações injetáveis, vários transportadores farmacêuti- cos eficazes são conhecidos na técnica (Ver, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22º ed., (2012) e ASHP Hand- book on Injectable Drugs, 18º ed., (2014)).
[00188] Os transportadores e excipientes farmaceuticamente aceitá- veis nas presentes composições não são tóxicos para os receptores às dosagens e concentrações empregues. Os transportadores e excipien- tes aceitáveispodem incluir tampões tais como fosfato, citrato, HEPES e TAE, antioxidantes tais como ácido ascórbico e metionina, conservan- tes tais como cloreto de hexametônio, cloreto de octadecildimetilbenzi- lamônio, resorcinol e cloreto de benzalcônio, proteínas tais como albu- mina sérica humana, gelatina, dextrano e imunoglobulinas, polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona, aminoácidos tais como glicina, glutamina, histidina e lisina, e carboidratos tais como glucose, manose, sacarose e sorbitol. As composições podem ser formuladas de acordo com a prática farmacêutica convencional. A concentração do composto na formulação irá variar dependendo de um número de fatores, incluindo a dosagem do agente ativo (por exemplo, PMP) a ser administrado e a via de administração.
[00189] Para administração oral a um animal, a composição de con- trole de patógenos pode ser preparada na forma de uma formulação oral. As formulações para uso oral podem incluir comprimidos, caplets, cápsulas, xaropes ou formas de dosagem líquidas orais contendo o(s) ingrediente(s) ativo(s) em uma mistura com excipientes farmaceutica- mente aceitáveisnão tóxicos. Esses excipientes podem ser, por exem- plo, diluentes inertes ou cargas (por exemplo, sacarose, sorbitol, açúcar,
manitol, celulose microcristalina, amidos, incluindo amido de batata, car- bonato de cálcio, cloreto de sódio, lactose, fosfato de cálcio, sulfato de cálcio ou fosfato de sódio); agentes de granulação e desintegração (por exemplo, derivados de celulose, incluindo celulose microcristalina, amido, incluindo amido de batata, croscarmelose sódica, alginatos ou ácido algínico); agentes de ligação (por exemplo, sacarose, glicose, sor- bitol, acácia, ácido algínico, alginato de sódio, gelatina, amido, amido pré-gelatinizado, celulose microcristalina, silicato de magnésio e alumí- nio, carboximetilcelulose sódica, metilcelulose, hidroxipropil metilcelu- lose, etilcelulose, polivinilpirrolidona ou polietileno glicol); e agentes lu- brificantes, agentes antiaderentes e antiadesivos (por exemplo, estea- rato de magnésio, estearato de zinco, ácido esteárico, sílicas, óleos ve- getais hidrogenados ou talco). Outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis podem ser corantes, agentes aromatizantes, plastificantes, molhantes, agentes tamponantes e similares. As formulações para uso oral podem também ser proporcionadas na forma de dosagem unitária como comprimidos mastigáveis, comprimidos não mastigáveis, caplets, cápsulas (por exemplo, como cápsulas de gelatina duras em que o in- grediente ativo é misturado com um diluente sólido inerte, ou como cáp- sulas de gelatina moles em que o ingrediente ativo é misturado com água ou um meio de óleo). As composições divulgadas aqui podem tam- bém incluir uma formulação de liberação imediata, liberação prolongada ou liberação retardada.
[00190] Para administração parenteral a um animal, as composições de controle de patógenos podem ser formuladas na forma de soluções ou suspensões líquidas e administradas por uma via parenteral (por exemplo, subcutânea, intravenosa ou intramuscular). A composição far- macêutica pode ser formulada para injeção ou infusão. As composições farmacêuticas para administração parenteral podem ser formuladas usando uma solução estéril ou qualquer líquido farmaceuticamente aceitável como um veículo. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, água estéril, solução salina fisioló- gica ou meio de cultura de células (por exemplo, Meio de Eagle Modifi- cado por Dulbecco (DMEM), Meio de Eagle a-Modificado (a-MEM), meio F-12). Os métodos de formulação são conhecidos na técnica, ver, por exemplo, Gibson (ed.) Pharmaceutical Preformulation and Formulation (2º ed.) Taylor & Francis Group, CRC Press (2009). E. Formulações Agrícolas
[00191] Estão incluídas aqui composições de controle de patógenos que podem ser formuladas em composições agrícolas, por exemplo, para administração a patógeno ou vetor de patógeno (por exemplo, um inseto). A composição farmacêutica pode ser administrada a um pató- geno ou vetor de patógeno (por exemplo, um inseto) com um diluente, transportador e/ou excipiente agricolamente aceitáveis. Exemplos adici- onais de formulações agrícolas úteis nas presentes composições e mé- todos são ainda delineados aqui.
[00192] Para permitir facilidade de aplicação, manuseamento, trans- porte, armazenamento e atividade máxima, o agente ativo, aqui PMPs, pode ser formulado com outras substâncias. Os PMPs podem ser for- mulados em, por exemplo, iscas, emulsões concentradas, pós, concen- trados emulsificáveis, fumigantes, géis, grânulos, microencapsulações, tratamentos de sementes, concentrados em suspensão, suspoemul- sões, comprimidos, líquidos solúveis em água, grânulos dispersíveis em água ou fluidos secos, pós molháveis e soluções de volume ultrabaixo. Para informação adicional sobre tipos de formulação ver "Catalogue of Pesticide Formulation Types and International Coding System" Mono- grafia Técnica nº 2, 5º Edição pela CropLife International (2002).
[00193] Os agentes ativos (por exemplo, PMPs com ou sem agentes funcionais heterólogos, por exemplo, agentes antipatogênicos, agentes pesticidas ou agentes repelentes) podem ser aplicados o mais frequen- temente como suspensões aquosas ou emulsões preparadas a partir de formulações concentradas de tais agentes. Tais formulações solúveis em água, suspensíveis em água ou emulsificáveis são sólidos, usual- mente conhecidos como pós molháveis, ou grânulos dispersíveis em água, ou líquidos usualmente conhecidos como concentrados emulsifi- cáveis, ou suspensões aquosas. Os pós molháveis, que podem ser compactados para formar grânulos dispersíveis em água, compreen- dem uma mistura íntima do pesticida, um transportador e tensoativos. O transportador é usualmente selecionado de entre as argilas de ata- pulgita, as argilas de montmorilonita, as terras diatomáceas ou os silica- tos purificados. Tensoativos eficazes, incluindo de cerca de 0,5% a cerca de 10% do pó molhável, são encontrados entre ligninas sulfona- das, naftalenossulfonatos condensados, naftalenossulfonatos, alquil- benzenossulfonatos, sulfatos de alquila e tensoativos não iônicos tais como adutos de óxido de etileno de fenóis de alquila.
[00194] Os concentrados emulsificáveis podem compreender uma concentração adequada de PMPs, tal como de cerca de 50 a cerca de 500 gramas por litro de líquido dissolvido em um transportador que é um solvente miscível em água ou uma mistura de solvente orgânico imiscí- vel em água e emulsificantes. Solventes orgânicos úteis incluem aromá- ticos, especialmente xilenos e frações de petróleo, especialmente as porções naftalênicas e olefínicas de elevado ponto de ebulição do pe- tróleo tais como nafta aromática pesada. Outros solventes orgânicos podem ser também usados, tais como os solventes terpênicos incluindo derivados de colofónia, cetonas alifáticas tais como ciclo-hexanona e álcoois complexos tais como 2-etoxietanol. Emulsificantes adequados para concentrados emulsificáveis são selecionados de tensoativos aniô- nicos e não iônicos convencionais.
[00195] As suspensões aquosas compreendem suspensões de pes- ticidas insolúveis em água dispersos em um transportador aquoso a uma concentração na gama de cerca de 5% a cerca de 50% em peso. As suspensões são preparadas por trituração fina do pesticida e sua mistura vigorosa em um transportador compreendido por água e tenso- ativos. Ingredientes, tais como sais inorgânicos e gomas sintéticas ou naturais, podem ser também adicionados, para aumentar a densidade e viscosidade do transportador aquoso.
[00196] Os PMPs podem ser também aplicados como composições granulares que são particularmente úteis para aplicações ao solo. As composições granulares contêm usualmente de cerca de 0,5% a cerca de 10% em peso do pesticida, disperso em um transportador que inclui argila ou uma substância similar. Tais composições são usualmente pre- paradas por dissolução da formulação em um solvente adequado e sua aplicação a um transportador granular que foi pré-formado com o tama- nho das partículas apropriado, na gama de cerca de 0,5 a cerca de 3 mm. Tais composições podem ser também formuladas por preparação de uma massa ou pasta do transportador e composto e esmagamento e secagem para se obter o tamanho das partículas granulares desejado.
[00197] As poeiras contendo a presente formulação de PMP são pre- parados por mistura íntima dos PMPs na forma de pó com um transpor- tador agrícola empoeirado adequado, tal como argila de caulim, rocha vulcânica moída e similares. As poeiras podem conter adequadamente de cerca de 1% a cerca de 10% dos pacotes. Podem ser aplicadas como uma cobertura de sementes ou como uma aplicação de folhagem com uma máquina sopradora de poeiras.
[00198] É igualmente prático aplicar a presente formulação na forma de uma solução em um solvente orgânico apropriado, usualmente óleo de petróleo, tal como os óleos de pulverização, que são amplamente usados na química agrícola.
[00199] Os PMPs podem ser também aplicados na forma de uma composição de aerossol. Em tais composições, os pacotes são dissol- vidos ou dispersos em um transportador, que é uma mistura de propul- sor geradora de pressão. A composição de aerossol é embalada em um recipiente a partir do qual a mistura é dispensada através de uma vál- vula de atomização.
[00200] —Outramodalidade é uma emulsão de óleo-em-água, em que a emulsão inclui glóbulos oleosos que são cada um proporcionados com um revestimento de cristal líquido lamelar e são dispersos em uma fase aquosa, em que cada glóbulo oleoso inclui pelo menos um composto que é agricolamente ativo, e é individualmente revestido com uma ca- mada monolamelar ou oligolamelar incluindo: (1) pelo menos um agente tensoativo lipofílico não iônico, (2) pelo menos um agente tensoativo hi- drofílico não iônico e (3) pelo menos um agente tensoativo iônico, em que os glóbulos têm um diâmetro médio das partículas de menos do que 800 nanômetros. Informação adicional sobre a modalidade é descrita na publicação de patente dos E.U.A. 20070027034 publicada a 1 de fev.,
2007. Para facilidade de uso, esta modalidade será referida como "OIWE".
[00201] — Adicionalmente, geralmente, quando as moléculas divulga- das acima são usadas em uma formulação, tal formulação pode também conter outros componentes. Estes componentes incluem, mas não es- tão limitados a, (esta é uma lista não exaustiva e não mutuamente ex- clusiva) molhantes, propagadores, adesivos, penetrantes, tampões, agentes sequestrantes, agentes de redução da deriva, agentes de com- patibilidade, agentes antiespumantes, agentes de limpeza e emulsifi- cantes. Alguns componentes são descritos de seguida.
[00202] “Um agente molhante é uma substância que quando adicio- nada a um líquido aumenta o poder de propagação ou penetração do líquido por redução da tensão interfacial entre o líquido e a superfície na qual está se propagando. Os agentes molhantes são usados para duas funções principais nas formulações agroquímicas: durante o processa- mento e fabricação para aumentar a taxa de molhagem dos pós em água para fazer concentrados para líquidos solúveis ou concentrados em suspensão; e durante a mistura de um produto com água em um tanque de pulverização para reduzir o tempo de molhagem de pós mo- lháveis e para melhorar a penetração de água em grânulos dispersíveis em água. Exemplos de agentes molhantes usados em formulações de pós molháveis, concentrado em suspensão e grânulos dispersíveis em água são: lauril sulfato de sódio; sulfossuccinato de dioctila de sódio; etoxilatos de fenol de alquila; e etoxilatos de álcool alifático.
[00203] “Um agente dispersante é uma substância que se adsorve na superfície das partículas e ajuda a preservar o estado de dispersão das partículas e previna que elas se reagreguem. Os agentes dispersantes são adicionados às formulações agroquímicas para facilitar a dispersão e suspensão durante a fabricação e para assegurar que as partículas se redispersem na água em um tanque de pulverização. São ampla- mente usados em pós molháveis, concentrados em suspensão e grânu- los dispersíveis em água. Os tensoativos que são usados como agentes dispersantes têm a capacidade de se adsorver fortemente na superfície de uma partícula e proporcionar uma barreira carregada ou estérica para a reagregação de partículas. Os tensoativos mais comumente usa- dos são aniônicos, não iônicos ou misturas dos dois tipos. Para formu- lações de pós molháveis, os agentes dispersantes mais comuns são lignossulfonatos de sódio. Para concentrados em suspensão, adsorção e estabilização muito boas são obtidas usando polieletrólitos, tais como condensados de formaldeído de naftalenossulfonato de sódio. Ésteres de fosfato de etoxilato de tristiriifenol são também usados. Não iônicos tais como condensados de óxido de alquilariletileno e copolímeros em bloco de EO-PO, são por vezes combinados com aniônicos como agen- tes dispersantes para concentrados em suspensão. Nos últimos anos, novos tipos de tensoativos poliméricos de peso molecular muito elevado foram desenvolvidos como agentes dispersantes. Estes têm "esquele- tos" hidrofóbicos muito longos e um grande número de cadeias de óxido de etileno formando os "dentes" de um tensoativo em "pente". Estes polímeros de peso molecular elevado podem dar estabilidade a longo prazo muito boa aos concentrados em suspensão porque os esqueletos hidrofóbicos têm muitos pontos de ancoragem nas superfícies das par- tículas. Exemplos de agentes dispersantes usados em formulações agroquímicas são: lignossulfonatos de sódio; condensados de formal- deído de naftalenossulfonato de sódio; ésteres de fosfato de etoxilato de tristiriifenol; etoxilatos de álcool alifático; etoxilatos de alquila; copo- límeros em bloco de EO-PO (óxido de etileno - óxido de propileno); e copolímeros de enxerto.
[00204] Um agente emulsificante é uma substância que estabiliza uma suspensão de gotículas de uma fase líquida em outra fase líquida. Sem o agente emulsificante, os dois líquidos se separariam em duas fases líquidas imiscíveis. As combinações de emulsificantes mais comu- mente usadas contêm alquilfenol ou álcool alifático com doze ou mais unidades de óxido de etileno e o sal de cálcio solúvel em óleo do ácido dodecilbenzenossulfônico. Uma gama de valores de equilíbrio hidrófilo- lipófilo ("HLB") de 8 a 18 irá normalmente proporcionar boas emulsões estáveis. A estabilidade da emulsão pode por vezes ser melhorada pela adição de uma pequena quantidade de um tensoativo de copolímero em bloco de EO-PO.
[00205] Um agente solubilizante é um tensoativo que formará micé- lios em água a concentrações acima da concentração micelar crítica. Os micélios são depois capazes de dissolver ou solubilizar materiais in- solúveis em água dentro da parte hidrofóbica do micélio. Os tipos de tensoativos usualmente usados para solubilização são não iônicos, mono-oleatos de sorbitana, etoxilatos de mono-oleato de sorbitana e és- teres de oleato de metila.
[00206] Os tensoativos são por vezes usados, sozinhos ou com ou- tros aditivos tais como óleos minerais ou vegetais, como adjuvantes para misturas em tanque de pulverização para melhorar o desempenho biológico do pesticida no alvo. Os tipos de tensoativos usados para biointensificação dependem geralmente da natureza e modo de ação do pesticida. No entanto são frequentemente não iônicos tais como: etoxi- latos de alquila; etoxilatos de álcool alifático lineares; etoxilatos de amina alifática.
[00207] Um transportador ou diluente em uma formulação agrícola é um material adicionado ao pesticida para dar um produto da resistência requerida. Os transportadores são usualmente materiais com elevadas capacidades de absorção, enquanto os diluentes são usualmente ma- teriais com baixas capacidades de absorção. Os transportadores e dilu- entes são usados na formulação de poeiras, pós molháveis, grânulos e grânulos dispersíveis em água.
[00208] Os solventes orgânicos são usados maioritariamente na for- mulação de concentrados emulsificáveis, emulsões óleo-em-água, sus- poemulsões e formulações de volume ultrabaixo e, em menor extensão, formulações granulares. Por vezes são usadas misturas de solventes. Os primeiros grupos principais de solventes são óleos parafínicos alifá- ticos tais como querosene ou parafinas refinadas. O segundo grupo principal (e o mais comum) inclui os solventes aromáticos tais como xi- leno e frações de peso molecular mais elevado de solventes aromáticos C9 e C10. Os hidrocarbonetos clorados são úteis como cossolventes para prevenir a cristalização de pesticidas quando a formulação é emul- sificada em água. Os álcoois são por vezes usados como cossolventes para aumentar o poder do solvente. Outros solventes podem incluir óleos vegetais, óleos de sementes e ésteres de óleos vegetais e de se- mentes.
[00209] Os espessantes ou agentes gelificantes são usados maiori- tariamente na formulação de concentrados em suspensão, emulsões e suspoemulsões para modificar a reologia ou propriedades de fluxo do líquido e para prevenir a separação e sedimentação das partículas ou gotículas dispersas. Os agentes espessantes, gelificantes e antissedi- mentação se enquadram geralmente em duas categorias, nomeada- mente, particulados insolúveis em água e polímeros solúveis em água. É possível produzir formulações de concentrado em suspensão usando argilas e sílicas. Exemplos destes tipos de materiais incluem, mas não estão limitados a, montmorilonita, bentonita, silicato de alumínio e mag- nésio e atapulgita. Polissacarídeos solúveis em água têm sido usados como agentes espessantes-gelificantes por muitos anos. Os tipos de polissacarídeos mais comumente usados são extratos naturais de se- mentes e algas marinhas ou são derivados sintéticos da celulose. Exem- plos destes tipos de materiais incluem, mas não estão limitados a, goma-guar; goma de alfarroba; carragenina; alginatos; celulose de me- tila; carboximetilcelulose de sódio (SCMC); celulose de hidroxietila (HEC). Outros tipos de agentes antissedimentação são baseados em amidos modificados, poliacrilatos, álcool de polivinila e óxido de polieti- leno. Outro bom agente antissedimentação é goma-xantana.
[00210] —Osmicrorganismos podem causar deterioração dos produtos formulados. Portanto são usados agentes de preservação para eliminar ou reduzir seu efeito. Exemplos de tais agentes incluem, mas não estão limitados a: ácido propiônico e seu sal de sódio; ácido sórbico e seus sais de sódio ou potássio; ácido benzoico e seu sal de sódio; sal de sódio do ácido p-hidroxibenzoico; p-hidroxibenzoato de metilo; e 1,2- benzisotiazolin-3-ona (BIT).
[00211] A presença de tensoativos faz frequentemente com que as formulações à base de água formem espuma durante as operações de mistura na produção e na aplicação através de um tanque de pulveriza- ção. De modo a se reduzir a tendência para a formação de espuma são frequentemente adicionados agentes antiespumantes durante a etapa de produção ou antes do enchimento em garrafas. Geralmente existem dois tipos de agentes antiespumantes, nomeadamente silicones e não silicones. Os silicones são geralmente emulsões aquosas de polis- siloxano de dimetila, enquanto os agentes antiespumantes não silicone são óleos insolúveis em água, tais como octanol e nonanol, ou sílica. Em ambos os casos, a função do agente antiespumante é deslocar o tensoativo da interface ar-água.
[00212] Agentes "verdes" (por exemplo, adjuvantes, tensoativos, sol- ventes) podem reduzir a pegada ambiental global das formulações de proteção de culturas. Os agentes verdes são biodegradáveis e geral- mente derivados de fontes naturais e/ou sustentáveis, por exemplo, fon- tes de plantas e animais. Exemplos específicos são: óleos vegetais, óleos de sementes e seus ésteres, também poliglucosídeos de alquila alcoxilados.
[00213] Em alguns casos, os PMPs podem ser criodessecados ou liofilizados. Ver Pat. dos E.U.A. No. 4,311,712. Os PMPs podem ser re- constituídos após contato com água ou outro líquido. Outros componen- tes podem ser adicionados aos lipossomos liofilizados ou reconstituí- dos, por exemplo, outros agentes antipatogênicos, agentes pesticidas, agentes repelentes, transportadores agricolamente aceitáveis ou outros materiais de acordo com as formulações descritas aqui.
[00214] Outras características opcionais da composição incluem transportadores ou veículos de entrega que protegem a composição de controle de patógenos contra UV e/ou condições ácidas. Em alguns ca- sos, o veículo de administração contém um tampão de pH. Em alguns casos, a composição é formulada para ter um pH na gama de cerca de
4,5 a cerca de 9,0, incluindo por exemplo gamas de pH de cerca de qualquer um de 5,0 a cerca de 8,0, cerca de 6,5 a cerca de 7,5 ou cerca de 6,5 a cerca de 7,0.
[00215] A composição pode ser ainda formulada com um atrator (por exemplo, um quimioatrator) que atrai uma praga, tal como um vetor de patógeno (por exemplo, um inseto), para a vizinhança da composição. Os atratores incluem feromônios, um químico que é secretado por um animal, especialmente uma praga, ou quimioatratores que influenciam o comportamento ou desenvolvimento de outros da mesma espécie. Outros atratores incluem açúcar e xaropes de hidrolisados de proteínas, leveduras e carne podre. Os atratores podem ser também combinados com um ingrediente ativo e pulverizados em folhagem ou outros itens na área de tratamento. São conhecidos vários atratores que influenciam o comportamento de uma praga como a busca de uma praga por ali- mento, oviposição ou locais de acasalamento ou parceiros de acasala- mento. Atratores úteis nos métodos e composições descritos aqui in- cluem, por exemplo, eugenol, propionato de fenetila, dimetilisobutil-ci- clopropanocarboxilato de etila, benzodioxancarboxilato de propila, cis- 7,8-epóxi-2-metiloctadecano, trans-8,trans-O-dodecadienol, cis-9-tetra- decenal (com cis-11-hexadecenal), trans-11-tetradecenal, cis-11-hexa- decenal, (Z)-11,12-hexadecadienal, acetato de cis-7-dodecenila, ace- tato de cis-8-dodecenila, acetato de cis-9-dodecenila, acetato de cis-9- tetradecenila, acetato de cis-11-tetradecenila, acetato de trans-11-tetra- decenila (com cis-11), acetato de cis-9,trans-11-tetradecadienila (com cis-9,trans-12), acetato de cis-9,trans-12-tetradecadienila, acetato de cis-7,cis-11-hexadecadienila (com cis-7,trans-11), acetato de cis-3,cis- 13-octadecadienila, acetato de trans-3,cis-13-octadecadienila, anetol e salicilato de isoamila.
[00216] Para informação adicional sobre formulações agrícolas ver "Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations" editado por
DA Knowles, copyright 1998 por Kluwer Academic Publishers. Ver tam- bém "Insecticides in Agriculture and Environment—Retrospects and Prospects" por AS Perry, |. Yamamoto, |. Ishaaya e R. Perry, copyright 1998 por Springer-Verlag. Il. Métodos Terapêuticos
[00217] Ascomposições de controle de patógenos descritas aqui são úteis em uma variedade de métodos terapêuticos, particularmente para a prevenção ou tratamento de infeções por patógenos em animais. Os presentes métodos envolvem entregar as composições de controle de patógenos descritas aqui a um animal.
[00218] São proporcionados aqui métodos de administrar a uma planta uma composição de controle de patógenos descrita aqui. Os mé- todos podem ser úteis para tratar ou prevenir uma infeção por patóge- nos em um animal.
[00219] Por exemplo é proporcionado aqui um método de tratar um animal tendo uma infeção fúngica, em que o método inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz de uma composição de controle de patógenos incluindo uma pluralidade de PMPs. Em alguns casos, o mé- todo inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz de uma compo- sição de controle de patógenos incluindo uma pluralidade de PMPs, em que a pluralidade de PMPs inclui um agente antifúngico. Em alguns ca- sos, o agente antifúngico é um ácido nucleico que inibe a expressão de um gene em um fungo que causa a infeção fúngica (por exemplo, Pro- teína de Crescimento Filamentoso Intensificado (EFG1)). Em alguns ca- sos, a infeção fúngica é causada por Candida albicans. Em alguns ca- sos, a composição inclui um PMP produzido a partir de uma EV de apo- plasto de Arabidopsis. Em alguns casos, o método diminui ou elimina substancialmente a infeção fúngica.
[00220] Em outro aspecto é proporcionado aqui um método de tratar um animal tendo uma infeção bacteriana, em que o método inclui admi- nistrar ao animal uma quantidade eficaz de uma composição de controle de patógenos incluindo uma pluralidade de PMPs. Em alguns casos, o método inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz de uma com- posição de controle de patógenos incluindo uma pluralidade de PMPs, e em que a pluralidade de PMPs inclui um agente antibacteriano (por exemplo, Anfotericina B). Em alguns casos, a bactéria é uma Strepto- coccus spp., Pneumococcus spp., Pseudomonas spp., Shigella spp, Salmonella spp., Campylobacter spp. ou uma Escherichia spp. Em al- guns casos, a composição inclui um PMP produzido a partir de uma EV de apoplasto de Arabidopsis. Em alguns casos, o método diminui ou elimina substancialmente a infeção bacteriana. Em alguns casos, o ani- mal é um humano, um animal veterinário ou um animal de criação.
[00221] Os presentes métodos são úteis para tratar uma infeção (por exemplo, como causada por um patógeno de animais) em um animal, que se refere a administrar tratamento a um animal já sofrendo de uma doença para melhorar ou estabilizar a condição do animal. Isto pode envolver reduzir a colonização de um patógeno em, sobre ou em torno de um animal por um ou mais patógenos (por exemplo em, cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100%) em relação a uma quantidade inicial e/ou permitir benefício para o indi- víduo (por exemplo, reduzir a colonização em uma quantidade suficiente para resolver os sintomas). Em tais casos, uma infeção tratada pode se manifestar como uma diminuição nos sintomas (por exemplo, em cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100%). Em alguns casos, uma infeção tratada é eficaz para aumentar a probabilidade de sobrevivência de um indivíduo (por exemplo, um au- mento na probabilidade de sobrevivência em cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100%) ou au-
mentar a sobrevivência global de uma população (por exemplo, um au- mento na probabilidade de sobrevivência em cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100%). Por exemplo, as composições e métodos podem ser eficazes para "eliminar substancialmente" uma infeção, que se refere a uma diminuição na in- feção em uma quantidade suficiente para resolver sustentavelmente os sintomas (por exemplo, durante pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses) no animal.
[00222] Os presentes métodos são úteis para prevenir uma infeção (por exemplo, como causada por um patógeno de animais), que se re- fere a prevenir um aumento na colonização em, sobre ou em torno de um animal por um ou mais patógenos (por exemplo, em 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% em relação a um animal não tratado) em uma quantidade suficiente para manter uma população de patógenos inicial (por exem- plo, aproximadamente a quantidade encontrada em um indivíduo sau- dável), prevenir o início de uma infeção e/ou prevenir sintomas ou con- dições associadas à infeção. Por exemplo, os indivíduos podem receber tratamento profilático para prevenir uma infeção fúngica enquanto estão sendo preparados para um procedimento médico invasivo (por exemplo, preparação para cirurgia, tal como receber um transplante, terapia com células-tronco, um enxerto, uma prótese, receber um tratamento de longo prazo ou cateterismo intravenoso frequente ou receber tratamento em uma unidade de cuidados intensivos), em indivíduos imunocompro- metidos (por exemplo, indivíduos com câncer, com HIV/AIDS ou to- mando agentes imunossupressores) ou em indivíduos submetidos a te- rapia com antibióticos a longo prazo.
[00223] A composição de controle de patógenos pode ser formulada para administração ou administrada por qualquer método adequado, in-
cluindo, por exemplo, intravenosamente, intramuscularmente, subcuta- neamente, intradermicamente, percutaneamente, intra-arterialmente, intraperitonealmente, intralesionalmente, intracranianalmente, intra-arti- cularmente, intraprostaticamente, intrapleuralmente, intratraquealmen- te, intratecalmente, intravaginalmente, intrarretalmente, topicamente, in- tratumoralmente, peritonealmente, subconjuntivalmente, intravesicular- mente, mucosalmente, intrapericardialmente, intraumbilicalmente, intra- ocularmente, intraorbitalmente, oralmente, topicamente, transdermica- mente, intravitrealmente (por exemplo, por injeção intravítrea), por colí- rio, por inalação, por injeção, por implantação, por infusão, por infusão contínua, por perfusão localizada banhando as células alvo diretamente, por cateter, por lavagem, em cremes ou em composições de lipídeos. As composições utilizadas nos métodos descritos aqui podem ser tam- bém administradas sistemicamente ou localmente. O método de admi- nistração pode variar dependendo de vários fatores (por exemplo, o composto ou composição sendo administrado e a gravidade da condi- ção, doença ou disfunção sendo tratada). Em alguns casos, a composi- ção de controle de patógenos é administrada intravenosamente, intra- muscularmente, subcutaneamente, topicamente, oralmente, transder- micamente, intraperitonealmente, intraorbitalmente, por implantação, por inalação, intratecalmente, intraventricularmente ou intranasalmente. A dosagem pode ser por qualquer via adequada, por exemplo, por inje- ções, tais como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração é breve ou crônica. Vários esquemas de dosa- gem incluindo mas não se limitando a administrações únicas ou múlti- plas ao longo de vários pontos temporais, administração de bólus e in- fusão em pulsos são contemplados aqui.
[00224] Para a prevenção ou tratamento de uma infeção descrita aqui (quando usado sozinho ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tra- tada, da gravidade e curso da doença, se o é administrado para propó- sitos preventivos ou terapêuticos, terapia prévia, historial clínico do pa- ciente e resposta à composição de controle de patógenos. A composi- ção de controle de patógenos pode ser, por exemplo, administrada ao paciente em uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento seria geralmente mantido até que ocorra uma supressão desejada dos sintomas da doença ou a infeção não seja mais detectável. Tais doses podem ser administradas intermitentemente, por exemplo, a cada semana ou a cada duas semanas (por exemplo, tal que o paciente receba, por exemplo, de cerca de duas a cerca de vinte, do- ses da composição de controle de patógenos. Pode ser administrada uma dose de carga inicial mais elevada, seguida por uma ou mais doses mais baixas. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorizado por técnicas e en- saios convencionais.
[00225] Em alguns casos, a quantidade da composição de controle de patógenos administrada ao indivíduo (por exemplo, humano) pode estar na gama de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 5 g/kg (por exemplo, cerca de 0,01 mg/kg - 0,1 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg - 1 mg/kg, cerca de 1 mg/kg - 10 mg/kg, cerca de 10 mg/kg - 100 mg/kg, cerca de 100 mg/kg - 1 g/kg ou cerca de 1 g/kg - 5 g/kg), do peso corporal do indiví- duo. Em alguns casos, a quantidade da composição de controle de pa- tógenos administrada ao indivíduo (por exemplo, humano) é pelo menos 0,01 mg/kg (por exemplo, pelo menos 0,01 mg/kg, pelo menos 0,1 mg/kg, pelo menos 1 mg/kg, pelo menos 10 mg/kg, pelo menos 100 mg/kg, pelo menos 1 g/kg ou pelo menos 5 g/kg), do peso corporal do indivíduo. A dose pode ser administrada como uma dose única ou como doses múltiplas (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais do que 7 doses).
Em alguns casos, a composição de controle de patógenos administrada ao animal pode ser administrada sozinha ou em combinação com um agente terapêutico ou agente de controle de patógenos adicional. A dose do anticorpo administrado em um tratamento de combinação pode ser reduzida em comparação com um único tratamento. O progresso desta terapia é facilmente monitorizado por técnicas convencionais. Ill. Métodos Agrícolas
[00226] As composições de controle de patógenos descritas aqui são úteis em uma variedade de métodos agrícolas, particularmente para a prevenção ou tratamento de infeções por patógenos em animais e para o controle da propagação de tais patógenos, por exemplo, por vetores de patógeno. Os presentes métodos envolvem entregar as composi- ções de controle de patógenos descritas aqui a um patógeno ou um vetor de patógeno.
[00227] As composições e métodos relacionados podem ser usados para prevenir a infestação pelos ou reduzir os números de patógenos ou vetores de patógenos em quaisquer habitats nos quais residam (por exemplo, fora dos animais, por exemplo, em plantas, partes de plantas (por exemplo, raízes, frutos e sementes), no ou sobre o solo, água ou em outro habitat de patógeno ou vetor de patógeno. Conformemente, as composições e métodos podem reduzir o efeito prejudicial de vetores de patógenos por, por exemplo, morte, ferida ou abrandamento da ati- vidade do vetor e podem deste modo controlar a aptidão do patógeno para animais. As composições divulgadas aqui podem ser usadas para controlar, matar, ferir, paralisar ou reduzir a atividade de um ou mais de quaisquer patógenos ou vetores de patógenos em qualquer etapa de desenvolvimento, por exemplo, seu ovo, ninfa, instar, larvas, adulto, ju- venil ou formas dessecadas. Os detalhes de cada um destes métodos são descritos ainda em baixo.
A. Entrega a um Patógeno
[00228] São proporcionados aqui métodos de entregar uma compo- sição de controle de patógenos a um patógeno, tal como uma descrita aqui, por contato do patógeno com uma composição de controle de pa- tógenos. Os métodos podem ser úteis para diminuir a aptidão de um patógeno, por exemplo, para prevenir ou tratar uma infeção por patóge- nos ou controlar a propagação de um patógeno em consequência da entrega da composição de controle de patógenos. Exemplos de patóge- nos que podem ser visados de acordo com os métodos descritos aqui incluem bactérias (por exemplo, Streptococcus spp., Pneumococcus Spp., Pseudomonas spp., Shigella spp, Salmonella spp., Campylobacter Spp. ou uma Escherichia spp.), fungos (Saccharomyces spp. ou uma Candida Spp.), insetos parasitários (por exemplo, Cimex spp.), nemató- deos parasitários (por exemplo, Heligmosomoides spp.) ou protozoários parasitários (por exemplo, Trichomoniasis Spp.).
[00229] — Por exemplo é proporcionado aqui um método de diminuir a aptidão de um patógeno, incluindo o método entregar ao patógeno qual- quer uma das composições descritas aqui, em que o método diminui a aptidão do patógeno em relação a um patógeno não tratado. Em algu- mas modalidades, o método inclui entregar a composição a pelo menos um habitat onde o patógeno cresce, vive, se reproduz, se alimenta ou infesta. Em alguns casos dos métodos descritos aqui, a composição é entregue como uma composição comestível pelo patógeno para inges- tão pelo patógeno. Em alguns casos dos métodos descritos aqui, a com- posição é entregue (por exemplo, a um patógeno) como um líquido, um sólido, um aerossol, uma pasta, um gel ou um gás.
[00230] É também proporcionado aqui um método de diminuir a ap- tidão de um inseto parasitário, em que o método inclui entregar ao inseto parasitário uma composição de controle de patógenos incluindo uma pluralidade de PMPs. Em alguns casos, o método inclui entregar ao in- seto parasitário uma composição de controle de patógenos incluindo uma pluralidade de PMPs, em que a pluralidade de PMPs inclui um agente inseticida. Por exemplo, o inseto parasitário pode ser um perce- vejo. Outros exemplos não limitantes de insetos parasitários são propor- cionados aqui. Em alguns casos, o método diminui a aptidão do inseto parasitário em relação a um inseto parasitário não tratado.
[00231] É adicionalmente proporcionado aqui um método de diminuir a aptidão de um nematódeo parasitário, em que o método inclui entregar ao nematódeo parasitário uma composição de controle de patógenos incluindo uma pluralidade de PMPs. Em alguns casos, o método inclui entregar ao nematódeo parasitário uma composição de controle de pa- tógenos incluindo uma pluralidade de PMPs, em que a pluralidade de PMP's inclui um agente nematicida. Por exemplo, o nematódeo parasi- tário é Heligmosomoides polygyrus. Outros exemplos não limitantes de nematódeos parasitários são proporcionados aqui. Em alguns casos, o método diminui a aptidão do nematódeo parasitário em relação a um nematódeo parasitário não tratado.
[00232] É adicionalmente proporcionado aqui um método de diminuir a aptidão de um protozoário parasitário, em que o método inclui entregar ao protozoário parasitário uma composição de controle de patógenos incluindo uma pluralidade de PMPs. Em alguns casos, o método inclui entregar ao protozoário parasitário uma composição de controle de pa- tógenos incluindo uma pluralidade de PMPs, em que a pluralidade de PMP's inclui um agente antiparasitário. Por exemplo, o protozoário pa- rasitário pode ser T. vaginalis. Outros exemplos não limitantes de pro- tozoários parasitários são proporcionados aqui. Em alguns casos, o mé- todo diminui a aptidão do protozoário parasitário em relação a um pro- tozoário parasitário não tratado.
[00233] “Uma diminuição na aptidão do patógeno em consequência da entrega de uma composição de controle de patógenos pode se ma- nifestar de um número de modos. Em alguns casos, a diminuição na aptidão do patógeno pode se manifestar como uma deterioração ou de- clínio na fisiologia do patógeno (por exemplo, saúde ou sobrevivência reduzida) em consequência da entrega da composição de controle de patógenos. Em alguns casos, a aptidão de um organismo pode ser me- dida por um ou mais parâmetros, incluindo, mas não se limitando a, taxa reprodutiva, fertilidade, expectativa de vida, viabilidade, mobilidade, fe- cundidade, desenvolvimento do patógeno, peso corporal, taxa ou ativi- dade metabólica ou sobrevivência em comparação com um patógeno ao qual a composição de controle de patógenos não foi administrada. Por exemplo, os métodos ou composições proporcionadas aqui podem ser eficazes para diminuir a saúde global do patógeno ou para diminuir a sobrevivência global do patógeno. Em alguns casos, a diminuição da sobrevivência do patógeno é cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, ou maior do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo, um nível encontrado em um pa- tógeno que não recebe uma composição de controle de patógenos). Em alguns casos, os métodos e composições são eficazes para diminuir a reprodução do patógeno (por exemplo, taxa reprodutiva, fertilidade) em comparação com um patógeno ao qual a composição de controle de patógenos não foi administrada. Em alguns casos, os métodos e com- posições são eficazes para diminuir outros parâmetros fisiológicos, tais como mobilidade, peso corporal, expectativa de vida, fecundidade ou taxa metabólica, em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, ou maior do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo, um nível encontrado em um patógeno que não recebe uma composição de controle de patógenos).
[00234] Em alguns casos, a diminuição na aptidão da praga pode se manifestar como um aumento na sensibilidade do patógeno a um agente antipatogênico e/ou uma diminuição na resistência do patógeno a um agente antipatogênico em comparação com um patógeno ao qual a composição de controle de patógenos não foi entregue. Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser efi- cazes para aumentar a sensibilidade do patógeno a um agente de con- trole de patógenos em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou maior do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo, um nível encontrado em uma praga que não recebe uma composição de controle de patógenos).
[00235] Em alguns casos, a diminuição na aptidão do patógeno pode se manifestar como outras desvantagens de aptidão, tais como uma to- lerância diminuída a certos fatores ambientais (por exemplo, uma tole- rância à temperatura elevada ou baixa), uma capacidade diminuída para sobreviver em certos habitats ou uma capacidade diminuída de manter uma certa dieta em comparação com um patógeno ao qual a composi- ção de controle de patógenos não foi administrada. Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionadas aqui podem ser eficazes para diminuir a aptidão do patógeno em qualquer pluralidade de modos descritos aqui. Ainda, a composição de controle de patógenos pode di- minuir a aptidão do patógeno em qualquer número de classes, ordens, famílias, gêneros ou espécies de patógenos (por exemplo, 1 espécie de patógeno, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 200, 250, 500, ou mais espécies de patógenos). Em alguns casos, a composição de controle de patógenos atua em uma única classe, ordem, família, gênero ou espécie de patógeno.
[00236] A aptidão do patógeno pode ser avaliada usando quaisquer métodos padrão da técnica. Em alguns casos, a aptidão da praga pode ser avaliada por avaliação de um patógeno individual. Alternativamente, a aptidão da praga pode ser avaliada por avaliação de uma população de patógenos. Por exemplo, uma diminuição na aptidão do patógeno pode se manifestar como uma diminuição na competição bem-sucedida contra outros patógenos, levando deste modo a uma diminuição no ta- manho da população de patógenos. B. Entrega a um Vetor de Patógeno
[00237] São proporcionados aqui métodos de entregar uma compo- sição de controle de patógenos a um vetor de patógeno, tal como uma descrita aqui, por contato do patógeno com uma composição de controle de patógenos. Os métodos podem ser úteis para diminuir a aptidão de um vetor de patógeno, por exemplo, para controlar a propagação de um patógeno em consequência da entrega da composição de controle de patógenos. Exemplos de vetores de patógenos que podem ser visados de acordo com os métodos descritos aqui incluem insetos, tais como aqueles descritos na Seção |V.G.
[00238] Por exemplo é proporcionado aqui um método de diminuir a aptidão de um vetor de patógeno de animais, incluindo o método entre- gar ao vetor uma quantidade eficaz de qualquer uma das composições descritas aqui, em que o método diminui a aptidão do vetor em relação a um vetor não tratado. Em alguns casos, o método inclui entregar a composição a pelo menos um habitat onde o vetor cresce, vive, se re- produz, se alimenta ou infesta. Em alguns casos, a composição é entre- gue como uma composição comestível para ingestão pelo vetor. Em al- guns casos, o vetor é um inseto. Em alguns casos, o inseto é um mos- quito, um carrapato, um ácaro ou um piolho. Em alguns casos, a com- posição é entregue (por exemplo, ao vetor de patógeno) como um lí- quido, um sólido, um aerossol, uma pasta, um gel ou um gás.
[00239] Por exemplo é proporcionado aqui um método de diminuir a aptidão de um vetor de insetos de um patógeno de animais, em que o método inclui entregar ao vetor uma composição de controle de patóge- nos incluindo uma pluralidade de PMPs. Em alguns casos, o método inclui entregar ao vetor uma composição de controle de patógenos in- cluindo uma pluralidade de PMPs, em que a pluralidade de PMP's inclui um agente inseticida. Por exemplo, o vetor de insetos pode ser um mos- quito, carrapato, ácaro ou piolho. Outros exemplos não limitantes de ve- tores de patógenos são proporcionados aqui. Em alguns casos, o mé- todo diminui a aptidão do vetor em relação a um vetor não tratado.
[00240] Em alguns casos, a diminuição na aptidão do vetor pode se manifestar como uma deterioração ou declínio na fisiologia do vetor (por exemplo, saúde ou sobrevivência reduzida) em consequência da admi- nistração de uma composição. Em alguns casos, a aptidão de um orga- nismo pode ser medida por um ou mais parâmetros, incluindo, mas não se limitando a, taxa reprodutiva, expectativa de vida, viabilidade, mobi- lidade, fecundidade, peso corporal, taxa ou atividade metabólica ou so- brevivência em comparação com um organismo vetor ao qual a compo- sição não foi entregue. Por exemplo, os métodos ou composições pro- porcionadas aqui podem ser eficazes para diminuir a saúde global do vetor ou para diminuir a sobrevivência global do vetor. Em alguns casos, a diminuição da sobrevivência do vetor é cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou maior do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo, um nível encontrado em um vetor que não recebe uma composição). Em alguns casos, os métodos e composições são eficazes para diminuir a reprodução do ve- tor (por exemplo, taxa reprodutiva) em comparação com um organismo vetor ao qual a composição não foi entregue. Em alguns casos, os mé- todos e composições são eficazes para diminuir outros parâmetros fisi- ológicos, tais como mobilidade, peso corporal, expectativa de vida, fe- cundidade ou taxa metabólica, em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou maior do que 100% em re- lação a um nível de referência (por exemplo, um nível encontrado em um vetor que não é entregue à composição).
[00241] Em alguns casos, a diminuição na aptidão do vetor pode se manifestar como um aumento na sensibilidade do vetor a um agente pesticida e/ou uma diminuição na resistência do vetor a um agente pes- ticida em comparação com um organismo vetor ao qual a composição não foi entregue. Em alguns casos, os métodos ou composições pro- porcionados aqui podem ser eficazes para aumentar a sensibilidade do vetor a um agente pesticida em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou maior do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo, um nível encontrado em um vetor que não recebe uma composição). O agente pesticida pode ser qual- quer agente pesticida conhecido na técnica, incluindo agentes insetici- das. Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionadas aqui podem aumentar a sensibilidade do vetor a um agente pesticida por diminuição da capacidade do vetor de metabolizar ou degradar o agente pesticida em substratos usáveis em comparação com um vetor ao qual a composição não foi entregue.
[00242] Em alguns casos, a diminuição na aptidão do vetor pode se manifestar como outras desvantagens de aptidão, tais como tolerância diminuída a certos fatores ambientais (por exemplo, uma tolerância à temperatura elevada ou baixa), capacidade diminuída para sobreviver em certos habitats ou uma capacidade diminuída de manter uma certa dieta em comparação com um organismo vetor ao qual a composição não foi entregue. Em alguns casos, os métodos ou composições pro- porcionadas aqui podem ser eficazes para diminuir a aptidão do vetor em qualquer pluralidade de modos descritos aqui. Ainda, a composição pode diminuir a aptidão do vetor em qualquer número de classes, or- dens, famílias, gêneros ou espécies de vetores (por exemplo, 1 espécie de vetor, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 200, 250, 500 ou mais espécies de vetores). Em alguns casos,
a composição atua em uma única classe, ordem, família, gênero ou es- pécie de vetor.
[00243] A aptidão do vetor pode ser avaliada usando quaisquer mé- todos padrão da técnica. Em alguns casos, a aptidão do vetor pode ser avaliada por avaliação de um vetor individual. Alternativamente, a apti- dão do vetor pode ser avaliada por avaliação de uma população de ve- tores. Por exemplo, uma diminuição na aptidão do vetor pode se mani- festar como uma diminuição na competição bem-sucedida contra outros vetores, levando deste modo a uma diminuição no tamanho da popula- ção de vetores.
[00244] “Por diminuição da aptidão de vetores que transportam pató- genos de animais, as composições proporcionadas aqui são eficazes para reduzir a propagação de doenças transmitidas por vetores. A com- posição pode ser entregue aos insetos usando qualquer uma das for- mulações e métodos de entrega descritos aqui, em uma quantidade e durante uma duração eficazes para reduzir a transmissão da doença, por exemplo, reduzir a transmissão vertical ou horizontal entre vetores e/ou reduzir a transmissão para animais. Por exemplo, a composição descrita aqui pode reduzir a transmissão vertical ou horizontal de um patógeno transmitido por vetores em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais em comparação com um organismo vetor ao qual a composição não foi entregue. Como outro exemplo, a composição descrita aqui pode reduzir a competência veto- rial de um vetor de insetos em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais em comparação com um organismo vetor ao qual a composição não foi entregue.
[00245] “Exemplos não limitadores de doenças que podem ser con- troladas pelas composições e métodos proporcionados aqui incluem do- enças causadas por vírus Togaviridae (por exemplo, Chikungunya, fe- bre de Ross River, Mayaro, febre de Onyon-nyong, febre de Sindbis,
encefalomielite equina oriental, encefalomielite equina ocidental, ence- falomielite equina venezuelana, ou floresta de Barmah); doenças cau- sadas por vírus Flavivirdae (por exemplo, Febre de Dengue, Febre ama- rela, doença da Floresta de Kyasanur, febre hemorrágica de Omsk, en- cefalite japonesa, encefalite de Murray Valley, Rocio, encefalite de St. Louis, encefalite do Nilo ocidental, ou Encefalite transmitida pelo carra- pato); doenças causadas por vírus Bunyaviridae (por exemplo, febre de Sandly, febre de Rift Valley, encefalite de La Crosse, encefalite da Cali- fórnia, febre hemorrágica da Crimeia-Congo, ou febre de Oropouche); doença causada por vírus Rhabdoviridae (por exemplo, Estomatite ve- sicular); doença causada por Orbiviridae (por exemplo, Língua azul); do- enças causadas por bactérias (por exemplo, Peste, Tularemia, febre Q, febre maculosa das Montanhas Rochosas, Tifo murino, febre de Bou- tonneuse, tifo do carrapato de Queensland, tifo do carrapato siberiano, Tifo dos arbustos, Febre recorrente, ou doença de Lyme); ou doenças causadas por protozoários (por exemplo, Malária, tripanossomíase afri- cana, Nagana, doença de Chagas, Leishmaniose, Piroplasmose, Filari- ose bancroftiana, ou Filariose brugiana).
C. Métodos de Aplicação
[00246] Um patógeno ou vetor de patógeno descrito aqui pode ser exposto a qualquer uma das composições descritas aqui em qualquer maneira adequada que permita entregar ou administrar a composição ao patógeno ou vetor de patógeno. A composição de controle de pató- genos pode ser entregue sozinha ou em combinação com outras subs- tâncias ativas (por exemplo, agentes pesticidas) ou inativas e pode ser aplicada por, por exemplo, pulverização, microinjeção, através de plan- tas, vertimento, imersão, na forma de líquidos concentrados, géis, solu- ções, suspensões, pulverizações, pós, péletes, briquetes, tijolos e simi- lares, formulados para entregar uma concentração eficaz da composi-
ção de controle de patógenos. Quantidades e localizações para aplica- ção das composições descritas aqui são geralmente determinados pe- los hábitos do patógeno ou vetor de patógeno, pela etapa do ciclo de vida no qual o patógeno ou vetor de patógeno pode ser visado pela composição de controle de patógenos, pelo local onde a aplicação é para ser feita e pelas características físicas e funcionais da composição de controle de patógenos. As composições de controle de patógenos descritas aqui podem ser administrados ao patógeno ou vetor de pató- geno por ingestão oral, mas podem ser também administrados por meios que permitam a penetração através da cutícula ou penetração do patógeno ou vetor de patógeno no sistema respiratório.
[00247] Em alguns casos, o patógeno ou vetor de patógeno pode ser simplesmente "embebido" ou "pulverizado" com uma solução incluindo a composição de controle de patógenos. Alternativamente, a composi- ção de controle de patógenos pode ser ligada a um componente alimen- tar (por exemplo, comestível) do patógeno ou vetor de patógeno para facilidade de entrega e/ou de modo a aumentar a captação da compo- sição de controle de patógenos pela praga. Os métodos para introdução oral incluem, por exemplo, mistura direta de uma composição de con- trole de patógenos com o alimento do patógeno ou vetor de patógeno, pulverização da composição de controle de patógenos no habitat ou área do patógeno ou vetor de patógeno, bem como abordagens mani- puladas nas quais uma espécie que é usada como alimento é manipu- lada para expressar uma composição de controle de patógenos, depois alimentada ao patógeno ou vetor de patógeno a ser afetado. Em alguns casos, por exemplo, a composição de controle de patógenos pode ser incorporada no, ou sobreposta sobre a, dieta do patógeno ou vetor de patógeno. Por exemplo, a composição de controle de patógenos pode ser pulverizada em uma área de culturas que um patógeno ou vetor de patógeno habita.
[00248] Em alguns casos, a composição é pulverizada diretamente em uma planta, por exemplo, culturas, por, por exemplo, pulverização de mochila, pulverização aérea, pulverização/empoeiramento de cultu- ras, etc. Nos casos onde a composição de controle de patógenos é ad- ministrada a uma planta, a planta recebendo a composição de controle de patógenos pode estar em qualquer etapa de crescimento da planta. Por exemplo, as composições de controle de patógenos formuladas po- dem ser aplicadas como um revestimento de sementes ou tratamento de raízes em etapas precoces do crescimento da planta ou como um tratamento total da planta em etapas mais tardias do ciclo da cultura. Em alguns casos, a composição de controle de patógenos pode ser apli- cada como um agente tópico a uma planta, tal que o patógeno ou vetor de patógeno ingira ou de outro modo entre em contato com a planta após interagir com a planta.
[00249] — Além disso, a composição de controle de patógenos pode ser aplicada (por exemplo, no solo no qual uma planta cresce ou na água que é usada para regar a planta) como um agente sistêmico que é absorvido e distribuído através dos tecidos de um patógeno ou vetor de patógeno de plantas ou animais, tal que um patógeno ou vetor de patógeno se alimentando dela obterá uma dose eficaz da composição de controle de patógenos. Em alguns casos, plantas ou organismos ali- mentares podem ser geneticamente transformados para expressar a composição de controle de patógenos tal que um patógeno ou vetor de patógeno se alimentando da planta ou organismo alimentar ingerirá a composição de controle de patógenos.
[00250] A liberação retardada ou contínua pode ser também alcan- çada por revestimento da composição de controle de patógenos ou uma composição com a(s) composição(ões) de controle de patógenos com uma camada de revestimento dissolvível ou bioerodível, tal como gela- tina, revestimento esse que se dissolve ou corrói no ambiente de uso,
para depois tornar disponível a composição de controle de patógenos ou por dispersão do agente em uma matriz dissolvível ou erodível. Tais meios de liberação e/ou dispensa contínuos podem ser vantajosamente empregues para manter consistentemente uma concentração eficaz de uma ou mais das composições de controle de patógenos descritas aqui em um habitat de patógeno ou vetor de patógeno específico.
[00251] A composição de controle de patógenos pode ser também incorporada no meio no qual o patógeno ou vetor de patógeno cresce, vive, se reproduz, se alimenta ou infesta. Por exemplo, uma composição de controle de patógenos pode ser incorporada em um recipiente de comida, estação de alimentação, embalagem protetora ou uma colmeia. Para algumas aplicações, a composição de controle de patógenos pode ser ligada a um suporte sólido para aplicação na forma de pó ou em uma armadilha ou estação de alimentação. Como exemplo, para aplica- ções onde a composição é para ser usada em uma armadilha ou como isca para um patógeno ou vetor de patógeno particular, as composições podem ser também ligadas a um suporte sólido ou encapsuladas em um material de liberação temporal. Por exemplo, as composições des- critas aqui podem ser administradas por entrega da composição a pelo menos um habitat onde um patógeno ou vetor de patógeno agrícola cresce, vive, se reproduz ou se alimenta.
[00252] Os pesticidas são frequentemente recomendados para apli- cação no campo como uma quantidade de pesticida por hectare (g/ha ou kg/ha) ou a quantidade de ingrediente ativo ou equivalente de ácido por hectare (kg de a.i./ha ou g de a.i./ha). Em alguns casos, uma quan- tidade mais baixa de pesticida nas presentes composições pode ser re- querida para ser aplicada ao solo, meios de plantas, sementes, tecido de plantas ou plantas para se alcançarem os mesmos resultados como onde o pesticida é aplicado em uma composição não tendo PMPs. Por exemplo, a quantidade de agente pesticida pode ser aplicada a níveis de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 50 ou 100 vezes (ou qualquer gama entre cerca de 2 e cerca de 100 vezes, por exemplo cerca de 2 a 10 vezes; cerca de 5 a 15 vezes, cerca de 10 a 20 vezes; cerca de 10 a 50 vezes) menos do que o mesmo agente pesticida apli- cado em uma composição diferente de PMP, por exemplo, aplicação direta do mesmo agente pesticida. As composições de controle de pa- tógenos divulgadas aqui podem ser aplicadas a uma variedade de quan- tidades por hectare, por exemplo a cerca de 0,0001, 0,001, 0,005, 0,01, 0,1, 1,2, 10, 100, 1.000, 2.000, 5.000 (ou qualquer gama entre cerca de 0,0001 e 5.000) kg/ha. Por exemplo, cerca de 0,0001 a cerca de 0,01, cerca de 0,01 a cerca de 10, cerca de 10 a cerca de 1.000, cerca de
1.000 a cerca de 5.000 kg/ha. IV. Patógenos ou Seus Vetores
[00253] As composições de controle de patógenos e métodos relaci- onados descritos aqui são úteis para diminuir a aptidão de um patógeno de animais e deste modo tratar ou prevenir infeções em animais. Exem- plos de patógenos de animais, ou seus vetores, que podem ser tratadas com as presentes composições ou métodos relacionados são ainda descritos aqui. A. Fungos
[00254] As composições de controle de patógenos e métodos relaci- onados podem ser úteis para diminuir a aptidão de um fungo, por exem- plo, para prevenir ou tratar uma infeção fúngica em um animal. Estão incluídos métodos para entregar uma composição de controle de pató- genos a um fungo por contato do fungo com a composição de controle de patógenos. Adicionalmente ou alternativamente, os métodos incluem prevenir ou tratar uma infeção fúngica (por exemplo, causada por um fungo descrito aqui) em um animal em seu risco ou com sua necessi- dade, por administração ao animal de uma composição de controle de patógenos.
[00255] As composições de controle de patógenos e métodos relaci- onados são adequados para tratamento ou prevenção de infeções fún- gicas em animais, incluindo infeções causadas por fungos pertencendo a Ascomycota (Fusarium oxysporum, Pneumocystis jirovecii, Asper- gillus spp., Coccidioides immitis/posadasii, Candida albicans), Basidio- mycota (Filobasidiella neoformans, Trichosporon), Microsporidia (En- cephalitozoon cuniculi, Enterocytozoon bieneusi), Mucoromycotina (Mu- cor circinelloides, Rhizopus oryzae, Lichtheimia corymbifera).
[00256] Em alguns casos, a infeção fúngica é uma causada por um pertencendo ao filo Ascomycota, Basidomycota, Chytridiomycota, Mi- crosporidia ou Zygomycota. A infeção ou sobrecrescimento fúngico pode incluir uma ou mais espécies fúngicas, por exemplo, Candida albi- cans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata, C. auris, C. krusei, Sac- charomyces cerevisiae, Malassezia globose, M. restricta, ou De- baryomyces hansenii, Gibberella moniliformis, Alternaria brassicicola, Cryptococcus neoformans, Pneumocystis carinii, P. jirovecii, P. murina, P. oryctolagi, P. wakefieldiae, e Aspergillus clavatus. As espécies fúngi- cas podem ser consideradas um patógeno ou um patógeno oportunista.
[00257] Em alguns casos, a infeção fúngica é causada por um fungo no gênero Candida (isto é, uma infeção por Candida). Por exemplo, uma infeção por Candida pode ser causada por um fungo no gênero Candida que é selecionado do grupo consistindo em C. albicans, C. glabrata, C. dubliniensis, C. krusei, C. auris, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. ortho- psilosis, C. guilliermondii, C. rugose, e C. lusitaniae. Candida infeções que podem ser tratadas pelos métodos divulgados aqui incluem, mas não estão limitados a, candidemia, candidíase orofaríngea, candidíase esofágica, candidíase mucosal, candidíase genital, candidíase vulvova- ginal, candidíase retal, candidíase hepática, candidíase renal, candidí- ase pulmonar, candidíase esplênica, otomicose, osteomielite, artrite séptica, candidíase cardiovascular (por exemplo, endocardite) e candi- díase invasiva. B. Bactérias
[00258] As composições de controle de patógenos e métodos relaci- onados podem ser úteis para diminuir a aptidão de uma bactéria, por exemplo, para prevenir ou tratar uma infeção bacteriana em um animal. Estão incluídos métodos para administrar uma composição de controle de patógenos a uma bactéria por contato da bactéria com a composição de controle de patógenos. Ainda ou alternativamente, os métodos in- cluem prevenir ou tratar uma infeção bacteriana (por exemplo, causada por uma bactéria descrita aqui) em um animal em seu risco ou com sua necessidade, por administração ao animal de uma composição de con- trole de patógenos.
[00259] As composições de controle de patógenos e métodos relaci- onados são adequados para prevenir ou tratar uma infeção bacteriana em animais causada por qualquer bactéria descrita ainda em baixo. Por exemplo, a bactéria pode ser uma pertencendo a Bacillales (B. anthra- cis, B. cereus, S. aureus, L. monocytogenes), Lactobacillales (S. pneu- moniae, S. pyogenes), Clostridiales (C. botulinum, C. difficile, C. perfrin- gens, C. tetani), Spirochaetales (Borrelia burgdorferi, Treponema palli- dum), Chlamydiales (Chlamydia trachomatis, Chlamydophila psittaci), Actinomycetales (C. diphtheriae, Mycobacterium tuberculosis, M. avium), Rickettsiales (R. prowazekii, R. rickettsii, R. typhi, A. phago- cytophilum, E. chaffeensis), Rhizobiales (Brucella melitensis), Burkhol- deriales (Bordetella pertussis, Burkholderia mallei, B. pseudomallei), Neisseriales (Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis), Campylobactera- les (Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori), Legionellales (Legionella pneumophila), Pseudomonadales (A. baumannii, Moraxella catarrhalis, P. aeruginosa), Aeromonadales (Aeromonas sp.), Vibrionales (Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus), Thiotrichales, Pasteurellales (Hae- mophilus influenzae), Enterobacteriales (Klebsiella pneumoniae, Pro- teus mirabilis, Yersinia pestis, Y. enterocolitica, Shigella flexneri, Salmo- nella enterica, E. coli).
[00260] Em alguns casos, a bactéria é Pseudomonas aeruginosa ou Escherichia coli. C. Insetos Parasitários
[00261] As composições de controle de patógenos e métodos relaci- onados podem ser úteis para diminuir a aptidão de um inseto parasitário, por exemplo, para prevenir ou tratar uma infeção por inseto parasitário em um animal. O termo "inseto" inclui qualquer organismo pertencendo ao filo Arthropoda e à classe Insecta ou à classe Arachnida, em qualquer etapa de desenvolvimento, isto é, insetos imaturos e adultos. Estão in- cluídos métodos para entregar uma composição de controle de patóge- nos a um inseto por contato do inseto com a composição de controle de patógenos. Adicionalmente ou alternativamente, os métodos incluem prevenir ou tratar uma infeção por inseto parasitário (por exemplo, cau- sada por um inseto parasitário descrito aqui) em um animal em seu risco ou com sua necessidade, por administração ao animal de uma compo- sição de controle de patógenos.
[00262] As composições de controle de patógenos e métodos relaci- onados são adequados para prevenir ou tratar infeção em animais por um inseto parasitário, incluindo infeções por insetos pertencendo a Phthiraptera: Anoplura (Piolho sugador), Ischnocera (Piolho Mastiga- dor), Amblycera (Piolho Mastigador). Siphonaptera: Pulicidae (Pulgas do gato), Ceratophyllidae (Pulgas da galinha). Diptera: Culicidae (Mos- quitos), Ceratopogonidae (Mosquitos), Psychodidae (Flebotomíneos), Simuliidae (Moscas negras), Tabanidae (Moscas do cavalo), Muscidae (Moscas do cavalo, etc.), Calliphoridae (Borboletas), Glossinidae (Mos-
cas tsé-tsé), Oestridae (Moscas-do-mato), Hippoboscidae (Moscas-pio- lho). Hemiptera: Reduviidae (Percevejos assassinos), Cimicidae (Per- cevejos). Arachnida: Sarcoptidae (Ácaros sarcóticos), Psoroptidae (Ácaros psorópticos), Cytoditidae (Ácaros do saco de ar), Laminosioptes (Ácaros dos cistos), Analgidae (Ácaros das penas), Acaridae (Ácaros dos grãos), Demodicidae (Ácaros do folículo piloso), Cheyletiellidae (Ácaros do pelo), Trombiculidae (Trombiculídeos), Dermanyssidae (Ácaros das aves), Macronyssidae (Ácaros das aves), Argasidae (Car- rapatos moles), Ixodidae (Carrapatos duros). D. Protozoários
[00263] As composições de controle de patógenos e métodos relaci- onados podem ser úteis para diminuir a aptidão de um protozoário pa- rasitário, por exemplo, para prevenir ou tratar uma infeção por protozo- ário parasitário em um animal. O termo "protozoário" inclui qualquer or- ganismo pertencendo ao filo Protozoa. Estão incluídos métodos para entregar uma composição de controle de patógenos a um protozoário parasitário por contato do protozoário parasitário com a composição de controle de patógenos. Adicionalmente ou alternativamente, os métodos incluem prevenir ou tratar uma infeção protozoária (por exemplo, cau- sada por um protozoário descrito aqui) em um animal em seu risco ou com sua necessidade, por administração ao animal de uma composição de controle de patógenos.
[00264] As composições de controle de patógenos e métodos relaci- onados são adequados para prevenir ou tratar infeção por protozoários parasitários em animais, incluindo protozoários pertencendo a Eugle- nozoa (Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei, Leishmania spp.), He- terolobosea (Naegleria fowleri), Diplomonadida (Giardia intestinalis), Amoebozoa (Acanthamoeba castellanii, Balamuthia mandrillaris, Enta- moeba histolytica), Blastocystis (Blastocystis hominis), Apicomplexa (Babesia microti, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis,
Plasmodium spp., Toxoplasma gondii). E. Nematódeos
[00265] As composições de controle de patógenos e métodos relaci- onados podem ser úteis para diminuir a aptidão de um nematódeo pa- rasitário, por exemplo, para prevenir ou tratar uma infeção por nemató- deo parasitário em um animal. Estão incluídos métodos para entregar uma composição de controle de patógenos a um nematódeo parasitário por contato do nematódeo parasitário com a composição de controle de patógenos. Ainda ou alternativamente, os métodos incluem prevenir ou tratar uma infeção por nematódeo parasitário (por exemplo, causada por um nematódeo parasitário descrito aqui) em um animal em seu risco ou com sua necessidade, por administração ao animal de uma composição de controle de patógenos.
[00266] As composições de controle de patógenos e métodos relaci- onados são adequados para prevenir ou tratar infeção por nematódeos parasitários em animais, incluindo nematódeos pertencendo a Nema- toda (lombrigas): Angiostrongylus cantonensis (lagarta de rato), Ascaris lumbricoides (lombriga de humano), Baylisascaris procyonis (lombiga de guaxinim), Trichuris trichiura (lagarta de humano), Trichinella spiralis, Strongyloides stercoralis, Wuchereria bancrofti, Brugia malayi, Ancylos- toma duodenale and Necator americanus (ancilóstomo de humano), Cestoda (tênias): Echinococcus granulosus, Echinococcus multilocula- ris, Taenia solium (tênia de porco). F. Vírus
[00267] As composições de controle de patógenos e métodos relaci- onados podem ser úteis para diminuir a aptidão de um vírus, por exem- plo, para prevenir ou tratar uma infeção viral em um animal. Estão inclu- ídos métodos para entregar uma composição de controle de patógenos a um vírus por contato do vírus com a composição de controle de pató-
genos. Adicionalmente ou alternativamente, os métodos incluem preve- nir ou tratar uma infeção viral (por exemplo, causada por um vírus des- crito aqui) em um animal em seu risco ou com sua necessidade, por administração ao animal de uma composição de controle de patógenos.
[00268] As composições de controle de patógenos e métodos relaci- onados são adequados para prevenir ou tratar uma infeção viral em ani- mais, incluindo infeções por vírus pertencendo a vírus de DNA: Parvo- viridae, Papillomaviridae, Polyomaviridae, Poxviridae, Herpesviridae; Vírus de RNA de fita negativa de fita única: Arenaviridae, Paramyxoviri- dae (Rubulavírus, Respirovírus, Pneumovírus, Moribilivírus), Filoviridae (Marburgvírus, Ebolavírus), Bornaoviridae, Rhabdoviridae, Orthomyxo- viridae, Bunyaviridae, Nairovírus, Hantunyavírus, Hantunyavírus. Vírus de RNA de fita positiva de fita única: Astroviridae, Coronaviridae, Calici- viridae, Togaviridae (Rubivírus, Alfavírus), Flaviviridae (Hepacivírus, Flavivírus), Picornaviridae (Hepatovírus, Rinovírus, Enterovírus); ou Ví- rus de dsRNA e Retrotranscritos: Reoviridae (Rotavírus, Coltivírus, Se- adornavírus), Retroviridae (Deltarretrovírus, Lentivírus), Hepadnaviridae (Orto-hepadnavírus).
G. Vetores de Patógenos
[00269] Os métodos e composições proporcionados aqui podem ser úteis para diminuir a aptidão de um vetor para um patógeno de animais. Em alguns casos, o vetor pode ser um inseto. Por exemplo, o vetor de insetos pode incluir aqueles, mas não está limitado àqueles, com apa- relhos bucais perfurantes-sugadores, como encontrado em Hemiptera e alguns Hymenoptera e Diptera tais como mosquitos, abelhas, vespas, mosquitos, piolhos, mosca tsé-tsé, pulgas e formigas, bem como mem- bros dos Arachnidae tais como carrapatos e ácaros; ordem, classe ou família de Acarina (carrapatos e ácaros), por exemplo representantes das famílias Argasidae, Dermanyssidae, Ixodidae, Psoroptidae ou Sar- coptidae e representantes das espécies Amblyomma spp., Anocenton
Spp., Argas spp., Boophilus spp., Cheyletiella spp., Chorioptes spp., De- modex spp., Dermacentor spp., Denmanyssus spp., Haemophysalis spp., Hyalomma spp., Ixodes spp., Lynxacarus spp., Mesostigmata Spp., Notoednes spp., Ornithodoros spp., Ornithonyssus spp., Otobius Spp., otodectes spp., Pneumonyssus spp., Psoroptes spp., Rhipicephalus spp., Sancoptes spp., ou Trombicula spp.; Anoplura (piolho sugador e mordedor), por exemplo, representantes das espécies Bovicola Spp., Haematopinus spp., Linognathus spp., Menopon spp., Pediculus Spp., Pemphigus spp., Phylloxera spp., ou Solenopotes spp.; Diptera (mos- cas), por exemplo, representantes das espécies Aedes spp., Anopheles spp., Calliphora spp., Chrysomyia spp., Chrysops spp., Cochliomyia spp., Cw/ex spp., Culicoides spp., Cuterebra spp., Dermatobia Spp., Gastrophilus spp., Glossina spp., Haematobia spp., Haematopota sSpp., Hippobosca spp., Hypoderma spp., Lucilia Sspp., Lyperosia spp., Me- lophagus spp., Oestrus spp., Phaenicia spp., Phlebotomus spp., Phor- mia spp., Acari (sarna sarcótica) por exemplo, Sarcoptidae spp., Sar- cophaga spp., Simulium spp., Stomoxys spp., Tabanus spp., Tannia spp. ou Zzpu/alpha spp.; Mallophaga (piolho mordedor), por exemplo, representantes das espécies Damalina spp., Felicola spp., Heterodoxus Spp. or Trichodectes spp.; ou Siphonaptera (insetos sem asas), por exemplo, representantes das espécies Ceratophyllus spp., Xenopsylla spp; Cimicidae (bichos verdadeiros), por exemplo, representantes das espécies Cimex spp., Tritominae spp., Rhodinius spp. ou Triatoma spp.
[00270] Em alguns casos, o inseto é um inseto sugador de sangue da ordem Diptera (por exemplo, subordem Nematocera, por exemplo, família Colicidae). Em alguns casos, o inseto é das subfamílias Culici- nae, Corethrinae, Ceratopogonidae, ou Simuliidae. Em alguns casos, o inseto é de uma Culex spp., Theobaldia spp., Aedes spp., Anopheles Spp., Aedes spp., Forciponiyia spp., Culicoides spp., ou Helea spp.
[00271] Em certos casos, o inseto é um mosquito. Em certos casos,
o inseto é um carrapato. Em certos casos, o inseto é um ácaro. Em cer- tos casos, o inseto é um piolho mordedor. V. Agentes Funcionais Heterólogos
[00272] As composições de controle de patógenos descritas aqui po- dem incluir ainda um agente adicional, tal como um agente funcional heterólogo (por exemplo, agente antifúngico, um agente antibacteriano, um agente virucida, um agente antiviral, um agente inseticida, um agente nematicida, um agente antiparasitário ou um repelente de inse- tos). Em alguns casos, o agente funcional heterólogo (por exemplo, agente antifúngico, um agente antibacteriano, um agente virucida, um agente antiviral, um agente inseticida, um agente nematicida, um agente antiparasitário ou um repelente de insetos) está incluído no PMP. Por exemplo, o PMP pode encapsular o agente funcional heterólogo (por exemplo, agente antifúngico, um agente antibacteriano, um agente viru- cida, um agente antiviral, um agente inseticida, um agente nematicida, um agente antiparasitário ou um repelente de insetos). Alternativa- mente, o agente funcional heterólogo (por exemplo, agente antifúngico, um agente antibacteriano, um agente virucida, um agente antiviral, um agente inseticida, um agente nematicida, um agente antiparasitário ou um repelente de insetos) pode estar embebido na ou conjugado à su- perfície do PMP. Em alguns casos, a composição de controle de pató- genos inclui dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais do que 10) diferentes agentes funcionais heterólogos.
[00273] Em outros casos, a composição de controle de patógenos pode ser formulada para incluir o agente funcional heterólogo (por exemplo, agente antifúngico, um agente antibacteriano, um agente viru- cida, um agente antiviral, um agente inseticida, um agente nematicida, um agente antiparasitário ou repelente de insetos), sem necessaria- mente estar associado ao PMP. Em formulações e nas formas de uso preparadas a partir destas formulações, a composição de controle de patógenos pode incluir compostos ativos adicionais, tais como antibac- terianos, inseticidas, esterilizantes, acaricidas, nematicidas, moluscici- das, bactericidas, fungicidas, virucidas, atratores ou repelentes.
[00274] O agente pesticida pode incluir um agente adequado para entrega a um vetor de um patógeno de animais, por exemplo, um agente pesticida, tal como um agente antifúngico, um agente antibacteriano, um agente inseticida, um agente moluscicida, um agente nematicida, um agente virucida ou uma sua combinação. O agente pesticida pode ser um agente químico, tal como aqueles bem conhecidos na técnica. O agente pesticida pode ser um agente que pode diminuir a aptidão de uma variedade de patógenos de animais, ou seus vetores, ou pode ser um que visa um ou mais patógenos de animais, ou seus vetores, espe- cíficos (por exemplo, uma espécie ou gênero de patógenos, ou seus vetores, específico).
[00275] —Alternativamente ou adicionalmente, o agente funcional he- terólogo (por exemplo, agente antifúngico, um agente antibacteriano, um agente virucida, um agente antiviral, um agente inseticida, um agente nematicida, um agente antiparasitário ou um repelente de inse- tos) pode ser um peptídeo, um polipeptídeo, um ácido nucleico, um po- linucleotídeo ou uma molécula pequena. Em alguns casos, o agente funcional heterólogo pode ser modificado. Por exemplo, a modificação pode ser uma modificação química, por exemplo, conjugação a um mar- cador, por exemplo, marcador fluorescente ou um marcador radioativo. Em outros exemplos, a modificação pode incluir conjugação ou ligação operacional a uma fração que intensifica a estabilidade, entrega, direci- onamento, biodisponibilidade ou meia-vida do agente, por exemplo, um lipídeo, uma glicana, um polímero (por exemplo, PEG), uma porção ca- tiônica.
[00276] Exemplos de agentes funcionais heterólogos (por exemplo, agente antifúngico, um agente antibacteriano, um agente virucida, um agente antiviral, um agente inseticida, um agente nematicida, um agente antiparasitário ou um repelente de insetos) que podem ser usados nas composições e métodos de controle de patógenos presentemente divul- gados são delineados em baixo. A. Agentes antibacterianos
[00277] Ascomposições de controle de patógenos descritas aqui po- dem incluir ainda um agente antibacteriano. Por exemplo, uma compo- sição de controle de patógenos incluindo um antibiótico como descrito aqui pode ser administrada a um animal em uma quantidade e durante um tempo suficientes para: alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de antibiótico dentro do ou no animal; e/ou tratar ou prevenir uma infeção bacteriana no ani- mal. Os antibacterianos descritos aqui podem ser formulados em uma composição de controle de patógenos para qualquer um dos métodos descritos aqui e, em certos casos, podem estar associados ao seu PMP. Em alguns casos, as composições de controle de patógenos incluem dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais do que 10) diferentes agentes antibacterianos.
[00278] “Como usado aqui, o termo "agente antibacteriano" se refere a um material que mata ou inibe o crescimento, proliferação, divisão, reprodução ou propagação de bactérias, tais como bactérias fitopatogê- nicas, e inclui agentes bactericidas (por exemplo, compostos desinfe- tantes, compostos antissépticos ou antibióticos) ou bacteriostáticos (por exemplo, compostos ou antibióticos). Os antibióticos bactericidas ma- tam as bactérias, enquanto os antibióticos bacteriostáticos somente abrandam seu crescimento ou reprodução.
[00279] Os bactericidas podem incluir desinfetantes, antissépticos ou antibióticos. Os desinfetantes mais usados podem incluir: cloro ativo (isto é, hipocloritos (por exemplo, hipoclorito de sódio), cloraminas, di- cloroisocianurato e tricloroisocianurato, cloro úmido, dióxido de cloro,
etc.), oxigênio ativo (peróxidos, tais como ácido peracético, persulfato de potássio, perborato de sódio, percarbonato de sódio e peridrato de ureia), iodo (iodopovidona (povidona-iodo, Betadine), solução de Lugol, tintura de iodo, tensoativos não iônicos iodados), álcoois concentrados (maioritariamente etanol, 1-propanol, também chamado n-propanol e 2- propanol, chamado isopropanol e suas misturas; ainda são usados 2- fenoxietanol e 1- e 2-fenoxipropanóis), substâncias fenólicas (tais como fenol (também chamado ácido carbólico), cresóis (chamados Lisol em combinação com sabões de potássio líquidos), fenóis halogenados (clo- rados, bromados), tais como hexaclorofeno, triclosano, triclorofenol, tri- bromofenol, pentaclorofenol, Dibromol e seus sais), tensoativos catiôni- cos, tais como alguns cátions de amônio quaternário (tais como cloreto de benzalcônio, brometo ou cloreto de cetiltrimetilamônio, cloreto de di- decildimetilamônio, cloreto de cetilpiridínio, cloreto de benzetônio) e ou- tros, compostos não quaternários, tais como clorexidina, glucoprota- mina, di-hidrocloreto de octenidina, etc.), oxidantes fortes, tais como ozônio e soluções de permanganato; metais pesados e seus sais, tais como prata coloidal, nitrato de prata, cloreto de mercúrio, sais de fenil- mercúrio, sulfato de cobre, cloreto-óxido de cobre, hidróxido de cobre, octanoato de cobre, sulfato de oxicloreto de cobre, sulfato de cobre, sul- fato de cobre penta-hidratado, etc. Metais pesados e seus sais são os bactericidas mais tóxicos e perigosos para o meio ambiente e, portanto, seu uso é fortemente oprimido ou cancelado; ainda, também ácidos for- tes apropriadamente concentrados (ácidos fosfórico, nítrico, sulfúrico, amidossulfúrico, toluenossulfônico) e alcalinos (hidróxidos de sódio, po- tássio, cálcio).
[00280] “Como antissépticos (isto é, agentes germicidas que podem ser usados no corpo humano ou animal, pele, mucosas, feridas e simi- lares), poucos dos desinfetantes mencionados acima podem ser usa- dos, sob condições apropriadas (maioritariamente concentração, pH,
temperatura e toxicidade para homem/animal). Entre eles são importan- tes: preparações de cloro apropriadamente diluídas (isto é, solução de Daquin, solução de hipoclorito de sódio ou potássio a 0,5%, pH ajustado até pH 7-8, ou solução de benzenossulfocloramida de sódio a 0,5-1% (cloramina B)), algumas preparações de iodo, tais como a iodopovidona em vários galênicos (pomadas, soluções, pensos para feridas), no pas- sado também solução de Lugol, peróxidos como soluções de peridrato de ureia e soluções de ácido peracético tamponadas com pH a 0,1- 0,25%, álcoois com ou sem aditivos antissépticos, usados maioritaria- mente para antissepsia da pele, ácidos orgânicos fracos tais como ácido sórbico, ácido benzoico, ácido láctico e ácido salicílico, alguns compos- tos fenólicos, tais como hexaclorofeno, triclosano e dibromol, e compos- tos ativos catiônicos, tais como soluções de benzalcônio a 0,05-0,5%, clorexidina a 0,5-4%, octenidina a 0,1-2%.
[00281] A composição de controle de patógenos descrita aqui pode incluir um antibiótico. Pode ser usado qualquer antibiótico conhecido na técnica. Os antibióticos são comumente classificados com base em seu mecanismo de ação, estrutura química ou espectro de atividade.
[00282] Oantibiótico descrito aqui pode visar qualquer função ou pro- cessos de crescimento bacterianos e pode ser bacteriostático (por exemplo, abranda ou previne o crescimento bacteriano) ou bactericida (por exemplo, mata bactérias). Em alguns casos, o antibiótico é um an- tibiótico bactericida. Em alguns casos, o antibiótico bactericida é um que visa a parede da célula bacteriana (por exemplo, penicilinas e cefalos- porinas); um que visa a membrana celular (por exemplo, polimixinas); ou um que inibe enzimas bacterianas essenciais (por exemplo, rifamici- nas, lipiarmicinas, quinolonas e sulfonamidas). Em alguns casos, o an- tibiótico bactericida é um aminoglicosídeo (por exemplo, casugamicina). Em alguns casos, o antibiótico é um antibiótico bacteriostático. Em al- guns casos, o antibiótico bacteriostático visa a síntese de proteínas (por exemplo, macrolídeos, lincosamidas e tetraciclinas). Classes adicionais de antibióticos que podem ser usados aqui incluem lipopeptídeos cícli- cos (tais como daptomicina), glicilciclinas (tais como tigeciclina), oxazo- lidinonas (tais como linezolida) ou lipiarmicinas (tais como fidaxomicina). Exemplos de antibióticos incluem rifampicina, ciprofloxacina, doxiciclina, ampicilina e polimixina B. O antibiótico descrito aqui pode ter qualquer nível de especificidade pelo alvo (por exemplo, espectro estreito ou am- plo). Em alguns casos, o antibiótico é um antibiótico de espectro estreito e assim visa tipos específicos de bactérias, tais como bactérias Gram- negativas ou Gram-positivas. Alternativamente, o antibiótico pode ser um antibiótico de espectro amplo que visa uma gama ampla de bacté- rias. Em alguns casos, o antibiótico é doxorrubicina ou vancomicina.
[00283] “Exemplos de agentes antibacterianos adequados para o tra- tamento de animais incluem Penicilinas (Amoxicilina, Ampicilina, Ba- campicilina, Carbenicilina, Cloxacilina, Dicloxacilina, Flucloxacilina, Mezlocilina, Nafcilina, Oxacilina, Penicilina G, Cristicilina 300 AS, Pen- tids, Permapeno, Pfizerpeno, Pfizerpeno-AS, Vicilina, Penicilina V, Pi- peracilina, Pivampicilina, Pivmecilinam, Ticarcilina), Cefalosporinas (Ce- facetril (cefacetrilo), Cefadroxil (cefadroxil), Cefalexina (cefalexina), Ce- faloglicina (cefaloglicina), Cefalônio (cefalônio), Cefaloridina (cefalora- dina), Cefalotina (cefalotina), Cefapirina (cefapirina), Cefatrizina, Cefa- zaflur, Cefazedona, Cefazolina (cefazolina), Cefradina (cefradina), Ce- froxadina, Ceftezol, Cefaclor, Cefamandol, Cefmetazol, Cefonicid, Ce- fotetano, Cefoxitina, Cefprozil (cefproxil), Cefuroxima, Cefuzonam, Cefcapeno, Cefdaloxima, Cefdinir, Cefditoreno, Cefetamete, Cefixima, Cefmenoxima, Cefodizima, Cefotaxima, Cefpimizol, Cefpodoxima, Cef- teram, Ceftibuteno, Ceftiofur, Ceftioleno, Ceftizoxima, Ceftriaxona, Ce- foperazona, Ceftazidima, Cefclidina, Cefepima, Cefluprenam, Cefoselis, Cefozoprano, Cefpirom, Cefquinome, Ceftobiprol, Ceftarolina, Cefaclo- mezina, Cefaloram, Cefaparol, Cefcanel, Cefedrolor, Cefempidona,
Cefetrizol, Cefivitril, Cefmatileno, Cefmepídio, Cefovecina, Cefoxazol, Cefrotil, Cefsumida, Cefuracetima, Ceftioxida, Combinações, Ceftazi- dima/Avibactam, Ceftolozano/Tazobactam, Monobactamas (Aztreo- nam), Carbapenêmicos (Imipenem, Imipenem/cilastatina, Doripenem, Ertapenem, Meropenem, Meropenem/vaborbactam), Macrolídeo (Azi- tromicina, Eritromicina, Claritromicina, Diritromicina, Roxitromicina, Te- litromicina), Lincosamidas (Clindamicina, Lincomicina), Estreptogrami- nas (Pristinamicina, Quinupristina/dalfopristina), Aminoglicosídeo (Ami- cacina, Gentamicina, Canamicina, Neomicina, Netilmicina, Paromomi- cina, Estreptomicina, Tobramicina), Quinolona (Flumequina, Ácido nali- díxico, Ácido oxolínico, Ácido piromídico, Ácido pipemídico, Rosoxacina, Segunda Geração, Ciprofloxacina, Enoxacina, Lomefloxacina, Nadi- floxacina, Norfloxacina, Ofloxacina, Pefloxacina, Rufloxacina, Balofloxa- cina, Gatifloxacina, Grepafloxacina, Levofloxacina, Moxifloxacina, Pazu- floxacina, Sparfloxacina, Temafloxacina, Tosufloxacina, Besifloxacina, Delafloxacina, Clinafloxacina, Gemifloxacina, Prulifloxacina, Sitafloxa- cina, Trovafloxacina), Sulfonamidas (Sulfametizol, Sulfametoxazol, Sul- fisoxazol, Trimetoprim-Sulfametoxazol), Tetraciclina (Demeclociclina, Doxiciclina, Minociclina, Oxitetraciclina, Tetraciclina, Tigeciclina), Outros (Lipopeptídeos, Fluoroquinolona, Lipoglicopeptídeos, Cefalosporina, Macrocíclicos, Cloranfenicol, Metronidazol, Tinidazol, Nitrofurantoína, Glicopeptídeos, Vancomicina, Teicoplanina, Lipoglicopeptídeos, Tela- vancina, Oxazolidinonas, Linezolida, Ciclosserina 2, Rifamicinas, Rifam- pina, Rifabutina, Rifapentina, Rifalazil, Polipeptídeos, Bacitracina, Poli- mixina B, Tuberactinomicinas, Viomicina, Capreomicina).
[00284] Um versado na técnica apreciará que uma concentração adequada de cada antibiótico na composição depende de fatores tais como eficácia, estabilidade do antibiótico, número de antibióticos distin- tos, a formulação e métodos de aplicação da composição. B. Agentes antifúngicos
[00285] As composições de controle de patógenos descritas aqui po- dem incluir ainda um agente antifúngico. Por exemplo, uma composição de controle de patógenos incluindo um antifúngico como descrito aqui pode ser administrada a um animal em uma quantidade e durante um tempo suficiente para alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de antifúngico dentro do ou no animal; e/ou tratar ou prevenir uma infeção fúngica no animal. Os antifúngicos descritos aqui podem ser formulados em uma composição de controle de patógenos para qualquer um dos métodos descritos aqui e, em certos casos, podem estar associados ao seu PMP. Em alguns casos, as composições de controle de patógenos incluem dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais do que 10) diferentes agentes antifúngicos.
[00286] Como usado aqui, o termo "fungicida" ou "agente antifún- gico" se refere a uma substância que mata ou inibe o crescimento, pro- liferação, divisão, reprodução ou propagação de fungos, tais como fun- gos que são patogênicos para animais. Muitos tipos diferentes de agen- tes antifúngicos foram produzidos comercialmente. Exemplos não limi- tantes de agentes antifúngicos incluem: Alilaminas (Amorolfina, Butena- fina, Naftifina, Terbinafina), Imidazóis (Bifonazol, Butoconazol, Clotri- mazol, Econazol, Fenticonazol, Cetoconazol, Isoconazol, Luliconazol, Miconazol, Omoconazol, Oxiconazol, Sertaconazol, Sulconazol, Tioco- nazol, Terconazol); Triazóis (Albaconazol, Efinaconazol, Fluconazol, Isavuconazol, ltraconazol, Posaconazol, Ravuconazol, Terconazol, Vo- riconazol), Tiazóis (Abafungina), Polienos (Anfotericina B, Nistatina, Na- tamicina, Tricomicina), Equinocandinas (Anidulafungina, Caspofungina, Micafungina), Outros (Tolnaftato, Flucitosina, Butenafina, Griseofulvina, Ciclopirox, Sulfeto de selênio, Tavaborol). Um perito na técnica apreci- ará que uma concentração adequada de cada antifúngico na composi- ção depende de fatores tais como eficácia, estabilidade do antifúngico,
número de antifúngicos distintos, a formulação e métodos de aplicação da composição. C. Inseticidas
[00287] As composições de controle de patógenos descritas aqui po- dem incluir ainda um inseticida. Por exemplo, o inseticida pode diminuir a aptidão de (por exemplo, diminuir o crescimento ou matar) um vetor de insetos de um patógeno de animais. Uma composição de controle de patógenos incluindo um inseticida como descrito aqui pode ser conta- tado com um inseto, em uma quantidade e durante tempo suficientes para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de inseticidas dentro do ou no inseto; e (b) diminuir a aptidão do inseto. Em alguns casos, o inseticida pode diminuir a aptidão de (por exemplo, diminuir o crescimento ou matar) um inseto parasitário. Uma composição de controle de patógenos incluindo um in- seticida como descrito aqui pode ser contatado com um inseto parasitá- rio, ou um animal infectado com ele, em uma quantidade e durante tempo suficientes para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo, um ní- vel predeterminado ou limiar) de concentração de inseticidas dentro do ou no inseto parasitário; e (b) diminuir a aptidão do inseto parasitário. Os inseticidas descritos aqui podem ser formulados em uma composi- ção de controle de patógenos para qualquer um dos métodos descritos aqui e, em certos casos, podem estar associados ao seu PMP. Em al- guns casos, as composições de controle de patógenos incluem dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais do que 10) diferentes agentes inseticidas.
[00288] “Como usado aqui, o termo "inseticida" ou "agente inseticida" se refere a uma substância que mata ou inibe o crescimento, prolifera- ção, reprodução ou propagação de insetos, tais como vetores de insetos de patógenos de animais ou insetos parasitários. Exemplos não limitan- tes de inseticidas estão listados na Tabela 1. Exemplos não limitantes adicionais de inseticidas adequados incluem biológicos, hormônios ou feromônios tais como azadiractina, espécies de Bacillus, espécies de Beauveria, codlemona, espécies de Metarrhizium, espécies de Pae- cilomyces, thuringiensis e espécies de Verticillium, e compostos ativos tendo mecanismos de ação desconhecidos ou não especificados tais como fumigantes (tais como fosfeto de alumínio, brometo de metila e fluoreto de sulfurila) e inibidores seletivos da alimentação (tais como cri- olita, flonicamida e pimetrozina). Um perito na técnica apreciará que uma concentração adequada de cada inseticida na composição de- pende de fatores tais como eficácia, estabilidade do inseticida, número de inseticidas distintos, a formulação e métodos de aplicação da com- posição.
Tabela 1. Exemplos de inseticidas cloronicotini- acetamiprida, clotianidina, dinotefurano, imidacloprida, niten- los/neonicotinoi- piram, nitiazina, tiacloprida, tiametoxam, imidaclotiz, (2E)-1- des [(2-cloro-1,3-tiazol-5-il)metil]-3,5-dimetil-N-nitro-1,3,5-tri-azi- nan-2-imina, inibidores de acetilcolinesterase (AChE) (tais como carbamatos e organofosfatos) carbamatos alanicarbe, aldicarbe, aldoxicarbe, alixicarbe, aminocarbe, bendiocarbe, benfuracarbe, bufencarbe, butacarbe, butocar- boxim, butoxicarboxim, carbaril, carbofurano, carbossulfano, cloetocarbe, dimetilano, etiofencarbe, fenobucarbe, fenotio- carbe, formetanato, furatiocarbe, isoprocarbe, metam-sódio, metiocarbe, metomil, metolcarbe, oxamil, fosfocarbe, pirimi- carbe, promecarbe, propoxur, tiodicarbe, tiofanox, triazamato, trimetacarbe, XMC, xililcarbe organofosfatos acefato, azametifos, azinfos (-metila, -etila), bromofos-etila, bromfenvinfos (-metila), butatiofos, cadusafos, carbofenoti- ona, cloretoxifos, clorfenvinfos, clormofos, clorpirifos (-metila/- etila), coumafos, cianofenfos, cianofos, demetona-S-metila, demetona-S-metilsulfona, dialifos, diazinona, diclofentiona, di-
clorvos/DDVP, dicrotofos, dimetoato, dimetilvinfos, dioxaben- zofos, dissulfotona, EPN, etiona, etoprofos, etrimfos, famfíur, fenamifos, fenitrotiona, fensulfotiona, fentiona, flupirazofos, fo- nofos, formotiona, fosmetilano, fostiazato, heptenofos, iodo- fenfos, iprobenfos, isazofos, isofenfos, O-salicilato de isopro- pila, isoxationa, malationa, mecarbam, metacrifos, metamido- fos, metidationa, mevinfos, monocrotofos, nalede, ometoato, oxidemetona-metila, parationa (-metila/-etila), fentoato, forato, fosalona, fosmete, fosfamidona, fosfocarbe, foxim, pirimifos (- metila/-etila), profenofos, propafos, propetamfos, protiofos, protoato, piraclofos, piridafentiona, piridationa, quinalfos, se- bufos, sulfotepe, sulprofos, tebupirimfos, temefos, terbufos, te- traclorvinfos, tiometona, triazofos, triclorfona, vamidotiona piretroides acrinatrina, aletrina (d-cis-trans, d-trans), cipermetrina (alfa-, beta-, teta-, zeta-), permetrina (cis-, trans-), beta-ciflutrina, bi- fentrina, bioaletrina, bioaletrina-S-ciclopentil-isômero, bioeta- nometrina, biopermetrina, biorresmetrina, chlovaportrina, cis- cipermetrina, cis-resmetrina, cis-permetrina, clocitrina, ciclo- protrina, ciflutrina, cialotrina, cifenotrina, DDT, deltametrina, empentrina (1R-isômero), esfenvalerato, etofenprox, fenflu- trina, fenpropatrina, fenpiritrina, fenvalerato, flubrocitrinato, flu- citrinato, flufenprox, flumetrina, fluvalinato, fubfenprox, gama- cialotrina, imiprotrina, cadetrina, lambda, cialotrina, metoflu- trina, fenotrina (isômero 1R-trans), praletrina, proflutrina, pro- trifenbuto, piresmetrina, resmetrina, RU 15525, silafluofeno, tau-fluvalinato, teflutrina, teraletrina, tetrametrina (1R-isô- mero), tralocitrina, tralometrina, transflutrina, ZXI 8901, piretri- nas (piretro) oxadiazinas indoxacarbe, moduladores do receptor de acetilcolina (tais A ln ciclodieno canficloro, clordano, endossulfano, gama-HCH, HCH, hep- A ua Mm OS mectinas abamectina, avermectina, emamectina, emamectina-benzo- ato, fenoxicarbe, hidropreno, quinopreno, metopreno, iver- mectina, lepimectina, epofenonano, piriproxifeno, milbemec- tina, milbemicina, tripreno benzoilureias bistrifluorona, clorfluazurona, diflubenzurona, fluazurona, fluci- cloxurona, flufenoxurona, hexaflumurona, lufenurona, novalu- rona, noviflumurona, penfluorona, teflubenzurona, triflumu- rona METIs fenazaquina, fenpiroximato, pirimidifeno, piridabeno, tebufen- pirade, tolfenpirade, rotenona, acequinocil, fluacrpirim, desre- guladores microbianos da membrana intestinal de insetos (tais como estirpes de Bacillus thuringiensis), inibidores da síntese de lipídeos (tais como ácidos tetrônicos e ácidos tetrâmicos) ácidos tetrâmicos | carbonato de cis-3-(2,5-dimetilfenil)-8-metóxi-2-0x0-1-azaes- piro [4.5]dec-3-en-4-ila e etila (sinônimo: ácido carbônico, és- ter de etila de 3-(2,5- dimetilfenil)-8-metóxi-2-0x0-1-azaespiro [4.5]dec-3-en-4-ila; No. Reg. CAS: 382608-10-8), carboxami- das (tais como flonicamida), agonistas octopaminérgicos (tais como amitraz), inibidores da ATPase estimulada por magné- sio (tais como propargite), agonistas do receptor de rianodina (tais como ftalamidas ou rinaxapir) ftalamidas N2-[1,1-dimetil-2-(metilsulfonil)etil]-3-iodo-N1- [2-metil-4-[1,2,2,2- tetrafluoro-1-(trifluorometil)etillfenil]-1,2-benzenodi-carboxamida (isto é, flubendiamida; No. reg. CAS: 272451-65-7) D. Nematicidas
[00289] As composições de controle de patógenos descritas aqui po- dem incluir ainda um nematicida. Em alguns casos, a composição de controle de patógenos inclui dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6,7,
8, 9, 10 ou mais do que 10) diferentes nematicidas. Por exemplo, o ne- maticida pode diminuir a aptidão de (por exemplo, diminuir o cresci- mento ou matar) um nematódeo parasitário. Una composição de con- trole de patógenos incluindo um nematicida como descrito aqui pode ser contatado com um nematódeo parasitário, ou um animal infectado com ele, em uma quantidade e durante tempo suficientes para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de con- centração de nematicidas dentro do ou no nematódeo alvo; e (b) dimi- nuir a aptidão do nematódeo parasitário. Os nematicidas descritos aqui podem ser formulados em uma composição de controle de patógenos para qualquer um dos métodos descritos aqui e, em certos casos, po- dem estar associados ao seu PMP.
[00290] “Como usado aqui, o termo "nematicida" ou "agente nemati- cida" se refere a uma substância que mata ou inibe o crescimento, pro- liferação, reprodução ou propagação de nematódeos, tais como um ne- matódeo parasitário. Exemplos não limitantes de nematicidas estão lis- tados na Tabela 2. Um perito na técnica apreciará que uma concentra- ção adequada de cada nematicida na composição depende de fatores tais como eficácia, estabilidade do nematicida, número de nematicidas distintos, a formulação e métodos de aplicação da composição. Tabela 2. Exemplos de Nematicidas FUMIGANTES DD, 1,3-Dicloropropeno, Dibrometo de Etileno, 1,2-Di- bromo-3-Cloropropano, Brometo de Metila, Cloropicrina, o eta Tetratiocarbonato de Sódio, Cloropicrina, CARBAMATOS Aldicarbe, Aldoxicarbe, Carbofurano, Oxamil, Cleoto- Ns age o PS SE SS ORGANOFOSFATOS Etoprofos, Fenamifos, Cadusafos, Fostiazato, Fensulfo- so Moment |
E. Agente antiparasitário
[00291] As composições de controle de patógenos descritas aqui po- dem incluir ainda um agente antiparasitário. Por exemplo, o antiparasi- tário pode diminuir a aptidão de (por exemplo, diminuir o crescimento ou matar) um protozoário parasitário. Una composição de controle de pa- tógenos incluindo um antiparasitário como descrito aqui pode ser con- tatado com um protozoário em uma quantidade e durante tempo sufici- entes para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeter- minado ou limiar) de concentração de antiparasitário dentro do ou no protozoário ou animal infectado com ele; e (b) diminuir a aptidão do pro- tozoário. Isto pode ser útil no tratamento ou prevenção de parasitas em animais. Por exemplo, uma composição de controle de patógenos inclu- indo um agente antiparasitário como descrito aqui pode ser adminis- trada a um animal em uma quantidade e durante um tempo suficientes para: alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de antiparasitário dentro do ou no animal; e/ou tratar ou prevenir uma infeção por parasitas (por exemplo, nematódeo parasitário, inseto parasitário ou protozoário) no animal. O antiparasitá- rio descrito aqui pode ser formulado em uma composição de controle de patógenos para qualquer um dos métodos descritos aqui e, em certos casos, pode estar associado ao seu PMP. Em alguns casos, a compo- sição de controle de patógenos inclui dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4,5,6,7,8,9,10 ou mais do que 10) diferentes agentes antiparasitários.
[00292] “Como usado aqui, o termo "antiparasitário" ou "agente anti- parasitário" se refere a uma substância que mata ou inibe o crescimento, proliferação, reprodução ou propagação de parasitas, tais como proto- zoários parasitários, nematódeos parasitários ou insetos parasitários. Exemplos de agentes antiparasitários incluem Anti-helmínticos (Befênio, Dietilcarbamazina, Ivermectina, Niclosamida, Piperazina, Praziquantel,
Pirantel, Pirvínio, Benzimidazóis, Albendazol, Flubendazol, Meben- dazol, Tiabendazol, Levamisol, Nitazoxanida, Monopantel, Emodepsida, Espiroindóis), Escabicidas (Benzoato de benzila, Benzoato de benzila/ dissulfiram, Lindano, Malationa, Permetrina), Pediculicidas (Butóxido de piperonila/piretrinas, Espinosada, Moxidectina), Escabicidas (Crotami- tona), Anticestódeos (Niclosamida, Pranziquantel, Albendazol), Antia- mébicos (Rifampina, Anfotericina B); ou Antiprotozoários (Melarsoprol, Eflornitina, Metronidazol, Tinidazol, Miltefosina, Artemisinina). Em cer- tos casos, o agente antiparasitário pode ser usado para tratar ou preve- nir infeções em animais de criação, por exemplo, Levamisol, Fenben- dazol, Oxfendazol, Albendazol, Moxidectina, Eprinomectina, Doramec- tina, Ivermectina ou Clorsulona. Um perito na técnica apreciará que uma concentração adequada de cada antiparasitário na composição de- pende de fatores tais como eficácia, estabilidade do antiparasitário, nú- mero de antiparasitários distintos, a formulação e métodos de aplicação da composição. F. Agente antiviral
[00293] As composições de controle de patógenos descritas aqui po- dem incluir ainda um agente antiviral. Uma composição de controle de patógenos incluindo um agente antiviral como descrito aqui pode ser administrada a um animal em uma quantidade e durante um tempo su- ficientes para alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeter- minado ou limiar) de concentração de antiviral dentro do ou no animal; e/ou para tratar ou prevenir uma infeção viral no animal. Os antivirais descritos aqui podem ser formulados em uma composição de controle de patógenos para qualquer um dos métodos descritos aqui e, em cer- tos casos, podem estar associados ao seu PMP. Em alguns casos, a composição de controle de patógenos inclui dois ou mais (por exemplo, 2,3,4,5,6,7,8,9,10 ou mais do que 10) diferentes antivirais.
[00294] “Como usado aqui, o termo "antiviral" ou "virucida" se refere a uma substância que mata ou inibe o crescimento, proliferação, repro- dução, desenvolvimento ou propagação de vírus, tais como patógenos virais que infectam animais. Um número de agentes pode ser empregue como um antiviral, incluindo químicos ou agentes biológicos (por exem- plo, ácidos nucleicos, por exemplo, dsRNA). Exemplos de agentes anti- virais úteis aqui incluem Abacavir, Aciclovir (Aciclovir), Adefovir, Aman- tadina, Amprenavir (Agenerase), Ampligen, Arbidol, Atazanavir, Atripla, Balavir, Cidofovir, Combivir, Dolutegravir, Darunavir, Delavirdina, Dida- nosina, Docosanol, Edoxudina, Efavirenz, Emtricitabina, Enfuvirtida, En- tecavir, Ecoliever, Famciclovir, Fomivirsen, Fosamprenavir, Foscarnete, Fosfonete, Inibidor da fusão, Ganciclovir, Ibacitabina, Imunovir, Idoxuri- dina, Imiquimod, Indinavir, Inosina, Inibidor de integrase, Interferon tipo III, Interferon tipo II, Interferon tipo |, Interferon, Lamivudina, Lopinavir, Lovirida, Maraviroc, Moroxidina, Metisazona, Nelfinavir, Nevirapina, Ne- xavir, Nitazoxanida, Análogos de nucleosídeos, Norvir, Oseltamivir (Ta- miflu), Peginterferon alfa-2a, Penciclovir, Peramivir, Pleconaril, Podofi- lotoxina, Raltegravir, Ribavirina, Rimantadina, Ritonavir, Piramidina, Sa- quinavir, Sofosbuvir, Stavudina, Intensificador sinérgico (antirretroviral), Telaprevir, Tenofovir, Tenofovir disoproxil, Tipranavir, Trifluridina, Trizi- vir, Tromantadina, Truvada, Valaciclovir (Valtrex), Valganciclovir, Vicri- viroc, Vidarabina, Viramidina, Zalcitabina, Zanamivir (Relenza) ou Zido- vudina. Um perito na técnica apreciará que uma concentração ade- quada de cada antiviral na composição depende de fatores tais como eficácia, estabilidade dos antivirais, número de antivirais distintos, a for- mulação e métodos de aplicação da composição.
G. Repelentes
[00295] As composições de controle de patógenos descritas aqui po- dem incluir ainda um repelente. Por exemplo, o repelente pode repelir um vetor de patógenos de animais, tais como insetos. O repelente des-
crito aqui pode ser formulado em uma composição de controle de pató- genos para qualquer um dos métodos descritos aqui e, em certos casos, pode estar associado ao seu PMP. Em alguns casos, a composição de controle de patógenos inclui dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10 ou mais do que 10) diferentes repelentes.
[00296] —Porexemplo, uma composição de controle de patógenos in- cluindo um repelente como descrito aqui pode ser contatado com um vetor de inseto ou um habitat do vetor em uma quantidade e durante tempo suficientes para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo, um ní- vel predeterminado ou limiar) de concentração de repelentes; e (b) di- minuir os níveis do inseto próximo ou na vizinhança de animais em re- lação a um controle. Alternativamente, uma composição de controle de patógenos incluindo um repelente como descrito aqui pode ser conta- tado com um animal em uma quantidade e durante tempo suficientes para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de repelentes; e (b) diminuir os níveis do in- seto próximo ou na vizinhança do animal em relação a um animal não tratado.
[00297] — Alguns exemplos de repelentes de insetos bem conhecidos incluem: benzil; benzoato de benzila; 2,3,4,5-bis(butil-2-eno)tetra-hidro- furfural (MGK Repelente 11); butoxipolipropilenoglicol; N-butilacetani- lida; normal-butil-6,6-dimetil-5,6-di-hidro-1,4-pirona-2-carboxilato (Inda- lona); adipato de dibutila; ftalato de dibutila; succinato de di-normal-bu- tila (Tabatrex); N,N-dietil-meta-toluamida (DEET); carbato de dimetila (biciclo[2.2.1]hept-5-eno-2,3-dicarboxilato de (endo,endo)-dimetila); fta- lato de dimetila; 2-etil-2-butil-1,3-propanodiol; 2-etil-1,3-hexanodiol (Ru- tgers 612); isocincomeronato de di-normal-propila (MGK Repelente 326); 2-fenilciclo-hexanol; p-metano-3,8-diol e N N-dietilsuccinamato de normal-propila. Outros repelentes incluem óleo de citronela, ftalato de dimetila, oxalato de óxido de normal-butilmesitila e hexanodiol-1,3 de 2-
etila (Ver Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 2º Ed., Vol. 11: 724-728; e The Condensed Chemical Dictionary, 8º Ed., p 756).
[00298] Em alguns casos, o repelente é um repelente de insetos, in- cluindo repelentes de insetos sintéticos ou não sintéticos. Exemplos de repelentes de insetos sintéticos incluem antranilato de metila e outros repelentes de insetos à base de antranilato, benzaldeído, DEET (N,N- dietil-n-toluamida), carbato de dimetila, ftalato de dimetila, icaridina (isto é, picaridina, Bayrepel e KBR 3023), indalona (por exemplo, como usado em uma mistura "6-2-2" (Ftalato de dimetila a 60%, Indalona a 20%, Etil-nexanodiol a 20%), IR3535 (Ácido 3-[N-butil-N-acetil]-amino- propiônico, éster de etila), metoflutrina, permetrina, SS220 ou éter de triciciodecenila alila. Exemplos de repelentes de insetos naturais in- cluem folhas de beautyberry (Callicarpa), casca de bétula, murta do pân- tano (Myrica gale), óleo de erva-gateira (por exemplo, nepetalactona), óleo de citronela, óleo essencial de eucalipto de limão (Corymbia citrio- dora; por exemplo, p-mentano-3,8-diol (PMD)), óleo de nim, capim-li- mão, óleo da árvore do chá das folhas de Melaleuca alternifolia, tabaco ou seus extratos. H. Agentes Biológicos i. Polipeptídeos
[00299] A composição de controle de patógenos (por exemplo, PMP's) descrita aqui pode incluir um polipeptídeo, por exemplo, um po- lipeptídeo que é um agente antibacteriano, inseticida, nematicida, anti- parasitário ou virucida. Em alguns casos, a composição de controle de patógenos descrita aqui inclui um polipeptídeo ou seus fragmentos ou derivados funcionais, que visam vias no patógeno. Uma composição de controle de patógenos incluindo um polipeptídeo como descrito aqui pode ser administrada a um patógeno, um seu vetor, em uma quanti- dade e durante tempo suficientes para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de poli- peptídeos; e (b) diminuir ou eliminar o patógeno. Em alguns casos, uma composição de controle de patógenos incluindo um polipeptídeo como descrito aqui pode ser administrada a um animal tendo ou em risco de uma infeção por um patógeno em uma quantidade e durante tempo su- ficientes para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível prede- terminado ou limiar) de concentração de polipeptídeo no animal; e (b) diminuir ou eliminar o patógeno. Os polipeptídeos descritos aqui podem ser formulados em uma composição de controle de patógenos para qualquer um dos métodos descritos aqui e, em certos casos, podem estar associados ao seu PMP.
[00300] “Exemplos de polipeptídeos que podem ser usados aqui po- dem incluir uma enzima (por exemplo, uma recombinase metabólica, uma helicase, uma integrase, uma RNAse, uma DNAse ou uma proteína de ubiquitinação), uma proteína formadora de poros, um ligando de si- nalização, um peptídeo de penetração de células, um fator de transcri- ção, um receptor, um anticorpo, um nanocorpo, uma proteína de edição gênica (por exemplo, sistema CRISPR-Cas, TALEN ou dedo de zinco), riboproteína, um aptâmero de proteína ou uma chaperona.
[00301] Os polipeptídeos incluídos aqui podem incluir polipeptídeos ocorrendo naturalmente ou variantes recombinantemente produzidas. Em alguns casos, o polipeptídeo pode ser um seu fragmento ou variante funcional (por exemplo, um seu fragmento ou variante enzimaticamente ativo). Por exemplo, o polipeptídeo pode ser uma variante funcional- mente ativa de qualquer um dos polipeptídeos descritos aqui com pelo menos 70%, 71%, 72%, 173%, T4%, T5%, 16%, 77%, 18%, 19%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade, por exemplo, ao longo de uma região especificada ou ao longo da sequência inteira,
com uma sequência de um polipeptídeo descrito aqui ou um polipeptí- deo ocorrendo naturalmente. Em alguns casos, o polipeptídeo pode ter pelo menos 50% (por exemplo, pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% ou mais) identidade com uma proteína de interesse.
[00302] Os polipeptídeos descritos aqui podem ser formulados em uma composição para qualquer um dos usos descritos aqui. As compo- sições divulgadas aqui podem incluir qualquer número ou tipo (por exemplo, classes) de polipeptídeos, tal como pelo menos cerca de qual- quer um de 1 polipeptídeo, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 ou mais polipeptídeos. Uma concentração adequada de cada polipeptídeo na composição de- pende de fatores tais como eficácia, estabilidade do polipeptídeo, nú- mero de polipeptídeos distintos na composição, a formulação e métodos de aplicação da composição. Em alguns casos, cada polipeptídeo em uma composição líquida é de cerca de 0,1 ng/mL a cerca de 100 mg/mL. Em alguns casos, cada polipeptídeo em uma composição sólida é de cerca de 0,1 ng/g a cerca de 100 mg/9g.
[00303] “Métodos de fabricação de um polipeptídeo são rotina na téc- nica. Ver, em geral, Smales & James (Eds.), Therapeutic Proteins: Me- thods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press (2005); e Crommelin, Sindelar & Meibohm (Eds.), Pharmaceutical Bio- technology: Fundamentals and Applications, Springer (2013).
[00304] “Métodos para produção de um polipeptídeo envolvem ex- pressão em células de plantas, embora as proteínas recombinantes possam ser também produzidas usando células de insetos, células de levedura, bactéria, mamífero ou outras células sob o controle de promo- tores apropriados. Os vetores de expressão de mamífero podem com- preender elementos não transcritos tais como uma origem de replica- ção, um promotor e intensificador adequados e outras sequências não transcritas flanqueantes 5' ou 3' e sequências não traduzidas 5' ou 3'
tais como locais de ligação ao ribossomo necessários, um local de poli- adenilação, locais dadores e aceitadores de encadeamento e sequên- cias de terminação. Sequências de DNA derivadas do genoma viral do SVA40, por exemplo, origem de SV40, promotor inicial, intensificador, lo- cais de encadeamento e poliadenilação podem ser usadas para propor- cionar os outros elementos genéticos requeridos para expressão de uma sequência de DNA heteróloga. Vetores de clonagem e expressão apropriados para uso com hospedeiros celulares bacterianos, fúngicos, de levedura e mamífero são descritos em Green & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Quarta Edição), Cold Spring Harbor La- boratory Press (2012).
[00305] Vários sistemas de cultura de células de mamífero podem ser empregues para expressar e fabricar um agente de polipeptídeo re- combinante. Exemplos de sistemas de expressão de mamífero incluem células CHO, células COS, linhas de células HeLA e BHK. Processos de cultura de células hospedeiras para produção de agentes terapêuti- cos proteicos são descritos, por exemplo, em Zhou e Kantardjieff (Eds.), Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing (Advances in Bio- chemical Engineering/Biotechnology), Springer (2014). A purificação de proteínas é descrita em Franks, Protein Biotechnology: Isolation, Cha- racterization, and Stabilization, Humana Press (2013); e em Cutler, Pro- tein Purification Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press (2010). A formulação de terapêuticos de proteína é descrita em Meyer (Ed.), Therapeutic Protein Drug Products: Practical Approaches to formulation in the Laboratory, Manufacturing, and the Clinic, Wo- odhead Publishing Series (2012).
[00306] Em alguns casos, a composição de controle de patógenos inclui um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno. Por exem- plo, um agente descrito aqui pode ser um anticorpo que bloqueia ou potencia a atividade e/ou função de um componente do patógeno. O anticorpo pode atuar como um antagonista ou agonista de um polipep- tídeo (por exemplo, enzima ou receptor celular) no patógeno. A prepa- ração e uso de anticorpos contra um antígeno alvo em um patógeno são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Zhigiang An (Ed.), Therapeu- tic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, 1º Edição, Wiley, 2009 e também Greenfield (Ed.), Antibodies: A Laboratory Manual, 2º Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2013, para métodos de prepara- ção de anticorpos recombinantes, incluindo manipulação de anticorpos, uso de oligonucleotídeos degenerados, 5'-RACE, exibição em fagos e mutagênese; teste e caracterização de anticorpos; farmacocinética e farmacodinâmica de anticorpos; purificação e armazenamento de anti- corpos; e técnicas de rastreamento e marcação.
[00307] A composição de controle de patógenos descrita aqui pode incluir uma bacteriocina. Em alguns casos, a bacteriocina é natural- mente produzida por bactérias Gram-positivas, tais como Pseudomo- nas, Streptomyces, Bacillus, Staphylococcus ou bactérias do ácido lác- tico (LAB, tais como Lactococcus lactis). Em alguns casos, a bacterio- cina é naturalmente produzida por bactérias Gram-negativas, tais como Hafnia alvei, Citrobacter freundii, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumo- nia, Enterobacter cloacae, Serratia plymithicum, Xanthomonas campes- tris, Erwinia carotovora, Ralstonia solanacearum ou Escherichia coli. Bacteriocinas exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, anti- bióticos LAB de Classes |-IV (tais como lantibióticos), colicinas, microci- nas e piocinas.
[00308] A composição de controle de patógenos descrita aqui pode incluir um peptídeo antimicrobiano (AMP). Pode ser usado qualquer AMP adequado para inibir um microrganismo. Os AMPs são um grupo diversificado de moléculas, que são divididas em subgrupos com base em sua composição de aminoácidos e estrutura. O AMP pode ser deri-
vado ou produzido a partir de qualquer organismo que produza natural- mente AMPs, incluindo AMPs derivados de plantas (por exemplo, cop- sina), insetos (por exemplo, mastoparano, poneratoxina, cecropina, mo- ricina, melitina), rãs (por exemplo, magainina, dermaseptina, aureína) e mamíferos (por exemplo, catelicidinas, defensinas e protegrinas). ii. Ácidos Nucleicos
[00309] — Numerosos ácidos nucleicos são úteis nas composições e métodos descritos aqui. As composições divulgadas aqui podem incluir qualquer número ou tipo (por exemplo, classes) de ácidos nucleicos (por exemplo, molécula de DNA ou molécula de RNA, por exemplo, mRNA, RNA guia (gRNA) ou molécula de RNA inibidor (por exemplo, siRNA, ShRNA ou miRNA) ou uma molécula de DNA-RNA híbrida), tal como pelo menos cerca de 1 classe ou variante de um ácido nucleico, 2, 3,4, 5, 10, 15, 20 ou mais classes ou variantes de ácidos nucleicos. Uma concentração adequada de cada ácido nucleico na composição de- pende de fatores tais como eficácia, estabilidade do ácido nucleico, nú- mero de ácidos nucleicos distintos, a formulação e métodos de aplica- ção da composição. Exemplos de ácidos nucleicos úteis aqui incluem um pequeno RNA de interferência (dsiRNA) com substrato Dicer, um RNA antissenso, um curto RNA de interferência (siRNA), um grampo de cabelo curto (ShRNA), um microRNA (miRNA), um (RNA de interferên- cia assimétrico) aiRNA, um ácido nucleico de peptídeo (PNA), um mor- folino, um ácido nucleico bloqueado (LNA), um RNA de interação com Piwi (piRNA), uma ribozima, uma desoxirribozima (DNAzime), um aptâ- mero (DNA, RNA), um RNA circular (circRNA), um RNA guia (gRNA) ou uma molécula de DNA
[00310] Uma composição de controle de patógenos incluindo um ácido nucleico como descrito aqui pode ser contatada com um pató- geno, ou seu vetor, em uma quantidade e durante tempo suficientes para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de ácido nucleico; e (b) diminuir ou eliminar o patógeno. Em alguns casos, uma composição de controle de patóge- nos incluindo um ácido nucleico como descrito aqui pode ser adminis- trada a um animal tendo ou em risco de uma infeção por um patógeno em uma quantidade e durante tempo suficientes para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concen- tração de ácido nucleico no animal; e (b) diminuir ou eliminar o pató- geno. Os ácidos nucleicos descritos aqui podem ser formulados em uma composição de controle de patógenos para qualquer um dos métodos descritos aqui e, em certos casos, podem estar associados ao seu PMP. (a) Peptídeos Codificando Ácidos Nucleicos
[00311] Em alguns casos, a composição de controle de patógenos inclui um ácido nucleico codificando um polipeptídeo. Os ácidos nuclei- cos codificando um polipeptídeo podem ter um comprimento de cerca de 10 a cerca de 50 000 nucleotídeos (nts), cerca de 25 a cerca de 100 nucleotídeos, cerca de 50 a cerca de 150 nucleotídeos, cerca de 100 a cerca de 200 nucleotídeos, cerca de 150 a cerca de 250 nucleotídeos, cerca de 200 a cerca de 300 nucleotídeos, cerca de 250 a cerca de 350 nucleotídeos, cerca de 300 a cerca de 500 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 1000 nucleotídeos, cerca de 50 a cerca de 1000 nucleotídeos, cerca de 100 a cerca de 1000 nucleotídeos, cerca de 1000 a cerca de 2000 nucleotídeos, cerca de 2000 a cerca de 3000 nucleotídeos, cerca de 3000 a cerca de 4000 nucleotídeos, cerca de 4000 a cerca de 5000 nucleotídeos, cerca de 5000 a cerca de 6000 nucleotídeos, cerca de 6000 a cerca de 7000 nucleotídeos, cerca de 7000 a cerca de 8000 nu- cleotídeos, cerca de 8000 a cerca de 9000 nucleotídeos, cerca de 9000 a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 10.000 a cerca de 15.000 nu- cleotídeos, cerca de 10.000 a cerca de 20000 nucleotídeos, cerca de
10.000 a cerca de 25.000 nucleotídeos, cerca de 10.000 a cerca de
30.000 nucleotídeos, cerca de 10.000 a cerca de 40.000 nucleotídeos,
cerca de 10.000 a cerca de 45.000 nucleotídeos, cerca de 10.000 a cerca de 50.000 nucleotídeos ou qualquer gama intermédia.
[00312] —Acomposição de controle de patógenos pode também incluir variantes funcionalmente ativas de uma sequência de ácido nucleico de interesse. Em alguns casos, a variante dos ácidos nucleicos tem pelo menos 70%, 71%, 72%, 173%, T4%, T5%, 16%, 77%, 18%, 19%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade, por exemplo, ao longo de uma região especificada ou ao longo da sequência inteira, com uma sequência de um ácido nucleico de interesse. Em alguns ca- sos, a invenção inclui um polipeptídeo funcionalmente ativo codificado por uma variante de ácido nucleico como descrito aqui. Em alguns ca- sos, o polipeptídeo funcionalmente ativo codificado pela variante de ácido nucleico tem pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, T5%, 16%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade, por exemplo, ao longo uma região especificada ou ao longo da sequência de aminoácidos inteira, com uma sequência de um poli- peptídeo de interesse ou a sequência de polipeptídeos naturalmente de- rivada.
[00313] Alguns métodos para expressar um ácido nucleico codifi- cando uma proteína podem envolver expressão em células, incluindo células de insetos, leveduras, plantas, bactérias ou outras sob o controle de promotores apropriados. Os vetores de expressão podem incluir ele- mentos não transcritos, tais como uma origem de replicação, um pro- motor e intensificador adequados e outras sequências não transcritas flanqueantes 5' ou 3' e sequências não traduzidas 5' ou 3' tais como locais de ligação ao ribossomo necessários, um local de poliadenilação, locais dadores e aceitadores de encadeamento e sequências de termi- nação. Sequências de DNA derivadas do genoma viral do SV40, por exemplo, origem de SV40, promotor inicial, intensificador, locais de en- cadeamento e poliadenilação podem ser usadas para proporcionar os outros elementos genéticos requeridos para expressão de uma sequên- cia de DNA heteróloga. Vetores de clonagem e expressão apropriados para uso com hospedeiros celulares bacterianos, fúngicos, de levedura e mamífero são descritos em Green et al., Molecular Cloning: A Labora- tory Manual, Quarta Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012.
[00314] A modificação genética usando métodos recombinantes é geralmente conhecida na técnica. Uma sequência de ácido nucleico co- dificando um gene desejado pode ser obtida usando métodos recombi- nantes conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, por rastreamento de bibliotecas de células expressando o gene, por derivação do gene a partir de um vetor conhecido como incluindo o mesmo ou por isolamento diretamente a partir de células e tecidos contendo o mesmo, usando técnicas padrão. Alternativamente, um gene de interesse pode ser pro- duzido sinteticamente, ao invés de clonado.
[00315] A expressão de ácidos nucleicos naturais ou sintéticos é tipi- camente alcançada por ligação operacional de um ácido nucleico codi- ficando o gene de interesse a um promotor e incorporação do construto em um vetor de expressão. Os vetores de expressão podem ser ade- quados para replicação e expressão em bactérias. Os vetores de ex- pressão podem ser também adequados para replicação e integração em eucariotas. Vetores de clonagem típicos contêm terminadores da transcrição e tradução, sequências de iniciação e promotores úteis para expressão da sequência de ácido nucleico desejada.
[00316] Elementos promotores adicionais, por exemplo, intensifica- dores, regulam a frequência da iniciação transcricional. Tipicamente, es- tes estão localizados na região 30-110 pares de bases (pb) a montante do local de início, embora tenha sido recentemente mostrado que um número de promotores contém também elementos funcionais a jusante do local de início. O espaçamento entre elementos promotores é fre- quentemente flexível, tal que a função promotora seja conservada quando os elementos são invertidos ou deslocados entre si. No promo- tor de timidina cinase (tk), o espaçamento entre elementos promotores pode ser aumentado até afastamento de 50 pb antes de a atividade co- meçar a declinar. Dependendo do promotor parece que elementos indi- viduais podem funcionar cooperativamente ou independentemente para ativar a transcrição.
[00317] Um exemplo de um promotor adequado é a sequência do promotor inicial imediato do citomegalovírus (CMV). Esta sequência pro- motora é uma sequência promotora constitutiva forte capaz de dirigir níveis elevados de expressão de qualquer sequência de polinucleotí- deos operacionalmente ligada a ela. Outro exemplo de um promotor adequado é o Fator de Crescimento de Alongamento-1a (EF-10). No entanto, outras sequências de promotores constitutivos podem ser tam- bém usadas, incluindo o, mas não se limitando ao, promotor inicial do vírus símio 40 (SV40), vírus do tumor mamário de camundongo (MMTV), pro- motor de repetições terminais longas (LTR) do vírus da imunodeficiência humana (HIV), promotor de MoMuLV, um promotor do vírus da leucemia aviária, um promotor inicial imediato do vírus de Epstein-Barr, um pro- motor do vírus do sarcoma de Rous, bem como promotores de genes humanos tais como o, mas não se limitando ao, promotor da actina, pro- motor de miosina, promotor de hemoglobina e promotor de creatina ci- nase.
[00318] Alternativamente, o promotor pode ser um promotor induzí- vel. O uso de um promotor induzível proporciona um interruptor molecu- lar capaz de ligar a expressão da sequência de polinucleotídeos que é operacionalmente ligada quando tal expressão é desejada ou desligar a expressão quando a expressão não é desejada. Exemplos de promoto-
res induzíveis incluem, mas não estão limitados a, um promotor da me- talotionina, um promotor de glucocorticoides, um promotor da progeste- rona e um promotor da tetraciclina.
[00319] O vetorde expressão a ser introduzido pode também conter um gene marcador selecionável ou um gene repórter ou ambos para facilitar a identificação e seleção de células de expressão a partir da população de células que se pretende transfectar ou infectar através de vetores virais. Em outros aspectos, o marcador selecionável pode ser transportado em uma porção separada de DNA e usado em um proce- dimento de cotransfecção. Tanto marcadores selecionáveis como ge- nes repórter podem ser flanqueados com sequências reguladoras apro- priadas para permitir a expressão nas células hospedeiras. Marcadores selecionáveis úteis incluem, por exemplo, genes de resistência a anti- bióticos, tais como neo e similares.
[00320] Os genes repórter podem ser usados para se identificarem células potencialmente transformadas e para se avaliar a funcionalidade de sequências reguladoras. Em geral, um gene repórter é um gene que não está presente na nem é expresso pela fonte receptora e que codifica um polipeptídeo cuja expressão é manifestada por alguma propriedade facilmente detectável, por exemplo, atividade enzimática. A expressão do gene repórter é avaliada em um momento adequado após o DNA ter sido introduzido nas células receptoras. Genes repórter adequados po- dem incluir genes codificando luciferase, beta-galactosidase, cloranfe- nicol acetil-transferase, fosfatase alcalina secretada ou o gene da pro- teína verde fluorescente (por exemplo, Ui-Tei et al., FEBS Letters 479: 79-82, 2000). Sistemas de expressão adequados são bem conhecidos e podem ser preparados usando técnicas conhecidas ou obtidos comer- cialmente. Em geral, o construto com a região flanqueante 5' mínima mostrando o nível mais elevado de expressão do gene repórter é iden- tificado como o promotor. Tais regiões promotoras podem ser ligadas a um gene repórter e usadas para se avaliarem agentes quanto à capaci- dade de modular a transcrição dirigida por promotores.
[00321] Em alguns casos, um organismo pode ser geneticamente modificado para alterar a expressão de uma ou mais proteínas. A ex- pressão da uma ou mais proteínas pode ser modificada durante um tempo específico, por exemplo, estado de desenvolvimento ou diferen- ciação do organismo. Em um caso, a invenção inclui uma composição para alterar a expressão de uma ou mais proteínas, por exemplo, pro- teínas que afetam a atividade, estrutura ou função. A expressão da uma ou mais proteínas pode ser restringida a localização(ões) específica(s) ou disseminada ao longo do organismo. (b) MRNA Sintético
[00322] A composição de controle de patógenos pode incluir uma molécula de mRNA sintética, por exemplo, uma molécula de mRNA sin- tética codificando um polipeptídeo. A molécula de mRNA sintética pode ser modificada, por exemplo, quimicamente. A molécula de MRNA pode ser quimicamente sintetizada ou transcrita in vitro. A molécula de MRNA pode ser disposta em um plasmídeo, por exemplo, um vetor viral, vetor bacteriano ou vetor de expressão eucariótico. Em alguns exemplos, a molécula de mRNA pode ser entregue a células por transfecção, eletro- poração ou transdução (por exemplo, transdução adenoviral ou lentivi- ral).
[00323] Em alguns casos, o agente de RNA modificado de interesse descrito aqui tem nucleosídeos ou nucleotídeos modificados. Tais mo- dificações são conhecidas e são descritas, por exemplo, em WO 2012/
019168. Modificações adicionais são descritas, por exemplo, em WO 2015/038892; WO 2015/038892; WO 2015/089511; WO 2015/196130; WO 2015/196118 e WO 2015/196128 A2.
[00324] Em alguns casos, o RNA modificado codificando um polipep-
tídeo de interesse tem uma ou mais modificações terminais, por exem- plo, uma estrutura de proteção terminal 5' e/ou uma cauda de poli-A (por exemplo, de entre 100-200 nucleotídeos em comprimento). A estrutura de proteção terminal 5' pode ser selecionada do grupo consistindo em Capo, Capl, ARCA, inosina, NI-metil-guanosina, 2'fluoro-guanosina, 7- desaza-guanosina, 8-0x0-guanosina, 2-amino-guanosina, LNA-guano- sina e 2-azido-guanosina. Em alguns casos, os RNAs modificados con- têm também uma 5' UTR incluindo pelo menos uma sequência de Kozak e uma 3' UTR. Tais modificações são conhecidas e são descritas, por exemplo, em WO 2012/135805 e WO 2013/052523. Modificações ter- minais adicionais são descritas, por exemplo, em WO 2014/164253 e WO 2016/011306, WO 2012/045075, e WO 2014/093924. Enzimas qui- méricas para sintetizar moléculas de RNA com proteção terminal (por exemplo, mRNA modificado) que podem incluir pelo menos uma modi- ficação química são descritas em WO 2014/028429.
[00325] Em alguns casos, um MRNA modificado pode ser ciclizado, ou concatemerizado, para gerar uma molécula competente para tradu- ção para auxiliar interações entre proteínas de ligação de poli-A e pro- teínas de ligação de extremidade 5'. O mecanismo de ciclização ou con- catemerização pode ocorrer através de pelo menos 3 vias diferentes: 1) química, 2) enzimática e 3) catalisada por ribozimas. A ligação 5'/3' re- cém-formada pode ser intramolecular ou intermolecular. Tais modifica- ções são descritas, por exemplo, em WO 2013/151736.
[00326] Métodos de preparação e purificação de RNA modificados são conhecidos e divulgados na técnica. Por exemplo, os RNAs modifi- cados são preparados usando somente síntese enzimática com trans- crição in vitro (IVT). Métodos de preparação de polinucleotídeos IVT são conhecidos na técnica e são descritos em WO 2013/151666, WO 2013/151668, WO 2013/151663, WO 2013/151669, WO 2013/151670, WO 2013/151664, WO 2013/151665, WO 2013/151671, WO 2013/
151672, WO 2013/151667 e WO 2013/151736. Os métodos de purifica- ção incluem purificar um transcrito de RNA incluindo uma cauda de poliA por contato da amostra com uma superfície ligada a uma pluralidade de timidinas ou seus derivados e/ou uma pluralidade de uracilas ou seus derivados (poliT/U) sob condições tais que o transcrito de RNA se ligue à superfície e eluição do transcrito de RNA purificado a partir da super- fície (WO 2014/152031); usando cromatografia de permuta iônica (por exemplo, aniônica) que permite a separação de RNAs mais longos até
10.000 nucleotídeos em comprimento através de um método escaloná- vel (WO 2014/144767); e sujeição de uma amostra de MRNA modifi- cado a tratamento com DNAse (WO 2014/152030).
[00327] Formulações de RNA modificados são conhecidas e são descritas, por exemplo, em WO 2013/090648. Por exemplo, a formula- ção pode serr, mas não está limitada a, nanopartículas, microesferas de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), lipidoides, lipoplex, lipossomo, polímeros, carboidratos (incluindo açúcares simples), lipídeos catiôni- cos, gel de fibrina, hidrogel de fibrina, cola de fibrina, selante de fibrina, fibrinogênio, trombina, nanopartículas de lipídeos rapidamente elimina- das (reLNP) e suas combinações.
[00328] RNAs modificados codificando polipeptídeos nas áreas de doença humana, anticorpos, vírus e uma variedade de cenários in vivo são conhecidos e são divulgados, por exemplo, na Tabela 6 das Publi- cações Internacionais Nos. WO 2013/151666, WO 2013/151668, WO 2013/151663, WO 2013/151669, WO 2013/151670, WO 2013/151664, WO 2013/151665, WO 2013/151736; Tabelas 6 e 7 da Publicação In- ternacional No. WO 2013/151672; Tabelas 6, 178 e 179 da Publicação Internacional No. WO 2013/151671; Tabelas 6, 185 e 186 da Publicação Internacional No WO 2013/151667. Qualquer um dos anteriores pode ser sintetizado como um polinucleotídeo IVT, polinucleotídeo quimérico ou um polinucleotídeo circular, e cada um pode incluir um ou mais nu- cleotídeos modificados ou modificações terminais.
(c) RNA Inibidor
[00329] Em alguns casos, a composição de controle de patógenos inclui uma molécula de RNA inibidor, por exemplo, que atua através da via de interferência de RNA (RNAi). Em alguns casos, a molécula de RNA inibidora diminui o nível da expressão gênica em um patógeno ou seu vetor. Em alguns casos, a molécula de RNA inibidora diminui o nível de uma proteína no patógeno ou seu vetor. Em alguns casos, a molé- cula de RNA inibidora inibe a expressão de um gene do patógeno. Em alguns casos, a molécula de RNA inibidora inibe a expressão de um gene em um vetor de um patógeno. Por exemplo, uma molécula de RNA inibidora pode incluir um curto RNA de interferência, um curto RNA em grampo de cabelo e/ou um microRNA que tem visa um gene no pató- geno. Certas moléculas de RNA podem inibir a expressão gênica atra- vés do processo biológico de interferência de RNA (RNAi). As moléculas de RNAi incluem RNA ou estruturas tipo RNA tipicamente contendo 15- 50 pares de bases (tal como cerca de 18-25 pares de bases) e tendo uma sequência de núcleobases idêntica (complementar) ou quase idên- tica (substancialmente complementar) a uma sequência codificante em um gene alvo expresso dentro da célula. As moléculas de RNAi incluem, mas não estão limitadas a: pequenos RNAs de interferência (dsiRNA) com substrato Dicer, curtos RNAs de interferência (SsiRNAs), RNAs de fita dupla (AsRNA), curtos RNAs em grampo de cabelo (ShRNA), mero- dúplexes, substratos dicer e interferência de RNA multivalente (Pat. dos E.U.A. Nos. 8,084,599, 8,349,809, 8,513,207 e 9,200,276). Um shRNA é uma molécula de RNA incluindo uma volta em grampo de cabelo que diminui a expressão de genes alvo através de RNAi. Os sSshRNAs podem ser entregues a células na forma de plasmídeos, por exemplo, vetores virais ou bacterianos, por exemplo, por transfecção, eletroporação ou transdução. Um microRNA é uma molécula de RNA não codificante que tem tipicamente um comprimento de cerca de 22 nucleotídeos. Os miR- NAs se ligam a locais alvo em moléculas de mRNA e silenciam o MRNA, por exemplo, ao causarem clivagem do mMRNA, desestabilização do MRNA ou inibição da tradução do MRNA. Em alguns casos, a molécula de RNA inibidora diminui o nível e/ou atividade de um regulador negativo da função. Em outros casos, a molécula de RNA inibidora diminui o nível e/ou atividade de um inibidor de um regulador positivo da função. A mo- lécula de RNA inibidora pode ser quimicamente sintetizada ou transcrita in vitro.
[00330] Em alguns casos, o ácido nucleico é um DNA, um RNA ou um PNA. Em alguns casos, o RNA é um RNA inibidor. Em alguns casos, o RNA inibidor inibe a expressão gênica em um patógeno. Em alguns casos, o ácido nucleico é um mMRNA, um mRNA modificado ou uma mo- lécula de DNA que aumenta a expressão no patógeno de uma enzima (por exemplo, uma recombinase metabólica, uma helicase, uma inte- grase, uma RNAse, uma DNAse ou uma proteína de ubiquitinação), uma proteína formadora de poros, um ligando de sinalização, um peptí- deo de penetração de células, um fator de transcrição, um receptor, um anticorpo, um nanocorpo, uma proteína de edição gênica (por exemplo, sistema CRISPR-Cas, TALEN ou dedo de zinco), riboproteína, um ap- tâmero de proteína ou uma chaperona. Em alguns casos, o ácido nu- cleico é um MRNA, um mRNA modificado ou uma molécula de DNA que aumenta a expressão de uma enzima (por exemplo, uma enzima meta- bólica, uma enzima recombinase, uma enzima helicase, uma enzima integrase, uma enzima RNAse, uma enzima DNAse ou uma proteína de ubiquitinação), uma proteína formadora de poros, um ligando de sinali- zação, um peptídeo de penetração de células, um fator de transcrição, um receptor, um anticorpo, um nanocorpo, uma proteína de edição gê- nica (por exemplo, um sistema CRISPR-Cas, uma TALEN ou um dedo de zinco), uma riboproteína, um aptâmero de proteína ou uma chape- rona. Em alguns casos, o aumento na expressão no patógeno é um au- mento na expressão de cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, ou mais do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo, a expressão em um patógeno não tra- tado). Em alguns casos, o aumento na expressão no patógeno é um aumento na expressão de cerca de 2x vezes, cerca de 4x vezes, cerca de 5x vezes, cerca de 10x vezes, cerca de 20x vezes, cerca de 25x vezes, cerca de 50x vezes, cerca de 75x vezes ou cerca de 100x vezes ou mais, em relação a um nível de referência (por exemplo, a expressão em um patógeno não tratado).
[00331] Em alguns casos, o ácido nucleico é um RNA antissenso, um SIRNA, um ShRNA, um miRNA, um aiRNA, um PNA, um morfolino, um LNA, um piRNA, uma ribozima, uma DNAzima, um aptâmero (DNA, RNA), um circRNA, um gRNA ou uma molécula de DNA (por exemplo, um polinucleotídeo antissenso) que reduz a expressão no patógeno de, por exemplo, uma enzima (uma enzima metabólica, uma enzima recom- binase, uma enzima helicase, uma enzima integrase, uma enzima RNAse, uma enzima DNAse, uma enzima polimerase, uma proteína de ubiquitinação, uma enzima de gestão de superóxido ou uma enzima de produção de energia), um fator de transcrição, uma proteína secretora, um fator estrutural (actina, cinesina ou tubulina), um riboproteína, um aptâmero de proteína, uma chaperona, um receptor, um ligando de si- nalização ou um transportador. Em alguns casos, a diminuição na ex- pressão no patógeno é uma diminuição na expressão de cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo, a ex- pressão em um patógeno não tratado). Em alguns casos, a diminuição na expressão no patógeno é uma diminuição na expressão de cerca de 2x vezes, cerca de 4x vezes, cerca de 5x vezes, cerca de 10x vezes,
cerca de 20x vezes, cerca de 25x vezes, cerca de 50x vezes, cerca de 75x vezes ou cerca de 100x vezes ou mais, em relação a um nível de referência (por exemplo, a expressão em um patógeno não tratado).
[00332] As moléculas de RNAi incluem uma sequência substancial- mente complementar, ou totalmente complementar, à totalidade ou a um fragmento de um gene alvo. As moléculas de RNAi podem comple- mentar sequências na fronteira entre íntrons e éxons para prevenir a maturação de transcritos de RNA nuclear recém-gerados de genes es- pecíficos em mRNA para transcrição. As moléculas de RNAi comple- mentares a genes específicos podem hibridar com o mRNA para um gene alvo e prevenir sua tradução. A molécula antissenso pode ser DNA, RNA ou um seu derivado ou híbrido. Exemplos de tais moléculas derivadas incluem, mas não estão limitados a, ácido nucleico de peptí- deo (PNA) e moléculas à base de fosforotioato tais como guanidina de- soxirribonucleica (DNG) ou guanidina ribonucleica (RNG).
[00333] —Asmoléculas de RNAi podem ser proporcionadas como RNA pronto-a-usar sintetizado in vitro ou como um gene antissenso transfec- tado em células que originarão moléculas de RNAi após transcrição. À hibridação com mRNA resulta em degradação da molécula hibridada por RNAse H e/ou inibição da formação de complexos de tradução. Am- bos fazem com que não seja produzido o produto do gene original.
[00334] O comprimento da molécula de RNAi que hibrida com o transcrito de interesse pode ser em torno de 10 nucleotídeos, entre cerca de 15 ou 30 nucleotídeos ou cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais nucleotídeos. O grau de iden- tidade da sequência antissenso com o transcrito visado pode ser pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95.
[00335] As moléculas de RNAi podem também incluir protuberân- cias, isto é, tipicamente nucleotídeos protuberantes, não emparelhados que não estão diretamente envolvidos na estrutura em hélice dupla nor- malmente formada pelas sequências do núcleo do par definido aqui da fita senso e fita antissenso. As moléculas de RNAi podem conter protu- berâncias 3' e/ou 5' de cerca de 1-5 bases independentemente em cada uma das fitas senso e fitas antissenso. Em alguns casos, tanto a fita senso como a fita antissenso contêm protuberâncias 3' e 5". Em alguns casos, um ou mais dos nucleotídeos protuberantes 3' de uma fita for- mam pares de bases com um ou mais nucleotídeos protuberantes 5' da outra fita. Em outros casos, o um ou mais dos nucleotídeos protuberan- tes 3' de uma fita não formam pares de bases com um ou mais nucleo- tídeos protuberantes 5' da outra fita. As fitas senso e antissenso de uma molécula de RNAi podem ou não conter o mesmo número de bases de nucleotídeos. As fitas antissenso e senso podem formar uma hélice du- pla em que a extremidade 5' tem somente uma extremidade não coe- siva, a extremidade 3' tem somente uma extremidade não coesiva, am- bas as extremidades 5' e 3' são não coesivas ou nem a extremidade 5' nem a extremidade 3' são não coesivas. Em outro caso, um ou mais dos nucleotídeos na protuberância contêm um tiofosfato, fosforotioato, nu- cleotídeo invertido (ligado 3' a 3') em desoxinucleotídeo ou é um ribonu- cleotídeo ou desoxinucleotídeo modificado.
[00336] As moléculas de pequeno RNA de interferência (siRNA) in- cluem uma sequência de nucleotídeos que é idêntica a cerca de 15 a cerca de 25 nucleotídeos contíguos do MRNA alvo. Em alguns casos, a sequência de siRNA começa com o dinucleotídeo AA, inclui um conte- údo de GC de cerca de 30-70% (cerca de 30-60%, cerca de 40-60% ou cerca de 45%-55%) e não tem uma elevada percentagem de identidade com qualquer sequência de nucleotídeos sem ser o alvo no genoma no qual é para ser introduzida, por exemplo como determinado por pes- quisa BLAST padrão.
[00337] Os siRNAs e shRNAs se assemelham a intermediários na via de processamento dos genes de microRNA (mIiRNA) endógenos (Bartel, Cell 116: 281-297, 2004). Em alguns casos, os siRNAs podem funcionar como miRNAs e vice-versa (Zeng et al., Mol. Cell 9: 1327- 1333, 2002; Doench et a/., Genes Dev. 17: 438-442, 2003). Os siRNAs exógenos subregulam mRNA com complementaridade de semente com o SiRNA (Birmingham et al., Nat. Methods 3: 199-204, 2006). Múltiplos locais alvo dentro de uma 3' UTR dão subregulação mais forte (Doench et al., Genes Dev. 17: 438-442, 2003).
[00338] Sequências de siRNA e locais de ligação cognatos eficazes conhecidos estão também bem representados na literatura relevante. As moléculas de RNAi são prontamente desenhadas e produzidas por tecnologias conhecidas na técnica. Adicionalmente existem ferramentas computacionais que aumentam a chance de se descobrirem motivos de sequências eficazes e específicos (Pei et al., Nat. Methods 3 (9): 670- 676, 2006; Reynolds et a/l., Nat. Biotechnol. 22 (3): 326-330, 2004; Khvo- rova et al., Nat. Struct. Biol. 10 (9): 708-712, 2003; Schwarz et al., Cell 115 (2): 199-208, 2003; Ui-Tei et al., Nucleic Acids Res. 32 (3): 936-948, 2004; Heale et al., Nucleic Acids Res. 33 (3): e30, 2005; Chalk et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 319 (1): 264-274, 2004; e Amarzgui- oui et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 316 (4): 1050-1058, 2004).
[00339] A moléculade RNAi modula a expressão de RNA codificado por um gene. Como múltiplos genes podem partilhar algum grau de ho- mologia de sequências entre si, em alguns casos, a molécula de RNAi pode ser desenhada para visar uma classe de genes com suficiente ho- mologia de sequências. Em alguns casos, a molécula de RNAi pode conter uma sequência que tem complementaridade com sequências que são partilhadas entre diferentes alvos gênicos ou são únicas de um alvo gênico específico. Em alguns casos, a molécula de RNAi pode ser desenhada para visar regiões conservadas de uma sequência de RNA tendo homologia entre vários genes visando deste modo vários genes em uma família de genes (por exemplo, diferentes isoformas gênicas, variantes de encadeamento, genes mutantes, etc.). Em alguns casos, a molécula de RNAi pode ser desenhada para visar uma sequência que seja única de uma sequência de RNA específica de um único gene.
[00340] “Uma molécula de RNA inibidor pode ser modificada, por exemplo, de modo a conter nucleotídeos modificados, por exemplo, 2'- fluoro, 2'-o-metila, 2'-desoxi, ácido nucleico não trancado, 2'-hidroxi, fos- forotioato, 2'-tiouridina, 4'-tiouridina, 2'-desoxiuridina. Sem ficar restrin- gido pela teoria se acredita que tais modificações podem aumentar a resistência a nucleases e/ou estabilidade no soro ou diminuir a imuno- genicidade.
[00341] Em alguns casos, a molécula de RNAi é ligada a um polímero de entrega através de uma ligação ou ligante fisiologicamente lábil. O ligante fisiologicamente lábil é selecionado tal que sofra uma transfor- mação química (por exemplo, clivagem) quando presente em certas condições fisiológicas (por exemplo, ligação de dissulfeto clivada no am- biente redutor do citoplasma celular). A liberação da molécula a partir do polímero, por clivagem da ligação fisiologicamente lábil, facilita a in- teração da molécula com os componentes celulares apropriados para atividade.
[00342] O conjugado molécula de RNAi-polímero pode ser formado por ligação covalente da molécula ao polímero. O polímero é polimeri- zado ou modificado tal que contenha um grupo reativo A. A molécula de RNAi é também polimerizada ou modificada tal que contenha um grupo reativo B. os grupos reativos A e B são escolhidos tal que possam ser ligados através de uma ligação covalente reversível usando métodos conhecidos na técnica.
[00343] A conjugação da molécula de RNAi ao polímero pode ser re- alizada na presença de um excesso de polímero. Como a molécula de
RNAi e o polímero podem ter carga oposta durante a conjugação, a pre- sença de polímero em excesso pode reduzir ou eliminar a agregação do conjugado. Alternativamente pode ser usado um excesso de um polí- mero transportador, tal como um policátion. O polímero em excesso pode ser removido do polímero conjugado antes da administração do conjugado. Alternativamente, o polímero em excesso pode ser coadmi- nistrado com o conjugado.
[00344] Ainjeçãode RNA de fita dupla (ASRNA) em insetos maternos suprime eficientemente a expressão gênica da sua descendência du- rante a embriogênese, ver, por exemplo, Khila et al., PLoS Genet. 5 (7): e1000583, 2009; e Liu et al., Development 131 (7): 1515-1527, 2004. Matsuura et al. (PNAS 112 (30): 9376-9381, 2015) mostraram que a su- pressão de Ubx elimina bacteriócitos e a localização de simbiontes de bacteriócitos.
[00345] A preparação e uso de agentes inibidores com base em RNA não codificante tais como ribozimas, RNAse P, siRNAs e miRNAs são também conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito em Sioud, RNA Therapeutics: Function, Design, and Delivery (Methods in Molecu- lar Biology). Humana Press (2010). (d) Edição Gênica
[00346] As composições de controle de patógenos descritas aqui po- dem incluir um componente de um sistema de edição gênica. Por exem- plo, o agente pode introduzir uma alteração (por exemplo, inserção, de- leção (por exemplo, nocaute), translocação, inversão, mutação pontual única ou outra mutação) em um gene no patógeno. Sistemas de edição gênica exemplificativos incluem as nucleases de dedos de zinco (ZFNs), Nucleases à base de Efetores Tipo Ativadores da Transcrição (TALEN) e o sistema de repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente intercaladas (CRISPR). Métodos à base de ZFNs, TALENs e CRISPR são descritos, por exemplo, em Gaj et al., Trends Biotechnol. 31 (7):
397-405, 2013.
[00347] Emum sistema CRISPR/Cas típico, uma endonuclease é di- rigida a uma sequência de nucleotídeos alvo (por exemplo, um local no genoma que é para ser editado quanto à sequência) por RNAs guias não codificantes, específicos da sequência que visam sequências de DNA de fita simples ou dupla. Foram identificadas três classes (I-I1I) de sistemas CRISPR. Os sistemas CRISPR de classe |l usam uma única endonuclease Cas (em vez de múltiplas proteínas Cas). Um sistema CRISPR de classe || inclui uma endonuclease Cas de tipo II tal como Cas9, um RNA de CRISPR ("crRNA") e um crRNA transativador ("tracr»RNA"). O crRNA contém um RNA guia, isto é, tipicamente uma sequência de RNA com cerca de 20 nucleotídeos que corresponde a uma sequência de DNA alvo. O crRNA contém também uma região que se liga ao tracrRNA para formar uma estrutura parcialmente de fita dupla que é clivada por RNase Ill, resultando em um híbrido cr»RNA/tracrRNA. Os RNA servem como guias para dirigir proteínas Cas para silenciar sequências de DNA/RNA específicas, dependendo da sequência espa- çadora. Ver, por exemplo, Horvath et al., Science 327: 167-170, 2010; Makarova et al., Biology Direct 1: 7, 2006; Pennisi, Science 341: 833- 836, 2013. A sequência de DNA alvo tem geralmente de ser adjacente a um motivo adjacente protoespaçador ("PAM") que é específico de uma dada endonuclease Cas; no entanto, sequências PAM aparecem ao longo de um dado genoma. As endonucleases de CRISPR identificadas a partir de várias espécies procarióticas têm requisitos únicos de se- quências PAM; exemplos de sequências PAM incluem 5'-NGG (SEQ ID NO: 78) (Streptococcus pyogenes), S-NNAGAA (SEQ ID NO: 79) (CRISPR1 de Streptococcus thermophilus) e S-NNNGATT (SEQ ID NO: 80) (CRISPR3 de Streptococcus thermophilus) e 5S-NNNGATT (SEQ ID NO: 81) (Neisseria meningiditis). Algumas endonucleases, por exemplo, endonucleases Cas9, estão associadas a locais PAM ricos em G, por exemplo, 5-NGG (SEQ ID NO: 78), e efetuam clivagem em extremida- des não coesivas do DNA alvo em uma localização 3 nucleotídeos a montante do (5' a partir do) local PAM. Outro sistema CRISPR de classe Il inclui a endonuclease de tipo V Cpf1, que é mais pequena do que Cas9; exemplos incluem AsCpf1 (de Acidaminococcus sp.) e LoCpf1 (de Lachnospiraceae sp.). Arranjos CRISPR associados a Cpf1 são proces- sados em crRNA maduros sem o requisito de um tracrRNA; por outras palavras, um sistema Cpf1 requer apenas a nuclease Cpf1i e um cr»RNA para clivar a sequência de DNA-alvo. As endonucleases Cpf1 estão as- sociadas a locais PAM ricos em T, por exemplo, 5-TTN. A Cpf1 conse- gue também reconhecer um motivo PAM 5'-CTA. Cpf1 cliva o DNA alvo por introdução de uma quebra de fita dupla assimétrica ou coesiva com uma protuberância 5' de 4 ou 5 nucleotídeos, por exemplo, clivagem de um DNA alvo com um corte assimétrico ou coesivo de 5 nucleotídeos localizado 18 nucleotídeos a jusante do (3' a partir do) local PAM na fita codificante e 23 nucleotídeos a jusante do local PAM na fita complemen- tar; a protuberância de 5 nucleotídeos que resulta de tal clivagem assi- métrica permite edição do genoma mais precisa por inserção de DNA por recombinação homóloga do que por inserção em DNA clivado em extremidades não coesivas. Ver, por exemplo, Zetsche et a/l., Cell 163: 759-771, 2015.
[00348] Paraos propósitos da edição gênica podem ser desenhadas redes de CRISPR que contenham uma ou múltiplas sequências de RNA guia correspondendo a uma sequência de DNA alvo desejada; ver, por exemplo, Cong et al., Science 339: 819-823, 2013; Ran et al., Nature Protocols 8: 2281-2308, 2013. Pelo menos cerca de 16 ou 17 nucleotí- deos da sequência de gRNA são requeridos por Cas9 para que ocorra clivagem de DNA; para Cpf1, pelo menos cerca de 16 nucleotídeos da sequência de gRNA são necessários para se alcançar clivagem de DNA detectável. Na prática, as sequências de RNA guia são geralmente de- senhadas para terem um comprimento de entre 17-24 nucleotídeos (por exemplo 19, 20, ou 21 nucleotídeos) e complementaridade com a se- quência do gene ou ácido nucleico visada. Geradores de gRNA e algo- ritmos customizados estão comercialmente disponíveis para uso no de- senho de RNA guia eficazes. Foi também alcançada edição gênica usando um RNA guia simples (sgRNA) quimérico, uma molécula de RNA simples manipulada (sintética) que mimetiza um complexo cr»RNA- tracrRNA ocorrendo naturalmente e contém tanto um tracrRNA (para ligação da nuclease) como pelo menos um crRNA (para guiar a nu- clease para a sequência visada para edição). Foi também demonstrado que sgRNAs quimicamente modificados são eficazes na edição do ge- noma; ver, por exemplo, Hendel et al., Nature Biotechnol. 985-991,
2015.
[00349] “Enquanto Casg9 de tipo selvagem gera quebras de fita dupla (DSB) em sequências de DNA específicas visadas por um gRNA, um número de endonucleases de CRISPR tendo funcionalidades modifica- das está disponível, por exemplo: uma versão nickase de Cas9 gera somente uma quebra de fita simples; uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) não corta o DNA alvo mas interfere na transcrição por impedi- mento estérico. dCas9 pode ser ainda fundida a um efetor para reprimir (CRISPRI) ou ativar (CRISPRa) a expressão de um gene alvo. Por exemplo, Cas9 pode ser fundida a um repressor da transcrição (por exemplo, um domínio KRAB) ou um ativador da transcrição (por exem- plo, uma fusão dCas9-VP64). Uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) fundida à nuclease Fokl (dCas9-Fokl) pode ser usada para ge- rar DSB em sequências alvo homólogas a dois gRNA. Ver, por exemplo, os numerosos plasmídeos CRISPR/Cas9 divulgados no e publicamente disponíveis a partir do repositório Addgene (Addgene, 75 Sidney St. Suite 550A, Cambridge, MA 02139; addgene.org/crispr/). Uma Cas9 nickase dupla que introduz duas quebras de fita dupla separadas, cada uma dirigida por um RNA guia separado, é descrita como alcançando edição do genoma mais precisa por Ran et al., Cell 154: 1380-1389,
2013.
[00350] “Tecnologia CRISPR para edição dos genes de eucariotas é descrita nas Publicações de Pedidos de Patentes US 2016/0138008 A1 e US 2015/0344912 A1 e nas patentes dos EUA 8,697,359, 8,771,945, 8,945,839, 8,999,641, 8,993,233, 8,895,308, 8,865,406, 8,889,418, 8,871,445, 8,889,356, 8,932,814, 8,795,965 e 8,906,616. A endonu- clease Cpf1 e correspondentes RNAs guia e locais PAM são divulgados na Publicação de Pedido de Patente dos EUA 2016/0208243 A1.
[00351] Em alguns casos, a modificação do genoma desejada en- volve recombinação homóloga, em que uma ou mais quebras de DNA de fita dupla na sequência de nucleotídeos alvo são geradas pela nu- clease guiada por RNA e RNA(s) guia(s), seguida por reparação da(s) quebra(s) usando um mecanismo de recombinação homóloga ("repara- ção dirigida pela homologia"). Em tais casos, um molde dador que codi- fica a sequência de nucleotídeos desejada a ser inserida ou modificada na quebra de fita dupla é proporcionado à célula ou sujeito; exemplos de moldes adequados incluem moldes de DNA de fita simples e moldes de DNA de fita dupla (por exemplo, ligados ao polipeptídeo descrito aqui). Em geral, um molde dador codificando uma mudança de nucleo- tídeos ao longo de uma região de menos do que cerca de 50 nucleotí- deos é proporcionado na forma de DNA de fita simples; modelos dado- res maiores (por exemplo, mais do que 100 nucleotídeos) são frequen- temente proporcionados como plasmídeos de DNA de fita dupla. Em alguns casos, o molde dador é proporcionado à célula ou sujeito em uma quantidade que é suficiente para alcançar a reparação dirigida pela homologia desejada, mas que não persiste na célula ou sujeito após um dado período de tempo (por exemplo, após um ou mais ciclos de divisão celular). Em alguns casos, um molde dador tem uma sequência de nu- cleotídeos de núcleo que difere da sequência de nucleotídeos alvo (por exemplo, uma região genômica endógena homóloga) em pelo menos 1, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo me- nos 40, pelo menos 50 ou mais nucleotídeos. Esta sequência de núcleo é flanqueada por braços de homologia ou regiões de elevada identidade de sequências com a sequência de nucleotídeos visada; em alguns ca- Sos, as regiões de elevada identidade incluem pelo menos 10, pelo me- nos 50, pelo menos 100, pelo menos 150, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, pelo menos 500, pelo menos 600, pelo menos 750 ou pelo menos 1000 nucleotídeos de cada lado da sequência de núcleo. Em alguns casos onde o molde dador está na forma de um DNA de fita simples, a sequência de núcleo é flanqueada por braços de ho- mologia incluindo pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80 ou pelo menos 100 nucleotídeos em cada lado da sequência de nú- cleo. Nos casos onde o molde dador está na forma de um DNA de fita dupla, a sequência de núcleo é flanqueada por braços de homologia incluindo pelo menos 500, pelo menos 600, pelo menos 700, pelo me- nos 800, pelo menos 900 ou pelo menos 1000 nucleotídeos em cada lado da sequência de núcleo. Em um caso, duas quebras de fita dupla separadas são introduzidas na sequência de nucleotídeos alvo da célula ou sujeito com uma Cas9 nickase dupla (ver Ran et al., Cell 154: 1380- 1389, 2013), seguido por entrega do molde doador.
[00352] Em alguns casos, a composição inclui um gRNA e uma nu- clease visada, por exemplo, uma Cas9, por exemplo, uma Cas9 de tipo selvagem, uma Cas9 nickase (por exemplo, Cas9 D10A), uma Cas9 morta (dCas9), eSpCas9, Cpf1, C2C01 ou C2C3 ou um ácido nucleico codificando uma tal nuclease. A escolha da nuclease e gRNA(s) é de-
terminada por se a mutação visada é uma deleção, substituição ou adi- ção de nucleotídeos, por exemplo, uma deleção, substituição ou adição de nucleotídeos a uma sequência visada. As fusões de uma endonu- clease cataliticamente inativa, por exemplo, uma Cas9 morta (dCas9, por exemplo, D10A; H840A) presa com a totalidade ou uma porção de (por exemplo, porção biologicamente ativa de) um (um ou mais) domí- nio(s) efetor(es) criam proteínas quiméricas que podem ser ligadas ao polipeptídeo para guiar a composição para locais de DNA específicos por uma ou mais sequências de RNA (sgRNA) para modular a atividade e/ou expressão de um ou mais sequências de ácidos nucleicos alvo.
[00353] Em -casos,o agente inclui um RNA guia (gRNA) para uso em um sistema CRISPR para edição gênica. Em alguns casos, o agente inclui uma nuclease de dedos de zinco (ZFN), ou um mRNA codificando um ZFN, que visa (por exemplo, cliva) uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, sequência de DNA) de um gene no patógeno. Em alguns casos, o agente inclui uma TALEN, ou um mRNA codificando uma TA- LEN, que visa (por exemplo, cliva) uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, sequência de DNA) em um gene no patógeno.
[00354] Por exemplo, o gRNA pode ser usado em um sistema CRISPR para manipular uma alteração em um gene no patógeno. Em outros exemplos, o ZFN e/ou TALEN podem ser usados para manipular uma alteração em um gene no patógeno. Alterações exemplificativas incluem inserções, deleções (por exemplo, nocautes), translocações, in- versões, mutações pontuais únicas ou outras mutações. A alteração pode ser introduzida no gene em uma célula, por exemplo, in vitro, ex vivo ou in vivo. Em alguns exemplos, a alteração aumenta o nível e/ou atividade de um gene no patógeno. Em outros exemplos, a alteração diminui o nível e/ou atividade de (por exemplo, inativa ou silencia) um gene no patógeno. Ainda em outro exemplo, a alteração corrige um de- feito (por exemplo, uma mutação causando um defeito), em um gene no patógeno.
[00355] Em alguns casos, o sistema CRISPR é usado para editar (por exemplo, para adicionar ou eliminar um par de bases) um gene alvo no patógeno. Em outros casos, o sistema CRISPR é usado para intro- duzir um códon de paragem prematura, por exemplo, diminuindo deste modo a expressão de um gene alvo. Ainda em outros casos, o sistema CRISPR é usado para desligar um gene alvo de uma maneira reversível, por exemplo, similarmente à interferência de RNA. Em alguns casos, o sistema CRISPR é usado para dirigir Cas para um promotor de um gene, bloqueando deste modo estericamente uma RNA polimerase.
[00356] Em alguns casos, um sistema CRISPR pode ser gerado para editar um gene no patógeno, usando tecnologia descrita, por exemplo, na Publicação dos E.U.A. No. 20140068797, Cong, Science 339: 819- 823, 2013; Tsai, Nature Biotechnol. 32: 6 569-576, 2014; Patente dos E.U.A. No.: 8,871,445; 8,865,406; 8,795,965; 8,771,945; e 8,697,359.
[00357] Em alguns casos, a técnica de interferência de CRISPR (CRISPRIi) pode ser usada para repressão transcricional de genes es- pecíficos no patógeno. Em CRISPRi, uma proteína Cas9 manipulada (por exemplo, dCas9 nula como nuclease ou proteína de fusão com dCas9, por exemplo, fusão dCas9-KRAB ou dCas9-SID4X) pode em- parelhar com um RNA guia específico da sequência (sgRNA). O com- plexo Cas9-gRNA pode bloquear RNA polimerase, interferindo deste modo no alongamento da transcrição. O complexo pode também blo- quear a iniciação da transcrição por interferência na ligação do fator de transcrição. O método CRISPRI é específico com efeitos fora do alvo mínimos e pode atuar como múltiplex, por exemplo, pode reprimir simul- taneamente mais do que um gene (por exemplo, usando múltiplos gRNA). Igualmente, o método CRISPRIi permite repressão gênica rever- sível.
[00358] Em alguns casos, a ativação gênica mediada por CRISPR
(CRISPRa) pode ser usada para ativação transcricional de um gene no patógeno. Na técnica CRISPRa, proteínas de fusão com dCas9 recru- tam ativadores transcricionais. Por exemplo, dCas9 pode ser fundida a polipeptídeos (por exemplo, domínios de ativação) tais como VP64 ou o domínio de ativação de p65 (p65D) e usado com sgRNA (por exemplo, um único sgRNA ou múltiplos saRNAs), para ativar um gene ou genes no patógeno. Múltiplos ativadores podem ser recrutados usando múlti- plos saRNAs -— isto pode aumentar a eficiência da ativação. Pode ser usada uma variedade de domínios de ativação e único ou múltiplos do- mínios de ativação. Ainda à manipulação de dCas9 para se recrutarem ativadores, os SsaRNAs podem também ser manipulados para se recru- tarem ativadores. Por exemplo, aptâmeros de RNA podem ser incorpo- rados em um sgRNA para se recrutarem proteínas (por exemplo, domí- nios de ativação) tais como VP64. Em alguns exemplos, o sistema me- diador de ativação sinérgica (SAM) pode ser usado para ativação trans- cricional. Em SAM, aptâmeros MS2 são adicionados ao saRNA. MS2 recruta a proteína de revestimento (MCP) de MS2 fundida a p65AD e fator de choque térmico 1 (HSF1).
[00359] —Astécnicas CRISPRi e CRISPRa são descritas em maior de- talhe, por exemplo, em Dominguez et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17: 5- 15, 2016, incorporado aqui por referência. Ainda, modificações epige- néticas mediadas por dCas9 e ativação e repressão simultâneas usando sistemas CRISPR, como descrito em Dominguez et a/l., podem ser usa- das para modular um gene no patógeno. iii. Moléculas pequenas
[00360] Em alguns casos, a composição de controle de patógenos inclui uma molécula pequena, por exemplo, uma molécula pequena bi- ológica. Numerosos agentes de moléculas pequenas são úteis nos mé- todos e composições descritos aqui.
[00361] As moléculas pequenas incluem, mas não estão limitados a,
peptídeos pequenos, peptidomiméticos (por exemplo, peptoides), ami- noácidos, análogos de aminoácidos, polinucleotídeos sintéticos, análo- gos de polinucleotídeos, nucleotídeos, análogos de nucleotídeos, com- postos orgânicos e inorgânicos (incluindo compostos hetero-orgânicos e organometálicos) tendo geralmente um peso molecular menor do que cerca de 5.000 gramas por mole, por exemplo, compostos orgânicos ou inorgânicos tendo um peso molecular menor do que cerca de 2.000 gra- mas por mole, por exemplo, compostos orgânicos ou inorgânicos tendo um peso molecular menor do que cerca de 1.000 gramas por mole, por exemplo, compostos orgânicos ou inorgânicos tendo um peso molecular menor do que cerca de 500 gramas por mole, e sais, ésteres e outras formas farmaceuticamente aceitáveis de tais compostos.
[00362] A molécula pequena descrita aqui pode ser formulada em uma composição ou associada ao PMP para qualquer uma das compo- sições de controle de patógenos ou métodos relacionados descritos aqui. As composições divulgadas aqui podem incluir qualquer número ou tipo (por exemplo, classes) de moléculas pequenas, tal como pelo menos cerca de qualquer um de 1 molécula pequena, 2, 3, 4, 5, 10,15, ou mais moléculas pequenas. Uma concentração adequada de cada molécula pequena na composição depende de fatores tais como eficá- cia, estabilidade da molécula pequena, número de moléculas pequenas distintas, a formulação e métodos de aplicação da composição. Em al- guns casos, em que a composição inclui pelo menos dois tipos de mo- léculas pequenas, a concentração de cada tipo de molécula pequena pode ser a mesma ou diferente.
[00363] “Uma composição de controle de patógenos incluindo uma molécula pequena como descrito aqui pode ser contatada com o pató- geno, ou seu vetor, em uma quantidade e durante tempo suficientes para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de moléculas pequenas dentro de ou em um patógeno, ou seu vetor, e (b) diminuir a aptidão do patógeno.
[00364] Em alguns casos, a composição de controle de patógenos incluindo uma molécula pequena como descrito aqui pode ser adminis- trada a um animal tendo ou em risco de uma infeção por um patógeno em uma quantidade e durante tempo suficientes para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concen- tração de molécula pequena no animal; e (b) diminuir ou eliminar o pa- tógeno.
[00365] Em alguns casos, a composição de controle de patógenos das composições e métodos descritos aqui inclui um metabolito secun- dário. Os metabolitos secundários são derivados de moléculas orgâni- cas produzidas por um organismo. Os metabolitos secundários podem atuar (i) como agentes competitivos usados contra bactérias, fungos, amibas, plantas, insetos e animais grandes; (ii) como agentes transpor- tadores de metais; (ili) como agentes de simbiose entre micróbios e plantas, insetos e animais superiores; (iv) como hormônios sexuais; e (v) como efetores de diferenciação.
[00366] O metabolito secundário usado aqui pode incluir um metabo- lito de qualquer grupo conhecido de metabolitos secundários. Por exem- plo, os metabolitos secundários podem ser classificados nos seguintes grupos: alcaloides, terpenoides, flavonoides, glicosídeos, fenóis natu- rais (por exemplo, gossypol, ácido acético), enais (por exemplo, trans- cinamaldeído), fenazinas, bifenóis e dibenzofuranos, policetídeos, pep- tídeos de ácido graxo sintase, peptídeos não ribossômicos, peptídeos ribossomicamente sintetizados e pós-translacionalmente modificados, polifenóis, polissacarídeos (por exemplo, quitosana) e biopolímeros. Para uma revisão profunda de metabolitos secundários ver, por exem- plo, Vining, Annu. Rev. Microbiol. 44: 395-427, 1990.
VI. Kits
[00367] Apresente invenção proporciona também um kit para o con- trole, prevenção ou tratamento de doenças causadas por patógenos de animais ou para controlar vetores de tais patógenos, onde o kit inclui um recipiente tendo uma composição de controle de patógenos descrita aqui. O kit pode incluir ainda material de instrução para aplicar ou entre- gar (por exemplo, a um animal, a um patógeno de animais ou a um vetor de um patógeno de animais) a composição de controle de patógenos para controlar, prevenir ou tratar uma infeção de acordo com um método da presente invenção. O especialista perito apreciará que as instruções para aplicar a composição de controle de patógenos nos métodos da presente invenção podem ser qualquer forma de instrução. Tais instru- ções incluem, mas não estão limitadas a, material de instrução escrito (tal como uma etiqueta, um livreto, um panfleto), material de instrução oral (tal como em uma fita cassete ou CD) ou instruções de vídeo (tal como em uma fita de vídeo ou DVD).
EXEMPLOS
[00368] O seguinte é um exemplo dos métodos da invenção. É en- tendido que várias outras modalidades podem ser praticadas, dada a descrição geral proporcionada acima. Exemplo 1: Isolamento de Pacotes de Mensageiros de Plantas a partir de plantas
[00369] Esteexemplo demonstra o isolamento de pacotes mensagei- ros de plantas (PMPs) em bruto a partir de várias fontes de plantas, inclu- indo o apoplasto das folhas, apoplasto das sementes, raiz, fruta, vegetal, pólen, floema, seiva do xilema e meio de cultura de células de plantas. Desenho experimental: a) Isolamento de PMP a partir do apoplasto de folhas de Arabidopsis thaliana
[00370] As sementes de Arabidopsis (Arabidopsis thaliana Col-0) são esterilizadas à superfície com lixívia a 50% e plaqueadas em meio de Murashige e Skoog 0,53 contendo ágar a 0,8%. As sementes são ver- nalizadas durante 2 d a 4 ºC antes de serem movidas para condições de dias curtos (dias de 9 h, 22 ºC, 150 uEm*?). Após 1 semana, as plân- tulas são transferidas para Pro-Mix PGX. As plantas são cultivadas du- rante 4-6 semanas antes da coleta.
[00371] Os PMPs são isolados a partir da lavagem apoplástica de rosetas de Arabidopsis com 4-6 semanas de idade, como descrito por Rutter e Innes, Plant Physiol. 173 (1): 728-741, 2017. Brevemente, ro- setas inteiras são coletadas na raiz e infiltradas a vácuo com tampão de isolamento de vesículas (MES a 20 mM, CaCl2 a 2 mM e NaCl a 0,1 M, pH 6). As plantas infiltradas são cuidadosamente enxugadas para se remover fluido em excesso, colocadas dentro de seringas de 30 mL e centrifugadas em tubos cônicos de 50 mL a 700 g durante 20min a 2ºC para se coletar o fluido extracelular do apoplasto contendo EVs. De se- guida, o fluido extracelular do apoplasto é filtrado através de um filtro de 0,85 um para se removerem as partículas grandes, e os PMPs são pu- rificados como descrito no Exemplo 2. b) Isolamento de PMP a partir do apoplasto de sementes de girassol
[00372] Sementes de girassol intactas (H. annuus L.) são embebidas em água durante 2 horas, descascadas para se remover o pericarpo, e o fluido extracelular apoplástico é extraído por um procedimento de in- filtração a vácuo-centrifugação modificado, adaptado a partir de Re- gente et al., FEBS Letters. 583: 3363-3366, 2009. Brevemente, as se- mentes são imersas em tampão de isolamento de vesículas (MES a 20 MM, CaCl7 a 2mMM e NaCl a 0,1 M, pH 6) e sujeitas a três pulsos de vácuo de 10 s, separados por intervalos de 30 s a uma pressão de 45 kPa. As sementes infiltradas são recuperadas, secas em papel de filtro, colocadas em filtros de frita de vidro e centrifugadas durante 20 min a 400 g a 4 ºC. O fluido extracelular do apoplasto é recuperado, filtrado através de um filtro de 0,85 um para se removerem as partículas gran- des, e os PMPs são purificados como descrito no Exemplo 2. c) Isolamento de PMP a partir de raízes de gengibre
[00373] Raízes de rizoma de gengibre frescas (Zingiber officinale) são adquiridas de um fornecedor local e lavadas 3x com PBS. Um total de 200 gramas de raízes lavadas é triturado em um misturador (liquidificador Osterizer de 12 velocidades) à velocidade mais elevada durante 10 min (pausa 1 min para cada 1 min de combinação), e os PMPs são isolados como descrito em Zhuang et al., J Extracellular Vesicles. 4 (1): 28713,
2015. Brevemente, o suco de gengibre é sequencialmente centrifugado a
1.000 g durante 10 min, 3.000 g durante 20 min e 10.000 g durante 40 min para se removerem as partículas grandes do sobrenadante contendo PMP. Os PMPs são purificados como descrito no Exemplo 2. d) Isolamento de PMP a partir de suco de toranja
[00374] Toranjas frescas (Citrus x paradisi) são adquiridas de um for- necedor local, suas cascas são removidas, e a fruta é manualmente prensada ou triturada em um misturador (liquidificador Osterizer de 12 velocidades) à velocidade mais elevada durante 10 min (pausa 1 min para cada minuto de combinação) para se coletar o suco, como descrito por Wang et al., Molecular Therapy. 22 (3): 522-534, 2014 com modifica- ções mínimas. Brevemente, o suco/polpa de suco é sequencialmente cen- trifugado a 1.000 g durante 10 min, 3.000 g durante 20 min e 10.000 g durante 40 min para se removerem as partículas grandes do sobrenadante contendo PMP. Os PMPs são purificados como descrito no Exemplo 2. e) Isolamento de PMP a partir de cabeças de brócolis
[00375] Os PMPs de brócolis (Brassica oleracea var. Italica) são iso- lados como previamente descrito (Deng et al., Molecular Therapy, 25 (7): 1641-1654, 2017). Brevemente, os brócolis frescos são adquiridos de um fornecedor local, lavados três vezes com PBS e triturados em um misturador (liquidificador Osterizer de 12 velocidades) à velocidade mais elevada durante 10 min (pausa 1 min para cada minuto de combi- nação). O suco de brócolis é depois sequencialmente centrifugado a
1.000 g durante 10 min, 3.000 g durante 20 min e 10.000 g durante 40 min para se removerem as partículas grandes do sobrenadante con- tendo PMP. Os PMPs são purificados como descrito no Exemplo 2. f) Isolamento de PMP a partir de pólen de oliveira
[00376] Os PMPs de pólen de oliveira (Olea europaea) são isolados como previamente descrito em Prado et al., Molecular Plant. 7 (3): 573- 577, 2014. Brevemente, o pólen de oliveira (0,1 g) é hidratado em uma câmara úmida à temperatura ambiente durante 30 min antes de ser transferido para placas de Petri (15 cm em diâmetro) contendo 20 mL de meio de germinação: sacarose a 10%, Ca(NO;z)2 a 0,03%, KNO;3 a 0,01%, MgSO. a 0,02% e H3BO; a 0,03%. O pólen é germinado a 30 ºC na escuridão durante 16 h. Os grãos de pólen são considerados germi- nados somente quando o tubo é mais longo do que o diâmetro do grão de pólen. O meio de cultura contendo PMPs é coletado e limpo de de- tritos de pólen por duas filtrações sucessivas em filtros de 0,85 um por centrifugação. Os PMPs são purificados como descrito no Exemplo 2. g) Isolamento de PMP a partir da seiva do floema de Arabidopsis
[00377] Assementes de Arabidopsis (Arabidopsis thaliana Col-0) são esterilizadas à superfície com lixívia a 50% e plaqueadas em meio de Murashige e Skoog 0,53 contendo ágar a 0,8%. As sementes são ver- nalizadas durante 2 d a 4 ºC antes de serem movidas para condições de dias curtos (dias de 9 h, 22 ºC, 150 uEm*?). Após 1 semana, as plân- tulas são transferidas para Pro-Mix PGX. As plantas são cultivadas du- rante 4-6 semanas antes da coleta.
[00378] A seivado floema de folhas de roseta de Arabidopsis com 4- 6 semanas de idade é coletada como descrito por Tetyuk et al., JoVE. 80, 2013. Brevemente, as folhas são cortadas na base do pecíolo, em- pilhadas e colocadas em um tubo de reação contendo K2-EDTA a 20 mM durante uma hora na escuridão para prevenir o selamento da ferida. As folhas são gentilmente removidas do recipiente, lavadas extensa- mente com água destilada para se remover todo o EDTA, colocadas em um tubo limpo, e a seiva do floema é coletada durante 5-8 horas na escuridão. As folhas são descartadas, a seiva do floema é filtrada atra- vés de um filtro de 0,85 um para se removerem as partículas grandes, e os PMPs são purificados como descrito no Exemplo 2. h) Isolamento de PMP a partir da seiva do xilema do tomate
[00379] Sementes de tomate (Solanum lycopersicum) são plantadas em um único vaso em solo rico orgânico, tal como Sunshine Mix (Sun Gro Horticulture, Agawam, MA) e mantidas em uma estufa entre 22 ºC e 28 ºC. Cerca de duas semanas após germinação, na etapa de duas folhas ver- dadeiras, as plântulas são transplantadas individualmente para vasos (10 cm de diâmetro e 17 cm de profundidade) preenchidos com solo arenoso estéril contendo areia a 90% e mistura orgânica a 10%. As plantas são mantidas em uma estufa a 22-28 ºC durante quatro semanas.
[00380] A seiva do xilema de tomateiros com 4 semanas de idade é coletada como descrito por Kohlen et al., Plant Physiology. 155 (2): 721- 734, 2011. Brevemente, os tomateiros são decapitados acima do hipo- cótilo, e um anel de plástico é colocado em torno do caule. A seiva do xilema acumulada é coletada durante 90 minutos após decapitação. À seiva do xilema é filtrada através de um filtro de 0,85 um para se remo- verem as partículas grandes, e os PMPs são purificados como descrito no Exemplo 2. i) Isolamento de PMP a partir do meio de cultura de células BY-2 do tabaco
[00381] Células de tabaco BY-2 (Nicotiana tabacum L cv. Bright Yel- low 2) são cultivadas na escuridão a 26 ºC, em um agitador a 180 rom em meio de cultura MS (Murashige e Skoog, 1962) BY-2 (pH 5,8) com- preendendo sais de MS (Duchefa, Haarlem, Países Baixos, em H
MO0221) suplementado com sacarose a 30 g/L, di-hidrogenofosfato de potássio a 2,0 mg/L, mio-inositol a 0,1 g/L, ácido 2,4-diclorofenoxiacé- tico a 0,2 mg/L e tiamina HCl a 1 mg/L. As células BY-2 são subcultiva- das semanalmente por transferência de 5% (v/v) de uma cultura de cé- lulas com 7 dias de idade para 100 mL de meio líquido fresco. Após 72- 96 horas, o meio cultivado BY-2 é coletado e centrifugado a 300 g a 4 ºC durante 10 minutos para se removerem as células. O sobrenadante contendo PMPs é coletado e limpo de detritos por filtração em filtro de 0,85 um. Os PMPs são purificados como descrito no Exemplo 2. Exemplo 2: Produção de Pacotes de Mensageiros de Plantas (PMPs) purificados
[00382] Esteexemplo demonstra a produção de PMPs purificados a partir de frações de PMP em bruto como descrito no Exemplo 1, usando ultrafiltração combinada com cromatografia por exclusão de tamanhos, um gradiente de densidade (iodixanol ou sacarose) e a remoção de agregados por precipitação ou cromatografia por exclusão de tamanhos. Desenho experimental: a) Produção de PMP's de toranja purificados usando ultrafiltração com- binada com cromatografia por exclusão de tamanhos
[00383] A fração de PMP de toranja em bruto do Exemplo 1a é con- centrada usando filtro de rotação Amicon com limiar de exclusão de peso molecular (MWCO) de 100 kDA (Merck Millipore). Subsequente- mente, a solução de PMP em bruto concentrada é carregada em uma coluna de cromatografia por exclusão de tamanhos PURE-EV (Hansa- BioMed Life Sciences Ltd) e isolada de acordo com as instruções do fabricante. As frações contendo PMP purificadas são agrupadas após eluição. Opcionalmente, os PMPs podem ser ainda concentrados usando um filtro de rotação Amicon com MWCO de 100 kDa ou por Fil- tração de Fluxo Tangencial (TFF). Os PMPs purificados são analisados como descrito no Exemplo 3.
b) Produção de PMPs de apoplasto de Arabidopsis purificados usando um gradiente de iodixanol
[00384] Os PMPs de apoplasto de folhas de Arabidopsis em bruto são isolados como descrito no Exemplo 1a, e os PMPs são purificados por uso de um gradiente de iodixanol como descrito em Rutter e Innes, Plant Physiol. 173 (1): 728-741, 2017. Para se prepararem gradientes descontínuos de iodixanol (OptiPrep; Sigma-Aldrich) são criadas solu- ções de iodixanol a 40% (v/v), 20% (v/v), 10% (v/v) e 5% (v/v) por dilui- ção de uma solução de estoque aquosa de OptiPrep a 60% em tampão de isolamento de vesículas (VIB; MES a 20 mM, CaCl2 a 2 mM e NaCl a 0,1 M, pH 6). O gradiente é formado por colocação em camadas de 3 mL de solução a 40%, 3 mL de solução a 20%, 3 mL de solução a 10% e 2 mL de solução a 5%. A solução de PMP de apoplasto em bruto do Exemplo 1a é centrifugada a 40.000 g durante 60 min a 4 “ºC. O pélete é ressuspenso em 0,5 mL de VIB e colocado em camadas no topo do gradiente. A centrifugação é realizada a 100.000 g durante 17 ha 4 ºC. Os primeiros 4,5 mL no topo do gradiente são descartados e, subse- quentemente, 3 volumes de 0,7 mL que contêm os PMPs do apoplasto são coletados, trazidos para 3,5 mL com VIB e centrifugados a 100.000 g durante 60 min a 4 “ºC. Os péletes são lavados com 3,5 mL de VIB e repeletizados usando as mesmas condições de centrifugação. Os péle- tes de PMP purificados são combinados para análise subsequente, como descrito no Exemplo 3. c) Produção de PMPs de toranja purificados usando um gradiente de Sacarose
[00385] Os PMPs de suco de toranja em bruto são isolados como descrito no Exemplo 1d, centrifugados a 150.000 g durante 90 min, e o pélete contendo PMP é ressuspenso em 1 mL de PBS como descrito (Mu et al., Molecular Nutrition & Food Research. 58 (7): 1561-1573, 2014). O pélete ressuspenso é transferido para um gradiente de passos de sacarose (8%/15%/30%/45%/60%) e centrifugado a 150.000 g du- rante 120 min para produzir PMPs purificados. Os PMPs de toranja pu- rificados são coletados a partir da interface a 30%/45% e, subsequen- temente, analisados, como descrito no Exemplo 3.
d) Remoção de agregados a partir de PMPs de toranja
[00386] De modo a se removerem agregados de proteína de PMPs de toranja produzidos como descrito no Exemplo 1d ou PMPs purifica- dos do Exemplo 2a-c, um passo de purificação adicional pode ser in- cluído. A solução de PMP produzida é submetida a uma gama de pHs para se precipitarem agregados de proteína em solução. O pH é ajus- tado até 3, 5, 7, 9 ou 11 com a adição de hidróxido de sódio ou ácido clorídrico. O pH é medido usando uma sonda de pH calibrada. Logo que a solução esteja ao pH especificado, ela é filtrada para se removerem os particulados. Alternativamente, a solução de PMP isolada pode ser floculada usando a adição de polímeros carregados, tais como Polymin- P ou Praestol 2640. Brevemente, 2-5 g de Polymin-P ou Praestol 2640 são adicionados à solução e misturado com um impulsor. A solução é depois filtrada para se removerem os particulados. Alternativamente, os agregados são solubilizados por aumento da concentração de sal. NaCl é adicionado à solução de PMP até estar a 1 mol/L. A solução é depois filtrada para se purificarem os PMPs. Alternativamente, os agregados são solubilizados por aumento da temperatura. A mistura de PMP iso- lada é aquecida sob agitação até ter alcançado uma temperatura uni- forme de 50 ºC durante 5 minutos. A mistura de PMP é depois filtrada para se isolarem os PMPs. Alternativamente, os contaminantes solúveis de soluções de PMP são separados por coluna de cromatografia por exclusão de tamanhos de acordo com procedimentos padrão, onde os PMP's eluem nas primeiras frações, ao passo que as proteínas e as ri- bonucleoproteínas e algumas lipoproteínas são eluídas mais tarde. À eficiência da remoção de agregados de proteína é determinada por me- dição e comparação da concentração de proteína antes da e após re- moção de agregados de proteína através da quantificação de proteínas BCA/Bradford. Os PMPs produzidos são analisados como descrito no Exemplo 3. Exemplo 3: Caracterização de Pacotes de Mensageiros de Plantas
[00387] Esteexemplo demonstra a caracterização de PMPs produzi- dos como descrito no Exemplo 1 ou Exemplo 2. Desenho experimental: a) Determinação da concentração de PMP
[00388] A concentração de partículas de PMP é determinada por Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA) usando um Malvern NanoSight, ou por Sensor de Pulso Resistente Ajustável (TRPS) usando um iZon qNano, seguindo as instruções do fabricante. A concentração de proteína de PMPs purificados é determinada por uso do ensaio DC Protein (Bio-Rad). A concentração de lipídeos de PMPs purificados é determinada usando um corante lipofílico fluorescente, tal como DIOC6 (ICN Biomedicals), como descrito por Rutter e Innes, Plant Physiol. 173 (1): 728-741, 2017. Brevemente, os péletes de PMP purificados do Exemplo 2 são ressuspensos em 100 mL de DiOC6 a 10 mM (ICN Bi- omedicals) diluído com tampão de MES (MES a 20 mM, pH 6) mais cocktail de inibidor de protease de plantas a 1% (Sigma-Aldrich) e dis- sulfeto de 2,29-dipiridila a 2 mM. Os PMPs ressuspensos são incubados a 37 ºC durante 10 min, lavados com 3 mL de tampão de MES, repele- tizados (40.000 g, 60 min, a 4 ºC) e ressuspensos em tampão de MES fresco. A intensidade de fluorescência de DIOC6 é medida à excitação de 485 nm e à emissão de 535 nm. b) Caracterização biofísica e molecular de PMPs
[00389] Os PMPs são caracterizados por microscopia eletrônica e crioeletrônica em um microscópio eletrônico de transmissão JEOL 1010,
seguindo o protocolo de Wu et al., Analyst. 140 (2): 386-406, 2015. O tamanho e o potencial zeta dos PMPs são também medidos usando um Malvern Zetasizer ou iZon qNano, seguindo as instruções do fabricante. Os lipídeos são isolados a partir de PMPs usando extração com cloro- fórmio e caracterizados com LC-MS/MS como demonstrado em Xiao et al. Plant Cell. 22 (10): 3193-3205, 2010. Os lipídeos de glicosil inositol fosforilceramidas (GIPCs) são extraídos e purificados como descrito por Cacas et al., Plant Physiology. 170: 367-384, 2016, e analisados por LC- MS/MS como descrito acima. O RNA total, DNA e proteína são caracte- rizados usando kits Quant-lt da Thermo Fisher de acordo com as instru- ções. As proteínas nos PMPs são caracterizadas por LC-MS/MS se- guindo o protocolo em Rutter e Innes, Plant Physiol. 173 (1): 728-741,
2017. O RNA e o DNA são extraídos usando Trizol, preparados em bi- bliotecas com o kit TruSegq Total RNA with Ribo-Zero Plant e o Kit Nex- tera Mate Pair Library Prep da Illumina e sequenciados em um Illumina MiSeg seguindo as instruções do fabricante. Exemplo 4: Caracterização da estabilidade dos Pacotes de Mensa- geiros de Plantas
[00390] Este exemplo demonstra a medição da estabilidade de PMP's sob uma ampla variedade de condições de armazenamento e fi- siológicas. Desenho experimental:
[00391] Os PMPs produzidos como descrito nos Exemplos 1 e 2 são sujeitos a várias condições. Os PMPs são suspensos em água, saca- rose a 5% ou PBS e deixados durante 1, 7, 30 e 180 dias a -20 ºC, 4"C, ºC e 37 ºC. Os PMPs são também suspensos em água e secos usando um sistema de evaporador rotativo e deixados durante 1,7 e 30 e 180 dias a 4 ºC, 20 ºC e 37 ºC. Os PMPs são também suspensos em água ou solução de sacarose a 5%, congelados em nitrogênio líquido e liofiizados. Após 1, 7, 30 e 180 dias, os PMPs secos e liofilizados são depois ressuspensos em água. As três experiências prévias com condi- ções a temperaturas acima de O ºC foram também expostas a um simu- lador de luz solar artificial de modo a se determinar a estabilidade do conteúdo em condições de UV externas simuladas. Os PMPs são tam- bém sujeitos a temperaturas de 37 ºC, 40 ºC, 45 ºC, 50 ºC e 55 ºC durante 1, 6 e 24 horas em soluções tamponadas com um pH de 1,3, 5, 7, e 9 com ou sem adição de 1 unidade de tripsina ou em outros fluidos gástricos simulados.
[00392] Após cada um destes tratamentos, os PMPs são trazidos de volta a 20 ºC, neutralizados até pH 7,4 e caracterizados usando alguns dos ou todos os métodos descritos no Exemplo 3. Exemplo 5: Tratamento de um fungo com Pacotes de Mensageiros de Plantas
[00393] Este exemplo demonstra a capacidade dos PMPs produzi- dos a partir de rosetas de Arabidopsis thaliana de diminuir a aptidão de um fungo patogênico. Em este exemplo, a levedura Saccharomyces ce- revisiae como um modelo de fungo patogênico.
[00394] Os fungos patogênicos como espécies de Candida represen- tam a principal causa de infeções fúngicas oportunistas globalmente. Saccharomyces cerevisiae (também conhecida como "fermento de pa- deiro") é maioritariamente considerada como sendo um comensal diges- tivo ocasional. No entanto, desde a década de 1990, tem existido um número crescente de relatórios sobre sua implicação como um agente etiológico de infeção invasiva. As infeções por fungos patogênicos estão tipicamente associadas a elevada morbidade e mortalidade, maioritari- amente devido à eficácia limitada dos fármacos antifúngicos correntes. Desenho terapêutico:
[00395] A solução de PMP de apoplasto de Arabidopsis foi formulada com O (controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 ug de proteína PMP/mL do Exemplo 1a, em 10 mL de PBS.
Desenho experimental: a) Marcação de PMPs de apoplasto com um corante membranar lipofí- lico
[00396] Os PMPs de apoplasto de Arabidopsis thaliana são isolados e purificados como descrito nos Exemplos 1-2 e são marcados com PKH26 (Sigma), de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações. Brevemente, 50 mg de PMPs de apoplasto em 1 mL de C diluído ou o kit PKH26 são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37 ºC durante 5 min. A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por lavagem por centrifugação a 150.000 g durante 90 min e os péletes de PMP mar- cados são ressuspensos em água estéril. b) Captação de PMP de apoplasto por Saccharomyces cerevisiae
[00397] Saccharomyces cerevisiae é obtida a partir da ATCC (tt9763) e mantida a 30 ºC em caldo de extrato de levedura, peptona e dextrose (YPD) como indicado pelo fabricante. Para se determinar a captação de PMP por S. cerevisiae, as células de levedura são cultivadas até uma ODeoo de 0,4-0,6 em meio de seleção e incubadas com O (controle ne- gativo), 1, 10, 50, 100 ou 250 ug/mL de PMPs derivados de apoplasto marcados com PKH26 diretamente em lâminas de vidro. Adicional- mente a um controle de PBS, as células de S. cerevisiae são incubadas na presença de corante PKH26 (concentração final 5 ug/mL). Após in- cubação de 5 min, 30 min e 1 h à temperatura ambiente são adquiridas imagens em um microscópio de fluorescência de elevada resolução. Os PMPs derivados de apoplasto são captados por células de levedura quando PMPs vermelhos são observados no citoplasma ou se o cito- plasma da célula de levedura ficar vermelho, versus a coloração exclu- siva da membrana celular pelo corante PKH26. Para se avaliar a capta- ção de PMP, a percentagem de células de levedura com um citoplasma vermelho/PMP's vermelhos no citoplasma, versus coloração somente da membrana é comparada entre as células tratadas com PMP e os con- troles somente com PBS e corante PKH26. c) Tratamento de S. cerevisiae com uma solução de PMP de apoplasto de Arabidopsis in vitro
[00398] Para se determinar o efeito do tratamento com PMP de apo- plasto de Arabidopsis na aptidão de células de levedura é realizado um teste de sensibilidade a fármacos modificado. Células de S. cerevisiae (10º células/mL) são misturadas com ágar YPD fundido (aproximada- mente 40 ºC) e vertidas em uma placa de Petri. Após a solidificação do ágar, 5 uL de soluções de O (PBS, controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 ug de proteína PMP/mL são colocados na placa. As placas são incubadas a 30 “C, e as zonas de inibição (círculos escuros) são avali- adas após 2 e 3 dias.
[00399] — Adicionalmente, um teste de pontos é realizado para se ava- liar o efeito de PMPs no crescimento da levedura. As células de S. ce- revisiae são cultivadas durante a noite em meio YPD. As células são depois suspensas em solução salina normal até uma DOsoo de 0,1 (Agoo). Cinco microlitros de diluições em série de cinco vezes de cada cultura de levedura são colocados em placas YPD na ausência (controle de PBS) e presença de 1, 10, 50, 100 ou 250 ug de proteína PMP/mL. As diferenças de crescimento são registradas após incubação das pla- cas durante 48 h a 30 ºC.
[00400] O efeito geral dos PMPs de apoplasto de Arabidopsis na ap- tidão fúngica é determinado por comparação das zonas de inibição e diferenças de crescimento entre o controle de PBS e as células fúngicas tratadas com PMP. Exemplo 6: Tratamento de uma bactéria com Pacotes de Mensagei- ros de Plantas
[00401] Este exemplo demonstra a capacidade dos PMPs de apo- plasto purificados de rosetas de Arabidopsis thaliana de serem captados por bactérias e de diminuírem a aptidão da bactéria patogênica Esche- richia coli. Em este exemplo, E. coli é usada como um patógeno bacte- riano modelo.
[00402] —Asdoenças humanas e animais desencadeadas por patóge- nos bacterianos, como Staphylococcus aureus, Salmonella e E. coli, causam morbidade e mortalidade significativas, devido à eficácia limi- tada e resistência crescente aos fármacos antimicrobianos correntes. Desenho terapêutico:
[00403] A solução de PMP de apoplasto de Arabidopsis é formulada com O (controle negativo), 1, 10, 50, 100 ou 250 ug de proteína PMP/mL em 10 mL de água estéril. a) Marcação de PMPs de apoplasto com um corante membranar lipofílico
[00404] Os PMPs de apoplasto de Arabidopsis thaliana são PMPs produzidos a partir de como descrito nos Exemplos 1-2 e são marcados com PKH26 (Sigma) de acordo com o protocolo do fabricante, com al- gumas modificações. Brevemente, 50 mg de PMPs são diluídos em 1 mL de C diluído são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37 ºC durante 5 min. A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por lavagem por centrifuga- ção a 150.000 g durante 90 min e os péletes de PMP marcados são res- suspensos em água estéril e analisado como descrito no Exemplo 3. b) Captação de PMP de apoplasto por E. coli
[00405] As E. colisão adquiridas a partir da ATCC (* 25922) e culti- vadas em Ágar de Soja de Tripticase/caldo a 37 ºC de acordo com as instruções do fabricante. Para se determinar a captação de PMP por E. coli, 10 ul de uma suspensão bacteriana de 1 mL durante a noite são incubados com O (controle negativo), 1, 10, 50, 100 ou 250 pug/mL de PMPs de apoplasto marcados com PKH26 diretamente em uma lâmina de vidro. Adicionalmente a um controle de água, as bactérias E. colisão incubadas na presença de corante PKH26 (concentração final 5 ug/mL).
Após incubação de 5 min, 30 min e 1 h à temperatura ambiente são adquiridas imagens em um microscópio de fluorescência de elevada re- solução. Os PMPs de apoplasto são captados por bactérias quando o citoplasma da bactéria fica vermelho versus a coloração exclusiva da membrana celular pelo corante PKH26. A percentagem de bactérias tra- tadas com PKH26-PMP com um citoplasma vermelho em comparação com tratamentos de controle somente com PBS e corante PKH26 é re- gistrada para se determinar a captação de PMP.
c) Tratamento de E. coli com uma solução de PMP de apoplasto de Ara- bidopsis in vitro
[00406] A capacidade dos PMPs de apoplasto de Arabidopsis de afe- tarem o crescimento de E. coli é determinada usando um método de suscetibilidade à difusão em disco padrão modificado. Brevemente, uma suspensão de inóculo de E. coli é preparada por seleção de várias co- lônias morfologicamente similares a partir de um crescimento durante a noite (16-24 h de incubação) em um meio não seletivo com uma alça estéril ou uma zaragato de algodão e suspensão das colônias em solu- ção salina estéril (NaCl a 0,85% p/v em água) até à densidade de um padrão 0,5 de McFarland, correspondendo aproximadamente a 1-2x10º CFU/mL. Placas de ágar Mueller-Hinton (diâmetro de 150 mm) são ino- culadas com a suspensão de E. coli, por imersão de uma zaragatoa de algodão estéril na suspensão de inóculo, remoção do fluido em excesso a partir da zaragatoa e espalhamento das bactérias uniformemente so- bre a superfície inteira da placa de ágar por esfregaço em três direções. De seguida, 3 uL de água (controle negativo), 1, 10, 50, 100 ou 250 ug de proteína PMP/ML são colocados na planta e deixados a secar. As placas são incubadas durante 16-18 horas a 35 ºC, fotografadas e digi- talizadas. O diâmetro da zona lítica (área sem bactérias) em torno da área manchada é medido. As zonas líticas de controle (água) e tratadas com PMP são comparadas para se determinar o efeito bactericida de
PMPs de apoplasto de Arabidopsis.
Exemplo 7: Tratamento de um inseto parasitário com PMPs
[00407] Esteexemplo demonstra a capacidade de matar ou diminuir a aptidão de um inseto parasitário, tal como percevejos, por seu trata- mento com uma solução de PMPs produzidos a partir de uma planta, tais como raízes de gengibre. Em este exemplo, os percevejos são usa- dos como um organismo modelo para insetos parasitários.
[00408] Os percevejos (Cimex lectularius) são ectoparasitas hema- tófagos que são uma importante praga emergente de saúde pública glo- balmente. A indisponibilidade de inseticidas residuais eficazes e a maior resistência a inseticidas piretroides em populações de percevejos justi- ficam o desenvolvimento de opções de tratamento eficazes e ambien- talmente seguras.
Desenho terapêutico:
[00409] A solução de PMP de raiz de gengibre é formulada com O (controle negativo), 1, 10, 50, 100 e 250 ug de proteína PMP/mL em 10 mL de PBS.
Desenho experimental: a) Cultivo de percevejos (Cimex lectularius)
[00410] Cimex /lectularius são obtidos a partir dos Sierra Research Laboratories (Modesto, CA). As colônias de percevejos são mantidas em compartimentos de vidro contendo refúgios de papelão e mantidos em um fotoperíodo 12:12 a 25 ºC e umidade a 40-45% (ambiente). As colônias são alimentadas com sangue uma vez por semana com um alimentador de membrana de parafilme contendo sangue de coelho des- fibrinado (Hemostat Laboratories, Dixon, CA).
b) Tratamento de Cimex lectularius com uma solução de PMP de raiz de gengibre
[00411] PMPs de raiz de gengibre são isolados como descrito no
Exemplo 1, e o efeito do tratamento com PMP na sobrevivência, fecun- didade e desenvolvimento de percevejos é determinado. Antes do tra- tamento, percevejos adultos com 0-2 semanas de idade que não foram alimentados com sangue durante quatro dias são isolados e colocados em jarros de vidro para permitir o acasalamento durante dois dias. Os machos são separados, e os percevejos fêmeas são separados em co- ortes experimentais de 10-15 insetos que são alojados em conjunto. Os percevejos fêmeas são tratados permitindo que se alimentem de san- gue de coelho desfibrinado enriquecido com uma concentração final de O (PBS, controle negativo), 1, 10, 50, 100 ou 250 ug de proteína PMP/mL durante 15 min até totalmente ingurgitados. Após tratamento com PMP, as coortes de 10-15 percevejos são mantidas a 25 ºC e umi- dade a 40-45% (ambiente) em uma placa de Petri contendo uma almo- fada estéril, que proporciona um substrato adequado para oviposição (Advantec MFS, Inc., Dublin, CA). Para os ensaios de sobrevivência, os insetos mortos são contados, registrados e removidos de seu comparti- mento a cada dia durante 10 dias, e a percentagem de sobrevivência média de percevejos tratados com PMP é calculada em comparação com os controles de PBS.
[00412] —Subsequentemente, os percevejos são alimentados a cada dias com sangue enriquecido com PMP, como indicado acima, e transferidos para uma nova placa de Petri. As placas de Petri com ovos são mantidas dentro de uma câmara de crescimento durante 2 semanas para permitir tempo suficiente de incubação. Os ovos postos são obser- vados em um estereomicroscópio com uma ampliação de 16x, e o nú- mero médio de ovos postos por percevejos fêmeas por intervalo de ali- mentação é calculado durante 30 d, o número médio de ninfas que emergem a partir dos ovos é avaliado, e a percentagem de sobrevivên- cia média dos percevejos é calculada. O efeito de PMPs de raiz de gen- gibre na sobrevivência, fecundidade e desenvolvimento de percevejos é determinado por comparação das coortes tratadas com PMP de raiz de gengibre com as coortes de controle tratadas com PBS.
Exemplo 8: Tratamento de um nematódeo parasitário com PMPs
[00413] Esteexemplo demonstra a capacidade de matar ou diminuir a aptidão de um nematódeo parasitário, tal como Heligmosomoides polygyrus, por seu tratamento com uma solução de PMPs produzidos a partir de uma planta, tais como raízes de gengibre.
[00414] As infeções crônicas por helmínteos permanecem um gran- de problema de saúde global, causando extensa morbidade tanto em humanos como em animais de criação. Muitos dos parasitos de helmín- teos mais prevalentes são difíceis de estudar no laboratório, pois coe- voluíram com as, e estão intimamente adaptados às, suas espécies hos- pedeiras definitivas. Em este exemplo usamos o helmínteo patogênico modelo H. polygyrus, um parasita natural de camundongo, para mostrar o efeito de PMPs de raiz de gengibre na sua aptidão.
Desenho terapêutico:
[00415] A solução de PMP de raiz de gengibre é formulada com O (controle negativo), 1, 10, 50, 100 ou 250 ug de proteína PMP/mL do Exemplo 1a em 10 mL de água estéril.
Desenho experimental: a) Cultivo do nematódeo parasitário Heligmosomoides polygyrus
[00416] O cultivode H. polygyrus é realizado como descrito em Kei- ser et al., Parasites & Vectors. 9 (1): 376, 2016. Camundongos NMRI fêmeas com quatro semanas de idade e H. polygyrus L3 são adquiridos a partir de um fornecedor local. Camundongos NMRI fêmeas são infec- tados com 80 nematódeos H. polygyrus L3 per os. Os ovos de H.
polygyrus são obtidos a partir de fezes infectadas.
b) Tratamento de ovos de H. polygyrus com uma solução de PMP de raiz de Gengibre in vitro
[00417] Para se avaliar a atividade nematocida da solução de PMP de raiz de gengibre na incubação de ovos, ovos de H. polygyrus são obtidos a partir de fezes de camundongos infectadas, limpos e embebi- dos em uma solução contendo O (controle negativo), 1, 10, 50, 100 ou 250 ug de proteína PMP/mL de PMPs de raiz de gengibre durante 30 min, 1 hora ou 2 horas. De seguida, os ovos são colocados em ágar durante 14 dias na escuridão a 24 “ºC e, a partir de 6 dias, o número de larvas L3 eclodidas é registrado. O efeito dos PMPs de raiz de gengibre na eclosão dos ovos é determinado por comparação da percentagem de ovos de H. polygyrus eclodidos com e sem tratamento com PMP. c) Tratamento de larvas de H. polygyrus L3 com uma solução de PMP de raiz de Gengibre in vitro
[00418] Para se avaliar a atividade nematocida da solução de PMP em larvas de H. polygyrus L3, ovos de H. polygyrus são obtidos a partir de fezes infectadas, colocados em ágar e, após 9 dias na escuridão a 24 ºC, as larvas L3 eclodem. Para o tratamento com PMP, 40 larvas L3 são colocadas em cada poço de uma placa de 96 poços. Os vermes são incubados na presença de 100 ul de meio RPMI 1640, suplementado com anfotericina B a 0,63 ug/mL, penicilina a 500 U/mL, estreptomicina a 500 ug/mL e O (controle negativo), 1, 10, 50, 100 ou 250 ug de proteína PMP/mL. Cada tratamento é testado em duplicado. Os vermes incuba- dos com levamisol a 100 uM (Sigma-Aldrich) servem como um controle positivo. As placas são mantidas à temperatura ambiente durante até 72 h. Para se avaliar o efeito do tratamento com PMP na aptidão de L3, o número total de larvas L3 por poço é contado, e as larvas em movimento após estimulação com 100 uL de água quente (= 80 ºC) são registradas. A percentagem relativa de larvas L3 em movimento entre o tratamento com PMP e os controles positivo e negativo é comparada para se de- terminar o efeito nematocida larval de PMPs de raiz de gengibre.
d) Tratamento de adultos de H. polygyrus com uma solução de PMP de raiz de Gengibre in vitro
[00419] “Camundongos NMRI fêmeas são infectados com 80 H. polygyrus L3 per os. Duas semanas pós-infeção, os camundongos são dissecados e três vermes adultos são colocados em cada poço de uma placa de 24 poços. Os vermes são incubados com meio de cultura e O (controle negativo), 1, 10, 50, 100 ou 250 ug de proteína PMP de raiz de gengibre/mL. Cada tratamento é testado em triplicado. Vermes adul- tos incubados com meio somente e levamisol a 50 uM servem como controle negativo e positivo, respectivamente. Os vermes são mantidos em uma incubadora a 37 ºC e CO» a 5% durante 72 h e, subsequente- mente, são microscopicamente avaliados usando uma escala de viabi- lidade de 3 (ativo) a O (sem movimento). As pontuações de viabilidade médias de adultos de H. polygyrus entre o tratamento com PMP e os controles positivo e negativo é comparada para se determinar o efeito nematocida adulto de PMPs de raiz de gengibre. e) Tratamento de H. polygyrus in vivo com uma solução de PMP de raiz de gengibre em camundongo
[00420] Para se testar o efeito nematocida in vivo do tratamento com PMP de raiz de gengibre, camundongos NMRI são infectados com 80 H. polygyrus L3 per os. Quatorze dias pós-infeção, os camundongos são tratados oralmente com os fármacos de teste às dosagens de 10, 100, 300 ou 400 mg de proteína PMP/kg ou um controle de levamisol. Quatro a seis camundongos não tratados servem como controles. Dez dias pós-tratamento, os animais são mortos pelo método de CO», e o trato gastrointestinal é coletado. O intestino é dissecado, e os vermes adultos são coletados e contados. A atividade nematocida de PMPs de raiz de gengibre oralmente administrados é determinada por compara- ção do número médio de vermes adultos em coortes de camundongos tratados com PMP versus controle negativo e positivo.
Exemplo 9: Tratamento de um protozoário parasitário com PMPs
[00421] Esteexemplo demonstra a capacidade de matar ou diminuir a aptidão de um protozoário parasitário, tal como Trichomonas vagina- lis, por tratamento com uma solução de PMPs produzidos a partir de uma planta, tais como raízes de gengibre. Em este exemplo, T. vaginalis é usado como um protozoário parasitário modelo.
[00422] —“Trichomonas vaginalis é uma das doenças sexualmente transmissíveis (STD) não virais mais comuns globalmente. Este proto- zoário anaeróbio, móvel por meio de flagelos anteriores e uma mem- brana ondulante, infecta 180 milhões de mulheres estimadas global- mente com estimativas conservadoras indicando que 6 milhões são in- fectadas anualmente nos Estados Unidos. Tendo em vista a resistência aumentada do parasita aos fármacos clássicos da família de metroni- dazol, a necessidade de novos agentes não relacionados está aumen- tando. Desenho terapêutico:
[00423] A solução de PMP de raiz de gengibre é formulada com O (controle negativo), 1, 10, 50, 100 ou 250 ug de proteína PMP/mL em mL de água estéril. Desenho experimental: a) Cultivo de protozoário parasitário T. vaginalis
[00424] “Trichomonas vaginalis é obtido a partir da ATCC (tH50167) e cultivada de acordo com a instrução do fabricante e como descrito por Tiwarti et al., Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 62 (3): 526-534,
2008. Os protozoários são cultivados em meio TY1-S33 padrão (pH 6,8) suplementado com FCS a 10%, mistura de vitaminas e penicilina/es- treptomicina a 100 U/mL a 37 ºC em tubos de vidro com tampa de rosca de 15 mL. As culturas atingem rotineiramente uma concentração de 2x107 células/mL em 48 h. Um inóculo de 1x10º células por tubo é usado para manutenção da cultura.
b) Tratamento de T. vaginalis com uma solução de PMP de raiz de gen- gibre
[00425] Os PMPs de raiz de gengibre são produzidos como descrito no Exemplo 1. Para se determinar o efeito de PMPs de raiz de gengibre na aptidão de T. vaginalis, um ensaio de suscetibilidade a fármacos é realizado como previamente descrito (Tiwarti et al., Journal of Antimicro- bial Chemotherapy, 62 (3): 526-534, 2008). Brevemente, 5x10º trofozo- itos de Trichomonas por mL são incubados na presença de O (água es- téril, controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 ug de proteína PMP/mL ou Metronidazol a 1-12 mM (Sigma-Aldrich), como controle positivo, no meio de cultura TY1I-S33 em placas de cultura de 24 poços a 37 ºC. As células são verificadas quanto à viabilidade a diferentes intervalos de tempo de 3 h a 48 h sob o microscópio a uma ampliação de 20x. À viabilidade das células de 7. vaginalis é determinada pelo ensaio de ex- clusão com Azul Tripano. As células são contadas usando um hemoci- tômetro. A concentração mínima da solução de PMP à qual todas as células são encontradas mortas é considerada como sua Concentração Inibidora Mínima (MIC). A experiência é repetida três vezes para se con- firmar a MIC. O efeito de PMPs de raiz de gengibre na aptidão de 7. vaginalis é determinado pela comparação da MIC média de tratamento com PMP versus controles negativos e positivos. Exemplo 10: Tratamento de um fungo com Pacotes de Mensageiros de Plantas carregados com ácido nucleico curto
[00426] Este exemplo demonstra a capacidade dos PMPs de entre- gar ácido nucleico curto, por isolamento de lipídeos de PMP e sua sín- tese em vesículas contendo ácidos nucleicos curtos. Em este exemplo, os PMPs carregados com RNAs de fita dupla (dsRNA) curtos são usa- dos para silenciar um fator de virulência em um fungo patogênico, Can- dida albicans. Demonstra também que os PMPs carregados com ácidos nucleicos curtos são estáveis e retêm sua atividade ao longo de uma gama de condições de processamento e ambientais. Em este exemplo, dsRNA é usado como um ácido nucleico modelo, e Candida albicans é usado como um fungo patogênico modelo.
[00427] As espécies de Candida representam a principal causa de infeções fúngicas oportunistas globalmente, e Candida albicans perma- nece o agente etiológico mais comum da candidíase, agora a terceira a quarta infeção nosocomial mais comum. Estas infeções estão tipica- mente associadas a elevada morbidade e mortalidade, maioritariamente devido à eficácia limitada dos fármacos antifúngicos correntes. Em C. albicans, as conversões morfogenéticas entre leveduras e formas fila- mentosas e a formação de biofilme representam dois importantes pro- cessos biológicos que estão intimamente associados à biologia deste fungo e, também, desempenham papéis importantes durante a patogê- nese da candidíase. Dose terapêutica:
[00428] —PMPs carregados com dsRNA, formulados em água até uma concentração que entrega um equivalente a uma dose eficaz de siRNA de O, 50, 500 ou 1000 nM em água estéril. Protocolo Experimental: a) Síntese de PMPs de toranja carregados com dsRNA de EFG1 a partir de lipídeos de PMP de toranja isolados
[00429] Os ácidos nucleicos curtos são carregados em PMPs de acordo com um protocolo modificado de Wang et al., Nature Comm., 4: 1867, 2013. Brevemente, PMPs purificados são produzidos a partir de toranja de acordo com os Exemplos 1-2, e lipídeos de PMP de toranja são isolados, adaptado a partir de Xiao et al. Plant Cell. 22 (10): 3193- 3205, 2010. Brevemente, 3,75 mL de 2:1 (v/v) MeOH:CHCI3 são adicio- nados a 1 mL de PMPs em PBS e submetidos a vórtex. CHCI3 (1,25 mL) e ddH2O (1,25 mL) são adicionados sequencialmente e submetidos a vórtex. A mistura é depois centrifugada a 2.000 r.p.m. durante 10 min a
22 ºC em tubos de vidro para separar a mistura em duas fases (fase aquosa e fase orgânica). Para coleta da fase orgânica, uma pipeta de vidro é inserida através da fase aquosa com pressão positiva suave, e a fase de fundo (fase orgânica) é aspirada e dispensada em tubos de vidro novos. As amostras da fase orgânica são aliquotadas e secas por aquecimento sob nitrogênio (2 psi).
[00430] RNA Curto de Fita única (ASRNA) visando siRNA de EFG1 de Candida albicans com sequências antissenso: 5'ACAUUGAG- CAAUUUGGUUC-3' e senso: "-GAACCAAAUUGCUCAAUGU-3', e um controle de siRNA embaralhado 5-AUAUGCGCAACAUUGACA-3' como especificado em Moazeni et al., Mycopathologia. 174 (3): 177- 185, 2012, são obtidos a partir da IDT. O emparelhamento senso/antis- senso é realizado em tampão de emparelhamento (HEPES-KOH a 30 mM pH 7,4, KCI a 100 mM, MgCl2 a 2 mM e NHJAc a 50 mM como descrito (Moazeni et al., Mycopathologia. 174 (3): 177185, 2012) para gerar dúplex de siRNA (dsRNA). Os PMPs carregados com dsRNA são sintetizados a partir de siRNA tanto visado como de controle, por mistura de lipídeos e ácidos nucleicos curtos, que são secos para formar um filme fino. O filme é disperso em PBS e sonicado para formar formula- ções lipossômicas carregadas. Os PMPs são purificados usando um gradiente de sacarose como descrito no Exemplo 2 e lavados através de ultracentrifugação antes de usar para se remover o ácido nucleico não ligado. Uma pequena porção de ambas as amostras é caracterizada usando os métodos no Exemplo 3, o conteúdo de RNA é medido usando o kit de ensaio Quant-lIt RiboGreen RNA e sua estabilidade é testada como descrito no Exemplo 4.
[00431] Para se determinar a eficiência do bloqueio fúngico usando PMP's carregados com siRNA do Exemplo 10a, fungos Candida albi- cans são tratados com uma solução de PMP com uma dose eficaz de
SIRNA de O, 50, 500 e 1000 nM em água estéril. A estirpe de tipo selva- gem C. albicans (ATCC t 14053) é cultivada em placas de meio de ex- trato de levedura e peptona/dextrose (YPD), incubada a 37 ºC durante 24 h e mantida a 4 ºC até ao uso. O efeito e a eficiência do tratamento com PMPs carregados com dsRNA de EFG1 são comparados com con- troles embaralhados e negativos.
b) Tratamento de Candida albicans com PMPs de toranja carregados com sSiRNA de EFG1 para se reduzir o biofilme fúngico
[00432] —Parase mediro efeito de PMPs carregados de siRNA na for- mação de biofilme de C. albicans, uma cultura durante a noite de C. albicans é cultivada por inoculação em 20 mL de meio líquido de pep- tona e dextrose de levedura (YPD) (extrato de levedura a 1% [p/vol], peptona a 2% [p/vol], dextrose a 2% [p/vol]) em frascos de 150 mL e incubação em um agitador orbital (150 - 180 rom) a 30 ºC. Sob estas condições, C. albicans cresce como levedura de brotamento. Os biofil- mes são formados usando o modelo de placa de microtitulação de 96 poços como descrito por Pierce et al., Pathog Dis. Abr; 70 (3): 423-431,
2014. Brevemente, as células são coletadas a partir de culturas YPD durante a noite e após lavagens foram ressuspensas em RPMI-1640 suplementado com L-glutamina (Cellgro) e tamponadas com ácido mor- folinopropanossulfônico (MOPS) a 165 mM a uma concentração final de 1,0 x 10º células/mL. Os biofilmes de C. albicans são formados em pla- cas de microtitulação de 96 poços, de fundo redondo, de poliestireno, pré-esterilizadas comercialmente disponíveis (Corning Incorporated, Corning, NY). Por poço, 250 ul de 1,0 x 10º células/mL células de C. albicans são dispensados, e PMPs carregados com siRNA de EFGR1 ou um controle embaralhado foram adicionados até uma concentração final de O (água, controle negativo), 50, 500 ou 1000 nM. Os tratamentos são feitos em triplicado e as placas são incubadas a 37 ºC durante 24 h. Após formação do biofilme, os poços são lavados duas vezes para se removerem as células não aderentes, visualizados por microscopia de luz e processados usando ensaio colorimétrico semiquantitativo com base na redução de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfo-fenil) -2H-tetra-zó- lio-5-carboxanilida (XTT, Sigma). A OD dos biofilmes de controle forma- dos (na ausência de PMPs) foi arbitrariamente definida a 100% e os efeitos inibidores dos PMP's carregados com siRNA foram determinados pela percentagem de redução na absorbância em relação aos controles. Os dados são calculados como percentagem de inibição do biofilme em relação à média dos poços de controle.
[00433] Para quantificar as mudanças na expressão de EFGR1, o nível de MRNA de EFG1 em C. albicans é medido por RT-PCR quanti- tativa em tempo real. O RNA total é extraído usando o Kit Fisher BioRe- agents!" SurePrep'!" Plant/Fungi Total RNA Purification (Fisher Scien- tific, Waltham, MA), síntese de cDNA usando SuperScript Ill Reverse Transcriptase (Invitrogen Carlsbad, CA) e quantificação por RT-PCR quantitativa. A expressão de EFG1 (XM 709104.1) e gene de manuten- ção beta actina ACT1 (XM 717232.1) é determinada em C. albicans após tratamento de EFGR1-dsRNA sintetizado e o controle embara- lhado é medido usando os seguintes iniciadores: EFG1-Fw:TGCCAA- TAATGTGTCGGTTG, EFG1-Rev:. CCCATCTCTTCTACCACGTGTOCE, ACT1-Fw: ACGGTATTGTTTCCAACTGGGACG, ACT1-Rev:TGGAG- CTTCGGTCAACAAAACTGG (Moazeni et al., Mycopathologia. 174 (3): 177-185, 2012). A RT-QPCR é realizada usando SsoAdvanced"" Uni- versal SYBRº Green Supermix (BioRad) com três réplicas técnicas de acordo com o seguinte protocolo: desnaturação a 95 ºC durante 3 min, 40 repetições de 95 ºC durante 20 s, 61 ºC durante 20 s e 72 “ºC durante 15s.
[00434] A abundânciade EFG1 é normalizada para a abundância de ACT1 do produto de PCR derivado de planta para se determinar a efici-
ência de silenciamento é determinada pelo cálculo do valor AACt, com- parando o crescimento fúngico normalizado no controle de PBS nega- tivo com o crescimento fúngico normalizado nas amostras de tratamento com PMP carregado com ds-RNA. c) Tratamento de Candida albicans com PMPs de toranja carregados com sSiRNA de EFG1 para se reduzir a aptidão fúngica
[00435] Para se avaliar o efeito de PMPs carregados com siRNA de EFG1 no crescimento fúngico, um ensaio de atividade de PMP usando levedura embebida em ágar foi realizado, como descrito por Beaumont et al., Cell Death and Disease. 4 (5), e619, 2013. Culturas durante a noite de transformantes em meio mínimo contendo glucose (2%, p/v) são lavadas duas vezes em Tris-HCIl a 10 mM (pH 8,0), EDTA a 1 mM (TE), depois ressuspensas em TE. A OD600 é medida e usado para introduzir 5x107 unidades formadoras de colônias de levedura em 7,5 mL de meio mínimo contendo galactose, que é equilibrado até 37 ºC. Cada suspensão de levedura é misturada com 7,5 mL de ágar de meio mínimo contendo galactose (2%, p/v) que é pré-equilibrado até 50 º C, rapidamente misturada por inversão, depois vertida em placas de 10 cm previamente feitas contendo 15 mL de ágar de meio mínimo contendo galactose. As placas são colocadas à temperatura ambiente durante uma hora. Cinco microlitros de PMPs carregados com siRNA de EFGR1 ou um controle embaralhado com uma concentração de O (água, con- trole negativo), 50, 500 ou 1000 nM são pipetados em placas contendo levedura embebida, deixados a secar à temperatura ambiente, incuba- dos a 30 ºC durante 3 dias, depois fotografados. Os círculos escuros revelam a supressão do crescimento da levedura mediada por PMP. Exemplo 11: Tratamento de um inseto com PMPs carregados com Ácido Nucleico de Peptídeo
[00436] Esteexemplodemonstra a carga de PMPs com um construto de ácido nucleico de peptídeo para o propósito de reduzir a aptidão do inseto por silenciamento de vATPase-E em percevejos (Cimex lectula- rius), que foi demonstrado por siRNA que afetava a sobrevivência e a reprodução (Basnet e Kamble, Journal of Medical Entomology, 55 (3): 540 a 546. 2018). Este exemplo demonstra também que os PMPs car- regados com PNA são estáveis e retêm sua atividade ao longo de uma gama de condições de processamento e ambientais. Em este exemplo, PNA é usado como uma proteína modelo, e Cimex lectularius é usado como um inseto patogênico modelo. Dose terapêutica:
[00437] —PMPs carregados com PNA, formulados em água até uma concentração que entrega um equivalente a uma dose eficaz de PNA de 0, 0,1, 1, 50u 10 UM em água estéril. Protocolo Experimental: a) Carga de PMPs de toranja com um ácido nucleico de peptídeo
[00438] —PNAs contra vATPase-E de Cimex lectularius (H!f de acesso de NCBI GenBank LOC106667865) são desenhados e sintetizados por um vendedor apropriado. PMPs de toranja são isolados de acordo com o Exemplo 1. Os PMPs são colocados em solução com o PNA em PBS. A solução é depois sonicada para induzir poração e difusão nos PMPs de acordo com o protocolo de Wang et al., Nature Comm., 4: 1867,
2013. Alternativamente, a solução pode ser passada através de uma extrusora de lipídeos de acordo com o protocolo de Haney et al., J Contr. Rel., 207: 18-30, 2015. Alternativamente podem ser eletroporados de acordo com o protocolo de Wahlgren et al. Nucl. Acids. Res. 40 (17): e130, 2012. Após 1 hora, os PMPs são purificados usando um gradiente de sacarose e lavados através de ultracentrifugação como descrito no Exemplo 2 antes do uso para se remover o ácido nucleico não ligado.
[00439] O tamanho, potencial zeta e contagem das partículas são medidos usando os métodos do Exemplo 3, e sua estabilidade é tes-
tada como descrito no Exemplo 4. Os PNAs nos PMPs são quantifica- dos usando um ensaio eletroforético de deslocamento em gel seguindo o protocolo em Nikravesh et al., Mol. Ther., 15 (8): 1537-1542, 2007. Brevemente, DNA antissenso para os PNAs são misturados com PNA- PMP's tratados com detergente para liberar os PNAs. Os complexos PNA-DNA são operados em um gel e visualizados com um corante SSDNA. Os dúplexes são depois quantificados por visualização fluores- cente. Os PMPs carregados e descarregados são comparados para se determinar a eficiência de carga. b) Tratamento de Cimex lectularius com PMPs de toranja carregados com PNA de vATPase-E para se reduzir a aptidão de insetos
[00440] Os PMPs carregados com o PNAs de vATPase-E identifi- cado acima e um controle de PNA embaralhados são carregados em PMP's de acordo com o método descrito acima. Cimex lectularius são obtidos a partir dos Sierra Research Laboratories (Modesto, CA). As co- lônias de percevejos são mantidas em compartimentos de vidro con- tendo refúgios de papelão e mantidos em um fotoperíodo 12:12 a 25ºC e umidade a 40-45% (ambiente). As colônias são alimentadas com san- gue uma vez por semana com um alimentador de membrana de para- filme contendo sangue de coelho desfibrinado (Hemostat Laboratories, Dixon, CA).
[00441] — Antes do tratamento com PMP carregado com PNA, adultos com 0-2 semanas de idade que não foram alimentados com sangue du- rante quatro dias são isolados e colocados em jarros de vidro para per- mitir o acasalamento durante dois dias. Os machos são separados, e os percevejos fêmeas são separados em coortes experimentais de 10-15 insetos que são alojados em conjunto. Os percevejos fêmeas são trata- dos permitindo que se alimentem de sangue de coelho desfibrinado en- riquecido com uma concentração final de O, 0,1, 1, 50u 10 uM de PMPs carregados com PNA de vATPase ou 0, 0,1, 1, 5 0u 10 UM de um PMP carregado com PNA embaralhado durante 15 min até totalmente ingur- gitados. Os percevejos alimentados com sangue de coelho desfibrinado servem somente como controles para experiências de alimentação. Após tratamento com PMP carregado com PNA, as coortes de 10-15 percevejos são mantidas a 25 ºC e umidade a 40-45% (ambiente) em uma placa de Petri contendo uma almofada estéril, que proporciona um substrato adequado para oviposição (Advantec MFS, Inc., Dublin, CA). Para os ensaios de sobrevivência, os insetos mortos são contados, re- gistrados e removidos de seu compartimento a cada dia durante 10 dias, e a percentagem de sobrevivência média de percevejos com PMPs car- regados com PNA de vATPase-E é calculada em comparação com con- troles de PMP carregado com PNA embaralhado e água.
[00442] —Subsequentemente, os percevejos são alimentados a cada dias com sangue enriquecido com PMP carregado com PMA e trans- feridos para uma nova placa de Petri. As placas de Petri com ovos são mantidas dentro de uma câmara de crescimento durante 2 semanas para permitir tempo suficiente de incubação. Os ovos postos são observados em um estereomicroscópio com uma ampliação de 16x, e o número médio de ovos postos por percevejos fêmeas por intervalo de alimentação é cal- culado durante 30 d, o número médio de ninfas que emergem a partir dos ovos é avaliado, e a percentagem de sobrevivência média dos percevejos é calculada. O efeito de PMPs de raiz de gengibre na sobrevivência, fecundidade e desenvolvimento de percevejos é determinado por com- paração das coortes tratadas com PMP de PNA de vATPase-E com as coortes de controle tratadas com PMP tratado com PNA e PBS.
[00443] “Nodia3e 30 pós-tratamento, três percevejos por tratamento são congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80 ºC para se avaliar o silenciamento de mRNA de vATPase-E de PNA por PCR Quantitativa em Tempo Real RT-gPCR. O RNA total é extraído usando um Kit RNeasy Mini (Qiagen), e o cDNA é sintetizado usando Transcri- ptase Reversa SuperScript Ill (Invitrogen Carlsbad, CA). A RT-gPCR é realizado usando SsoAdvanced'Y Universal SYBRº Green Supermix (BioRad) usando iniciadores previamente relatados: v-ATPase-E-Direto: AGGTCGCCTTGTCCAAAAC, v-ATPase-E-Reverso: GCTTTTAG- TCTCGCCTGGTTC, e gene de manutenção rpL8-Direto: AGGCACGG- TTACATCAAAGG, rpLô-Reverso: TCGGGAGCAATGAAGAGTTC (Basnet e Kamble, Journal of Medical Entomology, 55 (3): 540 a 546. 2018). A abundância de v-ATPase-E é normalizada para a abundância da proteína ribossomal L8, e a eficiência relativa do silenciamento de v- ATPase-E é determinada pelo cálculo do valor AACt, comparando a ex- pressão normalizada de v-ATPase-E em amostras tratadas com PMP tratado com PNA de v-ATPase-E em comparação com controles trata- dos com PMP carregadas com PNA embaralhado. Exemplo 12: Tratamento de uma bactéria com PMPs carregados com moléculas pequenas
[00444] Este exemplo demonstra métodos de carga de PMPs com moléculas pequenas, em esta modalidade, estreptomicina, para o pro- pósito de reduzir a aptidão de E. coli. Demonstra também que os PMPs carregados com moléculas pequenas são estáveis e retêm sua atividade ao longo de uma gama de condições de processamento e ambientais. Em este exemplo, estreptomicina é usada como uma molécula pequena mo- delo, e E. coli é usada como uma bactéria patogênica modelo. Dose terapêutica:
[00445] —PMPs carregados com molécula pequena, formulados em água até uma concentração que entrega um equivalente de uma dose eficaz de Sulfato de estreptomicina de O, 2,5, 10, 50, 100 ou 200 mg/mL. a) Carga de PMPs de toranja com Estreptomicina
[00446] Os PMPs são produzidos, como descrito acima, são coloca- dos em solução de PBS com Estreptomicina solubilizada. A solução é deixada durante 1 hora a 22 ºC, de acordo com o protocolo em Sun et al., Mol Ther. Set; 18 (9): 1606-14, 2010. Alternativamente, a solução é sonicada para induzir poração e difusão nos exossomos de acordo com o protocolo de Wang et al., Nature Comm., 4: 1867, 2013. Alternativa- mente, a solução pode ser passada através de uma extrusora de lipí- deos de acordo com o protocolo de Haney et al., J Contr. Rel., 207: 18- 30, 2015. Alternativamente podem ser eletroporados de acordo com o protocolo de Wahlgren et al. Nucl. Acids. Res. 40 (17): e130, 2012. Após 1 hora, os PMPs carregados são purificados usando um gradiente de sacarose e lavados através de ultracentrifugação como descrito no Exemplo 2 antes do uso para se removerem as moléculas pequenas não ligadas. Os PMPs carregados com estreptomicina são caracteriza- dos quanto ao tamanho e potencial zeta usando os métodos no Exem- plo 3. Uma pequena quantidade dos PMPs são conteúdo de Estrepto- micina é avaliado usando UV-Vis a 195 nm usando uma curva padrão. Brevemente, soluções estoque de estreptomicina a várias concentra- ções de interesse são feitas e 100 microlitros da solução são colocados em uma placa de 96 poços transparente de fundo plano. A absorvância a 195 nm é medida usando um leitor de placas de UV-V. As amostras são também colocadas na placa, e uma regressão é usada para se de- terminar qual poderia ser a concentração de acordo com o padrão. Para concentrações insuficientemente elevadas, o protocolo de Kurosawa et al., J. Chromatogr., 343: 379-385, 1985 é usado para se medir o conte- údo de estreptomicina por HPLC. A estabilidade de PMP carregado com estreptomicina é testada como descrito no Exemplo 4.
b) Tratamento de E. coli com PMPs de toranja carregados com estrep- tomicina para reduzir a aptidão bacteriana
[00447] AsE. colisão adquiridas a partir da ATCC (* 25922) e culti- vadas em Ágar de Soja de Tripticase/caldo a 37 ºC de acordo com as instruções do fabricante. As concentrações eficazes de estreptomicina,
PMPs e PMPs carregados com estreptomicina são testadas quanto à capacidade de prevenir o crescimento de E. coli de acordo com um mé- todo de suscetibilidade à difusão em disco padrão modificado.
[00448] “Uma suspensão de inóculo de E. coli é preparada por sele- ção de várias colônias morfologicamente similares a partir de um cres- cimento durante a noite (16-24 h de incubação) em um meio não seletivo com uma alça estéril ou uma zaragato de algodão e suspensão das co- lônias em solução salina estéril (NaCl a 0,85% p/v em água) até à den- sidade de um padrão 0,5 de McFarland, correspondendo aproximada- mente a 1-2x108 CFU/mL. Placas de ágar Mueller-Hinton (diâmetro de 150 mm) são inoculadas com a suspensão de E. coli, por imersão de uma zaragatoa de algodão estéril na suspensão de inóculo, remoção do fluido em excesso a partir da zaragatoa e espalhamento das bactérias uniformemente sobre a superfície inteira da placa de ágar por esfregaço em três direções. De seguida, 3 uL de uPBS (controle negativo), O (con- trole de PMP), 2,5, 10, 50, 100 ou 200 ug/mL de dose eficaz de PMPs carregados com Estreptomicina, e estreptomicina a 200 mg/mL sozinha (+ controle), são colocados na placa e deixados a secar. As placas são incubadas durante 16-18 horas a 35 ºC, fotografadas e digitalizadas. O diâmetro da zona lítica (área sem bactérias) em torno da área manchada é medido. As zones líticas tratadas com controle (PBS), estreptomicina, PMP e PMP carregada com estreptomicina são comparadas para se determinar o efeito bactericida. Exemplo 13: Tratamento de um nematódeo com Pacotes de Men- sageiros de Plantas carregados com proteína/peptídeo
[00449] Esteexemplodemonstra a carga de PMPs com um construto de peptídeo para o propósito de reduzir a aptidão em nematódeos pa- rasitas. Este exemplo demonstra que os PMPs carregados com GFP são captados no trato digestivo de C. elegans e demonstra que os PMPs carregados com peptídeo são estáveis e retêm sua atividade ao longo de uma variedade de condições de processamento e ambientais. Neste exemplo, GFP é usado como um peptídeo modelo, e C. elegans é usada como nematódeos modelo. Dose terapêutica:
[00450] — PMPs carregados com GFP, formulados em água até uma concentração que entrega O (controle de PMP não carregado), 10, 100 ou 1000 pug/mL de proteína GFP carregada em PMPs Protocolo Experimental: a) Carga de PMPs de toranja com uma proteína ou peptídeo
[00451] Os PMPs são produzidos a partir de suco de toranja de acordo com o Exemplo 1. A proteína verde fluorescente é sintetizada comercialmente e solubilizada em PBS. Os PMPs são colocados em solução com a proteína em PBS. Se a proteína ou peptídeo for insolúvel, o pH é ajustado até ser solúvel. Se a proteína ou peptídeo ainda for insolúvel, a proteína ou peptídeo insolúvel é usado. A solução é depois sonicada para induzir poração e difusão nos exossomos de acordo com o protocolo de Wang et al., Molecular Therapy. 22 (3): 522-534, 2014. Alternativamente, a solução pode ser passada através de uma extrusora de lipídeos de acordo com o protocolo de Haney et al., J Contr. Rel., 207: 18-30, 2015. Alternativamente, os PMPs podem ser eletroporados de acordo com o protocolo de Wahlgren et al. Nucl. Acids. Res. 40 (17): e130, 2012. Após 1 hora, os PMPs são purificados usando um gradiente de sacarose e lavados através de ultracentrifugação como descrito no Exemplo 1 antes do uso para se remover a proteína não ligada. Os lipossomas derivados de PMP são caracterizados como descrito no Exemplo 3, e sua estabilidade é testada conforme descrito no Exemplo
4. A encapsulação de GFP de PMPs é medido por transferência de Western ou fluorescência. b) Entrega de uma proteína modelo a um nematódeo
[00452] A estirpe de C. elegans N2 Bristol (C. elegans Genomics
Center) é mantido em um gramado de Escherichia coli (estirpe OP50) em placas de ágar de meio de crescimento de nematódeos (NGM) (NaCl a 3 g/L, ágar a 17 g/L, peptona a 2,5 g/L, colesterol a 5 mg/L, KH2PO, a 25 mM (pH 6,0), CaCl2 a 1 mM, MgSO. a 1 mM) a 20 ºC, da etapa L1 até LA.
[00453] IC.elegans de um dia de idade são transferidos para uma nova placa e são alimentados com O (controle de PMP não carregado), 10, 100, 1000 ug/mL de PMPs carregados com GFP em uma solução líquida se- guindo o protocolo de alimentação em Conte et al., Curr. Protoc. Mol. Bio., 109: 26.3.1-30 2015. Os vermes são de seguida examinados quanto à captação de PMP carregado com GFP no trato digestivo por uso de um microscópio fluorescente para fluorescência verde, em comparação com tratamento com PMP não carregado e um controle de água estéril. Exemplo 14: Produção de PMP a partir de suco de fruta combinado usando ultracentrifugação e purificação com gradiente de sacarose
[00454] Este exemplo demonstra que os PMPs podem ser produzi- dos a partir da fruta por combinação da fruta e uso de uma combinação de centrifugação sequencial para se removerem os detritos, ultracentri- fugação para se peletizarem PMPs em bruto e uso de um gradiente de densidade de sacarose para se purificarem os PMPs. Em este exemplo, a toranja foi usada como uma fruta modelo. a) Produção de PMPs de toranja por ultracentrifugação e purificação com gradiente de densidade de sacarose
[00455] Um fluxo de trabalho para a produção de PMP de toranja usando uma liquidificadora, ultracentrifugação e purificação com gradi- ente de sacarose é mostrado na Fig. 1A. Uma toranja vermelha foi ad- quirida a partir do Whole Foods Marketº local, e as membranas de al- bedo, flavedo e segmento foram removidas para se coletarem os sacos de suco, que foram homogeneizados usando uma liquidificadora à ve- locidade máxima durante 10 minutos. Cem mL de suco foram diluídos
5x com PBS, seguido por centrifugação subsequente a 1000x g durante minutos, 3000x g durante 20 minutos e 10.000x g durante 40 minutos para se removerem os grandes detritos. 28 mL de suco clarificado foram ultracentrifugados em uma centrífuga Sorvall”Y MX 120 Plus Micro-Ultra a 150.000x g durante 90 minutos a 4 ºC usando um rotor com balde oscilante S50-ST (4 x 7 mL) para se obter um pélete de PMP em bruto que foi ressuspenso em PBS pH 7,4. De seguida, um gradiente de sacarose foi preparado em Tris-HCI pH 7,2, os PMPs em bruto foram colocados em camadas no topo do gradiente de sacarose (de cima para baixo: sacarose a 8, 15, 30, 45 e 60%) e centrifugados por ultracentrifugação a 150.000x g durante 120 minutos a 4 ºC usando um rotor com balde oscilante S50-ST (4 x7 mL). Frações de um mL foram coletadas e os PMPs foram isolados na interface de 30-45%. As frações foram lavadas com PBS por ultracen- trifugação a 150.000x g durante 120 minutos a 4 ºC e os péletes foram dissolvidos em uma quantidade mínima de PBS.
[00456] A concentração de PMP (1x10º PMPs/mL) e o tamanho me- diano de PMP (121,8 nm) foram determinados usando um analisador de partículas Spectradyne nCS17Y, usando um cartucho TS-400 (Fig. 1B). O potencial zeta foi determinado usando um Malvern Zetasizer Ultra e foi -11,5 +/- 0,357 mV.
[00457] Este exemplo demonstra que PMPs de toranja podem ser isolados usando ultracentrifugação combinada com métodos de purifi- cação com gradiente de sacarose. No entanto, este método induziu ge- lificação grave das amostras em todos os passos de produção de PMP e na solução de PMP final. Exemplo 15: Produção de PMP a partir de suco de fruta prensado em malha usando ultracentrifugação e purificação com gradiente de sacarose
[00458] Este exemplo demonstra que os contaminantes da parede celular e membrana celular podem ser reduzidos durante o processo de produção de PMP usando um processo de sucção mais ligeiro (prensa de malha). Em este exemplo, a toranja foi usada como uma fruta mo- delo. a) A sucção ligeira reduz a gelificação durante a produção de PMP a partir de PMPs de toranja
[00459] Sacos de suco foram isolados a partir de uma toranja verme- Ilha como descrito no Exemplo 14. Para se reduzir a gelificação durante a produção de PMP, em vez de se usar um método de combinação des- trutivo, sacos de suco foram ligeiramente pressionados contra uma ma- lha de prensa de chá para se coletar o suco e para se reduzirem os contaminantes da parede celular e membrana celular. Após centrifuga- ção diferencial, o suco ficou mais claro do que após uso de uma liquidi- ficadora, e uma banda de sacarose contendo PMP limpa na interseção de 30-45% foi observada após centrifugação com gradiente de densi- dade de sacarose (Fig. 2). Existiu menos gelificação global durante a e após produção de PMP.
[00460] Os nossos dados mostram que o uso de um passo de sucção ligeira reduz a gelificação causada por contaminantes durante a produção de PMP em comparação com um método compreendendo combinação. Exemplo 16: Produção de PMP usando Ultracentrifugação e Cro- matografia por Exclusão de Tamanhos
[00461] Este exemplo descreve a produção de PMPs a partir de fru- tas por uso de Ultracentrifugação (UC) e Cromatografia por Exclusão de Tamanhos (SEC). Em este exemplo, a toranja é usada como uma fruta modelo. a) Produção de PMPs de toranja usando UC e SEC
[00462] Sacos de suco foram isolados a partir de uma toranja verme- Ilha, como descrito no Exemplo 14a, e foram gentilmente pressionados contra uma malha de prensa de chá para se coletaram 28 mL de suco. O fluxo de trabalho para a produção de PMP de toranja usando UC e
SEC é ilustrado na Fig. 3A. Brevemente, o suco foi sujeito a centrifuga- ção diferencial a 1000x g durante 10 minutos, 3000x g durante 20 minu- tos e 10.000x g durante 40 minutos para se removerem os grandes de- tritos.
[00463] 28 mL de suco clarificado foram ultracentrifugados em uma centrífuga Sorvall”Y MX 120 Plus Micro-Ultra a 100.000x g durante 60 minutos a 4 ºC usando um rotor com balde oscilante S50-ST (4 x 7 mL) para se obter um pélete de PMP em bruto que foi ressuspenso em tam- pão de MES (MES a 20 mM, NaCl, pH 6). Após lavagem dos péletes duas vezes com tampão de MES, o pélete final foi ressuspenso em 1 mL de PBS, pH 7,4. De seguida usámos cromatografia por exclusão de tamanhos para eluir as frações contendo PMP. As frações de eluição de SEC foram analisadas por citometria de nano-fluxo usando um Na- noFCM para se determinar o tamanho e a concentração de PMP usando padrões de concentração e tamanho proporcionados pelo fabricante. Adicionalmente, a absorvância a 280 nm (SpectraMaxº) e a concentra- ção de proteína (ensaio Pierce!M BCA, ThermoFisher) foram determina- das em frações de SEC para se identificar em que frações os PMPs são eluídos (Figs. 3B-3D). As frações de SEC 2-4 foram identificadas como as frações contendo PMP. A análise das frações de eluição precoce e tardia indicou que a fração de SEC 3 é a principal fração contendo PMP, com uma concentração de 2,83x10** PMPs/mL (57,2% de todas as par- tículas na gama de tamanhos 50-120 nm), com um tamanho mediano de 83,6 nm +/- 14,2 nm (SD). Enquanto as frações de eluição tardia 8- 13 tinham uma concentração muito baixa de partículas, como mostrado por NanoFCM, contaminantes de proteína foram detectados em estas frações por análise de BCA.
[00464] Os nossos dados mostram que TFF e SEC podem ser usa- das para se isolarem PMP's purificados a partir de contaminantes de eluição tardia e que uma combinação dos métodos de análise usados aqui consegue identificar frações de PMP a partir de contaminantes de eluição tardia. Exemplo 17: Produção de PMP escalonada usando Filtração de Fluxo Tangencial e Cromatografia por Exclusão de Tamanhos com- binadas com EDTA/Diálise para se reduzirem os contaminantes
[00465] Este exemplo descreve a produção escalonada de PMPs a partir de frutas por uso de Filtração de Fluxo Tangencial (TFF) e Croma- tografia por Exclusão de Tamanhos (SEC), combinadas com uma incu- bação com EDTA para se reduzir a formação de macromoléculas de pectina e diálise durante a noite para se reduzirem os contaminantes. Em este exemplo, a toranja é usada como uma fruta modelo. a) Produção de PMP's de toranja usando TFF e SEC
[00466] Toranjas vermelhas foram obtidas a partir de um Whole Fo- ods Marketº local, e 1000 mL de suco foram isolados usando uma prensa de suco. O fluxo de trabalho para a produção de PMP de toranja usando TFF e SEC é ilustrado na Fig. 4A. O suco foi sujeito a centrifu- gação diferencial a 1000x g durante 10 minutos, 3000x g durante 20 minutos e 10.000x g durante 40 minutos para se removerem os grandes detritos. O suco de toranja clarificado foi concentrado e lavado uma vez usando uma TFF (tamanho de poros de 5 nm) até 2 mL (100x). De se- guida usámos cromatografia por exclusão de tamanhos para eluir as frações contendo PMP. As frações de eluição de SEC foram analisadas por citometria de nano-fluxo usando um NanoFCM para se determinar a concentração de PMP usando padrões de concentração e tamanho proporcionados pelo fabricante. Adicionalmente, a concentração de pro- teína (ensaio Pierce!" BCA, ThermoFisher) foi determinada para as fra- ções de SEC para se identificarem as frações nas quais os PMPs são eluídos. A produção escalonada a partir de 1 litro de suco (100x con- centrado) concentrou também uma elevada quantidade de contaminan- tes nas frações de SEC tardias como pode ser detectado pelo ensaio
BCA (Fig. 4B, painel superior). O rendimento total global de PMP (Fig. 4B, painel inferior) foi mais baixo na produção escalonada em compara- ção com os isolamentos individuais de toranja, o que pode indicar perda de PMPs. b) Redução de contaminantes por incubação com EDTA e diálise
[00467] Toranjas vermelhas foram obtidas a partir de um Whole Fo- ods Marketº local, e 800 mL de suco foram isolados usando uma prensa de suco. O suco foi sujeito a centrifugação diferencial a 1000x g durante minutos, 3000x g durante 20 minutos e 10.000x g durante 40 minutos para se removerem os grandes detritos e filtrado através de um filtro de 1 um e 0,45 um para se removerem as grandes partículas. O sumo de toranja clarificado foi dividido em 4 grupos de tratamento diferentes con- tendo 125 mL de sumo cada. O Grupo de Tratamento 1 foi processado como descrito no Exemplo 17a, concentrado e lavado (PBS) até uma concentração final de 63x e sujeito a SEC. Antes de TFF, 475 mL de suco foram incubados com uma concentração final de EDTA de 50 mM, pH 7,15 durante 1,5 horas à TA para quelar o ferro e reduzir a formação de macromoléculas de pectina. Subsequentemente, o suco foi dividido em três grupos de tratamento que sofreram concentração em TFF com uma lavagem com PBS (sem cálcio/magnésio) pH 7,4, MES pH 6 ou Tris pH 8,6 até uma concentração final de suco de 63X. De seguida, as amostras foram dialisadas no mesmo tampão de lavagem durante a noite a 4 ºC usando uma membrana de 300 kDa e sujeitas a SEC. Em comparação com o elevado pico de contaminantes nas frações de elui- ção tardia do controle somente de TFF, a incubação com EDTA seguida por diálise durante a noite reduziu fortemente os contaminantes, como mostrado pela absorbância a 280 nm (Fig. 4C) e análise de proteína BCA (Fig. 4D), que é sensível à presença de açúcares e pectinas. Não existiu diferença nos tampões de diálise usados (PBS sem cálcio/mag- nésio pH 7,4, MES pH 6, Tris pH 8,6).
[00468] Os nossos dados indicam que a incubação com EDTA se- guida por diálise reduz a quantidade de contaminantes copurificados, facilitando a produção de PMP escalonada. Exemplo 18: Estabilidade de PMP
[00469] Este exemplo demonstra que os PMPs são estáveis a dife- rentes condições ambientais. Em este exemplo, os PMPs de toranja e limão são usados como PMPs modelo. a) Produção de PMPs de toranja usando TFF combinada com SEC
[00470] Toranjas vermelhas orgânicas (Flórida) foram obtidas a partir de um Whole Foods Marketº local. O fluxo de trabalho da produção de PMP é ilustrado na Fig. 5A. Um litro de suco de toranja foi coletado usando uma prensa de suco e foi subsequentemente centrifugado a 3000x g durante 20 minutos, seguido por 10.000x g durante 40 minutos para se removerem os grandes detritos. De seguida, EDTA a 500 mM pH 8,6 foi adicionado até uma concentração final de EDTA a 50 mM, pH 7, e a solução foi incubada durante 30 minutos para quelar cálcio e pre- venir a formação de macromoléculas de pectina. Subsequentemente, o suco foi passado através de filtros de 11 um, 1 um e 0,45 um para se removerem as grandes partículas. O suco filtrado foi concentrado e la- vado (500 mL de PBS) por Filtração de Fluxo Tangencial (TFF) (tama- nho de poros 5 nm) até 400 mL (2,5x) e dialisado durante a noite em PBS pH 7,4 (com uma troca de meio) usando uma membrana de diálise de 300 kDa para se removerem os contaminantes. Subsequentemente, O suco dialisado foi ainda concentrado por TFF até uma concentração final de 50 mL (20x). De seguida usámos cromatografia por exclusão de tamanhos para eluir as frações contendo PMP, que foram analisadas por absorbância a 280 nm (SpectraMaxº ) e um ensaio de concentração de proteína (ensaio Pierce!" BCA, ThermofFisher) para verificar as fra- ções contendo PMP e frações tardias contendo contaminantes (Figs. 5B e 5C). As frações de SEC 4-6 continham PMPs purificados (as frações
8-14 continham contaminantes), foram agrupadas e foram esterilizadas por filtração por filtração sequencial usando filtros de seringa de 0,8 um, 0,45 um e 0,22 um. A concentração final de PMP (1,32x10** PMPs/mL) e tamanho mediano de PMP (71,9 nm +/- 14,5 nm) nas frações contendo PMP esterilizadas combinadas foram determinados por NanoFCM usando padrões de concentração e tamanho proporcionados pelo fabri- cante (Fig. 5F).
b) Produção de PMPs de limão usando TFF combinada com SEC
[00471] Oslimões foram obtidos a partir de um Whole Foods Marketº local. Um litro de suco de limão foi coletado usando uma prensa de suco e foi subsequentemente centrifugado a 3000 g durante 20 minutos, se- guido por 10.000 g durante 40 minutos para se removerem os grandes detritos. De seguida, EDTA a 500 mM pH 8,6 foi adicionado até uma concentração final de EDTA a 50 mM, pH 7, e a solução foi incubada durante 30 minutos para quelar cálcio e prevenir a formação de macro- moléculas de pectina. Subsequentemente, o suco foi passado através de um filtro de café, filtros de 1 um e 0,45 um para se removerem as grandes partículas. O suco filtrado foi concentrado por Filtração de Fluxo Tangencial (TFF) (tamanho de poros de 5 nm) até 400 mL (2,5x con- centrado) e dialisado durante a noite em PBS pH 7,4 usando uma mem- brana de diálise de 300 kDa para se removerem os contaminantes. Sub- sequentemente, o suco dialisado foi ainda concentrado por TFF até uma concentração final de 50 mL (20x). De seguida usámos cromatografia por exclusão de tamanhos para eluir as frações contendo PMP, que fo- ram analisadas por absorbância a 280 nm (SpectraMaxº ) e um ensaio de concentração de proteína (ensaio Pierce!" BCA, ThermoFisher) para verificar as frações contendo PMP e frações tardias contendo contami- nantes (Figs. 5D e 5E). As frações de SEC 4-6 continham PMPs purifi- cados (as frações 8-14 continham contaminantes), foram agrupadas e foram esterilizadas por filtração por filtração sequencial usando filtros de seringa de 0,8 um, 0,45 um e 0,22 um. A concentração final de PMP (2,7x10** PMPs/mL) e tamanho mediano de PMP (70,7 nm +/- 15,8 nm) nas frações contendo PMP esterilizadas combinadas foram determina- dos por NanoFCM, usando padrões de concentração e tamanho propor- cionados pelo fabricante (Fig. 5G). c) Estabilidade de PMP's de toranja e limão a 4 ºC
[00472] Os PMPs de toranja e limão foram produzidos como descrito nos Exemplos 18a e 18b. A estabilidade dos PMPs foi avaliada por medição da concentração de PMPs totais (PMP/mL) na amostra ao longo do tempo usando NanoFCM. O estudo de estabilidade foi levado a cabo a 4 ºC durante 46 dias na escuridão. Alíquotas de PMPs foram armazenadas a 4 ºC e analisadas por NanoFCM em dias predetermina- dos. As concentrações de PMPs totais na amostra foram analisadas (Fig. 5H). A concentração relativa medida de PMP de PMPs de limão e toranja entre o início e o ponto final da experiência aos 46 dias foi 119% e 107%, respectivamente. Os nossos dados indicam que os PMPs são estáveis durante pelo menos 46 dias a 4 ºC. d) Estabilidade ao congelamento-descongelamento de PMP's de limão
[00473] Parase determinar a estabilidade ao congelamento-descon- gelamento dos PMPs, PMPs de limão foram produzidos a partir de li- mões orgânicos adquiridos em um Whole Foods Marketº local. Um litro de suco de limão foi coletado usando uma prensa de suco e foi subse- quentemente centrifugado a 3000 g durante 20 minutos, seguido por
10.000 g durante 40 minutos para se removerem os grandes detritos. De seguida, EDTA a 500 mM pH 8,6 foi adicionado até concentração final de EDTA a 50 mM, pH 7,5 e incubado durante 30 minutos para quelar cálcio e prevenir a formação de macromoléculas de pectina. Sub- sequentemente, o suco foi passado através de filtros de 11 um, 1um e 0,45 um para se removerem as grandes partículas. O suco filtrado foi concentrado e lavado com 400 mL de PBS, pH 7,4 por Filtração de Fluxo
Tangencial (TFF) até um volume final de 400 mL (2,5x concentrado) e dialisado durante a noite em PBS pH 7,4 usando uma membrana de diálise de 300 kDa para se removerem os contaminantes. Subsequen- temente, o suco dialisado foi ainda concentrado por TFF até uma con- centração final de 60 mL (-17x). De seguida usámos cromatografia por exclusão de tamanhos para eluir as frações contendo PMP, que foram analisadas por absorbância a 280 nm (SpectraMaxº ) e um ensaio de concentração de proteína (ensaio Pierce"M BCA, ThermoFisher) para verificar as frações contendo PMP e frações tardias contendo contami- nantes. As frações de SEC 4-6 continham PMP's purificados (as frações 8-14 continham contaminantes), foram agrupadas e foram esterilizadas por filtração por filtração sequencial usando filtros de seringa de 0,8 um, 0,45 um e 0,22 um. A concentração final de PMP (6,92x10"? PMPs/mL) nas frações contendo PMP esterilizadas combinadas foi determinada por NanoFCM, usando padrões de concentração e tamanho proporcio- nados pelo fabricante.
[00474] Os PMPs de limão foram congelados a -20 ºC ou -80 ºC du- rante uma semana, descongelados à temperatura ambiente, e a con- centração foi medida por NanoFCM (Fig. 51). Os dados indicam que os PMPs de limão são estáveis após 1 ciclo de congelamento-descongela- mento após armazenamento durante uma semana a -20 ºC ou -80 ºC. Exemplo 19: Produção de PMP a partir de meio de cultura de célu- las de plantas
[00475] Este exemplo demonstra que os PMPs podem ser produzi- dos a partir de cultura de células de plantas. Em este exemplo, a linha de células Black Mexican Sweet (BMS) de Zea mays é usada como uma linha de células de plantas modelo. a) Produção de PMP's da linha de células BMS de Zea mays
[00476] Alinha de células Black Mexican sweet (BMS) de Zea mays foi adquirida a partir da ABRC e foi cultivada em meio basal de Muras- hige e Skoog pH 5,8, contendo Mistura de Sais Basal de Murashige e Skoog a 4,3 g/L (Sigma M5524), sacarose a 2% (S0389, Millipore Sigma), 1x solução de vitamina MS (M3900, Millipore Sigma), ácido 2,4- diclorofenoxiacético a 2 mg/L (D7299, Millipore Sigma) e tiamina HCI a 250 ug/L (V-014, Millipore Sigma), a 24 ºC com agitação (110 rpm), e foi passada em 20% volume/volume a cada 7 dias.
[00477] Trêsdias após passagem, 160 mL de células BMS foram co- letadas e centrifugadas a 500x g durante 5 min para se removerem as células e 10.000x g durante 40 min para se removerem os grandes de- tritos. O meio foi passado através de um filtro de 0,45 um para se remo- verem as grandes partículas, e o meio filtrado foi concentrado e lavado (100 mL de tampão de MES, MES a 20 mM, NaCl a 100 mM, pH 6) por TFF (tamanho de poros de 5 nm) até 4 mL (40x). De seguida usámos cromatografia por exclusão de tamanhos para eluir as frações contendo PMP, que foram analisadas por NanoFCM para a concentração de PMP, por absorbância a 280 nm (SpectraMaxº) por e um ensaio de con- centração de proteína (ensaio Pierce!'M BCA, ThermoFisher) para veri- ficar as frações contendo PMP e frações tardias contendo contaminan- tes (Figs. 6A-6C). As frações de SEC 4-6 continham PMP'ss purificados (as frações 9-13 continham contaminantes) e foram agrupadas. A con- centração final de PMP (2,84x10*º PMPs/mL) e tamanho mediano de PMP (63,2 nm +/- 12,3 nm SD) nas frações contendo PMP combinadas foram determinados por NanoFCM, usando padrões de concentração e tamanho proporcionados pelo fabricante (Figs. 6D-6E).
[00478] Estesdados mostram que os PMPs podem ser isolados, pu- rificados e concentrados a partir de meios de cultura líquidos de plantas. Exemplo 20: Captação de PMPs por bactérias e fungos
[00479] Esteexemplo demonstra a capacidade dos PMPs de se as- sociarem a e serem captados por bactérias e fungos. Em este exemplo,
os PMPs de toranja e limão são usados como um PMP, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa são usados como bactérias patogênicas modelo, e a levedura Saccharomyces cerevisiae é usada como um fungo patogênico modelo. a) Marcação de PMPs de toranja e limão com Éster de NHS DyLight 800
[00480] Os PMPs de toranja e limão foram produzidos como descrito nos Exemplos 18a e 18b. Os PMPs foram marcados com o corante de membrana covalente Éster de NHS DyLight 800 (Life Technologies, t 46421) (DyL800). Brevemente, DyL800 foi dissolvido em DMSO até uma concentração final de 10 mg/mL, e 200 ul de PMPs foram mistu- rados com 5 uL de corante e incubados durante 1 h à temperatura am- biente em um agitador. Os PMPs marcados foram lavados 2-3 vezes por ultracentrífuga a 100.000 xg durante 1 hr a 4 ºC, e os péletes foram ressuspensos com 1,5 mL de água UltraPure. Para controlar a presença de potenciais agregados de corante, uma amostra de controle somente de corante foi preparada de acordo com o mesmo procedimento, adici- onando 200 uL de água UltraPure em vez de PMPs. O pélete final de PMP marcado com DyL800 e o controle somente com corante DyL800 foram ressuspensos em uma quantidade mínima de água UltraPure e caracterizados por NanoFCM. A concentração final de PMPs marcados com DyL800 de toranja foi 4,44x10"? PMPs/mL, com um tamanho me- diano de DyL800-PMP de 72,6 nm +/- 14,6 nm (Fig. 7A), e a concentra- ção final de PMPs marcados com DyL800 de limão foi 5,18x10"? PMPs/mL com um tamanho médio de DyL800-PMP de 68,5 nm +/- 14 nm (Fig. 7B). b. Captação de PMPs de toranja e limão marcados com DyL 800 pela levedura
[00481] “Saccharomyces cerevisiae (ATCC, tt 9763) foi cultivada em caldo de extrato de levedura, peptona e dextrose (YPD) e mantida a 30 ºC. Para se determinar se os PMPs podem ser captados pela levedura,
uma cultura de levedura fresca de 5 mL foi cultivada durante a noite a ºC, e as células foram peletizadas a 1500x g durante 5 min e ressus- pensas em 10 mL de água. As células de levedura foram lavadas uma vez com 10 mL de água, ressuspensas em 10 mL de água e incubadas durante 2 h a 30 ºC com agitação para privar as células de nutrientes. De seguida, 95 uL de células de levedura foram misturados com 5 ul de água (controle negativo), controle somente de corante DyL800 (con- trole de agregado de corante) ou DyL800-PMPs até uma concentração final de 5x10*º DyL800-PMPs/mL em um tubo de 1,5 mL. As amostras foram incubadas durante 2 h a 30 ºC com agitação. De seguida, as cé- lulas tratadas foram lavadas com 1 mL de tampão de lavagem (água suplementada com Triton X-100 a 0,5%), incubadas durante 5 min e centrifugadas a 1500x g durante 5 min. O sobrenadante foi removido e as células de levedura foram lavadas 3 vezes adicionais para se remo- verem os PMPs que não são captados pelas células e uma última vez com água para se remover o detergente. As células de levedura foram ressuspensas em 100 uL de água e transferidas para uma placa de 96 poços de fundo transparente, e a intensidade de fluorescência relativa (A.U.) à excitação de 800 nm foi medida em um scanner Odysseyº CLx (Li-Cor).
[00482] Para se avaliar a captação de DyL800-PMP pela levedura, as amostras foram normalizadas para o controle somente de corante DyL800, e as intensidades de fluorescência relativas de DyL800-PMP de toranja e limão foram comparadas. Os nossos dados indicam que Saccharomyces cerevisiae capta PMPs, e nenhuma diferença de cap- tação foi observada entre DyL800-PMP's de limão e toranja (Fig. 7C). c) Captação de PMPs de toranja e limão marcados com DyL800 por bactérias
[00483] As estirpes de bactérias e leveduras foram mantidas como indicado pelo fornecedor: E. coli (Ec, ATCC, ft 25922) foi cultivada em
Ágar de Soja de Tripticase/caldo a 37 ºC, Pseudomonas aeruginosa (Pa, ATCC) foi cultivada em caldo/Soja Tríptica Ágar com rifampicina a 50 mg/mL a 37 ºC.
[00484] —Parase determinarse os PMPs podem ser captados por bac- térias, culturas bacterianas frescas de 5 mL foram cultivadas durante a noite, e as células foram peletizadas a 3000x g durante 5 min, ressus- pensas em 5 mL de MgCl2 a 10 mM, lavadas uma vez com 5 mL de MgCl2 a 10 mM e ressuspensas em 5 mL de MgCl2 a 10 mM. As células foram incubadas durante 2 h a 37 ºC (Ec) ou 30 ºC (Pa) em uma incu- badora com agitação a -200 rpm para privar as células de nutrientes. À ODG600 foi medida e as densidades celulares foram ajustadas até —-10x10º CFU/mL. De seguida, 95 uL de células bacterianas foram mis- turados com 5 uL de água (controle negativo), controle somente de co- rante DyL800 (controle de agregado de corante) ou DyL800-PMPs a uma concentração final de 5x10ºº DyL800-PMPs/mL em um tubo de 1,5 mL. As amostras foram incubadas durante 2 h a 30 ºC com agitação. De seguida, as células tratadas foram lavadas com 1 mL de tampão de la- vagem (MgCl2 a 10 MM com Triton X-100 a 0,5%), incubadas durante 5 min e centrifugadas a 3000x g durante 5 min. O sobrenadante foi remo- vido e as células de levedura foram lavadas 3 vezes adicionais para se removerem os PMPs que não são captados pelas células e uma vez mais com 1ImL de MgCl2 a 10 mM para se remover o detergente. As células bacterianas foram ressuspensas em 100 ul de MgCl2 a 10 mM e transferidas para uma placa de 96 poços de fundo transparente, e a intensidade de fluorescência relativa (A.U.) à excitação de 800 nm foi medida em um scanner Odysseyº CLx (Li-Cor).
[00485] Parase avaliaracaptação de DyL800-PMP por bactérias, as amostras foram normalizadas para o controle somente de corante DyL800, e as intensidades de fluorescência relativas de DyL800-PMP de toranja e limão foram comparadas. Os nossos dados indicam que todas as espécies de bactérias testadas captam PMPs (Fig. 7C). Em geral, os PMPs de limão foram preferencialmente captados (intensidade de sinal mais elevado do que os PMPs de toranja). E. coli e P. aerugi- nosa exibiram a captação mais elevada de DyL800-PMP. Exemplo 21: Captação de PMPs por células de inseto
[00486] Esteexemplo demonstra a capacidade dos PMPs de se as- sociarem a e serem captados por células de inseto. Em este exemplo, as linhas de células de sf9 Spodoptera frugiperda (inseto) e S2 Droso- phila melanogaster (inseto) são usadas como células de inseto modelo, e PMPs limão são usados como PMPs modelo. a) Produção de PMPs de limão
[00487] Oslimões foram obtidos a partir de um Whole Foods Marketº local. O suco de limão (3,3 L) foi coletado usando uma prensa de suco, o pH ajustado até pH 4 com NaOH e incubado com pectinase a 0,5 U/mL (Sigma, 17389) para se removerem os contaminantes de pectina. O suco foi incubado durante uma hora à temperatura ambiente com agita- ção e armazenado durante a noite a 4ºC e, subsequentemente, centri- fugado a 3000 g durante 20 minutos, seguido por 10.000 g durante 40 minutos para se removerem os grandes detritos. De seguida, o suco processado foi incubado com EDTA a 500 mM pH 8,6, até uma concen- tração final de EDTA a 50 mM, pH 7,5 durante 30 minutos à temperatura ambiente para quelar o cálcio e prevenir a formação de macromoléculas de pectina. Subsequentemente, o suco tratado com EDTA foi passado através de um filtro de 11 um, 1 um e 0,45 um para se removerem as grandes partículas. O suco filtrado foi lavado (300 mL de PBS durante o procedimento de TFF) e concentrado 2x até um volume total de 1350 mL por Filtração de Fluxo Tangencial (TFF) e dialisado durante a noite usando uma membrana de diálise de 300 kDa. Subsequentemente, o suco dialisado foi ainda lavado (500 mL de PMS durante o procedimento de TFF) e concentrado por TFF até uma concentração final de 160 mL
(-20x). De seguida usámos a cromatografia por exclusão de tamanhos para eluir as frações contendo PMP e analisámos a absorbância de 280 nm (SpectraMaxº) para se determinar as frações contendo PMP das frações de eluição tardia contendo contaminantes. As frações de SEC 4-7 contendo PMPs purificados foram agrupadas, esterilizadas por fil- tração sequencial usando filtros de seringa de 0,85 um, 0,4 um e 0,22 um e concentradas ainda por peletização de PMPs durante 1,5 hrs a
40.000x g e finalmente o pélete é ressuspenso em água Ultrapure. À concentração final de PMP (1,53x10*? PMPs/mL) e o tamanho mediano de PMP (72,4 nm +/- 19,8 nm SD) (Fig. 8A) foram determinados por citometria de nano-fluxo (NanoFCM) usando padrões de concentração e tamanho proporcionados pelo fabricante, e a concentração de prote- ína PMP (12,317 mg/mL) foi determinada usando um ensaio Pierce" BCA (ThermoFisher) de acordo com as instruções do fabricante.
b) Marcação de PMPs de limão com Éster de NHS Alexa Fluor 488
[00488] Os PMPs de limão foram marcados com o corante de mem- brana covalente Éster de NHS Alexa Fluor 488 (Life Technologies) (AF488). Brevemente, AF488 foi dissolvido em DMSO até uma concen- tração final de 10 mg/mL, 200 ul de PMPs (1,53x10*? PMPs/mL) foram misturados com 5 uL de corante, incubados durante 1 h à temperatura ambiente em um agitador, e os PMPs marcados foram lavados 2-3 ve- zes por ultracentrífuga a 100.000 xg durante 1 hr a 4 ºC e os péletes foram ressuspensos com 1,5 mL de água UltraPure. Para controlar a presença de potenciais agregados de corante, uma amostra de controle somente de corante foi preparada de acordo com o mesmo procedi- mento, adicionando 200 uL de água UltraPure em vez de PMPs. O pé- lete final de PMP marcado com AF488 e o controle somente com co- rante AF488 foram ressuspensos em uma quantidade mínima de água UltraPure e caracterizados por NanoFCM. A concentração final de PMPs marcados com AF488 foi 1,33x10*? PMPs/mL com um tamanho mediano de AF488-PMP de 72,1 nm +/- 15,9 nm SD e uma eficiência de marcação de 99% foi alcançada (Fig. 8B).
c) Tratamento de células de inseto com AF488-PMPs de limão
[00489] Os PMPs de limão foram produzidos e marcados como des- crito nos Exemplos 21a e 21b. A linha de células sf9 Spodoptera frugi- perda foi obtida a partir da ThermoFisher Scientific (ff B82501) e mantida em meio de inseto TNM-FH (Sigma Aldrich, T1032) suplementado com soro fetal bovino inativado pelo calor a 10%. A linha de células S2 Dro- sophila melanogaster foi obtida a partir da ATCC (t% CRL-1963) e man- tida em meio Drosophila de Schneider (Gibco/ThermoFisher Scientific & 21720024) suplementado com soro fetal bovino inativado pelo calor a 10%. Ambas as linhas de células foram cultivadas a 26 ºC. Para o tra- tamento com PMP, as células S2/Sf9 foram inoculadas a 50% de con- fluência em lamelas de vidro revestidas com poli-I-lisina a 0,01% esté- reis em uma placa de 24 poços em 2 mL de meio completo e deixadas a aderir à lamela durante a noite. De seguida, as células foram tratadas por adição de 10 uL de somente corante AF488 (controle de agregado de corante), PMPs de limão (controle somente de PMP) ou AF488- PMPs para duplicar as amostras, que foram incubadas durante 2 h a 26 ºC. A concentração final foi 1,33x10** PMPs/AF488-PMPs por poço. As células foram depois lavadas duas vezes com 1 mL de PBS e fixadas durante 15 min com formaldeído a 4% em PBS. As células foram sub- sequentemente permeabilizadas com PBS + triton X-100 a 0,02% du- rante 15 min, e os núcleos foram corados com uma solução de DAPI 1:1000 durante 30 min. As células foram lavadas uma vez com PBS e as lamelas foram montadas em uma lâmina de vidro com ProLong “M Gold Antifade (ThermoFisher Scientific) para reduzir o fotobranquea- mento. A resina foi fixada durante a noite e as células foram examinadas em um microscópio de epifluorescência Olympus usando uma objetiva de 100x, e imagens Z-stack de 10 um com incrementos de 0,25 um fo- ram tiradas. Foram obtidos resultados similares foram obtidos para cé- lulas de S2 D. melanogaster e S9 L. frugiperda. Embora nenhuns focos verdes tenham sido observados no controle somente de corante AF488, e controle somente de PMP, quase todas as células de inseto tratadas com AF488-PMPs exibiram focos verdes dentro das células de inseto. Existiu um forte sinal no citoplasma com vários focos maiores brilhantes indicativos dos compartimentos endossômicos. Devido ao sangramento do DAPI no canal de 488, não foi possível avaliar a presença do sinal de AF488-PMP no núcleo. Para as células sf9, 94,4% (n = 38) das cé- lulas examinadas exibiram focos verdes, enquanto isto não foi obser- vado nas amostras de controle controles somente de corante AF488 (n = 68) ou somente de PMP (n = 42).
[00490] Os nossos dados indicam que os PMPs podem se associar às membranas das células dos insetos e podem ser eficientemente cap- tados pelas células de inseto. Exemplo 22: Carga de PMPs com uma molécula pequena
[00491] Este exemplo demonstra a carga de PMPs com uma molé- cula pequena modelo para o propósito de entregar um agente usando diferentes fontes de PMP e métodos de encapsulação. Em este exem- plo, doxorrubicina é usada como uma molécula pequena modelo, e os PMPs de limão e toranja são usados como PMPs modelo.
[00492] “Mostramos que os PMPs podem ser eficientemente carrega- dos com doxorrubicina e que os PMPs carregados são estáveis durante pelo menos 8 semanas a 4 ºC. a) Produção de PMPs de toranja usando TFF combinada com SEC
[00493] Toranjas brancas (Flórida) foram obtidas a partir de um Whole Foods Marketº local. Um litro de suco de toranja foi coletado usando uma prensa de suco e foi subsequentemente centrifugado a 3000x g durante 20 minutos, seguido por 10.000x g durante 40 minutos para se removerem os grandes detritos. De seguida, EDTA a 500 mM pH 8,6 foi adicionado até concentração final de EDTA a 50 MM, pH 7 e incubado durante 30 minutos para quelar cálcio e prevenir a formação de macromoléculas de pectina. Subsequentemente, o suco foi passado através de um filtro de café e filtros de 1 um e 0,45 um para se remove- rem as grandes partículas. O suco filtrado foi concentrado por Filtração de Fluxo Tangencial (TFF, tamanho de poros de 5 nm) até 400 mL e dialisado durante a noite em PBS pH 7,4 usando uma membrana de diálise de 300 kDa para se removerem os contaminantes. Subsequen- temente, o suco dialisado foi ainda concentrado por TFF até uma con- centração final de 50 mL (20x). De seguida usámos a cromatografia por exclusão de tamanhos para eluir as frações contendo PMP, que foram analisadas a absorbância de 280 nm (SpectraMaxº) para se verificar as frações contendo PMP e as frações tardias contendo contaminantes (Fig. 9A). As frações de SEC 4-6 contendo PMPs purificados foram agrupadas e concentradas ainda por peletização de PMPs durante 1,5 hrs a 40.000x g e o pélete ressuspenso em água Ultrapure. A concen- tração final de PMP (6,34x10*? PMPs/mL) e tamanho mediano de PMP (63,7 nm +/- 11,5 nm (SD)) foram determinados por NanoFCM, usando padrões de concentração e tamanho proporcionados pelo fabricante (Figs. 9B e 9C).
b) Produção de PMPs de limão usando TFF combinada com SEC
[00494] Os limões foram obtidos a partir de um Whole Foods Marketº local. Um litro de suco de limão foi coletado usando uma prensa de suco e foi subsequentemente centrifugado a 3000 g durante 20 minutos, se- guido por 10.000 g durante 40 minutos para se removerem os grandes detritos. De seguida, EDTA a 500 mM pH 8,6 foi adicionado até concen- tração final de EDTA a 50 mM, pH 7 e incubado durante 30 minutos para quelar cálcio e prevenir a formação de macromoléculas de pectina. Sub- sequentemente, o suco foi passado através de um filtro de café, filtros de 1 um e 0,45 um para se removerem as grandes partículas. O suco filtrado foi concentrado por Filtração de Fluxo Tangencial (TFF, tamanho de poros de 5 nm) até 400 mL e dialisado durante a noite em PBS pH 7,4 usando uma membrana de diálise de 300 kDa para se removerem os contaminantes. Subsequentemente, o suco dialisado foi ainda con- centrado por TFF até uma concentração final de 50 mL (20x). De se- guida usámos a cromatografia por exclusão de tamanhos para eluir as frações contendo PMP, que foram analisadas a absorbância de 280 nm (SpectraMaxº) para se verificar as frações contendo PMP e as frações tardias contendo contaminantes (Fig. 9D). As frações de SEC 4-6 con- tendo PMPs purificados foram agrupadas e concentradas ainda por pe- letização de PMPs durante 1,5 hrs a 40.000x g e o pélete ressuspenso em água Ultrapure. A concentração final de PMP (7,42x10*? PMPs/mL) e tamanho mediano de PMP (68 nm +/- 17,5 nm (SD)) foram determina- dos por NanoFCM, usando padrões de concentração e tamanho propor- cionados pelo fabricante (Figs. 9E e 9F).
c) Carga passiva de doxorrubicina em PMPs de limão e toranja
[00495] —PMPs de toranja (Exemplo 22a) e limão (Exemplo 22b) fo- ram usados para carregar doxorrubicina (DOX). Uma solução de esto- que de doxorrubicina (DOX, Sigma PHR1789) foi preparada a uma con- centração de 10 mg/mL em água Ultrapure (Água Destilada Isenta de DNase/RNase UltraPure"Y, ThermoFisher, 10977023), esterilizada por filtro (0,22 um) e armazenada a 4 ºC. 0,5 mL de PMPs foram misturados com 0,25 mL de solução de DOX. A concentração final de DOX na mis- tura foi 3,3 mg/mL. A concentração inicial das partículas para os PMPs de toranja (GF) foi 9,8x10"? PMPs/mL e para os PMPs de limão (LM) foi 1,8x10º? PMPs/mL. A mistura foi agitada durante 4 horas a 25 ºC, 100 rpm, na escuridão. Depois, a mistura foi diluída 3,3 vezes com água UI- traPure (a concentração final de DOX na mistura foi 1 mg/mL) e dividida em duas partes iguais (1,25 mL para a carga passiva e 1,25 mL para a carga ativa) (Exemplo 22d). Ambas as amostras foram incubadas du- rante 23 h adicionais a 25 ºC, 100 rpm, na escuridão. Todos os passos foram levados a cabo sob condições estéreis.
[00496] Para a carga passiva de DOX, para se remover DOX não carregada ou fracamente ligada, a amostra foi purificada por ultracentri- fugação. A mistura foi dividida em 6 partes iguais (200 uL cada) e água estéril (1,3 mL) foi adicionada. As amostras foram centrifugadas (40.000 xg, 1,5 h, 4 ºC) em tubos de ultracentrífuga de 1,5 mL. Os péletes de PMP-DOX foram ressuspensos em água estéril e centrifugados duas vezes. As amostras foram mantidas a 4 ºC durante três dias. Antes do uso, os PMPs carregados com DOX foram lavados mais uma vez por ultracentrifugação (40.000 xg, 1,5 h, 4 ºC). O pélete final foi ressuspenso em água UltraPure estéril e armazenado a 4 ºC até ao uso adicional. À concentração de DOX em PMPs foi determinada por um espectrofotô- metro SpectraMax (ExX/Em = 485/550 nm) e a concentração do número total de partículas foi determinada por citometria de nano-fluxo (Na- noFCM). d) Carga ativa de doxorrubicina em PMPs de limão e toranja
[00497] —PMPs de toranja (Exemplo 22a) e limão (Exemplo 22b) fo- ram usados para carregar doxorrubicina (DOX). Uma solução de esto- que de doxorrubicina (DOX, Sigma PHR1789) foi preparada a uma con- centração de 10 mg/mL em água UltraPure (ThermoFisher, 10977023), esterilizada (0,22 um) e armazenada a 4 ºC. 0,5 mL de PMPs foram misturados com 0,25 mL de solução de DOX. A concentração final de DOX na mistura foi 3,3 mg/mL. A concentração inicial das partículas para os PMPs de toranja (GF) foi 9,8x10*? PMPs/mL e para os PMPs de limão (LM) foi 1,8x10º? PMPs/mL. A mistura foi agitada durante 4 horas a 25 ºC, 100 rpm, na escuridão. Depois, a mistura foi diluída 3,3 vezes com água UltraPure (a concentração final de DOX na mistura foi 1 mg/mL) e dividida em duas partes iguais (1,25 mL para a carga passiva
(Exemplo 22c) e 1,25 mL para a carga ativa). Ambas as amostras foram incubadas durante 23 h adicionais a 25 ºC, 100 rpm, na escuridão. To- dos os passos foram levados a cabo sob condições estéreis.
[00498] — Após incubação a 25 ºC durante um dia, a mistura foi man- tida a 4 ºC durante 4 dias. Depois, a mistura foi sonicada durante 30 min em um banho de sonicação (Branson 2800) a 42 ºC, sujeita a vórtice e sonicada uma vez mais durante 20 min. De seguida, a mistura foi diluída duas vezes com água estéril e extrudada usando um Avanti Mini Extruder (Avanti Lipids). Para se reduzir o número de bicamadas de lipídeos e o tamanho global das partículas, os PMPs carregados com DOX foram ex- trudados de um modo passo a passo decrescente: 800 nm, 400 nm e 200 nm para os PMPs de toranja (GF); e 800 nm, 400 nm para os PMPs de limão (LM). Para se remover DOX não carregada ou fracamente ligada, as amostras foram lavadas usando uma abordagem de ultracentrifugação. Especificamente, a amostra (1,5 mL) foi diluída com água UltraPure estéril (6,5 mL total) e foi centrifugada duas vezes a 40.000 xg durante 1 h a 4 ºC em tubos de ultracentrífuga de 7 mL. O pélete final foi ressuspenso em água UltraPure estéril e mantido a 4 ºC até ao uso adicional. e) Determinação da capacidade de carga de PMPs carregados com DOX preparados por carga passiva e ativa
[00499] Para se avaliar a capacidade de carga de DOX em PMPs, a concentração de DOX foi avaliada por medição da intensidade de fluo- rescência (EX/Em = 485/550 nm) usando um espectrofotômetro Spec- traMaxº. Foi usada uma curva de calibração de DOX livre de O a 83,3 ug/mL. Para dissociar PMPs carregados com DOX e complexos de DOX (empilhamento Tr-TT), as amostras e os padrões foram incubados com SDS a 1% a 37 ºC durante 30 min antes das medições de fluorescência. A capacidade de carga (pg de DOX por 1000 partículas) foi calculada como a concentração de DOX (pg/mL) dividida pela concentração total de PMPs (PMPs/mL) (Fig. 9G). A capacidade de carga para PMPs pas- sivamente carregados foi 0,55 pg de DOX (GF PMP-DOX) e 0,25 pg de DOX (LM PMP-DOX) para 1000 PMPs. A capacidade de carga para PMP's ativamente carregados foi 0,23 pg de DOX (GF PMP-DOX) e 0,27 pg de DOX (LM PMP-DOX) para 1000 PMPs. f) Estabilidade de PMP's de toranja e limão carregados com doxorrubicina
[00500] A estabilidade dos PMPs carregados com DOX foi avaliada por medição da concentração de PMPs totais (PMP/mL) na amostra ao longo do tempo usando NanoFCM. O estudo de estabilidade foi levado a cabo a 4 ºC durante oito semanas na escuridão. Alíquotas de PMP- DOX foram armazenadas a 4 ºC e analisadas por NanoFCM em dias predeterminados. O tamanho das partículas de PMP-DOX não mudou sig- nificativamente. Assim, para os GF PMPs passivamente carregados, a gama de tamanhos médios das partículas foi 70-80 nm ao longo de dois meses. As concentrações de PMPs totais na amostra foram analisadas (Fig. 9H). A gama de concentrações para os GF PMPs passivamente car- regados foi 2,06x10*' a 3,06x10*' PMPs/mL, para os GF PMPs ativamente carregados foi 5,55x10*' a 9,97x10** PMPs/mL e, para os LM PMPs pas- sivamente carregados, foi 8,52x10" a 1,76x10*? PMPs/mL ao longo de oito semanas a 4 ºC. Os nossos dados indicam que os PMPs carrega- dos com DOX são estáveis durante 8 semanas a 4 ºC. Exemplo 23: Tratamento de bactérias e fungos com PMPs carrega- dos com moléculas pequenas
[00501] Este exemplo demonstra a capacidade dos PMPs de serem carregados com uma molécula pequena com o propósito de diminuir a aptidão de bactérias e fungos patogênicos. Em este exemplo, os PMPs de toranja são usados como um PMP modelo, E. coli e P. aeruginosa são usados como bactérias patogênicas modelo, a levedura S. cerevi- siae é usada como um fungo patogênico modelo, e doxorrubicina é usada como uma molécula pequena modelo. A doxorrubicina é um an- tibiótico de antraciclina citotóxico isolado a partir de culturas de Strep- tomyces peucetius var. caesius. A doxorrubicina interage com o DNA por intercalação e inibe tanto a replicação do DNA como a transcrição do RNA. Foi mostrado que a doxorrubicina tem atividade antibiótica (Westman et al., Chem Biol, 19 (10): 1255-1264, 2012.) a) Produção de PMPs de toranja usando TFF combinada com SEC
[00502] “Toranjas vermelhas orgânicas foram obtidas a partir de um Whole Foods Marketº local. Uma visão geral do fluxo de trabalho da produção de PMP é dada na Fig. 10A. Quatro litros de suco de toranja foram coletados em uma prensa de suco, o pH ajustado até pH 4 com NaOH, incubados com pectinase a 1U/mL (Sigma, 17389) para se re- moverem os contaminantes de pectina e, subsequentemente, centrifu- gados a 3.000 g durante 20 minutos, seguido por 10.000 g durante 40 minutos para se removerem os grandes detritos. De seguida, o suco processado foi incubado com EDTA a 500 mM pH 8,6, até uma concen- tração final de EDTA a 50 mM, pH 7,7 durante 30 minutos para quelar o cálcio e prevenir a formação de macromoléculas de pectina. Subse- quentemente, o suco tratado com EDTA foi passado através de um filtro de 11 um, 1 um e 0,45 um para se removerem as grandes partículas. O suco filtrado foi lavado e concentrado por Filtração de Fluxo Tangencial (TFF) usando uma TFF de 300 kDa. O suco foi concentrado 5x, seguido por uma lavagem de troca de 6 volumes com PBS e, ainda, filtrado até uma concentração final de 198 mL (20x). De seguida usámos cromato- grafia por exclusão de tamanhos para eluir as frações contendo PMP, que foram analisadas por absorbância a 280 nm (SpectraMaxº) e con- centração de proteína (ensaio Pierce!" BCA, ThermoFisher) para veri- ficar as frações contendo PMP e frações tardias contendo contaminan- tes (Figs. 10B e 10C). As frações de SEC 3-7 continham PMP's purifica-
dos (as frações 9-12 continham contaminantes), foram agrupadas, fo- ram esterilizadas por filtração sequencial usando filtros de seringa de 0,8 um, 0,45 um e 0,22 um e foram concentradas ainda por peletização de PMPs durante 1,5 hrs a 40.000x g e o pélete ressuspenso em 4 mL de Água Destilada Isenta de DNase/RNase UltraPure'" (ThermoFisher, 10977023). A concentração final de PMP (7,56x10*? PMPs/mL) e tama- nho médio de PMP (70,3 nm +/- 12,4 nm SD) foram determinados por NanoFCM, usando padrões de concentração e tamanho proporciona- dos pelo fabricante (Figs. 10D e 10E). Os PMPs de toranja produzidos foram usados para carregar doxorrubicina.
b) Carga de doxorrubicina em PMPs de toranja
[00503] Os PMPs de toranja produzidos no Exemplo 23a foram usa- dos para carregar doxorrubicina (DOX). Uma solução de estoque de do- xorrubicina (Sigma PHR1789) foi preparada a uma concentração de 10 mg/mL em água UltraPure e esterilizada por filtro (0,22 um). Os PMPs de toranja estéreis (3 mL à concentração de partículas de 7,56x10"? PMPs/mL) foram misturados com 1,29 mL de solução de DOX. A con- centração final de DOX na mistura foi 3 mg/mL. A mistura foi sonicada durante 20 min em um banho de sonicação (Branson 2800) com tempe- ratura subindo até 40 ºC e mantida durante 15 minutos adicionais no banho sem sonicação. A mistura foi agitada durante 4 horas a 24 ºC, 100 rpm, na escuridão. De seguida, a mistura foi extrudada usando Avanti Mini Extruder (Avanti Lipids). Para se reduzir o número de bica- madas de lipídeos e o tamanho global das partículas, os PMPs carrega- dos com DOX foram extrudados de um modo passo a passo decres- cente: 800 nm, 400 nm e 200 nm. A amostra extrudada foi esterilizada por filtro por passagem subsequente através de um filtro de 0,8 um e 0,45 um (Millipore, diâmetro de 13 mm) em uma cobertura TC. Para se remover DOX não carregada ou fracamente ligada, a amostra foi purifi- cada usando uma abordagem de ultracentrifugação. Especificamente, a amostra foi centrifugada a 100.000x g durante 1h a 4 ºC em tubos de ultracentrífuga de 1,5 mL. O sobrenadante foi coletado para análise adi- cional e armazenado a 4 ºC. O pélete foi ressuspenso em água estéril e ultracentrifugado sob as mesmas condições. Este passo foi repetido quatro vezes. O pélete final foi ressuspenso em água UltraPure estéril e mantido a 4 ºC até ao uso adicional.
[00504] “De seguida, a concentração de partículas e a capacidade de carga dos PMPs foram determinadas. O número total de PMPs na amostra (4,76x10 *? PMP/mL) e o tamanho mediano das partículas (72,8 nm +/- 21 nm SD) foram determinados usando um NanoFCM. A con- centração de DOX foi avaliada por medição da intensidade de fluores- cência (EX/Em = 485/550 nm) usando um espectrofotômetro Spectra- Maxº. Uma curva de calibração de DOX livre de O a 50 ug/mL foi prepa- rada em água estéril. Para dissociar PMPs carregados com DOX e com- plexos de DOX (empilhamento Tr-TT), as amostras e os padrões foram incubados com SDS a 1% a 37 ºC durante 45 min antes das medições de fluorescência. A capacidade de carga (pg de DOX por 1000 partícu- las) foi calculada como a concentração de DOX (pg/mL) dividida pelo número total de PMPs (PMPs/mL). A capacidade de carga de PMP-DOX foi 1,2 pg de DOX por 1000 PMPs. No entanto deve ser notado que a eficiência de carga (a % de PMPs carregados com DOX em comparação com o número total de PMPs) não pôde ser avaliada pois o espectro de fluorescência de DOX não pôde ser detectado no NanoFCM.
[00505] Os nossos resultados indicam que os PMPs podem ser efi- cientemente carregados com uma molécula pequena. c) Tratamento de bactérias e leveduras com PMPs de toranja carrega- dos com Dox
[00506] Para se estabelecer que os PMPs conseguem entregar um agente citotóxico, várias espécies de micróbios foram tratadas com
PMP's de toranja carregados com Doxorrubicina (PMP-DOX) do Exem- plo 23b.
[00507] As estirpes de bactérias e leveduras foram mantidas como indicado pelo fornecedor: E. coli (ATCC, t25922) foi cultivada em Ágar de Soja de Tripticase/caldo a 37 ºC, Pseudomonas aeruginosa (ATCC) foi cultivada em Ágar de soja Tríptico/caldo com rifampicina a 50 mg/mL a 37 ºC, e Saccharomyces cerevisiae (ATCC, t 9763) foi cultivada em caldo de extrato de levedura, peptona e dextrose (YPD) e mantida a 30 ºC. Antes do tratamento, as culturas frescas de um dia foram cultivadas durante a noite, a OD (600 nm) foi ajustada até 0,1 OD com meio antes do uso, e as bactérias/leveduras foram transferidas para uma placa de 96 poços para tratamento (amostras em duplicado, 100 ul/poço). As bactérias/leveduras foram tratadas com uma solução de PMP-DOX de 50 ul em água Ultrapure até uma concentração eficaz de DOX de O (controle negativo), 5 uM, 10 UM, 25 uM, 50 UM e 100 UM (o volume final por poço foi 150 uL). As placas foram cobertas com papel de alu- mínio e incubadas a 37 ºC (E. coli, P. aeruginosa) ou 30 ºC (S. cerevi- Siae) e agitadas a 220 rpm.
[00508] “Uma medição de Absorvância cinética a 600 nm foi realizada em um espectrofotômetro SpectraMaxº para se monitorizar a DO das culturas at = O h, t= 1h, t=2h,t=3h,t=4,5h,t=16h(E. coli, P. aeruginosa) ou t = 0,5h,t= 1,5h,t=2,5h,t=3,5h,t=4h,t=16h(S. cerevisiae). Uma vez que a doxorrubicina tem um amplo espectro de fluorescência que sangra parcialmente na absorbância de 600 nm a uma elevada concentração de DOX, todos os valores de DO por dose de tratamento foram em primeiro lugar normalizados para a DO do pri- meiro ponto temporal a essa dose (t = O para E. coli, P. aeruginosa, t = 0,5 para S. cerevisiae). Para se comparar o efeito citotóxico do trata- mento com PMP-DOX em diferentes estirpes de bactérias e leveduras, dentro de cada grupo de tratamento a DO relativa foi determinada em comparação com o controle não tratado (definido para 100%). Todas as espécies de micróbios testadas mostraram um grau variável de citotoxi- cidade induzida por PMP-DOX (Figs. 10F-10I), que era dependente da dose exceto em S. cerevisiae. S. cerevisiae foi a mais sensível a PMP- DOX, já mostrando uma resposta citotóxica após 2,5 hrs de tratamento e alcançando uma IC50 à menor dose efetiva testada (5 uM), 16 horas pós-tratamento, que é 10x mais sensível do que qualquer outro micróbio testado em esta série. A partir de 3 horas após tratamento, E. coli alcan- çou uma IC50 somente para 100 uM. P. aeruginosa foi a menos sensível a PMP-DOX, mostrando uma redução máxima de crescimento de 37% às dosagens eficazes de DOX de 50 e 100 uM. Testámos também a doxorrubicina livre e descobrimos que, usando as mesmas dosagens, a citotoxicidade é induzida mais cedo do que com a entrega de PMP-DOX. Isto indica que a molécula pequena doxorrubicina se difunde pronta- mente nos organismos unicelulares, em comparação com os PMPs de membrana de lipídeos que, para liberar sua carga, necessitam de cruzar a parede celular microbiana e se fundir com as membranas celulares alvo diretamente com a membrana plasmática ou com a membrana en- dossômica após captação endocítica.
[00509] Os nossos dados mostram que os PMPs carregados com uma molécula pequena conseguem impactar negativamente a aptidão de uma variedade de bactérias e leveduras. Exemplo 24: Tratamento de um micróbio com PMPs carregados com proteína
[00510] Este exemplo demonstra que os PMPs podem ser exogena- mente carregados com uma proteína, os PMPs podem proteger sua carga da degradação e os PMPs podem entregar sua carga funcional a um or- ganismo. Em este exemplo, os PMPs de toranja são usados como PMP modelo, a bactéria Pseudomonas aeruginosa é usada como um orga- nismo modelo, e a proteína luciferase é usada como uma proteína modelo.
[00511] Embora os fármacos baseados em proteínas e peptídeos te- nham grande potencial para impactar a aptidão de uma ampla variedade bactérias e fungos patogênicos que são resistentes ou difíceis de tratar, sua implantação tem sido malsucedida devido à sua instabilidade e de- safios de formulação.
a) Carga da proteína Luciferase em PMPs de toranja
[00512] Os PMPs de toranja foram produzidos como descrito no Exemplo 10a. A proteína Luciferase (Luc) foi adquirida a partir da LSBio (no. cat. LS-G5533-150) e dissolvida em PBS, pH 7,4 até uma concen- tração final de 300 ug/mL. Os PMP's esterilizados por filtro foram carre- gados com proteína luciferase por eletroporação, usando um protocolo adaptado a partir de Rachael W. Sirianni e Bahareh Behkam (eds.), Tar- geted Drug Delivery: Methods and Protocols, Methods in Molecular Bio- logy, vol. 1831. PMPs sozinhos (controle de PMP), proteína luciferase sozinha (controle de proteína) ou PMP + proteína luciferase (PMPs car- regados com proteína) foram misturados com tampão de eletroporação 4,8Xx (Optiprep a 100% (Sigma, D1556) em água UltraPure) para se ter uma concentração final de Optiprep de 21% na mistura reacional (ver Tabela 3). O controle de proteína foi feito por mistura da proteína lucife- rase com água UltraPure em vez de Optiprep (controle de proteína), pois o pélete final de PMP-Luc foi diluído em água. As amostras foram trans- feridas para cuvetes resfriadas e eletroporadas a 0,400 kV, 125 uF (0,125mF), resistência baixa 100 O - elevada 600 O com dois pulsos (4- ms) usando um Biorad GenePulserº. A reação foi colocada em gelo durante 10 minutos e transferida para um tubo de ultracentrífuga de 1,5 mL pré-resfriado. Todas as amostras contendo PMPs foram lavadas 3 vezes por adição de 1,4 mL de água ultrapure, seguida por ultracentri- fugação (100.000x g durante 1,5 h a 4 ºC). O pélete final foi ressuspenso em um volume mínimo de água UltraPure (50 uL) e mantido a 4 ºC até ao uso. Após eletroporação, as amostras contendo somente proteína luciferase não foram lavadas por centrifugação e foram armazenadas a 4 ºC até ao uso.
[00513] Parase determinar a capacidade de carga de PMP, um micro- litro de PMPs carregados com Luciferase (PMP-Luc) e um microlitro de PMP's não carregados foram usados. Para se determinar a quantidade de proteína Luciferase colocada nos PMPs, uma curva padrão da proteína Luciferase (LSBio, LS-G5533-150) foi feita (10, 30, 100, 300 e 1000 ng). À atividade de luciferase em todas as amostras e padrões foi avaliada usando o kit de ensaio de luciferase ONE-Glo"Y (Promega, E6110) e me- dindo a luminescência usando um espectrofotômetro SpectraMaxº. A quantidade de proteína luciferase carregada em PMPs foi determinada usando uma curva padrão da proteína Luciferase (LSBio, LS-G5533-150) e normalizada para a luminescência na amostra de PMP não carregada.
A capacidade de carga (ng de proteína luciferase por 1E+9 partículas) foi calculada como a concentração de proteína luciferase (ng) dividida pelo número de PMPs carregados (PMP-Luc). A capacidade de carga de PMP-Luc foi 2,76 ng de proteína Luciferase/1x10º PMPs.
[00514] Os nossos resultados indicam que os PMPs podem ser car- regados com uma proteína modelo que permanece ativa após encapsu- lação.
Tabela 3. Estratégia de carga da proteína luciferase usando eletro- poração.
PMP de Luciferase | Luciferase PMP (PMPs carregados | (controle de | (controle com proteína) proteína) de PMP) Laemntas o pg/mL) (uL) [Optiprepa TOURS [TZ [Er PMP GF (concentração de | 20 20 estoque de PMP = 7,56x10"? PMP/mL)
Nota: 25 uL de luciferase são equivalentes a 7,5 ug de proteína lucife- rase. b) Tratamento de Pseudomonas aeruginosa com PMPs de toranja car- regados com proteína luciferase
[00515] — Pseudomonas aeruginosa (ATCC) foi cultivada durante a noite a 30 ºC em caldo de soja tríptica suplementado com Rifampicina a 50 ug/mL, de acordo com as instruções do fornecedor. As células de Pseudomonas aeruginosa (volume total de 5 mL) foram coletadas por centrifugação a 3.000x g durante 5 min. As células foram lavadas duas vezes com 10 mL de MgCl2 a 10 mM e ressuspensas em 5 mL de MgCl? a 10 mM. A OD600 foi medida e ajustada até 0,5.
[00516] Ostratamentos foram realizados em duplicado em tubos Ep- pendorf de 1,5 mL, contendo 50 uL das células ressuspensas de Pseu- domonas aeruginosa suplementadas com 3 ng de PMP-Luc (diluído em água Ultrapure), 3 ng de proteína luciferase livre (controle somente de proteína; diluído em água Ultrapure) ou água Ultrapure (controle nega- tivo). Água Ultrapure foi adicionada a 75 ul em todas as amostras. As amostras foram misturadas e incubadas à temperatura ambiente du- rante 2 h e cobertas com folha de alumínio. As amostras foram de se- guida centrifugadas a 6.000x g durante 5 min, e 70 ul do sobrenadante foram coletados e guardados para a detecção de luciferase. O pélete bacteriano foi subsequentemente lavado três vezes com 500 ul de MgCl2 a 10 mM contendo Triton X-100 a 0,5% para se removerem/rom- per os PMPs que não foram captados. Uma lavagem final com 1 mL de MgCl2 a 10 mM foi realizada para se remover o Triton X-100 residual. 970 uL do sobrenadante foram removidos (deixando o pélete em 30 ul de tampão de lavagem) e 20 ul de MgCl2 a 10 mM e 25 ul de água Ultrapure foram adicionados para ressuspender os péletes de Pseudo- monas aeruginosa. A proteína luciferase foi medida por luminescência usando o kit de ensaio de luciferase ONE-Glo"Y (Promega, E6110), de acordo com as instruções do fabricante. As amostras (pélete bacteriano e amostras de sobrenadante) foram incubadas durante 10 minutos, e a luminescência foi medida em um espectrofotômetro SpectraMaxº. A Pseudomonas aeruginosa tratada com PMPs de toranja carregados com proteína Luciferase teve uma expressão de luciferase 19,3 vezes mais elevada do que o tratamento com proteína luciferase livre sozinha ou o controle de água Ultrapure (controle negativo), indicando que os PMP's são capazes de entregar eficientemente sua carga de proteína às bactérias (Fig. 11). Adicionalmente, os PMPs parecem proteger a pro- teína luciferase da degradação, uma vez que os níveis de proteína luci- ferase livre tanto no sobrenadante como nos péletes bacterianos são muito baixos. Considerando que a dose de tratamento foi 3 ng de pro- teína luciferase, com base na curva padrão da proteína luciferase, a proteína luciferase livre no sobrenadante ou péletes bacterianos após 2 horas de incubação à TA em água corresponde a <0,1 ng de proteína luciferase, indicando degradação da proteína.
[00517] Os nossos dados mostram que os PMPs conseguem entre- gar uma carga de proteína aos organismos e que os PMPs conseguem proteger sua carga da degradação pelo ambiente.
OUTRAS MODALIDADES
[00518] Algumas modalidades da invenção estão dentro dos seguin- tes parágrafos numerados.
1. Uma composição de controle de patógenos compreen- dendo uma pluralidade de PMPs, em que cada um da pluralidade de PMPs compreende um agente de controle de patógenos heterólogo e em que a composição é formulada para entrega a um patógeno de ani- mais agrícola ou veterinário ou um seu vetor.
2. A composição de controle de patógenos do parágrafo 1, em que o agente de controle de patógenos heterólogo é um agente an-
tibacteriano, um agente antifúngico, um agente virucida, um agente an- tiviral, um agente inseticida, um agente nematicida, um agente antipa- rasitário ou um repelente de insetos.
3. A composição de controle de patógenos do parágrafo 2, em que o agente antibacteriano é doxorrubicina.
4. A composição de controle de patógenos do parágrafo 2, em que o agente antibacteriano é um antibiótico.
5. A composição de controle de patógenos do parágrafo 4, em que o antibiótico é vancomicina.
6. A composição de controle de patógenos do parágrafo 4, em que o antibiótico é uma penicilina, uma cefalosporina, uma mo- nobactam, um carbapenem, um macrolídeo, um aminoglicosídeo, uma quinolona, uma sulfonamida, uma tetraciclina, um glicopeptídeo, uma lipoglicopeptídeo, uma oxazolidinina, uma rifamicina, uma tuberactino- micina, cloranfenicol, metronidazol, tinidazol, nitrofurantoína, teicopla- nina, telavancina, linezolida, ciclosserina 2, bacitracina, polimixina B, vi- omicina ou capreomicina.
7. A composição de controle de patógenos do parágrafo 2, em que o agente antifúngico é uma alilamina, um imidazol, um triazol, um tiazol, um polieno ou uma equinocandina.
8. A composição de controle de patógenos do parágrafo 2, em que o agente inseticida é um cloronicotinil, um neonicotinoide, um carbamato, um organofosfato, um piretroide, uma oxadiazina, uma es- pinosina, um ciclodieno, um organocloro, um fiprol, uma mectina, uma diacil-hidrazina, uma benzoilureia, um organoestanho, um pirrol, um di- nitroterpenol, um METI, um ácido tetrônico, um ácido tetrâmico ou uma ftalamida.
9. A composição de controle de patógenos do parágrafo 1, em que o agente de controle de patógenos heterólogo é uma molécula pequena, um ácido nucleico ou um polipeptídeo.
10. A composição de controle de patógenos do parágrafo 9, em que a molécula pequena é um antibiótico ou um metabolito secun- dário.
11. A composição de controle de patógenos do parágrafo 9, em que o ácido nucleico é um RNA inibidor.
12. A composição de controle de patógenos de qualquer um dos parágrafos 1-11, em que o agente de controle de patógenos hete- rólogo é encapsulado por cada um da pluralidade de PMPs.
13. A composição de controle de patógenos de qualquer um dos parágrafos 1-11, em que o agente de controle de patógenos hete- rólogo está embebido na superfície de cada um da pluralidade de PMPs.
14. A composição de controle de patógenos de qualquer um dos parágrafos 1-11, em que o agente de controle de patógenos hete- rólogo está conjugado à superfície de cada um da pluralidade de PMPs.
15. A composição de controle de patógenos de qualquer um dos parágrafos 1-14, em que cada um da pluralidade de PMPs compre- ende um agente de controle de patógenos adicional.
16. A composição de controle de patógenos de qualquer um dos parágrafos 1-15, em que o patógeno é uma bactéria, um fungo, um inseto parasitário, um nematódeo parasitário ou um protozoário parasi- tário.
17. A composição de controle de patógenos do parágrafo 16, em que a bactéria é uma espécie de Pseudomonas, uma espécie de Escherichia, uma espécie de Streptococcus, uma espécie de Pneumo- coccus, uma espécie de Shigella, uma espécie de Salmonella ou uma espécie de Campylobacter.
18. A composição de controle de patógenos do parágrafo 17, em que a espécie de Pseudomonas é Pseudomonas aeruginosa.
19. A composição de controle de patógenos do parágrafo 17, em que a espécie de Escherichia é Escherichia coli.
20. A composição de controle de patógenos do parágrafo 16, em que o fungo é uma espécie de Saccharomyces ou uma espécie de Candida.
21. A composição de controle de patógenos do parágrafo 16, em que o inseto parasitário é uma espécie de Cimex.
22. A composição de controle de patógenos do parágrafo 16, em que o nematódeo parasitário é uma espécie de Heligmosomoides.
23. A composição de controle de patógenos do parágrafo 16, em que o protozoário parasitário é uma espécie de Trichomonas.
24. A composição de controle de patógenos do parágrafo 1, em que o vetor é um inseto.
25. A composição de controle de patógenos do parágrafo 24, em que o vetor é um mosquito, um carrapato, um ácaro ou um piolho.
26. A composição de controle de patógenos de qualquer um dos parágrafos 1-25, em que a composição é estável durante pelo me- nos um dia à temperatura ambiente e/ou estável durante pelo menos uma semana a 4 ºC.
27. A composição de controle de patógenos de qualquer um dos parágrafos 1-26, em que os PMPs são estáveis durante pelo menos 24 horas, 48 horas, sete dias ou 30 dias a 4 ºC.
28. A composição de controle de patógenos do parágrafo 27, em que os PMPs são estáveis a uma temperatura de pelo menos 20 ºC, 24 ºC ou 37 ºC.
29. A composição de controle de patógenos de qualquer um dos parágrafos 1-23 ou 26-28, em que a pluralidade de PMPs na com- posição está a uma concentração eficaz para diminuir a aptidão de um patógeno de animais.
30. A composição de controle de patógenos de qualquer um dos parágrafos 1-15 ou 24-28, em que a pluralidade de PMPs na com- posição está a uma concentração eficaz para diminuir a aptidão de um vetor de patógeno de animais.
31. A composição de controle de patógenos de qualquer um dos parágrafos 1-23 ou 26-30, em que a pluralidade de PMPs na com- posição está a uma concentração eficaz para tratar uma infeção em um animal infectado com um patógeno.
32. A composição de controle de patógenos de qualquer um dos parágrafos 1-23 ou 26-30, em que a pluralidade de PMPs na com- posição está a uma concentração eficaz para prevenir uma infeção em um animal em risco de uma infeção com um patógeno.
33. A composição de controle de patógenos de qualquer um dos parágrafos 1-32, em que a pluralidade de PMPs na composição está a uma concentração de pelo menos 0,01 ng, 0,1 ng, 1 ng, 2 ng, 3 ng, 4 ng, 5 ng, 10 ng, 50 ng, 100 ng, 250 ng, 500 ng, 750 ng, 1 ug, 10 ug, 50 ug, 100 ug ou 250 ug de proteína PMP/mL.
34. A composição de controle de patógenos de qualquer um dos parágrafos 1-33, em que a composição compreende um transpor- tador agricolamente aceitável.
35. A composição de controle de patógenos de qualquer um dos parágrafos 1-34, em que a composição compreende um transpor- tador farmaceuticamente aceitável.
36. A composição de controle de patógenos de qualquer um dos parágrafos 1-35, em que a composição é formulada para estabilizar os PMPs.
37. A composição de controle de patógenos de qualquer um dos parágrafos 1-36, em que a composição é formulada como um lí- quido, um sólido, um aerossol, uma pasta, um gel ou uma composição de gás.
38. A composição de controle de patógenos de qualquer um dos parágrafos 1-37, em que a composição compreende pelo menos 5% de PMPs.
39. Uma composição de controle de patógenos compreen- dendo uma pluralidade de PMPs, em que os PMPs são isolados a partir de uma planta por um processo que compreende os passos de: (a) proporcionar uma amostra inicial de uma planta, ou uma sua parte, em que a planta ou sua parte compreende EVs; (b) isolar uma fração de PMP em bruto da amostra inicial, em que a fração de PMP em bruto tem um nível diminuído de pelo menos um contaminante ou componente indesejado da planta ou sua parte em relação ao nível na amostra inicial; (c) purificar a fração de PMP em bruto, produzindo deste modo uma pluralidade de PMPs puros, em que a pluralidade de PMPs puros tem um nível diminuído de pelo menos um contaminante ou com- ponente indesejado da planta ou sua parte em relação ao nível na fração de EV em bruto; (d) carregar a pluralidade de PMPs do passo (c) com um agente de controle de patógenos; e (e) formular os PMPs do passo (d) para entrega a um pató- geno de animais agrícola ou veterinário ou um seu vetor.
40. Um patógeno de animais compreendendo a composição de controle de patógenos de qualquer um dos parágrafos 1-39.
41. Um vetor de patógeno de animais compreendendo a composição de controle de patógenos de qualquer um dos parágrafos 1-40.
42. Um método de entregar uma composição de controle de patógenos a um animal compreendendo administrar ao animal a com- posição de qualquer um dos parágrafos 1-39.
43. Um método de tratar uma infeção em um animal com sua necessidade, compreendendo o método administrar ao animal uma quantidade eficaz da composição de qualquer um dos parágrafos 1-39.
44. Um método de prevenir uma infeção em um animal em seu risco, compreendendo o método administrar ao animal uma quanti- dade eficaz da composição de qualquer um dos parágrafos 1-39, em que o método diminui a probabilidade da infeção no animal em relação a um animal não tratado.
45. O método de qualquer um dos parágrafos 42-44, em que a infeção é causada por um patógeno, e o patógeno é uma bactéria, um fungo, um vírus, um inseto parasitário, um nematódeo parasitário ou um protozoário parasitário.
46. O método do parágrafo 45, em que a bactéria é uma es- pécie de Pseudomonas, uma espécie de Escherichia, uma espécie de Streptococcus, uma espécie de Pneumococcus, uma espécie de Shi- gella, uma espécie de Salmonella ou uma espécie de Campylobacter.
47. O método do parágrafo 45, em que o fungo é uma espé- cie de Saccharomyces ou uma espécie de Candida.
48. O método do parágrafo 45, em que o inseto parasitário é uma espécie de Cimex.
49. O método do parágrafo 45, em que o nematódeo parasi- tário é uma espécie de Heligmosomoides.
50. O método do parágrafo 45, em que o protozoário parasi- tário é uma espécie de Trichomonas.
51. O método de qualquer um dos parágrafos 42-50, em que a composição de controle de patógenos é administrada ao animal oral- mente, intravenosamente ou subcutaneamente.
52. Um método de entregar uma composição de controle de patógenos a um patógeno compreendendo contatar o patógeno com a composição de qualquer um dos parágrafos 1-39.
53. Um método de diminuir a aptidão de um patógeno, com- preendendo o método entregar ao patógeno a composição de qualquer um dos parágrafos 1-39, em que o método diminui a aptidão do pató- geno em relação a um patógeno não tratado.
54. O método do parágrafo 52 ou 53, em que o método com- preende entregar a composição a pelo menos um habitat onde o pató- geno cresce, vive, se reproduz, se alimenta ou infesta.
55. O método de qualquer um dos parágrafos 52-54, em que a composição é entregue como uma composição comestível pelo pató- geno para ingestão pelo patógeno.
56. O método de qualquer um dos parágrafos 52-55, em que o patógeno é uma bactéria, um fungo, um inseto parasitário, um nema- tódeo parasitário ou um protozoário parasitário.
57. O método do parágrafo 56, em que a bactéria é uma es- pécie de Pseudomonas, uma espécie de Escherichia, uma espécie de Streptococcus, uma espécie de Pneumococcus, uma espécie de Shi- gella, uma espécie de Salmonella ou uma espécie de Campylobacter.
58. O método do parágrafo 56, em que o fungo é uma espé- cie de Saccharomyces ou uma espécie de Candida.
59. O método do parágrafo 56, em que o inseto parasitário é uma espécie de Cimex.
60. O método do parágrafo 56, em que o nematódeo parasi- tário é uma espécie de Heligmosomoides.
61. O método do parágrafo 56, em que o protozoário parasi- tário é uma espécie de Trichomonas.
62. O método de qualquer um dos parágrafos 52-61, em que a composição é entregue como um líquido, um sólido, um aerossol, uma pasta, um gel ou um gás.
63. Um método de diminuir a aptidão de um vetor de pató- geno de animais, compreendendo o método entregar ao vetor uma quantidade eficaz da composição de qualquer um dos parágrafos 1-39, em que o método diminui a aptidão do vetor em relação a um vetor não tratado.
64. O método do parágrafo 63, em que o método compre- ende entregar a composição a pelo menos um habitat onde o vetor cresce, vive, se reproduz, se alimenta ou infesta.
65. O método do parágrafo 63 ou 64, em que a composição é entregue como uma composição comestível para ingestão pelo vetor.
66. O método de qualquer um dos parágrafos 63-65, em que o vetor é um inseto.
67. O método do parágrafo 66, em que o inseto é um mos- quito, um carrapato, um ácaro ou um piolho.
68. O método de qualquer um dos parágrafos 63-67, em que a composição é entregue como um líquido, um sólido, um aerossol, uma pasta, um gel ou um gás.
69. Um método de tratar um animal tendo uma infeção fún- gica, em que o método compreende administrar ao animal uma quanti- dade eficaz de uma composição de controle de patógenos compreen- dendo uma pluralidade de PMPs.
70. Um método de tratar um animal tendo uma infeção fún- gica, em que o método compreende administrar ao animal uma quanti- dade eficaz de uma composição de controle de patógenos compreen- dendo uma pluralidade de PMPs, e em que a pluralidade de PMPs com- preende um agente antifúngico.
71. O método do parágrafo 70, em que o agente antifúngico é um ácido nucleico que inibe a expressão de um gene em um fungo que causa a infeção fúngica.
72. O método do parágrafo 71, em que o gene é Proteína de Crescimento Filamentoso Intensificado (EFG1).
73. O método de qualquer um dos parágrafos 70-72, em que a infeção fúngica é causada por Candida albicans.
74. O método de qualquer um dos parágrafos 70-73, em que a composição compreende um PMP derivado de Arabidopsis.
75. O método de qualquer um dos parágrafos 70-74, em que o método diminui ou elimina substancialmente a infeção fúngica.
76. Um método de tratar um animal tendo uma infeção bac- teriana, em que o método compreende administrar ao animal uma quan- tidade eficaz de uma composição de controle de patógenos compreen- dendo uma pluralidade de PMPs.
77. Um método de tratar um animal tendo uma infeção bac- teriana, em que o método compreende administrar ao animal uma quan- tidade eficaz de uma composição de controle de patógenos compreen- dendo uma pluralidade de PMPs, e em que a pluralidade de PMPs com- preende um agente antibacteriano.
78. O método do parágrafo 77, em que o agente antibacteri- ano é Anfotericina B.
79. O método do parágrafo 77 ou 78, em que a bactéria é uma espécie de Pseudomonas, uma espécie de Escherichia, uma es- pécie de Streptococcus, uma espécie de Pneumococcus, uma espécie de Shigella, uma espécie de Salmonella ou uma espécie de Campylo- bacter.
80. O método de qualquer um dos parágrafos 77-79, em que a composição compreende um PMP derivado de Arabidopsis.
81. O método de qualquer um dos parágrafos 77-80, em que o método diminui ou elimina substancialmente a infeção bacteriana.
82. O método de qualquer um dos parágrafos 69-81, em que o animal é um animal veterinário ou um animal de criação.
83. Um método de diminuir a aptidão de um inseto parasitá- rio, em que o método compreende entregar ao inseto parasitário uma composição de controle de patógenos compreendendo uma pluralidade de PMPs.
84. Um método de diminuir a aptidão de um inseto parasitá- rio, em que o método compreende entregar ao inseto parasitário uma composição de controle de patógenos compreendendo uma pluralidade de PMPs, e em que a pluralidade de PMPs compreende um agente in- seticida.
85. O método do parágrafo 84, em que o agente inseticida é um ácido nucleico de peptídeo.
86. O método de qualquer um dos parágrafos 83-85, em que o inseto parasitário é um percevejo.
87. O método de qualquer um dos parágrafos 83-86, em que o método diminui a aptidão do inseto parasitário em relação a um inseto parasitário não tratado.
88. Um método de diminuir a aptidão de um nematódeo pa- rasitário, em que o método compreende entregar ao nematódeo parasi- tário uma composição de controle de patógenos compreendendo uma pluralidade de PMPs.
89. Um método de diminuir a aptidão de um nematódeo pa- rasitário, em que o método compreende entregar ao nematódeo parasi- tário uma composição de controle de patógenos compreendendo uma pluralidade de PMPs, e em que a pluralidade de PMPs compreende um agente nematicida.
90. O método do parágrafo 88 ou 89, em que o nematódeo parasitário é Heligmosomoides polygyrus.
91. O método de qualquer um dos parágrafos 88-90, em que o método diminui a aptidão do nematódeo parasitário em relação a um nematódeo parasitário não tratado.
92. Um método de diminuir a aptidão de um protozoário pa- rasitário, em que o método compreende entregar ao protozoário parasi- tário uma composição de controle de patógenos compreendendo uma pluralidade de PMPs.
93. Um método de diminuir a aptidão de um protozoário pa- rasitário, em que o método compreende entregar ao protozoário parasi- tário uma composição de controle de patógenos compreendendo uma pluralidade de PMPs, e em que a pluralidade de PMPs compreende um agente antiparasitário.
94. O método do parágrafo 92 ou 93, em que o protozoário parasitário é T. vaginalis.
95. O método de qualquer um dos parágrafos 92-94, em que o método diminui a aptidão do protozoário parasitário em relação a um protozoário parasitário não tratado.
96. Um método de diminuir a aptidão de um vetor de insetos de um patógeno de animais, em que o método compreende entregar ao vetor uma composição de controle de patógenos compreendendo uma pluralidade de PMPs.
97. Um método de diminuir a aptidão de um vetor de insetos de um patógeno de animais, em que o método compreende entregar ao vetor uma composição de controle de patógenos compreendendo uma pluralidade de PMPs, e em que a pluralidade de PMPs compreende um agente inseticida.
98. O método do parágrafo 96 ou 97, em que o método dimi- nui a aptidão do vetor em relação a um vetor não tratado.
99. O método de qualquer um dos parágrafos 96-98, em que o inseto é um mosquito, carrapato, ácaro ou piolho.
Embora a invenção anterior tenha sido descrita em algum detalhe a título de ilustração e exemplo para propósitos de clareza de entendimento, as descrições e exemplos não devem ser considerados como limitando o escopo da invenção. As divulgações de todas as pa- tentes e literatura científica citadas aqui são expressamente incorpora- das em sua totalidade por referência.
[00519] Outras modalidades estão dentro das reivindicações.
APÊNDICE Espécies Exemplifi- | No. de Nome da Proteína ms AR Arabidopsis thaliana COLGG8 | Provável serina/treonina-proteína cinase tipo Co, rota Arabidopsis thaliana F41/082 proteína da superfamília de albuminas 28 ini- bidora bifuncional/proteína de transferência de lipídeos/armazenamento de sementes Arabidopsis thaliana F4/13M3 | Cinase com proteína contendo domínio de re- o, dance Arabidopsis thaliana F4/B62 Proteína da família de proteínas cinases com Cd, mmeneentas — Arabidopsis thaliana O03042 | Cadeia grande de ribulose bifosfato carboxi- lase (Subunidade grande de RuBisCO) (EC
4.1.1.39) Arabidopsis thaliana O03986 | Proteína de choque térmico 90-4 (AtHSP90.4) (AtHsp90-4) (Proteína de choque térmico 81- 4) (Hsp81-4) Arabidopsis thaliana O04309 | Lectina 35 relacionada com Jacalina (Proteína 1 responsiva a JA) (At3g16470 tipo proteína de ligação à Mirosinase) Arabidopsis thaliana O04314 | Proteína 1 de ligação a PYK10 (Lectina 30 re- lacionada com Jacalina) (Proteína induzida por ácido jasmônico) Arabidopsis thaliana O04922 | Provável glutationa peroxidase 2 (EC ic Arabidopsis thaliana 022126 | Proteína 8 arabinogalactana tipo fasciclina
MA AP Arabidopsis thaliana 023179 | Proteína 1 tipo patatina (AtPLP1) (EC 3.1.1.-) (Fosfolipase A Ilgamma relacionada com a patatina) (pPLAIlg) (Fosfolipase A IVA)
E RBLAVIZ Arabidopsis thaliana 023207 | Provável NAD(P)H desidrogenase (quinona) OneramemeRã Arabidopsis thaliana 023255 | Adenosil-homocisteinase 1 (AdoHciase 1) (EC 3.3.1.1) (Proteína EMBRIÃO DEFEITU- OSA 1395) (Proteína SILENCIAMENTO GÊ- NICO DEPENDENTE DA HOMOLOGIA 1) (S- adenosil-L-homocisteína hidrolase 1) (SAH hi- drolase 1) Arabidopsis thaliana 023654 | Subunidade A catalítica de próton ATPase de tipo V (Subunidade A de V-ATPase) (EC
3.6.3.14) (Subunidade de 69 kDa de V- ATPase) (Subunidade A de H(+)-ATPase va- cuolar) (Subunidade alfa da bomba de prótons vacuolar) Arabidopsis thaliana O48963 | Fototropina-1 (EC 2.7.11.1) (Proteína 1 de hi- pocótilo não fototrópica) (Proteína de fototro- pismo de raiz 1) Arabidopsis thaliana O50008 | 5-metiltetra-hidropteroiltriglutamato--homocis- teína metiltransferase 1 (EC 2.1.1.14) (Metio- nina sintase independente da cobalamina 1) (AtMS1) (Metionina sintase independente da vitamina B12 1) Arabidopsis thaliana O64696 |Proteina não caracterizada putativa a A o Arabidopsis thaliana O65572 | Carotenoide 9,10(9' 10')-dioxigenase 1 de cli- vagem (EC 1.14.99.n4) (AtCCD1) (Enzima de clivagem de neoxantina NC1) (AINCED1) Arabidopsis thaliana O65660 | Proteína 1 contendo domínio PLAT (AtPLAT1) a rem Ia Arabidopsis thaliana O65719 | Proteína 3 de choque térmico de 70 kDa (Pro- is so PSC emacs)
(Proteína cognata de choque térmico 70-3) (AtHsc70-3) (Proteína de choque térmico 70- 3) (AtHsp70-3) Arabidopsis thaliana O80517 | Uclacianina-2 (Proteína || de ligação ao cobre a Tasnecenmiocmra tamo) Arabidopsis thaliana O80576 | At2g44060 (Proteína abundante de embriogê- nese tardia, grupo 2) (Similar a proteínas abundantes de embriogênese tardia) Arabidopsis thaliana 080725 | Membro da família 4 de transportadores ABC B (Transportador ABCB.4) (AtABCB4) (Prote- na 4 de resistência a múltiplos fármacos) (P- glicoproteína 4) Arabidopsis thaliana O80852 | Glutationa S-transferase F9 (AtGSTF9) (EC
2.5.1.18) (AIGSTF7) (Membro 9 de classe-phi GST) Arabidopsis thaliana O80858 | Proteína expressa (Proteína não caracteri- zada putativa At2g30930) (Proteína não ca- racterizada putativa At2g30930; F7F1.14) Arabidopsis thaliana O80939 | Receptor cinase IV.1 contendo domínio de le- ctina de tipo L (Cinase receptora e de cinase de Arabidopsis thaliana) (AthlecRK-e) (Le- CRK-IV.1) (EC 2.7.11.1) (Cinase Receptora de Lectina 1) Arabidopsis thaliana O80948 |Lectina 23 relacionada com Jacalina (At2g39330 tipo proteína de ligação à Mirosi- nase) Arabidopsis thaliana 082628 | Subunidade G1 de próton ATPase de tipo V (Subunidade G1 de V-ATPase) (Isoforma 1 da subunidade G de H(+)-ATPase vacuolar) (Su- bunidade G1 da bomba de prótons vacuolar) Arabidopsis thaliana P10795 | Cadeia pequena de ribulose bifosfato carboxi- lase 1A, cloroplástica (Subunidade pequena de RuBisCO 1A) (EC 4.1.1.39)
Arabidopsis thaliana P10896 | Ribulose bisfosfato carboxilase/oxigenase ati- CC A, Imeem fu meNco ans Arabidopsis thaliana P17094 | Proteína ribossômica 60S L3-1 (Proteína EM- o Jomaneremtaae Arabidopsis thaliana P19456 | ATPase 2, tipo membrana plasmática (EC a o a Arabidopsis thaliana P20649 | ATPase 1, tipo membrana plasmática (EC A o a Arabidopsis thaliana P22953 | Provável mediador da subunidade 37e de transcrição da RNA polimerase || (Proteína 1 de choque térmico de 70 kDa) (Proteína 1 cognata de choque térmico de 70 kDa) (Pro- teína cognata de choque térmico 70-1) (AtHsc70-1) (Proteína de choque térmico 70- 1) (AtHsp70-1) (Proteína PRIMEIRAMENTE RESPONSIVA À DESIDRATAÇÃO 2) Arabidopsis thaliana P23586 | Proteína de transporte de açúcar 1 (Transpor- a Msrcaecsomesemeraames)) Arabidopsis thaliana P25696 | Enolase bifuncional 2/ativador transcricional (EC 4.2.1.11) (2-fosfo-D-glicerato hidro-liase 2) (2-fosfoglicerato desidratase 2) (BAIXA EX-
PRESSÃO DE GENES OSMOTICAMENTE RESPONSIVOS 1) Arabidopsis thaliana P25856 | Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase GAPA1, cloroplástica (EC 1.2.1.13) (Subuni- dade 1 de gliceraldeídofosfato desidrogenase A dependente de NADP) Arabidopsis thaliana P28186 | Proteína relacionada com Ras RABE1c (AtRABE1c) (Proteína relacionada com Ras Ara-3) (Proteína relacionada com Ras Rab8A) (AtRab8A) Arabidopsis thaliana P30302 | Aquaporina PIP2-3 (Proteína intrínseca da membrana plasmática 2-3) (AtPIP2; 3) (Prote- na intrínseca da membrana plasmática 2c)
(PIP2c) (RD28-PIP) (TMP2C) (Proteína intrín- seca de tonoplastos induzida por estresse hí- drico) (WSI-TIP) [Clivada em: Aquaporina PIP2-3, N-terminalmente processada] Arabidopsis thaliana P31414 | Bomba de próton 1 da membrana vacuolar energizada com pirofosfato (EC 3.6.1.1) (Piro- fosfatase 1 inorgânica energizada com piro- fosfato) (H(+)-PPase 1) (Pirofosfatase de pró- ton vacuolar 1) (Pirofosfatase de próton vacu- olar 3) Arabidopsis thaliana P38666 | Proteína ribossômica 60S L24-2 (Proteína Cn enem — SS Arabidopsis thaliana P39207 | Nucleosídeo difosfato cinase 1 (EC 2.7.4.6) (Nucleosídeo difosfato cinase 1) (NDK |) (NDP cinase |) (NDPK |) Arabidopsis thaliana P42643 | Proteína GF14 chi tipo 14-3-3 (Fator regulador o aa Arabidopsis thaliana P42737 | Anidrase beta carbônica 2, cloroplástica (AtbCA2) (AtbetaCA2) (EC 4.2.1.1) (Beta car- bonato desidratase 2) Arabidopsis thaliana P42759 | Desidrina ERD10 (Proteína induzida por baixa O o lemeaeino "mA Arabidopsis thaliana P42761 | Glutationa S-transferase F10 (AtGSTF10) (EC
2.5.1.18) (A/GSTF4) (Membro 10 de classe- phi GST) (Proteina RESPOSTA INICIAL À DESIDRATAÇÃO 13) Arabidopsis thaliana P43286 | Aquaporina PIP2-1 (Proteína intrínseca da membrana plasmática 2-1) (AtPIP2; 1) (Prote- na intrínseca da membrana plasmática 2a) (PIP2a) [Clivada em: Aquaporina PIP2-1, N- terminalmente processada]
Arabidopsis thaliana P46286 | Proteína ribossômica L8-1 60S (Proteína L2 ri- bossômica 608) (Proteína EMBRIÃO DEFEI- TUOSA 2296) Arabidopsis thaliana P46422 | Glutationa S-transferase F2 (AtGSTF2) (EC
2.5.1.18) (Proteína de ligação a auxina de 24 kDa) (AtPM24) (Membro 2 de classe-phi GST) Arabidopsis thaliana P47998 | Cisteína sintase 1 (EC 2.5.1.47) (At.OAS.5-8) (Ala sintase beta-substituída 1;1) (ARAth- Bsas1;1) (CSase A) (AtCS-A) (Cys-3A) (O- acetilserina (tiol)-liase 1) (OAS-TL A) (O-ace- tilserina sulfidrilase) (Proteína INÍCIO DA MORTE DAS FOLHAS 3) Arabidopsis thaliana P48347 | Proteína GF14 épsilon tipo 14-3-3 (Fator regu- A A a Arabidopsis thaliana P48491 | Triosefosfato isomerase, citosólica (TIM) (Tri- Istamoronameltctta Arabidopsis thaliana P50318 | Fosfoglicerato cinase 2, cloroplástica (EC NM ta Arabidopsis thaliana P54144 | Membro 1 de transportador de amônio 1 A A a Arabidopsis thaliana P92963 | Proteína RABB1Ic relacionada com Ras (AtRABB1c) (Proteína Rab2A relacionada com Ras) (AtRab2A) Arabidopsis thaliana P93004 | Aquaporina PIP2-7 (Proteína intrínseca da membrana plasmática 2-7) (AtPIP2; 7) (Prote- ína intrínseca da membrana plasmática 3) (Oroteína intrínseca principal induzida pelo estresse salino) [Clivada em: Aquaporina PIP2-7, N-terminalmente processada] Arabidopsis thaliana P93025 | Fototropina-2 (EC 2.7.11.1) (Defeituoso na proteína de evitação de cloroplasto 1) (Prote- ína 1 tipo hipocótilo 1 não fototrópico) (AtKin7) (Proteína 1 tipo NPH1)
1.1.1.37) (Malato desidrogenase 1 depen- dente de NAD citosólica) (CNAD-MDH1) (Ma- lato desidrogenase citossólica 1) (MDH1 cito- sólica) Arabidopsis thaliana Q03250 | Proteína 7 de ligação a RNA rica em glicina (AtGR-RBP7) (AtRBG7) (Proteína 7 rica em glicina) (AtGRP7) (Proteína FRIA, RITMO CIRCADIANO E LIGAÇÃO AO RNA 2) (Prote- na CCR2) Arabidopsis thaliana Q05431 |L-ascorbato peroxidase 1, citosólica (AP) A o ra Arabidopsis thaliana QO06611 | Aquaporina PIP1-2 (AtPIP1; 2) (Proteína intrín- seca da membrana plasmática 1b) (PIP1b) (Pro- teína transmembranar A) (AthH2) (TMP-A) Arabidopsis thaliana Q07488 | Proteína de cobre azul (Proteína de ligação de cobre azul) (AtBCB) (Fitocianina 1) (Estelaci- anina) Arabidopsis thaliana Q1ECEO | Proteína 4-1 associada à vesícula (Homólogo 4-1 de VAP vegetal) (AtPVA41) (Proteína IN-
DUZIDA POR MANITOL ASSOCIADA À MEMBRANA) (AtMAMI) (Proteína 4-1 associ- ada a VAMP) Arabidopsis thaliana 038882 | Fosfolipase D alfa 1 (AtPLDalpha1) (PLD alfa 1) (EC 3.1.4.4) (Colina fosfatase 1) (PLDal- pha) (Fosfolipase hidrolisante de fosfatidilco- lina D1) Arabidopsis thaliana Q38900 | Peptidil-prolil cis-trans isomerase CYP19-1 (PPlase CYP19-1) (EC 5.2.1.8) (Ciclofilina de 19 kDa 1) (Rotamase ciclofilina-3) Arabidopsis thaliana 039033 | Fosfoinositídeo fosfolipase C 2 (EC 3.1.4.11) (Fosfoinositídeo fosfolipase PLC2) (AtPLC2) (PI-PLC2)
Arabidopsis thaliana 039085 | Delta (24)-esterol redutase (EC 1.3.1.72) (Pro- teína de alongamento celular DIMINUTO) (Proteína de alongamento celular Dwarf1) (Proteína CABBAGE1) (Proteína RESPOSTA DE FLUÊNCIA MUITO BAIXA INTENSIFI- CADA 1) Arabidopsis thaliana 039228 | Proteína de transporte de açúcar 4 (Transpor- dn teme Arabidopsis thaliana 039241 | Tiorredoxina H5 (AtTrxh5) (Proteína LOCUS DE INSENSIBILIDADE À VICTORINA 1) (Tiorredoxina 5) (AtTRX5) Arabidopsis thaliana Q39258 | Subunidade E1 de próton ATPase de tipo V (Subunidade E1 de V-ATPase) (Proteína EM- BRIÃO DEFEITUOSO 2448) (Isoforma 1 da subunidade E de H(+)-ATPase vacuolar) (Su- bunidade E1 da bomba de prótons vacuolar) Arabidopsis thaliana Q42403 | Tiorredoxina H3 (AtTrxh3) (Tiorredoxina 3) a o A Arabidopsis thaliana Q42479 | Proteína cinase dependente de cálcio 3 (EC
2.7.11.1) (Isoforma de proteína cinase depen- dente de cálcio CDPK6) (AtCDPK6) Arabidopsis thaliana Q7Y208 | Glicerofosfodiéster fosfodiesterase GDPDL1 (EC 3.1.4.46) (Tipo flicerofosfodiéster fosfodi- esterase 1) (ATGDPDL1) (Tipo glicerofosfodi- esterase 3) (Proteína 2 TIPO SHV3) Arabidopsis thaliana Q84VZ5 | Proteína ancorada por GPI não caracterizada CA 2 A carióticas (Proteína não caracterizada puta- mea gua aten Am Arabidopsis thaliana QO8GUL8 | Proteína ancorada por GPI não caracterizada A o a Arabidopsis thaliana Q8GYAA | Proteína cinase tipo receptor rica em cisteína (RLK10 rica em cisteína) (EC 2.7.11.-) (Proteína cinase tipo receptor 4) Arabidopsis thaliana Q8GZ99 | At5g49760 (Proteína da família das proteínas cinase de repetição rica em leucina) (Proteína cinase tipo receptor de repetição rica em leu- cina) (Proteína cinase receptora putativa) Arabidopsis thaliana Q8L636 | Permutador de sódio/cálcio NCL (Na(+)/Ca(2+)-proteina de permuta NCL) (Proteína tipo NOX) (AtNCL) Arabidopsis thaliana O8L7S1 | At1ig45200 (At1g45200/At1g45200) (Tipo tria- Cm datam Arabidopsis thaliana Q8LAA6 | Provável aquaporina PIP1-5 (AtPIP1; 5) (Pro- teína intrínseca da membrana plasmática 1d) (PIP1d) Arabidopsis thaliana Q8LCP6 | Endoglucanase 10 (EC 3.2.1.4) (Endo-1,4- A o a Arabidopsis thaliana QOS8RWV | Transcetolase-1, cloroplástica (TK) (EC Cm da aa mm DO Arabidopsis thaliana Q8VZG8 | Cinase tipo receptor de interação de MDIS1 2 (AtMIK2) (Provável serina/treonina-proteína cinase tipo receptor LRR At4g908850) (EC
27.111) Arabidopsis thaliana Q8W4E2 | Subunidade B3 de próton ATPase de tipo V (Subunidade B3 de V-ATPase) (Isoforma 3 da subunidade B de H(+)-ATPase vacuolar) (Su- bunidade B3 da bomba de prótons vacuolar)
(Subunidade a3 de V-ATPase) (Isoforma 3 de subunidade a de próton ATPase de tipo V de 95 kDa) (Isoforma a3 de V-ATPase de 95 kDa) (Isoforma 3 de subunidade a de H (+)-ATPase vacuolar) (Subunidade a3 da bomba de pró- tons vacuolar) (Isoforma 3 de subunidade a de ATPase de 95 kDa de translocação de prótons vacuolar) Arabidopsis thaliana Q93XY5 | Tetraspanina-18 (Proteína 2 homóloga de Cr a Arabidopsis thaliana Q93YS4 | Membro da família G dos transportadores ABC 22 (Transportador ABC ABCG.22) (AtA- BCG22) (Proteína homóloga do complexo branco-marrom 23) (AtWBC23) Arabidopsis thaliana Q93Z08 | Glucana endo-1,3-beta-glucosidase 6 (EC
3.2.1.39) ((1->3)-beta-glucana endo-hidrolase 6) ((1->3)-beta-glucanase 6) (Beta-1,3-endo- glucanase 6) (Beta-1,3-glucanase 6) Arabidopsis thaliana Q940M8 | 3-0x0-5-alfa-esteroide 4-desidrogenase A ar o a Arabidopsis thaliana Q944A7 | Provável serina/treonina-proteína — cinase Cn o REED Arabidopsis thaliana Q944G5 | Proteína NRT1I/PTR FAMÍLIA 2.10 (AtNPF2.10) (Proteina TRANSPORTADOR DE GLUCOSINOLATO-1) Arabidopsis thaliana Q94AZ2 | Proteína de transporte de açúcar 13 (Trans- portador de hexose 13) (Supressor de multi- cópias da proteína 1 de deficiência de snf4) Arabidopsis thaliana Q94BT2 | Proteína 12 induzida por auxina em culturas A a a Arabidopsis thaliana Q94CE4 | Anidrase beta carbônica 4 (AtbCA4) (Atbe- taCA4) (EC 4.2.1.1) (Beta carbonato desidra- tase 4)
(Proteína 1 do canal de cálcio) (AKCCH1) (Pro- teína 2 sobrerregulada da oxigenação de áci- dos graxos) (Proteína do canal de cálcio de- pendente da voltagem TPC1) (AtTPC1) Arabidopsis thaliana Q96262 | Proteína de ligação catiônica associada à membrana plasmática 1 (AtPCAP1) (Proteína desestabilizadora de microtúbulos 25) Arabidopsis thaliana Q9C5Y0 | Fosfolipase D delta (AtPLDdelta) (PLD delta) CE o Arabidopsis thaliana Q9C7F7 | Proteína de transferência de lipídeos não es- pecífica ancorada a GPI 1 (AtLTPG-1) (Prote- ína LTP-GPI-ANCORADA 1) Arabidopsis thaliana Q9C821 | Proteína cinase tipo receptor rica em prolina PERK15 (EC 2.7.11.1) (Cinase receptora tipo extensina rica em prolina 15) (APERK15) Arabidopsis thaliana Q9C8G5 | Proteína ERDA4 tipo CSC1 (Proteína INICIAL-
MENTE RESPONSIVA AO ESTRESSE DE DESIDRATAÇÃO 4) Arabidopsis thaliana Q9CAR7 | Proteína 2 de resposta induzida por hipersen- A o aaa Arabidopsis thaliana Q9FFH6 | Proteína 13 de arabinogalactana tipo fasci- Cr A Arabidopsis thaliana Q9FGT8 | Lipocalina-1 induzida por temperatura (At-
CA Arabidopsis thaliana Q9FJ62 | Glicerofosfodiéster fosfodiesterase GDPDL4 (EC 3.1.4.46) (Tipo flicerofosfodiéster fosfodi- esterase 4) (ATGDPDLA4) (Tipo glicerofosfodi- esterase 1) (Proteína 1 TIPO SHV3) Arabidopsis thaliana Q9FK68 | Proteina RABA1c relacionada com Ras a a tada
Arabidopsis thaliana Q9FWRA | Glutationa S-transferase DHAR1, mitocondrial (EC 2.5.1.18) (Homólogo 1 de canal intracelu- lar de cloreto) (Homólogo de CLIC 1) (Desi- droascorbato redutase dependente de glutati- ona 1) (AtDHAR1) (Desidroascorbato redu- tase dependente de GSH 1) (mtDHAR)
Arabidopsis thaliana Q9FX54 | Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase GAPC?2, citosólica (EC 1.2.1.12) (Subunidade 2 de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase C dependente de NAD)
Arabidopsis thaliana Q9LE22 | Provável proteína de ligação ao cálcio CML27 A a oo a Arabidopsis thaliana Q9LEX1 | At3g61050 (Proteína CaLB) (Proteína da fa- mília de ligação de lipídeos dependente de cálcio (domínio CaLB))
Arabidopsis thaliana Q9LF79 | ATPase 8 de transporte de cálcio, tipo mem- brana plasmática (EC 3.6.3.8) (Isoforma 8 de Ca(2+)-ATPase)
Arabidopsis thaliana Q9LJG3 | GDSL esterase/lipase ESM1 (EC 3.1.1.-) (Li- pase extracelular ESM1) (Proteína MODIFI- CADOR DE EPITIOESPECIFICADOR 1) (AtESM1)
Arabidopsis thaliana Q9LJIS Subunidade d1i de próton ATPase de tipo V (Subunidade d1i de V-ATPase) (Isoforma 1 da subunidade d de H(+)-ATPase vacuolar) (Su- bunidade d1 da bomba de prótons vacuolar)
Arabidopsis thaliana Q9LMEA4 | Provável proteína fosfatase 2C 9 (AtPP2C09) (EC 3.1.3.16) (Proteína fosfatase associada a fitocromo 2C) (PAPP2C)
Arabidopsis thaliana — | Q9LNP3 | Atig17620/F11A6 23 (F1L3.32) (Família de glicoproteínas ricas em hidroxiprolina abun- dante na embriogênese tardia (LEA)) (Prote- na não caracterizada putativa At1917620)
Arabidopsis thaliana Q9LNW1 | Proteína RABA2b relacionada com Ras a ta
Arabidopsis thaliana —| Q9LQU2 | Proteina RESISTÊNCIA AO CÁDMIO DE Cn amena Arabidopsis thaliana — | Q9LQUA4 | Proteina RESISTÊNCIA AO CÁDMIO DE Co ravezetas Arabidopsis thaliana Q9LR30 | Glutamato--glioxilato — aminotransferase — 1 (AtGGT2) (EC 2.6.1.4) (Alanina aminotransfe- rase GGT1) (EC 2.6.1.2) (Alanina--glioxilato aminotransferase GGT1) (EC 2.6.1.44) (Ala- nina-2-oxoglutarato aminotransferase 1) (EC
2.6.1.-) Arabidopsis thaliana Q9LSI9 | Serina/treonina-proteína cinase BIR2 tipo re- ceptor LRR inativa (Proteína CINASE 2 TIPO RECEPTOR DE INTERAÇÃO COM BAK1) Arabidopsis thaliana Q9LSQS5 | NAD(P)H desidrogenase (quinona) FOR1 (EC Cm TO Lt950/000m cano too tanto) Arabidopsis thaliana Q9LUTO | Proteína da superfamília das proteínas cina- ses (Proteína não caracterizada putativa At3g17410) (Proteína tipo serina/treonina pro- teína cinase) Arabidopsis thaliana Q9LV48 | Proteína cinase tipo receptor rica em prolina PERK1 (EC 2.7.11.1) (Cinase receptora tipo extensina rica em prolina 1) (A/PERK1) Arabidopsis thaliana Q9LX65 | Subunidade H de próton ATPase de tipo V (Subunidade H de V-ATPase) (Subunidade H de H(+)-ATPase vacuolar) (Subunidade H da bomba de prótons vacuolar) Arabidopsis thaliana Q9LYG3 | Enzima 2 málica dependente de NADP (At- NADP-ME2) (Enzima málica NADP 2) (EC
1.1.1.40) Arabidopsis thaliana Q9MO088 | Glucana endo-1,3-beta-glucosidase 5 (EC
3.2.1.39) ((1->3)-beta-glucana endo-hidrolase 5) ((1->3)-beta-glucanase 5) (Beta-1,3-endo- glucanase 5) (Beta-1,3-glucanase 5)
Arabidopsis thaliana Q9M386 | Família de glicoproteínas ricas em hidroxipro- lina abundante na embriogênese tardia (LEA) (Protena “não caracterizada putativa At3g54200) (Proteína não caracterizada puta- tiva F24B22.160) Arabidopsis thaliana — | Q9M390 | Proteína NRT1/PTR FAMÍLIA 8.1 (AtNPF8.1) a a a Arabidopsis thaliana Q9MS5P2 | Proteína de membrana associada ao trans- portador secretor 3 (AtSC3) (Proteína 3 da membrana transportadora secretora) Arabidopsis thaliana Q9SDS7 | Subunidade C de próton ATPase de tipo V (Subunidade C de V-ATPase) (Subunidade C de H(+)-ATPase vacuolar) (Subunidade C da bomba de prótons vacuolar) Arabidopsis thaliana Q9SEL6 | Transporte de vesícula v-SNARE 11 (AtvTI11) (Proteina GRAVITROPISMO DE REBENTOS 4) (Receptor de proteína de ane- xação de NSF solúvel de vesícula VTI1a) (AtVTI1a) (Proteína de transporte de vesícula v-SNARE VTI1a) Arabidopsis thaliana Q9SF85 | Adenosina cinase 1 (AK 1) (EC 2.7.1.20) e ao Ae tn D Arabidopsis thaliana Q9SIE7 | Proteína 2 contendo domínio PLAT (AtPLAT2) Cd femea Arabidopsis thaliana Q9SIU8 | Provável proteína fosfatase 2C 20 a nec EcsIamAMENTa Arabidopsis thaliana Q9SKB2 | Serina/treonina/tirosina-proteína cinase tipo receptor rica em leucina SOBIRI (EC
2.7.10.1) (EC 2.7.11.1) (Proteina EVERS- HED) (Proteína SUPRESSORA DE BIR1-1)
Arabidopsis thaliana Q9SKR2 | Sinaptotagmina-1 (NTMC2T1.1) (Sinaptotag- A ia a Arabidopsis thaliana Q9SPE6 | Proteína de anexação de NSF alfa-solúvel 2 (Alfa-SNAP2) (Proteína de anexação de fator sensível a N-etilmaleimida alfa 2) Arabidopsis thaliana Q9SRH6 | Proteína 3 de resposta induzida por hipersen- Cm A leenento Arabidopsis thaliana Q9SRY5 | Glutationa S-transferase F7 (EC 2.5.1.18) (AtGSTF8) (Membro 7 de classe-phi GST) (Glutationa S-transferase 11) Arabidopsis thaliana Q9SRZ6 | Isocitrato desidrogenase citosólica [NADP]
EMA Arabidopsis thaliana Q9SU40 | Proteína tipo mono-cobre oxidase SKU5 (Ra- A a o Arabidopsis thaliana Q9SUR6 | Cistina liase CORI3 (EC 4.4.1.35) (Proteína INDUZIDA POR CORONATINA 3) (Proteína RESPONSIVA AO ÁCIDO JASMÔNICO 2) (Tirosina aminotransferase CORI3) Arabidopsis thaliana Q9SVFO0 | Proteina não caracterizada putativa AT4g38350 (Proteína não caracterizada puta- tiva F22113.120) Arabidopsis thaliana Q9SW40 | Proteína da superfamília dos facilitadores principais (Proteína não caracterizada puta- tiva AT4934950) (Proteína não caracterizada putativa T11111.190) Arabidopsis thaliana Q9SZ11 | Glicerofosfodiéster fosfodiesterase GDPDL3 (EC 3.1.4.46) (Tipo glicerofosfodiéster fosfodi- esterase 3) (ATGDPDL3) (Tipo glicerofosfodi- esterase 2) (Proteína MUTANTE PELOS DAS RAÍZES 5) (Proteína SHAVEN 3)
Arabidopsis thaliana Q9SZN1 | Subunidade B2 de próton ATPase de tipo V (Subunidade B2 de V-ATPase) (Isoforma 2 da subunidade B de H(+)-ATPase vacuolar) (Su- bunidade B2 da bomba de prótons vacuolar) Arabidopsis thaliana Q9SZP6 | AT4g938690/F20M13 250 (Proteína da super- família das fosfodiesterases tipo PLC) (Prote- ína não caracterizada putativa AT4g938690) (Protena “não caracterizada putativa F20M13.250) Arabidopsis thaliana Q9SZR1 | ATPase 10 de transporte de cálcio, tipo mem- brana plasmática (EC 3.6.3.8) (Isoforma 10 de Ca(2+)-ATPase) Arabidopsis thaliana Q9TO053 | Fosfolipase D gama 1 (AtPLDgama1) (PLD gama 1) (EC 3.1.4.4) (Colina fosfatase) (Leci- tinase D) (Lipofosfodiesterase |!) Arabidopsis thaliana Q9TO076 | Proteína 2 tipo nodulina inicial (Proteína tipo
CAD Arabidopsis thaliana Q9TOAO | Acil-CoA de cadeia longa sintetase 4 (EC
CD Arabidopsis thaliana Q9TOG4 | Proteina “não caracterizada putativa AT4910060 (Proteína não caracterizada puta- tiva T5L19.190) Arabidopsis thaliana Q9XGM1 | Subunidade D de próton ATPase de tipo V (Subunidade D de V-ATPase) (Subunidade D de H(+)-ATPase vacuolar) (Subunidade D da bomba de prótons vacuolar) Arabidopsis thaliana Q9XI193 | At1ig13930/F16A14.27 (FI6GA14.14) (Proteína o Arabidopsis thaliana Q9XIE2 | Membro da família G dos transportadores ABC 36 (Transportador ABC ABCG.36) (AtA- BCG36) (Proteína 8 de resistência pleiotró- pica a fármacos) (Proteína PENETRAÇÃO 3)
não caracterizada putativa At1909310) (Prote-
AR A Arabidopsis thaliana Q9ZQX4 | Subunidade F de próton ATPase de tipo V (Subunidade F de V-ATPase) (Subunidade de 14 kDa de V-ATPase) (Subunidade F de H(+)- ATPase vacuolar) (Subunidade F de bomba de prótons vacuolar) Arabidopsis thaliana Q9ZSA2 | Proteína cinase dependente de cálcio 21 (EC E a Arabidopsis thaliana Q9ZSDA4 | Sintaxina-121 (AtSYP121) (Proteína relacio- A o a Arabidopsis thaliana Q9ZVO07 | Provável aquaporina PIP2-6 (Proteína intrín- seca da membrana plasmática 2-6) (AtPIP2; 6) (Proteína intrínseca da membrana plasmá- tica 2e) (PIP2e) [Clivada em: Provável aqua- porina PIP2-6, N-terminalmente processada] Arabidopsis thaliana Q9ZSD4 | SYR1, Proteína 1 Relacionada com a Sinta- xina, também conhecida como SYP121, PE- NETRAÇÃO1/PEN1 (Proteína PENETRA- ÇÃO 1) Citrus lemon A9YVC9 | Subunidade beta de pirofosfato--frutose 6-fos- fato 1-fosfotransferase (PFP) (EC 2.7.1.90) (6- fosfofrutocinase, dependente de pirofosfato) (PPi-PFK) (6-Fosfofrutose-1-cinase depen- dente de pirofosfato) Citrus lemon B6DZD3 | Glutationa S-transferase Tau2 (Glutationa o fumemeraa
Citrus lemon K9JG59 | Proteína relacionada com o amadurecimento o deem Citrus lemon QS5UENG6 | Proteína de partícula de reconhecimento de A a o Citrus lemon Q9SP55 | Subunidade G de próton ATPase de tipo V (Subunidade G de V-ATPase) (Subunidade G da bomba de prótons vacuolar)
Citrus lemon Q9THJ8 | Cadeia grande de ribulose bifosfato carboxi- A ÃO leemcnianmento Citrus lemon Q9ZST2 | Subunidade ALFA de pirofosfato--frutose 6-
fosfato 1-fosfotransferase (PFP) (6-fosfofruto- cinase, dependente de pirofosfato) (PPi-PFK) (6-Fosfofrutose-1-cinase dependente de piro- fosfato)
Citrus lemon V4RZF3 | 1,2-di-hidróxi-3-ceto-5-metiltiopenteno — dioxi- genase (EC 1.13.11.54) (Acirredutona dioxi- genase (requerendo Fe(2+))) (ARD) (Fe-ARD) Citrus lemon V4S409 |Cianato hidratase (Cianase) (EC 4.2.1.104) o Jesemenmentes
Citrus lemon V4S535 | Tipo alfa da subunidade de proteassomo (EC A a a
Citrus lemon V4S5A8 |lIsocitrtato — desidrogenase — [NADP] (EC A e
Citrus lemon V4S8T3 | Peptidil-prolil cis-trans isomerase (PPlase) o o jesa UU
Citrus lemon VA4SA44 | Serina/treonina-proteíina — fosfatase (EC a Nes EO
Citrus lemon V4SAI9 | Subunidade M do fator de iniciação da tradu- o acatada
Citrus lemon VA4SBI8 | D-3-fosfoglicerato desidrogenase (EC Mr ata Citrus lemon V4SCOQ6 | Peptidil-prolil cis-trans isomerase (PPlase) a EQ ee CTT Citrus lemon V4SE41 | Proteína DETOXIFICAÇÃO (Proteína de ex- trusão de múltiplos fármacos e compostos tó- xicos) Citrus lemon V4SED1 | Subunidade de flavoproteína succinato desi- drogenase [ubiquinonal, mitocondrial (EC
1.3.5.1) Citrus lemon V4SHH1 | ATPase da membrana plasmática (EC mm o snes TS
Citrus lemon V4SLC6 | Tipo beta da subunidade de proteassomo (EC a dn ea mm
Citrus lemon V4SSB8 | Tipo alfa da subunidade de proteassomo (EC A a
Citrus lemon VA4SV60 | Serina/treonina-proteíina — fosfatase (EC NM a a
Citrus lemon V4SVI5 | Tipo alfa da subunidade de proteassomo (EC a QE me
LB Citrus lemon V4TOV5 | Subunidade A do fator de iniciação da tradu- ção eucariótica 3 (elF3a) (subunidade 10 do fator de iniciação da tradução eucariótica 3) Citrus lemon V4T3P3 | 6-fosfogluconato desidrogenase, descarboxi- e een TT
Citrus lemon V4T7NO | Tipo beta da subunidade de proteassomo (EC a nn QCEss Citrus lemon V4T8E9 | S-aciltransferase (EC 2.3.1.225) (Palmitoil- A Nie
Citrus lemon V4TF24 |Tipo alfa da subunidade de proteassomo (EC a ee o 2 Citrus lemon V4TK29 | Subunidade reguladora da enzima E1 de ati- A een TUTO
Citrus lemon V4TP87 | Anidrase carbônica (EC 4.2.1.1) (Carbonato amena A
Citrus lemon V4TPM1 | Homosserina desidrogenase (HDH) (EC A A ta
Citrus lemon V4TS21 | Tipo beta da subunidade de proteassomo (EC a es ET
Citrus lemon V4TVG1 | Fator de iniciação da tradução eucariótica SA o QD es TE o O Citrus lemon V4TWU1 | Provável metiltiorribulose-1-fosfato desidra- tase/enolase-fosfatase E1 bifuncional [Inclui: Enolase-fosfatase E1 (EC 3.1.3.77) (2,3-di- ceto-5-metiltio-1-fosfopentano fosfatase); Me- tiltiorribulose-1-fosfato desidratase (MTRu-1- P desidratase) (EC 4.2.1.109)] Citrus lemon V4TXU9 | Tiamina tiazol sintase, cloroplástica (Enzima o licmaa Citrus lemon V4TZ91 | Inibidor de dissociação de guanosina nucleo- a nn eae COMU Citrus lemon V4TZU3 | Proteína cinase ativada por mitogênio (EC A E a Citrus lemon V4U003 | Subunidade k do fator de iniciação da tradu- e ease
Citrus lemon V4U1X9 | Tipo beta da subunidade de proteassomo (EC oo OS ja mm Citrus lemon V4UA4N5 | Fator de iniciação de tradução eucariótica 6
A Citrus lemon V4U5BO | Subunidade E do fator de iniciação da tradu- ção eucariótica 3 (elF3e) (Subunidade 6 do fa- a aa EEE Citrus lemon V4U6I5 | Subunidade beta de ATP sintase (EC a Ee O
Citrus lemon V4U734 | Serina/treonina-proteíina — fosfatase (EC NM o a Citrus lemon V4U7R7 | Proteína cinase ativada por mitogênio (EC e De Tm Citrus lemon V4U8J1 | 3-fosfochiquimato — 1-carboxiviniltransferase a Q2 eras "255" Citrus lemon V4U8J8 | Subunidade gama da proteína 1 do complexo MM a aa Citrus lemon V4U9C7 | Subunidade D de fator de iniciação de tradu- ção eucariótica 3 (elF3d) (Subunidade 7 do fa- tor de iniciação de tradução eucariótica 3) (elF-3-zeta)
Citrus lemon V4UG68 | Subunidade | do fator de iniciação da tradução A CS Seas OITO Citrus lemon V4UH77 | Tipo alfa da subunidade de proteassomo (EC a E E A Citrus lemon V4UI34 | Subunidade L do fator de iniciação da tradu-
MM
Citrus lemon V4UL30 | Subunidade beta de pirofosfato--frutose 6-fos- fato 1-fosfotransferase (PFP) (EC 2.7.1.90) (6- fosfofrutocinase, dependente de pirofosfato) (PPi-PFK) (6-Fosfofrutose-1-cinase depen- dente de pirofosfato)
Citrus lemon V4UTYO | Tipo alfa da subunidade de proteassomo (EC oo jaaãa Sm Citrus lemon V4UV83 | Lisina--tRNA ligase (EC 6.1.1.6) (Lisi-t*RNA oo So ses =? =" Citrus lemon V4UVJ5 | Diacilglicerol! cinase (DAG quinase) (EC a Citrus lemon V4V8H5 | Proteína associada à classificação de prote- o mess "2" Citrus lemon V4V9P6 | Subunidade F do fator de iniciação da tradu- o Iasaaasermeraano |
Citrus lemon V4VCL1 | Tipo beta da subunidade de proteassomo (EC oo aaa mm Citrus lemon V4VEB3 | Alanina-tRNA ligase (EC 6.1.1.7) (Alanil- o Sind Citrus lemon V4VFN5 | Tipo beta da subunidade de proteassomo (EC a RE Citrus lemon V4VKI5 | Proteína-L-isoaspartato — O-metiltransferase
A EE Citrus lemon VA4VKP2 | Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (EC A E a Citrus lemon V4VQH3 | Metilenotetra-hidrofolato redutase (EC e EQ ee E ES
Citrus lemon V4VUK6 | S-(hidroximetil)glutationa desidrogenase (EC MM Ao a Citrus lemon V4WAP9 | Subunidade beta de Coatomer (Proteína de o dn eementea O
Citrus lemon V4WC86 | Subunidade B reguladora de 55 kDA de se-
A Citrus lemon VA4WDK3 | 6-Fosfofrutocinase dependente de ATP (ATP- PFK) (Fosfofrutocinase) (EC 2.7.1.11) (Fosfo- hexocinase) Citrus lemon V4WGW | Uridina cinase (EC 2.7.1.48) a ra Citrus lemon V4WHQ | Proteína não caracterizada a Uva Acces- Proteínas Identificadas sion Number Uva ASC5K3 | Adenosil-homocisteinase
RA Uva ASFA65 | Aquaporina PIP1;3 mo
Uva QO0MX13 | Aquaporina PIP2;2
NA Uva ASFA69 | Aquaporina PIP2;4 Hi Uva ASAFS1 | Fator de alongamento 1-alfa
RNA Uva UPIOOO1 | fator de alongamento 2 a E E eme es E or [Eras Uva ASB118 | Frutose-bisfosfato aldolase
RA Uva A1IYW9O0 | Glutationa S-transferase
RA Uva UPIO0O01 | HSC70-1 (proteína 1 cognata de choque tér- S5C9A6A | mico de 70 kDa); isoforma 1 de ligação ao
ATP Uva D7FBCO | Malato desidrogenase
NA Uva ASATB7 | Metilenotetra-hidrofolato redutase
AA Uva ASJPK7 | Monodesidroascorbato redutase
AA Uva Q09VU3 | Fosfolipase D
RNA
O pese — Toranja G8Z362 |(E)-beta-farneseno sintase a Toranja DOUZK1 | 1,2-ramnosiltransferase
CA Toranja Q15GAA4 | Poliproteína de 286 kDa ss Toranja D7NHW | 2-fosfo-D-glicerato hidrolase su
E IJ o Toranja Q09MI8 | Subunidade beta" de RNA polimerase dirigida va Toranja G3CHK8 | Subunidade E do fator de iniciação da tradu- O ata Toranja A9NJGA4 | Hidroperoxido de ácidos graxos liase Gi Toranja G3CHK6 | Proteína da família de repetições ricas em leu- mo Tam
Toranja B2YGX9 | Limonoide UDP-glucosiltransferase a Toranja F8WLBA4 | Proteína contendo domínio de canal iônico A menta Toranja QO09MC9 | Subunidade 5 de NAD(P)H-quinona oxidorre-
SA Toranja Q8H6R9 | Proteína de resistência a doenças tipo NBS- MA a da Toranja Q8H6S0 | Proteína de resistência a doenças tipo NBS- MA a da Toranja Q8H6R6 | Proteína de resistência a doenças tipo NBS- om RN mt Toranja ET7DSSO | P23 o Toranja O04886 | Pectinesterase 1
MA
Toranja B1IPBV7 | Fitoeno sintase ss Toranja Q9ZWQ | Proteína associada a plastídeo-lipídeo, cloro- a lã TIO Toranja O64460 | Inibidor de poligalacturonase
MA Toranja Q06652 | Provável hidroperóxido de fosfolipídeos gluta- (+1) tiona peroxidase Toranja DOEFM?2 | Fator de iniciação da tradução eucariótico 1 eae Cm Toranja AIECK5 | Proteína de dedos de zinco responsivos a A ar A
Toranja J9UF5O | Proteína replicase 1a
MA Toranja G91823 Proteína 1 do motivo de reconhecimento de A a Pa Toranja Q9SLV8 | Sacarose sintase
A Toranja DOELH6 | Tiorredoxina contendo domínio de tetratrico- SN a a Toranja C6Kl43 | Proteína da família 1 de UDP-glucosiltransfe- SA a Helianthuus annuus HanXR- | Hsp90 QChro3g 0080391 Helianthuus annuus HanXR- | Hsp90 QChr1i3g 0408351
Helianthuus annuus HanXR- | Hsp90 QChr1i3g 0408441 Helianthuus annuus HanXR- | Hsp90 QChri49g 0462551 Helianthuus annuus HanXR- | Hsp70 QChro2g 0044471 Helianthuus annuus HanXR- | Hsp70 QChro2g 0044481 Helianthuus annuus HanXR- | Hsp70 QChro5g 0132631 Helianthuus annuus HanXR- | Hsp70 QChro5g 0134631 Helianthuus annuus HanXR- | Hsp70 QChro5g 0134801 Helianthuus annuus HanXR- | glutationa S-transferase QChr10g 0299441 Helianthuus annuus HanXR- | glutationa S-transferase QChr1i6g 0516291 Helianthuus annuus HanXR- | lactato/malato desidrogenase QChro3g 0091431 Helianthuus annuus HanXR- | lactato/malato desidrogenase QChr1i3g 0421951 Helianthuus annuus HanXR- | lactato/malato desidrogenase 2
E RREO
Helianthuus annuus HanXR- | lactato/malato desidrogenase QChr1i2g 0373491
Helianthuus annuus HanXR- | superfamília de GTPase pequenas, tipo Rab QChro1g 0031071
Helianthuus annuus HanXR- | superfamília de GTPase pequenas, tipo Rab QChro1g 0031091
Helianthuus annuus HanXR- | superfamília de GTPase pequenas, tipo Rab QChro2g 0050791
Helianthuus annuus HanXR- | superfamília de GTPase pequenas, tipo Rab QChri1ig 0353711
Helianthuus annuus HanXR- | superfamília de GTPase pequenas, tipo Rab QChr1i3g 0402771
Helianthuus annuus HanXR- | isocitrato/isopropilmalato desidrogenase QChro7g 0190171
Helianthuus annuus HanXR- | isocitrato/isopropilmalato desidrogenase QChr1i6g 0532251
Helianthuus annuus HanXR- | fosfoenolpiruvato carboxilase QChro3g 0079131
Helianthuus annuus HanXR- | fosfoenolpiruvato carboxilase QChri5g 0495261
Helianthuus annuus HanXR- | fosfoenolpiruvato carboxilase QChr1i3g 0388931
Helianthuus annuus HanXR- | fosfoenolpiruvato carboxilase QChri49g 0442731 Helianthuus annuus HanXR- | UTP--glucose-1-fosfato uridililtransferase QChri5g 0482381 Helianthuus annuus HanXR- | UTP--glucose-1-fosfato uridililtransferase QChr1i6g 0532261 Helianthuus annuus HanXR- | tubulina QChro5g 0135591 Helianthuus annuus HanXR- | tubulina QChro6g 0178921 Helianthuus annuus HanXR- | tubulina QChro8g 0237071 Helianthuus annuus HanXR- | tubulina QChri1ig 0337991 Helianthuus annuus HanXR- | tubulina QChr1i3g 0407921 Helianthuus annuus HanXR- | tubulina QChro5g 0145191 Helianthuus annuus HanXR- | tubulina QChro7g 0187021 Helianthuus annuus HanXR- | tubulina QChro7g 0189811 Helianthuus annuus HanXR- | tubulina mt
ER Helianthuus annuus HanXR- | tubulina QChr10g 0288911
Helianthuus annuus HanXR- | tubulina QChri1ig 0322631
Helianthuus annuus HanXR- | tubulina QChr1i2g 0367231
Helianthuus annuus HanXR- | tubulina QChr1i3g 0386681
Helianthuus annuus HanXR- | tubulina QChr1i3g 0393261
Helianthuus annuus HanXR- | ubiquitina QChr1i2g 0371591
Helianthuus annuus HanXR- | ubiquitina QChr1i2g 0383641
Helianthuus annuus HanXR- | ubiquitina QChri7g 0569881
Helianthuus annuus HanXR- | fotossistema 1|l HCF136, fator de estabili- QChro06g | dade/montagem 0171511
Helianthuus annuus HanXR- | fotossistema 1|l HCF136, fator de estabili- QChri7g | dade/montagem 0544921
Helianthuus annuus HanXR- | subunidade de proteassomo tipo B QChr1i6g 0526461
Helianthuus annuus HanXR- | subunidade de proteassomo tipo B QChri7g 0565551
Helianthuus annuus HanXR- | subunidade de proteassomo tipo B QChro5g 0149801
Helianthuus annuus HanXR- | subunidade de proteassomo tipo B QChrog9g 0241421
Helianthuus annuus HanXR- | subunidade de proteassomo tipo B QChri1ig 0353161
Helianthuus annuus HanXR- | família I3 de inibidores de proteinase (Kunitz) QChr1i6g 0506311
Helianthuus annuus HanXR- | família I3 de inibidores de proteinase (Kunitz) QChr1i6g 0506331
Helianthuus annuus HanXR- | metalopeptidase (família M10) QChrog9g 0265401
Helianthuus annuus HanXR- | metalopeptidase (família M10) QChrog9g 0265411
Helianthuus annuus HanXR- | ATPase, tipo AAA QChro5g 0154561
Helianthuus annuus HanXR- | ATPase, tipo AAA QChro8g 0235061
Helianthuus annuus HanXR- | ATPase, tipo AAA QChrog9g 0273921
Helianthuus annuus HanXR- | ATPase, tipo AAA a
E RREO
Helianthuus annuus HanXR- | oxoácido desidrogenase aciltransferase QChro2g 0058711
Helianthuus annuus HanXR- | oxoácido desidrogenase aciltransferase QChro8g 0214191
Helianthuus annuus HanXR- | superfamília de GTPase pequenas, tipo SAR1 QChro8g 0208631
Helianthuus annuus HanXR- | superfamília de GTPase pequenas, tipo SAR1 QChri1ig 0331441
Helianthuus annuus HanXR- | superfamília de GTPase pequenas, tipo SAR1 QChr1i2g 0371571
Helianthuus annuus HanXR- | superfamília de GTPase pequenas, tipo SAR1 QChr1i2g 0383571
Helianthuus annuus HanXR- | superfamília de GTPase pequenas, tipo SAR1 QChri49g 0446771
Helianthuus annuus HanXR- | superfamília de GTPase pequenas, tipo SAR1 QChri7g 0539461
Helianthuus annuus HanXR- | superfamília de GTPase pequenas, tipo SAR1 QChri7g 0548271
Helianthuus annuus HanXR- | superfamília de GTPase pequenas, tipo SAR1 QChri7g 0569871
Helianthuus annuus HanXR- | ATPase, complexo V1, subunidade À QChr10g 0311201
Helianthuus annuus HanXR- | ATPase, complexo V1, subunidade À QChr1i2g 0359711
Helianthuus annuus HanXR- | frutose-1,6-bisfosfatase QChro49g 0124671
Helianthuus annuus HanXR- | frutose-1,6-bisfosfatase QChro6g 0176631
Helianthuus annuus HanXR- | fotossistema Il PsbD/D2, centro de reação QCPgo5 79861
Helianthuus annuus HanXR- | fotossistema Il PsbD/D2, centro de reação QChrooc 0439g05 74731
Helianthuus annuus HanXR- | fotossistema Il PsbD/D2, centro de reação QChro49g 0099321
Helianthuus annuus HanXR- | fotossistema Il PsbD/D2, centro de reação QChro8g 0210231
Helianthuus annuus HanXR- | fotossistema Il PsbD/D2, centro de reação QChri1ig 0326671
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E RE Helianthuus annuus HanXR- | citocromo f QChro1g 0020341 Helianthuus annuus HanXR- | citocromo f QChr10g 0283571 Helianthuus annuus HanXR- | citocromo f QChr10g 0284261 Helianthuus annuus HanXR- | citocromo f QChr10g 0289281 Helianthuus annuus HanXR- | citocromo f QChr10g 0318181 Helianthuus annuus HanXR- | citocromo f QChri1ig 0326841 Helianthuus annuus HanXR- | citocromo f QChri5g 0497521 Helianthuus annuus HanXR- | proteína ribossômica QChro6g 0163851 Helianthuus annuus HanXR- | proteína ribossômica QChrog9g 0252071 Helianthuus annuus HanXR- | proteína ribossômica QChr1i2g 0374041 Helianthuus annuus HanXR- | proteína ribossômica QChro49g 0128141
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E ERR
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E E RREO
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Helianthuus annuus HanXR- | Protease Asp (Família de peptidases A1) QChrog9g 0247561 Helianthuus annuus HanXR- | Enzima da ponte de berberina (S)-reticu- QChr13g | lina:oxigênio oxidorredutase 0409681 Helianthuus annuus HanXR- | beta-hidroxiacil-(proteína transportadora de QChr1i0g | acila) desidratase 0295971 Helianthuus annuus HanXR- | família de carboidratos esterases 13 - CE1I3 QChr13g | (pectina acilesterase - PAE) 0412571 Helianthuus annuus HanXR- | família de carboidratos esterases 8 - CE8 QChr1i2g | (pectina metilesterase - PME) 0360101 Helianthuus annuus HanXR- | anidrase carbônica QChro1g 0019231 Helianthuus annuus HanXR- | ligação de retinaldeído celular/transporte de QChro2g | alfa-tocoferol 0036611 Helianthuus annuus HanXR- | chaperonina Cpn60 QChr10g 0313581 Helianthuus annuus HanXR- | clatrina QChrog9g 0251791 Helianthuus annuus HanXR- | proteína de ligação a clorofila A-B QChri1ig 0329811 Helianthuus annuus HanXR- | -metionina sintase independente de cobala- QChr1i3g | mina (vitamina B12) 0398861 Helianthuus annuus HanXR- | ciclofilina mt
E RREO
Helianthuus annuus HanXR- | Protease Cys (família das papaínas) QChro49g 0103281
Helianthuus annuus HanXR- | citocromo P450 QChrog9g 0268361
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Helianthuus annuus HanXR- | proteína expressa (domínios LRR) QChr10g 0291371
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Helianthuus annuus HanXR- | ferritina QChro8g 0221961
Helianthuus annuus HanXR- | desidrogenase dependente de FMN QChrog9g 0257521
Helianthuus annuus HanXR- | frutose-bisfosfato aldolase QChri49g 0441641
Helianthuus annuus HanXR- | germina
2
E RREO
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Helianthuus annuus HanXR- | glutamato sintase QChro3g 0061571
Helianthuus annuus HanXR- | gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase QChro5g 0144801
Helianthuus annuus HanXR- | diéster de glicerofosforila fosfodiesterase QChri7g 0550211
Helianthuus annuus HanXR- | família de glicosídeos hidrolases 16 - GH16 QChro6g | (endoxiloglucana transferase) 0175391
Helianthuus annuus HanXR- | família de glicosídeos hidrolases 17 - GH17 QChr1i1g | (beta-1,3-glucosidase) 0351571
Helianthuus annuus HanXR- | família de glicosídeos hidrolases 18 - GH18 QChro5g 0141461
Helianthuus annuus HanXR- | família de glicosídeos hidrolases 19 - GH19 QChrog9g 0276721
Helianthuus annuus HanXR- | família de glicosídeos hidrolases 2 - GH2 QChro2g 0046191
Helianthuus annuus HanXR- | família de glicosídeos hidrolases 20 - GH20 QChr1i6g | (N-acetil-beta-glucosaminidase) 0524981
Helianthuus annuus HanXR- | família de glicosídeos hidrolases 27 - GH27 QChr1i1g | (alfa-galactosidase/melibiase) 0322851
Helianthuus annuus HanXR- | família de glicosídeos hidrolases 3 - GH3 QChr10g 0293191
Helianthuus annuus HanXR- | família de glicosídeos hidrolases 31 - GH31 QChri6g | (alfa-xilosidase) 0511881
Helianthuus annuus HanXR- | família de glicosídeos hidrolases 32 - GH32 QChr14g | (invertase vacuolar) 0461441
Helianthuus annuus HanXR- | família de glicosídeos hidrolases 35 - GH35 QChr1i3g | (beta-galactosidase) 0423671
Helianthuus annuus HanXR- | família de glicosídeos hidrolases 35 - GH35 QChr10g | (beta-galactosidase) 0319301
Helianthuus annuus HanXR- | família de glicosídeos hidrolases 38 - GH38 QChro9g | (alfa-manosidase) 0256531
Helianthuus annuus HanXR- | família de glicosídeos hidrolases 5 - GH5 (glu- QChr1i1g | cana-1,3-beta glucosidase) 0320901
Helianthuus annuus HanXR- | família de glicosídeos hidrolases 51 - GH51 QChro05g | (alfa-arabinofuranosidase) 0130491
Helianthuus annuus HanXR- | família de glicosídeos hidrolases 79 - GH79 QChr10g | (endo-beta-glucuronidase/heparanase) 0314191
Helianthuus annuus HanXR- | homóloga com PMRS5 (Resistente ao Oídio) QChr13g | de A. thaliana (acilação de carboidratos) 0397411
Helianthuus annuus HanXR- | família de inibidores |3 (família Kunitz-P) QChri49g 0444681
Helianthuus annuus HanXR- | lactato/malato desidrogenase
2 o OB |
Helianthuus annuus HanXR- | lectina (D-manose) QChri7g 0564111
Helianthuus annuus HanXR- | lectina (domínio PAN-2) QChri7g 0558861
Helianthuus annuus HanXR- | lipase acil-hidrolase (família GDSL) QChro2g 0039251
Helianthuus annuus HanXR- | proteína de transferência de lipídeos/inibidor QChro01g | de tripsina-alfa amilase 0000161
Helianthuus annuus HanXR- | lectina de ligação à manose QChro2g 0047121
Helianthuus annuus HanXR- | proteína transportadora mitocondrial QChr10g 0303361
Helianthuus annuus HanXR- | multicobre oxidase QChri5g 0489551
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Helianthuus annuus HanXR- | nucleosídeo difosfato cinase QChro1g 0017621
Helianthuus annuus HanXR- | peroxidase QChr10g 0295991
Helianthuus annuus HanXR- | peroxirredoxina QChr1i3g 0398251
Helianthuus annuus HanXR- | proteína 1 induzida por fosfato (phi) QChri1ig 0333171 Helianthuus annuus HanXR- | fosfodiesterase/nucleotídeo pirofosfatase/fos- QChro3g | fato transferase 0060421 Helianthuus annuus HanXR- | fosfofrutocinase QChro3g 0078011 Helianthuus annuus HanXR- | fosfoglicerato cinase QChr1i3g 0408831 Helianthuus annuus HanXR- | fosfoglicerato mutase QChr10g 0286701 Helianthuus annuus HanXR- | fotossistema Il PsbP, complexo de evolução QChro06g | de oxigênio 0171591 Helianthuus annuus HanXR- | proteína associada a lipídeos de plastídeo/do- QChr14g | mínio conservado de fibrilina 0434951 Helianthuus annuus HanXR- | plastocianina (proteína de ligação a cobre QChro5g | azul) 0146621 Helianthuus annuus HanXR- | polifenol oxidase QChri1ig 0330251 Helianthuus annuus HanXR- | subunidade de proteassomo tipo À QChro49g 0094541 Helianthuus annuus HanXR- | subunidade de proteassomo tipo B QChro3g 0081271 Helianthuus annuus HanXR- | fosfatase ácida roxa 2
E RREO
Helianthuus annuus HanXR- | transferase dependente de fosfato de piridoxal QChri5g 0485781
Helianthuus annuus HanXR- | proteína ribossômica QChri1ig 0336791
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Helianthuus annuus HanXR- |ribulose bifosfato carboxilase, subunidade QChr1i1g | grande 0326801
Helianthuus annuus HanXR- | subunidade pequena de ribulose-1,5-bisfos- QChr1i6g | fato carboxilase 0523951
Helianthuus annuus HanXR- | S-adenosil-L-homocisteína hidrolase QChro1g 0022151
Helianthuus annuus HanXR- | S-adenosilmetionina sintetase QChri49g 0454811
Helianthuus annuus HanXR- | Proteína extracelular tipo SCP (PR-1) QChro49g 0109991
Helianthuus annuus HanXR- | Ser carboxipeptidase (Família de peptidases QChro3g | S10) 0072241
Helianthuus annuus HanXR- | Ser protease (subtilisina) (Família de peptida- QChr1i2g | ses S8) 0377221
Helianthuus annuus HanXR- | superóxido dismutase QChro2g 0055581
Helianthuus annuus HanXR- | taumatina (PRS5) QChri5g 0493261
Helianthuus annuus HanXR- | transcetolase QChr1i6g 0532531
Helianthuus annuus HanXR- |fator de alongamento da tradução EFTu / QChro7g | EFIA 0197421
Helianthuus annuus HanXR- | proteína tumoral translacionalmente contro- QChro6g | lada 0173951

Claims (99)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição de controle de patógenos, caracterizada por compreender uma pluralidade de PMPs, em que cada uma da plurali- dade de PMPs compreende um agente de controle de patógenos hete- rólogo e em que a composição é formulada para entrega a um patógeno de animais agrícola ou veterinário ou um seu vetor.
2. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o agente de controle de patógenos heterólogo ser um agente antibacteriano, um agente antifúngico, um agente virucida, um agente antiviral, um agente inseticida, um agente nematicida, um agente antiparasitário ou um repelente de insetos.
3. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por o agente antibacteriano ser doxorru- bicina.
4. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por o agente antibacteriano ser um anti- biótico.
5. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por o antibiótico ser vancomicina.
6. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por o antibiótico ser uma penicilina, uma cefalosporina, uma monobactam, um carbapenem, um macrolídeo, um aminoglicosídeo, uma quinolona, uma sulfonamida, uma tetraciclina, um glicopeptídeo, uma lipoglicopeptídeo, uma oxazolidinina, uma rifami- cina, uma tuberactinomicina, cloranfenicol, metronidazol, tinidazol, nitro- furantoína, teicoplanina, telavancina, linezolida, ciclosserina 2, bacitra- cina, polimixina B, viomicina ou capreomicina.
7. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por o agente antifúngico ser uma alila-
mina, um imidazol, um triazol, um tiazol, um polieno ou uma equinocan- dina.
8. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por o agente inseticida ser um cloronico- tinil, um neonicotinoide, um carbamato, um organofosfato, um piretroide, uma oxadiazina, uma espinosina, um ciclodieno, um organocloro, um fiprol, uma mectina, uma diacil-hidrazina, uma benzoilureia, um organo- estanho, um pirrol, um dinitroterpenol, um METI, um ácido tetrônico, um ácido tetrâmico ou uma ftalamida.
9. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o agente de controle de patógenos heterólogo ser uma molécula pequena, um ácido nucleico ou um poli- peptídeo.
10. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por a molécula pequena ser um antibió- tico ou um metabolito secundário.
11. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por o ácido nucleico ser um RNA inibi- dor.
12. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o agente de controle de patógenos heterólogo estar encapsulado por cada um da pluralidade de PMPs.
13. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o agente de controle de patógenos heterólogo estar embebido na superfície de cada uma da pluralidade de PMPs.
14. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o agente de controle de patógenos heterólogo estar conjugado à superfície de cada uma da pluralidade de PMPs.
15. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por cada uma da pluralidade de PMPs compreender ainda um agente de controle de patógenos adicional.
16. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o patógeno ser uma bactéria, um fungo, um inseto parasitário, um nematódeo parasitário ou um protozo- ário parasitário.
17. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por a bactéria ser uma espécie de Pseudomonas, uma espécie de Escherichia, uma espécie de Strepto- coccus, uma espécie de Pneumococcus, uma espécie de Shigella, uma espécie de Salmonella ou uma espécie de Campylobacter.
18. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por a espécie de Pseudomonas ser Pseudomonas aeruginosa.
19. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por a espécie de Escherichia ser Es- cherichia coli.
20. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por o fungo ser uma espécie de Sac- charomyces ou uma espécie de Candida.
21. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por o inseto parasitário ser uma espé- cie de Cimex.
22. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por o nematódeo parasitário ser uma espécie de Heligmosomoides.
23. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por o protozoário parasitário ser uma espécie de Trichomonas.
24. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o vetor ser um inseto.
25. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada por o vetor ser um mosquito, um car- rapato, um ácaro ou um piolho.
26. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a composição ser estável durante pelo menos um dia à temperatura ambiente e/ou estável durante pelo menos uma semana a 4 ºC.
27. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por os PMPs serem estáveis durante pelo menos 24 horas, 48 horas, sete dias ou 30 dias a 4 ºC.
28. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada por os PMPs serem estáveis a uma temperatura de pelo menos 20 ºC, 24 ºC ou 37 ºC.
29. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a pluralidade de PMPs na composi- ção estar a uma concentração eficaz para diminuir a aptidão de um pa- tógeno de animais.
30. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a pluralidade de PMPs na composi- ção estar a uma concentração eficaz para diminuir a aptidão de um vetor de patógeno de animais.
31. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a pluralidade de PMPs na composi- ção estar a uma concentração eficaz para tratar uma infeção em um animal infectado com um patógeno.
32. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a pluralidade de PMPs na composi- ção estar a uma concentração eficaz para prevenir uma infeção em um animal em risco de uma infeção com um patógeno.
33. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a pluralidade de PMPs na composi- ção estar a uma concentração de 0,01 ng, 0,1 ng, 1 ng, 2 ng, 3 ng, 4 ng, ng, 10 ng, 50 ng, 100 ng, 250 ng, 500 ng, 750 ng, 1 ug, 10 ug, 50 ug, 100 ug ou 250 ug de proteína PMP/mL.
34. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a composição compreender um transportador agricolamente aceitável.
35. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a composição compreender um transportador farmaceuticamente aceitável.
36. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a composição ser formulada para estabilizar os PMPs.
37. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a composição ser formulada como um líquido, um sólido, um aerossol, uma pasta, um gel ou uma compo- sição de gás.
38. Composição de controle de patógenos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a composição compreender pelo menos 5% de PMPs.
39. Composição de controle de patógenos, caracterizada por compreender uma pluralidade de PMPs, em que os PMPs são iso- lados a partir de uma planta por um processo que compreende os pas- sos de: (a) proporcionar uma amostra inicial de uma planta, ou uma sua parte, em que a planta ou sua parte compreende EVs; (b) isolar uma fração de PMP em bruto da amostra inicial,
em que a fração de PMP em bruto tem um nível diminuído de pelo me- nos um contaminante ou componente indesejado da planta ou sua parte em relação ao nível na amostra inicial; (c) purificar a fração de PMP em bruto, produzindo deste modo uma pluralidade de PMPs puros, em que a pluralidade de PMPs puros tem um nível diminuído de pelo menos um contaminante ou com- ponente indesejado da planta ou sua parte em relação ao nível na fração de EV em bruto; (d) carregar a pluralidade de PMPs do passo (c) com um agente de controle de patógenos; e (e) formular os PMPs do passo (d) para entrega a um pató- geno de animais agrícola ou veterinário ou um seu vetor.
40. Patógeno de animais, caracterizado por compreender a composição de controle de patógenos, como definida na reivindicação
1.
41. Vetor de patógeno de animais, caracterizado por com- preender a composição de controle de patógenos, como definida na rei- vindicação 1.
42. Método de entregar uma composição de controle de pa- tógenos a um animal, caracterizado por compreender administrar ao animal a composição, como definida na reivindicação 1.
43. Método de tratar uma infeção em um animal com sua necessidade, caracterizado por o método compreender administrar ao animal uma quantidade eficaz da composição, como definida na reivin- dicação 1.
44. Método de prevenir uma infeção em um animal em seu risco, caracterizado por o método compreender administrar ao animal uma quantidade eficaz da composição, como definida na reivindicação 1, em que o método diminui a probabilidade da infeção no animal em relação a um animal não tratado.
45. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracteri- zado por a infeção ser causada por um patógeno, e o patógeno ser uma bactéria, um fungo, um vírus, um inseto parasitário, um nematódeo pa- rasitário ou um protozoário parasitário.
46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracteri- zado por a bactéria ser uma espécie de Pseudomonas, uma espécie de Escherichia, uma espécie de Streptococcus, uma espécie de Pneumo- coccus, uma espécie de Shigella, uma espécie de Salmonella ou uma espécie de Campylobacter.
47. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracteri- zado por o fungo ser uma espécie de Saccharomyces ou uma espécie de Candida.
48. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracteri- zado por o inseto parasitário ser uma espécie de Cimex.
49. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado por o nematódeo parasitário ser uma espécie de Heligmosomoides.
50. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracteri- zado por o protozoário parasitário ser uma espécie de Trichomonas.
51. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracteri- zado por a composição de controle de patógenos ser administrada ao animal oralmente, intravenosamente ou subcutaneamente.
52. Método de entregar uma composição de controle de pa- tógenos a um patógeno, caracterizado por compreender contatar o pa- tógeno com a composição, como definida na reivindicação 1.
53. Método de diminuir a aptidão de um patógeno, caracte- rizado por o método compreender entregar ao patógeno a composição, como definida na reivindicação 1, em que o método diminui a aptidão do patógeno em relação a um patógeno não tratado.
54. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracteri- zado por o método compreender entregar a composição a pelo menos um habitat onde o patógeno cresce, vive, se reproduz, se alimenta ou infesta.
55. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracteri- zado por a composição ser entregue como uma composição comestível pelo patógeno para ingestão pelo patógeno.
56. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracteri- zado por o patógeno ser uma bactéria, um fungo, um inseto parasitário, um nematódeo parasitário ou um protozoário parasitário.
57. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracteri- zado por a bactéria ser uma espécie de Pseudomonas, uma espécie de Escherichia, uma espécie de Streptococcus, uma espécie de Pneumo- coccus, uma espécie de Shigella, uma espécie de Salmonella ou uma espécie de Campylobacter.
58. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracteri- zado por o fungo ser uma espécie de Saccharomyces ou uma espécie de Candida.
59. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracteri- zado por o inseto parasitário ser uma espécie de Cimex.
60. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado por o nematódeo parasitário ser uma espécie de Heligmosomoides.
61. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracteri- zado por o protozoário parasitário ser uma espécie de Trichomonas.
62. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracteri- zado por a composição ser entregue como um líquido, um sólido, um aerossol, uma pasta, um gel ou um gás.
63. Método de diminuir a aptidão de um vetor de patógeno de animais, caracterizado por o método compreender entregar ao vetor uma quantidade eficaz da composição, como definida na reivindicação 1, em que o método diminui a aptidão do vetor em relação a um vetor não tratado.
64. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado por o método compreender entregar a composição a pelo menos um ha- bitat onde o vetor cresce, vive, se reproduz, se alimenta ou infesta.
65. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracteri- zado por a composição ser entregue como uma composição comestível para ingestão pelo vetor.
66. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracteri- zado por o vetor ser um inseto.
67. Método, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado por o inseto ser um mosquito, um carrapato, um ácaro ou um piolho.
68. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracteri- zado por a composição ser entregue como um líquido, um sólido, um aerossol, uma pasta, um gel ou um gás.
69. Método de tratar um animal tendo uma infeção fúngica, caracterizado por o método compreender administrar ao animal uma quantidade eficaz de uma composição de controle de patógenos com- preendendo uma pluralidade de PMPs.
70. Método de tratar um animal tendo uma infeção fúngica, caracterizado por o método compreender administrar ao animal uma quantidade eficaz de uma composição de controle de patógenos com- preendendo uma pluralidade de PMPs, e em que a pluralidade de PMPs compreende um agente antifúngico.
71. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracteri- zado por o agente antifúngico ser um ácido nucleico que inibe a expres- são de um gene em um fungo que causa a infeção fúngica.
72. Método, de acordo com a reivindicação 71, caracteri- zado por o gene ser Proteína de Crescimento Filamentoso Intensificado (EFG1).
73. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracteri- zado por a infeção fúngica ser causada por Candida albicans.
74. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracteri- zado por a composição compreender um PMP derivado de Arabidopsis.
75. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado por o método diminuir ou eliminar substancialmente a infeção fúngica.
76. Método de tratar um animal tendo uma infeção bacteri- ana, caracterizado por o método compreender administrar ao animal uma quantidade eficaz de uma composição de controle de patógenos compreendendo uma pluralidade de PMPs.
77. Método de tratar um animal tendo uma infeção bacteri- ana, caracterizado por o método compreender administrar ao animal uma quantidade eficaz de uma composição de controle de patógenos compreendendo uma pluralidade de PMPs, e em que a pluralidade de PMPs compreende um agente antibacteriano.
78. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracteri- zado por o agente antibacteriano ser Anfotericina B.
79. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracteri- zado por a bactéria ser uma espécie de Pseudomonas, uma espécie de Escherichia, uma espécie de Streptococcus, uma espécie de Pneumo- coccus, uma espécie de Shigella, uma espécie de Salmonella ou uma espécie de Campylobacter.
80. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracteri- zado por a composição compreender um PMP derivado de Arabidopsis.
81. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracteri- zado por o método diminuir ou eliminar substancialmente a infeção bac- teriana.
82. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracteri- zado por o animal ser um animal veterinário ou um animal de criação.
83. Método de diminuir a aptidão de um inseto parasitário, caracterizado por o método compreender entregar ao inseto parasitário uma composição de controle de patógenos compreendendo uma plura- lidade de PMPs.
84. Método de diminuir a aptidão de um inseto parasitário, caracterizado por o método compreender entregar ao inseto parasitário uma composição de controle de patógenos compreendendo uma plura- lidade de PMPs, e em que a pluralidade de PMPs compreende um agente inseticida.
85. Método, de acordo com a reivindicação 84, caracteri- zado por o agente inseticida ser um ácido nucleico de peptídeo.
86. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracteri- zado por o inseto parasitário ser um percevejo.
87. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracteri- zado por o método diminuir a aptidão do inseto parasitário em relação a um inseto parasitário não tratado.
88. Método de diminuir a aptidão de um nematódeo parasi- tário, caracterizado por o método compreender entregar ao nematódeo parasitário uma composição de controle de patógenos compreendendo uma pluralidade de PMPs.
89. Método de diminuir a aptidão de um nematódeo parasi- tário, caracterizado por o método compreender entregar ao nematódeo parasitário uma composição de controle de patógenos compreendendo uma pluralidade de PMPs, e em que a pluralidade de PMPs compreende um agente nematicida.
90. Método, de acordo com a reivindicação 88, caracteri- zado por o nematódeo parasitário ser Heligmosomoides polygyrus.
91. Método, de acordo com a reivindicação 88, caracteri- zado por o método diminuir a aptidão do nematódeo parasitário em re- lação a um nematódeo parasitário não tratado.
92. Método de diminuir a aptidão de um protozoário parasi- tário, caracterizado por o método compreender entregar ao protozoário parasitário uma composição de controle de patógenos compreendendo uma pluralidade de PMPs.
93. Método de diminuir a aptidão de um protozoário parasi- tário, caracterizado por o método compreender entregar ao protozoário parasitário uma composição de controle de patógenos compreendendo uma pluralidade de PMPs, e em que a pluralidade de PMPs compreende um agente antiparasitário.
94. Método, de acordo com a reivindicação 92, caracteri- zado por o protozoário parasitário ser T. vaginalis.
95. Método, de acordo com a reivindicação 92, caracteri- zado por o método diminuir a aptidão do protozoário parasitário em re- lação a um protozoário parasitário não tratado.
96. Método de diminuir a aptidão de um vetor de insetos de um patógeno de animais, caracterizado por o método compreender en- tregar ao vetor uma composição de controle de patógenos compreen- dendo uma pluralidade de PMPs.
97. Método de diminuir a aptidão de um vetor de insetos de um patógeno de animais, caracterizado por o método compreender en- tregar ao vetor uma composição de controle de patógenos compreen- dendo uma pluralidade de PMPs, e em que a pluralidade de PMPs com- preende um agente inseticida.
98. Método, de acordo com a reivindicação 96, caracteri- zado por o método diminuir a aptidão do vetor em relação a um vetor não tratado.
99. Método, de acordo com a reivindicação 96, caracteri- zado por o inseto ser um mosquito, carrapato, ácaro ou piolho.
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