BR112020022589A2 - polipeptídeos imunorreativos - Google Patents

Abstract

''POLIPEPTÍDEOS IMUNORREATIVOS''. A presente invenção refere-se a métodos e composições para diagnosticar e vacinar contra Ehrlichia chaffeensis.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLI- PEPTÍDEOS IMUNORREATIVOS".

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO

[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Pro- visória U.S. No. 62/667.925, depositado em 7 de maio de 2018, cuja totalidade é aqui incorporada por referência.

1. Campo da Invenção

[0002] A presente invenção refere-se genericamente ao campo da biologia molecular e da medicina. Mais particularmente, refere-se a mé- todos de diagnóstico e composições de vacina para Ehrlichia.

2. Descrição da arte relacionada

[0003] A erliquiose monocitotrópica humana (HME) é uma doença emergente NIAID do grupo 1, e o agente etiológico, E. chaffeensis, é classificado como um patógeno de prioridade de Categoria C. HME é uma doença febril não diferenciada com risco de vida, o diagnóstico clí- nico é difícil e o diagnóstico definitivo é mais frequentemente retrospec- tivo (Walker e Dumler, 1997; Walker e outros, 2004; Dumler e outros, 2007). Embora bem mais de 8.000 casos tenham sido relatados aos Centros de Controle de Doenças em 2012, esse número provavelmente subestima o número real de casos em 100 vezes (Olano e outros, 2003). A doença frequentemente não é diagnosticada devido aos sintomas não específicos associados ao início, mas resulta na hospitalização do paci- ente em 43 a 62% dos casos (Fishbein e outros, 1994). A progressão da doença pode resultar em um desfecho fatal e frequentemente en- volve falência multissistêmica, com síndrome do desconforto respirató- rio agudo (ARDS) e meningoencefalite sendo comuns em muitos casos fatais (Fishbein e outros, 1994; Paparone e outros, 1995). A ameaça à saúde pública está aumentando com o surgimento de novos agentes erliquiais, mas as vacinas para a erliquiose humana não estão ainda disponíveis, e as opções terapêuticas são limitadas. Novas informações e ferramentas de previsão de bioinformática que foram desenvolvidas recentemente tornam viável uma identificação de todo o genoma de candidatos a imunodiagnóstico / vacina protetores (He e outros, 2010; Magnan e outros, 2010).

[0004] As perspectivas para o desenvolvimento de vacinas de su- bunidades eficazes e imunodiagnósticos para Ehrlichia foram limitadas devido a muitos fatores, não menos dos quais é o pequeno repertório de proteínas imunorreativas / protetoras que foram definidas molecular- mente (McBride e Walker, 2010). As lacunas de conhecimento neces- sário para resolver este problema para Ehrlichia chaffeensis foram re- duzidas pelo progresso recente na compreensão dos mecanismos imu- nológicos protetores / patológicos (Feng e Walker 2004; Nandi e outros, 2007; Winslow e outros, 2000), caracterização imunomolecular de al- guns antígenos de vacina / diagnóstico (Kuriakose e outros, 2012; Li e outros, 2002), perfis de genoma, transcriptoma e proteoma (Kuriakose e outros, 2011; Lin e outros, 2011), novos modelos animais (Winslow e outros, 1998; Sotomay e outros, 2001), e outros avanços tecnológicos. Estudos utilizando abordagens de baixo rendimento para definir compo- nentes antigênicos de E. chaffeensis produziram um pequeno grupo de antígenos protetores que incluem uma proteína principal da membrana externa (OMP), e uma família de efetores de proteína repetida em tan- dem (TRP) secretados com os principais epítopos de anticorpos linea- res protetores (Kuriakose e outros, 2012; Li e outros, 2001). No entanto, esses antígenos provavelmente representam um repertório significativo, mas incompleto de proteínas imunorreativas / protetoras. Além disso, está bem estabelecido que a imunidade mediada por anticorpos é ne- cessária para a proteção contra a infecção por E. chaffeensis (Winslow e outros, 2000; Li e outros, 2002; Kuriakose e outros, 2012; Li e outros, 2001; Racine e outros, 2011; Yager e outros, 2005), e os anticorpos são a base das vacinas mais eficazes para humanos. A eliminação de E.

chaffeensis ocorre, pelo menos em parte, durante o estágio extracelular da infecção (Li e Winslow 2003); entretanto, os mecanismos imunes in- tracelulares também podem ser importantes, e definir as características dos antígenos / anticorpos que são protetores em ambos os ambientes é fundamental para o desenvolvimento de vacinas eficazes.

[0005] Embora algumas proteínas imunorreativas de E. chaffeensis tenham sido identificadas, atualmente não está claro qual, se houver, das muitas proteínas de E. chaffeensis não testadas produzidas pelo genoma de E. chaffeensis podem exibir imunorreatividade ou ser impor- tantes para respostas imunes contra E. chaffeensis. Cerca de 45% das ORFs do genoma de E. chaffeensis codificam proteínas < 20 kDa (Ku- riakose e outros, 2011; Dunning Hotopp e outros, 2006), e muitas des- sas proteínas de pequena massa molecular não foram estudadas. Cla- ramente, há uma necessidade de métodos novos e aprimorados para diagnosticar e vacinar contra E. chaffeensis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] A presente invenção, em alguns aspectos, supera as limita- ções da técnica anterior, fornecendo métodos novos e aprimorados para o diagnóstico e vacinação contra Ehrlichia chaffeensis ou Ehrlichia ca- nis.

[0007] Como mostrado nos exemplos abaixo, proteínas de E. chaf- feensis altamente imunorreativas foram identificadas, e a importância in vivo dessas proteínas imunorreativas foi verificada usando testes ELISA em soros positivos para erliquiose monocitotrópica humana (HME) obti- dos de pacientes. O teste ELISA usando soros HME-positivos obtidos a partir de pacientes revelou que as seguintes proteínas desencadearam respostas significativas, indicando que as proteínas a seguir podem ser usadas, por exemplo, em métodos de diagnóstico para detectar infec- ção por E. chaffeensis ou podem ser usadas para induzir uma resposta imune em um sujeito contra E. chaffeensis:

Tabela 1: Proteínas Imunorreativas A4 (Ech 0261; SEQ ID NO: 1), A5 (Ech 0255; SEQ ID NO: 2), A9 (Ech 0722; SEQ ID NO: 3), A14 (Ech 0535; SEQ ID NO: 4), A15 (Ech 0251; SEQ ID NO: 5), A19 (Ech 0745; SEQ ID NO: 6), A21 (Ech 0825; SEQ ID NO: 7), A23 (Ech 0166; SEQ ID NO: 8), A34 (Ech 0252; SEQ ID NO: 9), A38 (Ech 0763; SEQ ID NO: 10), A42 (Ech 0240; SEQ ID NO: 11), A47 (Ech 0345; SEQ ID NO: 12), AB5O0 (Ech 0700; SEQ ID NO: 28) A51 (Ech 0607; SEQ ID NO: 13), AB54 (Ech 0614; SEQ ID NO: 14), A55 (Ech 1103; SEQ ID NO: 15), AB56 (Ech 0846; SEQ ID NO: 16), A62 (Ech 0578; SEQ ID NO: 17), A63 (Ech 0716; SEQ ID NO: 18), AG64 IN (Ech 0778; SEQ ID NO: 19), AG66 (Ech 0398; SEQ ID NO: 20), A7T5 (Ech 0388; SEQ ID NO: 21), A77 (Ech 1053; SEQ ID NO: 22).

[0008] Conforme mostrado nos exemplos abaixo, todos os polipep- tídeos listados na Tabela 1 demonstraram reatividade com os soros usa- dos para triagem. Conforme mostrado nos resultados abaixo, as proteí- nas listadas na Tabela 1 exibiram uma densidade óptica (OD) de pelo menos 0,3 ou mais. Em algumas modalidades, a proteína é uma prote- ína da Tabela 2:

Tabela 2: Proteínas de Imunorreatividade Média A14 (Ech 0535; SEQ ID NO: 5), A19 (Ech 0745; SEQ ID NO: 6), A38 (Ech 0763; SEQ ID NO: 10), A42 (Ech 0240; SEQ ID NO: 11), A47 (Ech 0345; SEQ ID NO: 12), A55 (Ech 1103; SEQ ID NO: 15), A62 (Ech 0578; SEQ ID NO: 17).

[0009] Como mostrado nos exemplos abaixo, as proteínas na Ta- bela 2 mostraram 100% de reatividade para todos os soros testados e mostraram valores de OD ELISA entre 0,2 a 0,5. Ainda mais preferenci- almente, a proteína imunorreativa é uma proteína como mostrado na Tabela 3: Tabela 3: Proteínas Altamente Imunorreativas A4 (Ech 0261; SEQ ID NO: 1), A5 (Ech 0255; SEQ ID NO: 2), A51 (Ech 0607; SEQ ID NO: 13), AB56 (Ech 0846; SEQ ID NO: 16), A63 (Ech 0716; SEQ ID NO: 18), A77 (Ech 1053; SEQ ID NO: 22).

[0010] Conforme mostrado nos exemplos abaixo, as proteínas na Tabela 3 exibiram 100% de reatividade para todos os soros testados e tinham uma densidade óptica de > 0,5 com pelo menos 4 soros. Em algumas modalidades, é antecipado que uma proteína tendo pelo me- nos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95%, 97,5% ou pelo me- nos 99% de identidade de sequência com uma proteína na Tabela 1 ou Tabela 2, ou mais preferencialmente da Tabela 3, que retém pelo menos parte de sua imunorreatividade pode ser usada em várias modalidades, conforme descrito neste documento (por exemplo, em um teste de diag-

nóstico, ou para induzir uma resposta imune contra Ehrlichia em um su- jeito, para inclusão em uma composição de vacina). Em algumas moda- lidades, a proteína pode ser usada para gerar um anticorpo que se liga seletivamente à proteína, e o anticorpo pode ser usado, por exemplo, em um ensaio de diagnóstico; por exemplo, em algumas modalidades, o anticorpo é marcado ou ligado a um substrato sólido (por exemplo, em um teste de fluxo lateral). Em algumas modalidades, a proteína é A77 (SEQ ID NO: 22), A62 (SEQ ID NO: 17), A56 (SEQ ID NO: 16), A19 (SEQ ID NO: 6), A5O (Ech 0700; SEQ ID NO : 28), A51 (SEQ ID NO: 13), A14 (SEQ ID NO: 4), A63 (SEQ ID NO: 18), A34 (SEQ ID NO: 9), A9 (SEQ ID NO: 3), ou A42 (Ech 0240; SEQ ID NO: 11).

[0011] Um aspecto da presente invenção refere-se ao método de detecção de anticorpos que se ligam especificamente a um organismo Ehrlichia em uma amostra de teste, compreendendo: (a) colocar em contato um polipeptídeo isolado da Tabela 1, Tabela 2 ou Tabela 3 ou um polipeptídeo tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com o mesmo, com a amostra de teste, sob condições que permitam a for- mação de complexos de peptídeo-anticorpo; (b) detectar os complexos de peptídeo-anticorpo; em que a detecção dos complexos de peptídeo- anticorpo é uma indicação de que anticorpos específicos para um orga- nismo Ehrlichia estão presentes na amostra de teste, e em que a au- sência dos complexos de peptídeo-anticorpo é uma indicação de que anticorpos específicos para um organismo Ehrlichia não estão presen- tes no amostra de teste. Em algumas modalidades, o polipeptídeo iso- lado pode compreender ou consistir em um peptídeo isolado da Tabela 1, Tabela 2 ou Tabela 3. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste de um polipeptídeo da Tabela 2 ou Tabela 3. Em algumas modalidades, o polipeptídeo isolado com- preende, consiste de, ou é A77 (SEQ ID NO: 22), A62 (SEQ ID NO: 17), A56 (SEQ ID NO: 16), A19 (SEQ ID NO: 6), A50O (Ech 0700; SEQ ID

NO: 28), A51 (SEQ ID NO: 13), A14 (SEQ ID NO: 4), A63 (SEQ ID NO: 18), A34 (SEQ ID NO: 9), A9 (SEQ ID NO: 3), ou A42 (Ech 0240; SEQ ID NO: 11). Em algumas modalidades, o organismo Ehrlichia é um or- ganismo Ehrlichia chaffeensis. A etapa de detecção pode compreender realizar um imunoensaio ligado à enzima, um radioimunoensaio, uma imunoprecipitação, um imunoensaio de fluorescência, um ensaio quimi- luminescente, um ensaio de imunoblot, um ensaio de fluxo lateral, um ensaio de citometria de fluxo, um imunoensaio multiplex (por exemplo, um Ensaio de arranjo de suspensão Bio-PlexO), um ensaio de espec- trometria de massas, ou um ensaio baseado em partículas. Em algumas modalidades, a etapa de detecção compreende um ensaio de fluxo la- teral ou um imunoensaio ligado à enzima, em que o imunoensaio ligado à enzima é um ELISA.

[0012] Outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para identificar uma infecção por Ehrlichia em um sujeito mamífero, compreendendo: (a) colocar em contato de uma amostra biológica do sujeito com um polipeptídeo isolado da Tabela 1, Tabela 2 ou Tabela 3 sob condições que permitem a formação de complexos de peptídeo- anticorpo; e (b) detectar os complexos de peptídeo-anticorpo; em que a detecção dos complexos de peptídeo-anticorpo é uma indicação de que o sujeito tem uma infecção por Ehrlichia. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é selecionado a partir da Tabela 2 ou Tabela 3. Em algu- mas modalidades, o polipeptídeo isolado pode compreender ou consistir de um peptídeo isolado da Tabela 1, Tabela 2 ou Tabela 3. Em algumas modalidades, o polipeptídeo isolado é A77 (SEQ ID NO: 22), A62 (SEQ ID NO: 17), A5S6 (SEQ ID NO: 16), A19 (SEQ ID NO: 6), A50 (Ech 0700; SEQ ID NO: 28), A51 (SEQ ID NO: 13), A14 (SEQ ID NO: 4), A63 (SEQ ID NO: 18), A34 (SEQ ID NO: 9), A9 (SEQ ID NO: 3) ou A42 (Ech 0240; SEQ ID NO: 11). A etapa de detecção pode compreender realizar um imunoensaio ligado à enzima, um radioimunoensaio, uma imunoprecipi- tação, um imunoensaio de fluorescência, um ensaio quimiluminescente, um ensaio de imunoblot, um ensaio de fluxo lateral, um ensaio de cito- metria de fluxo, um imunoensaio multiplex (por exemplo, um Ensaio de arranjo de suspensão Bio-Plex6), um teste de fita, ou um ensaio base- ado em partículas. Em algumas modalidades, o sujeito é um humano. Em algumas modalidades, o sujeito é um cão.

[0013] Ainda outro aspecto da presente invenção refere-se a um po- lipeptídeo isolado compreendendo uma sequência da Tabela 1, Tabela 2 ou Tabela 3, em que o peptídeo isolado é imobilizado em uma super- fície de um substrato de suporte. Em algumas modalidades, o polipep- tídeo é selecionado a partir do grupo que consiste da Tabela 2. Em al- gumas modalidades, o polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste da Tabela 3. Em algumas modalidades, o polipeptídeo isolado pode compreender ou consistir de um peptídeo isolado da Tabela 1, Ta- bela 2 ou Tabela 3. Em algumas modalidades, o polipeptídeo isolado é A77 (SEQ ID NO: 22), A62 (SEQ ID NO: 17), A56 (SEQ ID NO: 16), A19 (SEQ ID NO: 6), A50 (Ech 0700; SEQ ID NO: 28), A51 (SEQ ID NO: 13), A14 (SEQ ID NO: 4), A63 (SEQ ID NO: 18), A34 (SEQ ID NO: 9), A9 (SEQ ID NO: 3) ou A42 (Ech 0240; SEQ ID NO: 11). Em algumas modalidades, o substrato de suporte compreende látex, poliestireno, náilon, nitrocelulose, celulose, sílica, agarose ou resina magnética. Em algumas modalidades, o substrato de suporte é uma câmara de reação, um poço, uma membrana, um filtro, um papel, uma emulsão, um grâ- nulo, uma microesfera, uma fita, um cartão, uma lâmina de vidro, um aparelho de fluxo lateral, um microchip, um pente, uma partícula de sí- lica, uma partícula magnética, uma nanopartícula ou uma monocamada de automontagem. O peptídeo pode estar compreendido em um kit. Em algumas modalidades, o peptídeo é produzido por meio da síntese de peptídeos ou transcrição e tradução in vitro (IVTT). Em algumas moda- lidades, o peptídeo é produzido de forma recombinante.

[0014] Outro aspecto da presente invenção refere-se a um polipep- tídeo isolado compreendendo uma sequência da Tabela 1, Tabela 2 ou Tabela 3, em que o peptídeo isolado é covalentemente ligado a um mar- cador detectável. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é selecio- nado a partir do grupo que consiste da Tabela 2. Em algumas modali- dades, o polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste da Tabela 3. Em algumas modalidades, o polipeptídeo isolado pode com- preender ou consistir de um peptídeo isolado da Tabela 1, Tabela 2 ou Tabela 3. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende ou con- siste de A77 (SEQ ID NO: 22), A62 (SEQ ID NO: 17), A56 (SEQ ID NO: 16), A19 (SEQ ID NO : 6), A5SO (Ech 0700; SEQ ID NO: 28), A51 (SEQ ID NO: 13), A14 (SEQ ID NO: 4), A63 (SEQ ID NO: 18), A34 (SEQ ID NO: 9), A9 (SEQ ID NO: 3) ou A42 (Ech 0240; SEQ ID NO: 11). Em algumas modalidades, o marcador detectável é um marcador fluores- cente, um marcador radioativo, um marcador enzimático ou uma nano- partícula luminescente. Em algumas modalidades, a nanopartícula lumi- nescente é uma nanopartícula de terra rara luminescente, uma nano- partícula luminosa, ou uma nanopartícula de aluminato de estrôncio. O polipeptídeo pode estar incluído em um kit. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é produzido por meio da síntese de peptídeos ou trans- crição e tradução in vitro (IVTT). Em algumas modalidades, o polipeptí- deo é produzido de forma recombinante.

[0015] Ainda outro aspecto da presente invenção refere-se a um kit compreendendo: (a) o polipeptídeo isolado das presentes modalidades ou conforme descrito acima, (b) um anticorpo secundário anti-cão ou anti-humano ligado a uma molécula repórter; e, (c) um reagente apro- priado para a detecção da molécula repórter. Em algumas modalidades, o peptídeo é imobilizado em uma membrana ou placa de microtitulação.

Em algumas modalidades, a molécula repórter é selecionada a partir do grupo que consiste de luciferase, peroxidase de rábano, uma nanopar- tícula luminosa, P-galactosidase, e um marcador fluorescente. Em algu- mas modalidades, a nanopartícula luminosa é uma nanopartícula de aluminato de estrôncio. O kit pode ainda compreender um tampão de diluição para soro de cão ou humano. O kit pode compreender um imu- noensaio de fluxo lateral ou um ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral. Em algumas modalidades, o kit compreende um ensaio de imu- nossorção ligado à enzima (ELISA).

[0016] Outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para induzir uma resposta imune em um sujeito mamífero compreen- dendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de uma preparação farmacêutica compreendendo um polipeptídeo da Tabela 1, Tabela 2 ou Tabela 3. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é selecionado a par- tir do grupo que consiste da Tabela 2 e da Tabela 3. Em algumas mo- dalidades, o polipeptídeo isolado pode compreender ou consistir de um peptídeo isolado da Tabela 1, Tabela 2 ou Tabela 3. Em algumas mo- dalidades, o polipeptídeo compreende ou consiste de A77 (SEQ ID NO: 22), A62 (SEQ ID NO: 17), A56 (SEQ ID NO: 16), A19 (SEQ ID NO: 6), AB5O (Ech 0700; SEQ ID NO: 28), A51 (SEQ ID NO: 13), A14 (SEQ ID NO: 4), A63 (SEQ ID NO: 18), A34 (SEQ ID NO: 9), A9 (SEQ ID NO: 3) ou A42 (Ech 0240; SEQ ID NO: 11). O sujeito pode ser um humano. Em algumas modalidades, a preparação farmacêutica é administrada por via subcutânea, intramuscular, nasal, por inalação ou administração de aerossol, ou por via intradérmica.

[0017] Ainda outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para tratar uma infecção por Ehrlichia chaffeensis em um su- jeito, compreendendo: (a) colocar em contato uma amostra biológica do sujeito com um polipeptídeo isolado da Tabela 1, Tabela 2 ou Tabela 3 sob condições que permitem a formação de complexos de peptídeo-

anticorpo; (b) detectar os complexos de peptídeo-anticorpo; em que a detecção dos complexos de peptídeo-anticorpo é uma indicação de que o sujeito tem uma infecção por Ehrlichia chaffeensis; e (c) e administrar um composto terapêutico para tratar infecção por Ehrlichia no sujeito. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste da Tabela 2. Em algumas modalidades, o polipeptí- deo é selecionado a partir do grupo que consiste da Tabela 3. Em algu- mas modalidades, o polipeptídeo isolado pode compreender ou consistir de um peptídeo isolado da Tabela 1, Tabela 2 ou Tabela 3. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é A77 (SEQ ID NO: 22), A62 (SEQ ID NO: 17), A56 (SEQ ID NO: 16), A19 (SEQ ID NO: 6), A50 (Ech 0700; SEQ ID NO: 28), A51 (SEQ ID NO: 13), A14 (SEQ ID NO: 4), A63 (SEQ ID NO: 18), A34 (SEQ ID NO: 9), A9 (SEQ ID NO: 3), ou A42 (Ech 0240; SEQ ID NO: 11). A etapa de detecção pode compreender realizar um imunoensaio ligado à enzima, um radioimunoensaio, uma imunoprecipi- tação, um imunoensaio de fluorescência, um ensaio quimiluminescente, um ensaio de imunoblot, um ensaio de fluxo lateral, um ensaio de cito- metria de fluxo, um imunoensaio multiplex (por exemplo, um Ensaio de arranjo de suspensão Bio-Plex6), um teste de fita, ou um ensaio base- ado em partículas. Em algumas modalidades, o sujeito é um cão ou hu- mano. O composto terapêutico pode ser um antibiótico, tal como, por exemplo, doxiciclina.

[0018] Outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para detectar anticorpos que se ligam especificamente a um organismo Ehrlichia em uma amostra de teste, compreendendo: (a) colocar em contato um polipeptídeo isolado de: Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, Ecaj 0663 ou Ecaj 0881, mais preferencialmente Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104 ou Ecaj 0663, ainda mais preferencialmente Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, ainda mais preferencialmente Ecaj 0919 ou Ecaj 0073; ou um polipeptídeo tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a amostra de teste, sob condições que permitem a formação de complexos de peptídeo-anticorpo; (b) detectar os complexos de peptídeo-anticorpo; em que a detecção dos complexos de peptídeo-anticorpo é uma indicação de que os anticorpos específicos para um organismo Ehrlichia estão presentes na amostra de teste, e em que a ausência dos complexos de peptídeo-anticorpo é uma indicação de que anticorpos específicos para um organismo Ehrlichia não estão presentes na amostra de teste. A etapa de detecção pode compreender realizar um imunoensaio ligado à enzima, um radioimunoensaio, uma imunoprecipitação, um imunoensaio de fluorescência, um ensaio quimi- luminescente, um ensaio de imunoblot, um ensaio de fluxo lateral, um ensaio de citometria de fluxo, um imunoensaio multiplex, um ensaio de espectrometria de massas, ou um ensaio baseado em partículas. Em algumas modalidades, a etapa de detecção compreende um ensaio de fluxo lateral ou um imunoensaio ligado à enzima, em que o imunoensaio ligado à enzima é um ELISA.

[0019] Ainda outro aspecto da presente invenção refere-se a um mé- todo para identificar uma infecção por Ehrlichia em um sujeito mamífero, compreendendo: (a) colocar em contato uma amostra biológica do sujeito com um polipeptídeo isolado de Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, Ecaj 0663 ou Ecaj 0881, mais preferencialmente Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104 ou Ecaj 0663, ainda mais preferencialmente Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, ainda mais preferencialmente Ecaj 0919 ou Ecaj 0073, sob condições que permitem a formação de complexos de peptídeo-anticorpo; e (b) detectar os complexos de peptídeo-anticorpo; em que a detecção dos complexos de peptídeo-anticorpo é uma indica- ção de que o sujeito tem uma infecção por Ehrlichia. A etapa de detec- ção pode compreender realizar um imunoensaio ligado à enzima, um radioimunoensaio, uma imunoprecipitação, um imunoensaio de fluores-

cência, um ensaio quimiluminescente, um ensaio de imunoblot, um en- saio de fluxo lateral, um ensaio de citometria de fluxo, um imunoensaio multiplex, um teste de fita, ou um ensaio baseado em partículas. Em algumas modalidades, o sujeito é um cão.

[0020] Outro aspecto da presente invenção refere-se a um polipep- tídeo isolado que compreende uma sequência de Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, Ecaj 0663 ou Ecaj 0881, mais preferencial- mente Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, ou Ecaj 0663, ainda mais preferencialmente Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, ainda mais prefe- rencialmente Ecaj 0919 ou Ecaj 0073, em que o peptídeo isolado é imobilizado em uma superfície de um substrato de suporte. O substrato de suporte pode compreender ou consistir de látex, poliestireno, náilon, nitrocelulose, celulose, sílica, agarose ou resina magnética. Em algu- mas modalidades, o substrato de suporte é uma câmara de reação, um poço, uma membrana, um filtro, um papel, uma emulsão, um grânulo, uma microesfera, uma fita, um cartão, uma lâmina de vidro, um aparelho de fluxo lateral, um microchip, um pente, uma partícula de sílica, uma partícula magnética, uma nanopartícula ou uma monocamada de auto- montagem. Em algumas modalidades, o peptídeo está incluído em um kit. O peptídeo pode ser produzido através da síntese de peptídeos ou transcrição e tradução in vitro (IVTT). Em algumas modalidades, o pep- tídeo é produzido de forma recombinante.

[0021] Ainda outro aspecto da presente invenção refere-se a um po- lipeptídeo isolado compreendendo uma sequência de ou consistindo de Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, Ecaj 0663, ou Ecaj 0881, mais pre- ferencialmente Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, ou Ecaj 0663, ainda mais preferencialmente Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, ainda mais preferencialmente Ecaj 0919 ou Ecaj 0073, em que o peptídeo isolado é covalentemente ligado a um marcador detectável. O marcador detec- tável pode ser um marcador fluorescente, um marcador radioativo, um marcador enzimático, ou uma nanopartícula luminescente. A nanopartíi- cula luminescente pode ser uma nanopartícula de terra rara lumines- cente, uma nanopartícula luminosa, ou uma nanopartícula de aluminato de estrôncio. O polipeptídeo pode estar incluído em um kit. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é produzido por meio de síntese de peptí- deos ou transcrição e tradução in vitro (IVTT). Em algumas modalida- des, o polipeptídeo é produzido de forma recombinante.

[0022] Outro aspecto da presente invenção refere-se a um kit com- preendendo: (a) um polipeptídeo isolado aqui descrito ou listado acima, (b) um anticorpo secundário anti-cão ou anti-humano ligado a uma mo- lécula repórter; e (c) um reagente apropriado para a detecção da molé- cula repórter. O peptídeo pode ser imobilizado em uma membrana ou placa de microtitulação. Em algumas modalidades, a molécula repórter é selecionada a partir do grupo que consiste de luciferase, peroxidase de rábano, uma nanopartícula luminosa, P-galactosidase, e um marca- dor fluorescente. A nanopartícula luminosa pode ser uma nanopartícula de aluminato de estrôncio. O kit pode compreender ainda um tampão de diluição para soro de cão ou humano. O kit pode compreender um imunoensaio de fluxo lateral ou um ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral. Em algumas modalidades, o kit compreende um ensaio de imu- nossorção ligado à enzima (ELISA).

[0023] Ainda outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para induzir uma resposta imune em um sujeito mamífero, com- preendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de uma pre- paração farmacêutica compreendendo um polipeptídeo de Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, Ecaj 0663 ou Ecaj 0881, mais preferencial- mente Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104 ou Ecaj 0663, ainda mais preferencialmente Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, ainda mais prefe- rencialmente Ecaj 0919 ou Ecaj 0073. Em algumas modalidades, o su-

jeito é um humano. Em algumas modalidades, a preparação farmacêu- tica é administrada por via subcutânea, intramuscular, nasal, por inala- ção ou administração de aerossol, ou por via intradérmica.

[0024] Outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para tratar uma infecção por Ehrlichia canis em um sujeito mamífero, compreendendo: (a) colocar em contato uma amostra biológica do su- jeito com um polipeptídeo isolado de Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, Ecaj 0663 ou Ecaj 0881, mais preferencialmente Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104 ou Ecaj 0663, ainda mais preferencialmente Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, ainda mais preferencialmente Ecaj 0919 ou Ecaj 0073, sob condições que permitem a formação de complexos de peptídeo-anticorpo; (b) detectar os complexos de peptídeo-anticorpo; em que a detecção dos complexos de peptídeo-anticorpo é uma indica- ção de que o sujeito tem uma infecção por Ehrlichia canis; e (c) admi- nistrar um composto terapêutico para tratar a infecção por Ehrlichia no sujeito. Em algumas modalidades, a etapa de detecção compreende re- alizar um imunoensaio ligado à enzima, um radioimunoensaio, uma imu- noprecipitação, um imunoensaio de fluorescência, um ensaio quimilumi- nescente, um ensaio de imunoblot, um ensaio de fluxo lateral, um ensaio de citometria de fluxo, um imunoensaio multiplex, um teste de fita, ou um ensaio baseado em partículas. O sujeito pode ser um cão. Em algu- mas modalidades, o composto terapêutico é um antibiótico (por exem- plo, doxiciclina).

[0025] Conforme usado neste documento, o termo "polipeptídeo" abrange cadeias de aminoácidos compreendendo pelo menos 50 resí- duos de aminoácidos e, mais preferencialmente, pelo menos 100 resí- duos de aminoácidos, em que os resíduos de aminoácidos estão ligados por ligações peptídicas covalentes. Tal como aqui utilizado, um "poli- peptídeo antigênico" ou um "polipeptídeo imunorreativo" é um polipeptí-

deo que, quando introduzido em um vertebrado, pode estimular a pro- dução de anticorpos no vertebrado, ou seja, é antigênico, e em que o anticorpo pode reconhecer e / ou ligar o polipeptídeo antigênico. Um polipeptídeo antigênico pode compreender ou consistir de uma sequên- cia imunorreativa derivada de uma proteína de Ehrlichia imunorreativa como aqui descrito (por exemplo, como mostrado na Tabela 1, Tabela 2, Tabela 3, Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104 e / ou Ecaj 0663) e o polipeptídeo pode compreender uma ou mais sequências adicionais. Em algumas modalidades, as sequências adicionais podem ser deriva- das de um antígeno de Ehrlichia nativo e podem ser heterólogas, e tais sequências podem (mas não precisam) ser imunogênicas. Em algumas modalidades, o polipeptídeo antigênico ou polipeptídeo imunorreativo pode ser covalentemente ligado a um substrato sólido, por exemplo, em um imunoensaio, tal como um teste de fluxo lateral, etc.

[0026] Os polipeptídeos imunorreativos de Ehrlichia, conforme des- crito neste documento, podem ser um polipeptídeo recombinante, poli- peptídeo sintético, polipeptídeo purificado, polipeptídeo imobilizado, po- lipeptídeo marcado de forma detectável, polipeptídeo encapsulado, ou um polipeptídeo expresso por vetor. Em várias modalidades, os polipep- tídeos imunorreativos de Ehrlichia fornecidos neste documento podem ser truncados ou podem compreender uma mutação de deleção, sem eliminar a imunorreatividade do peptídeo ou polipeptídeo resultante. Um peptídeo ou polipeptídeo imunorreativo descrito neste documento tam- bém pode estar compreendido em uma composição farmacêutica, tal como, por exemplo, uma composição de vacina que é formulada para administração a um sujeito humano ou canino.

[0027] Conforme usado neste relatório descritivo, "um" ou "uma" pode significar um ou mais. Conforme usado aqui na(s) reivindica- ção(ões), quando usado em conjunto com a palavra "compreendendo", as palavras "um" ou "uma" podem significar um ou mais de um.

[0028] O termo "ou" nas reivindicações é usado para significar "e / ou", a menos que explicitamente indicado para se referir a alternativas apenas ou as alternativas são mutuamente exclusivas, embora a des- crição suporte uma definição que refere-se apenas a alternativas e "e / ou". Conforme usado neste documento, "outro" pode significar pelo me- nos um segundo ou mais.

[0029] Ao longo deste pedido, o termo "cerca de" é usado para in- dicar que um valor inclui a variação inerente de erro para o dispositivo, o método sendo empregado para determinar o valor, ou a variação que existe entre os sujeitos do estudo.

[0030] Outros objetivos, características e vantagens da presente in- venção tornar-se-ão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada. Dever-se-ia entender, no entanto, que a descrição detalhada e os exem- plos específicos, embora indiquem modalidades preferenciais da inven- ção, são dados apenas a título de ilustração, uma vez que várias altera- ções e modificações dentro do espírito e escopo da invenção tornar-se- ão evidentes para os versados na técnica a partir desta descrição deta- lhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0031] Os desenhos a seguir fazem parte da presente especificação e são incluídos para demonstrar adicionalmente certos aspectos da pre- sente invenção. A invenção pode ser melhor compreendida por referên- cia a um ou mais desses desenhos em combinação com a descrição detalhada de modalidades específicas aqui apresentadas.

[0032] Figura 1: Proteínas hipotéticas de E. chaffeensis triadas pelo método ELISA.

[0033] Figura 2: Candidatos de imunodiagnóstico de E. chaffeensis exibindo pelo menos OD 0,3 com base em testes de ELISA.

[0034] Figura 3: Teste de proteínas hipotéticas de E. chaffeensis usando múltiplos soros HME-positivos (total de 6 amostras de soro) por proteína.

[0035] Figuras 4A-B: Triagem de expressão e imunorreatividade de proteínas hipotéticas de E. chaffeensis. (Figura 4A) A expressão recom- binante de 17 proteínas hipotéticas de E. chaffeensis por IVTT foi de- tectada por dot blot com anticorpo anti-His. CTL, o controle negativo. (Figura 4B) Triagem de imunorreatividade de proteínas hipotéticas de E. chaffeensis recombinantes por ELISA com um soro de paciente com HME (no. Sandra). O soro do paciente não reconheceu a proteína de controle.

[0036] Figura 5: Imunorreatividade de 15 proteínas hipotéticas de E. chaffeensis e comparação com 3 TRPs por ELISA. Os produtos de IVTT reagiram com um painel de soros de 10 pacientes com HME. Um soro humano normal não reconheceu essas proteínas.

[0037] Figuras 6A-B: Imunorreatividade conformacional de proteí- nas hipotéticas de E. chaffeensis recombinantes. (Figura 6A) Compara- ção de imunorreatividade das proteínas hipotéticas recombinantes des- naturantes e TRPs detectados por ELISA com um painel de soros de 10 pacientes com HME. (Figura 6B) Imunorreatividade de peptídeos sinté- ticos sobrepostos abrangendo 3 proteínas hipotéticas de E. chaffeensis conforme determinado por ELISA com soro de paciente com HME (no. Sandra).

[0038] Figura 7: Imunorreatividade de ortólogos de E. canis de pro- teínas hipotéticas imunorreativas de E. chaffeensis por ELISA. As pro- teínas recombinantes reagiram com soros de 10 cães infectados com E. canis. O soro de um cão normal não reconheceu essas proteínas. TRP19 foi incluído para comparação da imunorreatividade.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES ILUSTRATIVAS

[0039] Em algumas modalidades, um polipeptídeo imunorreativo (por exemplo, na Tabela 1, Tabela 2, Tabela 3, Ecaj 0919, Ecaj 0073,

Ecaj 0104 e / ou Ecaj 0663) aqui descrito pode ser usado como ferra- mentas de diagnóstico ou profiláticas para a detecção ou imunização contra Infecção por Ehrlichia. Em particular, os polipeptídeos imunorre- ativos aqui descritos podem ser úteis em ensaios de fase de solução ou em ensaios em que o polipeptídeo imunorreativo isolado é imobilizado na superfície de um substrato de suporte. Alternativamente, um polipep- tídeo imunorreativo aqui descrito pode estar compreendido em uma for- mulação de vacina para induzir uma resposta imune protetora em um sujeito, ou uma resposta imune contra Ehrlichia chaffeensis ou Ehrlichia canis. Um ou mais polipeptídeos imunorreativos podem ser imobilizados em uma superfície por ligação covalente, encapsulação, ou adsorção usando métodos geralmente conhecidos na técnica, e podem incluir o uso de reticuladores, moléculas de captura e similares, aos quais os peptídeos podem ser acoplados, conjugados ou reticulados.

[0040] Como mostrado nos exemplos abaixo, as abordagens de alto rendimento foram combinadas incluindo análise bioinformática para pre- ver a antigenicidade, transcrição e tradução in vitro para expressar pro- teínas na conformação nativa, e ELISA para identificar um grupo de pro- teínas imunorreativas de E. chaffeensis com função desconhecida. O proteoma inteiro de E. chaffeensis (n = 1156) foi analisado pelo preditor de antigenicidade da proteína, ANTIGENpro, que identificou 250 prote- Ínas com um alto escore de antigenicidade (> 0,695). Proteínas hipoté- ticas (n = 93; 35 de 93 < 22 kDa) presentes neste grupo altamente anti- gênico foram investigadas neste estudo, e quase metade (n = 45) reagiu em níveis baixos a altos com anticorpos em um soro de paciente infec- tado por E. chaffeensis ou um soro de cão; no entanto, 15 proteínas foram consistentemente imunorreativas com um painel de soros de pa- cientes, incluindo seis em um nível altamente comparável a TRPs prin- cipais imunorreativas bem definidas. A maioria (10/15) dessas novas proteínas imunorreativas eram pequenas (< 22 kDa) ou continham do- mínios transmembrana previstos. Notavelmente, a imunorreatividade dessas proteínas foi predominantemente dependente da conformação, uma vez que a desnaturação afetou significativamente o reconheci- mento do anticorpo. Além disso, os ortólogos de E. canis (n = 12) tam- bém reagiram com soros de cães infectados com E. canis, incluindo duas proteínas com imunorreatividade comparável ao TRP19 "padrão ouro". Estas proteínas podem ser usadas, em várias modalidades, para diagnosticar erliquiose ou para gerar uma resposta imune contra E. chaffeensis ou E. canis em um sujeito mamífero, tal como um ser hu- mano ou um cão.

1. Polipeptídeos Imunorreativos Imobilizados

[0041] Em algumas modalidades, um polipeptídeo imunorreativo fornecido neste documento (por exemplo, na Tabela 1, Tabela 2, Tabela 3, Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104 ou Ecaj 0663) pode ser imobili- zado em uma superfície de um suporte ou um substrato sólido; por exemplo, o polipeptídeo imunorreativo pode ser imobilizado direta ou indiretamente por acoplamento, reticulação, adsorção, encapsulação, ou por qualquer método apropriado conhecido na técnica. A título de exemplo não limitante, a ligação de um polipeptídeo imunorreativo des- crito neste documento por adsorção a um poço em uma placa de micro- titulação ou a uma membrana pode ser conseguida pelo contato do pep- tídeo, em um tampão adequado, com a superfície do poço por uma quantidade de tempo adequada. O tempo de contato pode variar com a temperatura, mas é tipicamente entre cerca de 1 hora e 1 dia quando usando uma quantidade de peptídeo variando de cerca de 50 ng a cerca de 1 mg e, de preferência, cerca de 250 a 700 ng ou cerca de 450 a 550 ng.

[0042] Em algumas modalidades, um polipeptídeo imunorreativo descrito aqui é covalentemente ligado a um substrato de suporte, pri- meiro reagindo o suporte com um reagente que reagirá quimicamente tanto com o suporte quanto com um grupo funcional (ou seja, reticula- ção), tal como um grupo hidroxil ou amino, no peptídeo. Por exemplo, um polipeptídeo imunorreativo pode ser reticulado a uma superfície atra- vés de um grupo amina ou carboxílico em qualquer extremidade do pep- tídeo, e um peptídeo pode ser reticulado através de um grupo em cada extremidade do polipeptídeo (isto é, reticulado cabeça a cauda). Tais peptômeros (ou seja, peptídeos reticulados de cabeça a cauda ou imo- bilizados de outra forma) podem ser usados tanto com métodos de di- agnóstico quanto com métodos terapêuticos das presentes modalida- des.

[0043] Numerosos substratos de suporte para imobilização de poli- peptídeo que são conhecidos na técnica podem ser empregues com um polipeptídeo imunorreativo descrito neste documento, formado a partir de materiais tal como, por exemplo, látex, poliestireno, náilon, nitrocelu- lose, celulose, sílica, agarose, polímeros inorgânicos, lipídios, proteínas, açúcares, ou resina magnética. Um versado na técnica pode selecionar o substrato de suporte que é apropriado para uma determinada aplica- ção. Em modalidades particulares da presente invenção, um substrato de suporte pode ser uma câmara de reação, um poço de microplaca, uma membrana, um filtro, um papel, uma emulsão, um grânulo, uma microesfera, um nanocristal, uma nanosfera, uma fita, um cartão, uma lâmina de vidro, uma microlâmina, um aparelho de fluxo lateral, um mi- crochip, um pente, uma partícula de sílica, uma partícula magnética, uma nanopartícula, ou uma monocamada de automontagem. Il. Polipeptídeos Imunorreativos Marcados de Forma Detectável

[0044] Um polipeptídeo imunorreativo (por exemplo, na Tabela 1, Tabela 2, Tabela 3, Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104 ou Ecaj 0663) pode ser conjugado ou ligado a um marcador detectável, tal como, por exemplo, um isótopo radioativo, um isótopo não radioativo, um marca- dor particulado, um marcador fluorescente, um marcador quimilumines- cente, um marcador paramagnético, um marcador enzimático, ou um marcador colorimétrico. O polipeptídeo marcado de forma detectável pode ser usado, por exemplo, em métodos e composições de diagnós- tico ou profiláticos. Em certas modalidades, a porção polipeptídica do polipeptídeo imunorreativo marcado de forma detectável pode ser imo- bilizada em uma superfície de um substrato de suporte. Em outras mo- dalidades, o marcador detectável pode ser usado para imobilizar o pep- tídeo imunorreativo marcado de forma detectável na superfície de um substrato de suporte.

[0045] Conforme usado neste documento, "marcador detectável" é um composto e / ou elemento que pode ser detectado devido às suas propriedades funcionais específicas e / ou características químicas, cujo uso permite que o peptídeo ao qual está ligado seja detectado, e / ou quantificado adicionalmente se desejado.

[0046] Em algumas modalidades, o marcador detectável é uma sonda fotoluminescente tal como um fluoróforo, ou uma nanopartícula tal como, por exemplo, uma nanopartícula de aluminato de estrôncio (por exemplo, ver Paterson e outros, 2014). Marcadores exemplificati- vos incluem, mas não estão limitados a, um marcador particulado tal como ouro coloidal, um isótopo radioativo tal como astatina?!!, !ºcar- bono, *cromo, *eloro, cobalto, cobalto, cobre”, *ºEu, gálio””, dhi- drogênio, iodo'?3, iodo'?5, iodo'%!, índio!!!, SºFferro, fósforo, rênio186, rênio 188, "selênio, enxofre, tecnécio-99, tecnécio-99m ou fítrio?º, um marcador colorimétrico tal como dinitrobenzeno, dansil cloreto, dabsil cloreto, qualquer um dos corantes azo, cianina ou triazina, ou cromófo- ros descritos nas Patentes U.S. 5.470.932, 5.543.504 ou 6.372.445, to- das aqui incorporadas por referência; um marcador paramagnético, como cromo (III), manganês (II), ferro (III), ferro (II), cobalto (II), níquel

(11), cobre (11), neodímio (III), samário (III), itérbio (Ill), gadolínio (Ill), va- nádio (II), térbio (III), disprósio (III), hólmio (Ill) ou érbio (Ill), um marca- dor fluorescente tal como Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, Cascade Blue, Cy3, Cy5,6-FAM, Isotiocianato de Fluo- resceína, HEX, 6-JOE, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, REG, Rhodamine Green, Rhodamine Red, Re- nographin, ROX, TAMRA, TET, Tetrametilrodamina e / ou Texas Red ou Lucifer Yellow, um marcador enzimático tal como urease, luciferase, fosfatase alcalina, peroxidase de hidrogênio (rábano), ou oxidase de gli- cose, ou um marcador quimiluminescente tal como luminol, ftalazinadi- ona, e outros descritos em qualquer uma das patentes U.S. 4.373.932,

4.220.450, 5.470.723 e Pedido de Patente US 2007/0264664, todos in- corporados aqui por referência. III. Métodos para Produzir um Polipeptídeo Imunorreativo

[0047] Um polipeptídeo imunorreativo das presentes modalidades pode ser produzido usando métodos de transcrição e tradução in vitro (IVTT), pode ser produzido de forma recombinante usando uma varie- dade de tipos de células (por exemplo, células bacterianas, células de mamíferos, E. coli, levedura e células de inseto, etc.) ou, em alguns ca- sos, pode ser sintetizado (por exemplo, usando a síntese em fase só- lida). Em algumas modalidades, IVTT e métodos sintéticos podem for- necer certas vantagens sobre as abordagens recombinantes, uma vez que os polipeptídeos resultantes podem produzir formas altamente pu- ras sem contaminar bactérias ou outras proteínas que podem resultar em reações falso-positivas ao utilizar proteínas recombinantes. Assim, IVTT e métodos sintéticos têm a vantagem de não ter muitos dos pro- cedimentos de purificação dispendiosos e trabalhosos frequentemente associados a metodologias recombinantes.

[0048] Uma variedade de abordagens IVTT são conhecidas na téc- nica e podem ser usadas em várias modalidades. IVTT geralmente en- volve métodos livre de células para a produção ou síntese de uma pro- teína a partir de DNA. O sistema livre de células para a produção de proteínas pode usar, por exemplo, extrato de E. coli, extratos de proto- zoários, extratos de levedura, extrato de células humanas, extrato de gérmen de trigo, extratos de mamíferos, extratos de linhagens celulares humanas cultivadas, lisado de reticulócitos de coelho, extrato de células de inseto, ou componentes de E. coli reconstituídos e purificados. Uma variedade de kits estão disponíveis comercialmente, incluindo, por exemplo, RTS (FivePrime, San Francisco, CA), Expressway"" (Life Technologies); S30 T7 de alto rendimento (Promega), IVT humano de uma etapa (Thermo Scientific), WEPROO (CellFree Sciences), TNTO acoplado (Promega), RTS CECF (5 PRIME), TNTO acoplado (Pro- mega), lisado rético IVTTY (Life Technologies); TNTO T7 (Promega), kit EasyXpress Insect (Qiagen / RIN A), PURExpressO (New England Bio- labs) e PURESYSTEMO (BioComber). Esses métodos podem ser usa- dos para incorporar aminoácidos não naturais em proteínas, se dese- jado. Sistemas de expressão livres de células que podem ser usados em várias modalidades também são descritos, por exemplo, por Zemella e outros, 2015.

[0049] Uma proteína imunorreativa isolada, conforme descrito neste documento, pode ser produzida em algumas modalidades usando um método apropriado conhecido na técnica de química orgânica. Por exemplo, os peptídeos podem ser produzidos usando uma das técnicas de síntese de peptídeos em fase sólida estabelecidas, como as de Mer- rifield, Carpino, ou Atherton [Atherton e Sheppard, 1989]. Em algumas modalidades, os peptídeos podem ser sintetizados usando equipa- mento para síntese automática de peptídeos que está amplamente dis-

ponível a partir de fornecedores comerciais, tal como Perkin Elmer (Fos- ter City, CA), ou o peptídeo pode ser sintetizado quimicamente usando técnicas de fase de solução tal como as descritas por Carpino e outros, 2003 ou pedido de patente US 2009/0005535. Em algumas modalida- des, os peptídeos ou proteínas mais curtas podem ser sintetizados, por exemplo, usando síntese de peptídeo em fase sólida (SPPS), síntese de peptídeo em fase sólida t-Boc, ou síntese de peptídeo em fase sólida Fmoc.

[0050] Em algumas modalidades, uma proteína imunorreativa, con- forme descrito neste documento, pode ser preparada de forma recom- binante a partir de um ácido nucleico que codifica o peptídeo. Esse ácido nucleico pode ser operacionalmente ligado a um vetor de expressão. À título de exemplo não limitante, uma proteína imunorreativa pode ser expressa a partir de um vetor e isolada do meio de crescimento de uma célula hospedeira compreendendo o vetor. Em algumas modalidades, a proteína imunorreativa pode ser produzida em um sistema livre de célu- las a partir de um ácido nucleico codificando o peptídeo.

[0051] Uma proteína imunorreativa imobilizada, conforme descrito neste documento, pode ser conjugada, reticulada ou adsorvida, direta ou indiretamente sobre uma superfície de um substrato de suporte. Em algumas modalidades, uma proteína ou peptídeo imunorreativo imobili- zado pode ser sintetizado em um substrato de suporte.

[0052] Prevê-se que virtualmente qualquer método de imobilização de proteína ou peptídeo conhecido na técnica que não teria impacto na estrutura ou função dos peptídeos descritos pode ser usado para imo- bilizar uma proteína ou peptídeo imunorreativo como aqui descrito. Por exemplo, a imobilização de peptídeo pode ser realizada usando um agente de reticulação ou conjugação, tal como metil-p-hidroxibenzimi- dato, N-succinimidil-3-(4-hidroxifenil )propionato, usando sulfosuccinimi-

dil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SSMCC), N- [malei- midocaproiloxi] sulfosuccinimida éster (SEMCS), N-maleimidobenzoil-N- hidroxisuccinimida éster (MBS), glutaraldeído, 1-etil-3-(3-dimetilamino- propil) carbodiimida (EDCI), Bis-diazobenzidina (BDD), ou N-acetil ho- mocisteína tiolactona (NAHT), e outros descritos em qualquer uma das Patentes U.S. 5.853.744, 5.891.506, 6.210.708, 6.617.142, 6.875.750,

6.951.765, 7.163.677 e 7.282.194, cada uma das quais aqui incorporada por referência. As proteínas imunorreativas podem ser conjugadas di- reta ou indiretamente a qualquer um dos substratos de suporte disponí- veis comercialmente tendo revestimentos de superfície compreendendo reticulantes, agentes de acoplamento, agentes de derivatização de tiol ou hidroxila, grupos carboxil ou amina-reativos tal como de anidrido ma- leico (por exemplo, Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, em A12-A13, 1991).

[0053] Em algumas modalidades, uma proteína da invenção tam- bém pode ser imobilizada usando complexação de quelato de metal, empregando, por exemplo, um agente quelante orgânico tal como um anidrido de ácido dietilenotriaminopenta-acético (DTPA); EDTA; N- cloro-p-toluenossulfonamida; e / ou tetracloro-3a-6a-difenilglicouril-3 li- gado ao anticorpo (Patentes U.S. Nos. 4.472.509 e 4.938.948, cada uma das quais aqui incorporada por referência). Proteínas e peptídeos também podem ser imobilizados por acoplamento a outros peptídeos ou a grupos de condensação imobilizados em uma superfície ou presentes em um tampão de imobilização, tal como glutaraldeído ou periodato. Conjugados com marcadores de fluorescência também podem ser pre- parados na presença de tais agentes ou por reação com um isotiocia- nato. Um peptídeo pode ser ligado a uma superfície por conjugação, reticulação ou ligação a um agente de ligação por afinidade tal como biotina, estreptavidina, um polissacarídeo tal como um alginato, uma le- ctina e similares.

[0054] Em geral, independentemente do método de preparação ou do estado de imobilização, as proteínas imunorreativas aqui descritas são preferencialmente preparadas em uma forma substancialmente pura. Preferencialmente, as proteínas imunorreativas são pelo menos cerca de 80% puras, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% puras e mais preferencialmente pelo menos cerca de 99% puras. IV. Equivalentes Funcionais Biológicos

[0055] Os polipeptídeos imunorreativos preferenciais ou seus aná- logos ligam-se especificamente ou preferencialmente a um anticorpo específico de Ehrlichia chaffeensis ou Ehrlichia canis. Determinar se ou em que grau um determinado polipeptídeo imunorreativo, ou um aná- logo do mesmo, pode se ligar a um anticorpo específico de E. chaffeen- sis pode ser avaliado usando um ensaio in vitro, tal como, por exemplo, um ensaio de imunossorção ligado à enzima (ELISA), imunotransferên- cia, imunoprecipitação, radioimunoensaio (RIA), imunomarcação, aglu- tinação de látex, ensaio de hemaglutinação indireta (IHA), fixação de complemento, ensaio de imunofluorescência indireta (FA), nefelometria, ensaio de citometria de fluxo, ensaio de quimiluminescência, ensaio de fluxo lateral, ensaio de captura, ensaio de espectrometria de massas, ensaio baseado em partículas, ensaio de inibição e / ou um ensaio de avidez.

[0056] Um polipeptídeo imunorreativo das presentes modalidades pode ser modificado para conter substituições, inserções e / ou deleções de aminoácidos que não alteram suas respectivas interações com as regiões de ligação do anticorpo anti-Ehrlichia. Tal equivalente biologica- mente funcional de um polipeptídeo imunorreativo derivado de uma pro- teína Ehrlichia poderia ser uma molécula com características similares ou desejáveis, isto é, ligação de anticorpos específicos de Ehrlichia. Como um exemplo não limitante, certos aminoácidos podem ser substi-

tuídos por outros aminoácidos em um polipeptídeo imunorreativo des- crito neste documento sem perda apreciável de capacidade interativa, como demonstrado pela ligação de anticorpo detectavelmente inalte- rada. É, portanto, considerado que um polipeptídeo imunorreativo des- crito neste documento (ou um ácido nucleico que codifica tal polipeptí- deo) que é modificado na sequência e / ou estrutura, mas que é inalte- rado na utilidade ou atividade biológica, permanece dentro do escopo das presentes modalidades. O polipeptídeo imunorreativo pode ter, por exemplo, pelo menos 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com um polipeptídeo de E. chaffeensis de ocorrência natural e, em al- gumas modalidades, a proteína imunorreativa pode ter 1, 2, 3, 4, 5, ou mais substituições, inserções e / ou deleções de aminoácidos em com- paração com o polipeptídeo de E. chaffeensis ou E. canis de ocorrência natural correspondente.

[0057] Também é bem compreendido pelo versado na técnica, ine- rente à definição de um peptídeo equivalente biologicamente funcional, o conceito de que há um limite para o número de alterações que podem ser feitas dentro de uma porção definida da molécula, enquanto ainda mantendo um nível aceitável de atividade biológica equivalente. Poli- peptídeos equivalentes biologicamente funcionais são assim definidos aqui como aqueles peptídeos nos quais alguns, não a maioria ou todos, os aminoácidos podem ser substituídos. Obviamente, uma pluralidade de peptídeos distintos com diferentes substituições pode ser facilmente feita e usada de acordo com a invenção.

[0058] O versado na técnica também está ciente de que quando certos resíduos se mostram particularmente importantes para as propri- edades biológicas ou estruturais de um peptídeo, por exemplo, resíduos em epítopos específicos, tais resíduos podem geralmente não ser tro- cados. Prevê-se que uma mutação em um peptídeo imunorreativo ou polipeptídeo descrito neste documento pode resultar em uma perda de especificidade para a espécie e, por sua vez, reduzir a utilidade do pep- tídeo resultante para uso em métodos das presentes modalidades. As- sim, os polipeptídeos que são antigênicos (isto é, se ligam especifica- mente a anticorpos anti-Ehrlichia) e compreendem substituições conser- vativas de aminoácidos são entendidos como incluídos nas presentes modalidades. As substituições conservativas têm menos probabilidade de alterar drasticamente a atividade de uma proteína. Uma "substituição conservativa de aminoácidos" refere-se à substituição de aminoácidos por um aminoácido quimicamente similar, isto é, substituição de amino- ácidos não polares por outros aminoácidos não polares; substituição de aminoácidos polares por outros aminoácidos polares, resíduos ácidos por outros aminoácidos ácidos, etc.

[0059] As substituições de aminoácidos, tal como aquelas que po- dem ser empregues na modificação de um polipeptídeo imunorreativo descrito neste documento, são geralmente baseadas na similaridade re- lativa dos substituintes da cadeia lateral de aminoácidos, por exemplo, sua hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho e similares. Uma análise do tamanho, forma e tipo dos substituintes da cadeia lateral do aminoácido revela que arginina, lisina e histidina são todos resíduos car- regados positivamente; que a alanina, a glicina e a serina têm todas tamanhos similares; e que a fenilalanina, o triptofano e a tirosina têm uma forma geralmente similar. Portanto, com base nessas considera- ções, arginina, lisina e histidina; alanina, glicina e serina; e fenilalanina, triptofano e tirosina; são aqui definidos como equivalentes biologica- mente funcionais.

[0060] A invenção também considera isoformas dos polipeptídeos imunorreativos de E. chaffeensis aqui descritos. Uma isoforma contém o mesmo número e tipos de aminoácidos que um polipeptídeo de E. chaffeensis conforme descrito neste documento, mas a isoforma tem uma estrutura molecular diferente. As isoformas consideradas pelas presentes modalidades são aquelas que têm as mesmas propriedades de um polipeptídeo conforme descrito neste documento.

[0061] Aminoácidos não padrão podem ser incorporados em prote- ínas por modificação química de aminoácidos existentes ou por síntese de novo de um polipeptídeo aqui descrito. Um aminoácido não padrão refere-se a um aminoácido que difere na estrutura química dos vinte aminoácidos padrão codificados pelo código genético, e uma variedade de aminoácidos não padrão é bem conhecida na técnica.

[0062] Em modalidades selecionadas, a presente invenção consi- dera um derivado químico de um polipeptídeo imunorreativo descrito neste documento. "Derivado químico" refere-se a um peptídeo tendo um ou mais resíduos quimicamente derivatizados por reação de um grupo lateral funcional, e retendo a atividade biológica e a utilidade. Tais poli- peptídeos derivatizados incluem, por exemplo, aqueles em que grupos amino livres foram derivatizados para formar sais específicos ou deriva- tizados por alquilação e / ou acilação, grupos p-tolueno sulfonil, grupos carbobenzoxi, grupos t-butilocicarbonila, grupos cloroacetila, formila ou acetila grupos, entre outros. Os grupos carboxila livres podem ser deri- vatizados para formar sais orgânicos ou inorgânicos, metil e etil ésteres ou outros tipos de ésteres ou hidrazidas e preferencialmente amidas (primárias ou secundárias). Derivados químicos podem incluir polipeptí- deos que compreendem um ou mais derivados de aminoácidos de ocor- rência natural dos vinte aminoácidos padrão. Por exemplo, 4-hidroxipro- lina pode ser substituída por serina; e ornitina pode ser substituída por lisina.

[0063] Dever-se-ia notar que todas as sequências de resíduos de aminoácidos são representadas aqui por fórmulas cuja orientação es- querda e direita está na direção convencional do amino terminal para carbóxi terminal. Além disso, dever-se-ia notar que um traço no início ou no final de uma sequência de resíduos de aminoácidos indica uma ligação peptídica a uma sequência adicional de um ou mais resíduos de aminoácidos. Prefere-se que os aminoácidos aqui descritos estejam na forma isomérica "L". No entanto, os resíduos na forma isomérica "D" podem ser substituídos por qualquer resíduo de L-aminoácido, desde que as propriedades funcionais desejadas aqui estabelecidas sejam re- tidas pela proteína. De acordo com a nomenclatura padrão de proteínas, as abreviaturas para resíduos de aminoácidos são conhecidas na téc- nica.

[0064] Além dos equivalentes funcionais biológicos discutidos acima, é considerado que compostos estruturalmente similares podem ser formulados para simular as porções chave de um peptídeo imunor- reativo descrito neste documento. Esses compostos, que podem ser de- nominados peptidomiméticos, podem ser usados da mesma maneira que os peptídeos imunorreativos aqui descritos e, portanto, também são equivalentes funcionais. Os métodos para gerar estruturas específicas são descritos, por exemplo, por Mizuno e outros, 2017, bem como nas Patentes U.S. 5.446.128, 5.710.245, 5.840.833, 5.859.184, 5.440.013,

5.618.914, e 5.670.155. V. Métodos de Detecção de Infecção por Ehrlichia

[0065] A erliquiose em humanos geralmente refere-se a infecções causadas por bactérias intracelulares obrigatórias da família Anaplas- mataceae, principalmente nos gêneros Ehrlichia e Anaplasma. À maio- ria dos casos de erliquiose humana (HE) é causada por 3 espécies dis- tintas: Ehrlichia chaffeensis, a principal delas (Dumler e outros, 2007). As infecções por Ehrlichia em animais também são conhecidas como erliquiose, juntamente com uma variedade de doenças causadas por um grupo diversificado de patógenos dos gêneros Ehrlichia, Anaplasma, Neorickettsia e Cowdria (Dumler e outros, 2007). As infecções por Ehr- lichia são sustentadas principalmente em monócitos ou granulócitos, e estudos demonstraram que os anticorpos desempenham um papel es- sencial na resposta imune à infecção por Ehrlichia (Feng e Walker, 2004; Winslow e outros, 2003; Winslow e outros, 2000; Yager e outros, 2005).

[0066] Consequentemente, determinadas modalidades da presente invenção fornecem métodos de detecção de anticorpos que se ligam especificamente a um organismo Ehrlichia em uma amostra. Tal método pode envolver colocar em contato um polipeptídeo imunorreativo erli- quial isolado (por exemplo, da Tabela 1, 2, 3,, Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, ou Ecaj 0663) com a amostra de teste, sob condições que permitem a formação de complexos de peptídeo-anticorpo, e detectar os complexos de peptídeo-anticorpo. Nessas modalidades, a detecção dos complexos de peptídeo-anticorpo é uma indicação de que anticor- pos específicos para um organismo Ehrlichia estão presentes na amos- tra de teste, e a ausência dos complexos de peptídeo-anticorpo é uma indicação de que anticorpos específicos para um organismo Ehrlichia não estão presentes na amostra de teste.

[0067] Em várias modalidades, a detecção de um polipeptídeo imu- norreativo descrito aqui ligado a um anticorpo específico de Ehrlichia (ou seja, um complexo de peptídeo-anticorpo) pode ser realizada usando um imunoensaio ligado à enzima (por exemplo, um ELISA em sanduíche ou um ELISA competitivo), um radioimunoensaio, uma imu- noprecipitação, um imunoensaio de fluorescência, um ensaio quimilumi- nescente, um ensaio de imunotransferência, um ensaio de fluxo lateral, um ensaio de citometria de fluxo, um ensaio de espectrometria de massa, aglutinação de látex, um ensaio de hemaglutinação indireta (IHA), fixação de complemento, um ensaio de inibição, um ensaio de avidez, um teste de fita, ou um ensaio baseado em partículas. Em algu- mas modalidades preferenciais, os complexos de peptídeo-anticorpo aqui descritos são detectados usando um imunoensaio ligado à enzima,

um ensaio de fluxo lateral ou um ensaio baseado em partículas.

[0068] Conforme usado aqui, uma "amostra" é qualquer amostra que compreende ou se suspeita que compreenda anticorpos. De prefe- rência, a amostra é sangue integral, expectoração, soro, plasma, saliva, fluido cerebrospinal ou urina. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de sangue, soro ou plasma obtida a partir de um sujeito ou paciente.

[0069] A erliquiose causada por uma infecção por Ehrlichia chaffe- ensis em humanos se apresenta com sintomas similares aos da gripe dentre febre, calafrios, dor de cabeça e dores musculares. Em casos mais graves, também podem ser observadas náuseas, perda de apetite, perda de peso, dor abdominal, tosse, diarreia e alteração do estado mental. A erliquiose em humanos é potencialmente fatal.

[0070] Em cães, a erliquiose é mais frequentemente causada por bactérias Ehrlichia chaffeensis ou Ehrlichia canis, e progride em três fa- ses: uma fase aguda, uma fase subclínica, e uma fase crônica. A fase aguda normalmente se estende semanas após a infecção e apresenta sintomas similares aos da erliquiose humana, tal como febre, letargia, perda de apetite, falta de ar, dor nas articulações e rigidez, e também pode incluir sintomas mais graves, tal como anemia, depressão, hema- tomas e linfonodos, fígado e baço aumentados. A fase subclínica pode persistir por anos e na maioria das vezes não apresenta sintomas, em- bora anticorpos para antígenos de Ehrlichia possam ser detectados. À fase crônica da infecção por Ehrlichia geralmente apresenta sintomas recorrentes de perda de peso, anemia, disfunção neurológica, sangra- mento, inflamação ocular, edema nas pernas, e febre, e apresenta um perfil sanguíneo que geralmente leva a um diagnóstico incorreto de leu- cemia. Uma infecção por Ehrlichia que progride para o estágio crônico da doença costuma ser fatal.

[0071] Os sintomas inespecíficos de uma infecção por Ehrlichia e sua semelhança com os sintomas de gripe leves e graves tornam o di- agnóstico de erliquiose difícil em humanos e cães. O diagnóstico pode ser dificultado ainda mais pelos procedimentos de teste laboratorial atu- ais para infecção por Ehrlichia, que não são testes de ponto de atendi- mento, ou seja, os testes não estão disponíveis na maioria dos hospi- tais, clínicas e consultórios médicos ou veterinários onde um paciente pode receber tratamento.

[0072] Consequentemente, modalidades selecionadas da presente invenção fornecem métodos para identificar uma infecção por Ehrlichia em um sujeito mamífero. Tal método pode envolver colocar em contato uma amostra do sujeito com um polipeptídeo imunorreativo isolado des- crito neste documento (por exemplo, da Tabela 1, Tabela 2, Tabela 3, Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104 ou Ecaj 0663) sob condições que permitem que os complexos de peptídeo-anticorpo se formem, e detec- tar os complexos de peptídeo-anticorpo. Nessas modalidades, a detec- ção dos complexos de peptídeo-anticorpo é uma indicação de que o sujeito tem uma infecção por Ehrlichia. O organismo Ehrlichia pode ser um organismo Ehrlichia chaffeensis ou um organismo Ehrlichia canis. Em algumas modalidades, o sujeito é um humano ou um cão. Tal como acontece com outros métodos aqui descritos, a etapa de detecção pode ser realizada usando qualquer tipo apropriado de ensaio conhecido na técnica, e pode ser preferencialmente realizada usando um ensaio de fluxo lateral ou um ELISA.

[0073] Os termos "sujeito" e "paciente" são usados de forma inter- cambiável neste documento e podem se referir a um mamífero, especi- almente um humano ou um cão. Em certas modalidades, um "sujeito" ou "paciente" refere-se a um hospedeiro mamífero Ehrlichia (isto é, ani- mal infectado com um organismo Ehrlichia). Um hospedeiro Ehrlichia pode ser, por exemplo, primata humano ou não humano, bovino, canino, caprino, cavino, corvina, epino, equino, felino, hircino, lapino, leporino,

lupino, murino, ovino, suíno, racino, vulpino, e similares, incluindo gado, espécimes de zoológico, animais exóticos, bem como animais de com- panhia, animais de estimação e qualquer animal sob os cuidados de um médico veterinário. Um sujeito pode estar ou não infectado com um or- ganismo Ehrlichia, e um sujeito pode ser um mamífero suspeito de estar infectado com um organismo Ehrlichia.

[0074] Sem desejar ser limitado pela teoria, os polipeptídeos imu- norreativos erliquiais descritos neste documento compreendem, cada um, pelo menos uma parte de um epítopo de Ehrlichia principal que é responsável por uma imunogenicidade específica da espécie em huma- nos e animais. O termo "epítopo" é usado neste documento para indicar aquela porção de uma substância imunogênica que é especificamente identificada, reconhecida e ligada por um anticorpo ou receptor de su- perfície celular de um sistema imunológico hospedeiro que montou uma resposta imunológica à substância imunogênica como determinado por qualquer método conhecido na técnica (ver, por exemplo, Geysen e ou- tros, 1984). Assim, um epítopo que é "específico da espécie" é um epí- topo que pode ser usado para diferenciar uma espécie do gênero Ehrli- chia de outra espécie de Ehrlichia.

[0075] As modalidades particulares referem-se a determinar se um sujeito foi imunizado contra Ehrlichia ou está ativamente infectado com um organismo Ehrlichia. Nessas modalidades, o método compreende colocar em contato uma amostra do sujeito com pelo menos um poli- peptídeo imunorreativo isolado (por exemplo, da Tabela 1, Tabela 2, Ta- bela 3, Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104 ou Ecaj 0663) que não é um componente de uma Vacina para Ehrlichia, e detectar se um anticorpo na amostra se liga especificamente ao polipeptídeo imunorreativo erli- quial isolado. De acordo com o método, se um anticorpo na amostra se liga especificamente ao polipeptídeo imunorreativo erliquial isolado, en- tão o sujeito tem uma infecção ativa por Ehrlichia, e se um anticorpo não se liga especificamente ao peptídeo imunorreativo erliquial isolado, en- tão o sujeito está previamente imunizado com uma vacina contra Ehrli- chia ou não infectado com um organismo Ehrlichia. Um organismo Ehr- lichia pode ser um organismo E. chaffeensis ou um organismo E. canis.

[0076] Um polipeptídeo imunorreativo erliquial (por exemplo, das Tabelas 1, 2, 3, Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104 ou Ecaj 0663) pode ser usado para ligar um anticorpo específico para Ehrlichia ou específico para E. chaffeensis usando uma variedade de métodos ou kits. A ligação específica entre um anticorpo e um polipeptídeo erliquial, conforme des- crito neste documento, pode, portanto, ser avaliada por qualquer mé- todo apropriado conhecido na técnica incluindo, mas não limitado a, um ensaio de imunossorção ligado à enzima (ELISA), um ELISA sanduíche, um ELISA competitivo, imunoblotting, imunoprecipitação, radioimunoen- saio (RIA), imunocoloração, aglutinação de látex, ensaio de hemagluti- nação indireta (IHA), fixação de complemento, ensaio de imunofluores- cência indireta (FA), nefelometria, ensaio de citometria de fluxo, ensaio de quimiluminescência, ensaio de captura, ensaio de espectrometria de massas, ensaio baseado em partículas, ensaio de inibição e ensaio de avidez. Métodos exemplificativos para detectar a ligação de um anti- corpo específico para Ehrlichia a um polipeptídeo imunorreativo erli- quial, como descrito neste documento, podem incluir, por exemplo, um ELISA realizado em uma microplaca, um teste de fluxo lateral realizado usando uma fita ou dispositivo de fluxo lateral, ou um ensaio de arranjo de suspensão baseado em partículas realizado usando o sistema Bio- Plex6 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA).

A. ELISA

[0077] Em certas modalidades, a detecção de um complexo de pep- tídeo-anticorpo aqui descrito é realizada usando um ensaio de imunos- sorção ligado à enzima (ELISA). Este ensaio pode ser realizado primeiro colocando em contato um polipeptídeo imunorreativo erliquial (por exemplo, na Tabela 1, Tabela 2, Tabela 3, Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104 ou Ecaj 0663) que foi imobilizado em um suporte sólido, co- mumente o poço de uma placa de microtitulação, com a amostra, de modo que os anticorpos específicos para o peptídeo na amostra se li- guem ao peptídeo imobilizado. A amostra não ligada é então removida do peptídeo imobilizado e um reagente de detecção capaz de se ligar ao complexo de anticorpo — polipeptídeo imobilizado é adicionado. A quantidade de reagente de detecção que permanece ligado ao suporte sólido é então determinada usando um método apropriado para o rea- gente de detecção específico.

[0078] Em algumas modalidades, o reagente de detecção contém um agente de ligação (tal como, por exemplo, proteína A, proteína G, imunoglobulina, lectina ou antígeno livre) conjugado ou covalentemente ligado a um grupo repórter ou marcador. Grupos repórter exemplificati- vos ou marcadores incluem enzimas (tal como peroxidase de rábano), substratos, cofatores, inibidores, corantes, radionuclídeos, grupos lumi- nescentes, grupos fluorescentes e biotina. A conjugação do agente de ligação ao grupo repórter ou marcador pode ser alcançada usando mé- todos padrão conhecidos pelos versados na técnica. Os agentes de |li- gação comuns também podem ser adquiridos conjugados a uma varie- dade de grupos repórter de muitas fontes comerciais (por exemplo, Zymed Laboratories, San Francisco, CA; e Pierce, Rockford, IL.).

[0079] Em um aspecto da presente invenção, a presença ou ausên- cia de anticorpos específicos para Ehrlichia pode ser determinada na amostra, comparando o nível de um sinal detectado de um grupo repór- ter ou marcador na amostra com o nível de um sinal que corresponde a uma amostra de controle ou valor de corte predeterminado. Em certas modalidades, o valor de corte pode ser o sinal médio obtido quando o peptídeo imunorreativo erliquial imobilizado é incubado com amostras de um sujeito não infectado. O valor de corte pode ser determinado usando um método estatístico ou programa de computador.

B. Testes de Fluxo Lateral

[0080] Os testes de fluxo lateral também podem ser chamados de testes de tira imunocromatográfica (ICS) ou simplesmente testes de tira. Em geral, um teste de fluxo lateral é uma forma de ensaio em que a amostra de teste flui lateralmente ao longo de um substrato sólido por meio de ação capilar ou, alternativamente, sob controle fluídico. Esses testes costumam não ser dispendiosos, exigem uma quantidade muito pequena (por exemplo, uma gota) de amostra, e podem ser normal- mente realizados de forma reproduzível com treinamento mínimo. À simplicidade econômica e a robustez de muitos formatos de ensaio de fluxo lateral torna esses tipos de testes ideais para identificar uma infec- ção por Ehrlichia (por exemplo, E. chaffeensis) no local de atendimento, o que pode ser particularmente importante quando o sujeito é, por exem- plo, um humano ou cão exibindo anticorpos detectáveis durante a fase aguda tratável da infecção.

[0081] Os formatos de dispositivo de fluxo lateral exemplificativos incluem, mas não estão limitados a uma fita medidora de nível, um car- tão, um chip, uma microlâmina, e um cassete, e é amplamente demons- trado na técnica que a escolha do formato depende em grande parte das características de um ensaio específico. Consequentemente, os dispositivos de fluxo lateral são agora onipresentes na medicina humana e veterinária e bastante variados, fornecendo muitas opções para o ver- sado na técnica detectar um complexo de peptídeo-anticorpo em uma amostra usando um ensaio de fluxo lateral (ver qualquer uma das pa- tentes U.S. 7.344.893, 7.371.582, 6.136.610, e Pedidos de Patente U.S. 2005/0250141 e 2005/0047972, ou Koczula e outros (2016), cada um dos quais é aqui incorporado por referência). A título de exemplo não limitante, uma amostra de um sujeito suspeito de ter uma infecção por Ehrlichia é aplicada a um dispositivo de fluxo lateral que compreende pelo menos uma zona de amostra e uma zona de ligação. A amostra pode ser uma amostra de soro e pode ser retirada lateralmente da zona de amostra para a zona de ligação que compreende um polipeptídeo imunorreativo erliquial descrito neste documento (por exemplo, da Ta- bela 1, Tabela 2, Tabela 3, Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, ou Ecaj 0663) imobilizado a uma superfície do dispositivo de fluxo lateral. Neste exemplo, a ligação do polipeptídeo imunorreativo erliquial imobi- lizado no dispositivo de fluxo lateral é uma indicação de que anticorpos específicos para Ehrlichia estão presentes na amostra do sujeito, indi- cando uma infecção por Ehrlichia no sujeito, tal como infecção por E. chaffeensis ou E. canis no sujeito.

[0082] Em modalidades relacionadas, um ensaio ELISA como des- crito acima pode ser realizado em um fluxo rápido, fluxo lateral ou for- mato de teste de tira, em que o antígeno é imobilizado em uma mem- brana, tal como uma membrana de nitrocelulose. Neste teste de fluxo contínuo, os anticorpos de Ehrlichia dentro da amostra ligam-se ao pep- tídeo imunorreativo erliquial imobilizado à medida que a amostra passa através da membrana. Um reagente de detecção, tal como a proteína À marcada com ouro, um fluoróforo, ou um cromóforo, liga-se ao com- plexo de peptídeo-anticorpo à medida que a solução contendo o rea- gente de detecção flui através da membrana. Os complexos de peptí- deo-anticorpo ligados ao reagente de detecção podem então ser detec- tados, conforme apropriado para o reagente de detecção usado, por exemplo, com base na presença ou ausência de uma cor visivelmente detectável ou marcador fluorescente, uma nanopartícula, uma nanopar- tícula de terra rara luminescente, uma nanopartícula luminosa, uma na- nopartícula de aluminato de estrôncio (por exemplo, ver Paterson e ou- tros, 2014; e Wang e outros, 2017, etc.).

[0083] Em um aspecto, um formato de fluxo passante de ELISA pode ser realizado em que uma extremidade da membrana para a qual um peptídeo imunorreativo erliquial (por exemplo, da Tabela 1, 2 ou 3) está imobilizado pode ser imerso em uma solução contendo a amostra, ou a amostra pode ser adicionada a uma área (isto é, uma zona de amostra) em uma extremidade da membrana. A amostra migra ao longo da membrana através de uma região (ou seja, uma zona de marcação) que compreende o reagente de detecção, e flui para a área (ou seja, uma zona de ligação) que compreende o peptídeo imunorreativo erli- quial imobilizado. Um acúmulo de reagente de detecção na zona de |i- gação indica a presença de anticorpos específicos para Ehrlichia na amostra.

[0084] Tipicamente, um ELISA de fluxo passante pode apresentar um reagente de detecção aplicado a uma tira de teste em um padrão, tal como uma linha, que pode ser lida visualmente. Tal como acontece com outros testes de fluxo lateral, a ausência de tal padrão geralmente indica um resultado negativo. Está dentro da capacidade de um versado na técnica selecionar uma quantidade do polipeptídeo imunorreativo er- liquial para imobilização na membrana que pode gerar um padrão visu- almente discernível quando a amostra biológica contém um nível de an- ticorpos que seria suficiente para gerar um sinal positivo em um ELISA de formato padrão. De preferência, a quantidade de peptídeo imobili- zado na membrana varia de cerca de 25 ng a cerca de 1 mg. C. Ensaios Baseados em Partículas

[0085] Em geral, os ensaios baseados em partículas usam um par- ceiro de captura — ligação, tal como um anticorpo ou um antígeno, no caso de um imunoensaio, revestido na superfície das partículas, tal como microesferas, cristais, chips ou nanopartículas. Os ensaios à base de partículas podem ser efetivamente multiplexados ou modificados para testar várias variáveis de interesse, incorporando partículas mar- cadas fluorescentemente ou partículas de tamanhos diferentes em um único ensaio, cada uma revestida ou conjugada a um ou mais parceiros de captura — ligação marcados. O uso de tecnologias de detecção e amplificação sensíveis com plataformas de ensaio baseadas em partí- culas conhecidas na técnica resultou em vários sistemas de ensaio fle- xíveis e sensíveis para escolher a realização de um método aqui des- crito. Por exemplo, um ensaio baseado em partículas multiplex, tal como o sistema de ensaio de arranjo de suspensão Bio-Plex€ disponível a partir de Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA) e Luminex, Inc. (Aus- tin, TX) pode ser útil na identificação de anticorpos para Ehrlichia em uma amostra.

[0086] Em um aspecto, a presente invenção considera a imobiliza- ção de um polipeptídeo imunorreativo erliquial isolado (por exemplo, na Tabela 1, Tabela 2, Tabela 3, Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104 ou Ecaj 0663) em uma superfície de uma partícula para uso em um imu- noensaio baseado em partículas. Conforme descrito neste documento, os métodos de imobilização de peptídeo em superfícies de suporte são bem conhecidos na técnica. Em uma modalidade preferencial, um poli- peptídeo imunorreativo marcado aqui descrito é imobilizado em uma su- perfície de uma partícula e o complexo de peptídeo — partícula é empre- gue em um ELISA ou em um ensaio de citometria de fluxo de acordo com protocolos estabelecidos. Vl. Composições de Vacina para Ehrlichia

[0087] Trabalhos anteriores mostraram que as proteínas erliquiais que induzem respostas de anticorpos podem fornecer respostas imunes protetoras; assim, em algumas modalidades, uma proteína erliquial for- necida neste documento (por exemplo, na Tabela 1, Tabela 2, Tabela 3, Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104 ou Ecaj 0663) pode ser incluída em uma composição farmacêutica, tal como uma composição de vacina para administração a um mamífero ou sujeito humano. Por exemplo, a proteção contra a infecção por E. chaffeensis foi demonstrada com an-

ticorpos específicos de epítopo direcionados a OMP e TRPs em mode- los in vitro e em modelos animais (Kuriakose e outros, 2012; Li e outros, 2002; Li e outros, 2001), demonstrando que as proteínas erliquiais que induzem fortes respostas de anticorpos a epítopos lineares são proteto- ras.

[0088] Em modalidades selecionadas, é considerado que um poli- peptídeo imunorreativo erliquial (por exemplo, da Tabela 1, Tabela 2, Tabela 3, Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, ou Ecaj 0663) pode estar compreendido em uma composição de vacina e administrado a um su- jeito (por exemplo, um humano ou cão) para induzir uma resposta imune protetora no sujeito que pode substancialmente prevenir ou melhorar a infecção no sujeito por um organismo Ehrlichia, tal como Ehrlichia chaf- feensis ou Ehrlichia canis. Uma composição de vacina para uso farma- cêutico em um sujeito pode compreender um polipeptídeo imunorreativo da Tabela 1, 2 ou 3 e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0089] As frases "farmacêutico", "farmaceuticamente aceitável" ou "farmacologicamente aceitável" referem-se a entidades moleculares e composições que não produzem uma reação adversa, alérgica ou outra reação adversa quando administradas a um animal, tal como, por exem- plo, um humano, conforme apropriado. Tal como aqui utilizado, "carre- ador farmaceuticamente aceitável" inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, tensoativos, antioxidantes, conser- vantes (por exemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotônicos, agentes de retardo de absorção, sais, conservantes, fármacos, estabilizadores de fármacos, géis, ligantes, excipientes, agentes de desintegração, lubrificantes, agentes adoçantes, agentes flavorizantes, corantes, tal como materiais e combinações dos mesmos, como seria conhecido por um versado na técnica (ver, por exemplo, Re- mington's Pharmaceutical Sciences, 18º Ed. Mack Printing Company, 1289 a 1329, 1990, aqui incorporado por referência). Exceto na medida em que qualquer carreador convencional seja incompatível com o ingre- diente ativo, o seu uso nas composições de vacina da presente inven- ção é considerado.

[0090] Tal como aqui utilizado, uma "resposta imune protetora" re- fere-se a uma resposta do sistema imune de um hospedeiro mamífero a um antígeno de Ehrlichia que resulta em maior reconhecimento do antígeno e produção de anticorpos pelo sistema imunológico do hospe- deiro mamífero após exposição a um patógeno Ehrlichia. Uma resposta imune protetora pode reduzir ou prevenir substancialmente os sintomas como um resultado de uma exposição subsequente a Ehrlichia chaffe- ensis ou Ehrlichia canis.

[0091] Em algumas modalidades, uma composição de vacina da presente invenção pode compreender um polipeptídeo imunorreativo (por exemplo, tendo uma sequência que tem pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identi- dade de sequência com um polipeptídeo listado na Tabela 1 ou mais preferencialmente na Tabela 2 ou na Tabela 3). Em algumas modalida- des, uma composição de vacina compreendendo o polipeptídeo imunor- reativo pode ser usada para induzir uma resposta imune protetora con- tra Ehrlichia chaffeensis ou Ehrlichia canis (por exemplo, em um sujeito humano ou cão).

[0092] Uma pessoa versada nas técnicas médicas apreciará que a quantidade de dosagem real de uma composição de vacina adminis- trada a um paciente animal ou humano pode ser determinada por fato- res físicos e fisiológicos, tal como peso corporal, gravidade da condição, o tipo de doença a ser tratada, intervenções terapêuticas anteriores ou concomitantes, idiopatia do paciente e via de administração. O médico responsável pela administração, em qualquer caso, determinará a con- centração de ingrediente(s) ativo(s) em uma composição e dose(s) apropriada(s) para o sujeito individual.

[0093] Em certas modalidades, as composições de vacina podem compreender, por exemplo, pelo menos cerca de 0,1% de um polipeptí- deo imunorreativo erliquial (por exemplo, da Tabela 1, Tabela 2, Tabela 3, Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104 ou Ecaj 0663). Em outras moda- lidades, o composto ativo pode compreender entre cerca de 2% a cerca de 75% do peso da unidade, ou entre cerca de 25% a cerca de 60%, por exemplo, e qualquer intervalo derivável do mesmo. Tal como acon- tece com muitas composições de vacina, a frequência de administração, bem como a dosagem, variará dentre os membros de uma população de animais ou humanos de maneiras que são previsíveis por um ver- sado na técnica de imunologia. A título de exemplo não limitante, as composições farmacêuticas e vacinas podem ser administradas por in- jeção (por exemplo, intracutânea, intramuscular, intravenosa ou subcu- tânea), intranasalmente (por exemplo, por aspiração) ou oralmente. Po- dem ser administradas entre 1 e 3 doses por um período de 1 a 36 se- manas. De preferência, são administradas 3 doses, em intervalos de 3 a 4 meses, e as vacinações de reforço podem ser administradas perio- dicamente.

[0094] Em algumas modalidades, uma "dose adequada" é uma quantidade de um polipeptídeo imunorreativo que, quando administrado conforme descrito acima, é capaz de aumentar uma resposta imune em um paciente imunizado suficiente para proteger o sujeito de uma infec- ção por Ehrlichia em exposições subsequentes a organismos Ehrlichia. Em geral, a quantidade de peptídeo presente em uma dose adequada (ou produzida in situ pelo ácido nucleico em uma dose) pode variar de cerca de 1 pg a cerca de 500 mg por kg de hospedeiro, tipicamente de cerca de 10 pg a cerca de 10 mg, preferencialmente de cerca de 100 pg a cerca de 1 mg e mais preferencialmente de cerca de 100 pg a cerca de 100 microgramas.

[0095] Uma composição de vacina da presente invenção pode com- preender diferentes tipos de carreadores, dependendo se deve ser ad- ministrada na forma sólida, líquida ou aerossol, e se precisa ser estéril para tais vias de administração como injeção. Uma composição de va- cina descrita neste documento pode ser administrada por via intramus- cular, intradérmica, subcutânea, intravenosa, intra-arterial, intraperito- neal, intralesional, intracraniana, intra-articular, intraprostática, intra- pleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarretal, tó- pica, intratumoral, intramuscular, intraperitoneal, subconjuntiva, intrave- sicular, mucosa, intrapericárdica, local, oral, intranasal ou por inalação, injeção, infusão, infusão contínua, lavagem ou perfusão localizada. Uma composição de vacina também pode ser administrada a um sujeito por meio de um cateter, em cremes, em composições de lipídios, por en- trega de partículas balísticas, ou por outro método ou qualquer combi- nação dos anteriores, como seria conhecido por um versado na técnica (ver, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21º Ed. Lippincott Williams e Wilkins, 2005, aqui incorporado por refe- rência).

[0096] Embora qualquer carreador adequado conhecido por aque- les versados na técnica possa ser empregue nas composições de va- cina desta invenção, o tipo de carreador variará dependendo do modo de administração. Para administração parentérica, tal como injeção sub- cutânea, o carreador compreende preferencialmente água, solução sa- lina, álcool, uma gordura, uma cera ou um tampão. Para administração oral, qualquer um dos carreadores acima ou um carreador sólido, tal como manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de só- dio, talco, celulose, glicose, sacarose e carbonato de magnésio, pode ser empregue. Microesferas biodegradáveis (por exemplo, galactídeo polilático) também podem ser empregues como carreadores para as composições farmacêuticas desta invenção. Microesferas biodegradá- veis adequadas são descritas, por exemplo, nas Patentes U.S.

4.897.268 e 5.075.109.

[0097] De particular interesse em um aspecto da presente invenção é uma composição de vacina que pode ser administrada por entrega transdérmica microestruturada ou de partículas balísticas. Microestrutu- ras como carreadores para formulação de vacina são uma configuração desejável para aplicações de vacinas e são amplamente conhecidas na técnica (por exemplo, Patentes U.S. 5.797.898, 5.770.219 e 5.783.208, e Pedido de Patente U.S. 2005/0065463). Tal composição de vacina formulada para entrega de partículas balísticas pode compreender um polipeptídeo imunorreativo isolado das Tabelas 1, 2, e 3 imobilizado em uma superfície de um substrato de suporte. Nessas modalidades, um substrato de suporte pode incluir, mas não está limitado a uma micro- cápsula, uma micropartícula, uma microesfera, uma nanocápsula, uma nanopartícula, uma nanosfera ou uma combinação das mesmas.

[0098] Microestruturas ou partículas balísticas que servem como substrato de suporte para um polipeptídeo imunorreativo erliquial des- crito neste documento podem ser constituídas por material biodegradá- vel e material não biodegradável, e tais substratos de suporte podem ser constituídos por polímeros sintéticos, sílica, lipídios, carboidratos, proteínas, lectinas, agentes iônicos, reticuladores e outros componentes de microestrutura disponíveis na técnica. Protocolos e reagentes para a imobilização de um peptídeo da invenção em um substrato de suporte composto por tais materiais estão amplamente disponíveis comercial- mente e na técnica.

[0099] Em outras modalidades, uma composição de vacina compre- ende um polipeptídeo imunorreativo imobilizado ou encapsulado (por exemplo, da Tabela 1, Tabela 2, Tabela 3, Ecaj 0919, Ecaj 0073,

Ecaj 0104 ou Ecaj 0663) e um substrato de suporte. Nessas modalida- des, um substrato de suporte pode incluir, mas não está limitado a uma microesfera lipídica, uma nanopartícula lipídica, um etossomo, um lipos- somo, um niossomo, um fosfolipídio, um esfingossomo, um tensoativo, um transferossomo, uma emulsão, ou uma combinação dos mesmos. À formação e o uso de lipossomos e outras formulações de nano e micro- carreadores lipídicos são geralmente conhecidos por aqueles versados na técnica, e o uso de lipossomos, micropartículas, nanocápsulas e si- milares ganharam uso difundido na entrega de produtos terapêuticos (por exemplo, US Patente 5.741.516, especificamente incorporada neste documento em sua totalidade por referência). Numerosos méto- dos de preparações de lipossomos e similares a lipossomos como po- tenciais carreadores de fármacos, incluindo encapsulação de peptídeos, foram revisados (Patentes U.S. 5.567.434; 5.552.157; 5.565.213;

5.738.868 e 5.795.587, cada uma das quais é especificamente incorpo- rada aqui em sua totalidade por referência).

[0100] Além dos métodos de entrega descritos neste documento, uma série de técnicas alternativas também é considerada para a admi- nistração das composições de vacina descritas. A título de exemplo não limitante, uma composição de vacina pode ser administrada por sono- forese (isto é, ultrassom) que foi usada e descrita na Patente U.S.

5.656.016 para aumentar a taxa e eficácia de permeação de fármaco em e através do sistema circulatório; injeção intraóssea (Patente U.S.

5.779.708), ou entrega controlada por feedback (Patente U.S.

5.697.899), e cada uma das patentes neste parágrafo é especificamente incorporada neste documento em sua totalidade por referência.

[0101] Qualquer um de uma variedade de adjuvantes pode ser em- pregue nas vacinas desta invenção para aumentar não especificamente a resposta imune. A maioria dos adjuvantes contém uma substância projetada para proteger o antígeno de catabolismo rápido, tal como hi- dróxido de alumínio ou óleo mineral, e um estimulador não específico de respostas imunes, tal como lipídio A, Bortadella pertussis ou Myco- bacterium tuberculosis. Os adjuvantes adequados estão disponíveis co- mercialmente como, por exemplo, Adjuvante Incompleto de Freund e Adjuvante Completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) e Ad- juvante 65 da Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.). Outros adjuvantes adequados incluem alúmen, microesferas biodegradáveis, monofosforil lipídio A e quil A.

[0102] Um polipeptídeo pode ser formulado em uma composição em uma forma neutra ou de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino |li- vres da proteína) e que são formados com ácidos inorgânicos, tal como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou com ácidos orgânicos, tal como acético, oxálico, tartárico, mandélico e similares. Os sais formados com os grupos carboxil livres também podem ser derivados de bases inorgânicas, tal como, por exemplo, sódio, potássio, amônio, cálcio ou hidróxidos férricos, e bases orgânicas como isopropilamina, trimetila- mina, histidina, procaína e similares.

[0103] Em qualquer caso, a composição pode compreender vários antioxidantes para retardar a oxidação de um ou mais componentes. Além disso, a prevenção da ação de micro-organismos pode ser reali- zada por conservantes, tal como vários agentes antibacterianos e anti- fúngicos, incluindo, mas não limitados a parabenos (por exemplo, metil- parabenos, propilparabenos), clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timero- sal ou combinações dos mesmos.

[0104] Soluções injetáveis estéreis são preparadas incorporando- se os peptídeos ativos na quantidade necessária no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados acima, conforme ne-

cessário, seguido por esterilização por filtração. Geralmente, as disper- sões são preparadas incorporando-se os vários ingredientes ativos es- terilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e / ou os outros ingredientes. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, suspensões ou emulsões, os métodos preferenciais de preparação são técnicas de secagem a vácuo ou de liofiização que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer in- grediente adicional desejado a partir de um meio líquido filtrado previa- mente estéril do mesmo. O meio líquido deve ser adequadamente tam- ponado se necessário, e o diluente líquido primeiro tornado isotônico antes da injeção com solução salina ou glicose suficiente. A preparação de composições altamente concentradas para injeção direta também é considerada, onde o uso de DMSO como solvente é planejado para re- sultar em penetração extremamente rápida, entregando altas concen- trações dos agentes ativos a uma pequena área.

[0105] A composição deve ser estável nas condições de fabricação e armazenamento, e preservada contra a ação contaminante de micro- organismos, tal como bactérias e fungos. Será apreciado que a conta- minação por endotoxina deve ser mantida minimamente a um nível se- guro, por exemplo, menos de 0,5 ng / mg de proteína.

[0106] Em modalidades particulares, a absorção prolongada de uma composição injetável pode ser provocada pelo uso nas composi- ções de agentes que retardam a absorção, tal como, por exemplo, mo- noestearato de alumínio, gelatina ou combinações dos mesmos. VII. Kits de Detecção de Erlichia e Vacinação

[0107] Várias modalidades da presente invenção referem-se a kits para a detecção de anticorpos em uma amostra que se ligam especifi- camente a um organismo Ehrlichia, tal como E. chaffeensis ou E. canis. Os kits podem, portanto, ser usados para o diagnóstico ou identificação de uma infecção por Ehrlichia em um sujeito. Em outras modalidades, a invenção fornece kits para determinar se um sujeito foi imunizado contra Ehrlichia ou está ativamente infectado com um organismo Ehrlichia. Em ainda outras modalidades, os kits são fornecidos para a vacinação de um sujeito contra a infecção por Ehrlichia chaffeensis e, em algumas modalidades, é antecipado que a composição pode ser usada para for- necer uma resposta imune protetora contra uma infecção por Ehrlichia canis.

[0108] Em modalidades selecionadas, um kit da presente invenção pode ser usado para executar um método aqui descrito. Por exemplo, um kit pode ser adequado para detectar anticorpos para Ehrlichia em uma amostra, para identificar um indivíduo com infecção por Ehrlichia, para determinar se um sujeito foi imunizado contra Ehrlichia ou está ati- vamente infectado com um organismo Ehrlichia, ou para vacinar um su- jeito contra um organismo Ehrlichia. Nessas modalidades, um ou mais peptídeos imunorreativos (por exemplo, da Tabela 1, 2 ou 3, ou um po- lipeptídeo com pelo menos cerca de 95% ou mais de identidade de se- quência com um polipeptídeo da Tabela 1, 2 ou 3; e / ou Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, Ecaj 0663 ou um polipeptídeo tendo pelo me- nos cerca de 95% ou mais identidade de sequência com Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, Ecaj 0663) podem estar incluídos no kit. O po- lipeptídeo imunorreativo erliquial no kit pode ser marcado de forma de- tectável ou imobilizado em uma superfície de um substrato de suporte também incluído no kit. O(s) polipeptídeo(s) imunorreativo(s) pode, por exemplo, ser fornecido no kit em uma forma adequada, tal como estéril, liofilizada ou ambas.

[0109] O substrato de suporte compreendido em um kit da invenção pode ser selecionado com base no método a ser executado. A título de exemplo não limitante, um substrato de suporte pode ser uma placa de vários poços ou microplaca, uma membrana, um filtro, um papel, uma emulsão, um grânulo, um microgrânulo, uma microesfera, uma nano-

esfera, uma nanosfera, uma nanopartícula, uma etossomo, um lipos- somo, um niossomo, um transferossomo, uma fita de medição, um car- tão, uma tira de celuloide, uma lâmina de vidro, uma microlâmina, um biossensor, um aparelho de fluxo lateral, um microchip, um pente, uma partícula de sílica, uma partícula magnética, ou uma monocamada de automontagem.

[0110] Conforme apropriado para o método a ser realizado, um kit pode compreender ainda um ou mais aparelhos para entrega de uma composição a um sujeito ou para o manuseio de uma composição da invenção. A título de exemplo não limitante, um kit pode incluir um apa- relho que é uma seringa, um conta-gotas, um aplicador de partículas balísticas (por exemplo, aplicadores descritos nas patentes US

5.797.898, 5.770.219 e 5.783.208 e no pedido de patente US 2005/0065463), uma colher, uma tampa de microlâmina, um suporte de tiras de teste ou tampa, e similares.

[0111] Um reagente de detecção para marcar um componente do kit pode opcionalmente ser incluído em um kit para realizar um método da presente invenção. Em modalidades particulares, o reagente de mar- cação ou detecção é selecionado a partir de um grupo que compreende reagentes comumente usados na técnica e incluindo, sem limitação, ele- mentos radioativos, enzimas, moléculas que absorvem luz na faixa de UV, e fluoróforos tal como fluoresceína, rodamina, auramina, Texas Red, AMCA blue e Lucifer Yellow. Em outras modalidades, é fornecido um kit que compreende um ou mais meios de recipiente e um agente de proteína BST já marcado com um reagente de detecção selecionado a partir de um grupo que compreende um elemento radioativo, uma en- zima, uma molécula que absorve luz na faixa de UV, e um fluoróforo.

[0112] Em modalidades particulares, a presente invenção fornece um kit para detectar anticorpos anti-Ehrlichia em uma amostra que tam- bém pode ser usado para a identificação de uma infecção por Ehrlichia em um sujeito, e / ou para determinar se um sujeito foi imunizado contra Ehrlichia ou está ativamente infectado com um organismo Ehrlichia. Esse kit pode compreender um ou mais polipeptídeos imunorreativos (por exemplo, da Tabela 1, 2 ou 3, ou tendo pelo menos cerca de 95% ou mais identidade de sequência com um polipeptídeo da Tabela 1, 2 ou 3; Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, ou Ecaj 0663), e os peptídeos podem ser marcados de forma detectável e imobilizados em um ou mais substratos de suporte incluídos no kit.

[0113] Em algumas modalidades, um kit compreende um polipeptí- deo imunorreativo da Tabela 1, 2 ou 3 ou tendo cerca de 95% ou mais identidade de sequência com o polipeptídeo das Tabelas 1, 2 ou 3. Em algumas modalidades, um kit compreende um polipeptídeo imunorrea- tivo compreendendo ou consistindo de Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104 ou Ecaj 0663. Os peptídeos podem ser imobilizados em um ou mais dispositivos de ensaio de fluxo lateral separados, tal como tiras de teste de nitrocelulose. Nessas modalidades, cada uma das tiras de teste pode compreender ainda um reagente de detecção, por exemplo, uma proteína A marcada com cromóforo. Tal kit pode compreender ainda um ou mais recipientes para material de amostra, um ou mais di- luentes para diluição de amostra, e um ou mais tiras indicadoras de con- trole para comparação.

[0114] Quando os reagentes e / ou componentes compreendendo um kit são fornecidos em uma forma liofilizada (liofilizado) ou como um pó seco, o liofilizado ou pó pode ser reconstituído pela adição de um solvente adequado. Em modalidades particulares, o solvente pode ser um tampão e / ou outro diluente estéril, farmaceuticamente aceitável. Prevê-se que tal solvente também pode ser fornecido como parte de um kit.

[0115] Quando os componentes de um kit são fornecidos em uma e / ou mais soluções líquidas, a solução líquida pode ser, a título de exemplo não limitante, uma solução aquosa estéril. As composições também podem ser formuladas em uma composição administrativa. Neste caso, o recipiente pode ser ele próprio uma seringa, pipeta, apli- cador tópico ou similar, a partir do qual a formulação pode ser aplicada a uma área afetada do corpo, injetada em um sujeito, e / ou aplicada ou misturada com os outros componentes do kit. IV. Exemplos

[0116] Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar mo- dalidades preferenciais da invenção. Deveria ser apreciado por aqueles versados na técnica que as técnicas descritas nos exemplos que se se- guem representam técnicas descobertas pelo inventor para funcionar bem na prática da invenção e, portanto, podem ser consideradas como constituindo modos preferenciais para sua prática. No entanto, aqueles versados na técnica devem, face à presente descrição, apreciar que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades específicas que são descritas e ainda obter um resultado similar ou similar sem abando- nar o espírito e o escopo da invenção. EXEMPLO 1

[0117] Identificação e Validação de Proteínas Imunorreativas

[0118] Proteínas de Ehrlichia chaffeensis (cepa de Arkansas) foram avaliadas pela primeira vez quanto à antigenicidade usando uma aborda- gem bioinformática usando ANTIGENpro (scratch.proteomics.ics.uci.edu). Todas as proteínas foram classificadas e separadas com base em seu escore de antigenicidade e função. As 100 principais proteínas hipotéti- cas foram clonadas no vetor plIVEX2.3d contendo uma etiqueta His e expressas por um ensaio de transcrição / tradução in vitro. As proteínas expressas foram capturadas usando placas de ELISA revestidas com anticorpo anti-His. Placas de anticorpo com etiqueta His pré-revestidas (GenScript % LO0440C) foram bloqueadas por 20 minutos em tempera- tura ambiente usando tampão de bloqueio (bloco inicial (PBS), tampão de bloqueio (Thermo, cat t 37538) + 2% de leite). As placas bloqueadas foram incubadas durante a noite a 4º C com etiqueta His anexada a proteínas hipotéticas de E. chaffeensis diluídas em tampão de diluição (tampão de diluição, bloco inicial (PBS) tampão de bloqueio (Thermo, cat 4 37538) + 2% de leite + 0,05% de Tween 20). As placas foram lavadas 4 vezes com tampão de lavagem (Tampão de Lavagem, PBS + Tween 20 a 0,05%) e soros HME-positivos diluídos 1:500 foram adicio- nados a cada poço (100 ul) seguido por agitação suave em temperatura ambiente durante 2 horas. As placas foram lavadas 4 vezes e anticorpo secundário de coelho anti-lgG humano (H + L) marcado com fosfato al- calino foi adicionado a cada poço (100 ul, diluição 1:10000) e incubado em temperatura ambiente por 1 hora com agitação suave. As placas foram lavadas 5 vezes e 100 uL de Substrato de Fosfatase BluePhos (KPL, cat % 50-88-05 e 50-88-06) foram adicionados a cada poço e in- cubados no escuro por 30 minutos em temperatura ambiente com agi- tação suave. A densidade óptica foi medida em Asso em leitor de micro- placa (VERSAmax, Molecular Devices). As leituras foram analisadas no software SoftMax Pro 6.5.1.

[0119] Um total de 100 proteínas hipotéticas de E. chaffeensis fo- ram triadas pelo método ELISA. As proteínas que tinham densidade óp- tica >= 0,3 por ELISA foram submetidas à triagem adicional por múltiplos soros HME-positivos (total de 6 amostras de soro) (Figura 1). Após a triagem, as proteínas que mostraram ELISA OD > 0,3 com múltiplos so- ros foram ainda testadas (Figura 2). As proteínas que mostraram 100% de reatividade a todos os soros e tinham uma densidade óptica 2 0,5 com pelo menos 4 soros, foram designadas como altamente imunorre- ativas (Figura 3). As proteínas que mostraram 100% de reatividade para todos os soros testados, mas os valores de ELISA OD entre 0,2 a 0,5, foram designadas como de imunorreatividade média (Figura 3). As pro- teínas que não reagiram a pelo menos 4 amostras de soro positivas para

HME foram excluídas. EXEMPLO 2 Proteínas Imunorreativas de Ehrlichia que Contêm Domínios Trans- membrana e Epítopos de Anticorpos Dependentes de Conformação Materiais e Métodos

[0120] Previsão de antigenicidade de proteínas de E. chaffeensis: À antigenicidade de todas as proteínas de E. chaffeensis foi prevista pelo SCRATCH Protein Predictor ANTIGENpro, que é um preditor de antige- nicidade proteica baseado em sequência e sem alinhamento. As previ- sões são feitas por uma arquitetura de dois estágios baseada em várias representações da sequência primária e cinco algoritmos de aprendi- zado de máquina. Um escore final (O — 1) resume a previsão resultante da probabilidade antigênica, com um escore mais alto significando uma probabilidade antigênica mais alta.

[0121] A amplificação por PCR dos genes de Ehrlichia: E. chaffeen- sis (cepa Arkansas) ou E. canis (cepa Jake) foi propagada e purificada como descrito anteriormente. As frações contendo bactérias foram con- geladas e utilizadas para preparação de DNA. Os oligonucleotídeos principais para a amplificação dos fragmentos do gene de Ehrlichia fo- ram concebidos manualmente ou por PrimerSelect (Lasergene v13.0, DNAStar, Madison, WI) de acordo com as sequências no GenBank e sintetizados (Integrated DNA Technologies, Coralville, lowa). As PCRs foram realizadas com PCR HotMaster Mix (Eppendorf, Westbury, NY) usando DNA genômico de E. chaffeensis ou E. canis como modelo. O perfil do ciclo térmico foi: 95º C por 3 min, 30 ciclos de 94º C por 30 s, temperatura de recozimento (1º C menor que a Tm do iniciador mais baixa) por 30 s, e 72º C para o tempo de extensão apropriado (1 min / 1000 pares de bases) seguido por uma extensão de 72º C por 10 min e uma espera de 4º C.

[0122] Expressão das proteínas recombinantes de E. chaffeensis por transcrição e tradução in vitro (IVTT): A expressão de proteínas de E. chaffeensis foi realizada usando o kit RTS 100 E. coli HY (5 PRIME, Alemanha) ou o sistema de expressão de proteína de alto rendimento S30 T7 (Promega, Madison, WI), o sistema de síntese de proteína livre de células à base de extrato de E. coli, que pode produzir altos níveis de proteínas recombinantes em 1 h. Resumidamente, as sequências de DNA de E. chaffeensis foram clonadas no vetor pl VEX-2.3d ou pET-14b contendo o promotor / terminador T7 e uma sequência etiqueta 6His, e o plasmídeo recombinante foi misturado com um extrato de E. colie uma pré-mistura de reação que contém todos componentes necessários para a transcrição e tradução, tal como T7 RNA polimerase e maquina- ria ribossômica, seguido de incubação a 30º C por 4 h (para o kit 5 PRIME) ou 37º C por 1 h (para o kit Promega). A expressão da proteína foi confirmada por dot blot usando um anticorpo 6His marcado com pe- roxidase de rábano (HRP) (Thermo Fisher). Os produtos de IVTT foram usados diretamente para análise de imunorreatividade ou purificados usando o sistema de purificação de proteínas MagneHis (Promega).

[0123] Expressão e purificação dos ortólogos de E. canis recombi- nantes: Todas as proteínas de E. canis foram clonadas e expressas pelo sistema de expressão pBAD / Tio-TOPO (Invitrogen) e purificadas sob condições nativas ou desnaturantes usando resina de afinidade de me- tal TALON (Clontech) como descrito anteriormente.

[0124] Peptídeos sintéticos: Para proteínas de E. chaffeensis, os peptídeos sobrepostos foram sintetizados comercialmente por Bio- Synthesis (Lewisville, TX) ou Biomatik (Wilmington, DE). Todos os pep- tídeos foram fornecidos como um pó liofilizado e ressuspensos em água de grau de biologia molecular (1 mg / ml).

[0125] Antissoros: O soro de cão anti-E. chaffeensis convalescente foi obtido a partir de um cão infectado experimentalmente (no. 2251). Os soros de pacientes com HME foram presentes gentis dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (Atlanta, GA), de Vanderbilt Uni- versity (Nashville, TN), de Washington State University (Pullman, WA) e de St. Louis Children's Hospital (St. Louis, MO). Os soros de cães anti- E. canis foram obtidos a partir de cães infectados experimentalmente com E. canis como descrito anteriormente ou de cães naturalmente in- fectados de Focus Technologies (Cypress, CA).

[0126] Eletroforese em gel e Western immunoblotting: Proteínas re- combinantes purificadas foram separadas por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio - poliacrilamida (SDS-PAGE) e transferidas para nitrocelulose, e Western immunoblotting foi realizado conforme descrito anteriormente, exceto que os soros primários de cães foram diluídos 1:100, soros humanos foram diluídos 1:200, e antissoros de coelho fo- ram diluídos 1:1.000.

[0127] Ensaio de imunossorção ligado à enzima (ELISA): O ELISA foi realizado para determinar a imunorreatividade de proteínas recombi- nantes de Ehrlichia e peptídeos sintéticos. Para produtos de IVTT, a placa de anticorpo de etiqueta His (GenScript, Piscataway, NJ) foi usada para ligação específica de proteínas recombinantes. Resumidamente, as placas de ELISA foram bloqueadas com 100 ul de tampão de blo- queio StartingBlock (Thermo Fisher) com 2% de leite desnatado por 20 min e lavadas duas vezes com 200 ul de solução salina tamponada com fosfato contendo 0,05% (em volume) de Tween 20 (PBST, pH 7,2). As placas foram revestidas com 50 ul de proteínas de Ehrlichia expressas em IVTT diluídas (1:50) no tampão de diluição (tampão de bloqueio Star- tingBlock com 2% de leite e 0,05% de Tween) cada poço e incubadas durante a noite a 4º C. Os poços foram lavados cinco vezes com PBST. Soros humanos diluídos (1: 200) no tampão de diluição foram adiciona- dos a cada poço (50 ul) e incubados por 1 h. As placas de ELISA foram lavadas cinco vezes e 50 ul de anticorpo secundário de coelho anti-lgG

(H + L) marcado com fosfatase alcalina (Abpcam, Cambridge, MA) diluí- dos (1:5.000) no tampão de diluição foram adicionados e incubados por 1 h. Após as lavagens finais (5 x), o substrato de fosfatase BluePhos (100 ul; Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) foi adicio- nado e as placas foram incubadas no escuro por 30 min e o desenvol- vimento da cor foi determinado em um leitor de microplacas VersaMax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) em Asso e dados analisados por SoftmaxPro v7.0 (Molecular Devices). Todas as incubações foram rea- lizadas em temperatura ambiente com agitação suave, se não especifi- cado. Para os peptídeos sintéticos, foi utilizada a placa Nunc MaxiSorp (Thermo Fisher) e o ELISA foi realizado conforme descrito anterior- mente. As leituras de densidade óptica (OD) representam a OD média para três poços (+ desvios padrão) após subtrair a leitura do controle negativo. Uma vez que os controles negativos geralmente tinham leitu- ras brutas de < 0,08 OD, um limite de amostra positivo foi definido em > 0,1 OD após subtrair a leitura do controle negativo, com 0,1-0,5 OD con- siderado como positivo e > 0,5 OD como um forte positivo.

[0128] Ensaio de anticorpo com fluorescência indireta (IFA): O es- tado do anticorpo anti-E. chaffeensis em soros de pacientes com HME e do anticorpo anti-E. canis em soros de cães CME foi determinado con- forme descrito anteriormente. Lâminas de antígeno foram preparadas a partir de células THP-1 infectadas com E. chaffeensis (Arkansas) ou cé- lulas DH82 infectadas com E. canis (Jake). Os soros foram diluídos duas vezes em PBS, começando em 1:100.

[0129] Estatística: A diferença estatística entre os grupos experi- mentais foi avaliada com o teste t de Student bicaudal, e a significância foi indicada por um valor P < 0,05.

[0130] Números de etiqueta de locus de genes de Ehrlichia: Os nú- meros de etiqueta de locus de genes para as proteínas de E. chaffeensis ou E. canis neste estudo estavam previamente disponíveis nos Integra- ted Microbial Genomes.

Resultados

[0131] Previsão de antigenicidade do proteoma de E. chaffeensis por ANTIGENpro: A antigenicidade de todas as 1156 proteínas de E. chaffeensis (cepa Arkansas) foi prevista pelo preditor de proteína SCRATCH ANTIGENpro. Os resultados mostraram que o escore final da possibilidade antigênica de todas as proteínas de E. chaffeensis va- riou de 0,01 a 0,969, e as 250 principais proteínas tiveram um escore acima de 0,695. Algumas proteínas imunorreativas principais conheci- das na lista das 250 principais proteínas incluíram TRP47 (Ech 0166; classificação no. 30; escore = 0,908), TRP120 (Ech 0039; no. 100; es- core = 0,838) e p28 (Ech 1144; no. 158; escore = 0,776), indicando a eficácia e a validade da previsão de antigenicidade por ANTIGENpro. Dentre essas 250 proteínas de E. chaffeensis, 93 proteínas incluindo TRP47 foram anotadas como hipotéticas sem qualquer função putativa pelo banco de dados IMG. Este estudo se concentrou nessas 93 prote- ínas hipotéticas, que foram denominadas proteínas A1-A93 de acordo com o escore de antigenicidade (de alto a baixo), com TRP47 como proteína A23 (Tabela 6).

[0132] Triagem de imunorreatividade de proteínas hipotéticas de E. chaffeensis: Para a triagem das proteínas imunorreativas, usou-se o sis- tema de transcrição e tradução in vitro (IVTT) para expressar 93 proteí- nas hipotéticas (A1-A93) de E. chaffeensis que estavam dentre as 250 principais proteínas antigênicas de acordo com a previsão de ANTIGEN- pro. No total, o gene de 90 proteínas foi clonado no vetor para IVTT com Sucesso e expresso respectivamente. Para confirmar a expressão, 17 proteínas foram selecionadas aleatoriamente e detectadas por dot blot usando anticorpo anti-His. A expressão de todas as proteínas foi detec- tável, apesar dos níveis de expressão diferenciais com a proteína A83 o mais baixo (Figura 4A). A proteína de controle negativo expressa por IVTT não foi detectável. As outras três proteínas (A3, A67 e A92) não foram expressas devido à clonagem malsucedida. A imunorreatividade de todas as 90 proteínas expressas foi examinada por ELISA com o soro de um paciente com HME (tSandra), que tinha o anticorpo detectável de E. chaffeensis por IFA (titulação 1:1600) e foi efetivamente usado na publicação anterior. No total, 45 (50%) proteínas reagiram com o soro do paciente (OD > 0,1), e nove (10%) proteínas reagiram fortemente com o soro do paciente (OD > 0,5), incluindo A4, A5, A21, A23, A3A4, ABA, A63, A75 e A77 (Figura 4B). Assim, essas 45 proteínas foram con- sideradas candidatas a novas proteínas imunorreativas de E. chaffeen- sis e foram investigadas posteriormente. O soro do paciente ou cão anti- E. chaffeensis não reconheceu a proteína de controle negativo expressa por IVTT (OD bruto < 0,08).

[0133] Determinação da imunorreatividade de 45 proteínas hipoté- ticas de E. chaffeensis: A fim de determinar e comparar a imunorreativi- dade dessas 45 novas proteínas imunorreativas de E. chaffeensis, o ELISA foi realizado com um painel de 10 soros de pacientes com HME que tinham anticorpos para E. chaffeensis por IFA (titulações de 1:100 a 3200). Descobriu-se que 14 (31%) das 45 proteínas foram reconheci- das por todos os 10 soros de pacientes e 15 (33%) proteínas foram re- conhecidas por pelo menos oito soros, enquanto todas essas 15 prote- Ínas reagiram fortemente com pelo menos três soros de pacientes (OD > 0,5) e 11 (24%) proteínas reagiram fortemente com pelo menos seis soros, demonstrando que essas 15 proteínas eram novas proteínas imu- norreativas de E. chaffeensis (Figura 5). Todos os soros dos pacientes não reconheceram o controle negativo expresso a partir de IVTT (OD bruto < 0,08). Para comparar a imunorreatividade de novas proteínas imunorreativas de E. chaffeensis com TRPs imunorreativos principais bem definidos, também clonou-se e expressou-se TRP32, TRP47 e

TRP120 por IVTT, e 10 soros de pacientes com HME foram usados para detectar a imunorreatividade de TRPs. Os resultados mostraram que, de acordo com as publicações anteriores, todos os três TRPs reagiram fortemente com a maioria dos soros de pacientes e, particularmente, TRP32 e TRP120 reagiram fortemente com nove e oito soros de paci- entes, respectivamente (Figura 5). Algumas proteínas, tal como A56, A62, A77, A5O, A19 e A51, reagiram fortemente com anticorpos na mai- oria dos soros dos pacientes em um nível comparável aos TRPs, por- tanto, foram consideradas as principais proteínas imunorreativas de E. chaffeensis. A Tabela 4 mostra uma lista de 15 novas proteínas imunor- reativas de E. chaffeensis e suas características, com a classificação de imunorreatividade prevista pelas reações com soros de pacientes. Além disso, descobriu-se que dentre essas 15 proteínas, 10 (67%) eram de pequeno tamanho (< 22 kD), e 10 (67%) foram previstas como proteínas de membrana pelo servidor TMHMM 2.0, sugerindo que essas novas proteínas imunorreativas de Ehrlichia são proteínas de membrana pre- dominantemente pequenas.

[0134] Determinação da imunorreatividade conformacional de no- vas proteínas imunorreativas de E. chaffeensis: A fim de determinar a dependência conformacional da imunorreatividade de novas proteínas imunorreativas de E. chaffeensis, comparou-se a imunorreatividade de proteínas nativas (produtos de IVTT) com a de proteínas desnaturadas (Produtos de IVTT tratados com ureia) por ELISA com soros de 10 pa- cientes com HME. Após a desnaturação, três novas proteínas imunor- reativas, incluindo A19, A51 e A83, não reagiram com nenhum soro do paciente; seis proteínas, incluindo A56, A6, A77, A50, A73 e A36, rea- giram fracamente com 1 — 3 soros de paciente; cinco proteínas, inclu- indo A14, A63, A34, A9 e A42, ainda reagiram com a maioria dos soros dos pacientes, mas em um nível substancialmente inferior em compara-

ção com as proteínas IVTT nativas; a proteína A25 ainda reagiu forte- mente com o soro f 2 do paciente, mas não reagiu com nenhum outro soro. No entanto, a imunorreatividade de três TRPs principais imunorre- ativos bem definidos, incluindo TRP32, TRP47 e TRP120, não foi redu- zida substancialmente após desnaturação, consistente com a conclusão anterior de que os TRPs contêm epítopos principais contínuos (Figura 6A). Assim, este resultado indicou que a imunorreatividade da maioria dessas novas proteínas imunorreativas de E. chaffeensis eram depen- dentes da conformação e a maioria dos epítopos nessas proteínas eram descontínuos.

[0135] Peptídeos sintéticos também foram usados para confirmar se novas proteínas imunorreativas de E. chaffeensis contêm o epítopo linear. Polipeptídeos sobrepostos foram sintetizados para cobrir a se- quência de todas as 15 novas proteínas imunorreativas de E. chaffeen- sis, exceto para A83 e A36. Todos os peptídeos tinham 20 a 25 amino- ácidos de comprimento (exceto o último peptídeo cobrindo o C terminal de cada proteína) e 6 aminoácidos sobrepostos uns aos outros. Um soro de paciente (ttSandra) foi usado para reagir com todos os peptídeos por ELISA. Um peptídeo (A14-2) para a proteína A14 reagiu fracamente com o soro do paciente, enquanto quatro peptídeos (A63-3, 5, 12 e 21) para a proteína A63 reagiram fracamente e um peptídeo (A63-11) reagiu fortemente com o soro do paciente. Dois peptídeos (A34-14 e 15) para a proteína A34 reagiram fracamente e um peptídeo (A34-1) reagiu for- temente com o soro do paciente. Todos os peptídeos sintéticos para outras proteínas não reagiram com o soro do paciente, sugerindo que a maioria dessas novas proteínas imunorreativas de E. chaffeensis não contém epítopo linear, consistente com estes dados de ELISA com pro- dutos de IVTT nativos e desnaturados (Figura 6B).

[0136] Imunorreatividade de ortólogos de E. canis de proteínas imu-

norreativas hipotéticas de E. chaffeensis: Uma vez que foram encontra- dos vários pares de ortólogos de E. chaffeensis / E. canis, tal como TRP19/TRP32, TRP36 / TRP47, TRP75/TRP95 e TRP120 / TRP140, são ambas as principais proteínas imunorreativas de Ehrlichia, os ortó- logos de E. canis das proteínas A1-A93 de E. chaffeensis foram anali- sados. Foi encontrado um total de 25 ortólogos de E. canis de proteínas A de E. chaffeensis com imunorreatividade, conforme identificado na Fi- gura 1. Estes ortólogos de E. canis foram expressos e purificados a par- tir de E. coli, e uma triagem de Western blot mostrou que 12 ortólogos de E. canis selecionados reagiram com um soro de cão anti-E. canis (no. 2995) (dados não mostrados). A imunorreatividade de 12 ortólogos de E. canis foi ainda determinada e comparada com TRP19, uma pro- teína imunorreativa principal bem documentada de E. canis, por ELISA com um painel de soros de 10 cães com CME (Figura 7). Descobriu-se que as proteínas Ecaj 0919 e Ecaj 0073 reagiram fortemente com to- dos os 10 soros de cães como TRP19, portanto, essas 2 proteínas fo- ram consideradas as principais proteínas imunorreativas de E. canis. As proteínas Ecaj 0104, Ecaj 0663 e Ecaj 0881 reagiram fortemente com a maioria dos 10 soros de cães, e outras 7 proteínas também reagiram com a maioria dos soros de cães, então todos os 12 ortólogos de E. canis de proteínas de E. chaffeensis são imunorreativos (Figura 7). Mas pares de ortólogos conservados de E. chaffeensis e E. canis não têm necessariamente imunorreatividade equivalente (Tabela 4 e Tabela 5). A Tabela 5 mostra uma lista de 12 ortólogos de E. canis de proteínas hipotéticas imunorreativas de E. chaffeensis, classificados por imunor- reatividade detectada por ELISA com soros de cães CME. No total, 6 de 12 (50%) proteínas são de tamanho pequeno (< 22 kD).

[0137] Nesses experimentos, as proteínas de E. chaffeensis que fo- ram identificadas exibiram a imunorreatividade com soros de pacientes com HME ou cães CME, incluindo 15 proteínas de E. chaffeensis e 12 ortólogos de E. canis. Notavelmente, muitas novas proteínas imunorre- ativas principais de Ehrlichia foram encontradas para conter domínios transmembrana. Anteriormente, os principais epítopos de anticorpos contínuos de TRPs foram mapeados para a região TR central em todos os TRP's, indicando que os domínios TR erliquiais são alvos da resposta imune humoral do hospedeiro. A associação desses domínios trans- membrana com a resposta imune do hospedeiro é interessante e única e, para o conhecimento dos inventores, não foi descrita em relação a qualquer outro patógeno; entretanto, o papel específico desses domí- nios na patobiologia ou imunidade erliquial ainda é desconhecido.

[0138] Curiosamente, a maioria das novas proteínas imunorreativas principais de E. chaffeensis revelaram-se pequenas proteínas contendo epítopo conformacional. Apenas alguns epítopos conformacionais fo- ram mapeados em TRP's e a resposta do hospedeiro aos epítopos prin- cipais contínuos em proteínas imunodominantes erliquiais é forte, suge- rindo a ausência de epítopos conformacionais dominantes. Sem desejar estar limitado a nenhuma teoria, isso pode ser devido aos métodos an- teriores usados para identificação de proteínas, tal como SDS-PAGE e Western blot, durante os quais pequenas proteínas facilmente ficam sem gel regular e proteínas geralmente perdem a conformação após desnaturação. Assim, pode haver outros epítopos conformacionais as- sociados às proteínas imunorreativas principais previamente identifica- das que não foram determinadas. Da mesma forma, a identificação adi- cional de proteínas ortólogas de E. canis expressas por IVTT poderia fornecer mais epítopos conformacionais.

[0139] Além disso, os inventores observaram que os pares ortólo- gos conservados de E. chaffeensis e E. canis não têm necessariamente imunorreatividade equivalente, sugerindo que proteínas homólogas po- dem desempenhar papéis diferentes em Ehrlichia. Alguns novos pares de ortólogos de E. chaffeensis e E. canis são as principais proteínas imunorreativas, tal como Ech 0846 (A56) e Ecaj 0242, Ech 1053 (A77) e Ecaj 0846. Em contraste, as proteínas Ecaj 0919 e Ecaj 0073 reagi- ram fortemente com todos os 10 soros de cães como TRP19, mas seus ortólogos Ech 1147 (A2) e Ech 0122 (A78) não são identificados como proteínas imunorreativas principais.

Da mesma forma, as proteínas Ech 0535 (A14) e Ech 0181 (A73) reagiram com todos os 10 soros de pacientes, mas seus ortólogos Ecaj 0500 e Ecaj 0122 não são identifi- cados como proteínas imunorreativas principais (Tabela 5 e Tabela 6). Além disso, algumas das novas proteínas imunorreativas principais de Ech 0700 (A50) e proteínas Ech 0578 (A62) de E. chaffeensis não têm ortólogos em E. canis.

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TABELA 6. Uma lista de 93 proteínas hipotéticas de E. chaffeensis (Ar- kansas) com potencial antigenicidade prevista por ANTIGENpro (escore de antigenicidade > 0,695). No. — Ech tagno.

Escorede Antigenicidade Tamanho(AA) 1 018 0969 56 0

2 1147 0,964 126

3 0247 0,958 302

4 0261 0,956 264

0255 0,950 338

6 0253 0,950 189

7 0865 0,949 302

8 1152 0,949 185

9 0722 0,945 190

0246 0,944 275

E 0257 0,943 226

12 0609 0,935 301

13 0601 0,929 374

14 0535 0,928 186

0251 0,928 205

16 0576 0,924 98

7 0150 0,923 672

18 1037 0,920 1231

19 0745 0,920 118

0864 0,918 330

21 0825 0,917 380

22 0113 0,909 793

23 0166 (TRP47) 0,908 285

24 0862 0,907 403

0531 0,905 175

26 0285 0,895 181

TT OM 08 AB 28 0612 0,888 208 29 0879 0,885 815 0147 0,885 193 31 0611 0,880 229 32 1036 0,880 750 33 0525 0,879 666 34 0252 0,875 364 0118 0,873 30 36 0807 0,864 334 37 0348 0,862 202 38 0763 0,860 165 39 0106 0,858 7183 40 1154 0,857 135 41 0120 0,857 213 42 0240 0,857 158 43 1148 0,854 142 44 0243 0,853 293 45 0284 0,852 1016 46 0115 0,851 203 47 0345 0,850 294 48 0878 0,847 409 49 1021 0,845 219 50 0700 0,845 192 51 0607 0,844 322 52 0377 0,843 104 53 0549 0,842 195 54 0614 0,839 231 55 1103 0,830 223

B6 OBM OBA IA 57 0199 0,823 213 58 0108 0,819 825 59 0551 0,811 191 60 1027 0,804 34 61 0663 0,802 202 62 0578 0,798 185 63 0716 0,790 367 64 0778 0,786 1132 65 1013 0,785 203 66 0398 0,781 121 67 0991 0,779 710 68 0927 0,775 34 69 0949 0,773 31 70 0259 0,773 118 TI 0704 0,771 248 72 0256 0,770 72 73 0181 0,769 103 74 0297 0,769 272 75 0388 0,768 293 76 0159 0,767 507 TT 1053 0,763 193 78 0122 0,758 126 79 0593 0,758 382 80 0698 0,758 200 81 0079 0,756 134 82 0986 0,752 179 83 0715 0,748 551 84 0279 0,747 41

86 0281 0,716 179 87 0276 0,716 184 88 0526 0,715 495 89 0478 0,704 172 90 0126 0,704 334 91 0866 0,703 330 92 0945 0,699 1349 93 0767 0,695 621

[0140] Todos os métodos descritos e reivindicados neste docu- mento podem ser feitos e executados sem experimentação indevida face à presente descrição. Embora as composições e métodos desta invenção tenham sido descritos em termos de modalidades preferenci- ais, será evidente para aqueles versados na técnica que variações po- dem ser aplicadas aos métodos e nas etapas ou na sequência de etapas do método descrito aqui, sem abandonar o conceito, o espírito e o es- copo da invenção. Mais especificamente, será evidente que certos agentes que são química e fisiologicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentes descritos neste documento, enquanto os mesmos resultados ou resultados similares seriam alcançados. Todos esses substitutos e modificações similares evidentes para os versados na técnica são considerados como estando dentro do espírito, escopo e conceito da invenção conforme definido pelas reivindicações em anexo.

REFERÊNCIAS

[0141] As referências a seguir, na medida em que fornecem proce- dimentos exemplificativos ou outros detalhes complementares aos aqui estabelecidos, são especificamente incorporadas neste documento por referência.

Patente U.S. 4.373.932

Patente U.S. 4.220.450 Patente U.S. 4.897.268 Patente U.S. 4.472.509 Patente U.S. 4.938.948 Patente U.S. 5.075.109 Patente U.S. 5.440.013 Patente U.S. 5.446.128 Patente U.S. 5.470.723 Patente U.S. 5.470.932 Patente U.S. 5.543.504 Patente U.S. 5.552.157 Patente U.S. 5.565.213 Patente U.S. 5.567.434 Patente U.S. 5.618.914 Patente U.S. 5.656.016 Patente U.S. 5.670.155 Patente U.S. 5.697.899 Patente U.S. 5.738.868 Patente U.S. 5.741.516 Patente U.S. 5.770.219 Patente U.S. 5.779.708 Patente U.S. 5.783.208 Patente U.S. 5.795.587 Patente U.S. 5.797.898 Patente U.S. 5.840.833 Patente U.S. 5.853.744 Patente U.S. 5.859.184 Patente U.S. 5.891.506 Patente U.S. 5.929.237 Patente U.S. 6.136.610

Patente U.S. 6.210.708 Patente U.S. 6.372.445 Patente U.S. 6.617.142 Patente U.S. 6.875.750 Patente U.S. 6.951.765 Patente U.S. 7.163.677 Patente U.S. 7.282.194 Patente U.S. 7.344.893 Patente U.S. 7.371.582 Pedido de Patente U.S. 2005/0047972 Pedido de Patente U.S. 2005/0065463 Pedido de Patente U.S. 2005/0250141 Pedido de Patente U.S. 2007/0264664 Pedido de Patente U.S. 2009/0005535 Carpino et a/., Org.

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Claims (86)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para detectar anticorpos que se ligam especifica- mente a um organismo Ehrlichia em uma amostra de teste, caracteri- zado pelo fato de que compreende: (a) colocar em contato um polipep- tídeo isolado da Tabela 1, Tabela 2 ou Tabela 3 ou um polipeptídeo tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com o mesmo, com a amostra de teste, em condições que permitem a formação de comple- xos de peptídeo-anticorpo; (b) detectar os complexos de peptídeo-anti- corpo; em que a detecção dos complexos de peptídeo-anticorpo é uma indicação de que anticorpos específicos para um organismo Ehrlichia estão presentes na amostra de teste, e em que a ausência dos comple- xos de peptídeo-anticorpo é uma indicação de que anticorpos especiífi- cos para um organismo Ehrlichia não estão presentes na amostra de teste.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que con- siste de um polipeptídeo da Tabela 2.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que con- siste de um polipeptídeo da Tabela 3.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o organismo Ehrlichia é um orga- nismo Ehrlichia chaffeensis.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a etapa de detecção compreende realizar um imunoensaio ligado à enzima, um radioimunoensaio, uma imunoprecipitação, um imunoensaio de fluorescência, um ensaio quimi- luminescente, um ensaio de imunotransferência, um ensaio de fluxo la- teral, um ensaio de citometria de fluxo, um imunoensaio multiplex, um ensaio de espectrometria de massas ou um ensaio baseado em partí- culas.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a etapa de detecção compreende um ensaio de fluxo lateral ou um imunoensaio ligado à enzima, em que o imunoensaio |i- gado à enzima é um ELISA.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 4 a 6, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo isolado é A77 (SEQ ID NO: 22), A62 (SEQ ID NO: 17), A56 (SEQ ID NO: 16), A19 (SEQ ID NO: 6), A50 (Ech 0700; SEQ ID NO: 28), A51 (SEQ ID NO: 13), A14 (SEQ ID NO: 4), A63 (SEQ ID NO: 18), A34 (SEQ ID NO: 9), A9 (SEQ ID NO: 3) ou A42 (Ech 0240; SEQ ID NO: 11).

8. Método para identificar uma infecção por Ehrlichia em um sujeito mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) colo- car em contato uma amostra biológica do sujeito com um polipeptídeo isolado da Tabela 1, Tabela 2 ou Tabela 3 sob condições que permitem a formação de complexos de peptídeo-anticorpo; e (b) detectar os com- plexos de peptídeo-anticorpo; em que a detecção dos complexos de peptídeo-anticorpo é uma indicação de que o sujeito tem uma infecção por Ehrlichia.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que con- siste da Tabela 2.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que con- siste da Tabela 3.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que a etapa de detecção compreende realizar um imunoensaio ligado à enzima, um radioimunoensaio, uma imunoprecipitação, um imunoensaio de fluorescência, um ensaio de qui- miluminescência, um ensaio de imunotransferência, um ensaio de fluxo lateral, um ensaio de citometria de fluxo, um imunoensaio multiplex, um teste de fita, ou um ensaio baseado em partículas.

12. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um ser humano.

13. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um cão.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 ou 11 a 13, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo isolado é A77 (SEQ ID NO: 22), A62 (SEQ ID NO: 17), A56 (SEQ ID NO: 16), A19 (SEQ ID NO: 6), A50 (Ech 0700; SEQ ID NO: 28), A51 (SEQ ID NO: 13), A14 (SEQ ID NO: 4), A63 (SEQ ID NO: 18), A34 (SEQ ID NO: 9), A9 (SEQ ID NO: 3) ou A42 (Ech 0240; SEQ ID NO: 11).

15. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de que com- preende uma sequência da Tabela 1, Tabela 2 ou Tabela 3, em que o peptídeo isolado é imobilizado na superfície de um substrato de suporte.

16. Método, como definido na reivindicação 15, caracteri- zado pelo fato de que o polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste da Tabela 2.

17. Método, como definido na reivindicação 15, caracteri- zado pelo fato de que o polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste da Tabela 3.

18. Peptídeo, como definido em qualquer uma das reivindi- cações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que o substrato de suporte compreende látex, poliestireno, náilon, nitrocelulose, celulose, sílica, agarose ou resina magnética.

19. Peptídeo, como definido em qualquer uma das reivindi- cações 15 a 18, caracterizado pelo fato de que o substrato de suporte é uma câmara de reação, um poço, uma membrana, um filtro, um papel,

uma emulsão, um grânulo, uma microesfera, uma fita, um cartão, um lâmina de vidro, um aparelho de fluxo lateral, um microchip, um pente, uma partícula de sílica, uma partícula magnética, uma nanopartícula ou uma monocamada de automontagem.

20. Peptídeo, como definido em qualquer uma das reivindi- cações 15 a 19, caracterizado pelo fato de que o peptídeo está compre- endido em um kit.

21. Peptídeo, como definido em qualquer uma das reivindi- cações 15 a 19, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é produzido por meio da síntese de peptídeos ou transcrição e tradução in vitro (IVTT).

22. Peptídeo, como definido em qualquer uma das reivindi- cações 15 a 19, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é produzido de forma recombinante.

23. Método, como definido em qualquer uma das reivindica- ções 15 ou 18 a 22, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo iso- lado é A77 (SEQ ID NO: 22), A62 (SEQ ID NO: 17), A56 (SEQ ID NO: 16), A19 (SEQ ID NO: 6), A50 (Ech 0700; SEQ ID NO: 28), A51 (SEQ ID NO: 13), A14 (SEQ ID NO: 4), A63 (SEQ ID NO: 18), A34 (SEQ ID NO: 9), A9 (SEQ ID NO: 3) ou A42 (Ech 0240; SEQ ID NO: 11).

24. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de que com- preende uma sequência da Tabela 1, Tabela 2 ou Tabela 3, em que o peptídeo isolado é covalentemente ligado a um marcador detectável.

25. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 24, caracte- rizado pelo fato de que o polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste da Tabela 2.

26. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 24, caracte- rizado pelo fato de que o polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste da Tabela 3.

27. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 24 a 26, caracterizado pelo fato de que o marcador detectável é um marcador fluorescente, um marcador radioativo, um marcador enzi- mático ou uma nanopartícula luminescente.

28. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 27, caracte- rizado pelo fato de quea nanopartícula luminescente é uma nanopartí- cula de terra rara luminescente, uma nanopartícula luminosa ou uma nanopartícula de aluminato de estrôncio.

29. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 24 a 28, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo está com- preendido em um kit.

30. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 24 a 29, caracterizado pelo fato de queo polipeptídeo é produ- zido por meio de síntese de peptídeos ou transcrição e tradução in vitro (IVTT).

31. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 24 a 29, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é produ- zido de forma recombinante.

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 ou 27 a 31, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo isolado compreende ou consiste de A77 (SEQ ID NO: 22), A62 (SEQ ID NO: 17), A56 (SEQ ID NO: 16), A19 (SEQ ID NO: 6), A50 (Ech 0700; SEQ ID NO: 28), A51 (SEQ ID NO: 13), A14 (SEQ ID NO: 4), A63 (SEQ ID NO: 18), A34 (SEQ ID NO: 9), A9 (SEQ ID NO: 3) ou A42 (Ech 0240; SEQ ID NO: 11).

33. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) o po- lipeptídeo isolado como definido em qualquer uma das reivindicações 24 a 32, (b) um anticorpo secundário anti-cão ou anti-humano ligado a uma molécula repórter; e, (c) um reagente apropriado para a detecção da molécula repórter.

34. Kit, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é imobilizado em uma membrana ou placa de microtitulação.

35. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 34, caracterizado pelo fato de que a molécula repórter é selecionada a partir do grupo que consiste de luciferase, peroxidase de rábano, uma nanopartícula luminosa, P-galactosidase e um marcador fluorescente.

36. Kit, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a nanopartícula luminosa é uma nanopartícula de aluminato de estrôncio.

37. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 36, caracterizado pelo fato de que o kit compreende adicionalmente um tampão de diluição para soro de cão ou ser humano.

38. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 37, caracterizado pelo fato de que o kit compreende um imunoensaio de fluxo lateral ou um ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral.

39. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 38, caracterizado pelo fato de que o kit compreende um ensaio de imunossorção ligado à enzima (ELISA).

40. Método para induzir uma resposta imune em um sujeito mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de uma preparação farmacêutica que compreende um polipeptídeo da Tabela 1, Tabela 2 ou Tabela 3.

41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que con- siste da Tabela 2 e da Tabela 3.

42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 41, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um ser humano.

43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 42, caracterizado pelo fato de que a preparação farmacêutica é administrada por via subcutânea, intramuscular, nasal, inalação, ou en- trega de aerossol, ou por via intradérmica.

44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 ou 42 a 43, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo isolado compreende ou consiste de A77 (SEQ ID NO: 22), A62 (SEQ ID NO: 17), A56 (SEQ ID NO: 16), A19 (SEQ ID NO: 6), A50 (Ech 0700; SEQ ID NO: 28), A51 (SEQ ID NO: 13), A14 (SEQ ID NO: 4), A63 (SEQ ID NO: 18), A34 (SEQ ID NO: 9), A9 (SEQ ID NO: 3) ou A42 (Ech 0240; SEQ ID NO: 11).

45. Método para tratar uma infecção por Ehrlichia chaffeen- sis em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) colocar em contato uma amostra biológica do sujeito com um polipeptídeo isolado da Tabela 1, Tabela 2 ou Tabela 3 sob condi- ções que permitem a formação de complexos de peptídeo-anticorpo; (b) detectar os complexos de peptídeo-anticorpo; em que a detecção dos complexos de peptídeo-anticorpo é uma indicação de que o sujeito tem uma infecção por Ehrlichia chaffeensis; e (c) administrar um composto terapêutico para tratar infecção por Ehrlichia no sujeito.

46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que con- siste da Tabela 2.

47. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que con- siste da Tabela 3.

48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 47, caracterizado pelo fato de que a etapa de detecção compre- ende realizar um imunoensaio ligado à enzima, um radioimunoensaio, uma imunoprecipitação, um imunoensaio de fluorescência, um ensaio de quimiluminescência, um ensaio de imunoblot, um ensaio de fluxo la- teral, um ensaio de citometria de fluxo, um imunoensaio multiplex, um teste de fita ou um ensaio baseado em partículas.

49. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um cão.

50. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um ser humano.

51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 50, caracterizado pelo fato de que o composto terapêutico é um antibiótico.

52. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que o antibiótico é doxiciclina.

53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 ou 48 a 52, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo isolado é A77 (SEQ ID NO: 22), A62 (SEQ ID NO: 17), A56 (SEQ ID NO: 16), A19 (SEQ ID NO: 6), A50 (Ech 0700; SEQ ID NO: 28), A51 (SEQ ID NO: 13), A14 (SEQ ID NO: 4), A63 (SEQ ID NO: 18), A34 (SEQ ID NO: 9), A9 (SEQ ID NO: 3) ou A42 (Ech 0240; SEQ ID NO: 11).

54. Método para detectar anticorpos que se ligam especifi- camente a um organismo Ehrlichia em uma amostra de teste, caracteri- zado pelo fato de que compreende: (a) colocar em contato um polipep- tídeo isolado de: Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, Ecaj 0663 ou Ecaj 0881, mais preferencialmente Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104 ou Ecaj 0663, ainda mais preferencialmente Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, ainda mais preferencialmente Ecaj 0919 ou Ecaj 0073; ou um polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade de sequência com a amostra de teste, sob condições que permitem a formação de com- plexos de peptídeo-anticorpo; (b) detectar os complexos de peptídeo- anticorpo; em que a detecção dos complexos de peptídeo-anticorpo é uma indicação de que anticorpos específicos para um organismo Ehrli- chia estão presentes na amostra de teste, e em que a ausência dos complexos de peptídeo-anticorpo é uma indicação de que anticorpos específicos para um organismo Ehrlichia não estão presentes na amos- tra de teste.

55. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que a etapa de detecção compreende realizar um imuno- ensaio ligado à enzima, um radioimunoensaio, uma imunoprecipitação, um imunoensaio de fluorescência, um ensaio quimiluminescente, um ensaio de imunoblot, um ensaio de fluxo lateral, um ensaio de citometria de fluxo, a imunoensaio multiplex, um ensaio de espectrometria de mas- sas ou um ensaio baseado em partículas.

56. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a etapa de detecção compreende um ensaio de fluxo lateral ou um imunoensaio ligado à enzima, em que o imunoensaio |i- gado à enzima é um ELISA.

57. Método para identificar uma infecção por Ehrlichia em um sujeito mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) colo- car em contato uma amostra biológica do sujeito com um polipeptídeo isolado de Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, Ecaj 0663 ou Ecaj 0881, mais preferencialmente Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, ou Ecaj 0663, ainda mais preferencialmente Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, ainda mais preferencialmente Ecaj 0919 ou Ecaj 0073, sob condições que permitem a formação de complexos de peptídeo-anticorpo; e (b) detec- tar os complexos de peptídeo-anticorpo; em que a detecção dos com- plexos de peptídeo-anticorpo é uma indicação de que o sujeito tem uma infecção por Ehrlichia.

58. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a etapa de detecção compreende realizar um imuno- ensaio ligado à enzima, um radioimunoensaio, uma imunoprecipitação,

um imunoensaio de fluorescência, um ensaio quimiluminescente, um ensaio de imunoblot, um ensaio de fluxo lateral, um ensaio de citometria de fluxo, a imunoensaio multiplex, um teste de fita, ou um ensaio base- ado em partículas.

59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 58, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um cão.

60. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de que com- preende uma sequência de Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, Ecaj 0663 ou Ecaj 0881, mais preferencialmente Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, ou Ecaj 0663, ainda mais preferencialmente Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, ainda mais preferencialmente Ecaj 0919 ou Ecaj 0073, em que o peptídeo isolado é imobilizado em uma superfície de um substrato de suporte.

61. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 60, caracteri- zado pelo fato de que o substrato de suporte compreende látex, polies- tireno, náilon, nitrocelulose, celulose, sílica, agarose ou resina magné- tica.

62. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 60 a 61, caracterizado pelo fato de que o substrato de suporte é uma câmara de reação, um poço, uma membrana, um filtro, um papel, uma emulsão, um grânulo, uma microesfera, uma fita, um cartão, um lâmina de vidro, um aparelho de fluxo lateral, um microchip, um pente, uma partícula de sílica, uma partícula magnética, uma nanopartícula ou uma monocamada de automontagem.

63. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 60 a 62, caracterizado pelo fato de que o peptídeo está incluído em um kit.

64. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 60 a 62, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é produzido por meio da síntese de peptídeos ou transcrição e tradução in vitro (IVTT).

65. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 60 a 62, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é produzido de forma recombinante.

66. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de que com- preende uma sequência de Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, Ecaj 0663 ou Ecaj 0881, mais preferencialmente Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, ou Ecaj 0663, ainda mais preferencialmente Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, ainda mais preferencialmente isolado Ecaj 0919 ou Ecaj 0073, em que o peptídeo isolado é covalentemente ligado a um marcador detectável.

67. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 66, caracte- rizado pelo fato de que o marcador detectável é um marcador fluores- cente, um marcador radioativo, um marcador enzimático ou uma nano- partícula luminescente.

68. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 67, caracte- rizado pelo fato de que a nanopartícula luminescente é uma nanopartí- cula de terra rara luminescente, uma nanopartícula luminosa ou uma nanopartícula de aluminato de estrôncio.

69. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 66 a 68, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo está com- preendido em um kit.

70. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 66 a 69, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é produ- zido por meio da síntese de peptídeos ou transcrição e tradução in vitro (IVTT).

71. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 66 a 69, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é produ- zido de forma recombinante.

72. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) o po- lipeptídeo isolado como definido em qualquer uma das reivindicações

66 a 71, (b) um anticorpo secundário anti-cão ou anti-humano ligado a uma molécula repórter; e, (c) um reagente apropriado para a detecção da molécula repórter.

73. Kit, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é imobilizado em uma membrana ou placa de microtitulação.

74. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72 a 73, caracterizado pelo fato de que a molécula repórter é selecionada a partir do grupo que consiste de luciferase, peroxidase de rábano, uma nanopartícula luminosa, P-galactosidase e um marcador fluorescente.

75. Kit, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a nanopartícula luminosa é uma nanopartícula de aluminato de estrôncio.

76. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72 a 75, caracterizado pelo fato de que o kit compreende adicionalmente um tampão de diluição para soro de cão ou humano.

77. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72 a 76, caracterizado pelo fato de que o kit compreende um imunoensaio de fluxo lateral ou um ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral.

78. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72 a 77, caracterizado pelo fato de que o kit compreende um ensaio de imunossorção ligado à enzima (ELISA).

79. Método para induzir uma resposta imune em um sujeito mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de uma preparação farmacêutica com- preendendo um polipeptídeo de Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, Ecaj 0663 ou Ecaj 0881, mais preferencialmente Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104 ou Ecaj 0663, ainda mais preferencialmente Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, ainda mais preferencialmente Ecaj 0919 ou Ecaj 0073.

80. Método, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um ser humano.

81. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 80, caracterizado pelo fato de que a preparação farmacêutica é administrada por via subcutânea, intramuscular, nasal, por inalação, ou entrega de aerossol, ou por via intradérmica.

82. Método para tratar uma infecção por Ehrlichia canis em um sujeito mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) colocar em contato uma amostra biológica do indivíduo com um polipeptídeo isolado de Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, Ecaj 0663, ou Ecaj 0881, mais preferencialmente Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, ou Ecaj 0663, ainda mais preferencialmente Ecaj 0919, Ecaj 0073, Ecaj 0104, ainda mais preferencialmente Ecaj 0919 ou Ecaj 0073, sob condições que permitem a formação de complexos de peptídeo-anticorpo; (b) detectar os complexos de peptídeo-anticorpo; em que a detecção dos complexos de peptídeo-anticorpo é uma indicação de que o sujeito tem uma infecção por Ehrlichia canis; e (c) administrar um composto terapêutico para tratar infecção por Ehrlichia no sujeito.

83. Método, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que a etapa de detecção compreende realizar um imuno- ensaio ligado à enzima, um radioimunoensaio, uma imunoprecipitação, um imunoensaio de fluorescência, um ensaio quimiluminescente, um ensaio de imunoblot, um ensaio de fluxo lateral, um ensaio de citometria de fluxo, a imunoensaio multiplex, um teste de fita, ou um ensaio base- ado em partículas.

84. Método, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um cão.

85. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações

82 a 84, caracterizado pelo fato de que o composto terapêutico é um antibiótico.

86. Método, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que o antibiótico é doxiciclina.