BR112020019010A2 - Polipeptídeos antimicrobianos derivados de bacteriófagos e seu uso contra bactérias gram-negativas - Google Patents

Polipeptídeos antimicrobianos derivados de bacteriófagos e seu uso contra bactérias gram-negativas Download PDF

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Abstract

a presente invenção refere-se a composições farmacêuticas que compreendem uma quantidade eficaz de um peptídeo de chp isolado tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em seq id nos. 1-4, 6-26 e 54-66, ou um peptídeo de chp modificado tendo cerca de 80% de identidade da sequência com ela, em que o peptídeo de chp modificado inibe o crescimento, reduz a população ou mata pelo menos uma espécie de bactérias gram-negativas; e um veículo farmaceuticamente aceitável. ainda são divulgados neste documento peptídeos de chp isolados, bem como vetores que compreendem uma molécula de ácido nucleico que codifica os peptídeos de chp e células hospedeiras que compreendem um vetor. também são divulgados neste documento métodos de inibição do crescimento, redução da população ou matança de pelo menos uma espécie de bactérias gram-negativas e métodos de tratamento de uma infecção bacteriana em um paciente.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLIPEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS DERIVADOS DE BACTERIÓFAGOS E SEU USO CONTRA BACTÉRIAS GRAM- NEGATIVAS".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício do, e vale-se da data de depósito do, pedido de patente provisório dos U.S. número 62/650.235, depositado em 29 de março de 2018, cuja divulgação completa é incorporada neste documento por referência.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi apresentada eletronicamente no formato ASCII e é incorporada neste documento por referência em sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 28 de março de 2019, é denominada 0341_0002-PCT_SL.txt e tem 28.097 bytes de tamanho.
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] A presente invenção se refere ao campo de agentes antimicrobianos e, mais especificamente, aos peptídeos de amurina antimicrobianos derivados de fagos que infectam as bactérias Gram- negativas e ao uso desses peptídeos para matar as bactérias Gram- negativas e combater a infecção e a contaminação bacteriana.
ANTECEDENTES DA DESCRIÇÃO
[004] As bactérias gram-negativas, em particular, os membros do gênero Pseudomonas, e o patógeno emergente resistente a múltiplos fármacos Acinetobacter baumannii, são uma causa importante de infecções invasivas graves e potencialmente fatais. A infecção por Pseudomonas apresenta um grande problema em queimaduras, feridas crônicas, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), fibrose cística, crescimento da superfície sobre biomateriais implantados e dentro da superfície do hospital e fornecimentos de água, onde representa uma série de ameaças para pacientes vulneráveis.
[005] Uma vez estabelecida em um paciente, a P. aeruginosa pode ser especialmente difícil de tratar. O genoma codifica um hospedeiro de genes de resistência, incluindo as bombas de efluxo de múltiplos fármacos e as enzimas que conferem resistência aos antibióticos de beta-lactam e aminoglicosídeos, tornando a terapia contra este patógeno Gram-negativo particularmente desafiadora devido à falta de novas terapêuticas antimicrobianas. Esse desafio é agravado pela capacidade da P. aeruginosa de crescer em um biofilme, o que pode aumentar a sua capacidade de causar infecções por proteção das bactérias das defesas do hospedeiro e da quimioterapia.
[006] No ambiente de cuidados da saúde, a incidência de cepas resistentes a fármacos de Pseudomonas aeruginosa está aumentando. Em um estudo observacional de infecções da corrente sanguínea (BSIs) associadas aos cuidados da saúde em hospitais comunitários, a P. aeruginosa foi um dos quatro principais patógenos Resistentes a Múltiplos Fármacos (MDR), contribuindo para uma mortalidade hospitalar geral de 18%. Além disso, os surtos de P. aeruginosa MDR estão bem documentados. Os resultados ruins estão associados às cepas MDR de P. aeruginosa que frequentemente requerem tratamento com fármacos de último recurso, como a colistina.
[007] As outras bactérias resistentes a fármacos que foram identificadas como ameaças significativas pela Organização Mundial da Saúde (OMS) e pelos Centros para o Controle de Doenças (CDC) incluem as seguintes bactérias Gram-negativas: Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacteriaceae (incluindo Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Enterobacter cloacae), espécies de Salmonella, Neisseria gonorrhoeae e espécies de Shigella (Tillotson G. 2018. (Tillotson G. 2018. A crucial list of pathogens. Lancet Infect Dis 18:234-236).
[008] Para atender à necessidade por novos antimicrobianos com novos mecanismos, os pesquisadores estão investigando uma variedade de fármacos e produtos biológicos. Uma dessas classes de agentes antimicrobianos inclui as lisinas. As lisinas são hidrolases de peptidoglicano da parede celular, que atuam como "tesouras moleculares" para degradar o sistema de malhas de peptidoglicanos, responsável por manter a forma celular e por suportar a pressão osmótica interna. A degradação do peptidoglicano resulta em lise osmótica. No entanto, certas lisinas não têm sido eficazes contra as bactérias Gram-negativas, pelo menos em parte, devido à presença de uma membrana externa (ME), que está ausente nas bactérias Gram- positivas e que limita o acesso ao peptidoglicano subjacente. Também foram desenvolvidas lisinas modificadas (“artilisinas”). Esses agentes, que contêm lisinas fundidas a domínios helicoidais α específicos com características policatiônicas, anfipáticas e hidrofóbicas, são capazes de se deslocar através da ME. No entanto, certas artilisinas exibem baixa atividade in vivo. Isso pode ser causado por constituintes do soro humano e, especificamente, por sal fisiológico e cátions divalentes. Estes constituintes competem por sítios de ligação aos lipopolissacarídeos e podem interferir com os domínios de deslocamento helicoidais α das lisinas, restringindo assim a atividade no sangue e limitando a eficácia de certas lisinas e artilisinas para o tratamento de infecções invasivas. Uma falta semelhante de atividade no sangue foi relatada para múltiplos peptídeos antimicrobianos diferentes que penetram na membrana externa e desestabilizam.
[009] Além de lisinas e artilisinas, foram identificados outros sistemas de lise do hospedeiro codificados por fago, incluindo as "amurinas" ((Chamakura KR et al., 2017. Mutational analysis of the MS2 lysis protein L. Microbiology 163:961-969). O termo amurina descreve um conjunto limitado de atividades de lise não muralíticas (não
"destruidoras de parede", isto é, não baseadas na hidrólise do peptidoglicano da parede celular) dos fagos tanto de ssDNA quanto de ssRNA (Microviridae e Leviviridae, respectivamente). Por exemplo, a amurina de proteína E do fago φX174 (Família Microviridae, gênero Microvirus) é uma proteína de membrana de 91 aminoácidos que causa a lise ao inibir a translocase bacteriana MraY, uma enzima essencial incrustada na membrana que catalisa a formação do precursor da mureína, Lipídio I (Zheng Y et al., 2009. Purification and functional characterization of phiX174 lysis protein E.
Biochemistry 48:4999-5006). Além disso, a proteína de capsídeo A2 do fago Qβ (Família Leviviridae, gênero Allolevivirus) é uma proteína (e amurina) estrutural de 420 aminoácidos que causa a lise interferindo com a atividade de MurA e desregulando o processo de biossíntese de peptidoglicano (Gorzelnik KV et al., 2016. Proc Natl Acad Sci U S A 113:11519-11524). Os outros exemplos não limitativos incluem a amurina de LysM do fago M, que é um inibidor específico de MurJ, a flippase do lipídio II de E. coli e a amurina de proteína L do fago MS2 (Família Leviviridae, gênero Levivirus), que é uma proteína de membrana integral de 75 aminoácidos e causa a lise de uma maneira que requer a atividade da chaperona hospedeira DnaJ (Chamakura KR et al., 2017. J Bacteriol 199). Uma estrutura de domínio putativa para as amurinas tipo L foi atribuída e inclui um dipeptídeo de leucilserina interno imediatamente precedido por um trecho de 10-17 resíduos hidrofóbicos.
Essas amurinas são proteínas de membrana integrais e não foram purificadas e usadas como as lisinas.
Além disso, os seus alvos estão no citoplasma.
Elas não foram testadas como agentes líticos.
Algumas amurinas foram descritas em detalhes, por exemplo, no Pedido PCT Publicado No.
WO 2001/009382, porém, na melhor das hipóteses, elas constituem uma base para o desenvolvimento de terapêuticas e não foram desenvolvidas em terapêuticas antibacterianas.
[0010] Embora as publicações recentes tenham descrito lisinas/artilisinas e outros sistemas de lise do hospedeiro (por exemplo, amurinas) que podem ser usados contra bactérias Gram-negativas com níveis variados de eficácia in vivo, permanece uma necessidade por compostos antibacterianos adicionais que tenham como alvo a P. aeruginosa MDR e outras bactérias Gram-negativas, para o tratamento de infecções invasivas, e especialmente compostos antibacterianos que sejam altamente solúveis, permaneçam ativos in vivo na presença de soro e/ou não tenham atividade hemolítica.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0011] A Figura 1A são modelos tridimensionais previstos por I- Tasser para as estruturas dos membros da família de peptídeos de fagos de Chlamydia (Chp) Chp1, Chp 2, Chp4, Chp5, Chp6, Chp7, Ecp1, Ecp2 e Osp1. O peptídeo efetor imunológico inato humano LL-37 é incluído para comparação. As estruturas helicoidais alfa são evidentes, e a extremidade superior é, em geral, a extremidade de N.
[0012] A Figura 1B mostra as previsões da estrutura secundária de consenso para Chp2 (SEQ ID NO: 2) usando JPRED4. As hélices alfa são indicadas pela barra listrada grossa.
[0013] A Figura 1C mostra as previsões da estrutura secundária de consenso para Chp4 (SEQ ID NO: 4) usando JPRED4. As hélices alfa são indicadas pela barra listrada grossa.
[0014] A Figura 2A é a árvore filogenética enraizada (método de agrupamento UPGMA) de certos membros da família de Chp gerados a partir de um alinhamento de ClustalW.
[0015] A Figura 2B é a árvore filogenética não enraizada (método de agrupamento de união de vizinhos) de certos membros da família de Chp gerados a partir de um alinhamento de ClustalW.
[0016] A Figura 3 é uma série de fotomicrografias que mostram a análise microscópica (ampliação de x2000) da cepa 1292 de
Pseudomonas aeruginosa tratada por 15 minutos com Chp2 (10 µg/mL) ou um controle de tampão ("não tratada") em 100% de soro humano. As amostras foram coloridas usando o Kit Live/Dead Cell Viability (ThermoFisher) e examinadas tanto por contraste de interferência diferencial (DIC) quanto por microscopia de fluorescência. As fotomicrografias mostram uma ausência de bactérias mortas na fileira não tratada e uma redução de bactérias vivas na fileira tratada.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0017] Este pedido divulga uma nova classe de agentes de fagos líticos que são derivados, por exemplo, de sequências genômicas de Microviridae e são distintos de outros agentes, incluindo as lisinas/artilisinas e as amurinas conhecidas. Os agentes de fagos líticos divulgados neste documento são referidos como peptídeos de fagos de Chlamydia (Chp), também referidos como "peptídeos de amurina" (uma definição funcional que não implica similaridade de sequências com as amurinas). São divulgados neste documento 40 peptídeos de Chp que foram identificados, constituindo uma família de proteínas bacteriolíticas específicas. Vários dos peptídeos de Chp divulgados neste documento exibem similaridades de sequências notáveis entre si, porém são distintos de outros peptídeos conhecidos nas bases de dados de sequências. Apesar das sequências únicas dos peptídeos de Chp, prevê-se que todos eles adotem estruturas helicoidais alfa semelhantes a alguns peptídeos antimicrobianos (AMPs) anteriormente descritos dos sistemas imunológicos inatos de vertebrados (E.F. Haney et al, 2017, In Hansen PR (ed), Antimicrobial Peptides: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1548), porém sem similaridade de sequências com tais AMPs. Consistente com uma função antibacteriana para a classe Chp, é divulgada neste documento a atividade bactericida potente e de amplo espectro contra patógenos Gram-negativos para vários peptídeos de Chp purificados diferentes. Ao contrário das amurinas de Microviridae anteriormente descritas, que têm alvos citoplasmáticos no aparelho biossintético da parede celular que podem não ser facilmente acessados por proteínas aplicadas externamente, os peptídeos de Chp divulgados neste documento podem ser usados, em formas purificadas, para exercer a atividade bactericida "de fora", isto é, atuando sobre o lado de fora da parede celular. Os peptídeos de Chp identificados aqui representam uma nova classe de agentes antimicrobianos tendo atividade de amplo espectro contra os patógenos Gram-negativos e a capacidade de persistir na presença de soro.
[0018] Em um aspecto, a presente invenção é voltada para uma composição farmacêutica que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e uma quantidade eficaz de (i) um peptídeo de Chp isolado tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs. 1-4, 6-26 e 54-66 ou seus fragmentos ativos, ou (ii) um peptídeo de Chp modificado tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92,5%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade da sequência com pelo menos uma das SEQ ID NOs. 1- 4, 6-26 e 54-66, em que o peptídeo de Chp modificado inibe o crescimento, reduz a população e/ou mata pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas, opcionalmente na presença de soro humano. Em certas modalidades, a pelo menos uma espécie de bactérias Gram- negativas compreende a Pseudomonas aeruginosa.
[0019] Em outra modalidade divulgada neste documento, a composição farmacêutica compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e uma quantidade eficaz de um peptídeo de Chp isolado selecionado a partir do grupo que consiste nos peptídeos de Chp1, Chp 2, Chp3, Chp4, Chp6, Chp7, Chp8, Chp9, Chp10, Chp11, Chp12, CPAR39, Gkh1, Gkh2, Unp1, Ecp1, Tma1, Ecp2, Osp1, Unp2, Unp3, Gkh3, Unp5, Unp6, Spi1, Spi2, Ecp3, Ecp4, Lvp1, Lvp2, ALCES1,
AVQ206, AVQ244, CDL907, AGT915, HH3930, Fen7875 e SBR77 ou os seus fragmentos ativos.
[0020] Em algumas modalidades, o peptídeo de Chp é Chp2, Chp4, Chp6, Ecp1 ou Ecp2.
[0021] Em várias modalidades da descrição, a composição farmacêutica compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e uma quantidade eficaz de (i) um peptídeo de Chp isolado tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 65; e SEQ ID NO: 66 ou seus fragmentos ativos.
[0022] Em certas modalidades, a composição farmacêutica compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e uma quantidade eficaz de (i) um peptídeo de Chp isolado tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; e SEQ ID NO: 54 ou seus fragmentos ativos.
[0023] Em certas modalidades, o peptídeo de Chp conforme divulgado neste documento, ou os seus fragmentos ativos, contém pelo menos uma modificação não natural em relação à sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs. 1-4, 6-26 e 54-66 e, em certas modalidades, a modificação não natural é selecionada a partir do grupo que consiste em modificação por substituição, tal como uma substituição de um aminoácido; uma modificação por acetilação N terminal; e uma modificação por amidação C terminal. Em certas modalidades, o peptídeo de Chp modificado compreende pelo menos uma substituição, inserção ou remoção de aminoácido em relação à sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs. 1-4, 6- 26 e 54-66, em que o peptídeo de Chp modificado inibe o crescimento, reduz a população e/ou mata pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas, opcionalmente na presença de soro humano. Em certas modalidades, a pelo menos uma espécie de bactérias Gram- negativas compreende a Pseudomonas aeruginosa. Em certas modalidades, a pelo menos uma substituição de aminoácido é uma substituição de aminoácido conservativa. Em certas modalidades, o peptídeo de Chp modificado compreendendo pelo menos uma substituição de aminoácido em relação à sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs. 1-4, 6-26 e 54-66 é um peptídeo catiônico tendo pelo menos um domínio de hélice alfa.
[0024] A composição farmacêutica em algumas modalidades pode ser uma solução, uma suspensão, uma emulsão, um pó inalável, um aerossol ou um spray. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica também pode compreender um ou mais antibióticos adequados para o tratamento de bactérias Gram-negativas. Opcionalmente, o peptídeo de Chp1 é excluído de modo tal que a composição farmacêutica não compreenda o Chp1.
[0025] Em certas modalidades, é divulgado neste documento um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica (i) um peptídeo de Chp tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs. 1-4, 6-26 e 54-66 ou seus fragmentos ativos, ou (ii) um peptídeo de Chp tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92,5%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade da sequência com pelo menos uma das SEQ ID NOs. 1-4, 6-26 e 54-66, em que o peptídeo de Chp modificado inibe o crescimento, reduz a população e/ou mata pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas, opcionalmente na presença de soro humano. Em certas modalidades, a pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas compreende a Pseudomonas aeruginosa.
[0026] Também são divulgados neste documento vetores de expressão recombinantes compreendendo um ácido nucleico que codifica (i) um peptídeo de Chp compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs. 1-4, 6-26 e 54-66 ou seus fragmentos ativos, ou (ii) um peptídeo de Chp modificado tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92,5%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade da sequência com pelo menos uma das SEQ ID NOs. 1-4, 6-26 e 54-66, em que o peptídeo de Chp modificado inibe o crescimento, reduz a população e/ou mata pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas, opcionalmente na presença de soro humano. Em certas modalidades, a pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas compreende a Pseudomonas aeruginosa. Em certas modalidades, o ácido nucleico está operativamente ligado a um promotor heterólogo. Em certas modalidades, o ácido nucleico codifica um peptídeo de Chp que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste no grupo que consiste em SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 63; e SEQ ID NO: 66 ou seus fragmentos ativos e, em certas modalidades, o ácido nucleico codifica um peptídeo de Chp que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; e SEQ ID NO: 54 ou seus fragmentos ativos.
[0027] As outras modalidades divulgadas neste documento incluem uma célula hospedeira isolada compreendendo os vetores anteriores. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos é uma sequência de cDNA.
[0028] Ainda em outro aspecto, a descrição é voltada para um ácido nucleico isolado e purificado que codifica um peptídeo de Chp compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs. 1-26 e 54-66 ou seus fragmentos ativos. Em certas modalidades, o ácido nucleico codifica um peptídeo de Chp compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs. 1-4, 6-26 e 54-66 ou seus fragmentos ativos. Em uma modalidade alternativa, o DNA isolado e purificado compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs. 27-53 e 68-80 e, em certas modalidades, o DNA isolado e purificado compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs. 27-30, 32-53 e 68-79. Opcionalmente, o ácido nucleico é o cDNA. Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos contém pelo menos uma modificação não natural, como uma mutação (por exemplo, substituição, inserção ou remoção) ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma modificação N terminal ou uma modificação C terminal.
[0029] Em outros aspectos, a presente invenção é voltada para vários métodos/usos. Um desses usos é um método para inibir o crescimento, reduzir a população e/ou matar pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas, o método compreendendo o contato das bactérias com uma composição que compreende uma quantidade eficaz de (i) um peptídeo de Chp compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs. 1-4, 6-26 e 54-66 ou seus fragmentos ativos, ou (ii) um peptídeo de Chp modificado tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92,5%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade da sequência com ela, em que o peptídeo de Chp modificado inibe o referido crescimento, reduz a referida população e/ou mata a referida pelo menos uma espécie de bactérias Gram negativas. Em certas modalidades, o peptídeo de Chp compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 63; e SEQ ID NO: 66 ou seus fragmentos ativos e, em certas modalidades, o peptídeo de Chp compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; e SEQ ID NO: 54 ou seus fragmentos ativos.
[0030] Também é divulgado neste documento um método para inibir o crescimento de, reduzir a população de, e/ou matar pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas, o método compreendendo o contato das bactérias com uma composição que compreende uma quantidade eficaz de um peptídeo de Chp selecionado a partir do grupo que consiste em Chp1, Chp 2, Chp3, Chp4, Chp6, Chp7, Chp8, Chp9, Chp10, Chp11, Chp12, CPAR39, Gkh1, Gkh2, Unp1, Ecp1, Tma1, Ecp2, Osp1, Unp2, Unp3, Gkh3, Unp5, Unp6, Spi1, Spi2, Ecp3, Ecp4,
Lvp1, Lvp2, ALCES1, AVQ206, AVQ244, CDL907, AGT915, HH3930, Fen7875, e SBR77 ou seus fragmentos ativos, em que o peptídeo de Chp ou os seus fragmentos ativos têm a propriedade de inibir o crescimento, reduzir a população e/ou matar pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas.
[0031] Em certas modalidades, a pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas é a Pseudomonas aeruginosa e, em certas modalidades, o método compreende ainda matar pelo menos uma outra espécie de bactérias Gram-negativas, além da Pseudomonas aeruginosa.
[0032] Também é divulgado neste documento um método para tratar uma infecção bacteriana causada por uma bactéria Gram- negativa, compreendendo a administração de uma composição farmacêutica, conforme divulgada neste documento, a um paciente diagnosticado com, em risco de, ou exibindo sintomas de uma infecção bacteriana.
[0033] Em quaisquer dos métodos/usos anteriores, as bactérias Gram-negativas podem ser pelo menos uma bactéria Gram-negativa selecionada a partir do grupo que consiste em Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, espécie de Salmonella, Neisseria gonorrhoeae, e Shigella. Em certas modalidades, a bactéria Gram-negativa é a Pseudomonas aeruginosa.
[0034] Também é divulgado neste documento um método para tratar ou prevenir uma infecção bacteriana patogênica tópica ou sistêmica causada por uma bactéria Gram-negativa, que compreende a administração de uma composição farmacêutica, conforme divulgada neste documento, a um paciente que necessita de tratamento ou prevenção.
[0035] É ainda divulgado neste documento um método para prevenir ou tratar uma infecção bacteriana, que compreende a coadministração a um paciente diagnosticado com, em risco de, ou exibindo sintomas de uma infecção bacteriana, uma combinação de uma primeira quantidade de uma composição farmacêutica, conforme divulgada neste documento, e um segunda quantidade de um antibiótico adequado para o tratamento de infecção por bactérias Gram-negativas, em que a primeira e a segunda quantidades juntas são eficazes para prevenir ou tratar a infecção por bactérias Gram-negativas.
[0036] Em algumas modalidades, o antibiótico adequado para o tratamento de infecção por bactérias Gram-negativas é selecionado a partir de um ou mais de ceftazidima, cefepima, cefoperazona, ceftobiprol, ciprofloxacina, levofloxacina, aminoglicosídeos, imipenem, meropenem, doripenem, gentamicina, tobramicina, amicacina, piperacilina, ticarcilina, penicilina, rifampicina, polimixina B e colistina. Em certas modalidades, o antibiótico é selecionado a partir de um ou mais de amicacina, azitromicina, aztreonam, ciprofloxacina, colistina, fosfomicina, gentamicina, imipenem, piperacilina, rifampicina e tobramicina.
[0037] Ainda em outra modalidade, é divulgado um método para aumentar a eficácia de um antibiótico adequado para o tratamento de infecção por bactérias Gram-negativas, compreendendo a coadministração do antibiótico em combinação com uma composição farmacêutica, conforme divulgada neste documento, em que a administração da combinação é mais eficaz na inibição do crescimento, redução da população ou morte das bactérias Gram-negativas do que a administração do antibiótico ou da sua composição farmacêutica individualmente.
DESCRIÇÃO DETALHADA Definições
[0038] Como utilizado neste documento, os seguintes termos e seus cognatos terão os seguintes significados, a menos que o contexto indique claramente o contrário:
[0039] "Veículo" se refere a um solvente, aditivo, excipiente, meio de dispersão, agente solubilizante, revestimento, conservante, agente isotônico e retardador de absorção, tensoativo, propulsor, diluente, transportador e semelhantes com os quais um composto ativo é administrado. Esses veículos podem ser líquidos estéreis, como a água, as soluções salinas, as soluções aquosas de dextrose, as soluções aquosas de glicerol, e óleos, incluindo os de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, como o óleo de amendoim, o óleo de soja, o óleo mineral, o óleo de gergelim, e similar.
[0040] "Veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se a todos e quaisquer solventes, aditivos, excipientes, meios de dispersão, agentes solubilizantes, revestimentos, conservantes, agentes isotônicos e retardadores de absorção, tensoativos, propulsores, diluentes, transportadores e semelhantes que são fisiologicamente compatíveis. O(s) veículo(s) deve(m) ser "aceitável(is)" no sentido de não ser(em) deletério(s) para o paciente a ser tratado nas quantidades tipicamente utilizadas em medicamentos. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são compatíveis com os outros ingredientes da composição, sem tornar a composição inadequada para o seu propósito pretendido. Além disso, os veículos farmaceuticamente aceitáveis são adequados para uso com os pacientes, conforme proporcionados neste documento, sem efeitos colaterais adversos indevidos (como toxicidade, irritação e resposta alérgica). Os efeitos colaterais são “indevidos” quando o seu risco sobrepujar o benefício proporcionado pela composição. Os exemplos não limitativos de veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem quaisquer dos veículos farmacêuticos padrão, tais como as soluções salinas tamponadas com fosfato, a água e as emulsões, tais como as emulsões de óleo/água e as microemulsões. Os veículos farmacêuticos adequados são descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences por E.W. Martin, 18ª Edição. O veículo farmaceuticamente aceitável pode ser um veículo que não exista na natureza.
[0041] "Bactericida" ou "atividade bactericida" refere-se à propriedade de causar a morte de bactérias ou ser capaz de matar bactérias até uma proporção de pelo menos uma redução de 3-log10 (99,9%) ou melhor entre uma população inicial de bactérias durante um período de 18-24 horas.
[0042] "Bacteriostático" ou "atividade bacteriostática" refere-se à propriedade de inibir o crescimento bacteriano, incluindo a inibição do crescimento de células bacterianas, causando assim uma redução de 2-log10 (99%) ou melhor e quase abaixo de 3 log entre uma população inicial de bactérias durante um período de 18-24 horas.
[0043] "Antibacteriano" refere-se aos agentes tanto bacteriostáticos quanto bactericidas.
[0044] "Antibiótico" se refere a um composto com propriedades que têm um efeito negativo sobre as bactérias, como a letalidade ou a redução do crescimento. Um antibiótico pode ter um efeito negativo sobre as bactérias Gram-positivas, as bactérias Gram-negativas ou ambas. A título de exemplo, um antibiótico pode afetar a biossíntese de peptidoglicano da parede celular, a integridade da membrana celular ou a síntese de DNA ou proteína nas bactérias. Os exemplos não limitativos de antibióticos ativos contra as bactérias Gram-negativas incluem as cefalosporinas, tais como a ceftriaxona-cefotaxima, a ceftazidima, a cefepima, a cefoperazona e o ceftobiprol; as fluoroquinolonas, como a ciprofloxacina e a levofloxacina; os aminoglicosídeos, como a gentamicina, a tobramicina e a amicacina; a piperacilina, a ticarcilina, o imipenem, o meropenem, o doripenem, as penicilinas de amplo espectro com ou sem inibidores da beta-lactamase,
a rifampicina, a polimixina B e a colistina.
[0045] "Resistente a fármacos", em geral, se refere a uma bactéria que seja resistente à atividade antibacteriana de um fármaco. Quando usada em certas maneiras, a resistência a fármacos pode referir-se especificamente à resistência a antibióticos. Em alguns casos, uma bactéria que, em geral, seja suscetível a um antibiótico particular pode desenvolver resistência ao antibiótico, tornando-se, assim, um micróbio ou cepa resistente a fármacos. Um patógeno "resistente a múltiplos fármacos" ("MDR") é aquele que desenvolveu resistência a pelo menos duas classes de fármacos antimicrobianos, cada um usado como monoterapia. Por exemplo, certas cepas de S. aureus foram consideradas resistentes a diversos antibióticos, incluindo a meticilina e/ou a vancomicina (Antibiotic Resistant Threats in the United States, 2013, U.S. Department of Health and Services, Centers for Disease Control and Prevention). Um especialista na técnica pode prontamente determinar se uma bactéria é resistente a fármacos usando as técnicas laboratoriais de rotina que determinam a suscetibilidade ou a resistência de uma bactéria a um fármaco ou antibiótico.
[0046] "Quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade que, quando aplicada ou administrada em uma frequência ou regime de dosagem apropriado, seja suficiente para prevenir, reduzir, inibir ou eliminar o crescimento bacteriano ou a carga bacteriana ou para prevenir, reduzir ou melhorar o início, a gravidade, a duração ou a progressão do distúrbio que está sendo tratado (por exemplo, crescimento ou infecção por patógeno bacteriano Gram-negativo), prevenir o avanço do distúrbio que está sendo tratado, causar a regressão do distúrbio que está sendo tratado ou aumentar ou melhorar o(s) efeito(s) profilático(s) ou terapêutico(s) de outra terapia, como a terapia com antibiótico ou bacteriostático.
[0047] "Coadministrar" refere-se à administração de dois agentes,
como um peptídeo de Chp e um antibiótico ou qualquer outro agente antibacteriano, em uma forma sequencial, bem como à administração desses agentes em uma forma substancialmente simultânea, como em uma única mistura/composição ou em doses dadas separadamente, porém, apesar disso, administrados substancial e simultaneamente ao paciente, por exemplo, em momentos diferentes no mesmo dia ou em um período de 24 horas. Essa coadministração de peptídeos de Chp com um ou mais agentes antibacterianos adicionais pode ser proporcionada como um tratamento contínuo durando até dias, semanas ou meses. Além disso, dependendo do uso, a coadministração não precisa ser contínua ou coextensiva. Por exemplo, se o uso fosse como um agente antibacteriano tópico para tratar, por exemplo, uma úlcera bacteriana ou uma úlcera diabética infectada, um peptídeo de Chp poderia ser administrado apenas inicialmente, dentro de 24 horas de um antibiótico adicional, e então o uso do antibiótico adicional pode continuar sem a administração adicional do peptídeo de Chp.
[0048] "Paciente" refere-se a um mamífero, uma planta, um animal inferior, um organismo de uma única célula ou uma cultura de células. Por exemplo, o termo "paciente" se destina a incluir os organismos, por exemplo, os procariotos e os eucariotos, que são suscetíveis a, ou estão afetados por infecções bacterianas, por exemplo, infecções por bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas. Os exemplos de pacientes incluem os mamíferos, por exemplo, os seres humanos, os cães, as vacas, os cavalos, os porcos, as ovelhas, as cabras, os gatos, os camundongos, os coelhos, os ratos, e os animais transgênicos não humanos. Em certas modalidades, o paciente é um ser humano, por exemplo, um ser humano sofrendo de, em risco de sofrer de, ou suscetível à infecção por bactérias Gram-negativas, seja essa infecção sistêmica, tópica ou de outra forma concentrada ou confinada em um órgão ou tecido particular.
[0049] "Polipeptídeo" é usado neste documento indistintamente com o termo "peptídeo" e se refere a um polímero feito de resíduos de aminoácidos e, em geral, tendo pelo menos cerca de 30 resíduos de aminoácidos. O termo inclui não apenas os polipeptídeos na forma isolada, como também os seus fragmentos ativos e derivados. O termo "polipeptídeo" também abrange as proteínas de fusão ou os polipeptídeos de fusão compreendendo um peptídeo de Chp, como descrito neste documento, e mantendo, por exemplo, uma função lítica. Dependendo do contexto, um polipeptídeo pode ser um polipeptídeo que ocorre naturalmente ou um polipeptídeo recombinante, engenheirado ou produzido sinteticamente. Um peptídeo de Chp particular pode ser, por exemplo, derivado ou removido de uma proteína nativa por clivagem enzimática ou química, ou pode ser preparado usando técnicas convencionais de síntese de peptídeos (por exemplo, síntese em fase sólida) ou técnicas de biologia molecular (tais como as divulgadas em Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)) ou pode ser estrategicamente truncado ou segmentado produzindo fragmentos ativos, mantendo, por exemplo, a atividade lítica contra elas ou pelo menos uma bactéria-alvo comum.
[0050] "Polipeptídeo de fusão" refere-se a um produto de expressão resultante da fusão de dois ou mais segmentos de ácido nucleico, resultando em um produto de expressão fundido tipicamente tendo dois ou mais domínios ou segmentos, que tipicamente têm propriedades ou funcionalidades diferentes. Em um sentido mais particular, o termo "polipeptídeo de fusão" também pode se referir a um polipeptídeo ou peptídeo compreendendo dois ou mais polipeptídeos ou peptídeos heterólogos ligados covalentemente, diretamente ou através de um ligador de aminoácido ou peptídeo. Os polipeptídeos que formam o polipeptídeo de fusão são tipicamente ligados extremidade de C à extremidade de N, embora também possam ser ligados extremidade de C à extremidade de C, extremidade de N à extremidade de N ou extremidade de N à extremidade de C. O termo "polipeptídeo de fusão" pode ser usado indistintamente com o termo "proteína de fusão". A expressão ilimitada "um polipeptídeo compreendendo" uma certa estrutura inclui as moléculas maiores do que a estrutura descrita, como os polipeptídeos de fusão.
[0051] "Heterólogo" refere-se às sequências de nucleotídeos, peptídeos ou polipeptídeos que não são naturalmente contíguas. Por exemplo, no contexto da presente invenção, o termo "heterólogo" pode ser usado para descrever uma combinação ou fusão de dois ou mais peptídeos e/ou polipeptídeos, em que o peptídeo ou o polipeptídeo de fusão não é normalmente encontrado na natureza, tal como, por exemplo, um peptídeo de Chp ou o seu fragmento ativo e um peptídeo catiônico e/ou policatiônico, um peptídeo anfipático, um peptídeo sushi (Ding et al. Cell Mol Life Sci., 65(7-8):1202-19 (2008)), um peptídeo defensina (Ganz, T. Nature Reviews Immunology 3, 710-720 (2003)), um peptídeo hidrofóbico e/ou um peptídeo antimicrobiano que possa ter atividade lítica aumentada. Estão incluídos nesta definição dois ou mais peptídeos de Chp ou seus fragmentos ativos. Estes podem ser usados para fazer um polipeptídeo de fusão com atividade lítica.
[0052] "Fragmento ativo" refere-se a uma parte de um polipeptídeo que conserva uma ou mais funções ou atividades biológicas do polipeptídeo isolado do qual o fragmento foi retirado, por exemplo, atividade bactericida contra uma ou mais bactérias Gram- negativas.
[0053] "Peptídeo anfipático" refere-se a um peptídeo tendo grupos funcionais tanto hidrofílicos quanto hidrofóbicos. Em certas modalidades, a estrutura secundária pode colocar os resíduos de aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos em lados opostos (por exemplo,
lado interno vs. lado externo, quando o peptídeo estiver em um solvente, como a água) de um peptídeo anfipático. Estes peptídeos podem, em certas modalidades, adotar uma estrutura secundária helicoidal, como uma estrutura secundária helicoidal alfa.
[0054] "Peptídeo catiônico" refere-se a um peptídeo tendo uma alta porcentagem de resíduos de aminoácidos carregados positivamente. Em certas modalidades, um peptídeo catiônico tem um valor de pKa de 8,0 ou maior. O termo "peptídeo catiônico", no contexto da presente invenção, também abrange os peptídeos policatiônicos que são peptídeos produzidos sinteticamente, compostos de resíduos de aminoácidos principalmente carregados positivamente, tais como os resíduos de lisina (Lys) e/ou arginina (Arg). Os resíduos de aminoácidos que não são carregados positivamente podem ser os resíduos de aminoácidos com carga neutra, os resíduos de aminoácidos carregados negativamente e/ou os resíduos de aminoácidos hidrofóbicos.
[0055] "Grupo hidrofóbico" refere-se a um grupo químico, como uma cadeia lateral de aminoácido, que tem baixa ou nenhuma afinidade pelas moléculas de água, porém maior afinidade pelas moléculas de óleo. As substâncias hidrofóbicas tendem a ter baixa ou nenhuma solubilidade em água ou fases aquosas e são tipicamente apolares, porém tendem a ter maior solubilidade em fases oleosas. Os exemplos de aminoácidos hidrofóbicos incluem a glicina (Gly), a alanina (Ala), a valina (Val), a Leucina (Leu), a isoleucina (Ile), a prolina (Pro), a fenilalanina (Phe), a metionina (Met) e o triptofano (Trp)
[0056] "Aumentar" se refere a um grau de atividade de um agente, como a atividade antimicrobiana, que é maior do que seria de outra forma. "Aumentar" engloba os efeitos aditivos e sinergísticos (superaditivos).
[0057] "Sinergístico" ou "superaditivo" refere-se a um efeito benéfico ocasionado por duas substâncias em combinação, que excede a soma dos efeitos dos dois agentes trabalhando independentemente. Em certas modalidades, o efeito sinergístico ou superaditivo significativamente, isto é, estatística e significativamente, excede a soma dos efeitos dos dois agentes trabalhando independentemente. Um ou ambos os ingredientes ativos podem ser empregados em um nível sublimite, isto é, um nível no qual, se a substância ativa for empregada individualmente, não produz um efeito ou produz um efeito muito limitado. O efeito pode ser medido por ensaios como o ensaio chekerboard, descrito aqui.
[0058] "Tratamento" refere-se a qualquer processo, ação, aplicação, terapia ou semelhante, em que um paciente, como um ser humano, é submetido à ajuda médica com o objetivo de curar um distúrbio, erradicar um patógeno ou melhorar a condição do paciente, direta ou indiretamente. O tratamento também se refere à redução da incidência, alívio dos sintomas, eliminação da recorrência, prevenção da recorrência, prevenção da incidência, redução do risco de incidência, melhora dos sintomas, melhora do prognóstico ou suas combinações. O "tratamento" pode ainda abranger a redução da população, da taxa de crescimento ou da virulência de uma bactéria no paciente e, assim, controlar ou reduzir uma infecção bacteriana em um paciente ou a contaminação bacteriana de um órgão, tecido ou ambiente. Assim, o "tratamento" que reduz a incidência pode, por exemplo, ser eficaz para inibir o crescimento de pelo menos uma bactéria Gram-negativa em um meio particular, seja ele um paciente ou um ambiente. Por outro lado, o "tratamento" de uma infecção já estabelecida refere-se a inibir o crescimento, reduzir a população, matar, inclusive erradicar, uma bactéria Gram-negativa responsável por uma infecção ou contaminação.
[0059] "Prevenir" refere-se à prevenção da incidência, recorrência, propagação, início ou estabelecimento de um distúrbio,
como uma infecção bacteriana. Não se pretende que a presente invenção seja limitada à prevenção completa ou à prevenção do estabelecimento de uma infecção. Em algumas modalidades, o início é retardado ou a gravidade de uma doença contraída subsequentemente ou a chance de contrair a doença é reduzida, e isso constitui exemplos de prevenção.
[0060] "Doenças contraídas" se refere às doenças que se manifestam com sintomas clínicos ou subclínicos, como a detecção de febre, sepse ou bacteremia, bem como às doenças que podem ser detectadas pelo crescimento de um patógeno bacteriano (por exemplo, em cultura), quando os sintomas associados à tal patologia ainda não se manifestaram.
[0061] O termo "derivado", no contexto de um peptídeo ou polipeptídeo ou seus fragmentos ativos, se destina a abranger, por exemplo, um polipeptídeo modificado para conter uma ou mais partes químicas diferentes de um aminoácido, que não impactam ou destroem substancial e adversamente a atividade lítica. A parte química pode ser ligada covalentemente ao peptídeo, por exemplo, por meio de um resíduo de aminoácido amino terminal, um resíduo de aminoácido carbóxi terminal, ou em um resíduo de aminoácido interno. Essas modificações podem ser naturais ou não naturais. Em certas modalidades, uma modificação não natural pode incluir a adição de um grupo protetor ou de cobertura sobre uma porção reativa, a adição de uma marca detectável, como uma marca de anticorpo e/ou fluorescente, a adição ou a modificação da glicosilação ou a adição de um grupo de aumento, como o PEG (peguilação), e outras alterações conhecidas dos especialistas na técnica. Em certas modalidades, a modificação não natural pode ser uma modificação de cobertura, como as acetilações N terminais e as amidações C terminais. Os grupos protetores ilustrativos que podem ser adicionados aos peptídeos de Chp incluem, porém não estão limitados à, t-Boc e Fmoc. As proteínas marcadoras fluorescentes comumente usadas, tais como, porém não limitadas à, proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente vermelha (RFP), proteína fluorescente ciano (CFP), proteína fluorescente amarela (YFP) e mCherry, são proteínas compactas que podem ser ligadas covalente ou não covalentemente a um peptídeo de Chp ou fundidas a um peptídeo de Chp, sem interferir com as funções normais das proteínas celulares. Em certas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína fluorescente pode ser inserido a montante ou a jusante da sequência de polinucleotídeos de Chp. Isto produzirá uma proteína de fusão (por exemplo, Peptídeo::GFP) que não interfere com a função celular ou a função de um peptídeo de Chp ao qual ela está ligada. A conjugação do polietileno glicol (PEG) com as proteínas tem sido usada como um método para prolongar a meiavida de circulação de muitas proteínas farmacêuticas. Assim, no contexto de derivados do peptídeo de Chp, o termo "derivado" abrange os peptídeos de Chp quimicamente modificados por ligação covalente de uma ou mais moléculas de PEG. Espera-se que os peptídeos de Chp peguilados exibam uma meiavida de circulação prolongada em comparação com os peptídeos de Chp não peguilados, ao mesmo tempo mantendo a atividade biológica e terapêutica.
[0062] "Porcentagem de identidade da sequência de aminoácidos" refere-se à porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência de polipeptídeo de referência, como uma sequência de peptídeos de Chp específica, após o alinhamento das sequências e a introdução de lacunas, se necessário, para atingir a porcentagem máxima de identidade da sequência, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade da sequência. O alinhamento para propósitos de determinação da porcentagem de identidade da sequência de aminoácidos pode ser obtido de várias maneiras que estão dentro da habilidade na técnica, por exemplo, usando o software disponível publicamente, como o BLAST, ou um software disponível comercialmente, por exemplo, da DNASTAR. Duas ou mais sequências polipeptídicas podem ser, em qualquer lugar, de 0-100% idênticas, ou qualquer valor inteiro entre elas. No contexto da presente invenção, dois polipeptídeos são "substancialmente idênticos" quando pelo menos 80% dos resíduos de aminoácidos (tal como pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 92,5%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99%) forem idênticos. O termo "porcentagem (%) de identidade da sequência de aminoácidos", conforme descrito neste documento, também se aplica aos peptídeos de Chp. Assim, o termo "substancialmente idênticos" abrangerá as variantes mutadas, truncadas, fundidas ou de outra forma modificadas na sequência dos polipeptídeos e peptídeos de Chp isolados descritos neste documento e os seus fragmentos ativos, bem como os polipeptídeos com identidade da sequência substancial (por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92,5%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade, conforme medida, por exemplo, por um ou mais métodos mencionados acima) em comparação com o polipeptídeo de referência (tipo selvagem ou outro intacto).
[0063] Como usado neste documento, duas sequências de aminoácidos são "substancialmente homólogas" quando pelo menos cerca de 80% dos resíduos de aminoácidos (tal como pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 92,5%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99%) forem idênticos ou representem substituições conservativas. As sequências dos polipeptídeos da presente invenção são substancialmente homólogas quando um ou mais, tal como até 10%, até 15% ou até 20% dos aminoácidos do polipeptídeo, tal como os peptídeos de Chp descritos neste documento, forem substituídos por uma substituição de aminoácido semelhante ou conservativa, e em que os peptídeos resultantes têm pelo menos uma atividade (por exemplo, efeito antibacteriano) e/ou especificidades bacterianas do polipeptídeo de referência, como os peptídeos de Chp divulgados neste documento.
[0064] Como utilizado neste documento, uma "substituição conservativa de aminoácido" é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral com uma carga semelhante. As famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais com cargas semelhantes foram definidas na técnica. Estas famílias incluem os aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais apolares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais ramificadas em beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).
[0065] "Composição inalável" refere-se às composições farmacêuticas da presente invenção que são formuladas para a liberação direta ao trato respiratório, durante ou em combinação com a respiração de rotina ou assistida (por exemplo, por administração intratraqueobrônquica, pulmonar e/ou nasal), incluindo, porém não limitadas às, formulações atomizadas, nebulizadas, em pó seco e/ou em aerossol.
[0066] "Biofilme" refere-se às bactérias que se fixam às superfícies e se agregam em uma matriz polimérica hidratada que pode ser compreendida de componentes derivados de bactérias e/ou de hospedeiros. Um biofilme é um agregado de micro-organismos no qual as células aderem umas às outras sobre uma superfície biótica ou abiótica. Essas células aderentes estão frequentemente incrustadas em uma matriz compreendida de, porém não limitada à, substância polimérica extracelular (EPS). O biofilme de EPS, que também é referido como lodo (embora nem tudo descrito como lodo seja um biofilme) ou placa, é um conglomeração polimérica, em geral, composta de DNA, proteínas e polissacarídeos extracelulares.
[0067] "Adequado", no contexto de um antibiótico sendo adequado para uso contra certas bactérias, se refere a um antibiótico que foi considerado ser eficaz contra essas bactérias, mesmo se a resistência se desenvolvesse posteriormente.
[0068] "Membrana Externa" ou "ME" refere-se a uma característica das bactérias Gram-negativas. A membrana externa é compreendida de uma bicamada lipídica com uma folhinha interna de fosfolipídios e uma folhinha anfifílica externa consistindo basicamente em lipopolissacarídeo (LPS). O LPS tem três seções principais: um fosfolipídio à base de glicosamina hexa-acilado, chamado lipídio A, um núcleo de polissacarídeo e uma cadeia de polissacarídeo externa e estendida, chamada antígeno O. A ME apresenta um continuum não fluido, estabilizado por três interações principais, incluindo: i) a ligação ávida das moléculas de LPS umas às outras, especialmente se os cátions estiverem presentes para neutralizar os grupos fosfato; ii) o acondicionamento firme das cadeias de acila amplamente saturadas; e iii) o empilhamento hidrofóbico da parte de lipídio A. A estrutura resultante é uma barreira para as moléculas tanto hidrofóbicas quanto hidrofílicas. Abaixo da ME, o peptidoglicano forma uma camada fina que é muito sensível à clivagem hidrolítica - ao contrário do peptidoglicano de bactérias Gram-negativas que tem 30-100 nanômetros (nm) de espessura e consiste em até 40 camadas, o peptidoglicano de bactérias Gram-negativas tem apenas 2-3 nm de espessura e consiste em apenas 1-3 camadas. Fagos Microviridae
[0069] Os membros da família de fagos Microviridae podem ser de particular interesse como fontes potenciais de agentes anti-infecciosos por várias razões. Conforme divulgado neste documento, verificou-se que um grande subconjunto desses fagos, incluindo aqueles do gênero Chlamydiamicrovirus (Family Microvirus, subfamília Gokushovirinae), não tem sequência de amurina conservada e, em vez disso, codifica pequenos peptídeos catiônicos não caracterizados que parecem formar a base de um sistema lítico até então não caracterizado. Além disso, os bacteriófagos da família Microviridae infectam organismos clinicamente relevantes, incluindo os membros das famílias Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae e Chlamydiaceae (Doore SM et al, 2016. Virology 491:45-55.). Eles também carecem de amurinas e, em vez disso, como divulgado neste documento, codificam peptídeos do tipo antimicrobianos não caracterizados (chamados peptídeos de amurina) que não tinham sido anteriormente identificados ou tinham uma função atribuída a eles. Foi fundamentado que, se os peptídeos do tipo antimicrobianos putativos agem de uma maneira semelhante aos peptídeos antimicrobianos (AMPs) descritos anteriormente, eles seriam então previstos permitir a "lise de fora" em uma maneira não possível com as amurinas e os seus alvos citoplasmáticos.
[0070] Com base em uma análise de bioinformática de todas as sequências genômicas de Microviridae anotadas no GenBank (com um foco em fagos que não possuem amurinas), foram identificados 40 quadros de leitura abertos novos e sintênicos. Eles codificam pequenos peptídeos catiônicos com estruturas helicoidais alfa previstas, semelhantes aos AMPs (porém, com sequências de aminoácidos diferentes dos AMPs) dos sistemas imunológicos inatos de uma variedade de vertebrados. Esses peptídeos, coletivamente referidos como "peptídeos de Chp" ou "peptídeos de amurina", são encontrados principalmente no gênero Chlamydiamicrovirus e, em menor extensão, em outros membros relacionados da subfamília Gokushovirinae. Ver, por exemplo, as Tabelas 1 e 2 abaixo. Os peptídeos de Chp de uma gama de fagos Microviridae podem exibir 30-100% de identidade entre si e podem ter nenhuma ou pouca homologia com outros peptídeos no banco de dados de sequência de proteínas. Ver, por exemplo, a Tabela 3 abaixo. Com base na predição que os peptídeos de Chp possuem atividades do tipo AMP, os 39 membros da família diferentes foram sintetizados (Chp2 e Chp3 sendo sequências de aminoácidos idênticas) para análise em diferentes ensaios de Aspartato Aminotransferase (AST). Com base em valores de concentração inibitória mínima (MIC) de 0,25-4 µg/mL na presença de soro humano, vários peptídeos de Chp demonstraram atividade sérica superior em comparação com um grupo de até 17 AMPs conhecidos testados (incluindo os efetores imunológicos inatos e os seus derivados). Além disso, a atividade contra uma gama de patógenos Gram-negativos foi demonstrada, incluindo vários nas listas de prioridade da Organização Mundial da Saúde (OMS) e Centros para Controle de Doenças (CDC), incluindo P. aeruginosa, E. coli, E. cloacae, K pneumoniae, A. baumannii e S. typhimurium.
[0071] Para pelo menos dois dos potentes peptídeos de Chp, Chp2 e Chp4, foi demonstrada a capacidade de ser sinergístico in vitro com uma gama de até 11 antibióticos contra P. aeruginosa, incluindo os antibióticos usados no tratamento clínico de infecções Gram-negativas. Além disso, tanto o Chp2 quanto o Chp4 foram mostrados terem atividades antibiofilme potentes no formato de ensaio de MBEC (MBEC = 0,25 µg/mL) e atividade bactericida no formato de ensaio de time-kill em concentrações abaixo de 1 µg/mL ou inferiores. Ver o Exemplo 5,
abaixo.
[0072] No geral, essas descobertas são consistentes com um papel para os membros da família de Chp no processo de lise da célula hospedeira (no contexto do ciclo de vida do bacteriófago) e com o uso de peptídeos de Chp purificados ou seus derivados como agentes antimicrobianos de amplo espectro para atingir os patógenos Gram- negativos. Uma grande desvantagem com o uso dos AMPs descritos anteriormente como um tratamento para infecções invasivas diz respeito à toxicidade para os eritrócitos e uma atividade membranolítica generalizada (isto é, hemólise) (Oddo A. et al., 2017. Hemolytic Activity of Antimicrobial Peptides. Methods Mol Biol 1548:427-435). Em geral, isso pode ser testado in vitro usando um ensaio padronizado para detectar a lise de glóbulos vermelhos humanos. Muitos dos peptídeos de Chp divulgados neste documento não exibem atividade hemolítica contra os glóbulos vermelhos humanos, em contraste com vários AMPs descritos na literatura (bem como o Triton X-100) terem atividade hemolítica. Em certas modalidades, os peptídeos de Chp divulgados neste documento podem exibir apenas atividade hemolítica mínima ou nenhuma atividade hemolítica contra os glóbulos vermelhos humanos, em comparação comos AMPs. Outra desvantagem dos AMPs descritos na literatura diz respeito a uma perda de atividade na presença de matrizes de sangue humano e concentrações de sal fisiológicas (Mohanram H. et al., 2016. Salt-resistant short antimicrobial peptides. Biopolymers 106:345-356); na verdade, este efeito dos AMPs conhecidos pode ser observado na Tabela 6, abaixo. Os dados proporcionados neste documento demonstram que certos peptídeos de Chp são ativos na presença de soro ou plasma humano e/ou ativos em meios de crescimento, como o caldo de Mueller Hinton e o meio de Casaminoácido, contendo concentrações de sal fisiológicas. Embora não desejando ser limitado pela teoria, acredita-se que as diferenças observadas nas atividades dos peptídeos de Chp e peptídeos AMP (na literatura) possam ser atribuídas às fontes distintas dos dois tipos de agentes, onde os peptídeos de Chp são do fago e os AMPs são amplamente baseados em efetores imunológicos inatos dos sistemas imunológicos de vertebrados. A alta atividade dos peptídeos de Chp, a atividade dos peptídeos de Chp em matrizes de sangue e/ou a ausência de atividade hemolítica os tornam adequados para uso no tratamento de doenças invasivas. Por exemplo, em certas modalidades, os peptídeos de Chp podem ser ativos em quantidades nanomolares.
[0073] Em resumo, embora os agentes terapêuticos de lisina direcionados para patógenos específicos tenham a capacidade de servir como terapia personalizada para infecções monomicrobianas graves, causadas por patógenos MDR conhecidos, ainda há uma necessidade médica não atendida por agentes para tratar infecções graves e potencialmente fatais causadas por infecções por bactérias Gram- negativas resistentes a polimicrobianos (por exemplo, certas infecções intra-abdominais, bem como infecções graves de feridas por queimaduras, cirurgias e outras). Os peptídeos de Chp divulgados neste documento ajudam a atender essa necessidade porque foram mostrados aqui exibir atividade potente contra todos os principais patógenos ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter) comumente associados à MDR, e espera- se que sejam ativos contra muitas bactérias Gram-negativas. Os peptídeos de Chp divulgados neste documento podem ser ativos em altas concentrações nanomolares, comparáveis às das lisinas ativas. Os peptídeos de Chp divulgados neste documento também podem ser responsáveis por efeitos bacteriolíticos altamente potentes e rápidos, pela capacidade de limpar os biofilmes, por sinergia com os antibióticos convencionais e sinergia entre si, tal como sinergia entre dois ou mais peptídeos de Chp.
[0074] Embora os peptídeos de Chp da presente invenção não precisem ser modificados pela adição de peptídeos antimicrobianos, em certas modalidades, os peptídeos de Chp divulgados neste documento podem ser incorporados em uma proteína de fusão. Por exemplo, uma proteína de fusão pode compreender um peptídeo de Chp como divulgado neste documento e uma lisina, tal como uma lisina ativa contra bactérias Gram-negativas. Em certas modalidades, o peptídeo de Chp pode ser adicionado à extremidade de N ou à extremidade de C de uma lisina com ou sem uma sequência ligadora. Considera-se que os polipeptídeos de fusão contendo mais do que um segmento bacteriolítico possam contribuir positivamente para a atividade bacteriolítica da lisina de origem e/ou do peptídeo de Chp de origem. Polipeptídeos
[0075] Conforme demonstrado e explicado neste documento, os peptídeos de Chp descritos nesta seção, incluindo os peptídeos de Chp do tipo selvagem, os peptídeos de Chp modificados e os seus derivados ou fragmentos ativos, podem ser usados nas composições farmacêuticas e nos métodos descritos neste documento.
[0076] Em algumas modalidades, o peptídeo de Chp é selecionado a partir de pelo menos um de Chp1 (SEQ ID NO: 1), Chp2 (SEQ ID NO: 2), CPAR39 (SEQ ID NO: 3), Chp3 (SEQ ID NO: 54); Chp4 (SEQ ID NO: 4), Chp6 (SEQ ID NO: 6), Chp7 (SEQ ID NO: 7), Chp8 (SEQ ID NO: 8), Chp 9 (SEQ ID NO: 9), Chp 10 (SEQ ID NO: 10), Chp 11 (SEQ ID NO: 11), Chp12 (SEQ ID NO: 12), Gkh1 (SEQ ID NO: 13), Gkh2 (SEQ ID NO: 14), Unp1 (SEQ ID NO: 15), Ecp1 (SEQ ID NO: 16), Tma1 (SEQ ID NO: 17), Ecp2 (SEQ ID NO: 18), Osp1 (SEQ ID NO: 19), Unp2 (SEQ ID NO: 20), Unp3 (SEQ ID NO: 21), Gkh3 (SEQ ID NO: 22), Unp5 (SEQ ID NO: 23), Unp6 (SEQ ID NO: 24), Spi1 (SEQ ID NO: 25), Spi2 (SEQ ID NO: 26), Ecp3 (SEQ ID NO: 55), Ecp4 (SEQ ID NO: 56); Lvp1 (SEQ ID
NO: 57), Lvp2 (SEQ ID NO: 58), ALCES1 (SEQ ID NO: 59), AVQ206 (SEQ ID NO: 60), AVQ244 (SEQ ID NO: 61), CDL907 (SEQ ID NO: 62), AGT915 (SEQ ID NO: 63), HH3930 (SEQ ID NO: 64), Fen7875 (SEQ ID NO: 65), SBR77 (SEQ ID NO: 66), e Bdp1 (SEQ ID NO: 67) ou seus fragmentos ativos tendo atividade lítica.
[0077] O peptídeo de Chp pode ser um peptídeo de Chp modificado ou seu fragmento ativo. Em certas modalidades, o peptídeo de Chp ou o seu fragmento ativo contém pelo menos uma modificação em relação a pelo menos uma das SEQ ID NOs. 1-4, 6-26 e 54-66, tal como pelo menos uma substituição, inserção ou remoção de aminoácido. Em certas modalidades, o peptídeo de Chp modificado compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 92,5%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98% ou tal como pelo menos 99% de identidade da sequência com a sequência de aminoácidos de pelo menos um peptídeo de Chp selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs. 1-4, 6-26 e 54-66 ou um seu fragmento ativo, em que o peptídeo de Chp modificado inibe o crescimento, reduz a população e/ou mata pelo menos uma espécie de bactérias Gram- negativas, como a P. aeruginosa, e opcionalmente pelo menos uma espécie adicional de bactérias Gram-negativas, conforme descrito neste documento, opcionalmente na presença de soro humano.
[0078] Em algumas modalidades, o peptídeo de Chp é selecionado a partir de (i) pelo menos um de Chp1 (SEQ ID NO: 1), Chp2 (SEQ ID NO: 2), CPAR39 (SEQ ID NO: 3), Chp3 (SEQ ID NO: 54); Chp4 (SEQ ID NO: 4), Chp6 (SEQ ID NO: 6), Chp7 (SEQ ID NO: 7), Chp8 (SEQ ID NO: 8), Chp10 (SEQ ID NO: 10), Chp11 (SEQ ID NO: 11), Ecp1 (SEQ ID NO: 16), Ecp2 (SEQ ID NO: 18), Ecp3 (SEQ ID NO: 55), Ecp4 (SEQ ID NO: 56), Osp1 (SEQ ID NO: 19), Unp2 (SEQ ID NO: 20), Gkh3 (SEQ ID NO: 22), Unp5 (SEQ ID NO: 23), Unp6 (SEQ ID NO: 24), Spi1 (SEQ
ID NO: 25), Lvp1 (SEQ ID NO: 57), ALCES1 (SEQ ID NO: 59), AVQ206 (SEQ ID NO: 60), CDL907 (SEQ ID NO: 62), AGT915 (SEQ ID NO: 63) e SBR77 (SEQ ID NO: 66), ou seus fragmentos ativos, ou (ii) um peptídeo de Chp modificado tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92,5%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade da sequência com pelo menos uma das SEQ ID NOs. 1-4, 6-8, 10, 11, 16, 18, 19, 21-25, 54-57, 59, 60, 62, 63 e 66, em que o peptídeo de Chp modificado inibe o crescimento, reduz a população e/ou mata a Pseudomonas aeruginosa e pelo menos uma espécie adicional de bactérias Gram- negativas, opcionalmente na presença de soro humano.
[0079] Em algumas modalidades, o peptídeo de Chp é selecionado a partir de (i) pelo menos um de Chp2 (SEQ ID NO: 2), Chp3 (SEQ ID NO: 54), Chp4 (SEQ ID NO: 4), Chp6 (SEQ ID NO: 6), Ecp1 (SEQ ID NO: 16) e Ecp2 (SEQ ID NO: 18), ou seus fragmentos ativos, ou (ii) um peptídeo de Chp modificado tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92,5%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade da sequência com pelo menos uma das SEQ ID NOs. 2, 4, 6, 16 e 18, em que o peptídeo de Chp modificado inibe o crescimento, reduz a população e/ou mata pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas, como a Pseudomonas aeruginosa, e pelo menos uma espécie adicional de bactérias Gram-negativas, opcionalmente na presença de soro humano.
[0080] Em certas modalidades, o peptídeo de Chp é selecionado a partir de (i) pelo menos um peptídeo de Chp tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; e SEQ ID NO: 6 ou seus fragmentos ativos, ou (ii) um peptídeo de Chp modificado tendo pelo menos 92,5% de identidade da sequência com pelo menos uma das SEQ ID NOs. 2, 4 e 6, em que o peptídeo de Chp modificado inibe o crescimento, reduz a população e/ou mata pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas, como a Pseudomonas aeruginosa, e pelo menos uma espécie adicional de bactérias Gram-negativas, opcionalmente na presença de soro humano.
[0081] Em algumas modalidades, o peptídeo de Chp da presente invenção é um derivado de um dos peptídeos de Chp de referência que foi quimicamente modificado. Uma modificação química inclui, porém não está limitada a, adicionar partes químicas, criar novas ligações e remover partes químicas. As modificações químicas podem ocorrer em qualquer lugar em um peptídeo de Chp, incluindo as cadeias laterais de aminoácidos, bem como as extremidades de amino ou carboxila. Por exemplo, em certas modalidades, o peptídeo de Chp compreende uma modificação por acetilação N terminal. Em certas modalidades, o peptídeo de Chp ou o seu fragmento ativo compreende uma modificação por amidação C terminal. Essas modificações podem estar presentes em mais do que um sítio em um peptídeo de Chp.
[0082] Além disso, um ou mais grupos laterais, ou grupos terminais de um peptídeo de Chp ou seu fragmento ativo podem ser protegidos por grupos protetores conhecidos pelo especialista na técnica.
[0083] Em algumas modalidades, os peptídeos de Chp ou os seus fragmentos ativos são conjugados com uma parte de aumento da duração. Em algumas modalidades, a parte de aumento de duração é o polietileno glicol. O polietileno glicol ("PEG") tem sido usado para obter polipeptídeos terapêuticos de duração aumentada (Zalipsky, S., Bioconjugate Chemistry, 6:150-165 (1995); Mehvar, R., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3:125-136 (2000), que é incorporado neste documento por referência na sua totalidade). A cadeia principal do PEG, (CH2CH2-0-)n, em que n é um número de monômeros de repetição, é flexível e anfifílica. Quando ligadas a outra entidade química, como um peptídeo de Chp ou o seu fragmento ativo, as cadeias poliméricas de PEG podem proteger tais polipeptídeos da resposta imune e de outros mecanismos de depuração. Como resultado, a peguilação pode levar a eficácia e segurança melhoradas otimizando a farmacocinética, aumentando a biodisponibilidade e diminuindo a imunogenicidade e a quantidade e/ou a frequência de dosagem. Polinucleotídeos Peptídeos de Chp e seus fragmentos ativos
[0084] Em um aspecto, a presente invenção é voltada para um polinucleotídeo isolado compreendendo uma molécula de ácido nucleico que codifica um peptídeo de Chp ou os seus fragmentos ativos tendo atividade lítica. Como utilizado neste documento, a "atividade lítica" abrange a capacidade de um peptídeo de Chp de matar as bactérias, reduzir a população de bactérias ou inibir o crescimento bacteriano, por exemplo, penetrando na membrana externa de uma bactéria Gram-negativa (por exemplo, P. aeruginosa), na presença ou na ausência de soro humano. A atividade lítica também abrange a capacidade de remover ou reduzir um biofilme e/ou a capacidade de reduzir a concentração inibitória mínima (MIC) de um antibiótico, na presença e/ou na ausência de soro humano.
[0085] Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um peptídeo de Chp tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 65; e SEQ ID NO: 66 ou seus fragmentos ativos.
[0086] Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um peptídeo de Chp tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 65; e SEQ ID NO: 66 ou seus fragmentos ativos.
[0087] Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um peptídeo de Chp tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 63; e SEQ ID NO: 66 ou seu fragmento ativo e, em certas modalidades, o ácido nucleico codifica um peptídeo de Chp tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; e SEQ ID NO: 54 ou seus fragmentos ativos.
[0088] Em algumas modalidades, os peptídeos de Chp divulgados neste documento e os seus fragmentos ativos são capazes de penetrar na membrana externa das bactérias Gram-negativas. Sem estar limitado pela teoria, após a penetração na membrana externa, os peptídeos de Chp ou os seus fragmentos ativos podem degradar o peptidoglicano, um importante componente estrutural da parede celular bacteriana, resultando na lise celular. Em algumas modalidades, os peptídeos de Chp ou os seus fragmentos ativos divulgados neste documento contêm domínios helicoidais α N e/ou C terminais carregados positivamente (e anfipáticos) que facilitam a ligação à membrana externa aniônica de uma bactéria Gram-negativa para efetuar a deslocamento para o peptidoglicano subadjacente.
[0089] A capacidade de um peptídeo de Chp ou do seu fragmento ativo de penetrar em uma membrana externa de uma bactéria Gram- negativa pode ser avaliada por qualquer método conhecido na técnica, tal como descrito no WO 2017/049233, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade. Por exemplo, o peptídeo de Chp ou o seu fragmento ativo pode ser incubado com as bactérias Gram-negativas e um composto hidrofóbico. A maioria das bactérias Gram-negativas é fortemente resistente a compostos hidrofóbicos, devido à presença da membrana externa e, portanto, não permite a captação de agentes hidrofóbicos como a 1-N-fenilnaftilamina (NPN), a violeta de cristal ou o ácido 8-anilino-1-naftalenossulfônico (ANS). A NPN, por exemplo, apresenta fluorescência forte sob condições hidrofóbicas e fraca sob condições aquosas. Consequentemente, a fluorescência da NPN pode ser usada como uma medição da permeabilidade da membrana externa.
[0090] Mais particularmente, a capacidade de um peptídeo de Chp ou do seu fragmento ativo de penetrar em uma parede externa pode ser avaliada incubando, por exemplo, a NPN com uma bactéria Gram- negativa, por exemplo, a cepa de P. aeruginosa PA01, na presença do peptídeo de Chp ou do seu fragmento ativo a ser testado quanto à atividade. Uma indução maior de fluorescência em comparação com a fluorescência emitida na ausência de um peptídeo de Chp (controle negativo) indica penetração na membrana externa. Além disso, a indução de fluorescência pode ser comparada àquela de agentes de permeabilização estabelecidos, como o EDTA (etileno diamina tetra- acetato), ou um antibiótico, como um antibiótico de último recurso usado no tratamento de P. aeruginosa, ou seja, a Polimixina B (PMB), para avaliar o nível de permeabilização da membrana externa.
[0091] Em algumas modalidades, os peptídeos de Chp divulgados neste documento ou os seus fragmentos ativos exibem atividade lítica na presença e/ou na ausência de soro humano. Os métodos adequados para avaliar a atividade de um peptídeo de Chp ou do seu fragmento ativo em soro humano são conhecidos na técnica e descritos nos exemplos. Resumidamente, um valor de MIC (isto é, a concentração mínima de peptídeo suficiente para suprimir pelo menos 80% do crescimento bacteriano em comparação com o controle) pode ser determinado para um peptídeo de Chp ou o seu fragmento ativo e comparado com, por exemplo, um composto inativo no soro humano, por exemplo, a lisozima do fago T4 ou a artilisina GN126. A lisozima do fago T4 está disponível comercialmente, por exemplo, da Sigma- Aldrich, Inc. A GN126 corresponde à Art-175, que é descrita na literatura e é obtida por fusão do AMP SMAP-29 à GN lisina KZ144. Ver Briers et al. 2014, Antimicrob, Agents Chemother. 58:3774-3784, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
[0092] Mais particularmente, os valores de MIC para um peptídeo de Chp ou o seu fragmento ativo podem ser determinados contra, por exemplo, a cepa de P. aeruginosa PA01 de laboratório, em, por exemplo, caldo de Mueller-Hinton, caldo de Mueller-Hinton suplementado com soro humano, CAA como descrito neste documento, que inclui concentrações de sal fisiológicas e CAA suplementado com soro humano. O uso de PA01 permite o teste na presença de concentrações séricas elevadas, pois, ao contrário da maioria dos isolados clínicos, a PA01 é insensível à atividade antibacteriana de matrizes de sangue humano.
[0093] Em algumas modalidades, os peptídeos de Chp divulgados neste documento ou os seus fragmentos ativos são capazes de reduzir um biofilme. Os métodos para avaliar a Concentração Mínima de Erradicação de Biofilme (MBEC) de um peptídeo de Chp ou seu fragmento ativo podem ser determinados usando uma variação do método de MIC por microdiluição de caldo com modificações (Ver Ceri et al. 1999. J. Clin Microbial. 37:1771-1776, que é incorporado neste documento por referência na sua totalidade, e Schuch et al., 2017, Antimicrob. Agents Chemother. 61, páginas 1-18, que é incorporado neste documento por referência na sua totalidade). Neste método, as colônias novas de, por exemplo, uma cepa de P. aeruginosa, como a ATCC 17647, são suspensas em meio, por exemplo, solução de tampão de fosfato (PBS) diluída, por exemplo, 1: 100 em TSBg (caldo tríptico de soja suplementado com glicose a 0,2%), adicionadas como, por exemplo, alíquotas de 0,15 ml, a um Dispositivo de Biofilme de Calgary (placa de 96 poços com uma tampa contendo 96 pinos de policarbonato; Innovotech Inc.) e incubadas, por exemplo, 24 horas a 37°C. Os biofilmes são então lavados e tratados com, por exemplo, uma série de diluições de 2 vezes da lisina em TSBg a, por exemplo, 37°C, durante 24 horas. Após o tratamento, os poços são lavados, secos ao ar a, por exemplo, 37°C e coloridos com, por exemplo, violeta de cristal a 0,05% durante 10 minutos. Após a coloração, os biofilmes são descoloridos em, por exemplo, ácido acético a 33% e a OD600 da, por exemplo, violeta de cristal extraída é determinada. A MBEC de cada amostra é a concentração mínima de peptídeo de Chp necessária para remover pelo menos 95% da biomassa do biofilme avaliada por quantificação da violeta de cristal.
[0094] Em algumas modalidades, os peptídeos de Chp divulgados neste documento ou os seus fragmentos ativos reduzem a concentração inibitória mínima (MIC) de um antibiótico na presença e/ou na ausência de soro humano. Qualquer método conhecido para avaliar a MIC pode ser usado. Em algumas modalidades, um ensaio checkerboard é usado para determinar o efeito de um peptídeo de Chp ou do seu fragmento ativo sobre a concentração de antibiótico. O ensaio checkerboard é baseado em uma modificação do método do CLSI para a determinação da MIC por microdiluição do caldo (Ver o Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), CLSI. 2015. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard-10th Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA, que é incorporado neste documento por referência na sua totalidade, e Ceri et al. 1999. J. Clin. Microbiol. 37: 1771-1776, que também é incorporado neste documento por referência na sua totalidade) .
[0095] Os checkerboards são construídos preparando primeiro colunas de, por exemplo, uma placa de microtítulo de polipropileno de 96 poços, em que cada poço tem a mesma quantidade de antibiótico diluído 2 vezes ao longo do eixo horizontal. Em uma placa separada, são preparadas fileiras comparáveis nas quais cada poço tem a mesma quantidade de peptídeo de Chp ou seu fragmento ativo diluído, por exemplo, 2 vezes ao longo do eixo vertical. O peptídeo de Chp ou o seu fragmento ativo e as diluições de antibiótico são então combinados, de modo que cada coluna tenha uma quantidade constante de antibiótico e diluições de duplicação de peptídeo de Chp, ao mesmo tempo que cada fileira tem uma quantidade constante de peptídeo de Chp e diluições de duplicação de antibiótico. Cada poço, assim, tem uma combinação única de peptídeo de Chp e antibiótico. As bactérias são adicionadas às combinações de fármacos em concentrações de 1 x 105 GFU/ml em CAA, por exemplo, com ou sem soro humano. A MIC de cada fármaco, sozinho e em combinação, é então registrada após, por exemplo, 16 horas, a 37°C, em ar ambiente. As concentrações inibitórias fracionárias de soma (∑FICs) são calculadas para cada fármaco e o valor mínimo de ∑FIC (∑FICmín) é usado para determinar o efeito da combinação de peptídeo de Chp/antibiótico.
[0096] Em algumas modalidades, os peptídeos de Chp divulgados neste documento ou os seus fragmentos ativos mostram baixa toxicidade contra eritrócitos. Qualquer metodologia conhecida na técnica pode ser usada para avaliar o potencial para atividade hemolítica dos presentes peptídeos de Chp ou de seus fragmentos ativos.
[0097] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos isolados da presente invenção compreendem uma molécula de ácido nucleico que codifica um peptídeo de Chp modificado, por exemplo, um peptídeo de Chp contendo uma ou mais inserções, remoções e/ou substituições de aminoácidos em comparação com um peptídeo de Chp de referência. Esses peptídeos de Chp de referência incluem qualquer uma das SEQ ID NOs. 1-4, 6-26 e 54-66. Em certas modalidades, o peptídeo de Chp modificado tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade da sequência com um polipeptídeo de Chp de referência tendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs. 1-4, 6-26 e 54-66.
[0098] Os peptídeos de Chp modificados da presente invenção são tipicamente projetados para manter um domínio de hélice α, cuja presença ou ausência pode ser prontamente determinada usando vários programas de software, tais como Jpred4 (compio.dundee.ac.uk/jpred) e Helical Wheel (hael.net/helical.htm).
[0099] Em algumas modalidades, o domínio de hélice α se estende sobre a maior parte da molécula. Ver, por exemplo, o Chp1 e o Chp4 na Figura 1. Em algumas modalidades, o domínio de hélice α é interrompido (ver, por exemplo, o Chp2 na Figura 1) e, em algumas modalidades, o domínio de hélice α é truncado (ver, por exemplo, o Chp6 e o Osp1 na Figura 1). O domínio de hélice α dos peptídeos de Chp da presente invenção varia em tamanho entre cerca de 3 e 32 aminoácidos, mais tipicamente entre cerca de 10 e 25 resíduos de aminoácidos.
[00100] Os peptídeos de Chp modificados da presente invenção mantêm tipicamente uma ou mais atividades funcionais ou biológicas do peptídeo de Chp de referência. Em algumas modalidades, a modificação melhora a atividade antibacteriana do peptídeo de Chp. Tipicamente, o peptídeo de Chp modificado melhorou a atividade antibacteriana in vitro (por exemplo, em tampão e/ou meio) em comparação com o peptídeo de Chp de referência. Em outras modalidades, o peptídeo de Chp modificado melhorou a atividade antibacteriana in vivo (por exemplo, em um modelo de infecção animal). Em algumas modalidades, a modificação melhora a atividade antibacteriana do peptídeo de Chp na ausência e/ou na presença de soro humano.
[00101] Em algumas modalidades, os peptídeos de Chp divulgados neste documento ou as variantes ou os fragmentos ativos deles são capazes de inibir o crescimento da, ou reduzir a população da, ou matar a, P. aeruginosa e, opcionalmente, pelo menos uma outra espécie de bactérias Gram-negativas na ausência ou na presença de, ou tanto na ausência quanto na presença de, soro humano.
[00102] Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico da presente invenção codificam um fragmento ativo dos peptídeos de Chp ou dos peptídeos de Chp modificados divulgados neste documento. O termo "fragmento ativo" refere-se a uma parte de um peptídeo de Chp de tamanho natural, que mantém uma ou mais atividades biológicas do peptídeo de referência. Assim, um fragmento ativo de um peptídeo de
Chp ou peptídeo de Chp modificado, como utilizado neste documento, inibe o crescimento da, ou reduz a população da, ou mata a, P. aeruginosa e, opcionalmente, pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas, conforme descrito neste documento, na ausência ou na presença de, ou tanto na ausência quanto na presença de, soro humano. Tipicamente, os fragmentos ativos mantêm um domínio de hélice α. Em certas modalidades, o fragmento ativo é um peptídeo catiônico que mantém um domínio de hélice α. Vetores e Células Hospedeiras
[00103] Em outro aspecto, a presente invenção é voltada para um vetor que compreende um polinucleotídeo isolado compreendendo uma molécula de ácido nucleico que codifica quaisquer dos peptídeos de Chp ou seus fragmentos ativos divulgados neste documento ou uma sequência complementar dos presentes polinucleotídeos isolados. Em algumas modalidades, o vetor é um plasmídio ou cosmídio. Em outras modalidades, o vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados ao vetor viral. Em algumas modalidades, o vetor pode se replicar autonomamente em uma célula hospedeira na qual é introduzido. Em algumas modalidades, o vetor pode ser integrado no genoma de uma célula hospedeira após a introdução na célula hospedeira e, assim, ser replicado junto com o genoma do hospedeiro.
[00104] Em algumas modalidades, vetores particulares, referidos neste documento como "vetores de expressão recombinantes" ou "vetores de expressão", podem direcionar a expressão de genes aos quais estão ligados operativamente. Uma sequência de polinucleotídeos está "ligada operativamente" quando for colocada em uma relação funcional com outra sequência de nucleotídeos. Por exemplo, um promotor ou sequência de DNA reguladora é dita estar "ligada operativamente" a uma sequência de DNA que codifica para um RNA e/ou uma proteína, se as duas sequências estiverem ligadas operativamente, ou situadas de modo tal que o promotor ou a sequência de DNA reguladora afete o nível de expressão da sequência de DNA codificante ou estrutural. As sequências de DNA ligadas operativamente são tipicamente, porém não necessariamente, contíguas.
[00105] Em algumas modalidades, a presente invenção é voltada para um vetor que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica um peptídeo de Chp tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 65; e SEQ ID NO: 66 ou seus fragmentos ativos.
[00106] Em certas modalidades, o vetor compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica um peptídeo de Chp tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 65; e SEQ ID NO: 66 ou seus fragmentos ativos.
[00107] Em certas modalidades, o vetor compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica um peptídeo de Chp tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 63; e SEQ ID NO: 66 ou seu fragmento ativo e, em certas modalidades, o vetor compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica um peptídeo de Chp tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; e SEQ ID NO: 54 ou seus fragmentos ativos.
[00108] Em geral, qualquer sistema ou vetor adequado para manter, propagar ou expressar um polipeptídeo em um hospedeiro pode ser usado para a expressão dos peptídeos de Chp divulgados neste documento ou seus fragmentos ativos. A sequência de DNA/polinucleotídeos apropriada pode ser inserida no sistema de expressão por qualquer de uma variedade de técnicas bem conhecidas e de rotina, tais como, por exemplo, aquelas mostradas em Sambrook et al., Eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ª Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (2001). Além disso, marcas também podem ser adicionadas aos peptídeos de Chp ou aos seus fragmentos ativos para proporcionar métodos convenientes de isolamento, por exemplo, c-myc, biotina, poli-His, etc. Os kits para tais sistemas de expressão estão comercialmente disponíveis.
[00109] Uma ampla variedade de combinações de hospedeiro/vetor de expressão pode ser empregada na expressão das sequências de polinucleotídeos que codificam os peptídeos de Chp divulgados neste documento ou os seus fragmentos ativos. Muitos vetores adequados são conhecidos pelos versados na técnica e estão disponíveis comercialmente. Os exemplos de vetores adequados são proporcionados, por exemplo, em Sambrook et al, eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ª Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (2001). Tais vetores incluem, entre outros, os vetores cromossômicos, epissômicos e derivados de vírus, por exemplo, os vetores derivados de plasmídios bacterianos, de bacteriófago, de transposons, de epissomos de levedura, de elementos de inserção, de elementos cromossômicos de levedura, de vírus, como os baculovírus, os papovavírus, tais como o SV40, os vírus da vacínia, os adenovírus, os vírus da varíola aviária, os vírus da pseudorraiva e os retrovírus, e os vetores derivados de suas combinações, tais como aqueles derivados de elementos genéticos de plasmídios e bacteriófagos, tais como os cosmídios e os fagomídios.
[00110] Além disso, os vetores podem proporcionar a expressão constitutiva ou induzível dos peptídeos de Chp ou dos seus fragmentos ativos da presente invenção. Os vetores adequados incluem, porém não estão limitados aos, derivados de SV40 e plasmídios bacterianos conhecidos, por exemplo, os plasmídios de E. coli colEl, pCRl, pBR322, pMB9 e os seus derivados, os plasmídios tais como RP4, pBAD24 e pBAD-TOPO; os DNAS de fago, por exemplo, os numerosos derivados do fago A, por exemplo, NM989, e outro DNA de fago, por exemplo, M13 e DNA de fago de cadeia simples filamentoso; os plasmídios de levedura, tais como o plasmídio 2 D ou os seus derivados; os vetores úteis em células eucarióticas, tais como os vetores úteis em células de inseto ou mamífero; os vetores derivados de combinações de plasmídios e DNAs de fago, tais como os plasmídios que tenham sido modificados para empregar o DNA de fago ou outras sequências de controle da expressão; e semelhantes. Muitos dos vetores mencionados acima estão disponíveis comercialmente de fornecedores como a New England Biolabs Inc., a Addgene, a Takara Bio Inc., a ThermoFisher Scientific Inc. etc.
[00111] Além disso, os vetores podem compreender vários elementos reguladores (incluindo promotor, sítio de ligação ao ribossomo, terminador, reforçador, vários elementos cis para controlar o nível de expressão), em que o vetor é construído de acordo com a célula hospedeira. Qualquer de uma ampla variedade de sequências de controle da expressão (sequências que controlam a expressão de uma sequência de polinucleotídeos ligada operativamente a elas) pode ser usada nestes vetores para expressar as sequências de polinucleotídeos que codificam os peptídeos de Chp ou os seus fragmentos ativos da presente invenção. As sequências de controle úteis incluem, porém não estão limitadas: os promotores iniciais ou tardios de SV40, CMV, vacínia, polioma ou adenovírus, o sistema lac, o sistema trp, o sistema TAC, o sistema TRC, o sistema LTR, as regiões operadoras e promotoras principais do fago A, as regiões de controle da proteína de revestimento fd, o promotor para a 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, os promotores da ácido fosfatase (por exemplo, Pho5), os promotores dos fatores de união de levedura, o promotor de E. coli para a expressão em bactérias e outras sequências promotoras conhecidas por controlar a expressão de genes de células procarióticas ou eucarióticas ou os seus vírus, e várias combinações deles. Tipicamente, as sequências de polinucleotídeos que codificam os peptídeos de Chp ou os seus fragmentos ativos estão operativamente ligadas a um promotor heterólogo ou elemento regulador.
[00112] Em outro aspecto, a presente invenção é voltada para uma célula hospedeira que compreende quaisquer dos vetores divulgados neste documento, incluindo os vetores de expressão que compreendem as sequências de polinucleotídeos que codificam os peptídeos de Chp ou os seus fragmentos ativos da presente invenção. Uma ampla variedade de células hospedeiras é útil na expressão dos presentes polipeptídeos. Os exemplos não limitativos de células hospedeiras, adequadas para a expressão dos presentes polipeptídeos, incluem os hospedeiros eucarióticos e procarióticos bem conhecidos, tais como as cepas de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, os fungos, como as leveduras, e as células animais, como as células CHO, Rl.l, B- W e L-M, as células do rim do Macaco Verde Africano (por exemplo, COS 1, COS 7, BSCl, BSC40 e BMT10), as células de inseto (por exemplo, Sf9) e as células humanas e as células vegetais em cultura de tecidos. Embora o hospedeiro de expressão possa ser qualquer célula hospedeira de expressão conhecida, em uma modalidade típica, o hospedeiro de expressão é uma das cepas de E. coli. Estas incluem, porém não estão limitadas às, cepas de E. coli disponíveis comercialmente, como Top10 (ThermoFisher Scientific, Inc.), DH5a (Thermo Fisher Scientific, Inc.), XLI-Blue (Agilent Technologies, Inc.), SCSllO (Agilent Technologies, Inc.), JM109 (Promega, Inc.), LMG194 (ATCC) e BL21 (Thermo Fisher Scientific, Inc.).
[00113] Existem várias vantagens de usar a E. coli como um sistema hospedeiro, incluindo: cinética de crescimento rápido, onde, sob as condições ambientais ideais, o seu tempo de duplicação é cerca de 20 min (Sezonov et al., J. Bacterial. 189 8746-8749 (2007)), culturas de alta densidade facilmente obtidas, transformação fácil e rápida com DNA exógeno etc. Os detalhes sobre a expressão de proteínas em E. coli, incluindo a seleção do plasmídio, bem como a seleção da cepa, são discutidos em detalhes por Rosano, G. e Ceccarelli, E., Front Microbial., 5: 172 (2014).
[00114] A expressão eficiente dos presentes peptídeos de Chp ou de seus fragmentos ativos depende de uma variedade de fatores, tais como os sinais de expressão ótimos (tanto no nível de transcrição quanto de tradução), a duplicação correta da proteína e as características de crescimento celular. Com relação aos métodos para construir o vetor e aos métodos para transduzir o vetor recombinante construído na célula hospedeira, podem ser utilizados métodos convencionais conhecidos na técnica. Embora seja entendido que nem todos os vetores, sequências de controle da expressão e hospedeiros funcionarão igualmente bem para expressar as sequências de polinucleotídeos que codificam os peptídeos de Chp ou os seus fragmentos ativos da presente invenção, um especialista na técnica será capaz de selecionar os vetores, as sequências de controle da expressão e os hospedeiros adequados, sem experimentação indevida, para realizar a expressão desejada sem se afastar do escopo desta descrição.
[00115] Os peptídeos de Chp ou os seus fragmentos ativos da presente invenção podem ser recuperados e purificados a partir de culturas de células recombinantes por métodos bem conhecidos, incluindo a precipitação com sulfato de amônio ou etanol, extração com ácido, a cromatografia de troca aniônica ou catiônica, a cromatografia de fosfocelulose, ca romatografia de interação hidrofóbica, a cromatografia por afinidade, a cromatografia em hidroxilapatita e a cromatografia em lectina. A cromatografia líquida de alto desempenho também pode ser empregada para a purificação do peptídeo de Chp.
[00116] Alternativamente, o sistema de vetor usado para a produção dos peptídeos de Chp ou dos fragmentos ativos da presente invenção pode ser um sistema de expressão sem células. Vários sistemas de expressão sem células estão disponíveis comercialmente, incluindo, porém não estão limitados aos, disponíveis de Promega, LifeTechnologies, Clonetech etc.
[00117] Conforme indicado acima, há uma variedade de opções quando se trata de produção e purificação de proteínas. Os exemplos de métodos e estratégias adequados a serem considerados na produção e na purificação de proteínas são proporcionados em WO 2017/049233, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade, e proporcionados adicionalmente em Structural Genomics Consortium et al., Nat. Methods., 5(2): 135-146 (2008). Composições Farmacêuticas
[00118] As composições da presente invenção podem assumir a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, pelotas, cápsulas, cápsulas contendo líquidos, pós, formulações de liberação contínua, supositórios, aplicações de tampões, emulsões, aerossóis, sprays, suspensões, pastilhas, trociscos, balas, injetáveis, gomas de mascar, unguentos, esfregaços, emplastros de liberação com o tempo, lenços absorventes de líquidos e suas combinações.
[00119] A administração das composições da presente invenção ou das suas formas farmaceuticamente aceitáveis pode ser tópica, ou seja, a composição farmacêutica pode ser aplicada diretamente onde a sua ação for desejada (por exemplo, diretamente em uma ferida), ou sistêmica. Por sua vez, a administração sistêmica pode ser enteral ou oral, ou seja, a composição pode ser administrada por meio do trato digestivo, parenteral, ou seja, a composição pode ser administrada por outras vias que não o trato digestivo, como por injeção ou inalação. Assim, os peptídeos de Chp da presente invenção e as composições que os compreendem podem ser administrados a um paciente por via oral, parenteral, por inalação, por via tópica, retal, nasal, bucal, por meio de um reservatório implantado ou por qualquer outro método conhecido. Os peptídeos de Chp da presente invenção ou os seus fragmentos ativos também podem ser administrados por meio de formas de dosagem de liberação contínua.
[00120] Para a administração oral, os peptídeos de Chp da presente invenção ou os seus fragmentos ativos podem ser formulados em preparações sólidas ou líquidas, por exemplo, comprimidos, cápsulas,
pós, soluções, suspensões e dispersões. A composição pode ser formulada com excipientes, tais como, por exemplo, lactose, sacarose, amido de milho, gelatina, amido de batata, ácido algínico e/ou estearato de magnésio.
[00121] Para preparar as composições sólidas, como os comprimidos e as pílulas, um peptídeo de Chp da presente invenção ou os seus fragmentos ativos podem ser misturados com um excipiente farmacêutico para formar uma composição de pré-formulação sólida. Se desejado, os comprimidos podem ser revestidos com açúcar ou com revestimento entérico por técnicas padrão. Os comprimidos ou as pílulas podem ser revestidas ou compostas de outra forma para proporcionar uma forma de dosagem que proporcione a vantagem de ação prolongada. Por exemplo, o comprimido ou a pílula pode incluir uma dosagem interna e um componente de dosagem externa, sendo o último na forma de um envelope sobre o primeiro. Os dois componentes podem ser separados por uma camada entérica, que serve para resistir à desintegração no estômago e permitir que o componente interno passe intacto para o duodeno ou seja retardado na liberação. Uma variedade de materiais pode ser usada para tais camadas ou revestimentos entéricos, tais materiais incluindo uma série de ácidos poliméricos e misturas de ácidos poliméricos com materiais como a goma-laca, o álcool cetílico e o acetato de celulose.
[00122] As composições tópicas da presente invenção podem compreender ainda um veículo farmacêutica ou fisiologicamente aceitável, tal como um veículo dermatológica ou oticamente aceitável. Esses veículos, no caso de veículos dermatologicamente aceitáveis, podem ser compatíveis com a pele, unhas, membranas mucosas, tecidos e/ou cabelo e podem incluir qualquer veículo dermatológico usado convencionalmente que atenda estes requisitos. No caso dos veículos oticamente aceitáveis, o veículo pode ser compatível com todas as partes da orelha.
Esses veículos podem ser prontamente selecionados por um versado na técnica.
Os veículos para administração tópica das composições da presente invenção incluem, porém não estão limitados aos, compostos de óleo mineral, petróleo líquido, petróleo branco, propileno glicol, polioxietileno e/ou polioxipropileno, cera emulsificante, monoestearato de sorbitan, polissorbato 60, cera de ésteres de cetila, álcool cetearílico, 2- octildodecanol, álcool benzílico e água.
Na formulação de unguentos para a pele, os componentes ativos da presente invenção podem ser formulados, por exemplo, em uma base de hidrocarboneto oleaginoso, uma base de absorção anidra, uma base de absorção de água em óleo, uma base removível por água de óleo em água, e/ou uma base solúvel em água.
Na formulação de composições óticas, os componentes ativos da presente invenção podem ser formulados, por exemplo, em uma suspensão polimérica aquosa que inclui tais veículos como dextranas, polietileno glicóis, polivinilpirrolidona, géis de polissacarídeo, gomas de gelana, como Gelrite®, polímeros celulósicos, como hidroxipropil metilcelulose, e polímeros contendo carbóxi, como os polímeros ou os copolímeros de ácido acrílico, bem como outros demulcentes poliméricos.
As composições tópicas de acordo com a presente invenção podem estar em qualquer forma adequada para aplicação tópica, incluindo soluções aquosas, aquosas-alcoólicas ou oleosas; loção ou dispersões de soro; géis aquosos, anidros ou oleosos; emulsões obtidas por dispersão de uma fase oleosa em uma fase aquosa (O/A ou óleo em água) ou, inversamente, (A/O ou água em óleo); microemulsões ou alternativamente microcápsulas, micropartículas ou dispersões de vesículas lipídicas do tipo iônico e/ou não iônico; cremes; loções; géis; espumas (que podem usar um recipiente pressurizado, um aplicador adequado, um emulsificante e um propulsor inerte); essências; leites; suspensões; e emplastros.
As composições tópicas da presente invenção também podem conter adjuvantes, tais como agentes gelificantes hidrofílicos ou lipofílicos, agentes ativos hidrofílicos ou lipofílicos, agentes conservantes, antioxidantes, solventes, fragrâncias, enchimentos, filtros solares, absorvedores de odores e corantes. Em um aspecto adicional, as composições tópicas divulgadas neste documento podem ser administradas em conjunto com dispositivos tais como adesivos transdérmicos, curativos, compressas, envoltórios, matrizes e bandagens capazes de serem aderidos ou de outra forma associados à pele ou outro tecido de um paciente, sendo capaz de liberar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais peptídeos de Chp ou seus fragmentos ativos, conforme divulgados neste documento.
[00123] Em uma modalidade, as composições tópicas da presente invenção compreendem adicionalmente um ou mais componentes usados para tratar queimaduras tópicas. Esses componentes podem incluir, porém não estão limitados a, um hidrogel de propileno glicol; uma combinação de um glicol, um derivado de celulose e um sal de alumínio solúvel em água; um antisséptico; um antibiótico; e um corticosteroide. Os umectantes, como os ésteres de cera sólida ou líquida; os promotores de absorção, tais como as argilas hidrofílicas ou os amidos; os agentes de aumento de viscosidade; e os agentes de proteção da pele também podem ser adicionados. As formulações tópicas podem estar na forma de enxagues, como os colutórios. Ver, por exemplo, o WO2004/004650.
[00124] As composições da presente invenção também podem ser administradas por injeção de um agente terapêutico compreendendo a quantidade apropriada de um peptídeo de Chp ou seu fragmento ativo e um veículo. Por exemplo, o peptídeo de Chp ou o seu fragmento ativo pode ser administrado por via intramuscular, intratecal, subdérmica, subcutânea ou intravenosa para tratar as infecções por bactérias Gram-
negativas, como as causadas por P. aeruginosa. O veículo pode ser compreendido de água destilada, uma solução salina, albumina, um soro ou qualquer combinação deles. Além disso, as composições farmacêuticas de injeções parenterais podem compreender soluções aquosas ou não aquosas farmaceuticamente aceitáveis de peptídeos de Chp, conforme divulgados neste documento, ou seus fragmentos ativos, além de um ou mais dos seguintes: soluções de pH tamponado, adjuvantes (por exemplo, conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes), formulações de lipossomas, nanopartículas, dispersões, suspensões ou emulsões, bem como pós estéreis para reconstituição em soluções injetáveis estéreis ou dispersões imediatamente antes do uso.
[00125] Nos casos em que a injeção parenteral for o modo de administração escolhido, pode ser usada uma formulação isotônica. Em geral, os aditivos para isotonicidade podem incluir o cloreto de sódio, a dextrose, o manitol, o sorbitol e a lactose. Em alguns casos, as soluções isotônicas, como a solução salina tamponada com fosfato, são preferidas. Os estabilizadores podem incluir a gelatina e a albumina. Um agente de vasoconstrição pode ser adicionado à formulação. As preparações farmacêuticas de acordo com este tipo de aplicação podem ser proporcionadas estéreis e sem pirogênio.
[00126] O diluente pode compreender ainda um ou mais outros excipientes, como o etanol, o propileno glicol, um óleo ou um emulsionante ou tensoativo farmaceuticamente aceitável.
[00127] Em outra modalidade, as composições da presente invenção são composições inaláveis. As composições inaláveis da presente invenção podem compreender ainda um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, os peptídeos de Chp da presente invenção ou os seus fragmentos ativos podem ser formulados como um pó seco inalável. Em modalidades específicas, uma solução para inalação compreendendo os peptídeos de Chp ou os seus fragmentos ativos pode ainda ser formulada com um propulsor para a liberação por aerossol. Em certas modalidades, as soluções podem ser nebulizadas.
[00128] Um tensoativo pode ser adicionado a uma composição farmacêutica inalável da presente invenção, a fim de diminuir a tensão superficial e interfacial entre os medicamentos e o propulsor. Quando os medicamentos, o propulsor e o excipiente forem para formar uma suspensão, um tensoativo pode ou não ser usado. Quando os medicamentos, o propulsor e o excipiente forem para formar uma solução, um tensoativo pode ou não ser usado, dependendo, por exemplo, da solubilidade do medicamento e do excipiente particular. O tensoativo pode ser qualquer composto não tóxico adequado que não seja reativo com o medicamento e que reduza a tensão superficial entre o medicamento, o excipiente e o propulsor e/ou atue como um lubrificante de válvula.
[00129] Os exemplos de tensoativos adequados incluem, porém não estão limitados ao: ácido oleico; trioleato de sorbitan; cloreto de cetil piridínio; lecitina de soja; monolaurato de polioxietileno (20) sorbitan; éter estearílico de polioxietileno (10); éter oleílico de polioxietileno (2); copolímeros em blocos de polioxipropileno-polioxietileno etilenodiamina; monoestearato de polioxietileno (20) sorbitan; mono- oleato de polioxietileno (20) sorbitan; copolímeros em blocos de polioxipropileno-polioxietileno; etoxilato de óleo de rícino; e suas combinações.
[00130] Os exemplos de propulsores adequados incluem, porém não estão limitados ao: diclorodifluormetano, triclorofluormetano, dicloro- tetrafluoretano e dióxido de carbono.
[00131] Os exemplos de excipientes adequados para uso em composições inaláveis incluem, porém não estão limitados à: lactose, amido, diésteres de propileno glicol de ácidos graxos de cadeia média;
ésteres de triglicerídeos de ácidos graxos de cadeia média, cadeias curtas ou cadeias longas ou qualquer combinação deles; perfluordimetilciclobutano; perfluorciclobutano; polietileno glicol; mentol; lauroglicol; monoetiléter de dietileno glicol; glicerídeos poliglicolisados de ácidos graxos de cadeia média; álcoois; óleo de eucalipto; ácidos graxos de cadeia curta; e suas combinações.
[00132] Em algumas modalidades, as composições da presente invenção compreendem as aplicações nasais. As aplicações nasais incluem as aplicações para uso direto, como os sprays nasais, as gotas nasais, os unguentos nasais, as lavagens nasais, as injeções nasais, os tamponamentos nasais, os sprays brônquicos e os inaladores, bem como as aplicações para uso indireto, como as pastilhas para a garganta e os líquidos para a limpeza bucal ou os gargarejos, ou através do uso de unguentos aplicados nas narinas nasais ou no rosto, e qualquer combinação destes e métodos de aplicação semelhantes.
[00133] Em outra modalidade, as composições farmacêuticas da presente invenção compreendem um agente complementar, incluindo um ou mais agentes antimicrobianos e/ou um ou mais antibióticos convencionais. A fim de acelerar o tratamento da infecção ou aumentar o efeito antibacteriano, o agente terapêutico contendo um peptídeo de Chp da presente invenção ou o seu fragmento ativo pode incluir ainda pelo menos um agente complementar que também possa potencializar a atividade bactericida do peptídeo. O agente complementar pode ser um ou mais antibióticos usados para tratar bactérias Gram-negativas. Em uma modalidade, o agente complementar é um antibiótico ou agente antimicrobiano usado para o tratamento de infecções causadas por P. aeruginosa.
[00134] As composições da presente invenção podem ser apresentadas na forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por quaisquer métodos bem conhecidos na técnica. A quantidade de ingredientes ativos que podem ser combinados com um material veículo para produzir uma forma de dosagem única variará, dependendo, por exemplo, do hospedeiro que está sendo tratado, da duração da exposição do receptor às bactérias infecciosas, do tamanho e peso do paciente e do modo particular de administração. A quantidade de ingredientes ativos que podem ser combinados com um material veículo para produzir uma forma de dosagem única pode, por exemplo, ser aquela quantidade de cada composto que produza um efeito terapêutico. Em certas modalidades, de cem por cento, a quantidade total pode variar de cerca de 1 por cento a cerca de noventa e nove por cento de ingredientes ativos, como de cerca de 5 por cento a cerca de 70 por cento, ou de cerca de 10 por cento a cerca de 30 por cento. Dosagem e Administração
[00135] As dosagens administradas podem depender de vários fatores, como a atividade da infecção que está sendo tratada; a idade, a saúde e a condição física geral do paciente a ser tratado; a atividade de um determinado peptídeo de Chp ou de seu fragmento ativo; a natureza e a atividade do antibiótico, se houver, com o qual um peptídeo de Chp ou o seu fragmento ativo de acordo com a presente invenção está sendo unido; e o efeito combinado de tal união. Em certas modalidades, as quantidades eficazes do peptídeo de Chp ou do seu fragmento ativo a ser administrado podem situar-se na faixa de cerca de 1-50 mg/kg (ou 1 a 50 mcg/ml). Em certas modalidades, o peptídeo de Chp ou o seu fragmento ativo pode ser administrado 1-4 vezes ao dia por um período que varia de 1 a 14 dias. O antibiótico, se também for usado, pode ser administrado em regimes de dosagem padrão ou em quantidades menores em vista de qualquer sinergismo. Todas essas dosagens e regimes, no entanto, (seja do peptídeo de Chp ou de seu fragmento ativo ou de qualquer antibiótico administrado em combinação com ele) estão sujeitos à otimização. As dosagens ótimas podem ser determinadas realizando experimentos de eficácia piloto in vitro e in vivo, como está dentro da habilidade na técnica, porém levando em consideração a presente invenção.
[00136] Considera-se que os peptídeos de Chp divulgados neste documento ou os seus fragmentos ativos podem proporcionar um efeito bactericida rápido e, quando usados em quantidades sub-MIC, podem proporcionar um efeito bacteriostático. Considera-se ainda que os peptídeos de Chp divulgados neste documento ou os seus fragmentos ativos podem ser ativos contra uma gama de bactérias resistentes a antibióticos e podem não estar associados à evolução da resistência. Com base na presente invenção, em um cenário clínico, os presentes peptídeos de Chp ou os seus fragmentos ativos podem ser uma alternativa (ou aditivo) potente para o tratamento de infecções decorrentes de bactérias resistentes a fármacos e múltiplos fármacos, sozinhos ou em combinação com antibióticos (incluindo os antibióticos aos quais a resistência desenvolveu-se). Acredita-se que os mecanismos de resistência existentes para as bactérias Gram- negativas não afetem a sensibilidade à atividade lítica dos presentes peptídeos de Chp ou dos seus fragmentos ativos.
[00137] Em algumas modalidades, a exposição com o tempo aos peptídeos de Chp divulgados neste documento ou aos seus fragmentos ativos possa influenciar a concentração desejada de unidades de peptídeos ativos por ml. Os veículos que são classificados como veículos de liberação "longa" ou "lenta" (como, por exemplo, certos sprays nasais ou pastilhas) podem possuir ou proporcionar uma concentração mais baixa de unidades de peptídeo por ml, porém, durante um período de tempo mais longo, ao passo que um veículo de liberação "curta" ou "rápida" (como, por exemplo, um gargarejo) pode possuir ou proporcionar unidades de peptídeo de alta concentração (mcg) por ml, porém, durante um período de tempo mais curto. Existem circunstâncias em que pode ser desejável ter uma unidade/ml de dosagem mais alta ou uma unidade/ml de dosagem mais baixa.
[00138] Para os peptídeos de Chp ou os seus fragmentos ativos da presente invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente em ensaios de cultura de células ou em modelos animais, normalmente camundongos, coelhos, cães ou porcos. O modelo animal também pode ser usado para obter uma faixa de concentrações desejável e uma rota de administração. As informações obtidas podem então ser usadas para determinar as doses eficazes, bem como as rotas de administração, em humanos. A dosagem e a administração podem ser ajustadas adicionalmente para proporcionar níveis suficientes do ingrediente ativo ou para manter o efeito desejado. Os fatores adicionais que podem ser levados em consideração incluem a gravidade do estado da doença; a idade, o peso e o sexo do paciente; a dieta; a duração desejada do tratamento; o método de administração; o tempo e a frequência de administração; as combinações de fármacos; a sensibilidades da reação; a tolerância/resposta à terapia; e o julgamento de um médico assistente.
[00139] Um regime de tratamento pode envolver a administração diária (por exemplo, uma, duas, três vezes etc. diariamente), em dias alternados (por exemplo, uma, duas, três vezes etc. em dias alternados), bissemanal, semanal, uma vez a cada duas semanas, uma vez por mês etc. Em uma modalidade, o tratamento pode ser administrado como uma infusão contínua. As doses unitárias podem ser administradas em múltiplas ocasiões. Os intervalos também podem ser irregulares, conforme indicado pelo monitoramento dos sintomas clínicos. Alternativamente, a dose unitária pode ser administrada como uma formulação de libertação contínua, caso em que pode ser utilizada uma administração menos frequente. A dosagem e a frequência podem variar dependendo do paciente. Será entendido por um versado na técnica que tais diretrizes serão ajustadas para uma administração localizada, por exemplo, intranasal, inalação, retal etc., ou para uma administração sistêmica, por exemplo, oral, retal (por exemplo, por meio de enema), intramuscular (i.m.), intraperitoneal (i.p.), intravenosa (i.v.), subcutânea (s.c.), transuretral e semelhantes. Métodos
[00140] Os peptídeos de Chp e os seus fragmentos ativos da presente invenção podem ser usados in vivo, por exemplo, para tratar infecções bacterianas devidas a bactérias Gram-negativas, como a P. aeruginosa, em um paciente, bem como in vitro, por exemplo, para reduzir o nível de contaminação bacteriana sobre, por exemplo, uma superfície, por exemplo, de um dispositivo médico.
[00141] Por exemplo, em algumas modalidades, os presentes peptídeos de Chp ou os seus fragmentos ativos podem ser usados para a prevenção, o controle, a interrupção e o tratamento de biofilme bacteriano formado por bactérias Gram-negativas. A formação de biofilme ocorre quando as células microbianas aderem umas às outras e são incrustradas em uma matriz de substância polimérica extracelular (EPS) sobre uma superfície. O crescimento de micróbios em um ambiente protegido que está enriquecido com biomacromoléculas (por exemplo, polissacarídeos, ácidos nucléicos e proteínas) e nutrientes permite uma troca de sinais ("cross-talk") microbiana aumentada e uma virulência aumentada. O biofilme pode se desenvolver em qualquer ambiente de suporte, incluindo as superfícies vivas e não vivas, como os tampões de muco do pulmão com FC, os cateteres contaminados, as lentes de contato etc. (Sharma et al. Biologicals, 42(1):1-7 (2014), que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Assim, em uma modalidade, os peptídeos de Chp ou os seus fragmentos ativos da presente invenção podem ser usados para a prevenção, o controle, a interrupção e o tratamento de infecções bacterianas devidas a bactérias Gram-negativas, quando as bactérias estiverem protegidas por um biofilme bacteriano.
[00142] Em um aspecto, a presente invenção é voltada para um método de tratamento de uma infecção bacteriana causada por uma ou mais bactérias Gram-negativas adicionais, como descrito neste documento, compreendendo a administração a um paciente diagnosticado com, em risco de, ou exibindo sintomas de, uma infecção bacteriana de uma composição farmacêutica conforme descrita neste documento.
[00143] Os termos "infecção" e "infecção bacteriana" pretendem incluir as infecções do trato respiratório (RTIs), como as infecções do trato respiratório em pacientes tendo fibrose cística (FC), as infecções do trato respiratório inferior, como a exacerbação aguda de bronquite crônica (ACEB), a sinusite aguda, a pneumonia adquirida na comunidade (CAP), a pneumonia adquirida em hospital (HAP) e as infecções do trato respiratório nosocomial; as doenças sexualmente transmissíveis, como cervicite gonocócica e a uretrite gonocócica; as infecções do trato urinário; a otite média aguda; a sepse, incluindo a septicemia neonatal e a sepse relacionada ao cateter; e a osteomielite. As infecções causadas por bactérias resistentes a fármacos e bactérias resistentes a múltiplos fármacos também são consideradas.
[00144] Os exemplos não limitativos de infecções causadas por bactérias Gram-negativas, como a P. aeruginosa, incluem: A) Infecções nosocomiais: 1. Infecções do trato respiratório, especialmente em pacientes com fibrose cística e pacientes ventilados mecanicamente; 2. Bacteremia e sepse; 3. Infecções das feridas, especialmente aquelas de vítimas de queimaduras; 4. Infecções do trato urinário; 5. Infecções pós-cirurgias sobre dispositivos invasivos; 6. Endocardite por administração intravenosa de soluções de fármacos contaminadas; 7. Infecções em pacientes com síndrome da imunodeficiência adquirida,
quimioterapia do câncer, terapia com esteroides, neoplasias hematológicas, transplante de órgãos, terapia de substituição renal e outras condições com neutropenia grave. B) Infecções adquiridas na comunidade: 1. Infecções do trato respiratório adquiridas na comunidade; 2. Meningite; 3. Foliculite e infecções do canal auditivo causadas por água contaminada; 4. Otite externa maligna em idosos e diabéticos; 5. Osteomielite do calcâneo em crianças; 6. Infecções oculares comumente associadas a lentes de contato contaminadas; 7. Infecções da pele, como as infecções das unhas em pessoas cujas mãos são frequentemente expostas à água; 8. Infecções do trato gastrointestinal; e 9. Infecções do sistema musculoesquelético.
[00145] As uma ou mais espécies de bactérias Gram-negativas dos presentes métodos podem incluir quaisquer das espécies de bactérias Gram-negativas conforme descritas neste documento. Tipicamente, as espécies adicionais de bactérias Gram-negativas são selecionadas a partir de uma ou mais de Acinetobacter baumannii, Acinetobacter haemolyticus, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aeromonas hydrophila, Bacteroides spp., tais como, Bacteroides fragilis, Bacteroides theataioatamicron, Bacteroides distasonis, Bacteroides ovatus, Bacteroides vulgatus, Bartonella Quintana, Bordetella pertussis, Brucella spp., tais como, Brucella melitensis, Burkholderia spp, tais como, Burkholderia cepacia, Burkholderia pseudomallei, e Burkholderia mallei, Fusobacterium, Prevotella corporis, Prevotella intermedia, Prevotella endodontalis, Porphyromonas asaccharolytica, Campylobacter jejuni, Campylobacter fetus, Campylobacter coli, Chlamydia spp., tais como Chlamydia pneumoniae e Chlamydia trachomatis, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Coxiella burnetii, Edwarsiella spp., tais como, Edwarsiella tarda, Eikenella corrodens, Enterobacter spp., tais como, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, e Enterobacter agglomerans, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Helicobacter pylori, Kingella kingae, Klebsiella spp., tais como, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella rhinoscleromatis, e Klebsiella ozaenae, Legionella penumophila, Moraxella spp., tais como, Moraxella catarrhalis, Morganella spp., tais como, Morganella morganii, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, P. aeruginosa, Pasteurella multocida, Plesiomonas shigelloides, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus penneri, Proteus myxofaciens, Providencia spp., tais como, Providencia stuartii, Providencia rettgeri, Providencia alcalifaciens, Pseudomonas fluorescens, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella paratyphi, Serratia spp., tais como, Serratia marcescens, Shigella spp., tais como, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, e Shigella dysenteriae, Stenotrophomonas maltophilia, Streptobacillus moniliformis, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio alginolyticus, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Ricketsia prowazekii, Coxiella burnetii, Ehrlichia chafeensis e/ou Bartonella hensenae.
[00146] Mais tipicamente, a pelo menos uma outra espécie de bactérias Gram-negativas é selecionada a partir de um ou mais de Acinetobacter baumannii, Bordetella pertussis, Burkholderia cepacia, Burkholderia pseudomallei, Burkholderia mallei, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Legionella penumophila, Moraxella catarrhalis, Morganella morganii, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pasteurella multocida, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Salmonella typhi, Serratia marcescens, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Shigella dysenteriae, Stenotrophomonas maltophilia, Vibrio cholerae, e/ou
Chlamydia pneumoniae.
[00147] Ainda mais tipicamente, a pelo menos uma outra espécie de bactérias Gram-negativas é selecionada a partir de uma ou mais de Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Shigella spp., Escherichia coli, Acinetobacter baumanii, Klebsiella pneumonia, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitides, Serratia spp. Proteus mirabilis, Morganella morganii, Providencia spp., Edwardsiella spp., Yersinia spp., Haemophilus influenza, Bartonella quintana, Brucella spp., Bordetella pertussis, Burkholderia spp., Moraxella spp., Francisella tularensis, Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Bacteroides spp., Enterobacter spp., e/ou Chlamydia spp.
[00148] Ainda mais tipicamente, a pelo menos uma outra espécie de bactérias Gram-negativas é selecionada a partir de uma ou mais de Klebsiella spp., Enterobacter spp., Escherichia coli, Citrobacter freundii, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis e/ou Franciscella tulerensis.
[00149] Em algumas modalidades, a infecção com bactérias Gram- negativas resulta em uma infecção localizada, como uma infecção bacteriana tópica, por exemplo, uma ferida na pele. Em outras modalidades, a infecção bacteriana é uma infecção bacteriana patogênica sistêmica. Os patógenos Gram-negativos comuns e as infecções associadas estão listados na Tabela A da presente invenção. Estes destinam-se a servir como exemplos das infecções bacterianas que podem ser tratadas, mitigadas ou prevenidas com os presentes peptídeos de Chp e os seus fragmentos ativos e não se destinam a ser limitantes. Tabela A - Bactérias Gram-negativas clinicamente relevantes e doenças associadas Salmonella typhimurium Infecções gastrointestinais (GI) - salmonelose Shigella spp. shigelose
Escherichia coli Infecções do trato urinário (ITUs) Acinetobacter baumanii Infecções de feridas Pseudomonas aeruginosa infecções da corrente sanguínea e pneumonia Klebsiella pneumoniae ITUs e infecções da corrente sanguínea Neisseria gonorrhoeae Doença sexualmente transmissível (DST) - gonorreia Neisseria meningitides Meningite Serratia spp.
Contaminações no cateter, ITUs e pneumonia Proteus mirabilis ITUs Morganella spp.
ITUs Providencia spp.
ITUs Edwardsiella spp ITUs Salmonella typhi Infecções GI - febre tifoide Yersinia pestis Peste bubônica e pneumônica Yersinia enterocolitica Infecções GI Yersinia pseudotuberculosis Infecções GI Haemophilus influenza Meningite Bartonella Quintana Febre da trincheira Brucella spp.
Brucelose Bordetella pertussis Respiratórias - Coqueluche Burkholderia spp.
Respiratórias Moraxella spp.
Respiratórias Francisella tularensis Tularemia Legionella pneumophila Respiratórias - Doença do legionário Coxiella burnetii Febre Q
Bacteroides spp. Infecções abdominais Enterobacter spp. ITUs e respiratórias Chlamydia spp. DSTs, respiratórias e oculares
[00150] Em algumas modalidades, os peptídeos de Chp e os seus fragmentos ativos da presente invenção são usados para tratar um paciente em risco de adquirir uma infecção devida a uma bactéria Gram- negativa. Os pacientes em risco de adquirir uma infecção por bactérias Gram-negativas incluem, por exemplo, os pacientes com fibrose cística, pacientes neutropênicos, os pacientes com enterocolite necrosante, as vítimas de queimaduras, os pacientes com infecções de feridas e, mais em geral, os pacientes em um ambiente hospitalar, em particular, os pacientes cirúrgicos e os pacientes sendo tratados usando um dispositivo médico implantável, como um cateter, por exemplo, um cateter venoso central, um dispositivo de Hickman ou dispositivos cardíacos eletrofisiológicos, por exemplo, marcapassos e desfibriladores implantáveis. Os outros grupos de pacientes com risco de infecção por bactérias Gram-negativas incluem, sem limitação, os pacientes com próteses implantadas, como a substituição total da articulação (por exemplo, substituição total do joelho ou quadril).
[00151] Em outro aspecto, a presente invenção é voltada para um método de prevenção ou tratamento de uma infecção bacteriana, que compreende a coadministração a um paciente diagnosticado com, em risco de, ou exibindo sintomas de, uma infecção bacteriana de uma combinação de uma primeira quantidade eficaz da composição contendo uma quantidade eficaz de um peptídeo de Chp ou o seu fragmento ativo, conforme descrito neste documento, e uma segunda quantidade eficaz de um antibiótico adequado para o tratamento de infecção por bactérias Gram-negativas.
[00152] Os peptídeos de Chp e os seus fragmentos ativos da presente invenção podem ser coadministrados com antibióticos de tratamento padrão ou com antibióticos de último recurso, individualmente ou em várias combinações, como dentro da perícia na técnica. Os antibióticos tradicionais usados contra a P. aeruginosa são descritos na Tabela B. Os antibióticos para outras bactérias Gram- negativas, como Klebsiella spp., Enterobacter spp., Escherichia coli, Citrobacter freundii, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis e Franciscella tulerensis, são semelhantes ao proporcionado na Tabela B para a P. aeruginosa. Tabela B - Antibióticos usados para o tratamento de Pseudomonas aeruginosa Classe Agente Penicilinas Ticarcilina-clavulanato Piperacilina-tazobactam Cefalosporinas Ceftazidima Cefepima Cefoperazona Monobactams Aztreonam Flouroquinolonas Ciprofloxacina Levofloxacina Carbapemens Imipenem Meropenem Doripenem Aminoglicosídeos Gentamicina Tobramicina Amicacina Polimixinas Colistina Polimixina B
[00153] Em modalidades mais específicas, o antibiótico é selecionado a partir de um ou mais de ceftazidima, cefepima, cefoperazona, ceftobiprol, ciprofloxacina, levofloxacina,
aminoglicosídeos, imipenem, meropenem, doripenem, gentamicina, tobramicina, amicacina, piperacilina, ticarcilina, penicilina, rifampicina, polimixina B e colistina.
[00154] A combinação dos peptídeos de Chp ou de seus fragmentos ativos da presente invenção com antibióticos proporciona um regime antibacteriano eficaz. Em algumas modalidades, a coadministração dos peptídeos de Chp ou de seus fragmentos ativos da presente invenção com um ou mais antibióticos pode ser realizada em doses e quantidades reduzidas dos peptídeos de Chp ou de seus fragmentos ativos ou do antibiótico ou de ambos, e/ou frequência e/ou duração reduzida do tratamento com atividade bactericida e bacteriostática aumentaa, risco reduzido de resistência aos antibióticos e com risco reduzido de efeitos colaterais neurológicos ou renais deletérios (como aqueles associados ao uso de colistina ou polimixina B). Os estudos anteriores mostraram que a dose cumulativa total de colistina está associada a danos renais, sugerindo que a diminuição na dosagem ou o encurtamento da duração do tratamento usando a terapia de combinação com os peptídeos de Chp ou os seus fragmentos ativos poderia diminuir a incidência de nefrotoxicidade (Spapen et al. Ann Intensive Care. 1: 14 (2011), que é incorporado neste documento por referência na sua totalidade). Como utilizado neste documento, o termo "dose reduzida" refere-se à dose de um ingrediente ativo na combinação em comparação com a monoterapia com o mesmo ingrediente ativo. Em algumas modalidades, a dose de peptídeos de Chp ou de seus fragmentos ativos ou do antibiótico em uma combinação pode ser subótima ou mesmo sublimiar, em comparação com a respectiva monoterapia.
[00155] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona um método para aumentar a atividade antibiótica de um ou mais antibióticos contra as bactérias Gram-negativas, em comparação com a atividade dos referidos antibióticos usados isoladamente, pela administração a um paciente dos peptídeos de Chp ou seus fragmentos ativos, divulgados neste documento, juntamente com um antibiótico de interesse. A combinação é eficaz contra as bactérias e permite que a resistência ao antibiótico seja superada e/ou o antibiótico seja empregado em doses menores, diminuindo os efeitos colaterais indesejáveis, como os efeitos nefrotóxicos e neurotóxicos da polimixina B.
[00156] Os peptídeos de Chp ou os seus fragmentos ativos, opcionalmente em combinação com os antibióticos da presente invenção, podem ser ainda combinados com agentes de permeabilização adicionais da membrana externa das bactérias Gram- negativas, incluindo, porém não limitados aos, quelantes de metal, como, por exemplo, EDTA, TRIS, ácido láctico, lactoferrina, polimixinas, ácido cítrico (Vaara M. Microbial Rev. 56(3):395-441 (1992), que é incorporado neste documento por referência na sua totalidade).
[00157] Ainda em outro aspecto, a presente invenção é voltada para um método de inibir o crescimento ou reduzir a população ou matar pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas, o método compreendendo o contato das bactérias com uma composição contendo uma quantidade eficaz de um peptídeo de Chp ou seu fragmento ativo, como descrito neste documento, em que o peptídeo de Chp ou o seu fragmento ativo inibe o crescimento ou reduz a população ou mata pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas.
[00158] Em algumas modalidades, a inibição do crescimento ou a redução da população ou a matança de pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas compreende o contato das bactérias com os peptídeos de Chp ou os fragmentos ativos conforme descrito neste documento, em que as bactérias estão presentes sobre uma superfície de, por exemplo, dispositivos médicos, pisos, escadas, paredes e bancadas em hospitais e outros prédios relacionados à saúde ou de uso público e superfícies de equipamentos em salas de cirurgia, salas de emergência, quartos de hospital, clínicas e banheiros e semelhantes.
[00159] Os exemplos de dispositivos médicos que podem ser protegidos usando os peptídeos de Chp ou os seus fragmentos ativos descritos neste documento incluem, porém não estão limitados às, tubulações e outros dispositivos médicos de superfície, tais como cateteres urinários, cateteres de extração de mucosa, cateteres de sucção, cânulas umbilicais, lentes de contato, dispositivos intrauterinos, dispositivos intravaginais e intraintestinais, tubos endotraqueais, broncoscópios, próteses dentárias e dispositivos ortodônticos, instrumentos cirúrgicos, instrumentos dentários, tubulações, linhas de água dentárias, tecidos, papel, tiras indicadoras (por exemplo, tiras indicadoras de papel ou tiras indicadoras de plástico), adesivos (por exemplo, adesivos de hidrogel, adesivos fundidos a quente ou adesivos à base de solvente), bandagens, curativos de tecido ou dispositivos de cicatrização e emplastros oclusivos e quaisquer outros dispositivos de superfície usados no campo médico. Os dispositivos podem incluir os eletrodos, as próteses externas, as fitas de fixação, as bandagens de compressão e os monitores de vários tipos. Os dispositivos médicos também podem incluir qualquer dispositivo que possa ser colocado no local de inserção ou implantação, como a pele perto do local de inserção ou implantação, e que possa incluir pelo menos uma superfície que seja suscetível à colonização por bactérias Gram-negativas. Exemplos Materiais e métodos
[00160] Cepas bacterianas e condições de crescimento. A maioria dos estudos divulgados neste documento foi realizada usando um isolado clínico de P. aeruginosa resistente ao carbapenam CFS- 1292, obtido de sangue humano no Hospital for Special Surgery, em Nova York (proporcionado pelo Dr. Lars Westblade, Professor de
Patologia e Medicina Laboratorial), porém também podem ser usados isolados resistentes a antibióticos disponíveis comercialmente. Todos os outros isolados foram obtidos da American Type Culture Collection ("ATCC"), da coleção d'Herelle ("HER"), da BEI Resources ("HM") ou do Hospital for Special Surgery, em Nova York ("HSS") Os isolados foram cultivados e testados em caldo de lisogenia (LB; Sigma-Aldrich), meio de casaminoácido (CAA) (5 g/L de casaminoácidos, Ameresco/VWR; 5,2 mM de K2HPO4, Sigma-Aldrich; 1 mM de MgSO4, Sigma-Aldrich), CAA suplementado com 100 mM de NaCl ou CAA suplementado com soro humano a 2,5% (Tipo AB, masculino, combinado; Sigma-Aldrich). Todos os antibióticos e reagentes de proteína (por exemplo, lisozima T4) foram obtidos da Sigma-Aldrich, a menos que indicado de outra forma.
[00161] Estudos de bioinformática. Todas as proteínas foram identificadas nas entradas anotadas do banco de dados GenBank para todos os genomas de Microviridae e Leviviridae. O número de acesso para cada peptídeo do grupo Chp é indicado nas Tabelas 1 e 2 abaixo. As análises por Blastp foram realizadas usando o servidor UniProt, disponível em uniprot.org/blast/. As previsões da estrutura secundária da proteína foram realizadas usando JPRED4, disponível em www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/index, e I-Tasser, disponível em www.zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/. As análises filogenéticas foram realizadas usando as ferramentas ClustalW Multiple Sequence Alignment, disponíveis em www.genome.jp/tools- bin/clustalw. Os pesos moleculares e os pontos isoelétricos previstos foram determinados usando o ExPASy Resource Portal, disponível em web.expasy.org/compute_pi/.
[00162] Determinação das Concentrações Inibitórias Mínimas (MIC). Os valores de MIC foram determinados usando uma modificação do método de referência de microdiluição de caldo padrão, definido pelo
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2015. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard-10th Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA). A modificação foi baseada na substituição do caldo de Mueller Hinton, em alguns casos, por meio CAA (com e sem NaCl) ou CAA suplementado com soro humano a 2,5%. Como utilizado neste documento, a MIC é a concentração mínima de peptídeo suficiente para suprimir pelo menos 80% do crescimento bacteriano, em comparação com o controle.
[00163] Determinação das Concentrações Mínimas de Erradicação de Biofilme (MBEC). Os valores de MBEC foram determinados usando uma variação do método MIC por microdiluição de caldo com modificações (Ceri H et al., 1999. J Clin Microbiol 37:1771- 1776; e Schuch R et al., 2017. Antimicrob Agents Chemother 61). As colônias novas da cepa de P. aeruginosa ATCC 17647 foram suspensas em PBS (0,5 unidades de McFarland), diluídas 1:100 em LB com 0,2% de glicose, adicionadas como alíquotas de 0,15 ml a cada poço de um Dispositivo de Biofilme de Calgary de 96 poços (Innovotech) e incubadas por 24 horas, a 37 °C, para a formação dos biofilmes sobre pinos de policarbonato. Os biofilmes foram lavados e tratados com uma série de diluição de 2 vezes de cada peptídeo em TSBg, a 37 °C, por 16 horas. Após o tratamento, os poços foram lavados, secos ao ar a 37°C, coloridos com 0,05% de violeta de cristal durante 10 minutos e descoloridos em 33% de ácido acético. A OD600 da violeta de cristal extraída foi determinada. O valor de MBEC de cada amostra foi determinado como a concentração mínima de fármaco necessária para remover >95% da biomassa do biofilme, conforme avaliado por quantificação da violeta de cristal (em comparação com controles não tratados). A lisozima do fago T4 foi usada como um controle negativo e não proporciona atividade antibiofilme.
[00164] Ensaios checkerboard.
O ensaio checkerboard é baseado em uma modificação do método do CLSI para a determinação da MIC por microdiluição do caldo (CLSI 2015; e Moody J. 2010. Synergy testing: broth microdilution checkerboard and broth macrodilution methods, p 5.12.11-15.12.23. In Garcia LS (ed), Clinical Microbiology Procedures Handbook, vol 2). Os checkerboards foram construídos preparando primeiro colunas de uma placa de microtítulo de polipropileno de 96 poços, em que cada poço tinha a mesma quantidade de antibiótico diluído 2 vezes ao longo do eixo horizontal.
Em uma placa separada, foram preparadas fileiras comparáveis, nas quais cada poço tinha a mesma quantidade de peptídeo diluído 2 vezes ao longo do eixo vertical.
As diluições de peptídeo e antibiótico foram então combinadas, de modo que cada coluna tivesse uma quantidade constante de antibiótico e diluições de duplicação de lisina Gram-negativa, ao passo que cada fileira teria uma quantidade constante de lisina Gram-negativa e diluições de duplicação de antibiótico.
Cada poço, portanto, tinha uma combinação única de peptídeo e antibiótico.
As bactérias foram adicionadas a cada poço, a uma concentração de 1 x 105 CFU/mL, em CAA com 2,5% de soro humano.
A MIC de cada agente, sozinho e em combinação, foi então registrada após 16 horas, a 37 °C, em ar ambiente.
Os índices de concentração inibitória fracionária de soma (FICIs) foram calculados para cada fármaco e o FICI mínimo foi usado para determinar a sinergia.
Os FICIs foram calculados da seguinte forma: FICI = FIC A + FIC B, onde FIC A é a MIC de cada antibiótico na combinação/MIC de cada antibiótico sozinho e FIC B é a MIC de cada lisina Gram-negativa na combinação/MIC de cada lisina Gram-negativa sozinha.
A combinação é considerada sinergística quando o FICI for ≤0,5, fortemente aditiva quando o FICI for >0,5 a <1, aditiva quando o FICI for 1-<2 e antagonística quando o FICI for ≥2. Os ensaios checkerboard foram realizados usando a cepa de P. aeruginosa CFS-
1292 em CAA/HuS com combinações de Chp2 ou Chp4 contra uma gama de 11 antibióticos diferentes, incluindo a amicacina, a azitromicina, o aztreonam, a ciprofloxacina, a colistina, a fosfomicina, a gentamicina, o imipenem, a piperacilina, a rifamipicina e a tobramicina. Os valores de FICI de ≤0,5 foram observados para a maioria das combinações, indicando a capacidade de Chp2 e Chp4 de ser sinergístico com uma ampla gama de antibióticos (ver a Tabela 8 abaixo). Essas descobertas sugerem que os peptídeos de Chp podem proporcionar atividade antibacteriana potente na presença de antibióticos.
[00165] Ensaio da Atividade Hemolítica da Lisina Gram Negativa. A atividade hemolítica foi medida como a quantidade de hemoglobina liberada pela lise de eritrócitos humanos (Lv Y et al, 2014. PLoS One 9:e86364). Resumidamente, 3 ml de células sanguíneas humanas (hRBCs) novas, obtidas de doadores saudáveis agrupados (BioreclamationIVT), em um tubo de policarbonato contendo heparina, foram centrifugados a 1.000×g, por 5 min, a 4 °C. Os eritrócitos obtidos foram lavados três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) (pH 7,2) e suspensos novamente em 30 ml de PBS. Um volume de 50 µl da solução de eritrócitos foi incubado com 50 µl de cada lisina Gram-negativa (em PBS), em uma faixa de diluições de 2 vezes (de 128 μg/mL a 0,25 μg/mL), por 1 h, a 37 °C. Os eritrócitos intactos foram peletizados por centrifugação a 1.000×g, por 5 min, a 4 °C, e o sobrenadante foi transferido para uma nova placa de 96 poços. A liberação de hemoglobina foi monitorada medindo a absorbância a uma densidade óptica (OD) de 570 nm. A concentração hemolítica mínima foi determinada como a menor concentração de peptídeo que exibe lise visual (que corresponde à concentração mínima que resulta em um valor de OD ≥5% da amostra de controle não tratada). Foram usados controles adicionais, incluindo as hRBCs em PBS tratados como acima descrito com 0,1% de Triton X-100 ou cada um de uma série de peptídeos antimicrobianos com atividade hemolítica conhecida, incluindo RR12, RR12polar e RR12hidrofóbico (Mohanram H. et al,
2016. Biopolymers 106:345-356), e com pouca ou nenhuma atividade hemolítica, incluindo RI18 (Lyu Y. et al., 2016. Sci Rep 6:27258) e RR22.
[00166] Ensaio de Time-Kill da Atividade da Lisina Gram Negativa. Uma cultura noturna da cepa de P. aeruginosa CFS-1292 foi diluída 1:00, em meio de CAA novo, com 2,5% de soro humano (CAA/HuS) e cultivada por 2,5 horas, a 37 °C, com agitação. As bactérias da fase exponencial foram então diluídas 1:100 em CAA/HuS e o peptídeo foi adicionado a uma concentração final de 1 ou 10 μg/mL. As culturas de controle foram incluídas sem nenhum peptídeo adicionado (isto é, controle de tampão). As culturas foram incubadas a 37 °C, com aeração e, nos pontos de tempo de 1 h, 3 h e 24 h, as amostras foram removidas para a preparação quantitativa sobre placas de CAA ágar.
[00167] Microscopia. As alíquotas da cepa de P. aeruginosa CFS- 1292, cultivadas por 2,5 horas em LB, foram lavadas com PBS e suspensas novamente em PBS ou 100% de soro humano e tratadas por 15 minutos, em temperatura ambiente, com e sem peptídeo de Chp2, em uma concentração final de 10 μg/mL. Os subconjuntos de amostras foram coloridos usando o Kit Live/Dead Cell Viability (ThermoFisher) de acordo com o protocolo do fabricante e examinados por microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) e microscopia de fluorescência. Exemplo 1: Identificação dos peptídeos de Chp
[00168] Tendo conhecimento de certos bacteriófagos insatisfatoriamente descritos (Chlamydiamicroviridae) que infectam e matam especificamente as bactérias Gram-negativas Chlamydia, foram estudados os genomas publicados desses organismos, inicialmente procurando identificar novas lisinas, embora não fosse observada qualquer sequência semelhante à lisina, nem quaisquer sequências semelhantes às amurinas descritas anteriormente. As Chlamydia não utilizam peptidoglicanos (um alvo conhecido das lisinas) em suas estruturas tão abundantemente quanto as outras bactérias, porém, em vez disso, as Chlamydia, em geral, somente utilizam os peptidoglicanos durante a divisão. Portanto, surgiu a questão referente à qual seria o alvo do fago de Chlamydia. Postulou-se que o mecanismo pelo qual os fagos de Chlamydia invadem o seu alvo pode ser diferente dos anteriormente conhecidos, e o seu alvo pode ser diferente e focado em lipopolissacarídeo (LPS), um constituinte principal da membrana externa das bactérias Gram-negativas e um obstáculo à penetração das lisinas na membrana externa.
[00169] Os genomas publicados de Chlamydiamicrovirus foram estudados com o objetivo de identificar loci sintênicos, ou seja, genes semelhantes na mesma posição em um genoma de um grupo de fagos geneticamente relacionados, o que sugeria função semelhante. Foram identificados pequenos peptídeos altamente catiônicos que tinham um perfil de carga molecular muito semelhante aos peptídeos antimicrobianos (AMPs) identificados anteriormente. Embora as sequências do fago de Chlamydia não tivessem nenhuma similaridade da sequência de proteína com os AMPs, as lisinas ou com as proteínas de amurina conhecidas (como a Proteína A2, a proteína E e outras), a carga positiva geral era uma característica proeminente. Usando técnicas de bioinformática conforme descrito acima (JPRED e iTASSAR), foram conduzidas previsões estruturais que revelaram a presença de hélices alfa, uma característica marcante de muitos AMPs. As hélices alfa, a carga geral, a conservação entre as Chlamydia e os genomas de fagos de bactérias Gram-negativas relacionadas sugeriram que essas proteínas podem representar uma família de polipeptídeos de fago líticos previamente não caracterizados e que elas podem definir um mecanismo de fago lítico anteriormente não descrito. O fato que elas foram previstas serem de tamanho pequeno e solúveis (com base em seu perfil de carga) também significava que, uma vez sintetizadas, elas provavelmente seriam prontamente receptivas ao ensaio simplesmente adicionando-as a culturas de bactérias suscetíveis.
[00170] Com base no precedente, 12 sequências conservadas dentro de loci sintênicos foram extraídas dos genomas de Microviridae no banco de dados GenBank e especificamente dos genomas de Chlamydiamicrovírus (bem como alguns outros vírus descritos abaixo). As 12 sequências conservadas foram anotadas apenas como proteínas hipotéticas, não caracterizadas ou não estruturais e codificaram pequenas proteínas (putativamente) catiônicas previstas de adotar estruturas helicoidais alfa. Essas 12 sequências são apresentadas na Tabela 1. Um dos peptídeos na Tabela 1, Chp5, foi sintetizado para ter uma carga molecular diferente de Chp4 por substituição das argininas e lisinas, que são carregadas positivamente, com resíduos de aminoácidos de cargas negativas. O Chp5 foi previsto ser inativo. Embora esses peptídeos não exibam nenhuma similaridade da sequência com outras proteínas líticas ou antimicrobianas, eles são previstos adotarem estruturas helicoidais alfa (por exemplo, ver a Figura 1), semelhantes aos subconjuntos da grande família de agentes antibacterianos AMPs. Foi postulado que os peptídeos de Chp desempenham a função de lise do hospedeiro para os fagos dos quais são derivados.
[00171] Com base nas considerações anteriores, um estudo posterior de genomas de outros fagos (relacionados aos Chlamydiamicroviruses, na mesma família, Microviridae) que infectam bactérias Gram-negativas, bem como outras fontes não caracterizadas que se apresentaram com a mesma sintonia e perfil de carga, produziu
14 peptídeos adicionais listados na Tabela 2. Juntos, todos os 39 peptídeos (excluindo o Chp5) formam uma família relacionada de novos agentes líticos de fagos. Eles são todos de fontes Microviridae.
[00172] Assim, uma lista completa de todos os membros da família Chp (incluindo certas características de cada peptídeo) é proporcionada na Tabela 1 e na Tabela 2. Estão incluídos neste grupo os peptídeos de Chp1-4 e 6-12 e CPAR39, que são derivados de 11 Chlamydiamicroviruses diferentes e são descritos na Tabela 1; os peptídeos de Chp2 e Chp3 são dois peptídeos idênticos de dois fagos diferentes. Como afirmado acima, o Chp5 é um derivado modificado de Chp4, gerado pela substituição de todos os aminoácidos carregados positivamente, incluindo as argininas e as lisinas, por aminoácidos carregados negativamente, incluindo a glutamina e o ácido glutâmico. Os 27 membros adicionais da família Chp foram identificados por homologia com as proteínas de Chlamydiamicrovirus e são descritos na Tabela 2 ("Membros adicionais da família Chp"). Os 27 membros adicionais da família Chp não são de fontes de Chlamydiamicrovirus, porém de fontes putativas de fagos Microviridae. Tabela 1 - Agentes líticos derivados de fago de Chlamydia (Chp) Nome da Informação Sequência de pI/kDa Sequência de DNA proteína do Proteínas (aminoácid Identificador os) Chp1 Fago Chp1 MVRRRRLRR 13,23/4669, ATGGTTCGTAGAAGAC Gene: RISRRIFRRT 64 (36) GTTTGAGAAGAAGAATA Chp1p08 VARVGRRRR AGTAGAAGAATTTTTAG
SFRGGIRF AAGAACAGTAGCTAGA GenBank: (SEQ ID NO: GTTGGTAGAAGGCGAA NP_044319.1 1) GGTCTTTTCGTGGTGGT Família: ATTAGATTTTAA (SEQ Microviridae ID NO: 27)
Nome da Informação Sequência de pI/kDa Sequência de DNA proteína do Proteínas (aminoácid Identificador os) Chp2 Fago 2 MRLKMARRR 12,90/5708, ATGAGGTTAAAAATGGC Gene: Ch-2p5 YRLPRRRSR 98 (44) ACGAAGAAGATACAGA
RLFSRTALR CTTCCGCGACGTAGAA GenBank:
MHPRNRLRR GTCGAAGACTTTTTTCA NP_054652.1
IMRGGIRF AGAACTGCATTGAGGA Família: (SEQ ID NO: TGCATCCAAGAAATAG Microviridae 2) GCTTCGAAGAATTATGC
GTGGCGGCATTAGGTT CTAG (SEQ ID NO: 28) CPAR39 Fago CPAR39 MCKKVCKKC 10,26/3993, TTGTGCAAAAAAGTGTG Gene: PKKGPKNAP 91 (35) CAAAAAATGCCCAAAAA CPA000S KIGAFYERKT AAGGGCCAAAAAATGC
PRLKQST CCCCAAAATCGGAGCA GenBank: (SEQ ID NO: TTTTACGAGAGAAAAAC NP_063898.1 3) ACCTAGACTTAAACAGT Família: CTACTTGA (SEQ ID NO: Microviridae 29) Chp3 Fago 3 MRLKMARRR 12,90/5708, ATGAGGTTAAAAATGGC Gene: CP3p6 YRLPRRRSR 98 (44) ACGAAGAAGATACAGA
RLFSRTALR CTTCCGCGACGTAGAA GenBank:
MHPRNRLRR GTCGAAGACTTTTTTCA YP_022484.1
IMRGGIRF AGAACTGCATTAAGGAT Família: (mesma GCATCCAAGAAATAGG Microviridae sequência que CTTCGAAGAATTATGCG Chp2) (SEQ TGGCGGCATTAGGTTC ID NO: 54) TAG (SEQ ID NO: 53) Chp4 Fago 4 MARRYRLSR 12,88/5073, ATGGCACGAAGATACA Gene: RRSRRLFSR 11 (39) GACTTTCGCGACGCAG Chp4p6 TALRMHRRN AAGTCGACGACTTTTTT
RLRRIMRGGI CAAGAACTGCATTAAGA GenBank: RF (SEQ ID ATGCATCGAAGAAATAG YP_338243.1 NO: 4) ACTTCGAAGAATTATGC Família:
GTGGCGGCATTAGGTT Microviridae TTAG (SEQ ID NO: 30)
Nome da Informação Sequência de pI/kDa Sequência de DNA proteína do Proteínas (aminoácid Identificador os) Chp5 Fago ChpQE MAEQYELSQ 3,73/4605,0 ATGGCGGAACAGTATG Derivado do EQSEQLFSE 1 (39) AACTGAGCCAGGAACA Fago 4 TALQMHEQN GAGCGAACAGCTGTTT
ELQEIMQGGI AGCGAAACCGCGCTGC EF (SEQ ID AGATGCATGAACAGAA NO: 5) CGAACTGCAGGAAATT
ATGCAGGGCGGCATTG AATTTTAA (SEQ ID NO: 31) Chp6 Fago de MARRRYRLP 12,88/5180, ATGGCACGAAGAAGAT Chlamydia de RRRSRRLFS 27 (40) ACAGACTTCCGCGACG porquinho-da-RTALRMHPR TAGAAGTCGAAGACTTT índia NRLRRIMRG TTTCAAGAACTGCATTA GenBank: GIRF (SEQ ID AGGATGCATCCAAGAA NP_510878.1 NO: 6) ATAGGCTTCGAAGAATT
ATGCGTGGCGGCATTA Família: GGTTCTAG (SEQ ID NO: Microviridae 32) Chp7 Proteína não MKRRKMTRK 12,31/4302, ATGAAACGTAGAAAAAT caracterizada GSKRLFTATA 19 (38) GACAAGAAAAGGTTCTA [Chlamydia DKTKSINTAP AGCGTCTTTTTACTGCA trachomatis] PPMRGGIRL ACTGCTGATAAAACTAA GenBank: (SEQ ID NO: ATCTATCAATACTGCCC CRH73061.1 7) CGCCGCCAATGCGTGG
CGGTATCCGGTTGTAA Família: (SEQ ID NO: 33) Microviridae Chp8 Proteína não MSKKRSRMS 12,91/4672, ATGTCTAAAAAGCGTTC caracterizada RRRSKKLFS 61 (39) TCGCATGTCTCGCCGC (C. KTALRTKSVN CGTTCTAAGAAGTTGTT trachomatis) TRPPMRGGF CTCGAAAACGGCTCTC GenBank: RF (SEQ ID CGCACGAAGAGTGTCA CRH64983.1 NO: 8) ACACCCGTCCGCCTAT
GCGCGGAGGGTTCCG Família: GTTCTGA (SEQ ID NO: Microviridae 34)
Nome da Informação Sequência de pI/kDa Sequência de DNA proteína do Proteínas (aminoácid Identificador os) Chp9 Proteína não MSLRRHKLS 12,91/4672, ATGTCTCTTCGTCGTCA caracterizada RKASKRIFRK 60 (40) TAAGCTTTCTCGTAAGG (C. GASRTKTLNT CGTCTAAGCGTATTTTT trachomatis) RATPMRGGF CGTAAAGGTGCATCAC GenBank: RI (SEQ ID GCACGAAGACTTTGAAT CRH84960.1 NO: 9) ACTCGTGCTACGCCTAT
GCGCGGCGGTTTCCGT Família: ATTTAA (SEQ ID NO: 35) Microviridae Chp10 Proteína não MKRRKLSKK 12,91/4570, GTGAAACGTCGTAAACT caracterizada KSRKIFTRGA 64 (38) GTCCAAAAAGAAATCTC (C. VNVKKRNLR GCAAGATTTTCACTCGC trachomatis) ARPMRGGFR GGTGCTGTAAATGTGA GenBank: I (SEQ ID NO: AAAAGCGTAACCTTCG CRH93270.1 10) CGCTCGCCCAATGCGC
GGCGGTTTCCGGATCT Família:
AA Microviridae (SEQ ID NO: 36) Chp11 Proteína não MAKKMTKGK 11,74/4375, ATGGCTAAAAAAATGAC caracterizada DRQVFRKTA 32 (37) TAAAGGCAAGGATCGT (C. DRTKKLNVR CAGGTTTTTCGTAAAAC trachomatis) PLLYRGGIRL CGCTGATCGTACTAAG GenBank: (SEQ ID NO: AAACTCAATGTTAGACC CRH59954.1 11) GTTGTTATATCGAGGAG
GTATCAGATTATGA Família: (SEQ ID NO: 37) Microviridae Chp12 Proteína não MAGKKMVSK 11,74/4549, ATGGCAGGAAAAAAAAT caracterizada GKDRQIFRKT 53 (39) GGTATCAAAAGGAAAA (C. ADRTKKMNV GATAGACAGATTTTCCG trachomatis) RPLLYRGGIR AAAAACTGCTGATCGCA GenBank: L (SEQ ID NO: CTAAAAAAATGAATGTG CRH59965.1 12) CGCCCGCTATTATATCG
TGGAGGTATTAGATTAT Família: GA (SEQ ID NO: 38) Microviridae
Tabela 2 - Membros adicionais da família Chp Informação Sequência Nome da pI/kDa do de Sequência de DNA proteína (aminoácidos) identificador Proteínas Gokushovírus marinho ATGAGAAGACCAAGA
MRRPRKM
AAAATGAACTATAAAA Gene: NYKKSKR
AATCAAAAAGAATGTT V508_gp1 MFSRTAA
TTCACGCACAGCAGC GenBank: RTHRKNS 12,66/4974,97 Gkh1 GAGAACACACAGAAA YP_00879824 LRGSRPM (41)
AAACTCTCTAAGAGGT
5.1 RGGIRL
AGCCGACCTATGAGA Gokushovirina (SEQ ID GGCGGAATACGTCTTT e Não NO: 13) AA (SEQ ID NO: 39) classificado Gokushovirina e Fen672_31 ATGTCGAAGAAGGCG
MSKKASR
TCGAGGAAGAGTTTTA Gene: KSFTKGA
CTAAGGGTGCCGTTA AFL78_gp4 VKVHKKN 12,49/3794,63 AGGTTCATAAGAAAAA Gkh2 GenBank: VPTRVPM (34) TGTTCCTACTCGTGTT YP_00916038 RGGIRL CCTATGCGTGGCGGT
2.1 (SEQ ID ATTAGGCTTTAG (SEQ NO: 14) Gokushovirina ID NO: 40) e Não classificado Produto de proteína sem ATGAAAATGCGTAAGC nome MKMRKRT
GGACGGACAAGCGAG (bactéria não DKRVFTR TGTTTACCCGCACCG cultivada) TAAKSKKV 12,31/4104,04 CTGCTAAGTCCAAGAA Unp1 NIAPKIFR GenBank: (35) AGTGAACATTGCCCC
GGIRL CDL66944.1 GAAAATTTTTAGAGGA (SEQ ID Plasmídeo GGTATCCGTCTGTGA NO: 15) circular, ceco (SEQ ID NO: 41) de rato
Informação Sequência Nome da pI/kDa do de Sequência de DNA proteína (aminoácidos) identificador Proteínas Proteína não estrutural ATGGCTCGTTCTCGC (Escherichia MARSRRR CGTCGTATGTCCAAG coli) MSKRSSR CGTTCTTCCCGTCGTT
RSFRKYA CGTTCCGTAAGTACG GenBank: 12,70/4812,72 Ecp1 KTHKRNF CAAAGACGCATAAAC WP_1007564 (39)
KARSMRG GTAACTTTAAAGCCCG
32.1 GIRL (SEQ CTCTATGCGTGGTGG Cepa das ID NO: 16) AATTCGTCTTTGA fezes de (SEQ ID NO: 42) sEPEC
ATGGAAAGCCCGAAC AGCCGCAGCCAGCTG
MESPNSR Proteína GGCATTACCCTGTATC
SQLGITLY hipotética (T. TGCTGAGCACCATTTT
LLSTIFPD maritimus) TCCGGATGCGTGCTTT ACFRYRR 7,80/5433,39 Tma1 SAMN044880 CGCTATCGCCGCGAA ELPYPLVI (47) 44_0855 CTGCCGTATCCGCTG
WGVATLC GenBank: GTGATTTGGGGCGTG LQ (SEQ SHG47122.1 GCGACCCTGTGCCTG ID NO: 17) CAGTAA (SEQ ID NO: 43) Proteína ATGGCTCGTTCCCGTA hipotética MARSRRR GACGTATGTCTAAGC EC13107_44c MSKRSSR GTTCTTCCCGCCGTTC 00010 (E. coli) RSFRKYA 12,66/4770,68
GTTCCGCAAGTATGC Ecp2 KSHKKNF GAAGTCGCATAAGAA GenBank: (39)
KARSMRG GAACTTTAAAGCCCGC OAC14041.1 GIRL (SEQ TCAATGCGTGGCGGT Úbere, ID NO: 18) ATCCGTTTATAA (SEQ mastite aguda ID NO: 44) Proteína ATGAGAAAGCGAATGT
MRKRMSK hipotética CTAAGCGTGTTGACAA
RVDKKVF SAMN052163 GAAGGTGTTCCGTCG
RRTAASA 43_103150 11,90/4389,35 TACTGCCGCATCTGC Osp1 KKINIDPKI (Oscillibacter (37) CAAGAAGATTAACATT
YRGGIRL sp. PC13) GACCCCAAGATTTACC (SEQ ID GenBank: GTGGAGGTATTCGCC NO: 19) SFP13761.1 TATGA (SEQ ID NO: 45)
Informação Sequência Nome da pI/kDa do de Sequência de DNA proteína (aminoácidos) identificador Proteínas Produto de ATGAGACGTCGTCGT proteína sem MRRRRLS CTATCCCGCAGAACTT nome RRTSRRF CCCGCCGTTTTTTCCG GenBank: FRKGLKV TAAAGGACTTAAGGTT
13.18/4757,77 Unp2 CDL65918.1 RRRNLRA CGCCGTCGTAACCTC (37)
DNA RPMRGGF CGCGCGAGACCCATG extracromoss RI (SEQ ID AGAGGCGGATTCAGA ômico NO: 20) ATTTGA (SEQ ID NO: RGI00327 46) Produto de ATGGCACGACGCAAG proteína sem MARRKKM AAGATGAAAGGCAAG nome KGKRDKR CGGGATAAACGGGTG GenBank: VFKQTAN TTTAAGCAGACAGCCA 12,32/4545,51 Unp3 CDL65808.1 KTKAINISP ACAAAACCAAGGCTAT (39)
DNA KNMRGGT CAACATCAGCCCAAAA extracromoss RL (SEQ ID AACATGAGAGGGGGT ômico NO: 21) ACGAGACTGTGA RGI00234 (SEQ ID NO: 47)
ATGTTAACTGTGTGGA MLTVWSD GTGACACCCCTACCAT
TPTIKRRK AAAAAGGAGAAAAGA Proteína
DMYRKRM CATGTATAGAAAGAGA hipotética
SRKKSKK ATGTCAAGAAAGAAAA (Gokushovíru 11.2/6440,82 Gkh3 VFAKTAM GTAAAAAGGTTTTTGC s marinho) (53)
KVNKRNH AAAAACCGCAATGAAA GenBank:
VKPMRGG GTAAATAAAAGAAACC AGT39941.1 YRI (SEQ ACGTTAAACCTATGCG ID NO: 22) TGGTGGATATAGAATA TAA (SEQ ID NO: 48)
ATGATGAAGTACAGAA
MMKYRKK AAAAAATGAGCGCTAA Proteína
MSAKSSR AAGTAGCCGAAAGCA hipotética
KQFTKGA ATTTACAAAAGGCGCC (Gokushovíru 12,04/4536,61 Unp5 MKVKGKN ATGAAAGTGAAGGGT s marinho) (39)
FTKPMRG AAAAACTTCACAAAAC GenBank: GIRL (SEQ CAATGCGCGGAGGCA AGT39924.1 ID NO: 23) TCCGTCTATAG (SEQ ID NO: 49)
Informação Sequência Nome da pI/kDa do de Sequência de DNA proteína (aminoácidos) identificador Proteínas
ATGCGACGTTACAATG
MRRYNVN TAAATAAAGGTAAATC Proteína
KGKSAKK TGCTAAGAAGTTTCGA hipotética
FRKQVSK AAGCAGGTAAGTAAG (Gokushovíru 12,31/4492,34 Unp6 TKVANLRS ACGAAGGTTGCAAAC s marinho) (38)
NPMRGG CTACGTTCTAATCCAA GenBank: WRL (SEQ TGCGAGGTGGTTGGA AGT39915.1 ID NO: 24) GACTCTAA (SEQ ID NO: 50) Proteína hipotética Sp- ATGGCTTATCGTGGTT 4p3 (Vírus de MAYRGFK TTAAAACGAGTCGTGT Spiroplasma TSRVVKH TGTAAAACATAGAGTA SpV4] RVRRRWF 12,37/3776,45 Spi1 CGTAGAAGATGGTTTA NHRRRYR (28) Orf9 ATCATAGAAGACGTTA (SEQ ID NCBI Ref. TAGATAG (SEQ ID NO: NO: 25) Seq: 51) NP_598337.1 Proteína GTGAGACGCAAGGTT hipotética Sp- MRRKVKN AAGAACACAAAGCGT 4p2 (Vírus de TKRHQWR CATCAGTGGAGGTTG Spiroplasma LTHSARSI ACTCATTCTGCACGTT SpV4) 12,91/4629,45 Spi2 KRANIMPS CAATTAAACGTGCTAA (38) Orf8 NPRGGRR TATAATGCCGTCAAAT NCBI Ref. F (SEQ ID: CCTCGTGGTGGACGT Seq: 26) CGTTTTTAG (SEQ ID NP_598336.1 NO: 52)
ATGGCTCGTTCTCGTC Proteína não MARSRRR GTCGTATGTCTAAACG estrutural MSKRSSR TTCTTCTCGTCGTTCT (Escherichia) RSFRKYA TTTCGTAAATATGCTA 12,76/4784,69 Ecp3 NCBI Ref. KTHKKNF AAACTCATAAAAAAAA (39) Seq: KARSMRG TTTTAAAGCTCGTTCT WP_1052692 GIRL (SEQ ATGCGTGGAGGAATT
19.1 ID NO: 55) CGTTTATAA (SEQ ID NO: 68)
Informação Sequência Nome da pI/kDa do de Sequência de DNA proteína (aminoácidos) identificador Proteínas
ATGGCGCGCAGCCGC Proteína não MARSRRR CGCCGCATGAGCAAA estrutural MSKRSSR CGCAGCAGCCGCCGC (Escherichia) RSFRKYA AGCTTTCGCAAATAT 12,66/4770,68 Ecp4 NCBI Ref. KSHKKNF GCGAAAAGCCATAAAA (39) Seq: KARSMRG AAAACTTTAAAGCGCG WP_1054665 GIRL (SEQ CAGCATGCGCGGCGG
06.1 ID NO: 56) CATTCGCCTG (SEQ ID NO: 69)
TTGTCGTCAACCTTGT GCCGCTGGGCCGTTA MSSTLCR AGGCCCTGCGGTGTA
WAVKALR Proteína de CCCGTGTGTATAAGG
CTRVYKE lise (Fago de AGTTTATATGGAAACC
FIWKPLVA Pseudomonas CTTAGTAGCGCTCAGT Lvp1 LSYVTLYL 9,7/6346,6 (55) PP7) NCBI TACGTGACGTTGTATC
LSSVFLSQ Ref. Seq: TTCTGAGCTCGGTCTT
LSYPIGSW NP_042306.1 CCTGTCCCAACTCAG AV (SEQ
CTACCCCATCGGGAG ID NO: 57)
CTGGGCGGTGTAG (SEQ ID NO: 70)
ATGAAGAAAAGGACAA
MKKRTKA Proteína de AAGCCTTGCTTCCCTA
LLPYAVFII lise (Fago de TGCGGTTTTCATCATA
LSFQLTLL (ABP1) Acinetobacter 9,93/4247,21 CTCAGCTTTCAACTAA
TALFMYY Lvp2 AP205) NCBI (35) CATTGTTGACTGCCTT
HYTF Ref. Seq: GTTTATGTATTACCAT (SEQ ID NP_085469.1 TATACCTTTTAG (SEQ NO: 58) ID NO: 71) Proteína
ATGGCAAAGAAAATTA hipotética
MAKKIRNK GAAACAAAGCACGTG (Microvírus
ARDRRIFT ATAGACGTATCTTCAC associado às
RTASRMH AAGAACAGCTTCACG fezes de 12,70/4599,52 ALCES1 KANRTPR CATGCACAAGGCAAA Alces alces (38)
FMRGGIRL CCGCACACCAAGATTT MP12 5423) (SEQ ID ATGAGAGGCGGTATT NCBI Ref. NO: 59) AGGTTATGA (SEQ ID Seq: NO: 72) AXB22573.1
Informação Sequência Nome da pI/kDa do de Sequência de DNA proteína (aminoácidos) identificador Proteínas Proteína ATGCGTCGTAAAAAAA hipotéticaMRRKKMS TGTCACGCGGTAAATC (Amostras RGKSKKL AAAAAAACTCTTTCGC ambientais de
FRRTAKR CGAACAGCAAAACGC 13,10/4680,78 AVQ206 gokushovirina
VHRKNLR GTTCATCGAAAAAACC (38) e) ARPMRGG TACGAGCTCGCCCAA NCBI Ref. IRM (SEQ TGCGTGGCGGCATAC Seq: ID NO: 60) GCATGTAG (SEQ ID AVQ10236.1 NO: 73) Proteína ATGGCGAAGCGACAC hipotética MAKRHKIP AAAATCCCGCAACGC (Amostras QRASQHS GCGTCACAACATTCCT ambientais de FTRHAQK TCACGCGCCATGCGC 12,8/4566,43 AVQ244 Gokushovirina VHPKNVP AAAAGGTCCACCCTAA (39) e) RLPMRGG GAACGTTCCCCGCCT NCBI Ref. IRL (SEQ GCCAATGCGAGGCGG Seq: ID NO: 61) TATCCGTCTCTAA AVQ10244.1 (SEQ ID NO: 74) Produto de ATGCGTAAAAAAATGC
MRKKMHK proteína sem ACAAATCATTAGACAA
SLDKRVF nome GCGAGTGTTTAACCG
NRTAKKS (bactéria não 11,96/4398,22 CACTGCAAAAAAATCA CDL907 KKINVNPV cultivada) (37) AAAAAAATAAATGTTA
VYRGGIRL NCBI Ref. ATCCTGTAGTTTATCG (SEQ ID Seq: TGGAGGTATTAGATTA NO: 62) CDL65907.1 TGA (SEQ ID NO: 75)
ATGCGACGTTACAATG Proteína MRRYNVN TAAATAAAGGTAAATC hipotética KGKSAKK TGCTAAGAAGTTTCGA (Gokushovíru FRKQVSK AAGCAGGTAAGTAAG 12,41/4492,32 AGT915 s marinho) TKVANLRS ACGAAGGTTGCAAAC (38) NCBI Ref. NPMRGG CTACGTTCTAATCCAA Seq: WRL (SEQ TGCGAGGTGGTTGGA AGT39915.1 ID NO: 63) GACTCTAA (SEQ ID NO: 76)
Informação Sequência Nome da pI/kDa do de Sequência de DNA proteína (aminoácidos) identificador Proteínas Proteína ATGCGTCCAGTTAAAA
MRPVKRS hipotética GATCAAGAGTAAATAA
RVNKARS RINTHH_393 GGCCCGATCTGCAGG
AGKFRKQ 0 (Richelia CAAGTTTCGTAAGCAG VGKTKMA 12,95/4755,69 HH3930 intracellularis GTCGGTAAAACAAAGA NLRSNPM (41) HH01) TGGCAAATCTGCGTA
RGGWRL NCBI Ref. GTAATCCGATGCGCG (SEQ ID Seq: GCGGATGGCGGCTGT NO: 64) CCH66548.1 GA (SEQ ID NO: 77) Proteína ATGAAGCCATTGAAGC
MKPLKRK hipotética GTAAGCCGGTTCAGA
PVQKARS (Gokushovirin AGGCGCGGTCAGCAG
AAKFRRN ae CCAAGTTCCGTCGAAA VSTVKAA 12,81/4699,7 Fen7875 Fen7875_21) TGTGTCTACCGTTAAG NMAVKPM (41) NCBI Ref. GCTGCCAATATGGCG
RGGWRF Seq: GTGAAGCCGATGCGC (SEQ ID YP_00916039 GGCGGTTGGCGGTTC NO: 65)
9.1 TGA (SEQ ID NO: 78) Proteína ATGACCAAGAGAGAC hipotética MTKRDIEY ATCGAGTACCGGAAA SEA_BABYR RKALGLN GCTTTGGGGCTCAAC AY_77 (Fago PSEPLPKI CCATCTGAGCCGCTC de VGAVTRH 11,48/4882,78 CCGAAGATTGTGGGT SBR77 Micobactéria GATLKRP (44) GCCGTCACCCGCCAC BabyRay) RVTALAR GGGGCCACTCTGAAA NCBI Ref. (SEQ ID CGCCCACGGGTCACC Seq: NO: 66) GCACTGGCCCGATAG AOT25441 (SEQ ID NO: 79) Proteína de ATGAAAAGAAAACCAA ligação ao MKRKPMS TGAGCCGCAAGGCCT DNA putativa RKASQKT CTCAAAAAACCTTCAA (Fago de FKKNTGV AAAGAACACAGGCGT 12,9/5708,98 Bdp1 Bdellovibrio QRMNHLN TCAACGCATGAACCAT (38) phiMH2K) PRAMRGG CTCAACCCACGCGCC NCBI Ref. IRL (SEQ ATGCGTGGTGGCATT Seq: ID NO: 67) AGACTATAA (SEQ ID NP_073546.1 NO: 80)
[00173] As informações adicionais sobre as homologias das sequência de proteínas de vários membros da família Chp são proporcionadas na Tabela 3. O Chp1, o Bdp1, o Lvp1 e o Lvp2 são os únicos membros da família Chp para os quais uma atividade prevista é indicada na anotação do GenBank.
O Chp1 (sequência NP_044319.1 do GenBank) é anotado como uma proteína de ligação ao DNA, embora nenhum dado seja proporcionado para apoiar isso, e a anotação é inconsistente com um papel putativo na lise do hospedeiro.
No geral, as proteínas de Chp são 39-100% idênticas umas às outras e não são homólogas a outros peptídeos no banco de dados de sequências de proteínas.
As árvores filogenéticas enraizadas e não enraizadas que mostram certos membros da família Chp são indicadas nas Figuras 2A e 2B, respectivamente.
Tabela 3 - Comentários e similaridades das proteínas da família Chp Proteína Anotação (função) Similaridades anotadas Chp1 Proteína de ligação ao DNA Orf8; 61,5% idêntica ao Chp4 Medeia o acondicionamento do 60% idêntica ao Chp2 ssDNA no virion; localiza-se na 60% idêntica ao Chp3 superfície interna do capsídeo; Identidade compartilhada com Desempenha um papel na ligação outros também viral à célula hospedeira (por similaridade) Chp2 Proteína não estrutural 60% idêntica ao Chp1 100% idêntica ao Chp3 92,5% idêntica ao Chp4 55% idêntica ao Chp8 54,8% idêntica ao Gkh1 60,5% idêntica ao Unp2 Identidade compartilhada com outros também CPAR39 Proteína não caracterizada 60% idêntica ao Chp6 Chp3 Proteína não estrutural 60% idêntica ao Chp1 100% idêntica ao Chp2 92,5% idêntica ao Chp4
Proteína Anotação (função) Similaridades anotadas 55% idêntica ao Chp8 54,8% idêntica ao Gkh1 60,5% idêntica ao Unp2 Identidade compartilhada com outros também Chp4 Proteína estrutural putativa 61,5% idêntica ao Chp1 92,5% idêntica ao Chp2 92,5% idêntica ao Chp3 55% idêntica ao Gkh1 64,1% idêntica ao Unp2 59,5% idêntica ao Chp8 Identidade compartilhada com outros também Chp5 Variante de carga invertida do Os resíduos de RK do Chp4 Fago de Chp4 mudaram para resíduos de QE Gerada como uma proteína de controle negativo Chp6 Proteína não estrutural 60% idêntica ao Chp1 100% idêntica ao Chp2 (Truncamento de 4 resíduos) 100% idêntica ao Chp3 (Truncamento de 4 resíduos) 92,5% idêntica ao Chp4 55% idêntica ao Chp8 54,8% idêntica ao Gkh1 60,5% idêntica ao Unp2 Identidade compartilhada com outros também Chp7 Proteína não caracterizada 61,1% idêntica ao Chp8 56% idêntica ao Unp3 50% idêntica ao Chp9 53,7% idêntica ao Gkh1 57,9% idêntica ao Unp4 Identidade compartilhada com
Proteína Anotação (função) Similaridades anotadas outros também Chp8 Proteína não caracterizada 59% idêntica ao Chp9 55% idêntica ao Chp2 55% idêntica ao Chp3 61,1% idêntica ao Chp7 56,8% idêntica ao Gkh3 59,5% idêntica ao Chp4 47,2% idêntica ao Chp10 50% idêntica ao Gkh2 47,4% idêntica ao Unp5 46,2% idêntica ao Gkh1 Identidade compartilhada com outros também Chp9 Proteína não caracterizada 59% idêntica ao Chp8 59% idêntica ao Unp2 57,9% idêntica ao Chp10 50% idêntica ao Chp7 46,2% idêntica ao Unp6 Identidade compartilhada com outros também Chp10 Proteína não caracterizada 63% idêntica ao Unp2 52,6% idêntica ao Gkh2 57,9% idêntica ao Chp9 61,8% idêntica ao Gkh2 56,4% idêntica ao Unp5 51,3% idêntica ao Chp4 47,5% idêntica ao Chp2 47,5% idêntica ao Chp3 47,4% idêntica ao Chp7 47,2% idêntica ao Chp8 44,4% idêntica ao Chp1 Identidade compartilhada com outros também Chp11 Proteína não caracterizada Similar ao acima mencionado
Proteína Anotação (função) Similaridades anotadas Chp12 Proteína não caracterizada Similar ao acima mencionado Gkh1 Proteína não caracterizada 55% idêntica ao Chp4 54,8% idêntica ao Chp2 54,8% idêntica ao Chp3 53,7% idêntica ao Chp7 48,8% idêntica ao Chp10 46,2% idêntica ao Chp8 40,5% idêntica ao Gkh3 42,5% idêntica ao Chp1 Identidade compartilhada com outros também Gkh2 Proteína não caracterizada 70,6% idêntica ao Unp5 63,6% idêntica ao Chp10 Unp1 Produto de proteína sem nome 70,6% idêntica ao Osp1 57,9% idêntica ao Chp7 42,4% idêntica ao Chp1 39,5% idêntica ao Chp10 45,2% idêntica ao Chp4 41,2% idêntica ao Gkh2 45,2% idêntica ao Chp2 Identidade compartilhada com outros também Ecp1 Proteína não estrutural 60% idêntica ao Unp2 56,4% idêntica ao Chp4 53,8% idêntica ao Chp2 53,8% idêntica ao Chp3 61,8% idêntica ao Gkh2 50% idêntica ao Chp10 50% idêntica ao Unp5 51,3% idêntica ao Chp1 Identidade compartilhada com outros também Ecp2 Proteína hipotética 57,1% idêntica ao Unp2 64,7% idêntica ao Gkh2
Proteína Anotação (função) Similaridades anotadas 53,8% idêntica ao Chp4 51,3% idêntica ao Chp2 51,3% idêntica ao Chp3 52,8% idêntica ao Osp1 47,2% idêntica ao Chp10 47,5% idêntica ao Chp1 Identidade compartilhada com outros também Tma1 Proteína não caracterizada Nenhuma Osp1 Proteína hipotética 70,6% idêntica ao Unp1 37,1% idêntica ao Chp1 48,6% idêntica ao Chp8 48,6% idêntica ao Gkh3 Identidade compartilhada com outros também Unp2 Produto de proteína sem nome 63,2% idêntica ao Chp10 59% idêntica ao Chp9 64,1% idêntica ao Chp4 56,8% idêntica ao Chp1 60,5% idêntica ao Chp2 60,5% idêntica ao Chp3 Identidade compartilhada com outros também Unp3 Produto de proteína sem nome 56,8% idêntica ao Chp7 58,8% idêntica ao Unp1 59,5% idêntica ao Osp1 43,2% idêntica ao Chp9 45,9% idêntica ao Gkh3 Identidade compartilhada com outros também Gkh3 Proteína não caracterizada 52,6% idêntica ao Chp10 55,9% idêntica ao Chp8 50% idêntica ao Unp2 42,9% idêntica ao Chp4
Proteína Anotação (função) Similaridades anotadas 47,2% idêntica ao Chp9 40% idêntica ao Chp2 40% idêntica ao Chp3 Identidade compartilhada com outros também Unp5 Proteína não caracterizada 61,1% idêntica ao Gkh3 56,4% idêntica ao Chp10 70,6% idêntica ao Gkh2 53,8% idêntica ao Chp7 43,6% idêntica ao Unp2 48,6% idêntica ao Chp9 Identidade compartilhada com outros também Unp6 Proteína não caracterizada 46,2% idêntica ao Chp9 44,7% idêntica ao Chp10 Identidade compartilhada com outros também Spi1 Proteína hipotética Sem homologia Spi2 Proteína hipotética Sem homologia Exemplo 2: Síntese dos peptídeos de Chp
[00174] Todos os peptídeos de Chp foram sintetizados pela GenScript, NJ, EUA, com ligação [acetilação N terminal (Ac) e amidação C terminal (NH2)] em uma base de taxa por serviço. A GenScript avaliou a pureza de cada peptídeo por cromatografia líquida de alta performance (HPLC) e espectrometria de massa (MS). A GenScript também realizou um teste de solubilidade para todos os peptídeos e determinou o teor líquido de peptídeos (NPC%) usando um Vario MICRO Organic Elemental Analyzer. Com a exceção de Chp5, Lvp1 e Lvp2, todos os peptídeos eram solúveis em água e foram suspensos em uma concentração de 5 mg/mL ou 10 mg/mL. O Chp5 e o Lvp1 foram suspensos em DMSO a uma concentração de 10 mg/mL; o Lvp2 foi suspenso em DMSO a uma concentração de 2 mg/mL. Os peptídeos de controle RI18, RP-1, WLBU2, BAC3, GN-2 amp, GN-3 amp, GN-4 amp, GN-6 amp e Bac8c também foram sintetizados na GenScript como acima mencionado. Todos os peptídeos adicionais eram produtos comerciais adquiridos da GenScript ou da Anaspec. Exemplo 3: Atividade dos peptídeos de Chp - Concentração Inibitória Mínima (MIC) contra as bactérias Gram-negativas
[00175] Os 39 peptídeos de Chp (excluindo o Chp3, que tem uma sequência de peptídeos idêntica ao Chp2) foram sintetizados e examinados em formatos de teste de sensibilidade antimicrobiana (AST). Primeiro, os valores de MIC foram determinados contra o isolado clínico de P. aeruginosa resistente ao carbapenam CFS-1292 em meio de CAA suplementado com 2,5% de soro humano (Tabela 4). Vários peptídeos, incluindo Chp1, Chp2, Chp4, Chp6, CPAR39 (with dithiothreitol (DTT)), Chp7, Chp8, Chp10, Chp11, Ecp1, Ecp2, Osp1, Spi1, Gkh3, Unp2, Unp5, Unp6, Ecp3, Ecp4, Lvp1, ALCES1, AVQ206, CDL907, AGT915, e SBR77, exibiram valores de MIC superiores variando de 0,25-4 µg/mL. Os peptídeos de Chp5, CPAR39 (sem DTT), Gkh1, Unp1, Spi2 e Bdp1 foram apenas fracamente ativos e exibiram valores de MIC de ≥32 µg/mL. O CPAR39 é único neste grupo, pois contém resíduos de cisteína internos e requer a presença de 0,5 mM de DTT para a atividade. O Chp5 foi projetado como um derivado de Chp4 no qual todos os resíduos carregados positivamente foram alterados para cargas negativas; prevê-se, com base em estudos de AMPs catiônicos, que os resíduos catiônicos são necessários para a atividade antibacteriana e a remoção dos resíduos catiônicos com resíduos aniônicos eliminará a atividade. Consequentemente, o Chp5 (MIC>64 µg/mL) é uma variante inativa de Chp4 (MIC = 0,5 µg/mL). Tanto o CPAR39 (sem DTT) quanto o Chp5 são usados como controles negativos.
Tabela 4 Peptídeo MIC (µg/mL) contra CFS-1292 Chp1 2 Chp2 0,5 CPAR39 + DTT 4 CPAR39 - DTT 64 Chp4 0,5 Chp5 >64 Chp6 0,25 Chp7 4 Chp8 2 Chp9 8 Chp10 2 Chp11 4 Chp12 8 Gkh1 128 Gkh2 8 Gkh3 2 Unp1 32 Unp2 1 Unp3 8 Unp5 2 Unp6 4 Ecp1 0,5 Tma1 n.d.
Ecp2 1 Osp1 0,5 Spi1 2 Spi2 64
Peptídeo MIC (µg/mL) contra CFS-1292 Ecp3 4 Ecp4 2 Bdp1 >128 Lvp1 + DTT 2 Lvp2 8 ALCES1 2 AVQ206 2 AVG244 >16 CDL907 2 AGT915 1 HH3930 n.d. Fen7875 n.d. SBR77 0,5
[00176] O teste da MIC adicional foi realizado usando os peptídeos de Chp1, Chp2, Chp4, CPAR39 (sem DTT), Chp6, Ecp1 e Ecp2 contra uma gama de organismos Gram-negativos, incluindo Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae e Acinetobacter baumannii, que inclui alguns dos principais patógenos ESKAPE (Tabela 5). O teste foi realizado em CAA (contendo concentrações fisiológicas de sal) que não foi suplementado com 2,5% de soro humano, devido às suscetibilidades diferenciais dos organismos-alvo à presença de soro humano. Foram observados valores de MIC superiores de 1-4 µg/mL contra todas as cepas testadas para Chp2, Chp4, Chp6, Ecp1 e Ecp2, indicando uma atividade de amplo espectro para os presentes peptídeos de Chp no contexto de concentrações de sal fisiológicas. O Chp2 e o Ecp1 foram adicionalmente testados contra Salmonella typhimurium e demonstraram ter uma MIC de 2 µg/mL.
Tabela 5 MIC (μg/mL) Organismo CPAR39 RSC Chp2 Chp4 Ecp1 Chp6 Chp1 Ecp2 (número da cepa) -DTT P. aeruginosa 489 (ATCC 15692, 4 128 4 2 2 4 2 ferida infectada) P. aeruginosa (PAO1, fonte 490 4 128 4 2 1 8 2 alternativa, HER1018) P. aeruginosa 815 (ATCC 27853, cepa 4 >128 4 2 1 8 2 de controle da MIC) P. aeruginosa (ATCC 19142, 1108 2 16 4 1 2 8 4 secreção traqueobrônquica) P. aeruginosa (ATCC 1109 17646, abcesso do 4 >128 4 2 4 8 4 fígado humano) P. aeruginosa (ATCC 15152, 1110 4 128 4 1 2 4 1 abscesso no ouvido médio) P. aeruginosa (ATCC 14213, 1111 4 >128 4 2 4 8 4 ferida de quadril humano) P. aeruginosa 1113 (ATCC BAA-27, 4 >128 4 4 2 8 2 cepa de laboratório) P. aeruginosa 1114 (ATCC 25102, 4 >128 4 2 2 8 2 hospedeiro de
MIC (μg/mL) Organismo CPAR39 RSC Chp2 Chp4 Ecp1 Chp6 Chp1 Ecp2 (número da cepa) -DTT bacteriófago) P. aeruginosa 1115 (ATCC 15692, 4 128 4 2 4 8 8 ferida infectada) P. aeruginosa 453 1292 (Isolado clínico 4 16 4 2 2 8 8 humano, HSS) E. coli (ATCC 813 25922, cepa de 2 32 2 2 2 8 2 controle da MIC) E. coli (HM346, 1212 cólon, doença de 2 16 4 2 2 8 4 Crohn) Enterobacter cloacae (ATCC 1240 4 >128 4 2 4 8 4 13047, cepa de controle da MIC) Klebsiella pneumoniae (ATCC 814 4 64 4 2 4 16 4 10031 (cepa de controle da MIC) Klebsiella spp. (HM- 223; intestino de 1131 4 >128 4 2 4 8 2 paciente com doença de Crohn) Klebsiella 1138 pneumoniae (g2-3 4 >128 4 2 4 16 2 HM35K) Klebsiella sp. (HM- 1139 44; cólon, doença 2 64 4 2 1 8 4 de Crohn) 30 Acinetobacter 2 64 4 2 2 8 2
MIC (μg/mL) Organismo CPAR39 RSC Chp2 Chp4 Ecp1 Chp6 Chp1 Ecp2 (número da cepa) -DTT baumannii (isolado clínico HSS) Acinetobacter 32 baumannii (isolado 2 64 4 2 2 8 2 clínico HSS) Salmonella typhimurium LT2 27 2 n.d. n.d. 2 n.d. n.d. n.d. (isolado de laboratório) n.d. = não determinado
[00177] Os valores de MIC para tanto o Chp2 quanto o Chp4 também foram determinados e comparados com o de uma gama de AMPs da literatura (incluindo os efetores imunológicos inatos e os seus derivados) contra o a cepa de P. aeruginosa de laboratório PAO1, em caldo de Mueller-Hinton suplementado com 50% de plasma humano ou soro humano (Tabela 6). Aqui, o uso de PAO1 (um isolado de laboratório) permite o teste na presença de concentrações elevadas de soro ou plasma; a PAO1, ao contrário da maioria dos isolados clínicos, é insensível à atividade antibacteriana das matrizes de sangue humano. Na Tabela 6, os valores de MIC para Chp2 e Chp4 foram 2 µg/mL; em comparação, apenas o RI18 e a protegrina foram similarmente ativos (MIC = 1-4 µg/mL), e os 18 peptídeos adicionais testados eram inativos ou pouco ativos. Tabela 6 Concentração inibitória mínima (µg/mL) Agente Plasma Humano Soro Humano Protegrina 1 1 4 Indolicidina >64 >64
Concentração inibitória mínima (µg/mL) Agente Plasma Humano Soro Humano LL-37 >64 >64 LL-37 (18-37) >64 >64 LL-37 (17-29) >64 >64 GN-2 amp >64 >64 GN-3 amp >64 >64 GN-4 amp >64 >64 Pediocina >64 >64 Parasina >64 >64 PGLa >64 >64 OV-1 32 32 Dermaseptina >64 >64 WLBU2 >64 >64 RP-1 32 64 T9W 16 32 BAC3 >64 >64 GN-6 amp >64 >64 Bac 8c >64 >64 RI18 2 1 Chp2 2 2 Chp4 2 2 Exemplo 4: Atividade dos peptídeos de Chp - erradicação do biofilme de bactérias Gram-negativas
[00178] Para avaliar a atividade antibiofilme, os valores de MBEC (concentração mínima de erradicação de biofilme) foram determinados para os peptídeos de Chp2 e Chp4 contra os biofilmes maduros formados pela cepa de P. aeruginosa ATCC 17647, em meio de caldo de soja tríptico suplementado com 2% de glicose. Os valores de MBEC de 0,25 µg/mL foram observados tanto para o Chp2 quanto para o Chp4 (Tabela 7), os quais são consistentes com uma potente capacidade de erradicar biofilmes maduros. Em comparação, a atividade de RI18, um AMP altamente ativo (15), foi observada como sendo substancialmente menor, 4 µg/mL, e a atividade da lisozima T4, uma lisina pouco ativa, foi observada como sendo >64 µg/mL. Tabela 7 Agente MBEC (μg/mL) RI18 4 Chp2 0,25 Chp4 0,25 T4LYZ >64 Exemplo 5: Combinação dos peptídeos de Chp e dos antibióticos
[00179] Para avaliar a sinergia entre o Chp2 ou o Chp4 e uma gama de 11 antibióticos, cada combinação de Chp2 com os 11 antibióticos e de Chp4 com os 11 antibióticos foi testada em um formato de ensaio checkerboard padrão, usando a cepa de P. aeruginosa CFS-1292, em meio de CAA suplementado com 2,5% de soro humano. No ensaio checkerboard, são calculados os valores do índice de concentração inibitória fracionária (FICI). Valores do FICI ≤0,5 são consistentes com a sinergia, os valores >0,5-1 são consistentes com a atividade fortemente aditiva, os valores de 1-2 são consistentes com a atividade aditiva e os valores >2 são considerados antagonísticos. Conforme mostrado abaixo, na Tabela 8, tanto para o Chp2 quanto para o Chp4, os valores eram consistentes com a sinergia (isto é, ≤0,5) ou com as interações fortemente aditivas (isto é, >0,5-1) entre o peptídeo de Chp e o antibiótico.
Tabela 8 Antibiótico Chp2 Chp4 Amicacina 0,500 0,500 Azitromicina 0,156 0,156 Aztreonam 0,500 0,375 Ciprofloxacina 0,500 0,375 Colistina 0,375 0,375 Fosfomicina 0,250 0,250 Gentamicina 0,281 0,250 Imipenem 0,188 0,375 Piperacilina 0,188 0,188 Rifampicina 0,563 0,750 Tobramicina 0,266 0,266 Exemplo 6: Avaliação da atividade hemolítica dos peptídeos de Chp
[00180] Os peptídeos antimicrobianos receptivos para uso no tratamento de infecções invasivas devem mostrar baixa toxicidade contra os eritrócitos (Oddo A. et al, 2017. Methods Mol Biol 1548:427- 435). Para examinar o potencial para atividade hemolítica, uma metodologia comum (descrita em Materiais e Métodos acima) foi usada para medir a capacidade dos AMPs de efetuar a lise dos glóbulos vermelhos, com base na determinação das concentrações hemolíticas mínimas (MHCs) contra os glóbulos vermelhos humanos. Para 33 dos 37 peptídeos de Chp testados, nenhuma evidência de hemólise foi observada com os valores da MHC de >128 µg/mL (Tabela 9). O controle Triton X100 foi testado em uma concentração de partida de 2% e a MHC foi observada a 0,007%. Em comparação, quatro AMPs com atividade hemolítica conhecida, incluindo RI18, R12, RR12p e RR12h, foram observados com valores da MHC variando de 4-128 µg/mL. O
Triton X-100, um detergente membranolítico comumente utilizado como um controle positivo em ensaios hemolíticos, foi hemolítico sobre uma faixa de concentrações de 2% a 0,007%. Essas descobertas sugerem que os peptídeos de Chp não têm a toxicidade in vitro (ou seja, a atividade hemolítica) comumente observada para os AMPs.
Esta propriedade é esperada dos demais peptídeos de Chp das Tabelas 1 e 2 com base não apenas na porcentagem de identidade da sequência, similaridade estrutural 3D e perfil de carga, como também na antecipação que, como agentes líticos, os presentes peptídeos mais provavelmente serão muito altamente específicos para o envelope das células Gram-negativas.
Tabela 9: Valores da concentração hemolítica mínima (MHC) determinados contra os glóbulos vermelhos humanos Agente MHC (μg/mL)
Peptídeos de Controle
RI18 128
RR12 8
RR12p 4
RR12h 32
Controle de Triton* 1
Peptídeos de Chp
Chp1 >128
Chp2 >128
CPAR39 >128
Chp4 >128
Chp5 >128
Chp6 >128
Agente MHC (μg/mL) Chp7 >128 Chp8 >128 Chp9 >128 Chp10 >128 Chp11 >128 Chp12 >128 Gkh1 >128 Gkh2 >128 Gkh3 >128 Ecp1 >128 Ecp2 >128 Ecp3 >128 Ecp4 >128 Osp1 >128 Unp1 >128 Unp2 >128 Unp3 >128 Unp5 >128 Unp6 >128 Spi1 >128 Spi2 >128 Bdp1 >128 Lvp1 n.d.
Lvp2 8
Agente MHC (μg/mL) ALCES1 >128 AVQ206 >128 AVQ244 >128 CDL907 >128 AGT915 >128 HH3930 n.d.
Fen7875 n.d.
SBR77 >128 Exemplo 7: Duração da atividade lítica contra as bactérias Gram Negativas
[00181] A atividade de Chp2 e Chp4 foi examinada contra a cepa de P. aeruginosa CFS-1292, no formato de time-kill, usando o CAA com 2,5% de soro humano, como descrito em Materiais e Métodos. As avaliações da viabilidade bacteriana, em 1, 3 e 24 horas após o tratamento com concentrações de 1 µg/mL e 10 µg/mL de Chp2 ou Chp4, resultaram em diminuições de múltiplos log’s consistentes com atividade bactericida potente em todos os casos (Tabela 10). A Tabela 10 apresenta a redução em log das unidades formadoras de colônia (em comparação com os controles não tratados), determinada usando o formato de time-kill para a cepa de P. aeruginosa CFS-1292 após o tratamento em CAA suplementado com 2,5% de soro humano. Tabela 10 Tratamento Perda de viabilidade bacteriana (log10 das CFU/mL) 1 hora 3 horas 24 horas Chp2 (1 μg/mL) >3,5 >4 >4,8
Tratamento Perda de viabilidade bacteriana (log10 das CFU/mL) 1 hora 3 horas 24 horas Chp2 (10 μg/mL) >3,5 >4 >4,8 Chp4 (1 μg/mL) >3,5 >4 >4,8 Chp4 (10 µg/mL) >3,5 >4 >4,8
[00182] Além disso, uma avaliação da estabilidade foi conduzida para detectar o número de vezes que a MIC foi modificada, após a incubação dos peptídeos preparados conforme descrito acima no Exemplo 2. A estabilidade foi avaliada após a incubação em 100% de soro humano, a 37 ºC, após 10 minutos, 1 hora e 2 horas. Os resultados são mostrados abaixo na Tabela 11. Tabela 11 Peptídeo No. de vezes que a MIC foi modificada 10 minutos 1 hora 2 horas Chp1 1 1 1 Chp2 1 1 2 CPAR39 1 0,5 0,5 Chp4 1 1 0,5 Chp5 1 2 2 Chp6 1 1 1 Chp7 1 1 1 Chp8 1 1 1 Chp9 1 0,5 0,5 Chp10 1 2 2
Peptídeo No. de vezes que a MIC foi modificada 10 minutos 1 hora 2 horas Chp11 1 2 2 Chp12 1 1 1 Gkh1 1 0,5 1 Gkh2 1 0,5 2 Gkh3 1 1 1 Ecp1 1 4 1 Ecp2 1 2 2 Ecp3 1 1 1 Ecp4 n.d. n.d. n.d.
Osp1 1 0,5 1 Unp1 1 0,5 2 Unp2 1 2 1 Unp3 1 1 1 Unp5 1 1 4 Unp6 1 1 1 Spi1 1 2 2 Spi2 1 1 1 Bdp1 1 1 0,25 Lvp1 n.d. n.d. n.d.
Lvp2 1 1 0,25 ALCES1 1 1 1
Peptídeo No. de vezes que a MIC foi modificada 10 minutos 1 hora 2 horas AVQ206 1 1 1 AVQ244 1 1 0,5 CDL907 1 1 1 AGT915 1 1 0,5 HH3930 n.d. n.d. n.d.
Fen7875 n.d n.d. n.d SBR77 1 4 1
[00183] Como mostrado na Tabela 11, todos os Chp1, Chp2, CPAR39, Chp4, Chp5, Chp6, Chp7, Chp8, Chp9, Chp10, Chp11, Chp12, Gkh1, Gkh2, Gkh3, Ecp1, Ecp2, Ecp3, Ecp4, Osp1, Unp1, Unp2, Unp3, Unp5, Unp6, Spi1, Spi2, Bdp1, Lvp1, Lvp2, ALCES1, AVQ206, AVQ244, CDL907, AGT915, HH3930, Fen7875, e SBR77 estavam adequadamente estáveis após 10 minutos, 1 hora e 2 horas.

Claims (34)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: uma quantidade eficaz de (i) um peptídeo de Chp isolado tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs. 1-4, 6-26 e 54-66 ou seu fragmento ativo, ou (ii) um peptídeo de Chp modificado tendo 80% de identidade da sequência com a sequência de aminoácidos de pelo menos uma das SEQ ID NOs. 1-4, 6-26 e 54-66, em que o peptídeo de Chp modificado inibe o crescimento, reduz a população ou mata pelo menos uma espécie de bactérias Gram- negativas; e um veículo farmaceuticamente aceitável.
2. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peptídeo de Chp contém pelo menos uma modificação não natural em relação à sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs. 1-4, 6-26 e 54-66 ou seus fragmentos ativos.
3. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a modificação não natural é selecionada a partir do grupo que consiste em modificações de substituição, modificações por acetilação N terminal e modificações por amidação C terminal.
4. Composição farmacêutica, de acordo com quaisquer das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 59; SEQ
ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 63; e SEQ ID NO: 66 ou seus fragmentos ativos.
5. Composição farmacêutica, de acordo com quaisquer das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; e SEQ ID NO: 54 ou seus fragmentos ativos.
6. Composição farmacêutica, de acordo com quaisquer das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que é uma solução, uma suspensão, uma emulsão, um pó inalável, um aerossol ou um spray.
7. Composição farmacêutica, de acordo com quaisquer das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ou mais antibióticos adequados para o tratamento de bactérias Gram-negativas.
8. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica (i) um peptídeo de Chp tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs. 1-4, 6-26 e 54-66 ou seus fragmentos ativos, ou (ii) um peptídeo de Chp modificado tendo 80% de identidade da sequência com a sequência de aminoácidos de pelo menos uma das SEQ ID NOs. 1-4, 6-26 e 54-66, em que o peptídeo de Chp modificado inibe o crescimento ou reduz a população ou mata pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas.
9. Vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica (i) um peptídeo de Chp tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs. 1-4, 6-26 e 54-66 ou seus fragmentos ativos, ou (ii) um peptídeo de Chp modificado tendo 80% de identidade da sequência com a sequência de aminoácidos de pelo menos uma das SEQ ID NOs. 1-4, 6-26 e 54-66, em que o peptídeo de Chp modificado inibe o crescimento ou reduz a população ou mata pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas, o ácido nucleico sendo operativamente ligado a um promotor heterólogo.
10. Vetor de expressão recombinante, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 63; e SEQ ID NO: 66 ou seus fragmentos ativos.
11. Vetor de expressão recombinante, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; e SEQ ID NO: 54 ou seus fragmentos ativos.
12. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico é uma sequência de cDNA.
13. Célula hospedeira isolada, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 12.
14. Ácido nucleico isolado e purificado, caracterizado pelo fato de que codifica um peptídeo de Chp compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs. 1-4, 6-26 e 54-66 ou seus fragmentos ativos ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência complementar a ele.
15. Ácido nucleico isolado e purificado, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de Chp contém pelo menos uma modificação não natural em relação à sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs. 1-4, 6- 26 e 54-66 ou seus fragmentos ativos.
16. Ácido nucleico isolado e purificado, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que a modificação é selecionada a partir do grupo que consiste em modificações de substituição, modificações por acetilação N terminal e modificações por amidação C terminal.
17. DNA isolado e purificado, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs. 27-30, SEQ ID NOs. 32-53 e SEQ ID NOs. 68-79.
18. DNA isolado e purificado, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos contém pelo menos uma modificação não natural.
19. DNA isolado e purificado, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que a modificação não natural é uma mutação ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma modificação por acetilação N terminal ou uma modificação por amidação C terminal.
20. Método de inibir o crescimento, reduzir a população ou matar pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas, o método caracterizado pelo fato de que compreende o contato das bactérias com uma composição que compreende uma quantidade eficaz de (i) um peptídeo de Chp que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs. 1-4, 6-26 e 54-66 ou seus fragmentos ativos, ou (ii) um peptídeo de Chp modificado tendo 80% de identidade da sequência com a sequência de aminoácidos de pelo menos uma das SEQ ID NOs. 1-4, 6-26 e 54-66, o referido peptídeo de Chp ou peptídeo de Chp modificado tendo atividade lítica por um período suficiente para inibir o referido crescimento, reduzir a referida população ou matar a referida pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas.
21. Método de inibir o crescimento, reduzir a população ou matar pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 63; e SEQ ID NO: 66 ou seus fragmentos ativos.
22. Método de inibir o crescimento, reduzir a população ou matar pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; e SEQ ID NO: 54 ou seus fragmentos ativos.
23. Método de prevenir ou tratar uma infecção bacteriana causada por pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um paciente diagnosticado com, em risco de, ou exibindo sintomas de uma infecção bacteriana de uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 1-7.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, caracterizado pelo fato de que a bactéria Gram-negativa é selecionada a partir do grupo que consiste em Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Salmonella, Neisseria gonorrhoeae e Shigella.
25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 24, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas é a Pseudomonas aeruginosa.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 25, caracterizado pelo fato de que a infecção bacteriana é uma infecção bacteriana tópica ou sistêmica.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 26, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a administração ao paciente de um antibiótico adequado para o tratamento de infecção por bactérias Gram-negativas.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o antibiótico é selecionado a partir de um ou mais de azitromicina, aztreonam, fosfomicina, ceftazidima, cefepima, cefoperazona, ceftobiprol, ciprofloxacina, levofloxacina, aminoglicosídeos, imipenem, meropenem, doripenem, gentamicina, tobramicina, amicacina, piperacilina, ticarcilina, penicilina, rifampicina, polimixina B e colistina.
29. Método, de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que o antibiótico é selecionado a partir de um ou mais de amicacina, azitromicina, aztreonam, ciprofloxacina, colistina, fosfomicina, gentamicina, imipenem, piperacilina, rifampicina e tobramicina.
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, caracterizado pelo fato de que a administração da composição farmacêutica como definida nas reivindicações 1 a 7 é mais eficaz na inibição do crescimento, na redução da população ou na matança das bactérias Gram-negativas do que a administração do antibiótico sozinho.
31. Método para prevenir ou tratar uma infecção bacteriana causada por pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas, caracterizado pelo fato de que compreende a coadministração a um paciente diagnosticado com, em risco de, ou exibindo sintomas de, uma infecção bacteriana de uma combinação de uma primeira quantidade de uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 1-7 e uma segunda quantidade de um antibiótico adequado para o tratamento de infecção por bactérias Gram-negativas, em que a primeira e a segunda quantidades juntas são eficazes para prevenir ou tratar a infecção bacteriana.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o antibiótico é selecionado a partir de um ou mais de azitromicina, aztreonam, fosfomicina, ceftazidima, cefepima, cefoperazona, ceftobiprol, ciprofloxacina, levofloxacina, aminoglicosídeos, imipenem, meropenem, doripenem, gentamicina, tobramicina, amicacina, piperacilina, ticarcilina, penicilina, rifampicina, polimixina B e colistina.
33. Método, de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizado pelo fato de que o antibiótico é selecionado a partir de um ou mais de amicacina, azitromicina, aztreonam, ciprofloxacina, colistina, fosfomicina, gentamicina, imipenem, piperacilina, rifampicina e tobramicina.
34. Método para aumentar a eficácia de um antibiótico adequado para o tratamento de uma infecção bacteriana causada por pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas, caracterizado pelo fato de que compreende a coadministração do antibiótico em combinação com uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a administração da combinação é mais eficaz na inibição do crescimento, na redução da população ou na matança das bactérias Gram-negativas do que a administração do antibiótico ou da composição farmacêutica individualmente.
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