BR112020018972A2 - HIGH PURITY STEVIOL GLYCOSIDES - Google Patents

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Avetik Markosyan
Saravanan A/L Ramandach
Mohamad Afzaal Bin HASIM
Khairul Nizam Bin Nawi
Siew Yin Chow
Siddhartha PURKAYASTHA
Marcia Petit
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Abstract

são descritos métodos de uso de rebaudiosídeo am altamente purificado. os métodos incluem usar preparações de enzima e micro-organismos recombinantes para converter diversas composições de partida para alvejar glicosídeos de esteviol. o rebaudiosídeo am altamente purificado é útil como intensificador de sabor, intensificador de doçura e supressor de formação de espuma em composições comestíveis e mastigáveis como qualquer bebida, confeitos, produtos de panificação, biscoitos e gomas de mascar.methods of using highly purified rebaudioside am are described. methods include using enzyme preparations and recombinant microorganisms to convert various starting compositions to target steviol glycosides. the highly purified rebaudioside am is useful as a flavor enhancer, sweetening intensifier and foaming suppressant in edible and chewable compositions like any beverage, confectionery, bakery products, cookies and chewing gum.

Description

“GLICOSÍDEOS DE ESTEVIOL DE ALTA PUREZA”“HIGH PURITY STEVIOL GLYCOSIDES” CAMPO DA TÉCNICATECHNICAL FIELD

[001] A presente invenção refere-se a composições que compreendem glicosídeos de esteviol, incluindo composições de glicosídeo de esteviol altamente purificado, e processos para a produção das mesmas.[001] The present invention relates to compositions comprising steviol glycosides, including highly purified steviol glycoside compositions, and processes for producing them.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃOBACKGROUND OF THE INVENTION

[002] Os adoçantes de alta intensidade possuem um nível de doçura que é muitas vezes maior que o nível de doçura de sacarose. São essencialmente não calóricos e são comumente usados em produtos com teor calórico reduzido e dietéticos, incluindo alimentos e bebidas. Os adoçantes de alta intensidade não elicitam uma resposta glicêmica, tornando-os adequados para o uso em produtos direcionados a diabéticos e outros interessados no controle de sua ingestão de carboidratos.[002] High intensity sweeteners have a level of sweetness that is many times higher than the sweetness level of sucrose. They are essentially non-caloric and are commonly used in low calorie and diet products, including food and beverages. High-intensity sweeteners do not elicit a glycemic response, making them suitable for use in products aimed at diabetics and others interested in controlling their carbohydrate intake.

[003] Os glicosídeos de esteviol são uma classe de compostos encontrados nas folhas de Stevia rebaudiana Bertoni, um arbusto perene da família Asteraceae (Compositae) nativa de certas regiões da América do Sul. São caracterizados estruturalmente por uma única base, esteviol, que se difere pela presença de resíduos de carboidrato nas posições C13 e C19. Se acumulam em folhas de Stevia, compondo aproximadamente 10% a 20% do peso seco total. Em uma base de peso seco, os quatro glicosídeos principais encontrados na folhas de Stevia incluem tipicamente esteviosídeo (9,1%), rebaudiosídeo A (3,8%), rebaudiosídeo C (0,6 a 1,0%) e dulcosídeo A (0,3%). Outros glicosídeos de esteviol conhecidos incluem rebaudiosídeo B, C, D, E, F e M, esteviolbiosídeo e rubusosídeo.[003] Steviol glycosides are a class of compounds found in the leaves of Stevia rebaudiana Bertoni, a perennial shrub of the Asteraceae (Compositae) family native to certain regions of South America. They are structurally characterized by a single base, steviol, which differs by the presence of carbohydrate residues in positions C13 and C19. They accumulate in Stevia leaves, making up approximately 10% to 20% of the total dry weight. On a dry weight basis, the four main glycosides found in Stevia leaves typically include stevioside (9.1%), rebaudioside A (3.8%), rebaudioside C (0.6 to 1.0%) and dulcoside A (0.3%). Other known steviol glycosides include rebaudioside B, C, D, E, F and M, steviolbioside and rubusoside.

[004] Embora os métodos sejam conhecidos para preparar glicosídeos de esteviol a partir de Stevia rebaudiana, muitos desses métodos são inadequados para usar comercialmente.[004] Although methods are known to prepare steviol glycosides from Stevia rebaudiana, many of these methods are unsuitable for commercial use.

[005] Consequentemente, existe uma necessidade por métodos simples, eficazes e econômicos para preparar composições que compreendem glicosídeos de esteviol, incluindo composições de glicosídeo de esteviol altamente purificado.[005] Consequently, there is a need for simple, effective and economical methods for preparing compositions comprising steviol glycosides, including highly purified steviol glycoside compositions.

SUMÁRIO DA INVENÇÃOSUMMARY OF THE INVENTION

[006] A presente invenção fornece um processo para preparar uma composição que compreende um glicosídeo de esteviol alvo mediante a colocação de uma composição de partida que compreende um substrato orgânico em contato com uma célula microbiana e/ou preparação de enzima, produzindo assim uma composição que compreende um glicosídeo de esteviol alvo.[006] The present invention provides a process for preparing a composition comprising a target steviol glycoside by placing a starting composition comprising an organic substrate in contact with a microbial cell and / or enzyme preparation, thereby producing a composition which comprises a target steviol glycoside.

[007] A composição de partida pode ser qualquer composto orgânico que compreende pelo menos um átomo de carbono. Em uma modalidade, a composição de partida é selecionada a partir do grupo que consiste em glicosídeos de esteviol, polióis ou álcoois de açúcar, diversos carboidratos.[007] The starting composition can be any organic compound that comprises at least one carbon atom. In one embodiment, the starting composition is selected from the group consisting of steviol glycosides, polyols or sugar alcohols, various carbohydrates.

[008] O glicosídeo de esteviol alvo pode ser qualquer glicosídeo de esteviol. Em uma modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo AM ou um glicosídeo de esteviol sintético.[008] The target steviol glycoside can be any steviol glycoside. In one embodiment, the target steviol glycoside is steviolmonoside, steviolmonoside A, steviolbioside, steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C, rebaudioside E, rebaudioside E, rebaudios E, rebaudioside E, rebaudioside E, rebaudioside E, rebaudioside E, rebaudioside E, rebaudioside E, rebaudioside E, rebaudioside E, rebaudioside E, rebaudioside E, rebaudioside E, rebaudioside E, rebaudioside E, rebaudioside E, rebaudioside E2 AM or a synthetic steviol glycoside.

[009] Em uma modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é rebaudiosídeo AM.[009] In one embodiment, the target steviol glycoside is rebaudioside AM.

[010] Em algumas modalidades preferenciais, é usada a preparação de enzima que compreende uma ou mais enzimas, ou uma célula microbiana que compreende uma ou mais enzimas, com capacidade para converter a composição de partida em glicosídeos de esteviol alvo. A enzima pode estar situada sobre a superfície e/ou dentro da célula. A preparação de enzima pode ser fornecida sob a forma de uma suspensão de células inteiras, um lisato bruto ou como enzima purificada (ou enzimas purificadas).[010] In some preferred embodiments, an enzyme preparation comprising one or more enzymes, or a microbial cell comprising one or more enzymes, capable of converting the starting composition into target steviol glycosides is used. The enzyme can be located on the surface and / or inside the cell. The enzyme preparation can be provided as a whole cell suspension, a crude lysate or as a purified enzyme (or purified enzymes).

A preparação de enzima pode ser na forma livre ou imobilizada em um suporte sólido produzido a partir de materiais inorgânicos ou orgânicos.The enzyme preparation can be in free form or immobilized on a solid support produced from inorganic or organic materials.

[011] Em algumas modalidades, uma célula microbiana compreende as enzimas necessárias e genes que codificam as mesmas para converter a composição de partida em glicosídeos de esteviol alvo. Consequentemente, a presente invenção também fornece um processo para preparar uma composição que compreende um glicosídeo de esteviol alvo por meio da colocação de uma composição de partida que compreende um substrato orgânico em contato com uma célula microbiana que compreende pelo menos uma enzima com capacidade para converter a composição de partida em glicosídeos de esteviol alvo, produzindo assim um meio que compreende pelo menos um glicosídeo de esteviol alvo.[011] In some embodiments, a microbial cell comprises the necessary enzymes and genes that encode them to convert the starting composition into target steviol glycosides. Accordingly, the present invention also provides a process for preparing a composition comprising a target steviol glycoside by placing a starting composition comprising an organic substrate in contact with a microbial cell comprising at least one enzyme capable of converting the starting composition in target steviol glycosides, thereby producing a medium that comprises at least one target steviol glycoside.

[012] As enzimas necessárias para converter a composição de partida em glicosídeos de esteviol alvo incluem as enzimas de biossíntese de esteviol, UDP- glicosiltransferases (UGTs) e/ou enzima de reciclagem de UDP.[012] The enzymes necessary to convert the starting composition to target steviol glycosides include steviol biosynthesis enzymes, UDP-glycosyltransferases (UGTs) and / or UDP recycling enzyme.

[013] Em uma modalidade, as enzimas de biossíntese de esteviol incluem enzimas de via de mevalonato (MVA).[013] In one embodiment, steviol biosynthesis enzymes include mevalonate pathway (MVA) enzymes.

[014] Em uma outra modalidade, as enzimas de biossíntese de esteviol incluem enzimas de via de 2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato não-mevalonato (MEP/DOXP).[014] In another embodiment, steviol biosynthesis enzymes include enzymes from the 2-C-methyl-D-erythritol-4-non-mevalonate pathway (MEP / DOXP).

[015] Em uma modalidade, as enzimas de biossíntese de esteviol são selecionadas a partir do grupo que inclui geranilgeranil difosfato sintase, copalil difosfato sintase, caureno sintase, caureno oxidase, ácido caurenoico 13-hidroxilase (KAH), esteviol sintetase, dcoxixilulose 5 -fosfato sintase (DXS), D-1-desoxixilulose 5-fosfato reductoisomerase (DXR), 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol sintase (CMS), 4- difosfocitidiI-2-C-metil-D-eritritol quinase (CMK), 4-difosfocitidil-2-C- metil-D-eritritol 2,4-[015] In one embodiment, the steviol biosynthesis enzymes are selected from the group that includes geranylgeranyl diphosphate synthase, copalyl diphosphate synthase, kurene synthase, kurene oxidase, kurenoic acid 13-hydroxylase (KAH), steviol synthase, dcoxixylulose 5 - phosphate synthase (DXS), D-1-deoxyxylulose 5-phosphate reductoisomerase (DXR), 4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol synthase (CMS), 4-diphosphocytidiI-2-C-methyl-D-erythritol kinase (CMK), 4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol 2,4-

ciclodifosfato sintase (MCS), 1-hidroxi-2-metil-2(E)- butenil 4-difosfato sintase (HDS), 1- hidroxi-2-metil-2(E)-butenil 4-difosfato redutase (HDR), acetoacetil-CoA tiolase, HMG- CoA redutase truncada, mevalonato quinase, fosfomevalonato quinase, mevalonato pirofosfato decarboxilase, citocromo P450 redutase etc.cyclodiphosphate synthase (MCS), 1-hydroxy-2-methyl-2 (E) - butenyl 4-diphosphate synthase (HDS), 1-hydroxy-2-methyl-2 (E) -butenyl 4-diphosphate reductase (HDR), acetoacetyl-CoA thiolase, HMG-CoA truncated reductase, mevalonate kinase, phosphomevalonate kinase, mevalonate pyrophosphate decarboxylase, cytochrome P450 reductase etc.

[016] A UDP-glicosiltransferase pode ser qualquer UDP-glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviol e/ou um substrato de glicosídeo de esteviol para fornecer o glicosídeo de esteviol alvo.[016] UDP-glycosyltransferase can be any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to steviol and / or a steviol glycoside substrate to provide the target steviol glycoside.

[017] Como usado mais adiante neste documento, o termo “SuSy_AT”, exceto onde especificado em contrário, se refere a sacarose sintase que tem a sequência de aminoácidos “SEQ ID 1”, conforme descrito no Exemplo 1.[017] As used later in this document, the term "SuSy_AT", unless otherwise specified, refers to sucrose synthase which has the amino acid sequence "SEQ ID 1", as described in Example 1.

[018] Como usado mais adiante neste documento, o termo “UGTSl2”, exceto onde especificado em contrário, se refere a UDP-glicosiltransferase que tem a sequência de aminoácidos “SEQ ID 2” conforme descrito no Exemplo 1.[018] As used later in this document, the term "UGTSl2", unless otherwise specified, refers to UDP-glycosyltransferase which has the amino acid sequence "SEQ ID 2" as described in Example 1.

[019] Como usado mais adiante neste documento, o termo “UGT76G1”, exceto onde especificado em contrário, se refere a UDP-glicosiltransferase que tem a sequência de aminoácidos “SEQ ID 3” conforme descrito no Exemplo 1.[019] As used later in this document, the term "UGT76G1", unless otherwise specified, refers to UDP-glycosyltransferase which has the amino acid sequence "SEQ ID 3" as described in Example 1.

[020] Em uma modalidade, as enzimas de biossíntese de esteviol e UDP- glicosiltransferases são produzidas em uma célula microbiana. A célula microbiana pode ser, por exemplo, E. coli, Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Pichia sp., Bacillus sp., Yarrowia sp. etc. Em uma outra modalidade, as UDP-glicosiltransferases são sintetizadas.[020] In one embodiment, steviol and UDP-glycosyltransferase biosynthesis enzymes are produced in a microbial cell. The microbial cell can be, for example, E. coli, Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Pichia sp., Bacillus sp., Yarrowia sp. etc. In another embodiment, UDP-glycosyltransferases are synthesized.

[021] Em uma modalidade, a UDP-glicosiltransferase é selecionada a partir do grupo que inclui UGT74G1, UGT85C2, UGT76G1, UGT91D2, UGTS12, EUGT11 e UGTs que tem identidade de sequência de aminoácidos substancial (>85%, >86%, >87%, >88%, >89%, >90%, >91%, >92%, >93%, >94%, >95%, >96%, >97%, >98%, >99%) com esses polipeptídeos, bem como moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam essas UGTs.[021] In one embodiment, UDP-glycosyltransferase is selected from the group that includes UGT74G1, UGT85C2, UGT76G1, UGT91D2, UGTS12, EUGT11 and UGTs that have substantial amino acid sequence identity (> 85%,> 86%,> 87%,> 88%,> 89%,> 90%,> 91%,> 92%,> 93%,> 94%,> 95%,> 96%,> 97%,> 98%,> 99% ) with these polypeptides, as well as isolated nucleic acid molecules encoding these UGTs.

[022] Em uma modalidade, as enzimas de biossíntese de esteviol, UGTs e sistema de reciclagem de UDP-glicose estão presentes em um micro-organismo (célula microbiana). O micro-organismo pode ser, por exemplo, E. coli, Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Pichia sp., Bacillus sp., Yarrowia sp.[022] In one embodiment, the steviol biosynthesis enzymes, UGTs and UDP-glucose recycling system are present in a micro-organism (microbial cell). The microorganism can be, for example, E. coli, Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Pichia sp., Bacillus sp., Yarrowia sp.

[023] Em uma modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviol ou qualquer glicosídeo de esteviol de partida que contêm um grupo funcional -OH em C13 para gerar um glicosídeo de esteviol alvo que tem uma ligação glicosídica de -O- glicose beta glicopiranosídeo em C13. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT85C2, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.[023] In one embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to steviol or any starting steviol glycoside that contains a -OH functional group on C13 to generate a steviol glycoside target that has a glycosidic bond of -O- glucose beta glycopyranoside at C13. In a particular embodiment, the UDP-glycosyltransferase is UGT85C2, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT85C2.

[024] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviol ou qualquer glicosídeo de esteviol de partida que contém um grupo funcional -COOH em C19 para gerar um glicosídeo de esteviol alvo que tem uma ligação glicosídica de -COO-glicose beta-glicopiranosídeo em C19. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT74G1, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.[024] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to the steviol or any starting steviol glycoside that contains a -COOH functional group in C19 to generate a glycoside of C19 target steviol which has a C19 -COO-glucose beta-glycopyranoside glycosidic bond. In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT74G1, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT74G1.

[025] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose à glicose existente em C19 de qualquer glicosídeo de esteviol de partida para gerar um glicosídeo de esteviol alvo com pelo menos uma glicose adicional que contém pelo menos uma ligação glicosídica (ou ligações glicosídicas) de beta 1→2 glicopiranosídeo na ligação glicosídica (ou ligações glicosídicas) recém formada. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGTS12, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em uma outra modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.[025] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to the C19 glucose of any starting steviol glycoside to generate a target steviol glycoside with at least one additional glucose containing at least one glycosidic bond (or glycosidic bonds) of beta 1 → 2 glycopyranoside in the newly formed glycosidic bond (or glycosidic bonds). In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGTS12, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGTS12. In another particular embodiment, the UDP-glycosyltransferase is EUGT11, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with EUGT11. In yet another particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT91D2, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT91D2.

[026] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose à glicose existente em C19 de qualquer glicosídeo de esteviol de partida para gerar um glicosídeo de esteviol alvo com pelo menos uma glicose adicional que contém pelo menos uma ligação glicosídica (ou ligações glicosídicas) de beta 1→3 glicopiranosídeo na ligação glicosídica (ou ligações glicosídicas) recém formada. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT76G1, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.[026] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to the C19 glucose of any starting steviol glycoside to generate a target steviol glycoside with at least one additional glucose containing at least one glycosidic bond (or glycosidic bonds) of beta 1 → 3 glycopyranoside in the newly formed glycosidic bond (or glycosidic bonds). In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT76G1, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT76G1.

[027] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose à glicose existente em C13 de qualquer glicosídeo de esteviol de partida para gerar um glicosídeo de esteviol alvo com pelo menos uma glicose adicional que contém pelo menos uma ligação glicosídica (ou ligações glicosídicas) de beta 1→2 glicopiranosídeo na ligação glicosídica (ou ligações glicosídicas) recém formada. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGTS12, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em uma outra modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.[027] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to the existing C13 glucose of any starting steviol glycoside to generate a target steviol glycoside with at least one additional glucose containing at least one glycosidic bond (or glycosidic bonds) of beta 1 → 2 glycopyranoside in the newly formed glycosidic bond (or glycosidic bonds). In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGTS12, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGTS12. In another particular embodiment, the UDP-glycosyltransferase is EUGT11, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with EUGT11. In yet another particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT91D2, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT91D2.

[028] Em uma modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviol para formar esteviolmonosídeo. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT85C2 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.[028] In one embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to steviol to form steviolmonoside. In a particular embodiment, the UDP-glycosyltransferase is UGT85C2 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT85C2 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT85C2.

[029] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviol para formar esteviolmonosídeo A. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT74G1 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.[029] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to steviol to form steviolmonoside A. In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT74G1 or a UGT that has > 85% amino acid sequence identity with UGT74G1.

[030] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviolmonosídeo A para formar esteviolbiosídeo B. Em uma modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.[030] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one unit of glucose to steviolmonoside A to form steviolbioside B. In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT76G1 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT76G1.

[031] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviolmonosídeo A para formar esteviolbiosídeo A. Em uma modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é UGTS12 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em uma outra modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade particular, a UDP-[031] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase with the ability to add at least one glucose unit to steviolmonoside A to form steviolbioside A. In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGTS12 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGTS12. In another particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is EUGT11, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with EUGT11. In yet another particular modality, UDP-

glicosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.glycosyltransferase is UGT91D2, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT91D2.

[032] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviolmonosídeo A para formar rubusosídeo. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT85C2 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.[032] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to steviolmonoside A to form rubusoside. In a particular embodiment, the UDP-glycosyltransferase is UGT85C2 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT85C2.

[033] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviolmonosídeo para formar rubusosídeo. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT74G1 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.[033] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to steviolmonoside to form rubusoside. In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT74G1 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT74G1.

[034] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviolmonosídeo para formar esteviolbiosídeo.[034] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one unit of glucose to steviolmonoside to form steviolbioside.

[035] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviolbiosídeo B para formar esteviosídeo B. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT85C2 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.[035] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase with the ability to add at least one glucose unit to steviolbioside B to form stevioside B. In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT85C2 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT85C2.

[036] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviolbiosídeo B para formar esteviosídeo C. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGTS12 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em uma outra modalidade particular, a UDP-[036] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one unit of glucose to steviolbioside B to form stevioside C. In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGTS12 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGTS12. In another particular modality, UDP-

glicosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.glycosyltransferase is EUGT11, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with EUGT11. In yet another particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT91D2, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT91D2.

[037] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviolbiosídeo A para formar esteviosídeo A. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT85C2 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.[037] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one unit of glucose to steviolbioside A to form stevioside A. In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT85C2 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT85C2.

[038] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviolbiosídeo A para formar esteviosídeo C. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.[038] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to steviolbioside A to form stevioside C. In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT76G1 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT76G1.

[039] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a rubusosídeo para formar esteviosídeo B. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.[039] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase with the capacity to add at least one glucose unit to rubusoside to form stevioside B. In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT76G1 or a UGT that has > 85% amino acid sequence identity with UGT76G1.

[040] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a rubusosídeo para formar esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA). Em uma modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é UGTS12 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em uma outra modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.[040] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one unit of glucose to rubusoside to form stevioside A (rebaudioside KA). In a particular embodiment, the UDP-glycosyltransferase is UGTS12 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGTS12. In another particular embodiment, the UDP-glycosyltransferase is EUGT11, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with EUGT11. In yet another particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT91D2, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT91D2.

[041] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a rubusosídeo para formar esteviosídeo.[041] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase with the capacity to add at least one glucose unit to rubusoside to form stevioside.

[042] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviolbiosídeo para formar esteviosídeo. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT74G1 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.[042] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to steviolbioside to form stevioside. In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT74G1 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT74G1.

[043] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviosídeo B para formar rebaudiosídeo E3. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGTS12 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em uma outra modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.[043] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to stevioside B to form E3 rebaudioside. In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGTS12 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGTS12. In another particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is EUGT11, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with EUGT11. In yet another particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT91D2, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT91D2.

[044] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviosídeo B para formar rebaudiosídeo E2.[044] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to stevioside B to form E2 rebaudioside.

[045] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA ) para formar rebaudiosídeo E3. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.[045] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase with the capacity to add at least one glucose unit to stevioside A (rebaudioside KA) to form E3 rebaudioside. In a particular embodiment, the UDP-glycosyltransferase is UGT76G1 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT76G1.

[046] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA) para formar rebaudiosídeo E.[046] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to stevioside A (rebaudioside KA) to form rebaudioside E.

[047] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviosídeo C para formar rebaudiosídeo E3. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT85C2 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.[047] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to stevioside C to form E3 rebaudioside. In a particular embodiment, the UDP-glycosyltransferase is UGT85C2 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT85C2.

[048] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviosídeo para formar rebaudiosídeo E2. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.[048] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to stevioside to form E2 rebaudioside. In a particular embodiment, the UDP-glycosyltransferase is UGT76G1 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT76G1.

[049] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviosídeo para formar rebaudiosídeo E. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGTS12 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em uma outra modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.[049] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase with the ability to add at least one glucose unit to stevioside to form rebaudioside E. In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGTS12 or a UGT that has > 85% amino acid sequence identity with UGTS12. In another particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is EUGT11, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with EUGT11. In yet another particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT91D2, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT91D2.

[050] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a rebaudiosídeo E3 para formar rebaudiosídeo AM.[050] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to E3 rebaudioside to form AM rebaudioside.

[051] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a rebaudiosídeo E2 para formar rebaudiosídeo AM. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGTS12 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em uma outra modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.[051] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to E2 rebaudioside to form AM rebaudioside. In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGTS12 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGTS12. In another particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is EUGT11, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with EUGT11. In yet another particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT91D2, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT91D2.

[052] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a rebaudiosídeo E para formar rebaudiosídeo AM. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.[052] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase with the capacity to add at least one unit of glucose to rebaudioside E to form rebaudioside AM. In a particular embodiment, the UDP-glycosyltransferase is UGT76G1 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT76G1.

[053] Opcionalmente, o método da presente invenção compreende adicionalmente usar mais de uma UGT em uma composição de partida, para gerar um glicosídeo (ou glicosídeos) de esteviol alvo que tem mais de uma unidade de glicose em relação à composição de partida. Em uma modalidade particular, as UDP- glicosiltransferases são UGT74G1, UGT85C2, UGT76G1, UGTS12, EUGT11 e/ou UGT91D2 ou qualquer UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1, UGT85C2, UGT76G1, UGTS12, EUGT11 e/ou UGT91D2 ou qualquer combinação dos mesmos, com capacidade para adicionar mais de uma unidade de glicose a uma composição de partida para gerar um glicosídeo (ou glicosídeos) de esteviol que tem mais de uma unidade de glicose relação à composição de partida.[053] Optionally, the method of the present invention further comprises using more than one UGT in a starting composition, to generate a target steviol glycoside (or glycosides) that has more than one glucose unit relative to the starting composition. In a particular embodiment, the UDP-glycosyltransferases are UGT74G1, UGT85C2, UGT76G1, UGTS12, EUGT11 and / or UGT91D2 or any UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT74G1, UGT85C2, UGT12G, UGT91D2 or any combination thereof, capable of adding more than one glucose unit to a starting composition to generate a steviol glycoside (or glycosides) that has more than one glucose unit relative to the starting composition.

[054] Em uma modalidade, as UDP-glicosiltransferases são qualquer UDP- glicosiltransferases com capacidade para adicionar, em geral, duas unidades de glicose a esteviosídeo para formar rebaudiosídeo AM. Em uma modalidade particular, as UDP- glicosiltransferases são selecionadas a partir de UGTS12, EUGT11, UGT91D2, UGT76G1 ou qualquer UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12, EUGT11, UGT91D2, UGT76G1 ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade particular, as UDP-glicosiltransferases são UGTS12 e UGT76G1.[054] In one embodiment, UDP-glycosyltransferases are any UDP-glycosyltransferases capable of adding, in general, two glucose units to stevioside to form AM rebaudioside. In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferases are selected from UGTS12, EUGT11, UGT91D2, UGT76G1 or any UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGTS12, EUGT11, UGT91D2, UGT76G1 or any combination thereof. In another particular embodiment, UDP-glycosyltransferases are UGTS12 and UGT76G1.

[055] Opcionalmente, o método da presente invenção compreende adicionalmente reciclar UDP para fornecer UDP-glicose. Em uma modalidade, o método compreende reciclar UDP mediante o fornecimento de um catalisador de reciclagem e um substrato de reciclagem, de modo que a biotransformação de esteviol e/ou o substrato de glicosídeo de esteviol para o glicosídeo de esteviol alvo é realizada com o uso de quantidades catalíticas de UDP-glicosiltransferase e UDP-glicose.[055] Optionally, the method of the present invention further comprises recycling UDP to provide UDP-glucose. In one embodiment, the method comprises recycling UDP by providing a recycling catalyst and a recycling substrate, so that the biotransformation of steviol and / or the steviol glycoside substrate into the target steviol glycoside is performed using of catalytic amounts of UDP-glycosyltransferase and UDP-glucose.

[056] Em uma modalidade, o catalisador de reciclagem é sacarose sintase SuSy_At ou uma sacarose sintase que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com SuSy_At.[056] In one embodiment, the recycling catalyst is suSose synthase SuSy_At or a sucrose synthase that has> 85% amino acid sequence identity with SuSy_At.

[057] Em uma modalidade, o substrato de reciclagem é sacarose.[057] In one embodiment, the recycling substrate is sucrose.

[058] Opcionalmente, o método da presente invenção compreende adicionalmente o uso de transglicosidases que usam oligo- ou polissacarídeos como o doador de açúcar para modificar moléculas de glicosídeo de esteviol alvo de receptor. Os exemplos não limitadores incluem ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase), fructofuranosidase, amilase, saccarase, glicosucrase, beta-h-fructosidase, beta-[058] Optionally, the method of the present invention further comprises the use of transglycosidases that use oligo- or polysaccharides as the sugar donor to modify receptor-steviol glycoside molecules. Non-limiting examples include cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase), fructofuranosidase, amylase, saccarase, glycosucrase, beta-h-fructosidase, beta-

fructosidase, sucrase. fructosilinvertase, invertase alcalina, invertase ácida, fructofuranosidase. Em algumas modalidades, glicose e açúcar (ou açúcares) além de glicose, incluindo, porém sem limitação, frutose, xilose, ramnose, arabinose, desoxiglicose, galactose são transferidos para os glicosídeos de esteviol alvo receptores.fructosidase, sucrase. fructosylinvertase, alkaline invertase, acid invertase, fructofuranosidase. In some embodiments, glucose and sugar (or sugars) in addition to glucose, including, but not limited to, fructose, xylose, rhamnose, arabinose, deoxyglucose, galactose are transferred to the target steviol glycosides receptors.

Em uma modalidade, o glicosídeo de esteviol receptor é rebaudiosídeo AM.In one embodiment, the steviol receptor glycoside is rebaudioside AM.

[059] Opcionalmente, o método da presente invenção compreende adicionalmente separar o glicosídeo de esteviol alvo a partir do meio para fornecer uma composição de glicosídeo de esteviol alvo altamente purificado. O glicosídeo de esteviol alvo pode ser separado por pelo menos um método adequado, como, por exemplo, cristalização, separação por membranas, centrifugação, extração, separação cromatográfica ou uma combinação de tais métodos.[059] Optionally, the method of the present invention further comprises separating the target steviol glycoside from the medium to provide a highly purified target steviol glycoside composition. The target steviol glycoside can be separated by at least one suitable method, such as, for example, crystallization, membrane separation, centrifugation, extraction, chromatographic separation or a combination of such methods.

[060] Em uma modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo pode ser produzido dentro do micro-organismo. Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo pode ser secretado no meio. Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol liberado pode ser continuamente removido do meio. Em ainda outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é separado após a conclusão da reação de conversão.[060] In one embodiment, the target steviol glycoside can be produced within the microorganism. In another embodiment, the target steviol glycoside can be secreted into the medium. In another embodiment, the released steviol glycoside can be continuously removed from the medium. In yet another embodiment, the target steviol glycoside is separated after completion of the conversion reaction.

[061] Em uma modalidade, a separação produz uma composição que compreende mais que cerca de 80% em peso do glicosídeo de esteviol alvo em uma base anidra, isto é, uma composição de glicosídeo de esteviol altamente purificado. Em uma outra modalidade, a separação produz uma composição que compreende mais que cerca de 90% em peso do glicosídeo de esteviol alvo. Em modalidades particulares, a composição compreende mais que cerca de 95% em peso do glicosídeo de esteviol alvo.[061] In one embodiment, the separation produces a composition that comprises more than about 80% by weight of the target steviol glycoside on an anhydrous basis, i.e., a highly purified steviol glycoside composition. In another embodiment, the separation produces a composition that comprises more than about 90% by weight of the target steviol glycoside. In particular embodiments, the composition comprises more than about 95% by weight of the target steviol glycoside.

Em outras modalidades, a composição compreende mais que cerca de 99% em peso do glicosídeo de esteviol alvo.In other embodiments, the composition comprises more than about 99% by weight of the target steviol glycoside.

[062] O glicosídeo de esteviol alvo pode ser em qualquer forma polimórfica ou amorfa, incluindo hidratos, solvatos, anidro ou combinações dos mesmos.[062] The target steviol glycoside can be in any polymorphic or amorphous form, including hydrates, solvates, anhydrous or combinations thereof.

[063] Os glicosídeos de esteviol alvo purificados podem ser usados em produtos consumíveis como um adoçante, modificador de sabor, sabor com propriedades de modificação e/ou supressor de formação de espuma. Os produtos consumíveis incluem, mas não se limitam a, alimento, bebidas, composições farmacêuticas, produtos de tabaco, composições nutracêuticas, composições de higiene bucal e composições cosméticas.[063] Purified target steviol glycosides can be used in consumable products such as a sweetener, flavor modifier, flavor with modifying properties and / or foaming suppressor. Consumable products include, but are not limited to, food, beverages, pharmaceutical compositions, tobacco products, nutraceutical compositions, oral hygiene compositions and cosmetic compositions.

BREVES DESCRIÇÕES DOS DESENHOSBRIEF DESCRIPTIONS OF THE DRAWINGS

[064] A Figura 1 mostra estrutura química de rebaudiosídeo AM.[064] Figure 1 shows the chemical structure of AM rebaudioside.

[065] A Figura 2 mostra as vias para produzir rebaudiosídeo AM e diversos glicosídeos de esteviol a partir de esteviol.[065] Figure 2 shows the ways to produce rebaudioside AM and several steviol glycosides from steviol.

[066] A Figura 3 mostra a produção biocatalítica de rebaudiosídeo AM a partir de esteviosídeo com o uso das enzimas UGTS12 e UGT76G1 e reciclagem concomitante de UDP para UDP- glicose através de sacarose sintase SuSy_At.[066] Figure 3 shows the biocatalytic production of rebaudioside AM from stevioside using the enzymes UGTS12 and UGT76G1 and concomitant recycling of UDP to UDP-glucose through suSose synthase SuSy_At.

[067] A Figura 4 mostra a produção biocatalítica de rebaudiosídeo AM a partir de rebaudiosídeo E com o uso da enzima UGT76G1 e reciclagem concomitante de UDP em UDP-glicose através de sacarose sintase SuSy_At.[067] Figure 4 shows the biocatalytic production of AM rebaudioside from rebaudioside E with the use of the UGT76G1 enzyme and concomitant recycling of UDP into UDP-glucose using suSose synthase SuSy_At.

[068] A Figura 5 mostra o cromatograma HPLC de esteviosídeo. O pico com tempo de retenção de 25,992 minutos corresponde a esteviosídeo.[068] Figure 5 shows the HPLC chromatogram of stevioside. The peak with a retention time of 25.992 minutes corresponds to stevioside.

[069] A Figura 6 mostra o cromatograma HPLC do produto da produção biocatalítica de rebaudiosídeo AM a partir de esteviosídeo. O pico com tempo de retenção de 10,636 minutos corresponde a rebaudiosídeo AM.[069] Figure 6 shows the HPLC chromatogram of the product of the biocatalytic production of rebaudioside AM from stevioside. The peak with a retention time of 10.636 minutes corresponds to rebaudioside AM.

[070] A Figura 7 mostra o cromatograma HPLC de rebaudiosídeo E. O pico com tempo de retenção de 10,835 minutos corresponde a rebaudiosídeo E.[070] Figure 7 shows the HPLC chromatogram of rebaudioside E. The peak with retention time of 10.835 minutes corresponds to rebaudioside E.

[071] A Figura 8 mostra o cromatograma HPLC do produto da produção biocatalítica de rebaudiosídeo AM a partir de rebaudiosídeo E. Os picos com tempo de retenção de 10,936 e 11,442 minutos correspondem a rebaudiosídeo E e rebaudiosídeo AM, respectivamente.[071] Figure 8 shows the HPLC chromatogram of the product of the biocatalytic production of rebaudioside AM from rebaudioside E. The peaks with retention time of 10.936 and 11.442 minutes correspond to rebaudioside E and rebaudioside AM, respectively.

[072] A Figura 9 mostra o cromatograma HPLC de rebaudiosídeo AM após a purificação por cristalização de metanol. O pico com tempo de retenção de 10,336 minutos corresponde a rebaudiosídeo AM.[072] Figure 9 shows the HPLC chromatogram of rebaudioside AM after purification by methanol crystallization. The peak with a retention time of 10.336 minutes corresponds to rebaudioside AM.

[073] A Figura 10 mostra o espectro de RMN de 1H de rebaudiosídeo AM (500 MHz, piridina-d5).[073] Figure 10 shows the 1H NMR spectrum of rebaudioside AM (500 MHz, pyridine-d5).

[074] A Figura 11 mostra o espectro de HSQC de rebaudiosídeo AM (500 MHz, piridina-d5).[074] Figure 11 shows the HSQC spectrum of rebaudioside AM (500 MHz, pyridine-d5).

[075] A Figura 12 mostra o espectro de H,H COSY de rebaudiosídeo AM (500 MHz, piridina- d5).[075] Figure 12 shows the H, H COZY spectrum of rebaudioside AM (500 MHz, pyridine-d5).

[076] A Figura 13 mostra o espectro de HMBC de rebaudiosídeo AM (500 MHz, piridina-d5).[076] Figure 13 shows the HMBC spectrum of rebaudioside AM (500 MHz, pyridine-d5).

[077] A Figura 14 mostra o espectro de HSQC-TOCSY de rebaudiosídeo AM (500 MHz, piridina-d5).[077] Figure 14 shows the HSQC-TOCSY spectrum of rebaudioside AM (500 MHz, pyridine-d5).

[078] A Figura 15a e a Figura 15b mostram o cromatograma LC e espectro de massa de rebaudiosídeo AM respectivamente.[078] Figure 15a and Figure 15b show the LC chromatogram and mass spectrum of rebaudioside AM respectively.

[079] A Figura 16 é um gráfico que mostra o efeito de Reb AM na modificação de sabor de água de coco.[079] Figure 16 is a graph showing the effect of Reb AM on the modification of coconut water flavor.

[080] A Figura 17 é um gráfico que mostra o efeito de Reb AM na modificação de sabor de um shake de proteína de chocolate.[080] Figure 17 is a graph showing the effect of Reb AM on the flavor modification of a chocolate protein shake.

DESCRIÇÃO DETALHADADETAILED DESCRIPTION

[081] A presente invenção fornece um processo para preparar uma composição que compreende um glicosídeo de esteviol alvo mediante a colocação de uma composição de partida que compreende um substrato orgânico em contato com uma célula microbiana e/ou preparação de enzima, produzindo assim uma composição que compreende um glicosídeo de esteviol alvo.[081] The present invention provides a process for preparing a composition that comprises a target steviol glycoside by placing a starting composition that comprises an organic substrate in contact with a microbial cell and / or enzyme preparation, thereby producing a composition which comprises a target steviol glycoside.

[082] Um objetivo da invenção é fornecer um método biocatalítico eficaz para preparar glicosídeos de esteviol alvo, particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo AM ou um glicosídeo de esteviol sintético a partir de diversas composições de partida.[082] An object of the invention is to provide an effective biocatalytic method for preparing target steviol glycosides, particularly steviolmonoside, steviolmonoside A, steviolbioside, steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA, stevioside B, stevioside B, stevioside B, stevioside B , rebaudioside E, rebaudioside E2, rebaudioside E3, rebaudioside AM or a synthetic steviol glycoside from various starting compositions.

[083] Como usado aqui, o termo de abreviação “reb” se refere a “rebaudiosídeo”.[083] As used here, the abbreviation term "reb" refers to "rebaudioside".

Ambos os termos têm o mesmo significado e podem ser usados de forma intercambiável.Both terms have the same meaning and can be used interchangeably.

[084] Como usado no presente documento, “biocatálise” ou “biocatalítico” se refere ao uso de biocatalisadores naturais ou geneticamente modificados, como enzimas, ou células incluindo micro-organismos, que compreendem uma ou mais enzimas, com capacidade para transformações químicas de etapa única ou múltipla em compostos orgânicos. Os processos de biocatálise incluem processos de fermentação, biossíntese, bioconversão e biotransformação. Tanto os métodos de biocatálise de célula inteira como de enzima isolada são conhecidos na técnica. As enzimas de proteína de biocatalisador podem ser proteínas recombinantes ou de ocorrência natural.[084] As used herein, “biocatalysis” or “biocatalytic” refers to the use of natural or genetically modified biocatalysts, such as enzymes, or cells including microorganisms, which comprise one or more enzymes, capable of chemical transformations of single or multiple step in organic compounds. Biocatalysis processes include fermentation, biosynthesis, bioconversion and biotransformation processes. Both whole cell and isolated enzyme biocatalysis methods are known in the art. Biocatalyst protein enzymes can be recombinant or naturally occurring proteins.

[085] Conforme usado no presente documento, o termo “glicosídeo (ou glicosídeos) de esteviol” se refere a um glicosídeo de esteviol, incluindo, porém sem limitação, glicosídeos de esteviol de ocorrência natural, por exemplo, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo[085] As used herein, the term “steviol glycoside (or glycosides)” refers to a steviol glycoside, including, but not limited to, naturally occurring steviol glycosides, for example, steviolmonoside, steviolmonoside A, steviolbioside , steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C, rebaudioside E, rebaudioside E2, rebaudioside E3, rebaudioside

AM, glicosídeos de esteviol sintéticos, por exemplo, glicosídeos de esteviol enzimaticamente glicosilados e combinações dos mesmos. Composição de partidaAM, synthetic steviol glycosides, for example, enzymatically glycosylated steviol glycosides and combinations thereof. Starting composition

[086] Como usado no presente documento, “composição de partida” se refere a qualquer composição (em geral, uma solução aquosa) que contém um ou mais compostos orgânicos que compreendem pelo menos um átomo de carbono. Em uma modalidade, a composição de partida é selecionada a partir do grupo que consiste em esteviol, glicosídeos de esteviol, polióis e diversos carboidratos.[086] As used herein, "starting composition" refers to any composition (in general, an aqueous solution) that contains one or more organic compounds that comprise at least one carbon atom. In one embodiment, the starting composition is selected from the group consisting of steviol, steviol glycosides, polyols and various carbohydrates.

[087] O glicosídeo de esteviol de composição de partida é selecionado a partir do grupo que consiste em esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 ou outro glicosídeo de esteviol que ocorre na planta Stevia rebaudiana, glicosídeos de esteviol sintéticos, por exemplo, glicosídeos de esteviol enzimaticamente glicosilados e combinações dos mesmos.[087] The starting composition steviol glycoside is selected from the group consisting of steviolmonoside, steviolmonoside A, steviolbioside, steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C, rebaudioside E, rebaudioside E2, rebaudioside E3 or other steviol glycoside that occurs in the Stevia rebaudiana plant, synthetic steviol glycosides, for example, enzymatically glycosylated steviol glycosides and combinations thereof.

[088] Em uma modalidade, a composição de partida é esteviol.[088] In one embodiment, the starting composition is steviol.

[089] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol de composição de partida é esteviolmonosídeo.[089] In another embodiment, the starting composition steviol glycoside is steviolmonoside.

[090] Em ainda outra modalidade, o glicosídeo de esteviol de composição de partida é esteviolmonosídeo A.[090] In yet another embodiment, the starting composition steviol glycoside is steviolmonoside A.

[091] Em mais outra modalidade, o glicosídeo de esteviol de composição de partida é rubusosídeo.[091] In yet another embodiment, the starting composition steviol glycoside is rubusoside.

[092] Em ainda outra modalidade, o glicosídeo de esteviol de composição de partida é esteviolbiosídeo.[092] In yet another embodiment, the starting composition steviol glycoside is steviolbioside.

[093] Em ainda outra modalidade, o glicosídeo de esteviol de composição de partida é esteviolbiosídeo A.[093] In yet another embodiment, the starting composition steviol glycoside is steviolbioside A.

[094] Em ainda outra modalidade, o glicosídeo de esteviol de composição de partida é esteviolbiosídeo B.[094] In yet another embodiment, the starting composition steviol glycoside is steviolbioside B.

[095] Em mais outra modalidade, o glicosídeo de esteviol de composição de partida é esteviosídeo.[095] In yet another embodiment, the starting composition steviol glycoside is stevioside.

[096] Em ainda outra modalidade, o glicosídeo de esteviol de composição de partida é esteviosídeo A, também conhecido como rebaudiosídeo KA.[096] In yet another embodiment, the starting composition steviol glycoside is stevioside A, also known as rebaudioside KA.

[097] Em mais outra modalidade, o glicosídeo de esteviol de composição de partida é esteviosídeo B.[097] In yet another embodiment, the starting composition steviol glycoside is stevioside B.

[098] Em mais outra modalidade, o glicosídeo de esteviol de composição de partida é esteviosídeo C.[098] In yet another embodiment, the starting composition steviol glycoside is stevioside C.

[099] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol de composição de partida é rebaudiosídeo E.[099] In another embodiment, the starting composition steviol glycoside is rebaudioside E.

[0100] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol de composição de partida é rebaudiosídeo E2.[0100] In another embodiment, the starting composition steviol glycoside is rebaudioside E2.

[0101] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol de composição de partida é rebaudiosídeo E3.[0101] In another embodiment, the starting composition steviol glycoside is rebaudioside E3.

[0102] O termo “poliol” se refere a uma molécula que contém mais de um grupo hidroxila. Um poliol pode ser um diol, triol ou um tetraol que contém 2, 3 e 4 grupos hidroxila, respectivamente. Um poliol também pode conter mais de quatro grupos hidroxila, como um pentaol, hexaol, heptaol ou similares, que contêm 5, 6 ou 7 grupos hidroxila, respectivamente. Adicionalmente, um poliol também pode ser um álcool de açúcar, álcool poli-hídrico ou poliálcool que é uma forma reduzida de carboidrato, em que o grupo carbonila (aldeído ou cetona, açúcar redutor) foi reduzido a um grupo hidroxila primário ou secundário. Os exemplos de polióis incluem, porém sem limitação, eritritol,[0102] The term "polyol" refers to a molecule that contains more than one hydroxyl group. A polyol can be a diol, triol or a tetraol that contains 2, 3 and 4 hydroxyl groups, respectively. A polyol can also contain more than four hydroxyl groups, such as a pentaol, hexaol, heptaol or the like, which contain 5, 6 or 7 hydroxyl groups, respectively. In addition, a polyol can also be a sugar alcohol, polyhydric alcohol or polyalcohol which is a reduced form of carbohydrate, in which the carbonyl group (aldehyde or ketone, reducing sugar) has been reduced to a primary or secondary hydroxyl group. Examples of polyols include, but are not limited to, erythritol,

maltitol, manitol, sorbitol, lactitol, xilitol, inositol, isomalte, propilenoglicol, glicerol, treitol, galactitol, isomaltulose hidrogenada, isomalto-oligossacarídeos reduzidos, xilo- oligossacarídeos reduzidos, gentio-oligossacarídeos reduzidos, xarope de maltose reduzida, xarope de glicose reduzida, hidrolisados de amido hidrogenados, poliglicitóis e álcoois de açúcar ou quaisquer outros carboidratos com capacidade para serem reduzidos.maltitol, mannitol, sorbitol, lactitol, xylitol, inositol, isomalt, propylene glycol, glycerol, treitol, galactitol, hydrogenated isomaltulose, reduced isomalto-oligosaccharides, reduced xylo-oligosaccharides, reduced glycoside, reduced-glycoside syrups hydrogenated starch hydrolysates, polyglycitols and sugar alcohols or any other carbohydrates capable of being reduced.

[0103] O termo “carboidrato” se refere a compostos de aldeído ou cetona substituídos por múltiplos grupos hidroxila, da fórmula geral (CH2O)n, em que n é 3 a 30, bem como seus oligômeros e polímeros. Os carboidratos da presente invenção podem ser, adicionalmente, substituídos ou desoxigenados em uma ou mais posições. Os carboidratos, conforme usado no presente documento, abrangem carboidratos não modificados, derivados de carboidrato, carboidratos substituídos e carboidratos modificados. Conforme usado no presente documento, as frases “derivados de carboidrato”, “carboidrato substituído” e “carboidratos modificados” são sinônimos. O carboidrato modificado significa qualquer carboidrato em que pelo menos um átomo foi adicionado, removido ou substituído, ou combinações dos mesmos. Dessa forma, os derivados de carboidrato ou carboidratos substituídos incluem monossacarídeos, dissacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos substituídos e não substituídos. Os derivados de carboidrato ou carboidratos substituídos podem ser opcionalmente desoxigenados em qualquer posição C correspondente e/ou substituídos por uma ou mais porções químicas como hidrogênio, halogênio, haloalquila, carboxila, acila, aciloxi, amino, amido, derivados de carboxila, alquilamino, dialquilamino, arilamino, alcoxi, ariloxi, nitro, ciano, sulfo, mercapto, imino, sulfonila, sulfenila, sulfmila, sulfamoila, carboalcoxi, carboxamido, fosfonila, fosfinila, fosforila, fosfino, tioéster, tioéter, oximino, hidrazino, carbamila, fosfo, fosfonato, ou qualquer outro grupo funcional viável desde que o derivado de carboidrato ou carboidrato substituído funcione para melhorar o sabor doce da composição de adoçante.[0103] The term "carbohydrate" refers to compounds of aldehyde or ketone substituted by multiple hydroxyl groups, of the general formula (CH2O) n, where n is 3 to 30, as well as their oligomers and polymers. The carbohydrates of the present invention can be additionally substituted or deoxygenated in one or more positions. Carbohydrates, as used herein, include unmodified carbohydrates, carbohydrate derivatives, substituted carbohydrates and modified carbohydrates. As used in this document, the phrases “carbohydrate derivatives”, “substituted carbohydrate” and “modified carbohydrates” are synonymous. The modified carbohydrate means any carbohydrate to which at least one atom has been added, removed or replaced, or combinations thereof. Thus, substituted carbohydrate or carbohydrate derivatives include substituted and unsubstituted monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides and polysaccharides. The carbohydrate derivatives or substituted carbohydrates can optionally be deoxygenated in any corresponding C position and / or substituted by one or more chemical moieties such as hydrogen, halogen, haloalkyl, carboxyl, acyl, acyloxy, amino, starch, carboxyl derivatives, alkylamino, dialkylamino , arylamino, alkoxy, aryloxy, nitro, cyano, sulfo, mercapto, imino, sulfonyl, sulfenyl, sulfmyl, sulfamoyl, carboalkoxy, carboxamido, phosphonyl, phosphoryl, phosphoryl, phosphine, thioester, thioether, oxy, hydrazine, carbamyl, phosphonyl, carbamyl, phosphonate , or any other viable functional group as long as the carbohydrate derivative or substituted carbohydrate works to improve the sweet taste of the sweetener composition.

[0104] Os exemplos de carboidratos que podem ser usados de acordo com essa invenção incluem, porém sem limitação, tagatose, trealose, galactose, ramnose, diversas ciclodextrinas, oligossacarídeos cíclicos, diversos tipos de maltodextrinas, dextrano, sacarose, glicose, ribulose, frutose, treose, arabinose, xilose, lixose, alose, altrose, manose, idose, lactose, maltose, açúcar invertido, isotrealose, neotrealose, isomaltulose, eritrose, desoxirribose, gulose, idose, talose, eritrulose, xilulose, psicose, turanose, celobiose, amilopectina, glucosamina, manosamina, fucose, ácido glucurônico, ácido glucônico, glucono- lactona, abequose, galactosamina, oligossacarídeos de beterraba, isomalto-oligossacarídeos (isomaltose, isomaltotriose, panose e similares), xilo-oligossacarídeos (xilotriose, xilobiose e similares), oligossacarídeos xilo-terminados, gentio-oligossacarídeos (gentiobiose, gentiotriose, gentiotetraose e similares), sorbose, nigero-oligossacarídeos, palatinose oligossacarídeos, fructooligossacarídeos (cestose, nistose e similares), maltotetraol, maltotriol, malto-oligossacarídeos (maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, malto-hexaose, malto-heptaose e similares), amido, inulina, inulo- oligossacarídeos, lactulose, melibiose, raffmose, ribose, açúcares líquidos isomerizados como xaropes de milho com alto teor de frutose, açúcares de acoplamento e oligossacarídeos de soja. Adicionalmente, os carboidratos conforme usado no presente documento podem ser na configuração D- ou L-.[0104] Examples of carbohydrates that can be used according to this invention include, but are not limited to, tagatose, trehalose, galactose, rhamnose, various cyclodextrins, cyclic oligosaccharides, various types of maltodextrins, dextran, sucrose, glucose, ribulose, fructose , threose, arabinose, xylose, lixose, alose, altrose, mannose, idose, lactose, maltose, inverted sugar, isotrealose, neotrealose, isomaltulose, erythrosis, deoxyribose, gulose, idose, thalose, erythrulose, xylulose, psychosis, turanosis, celobiosis, amylopectin, glucosamine, mannosamine, fucose, glucuronic acid, gluconic acid, glucono-lactone, abecose, galactosamine, beet oligosaccharides, isomalto-oligosaccharides (isomaltose, isomaltotriose, panosis and similar), xylo-oligosaccharides, xylotrobes, xyl-terminated oligosaccharides, gentio-oligosaccharides (gentiobiosis, gentiotriosis, gentiotetraose and the like), sorbose, nigero-oligosaccharides, palatosis oligosaccharides, fructooligosaccharides (cestosis, nystosis and the like), maltotetraol, maltotriol, malto-oligosaccharides (maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, malto-hexaose, malto-heptaose and similar), starch, inulin, inulo-oligosaccharides, lactose, lactose, lactose, lactose, lactose, isomerized liquid sugars like high fructose corn syrups, coupling sugars and soy oligosaccharides. In addition, the carbohydrates as used in this document can be in the D- or L- configuration.

[0105] A composição de partida pode ser sintética ou purificada (parcial ou totalmente), comercialmente disponível ou preparada.[0105] The starting composition can be synthetic or purified (partially or totally), commercially available or prepared.

[0106] Em uma modalidade, a composição de partida é glicerol.[0106] In one embodiment, the starting composition is glycerol.

[0107] Em uma outra modalidade, a composição de partida é glicose.[0107] In another embodiment, the starting composition is glucose.

[0108] Em mais outra modalidade, a composição de partida é sacarose. Em ainda outra modalidade, a composição de partida é amido.[0108] In yet another embodiment, the starting composition is sucrose. In yet another embodiment, the starting composition is starch.

[0109] Em uma outra modalidade, a composição de partida é maltodextrina.[0109] In another embodiment, the starting composition is maltodextrin.

[0110] Em ainda outra modalidade, a composição de partida é celulose.[0110] In yet another modality, the starting composition is cellulose.

[0111] Em mais outra modalidade, a composição de partida é amilose. O composto orgânico (ou compostos orgânicos) da composição de partida serve como um substrato (ou substratos) para a produção do glicosídeo (ou glicosídeos) de esteviol alvo, conforme descrito no presente documento.[0111] In yet another embodiment, the starting composition is amylose. The organic compound (or organic compounds) of the starting composition serves as a substrate (or substrates) for the production of the target steviol glycoside (or glycosides), as described herein.

Glicosídeo de esteviol alvoTarget steviol glycoside

[0112] O glicosídeo de esteviol alvo do presente método pode ser qualquer glicosídeo de esteviol que pode ser preparado pelo processo revelado no presente documento. Em uma modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é selecionado a partir do grupo que consiste em esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA ), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo AM ou outro glicosídeo de esteviol que ocorre na planta Stevia rebaudiana, glicosídeos de esteviol sintéticos, por exemplo, glicosídeos de esteviol enzimaticamente glicosilados e combinações dos mesmos.[0112] The steviol glycoside targeted by the present method can be any steviol glycoside that can be prepared by the process disclosed herein. In one embodiment, the target steviol glycoside is selected from the group consisting of steviolmonoside, steviolmonoside A, steviolbioside, steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C, rebaud , E2 rebaudioside, E3 rebaudioside, AM rebaudioside or other steviol glycoside that occurs in the Stevia rebaudiana plant, synthetic steviol glycosides, for example, enzymatically glycosylated steviol glycosides and combinations thereof.

[0113] Em uma modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é esteviolmonosídeo.[0113] In one embodiment, the target steviol glycoside is steviolmonoside.

[0114] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é esteviolmonosídeo A.[0114] In another embodiment, the target steviol glycoside is steviolmonoside A.

[0115] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é esteviolbiosídeo. Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é esteviolbiosídeo A.[0115] In another embodiment, the target steviol glycoside is steviolbioside. In another embodiment, the target steviol glycoside is steviolbioside A.

[0116] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é esteviolbiosídeo B.[0116] In another embodiment, the target steviol glycoside is steviolbioside B.

[0117] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é rubusosídeo.[0117] In another embodiment, the target steviol glycoside is rubusoside.

[0118] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é esteviosídeo.[0118] In another embodiment, the target steviol glycoside is stevioside.

[0119] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA).[0119] In another embodiment, the target steviol glycoside is stevioside A (rebaudioside KA).

[0120] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é esteviosídeo B.[0120] In another embodiment, the target steviol glycoside is stevioside B.

[0121] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é esteviosídeo C.[0121] In another embodiment, the target steviol glycoside is stevioside C.

[0122] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é rebaudiosídeo E.[0122] In another embodiment, the target steviol glycoside is rebaudioside E.

[0123] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é rebaudiosídeo E2.[0123] In another embodiment, the target steviol glycoside is rebaudioside E2.

[0124] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é rebaudiosídeo E3.[0124] In another embodiment, the target steviol glycoside is rebaudioside E3.

[0125] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é rebaudiosídeo AM.[0125] In another embodiment, the target steviol glycoside is rebaudioside AM.

[0126] O glicosídeo de esteviol alvo pode ser em qualquer forma polimórfica ou amorfa, incluindo hidratos, solvatos, anidro ou combinações dos mesmos.[0126] The target steviol glycoside can be in any polymorphic or amorphous form, including hydrates, solvates, anhydrous or combinations thereof.

[0127] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviolmonosídeo.[0127] In one embodiment, the present invention is a biocatalytic process for the production of steviolmonoside.

[0128] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviolmonosídeo A.[0128] In one embodiment, the present invention is a biocatalytic process for the production of steviolmonoside A.

[0129] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviolbiosídeo.[0129] In one embodiment, the present invention is a biocatalytic process for the production of steviolbioside.

[0130] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviolbiosídeo A.[0130] In one embodiment, the present invention is a biocatalytic process for the production of steviolbioside A.

[0131] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviolbiosídeo B.[0131] In one embodiment, the present invention is a biocatalytic process for the production of steviolbioside B.

[0132] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rubusosídeo.[0132] In one embodiment, the present invention is a biocatalytic process for the production of rubusoside.

[0133] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviosídeo.[0133] In one embodiment, the present invention is a biocatalytic process for the production of stevioside.

[0134] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA).[0134] In one embodiment, the present invention is a biocatalytic process for the production of stevioside A (rebaudioside KA).

[0135] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviosídeo B.[0135] In one embodiment, the present invention is a biocatalytic process for the production of stevioside B.

[0136] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviosídeo C.[0136] In one embodiment, the present invention is a biocatalytic process for the production of stevioside C.

[0137] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo E.[0137] In one embodiment, the present invention is a biocatalytic process for the production of E rebaudioside.

[0138] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo E2.[0138] In one embodiment, the present invention is a biocatalytic process for the production of E2 rebaudioside.

[0139] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo E3.[0139] In one embodiment, the present invention is a biocatalytic process for the production of E3 rebaudioside.

[0140] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo AM.[0140] In one embodiment, the present invention is a biocatalytic process for the production of AM rebaudioside.

[0141] Em uma modalidade particular, a presente invenção fornece o processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo AM a partir de uma composição de partida que compreende esteviosídeo e UDP-glicose.[0141] In a particular embodiment, the present invention provides the biocatalytic process for the production of AM rebaudioside from a starting composition comprising stevioside and UDP-glucose.

[0142] Em uma outra modalidade particular, a presente invenção fornece o processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo AM a partir de uma composição de partida que compreende rebaudiosídeo E e UDP-glicose.[0142] In another particular embodiment, the present invention provides the biocatalytic process for the production of AM rebaudioside from a starting composition comprising E rebaudioside and UDP-glucose.

[0143] Opcionalmente, o método da presente invenção compreende adicionalmente separar o glicosídeo de esteviol alvo a partir do meio para fornecer uma composição de glicosídeo de esteviol alvo altamente purificado. O glicosídeo de esteviol alvo pode ser separado por meio de qualquer método adequado, como, por exemplo, cristalização, separação por membranas, centrifugação, extração, separação cromatográfica ou uma combinação de tais métodos.[0143] Optionally, the method of the present invention further comprises separating the target steviol glycoside from the medium to provide a highly purified target steviol glycoside composition. The target steviol glycoside can be separated by any suitable method, such as, for example, crystallization, membrane separation, centrifugation, extraction, chromatographic separation or a combination of such methods.

[0144] Em modalidades particulares, o processo descrito no presente documento resulta em uma composição de glicosídeo de esteviol alvo altamente purificado. O termo “altamente purificado”, conforme usado no presente documento, se refere a uma composição que tem mais que cerca de 80% em peso do glicosídeo de esteviol alvo em uma base anidra (seca). Em uma modalidade, a composição de glicosídeo de esteviol alvo altamente purificado contém mais que cerca de 90% em peso do glicosídeo de esteviol alvo em uma base anidra (seca), como, por exemplo, mais que cerca de 91%, mais que cerca de 92%, mais que cerca de 93%, mais que cerca de 94%, mais que cerca de 95%, mais que cerca de 96%, mais que cerca de 97%, mais que cerca de 98% ou mais que cerca de 99% de teor de glicosídeo de esteviol alvo em uma base seca.[0144] In particular embodiments, the process described in this document results in a highly purified target steviol glycoside composition. The term "highly purified", as used herein, refers to a composition that has more than about 80% by weight of the target steviol glycoside on an anhydrous (dry) basis. In one embodiment, the highly purified target steviol glycoside composition contains more than about 90% by weight of the target steviol glycoside on an anhydrous (dry) basis, such as, for example, more than about 91%, more than about 92%, more than about 93%, more than about 94%, more than about 95%, more than about 96%, more than about 97%, more than about 98% or more than about 99% target glycoside steviol content on a dry basis.

[0145] Em uma modalidade, quando o glicosídeo de esteviol alvo é reb AM, o processo descrito no presente documento fornece uma composição que tem mais que cerca de 90% de teor de reb AM em uma base seca. Em uma outra modalidade particular,[0145] In one embodiment, when the target steviol glycoside is reb AM, the process described in this document provides a composition that has more than about 90% reb AM content on a dry basis. In another particular modality,

quando o glicosídeo de esteviol alvo é reb AM, o processo descrito no presente documento fornece uma composição que compreende mais que cerca de 95% de teor de reb AM em peso em uma base seca.when the target steviol glycoside is reb AM, the process described herein provides a composition that comprises more than about 95% reb AM content by weight on a dry basis.

Micro-organismos e preparações de enzimaMicroorganisms and enzyme preparations

[0146] Em uma modalidade da presente invenção, um micro-organismo (célula microbiana) e/ou preparação de enzima é colocada em contado com um meio que contém a composição de partida para produzir glicosídeos de esteviol alvo.[0146] In one embodiment of the present invention, a microorganism (microbial cell) and / or enzyme preparation is contacted with a medium containing the starting composition to produce target steviol glycosides.

[0147] A enzima pode ser fornecida sob a forma de uma suspensão de células inteiras, um lisato bruto, uma enzima purificada ou uma combinação dos mesmos.[0147] The enzyme can be supplied in the form of a suspension of whole cells, a crude lysate, a purified enzyme or a combination thereof.

Em uma modalidade, o biocatalisador é uma enzima purificada com capacidade para converter a composição de partida no glicosídeo de esteviol alvo. Em uma outra modalidade, o biocatalisador é um lisato bruto que compreende pelo menos uma enzima com capacidade para converter a composição de partida no glicosídeo de esteviol alvo.In one embodiment, the biocatalyst is a purified enzyme capable of converting the starting composition into the target steviol glycoside. In another embodiment, the biocatalyst is a crude lysate that comprises at least one enzyme capable of converting the starting composition into the target steviol glycoside.

Em mais outra modalidade, o biocatalisador é uma suspensão de células inteiras que compreende pelo menos uma enzima com capacidade para converter a composição de partida no glicosídeo de esteviol alvo.In yet another embodiment, the biocatalyst is an entire cell suspension comprising at least one enzyme capable of converting the starting composition into the target steviol glycoside.

[0148] Em uma outra modalidade, o biocatalisador é uma ou mais célula microbianas que compreende enzima (ou enzimas) com capacidade para converter a composição de partida no glicosídeo de esteviol alvo. A enzima pode estar situada sobre a superfície da célula, dentro da célula ou situada tanto sobre a superfície da célula como dentro da célula.[0148] In another embodiment, the biocatalyst is one or more microbial cells that comprise an enzyme (or enzymes) capable of converting the starting composition into the target steviol glycoside. The enzyme can be located on the cell surface, inside the cell, or located either on the cell surface or inside the cell.

[0149] As enzimas adequadas para converter a composição de partida em glicosídeos de esteviol alvo incluem, porém sem limitação, as enzimas de biossíntese de esteviol e UDP- glicosiltransferases (UGTs). Opcionalmente, pode incluir enzima (ou enzimas) de reciclagem de UDP.[0149] Enzymes suitable for converting the starting composition to target steviol glycosides include, but are not limited to, steviol biosynthesis enzymes and UDP-glycosyltransferases (UGTs). Optionally, it can include UDP recycling enzyme (or enzymes).

[0150] Em uma modalidade, as enzimas de biossíntese de esteviol incluem enzimas de via de mevalonato (MVA).[0150] In one embodiment, steviol biosynthesis enzymes include mevalonate pathway (MVA) enzymes.

[0151] Em uma outra modalidade, as enzimas de biossíntese de esteviol incluem enzimas de via de 2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato não-mevalonato (MEP/DOXP).[0151] In another embodiment, steviol biosynthesis enzymes include enzymes from the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate non-mevalonate pathway (MEP / DOXP).

[0152] Em uma modalidade, as enzimas de biossíntese de esteviol são selecionadas a partir do grupo que inclui geranilgeranil difosfato sintase, copalil difosfato sintase, caureno sintase, caureno oxidase, ácido caurenoico 13-hidroxilase (KAH), esteviol sintetase, desoxixilulose 5 -fosfato sintase (DXS), D-1-desoxixilulose 5-fosfato reductoisomerase (DXR), 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol sintase (CMS), 4- difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol quinase (CMK), 4-difosfocitidil-2-C- metil-D-eritritol 2,4- ciclodifosfato sintase (MCS), 1-hidroxi-2-metil-2(E)- butenil 4-difosfato sintase (HDS), 1- hidroxi-2-metil-2(E)-butenil 4-difosfato redutase (HDR), acetoacetil-CoA tiolase, HMG- CoA redutase truncada, mevalonato quinase, fosfomevalonato quinase, mevalonato pirofosfato decarboxilase, citocromo P450 redutase etc.[0152] In one embodiment, steviol biosynthesis enzymes are selected from the group that includes geranylgeranyl diphosphate synthase, copalyl diphosphate synthase, kurene synthase, kaurene oxidase, kaurenic acid 13-hydroxylase (KAH), steviol synthetase, deoxyxylulose 5 - phosphate synthase (DXS), D-1-deoxyxylulose 5-phosphate reductoisomerase (DXR), 4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol synthase (CMS), 4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase (CMK), 4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase (MCS), 1-hydroxy-2-methyl-2 (E) - butenyl 4-diphosphate synthase (HDS), 1- hydroxy-2-methyl-2 (E) -butyl 4-diphosphate reductase (HDR), acetoacetyl-CoA thiolase, HMG- CoA truncated reductase, mevalonate kinase, phosphomevalonate kinase, mevalonate pyrophosphate decarboxylase, cytochrome P4 etc.

[0153] A UDP-glicosiltransferase pode ser qualquer UDP-glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviol e/ou um substrato de glicosídeo de esteviol para fornecer o glicosídeo de esteviol alvo.[0153] UDP-glycosyltransferase can be any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to steviol and / or a steviol glycoside substrate to provide the target steviol glycoside.

[0154] Em uma modalidade, as enzimas de biossíntese de esteviol e UDP- glicosiltransferases são produzidas em uma célula microbiana. A célula microbiana pode ser, por exemplo, E. coli, Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Pichia sp., Bacillus sp., Yarrowia sp. etc. Em uma outra modalidade, as UDP-glicosiltransferases são sintetizadas.[0154] In one embodiment, the biosynthesis enzymes of steviol and UDP-glycosyltransferases are produced in a microbial cell. The microbial cell can be, for example, E. coli, Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Pichia sp., Bacillus sp., Yarrowia sp. etc. In another embodiment, UDP-glycosyltransferases are synthesized.

[0155] Em uma modalidade, a UDP-glicosiltransferase é selecionada a partir do grupo que inclui UGT74G1, UGT85C2, UGT76G1, UGT91D2, UGTS12, EUGT11 e UGTs que tem identidade de sequência de aminoácidos substancial (>85%,[0155] In one embodiment, UDP-glycosyltransferase is selected from the group that includes UGT74G1, UGT85C2, UGT76G1, UGT91D2, UGTS12, EUGT11 and UGTs that have substantial amino acid sequence identity (> 85%,

>86%, >87%, >88%, >89%, >90%, >91%, >92%, >93%, >94%, >95%, >96%, >97%, >98%, >99%) com esses polipeptídeos, bem como moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam essas UGTs.> 86%,> 87%,> 88%,> 89%,> 90%,> 91%,> 92%,> 93%,> 94%,> 95%,> 96%,> 97%,> 98 %,> 99%) with these polypeptides, as well as isolated nucleic acid molecules encoding these UGTs.

[0156] Em uma modalidade, as enzimas de biossíntese de esteviol, UGTs e sistema de reciclagem de UDP-glicose estão presentes em um micro-organismo (célula microbiana). O micro-organismo pode ser, por exemplo, E. coli, Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Pichia sp., Bacillus sp., Yarrowia sp.[0156] In one embodiment, the steviol biosynthesis enzymes, UGTs and UDP-glucose recycling system are present in a micro-organism (microbial cell). The microorganism can be, for example, E. coli, Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Pichia sp., Bacillus sp., Yarrowia sp.

[0157] Em uma modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviol ou qualquer glicosídeo de esteviol de partida que contêm um grupo funcional -OH em C13 para gerar um glicosídeo de esteviol alvo que tem uma ligação glicosídica de -O- glicose beta glicopiranosídeo em C13. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT85C2, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.[0157] In one embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to the steviol or any starting steviol glycoside that contains a -OH functional group on C13 to generate a steviol glycoside target that has a glycosidic bond of -O- glucose beta glycopyranoside at C13. In a particular embodiment, the UDP-glycosyltransferase is UGT85C2, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT85C2.

[0158] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviol ou qualquer glicosídeo de esteviol de partida que contém um grupo funcional -COOH em C19 para gerar um glicosídeo de esteviol alvo que tem uma ligação glicosídica de -COO-glicose beta-glicopiranosídeo em C19. Em uma modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é UGT74G1, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.[0158] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to steviol or any starting steviol glycoside that contains a -COOH functional group in C19 to generate a C19 glycoside target steviol which has a C19 -COO-glucose beta-glycopyranoside glycosidic bond. In a particular embodiment, the UDP-glycosyltransferase is UGT74G1, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT74G1.

[0159] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose à glicose existente em C19 de qualquer glicosídeo de esteviol de partida para gerar um glicosídeo de esteviol alvo com pelo menos uma glicose adicional que contém pelo menos uma ligação glicosídica (ou ligações glicosídicas) de beta 1→2 glicopiranosídeo na ligação glicosídica (ou ligações glicosídicas) recém formada. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGTS12, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em uma outra modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é EUGT1 1, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.[0159] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to the C19 glucose of any starting steviol glycoside to generate a target steviol glycoside with at least one additional glucose containing at least one glycosidic bond (or glycosidic bonds) of beta 1 → 2 glycopyranoside in the newly formed glycosidic bond (or glycosidic bonds). In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGTS12, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGTS12. In another particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is EUGT1 1, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with EUGT11. In yet another particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT91D2, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT91D2.

[0160] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose à glicose existente em C19 de qualquer glicosídeo de esteviol de partida para gerar um glicosídeo de esteviol alvo com pelo menos uma glicose adicional que contém pelo menos uma ligação glicosídica (ou ligações glicosídicas) de beta 1→3 glicopiranosídeo na ligação glicosídica (ou ligações glicosídicas) recém formada. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT76G1, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.[0160] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to the C19 glucose of any starting steviol glycoside to generate a target steviol glycoside with at least one additional glucose containing at least one glycosidic bond (or glycosidic bonds) of beta 1 → 3 glycopyranoside in the newly formed glycosidic bond (or glycosidic bonds). In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT76G1, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT76G1.

[0161] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose à glicose existente em C13 de qualquer glicosídeo de esteviol de partida para gerar um glicosídeo de esteviol alvo com pelo menos uma glicose adicional que contém pelo menos uma ligação glicosídica (ou ligações glicosídicas) de beta 1→2 glicopiranosídeo na ligação glicosídica (ou ligações glicosídicas) recém formada. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGTS12, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em uma outra modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.[0161] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one unit of glucose to the existing C13 glucose of any starting steviol glycoside to generate a target steviol glycoside with at least one additional glucose containing at least one glycosidic bond (or glycosidic bonds) of beta 1 → 2 glycopyranoside in the newly formed glycosidic bond (or glycosidic bonds). In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGTS12, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGTS12. In another particular embodiment, the UDP-glycosyltransferase is EUGT11, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with EUGT11. In yet another particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT91D2, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT91D2.

[0162] Em uma modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviol para formar esteviolmonosídeo. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT85C2 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.[0162] In one embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to steviol to form steviolmonoside. In a particular embodiment, the UDP-glycosyltransferase is UGT85C2 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT85C2 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT85C2.

[0163] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviol para formar esteviolmonosídeo A. Em uma modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é UGT74G1 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.[0163] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase with the capacity to add at least one glucose unit to steviol to form steviolmonoside A. In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT74G1 or a UGT that has > 85% amino acid sequence identity with UGT74G1.

[0164] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviolmonosídeo A para formar esteviolbiosídeo B. Em uma modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.[0164] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one unit of glucose to steviolmonoside A to form steviolbioside B. In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT76G1 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT76G1.

[0165] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviolmonosídeo A para formar esteviolbiosídeo A. Em uma modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é UGTS12 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em uma outra modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.[0165] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one unit of glucose to steviolmonoside A to form steviolbioside A. In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGTS12 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGTS12. In another particular embodiment, the UDP-glycosyltransferase is EUGT11, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with EUGT11. In yet another particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT91D2, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT91D2.

[0166] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviolmonosídeo A para formar rubusosídeo. Em uma modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é UGT85C2 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.[0166] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one unit of glucose to steviolmonoside A to form rubusoside. In a particular embodiment, the UDP-glycosyltransferase is UGT85C2 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT85C2.

[0167] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviolmonosídeo para formar rubusosídeo. Em uma modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é UGT74G1 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.[0167] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase with the capacity to add at least one glucose unit to steviolmonoside to form rubusoside. In a particular embodiment, the UDP-glycosyltransferase is UGT74G1 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT74G1.

[0168] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviolmonosídeo para formar esteviolbiosídeo.[0168] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one unit of glucose to steviolmonoside to form steviolbioside.

[0169] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviolbiosídeo B para formar esteviosídeo B. Em uma modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é UGT85C2 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.[0169] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to steviolbioside B to form stevioside B. In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT85C2 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT85C2.

[0170] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviolbiosídeo B para formar esteviosídeo C. Em uma modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é UGTS12 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em uma outra modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.[0170] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to steviolbioside B to form stevioside C. In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGTS12 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGTS12. In another particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is EUGT11, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with EUGT11. In yet another particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT91D2, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT91D2.

[0171] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviolbiosídeo A para formar esteviosídeo A. Em uma modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é UGT85C2 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.[0171] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to steviolbioside A to form stevioside A. In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT85C2 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT85C2.

[0172] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviolbiosídeo A para formar esteviosídeo C. Em uma modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.[0172] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase with the ability to add at least one glucose unit to steviolbioside A to form stevioside C. In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT76G1 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT76G1.

[0173] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a rubusosídeo para formar esteviosídeo B. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.[0173] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase with the capacity to add at least one glucose unit to rubusoside to form stevioside B. In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT76G1 or a UGT that has > 85% amino acid sequence identity with UGT76G1.

[0174] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a rubusosídeo para formar esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA). Em uma modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é UGTS12 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em uma outra modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.[0174] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to rubusoside to form stevioside A (rebaudioside KA). In a particular embodiment, the UDP-glycosyltransferase is UGTS12 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGTS12. In another particular embodiment, the UDP-glycosyltransferase is EUGT11, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with EUGT11. In yet another particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT91D2, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT91D2.

[0175] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a rubusosídeo para formar esteviosídeo.[0175] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase with the capacity to add at least one glucose unit to rubusoside to form stevioside.

[0176] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviolbiosídeo para formar esteviosídeo. Em uma modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é UGT74G1 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.[0176] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to steviolbioside to form stevioside. In a particular embodiment, the UDP-glycosyltransferase is UGT74G1 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT74G1.

[0177] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviosídeo B para formar rebaudiosídeo E3. Em uma modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é UGTS12 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em uma outra modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.[0177] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to stevioside B to form E3 rebaudioside. In a particular embodiment, the UDP-glycosyltransferase is UGTS12 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGTS12. In another particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is EUGT11, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with EUGT11. In yet another particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT91D2, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT91D2.

[0178] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviosídeo B para formar rebaudiosídeo E2.[0178] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to stevioside B to form E2 rebaudioside.

[0179] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer[0179] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any

UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA) para formar rebaudiosídeo E3. Em uma modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to stevioside A (rebaudioside KA) to form E3 rebaudioside. In a particular embodiment, the UDP-glycosyltransferase is UGT76G1 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT76G1.

[0180] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA) para formar rebaudiosídeo E.[0180] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to stevioside A (rebaudioside KA) to form rebaudioside E.

[0181] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviosídeo C para formar rebaudiosídeo E3. Em uma modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é UGT85C2 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.[0181] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to stevioside C to form E3 rebaudioside. In a particular embodiment, the UDP-glycosyltransferase is UGT85C2 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT85C2.

[0182] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviosídeo para formar rebaudiosídeo E2. Em uma modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.[0182] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to stevioside to form E2 rebaudioside. In a particular embodiment, the UDP-glycosyltransferase is UGT76G1 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT76G1.

[0183] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a esteviosídeo para formar rebaudiosídeo E. Em uma modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é UGTS12 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em uma outra modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.[0183] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase with the ability to add at least one glucose unit to stevioside to form rebaudioside E. In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGTS12 or a UGT that has > 85% amino acid sequence identity with UGTS12. In another particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is EUGT11, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with EUGT11. In yet another particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT91D2, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT91D2.

[0184] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a rebaudiosídeo E3 para formar rebaudiosídeo AM.[0184] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to E3 rebaudioside to form AM rebaudioside.

[0185] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a rebaudiosídeo E2 para formar rebaudiosídeo AM. Em uma modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é UGTS12 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em uma outra modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade particular, a UDP- glicosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.[0185] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase capable of adding at least one glucose unit to E2 rebaudioside to form AM rebaudioside. In a particular embodiment, the UDP-glycosyltransferase is UGTS12 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGTS12. In another particular embodiment, the UDP-glycosyltransferase is EUGT11, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with EUGT11. In yet another particular embodiment, UDP-glycosyltransferase is UGT91D2, or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT91D2.

[0186] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a rebaudiosídeo E para formar rebaudiosídeo AM. Em uma modalidade particular, a UDP-glicosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.[0186] In another embodiment, UDP-glycosyltransferase is any UDP-glycosyltransferase with the capacity to add at least one unit of glucose to E rebaudioside to form AM rebaudioside. In a particular embodiment, the UDP-glycosyltransferase is UGT76G1 or a UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT76G1.

[0187] Opcionalmente, o método da presente invenção compreende adicionalmente usar mais de uma UGT em uma composição de partida, para gerar um glicosídeo (ou glicosídeos) de esteviol alvo que tem mais de uma unidade de glicose em relação à composição de partida. Em uma modalidade particular, as UDP- glicosiltransferases são UGT74G1, UGT85C2, UGT76G1, UGTS12, EUGT11 e/ou UGT91D2 ou qualquer UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1, UGT85C2, UGT76G1, UGTS12, EUGT11 e/ou UGT91D2 ou qualquer combinação dos mesmos, com capacidade para adicionar mais de uma unidade de glicose a uma composição de partida para gerar um glicosídeo (ou glicosídeos) de esteviol que tem mais de uma unidade de glicose relação à composição de partida.[0187] Optionally, the method of the present invention further comprises using more than one UGT in a starting composition, to generate a target steviol glycoside (or glycosides) that has more than one glucose unit in relation to the starting composition. In a particular embodiment, the UDP-glycosyltransferases are UGT74G1, UGT85C2, UGT76G1, UGTS12, EUGT11 and / or UGT91D2 or any UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGT74G1, UGT85C2, UGT12G, UGT91D2 or any combination thereof, capable of adding more than one glucose unit to a starting composition to generate a steviol glycoside (or glycosides) that has more than one glucose unit relative to the starting composition.

[0188] Em uma modalidade, as UDP-glicosiltransferases são qualquer UDP- glicosiltransferases com capacidade para adicionar, em geral, duas unidades de glicose a esteviosídeo para formar rebaudiosídeo AM. Em uma modalidade particular, as UDP-glicosiltransferases são selecionadas a partir de UGTS12, EUGT11, UGT91D2, UGT76G1 ou qualquer UGT que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12, EUGT11, UGT91D2, UGT76G1 ou qualquer combinação dos mesmos.[0188] In one embodiment, UDP-glycosyltransferases are any UDP-glycosyltransferases capable of adding, in general, two glucose units to stevioside to form AM rebaudioside. In a particular embodiment, UDP-glycosyltransferases are selected from UGTS12, EUGT11, UGT91D2, UGT76G1 or any UGT that has> 85% amino acid sequence identity with UGTS12, EUGT11, UGT91D2, UGT76G1 or any combination thereof.

Em uma outra modalidade particular, as UDP-glicosiltransferases são UGTS12 e UGT76G1.In another particular embodiment, UDP-glycosyltransferases are UGTS12 and UGT76G1.

[0189] Opcionalmente, o método da presente invenção compreende adicionalmente reciclar UDP para fornecer UDP-glicose. Em uma modalidade, o método compreende reciclar UDP mediante o fornecimento de um catalisador de reciclagem e um substrato de reciclagem, de modo que a biotransformação de esteviol e/ou o substrato de glicosídeo de esteviol para o glicosídeo de esteviol alvo é realizada com o uso de quantidades catalíticas de UDP-glicosiltransferase e UDP-glicose. A enzima de reciclagem de UDP pode ser sacarose sintase SuSy_At ou uma sacarose sintase que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com SuSy_At e o substrato de reciclagem pode ser sacarose.[0189] Optionally, the method of the present invention further comprises recycling UDP to provide UDP-glucose. In one embodiment, the method comprises recycling UDP by providing a recycling catalyst and a recycling substrate, so that the biotransformation of steviol and / or the steviol glycoside substrate into the target steviol glycoside is performed using of catalytic amounts of UDP-glycosyltransferase and UDP-glucose. The UDP recycle enzyme can be suSose synthase SuSy_At or a sucrose synthase that has> 85% amino acid sequence identity with SuSy_At and the recycle substrate can be sucrose.

[0190] Opcionalmente, o método da presente invenção compreende adicionalmente o uso de transglicosidases que usam oligo- ou polissacarídeos como o doador de açúcar para modificar moléculas de glicosídeo de esteviol alvo de receptor. Os exemplos não limitadores incluem ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase), fructofuranosidase, amilase, saccarase, glicosucrase, beta-h-fructosidase, beta-[0190] Optionally, the method of the present invention further comprises the use of transglycosidases that use oligo- or polysaccharides as the sugar donor to modify receptor-steviol glycoside molecules. Non-limiting examples include cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase), fructofuranosidase, amylase, saccarase, glycosucrase, beta-h-fructosidase, beta-

fructosidase, sucrase. fructosilinvertase, invertase alcalina, invertase ácida, fructofuranosidase. Em algumas modalidades, glicose e açúcar (ou açúcares) além de glicose, incluindo, porém sem limitação, frutose, xilose, ramnose, arabinose, desoxiglicose, galactose são transferidos para os glicosídeos de esteviol alvo receptores.fructosidase, sucrase. fructosylinvertase, alkaline invertase, acid invertase, fructofuranosidase. In some embodiments, glucose and sugar (or sugars) in addition to glucose, including, but not limited to, fructose, xylose, rhamnose, arabinose, deoxyglucose, galactose are transferred to the target steviol glycosides receptors.

Em uma modalidade, o glicosídeo de esteviol receptor é rebaudiosídeo AM.In one embodiment, the steviol receptor glycoside is rebaudioside AM.

[0191] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase com capacidade para adicionar pelo menos uma unidade de glicose a glicosídeo de esteviol de composição de partida tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTs selecionadas a partir da seguinte listagem de número identificadores Genlnfo, de preferência, a partir do grupo apresentado na Tabela 1 e Tabela 2.[0191] In another embodiment, the UDP-glycosyltransferase with the ability to add at least one glucose unit to the steviol glycoside of the starting composition has> 85% amino acid sequence identity with UGTs selected from the following number listing Genlnfo identifiers, preferably from the group shown in Table 1 and Table 2.

397567 30680413 115480946 147798902 218193594 225443294 454245 32816174 116310259 147811764 218193942 225444853 1359905 32816178 116310985 147827151 219885307 225449296 1685003 34393978 116788066 147836230 222615927 225449700 1685005 37993665 116788606 147839909 222619587 225454338 2191136 37993671 116789315 147846163 222623142 225454340 2501497 37993675 119394507 147855977 222625633 225454342 2911049 39104603 119640480 148905778 222625635 225454473 4218003 41469414 122209731 148905999 222636620 225454475 4314356 41469452 125526997 148906835 222636621 225458362 13492674 42566366 125534279 148907340 222636628 225461551 13492676 42570280 125534461 148908935 222636629 225461556 15217773 42572855 125540090 148909182 224053242 225461558 15217796 44890129 125541516 148909920 224053386 225469538 15223396 46806235 125545408 148910082 224055535 225469540397567 30680413 115480946 147798902 218193594 225443294 454245 32816174 116310259 147811764 218193942 225444853 1359905 32816178 116310985 147827151 219885307 225449296 1685003 34393978 116788066 147836230 222615927 225449700 1685005 37993665 116788606 147839909 222619587 225454338 2191136 37993671 116789315 147846163 222623142 225454340 2501497 37993675 119394507 147855977 222625633 225454342 2911049 39104603 119640480 148905778 222625635 225454473 4218003 41469414 122209731 148905999 222636620 225454475 4314356 125526997 41469452 148906835 222636621 225458362 13492674 125534279 42566366 148907340 222636628 225461551 13492676 125534461 42570280 148908935 222636629 225461556 15217773 125540090 42572855 148909182 224053242 225461558 15217796 125541516 44890129 148909920 224053386 225469538 15223396 125545408 148910082 224055535 46806235 225469540

Tabela 1Table 1

Número GI Acesso OrigemGI Number Access Origin

190692175 ACE87855.1 Stevia rebaudiana190692175 ACE87855.1 Stevia rebaudiana

41469452 AAS07253.1 Oryza sativa41469452 AAS07253.1 Oryza sativa

62857204 BAD95881.1 Ipomoea nil62857204 BAD95881.1 Ipomoea nil

62857206 BAD95882.1 Ipomoea purperea62857206 BAD95882.1 Ipomoea purperea

56550539 BAD77944.1 Bellis pernis56550539 BAD77944.1 Bellis pernis

115454819 NP_001051010.1 Oryza sativa Grupo Japonica115454819 NP_001051010.1 Oryza sativa Grupo Japonica

115459312 NP_001053256.1 Oryza sativa Grupo Japonica115459312 NP_001053256.1 Oryza sativa Grupo Japonica

115471069 NP_001059133.1 Oryza sativa Grupo Japonica115471069 NP_001059133.1 Oryza sativa Grupo Japonica

115471071 NP_001059134.1 Oryza sativa Grupo Japonica115471071 NP_001059134.1 Oryza sativa Grupo Japonica

116310985 CAH67920.1 Oryza sativa Grupo Indica116310985 CAH67920.1 Oryza sativa Grupo Indica

116788066 ABK24743.1 Picea sitchensis116788066 ABK24743.1 Picea sitchensis

122209731 Q2V6J9.1 Fragaria x amamassa122209731 Q2V6J9.1 Fragaria x amamassa

125534461 EAY81009.1 Oryza sativa Grupo Indica125534461 EAY81009.1 Oryza sativa Grupo Indica

125559566 EAZ05102.1 Oryza sativa Grupo Indica125559566 EAZ05102.1 Oryza sativa Grupo Indica

125588307 EAZ28971.1 Oryza sativa Grupo Japonica125588307 EAZ28971.1 Oryza sativa Grupo Japonica

148907340 ABR16806.1 Picea sitchensis148907340 ABR16806.1 Picea sitchensis

148910082 ABR18123.1 Picea sitchensis148910082 ABR18123.1 Picea sitchensis

148910612 ABR18276.1 Picea sitchensis148910612 ABR18276.1 Picea sitchensis

15234195 NP_194486.1 Arabidopsis thaliana15234195 NP_194486.1 Arabidopsis thaliana

15239523 NP_200210.1 Arabidopsis thaliana15239523 NP_200210.1 Arabidopsis thaliana

15239937 NP_196793.1 Arabidopsis thaliana15239937 NP_196793.1 Arabidopsis thaliana

1685005 AAB36653.1 Nicotiana tabacum1685005 AAB36653.1 Nicotiana tabacum

183013903 ACC38471.1 Medicago truncatula183013903 ACC38471.1 Medicago truncatula

186478321 NP_172511.3 Arabidopsis thaliana186478321 NP_172511.3 Arabidopsis thaliana

187373030 ACD03249.1 Avena strigosa187373030 ACD03249.1 Avena strigosa

194701936 ACF85052.1 Zea mays194701936 ACF85052.1 Zea mays

19743740 AAL92461.1 Solanum lycopersicum19743740 AAL92461.1 Solanum lycopersicum

212275846 NP_001131009.1 Zea mays212275846 NP_001131009.1 Zea mays

222619587 EEE55719.1 Oryza sativa Grupo Japonica222619587 EEE55719.1 Oryza sativa Grupo Japonica

224055535 XP_002298527.1 Populus trichocarpa224055535 XP_002298527.1 Populus trichocarpa

224101569 XP_002334266.1 Populus trichocarpa224101569 XP_002334266.1 Populus trichocarpa

224120552 XP_002318358.1 Populus trichocarpa224120552 XP_002318358.1 Populus trichocarpa

224121288 XP_002330790.1 Populus trichocarpa224121288 XP_002330790.1 Populus trichocarpa

225444853 XP_002281094 Vitis vinífera225444853 XP_002281094 Vitis vinífera

225454342 XP_002275850.1 Vitis vinífera225454342 XP_002275850.1 Vitis vinífera

225454475 XP_002280923.1 Vitis vinífera225454475 XP_002280923.1 Vitis vinífera

225461556 XP_002285222 Vitis vinífera225461556 XP_002285222 Vitis vinífera

225469540 XP_002270294.1 Vitis vinifera225469540 XP_002270294.1 Vitis vinifera

226495389 NP_001148083.1 Zea mays226495389 NP_001148083.1 Zea mays

226502400 NP_001147674.1 Zea mays226502400 NP_001147674.1 Zea mays

238477377 ACR43489.1 Triticum aestivum238477377 ACR43489.1 Triticum aestivum

240254512 NP_565540.4 Arabidopsis thaliana240254512 NP_565540.4 Arabidopsis thaliana

2501497 Q43716.1 Petunia x hybrida2501497 Q43716.1 Petunia x hybrida

255555369 XP_002518721.1 Ricinus communis255555369 XP_002518721.1 Ricinus communis

26452040 BAC43110.1 Arabidopsis thaliana26452040 BAC43110.1 Arabidopsis thaliana

296088529 CBI37520.3 Vitis vinifera296088529 CBI37520.3 Vitis vinifera

297611791 NP_001067852.2 Oryza sativa Grupo Japonica297611791 NP_001067852.2 Oryza sativa Grupo Japonica

297795735 XP_002865752.1 Arabidopsis lyrata sybspe. lyrata297795735 XP_002865752.1 Arabidopsis lyrata sybspe. lyrata

297798502 XP_002867135.1 Arabidopsis lyrata sybspe. lyrata297798502 XP_002867135.1 Arabidopsis lyrata sybspe. lyrata

297820040 XP_002877903.1 Arabidopsis lyrata sybspe. lyrata297820040 XP_002877903.1 Arabidopsis lyrata sybspe. lyrata

297832276 XP_002884020.1 Arabidopsis lyrata sybspe. lyrata297832276 XP_002884020.1 Arabidopsis lyrata sybspe. lyrata

302821107 XP_002992218.1 Selaginella mellendorffii302821107 XP_002992218.1 Selaginella mellendorffii

30680413 NP_179446.2 Arabidopsis thaliana30680413 NP_179446.2 Arabidopsis thaliana

319759266 ADV71369.1 Pueraria montana var. lobata319759266 ADV71369.1 Pueraria montana var. lobata

326507826 BAJ86656.1 Hordeum vulgare subsp.326507826 BAJ86656.1 Hordeum vulgare subsp.

VulgareVulgare

343457675 AEM37036.1 Brassica rapa subsp. oleífera343457675 AEM37036.1 Brassica rapa subsp. oleiferous

350534960 NP_001234680.1 Solanum lycopersicum350534960 NP_001234680.1 Solanum lycopersicum

356501328 XP_003519477.1 Glycine max356501328 XP_003519477.1 Glycine max

356522586 XP_003529927.1 Glycine max356522586 XP_003529927.1 Glycine max

356535480 XP_003536273.1 Glycine max356535480 XP_003536273.1 Glycine max

357445733 XP_003593144.1 Medicago truncatula357445733 XP_003593144.1 Medicago truncatula

357452783 XP_003596668.1 Medicago truncatula357452783 XP_003596668.1 Medicago truncatula

357474493 XP_003607531.1 Medicago truncatula357474493 XP_003607531.1 Medicago truncatula

357500579 XP_003620578.1 Medicago truncatula357500579 XP_003620578.1 Medicago truncatula

357504691 XP_003622634.1 Medicago truncatula357504691 XP_003622634.1 Medicago truncatula

359477998 XP_003632051.1 Vitis vinifera359477998 XP_003632051.1 Vitis vinifera

359487055 XP_002271587 Vitis vinifera359487055 XP_002271587 Vitis vinifera

359495869 XP_003635104.1 Vitis vinifera359495869 XP_003635104.1 Vitis vinifera

387135134 AFJ52948.1 Linum usitatissimum387135134 AFJ52948.1 Linum usitatissimum

387135176 AFJ52969.1 Linum usitatissimum387135176 AFJ52969.1 Linum usitatissimum

387135192 AFJ52977.1 Linum usitatissimum387135192 AFJ52977.1 Linum usitatissimum

387135282 AFJ53022.1 Linum usitatissimum387135282 AFJ53022.1 Linum usitatissimum

387135302 AFJ53032.1 Linum usitatissimum387135302 AFJ53032.1 Linum usitatissimum

387135312 AFJ53037.1 Linum usitatissimum387135312 AFJ53037.1 Linum usitatissimum

388519407 AFK47765.1 Medicago truncatula388519407 AFK47765.1 Medicago truncatula

393887646 AFN26668.1 Barbarea vulgaris subsp. arcuata393887646 AFN26668.1 Barbarea vulgaris subsp. arcuata

414888074 DAA64088.1 Zea mays414888074 DAA64088.1 Zea mays

42572855 NP_974524.1 Arabidopsis thaliana42572855 NP_974524.1 Arabidopsis thaliana

449440433 XP_004137989.1 Cucumis sativus449440433 XP_004137989.1 Cucumis sativus

449446454 XP_004140986.1 Cucumis sativus449446454 XP_004140986.1 Cucumis sativus

449449004 XP_004142255.1 Cucumis sativus449449004 XP_004142255.1 Cucumis sativus

449451593 XP_004143546.1 Cucumis sativus449451593 XP_004143546.1 Cucumis sativus

449515857 XP_004164964.1 Cucumis sativus449515857 XP_004164964.1 Cucumis sativus

460382095 XP_004236775.1 Solanum lycopersicum460382095 XP_004236775.1 Solanum lycopersicum

460409128 XP_004249992.1 Solanum lycopersicum460409128 XP_004249992.1 Solanum lycopersicum

460409461 XP_004250157.1 Solanum lycopersicum460409461 XP_004250157.1 Solanum lycopersicum

460406465 XP_004250159.1 Solanum lycopersicum460406465 XP_004250159.1 Solanum lycopersicum

462396388 EMJ02187.1 Prunus persica462396388 EMJ02187.1 Prunus persica

462402118 EMJ07675.1 Prunus persica462402118 EMJ07675.1 Prunus persica

462409359 EMJ14693.1 Prunus persica462409359 EMJ14693.1 Prunus persica

462416923 EMJ21660.1 Prunus persica462416923 EMJ21660.1 Prunus persica

46806235 BAD17459.1 Oryza sativa Grupo Japonica46806235 BAD17459.1 Oryza sativa Grupo Japonica

470104266 XP_004288529.1 Fragaria vesca subsp. vesca470104266 XP_004288529.1 Fragaria vesca subsp. vesca

470142008 XP_004306714.1 Fragaria vesca subsp. vesca470142008 XP_004306714.1 Fragaria vesca subsp. vesca

475432777 EMT01232.1 Aegilops tauschii475432777 EMT01232.1 Aegilops tauschii

51090402 BAD35324.1 Oryza sativa Grupo Japonica51090402 BAD35324.1 Oryza sativa Grupo Japonica

Tabela 2Table 2

Número GI Acesso Origem Referência internaGI Number Access Origin Internal reference

460409128 XP.004249992.1 Solanum lycopersicum UGTSl460409128 XP.004249992.1 Solanum lycopersicum UGTSl

460386018 XP.004238697.1 Solanum lycopersicum -460386018 XP.004238697.1 Solanum lycopersicum -

460409134 XP.004249995.1 Solanum lycopersicum -460409134 XP.004249995.1 Solanum lycopersicum -

460410132 XP.004250485.2 Solanum lycopersicum UGTSl2460410132 XP.004250485.2 Solanum lycopersicum UGTSl2

460410130 XP.004250484.1 -460410130 XP.004250484.1 -

460410128 XP.004250483.1 -460410128 XP.004250483.1 -

460378310 XP.004234916.1 -460378310 XP.004234916.1 -

209954733 BAG80557.1 Lycium barbarum UGTLB 209954725 BAG80553.1 Lycium barbarum -209954733 BAG80557.1 Lycium barbarum UGTLB 209954725 BAG80553.1 Lycium barbarum -

[0192] Um modalidade da presente invenção é uma célula microbiana que compreende uma enzima, isto é, uma enzima com capacidade para converter a composição de partida no glicosídeo de esteviol alvo. Consequentemente, algumas modalidades do presente método incluem colocar um micro-organismo em contato com um meio que contém a composição de partida para fornecer um meio que compreende pelo menos um glicosídeo de esteviol alvo.[0192] One embodiment of the present invention is a microbial cell comprising an enzyme, that is, an enzyme capable of converting the starting composition into the target steviol glycoside. Consequently, some embodiments of the present method include bringing a microorganism into contact with a medium containing the starting composition to provide a medium comprising at least one target steviol glycoside.

[0193] O micro-organismo pode ser qualquer micro-organismo que possui a enzima (ou enzimas) necessária para converter a composição de partida em glicosídeo (ou glicosídeos) de esteviol alvo. Essas enzimas são codificadas dentro do genoma do micro-organismo.[0193] The microorganism can be any microorganism that has the enzyme (or enzymes) necessary to convert the starting composition to target steviol glycoside (or glycosides). These enzymes are encoded within the microorganism's genome.

[0194] Os micro-organismos adequados incluem, porém sem limitação, E.coli, Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Pichia sp., Bacillus sp., Yarrowia sp. etc.[0194] Suitable microorganisms include, but are not limited to, E.coli, Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Pichia sp., Bacillus sp., Yarrowia sp. etc.

[0195] Em uma modalidade, o micro-organismo é livre quando colocado em contato com a composição de partida.[0195] In one embodiment, the micro-organism is free when placed in contact with the starting composition.

[0196] Em uma outra modalidade, o micro-organismo é imobilizado quando colocado em contato com a composição de partida. Por exemplo, o micro-organismo pode ser imobilizado em um suporte sólido produzido a partir de materiais inorgânicos ou orgânicos. Os exemplos não limitadores de suportes sólidos adequados para imobilizar o micro-organismo incluem vidro ou celulose derivada, cerâmica, óxidos de metal ou membranas. O micro-organismo pode ser imobilizado no suporte sólido, por exemplo, por meio de ligação covalente, adsorção, reticulação, aprisionamento ou encapsulação.[0196] In another modality, the microorganism is immobilized when placed in contact with the starting composition. For example, the microorganism can be immobilized on a solid support produced from inorganic or organic materials. Non-limiting examples of solid supports suitable for immobilizing the microorganism include glass or derived cellulose, ceramic, metal oxides or membranes. The microorganism can be immobilized on the solid support, for example, by means of covalent bonding, adsorption, crosslinking, trapping or encapsulation.

[0197] Em mais outra modalidade, a enzima com capacidade para converter a composição de partida no glicosídeo de esteviol alvo é secretada do micro-organismo e no meio de reação.[0197] In yet another embodiment, the enzyme capable of converting the starting composition into the target steviol glycoside is secreted from the microorganism and the reaction medium.

[0198] O glicosídeo de esteviol alvo é opcionalmente purificado. A purificação do glicosídeo de esteviol alvo a partir do meio de reação pode ser alcançada por pelo menos um método adequado para fornecer uma composição de glicosídeo de esteviol alvo altamente purificado. Os métodos adequados incluem cristalização, separação por membranas, centrifugação, extração (fase líquida ou sólida), separação cromatográfica, HPLC (preparativa ou analítica) ou uma combinação de tais métodos.[0198] The target steviol glycoside is optionally purified. Purification of the target steviol glycoside from the reaction medium can be achieved by at least one suitable method to provide a highly purified target steviol glycoside composition. Suitable methods include crystallization, membrane separation, centrifugation, extraction (liquid or solid phase), chromatographic separation, HPLC (preparative or analytical) or a combination of such methods.

UsosUses

[0199] O glicosídeo (ou glicosídeos) alvo altamente purificado, particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B , esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM obtido de acordo com esta invenção pode ser usado “tal como é” ou em combinação com outros adoçantes, sabores, ingredientes alimentícios e combinações dos mesmos.[0199] The highly purified target glycoside (or glycosides), particularly steviolmonoside, steviolmonoside A, steviolbioside A, steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C, rebaudios E, rebaudioside rebaudioside E3 and / or rebaudioside AM obtained in accordance with this invention can be used "as is" or in combination with other sweeteners, flavors, food ingredients and combinations thereof.

[0200] Os exemplos não limitadores de sabores incluem, porém sem limitação, lima, limão, laranja, fruta, banana, uva, pera, abacaxi, manga, baga, amêndoa amarga, cola, canela, açúcar, algodão doce, baunilha e combinações dos mesmos.[0200] Non-limiting examples of flavors include, but are not limited to, lime, lemon, orange, fruit, banana, grape, pear, pineapple, mango, berry, bitter almond, cola, cinnamon, sugar, cotton candy, vanilla and combinations of the same.

[0201] Os exemplos não limitadores de outros ingredientes alimentícios incluem, porém sem limitação, acidulantes, aminoácidos e ácidos orgânicos, agentes corantes, agentes avolumadores, amidos modificados, gomas, texturizadores, conservantes, cafeína, antioxidantes, emulsificantes, estabilizantes, espessantes, agentes gelificantes e combinações dos mesmos.[0201] Non-limiting examples of other food ingredients include, but are not limited to, acidulants, amino acids and organic acids, coloring agents, bulking agents, modified starches, gums, texturizers, preservatives, caffeine, antioxidants, emulsifiers, stabilizers, thickeners, agents gelling agents and combinations thereof.

[0202] O glicosídeo (ou glicosídeos) alvo altamente purificado, particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo,[0202] The highly purified target glycoside (or glycosides), particularly steviolmonoside, steviolmonoside A, steviolbioside,

esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM obtido de acordo com esta invenção pode ser preparado em diversas formas polimórficas, incluindo, porém sem limitação, hidratos, solvatos, anidras, formas amorfas e combinações dos mesmos.steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C, rebaudioside E, rebaudioside E2, rebaudioside E3 and / or rebaudioside AM obtained according to this invention can be prepared in various polymorphic forms including, but not limited to, hydrates, solvates, anhydrous, amorphous forms and combinations thereof.

[0203] O glicosídeo (ou glicosídeos) alvo altamente purificado, particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM obtido de acordo com esta invenção pode ser incorporado como um adoçante natural de alta intensidade em gêneros alimentícios, bebidas, composições farmacêuticas, cosméticos, gomas de mascar, produtos de mesa, cereais, produtos lácteos, pastas dentais e outras composições de cavidade bucal, etc.[0203] The highly purified target glycoside (or glycosides), particularly steviolmonoside, steviolmonoside A, steviolbioside A, steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C, rebaudios E, rebaudioside rebaudioside E3 and / or rebaudioside AM obtained in accordance with this invention can be incorporated as a natural sweetener of high intensity in foodstuffs, beverages, pharmaceutical compositions, cosmetics, chewing gums, tableware, cereals, dairy products, toothpastes and other oral cavity compositions, etc.

O glicosídeo (ou glicosídeos) alvo altamente purificado, particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B , esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM obtido de acordo com esta invenção pode ser empregado como um composto adoçante como o único adoçante, ou pode ser usado em conjunto com pelo menos um adoçante de alta intensidade de ocorrência natural como rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo A2, rebaudiosídeo A3, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C2, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo D2, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo F2, rebaudiosídeo F3, rebaudiosídeo G, rebaudiosídeo H, rebaudiosídeo /, rebaudiosídeo 12, rebaudiosídeo 13, rebaudiosídeo J, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo K2, rebaudiosídeo L, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo M2, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo O,The highly purified target glycoside (or glycosides), particularly steviolmonoside, steviolmonoside A, steviolbioside, steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside C, reudioside E, rebaudioside E, reba3 E2 / or AM rebaudioside obtained according to this invention can be used as a sweetener compound as the only sweetener, or it can be used in conjunction with at least one naturally occurring high intensity sweetener such as rebaudioside A, rebaudioside A2, rebaudioside A3, rebaudioside B, rebaudioside C, rebaudioside C2, rebaudioside D, rebaudioside D2, rebaudioside F2, rebaudioside F3, rebaudioside G, rebaudioside H, rebaudioside 12, rebaudioside 13, rebaudioside K, rebaudioside K, rebaudioside rebaudioside M, rebaudioside M2, rebaudioside N, rebaudioside O,

rebaudiosídeo 02, rebaudiosídeo Q, rebaudiosídeo Q2, rebaudiosídeo Q3, rebaudiosídeorebaudioside 02, rebaudioside Q, rebaudioside Q2, rebaudioside Q3, rebaudioside

R, rebaudiosídeo S, rebaudiosídeo T, rebaudiosídeo Tl, rebaudiosídeo U, rebaudiosídeo U2, rebaudiosídeo V, rebaudiosídeo W, rebaudiosídeo W2, rebaudiosídeo W3,R, rebaudioside S, rebaudioside T, rebaudioside Tl, rebaudioside U, rebaudioside U2, rebaudioside V, rebaudioside W, rebaudioside W2, rebaudioside W3,

rebaudiosídeo Y, rebaudiosídeo Zl, rebaudiosídeo Z2, dulcosídeo A, dulcosídeo C,rebaudioside Y, rebaudioside Zl, rebaudioside Z2, dulcoside A, dulcoside C,

esteviosídeo D, esteviosídeo E, esteviosídeo E2, esteviosídeo F, mogrosídeos, brazeína, neoesperidina dihidrocalcona, ácido glicirrízico e seus sais, taumatina, perilartina,stevioside D, stevioside E, stevioside E2, stevioside F, mogrosides, brazein, neoesperidin dihydrocalcone, glycyrrhizic acid and its salts, thaumatin, perilartine,

pernandulcina, mukuroziosídeos, baiyunosídeo, flomisosídeo-I, dimetil-hexaidrofluoreno-pernandulcin, mukuroziosides, baiyunoside, flomisoside-I, dimethyl-hexahydrofluorene-

ácido dicarboxílico, abrusosídeos, periandrina, carnosiflosídeos, ciclocariosídeo, pterocariosídeos, polipodosídeo A, brazilina, hernandulcina, fillodulcina, glicifilina,dicarboxylic acid, abrusosides, periandrine, carnosiflosides, cyclocarioside, pterocariosides, polypodoside A, brazilina, hernandulcina, fillodulcina, glyphiline,

florizina, trilobatina, di-hidro flavonol, di-hidroquercetina-3 -acetato, neoastilibina, trans-florizine, trilobatin, dihydro flavonol, dihydroquercetin-3-acetate, neoastilibine, trans-

cinamaldeído, monatina e seus sais, seligueaina A, hematoxilina, monelina, osladina, pterocariosídeo A, pterocariosídeo B, mabinlina, pentadina, miraculina, curculina,cinnamaldehyde, monatin and its salts, seligueaine A, hematoxylin, monelin, osladin, pterocarioside A, pterocarioside B, mabinline, pentadine, miraculin, curculin,

neoculina, ácido clorogênico, cinarina, adoçante Luo Han Guo, mogrosídeo V,neoculin, chlorogenic acid, cinarin, sweetener Luo Han Guo, mogroside V,

siamenosídeo e combinações dos mesmos.siamenoside and combinations thereof.

Em uma modalidade particular, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A,In a particular embodiment, steviolmonoside, steviolmonoside A, steviolbioside, steviolbioside A,

esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA),steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA),

esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM pode ser usado em uma composição de adoçante que compreende um composto selecionado a partir do grupo que consiste em rebaudiosídeostevioside B, stevioside C, rebaudioside E, rebaudioside E2, rebaudioside E3 and / or rebaudioside AM can be used in a sweetener composition that comprises a compound selected from the group consisting of rebaudioside

A, rebaudiosídeo A2, rebaudiosídeo A3, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C2, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo D2, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeoA, rebaudioside A2, rebaudioside A3, rebaudioside B, rebaudioside C, rebaudioside C2, rebaudioside D, rebaudioside D2, rebaudioside F, rebaudioside

F2, rebaudiosídeo F3, rebaudiosídeo G, rebaudiosídeo H, rebaudiosídeo I, rebaudiosídeoF2, rebaudioside F3, rebaudioside G, rebaudioside H, rebaudioside I, rebaudioside

12, rebaudiosídeo 13, rebaudiosídeo J rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo K2, rebaudiosídeo L, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo M2, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo12, rebaudioside 13, rebaudioside J rebaudioside K, rebaudioside K2, rebaudioside L, rebaudioside M, rebaudioside M2, rebaudioside N, rebaudioside

O, rebaudiosídeo 02, rebaudiosídeo Q, rebaudiosídeo Q2, rebaudiosídeo Q3,O, rebaudioside 02, rebaudioside Q, rebaudioside Q2, rebaudioside Q3,

rebaudiosídeo R, rebaudiosídeo S, rebaudiosídeo T, rebaudiosídeo Tl, rebaudiosídeo U, rebaudiosídeo U2, rebaudiosídeo V, rebaudiosídeo W, rebaudiosídeo W2, rebaudiosídeo W3, rebaudiosídeo Y, rebaudiosídeo Zl, rebaudiosídeo Z2, dulcosídeo A, dulcosídeo C, esteviosídeo D, esteviosídeo E, esteviosídeo E2, esteviosídeo F, NSF-02, mogrosídeo V, Luo Han Guo, alulose, alose, D-tagatose, eritritol e combinações dos mesmos.rebaudioside R, rebaudioside S, rebaudioside Tl, rebaudioside U, rebaudioside U2, rebaudioside V, rebaudioside W, rebaudioside W2, rebaudioside Y3, rebaudioside Zl, rebaudioside Zl, reudioside Zl, reudioside Z2, rebaudioside Z2, rebaudioside A , stevioside E2, stevioside F, NSF-02, mogroside V, Luo Han Guo, allulose, alose, D-tagatose, erythritol and combinations thereof.

[0204] O glicosídeo (ou glicosídeos) alvo altamente purificado, particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM também pode ser usado em combinação com adoçantes de alta intensidade sintéticos como sucralose, acessulfame de potássio, aspartame, alitame, sacarina, neoesperidina di-hidrocalcona, ciclamato, neotame, dulcina, suosan advantame, sais dos mesmos, e combinações dos mesmos.[0204] The highly purified target glycoside (or glycosides), particularly steviolmonoside, steviolmonoside A, steviolbioside A, steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C, rebaudios E, rebaudioside rebaudioside E3 and / or rebaudioside AM can also be used in combination with synthetic high intensity sweeteners such as sucralose, acesulfame potassium, aspartame, alitame, saccharin, neoesperidin dihydrocalcone, cyclamate, neotame, dulcin, suosan advantame, salts thereof, and combinations thereof.

[0205] Ademais, o glicosídeo (ou glicosídeos) de esteviol alvo altamente purificado particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM pode ser usado em combinação com supressores de adoçante natural como ácido gimnêmico, hodulcina, zizifina, lactisol, e outros. O esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM também pode ser combinado com diversos intensificadores de sabor umami. O esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A[0205] In addition, the highly purified target steviol glycoside (or glycosides), particularly steviolmonoside, steviolmonoside A, steviolbioside, steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside B, stevioside B, stevioside B, stevioside B, stevioside B, stevioside B, stevioside B, stevioside B, stevioside B, stevioside B, stevioside B, stevioside B, stevioside B, stevioside B, stevioside B, stevioside B, stevioside B, stevioside B, stevioside B, stevioside B, stevioside B, stevioside B, steviosideB, steviosideB, steviosideB, steviosideB, steviosideB, steviosideB, steviosideA, rebaudioside E2, rebaudioside E3 and / or rebaudioside AM can be used in combination with natural sweetener suppressants such as gymnemic acid, hodulcin, zizifine, lactisol, and others. The steviolmonoside, steviolmonoside A, steviolbioside, steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C, rebaudioside E, rebaudioside E2, rebaudioside E3 and / or can be combined with several E3 and / or rebaudioside E3 and / or can also be combined with different E3 and / or rebaudioside E3 and / or rebaudioside E3 and / or rebaudioside E3 and / or rebaudioside E3 and / or rebaudioside E3 and / or rebaudioside E3 and / or rebaudioside E3 and / or rebaudioside E3 and / or rebaudioside E3 and / or rebaudioside E3 and / or rebaudioside E3 and / or rebaudioside E3 and / or rebaudioside E3 and / or rebaudioside E3 and / or rebaudioside E3 and / or rebaudioside and E3 and / or umami flavor intensifiers. Steviolmonoside, Steviolmonoside A, Steviolbioside, Steviolbioside A, Steviolbioside B, Rubusoside, Stevioside, Stevioside A

(rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM pode ser misturado com aminoácidos doces e sabor umami como glutamato, ácido aspártico, glicina, alanina, treonina, prolina, serina, glutamato, lisina, triptofano e combinações dos mesmos.(rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C, rebaudioside E, rebaudioside E2, rebaudioside E3 and / or rebaudioside AM can be mixed with sweet amino acids and umami flavor like glutamate, aspartic acid, glycine, alanine, threonine, proline, serine, glutamate , lysine, tryptophan and combinations thereof.

[0206] O glicosídeo (ou glicosídeos) de esteviol alvo altamente purificado, particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM pode ser usado em combinação com um ou mais aditivos selecionados a partir do grupo que consiste em carboidratos, polióis, aminoácidos e seus sais correspondentes, poli-aminoácidos e seus sais correspondentes, ácidos de açúcar e seus sais correspondentes, nucleotídeos, ácidos orgânicos, ácidos inorgânicos, sais orgânicos incluindo sais de ácido orgânico e sais de base orgânica, sais inorgânicos, compostos amargos, saborizantes e ingredientes saborizantes, compostos adstringentes, proteínas ou hidrolisatos de proteína, tensoativos, emulsificantes, flavonoides, álcoois, polímeros e combinações dos mesmos.[0206] Highly purified target steviol glycoside (or glycosides), particularly steviolmonoside, steviolmonoside A, steviolbioside, steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C, stevioside E, E2, E3 rebaudioside and / or AM rebaudioside can be used in combination with one or more additives selected from the group consisting of carbohydrates, polyols, amino acids and their corresponding salts, poly-amino acids and their corresponding salts, sugar acids and their corresponding salts, nucleotides, organic acids, inorganic acids, organic salts including organic acid salts and organic based salts, inorganic salts, bitter compounds, flavorings and flavoring ingredients, astringent compounds, protein or protein hydrolysates, surfactants, emulsifiers, flavonoids, alcohols, polymers and combinations thereof.

[0207] O glicosídeo (ou glicosídeos) de esteviol alvo altamente purificado, particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM pode ser combinado com polióis ou álcoois de açúcar. O termo “poliol” se refere a uma molécula que contém mais de um grupo hidroxila.[0207] The highly purified target steviol glycoside (or glycosides), particularly steviolmonoside, steviolmonoside A, steviolbioside, steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C, stevioside E, E2, E3 rebaudioside and / or AM rebaudioside can be combined with polyols or sugar alcohols. The term "polyol" refers to a molecule that contains more than one hydroxyl group.

Um poliol pode ser um diol, triol ou um tetraol que contém 2, 3 e 4 grupos hidroxila, respectivamente. Um poliol também pode conter mais de quatro grupos hidroxila, como um pentaol, hexaol, heptaol ou similares, que contêm 5, 6 ou 7 grupos hidroxila,A polyol can be a diol, triol or a tetraol that contains 2, 3 and 4 hydroxyl groups, respectively. A polyol can also contain more than four hydroxyl groups, such as a pentaol, hexaol, heptaol or the like, which contain 5, 6 or 7 hydroxyl groups,

respectivamente. Adicionalmente, um poliol também pode ser um álcool de açúcar, álcool poli-hídrico ou poliálcool que é uma forma reduzida de carboidrato, em que o grupo carbonila (aldeído ou cetona, açúcar redutor) foi reduzido a um grupo hidroxila primário ou secundário. Os exemplos de polióis incluem, porém sem limitação, eritritol, maltitol, manitol, sorbitol, lactitol, xilitol, inositol, isomalte, propilenoglicol, glicerol, treitol, galactitol, isomaltulose hidrogenada, isomalto-oligossacarídeos reduzidos, xilo- oligossacarídeos reduzidos, gentio-oligossacarídeos reduzidos, xarope de maltose reduzida, xarope de glicose reduzida, hidrolisados de amido hidrogenados, poliglicitóis e álcoois de açúcar ou quaisquer outros carboidratos com capacidade para serem reduzidos que não afetem de modo adverso o sabor da composição de adoçante. O glicosídeo (ou glicosídeos) de esteviol alvo altamente purificado, particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM pode ser combinado com adoçantes com teor calórico reduzido como, por exemplo, D-tagatose, L-açúcares, L-sorbose, L-arabinose e combinações dos mesmos.respectively. In addition, a polyol can also be a sugar alcohol, polyhydric alcohol or polyalcohol which is a reduced form of carbohydrate, in which the carbonyl group (aldehyde or ketone, reducing sugar) has been reduced to a primary or secondary hydroxyl group. Examples of polyols include, but are not limited to, erythritol, maltitol, mannitol, sorbitol, lactitol, xylitol, inositol, isomalt, propylene glycol, glycerol, treitol, galactitol, hydrogenated isomaltulose, reduced isomalto-oligosaccharides, oligosaccharides, oligosaccharides, oligosaccharides, oligosaccharides reduced, reduced maltose syrup, reduced glucose syrup, hydrogenated starch hydrolysates, polyglycitols and sugar alcohols or any other carbohydrates capable of being reduced that do not adversely affect the taste of the sweetener composition. The highly purified target steviol glycoside (or glycosides), particularly steviolmonoside, steviolmonoside A, steviolbioside A, steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C, rebaudios E, rebaudios E, rebaudios E, rebaudios E E3 and / or rebaudioside AM can be combined with sweeteners with reduced caloric content, such as, for example, D-tagatose, L-sugars, L-sorbose, L-arabinose and combinations thereof.

[0208] O glicosídeo (ou glicosídeos) de esteviol alvo altamente purificado, particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM também pode ser combinado com diversos carboidratos. O termo “carboidrato” se refere, em geral, a compostos de aldeído ou cetona substituídos por múltiplos grupos hidroxila, da fórmula geral (CH2O)n, em que n é 3 a 30, bem como seus oligômeros e polímeros. Os carboidratos da presente invenção podem ser, adicionalmente, substituídos ou desoxigenados em uma ou mais posições.[0208] The highly purified target steviol glycoside (or glycosides), particularly steviolmonoside, steviolmonoside A, steviolbioside, steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C, stevioside E, E2, E3 rebaudioside and / or AM rebaudioside can also be combined with several carbohydrates. The term "carbohydrate" refers, in general, to compounds of aldehyde or ketone substituted by multiple hydroxyl groups, of the general formula (CH2O) n, where n is 3 to 30, as well as their oligomers and polymers. The carbohydrates of the present invention can be additionally substituted or deoxygenated in one or more positions.

Os carboidratos, conforme usado no presente documento, abrangem carboidratos não modificados, derivados de carboidrato, carboidratos substituídos e carboidratos modificados. Conforme usado no presente documento, as frases “derivados de carboidrato”, “carboidrato substituído” e “carboidratos modificados” são sinônimos. O carboidrato modificado significa qualquer carboidrato em que pelo menos um átomo foi adicionado, removido ou substituído, ou combinações dos mesmos. Dessa forma, os derivados de carboidrato ou carboidratos substituídos incluem monossacarídeos, dissacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos substituídos e não substituídos. Os derivados de carboidrato ou carboidratos substituídos podem ser opcionalmente desoxigenados em qualquer posição C correspondente e/ou substituídos por uma ou mais porções químicas como hidrogênio, halogênio, haloalquila, carboxila, acila, aciloxi, amino, amido, derivados de carboxila, alquilamino, dialquilamino, arilamino, alcoxi, ariloxi, nitro, ciano, sulfo, mercapto, imino, sulfonila, sulfenila, sulfmila, sulfamoila, carboalcoxi, carboxamido, fosfonila, fosfinila, fosforila, fosfino, tioéster, tioéter, oximino, hidrazino, carbamila, fosfo, fosfonato, ou qualquer outro grupo funcional viável desde que o derivado de carboidrato ou carboidrato substituído funcione para melhorar o sabor doce da composição de adoçante.Carbohydrates, as used herein, include unmodified carbohydrates, carbohydrate derivatives, substituted carbohydrates and modified carbohydrates. As used in this document, the phrases “carbohydrate derivatives”, “substituted carbohydrate” and “modified carbohydrates” are synonymous. The modified carbohydrate means any carbohydrate to which at least one atom has been added, removed or replaced, or combinations thereof. Thus, substituted carbohydrate or carbohydrate derivatives include substituted and unsubstituted monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides and polysaccharides. The carbohydrate derivatives or substituted carbohydrates can optionally be deoxygenated in any corresponding C position and / or substituted by one or more chemical moieties such as hydrogen, halogen, haloalkyl, carboxyl, acyl, acyloxy, amino, starch, carboxyl derivatives, alkylamino, dialkylamino , arylamino, alkoxy, aryloxy, nitro, cyano, sulfo, mercapto, imino, sulfonyl, sulfenyl, sulfmyl, sulfamoyl, carboalkoxy, carboxamido, phosphonyl, phosphoryl, phosphoryl, phosphine, thioester, thioether, oxy, hydrazine, carbamyl, phosphonyl, carbamyl, phosphonate , or any other viable functional group as long as the carbohydrate derivative or substituted carbohydrate works to improve the sweet taste of the sweetener composition.

[0209] Os exemplos de carboidratos que podem ser usados de acordo com esta invenção incluem, porém sem limitação, psicose, turanose, alose, tagatose, trealose, galactose, ramnose, diversas ciclodextrinas, oligossacarídeos cíclicos, diversos tipos de maltodextrinas, dextrano, sacarose, glicose, ribulose, frutose, treose, arabinose, xilose, lixose, alose, altrose, manose, idose, lactose, maltose, açúcar invertido, isotrealose, neotrealose, isomaltulose, eritrose, desoxirribose, gulose, idose, talose, eritrulose, xilulose, psicose, turanose, celobiose, amilopectina, glucosamina, manosamina, fucose,[0209] Examples of carbohydrates that can be used in accordance with this invention include, but are not limited to, psychosis, turanosis, alose, tagatose, trehalose, galactose, rhamnose, various cyclodextrins, cyclic oligosaccharides, various types of maltodextrins, dextran, sucrose , glucose, ribulose, fructose, threose, arabinose, xylose, lixose, alose, altrose, mannose, idose, lactose, maltose, inverted sugar, isotrealose, neotrealose, isomaltulose, erythrose, deoxyribose, glucose, idose, talose, erythrulose, xylulose, psychosis, turanosis, cellobiosis, amylopectin, glucosamine, mannosamine, fucose,

ácido glucurônico, ácido glucônico, glucono-lactona, abequose, galactosamina, oligossacarídeos de beterraba, isomalto- oligossacarídeos (isomaltose, isomaltotriose, panose e similares), xilo-oligossacarídeos (xilotriose, xilobiose e similares), oligossacarídeos xilo-terminados, gentio- oligossacarídeos (gentiobiose, gentiotriose, gentiotetraose e similares), sorbose, nigero- oligossacarídeos, palatinose oligossacarídeos, fructo-oligossacarídeos (cestose, nistose e similares), maltotetraol, maltotriol, malto-oligossacarídeos (maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, malto- hexaose, malto-heptaose e similares), amido, inulina, inulo- oligossacarídeos, lactulose, melibiose, raffmose, ribose, açúcares líquidos isomerizados como xaropes de milho com alto teor de frutose, açúcares de acoplamento e oligossacarídeos de soja.glucuronic acid, gluconic acid, glucono-lactone, abecose, galactosamine, beetroot oligosaccharides, isomalto-oligosaccharides (isomaltose, isomaltotriose, panose and similar), xylo-oligosaccharides (xylotriosis, xylobiose and similar), oligosaccharides, x-oligosaccharides (gentiobiosis, gentiotriose, gentiotetraose and the like), sorbose, nigero-oligosaccharides, palatinose oligosaccharides, fructo-oligosaccharides (cestosis, nystosis and similar), maltotetraol, maltotriol, malto-oligosaccharides (maltotriches, maltotriches, maltetra, malts heptaose and the like), starch, inulin, inulo-oligosaccharides, lactulose, melibiosis, raffmose, ribose, isomerized liquid sugars such as high fructose corn syrups, coupling sugars and soy oligosaccharides.

Adicionalmente, os carboidratos conforme usado no presente documento podem ser na configuração D- ou L-.In addition, the carbohydrates as used in this document can be in the D- or L- configuration.

[0210] O glicosídeo (ou glicosídeos) de esteviol alvo altamente purificado, particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA ), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM obtido de acordo com esta invenção pode ser usado em combinação com diversos ingredientes funcionais ou substâncias fisiologicamente ativas. Os ingredientes funcionais são, de modo geral, classificados em categorias como carotenoides, fibra dietética, ácidos graxos, saponinas, antioxidantes, nutracêuticos, flavonoides, isotiocianatos, fenóis, talhões e esteróis vegetais (fitoesteróis e fitoestanóis); polióis; prebióticos, probióticos; fitoestrogênios; proteína de soja; sulfetos/tióis; aminoácidos; proteínas; vitaminas; e minerais. Os ingredientes funcionais também podem ser classificados com base em seus benefícios para a saúde, como cardiovascular, redução de colesterol e anti-inflamatório. Os ingredientes funcionais exemplificadores são fornecidos no documento sob o n° WO2013/096420, cujo conteúdo está aqui incorporado, a título de referência.[0210] The highly purified target steviol glycoside (or glycosides), particularly steviolmonoside, steviolmonoside A, steviolbioside, steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C, rebaudioside E, re E2, E3 rebaudioside and / or AM rebaudioside obtained in accordance with this invention can be used in combination with various functional ingredients or physiologically active substances. Functional ingredients are generally classified into categories such as carotenoids, dietary fiber, fatty acids, saponins, antioxidants, nutraceuticals, flavonoids, isothiocyanates, phenols, plots and plant sterols (phytosterols and phytostanols); polyols; prebiotics, probiotics; phytoestrogens; soy protein; sulfides / thiols; amino acids; proteins; vitamins; and minerals. Functional ingredients can also be classified based on their health benefits, such as cardiovascular, cholesterol lowering and anti-inflammatory. Exemplary functional ingredients are provided in the document under No. WO2013 / 096420, the content of which is incorporated herein by way of reference.

[0211] O glicosídeo (ou glicosídeos) de esteviol alvo altamente purificado, particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM obtido de acordo com esta invenção pode ser aplicado como um adoçante de alta intensidade para produzir bebidas e produtos alimentícios para diabéticos, de zero caloria ou com teor calórico reduzido com características de sabor melhoradas. Também pode ser usado em bebidas, gêneros alimentícios, produtos farmacêuticos e outros produtos em que o açúcar não pode ser usado. Além disso, o glicosídeo (ou glicosídeos) de esteviol alvo altamente purificado, particularmente esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM pode ser usado como um adoçante não apenas para bebidas, gêneros alimentícios e outros produtos dedicados para o consumo humano, mas também em ração animal e forragem com características melhoradas. O glicosídeo (ou glicosídeos) de esteviol alvo altamente purificado, particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM obtido de acordo com esta invenção pode ser aplicado como um modificador de sabor para produzir bebidas e produtos alimentícios para diabéticos, de zero caloria ou com teor calórico reduzido com sabor modificado. Quando usado como um modificador de sabor, ou um sabor com propriedades de modificação (FMP), o glicosídeo de esteviol alvo altamente purificado é usado em um produto consumível abaixo do nível de detecção do modificador de sabor ou FMP. O modificador de sabor ou FMP, portanto, não confere ao produto consumível um gosto detectável ou seu próprio sabor, mas, de preferência, serve para modificar a detecção do consumidor de gostos e/ou sabores de outros ingredientes no produto consumível. Um exemplo de modificação de gosto e sabor é a intensificação de doçura, em que o próprio modificador de sabor ou FMP não contribui para a doçura do produto consumível, mas intensifica a qualidade da doçura degustada pelo consumidor.[0211] The highly purified target steviol glycoside (or glycosides), particularly steviolmonoside, steviolmonoside A, steviolbioside, steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C, rebaudioside E, re E2, E3 rebaudioside and / or AM rebaudioside obtained according to this invention can be applied as a high intensity sweetener to produce drinks and food products for diabetics, with zero calorie or reduced calorie content with improved flavor characteristics. It can also be used in drinks, foodstuffs, pharmaceuticals and other products in which sugar cannot be used. Furthermore, the glucoside (or glycosides) steviol highly purified target, particularly esteviolmonosídeo A esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A esteviolbiosídeo B rubusosídeo, Stevioside, Stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C, rebaudioside E, rebaudioside E 2, rebaudioside E3 and / or rebaudioside AM can be used as a sweetener not only for drinks, foodstuffs and other products dedicated to human consumption, but also in animal feed and forage with improved characteristics. The highly purified target steviol glycoside (or glycosides), particularly steviolmonoside, steviolmonoside A, steviolbioside A, steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C, rebaudios E, rebaudios E, rebaudios E, rebaudios E E3 and / or rebaudioside AM obtained in accordance with this invention can be applied as a flavor modifier to produce drinks and food products for diabetics, of zero calorie or with reduced calorie content with modified flavor. When used as a flavor modifier, or a flavor with modifying properties (FMP), the highly purified target steviol glycoside is used in a consumable product below the level of taste modifier or FMP detection. The flavor modifier or FMP, therefore, does not give the consumable product a detectable taste or its own flavor, but preferably serves to modify the consumer's detection of tastes and / or flavors of other ingredients in the consumable product. An example of a change in taste and flavor is the intensification of sweetness, in which the flavor modifier or FMP itself does not contribute to the sweetness of the consumable product, but rather enhances the quality of the sweetness enjoyed by the consumer.

[0212] Os exemplos de produtos consumíveis em que o glicosídeo (ou glicosídeos) de esteviol alvo altamente purificado, particularmente esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM pode ser usado como um modificador de sabor ou sabor com propriedades de modificação incluem, porém sem limitação, bebidas alcoólicas como vodca, vinho, cerveja, licor e saquê, etc.; sucos naturais; bebidas refrescantes; refrigerantes carbonatados; bebidas dietéticas; bebidas de zero caloria; bebidas e alimentos com teor calórico reduzido; bebidas de iogurte; sucos instantâneos; café instantâneo; tipos em pó de bebidas instantâneas; produtos enlatados; xaropes; pasta de soja fermentada; molho de soja; vinagre; temperos; maionese; catchups; curry; sopa; caldo instantâneo; molho de soja em pó; vinagre em pó; tipos de biscoitos; biscoito de arroz; biscoitos cracker; pão; chocolates; caramelo; bala; goma de mascar; geleia; pudim; frutas e vegetais em conserva; nata fresca; geleia; marmelada; pasta de flores; leite em pó; sorvete; sorbet; vegetais e frutas embaladas em garrafas; feijões cozidos e enlatados; carne e alimentos cozidos em molho adoçado; produtos alimentícios vegetais agrícolas; frutos do mar; presunto; salsicha; presunto de peixe; salsicha de peixe; pasta de peixe; produtos de peixe frito; produtos de frutos do mar secos; produtos alimentícios congelados; algas marinhas em conserva; carne em conserva; tabaco; produtos medicinais; e muitos outros. Em princípio, o mesmo pode ter aplicações ilimitadas. O glicosídeo (ou glicosídeos) de esteviol alvo altamente purificado, particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM obtido de acordo com esta invenção pode ser aplicado como um supressor de formação de espuma para produzir bebidas e produtos alimentícios para diabéticos, de zero caloria ou com teor calórico reduzido.[0212] Examples of consumables in which the highly purified target steviol glycoside (or glycosides), particularly steviolmonoside A, steviolbioside, steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C , rebaudioside E, rebaudioside E2, rebaudioside E3 and / or rebaudioside AM can be used as a flavor or flavor modifier with modifying properties that include, but are not limited to, alcoholic beverages such as vodka, wine, beer, liquor and sake, etc .; natural juices; refreshing drinks; carbonated soft drinks; diet drinks; zero calorie drinks; drinks and foods with reduced caloric content; yogurt drinks; instant juices; instant coffee; powder types of instant drinks; canned products; syrups; fermented soybean paste; soy sauce; vinegar; spices; mayonnaise; catchups; curry; soup; instant broth; powdered soy sauce; powdered vinegar; types of cookies; rice cracker; cracker cookies; bread; chocolates; caramel; bullet; bubble gum; jelly; pudding; preserved fruits and vegetables; fresh cream; jelly; marmalade; flower paste; powdered milk; ice cream; sorbet; vegetables and fruits packaged in bottles; cooked and canned beans; meat and food cooked in sweetened sauce; agricultural vegetable food products; Seafood; Ham; sausage; fish ham; fish sausage; fish paste; fried fish products; dried seafood products; frozen food products; preserved seaweed; preserved meat; tobacco; medicinal products; and many others. In principle, it can have unlimited applications. The highly purified target steviol glycoside (or glycosides), particularly steviolmonoside, steviolmonoside A, steviolbioside A, steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C, rebaudios E, rebaudios E, rebaudios E, rebaudios E E3 and / or rebaudioside AM obtained in accordance with this invention can be applied as a foaming suppressor to produce drinks and food products for diabetics, of zero calorie or with reduced caloric content.

[0213] Os exemplos de produtos consumíveis em que o glicosídeo (ou glicosídeos) de esteviol alvo altamente purificado, particularmente esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM pode ser usado como um composto adoçante incluem, porém sem limitação, bebidas alcoólicas como vodca, vinho, cerveja, licor e saquê, etc.; sucos naturais; bebidas refrescantes; refrigerantes carbonatados; bebidas dietéticas; bebidas de zero caloria; bebidas e alimentos com teor calórico reduzido; bebidas de iogurte; sucos instantâneos; café instantâneo; tipos em pó de bebidas instantâneas; produtos enlatados; xaropes; pasta de soja fermentada; molho de soja; vinagre; temperos; maionese; catchups; curry; sopa; caldo instantâneo; molho de soja em pó; vinagre em pó; tipos de biscoitos; biscoito de arroz; biscoitos cracker; pão; chocolates; caramelo; bala; goma de mascar; geleia; pudim; frutas e vegetais em conserva; nata fresca; geleia; marmelada; pasta de flores; leite em pó; sorvete; sorbet;[0213] Examples of consumables in which the highly purified target steviol glycoside (or glycosides), particularly steviolmonoside A, steviolbioside, steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C , rebaudioside E, rebaudioside E2, rebaudioside E3 and / or rebaudioside AM can be used as a sweetening compound include, but are not limited to, alcoholic beverages such as vodka, wine, beer, liquor and sake, etc .; natural juices; refreshing drinks; carbonated soft drinks; diet drinks; zero calorie drinks; drinks and foods with reduced caloric content; yogurt drinks; instant juices; instant coffee; powder types of instant drinks; canned products; syrups; fermented soybean paste; soy sauce; vinegar; spices; mayonnaise; catchups; curry; soup; instant broth; powdered soy sauce; powdered vinegar; types of cookies; rice cracker; cracker cookies; bread; chocolates; caramel; bullet; bubble gum; jelly; pudding; preserved fruits and vegetables; fresh cream; jelly; marmalade; flower paste; powdered milk; ice cream; sorbet;

vegetais e frutas embaladas em garrafas; feijões cozidos e enlatados; carne e alimentos cozidos em molho adoçado; produtos alimentícios vegetais agrícolas; frutos do mar; presunto; salsicha; presunto de peixe; salsicha de peixe; pasta de peixe; produtos de peixe frito; produtos de frutos do mar secos; produtos alimentícios congelados; algas marinhas em conserva; carne em conserva; tabaco; produtos medicinais; e muitos outros. Em princípio, o mesmo pode ter aplicações ilimitadas.vegetables and fruits packaged in bottles; cooked and canned beans; meat and food cooked in sweetened sauce; agricultural vegetable food products; Seafood; Ham; sausage; fish ham; fish sausage; fish paste; fried fish products; dried seafood products; frozen food products; preserved seaweed; preserved meat; tobacco; medicinal products; and many others. In principle, it can have unlimited applications.

[0214] Durante a fabricação de produtos como gêneros alimentícios, bebidas, produtos farmacêuticos, cosméticos, produtos de mesa e goma de mascar, os métodos convencionais como mistura, amassamento, dissolução, decapagem, permeação, percolação, salpicamento de pó, atomização, infusão e outros métodos podem ser usados.[0214] During the manufacture of products such as foodstuffs, beverages, pharmaceuticals, cosmetics, tableware and chewing gum, conventional methods such as mixing, kneading, dissolving, pickling, permeation, percolation, powder splashing, atomization, infusion and other methods can be used.

[0215] Ademais, o glicosídeo (ou glicosídeos) de esteviol alvo altamente purificado, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM obtido nesta invenção pode ser usado nas formas líquidas ou secas.[0215] In addition, the highly purified target steviol glycoside (or glycosides), steviolmonoside A, steviolbioside A, steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C, re-baudios E2 , E3 rebaudioside and / or AM rebaudioside obtained in this invention can be used in liquid or dry forms.

[0216] O glicosídeo de esteviol alvo altamente purificado pode ser adicionado antes ou após o tratamento térmico dos produtos alimentícios. A quantidade do glicosídeo (ou glicosídeos) de esteviol alvo altamente purificado, particularmente esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM depende do propósito de uso. Conforme discutido acima, pode ser adicionado sozinho ou em combinação com outros compostos.[0216] The highly purified target steviol glycoside can be added before or after heat treatment of food products. The amount of the highly purified target steviol glycoside (or glycosides), particularly steviolmonoside A, steviolbioside, steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C, rebaudioside E, rebaudioside E, rebaudioside E3 and / or rebaudioside AM depends on the purpose of use. As discussed above, it can be added alone or in combination with other compounds.

[0217] A presente invenção também é dirigida à intensificação de doçura em bebidas com o uso de esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM. Consequentemente, a presente invenção fornece uma bebida que compreende um adoçante e esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM como um intensificador de doçura, em que esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM está presente em uma concentração em ou abaixo de seus respectivos limiares de reconhecimento de doçura.[0217] The present invention is also directed to intensifying sweetness in beverages with the use of steviolmonoside A, steviolbioside, steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C, rebaudioside E, rebaudioside E2, rebaudioside E3 and / or rebaudioside AM. Accordingly, the present invention provides a drink comprising a sweetener and esteviolmonosídeo A esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A esteviolbiosídeo B rubusosídeo, Stevioside, Stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C, rebaudioside E, rebaudioside E2, rebaudioside E3 and / or rebaudioside AM as a sweetening enhancer, in which steviolmonoside A, steviolbioside A, steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C, rebaudioside E, rebaudioside E, rebaudioside E2 or rebaudioside AM is present in a concentration at or below their respective sweetness recognition thresholds.

[0218] Conforme usado no presente documento, o termo “intensificador de doçura” se refere a um composto com capacidade para intensificar ou realçar a percepção de sabor doce em uma composição, como uma bebida. O termo “intensificador de doçura” é sinônimo com os termos “potenciador de sabor doce”, “potenciador de doçura”, “amplificador de doçura” e “intensificador de doçura”.[0218] As used in this document, the term "sweetness enhancer" refers to a compound with the ability to enhance or enhance the perception of sweet taste in a composition, such as a drink. The term "sweetness enhancer" is synonymous with the terms "sweet flavor enhancer", "sweetness enhancer", "sweetness amplifier" and "sweetness enhancer".

[0219] O termo “concentração limiar de reconhecimento de doçura”, conforme usado de modo geral no presente documento, é a concentração conhecida menor de um composto doce que é perceptível pelo sentido de paladar humano, tipicamente ao redor de 1,0% de equivalência de sacarose (1,0% de SE). Em geral, os intensificadores de doçura podem intensificar ou potencializar o sabor doce de adoçantes sem fornecer qualquer sabor doce perceptível por si mesmo quando presentes em ou abaixo da concentração limiar de reconhecimento de doçura de um determinado intensificador de doçura; entretanto, os intensificadores de doçura podem fornecer, por si mesmos, sabor doce em concentrações acima de sua concentração limiar de reconhecimento de doçura. A concentração limiar de reconhecimento de doçura é específica para um intensificador particular e pode variar com base na matriz de bebida.[0219] The term “sweetness threshold concentration”, as used generally in this document, is the lowest known concentration of a sweet compound that is perceptible to the sense of human taste, typically around 1.0% of sucrose equivalence (1.0% SE). In general, sweetening enhancers can enhance or enhance the sweetness of sweeteners without providing any perceptible sweet flavor per se when present at or below the sweetness recognition threshold concentration of a given sweetness enhancer; however, sweetness enhancers can provide, by themselves, sweet taste in concentrations above their sweetness threshold concentration. The threshold concentration of sweetness recognition is specific to a particular intensifier and may vary based on the beverage matrix.

A concentração limiar de reconhecimento de doçura pode ser facilmente determinada por concentrações crescentes de teste de sabor de um determinado intensificador até mais que 1,0% de equivalência de sacarose em uma determinada matriz de bebida ser detectada. A concentração que fornece cerca de 1,0% de equivalência de sacarose é considerada o limiar de reconhecimento de doçura.The threshold concentration of sweetness recognition can be easily determined by increasing concentrations of taste test of a given enhancer until more than 1.0% sucrose equivalence in a given beverage matrix is detected. The concentration that provides about 1.0% sucrose equivalence is considered the sweetness recognition threshold.

[0220] Em algumas modalidades, o adoçante está presente na bebida em uma quantidade a partir de cerca de 0,5% a cerca de 12% em peso, como, por exemplo, cerca de 1,0% em peso, cerca de 1,5% em peso, cerca de 2,0% em peso, cerca de 2,5% em peso, cerca de 3,0% em peso, cerca de 3,5% em peso, cerca de 4,0% em peso, cerca de 4,5% em peso, cerca de 5,0% em peso, cerca de 5,5% em peso, cerca de 6,0% em peso, cerca de 6,5% em peso, cerca de 7,0% em peso, cerca de 7,5% em peso, cerca de 8,0% em peso, cerca de 8,5% em peso, cerca de 9,0% em peso, cerca de 9,5% em peso, cerca de 10,0% em peso, cerca de 10,5% em peso, cerca de 11,0% em peso, cerca de 11,5% em peso ou cerca de 12,0% em peso.[0220] In some embodiments, the sweetener is present in the beverage in an amount from about 0.5% to about 12% by weight, such as, for example, about 1.0% by weight, about 1 , 5% by weight, about 2.0% by weight, about 2.5% by weight, about 3.0% by weight, about 3.5% by weight, about 4.0% by weight , about 4.5% by weight, about 5.0% by weight, about 5.5% by weight, about 6.0% by weight, about 6.5% by weight, about 7, 0% by weight, about 7.5% by weight, about 8.0% by weight, about 8.5% by weight, about 9.0% by weight, about 9.5% by weight, about 10.0% by weight, about 10.5% by weight, about 11.0% by weight, about 11.5% by weight or about 12.0% by weight.

[0221] Em uma modalidade particular, o adoçante está presente na bebida em uma quantidade a partir de cerca de 0,5% de cerca de 10%, como, por exemplo, a partir de cerca de 2% a cerca de 8%, a partir de cerca de 3% a cerca de 7% ou a partir de cerca de 4% a cerca de 6% em peso. Em uma modalidade particular, o adoçante está presente na bebida em uma quantidade a partir de cerca de 0,5% a cerca de 8% em peso. Em uma outra modalidade particular, o adoçante está presente na bebida em uma quantidade a partir de cerca de 2% a cerca de 8% em peso.[0221] In a particular embodiment, the sweetener is present in the drink in an amount from about 0.5% to about 10%, such as, for example, from about 2% to about 8%, from about 3% to about 7% or from about 4% to about 6% by weight. In a particular embodiment, the sweetener is present in the beverage in an amount from about 0.5% to about 8% by weight. In another particular embodiment, the sweetener is present in the beverage in an amount from about 2% to about 8% by weight.

[0222] Em uma modalidade, o adoçante é um adoçante calórico tradicional.[0222] In one embodiment, the sweetener is a traditional caloric sweetener.

Os adoçantes adequados incluem, porém sem limitação, sacarose, frutose, glicose, xarope de milho com alto teor de frutose e xarope de amido com alto teor de frutose.Suitable sweeteners include, but are not limited to, sucrose, fructose, glucose, high fructose corn syrup and high fructose starch syrup.

[0223] Em uma outra modalidade, o adoçante é eritritol.[0223] In another embodiment, the sweetener is erythritol.

[0224] Em mais outra modalidade, o adoçante é uma açúcar raro. Os açúcares raros adequados incluem, porém sem limitação, D-alose, D-psicose, D-ribose, D-tagatose, L-glicose, L- fucose, L-arabinose, D-turanose, D-leucrose e combinações dos mesmos.[0224] In yet another modality, the sweetener is a rare sugar. Suitable rare sugars include, but are not limited to, D-alose, D-psychosis, D-ribose, D-tagatose, L-glucose, L-fucose, L-arabinose, D-turanosis, D-leukrose and combinations thereof.

[0225] É contemplado que um adoçante pode ser usado sozinho ou em combinação com outros adoçantes.[0225] It is contemplated that a sweetener can be used alone or in combination with other sweeteners.

[0226] Em uma modalidade, o açúcar raro é D-alose. Em uma modalidade mais particular, D-alose está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10% em peso, como, por exemplo, de cerca de 2% a cerca de 8%.[0226] In one embodiment, the rare sugar is D-alose. In a more particular embodiment, D-alose is present in the beverage in an amount of about 0.5% to about 10% by weight, such as, for example, from about 2% to about 8%.

[0227] Em uma outra modalidade, o açúcar raro é D-psicose. Em uma modalidade mais particular, D-psicose está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10% em peso, como, por exemplo, a partir de cerca de 2% a cerca de 8%.[0227] In another embodiment, the rare sugar is D-psychosis. In a more particular embodiment, D-psychosis is present in the beverage in an amount of about 0.5% to about 10% by weight, such as, for example, from about 2% to about 8%.

[0228] Em mais outra modalidade, o açúcar raro é D-ribose. Em uma modalidade mais particular, D-ribose está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10% em peso, como, por exemplo, a partir de cerca de 2% a cerca de 8%.[0228] In yet another modality, the rare sugar is D-ribose. In a more particular embodiment, D-ribose is present in the beverage in an amount of about 0.5% to about 10% by weight, such as, for example, from about 2% to about 8%.

[0229] Em ainda outra modalidade, o açúcar raro é D-tagatose. Em uma modalidade mais particular, D-tagatose está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10% em peso, como, por exemplo, a partir de cerca de 2% a cerca de 8%.[0229] In yet another modality, the rare sugar is D-tagatose. In a more particular embodiment, D-tagatose is present in the beverage in an amount of about 0.5% to about 10% by weight, such as, for example, from about 2% to about 8%.

[0230] Em uma modalidade adicional, o açúcar raro é L-glicose. Em uma modalidade mais particular, L-glicose está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10% em peso, como, por exemplo, a partir de cerca de 2% a cerca de 8%.[0230] In an additional embodiment, the rare sugar is L-glucose. In a more particular embodiment, L-glucose is present in the beverage in an amount of about 0.5% to about 10% by weight, such as, for example, from about 2% to about 8%.

[0231] Em uma modalidade, o açúcar raro é L-fucose. Em uma modalidade mais particular, L-fucose está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10% em peso, como, por exemplo, a partir de cerca de 2% a cerca de 8%.[0231] In one embodiment, the rare sugar is L-fucose. In a more particular embodiment, L-fucose is present in the beverage in an amount of about 0.5% to about 10% by weight, such as, for example, from about 2% to about 8%.

[0232] Em uma outra modalidade, o açúcar raro é L-arabinose. Em uma modalidade mais particular, L-arabinose está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10% em peso, como, por exemplo, a partir de cerca de 2% a cerca de 8%.[0232] In another embodiment, the rare sugar is L-arabinose. In a more particular embodiment, L-arabinose is present in the beverage in an amount of about 0.5% to about 10% by weight, such as, for example, from about 2% to about 8%.

[0233] Em ainda outra modalidade, o açúcar raro é D-turanose. Em uma modalidade mais particular, D-turanose está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10% em peso, como, por exemplo, a partir de cerca de 2% a cerca de 8%.[0233] In yet another modality, the rare sugar is D-turanosis. In a more particular embodiment, D-turanosis is present in the beverage in an amount of about 0.5% to about 10% by weight, such as, for example, from about 2% to about 8%.

[0234] Em ainda outra modalidade, o açúcar raro é D-leucrose. Em uma modalidade mais particular, D-leucrose está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10% em peso, como, por exemplo, a partir de cerca de 2% a cerca de 8%.[0234] In yet another modality, the rare sugar is D-leukrose. In a more particular embodiment, D-leukrose is present in the beverage in an amount of about 0.5% to about 10% by weight, such as, for example, from about 2% to about 8%.

[0235] A adição do intensificador de doçura a uma concentração em ou abaixo se seu limiar de reconhecimento de doçura aumenta a equivalência de sacarose detectada da bebida que compreende o adoçante e o intensificador de doçura em comparação com uma bebida correspondente na ausência do intensificador de doçura.[0235] The addition of the sweetener intensifier to a concentration at or below if its sweetness recognition threshold increases the sucrose equivalence detected of the drink comprising the sweetener and sweetener intensifier compared to a corresponding drink in the absence of the sweetener intensifier. sweetness.

Ademais, a doçura pode ser aumentada em uma quantidade maior que a doçura detectável de uma solução que contém a mesma concentração do pelo menos um intensificador de doçura na ausência de qualquer adoçante.In addition, sweetness can be increased by an amount greater than the detectable sweetness of a solution that contains the same concentration as at least one sweetener enhancer in the absence of any sweetener.

[0236] Consequentemente, a presente invenção também fornece um método para intensificar a doçura de uma bebida que compreende um adoçante que compreende fornecer uma bebida que compreende um adoçante e adicionar um intensificador de doçura selecionado a partir de esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA ), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM ou uma combinação dos mesmos, em que esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM estão presentes em uma concentração em ou abaixo de seus limiares de reconhecimento de doçura.[0236] Consequently, the present invention also provides a method for enhancing the sweetness of a beverage that comprises a sweetener that comprises providing a beverage that comprises a sweetener and adding a sweetener enhancer selected from steviolmonoside A, steviolbioside, steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C, rebaudioside E, rebaudioside E2, rebaudioside E3 and / or rebaudioside AM or a combination thereof, where steviolmonide A, steviolbioside, steviolbioside, steviolides, B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C, rebaudioside E, rebaudioside E2, rebaudioside E3 and / or rebaudioside AM are present in a concentration at or below their sweetness recognition thresholds.

[0237] A adição de esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM em uma concentração em ou abaixo do limiar de reconhecimento de doçura a uma bebida que contém um adoçante pode aumentar a equivalência de sacarose detectada a partir de cerca de 1,0% a cerca de 5,0%, como, por exemplo, cerca de 1,0%, cerca de 1,5%, cerca de 2,0%, cerca de 2,5%, cerca de 3,0%, cerca de 3,5%, cerca de 4,0%, cerca de 4,5% ou cerca de 5,0%.[0237] The addition of steviolmonoside A, steviolbioside, steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C, rebaudioside E, rebaudioside E3 and rebaudioside in an E3 concentration and / or rebaudioside in an E3 and / or rebaudioside in E3 and / or rebaudioside in an E3 and / or rebaudioside in E3 and / or rebaudioside in an E3 concentration and / or rebaudioside in E3 and / or rebaudioside in E3 and / or rebaudioside in E3 and / or rebaudioside in E3 and / or rebaudioside in E3 and / or rebaudioside in E3 and / or rebaudioside in E3 and / or rebaudioside concentration at or below the sweetness recognition threshold for a drink containing a sweetener can increase the sucrose equivalence detected from about 1.0% to about 5.0%, for example, about 1.0 %, about 1.5%, about 2.0%, about 2.5%, about 3.0%, about 3.5%, about 4.0%, about 4.5% or about 5.0%.

[0238] Os exemplos a seguir ilustram as modalidades preferenciais da invenção para a preparação do glicosídeo (ou glicosídeos) de esteviol alvo altamente purificado, particularmente esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM. Será entendido que a invenção não é limitada aos materiais, proporções, condições e procedimentos apresentados nos exemplos, que são apenas ilustrativos.[0238] The following examples illustrate the preferred embodiments of the invention for the preparation of the highly purified target steviol glycoside (or glycosides), particularly steviolmonoside A, steviolbioside A, steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside, stevioside A (rebaudioside KA) , stevioside B, stevioside C, rebaudioside E, rebaudioside E2, rebaudioside E3 and / or rebaudioside AM. It will be understood that the invention is not limited to the materials, proportions, conditions and procedures presented in the examples, which are illustrative only.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 Sequências de proteína de enzimas geneticamente modificadas usadas no processo biocatalítico SEQ ID 1: >SuSy_At, variante PM1-54-2-E05 (sacarose sintase geneticamente modificada; fonte de gene WT: Arabidopsis thaliana)EXAMPLES EXAMPLE 1 Genetically modified enzyme protein sequences used in the biocatalytic process SEQ ID 1:> SuSy_At, variant PM1-54-2-E05 (genetically modified sucrose synthase; WT gene source: Arabidopsis thaliana)

MANAERMITRVHSQRERLNETLVSERNEVLALLSRVEAKGKGILQQNQIIMANAERMITRVHSQRERLNETLVSERNEVLALLSRVEAKGKGILQQNQII AEFEALPEQTRKKLEGGPFFDLLKSTQEAIVLPPWVALAVRPRPGVWEYLAEFEALPEQTRKKLEGGPFFDLLKSTQEAIVLPPWVALAVRPRPGVWEYL RVNLHALVVEELQPAEFLHFKEELVDGVKNGNFTLELDFEPFNASIPRPTRVNLHALVVEELQPAEFLHFKEELVDGVKNGNFTLELDFEPFNASIPRPT LHKYIGNGVDFLNRHLSAKLFHDKESLLPLLDFLRLHSHQGKNLMLSEKILHKYIGNGVDFLNRHLSAKLFHDKESLLPLLDFLRLHSHQGKNLMLSEKI QNLNTLQHTLRKAEEYLAELKSETLYEEFEAKFEEIGLERGWGDNAERVLQNLNTLQHTLRKAEEYLAELKSETLYEEFEAKFEEIGLERGWGDNAERVL DMIRLLLDLLEAPDPSTLETFLGRVPMVFNVVILSPHGYFAQDNVLGYPDDMIRLLLDLLEAPDPSTLETFLGRVPMVFNVVILSPHGYFAQDNVLGYPD TGGQVVYILDQVRALEIEMLQRIKQQGLNIKPRILILTRLLPDAVGTTCGTGGQVVYILDQVRALEIEMLQRIKQQGLNIKPRILILTRLLPDAVGTTCG ERLERVYDSEYCDILRVPFRTEKGIVRKWISRFEVWPYLETYTEDAAVELERLERVYDSEYCDILRVPFRTEKGIVRKWISRFEVWPYLETYTEDAAVEL SKELNGKPDLIIGNYSDGNLVASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPDSDISKELNGKPDLIIGNYSDGNLVASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPDSDI YWKKLDDKYHFSCQFTADIFAMNHTDFIITSTFQEIAGSKETVGQYESHTYWKKLDDKYHFSCQFTADIFAMNHTDFIITSTFQEIAGSKETVGQYESHT AFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMSIYFPYTEEKRRLTKFHSEIAFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMSIYFPYTEEKRRLTKFHSEI EELLYSDVENDEHLCVLKDKKKPILFTMARLDRVKNLSGLVEWYGKNTRLEELLYSDVENDEHLCVLKDKKKPILFTMARLDRVKNLSGLVEWYGKNTRL RELVNLVVVGGDRRKESKDNEEKAEMKKYDLIEEYKLNGQFRWISSQMDRELVNLVVVGGDRRKESKDNEEKAEMKKYDLIEEYKLNGQFRWISSQMD RVRNGELYRYICDTKGAFVQPALYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCKGGPARVRNGELYRYICDTKGAFVQPALYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCKGGPA EIIVHGKSGFHIDPYHGDQAADLLADFFTKCKEDPSHWDEISKGGLQRIEEIIVHGKSGFHIDPYHGDQAADLLADFFTKCKEDPSHWDEISKGGLQRIE EKYTWQIYSQRLLTLTGVYGFWKHVSNLDRLEHRRYLEMFYALKYRPLAQEKYTWQIYSQRLLTLTGVYGFWKHVSNLDRLEHRRYLEMFYALKYRPLAQ

AVPLAQDD SEQ ID 2: >variante UGTSl2 0234 (glicosiltransferase geneticamente modificada; fonte de gene WT: Solanum lycopersicum)AVPLAQDD SEQ ID 2:> UGTSl2 0234 variant (genetically modified glycosyltransferase; WT gene source: Solanum lycopersicum)

MATNLRVLMFPWLAYGHISPFLNIAKQLADRGFLIYLCSTRINLESIIKKMATNLRVLMFPWLAYGHISPFLNIAKQLADRGFLIYLCSTRINLESIIKK IPEKYADSIHLIELQLPELPELPPHYHTTNGLPPHLNPTLHKALKMSKPNIPEKYADSIHLIELQLPELPELPPHYHTTNGLPPHLNPTLHKALKMSKPN FSRILQNLKPDLLIYDVLQPWAEHVANEQGIPAGKLLVSCAAVFSYFFSFFSRILQNLKPDLLIYDVLQPWAEHVANEQGIPAGKLLVSCAAVFSYFFSF RKNPGVEFPFPAIHLPEVEKVKIREILAKEPEEGGRLDEGNKQMMLMCTSRKNPGVEFPFPAIHLPEVEKVKIREILAKEPEEGGRLDEGNKQMMLMCTS RTIEAKYIDYCTELCNWKVVPVGPPFQDLITNDADNKELIDWLGTKPENSRTIEAKYIDYCTELCNWKVVPVGPPFQDLITNDADNKELIDWLGTKPENS TVFVSFGSEYFLSKEDMEEIAFALEASNVNFIWVVRFPKGEERNLEDALPTVFVSFGSEYFLSKEDMEEIAFALEASNVNFIWVVRFPKGEERNLEDALP EGFLERIGERGRVLDKFAPQPRILNHPSTGGFISHCGWNSVMESIDFGVPEGFLERIGERGRVLDKFAPQPRILNHPSTGGFISHCGWNSVMESIDFGVP IIAMPIHNDQPINAKLMVELGVAVEIVRDDDGKIHRGEIAEALKSVVTGEIIAMPIHNDQPINAKLMVELGVAVEIVRDDDGKIHRGEIAEALKSVVTGE

TGEILRAKVREISKNLKSIRDEEMDAVAEELIQLCRNSNKSK SEQ ID 3: >UGT76G1 variante 0042 (glicosiltransferase geneticamente modificada; fonte de gene WT: Stevia rebaudiana)TGEILRAKVREISKNLKSIRDEEMDAVAEELIQLCRNSNKSK SEQ ID 3:> UGT76G1 variant 0042 (genetically modified glycosyltransferase; gene source WT: Stevia rebaudiana)

MENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFAITILHTNFNKPKTSMENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFAITILHTNFNKPKTS NYPHNYPH FTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEED EEVSCEEVSC LITDALWYFAQDVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTLITDALWYFAQDVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKT RLEEQASRLEEQAS GFPMLKVKDIKSAYSNWQIGKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIRGFPMLKVKDIKSAYSNWQIGKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIR EIPAPEIPAP SFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFEWLDQQAPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLESFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFEWLDQQAPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLE IARGLVIARGLV DSGQSFLVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGKIVKWVPQQEVLAHPAIGAFDSGQSFLVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGKIVKWVPQQEVLAHPAIGAF WTHSGWNWTHSGWN STLESVCEGVPMIFSSFGGDQPLNARYMSDVLRVGVYLENGWERGEVVNAIRSTLESVCEGVPMIFSSFGGDQPLNARYMSDVLRVGVYLENGWERGEVVNAIR RVMVDEEGRVMVDEEG

EYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSL EXEMPLO 2 Expressão e formulação da variante SuSy_At da SEQ ID 1EYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSL EXAMPLE 2 Expression and formulation of the SuSy_At variant of SEQ ID 1

[0239] O gene que codifica a variante SuSy_At da SEQ ID 1 (EXEMPLO 1) foi clonado no vetor de expressão pLElAl7 (derivado de pRSF-lb, Novagen). O plasmídeo resultante foi usado para a transformação de células de E.coli BL21(DE3).[0239] The gene encoding the SuSy_At variant of SEQ ID 1 (EXAMPLE 1) was cloned into the pLElAl7 expression vector (derived from pRSF-lb, Novagen). The resulting plasmid was used for the transformation of E.coli BL21 (DE3) cells.

[0240] As células foram cultivadas em meio ZYM505 (F. William Studier, Protein Expression and Purification 41 (2005) 207 a 234) suplementado com canamicina (50 mg/l) a 37 °C. A expressão dos genes foi induzida na fase logarítmica por IPTG (0,2 mM) e realizada a 30 °C e 200 rpm durante 16 a 18 horas.[0240] The cells were grown in ZYM505 medium (F. William Studier, Protein Expression and Purification 41 (2005) 207 to 234) supplemented with kanamycin (50 mg / l) at 37 ° C. Gene expression was induced in the logarithmic phase by IPTG (0.2 mM) and performed at 30 ° C and 200 rpm for 16 to 18 hours.

[0241] As células foram coletadas por centrifugação (3.220 x g, 20 min, 4 °C) e ressuspensas a uma densidade óptica de 200 (medida a 600 nm (OD600)) com tampão de lise celular (Tris-HCl a 100 nM pH 7,0; MgCl2 a 2 mM, DNA nuclease a 20 U/ml, lisozima a 0,5 mg/ml). As células foram, então, rompidas por sonicação e extratos brutos foram separados de restos de células por centrifugação (18.000 x g. 40 min, 4 °C).[0241] The cells were collected by centrifugation (3,220 xg, 20 min, 4 ° C) and resuspended at an optical density of 200 (measured at 600 nm (OD600)) with cell lysis buffer (Tris-HCl at 100 nM pH 7.0; 2 mM MgCl2, 20 U / ml DNA nuclease, 0.5 mg / ml lysozyme). The cells were then disrupted by sonication and crude extracts were separated from cell debris by centrifugation (18,000 x g. 40 min, 4 ° C).

O sobrenadante foi esterilizado por filtração através de um filtro de 0,2 µm e diluído 50:50 com água destilada, resultando em uma preparação ativa enzimática.The supernatant was sterilized by filtration through a 0.2 µm filter and diluted 50:50 with distilled water, resulting in an active enzymatic preparation.

[0242] Para preparações ativas enzimáticas de SuSy_At, a atividade em unidades é definida conforme exposto a seguir: 1 mU de SuSy_At transforma 1 nmol de sacarose em frutose em 1 minuto. As condições de reação para o ensaio são 30 °C, tampão de fosfato de potássio a 50 mM pH 7,0, sacarose a 400 mM em t0, MgCl2 a 3 mM e difosfato de uridina a 15 mM (UDP).[0242] For active enzymatic preparations of SuSy_At, the activity in units is defined as shown below: 1 mU of SuSy_At transforms 1 nmol of sucrose into fructose in 1 minute. The reaction conditions for the test are 30 ° C, 50 mM potassium phosphate buffer pH 7.0, 400 mM sucrose in t0, 3 mM MgCl2 and 15 mM uridine diphosphate (UDP).

EXEMPLO 3 Expressão e formulação de variante UGTS12 da SEQ ID 2EXAMPLE 3 UGTS12 variant expression and formulation of SEQ ID 2

[0243] O gene que codifica a variante UGTS12 da SEQ ID 2 (EXEMPLO 1) foi clonado no vetor de expressão pLElA17 (derivado de pRSF-lb, Novagen). O plasmídeo resultante foi usado para a transformação de células de E.coli BL21(DE3).[0243] The gene encoding the UGTS12 variant of SEQ ID 2 (EXAMPLE 1) was cloned into the expression vector pLElA17 (derived from pRSF-lb, Novagen). The resulting plasmid was used for the transformation of E.coli BL21 (DE3) cells.

[0244] As células foram cultivadas em meio ZYM505 (F. William Studier, Protein Expression and Purification 41 (2005) 207 a 234) suplementado com canamicina (50 mg/l) a 37 °C. A expressão dos genes foi induzida na fase logarítmica por IPTG (0,1 mM) e realizada a 30 °C e 200 rpm durante 16 a 18 horas.[0244] The cells were cultured in ZYM505 medium (F. William Studier, Protein Expression and Purification 41 (2005) 207 to 234) supplemented with kanamycin (50 mg / l) at 37 ° C. Gene expression was induced in the logarithmic phase by IPTG (0.1 mM) and performed at 30 ° C and 200 rpm for 16 to 18 hours.

[0245] As células foram coletadas por centrifugação (3.220 x g, 20 min, 4 °C) e ressuspensas a uma densidade óptica de 200 (medida a 600 nm (OD600)) com tampão de lise celular (Tris-HCl a 100 mM pH 7,0; MgCl2 a 2 mM, DNA nuclease a 20 U/ml, lisozima a 0,5 mg/ml). As células foram, então, rompidas por sonicação e extratos brutos foram separados de restos de células por centrifugação (18.000 x g. 40 min, 4 °C). O sobrenadante foi esterilizado por filtração através de um filtro de 0,2 µm e diluído 50:50 com solução de sacarose a 1 M, resultando em uma preparação ativa enzimática.[0245] The cells were collected by centrifugation (3,220 xg, 20 min, 4 ° C) and resuspended at an optical density of 200 (measured at 600 nm (OD600)) with cell lysis buffer (Tris-HCl at 100 mM pH 7.0; 2 mM MgCl2, 20 U / ml DNA nuclease, 0.5 mg / ml lysozyme). The cells were then disrupted by sonication and crude extracts were separated from cell debris by centrifugation (18,000 x g. 40 min, 4 ° C). The supernatant was sterilized by filtration through a 0.2 µm filter and diluted 50:50 with 1 M sucrose solution, resulting in an active enzymatic preparation.

[0246] Para preparações ativas enzimáticas de UGTS12, a atividade em unidades é definida conforme exposto a seguir: 1 mU de UGTS12 transforma 1 nmol de rebaudiosídeo A (RebH) em rebaudiosídeo D (Reb D) em 1 minuto. As condições de reação para o ensaio são 30 °C, tampão de fosfato de potássio a 50 mM pH 7,0, RebA a 10 mM em t0, sacarose a 500 mM, MgCl2 a 3 mM, difosfato de uridina a 0,25 mM (UDP) e 3 U/ml de SuSy_At.[0246] For active enzymatic preparations of UGTS12, the activity in units is defined as shown below: 1 mU of UGTS12 transforms 1 nmol of rebaudioside A (RebH) into rebaudioside D (Reb D) in 1 minute. The reaction conditions for the test are 30 ° C, 50 mM potassium phosphate buffer pH 7.0, 10 mM RebA in t0, 500 mM sucrose, 3 mM MgCl2, 0.25 mM uridine diphosphate (UDP) and 3 U / ml of SuSy_At.

EXEMPLO 4 Expressão e formulação de variante UGT76G1 da SEQ ID 3EXAMPLE 4 Expression and formulation of variant UGT76G1 of SEQ ID 3

[0247] O gene que codifica a variante UGT76G1 da SEQ ID 3 (EXEMPLO 1) foi clonado no vetor de expressão pLElAl7 (derivado de pRSF-lb, Novagen). O plasmídeo resultante foi usado para a transformação de células de E.coli BL21(DE3).[0247] The gene encoding the UGT76G1 variant of SEQ ID 3 (EXAMPLE 1) was cloned into the pLElAl7 expression vector (derived from pRSF-lb, Novagen). The resulting plasmid was used for the transformation of E.coli BL21 (DE3) cells.

[0248] As células foram cultivadas em meio ZYM505 (F. William Studier, Protein Expression and Purification 41 (2005) 207 a 234) suplementado com canamicina (50 mg/l) a 37 °C. A expressão dos genes foi induzida na fase logarítmica por IPTG (0,1 mM) e realizada a 30 °C e 200 rpm durante 16 a 18 horas.[0248] Cells were grown in ZYM505 medium (F. William Studier, Protein Expression and Purification 41 (2005) 207 to 234) supplemented with kanamycin (50 mg / l) at 37 ° C. Gene expression was induced in the logarithmic phase by IPTG (0.1 mM) and performed at 30 ° C and 200 rpm for 16 to 18 hours.

[0249] As células foram coletadas por centrifugação (3.220 x g, 20 min, 4 °C) e ressuspensas a uma densidade óptica de 200 (medida a 600 nm (OD600)) com tampão de lise celular (Tris-HCl a 100 mM pH 7,0; MgCl2 a 2 mM, DNA nuclease a 20 U/ml, lisozima a 0,5 mg/ml). As células foram, então, rompidas por sonicação e extratos brutos foram separados de restos de células por centrifugação (18.000 x g. 40 min, 4 °C). O sobrenadante foi esterilizado por filtração através de um filtro de 0,2 µm e diluído 50:50 com solução de sacarose a 1 M, resultando em uma preparação ativa enzimática.[0249] The cells were collected by centrifugation (3,220 xg, 20 min, 4 ° C) and resuspended at an optical density of 200 (measured at 600 nm (OD600)) with cell lysis buffer (Tris-HCl at 100 mM pH 7.0; 2 mM MgCl2, 20 U / ml DNA nuclease, 0.5 mg / ml lysozyme). The cells were then disrupted by sonication and crude extracts were separated from cell debris by centrifugation (18,000 x g. 40 min, 4 ° C). The supernatant was sterilized by filtration through a 0.2 µm filter and diluted 50:50 with 1 M sucrose solution, resulting in an active enzymatic preparation.

[0250] Para preparações ativas enzimáticas de UGT76G1, a atividade em unidades é definida conforme exposto a seguir: 1 mU de UGT76G1 transforma 1 nmol de rebaudiosídeo D (Reb D) em rebaudiosídeo (Reb M) em 1 minuto. As condições de reação para o ensaio são 30 °C, tampão de fosfato de potássio a 50 mM pH 7,0, RebA a 10 mM em t0, sacarose a 500 mM, MgCl2 a 3 mM, difosfato de uridina a 0,25 mM (UDP) e 3 U/ml de SuSy_At.[0250] For active enzymatic preparations of UGT76G1, the activity in units is defined as shown below: 1 mU of UGT76G1 transforms 1 nmol of rebaudioside D (Reb D) into rebaudioside (Reb M) in 1 minute. The reaction conditions for the test are 30 ° C, 50 mM potassium phosphate buffer pH 7.0, 10 mM RebA in t0, 500 mM sucrose, 3 mM MgCl2, 0.25 mM uridine diphosphate (UDP) and 3 U / ml of SuSy_At.

EXEMPLO 5 Síntese de rebaudiosídeo AM a partir de esteviosídeo em uma reação em uma única etapa, adicionando-se UGTS12, SuSy_At e UGT76G1 ao mesmo tempoEXAMPLE 5 Synthesis of AM rebaudioside from stevioside in a single step reaction, adding UGTS12, SuSy_At and UGT76G1 at the same time

[0251] O rebaudiosídeo AM (reb AM) foi sintetizado diretamente a partir de esteviosídeo em uma reação em uma única etapa (Figura 3), com o uso das três enzimas (consultar EXEMPLOS 1, 2, 3 e 4): UGTSl2 (variante da SEQ ID 2), SuSy_At (variante da SEQ ID 1) e UGT76G1 (variante da SEQ ID 3). A solução de reação final continha 105 U/l de UGTSl2, 405 U/l de SuSy_At, 3 U/l de UGT76G1, esteviosídeo a 5 mM, difosfato de uridina a 0,25 mM (UDP), sacarose a 1 M, MgCl2 e tampão de fosfato de potássio a 4 mM (pH 6,6). Primeiramente, 207 ml de água destilada foram misturados com 0,24 g de MgCl2•6H2O, 103 g de sacarose, 9,9 ml de tampão de fosfato de potássio a 1,5 M (pH 6,6) e 15 g de esteviosídeo. Após a dissolução dos componentes, a temperatura foi ajustada a 45 °C e UGTSl2, SuSy_At, UGT76G1 e 39 mg de UDP foram adicionados. A mistura de reação foi incubada em agitador a 45 °C durante 24 h. 39 mg de UDP adicional foram adicionais em 8 h e 18 horas. O teor de reb AM, reb E, esteviosídeo, reb M, reb B, esteviolbiosídeo e reb I em vários pontos no tempo foi analisado por HPLC.[0251] The rebaudioside AM (reb AM) was synthesized directly from stevioside in a single step reaction (Figure 3), using the three enzymes (see EXAMPLES 1, 2, 3 and 4): UGTSl2 (variant of SEQ ID 2), SuSy_At (variant of SEQ ID 1) and UGT76G1 (variant of SEQ ID 3). The final reaction solution contained 105 U / l UGTS12, 405 U / l SuSy_At, 3 U / l UGT76G1, 5 mM stevioside, 0.25 mM uridine diphosphate (UDP), 1 M sucrose, MgCl2 and 4 mM potassium phosphate buffer (pH 6.6). First, 207 ml of distilled water were mixed with 0.24 g of MgCl2 • 6H2O, 103 g of sucrose, 9.9 ml of 1.5 M potassium phosphate buffer (pH 6.6) and 15 g of stevioside . After dissolving the components, the temperature was adjusted to 45 ° C and UGTSl2, SuSy_At, UGT76G1 and 39 mg of UDP were added. The reaction mixture was incubated on a shaker at 45 ° C for 24 h. 39 mg of additional UDP was added at 8 h and 18 hours. The content of reb AM, reb E, stevioside, reb M, reb B, steviolbioside and reb I at various points in time was analyzed by HPLC.

[0252] Para a análise, as amostras de biotransformação foram inativadas mediante o ajuste da mistura de reação para o pH 5,5 com o uso de 17% de H3PO4 e, então, fervidas durante 10 minutos. As amostras resultantes foram filtradas, os filtrados foram diluídos 10 vezes e usados como amostras para análise de HPLC. O ensaio de HPLC foi realizado no sistema de HPLC Agilent HP 1200, compreendido de uma bomba, um termostato de coluna, uma auto-amostrador, um detector de UV com capacidade para correção de fundo e um sistema de aquisição de dados. Os analitos foram separados com o uso de Agilent Poroshell 120 SB-C18, 4,6 mm x 150 mm, 2,7 µm a 40 °C. A fase móvel consistiu em duas pré-misturas: - pré-mistura 1 que contém 75% de tampão de fosfato a 10 mM (pH 2,6) e 25% de acetonitrila, e - pré-mistura 2 que contém 68% de tampão de fosfato a 10 mM (pH 2,6) e 32%[0252] For the analysis, the biotransformation samples were inactivated by adjusting the reaction mixture to pH 5.5 with the use of 17% H3PO4 and then boiled for 10 minutes. The resulting samples were filtered, the filtrates were diluted 10 times and used as samples for HPLC analysis. The HPLC test was performed on the Agilent HP 1200 HPLC system, comprising a pump, a column thermostat, an auto-sampler, a UV detector with background correction capability and a data acquisition system. The analytes were separated using Agilent Poroshell 120 SB-C18, 4.6 mm x 150 mm, 2.7 µm at 40 ° C. The mobile phase consisted of two premixes: - premix 1 containing 75% 10 mM phosphate buffer (pH 2.6) and 25% acetonitrile, and - premix 2 containing 68% buffer phosphate 10 mM (pH 2.6) and 32%

de acetonitrila.acetonitrile.

[0253] O gradiente de eluição iniciou com a pré-mistura 1, alterou para a pré-mistura 2 para 50% em 12,5 minutos, alterou para a pré-mistura 2 para 100% em 13 minutos. O tempo de execução total foi de 45 minutos. A temperatura da coluna foi mantida a 40 °C. O volume de injeção foi de 5 µl. As espécies de rebaudiosídeo foram detectadas por UV em 210 nm.[0253] The elution gradient started with premix 1, changed to premix 2 to 50% in 12.5 minutes, changed to premix 2 to 100% in 13 minutes. The total run time was 45 minutes. The column temperature was maintained at 40 ° C. The injection volume was 5 µl. The rebaudioside species were detected by UV at 210 nm.

[0254] A Tabela 3 mostra para cada ponto no tempo a conversão de esteviosídeo em espécies de rebaudiosídeo identificadas (porcentagem de área). Os cromatogramas de esteviosídeo e da mistura de reação em 24 horas são mostrados na Figura 5 e Figura 6, respectivamente. Aqueles versados na técnica irão observar que os tempos de retenção podem ocasionalmente variar com alterações em solvente e/ou equipamento.[0254] Table 3 shows for each point in time the conversion of stevioside into identified rebaudioside species (percentage of area). The chromatograms of stevioside and the 24 hour reaction mixture are shown in Figure 5 and Figure 6, respectively. Those skilled in the art will note that retention times may occasionally vary with changes in solvent and / or equipment.

Tabela 3 Biotransformação de esteviosídeo em reb AM Tempo, h % de conversão a partir de esteviosídeo Reb E Reb AM Reb M Reb I Esteviosídeo Reb B Esteviolbiosídeo 0 0 0 0 0 100 0 0 6 1,9 35,9 1,3 1,7 58,7 0,0 0,4 18 0,9 96,7 1,3 0,6 0,0 0,0 0,4 24 0,3 96,4 2,1 0,7 0,0 0,2 0,4 EXEMPLO 6 Síntese de rebaudiosídeo AM a partir de rebaudiosídeo E em uma reação em uma única etapa, SuSy_At e UGT76G1 ao mesmo tempoTable 3 Biotransformation of stevioside into reb AM Time, h% conversion from stevioside Reb E Reb AM Reb M Reb I Stevioside Reb B Steviolbioside 0 0 0 0 0 100 0 0 6 1.9 35.9 1.3 1, 7 58.7 0.0 0.4 18 0.9 96.7 1.3 0.6 0.0 0.0 0.4 24 0.3 96.4 2.1 0.7 0.0 0, 2 0.4 EXAMPLE 6 Synthesis of AM rebaudioside from rebaudioside E in a single step reaction, SuSy_At and UGT76G1 at the same time

[0255] O rebaudiosídeo AM (reb AM) foi sintetizado diretamente a partir de rebaudiosídeo E (reb E) em uma reação em uma única etapa (Figura 4), com o uso das duas enzimas (consultar EXEMPLOS 1, 2 e 4): SuSy_At (variante da SEQ ID 1) e UGT76G1 (variante da SEQ ID 3). A solução de reação final continha 405 U/l de SuSy_At, 3 U/l de UGT76G1, reb E a 5 mM, difosfato de uridina a 0,25 mM (UDP), sacarose a 1 M, MgCl2•6H2O e tampão de fosfato de potássio a 4 mM (pH 6,6). Primeiramente, 37 ml de água destilada foram misturados com 40,3 mg de MgCl2, 17,12 g de sacarose, 1,65 ml de tampão de fosfato de potássio a 1,5 M (pH 6,6) e 5,04 g de reb E. Após a dissolução dos componentes, a temperatura foi ajustada para 45 °C e SuSy_At, UGT76G1 e 6,5 mg de UDP foram adicionados. A mistura de reação foi incubada em agitador a 45 °C durante 24 h. 6,5 mg de UDP adicional foram adicionais em 8 h e 18 horas. O teor de reb AM, reb E, esteviosídeo, reb A, reb M, reb B e esteviolbiosídeo em vários pontos no tempo foi analisado por HPLC.[0255] The rebaudioside AM (reb AM) was synthesized directly from rebaudioside E (reb E) in a single step reaction (Figure 4), using the two enzymes (see EXAMPLES 1, 2 and 4): SuSy_At (variant of SEQ ID 1) and UGT76G1 (variant of SEQ ID 3). The final reaction solution contained 405 U / l of SuSy_At, 3 U / l of UGT76G1, 5 mM reb E, 0.25 mM uridine diphosphate (UDP), 1 M sucrose, MgCl2 • 6H2O and phosphate buffer 4 mM potassium (pH 6.6). First, 37 ml of distilled water were mixed with 40.3 mg of MgCl2, 17.12 g of sucrose, 1.65 ml of 1.5 M potassium phosphate buffer (pH 6.6) and 5.04 g of reb E. After the components dissolved, the temperature was adjusted to 45 ° C and SuSy_At, UGT76G1 and 6.5 mg of UDP were added. The reaction mixture was incubated on a shaker at 45 ° C for 24 h. 6.5 mg of additional UDP was added at 8 h and 18 hours. The content of reb AM, reb E, stevioside, reb A, reb M, reb B and steviolbioside at various points in time was analyzed by HPLC.

[0256] Para a análise, as amostras de biotransformação foram inativadas mediante o ajuste da mistura de reação para o pH 5,5 com o uso de 17% de H3PO4 e, então, fervidas durante 10 minutos. As amostras resultantes foram filtradas, os filtrados foram diluídos 10 vezes e usados como amostras para análise de HPLC. O ensaio de HPLC foi realizado no sistema de HPLC Agilent HP 1200, compreendido de uma bomba, um termostato de coluna, uma auto-amostrador, um detector de UV com capacidade para correção de fundo e um sistema de aquisição de dados. Os analitos foram separados com o uso de Agilent Poroshell 120 SB-C18, 4,6 mm x 150 mm, 2,7 µm a 40 °C. A fase móvel consistiu em duas pré-misturas: - pré-mistura 1 que contém 75% de tampão de fosfato a 10 mM (pH 2,6) e 25% de acetonitrila, e pré-mistura 2 que contém 68% de tampão de fosfato a 10 mM (pH 2,6) e 32% de acetonitrila.[0256] For the analysis, the biotransformation samples were inactivated by adjusting the reaction mixture to pH 5.5 with the use of 17% H3PO4 and then boiled for 10 minutes. The resulting samples were filtered, the filtrates were diluted 10 times and used as samples for HPLC analysis. The HPLC test was performed on the Agilent HP 1200 HPLC system, comprising a pump, a column thermostat, an auto-sampler, a UV detector with background correction capability and a data acquisition system. The analytes were separated using Agilent Poroshell 120 SB-C18, 4.6 mm x 150 mm, 2.7 µm at 40 ° C. The mobile phase consisted of two premixes: - premix 1 containing 75% 10 mM phosphate buffer (pH 2.6) and 25% acetonitrile, and premix 2 containing 68% buffer 10 mM phosphate (pH 2.6) and 32% acetonitrile.

[0257] O gradiente de eluição iniciou com a pré-mistura 1, alterou para a pré-mistura 2 para 50% em 12,5 minutos, alterou para a pré-mistura 2 para 100% em 13 minutos. O tempo de execução total foi de 45 minutos. A temperatura da coluna foi mantida a 40 °C. O volume de injeção foi de 5 µl. As espécies de rebaudiosídeo foram detectadas por UV em 210 nm.[0257] The elution gradient started with premix 1, changed to premix 2 to 50% in 12.5 minutes, changed to premix 2 to 100% in 13 minutes. The total run time was 45 minutes. The column temperature was maintained at 40 ° C. The injection volume was 5 µl. The rebaudioside species were detected by UV at 210 nm.

[0258] A Tabela 4 mostra para cada ponto no tempo a conversão de reb E em espécies de rebaudiosídeo identificadas (porcentagem de área). Os cromatogramas de reb E e da mistura de reação em 24 horas são mostrados na Figura 7 e Figura 8, respectivamente. Aqueles versados na técnica irão observar que os tempos de retenção podem ocasionalmente variar com alterações em solvente e/ou equipamento.[0258] Table 4 shows the conversion of reb E into identified rebaudioside species (percentage of area) for each point in time. The chromatograms of reb E and the 24 hour reaction mixture are shown in Figure 7 and Figure 8, respectively. Those skilled in the art will note that retention times may occasionally vary with changes in solvent and / or equipment.

Tabela 4 Biotransformação de reb E em reb AM Tempo, h % de conversão a partir de Reb E Reb E Reb AM Reb M Reb I Esteviosídeo Reb B Esteviolbiosídeo 0 99,46 0 0 0,54 0 0 0 4 40,75 57,92 0 0,59 0 0,73 0 7 24,79 73,92 0 0,58 0 0,71 0 24 4,38 94,33 0 0,59 0 0,70 0 EXEMPLO 7 Purificação de rebaudiosídeo AMTable 4 Biotransformation of reb E into reb AM Time, h% conversion from Reb E Reb E Reb AM Reb M Reb I Stevioside Reb B Steviolbioside 0 99.46 0 0 0.54 0 0 0 4 40.75 57, 92 0 0.59 0 0.73 0 7 24.79 73.92 0 0.58 0 0.71 0 24 4.38 94.33 0 0.59 0 0.70 0 EXAMPLE 7 Purification of rebaudioside AM

[0259] A mistura de reação do EXEMPLO 5, após 24 h, foi inativada mediante o ajuste do pH para pH 5,5 com H3PO4 e, então, fervida durante 10 minutos.[0259] The reaction mixture of EXAMPLE 5, after 24 h, was inactivated by adjusting the pH to pH 5.5 with H3PO4 and then boiled for 10 minutes.

Após a ebulição, a mistura de reação foi filtrada e diluída com água RO até o teor de sólidos de 5%. A solução diluída foi passada através da coluna de 1 l recheada com resina de adsorção macroporosa YWD03 (Cangzhou Yuanwei, China). Os glicosídeos de esteviol adsorvidos foram eluídos com 5 l de etanol a 70%. O eluato obtido foi evaporado até a secura para render 16 g de pó seco que foi dissolvido em 80 ml de metanol a 70%. A solução foi cristalizada a 20 °C durante 3 dias. Os cristais foram separados por filtração e secos em forno a vácuo a 80 °C durante 18 horas para render 10,4 g de cristais de reb AM puro com 95,92% de pureza, determinada pelo ensaio de HPLC. O cromatograma de reb AM é mostrado na Figura 9. Aqueles versados na técnica irão observar que os tempos de retenção podem ocasionalmente variar com alterações em solvente e/ou equipamento. EXEMPLO 8 Elucidação de estrutura de rebaudiosídeo AMAfter boiling, the reaction mixture was filtered and diluted with RO water to a solids content of 5%. The diluted solution was passed through the 1 l column filled with YWD03 macroporous adsorption resin (Cangzhou Yuanwei, China). The adsorbed steviol glycosides were eluted with 5 l of 70% ethanol. The eluate obtained was evaporated to dryness to yield 16 g of dry powder which was dissolved in 80 ml of 70% methanol. The solution was crystallized at 20 ° C for 3 days. The crystals were filtered off and dried in a vacuum oven at 80 ° C for 18 hours to yield 10.4 g of pure crystals of reb AM with 95.92% purity, determined by the HPLC assay. The reb AM chromatogram is shown in Figure 9. Those skilled in the art will note that retention times may occasionally vary with changes in solvent and / or equipment. EXAMPLE 8 Clarification of AM rebaudioside structure

[0260] Os experimentos de RMN foram realizados em um espectrômetro Bruker 500 MHz, com a amostra dissolvida em piridina-d5. Juntamente com os sinais a partir da amostra, os sinais a partir de piridina-d5 em δC 123,5, 135,5, 149,9 ppm e δH 7,19, 7,55, 8,71 ppm foram observados.[0260] The NMR experiments were performed on a Bruker 500 MHz spectrometer, with the sample dissolved in pyridine-d5. Along with the signals from the sample, the signals from pyridine-d5 at δC 123.5, 135.5, 149.9 ppm and δH 7.19, 7.55, 8.71 ppm were observed.

[0261] O espectro de RMN de 1H de rebaudiosídeo AM em piridina-d5 revelou a qualidade excelente da amostra (consultar a Figura 10). O HSQC (consultar a Figura 11) mostra a presença de um grupo exometileno na região de açúcar com um acoplamento de longo alcance a C-15, observável no H,H-COSY (Figura 12). Outros sinais de campo profundo dos carbonos quaternários (C-13, C-16 e C-19) são detectados pelo HMBC (Figura 13). A correlação dos sinais no HSQC, HMBC e H,H-COSY revela a presença de glicosídeo de esteviol com a seguinte estrutura de aglicona:[0261] The 1H NMR spectrum of AM rebaudioside in pyridine-d5 revealed the excellent quality of the sample (see Figure 10). HSQC (see Figure 11) shows the presence of an exomethylene group in the sugar region with a long-range coupling at C-15, observable in H, H-COZY (Figure 12). Other deep-field signals from quaternary carbons (C-13, C-16 and C-19) are detected by the HMBC (Figure 13). The correlation of signals in HSQC, HMBC and H, H-COZY reveals the presence of steviol glycoside with the following aglycone structure:

[0262] A correlação de sinais de HSQC e HMBC revela cinco sinais anoméricos. A constante de acoplamento dos prótons anoméricos de cerca de 8 Hz e dos sinais amplos de sua ligação de açúcar permite a identificação desses cinco açúcares como β-D-glicopiranosídeos.[0262] The correlation of HSQC and HMBC signals reveals five anomeric signals. The coupling constant of the anomeric protons of about 8 Hz and the broad signals of their sugar binding allows the identification of these five sugars as β-D-glycopyranosides.

[0263] A observação dos prótons anoméricos em combinação com HSQC e HMBC revela a ligação de açúcar e a correlação com aglicona. A atribuição da sequência de açúcar foi confirmada com o uso da combinação de HSQC-TOCSY (Figura 14) e HSQC.[0263] Observation of anomeric protons in combination with HSQC and HMBC reveals the binding of sugar and the correlation with aglycone. The assignment of the sugar sequence was confirmed using the combination of HSQC-TOCSY (Figure 14) and HSQC.

[0264] Os experimentos de RMN acima foram aplicados para atribuir os deslocamentos químicos dos prótons e carbonos, constantes principais de acoplamento e correlações principais de HMBC (consultar a Tabela 5).[0264] The NMR experiments above were applied to assign the chemical displacements of protons and carbons, main coupling constants and main HMBC correlations (see Table 5).

Tabela 5 Deslocamentos químicos de rebaudiosídeo AM Posição δC [ppm] δH [ppm] J [Hz] HMBC (H→C) Porção química de Aglicona 1 39,9 t 0,68 m 1,64 m 2 19,4 t 1,39 m 2,08 m 3 37,4 t 1,05 m 2,80 m 4 44,2 s - 5 57,3 d 0,95 6 21,7 t 1,90 m 2,12 m 7 41,0 t 1,26 m 1,38 mTable 5 Chemical displacements of AM rebaudioside Position δC [ppm] δH [ppm] J [Hz] HMBC (H → C) Chemical portion of Aglycone 1 39.9 t 0.68 m 1.64 m 2 19.4 t 1, 39 m 2.08 m 3 37.4 t 1.05 m 2.80 m 4 44.2 s - 5 57.3 d 0.95 6 21.7 t 1.90 m 2.12 m 7 41.0 t 1.26 m 1.38 m

8 41,9 s -8 41.9 s -

9 53,3 d 0,85 m9 53.3 d 0.85 m

10 39,2 s -10 39.2 s -

11 20,1 t 1,59 m 1,61 m11 20.1 t 1.59 m 1.61 m

12 36,9 t 1,65 m 1,92 m12 36.9 t 1.65 m 1.92 m

13 85,9 s -13 85.9 s -

14 43,8 t 1,78 d 11,0 2,52 d 11,014 43.8 t 1.78 d 11.0 2.52 d 11.0

15 47,4 t 2,00 d 16,0 7, 8, 9, 1415 47.4 t 2.00 d 16.0 7, 8, 9, 14

2,06 d 16,02.06 d 16.0

16 154,6 s -16 154.6 s -

17 104,3 t 5,03 br s 13, 15, 16 5,71 br s17 104.3 t 5.03 br s 13, 15, 16 5.71 br s

18 28,5 q 1,40 s 3, 4, 5, 1918 28.5 q 1.40 s 3, 4, 5, 19

19 175,2 s -19 175.2 s -

20 16,2 q 1,06 s 1, 5, 9, 1020 16.2 q 1.06 s 1, 5, 9, 10

Tabela 5 (continuação) Deslocamentos químicos de rebaudiosídeo AMTable 5 (continued) Chemical shifts of rebaudioside AM

Posição δC [ppm] δH [ppm] J [Hz] HMBC (H→C)Position δC [ppm] δH [ppm] J [Hz] HMBC (H → C)

Porção química de AçúcarChemical portion of Sugar

Açúcar I: β-D-glicopiranosídeoSugar I: β-D-glycopyranoside

1i 97,5 d 5,13 d 7,7 131i 97.5 d 5.13 d 7.7 13

2i 84,0 d 4,14 m2i 84.0 d 4.14 m

3i 77,6 d 4,20 m3i 77.6 d 4.20 m

4i 71,3 d 4,19 m4i 71.3 d 4.19 m

5i 77,6 d 3,70 m5i 77.6 d 3.70 m

6i 62,0 t 4,23 m 4,32 m6i 62.0 t 4.23 m 4.32 m

Açúcar II: β-D-glicopiranosídeoSugar II: β-D-glycopyranoside

1ii 106,3 d 5,26 d 8,0 2i1ii 106.3 d 5.26 d 8.0 2i

2ii 76,8 d 4,13 m2ii 76.8 d 4.13 m

3ii 77,3 d 4,21 m3ii 77.3 d 4.21 m

4ii 71,6 d 4,18 m4ii 71.6 d 4.18 m

5ii 77,9 d 3,91 m5ii 77.9 d 3.91 m

6ii 62,4 t 4,26 m6ii 62.4 t 4.26 m

4,41 m4.41 m

Açúcar III: β-D-glicopiranosídeoSugar III: β-D-glycopyranoside

1iii 92,9 d 6,20 d 8,1 191iii 92.9 d 6.20 d 8.1 19

2iii 77,0 d 4,46 m2iii 77.0 d 4.46 m

3iii 88,1 d 4,24 m3iii 88.1 d 4.24 m

4iii 69,0 d 4,12 m4iii 69.0 d 4.12 m

5iii 78,4 d 3,82 m5iii 78.4 d 3.82 m

6iii 61,3 t 4,20 m 4,33 m6iii 61.3 t 4.20 m 4.33 m

Açúcar IV: β-D-glicopiranosídeoSugar IV: β-D-glycopyranoside

1iv 103,4 d 5,73 d 7,7 2iii1iv 103.4 d 5.73 d 7.7 2iii

2iv 75,4 d 3,98 m2iv 75.4 d 3.98 m

3iv 78,1 d 4,09 m3iv 78.1 d 4.09 m

4iv 72,6 d 4,08 m 5iv 77,4 d 3,92 m 6iv 62,9 t 4,32 m 4,51 m Açúcar V: β-D-glicopiranosídeo 1v 104,4 d 5,29 d 8,1 3iii 2v 75,1 d 4,00 m 3v 78,2 d 4,24 m 4v 71,4 d 4,27 m 5v 78,2 d 3,99 m 6v 61,9 t 4,27 m 4,48 m4iv 72.6 d 4.08 m 5iv 77.4 d 3.92 m 6iv 62.9 t 4.32 m 4.51 m Sugar V: β-D-glycopyranoside 1v 104.4 d 5.29 d 8, 1 3iii 2v 75.1 d 4.00 m 3v 78.2 d 4.24 m 4v 71.4 d 4.27 m 5v 78.2 d 3.99 m 6v 61.9 t 4.27 m 4.48 m

[0265] A correlação de todos os dados de RMN indica que rebaudiosídeo A tem cinco β-D-glicopiranoses fixadas a um esteviol aglicona, conforme representado com a estrutura química a seguir:[0265] The correlation of all NMR data indicates that rebaudioside A has five β-D-glycopyraneses attached to a steviol aglycone, as represented with the following chemical structure:

[0266] A fórmula química de rebaudiosídeo AM é C50H80O28, que corresponde a uma massa molecular monoisotópica calculada de 1.128,5. Para a análise de LCMS, o rebaudiosídeo AM foi dissolvido em metanol e analisado com o uso do instrumento Shimadzu Nexera 2020 UFLC LCMS em uma coluna Cortecs UPLC C18 1,6 µm, 50 x 2,1 mm. O resultado de LCMS observado (modo ESI negativo) de 1.127,3 (consultar a Figura 15a e Figura 15b, respectivamente) é consistente com rebaudiosídeo AM e corresponde ao íon (M-H) .[0266] The chemical formula for rebaudioside AM is C50H80O28, which corresponds to a calculated monoisotopic molecular mass of 1,128.5. For LCMS analysis, the rebaudioside AM was dissolved in methanol and analyzed using the Shimadzu Nexera 2020 UFLC LCMS instrument in a Cortecs UPLC C18 1.6 µm column, 50 x 2.1 mm. The observed LCMS result (negative ESI mode) of 1,127.3 (see Figure 15a and Figure 15b, respectively) is consistent with rebaudioside AM and corresponds to the ion (M-H).

Propriedades de modificação de sabor, doçura e solubilidade de Reb AM EXEMPLO 9Reb AM's flavor, sweetness and solubility modifying properties EXAMPLE 9

[0267] Reb AM foi avaliado acerca de propriedades de estabilidade de solução e solubilidade. As Tabelas 6a e 6b, abaixo, mostram a composição da amostra de teste, com a porcentagem total de glicosídeo de esteviol (TSG) mostrada na coluna final da Tabela 6b.[0267] Reb AM was evaluated for solution stability and solubility properties. Tables 6a and 6b, below, show the composition of the test sample, with the total percentage of steviol glycoside (TSG) shown in the final column of Table 6b.

Tabela 6a: Composição de Amostra de Teste:Table 6a: Test Sample Composition:

ID de amostra Ensaio, % (conforme seco) Reb Reb Reg Reb Reb Reb Reb Reb RebSample ID Assay,% (as dry) Reb Reb Reg Reb Reb Reb Reb Reb Reb

E AM O D N M H I A Amostra de Reb 0,23 99,30 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,05 0,00 AM 1 Tabela 6b ID de amostra Ensaio, % (conforme seco) Estev Reb F Reb C Dul. A Rubu Reb B Sbio TSG Amostra de Reb AM 1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,26 99,84 Tabela 7: Propriedades físicas de Reb AM: Descrição física Material & Método Resultados de Reb AM Forma Avaliação Visual Pó Aparência Avaliação Visual Muito fino Odor Avaliação olfativa Inodoro Cor Avaliação Visual Branco Teor de umidade Estabilidade de SoluçãoE AM ODNMHIA Reb sample 0.23 99.30 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.05 0.00 AM 1 Table 6b Sample ID Assay,% (as dry) Estev Reb F Reb C Dul. A Rubu Reb B Sbio TSG Reb AM sample 1 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.26 99.84 Table 7: Physical properties of Reb AM: Physical description Material & Method Results de Reb AM Form Visual Assessment Powder Appearance Visual Assessment Very fine Odor Olfactory Assessment Odorless Color Visual Assessment White Moisture Content Solution Stability

[0268] As características de solubilidade foram medidas conforme exposto a seguir. Preparar as soluções a seguir em água e agitar a 700 rpm para cada. Adicionar calor, se for necessário, em 2 minutos e 30 segundos de agitação. Com o uso de um cronômetro, determinar quanto tempo leva para todo o pó se dissolver completamente e registrar a temperatura na qual o mesmo se dissolve. A tabela a seguir resume as características de solubilidade de rebaudiosídeos D, M e AM. Surpreendentemente, Reb AM mostra solubilidade significativamente maior que outros glicosídeos de esteviol maiores e menores.[0268] The solubility characteristics were measured as shown below. Prepare the following solutions in water and stir at 700 rpm for each. Add heat, if necessary, in 2 minutes and 30 seconds of stirring. Using a stopwatch, determine how long it takes for all the powder to dissolve completely and record the temperature at which it dissolves. The following table summarizes the solubility characteristics of D, M and AM rebaudiosides. Surprisingly, Reb AM shows significantly greater solubility than other major and minor steviol glycosides.

Tabela 8: Comparação de Características de Solubilidade Produto Conc. Dissolução Dissolução Solução Solução Comentário de em água em água após 24 h após 48 h sobre Teste (Ambiente) (Aquecida) solubilidade Reb D 0,05% Calor 8 min e 30 s Transparente Transparente Facilmente adicionado em temp.: 39 °C solúvel 2 minutos/30 segundos Reb D 0,1% Calor 15 min e 4 s Transparente Transparente Facilmente adicionado em temp.: 72 °C solúvel 2 minutos/30 segundos Reb D 0,3% Calor 20 min e 27 Precipitado Exige agente de adicionado em segundos temp.: em menos de dispersão 2 minutos/30 78,5 °C 24 h segundos Reb M 0,1% 12 minutos de Nenhum calor Transparente Transparente Facilmente agitação necessário solúvel Reb M 0,3% Calor Aquecido até 99 Transparente Ligeira Moderadamente adicionado em °C com agitação precipitação solúvel 2 min e 30 segundos.Table 8: Comparison of Solubility Characteristics Product Conc. Dissolution Dissolution Solution Solution Comment of in water in water after 24 h after 48 h on Test (Ambient) (Heated) solubility Reb D 0.05% Heat 8 min and 30 s Transparent Transparent Easily added in temp .: 39 ° C soluble 2 minutes / 30 seconds Reb D 0.1% Heat 15 min and 4 s Transparent Transparent Easily added in temp .: 72 ° C soluble 2 minutes / 30 seconds Reb D 0.3% Heat 20 min and 27 Precipitates Requires added agent in seconds temp .: in less dispersion 2 minutes / 30 78.5 ° C 24 h seconds Reb M 0.1% 12 minutes of No heat Transparent Transparent Easily stir needed soluble Reb M 0.3% Heat Heated to 99 Transparent Mild Moderately added at ° C with stirring soluble precipitation 2 min and 30 seconds.

Reb M 0,5% Calor Aquecido até 87 Precipitação - Exige agente de adicionado em °C com moderada em dispersão 2 min e 30 s agitação, 16 min 2 horas e 12 segundos Reb 1% Agitado por 3 Sem calor Transparente Transparente Facilmente AM min e 28 s adicionado solúvel Reb 5% Calor 15 min e 32 s em Transparente Transparente Facilmente AM adicionado em temperatura: 45 solúvel 2 minutos/30 °C segundos.Reb M 0.5% Heat Heated to 87 Precipitation - Requires added agent in ° C with moderate dispersion 2 min and 30 s agitation, 16 min 2 hours and 12 seconds Reb 1% Stirred for 3 No heat Transparent Transparent Easily AM min and 28 s added soluble Reb 5% Heat 15 min and 32 s in Transparent Transparent Easily AM added at temperature: 45 soluble 2 minutes / 30 ° C seconds.

Reb 10% Calor 10 min e 2 s Transparente Ligeira Moderadamente AM adicionado em Temperatura: 54 precipitação solúvel 2 minutos/30 °C segundos.Reb 10% Heat 10 min and 2 s Clear Slight Moderately AM added at Temperature: 54 soluble precipitation 2 minutes / 30 ° C seconds.

Tabela 9: Sumário de estabilidade de solução de glicosídeos de esteviol maiores e menores: SG/Propriedade Reb A* Esteviosídeo* Reb AM Reb D Reb M Solubilidade <0,7% <0,7% 10% 0,1% 0,3% *Solubilidade de esteviosídeo foi ligeiramente menor que Reb A em solução aquosa. Ref.: Celaya et al (2016). Int. J. of Food Studies, V.5, páginas 158 a 166 EXEMPLO 10 Reb AM foi avaliado acerca de seus atributos sensoriais.Table 9: Summary of solution stability of major and minor steviol glycosides: SG / Property Reb A * Stevioside * Reb AM Reb D Reb M Solubility <0.7% <0.7% 10% 0.1% 0.3 % * Stevioside solubility was slightly lower than Reb A in aqueous solution. Ref .: Celaya et al (2016). J. of Food Studies, V.5, pages 158 to 166 EXAMPLE 10 Reb AM was assessed for its sensory attributes.

Atributos sensoriaisSensory attributes

[0269] As moléculas de glicosídeo de esteviol são conhecidas por seus perfis de doçura variados, que são uma função das porções químicas de açúcar presentes em suas estruturas. Uma vez que os glicosídeos de esteviol contêm porções hidrofóbicas (esteviol) e hidrofílicas (porções químicas de açúcar), podem exibir modificação de sabor em um certo nível de dosagem sem contribuir com qualquer percepção de doçura detectável significativa.[0269] The steviol glycoside molecules are known for their varied sweetness profiles, which are a function of the chemical portions of sugar present in their structures. Since steviol glycosides contain hydrophobic (steviol) and hydrophilic (chemical sugar portions) portions, they can exhibit flavor modification at a certain dosage level without contributing to any significant detectable sweetness perception.

Determinação em Isosweet de Reb AM e outros glicosídeos de esteviol: • Cinco níveis de concentração de adoçante de teste foram identificados para corresponder a 2,5%, 5%, 7,5% e 10% de equivalente de sacarose em água acidificada (pH de 3,2), para qual um painel de 40 participantes foi recrutado para conduzir o teste de escolha forçada entre duas alternativas (2-AFC) em cada nível de concentração.Isosweet determination of Reb AM and other steviol glycosides: • Five levels of test sweetener concentration have been identified to correspond to 2.5%, 5%, 7.5% and 10% sucrose equivalent in acidified water (pH of 3.2), for which a panel of 40 participants was recruited to conduct the forced choice test between two alternatives (2-AFC) at each concentration level.

• As amostras foram avaliadas e o ponto de isosweet foi determinado em um ponto em que 50% dos participantes do painel selecionaram a amostra de sacarose como adoçante e 50% selecionaram a amostra de estévia como adoçante.• Samples were evaluated and the isosweet point was determined at a point where 50% of panel participants selected the sucrose sample as a sweetener and 50% selected the stevia sample as a sweetener.

• Um modelo de Beidler foi usado para ajustar a relação de concentração- resposta com o uso de quatro concentrações de isosweet e seus valores de doçura alvo correspondentes como os dados.• A Beidler model was used to adjust the concentration-response ratio using four concentrations of isosweet and their corresponding target sweetness values as the data.

• A potência de doçura é calculada como uma razão entre a concentração e açúcar e o equivalente de doçura. Como um exemplo, Reb AM foi avaliado. Tabela 10: Concentração de iso-sweet (ppm) e Potência de doçura (x equivalente de açúcar) de Reb AM e outros glicosídeos de esteviol Equivalente de doçura (ppm) em água (adoçada para Potência de doçura em água (adoçada obter % de SE designada em pH = 3,2) para obter % de SE designada em pH = 3,2) concentração de 2,5% 5,0% 7,5% 10,0% 2,5% 5,0% 7,5% 10,0% açúcar Reb A 94 299 NA NA 266 167 NA NA Delta (Reb D) 62 212 500 926 403 236 150 108 PCS-4000 (Reb M) 84 209 418 832 298 239 179 90 Reb AM (Reb AM) 150 365 869 1.750 167 137 86 57• The sweetness potency is calculated as a ratio between the concentration and sugar and the sweetness equivalent. As an example, Reb AM was evaluated. Table 10: Concentration of iso-sweet (ppm) and sweetness potency (x sugar equivalent) of Reb AM and other steviol glycosides Sweetness equivalent (ppm) in water (sweetened to sweetness potency in water (sweetened get% of SE designated at pH = 3.2) to obtain% SE designated at pH = 3.2) concentration of 2.5% 5.0% 7.5% 10.0% 2.5% 5.0% 7, 5% 10.0% sugar Reb A 94 299 NA NA 266 167 NA NA Delta (Reb D) 62 212 500 926 403 236 150 108 PCS-4000 (Reb M) 84 209 418 832 298 239 179 90 Reb AM (Reb AM ) 150 365 869 1,750 167 137 86 57

Efeito de Reb AM em perfis de gosto & sabor de aplicações de bebida e alimentoReb AM effect on taste & flavor profiles of food and beverage applications

[0270] Uma série de experimentos foi realizada para avaliar o efeito de Reb AM no perfil de gosto e sabor. A doçura e modificação de gosto/sabor podem influenciar uma à outra em aplicações de bebida e alimento. Para determinar a influência da modificação de gosto e sabor em aplicações diferentes, a FEMA (Flavor and Extract Manufacturing Association) prescreve um método sensorial que determina a determinação de limiar de percepção de doçura apresentada no Experimento 1, que é discutido abaixo.[0270] A series of experiments was carried out to evaluate the effect of Reb AM on the taste and flavor profile. Sweetness and taste / flavor modification can influence each other in beverage and food applications. To determine the influence of taste and flavor modification in different applications, the FEMA (Flavor and Extract Manufacturing Association) prescribes a sensory method that determines the determination of the sweetness perception threshold presented in Experiment 1, which is discussed below.

[0271] O experimento 1 fornece a estimativa da concentração de Reb AM em água que dificilmente contribui para a percepção de doçura. A concentração limiar de percepção de doçura fornece significativamente menos doçura que a solução aquosa de açúcar a 1,5%. O sumário de limiar de percepção de doçura para os glicosídeos de esteviol selecionados está abaixo na Tabela 11.[0271] Experiment 1 provides an estimate of the concentration of Reb AM in water that hardly contributes to the perception of sweetness. The threshold concentration of perceived sweetness provides significantly less sweetness than the 1.5% aqueous sugar solution. The summary of the sweetness perception threshold for the selected steviol glycosides is shown in Table 11 below.

Tabela 11 Glicosídeos de Concentração limiar de FEMA Referência de publicação esteviol percepção de doçura GRAS n° FEMA GRAS (site da Web do FEMA) Reb A 30 ppm 4601 GRAS Flavoring Substances 24 (2008) Reb D 32,5 ppm 4921 GRAS Flavoring Substances 29 (2018) Reb M 24 ppm 4922 GRAS Flavoring Substances 29 (2018) Reb AM 50 ppm NA NATable 11 FEMA threshold concentration glycosides Publication reference steviol perception of sweetness GRAS n ° FEMA GRAS (FEMA website) Reb A 30 ppm 4601 GRAS Flavoring Substances 24 (2008) Reb D 32.5 ppm 4921 GRAS Flavoring Substances 29 (2018) Reb M 24 ppm 4922 GRAS Flavoring Substances 29 (2018) Reb AM 50 ppm NA NA

[0272] O experimento 2, que é adicionalmente discutido abaixo, explora o efeito de Reb AM no perfil de sabor de uma bebida não alcoólica. Uma amostra de água de coco, melancia e framboesa comercial foi usada sem (controle) e com Reb AM (teste) para determinar o efeito de Reb AM em atributos de sabor diferentes da bebida. Os resultados indicaram que a amostra de teste que tem Reb AM teve sabor de pêssego e manga, sabor de água de coco e agrado geral significativamente maior em comparação com as amostras de controle (em 95% de confiança).[0272] Experiment 2, which is further discussed below, explores the effect of Reb AM on the flavor profile of a non-alcoholic beverage. A sample of coconut water, watermelon and commercial raspberry was used without (control) and with Reb AM (test) to determine the effect of Reb AM on different flavor attributes of the drink. The results indicated that the test sample that has Reb AM had a peach and mango flavor, a taste of coconut water and a significantly higher overall taste compared to control samples (at 95% confidence).

[0273] O experimento 3, que é adicionalmente discutido abaixo, explora o efeito de Reb AM no perfil de gosto e sabor de um produto lácteo adoçado. Um painel sensorial testou amostras de shake de proteína láctea com sabor de chocolate, sem adição de açúcar e adoçado com estévia (Reb A) sem (controle) e com Reb AM. O painel constatou que a amostra de teste que contém 50 ppm de Reb AM tem amargor significativamente menor, nota metálica, proteína de soro de leite e gosto residual amargo menor do que o controle (em 95% de confiança) e superior em sabor de cacau, notas lácteas, sabor de baunilha e agrado geral (em 95% de confiança).[0273] Experiment 3, which is further discussed below, explores the effect of Reb AM on the taste and flavor profile of a sweetened dairy product. A sensory panel tested samples of milk protein shake with chocolate flavor, without added sugar and sweetened with stevia (Reb A) without (control) and with Reb AM. The panel found that the test sample containing 50 ppm of Reb AM has significantly less bitterness, metallic note, whey protein and less bitter aftertaste than the control (at 95% confidence) and higher in cocoa flavor , milk notes, vanilla flavor and general liking (at 95% confidence).

[0274] Um grupo de membros do painel treinados e experientes avaliou o refrigerante carbonatado de lima-limão sem calorias (CSD) adoçado com 500 ppm de amostras de Reb AM, Reb D ou Reb M. Os membros do painel constataram que o CSD com Reb AM é menos doce, mas tem amargor significativamente menor e doçura persistente em comparação com outras amostras, especialmente o CSD adoçado com Reb M. EXPERIMENTO 1 DO EXEMPLO 10: Limiar de percepção de doçura com Reb AM Aplicação: Água neutra[0274] A group of trained and experienced panel members evaluated the carbonated lemon lime carbonated soft drink (CSD) sweetened with 500 ppm samples of Reb AM, Reb D or Reb M. Panel members found that the CSD with Reb AM is less sweet, but has significantly less bitterness and persistent sweetness compared to other samples, especially the CSD sweetened with Reb M. EXAMPLE 1 OF EXAMPLE 10: Perceptual sweetness threshold with Reb AM Application: Neutral water

[0275] A percepção de doçura da solução de açúcar a 1,5% e de soluções diferentes de Reb AM foi testada com um painel sensorial e constatou-se que 50 ppm de solução de Reb AM em água forneceram percepção de doçura significativamente menor que aquela da solução de açúcar a 1,5%. Portanto, selecionou-se 50 ppm de Reb AM como a concentração limiar de reconhecimento.[0275] The perception of sweetness of the 1.5% sugar solution and of different solutions of Reb AM was tested with a sensory panel and it was found that 50 ppm of solution of Reb AM in water provided perception of sweetness significantly less than that of the 1.5% sugar solution. Therefore, 50 ppm of Reb AM was selected as the threshold concentration of recognition.

METODOLOGIA Tabela 12 • Natureza dos Painel treinado participantes: • Número de sessões 1 • Número de participantes: 30 • Projeto de teste: 2-AFC, balanceado, randomizado dentro do par, Cego • Método de teste Classificações de intensidade sensorial: • Condição ambiental Luz de cabine padrão • Atributos e Escalas: Qual amostra é doce? • Análise estatística: Teste de comparação pareado • Tamanho de amostra ~0,04 l (1,5 oz) em um copo plástico tampado transparente • Temperatura para servir Temperatura ambiente (~21,11 °C (70 °F)) porção • Instrução para Amostras servidas simultaneamente.METHODOLOGY Table 12 • Nature of the trained Panel participants: • Number of sessions 1 • Number of participants: 30 • Test project: 2-AFC, balanced, randomized within the pair, Blind • Test method Sensory intensity ratings: • Environmental condition Standard cabin light • Attributes and Scales: Which sample is sweet? • Statistical analysis: Paired comparison test • Sample size ~ 0.04 l (1.5 oz) in a clear capped plastic cup • Serving temperature Ambient temperature (~ 21.11 ° C (70 ° F)) portion • Instruction for Samples served simultaneously.

servir/participantes do Participantes do painel instruídos para ler painel declaração de ingrediente, avaliar cada amostra.serve / panel participants instructed to read panel ingredient statement, evaluate each sample.

[0276] A Tabela a seguir (Tabela 13) mostra uma avaliação da concentração limiar de reconhecimento para seguir a metodologia descrita na seção 1.4.2 do “Guidance for the Sensory Testing of Flavorings with Modifying Properties within the FEMA GRAS™ Program”, lançado por FEMA (Flavor and Extract Manufacturers Association, https://www.femaflavor.org/).[0276] The following Table (Table 13) shows an assessment of the threshold concentration of recognition to follow the methodology described in section 1.4.2 of the “Guidance for the Sensory Testing of Flavorings with Modifying Properties within the FEMA GRAS ™ Program”, launched by FEMA (Flavor and Extract Manufacturers Association, https://www.femaflavor.org/).

Tabela 13 DADOS: n= 30 Relatório de tabela de análise bicaudal para resultado de Reb AM Probabilidade de distribuição binomial 1,5% de 30 ppm Porcentagem de Valor P Sig Sacarose de Reb frequência de AM amostra 1 PC 29 1 96,7% 0,0001 *** % de 96,7% 3,3% frequência DADOS: n= 30 Relatório de tabela de análise bicaudal para resultado de Reb AM Probabilidade de distribuição binomial 1,5% de 50 ppm Porcentagem de Valor P Sig Sacarose de Reb frequência de AM amostra 1 PC 23 7 76,7% 0,01 *** % de 76,7% 23,3% frequência DADOS: n= 30 Relatório de tabela de análise bicaudal para resultado de Reb AM Probabilidade de distribuição binomial 1,5% de 70 ppm Porcentagem de Valor P Sig Sacarose de Reb frequência de AM amostra 1 PC 9 21 30,0% 0,05 *** % de 30% 70% frequência DADOS: n= 30 Relatório de tabela de análise bicaudal para resultado de Reb AM Probabilidade de distribuição binomial 1,5% de 100 ppm Porcentagem de Valor P Sig Sacarose de Reb frequência de AM amostra 1 PC 3 27 10% 0,0001 *** % de 10% 90% frequência EXPERIMENTO 2 DO EXEMPLO 10: Água de coco, melancia e framboesa com Reb AM Aplicação: Bebida não alcoólicaTable 13 DATA: n = 30 Two-tailed analysis table report for Reb AM result Probability of binomial distribution 1.5% of 30 ppm Percentage of P Sig value Reb sucrose AM frequency sample 1 PC 29 1 96.7% 0 , 0001 ***% 96.7% 3.3% frequency DATA: n = 30 Two-tailed analysis table report for Reb AM result Probability of binomial distribution 1.5% 50 ppm Percentage of P Sig Value Sucrose from Reb frequency of AM sample 1 PC 23 7 76.7% 0.01 ***% of 76.7% 23.3% frequency DATA: n = 30 Two-tail analysis table report for result of Reb AM Probability of binomial distribution 1.5% of 70 ppm Percentage of Value P Sig Reb Sucrose frequency of AM sample 1 PC 9 21 30.0% 0.05 ***% of 30% 70% frequency DATA: n = 30 Analysis table report two-tailed for Reb AM result Probability of binomial distribution 1.5% of 100 ppm Percent Value P Sig Sucrose of Reb AM frequency sample 1 PC 3 27 10% 0.0001 ***% 10% 90% frequency EXPERIMENT 2 OF EXAMPLE 10: Coconut water, watermelon and raspberry with Reb AM Application: Non-alcoholic drink

SUMÁRIOSUMMARY

[0277] Trinta membros do painel avaliaram duas amostras de água de coco saborizada com melancia e framboesa acerca da aceitação geral e de intensidades de atributo (doçura, sabor de framboesa, sabor de melancia, sabor de água de coco, salinidade, amargor e gosto residual doce, gosto residual amargo) em duas sessões. Na sessão um, as duas amostras incluíram: 1) amostra de controle de água de coco,[0277] Thirty panel members evaluated two samples of coconut water flavored with watermelon and raspberry on general acceptance and attribute intensities (sweetness, raspberry flavor, watermelon flavor, coconut water flavor, salinity, bitterness and taste residual sweet, residual bitter taste) in two sessions. In session one, the two samples included: 1) coconut water control sample,

melancia e framboesa adquirida comercialmente e 2) amostra de teste de água de coco, melancia e framboesa adquirida comercialmente que contém Reb AM. O objetivo do teste foi determinar se a adição de Reb AM afeta o perfil de sabor de uma bebida não alcoólica.commercially purchased watermelon and raspberry and 2) commercially acquired coconut water, watermelon and raspberry test sample containing Reb AM. The purpose of the test was to determine whether the addition of Reb AM affects the taste profile of a non-alcoholic beverage.

Os resultados indicaram que a amostra de teste de Reb AM teve sabor de pêssego e manga, sabor de água de coco e agrado geral significativamente maior em comparação com as amostras de controle (em 95% de confiança).The results indicated that the test sample of Reb AM had a peach and mango flavor, a taste of coconut water and a significantly higher overall taste compared to the control samples (at 95% confidence).

OBJETIVOGOAL

[0278] O objetivo do projeto é avaliar se a adição de sólidos de extrato de estévia tem um efeito sobre atributos de sabor principais em diversas aplicações de bebida.[0278] The aim of the project is to assess whether the addition of stevia extract solids has an effect on major flavor attributes in various beverage applications.

OBJETIVO DO TESTEPURPOSE OF THE TEST

[0279] O objetivo do teste é determinar se o perfil de sabor e a aceitação geral de uma amostra de controle de água de coco saborizada se difere de uma amostra de teste da mesma bebida que contém Reb AM.[0279] The purpose of the test is to determine whether the flavor profile and overall acceptance of a flavored coconut water control sample differs from a test sample of the same drink that contains Reb AM.

METODOLOGIA Tabela 14 • Natureza dos Painel treinado participantes: • Número de sessões 1 • Número de participantes: 30 • Projeto de teste: Balanceado, randomizado dentro do par, Cego • Método de teste Classificações de intensidade e aceitação sensorial: • Condição ambiental Luz de cabine padrão • Atributos e Escalas:METHODOLOGY Table 14 • Nature of the trained Panel participants: • Number of sessions 1 • Number of participants: 30 • Test project: Balanced, randomized within the pair, Blind • Test method Classifications of intensity and sensory acceptance: • Environmental condition standard cabin • Attributes and Scales:

• Aceitação geral em uma escala hedônica de 10 pontos em que 10 = Extremamente apreciado e 0 = Extremamente desapreciado • Agrado geral, doçura, sabor de framboesa, sabor de melancia, sabor de água de coco, adstringência, nota química artificial, amargor e gosto residual doce, gosto residual amargo. Escala de intensidade contínua de 10 pontos em que 0 = Imperceptível e 0 = Extremamente acentuado • Análise estatística: ANOVA (por Block) com Teste de Duncan post- hoc • Tamanho de amostra ~0,04 l (1,5 oz) em um copo plástico tampado transparente • Temperatura para servir Temperatura refrigerada (~7,22 °C (45 °F)) porção • Instrução para Amostras servidas simultaneamente.• General acceptance on a 10-point hedonic scale where 10 = Extremely appreciated and 0 = Extremely unappreciated • General delight, sweetness, raspberry flavor, watermelon flavor, coconut water flavor, astringency, artificial chemical note, bitterness and taste residual sweet, residual bitter taste. 10-point continuous intensity scale where 0 = Not noticeable and 0 = Extremely accentuated • Statistical analysis: ANOVA (by Block) with post-hoc Duncan test • Sample size ~ 0.04 l (1.5 oz) in one transparent capped plastic cup • Serving temperature Refrigerated temperature (~ 7.22 ° C (45 ° F)) portion • Instruction for Samples served simultaneously.

servir/participantes do Participantes do painel instruídos para ler painel declaração de ingrediente, avaliar cada amostra.serve / panel participants instructed to read panel ingredient statement, evaluate each sample.

AMOSTRAS Tabela 15 Bebida Tipo I, Não alcoólica Referência Reb AM *Suco de melancia, framboesa e água de coco 100 99,995 Reb AM 0,005 Total (g) 100 100 *Marca comercial Vita CocoSAMPLES Table 15 Type I drink, non-alcoholic Reference Reb AM * Watermelon juice, raspberry and coconut water 100 99.995 Reb AM 0.005 Total (g) 100 100 * Trademark Vita Coco

RESULTADOSRESULTS

[0280] A Tabela 16 (abaixo) resume os resultados de aceitação geral e intensidade de atributo média para cada amostra. Tabela 16: Pontuações médias Água de coco, melancia e framboesa com 50 ppm Reb AM Sumário de pontuações médias, Valores P e Significância Código de resultado de teste: Água de coco (sabor framboesa/melancia) Reb AM em 50 ppm Esse teste foi realizado em 30 participantes do painel Atributo Controle de água de Água de coco com 50 ppm de Valor Sig coco Reb AM P Intensidade de doce 4,38 4,44 0,6990 NS Intensidade de 0,32 0,24 0,4267 NS amargo Adstringência 1,04 1,10 0,4942 NS Sabor de coco 4,89 5,11 0,4372 NS Sabor de melancia b a 0,0221 *** 3,85 4,41 Sabor de framboesa 0,68 0,95 0,2423 NS Nota artificial/química 2,94 2,55 0,2583 NS Gosto residual doce a b 0,0905 ** 1,60 1,33 Gosto residual 0,36 0,29 0,5409 NS amargo Agrado geral b a 0,0710 ** 4,49 5,04 *= 80% de Cl, ** = 90% de Cl, ***= 95% de CI[0280] Table 16 (below) summarizes the results of general acceptance and average attribute intensity for each sample. Table 16: Average scores Coconut water, watermelon and raspberry with 50 ppm Reb AM Summary of average scores, P-Values and Significance Test result code: Coconut water (raspberry / watermelon flavor) Reb AM at 50 ppm This test was performed in 30 panel participants Attribute Coconut water water control with 50 ppm Sig coconut value Reb AM P Sweet intensity 4.38 4.44 0.6499 NS NS 0.32 0.24 0.4267 Bitter astringency 1.04 1.10 0.4942 NS Coconut flavor 4.89 5.11 0.4372 NS Watermelon flavor ba 0.0221 *** 3.85 4.41 Raspberry flavor 0.68 0.95 0, 2423 NS Artificial / chemical note 2.94 2.55 0.2583 NS Residual sweet taste ab 0.0905 ** 1.60 1.33 Residual taste 0.36 0.29 0.5409 Bitter General taste ba 0.0710 ** 4.49 5.04 * = 80% Cl, ** = 90% Cl, *** = 95% CI

[0281] Os resultados indicam que a amostra de teste Reb AM teve sabor de melancia e agrado geral significativamente maior em comparação com a amostra de controle (em 95% de confiança). A amostra de teste Reb AM teve intensidade de gosto residual doce significativamente menor em comparação com as amostras de controle (em 90% de confiança).[0281] The results indicate that the Reb AM test sample tasted watermelon and had a significantly higher overall taste compared to the control sample (at 95% confidence). The Reb AM test sample had significantly lower sweet taste intensity compared to the control samples (at 90% confidence).

CONCLUSÃOCONCLUSION

[0282] Trinta participantes do painel avaliaram duas amostras de água de coco saborizada com melancia e framboesa acerca da aceitação geral e intensidades de atributo (doçura, sabor de melancia, sabor de framboesa, sabor de água de coco, adstringência, nota artificial/química, amargor e gosto residual doce, gosto residual amargo) em duas sessões. Na sessão um, as duas amostras incluíram: 1) amostra de controle de água de coco, melancia e framboesa adquirida comercialmente e 2) amostra de teste de água de coco, melancia e framboesa adquirida comercialmente que contém Reb AM. O objetivo do teste foi determinar se a adição de Reb AM afeta o perfil de sabor de uma bebida não alcoólica Os resultados indicaram que a amostra de teste Reb AM teve sabor de melancia e agrado geral significativamente maior em comparação com as amostras de controle (em 95% de confiança). Um gráfico dos resultados é mostrado na Figura 16.[0282] Thirty panel participants evaluated two samples of coconut water flavored with watermelon and raspberry on general acceptance and attribute intensities (sweetness, watermelon flavor, raspberry flavor, coconut water flavor, astringency, artificial / chemical grade , bitterness and sweet aftertaste, bitter aftertaste) in two sessions. In session one, the two samples included: 1) commercially acquired coconut, watermelon and raspberry control sample and 2) commercially acquired coconut, watermelon and raspberry test sample containing Reb AM. The purpose of the test was to determine whether the addition of Reb AM affects the taste profile of a non-alcoholic beverage. The results indicated that the Reb AM test sample tasted watermelon and had a significantly higher overall taste compared to the control samples 95% confidence). A graph of the results is shown in Figure 16.

[0283] A amostra de teste Reb AM teve intensidade de gosto residual doce significativamente menor em comparação com as amostras de controle (em 90% de confiança). EXPERIMENTO 3 DO EXEMPLO 10: Shake de proteína de chocolate com Reb AM Aplicação: Leite/Produto lácteo[0283] The Reb AM test sample had significantly less residual sweet taste intensity compared to control samples (at 90% confidence). EXAMPLE 3 OF EXAMPLE 10: Chocolate protein shake with Reb AM Application: Milk / dairy product

SUMÁRIOSUMMARY

[0284] Trinta participantes do painel treinados avaliaram duas amostras de shake de proteína láctea sabor chocolate acerca da aceitação geral e intensidades de atributo (sabor de cacau, nota láctea, proteína de soro do leite, baunilha, metálico, doçura, amargor e gosto residual). As duas amostras incluíram: 1) amostra de “controle” sem açúcar adicionado que contém 300 ppm de PureCircle Reb A e 2) amostra de “teste” sem açúcar adicionado que contém 300 ppm de PureCircle Reb A e 50 ppm de Reb AM. O objetivo do teste foi determinar se a adição de Reb AM afeta o perfil de sabor de um produto de leite. O painel constatou que a amostra de teste que contém 50 ppm de Reb AM tem amargor significativamente menor, nota metálica, proteína de soro de leite e gosto residual amargo menor do que o controle (em 95% de confiança) e superior em sabor de cacau, notas lácteas, sabor de baunilha e agrado geral (em 95% de confiança).[0284] Thirty trained panelists evaluated two samples of chocolate-flavored milk protein shake about general acceptance and attribute intensities (cocoa flavor, milk note, whey protein, vanilla, metallic, sweetness, bitterness and aftertaste ). The two samples included: 1) sugar-free “control” sample containing 300 ppm PureCircle Reb A and 2) sugar-free “test” sample containing 300 ppm PureCircle Reb A and 50 ppm Reb AM. The purpose of the test was to determine whether the addition of Reb AM affects the flavor profile of a milk product. The panel found that the test sample containing 50 ppm of Reb AM has significantly less bitterness, metallic note, whey protein and less bitter aftertaste than the control (at 95% confidence) and higher in cocoa flavor , milk notes, vanilla flavor and general liking (at 95% confidence).

Adicionalmente, não houve impacto significativo na intensidade de doçura.Additionally, there was no significant impact on the sweetness intensity.

OBJETIVOGOAL

[0285] O objetivo do projeto é avaliar se a adição de sólidos de extrato de estévia tem um efeito sobre atributos de sabor principais em diversas aplicações de bebida.[0285] The aim of the project is to assess whether the addition of stevia extract solids has an effect on major flavor attributes in various beverage applications.

OBJETIVO DO TESTEPURPOSE OF THE TEST

[0286] O objetivo do teste é determinar se o perfil de sabor e a aceitação geral de uma amostra de controle de aplicação de bebida láctea se diferem de uma amostra de teste da mesma bebida que contém Reb AM.[0286] The purpose of the test is to determine whether the taste profile and overall acceptance of a dairy drink control sample differs from a test sample of the same drink that contains Reb AM.

METODOLOGIA Tabela 17 • Natureza dos Painel treinado participantes: • Número de sessões 1 • Número de participantes: 30METHODOLOGY Table 17 • Nature of the trained panel participants: • Number of sessions 1 • Number of participants: 30

• Projeto de teste: Balanceado, randomizado dentro do par, Cego • Método de teste Classificações de intensidade e aceitação sensorial: • Condição ambiental Luz de cabine padrão • Atributos e Escalas: • Aceitação geral em uma escala hedônica de 10 pontos em que 10 = Extremamente apreciado e 0 = Extremamente desapreciado • Agrado geral, doçura, sabor de cacau, notas lácteas, chocolate, notas de proteína de soro do leite, nota metálica, nota de baunilha e gosto residual. Escala de intensidade contínua de 10 pontos em que 0 = Imperceptível e 0 = Extremamente acentuado • Análise estatística: ANOVA (por Block) com Teste de Duncan post- hoc • Tamanho de amostra ~0,04 l (1,5 oz) em um copo plástico tampado transparente • Temperatura para servir Temperatura refrigerada (~7,22 °C (45 °F)) porção • Instrução para Amostras servidas simultaneamente.• Test project: Balanced, randomized within the pair, Blind • Test method Classifications of intensity and sensory acceptance: • Environmental condition Standard cabin light • Attributes and Scales: • General acceptance on a 10 point hedonic scale where 10 = Extremely appreciated and 0 = Extremely unappreciated • Generally pleasing, sweetness, cocoa flavor, milk notes, chocolate, whey protein notes, metallic note, vanilla note and aftertaste. 10-point continuous intensity scale where 0 = Not noticeable and 0 = Extremely accentuated • Statistical analysis: ANOVA (by Block) with post-hoc Duncan test • Sample size ~ 0.04 l (1.5 oz) in one transparent capped plastic cup • Serving temperature Refrigerated temperature (~ 7.22 ° C (45 ° F)) portion • Instruction for Samples served simultaneously.

servir/participantes do Participantes do painel instruídos para ler painel declaração de ingrediente, avaliar cada amostra.serve / panel participants instructed to read panel ingredient statement, evaluate each sample.

AMOSTRAS Tabela 18 Lista de ingredientes Referência de 50 ppm Reb açúcar AM Leite, 2% 86,47SAMPLES Table 18 List of ingredients 50 ppm reference Reb sugar AM Milk, 2% 86.47

Proteína de soro do leite instantânea 90 – 6,8250Instant whey protein 90 - 6.8250

Não GMO (Prod.: 18618)Non GMO (Prod .: 18618)

Leite em pó desnatado 4,6269Skimmed milk powder 4,6269

Maltrin QD M585 1,1066Maltrin QD M585 1.1066

Mistura de vitaminas 0,0063Mix of vitamins 0,0063

Goma Xantana (Dissolver fria) 0,0359Xanthan Gum (Cold dissolve) 0.0359

Cacau em pó Forbes 10/12 7113 0,7194Forbes cocoa powder 10/12 7113 0.7194

Sabor de baunilha em pó 0,1799Vanilla flavor powder 0.1799

Reb A 0,0300 0,0300Reb A 0.0300 0.0300

Reb AM 0,0050Reb AM 0.0050

TOTAL 100 100TOTAL 100 100

Contribuição de açúcar (gramas) por 100 Referência de 165 ppm de gramas* açúcar Reb AMContribution of sugar (grams) per 100 Reference of 165 ppm grams * Reb AM sugar

Leite, 2% 4,08 4,15Milk, 2% 4.08 4.15

Leite em pó desnatado 2,41 2,41Skimmed milk powder 2.41 2.41

Maltrin QD M585 0,08 0,08Maltrin QD M585 0.08 0.08

TOTAL 8,07 6,64TOTAL 8.07 6.64

*Calculado com Genesis R&D versão 1 1.4* Calculated with Genesis R&D version 1 1.4

Tabela 19: Efeito de Reb AM em modificação de sabor de shake de proteína de chocolate Sumário de pontuações médias, Valores P e Significância Código de resultado de teste: PROTEIN6 Descrição de teste: Shake lácteo de proteína de baunilha e chocolate: 50 ppm de Reb AMTable 19: Effect of Reb AM on chocolate protein shake flavor modification Summary of average scores, P-Values and Significance Test result code: PROTEIN6 Test description: Vanilla and chocolate protein milk shake: 50 ppm Reb AM

Esse teste foi realizado em 30 participantes do painelThis test was carried out on 30 panelists

Atributo Controle – Shake de Teste - Shake de proteína NSA Valor Sig proteína NSA com Reb A com Reb A e 50 ppm de Reb AM P Intensidade de doce 6,04 5,98 0,7329 NS Amargor a b 0,0138 *** 1,98 1,46 Nota metálica a b 0,0311 *** 1,93 1,48 Sabor de cacau b a 0,0409 *** 4,06 4,55 Nota láctea b a 0,0515 ** 4,10 4,59 Nota de proteína de a b 0,0460 *** soro do leite 4,79 4,32 Nota de baunilha b a 0,0174 *** 2,10 2,52 Gosto residual doce 1,82 1,65 0,2130 NS Gosto residual a b 0,0495 *** amargo 1,03 0,77 Agrado geral b a 0,0001 *** 4,80 5,59 *= 80% de Cl,**= 90% de Cl, ***= 95%de CIControl Attribute - Test Shake - NSA protein shake Sig value NSA protein with Reb A with Reb A and 50 ppm of Reb AM P Sweet intensity 6.04 5.98 0.7329 NS Amargor ab 0.0138 *** 1 , 98 1.46 Metallic note ab 0.0311 *** 1.93 1.48 Cocoa flavor ba 0.0409 *** 4.06 4.55 Milky note ba 0.0515 ** 4.10 4.59 Protein note ab 0.0460 *** whey 4.79 4.32 Vanilla note ba 0.0174 *** 2.10 2.52 Sweet residual taste 1.82 1.65 0.2130 NS Taste residual ab 0.0495 *** bitter 1.03 0.77 General pleasure ba 0.0001 *** 4.80 5.59 * = 80% Cl, ** = 90% Cl, *** = 95 % CI

[0287] O painel constatou que a amostra de teste que contém 50 ppm de Reb AM tem amargor significativamente menor, nota metálica, proteína de soro do leite e gosto residual amargo menor que o controle (em 95% de confiança).[0287] The panel found that the test sample containing 50 ppm of Reb AM has significantly less bitterness, metallic note, whey protein and less bitter aftertaste than the control (at 95% confidence).

[0288] O painel constatou que a amostra de teste que contém 50 ppm de Reb AM é significativamente superior em sabor de cacau, notas lácteas, sabor de baunilha e agrado geral (em 95% de confiança).[0288] The panel found that the test sample containing 50 ppm of Reb AM is significantly superior in cocoa flavor, milk notes, vanilla flavor and overall liking (at 95% confidence).

CONCLUSÃOCONCLUSION

[0289] Trinta participantes do painel avaliaram duas amostras de shake de proteína láctea sabor chocolate acerca da aceitação geral e intensidades de atributo (sabor de cacau, nota láctea, proteína de soro do leite, baunilha, metálico, doçura, amargor e gosto residual). As duas amostras incluíram: 1) amostra de “controle” sem açúcar adicionado que contém 300 ppm de PureCircle Reb A e 2) amostra de “teste” sem açúcar adicionado que contém 300 ppm de PureCircle Reb A e 50 ppm de Reb AM. O objetivo do teste foi determinar se a adição de Reb AM afeta o perfil de sabor de um produto de leite. O painel constatou que a amostra de teste que contém 50 ppm de Reb AM tem amargor significativamente menor, nota metálica, proteína de soro de leite e gosto residual amargo menor do que o controle (em 95% de confiança) e superior em sabor de cacau, notas lácteas, sabor de baunilha e agrado geral (em 95% de confiança).[0289] Thirty panelists evaluated two samples of chocolate flavored milk protein shake about general acceptance and attribute intensities (cocoa flavor, milk note, whey protein, vanilla, metallic, sweetness, bitterness and residual taste) . The two samples included: 1) sugar-free “control” sample containing 300 ppm PureCircle Reb A and 2) sugar-free “test” sample containing 300 ppm PureCircle Reb A and 50 ppm Reb AM. The purpose of the test was to determine whether the addition of Reb AM affects the flavor profile of a milk product. The panel found that the test sample containing 50 ppm of Reb AM has significantly less bitterness, metallic note, whey protein and less bitter aftertaste than the control (at 95% confidence) and higher in cocoa flavor , milk notes, vanilla flavor and general liking (at 95% confidence).

Adicionalmente, não houve impacto significativo na intensidade de doçura. Um gráfico dos resultados é mostrado na Figura 17.Additionally, there was no significant impact on the sweetness intensity. A graph of the results is shown in Figure 17.

[0290] Embora a invenção e suas vantagens tenham sido descritas em detalhe, deve-se compreender que várias mudanças, substituições e alterações podem ser feitas na presente invenção sem que se desvie do espírito e escopo da invenção, conforme definido pelas reivindicações anexas. Ademais, o escopo do pedido não tem a intenção de ser limitado às modalidades particulares da invenção descritas no relatório descritivo. Conforme será prontamente observado pelo versado na técnica a partir da revelação da invenção, as composições, processos, métodos e etapas presentemente existentes ou a serem desenvolvidos posteriormente, que realizam substancialmente a mesma função ou obtêm substancialmente o mesmo resultado que as modalidades correspondentes descritas no presente documento, podem ser usados de acordo com a invenção.[0290] Although the invention and its advantages have been described in detail, it should be understood that various changes, substitutions and changes can be made to the present invention without departing from the spirit and scope of the invention, as defined by the appended claims. Furthermore, the scope of the application is not intended to be limited to the particular modalities of the invention described in the specification. As will be readily observed by the person skilled in the art from the disclosure of the invention, the compositions, processes, methods and stages presently existing or to be further developed, which perform substantially the same function or obtain substantially the same result as the corresponding modalities described in the present document, can be used in accordance with the invention.

Claims (11)

REIVINDICAÇÕES 1. Método para intensificar o sabor em um produto consumível CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionar rebaudiosídeo AM altamente purificado ao produto em um nível abaixo de um nível de detecção de doçura de rebaudiosídeo AM, em que rebaudiosídeo AM tem a fórmula:1. Method to intensify the flavor in a consumable product CHARACTERIZED by the fact that it comprises adding highly purified AM rebaudioside to the product at a level below the sweetness detection level of rebaudioside AM, where rebaudioside AM has the formula: 2. Método para produzir o rebaudiosídeo AM altamente purificado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: a. fornecer uma composição de partida que compreende um composto orgânico com pelo menos um átomo de carbono; b. fornecer um biocatalisador selecionado a partir do grupo que consiste em uma preparação de enzima, uma célula ou um micro-organismo; sendo que o dito biocatalisador compreende pelo menos uma enzima com capacidade para converter a composição de partida em rebaudiosídeo AM; c. colocar o biocatalisador em contato com um meio que contém a composição de partida para produzir um meio que compreende rebaudiosídeo AM.2. Method for producing the highly purified rebaudioside AM according to claim 1, CHARACTERIZED by the fact that it comprises the steps of: a. providing a starting composition comprising an organic compound with at least one carbon atom; B. supply a biocatalyst selected from the group consisting of an enzyme preparation, a cell or a micro-organism; said biocatalyst comprising at least one enzyme capable of converting the starting composition to rebaudioside AM; ç. placing the biocatalyst in contact with a medium containing the starting composition to produce a medium comprising AM rebaudioside. 3. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de: d. separar o rebaudiosídeo AM do meio para fornecer uma composição de rebaudiosídeo AM altamente purificado.3. Method, according to claim 2, CHARACTERIZED by the fact that it additionally comprises the step of: d. separating the AM rebaudioside from the medium to provide a highly purified AM rebaudioside composition. 4. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição de partida é selecionada a partir do grupo que consiste em esteviol, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3, outros glicosídeos de esteviol, polióis, carboidratos e combinações dos mesmos.4. Method according to claim 2, CHARACTERIZED by the fact that the starting composition is selected from the group consisting of steviol, steviolmonoside, steviolmonoside A, steviolbioside, steviolbioside A, steviolbioside B, rubusoside, stevioside A (rebaudioside KA), stevioside B, stevioside C, rebaudioside E, rebaudioside E2, rebaudioside E3, other steviol glycosides, polyols, carbohydrates and combinations thereof. 5. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o micro-organismo é selecionado a partir do grupo que consiste em E.coli, Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Pichia sp., Bacillus sp. e Yarrowia sp.5. Method, according to claim 2, CHARACTERIZED by the fact that the microorganism is selected from the group consisting of E.coli, Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Pichia sp., Bacillus sp. and Yarrowia sp. 6. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima é selecionada a partir do grupo que consiste em: uma enzima de biossíntese de esteviol, uma UDP glicosiltransferase, uma enzima de reciclagem de UDP glicose, uma enzima da via de mevalonato (MVA), uma enzima da via de 2-C-metil-D-eritritol-4- fosfato (MEP/DOXP), geranilgeranil difosfato sintase, copalil difosfato sintase, caureno sintase, caureno oxidase, ácido caurenoico 13-hidroxilase (KAH), esteviol sintetase, desoxixilulose 5 -fosfato sintase (DXS), D-1- desoxixilulose 5-fosfato reductoisomerase (DXR), 4-difosfocitidil-2-C-metil-D- eritritol sintase (CMS), 4-difosfocitidil-2-C-metil-D- eritritol quinase (CMK), 4- difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol 2,4- ciclodifosfato sintase (MCS), 1- hidroxi-2-metil-2(E)-butenil 4-difosfato sintase (EIDS), 1-hidroxi-2-metil-2(E)- butenil 4-difosfato redutase (HDR), acetoacetil-CoA tiolase, HMG-CoA redutase truncada,6. Method, according to claim 2, CHARACTERIZED by the fact that the enzyme is selected from the group consisting of: a steviol biosynthesis enzyme, a UDP glycosyltransferase, a UDP glucose recycling enzyme, an enzyme from the mevalonate pathway (MVA), an enzyme from the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway (MEP / DOXP), geranylgeranyl diphosphate synthase, copalyl diphosphate synthase, kaurene synthase, kaurene oxidase, caurenic acid 13-hydroxylase (KAH), steviol synthase, deoxyxylulose 5-phosphate synthase (DXS), D-1-deoxyxylulose 5-phosphate reductoisomerase (DXR), 4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol synthase (CMS), 4-diphosphocytidyl -2-C-methyl-D-erythritol kinase (CMK), 4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase (MCS), 1-hydroxy-2-methyl-2 (E) -butenyl 4-diphosphate synthase (EIDS), 1-hydroxy-2-methyl-2 (E) - butenyl 4-diphosphate reductase (HDR), acetoacetyl-CoA thiolase, truncated HMG-CoA reductase, mevalonato quinase, fosfomevalonato quinase, mevalonato pirofosfato decarboxilase, citocromo P450 redutase, UGT74G1, UGT85C2, UGT91D2, EUGT11, UGTS12, UGT76G1 ou variante mutante dos mesmos que tem >85% de identidade de sequência de aminoácidos, >86% de identidade de sequência de aminoácidos, >87% de identidade de sequência de aminoácidos, >88% de identidade de sequência de aminoácidos, >89% de identidade de sequência de aminoácidos, >90% de identidade de sequência de aminoácidos, >91% de identidade de sequência de aminoácidos, >92% de identidade de sequência de aminoácidos, >93% de identidade de sequência de aminoácidos, >94% de identidade de sequência de aminoácidos, >95% de identidade de sequência de aminoácidos, >96% de identidade de sequência de aminoácidos, >97% de identidade de sequência de aminoácidos, >98% de identidade de sequência de aminoácidos, >99% de identidade de sequência de aminoácidos; e combinações dos mesmos.mevalonate kinase, phosphomevalonate kinase, mevalonate pyrophosphate decarboxylase, cytochrome P450 reductase, UGT74G1, UGT85C2, UGT91D2, EUGT11, UGTS12, UGT76G1 or mutant variant of the same that has> 85% of the same sequence identity amino acids,> 87% amino acid sequence identity,> 88% amino acid sequence identity,> 89% amino acid sequence identity,> 90% amino acid sequence identity,> 91% amino acid sequence identity amino acids,> 92% amino acid sequence identity,> 93% amino acid sequence identity,> 94% amino acid sequence identity,> 95% amino acid sequence identity,> 96% amino acid sequence identity amino acids,> 97% amino acid sequence identity,> 98% amino acid sequence identity,> 99% amino acid sequence identity; and combinations thereof. 7. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o teor de rebaudiosídeo AM na composição de rebaudiosídeo AM altamente purificado é maior que cerca de 95% em peso em uma base seca.7. Method according to claim 3, CHARACTERIZED by the fact that the content of rebaudioside AM in the composition of highly purified rebaudioside AM is greater than about 95% by weight on a dry basis. 8. Produto consumível produzido pelo método, conforme definido na reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o produto é selecionado a partir do grupo que consiste em um alimento, uma bebida, uma composição farmacêutica, um produto de tabaco, uma composição nutracêutica, uma composição de higiene bucal e uma composição cosmética.8. Consumable product produced by the method, as defined in claim 1, CHARACTERIZED by the fact that the product is selected from the group consisting of a food, a drink, a pharmaceutical composition, a tobacco product, a nutraceutical composition, a oral hygiene composition and a cosmetic composition. 9. Produto consumível, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos um aditivo selecionado a partir do grupo que consiste em carboidratos, polióis, aminoácidos e seus sais correspondentes, poli- aminoácidos e seus sais correspondentes, ácidos de açúcar e seus sais correspondentes, nucleotídeos, ácidos orgânicos, ácidos inorgânicos, sais orgânicos incluindo sais de ácido orgânico e sais de base orgânica, sais inorgânicos, compostos amargos, cafeína, saborizantes e ingredientes saborizantes, compostos adstringentes, proteínas ou hidrolisatos de proteína, tensoativos, emulsificantes, flavonoides, álcoois, polímeros e combinações dos mesmos.9. Consumable product according to claim 8, CHARACTERIZED by the fact that it comprises at least one additive selected from the group consisting of carbohydrates, polyols, amino acids and their corresponding salts, poly-amino acids and their corresponding salts, acids of sugar and its corresponding salts, nucleotides, organic acids, inorganic acids, organic salts including salts of organic acid and salts of organic base, inorganic salts, bitter compounds, caffeine, flavoring and flavoring ingredients, astringent compounds, proteins or protein hydrolysates, surfactants , emulsifiers, flavonoids, alcohols, polymers and combinations thereof. 10. Produto consumível, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente pelo menos um ingrediente funcional selecionado a partir do grupo que consiste em saponinas, antioxidantes, fontes de fibras dietárias, ácidos graxos, vitaminas, glucosamina, minerais, conservantes, agentes de hidratação, probióticos, prebióticos, agentes de gerenciamento de peso, agentes de gerenciamento de osteoporose, fitoestrogênios, álcoois saturados alifáticos primários de cadeia longa, fitoesteróis e combinações dos mesmos.10. Consumable product according to claim 8, CHARACTERIZED by the fact that it additionally comprises at least one functional ingredient selected from the group consisting of saponins, antioxidants, dietary fiber sources, fatty acids, vitamins, glucosamine, minerals, preservatives, hydrating agents, probiotics, prebiotics, weight management agents, osteoporosis management agents, phytoestrogens, long chain primary aliphatic saturated alcohols, phytosterols and combinations thereof. 11. Produto consumível, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente um composto selecionado a partir do grupo que consiste em rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo A2, rebaudiosídeo A3, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C2, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo D2, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo F2, rebaudiosídeo F3, rebaudiosídeo G, rebaudiosídeo H, rebaudiosídeo 7, rebaudiosídeo 12, rebaudiosídeo 13, rebaudiosídeo J rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo K2, rebaudiosídeo KA, rebaudiosídeo L, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo M2, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo O, rebaudiosídeo 02, rebaudiosídeo Q, rebaudiosídeo Q2, rebaudiosídeo Q3, rebaudiosídeo R, rebaudiosídeo S, rebaudiosídeo T, rebaudiosídeo Tl, rebaudiosídeo U, rebaudiosídeo U2, rebaudiosídeo V, rebaudiosídeo W, rebaudiosídeo W2, rebaudiosídeo W3, rebaudiosídeo Y, rebaudiosídeo Zl, rebaudiosídeo Z2, dulcosídeo A, dulcosídeo C, rubusosídeo, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A,11. Consumable product, according to claim 8, CHARACTERIZED by the fact that it additionally comprises a compound selected from the group consisting of rebaudioside A, rebaudioside A2, rebaudioside B, rebaudioside C, rebaudioside C2, rebaudioside D, rebaudioside D2, rebaudioside E, rebaudioside E3, rebaudioside F, rebaudioside F2, rebaudioside F3, rebaudioside G, rebaudioside 7, rebaudioside 12, rebaudioside K, rebaudioside K, rebaudioside K, rebaudioside K, rebaudioside rebaudioside M, rebaudioside M2, rebaudioside N, rebaudioside O, rebaudioside 02, rebaudioside Q2, rebaudioside Q3, rebaudioside R, rebaudioside T, rebaudioside Tl, rebaudioside U, rebaudioside U, rebaudioside U, rebaudioside U, re2 , rebaudioside W3, rebaudioside Y, rebaudioside Zl, rebaudioside Z2, dulcoside A, dulcoside C, rubusoside, and steviolbioside, steviolbioside A, steviolbioside B, steviolmonoside, steviolmonoside A, esteviosídeo, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo D,stevioside, stevioside A, stevioside B, stevioside C, stevioside D, esteviosídeo E, esteviosídeo E2, esteviosídeo F, NSF-02, mogrosídeo V, Luo Han Guo,stevioside E, stevioside E2, stevioside F, NSF-02, mogroside V, Luo Han Guo, alulose, D-alose, D-tagatose, eritritol, brazeína, neoesperidina dihidrocalcona, ácido glicirrízico e seus sais, taumatina, perilartina, pernandulcina, mukuroziosídeos, baiyunosídeo, flomisosídeo-7, dimetil-hexaidrofluoreno- ácido dicarboxílico,allulose, D-alose, D-tagatose, erythritol, brazein, neoesperidin dihydrochalcone, glycyrrhizic acid and its salts, thaumatin, perilartine, pernandulcine, mukuroziosides, baiyunoside, flomisoside-7, dimethyl-hexahydrofluoroene acid, abrusosídeos, periandrina, carnosiflosídeos, ciclocariosídeo, pterocariosídeos,abrusosides, periandrine, carnosiflosides, cyclocarioside, pterocariosides, polipodosídeo A, brazilina, hernandulcina, filodulcina, glicifilina, florizina, trilobatina, di-polypodoside A, brazilina, hernandulcina, filodulcina, glicifilina, florizina, trilobatina, di- hidroflavonol, di-hidroquercetina-3 -acetato, neoastilibina, trans- cinamaldeído, monatina e seus sais, seligueaína A, hematoxilina, monelina, osladina, pterocariosídeo A,hydroflavonol, dihydroquercetin-3-acetate, neoastilibine, trans-cinnamaldehyde, monatin and its salts, seligueain A, hematoxylin, monelin, osladin, pterocarioside A, pterocariosídeo B, mabinlina, pentadina, miraculina, curculina, neoculina, ácido clorogênico, cinarina, siamenosídeo, sucralose, acessulfame de potássio, aspartame, alitame, sacarina, ciclamato, neotame, dulcina, suosan advantame, ácido gimnêmico,pterocarioside B, mabinline, pentadine, miraculin, curculin, neoculin, chlorogenic acid, cinarina, siamenoside, sucralose, potassium acesulfame, aspartame, alitame, saccharin, cyclamate, neotame, dulcine, suosan advantame, gymnemic acid, hodulcina, zizifina, lactisol, glutamato, ácido aspártico, glicina, alanina, treonina, prolina, serina, lisina, triptofano, maltitol, manitol, sorbitol, lactitol, xilitol, inositol, isomalte,hodulcin, zizifin, lactisol, glutamate, aspartic acid, glycine, alanine, threonine, proline, serine, lysine, tryptophan, maltitol, mannitol, sorbitol, lactitol, xylitol, inositol, isomalt, propilenoglicol, glicerol, treitol, galactitol, isomaltulose hidrogenada, isomalto-propylene glycol, glycerol, treitol, galactitol, hydrogenated isomaltulose, isomalto- oligossacarídeos reduzidos, xilo-oligossacarídeos reduzidos, gentio- oligossacarídeos reduzidos, xarope de maltose reduzido, xarope de glicose reduzido, hidrolisatos de amido hidrogenados, poliglicitóis, álcoois de açúcar, L-açúcares, L-sorbose, L-arabinose,reduced oligosaccharides, reduced xylo-oligosaccharides, reduced gentio-oligosaccharides, reduced maltose syrup, reduced glucose syrup, hydrogenated starch hydrolysates, polyglycitols, sugar alcohols, L-sugars, L-sorbose, L-arabinose, trealose, galactose, ramnose, diversas ciclodextrinas, oligossacarídeos cíclicos, diversos tipos de maltodextrinas, dextrano, sacarose, glicose, ribulose, frutose, treose, xilose,trehalose, galactose, rhamnose, various cyclodextrins, cyclic oligosaccharides, various types of maltodextrins, dextran, sucrose, glucose, ribulose, fructose, treose, xylose, lixose, altrose, manose, idose, lactose, maltose, açúcar invertido, isotrealose,lixose, altrose, mannose, idose, lactose, maltose, inverted sugar, isotrealose, neotrealose, isomaltulose, eritrose, desoxirribose, gulose, talose, eritrulose, xilulose, celobiose, amilopectina, glucosamina, manosamina, ácido glucurônico, ácido glucônico,neotrealose, isomaltulose, erythrose, deoxyribose, gulose, thalose, erythrulose, xylulose, cellobiose, amylopectin, glucosamine, mannosamine, glucuronic acid, gluconic acid, glucono-lactona, abequose, galactosamina, oligossacarídeos de beterraba, isomalto-glucono-lactone, abecose, galactosamine, beetroot oligosaccharides, isomalto- oligossacarídeos (isomaltose, isomaltotriose, panose e similares), xilo-oligossacarídeosoligosaccharides (isomaltose, isomaltotriose, panose and the like), xylooligosaccharides (xilotriose, xilobiose e similares), oligossacarídeos xilo-terminados, gentio-(xylotriosis, xylobiosis and the like), xyl-terminated oligosaccharides, oligossacarídeos (gentiobiose, gentiotriose, gentiotetraose e similares), nigero-oligosaccharides (gentiobiosis, gentiotriosis, gentiotetraose and the like), nigero- oligossacarídeos, oligossacarídeos de palatinose, fruto-oligossacarídeos (questose,oligosaccharides, palatinose oligosaccharides, fructo-oligosaccharides (questose, nistose e similares), maltotetraol, maltotriol, malto- oligossacarídeos (maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose, maltoheptaose e similares), amido, inulina,nystosis and the like), maltotetraol, maltotriol, malto-oligosaccharides (maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose, maltoheptaose and the like), starch, inulin, inulo-oligossacarídeos, lactulose, melibiose, raffmose, açúcares líquidos isomerizados como xaropes de milho com alto teor de frutose, agentes de acoplamento,inulo-oligosaccharides, lactulose, melibiosis, raffmose, isomerized liquid sugars such as high fructose corn syrups, coupling agents, oligossacarídeos de soja, D-psicose, D-ribose, L-glicose, L-fucose, D-turanose, D- leucrose.soy oligosaccharides, D-psychosis, D-ribose, L-glucose, L-fucose, D-turanosis, D-leukrose.
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