BR112020018301A2

BR112020018301A2 - Imunoterapia com células de car de anticorpo bispecífico

Info

Publication number: BR112020018301A2
Application number: BR112020018301-6A
Authority: BR
Inventors: Jianhua Yu; Michael Caligiuri
Original assignee: Cytoimmune Therapeutics, Inc.
Priority date: 2018-03-16
Filing date: 2019-03-15
Publication date: 2020-12-22
Also published as: CO2020012504A2; RU2020133311A3; AU2019233917A1; MX2020009475A; KR20200131844A; US20210087275A1; CA3092355A1; JP7202689B2; EP3765042A1; EP3765042A4; WO2019178576A1; CN112118850A; SG11202008129YA; JP2021524731A; IL276975A; RU2020133311A

Abstract

imunoterapia com células de car de anticorpo bispecífico são descritos aqui vetores únicos que, quando expressos em células imunes citolíticas, resultam em ambas a expressão de (1) antígenos associados a um tumor alvo de car e (2) secreção de um anticorpo biespecífico que em uma extremidade reconhece nkg2d expresso em ambas as células imunes citolíticas inatas e específicas de antígeno e na outra extremidade tem como alvo os antígenos associados a tumor. inesperadamente, essas modificações nas células t resultam em maior sobrevivência e proliferação in vivo. assim, são divulgados usos terapêuticos e de diagnóstico.

Description

“IMUNOTERAPIA COM CÉLULAS DE CAR DE ANTICORPO BISPECÍFICO” RELATÓRIO DESCRITIVO REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS CORRELATOS

[0001] Este Pedido reivindica a prioridade sob 35 U.S.C. § 119 (d) do Pedido Provisório US nº 62/644,343, depositado em 16 de março de 2018, cujo conteúdo é incorporado aqui por referência na presente divulgação.

CAMPO TÉCNICO

[0002] A presente divulgação se refere geralmente ao campo da imunologia humana, especificamente imunoterapia do câncer.

ANTECEDENTES

[0003] A seguinte discussão dos antecedentes da invenção é fornecida meramente para auxiliar a técnica da presente invenção.

[0004] Regimes atuais de tratamento de câncer, incluindo quimioterapias, fármacos imunomoduladores14, anticorpos monoclonais15e transplante autólogo ou alogênico. Essas terapias costumam levar à remissão, mas quase todos os pacientes eventualmente recaem e morrem devido ao retorno da doença. Assim, há uma necessidade não atendida de novas terapias, incluindo novas imunoterapias de combinação para doença recorrente e/ou refratária. Esta divulgação aborda essas limitações e, também, fornece vantagens relacionadas.

SUMÁRIO DA DIVULGAÇÃO

[0005] As células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) têm sido usadas com sucesso na clínica para o tratamento de doenças malignas hematológicas e tumores sólidos e foram recentemente aprovadas pelo FDA dos EUA1-4. Os anticorpos biespecíficos (BsAb) também foram aprovados pelo FDA para o tratamento do câncer e estão sendo usados como uma abordagem imunoterapêutica alternativa para a terapia com células T de CAR5. No entanto, as imunoterapias contra o câncer baseadas em CAR e BsAb ainda precisam ser melhoradas por cinco razões importantes.

Primeiro, em alguns casos, as células T de CAR não podem ser expandidas in vivo e não podem sobreviver por um período de tempo suficiente para iniciar a lise tumoral em pacientes6. Foi relatado que a eficácia das células T de CAR se correlaciona com a quantidade e a duração da presença de células T de CAR in vivo 6-8. Em segundo lugar, as células de tumor podem liberar antígenos alvos para evitar a terapia, especialmente quando apenas um único antígeno é alvo.

Em terceiro lugar, além de ser caro e demorado para fabricar, o BsAb tem meia-vida curta e até o momento não se mostrou curativo9,10. Em quarto lugar, a terapia de combinação de células T de CAR com BsAb tendo como alvo dois antígenos associados a tumores distintos pode ser uma boa abordagem; no entanto, a produção de cada uma individualmente ex vivo seria muito trabalhosa e cara; a manipulação de células T para expressar ambos dentre um CAR e um BsAb dentro de um construto único, do qual o BsAB se encaixa com todas as células efetoras citolíticas ainda não foi relatada ou mostrou ser aditiva ou sinérgica, ou intensificar a sobrevivência das células T in vivo.

Finalmente, as abordagens atuais para a imunoterapia com CAR focam principalmente em um tipo de célula imune, ou seja, células T, excluindo todas as outras células efetoras citolíticas nos braços inato e adaptativo do sistema imunológico.

NKG2D é um tipo de receptor de c-lectina expresso em praticamente todas as células efetoras citolíticas nos braços inato e adaptativo do sistema imunológico11,12.

[0006] Esta divulgação fornece uma plataforma para resolver esses problemas, em parte ou no todo, pela manipulação de células T infectadas com um único vetor que distribui esses dois modos de terapia, ou seja, a produção de uma célula T cujo CAR tem como alvo um antígeno associado a tumor específico.

[0007] Assim, em um aspecto, são fornecidos aqui receptores de antígenos quiméricos (CARs) que compreendem ou, alternativamente, consistem essencialmente em, ou ainda consistem em: (a) um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo alvo de câncer ou de tumor; (b) um domínio de dobradiça; (c) um domínio transmembrana; e (d) e um domínio intracelular; Outros aspectos da divulgação se referem a um receptor de antígeno quimérico (CAR) que compreende, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste em: (a) um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo alvo de tumor; (b) um domínio de dobradiça CD8 α; (c) um domínio transmembrana CD8 α; (d) uma região de sinalização coestimuladora de CD28 e/ou uma região de sinalização coestimuladora de 4-1BB; e (e) um domínio de sinalização de CD3 zeta.

[0008] Em certas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno do anticorpo alvo de tumor compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste em uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve que são opcionalmente ligadas por um peptídeo ligante. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada e/ou leve compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste nas regiões de CDR relevantes de um anticorpo para qualquer um dentre um antígeno de maturação de células B (BCMA) e/ou SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319), e/ou um equivalente de cada um dos mesmos. Em um aspecto, o anticorpo alvo de tumor tem como alvo BCMA. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada e/ou de cadeia leve compreende, ou, alternativamente, consiste essencialmente na mesma, ou ainda consiste na sequência de aminoácidos de um anticorpo para qualquer um dentre um antígeno de maturação de células B (BCMA) e/ou SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319) e/ou um equivalente de cada um dos mesmos.

[0009] Em certas modalidades, o CAR compreende adicionalmente, ou alternativamente consiste adicionalmente essencialmente em, ou ainda consiste em, um polipeptídeo ligante localizado entre a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve. Em certas modalidades, o ligante é um ligante de glicina-serina. Em outras modalidades, o polipeptídeo ligante compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste na sequência (glicina- serina)n em que n é um número inteiro de 1 a 6.

[0010] Em certas modalidades, o CAR compreende adicionalmente, ou alternativamente ainda consiste essencialmente em, ou ainda consiste em, um marcador detectável e/ou um marcador de purificação anexado ao CAR.

[0011] Aspectos adicionais da divulgação se referem a uma sequência de ácido nucleico isolada que codifica um CAR, conforme descrito acima, ou seu complemento, ou um equivalente de cada um dos mesmos.

[0012] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico isolada compreende adicionalmente, ou consiste essencialmente em, ou ainda consiste em, uma sequência de consenso Kozak localizada a montante do polinucleotídeo que codifica o domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo alvo de câncer ou de tumor.

[0013] Em certos aspectos, o ácido nucleico isolado compreende adicionalmente, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste em um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de resistência a antibióticos operativamente acoplado ao ácido nucleico isolado, um promotor e/ou um elemento potencializador.

[0014] Também é fornecido um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo biespecífico que reconhece e se liga a NKG2D. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica um anticorpo biespecífico que compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste em um ligante NKG2D e, opcionalmente, um ligante SALMF7 (também conhecido como CS1 de CD319) que são opcionalmente códon otimizados. Em certas modalidades, o ácido nucleico isolado codifica um anticorpo biespecífico que compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste nas regiões de CDR relevantes de um anticorpo para NKG2D e, opcionalmente, SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319), que são opcionalmente códon otimizados ou um equivalente de cada um dos mesmos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica um anticorpo biespecífico que compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste na região variável de cadeia pesada e/ou de cadeia leve de um anticorpo para NKG2D e, opcionalmente, SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319), que são opcionalmente códon otimizados e/ou um equivalente de cada um dos mesmos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica um anticorpo biespecífico que compreende um fragmento variável de cadeia simples (scFV) derivado de um anticorpo para NKG2D e, opcionalmente, um fragmento variável de cadeia simples (scFV) derivado de SALMF7 (também conhecido como CS1 de CD319), que são opcionalmente códon otimizados e/ou um equivalente de cada um dos mesmos. Em certas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende adicionalmente ou, alternativamente, consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste em um polinucleotídeo que codifica um gene de resistência a antibióticos.

[0015] Em outro aspecto, são fornecidos aqui ácidos nucleicos isolados que codificam, em um construto, o CAR e o anticorpo biespecífico conforme divulgado acima (“construto BsAb-CAR”). Em um aspecto, o ácido nucleico isolado codifica um fragmento de ligação ao antígeno que tem como alvo BCMA e um anticorpo biespecífico, por exemplo, um scFv de um anticorpo anti-CS1 e um scFv de um anticorpo anti-NKG2D, unidos por um ácido nucleico que codifica um ligante de proteína não imunogênica, como de aldose de músculo humano. Um exemplo de vetor BsAb-CAR é mostrado na Figura 3A. Os vetores opcionalmente compreendem sequências regulatórias, tais como promotoras, potencializadoras e LTRs virais.

[0016] Os aspectos da divulgação se referem a um vetor que compreende um ou mais dos ácidos nucleicos isolados descritos acima. Em certas modalidades, o vetor é um plasmídeo ou um vetor viral selecionado do grupo dentre um vetor retroviral, um vetor lentiviral, um vetor adenoviral e um vetor viral adenoassociado. Os ácidos nucleicos isolados e vetores que os contêm são úteis para preparar os CARs conforme descrito na presente invenção.

[0017] Outros aspectos da divulgação se referem a uma célula isolada compreendendo, ou alternativamente consistindo essencialmente na mesma, ou ainda consistindo em uma ou mais das composições descritas acima: um CAR, um ácido nucleico isolado que codifica um CAR ou seu complemento, um ácido nucleico isolado que codifica o construto de CAR/BsA ou um vetor contendo os ácidos nucleicos isolados. Em algumas modalidades, o CAR é expresso na superfície da célula isolada.

[0018] Em certas modalidades, a célula isolada compreende adicionalmente, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste em, um ácido nucleico isolado que compreende, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste em um polinucleotídeo que codifica um anticorpo biespecífico, que opcionalmente reconhece e se liga a NKG2D. Em algumas modalidades,

o anticorpo biespecífico compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste em um ligante NKG2D ou um fragmento de ligação ao antígeno anti-NKG2 de um anticorpo anti- NKG2 e, opcionalmente, um SALMF7 (também conhecido como CS1 de CD319 ) ligando. Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste nas regiões relevantes da cadeia leve e da cadeia pesada ou as regiões de CDR de um anticorpo para NKG2D e, opcionalmente, SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319), que são opcionalmente códon otimizados ou um equivalente de cada um dos mesmos. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste na região variável de cadeia pesada e/ou de cadeia leve de um anticorpo para NKG2D e, opcionalmente, SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319), que são opcionalmente códon otimizados e/ou um equivalente de cada um dos mesmos. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende um fragmento variável de cadeia simples (scFv) derivado de um anticorpo para NKG2D e, opcionalmente, um fragmento variável de cadeia simples (scFv) derivado de SALMF7 (também conhecido como CS1 de CD319), que são opcionalmente códon otimizados e/ou equivalentes de cada um dos mesmos. Em certas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende adicionalmente ou, alternativamente, consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste em um polinucleotídeo que codifica um gene de resistência a antibióticos.

[0019] Exemplos não limitantes de uma célula isolada é uma célula procariótica, como uma célula de bactéria, por exemplo, um E coli, ou uma célula eucariótica. Em algumas modalidades, a célula eucariótica isolada é selecionada dentre uma célula de animal, uma célula de mamífero, uma célula bovina, uma célula felina, uma célula canina, uma célula de murino, uma célula de equino ou uma célula humana. Em outras modalidades, a célula isolada é uma célula T, uma célula B, uma célula NK, uma célula dendrítica, uma célula mieloide, um monócito, um macrófago, quaisquer subconjuntos dos mesmos ou qualquer outra célula imune de qualquer uma das espécies conforme divulgado aqui.

[0020] Os aspectos da divulgação se referem a uma composição compreendendo, ou alternativamente consistindo essencialmente em, ou ainda consistindo em uma ou mais das composições descritas acima, por exemplo, um CAR, um ácido nucleico isolado, uma célula ou um vetor e um transportador.

[0021] Em certas modalidades, a composição compreende adicionalmente, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste em, um anticorpo biespecífico, que opcionalmente reconhece e se liga à NKG2D e/ou um ácido nucleico isolado compreendendo um polinucleotídeo que codifica um anticorpo biespecífico, que opcionalmente reconhece e se liga a NKG2D. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste em um ligante NKG2D e, opcionalmente, um ligante SALMF7 (também conhecido como CS1 de CD319). Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste nas regiões de CDR relevantes de um anticorpo para NKG2D e, opcionalmente, SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319), ou um equivalente de cada um dos mesmos. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende, ou alternativamente consiste essencialmente deste, ou ainda consiste na região variável de cadeia pesada e/ou de cadeia leve de um anticorpo para NKG2D e, opcionalmente, SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319), e/ou um equivalente de cada um dos mesmos. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende um fragmento variável de cadeia simples (scFv) derivado de um anticorpo para NKG2D e, opcionalmente, um fragmento variável de cadeia simples (scFv) derivado de SALMF7 (também conhecido como CS1 de CD319), e/ou um equivalente de cada um dos mesmos.

[0022] Os aspectos da divulgação se referem a um complexo isolado compreendendo um CAR ou uma célula compreendendo o CAR ligado a um antígeno de câncer ou de tumor ou um fragmento do mesmo e/ou uma célula que expressa o antígeno de câncer ou de tumor. Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno é expresso na superfície da célula. Em outro aspecto, o antígeno de câncer ou de tumor é o antígeno de maturação de células B (BCMA), SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319) e/ou um equivalente de cada um dos mesmos. Em um aspecto, a célula que contém ou expressa o CAR é uma célula T, uma célula B, uma célula NK, uma célula dendrítica, uma célula mieloide, um monócito, um macrófago, quaisquer subconjuntos dos mesmos ou qualquer outra célula imune. Os tumores ou células podem ser de qualquer animal, por exemplo, mamífero, como uma célula humana.

[0023] Alguns aspectos da divulgação se referem a um método para produção de uma célula que expressa CAR ou uma célula que expressa CAR que secreta BsA, o método compreendendo, ou alternativamente consistindo essencialmente no mesmo, ou ainda consistindo ainda em transduzir uma célula isolada com a sequência de ácido nucleico que codifica um CAR e Bsa ou o ácido nucleico isolado que codifica o BsAb- CAR, conforme descrito na presente invenção.

[0024] Em um aspecto adicional, o método compreende adicionalmente selecionar e isolar a célula que expressa o CAR ou BsAb-CAR. Em um aspecto adicional, a célula é uma célula eucariótica, como uma célula de mamífero, por exemplo, uma célula humana, como uma célula T, uma célula B, uma célula NK, uma célula dendrítica, uma célula mieloide, um monócito, um macrófago, quaisquer subconjuntos dos mesmos ou qualquer outra célula imune. As células podem ser transduzidas com o uso dos vetores virais conforme descrito aqui ou alternativamente com o uso da tecnologia descrita em Riet et al. (2013) Meth. Mol. Biol. 969:187- 201 intitulado “Nonviral RNA transfection to transiently modify T cell with chimeric antigen receptors for adoptive therapy”.

[0025] Em certas modalidades, a célula isolada compreende adicionalmente, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste em transduzir a célula com um ácido nucleico isolado que compreende, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste em um polinucleotídeo que codifica um anticorpo biespecífico, que opcionalmente reconhece e se liga a NKG2D. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste em um ligante NKG2D e, opcionalmente, um ligante SALMF7 (também conhecido como CS1 de CD319), cada ligante opcionalmente códon otimizado. Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste nas regiões de CDR relevantes de um anticorpo para NKG2D e, opcionalmente, SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319), opcionalmente códon otimizado, ou um equivalente de cada um dos mesmos. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste na região variável de cadeia pesada e/ou de cadeia leve de um anticorpo para NKG2D e, opcionalmente, SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319), que são opcionalmente códon otimizados e/ou um equivalente de cada um dos mesmos. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende um fragmento variável de cadeia simples (scFv) derivado de um anticorpo para NKG2D e, opcionalmente, um fragmento variável de cadeia simples (scFv) derivado de SALMF7 (também conhecido como CS1 de CD319), que são opcionalmente códon otimizados e/ou equivalentes de cada um dos mesmos. As células podem ser transduzidas com o uso dos vetores virais, por exemplo, vetores lentivirais, conforme descrito aqui ou alternativamente com o uso da tecnologia descrita em Riet et al. (2013)

Meth. Mol. Biol. 969:187-201 intitulado “Nonviral RNA transfection to transiently modify T cell with chimeric antigen receptors for adoptive therapy”.

[0026] Em certas modalidades, o método de produção de uma célula que expressa CAR ou BsAb-CAR compreende adicionalmente, ou, alternativamente, consiste essencialmente em, ou ainda consiste em ativar e expandir a população de células que expressam CAR. Certos aspectos da presente divulgação se referem a uma população de células ativadas e isoladas compreendendo ou, alternativamente, consistindo essencialmente em, ou ainda consistindo em um CAR ou BsAb-CAR. Em certas modalidades, as células são uma ou mais das células T, células B, células NK, células dendríticas, células mieloides, monócitos, macrófagos, quaisquer subconjuntos dos mesmos ou quaisquer outras células imunológicas.

[0027] Os aspectos da divulgação se referem a um método para inibição do crescimento de um tumor que expressa um antígeno de câncer ou de tumor, por contato do tumor com uma quantidade eficaz das células isoladas ou composições divulgadas acima. O contato pode ser in vitro ou in vivo. Quando o contato é in vitro, o método pode ser usado para testar a terapia personalizada contra o tumor de um paciente ou para testar terapias de combinação. Quando o contato é in vivo, o método é útil para inibir o crescimento da célula de câncer ou de tumor em um sujeito com necessidade do mesmo, tal como um paciente humano que sofre de câncer e o paciente recebe uma quantidade eficaz das células. Em certas modalidades, o tumor é um tumor sólido. Uma quantidade eficaz é administrada sozinha ou em combinação com outras terapias, conforme descrito na presente invenção. Em certas modalidades, o câncer/tumor alvo é um tumor sólido ou um câncer que afeta o sangue e/ou a medula óssea, por exemplo, mieloma múltiplo (MM). Em certas modalidades, as células isoladas são autólogas para o sujeito em tratamento. Em outro aspecto, as células são alogênicas ao sujeito em tratamento. Em outro aspecto, o método compreende adicionalmente, ou consiste essencialmente em, ou ainda consiste em, administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de uma terapia citorredutora. Em um aspecto adicional, o método compreende adicionalmente as etapas de isolamento das células a serem administradas ao sujeito, transdução das células com uma quantidade eficaz de um ácido nucleico isolado que codifica um CAR ou BsAb-CAR conforme descrito na presente invenção, cultivo das células para obter uma população de células que codificam CAR ou BsAb- CAR, que são opcionalmente expandidas e ativadas e, em seguida, administração das células ao paciente.

[0028] Também são divulgados na presente invenção kits que compreendem uma ou mais das composições e instruções acima mencionadas para seu uso nos métodos conforme divulgados na presente invenção.

[0029] As composições e métodos acima são únicos e superam a limitação do estado da técnica em que fornecem uma célula de CAR que simultaneamente secreta um BsAb baseado em NKG2D que tem como alvo um segundo antígeno associado a tumor. O BsAb baseado em CAR NKGD2D divulgado é apenas exemplificador. Esta abordagem pode ser modificada para qualquer número de antígenos tumorais, como conhecido na técnica, por exemplo, EGFRVIII; CD70, mesotelina, CD123, CD19, CEA, CD133, Her2, ver Townsend et al. (2018) J. Exp. & Clinical Cancer Res. 37:163.

[0030] Os construtos exemplificadores foram testados em um modelo de mieloma múltiplo (MM). O mieloma múltiplo (MM) é uma doença maligna caracterizada por um acúmulo de células plasmáticas clonais13. Como observado acima, os regimes de tratamento atuais, incluindo quimioterapias, fármacos imunomoduladores14, anticorpos monoclonais15, e o transplante autólogo ou alogênico frequentemente leva à remissão, mas quase todos os pacientes eventualmente recaem e sucumbem devido ao retorno da doença. Assim, há uma necessidade não atendida de novas terapias, incluindo novas imunoterapias de combinação para MM recorrente e/ou refratária.

[0031] Como um componente do sistema imunológico inato, as células assassinas naturais (NK) desempenham um papel importante na prevenção do crescimento do tumor16, mas a atividade antitumoral das células NK foi diminuída em muitos pacientes com MM17. A transferência adotiva de células NK ativadas ou alogênicas produz respostas antitumorais eficazes no tratamento de uma série de doenças hematológicas, incluindo MM18,19e tumores sólidos. No entanto, em muitos casos, as respostas antitumorais mediadas por células NK são fracas, o que pode resultar da expressão de células NK de receptores inibidores, baixa capacidade de sobrevivência ou migração limitada de células efetoras para os locais do tumor 20-22. Enquanto isso, como parte da imunidade adaptativa, as células T podem migrar com eficiência para vários tecidos e tendem a se proliferar bem em resposta à estimulação do antígeno. No entanto, as células T têm especificidades estritas ditadas por receptores de células T específicas para antígenos (TCR). Assim, um método que envolva tanto as células T quanto as células NK e, assim, supere suas próprias limitações seria de grande benefício para a imunoterapia contra o câncer. Esta divulgação fornece esse benefício.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0032] As FIGs. 1A-1D mostram os resultados da manipulação de células T para expressar BCMA CAR e proteína de fusão biespecífica anti- NKG2D-anti-CS1 individualmente ou em combinação. (A) Representação esquemática dos construtos lentivirais BCMA CAR contendo um scFv contra BCMA ligado aos endodomínios CD28 e CD3 zeta (ζ). A expressão do transgene foi rastreada pela expressão de GFP conduzida por um promotor EF1 alfa (α). LTR, repetições terminais longas; SP, peptídeo sinal; VH, cadeia pesada variável; L, ligante; VL, cadeia leve variável. MyC, tag MyC; Dobradiça, cadeia de dobradiça; CD28, uma molécula coestimuladora de células T; CD3ζ, cadeia CD3 zeta. (B) Diagrama esquemático do construto lentiviral para a expressão em mamíferos do anticorpo biespecífico anti-NKG2D-anti-CS1 (BsAb). O anti-NKG2D-anti- CS1 BsAb consistia em um anti-NKG2D scFv, que era composto de VH e VL ligadas entre si por um ligante (L), e um anti-CS1 scFv. A expressão de BsAb é conduzida por um promotor CMV flanqueado por LTR lentiviral. (C) PBMC (células mononucleares de sangue periférico) de doadores saudáveis foram ativadas com microesferas de CD3 e CD28 e transduzidas com o vetor vazio pCDH (EV), BCMA CAR, anti-NKG2D- anti-CS1 BsAb. As células T ativadas também foram transduzidas sequencialmente com BsAb e BCMA-CAR e essas células transduzidas foram denominadas “BsAb-BCMA seq. trans. T”. As células GFP-positivas foram classificadas, e as células foram coradas com anticorpo de controle específico de Fab anti-camundongo de cabra marcado com biotina ou de controle compatível com isotipo, seguido por coloração com estreptavidina e de anticorpo CD3. (D) Sobrenadante de células T não modificadas, células T BsAb ou BsAb-BCMA seq. trans. As células T foram coletadas e os lisados de células individuais foram submetidos à análise de Immunoblotting com anticorpo anti-6x His-tag.

[0033] As FIGs. 2A-2E mostram que as células T BsAb-BCMA seq. trans. possuem maior capacidade de citotoxicidade e produção de IFN-gama () de células T BCMA-CAR ou células T BsAb em resposta. (A) Análise de citometria de fluxo da expressão de BCMA e CS1 na superfície de linhagens de células de MM. Três linhagens de células de MM (MM1.S, H929 e RPMI-8226) e uma linhagem de células de leucemia mieloide crônica (K562) foram coradas com anticorpo mAb anti-CS1 (painel superior) ou mAb anti-BCMA (painel inferior), cores diferentes foram usadas para distinguir as três linhagens de células de MM, MM.1S (verde), H929 (vermelho) e RPMI-8226 (cinza), bem como a linhagem de células K562 (azul) ou anticorpo de controle compatível com isotipo (linha sólida preta e área aberta). (B) linhagens de células de MM1.S marcado com Cr51, H929, RPMI-8226 MM e a linhagem de células K562 (5 × 103 para cada linhagem de células) foram co-cultivadas com células T não modificadas (T, linha sólida preta), células T transduzidas com vetor vazio (EV T, linha pontilhada preta), células T expressando anti-NKG2D-anti- CS1 BsAb (BsAb T, linha sólida vermelha), BCMA CAR (BCMA CAR T, linha sólida verde) e células T BsAb-BCMA seq. trans. (linha sólida azul) nas razões de E:T indicadas por 4 horas, e a lise alvo (liberação de Cr51) foi medida. BsAb-BCMA seq. trans. T vs BCMA CAR T, * p<0,05, ** p<0,01; seq. trans. T vs BsAb T, # p<0,05, ## p<0,01. Células K562 como controle negativo de BCMACS1. (C) células T não modificadas (quadrado branco), células T EV (quadrado de sombra cinza), células T BsAb (quadrado vermelho), células T BCMA CAR (quadrado verde) ou células T BSAb-BCMA seq. trans. (quadrado azul) 2 × 105 foram cultivadas isoladamente (sem alvo) ou estimuladas com um número igual de células de MM.1S, H929 ou RPMI-8226 MM expressando diferentes níveis de CS1 e células BCMA ou BCMACS1 K562 por 24 horas, e os sobrenadantes foram coletados para medir a secreção de IFN-γ por ELISA. * p<0,05, ** p<0,01, n.s. sem diferença significativa. (D e E) As células foram tratadas como descrito em (c), e a secreção de IL-2 ou TNF- alfa (α) nos sobrenadantes livres de células foi determinada por ELISA, respectivamente. ** p<0,01, n.s. sem diferença significativa.

[0034] As FIGs. 3A-3H mostram a geração de um vetor BsAb-CAR contendo BCMA CAR e anticorpo biespecífico anti-NKG2D-anti-CS1 (BsAb) no mesmo construto e exame funcional de células T transduzidas com este construto. (A) Representação esquemática de um vetor lentiviral gerado expressando BCMA CAR e anti-NKG2D-anti-CS1 BsAb (referido a seguir como BsAb-CAR). T2A, um gene 2A autoclivável. (B) Os sobrenadantes e lisados celulares de células T induzidas por vetor vazio (EV) ou células T BsAb-CAR foram submetidos à análise de

Immunoblotting com um anticorpo anti-6x His-tag. (C) células de MM1.S marcadas com Cr51 (5 × 103) foram co-cultivadas com células T não modificadas (T, linha sólida preta), células T transduzidas com vetor vazio (EV T, linha pontilhada preta) ou células T BsAb-CAR (linha roxa) nas razões de E:T indicadas por 4 horas e a lise alvo (liberação de Cr51) foi medida. (D) Células T CD8(+)-transduzidas não modificadas - (linha sólida preta), de EV- (linha pontilhada preta), BsAb- (linha vermelha), BCMA CAR- (linha sólida verde) ou BsAb-CAR (linha sólida roxa) isoladas de doadores saudáveis foram co-cultivadas com células de MM1.S MM marcadas com Cr51 (5 × 103) nas razões de E:T indicadas por 4 horas, e a lise alvo (liberação de Cr51) foi medida. (E) Ensaios de liberação de Cr51 por 4 horas com células de MM.1S MM em uma razão de E:T de 10:1. Para avaliar este efeito antitumoral na presença de diferentes quantidades de PBMCs humanas normais (não infectadas), as PBMCs foram adicionadas em uma quantidade de 1 vez, 10 vezes, 100 vezes e 200 vezes de células alvo MM.1S MM. (F) Ensaios de liberação de Cr51 de células T não modificadas (quadrado preto), células T EV (quadrado padrão), células T BsAb (quadrado vermelho), células T BCMA-CAR (quadrado verde) ou células T BsAb-CAR (quadrado roxo) contra células alvo MM.1S MM em uma razão de E:T de 5:1. Conforme observado na figura, o tempo de incubação das células efetoras e células alvo MM.1S MM é de 4 horas para células PBMC, NK e NKT (painel esquerdo) e 16 horas para células T CD3+, Células T CD8+, células T V9V2 ou células T CD4+. * p<0,05, ** p<0,01, n.s. sem diferença significativa. (G) Controle de co-cultura de células T EV (GFP, verde) e células de MM.1S MM (vermelho) após 1 hora, a análise de microscopia confocal das sinapses foi determinada (escala 10 µL, painel superior; escala 20 µL, painel inferior); Sem sinapses são notadas, mesmo em uma potência mais alta mostrada no painel inferior. (H) Co-cultura de uma hora de células T BsAb-CAR (E: GFP, verde) e células de MM.1S MM (T: vermelho); Sinapses de E/T foram observadas e indicadas pelas setas em todos os quadros (S1 mostra o mesmo par E/T conjugado em cada estrutura movendo-se da esquerda para a direita, assim como S2 e S3). A estrutura na parte superior esquerda mostra um campo claro (Bf, escala 10µL); a estrutura superior e intermediária mostra uma imagem de imunofluorescência de células T BsAb-CAR (GFP, verde) e co-cultura de células de MM.1S MM (vermelho) (escala de 10 µL). A estrutura na parte superior direita é uma imagem mesclada com anti-6x-His-tag adicional identificando o BsAb (azul, escala de 10µL). As três linhas inferiores demonstram os três conjugados E/T individuais (S1, S2 e S3) visualizados em um campo ampliado (escala de 20 µL).

[0035] As FIGs. 4A-4D mostram que a superexpressão de BCMA e CS1 em células K562 desencadeia citotoxicidade potencializada e a secreção de citocinas após o reconhecimento por células T BsAb-CAR. (A) Análise de citometria de fluxo de células K562 que superexpressam CS1 e BCMA (K562-CS1-BCMA, sombra cinza) ou um controle de vetor vazio (K562- PCDH, linha sólida preta) depois que as células foram coradas com um CS1 (painel esquerdo) ou BCMA (painel direito) ou anticorpo de controle de isotipo IgG (linha pontilhada preta em cada painel). (B) Citotoxicidade de vetor vazio (EV) - ou células T transduzidas por BsAb-CAR contra células K562-CS1-BCMA e K562-PCDH, determinada por ensaios de liberação de Cr51por 4 horas. As células K562-CS1-BCMA ou K562-PCDH foram incubadas com células T EV ou células T BsAb-CAR nas razões de E:T indicadas. ** p<0,01 (células T K562-CS1-BCMA + BsAb vs. células T K562-PCDH + BsAb). (C) células T EV ou células T BsAb-CAR (1 × 105) foram cultivadas sozinhas ou estimuladas com um número igual de células K562-CS1-BCMA ou K562-PCDH. Os sobrenadantes das culturas foram usados para determinar a secreção de IFN-γ por ELISA. ** p<0,01. (D) As células foram tratadas como em (C) e a secreção de IL-2 em sobrenadantes livres de células foi determinada por ELISA. ** p<0,01.

[0036] As FIGs. 5A-5E mostram que o anti-NKG2D-anti-CS1 BsAb secretado potencializa a proliferação de células T de CAR através da sinalização de NKG2D. (A) As cores do meio de cultura após cultura de células T não modificadas (1), células T 2-EV (2), células T BsAb (3), células T BCMA CAR (4), células T BsAb-CAR (5) ou células T naïve (6) (controle não proliferado) foram exibidas no painel superior.

O gráfico de barras fornece análises estatísticas do número total de células, incluindo 6 amostras individuais para cada grupo. ** p<0,01 (grupo 5 vs. grupos 1, 2, 4 e grupo 3 vs. grupos 1, 2, 4). Para documentar a proliferação de células T ou a falta das mesmas, o rastreador de células violetas foi usado e mostrado como diluição de V450 que é exibida por histogramas no painel inferior. (B) Meios de cultura antigos de cinco dias de células T não modificadas, células T EV e células T BCMA CAR na presença ou ausência de sobrenadantes livres de células de células T BsAb-CAR de (A), designados como 1+, 2 +, 4+ ou 1, 2, 4, respectivamente.

As células foram enumeradas e os dados foram apresentados como um gráfico de barras (parte superior). ** p<0,01 (4+ vs. 4, 2+ vs. 2, 1+ vs. 1). O rastreador de células violetas foi mostrado como diluição de V450 exibida por histogramas no painel inferior (parte inferior). (C) O meio de cultura antigo de dois dias é mostrado.

Células T não modificadas 1A, células T 2A-EV, células T 3A-BsAb, células T 4A-BCMA CAR e células T 5A-BsAb- CAR.

No dia 0, o anticorpo de bloqueio NKG2D (20 µg/mL) foi adicionado à cultura de 1B, 2B, 3B, 4B e 5B, enquanto um anticorpo de controle de isotipo não reativo (20 µg/mL) foi adicionado a 1A, 2A, 3A, 4A e 5A). Abaixo desses poços está a coloração por citometria de fluxo para CD3, NKG2D, F (ab)2 (que é denotado por “Fab” indicando a expressão do CAR) e Ki67 para medir a proliferação celular. (D) A análise de imunoblot foi realizada para determinar a fosforilação (p) da proteína AKT e da proteína AKT total de 1A--- T não modificada, 2A--- T EV, 3A--- T BsAb, 4A--- T BCMA- CAR e 5A--- T BsAb-CAR, bem como 1B- células T não modificadas + bloqueio de NKG2D, 2A--- T EV + bloqueio de NKG2D, 3A- -- T-BsAb+ bloqueio de NKG2D, 4A--- T BCMA-CAR + bloqueio de NKG2D e 5A--- T BsAb-CAR + bloqueio de NKG2D. (E) As mesmas células mostradas em (C) (1A, 2A, 3A, 4A e 5A) também foram co-cultivadas com células de MM.1S MM por 48 horas. As análises de citometria de fluxo para avaliar a proliferação celular foram realizadas conforme descrito acima em (C).

[0037] As FIGs. 6A-6C mostram que o anti-NKG2D-anti-CS1 BsAb secretado potencializa a sobrevivência das células T de CAR através da sinalização de NKG2D in vitro. (A) Meios de cultura antigos de cinco dias de 1--- T Un. (Não modificada) + IL-2, 2--- T EV + IL-2, 3--- T BsAb + IL- 2, 4--- T BCMA-CAR + IL-2, 5--- T BsAb- CAR + IL-2 foram exibidos. Coloração por citometria de fluxo para CD3 (1ª coluna), F(ab)2 (2ª coluna), e Ki67 para observar a proliferação celular (3ªcoluna), e Anexina V/Sytox Azul para observar a sobrevivência celular (4ª coluna). (B) Meios de cultura antigos de cinco dias (sem IL-2) de 1--- T não modificada, 2--- T EV, 3--- T BsAb, 4--- T BCMA-CAR e 5-- -T BsAb-CAR foram mostrados no painel superior. Coloração por citometria de fluxo para CD3 (1ª coluna) e Ki67 (2ª coluna) para detectar a proliferação celular. Anexina V/Sytox Azul foi incluída para detectar a sobrevivência celular (3ª coluna). (C) Análises estatísticas das porcentagens de células CD3, células proliferativas Ki67, células vivas de Anexina V(-) Sytox Azul (-), células de apoptose de Anexina V(+) e células mortas de Anexina V(+) Sytox Azul(+) foram exibidas. Teste-t múltiplo, comparou-se cada grupo. ** p<0,01.

[0038] As FIGs. 7A-7D mostram que as células T transduzidas BsAb- CAR têm melhor proliferação e capacidade de sobrevivência do que células T BCMA-CAR e as células T de controle in vivo. (A) Projeto de injeção i.v. de células T não modificadas, células T EV, células T BCMA- CAR e células T BsAb-CAR em camundongos NSG imunodeficientes (a, superior). Histogramas 3D (painel inferior, 1ª coluna) indicam as porcentagens de células T CD3 humanas injetadas. Os histogramas azuis são para os camundongos que não tiveram injeção de células T no dia - 1, os histogramas de cor laranja representam 1 dia após a injeção de células T e os histogramas de cor preta representam 14 dias após a injeção de células T (a seta vermelha aponta para o grupo de T BsAb- CAR) Os contornos indicam a expressão de CD69 (laranja para 1 dia após a injeção i.v. e preto para 14 dias após a injeção i.v.). Os histogramas de cor roxa (4ª coluna) indicaram as porcentagens das células T CD3 injetadas 35 dias após i.v.. Os contornos roxos são a combinação de coloração Ki67 e CD69 de 4 grupos para revelar a proliferação celular. Os contornos vermelhos são a combinação de coloração Sytox Azul e Anexina V para revelar a apoptose celular e morte celular. S-/A- denota Sytox Azul (-)/Anexina V(-), S-/A+ denota Sytox Azul-/Anexina V+, e S+/A+ denota Sytox Azul+/Anexina V+. (B, C) Análise estatística de CD3+ humana (B) e CD69+ (C) células mostradas em (A). T não modificada (retângulo vazio), T EV (retângulo preenchido com padrão), T BCMA-CAR (retângulo de sombra cinza) e T BsAb-CAR (retângulo preto). Teste-t múltiplo, comparou-se cada grupo. ** p<0,01, n.s. sem diferença significativa, n = 5 camundogos por grupo. (D) Análise estatística das porcentagens de células proliferativas Ki67+CD69+, células vivas de anexina V(-) Sytox Azul(-), células de apoptose de anexina V(+) Sytox Azul(-) e células mortas de anexina V(+) Sytox Azul(+). Teste-t múltiplo, comparou-se cada grupo. ** p<0,01, n.s. sem diferença significativa, n = 5/grupo.

[0039] As FIGs. 8A-8C mostram que células T BsAb-CAR reconhecem e eliminam especificamente células de mieloma múltiplo primário humano que expressam CS1 ou/e BCMA ex vivo. (A) Coloração de superfície de citometria de fluxo para proteína CS1 e BCMA em células de tumor de mieloma múltiplo CD138+ isoladas da medula óssea de pacientes com MM. Os resultados de 8 pacientes são mostrados. Oito células de MM de pacientes foram coradas com anticorpo anti-mAb CS1 conjugados com PE (painel esquerdo) ou estreptavidina conjugada com APC com mAb anti-BCMA marcado com biotina (painel direito). Várias cores são usadas para indicar cada um dos 8 pacientes ou anticorpo de controle compatível com o isotipo (sombra cinza). (B) 5 × 103 células de tumor de mieloma múltiplo CD138+ foram co-cultivadas com células T EV (linha pontilhada preta), células T BsAb (linha vermelha), células T BCMA-CAR (linha verde) ou células T BsAb-CAR (linha roxa) nas razões de E:T indicadas por 4 horas, então a lise específica foi determinada com o uso de um ensaio de liberação de Cr51 padrão. Os dados que representam a amostra 1 do paciente e a amostra 4 do paciente são mostrados. Os dados de oito pacientes foram analisados e apresentados como valores individuais para cada paciente (painel direito). (C) As células T transduzidas conforme indicado foram co-cultivadas com células de tumor de mieloma múltiplo CD138+ em uma razão de E:T de 1:1 por 24 horas, e a secreção de IFN- foi medida em sobrenadantes livres de células via ELISA.

[0040] As FIGs. 9A-9C mostram que as células T BsAb-CAR são superiores para suprimir o crescimento de MM in vivo e prolongar a sobrevivência de camundongos portadores de MM ou sendo desafiados novamente com células tumorais. (A) A imagem de bioluminescência foi mostrada para cinco camundongos representativos portadores de tumores MM.1S de cada grupo indicado. Camundongos NSG foram inoculados por via intravenosa com 8 × 106 células de MM.1S que expressam luciferase (dia 0). Nos dias 10, 17 e 24 após a implantação do tumor, cada camundongo recebeu uma injeção i.v. com solução salina (grupo de controle) ou, 10 × 106 células T EV, células T BsAb, células T BSMA CAR, células T BsAb-BCMA seq. trans., ou células T BsAb-CAR, respectivamente (painel superior, cronograma do experimento). As imagens na linha foram tiradas no dia 10 após a implantação do tumor, pouco antes da infusão de células T modificadas ou células T de controle. As imagens na linha do meio foram tiradas no dia 24, após os camundongos já terem sido submetidos ao tratamento duas vezes (no dia 10, 17) e imediatamente antes do terceiro tratamento. As imagens na linha inferior mostram camundongos no dia 31, após 3 ciclos de tratamento (nos dias 10, 17 e 24). (B) No dia 80 após a implantação do tumor, sangue periférico (PBL) foi coletado de camundongos sobreviventes (3 camundongos do grupo tratado com células T BCMA

CAR, 4 camundongos do grupo tratado com células T BCMA seq. trans. e 5 camundongos do grupo tratado com células T BsAb-CAR). O número total de células PBL foi calculado (painel esquerdo). Coloração de citométrica de fluxo com anticorpo mAb anti-humano CD45 conjugado com FITC e estreptavidina conjugada com APC com anticorpo policlonal (Fab)2 anti-camundongo de cabra marcado com biotina ou anticorpo policlonal normal de imunoglobulina G (IgG) de cabra. As porcentagens de células Fab(+) e os números foram calculados como mostrado no meio. (C) Curva de sobrevivência de Kaplan-Meier de camundongos com MM.1S tratados com várias células T transduzidas, solução salina (linha sólida preta), células T EV (linha pontilhada preta), células T BsAb (linha vermelha), células T BCMA CAR (linha verde), células T BCMA seq. trans. (linha azul) e células T BsAb-CAR (linha pontilhada roxa). A linha vertical pontilhada cinza com seta indicou o dia 80, quando os camundongos foram desafiados novamente com 4 × 106 células de MM.1S.

[0041] As FIGs. 10A-10D mostram que as células T BsAb-CAR suprimem de forma mais eficaz do que as células T BCMA-CAR in vivo o crescimento de MM e prolonga a sobrevivência de camundongos portadores de tumor MM na presença de PBMC humanas transferidas de maneira adotiva. (A) A imagem de bioluminescência foi mostrada para três camundongos representativos portadores de tumores MM.1S de cada grupo indicado. Camundongos NSG foram inoculados por via intravenosa com 8 × 106 células de MM.1S que expressam luciferase (dia 0). Nos dias 10, 17 e 24 após a implantação do tumor, cada camundongo recebeu uma injeção i.v. com solução salina (grupo de controle), células T BSMA-CAR ou células T BsAb-CAR. PBMC sem células mieloides do mesmo doador foram injetadas i.v. em camundongos no dia 10 após a implantação do tumor (painel superior, cronograma do experimento). As imagens da primeira coluna foram obtidas no dia 10 após a implantação do tumor, imediatamente antes da infusão de células T manipuladas ou células T de controle. As imagens da segunda coluna foram obtidas no dia 19, após os camundongos já terem sido submetidos ao tratamento duas vezes (no dia 10, 17) e imediatamente antes do terceiro tratamento ser administrado. As imagens na terceira coluna mostram camundongos no dia 28, após 3 ciclos de tratamento (nos dias 10, 17 e 24). As imagens na quarta coluna mostram camundongos no dia 37. (B) O sangue foi coletado de camundongos injetados com células T BsAb-CAR sobreviventes (n = 5) e camundongos NSG não tratados (Nenhum, n = 5). Coloração por citometria de fluxo para células plasmáticas humanas CD19/20(+), células NK CD56(+) e células T CD3(+). A cor verde do contorno que delimitou em CD3(+)F(ab)2(+) humano indica a porcentagem de expressão de CAR em células T humanas sobreviventes. (C) Análise estatística das porcentagens de células plasmáticas CD19/20(+) humanas, células NK CD56(+), células T CD3(+) e células T de CAR sobreviventes de CD3(+)F(ab)2(+). (d) Curva de sobrevivência de Kaplan- Meier de camundongos com MM.1S tratados com várias células T transduzidas, solução salina (linha sólida preta), células T BCMA-CAR (linha verde) ou células T BsAb-CAR (linha pontilhada roxa ). P <0,0001, células T BsAb-CAR vs. células T BCMA-CAR.

[0042] As FIGs. 11A-11C. (A) O mapa citométrico de fluxo de pontos do arco-íris 3D (básico na coloração de CD3, as células positivas de CD3 mostram a cor amarela e verde, e as células negativas de CD3 mostram a cor azul escura e roxa) exibe as porcentagens de células T CD3(+) sozinha), células NKT (círculo laranja, cor amarela com cor verde) e células NK (círculo azul, azul escuro e roxo). Os mapas de contorno 2D mostram os detalhes do mapa 3D. (B) Coloração por citometria de fluxo da expressão de superfície de NKG2D em células T, células T CD8+, apresentados são representativos de PBMC de 10 doadores saudáveis. (C) Análises estatísticas de porcentagens de células NKG2D+ em (B). n = 10.

[0043] As FIGs. 12A-12B. (A) Ensaios de liberação de 51Cr por 4 horas na razão de E:T de 10:1 [E, células efetoras de células T não modificadas (linha sólida preta) ou EV- (linha pontilhada preta), BsAb- (linha vermelha), BCMA-CAR- (linha verde), ou células T transduzidas com BsAb-CAR (linha roxa)]. Diferentes quantidades de PBMC humana a 1 vez, 10 vezes, 100 vezes ou 200 vezes sobre as células alvo. Curvas de lise específica de um experimento representativo de três são mostradas em A e os dados de resumo das três são mostrados em B. (B) Análises estatísticas dos 5resultados dos ensaios de liberação de Cr51 de (a), teste- t múltiplo, * p<0,05, ** p<0,01, n.s. sem diferença significativa, repetição de 3 vezes.

[0044] As FIGs. 13A-13D. (A) Células T CD3(+), células T citotóxicas CD8(+), células T CD4(+), células T , células NKT e células NK foram isoladas de leucopacks encomendados junto à Cruz Vermelha Americana. O mapa de contorno de cor preta para T de primer mostra a coloração combinatória de CD3 e pan  TCR. Os mapas de contorno de cor marrom e verde mostram células T CD8(+) e CD4(+) classificadas, respectivamente. (B) Células NK humanas ativadas foram marcadas com CD3 e CD56. (C) As células T pan  classificadas foram coradas com anticorpos CD3 e pan  CR. Mapas de contorno de cor preta para células T V9 TCR foram realizadas por coloração combinatória de CD3, CD56, V9 e V2. (D) Células NKT CD3(+) CD56(+) humanas recentemente classificadas por FACS foram coradas com CD3 e CD56.

[0045] As FIGs. 14A-14E. (A) Ensaios de liberação de Cr51 de células T não modificadas (linha sólida preta), células T EV (linha pontilhada preta), células T BsAb (linha vermelha), células T BCMA-CAR (linha verde) ou células T BsAb-CAR (linha roxa) em uma razão de E:T de 5:1 em pontos de tempo diferentes, incluindo 2h, 4h, 8h e 16h. Nenhum PBMC adicional foi adicionado. (B, C, D, E) Os ensaios de citotoxicidade descritos acima foram repetidos na presença ou ausência de células T em massa ou subconjuntos de células T individuais, incluindo células T CD3(+) de prime, células T CD8(+), células T CD4(+) células, e células T V9V2. A razão de células efetoras para células alvo MM.1S é de 5:1 para todos os experimentos.

[0046] As FIGs. 15A-15J mostram análise microscópica confocal após co-cultura de 24 horas de células T BsAb-CAR (verdes) ou células T EV (verdes) com células de MM.1S MM (vermelhas). (A - F) Co-cultura de células T BsAb-CAR com células de MM.1S MM por 24 horas mostra a eliminação de células de MM MM.1S. (GJ) Co-cultura de células T EV com células de MM.1S MM por 24 horas mostra a persistência de células de MM.1S MM. Bf = Campo Claro; Escala, 10L.

[0047] A FIG. 16 mostra a geração de células K562 expressando de forma estável os genes CS1 e BCMA. O mapa de fluxo de pseudo cor à esquerda indica o controle de células K562 não transduzidas. O mapa de fluxo de pseudo cor do meio indica células K562 infectadas com lentivírus pCDH- CS1-GFP classificadas por FACS. O terceiro mapa de fluxo de pseudo cor indica células CS1(+) BCMA(+) K562 classificadas por FACS.

[0048] As FIGs. 17A-17D. (A) cultura de 48 horas. Células T não modificadas 1A, células T 2A-EV, células T 3A-BsAb, células T 4A-BCMA CAR e células T 5A-BsAb-CAR. Coloração por citometria de fluxo para CD3 e NKG2D para observar populações de CD3(+) (chamas azuis), populações de CD3(+) NKG2D(+) (chamas vermelhas) e populações de CD3(+) NKG2D(-) (chamas verdes). (b) No dia 0, o anticorpo de bloqueio 1B, 2B, 3B, 4B e 5B. Após 48 horas, coloração por citometria de fluxo para CD3 e F(ab)2 para observar a população de células. Populações de CD3(+) (chamas azuis). (C) Meios de cultura de 48 horas de (A) foram mostrados. No dia 0, o anticorpo de bloqueio de CS1 (20 g/mL) foi adicionado à cultura (A) e denominado como 1C, 2C, 3C, 4C e 5C. Após

48 horas, a análise de citometria de fluxo foi realizada após a coloração das células com anti-CD3, anti-F (ab)2, anti-NKG2D e anti-Ki67 para observar as proliferações celulares. As células foram delimitadas em CD3(+) e as populações de CD3(+) NKG2D(+) (chamas vermelhas), populações de CD3(+) NKG2D (-) (chamas verdes) foram indicadas. Mapas de fluxo de pontos de cor vermelha indicaram a proliferação de células NKG2D(+) Fab(+) (três superiores) ou NKG2D(+) Fab (-) (duas inferiores). Mapas de fluxo de pontos de cor verde indicam proliferação de células NKG2D (-) Fab(+) (três superiores) ou NKG2D(-)Fab(-) (duas inferiores). Fab denota coloração de anti-F(ab)2 para a expressão do CAR. (D) As células de 1A, 2A, 3A, 4A e 5A em (A) foram co-cultivadas com células de tumor MM.1S por 48 horas. As análises de citometria de fluxo foram realizadas após a coloração das células com anticorpos anti-CD3, anti-F(ab)2 e anti-NKG2D. Fab denota a coloração de F(ab)2, que indica a expressão de CAR.

[0049] A FIG. 18 fornece dados suplementares aos dados na FIG. 7. Na FIG. 7, histogramas 3D (1ª coluna) das porcentagens de células T CD3 humanas. Estes são os mapas de fluxo em pseudo cores originais. O quadro de cor azul indicou as porcentagens de CD3 humana dos camundongos que não tiveram injeção de células T no dia -1 (1ª coluna). O quadro de cor laranja representa células CD3(+) anti-humanas em camundongos um dia após a injeção de células T, e a expressão de CAR foi detectada por análise de citometria de fluxo após a coloração com anti- F(ab)2 (2ªe 3ª colunas). O quadro preto mostra células CD3(+) anti- humanas em camundongos 14 dias após a infusão com células T humanas manipuladas ou de controle (4ª coluna). O quadro de cor roxa mostra células CD3(+) anti-humanas em camundongos 35 dias após a infusão com células T humanas manipuladas ou de controle (5ª coluna). A análise estatística para células humanas CD3(+) é mostrada na Figura

7.

[0050] As FIGs. 19A-19B mostram os efeitos da depleção de células mieloides em PBMC de doadores humanos saudáveis para evitar GVHD quando injetadas em camundongos NSG. (A) PBMC humanas isoladas com Ficoll-Paque PLUS foram coradas. O número 1 indica as porcentagens de linfócitos, 2 indica as porcentagens de granulócitos e 3 indica as porcentagens de monócitos. CD11c, CD14, CD33 e CD66b foram coradas para verificar as porcentagens de células mieloides em PBMC de dadores saudáveis antes da classificação FACS. (B) Após a classificação, CD11c, CD14, CD33 e CD66b foram coradas como descrito acima, mapas de pseudo cor inferiores foram exibidos.

[0051] A FIG. 20 fornece uma avaliação da citotoxicidade de células T BsAb-CAR humanas contra PBMC autólogas, células T, células NK e células plasmáticas por um padrão de ensaio de liberação de Cr51 por 4 horas. PBMC foram isoladas por centrifugação em gradiente Ficoll-Paque PLUS. As células T CD3(+), as células NK CD56(+) e as células plasmáticas CD19/20(+) foram classificadas por FACS de PBMC. As células T EV foram utilizadas como controle no ensaio de citotoxicidade.

[0052] As FIGs. 21A-21D. (A) Diferentes pontos no tempo (12h, 24h, 48h, 72h e 96h) de células T de primer de doadores saudáveis infectadas com lentivírus BsAb BCMA-CAR (BsAb-CAR T). A mesma visualização de BF (campo claro) GFP (verde) é mostrada. (B) Immunoblotting com anti-His- tag para mostrar a secreção de BsAb no sobrenadante de células T BsAb- CAR. (C) Coloração por citometria de fluxo para células T de primer infectadas com lentivírus BsAb-CAR T. As células GFP-positivas foram classificadas, e as células foram coradas com anticorpo de controle específico de Fab anti-camundongo de cabra marcado com biotina ou de controle compatível com isotipo, seguido por coloração com estreptavidina e de anticorpo CD3. (D) Linhagens de células alvo H929, RPMI-8226 e K562 marcadas com Cr51 (5 × 103) foram co-cultivadas com células T não modificadas (linha sólida preta), células T transduzidas com vetor vazio (T EV, linha pontilhada preta) ou células T BsAb-CAR (linha roxa) nas razões de E:T indicadas por 4 horas. A lise alvo (liberação de Cr51) foi medida. T BsAb-CAR vs T não modificada ou T EV, ** P<0,01, repetido três vezes. K562 negativo para BCMA(-)CS1(-) serviu como células alvo de controle negativo.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0053] Deve ser entendido que a presente divulgação não está limitada a aspectos particulares descritos, como tal, é claro, varia. Também deve ser entendido que a terminologia usada na presente invenção tem a finalidade de descrever aspectos particulares apenas e não se destina a ser limitante, uma vez que o escopo da presente divulgação será limitado apenas pelas Reivindicações anexas. Ao longo desta divulgação, várias publicações técnicas são referenciadas por um algarismo arábico. As citações completas para estas publicações podem ser encontradas imediatamente antes das Reivindicações e são aqui incorporadas por referência.

[0054] Ambos os antígenos de maturação de células B (BCMA) e SLAMF7 (CS1 ou CD319) demonstraram ser excelentes alvos do antígeno tumoral MM, enquanto NKG2D é um excelente alvo de células imunes. NKG2D, um receptor, é expresso em virtualmente todas as células imunes citolíticas, incluindo células NK, células NKT, células T CD8(+) e  Células T 23. BCMA é um membro da superfamília de receptores do fator de necrose tumoral (TNFRSF17 ou CD269), é induzido seletivamente durante a diferenciação de células plasmáticas e está quase ausente em células B naïve e de memória 24,25. A transferência adotiva de células T que expressam anti-BCMA-CAR foi relatada como uma nova estratégia promissora para o tratamento de MM26-28. CS1 é outro antígeno alvo associado a tumor atraente em MM, porque CS1 é altamente e ubiquamente expresso na superfície das células de MM29,30. CS1 é expresso em níveis baixos em células NK e em um subconjunto de células

T CD8(+) ativadas, mas é quase indetectável em células mieloides e células-tronco hematopoéticas normais31. Um anticorpo monoclonal terapêutico contra CS1 foi aprovado pela FDA para o tratamento de MM32. A pesquisa publicada do requerente mostrou que a modificação genética de células T ou células NK redirecionadas para CS1 intensificou a erradicação de células de mieloma29,30. Um estudo pré-clínico recente mostrou que as células de MM do paciente submetidas ao tratamento com células T CS1 CAR foram efetivamente erradicadas, enquanto as células NK e T normais com baixos níveis de expressão de CS1 permaneceram inalteradas (Gogishvili, 2017 Blood. 28 de dezembro de 2017;130(26):2838-2847. doi: 10.1182/blood-2017-04-778423. Epub 31 de outubro de 2017). NKG2D, um receptor de ativação, é expresso em uma variedade de células citolíticas inatas e adaptativas, conforme mencionado acima 11,33. O desencadeamento de NKG2D pode levar à ativação da imunidade celular inata e adaptativa34.

[0055] Conforme divulgado na presente invenção, os Requerentes manipularam células T para (1) expressar um CAR de segunda geração específico de BCMA e (2) simultaneamente secretar um anti-NKG2D-anti- CS1 BsAb. Esses dados sugerem que essas células, doravante denominadas células T BsAb-CAR, representam uma terapia promissora para MM recorrente e/ou refratária e podem ser uma plataforma adequada para produzir a imunoterapia contra câncer baseada em CAR de próxima geração.

[0056] Essa combinação de um CAR e um anticorpo biespecífico baseado em anti-NKG2D como um único vetor transduzido em células T ainda não foi descrita na literatura. Os requerentes demonstraram que esta abordagem gera células T (células T BsAb CAR) que funcionam como células efetoras citolíticas potentes contra tumores. É fornecido na presente invenção um exemplo representativo de um CAR de célula T dirigido contra um alvo bem conhecido em mieloma múltiplo (MM),

chamado BCMA, e o anticorpo biespecífico baseado em anti-NKG2D reconhece o antígeno tumoral CS1 de MM bem descrito que o traz em estreita proximidade de qualquer célula efetora citolítica inata ou adaptativa contendo o antígeno NKG2D. No entanto, é contemplada na presente invenção a expansão para uma variedade de CARs complementares e anticorpos biespecíficos baseados em anti-NKG2D em um único vetor para então infectar células T e NK para eficácia antitumoral. Esta abordagem pode ser modificada para qualquer número de antígenos tumorais, como conhecido na técnica, por exemplo, EGFRVIII; CD70, mesotelina, CD123, CD19, CEA, CD133, Her2, ver Townsend et al. (2018) J. Exp. & Clinical Cancer Res. 37:163.

[0057] Como mostrado nos exemplos abaixo, um único vetor que distribui duas modalidades complementares dirigidas contra dois antígenos associados a tumores distintos em células de MM é superior a qualquer modalidade sozinha e é superior ao uso de células T infectadas sequencialmente com os dois construtos separados, um que codifica o CAR e o outro que codifica o anticorpo biespecífico baseado em anti- NKG2D. Além disso, quando a célula T (infectada com o vetor experimental que codifica tanto o CAR quanto o anticorpo biespecífico baseado em anti-NKG2D) encontra a célula MM que expressa ambos os antígenos, a célula T BsAb CAR sofre proliferação e sobrevivência potencializada in vitro e in vivo através da ativação mediada por NKG2D. Esses resultados são totalmente inesperados.

[0058] Em suma, os requerentes construíram células T BCMA CAR que também secretam anticorpos biespecíficos anti-NKG2D-anti-CS1; essas células têm como alvo eficaz as células de mieloma múltiplo (MM) BCMA(+) e/ou CS1(+). A secreção de anticorpos biespecíficos anti- NKG2D-anti-CS1 por células T BCMA CAR aumenta a proliferação de células T de CAR in vitro e a sobrevivência e proliferação de células T de CAR in vivo através da ativação mediada por NKG2D. As células T BCMA

CAR que secretam anticorpos biespecíficos anti-NKG2D-anti-CS1 apresentam significativamente melhor eficácia in vitro e in vivo contra alvos de células de tumor em comparação com terapias únicas com células T BCMA CAR ou células T que secretam anticorpo biespecífico anti-NKG2D-anti-CS1 sozinho. Esses resultados podem ser generalizados para uma variedade de CARs empregados da mesma maneira.

[0059] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm os mesmos significados como comumente entendidos por alguém versado na técnica à qual esta tecnologia pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos na presente invenção possam ser usados na prática ou teste da presente tecnologia, os métodos, dispositivos e materiais preferidos são agora descritos. Todas as publicações técnicas e de patentes citadas na presente invenção são incorporadas na presente invenção por referência em sua totalidade. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a presente tecnologia não tem o direito de antecipar tal divulgação em virtude de invenção anterior.

[0060] A prática da presente tecnologia irá empregar, a menos que indicado de outra forma, técnicas convencionais de cultura de tecidos, imunologia, biologia molecular, microbiologia, biologia celular e DNA recombinante, que fazem parte dos conhecimentos da técnica. Veja, por exemplo, Green e Sambrook eds. (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4ª edição; the series Ausubel et al. eds. (2015) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (2015) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; McPherson et al. (2006) PCR: The Basics (Garland Science); Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Greenfield ed. (2014) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2010)

Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 6th edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; patente US nº 4.683.195; Eds de Hames e Higgins. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Herdewijn ed. (2005) Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Buzdin and Lukyanov ed. (2007) Nucleic Acids Hybridization: Modern Applications; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Grandi ed. (2007) In Vitro Transcription and Translation Protocols, 2ª edição; Guisan ed. (2006) Immobilization of Enzymes and Cells; Perbal (1988) A Practical Guide to Molecular Cloning, 2ª edição; Miller and Calos eds, (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Lundblad and Macdonald eds. (2010) Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, 4ª edição; and Herzenberg et al. eds (1996) Weir’s Handbook of Experimental Immunology, 5ª edição; e as edições mais recentes, cada uma delas disponível no momento do depósito.

[0061] Todas as designações numéricas, por exemplo, pH, temperatura, tempo, concentração e peso molecular, incluindo faixas, são aproximações que são variadas (+) ou (-) por incrementos de 1,0 ou 0,1, conforme apropriado, ou alternativamente por uma variação de +/- 15%, ou alternativamente 10%, ou alternativamente 5%, ou alternativamente 2%. Deve ser entendido, embora nem sempre explicitamente declarado, que todas as designações numéricas são precedidas do termo “cerca de”. Também deve ser entendido, embora nem sempre explicitamente declarado, que os reagentes descritos na presente invenção são meramente exemplificadores e que equivalentes dos mesmos são conhecidos na técnica.

[0062] Deve ser inferido sem recitação explícita e a menos que de outra forma pretendido, que quando a presente tecnologia se refere a um polipeptídeo, proteína, polinucleotídeo ou anticorpo, um equivalente ou equivalente biologicamente de tal é pretendido dentro do escopo da presente tecnologia.

Definições

[0063] Conforme usado no relatório descritivo e nas Reivindicações, as formas singulares “um”, “uma” e “o, a” incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Por exemplo, o termo “uma célula” inclui uma pluralidade de células, incluindo as misturas das mesmas.

[0064] Como usado na presente invenção, o termo “animal” se refere a organismos vertebrados multicelulares vivos, uma categoria que inclui, por exemplo, mamíferos e pássaros. O termo “mamífero” inclui mamíferos humanos e não humanos.

[0065] Os termos “sujeito”, “hospedeiro”, “indivíduo” e “paciente” são usados indistintamente aqui para se referir a sujeitos humanos e veterinários, por exemplo, humanos, animais, primatas não humanos, cães, gatos, ovelhas, camundongos, cavalos e vacas. Em algumas modalidades, o sujeito é um humano.

[0066] Como usado na presente invenção, o termo “anticorpo” se refere coletivamente a imunoglobulinas ou moléculas semelhantes a imunoglobulinas, incluindo a título de exemplo e sem limitação, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, combinações das mesmas e moléculas semelhantes produzidas durante uma resposta imune em quaisquer vertebrados, por exemplo, em mamíferos como humanos, cabras, coelhos e camundongos, bem como em espécies não mamíferas, como imunoglobulinas de tubarão. A menos que especificamente indicado de outra forma, o termo

“anticorpo” inclui imunoglobulinas intactas e “fragmentos de anticorpo” ou “fragmentos de ligação ao antígeno” que se ligam especificamente a uma molécula de interesse (ou um grupo de moléculas de interesse altamente semelhantes) para a exclusão substancial de ligação a outras moléculas (por exemplo, anticorpos e fragmentos de anticorpos que têm uma constante de ligação para a molécula de interesse que é pelo menos 103 M-1 maior, pelo menos 104 M-1 maior ou pelo menos 105 M-1 maior do que uma constante de ligação para outras moléculas em uma amostra biológica). O termo “anticorpo” também inclui formas geneticamente modificadas, como anticorpos quiméricos (por exemplo, anticorpos de murinos ou humanizados não primatas), anticorpos heteroconjugados (como anticorpos biespecíficos). Ver também, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.); Owen et al., Kuby Immunology, 7º Ed., W.H. Freeman & Co., 2013; Murphy, Janeway’s Immunobiology, 8th Ed., Garland Science, 2014; Male et al., Immunology (Roitt), 8th Ed., Saunders, 2012; Parham, The Immune System, 4th Ed., Garland Science, 2014.

[0067] Como usado na presente invenção, o termo “anticorpo monoclonal” se refere a um anticorpo produzido por um único clone de linfócitos B ou por uma célula na qual os genes da cadeia leve e pesada de um único anticorpo foram transfectados. Os anticorpos monoclonais são produzidos por métodos conhecidos pelos versados na técnica, por exemplo, produzindo células híbridas formadoras de anticorpos a partir de uma fusão de células de mieloma com células do baço imunológico. Os anticorpos monoclonais incluem anticorpos monoclonais humanizados.

[0068] Em termos de estrutura de anticorpo, uma imunoglobulina tem cadeias pesadas (H) e cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfeto. Existem dois tipos de cadeia leve, lambda (λ) e kappa () Existem cinco classes principais de cadeia pesada (ou isotipos) que determinam a atividade funcional de uma molécula de anticorpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Cada cadeia pesada e leve contém uma região constante e uma região variável (as regiões também são conhecidas como “domínios”). Em combinação, as regiões variáveis de cadeia pesada e leve ligam-se especificamente ao antígeno. As regiões variáveis da cadeia leve e pesada contêm uma região de “estrutura” interrompida por três regiões hipervariáveis, também chamadas de “regiões determinantes de complementaridade” ou “CDRs”. A extensão da região de estrutura e as CDRs foram definidas (Veja, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991, que é incorporada na presente invenção por referência). O banco de dados de Kabat agora é mantido online. As sequências das regiões de estrutura de diferentes cadeias leves ou pesadas são relativamente conservadas dentro de uma espécie. A região de estrutura de um anticorpo, que são as regiões de estrutura combinadas das cadeias leves e pesadas constituintes, em grande parte adota uma conformação de β-folha e as CDRs formam laços que se conectam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura de β-folha. Assim, as regiões de estrutura atuam para formar uma estrutura que fornece o posicionamento das CDRs na orientação correta por interações não covalentes entre cadeias.

[0069] As CDRs são principalmente responsáveis pela ligação a um epítopo de um antígeno. As CDRs de cada cadeia são tipicamente referidas como CDR1, CDR2 e CDR3, numeradas sequencialmente a partir do terminal N, e também são tipicamente identificados pela cadeia em que a CDR particular está localizada (regiões de cadeia pesada marcadas como CDHR e regiões de cadeia leve marcadas como CDLR). Assim, uma CDHR3 é a CDR3 do domínio variável de cadeia pesada do anticorpo em que se encontra, enquanto uma CDLR1 é a CDR1 do domínio variável de cadeia leve do anticorpo no qual se encontra. Por exemplo, um anticorpo TNT terá uma sequência de região VH específica e de região de VL única para o antígeno relevante TNT e, portanto, as sequências CDR específicas. Os anticorpos com diferentes especificidades (ou seja, diferentes locais de combinação para diferentes antígenos) têm diferentes CDRs. Embora sejam as CDRs que variam de anticorpo para anticorpo, apenas um número limitado de posições de aminoácidos dentro das CDRs está diretamente envolvido na ligação ao antígeno. Essas posições dentro das CDRs são chamadas de resíduos de determinação de especificidade (SDRs).

[0070] Como usado na presente invenção, o termo “antígeno” se refere a um composto, composição ou substância que pode ser especificamente ligada pelos produtos de imunidade humoral ou celular específica, como uma molécula de anticorpo ou receptor de células T. Os antígenos podem ser qualquer tipo de molécula, incluindo, por exemplo, haptenos, metabólitos intermediários simples, açúcares (por exemplo, oligossacarídeos), lipídios e hormônios, bem como macromoléculas, como carboidratos complexos (por exemplo, polissacarídeos), fosfolipídeos e proteínas. As categorias comuns de antígenos incluem, mas sem limitação, antígenos virais, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos, protozoários e outros antígenos parasitários, antígenos tumorais, antígenos envolvidos em doenças autoimunes, alergia e rejeição de enxerto, toxinas e outros antígenos diversos.

[0071] Como usado na presente invenção, o termo “domínio de ligação ao antígeno” se refere a qualquer proteína ou domínio de polipeptídeo que pode se ligar especificamente a um alvo de antígeno.

[0072] Como usado na presente invenção, o termo “autólogo”, em referência a células, se refere a células que são isoladas e infundidas de volta no mesmo sujeito (receptor ou hospedeiro). “Alogênico” se refere a células não autólogas.

[0073] Como usado na presente invenção, o termo “célula B” se refere a um tipo de linfócito na imunidade humoral do sistema imunológico adaptativo. As células B funcionam principalmente para produzir anticorpos, atuam como células apresentadoras de antígenos, liberam citocinas e desenvolvem células B de memória após ativação por interação com o antígeno. As células B se distinguem de outros linfócitos, como as células T, pela presença de um receptor de células B na superfície celular. As células B podem ser isoladas ou obtidas de uma fonte comercialmente disponível. Exemplos não limitantes de linhagens de células B comercialmente disponíveis incluem as linhagens AHH-1 (ATCC® CRL-8146™), BC-1 (ATCC® CRL-2230™), BC-2 (ATCC® CRL- 2231™), BC-3 (ATCC® CRL-2277™), CA46 (ATCC® CRL-1648™), DG-75 [D.G.-75] (ATCC® CRL-2625™), DS-1 (ATCC® CRL-11102™), EB-3 [EB3] (ATCC® CCL-85™), Z-138 (ATCC #CRL-3001), DB (ATCC CRL-2289), Toledo (ATCC CRL-2631), Pfiffer (ATCC CRL-2632), SR (ATCC CRL-2262), JM-1 (ATCC CRL-10421), NFS-5 C-1 (ATCC CRL-1693); NFS-70 C10 (ATCC CRL-1694), NFS-25 C-3 (ATCC CRL-1695), e SUP-B15 (ATCC CRL- 1929). Outros exemplos incluem, mas sem limitação linhagens de células derivadas de linfomas anaplásicos e de células grandes, por exemplo, DEL, DL-40, FE-PD, JB6, Karpas 299, Ki-JK, Mac-2A Ply1, SR-786, SU- DHL-1, -2, -4, -5,-6,-7,-8,-9,-10, and -16, DOHH-2, NU-DHL-1, U-937, Granda 519, USC-DHL-1, RL; linfomas de Hodgkin, por exemplo, DEV, HD-70, HDLM-2, HD-MyZ, HKB-1, KM-H2, L 428, L 540, L1236, SBH-1, SUP-HD1, SU/RH-HD-l. Fontes exemplificadoras não limitantes para tais linhagens de células comercialmente disponíveis incluem Type Culture Collection, or ATCC, (http://www.atcc.org/) and the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (https://www.dsmz.de/).

[0074] Como usado na presente invenção, um “câncer” é um estado de doença caracterizado pela presença em um sujeito de células que demonstram replicação descontrolada anormal e, em alguns aspectos, o termo pode ser usado de forma intercambiável com o termo “tumor”. O termo “antígeno de câncer ou de tumor” se refere a um antígeno conhecido por estar associado e expresso na superfície com uma célula cancerosa ou célula tumoral ou tecido, e o termo “anticorpo alvo de câncer ou de tumor” se refere a um anticorpo que tem como alvo tal antígeno.

[0075] O termo “receptor de antígeno quimérico” (CAR), como usado na presente invenção, se refere a uma proteína fundida que compreende um domínio extracelular capaz de se ligar a um antígeno, um domínio transmembrana derivado de um polipeptídeo diferente de um polipeptídeo do qual o domínio extracelular é derivado, e pelo menos um domínio intracelular. O “receptor de antígeno quimérico (CAR)” às vezes é chamado de “receptor quimérico”, “corpo T” ou “receptor imunológico quimérico (CIR)”. O “domínio extracelular capaz de se ligar a um antígeno” significa qualquer oligopeptídeo ou polipeptídeo que pode se ligar a um determinado antígeno. O “domínio intracelular” ou “domínio de sinalização intracelular” significa qualquer oligopeptídeo ou polipeptídeo conhecido por funcionar como um domínio que transmite um sinal para causar ativação ou inibição de um processo biológico em uma célula. Em certas modalidades, o domínio intracelular pode compreender, alternativamente consistir essencialmente em, ou ainda compreender adicionalmente um ou mais domínios de sinalização coestimuladores, além do domínio de sinalização primário. O “domínio transmembrana” significa qualquer oligopeptídeo ou polipeptídeo conhecido por abranger a membrana celular e que pode funcionar para ligar os domínios extracelular e de sinalização. Um receptor de antígeno quimérico pode opcionalmente compreender um “domínio de dobradiça” que serve como um ligante entre os domínios extracelular e transmembrana. Exemplos não limitantes de tais domínios são fornecidos na presente invenção, por exemplo: Domínio de dobradiça: Sequência de codificação de dobradiça de cadeia pesada de IgG1:

CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTG

CCCG O exemplo não limitante adicional inclui uma região de dobradiça de IgG4, domínios de IgD e CD8, como conhecidos na técnica.

Domínio transmembrana: Sequência de codificação da região transmembrana de CD28:

TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAG

CTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG Domínio intracelular: Sequência de codificação da região de sinalização coestimuladora 4-1BB:

AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTT ATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCG

ATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG Domínio intracelular: Sequência de codificação da região de sinalização coestimuladora CD28:

AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACAT GACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGC

CCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC Domínio intracelular: Sequência de codificação da região de sinalização de CD3 zeta:

AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGC AGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGA GTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGG AAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAG AAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAG CGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACA GCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCT CGCTAA

[0076] Outras modalidades de cada componente de domínio exemplificador incluem outras proteínas que têm função biológica análoga que compartilham pelo menos 70% ou, alternativamente, pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos, de preferência, 90% de identidade de sequência, com mais preferência pelo menos 95% de identidade de sequência com as proteínas codificadas pelas sequências de ácido nucleico divulgadas acima. Além disso, exemplos não limitantes de tais domínios são fornecidos aqui.

[0077] Como usado na presente invenção, o termo “domínio de dobradiça CD8 α” se refere a um fragmento de proteína específico associado a este nome e quaisquer outras moléculas que têm função biológica análoga que compartilham pelo menos 70%, ou alternativamente pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos, de preferência 90% de identidade de sequência, com mais preferência, pelo menos 95% identidade de sequência com a sequência de domínio de dobradiça CD8 α como mostrado aqui. As sequências de exemplo de domínio de dobradiça de CD8 α para humanos, camundongos e outras espécies são fornecidas emPinto, R.D. et al. (2006) Vet. Immunol. Immunopathol. 110:169-177. As sequências associadas ao domínio de dobradiça de CD8 α são fornecidas em Pinto, R.D. et al. (2006) Vet. Immunol. Immunopathol. 110:169-177. Exemplos não limitantes de tais incluem: Domínio de dobradiça de CD8 alfa humano:

PAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY Domínio de dobradiça de CD8 alfa de camundongo:

KVNSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIY Domínio de dobradiça de Cat CD8 alfa:

PVKPTTTPAPRPPTQAPITTSQRVSLRPGTCQPSAGSTVEASGLDLSCDIY

[0078] Como usado na presente invenção, o termo “domínio transmembrana CD8 α” se refere a um fragmento de proteína específico associado a este nome e quaisquer outras moléculas que têm função biológica análoga que compartilham pelo menos 70%, ou alternativamente pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos, de preferência 90% de identidade de sequência, com mais preferência pelo menos 95% identidade de sequência com a sequência de domínio transmembrana CD8 α como mostrado aqui. As sequências de fragmentos associadas às posições de aminoácidos 183 a 203 da cadeia CD8 alfa de glicoproteína de superfície de células T humanas (nº de acesso do GenBank: NP_001759.3), ou as posições de aminoácidos 197 a 217 da cadeia CD8 alfa de glicoproteína de superfície de células T de camundongo (nº de acesso do GenBank: NP_001074579.1), e as posições de aminoácidos 190 a 210 da cadeia CD8 alfa da glicoproteína de superfície de células T de rato (nº de acesso do GenBank: NP_ 113726.1) fornecem sequências de exemplo adicionais do domínio transmembrana CD8 α. As sequências associadas a cada um dos números de acesso listados são fornecidas da seguinte forma: domínio transmembrana CD8 alfa humano:

IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT domínio transmembrana CD8 alfa de camundongo:

IWAPLAGICVALLLSLIITLI domínio transmembrana CD8 alfa de rato:

IWAPLAGICAVLLLSLVITLI

[0079] Como usado na presente invenção, o termo “domínio transmembrana CD28” se refere a um fragmento de proteína específico associado a este nome e quaisquer outras moléculas que têm função biológica análoga que compartilham pelo menos 70% ou, alternativamente, pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos, pelo menos 90% de identidade de sequência ou, alternativamente, pelo menos 95% identidade de sequência com a sequência de domínio transmembrana CD28 como mostrado aqui. As sequências de fragmentos associadas aos números de acesso do GenBank: XM_006712862.2 e XM_009444056.1 fornecem sequências de exemplo adicionais, não limitantes do domínio transmembrana CD28. As sequências associadas a cada um dos números de acesso listados são fornecidas aqui.

[0080] Como usado na presente invenção, o termo “região de sinalização coestimuladora 4-1BB”se refere a um fragmento de proteína específico associado a este nome e quaisquer outras moléculas que têm função biológica análoga que compartilham pelo menos 70%, ou alternativamente pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos, de preferência, 90% de identidade de sequência, com mais preferência, pelo menos 95% identidade de sequência com a sequência da região de sinalização coestimuladora 4-1BB como mostrado aqui. Sequências de exemplo não limitantes da região de sinalização coestimuladora 4-1BB são fornecidas na publicação US 20130266551A1 (depositada como Pedido de Patente US nº 13/826.258), tal como a sequência exemplificadora fornecida abaixo: Região de sinalização coestimuladora 4-1BB:

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

[0081] Como usado na presente invenção, o termo “região de sinalização coestimuladora de CD28” se refere a um fragmento de proteína específico associado a este nome e quaisquer outras moléculas que têm função biológica análoga que compartilham pelo menos 70% ou, alternativamente, pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos, de preferência, 90% de identidade de sequência, com mais preferência, pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência da região de sinalização coestimuladora de CD28 mostrada aqui. As sequências de exemplo de domínio de sinalização coestimuladora de CD28 são fornecidas na Patente US nº 5.686.281; Geiger, T.L. et al., Blood 98: 2364-2371 (2001); Hombach, A. et al., J Immunol 167: 6123- 6131 (2001); Maher, J. et al. Nat Biotechnol 20: 70-75 (2002); Haynes, N.M. et al., J Immunol 169: 5780-5786 (2002); Haynes, N.M. et al., Blood 100: 3155-3163 (2002). Os exemplos não limitantes incluem os resíduos 114-220 da sequência de CD28 abaixo: MLRLLLALNL FPSIQVTGNK

ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE FRASLHKGLDSAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPPPYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG

GVLACYSLLVTVAFIIFWVR SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS, e equivalentes dos mesmos.

[0082] Como usado na presente invenção, o termo “região de sinalização coestimuladora ICOS”se refere a um fragmento de proteína específico associado a este nome e quaisquer outras moléculas que têm função biológica análoga que compartilham pelo menos 70%, ou alternativamente pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos, de preferência, 90% de identidade de sequência, com mais preferência, pelo menos 95% identidade de sequência com a sequência da região de sinalização coestimuladora ICOS como mostrado aqui. Sequências de exemplo não limitantes da região de sinalização coestimuladora ICOS são fornecidas na Publicação US 2015/0017141A1 na sequência de polinucleotídeos exemplificadora fornecida abaixo.

Sequência de codificação da região de sinalização coestimuladora ICOS:

ACAAAAAAGA AGTATTCATC CAGTGTGCAC GACCCTAACG GTGAATACAT GTTCATGAGA GCAGTGAACA CAGCCAAAAA ATCCAGACTC ACAGATGTGA CCCTA

[0083] Como usado na presente invenção, o termo “região de sinalização coestimuladora OX40” se refere a um fragmento de proteína específico associado a este nome e quaisquer outras moléculas que têm função biológica análoga que compartilham pelo menos 70%, ou alternativamente, pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos, ou alternativamente 90% de identidade de sequência, ou alternativamente pelo menos 95 % identidade de sequência com a sequência da região de sinalização coestimuladora OX40 como mostrado aqui. Sequências de exemplo não limitantes da região de sinalização coestimuladora OX40 são divulgadas na Publicação US 2012/20148552A1, e incluem a sequência exemplificadora fornecida abaixo.

Sequência de codificação da região de sinalização coestimuladora OX40:

AGGGACCAG AGGCTGCCCC CCGATGCCCA CAAGCCCCCT

GGGGGAGGCA GTTTCCGGAC CCCCATCCAA GAGGAGCAGG CCGACGCCCA CTCCACCCTG GCCAAGATC, e equivalentes dos mesmos.

[0084] Como usado na presente invenção, o termo “região de sinalização coestimuladora de CD28” se refere a um fragmento de proteína específico associado a este nome e quaisquer outras moléculas que têm função biológica análoga que compartilham pelo menos 70% ou, alternativamente, pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos, ou alternativamente 90% de identidade de sequência ou, alternativamente, pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência da região de sinalização coestimuladora de CD28 mostrada na presente invenção. As sequências de exemplo de domínio de sinalização coestimuladora CD28 são fornecidas na Patente US n° 5.686.281; Geiger, T.L. et al. (2001) Blood 98: 2364-2371; Hombach, A. et al. (2001) J Immunol 167: 6123-6131; Maher, J. et al. (2002) Nat Biotechnol 20: 70- 75; Haynes, N.M. et al. (2002) J Immunol 169: 5780-5786 (2002); Haynes, N.M. et al. (2002) Blood 100: 3155-3163. Exemplos não limitantes incluem os resíduos 114-220 do seguinte e a sequência codificada:

Sequência CD28: MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV

AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE FRASLHKGLDSAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPPPYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG

[0085] Como usado na presente invenção, o termo “domínio de sinalização de CD3 zeta” se refere a um fragmento de proteína específico associado a este nome e a quaisquer outras moléculas que têm função biológica análoga que compartilham pelo menos 70%, ou alternativamente pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos, de preferência 90% de identidade de sequência, com mais preferência pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de domínio de sinalização de CD3 zeta como mostrado aqui. Sequências de exemplo não limitantes do domínio de sinalização de CD3 zeta são fornecidas no Pedido US nº 13/826.258, por exemplo:

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKP RRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATK DTYDALHMQALPPR

[0086] Como usado na presente invenção, o termo NKG2D se refere a um receptor de ativação que recentemente gerou considerável interesse. Vários ligantes alvos de NKG2D foram identificados. O mais intrigante deles é um par de proteínas intimamente relacionadas chamadas MICA e MICB (complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I relacionado à cadeia).

[0087] Como usado na presente invenção, o termo ULBP se refere a um membro da família de proteínas de ligação eUL16.

[0088] Uma “composição” normalmente se destina a uma combinação do agente ativo, por exemplo, composto ou composição e um carreador de ocorrência natural ou não natural, inerte (por exemplo, um agente ou marcador detectável) ou ativo, tal como um adjuvante, diluente, ligante, estabilizador, tampões, sais, solventes lipofílicos, conservante, adjuvante ou semelhantes e incluem veículos farmaceuticamente aceitáveis. Os transportadores também incluem excipientes farmacêuticos e proteínas aditivas, peptídeos, aminoácidos, lipídios e carboidratos (por exemplo, açúcares, incluindo monossacarídeos, di-, tri-, tetra-oligossacarídeos e oligossacarídeos; açúcares derivatizados, tais como alditóis, ácidos aldônicos, açúcares esterificados e semelhantes; e polissacáridos ou polímeros de açúcar), que podem estar presentes isoladamente ou em combinação, compreendendo isoladamente ou em combinação 1 a 99,99% em peso ou volume. Excipientes de proteína exemplificadores incluem albumina de soro, como albumina de soro humano (HSA), albumina humana recombinante (rHA), gelatina, caseína e semelhantes. Componentes de aminoácido/anticorpo representativos, que também podem funcionar em uma capacidade de tamponamento, incluem alanina, arginina, glicina, arginina, betaína, histidina, ácido glutâmico, ácido aspártico, cisteína, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartame e semelhantes. Excipientes de carboidratos também se destinam ao escopo desta tecnologia, exemplos dos quais incluem, mas sem limitação monossacarídeos, tais como frutose, maltose, galactose, glicose, D-manose, sorbose e semelhantes; dissacarídeos, tais como lactose, sacarose, trealose, celobiose e semelhantes; polissacarídeos, tais como rafinose, melezitose, maltodextrinas, dextranos, amidos e semelhantes; e alditóis, tais como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol) e mioinositol.

[0089] Como usado na presente invenção, o termo “compreendendo” se destina a significar que as composições e métodos incluem os elementos recitados, mas não excluem outros. “Consistindo essencialmente em” quando usado para definir composições e métodos, deve significar a exclusão de outros elementos de qualquer significado essencial para a combinação para o uso pretendido. Por exemplo, uma composição que consiste essencialmente nos elementos conforme definido na presente invenção não excluiria traços de contaminantes do método de isolamento e purificação e veículos farmaceuticamente aceitáveis, tais como solução salina tamponada com fosfato, conservantes e semelhantes. “Consistindo em” deve significar a exclusão de mais do que elementos traços de outros ingredientes e etapas substanciais do método para administrar as composições aqui divulgadas. Os aspectos definidos por cada um desses termos de transição estão dentro do escopo da presente divulgação.

[0090] O termo “sequência de consenso”, como usado na presente invenção, se refere a uma sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos que é determinada pelo alinhamento de uma série de múltiplas sequências e que define uma sequência idealizada que representa a escolha predominante de aminoácido ou base em cada posição correspondente das sequências múltiplas. Dependendo das sequências da série de sequências múltiplas, a sequência de consenso para a série pode diferir de cada uma das sequências por zero, uma, algumas ou mais substituições. Além disso, dependendo das sequências da série de sequências múltiplas, mais de uma sequência de consenso pode ser determinada para a série. A geração de sequências de consenso foi submetida a análises matemáticas intensivas. Vários programas de software podem ser usados para determinar uma sequência de consenso.

[0091] Como usado na presente invenção, o termo “CRISPR” se refere a uma técnica de manipulação genética de sequência específica que se baseia na via de repetições palindrômicas curtas regularmente interespaçadas e agrupadas. CRISPR pode ser usado para realizar edição de genes e/ou regulação de genes, bem como simplesmente direcionar proteínas para uma localização genômica específica. A edição de genes se refere a um tipo de engenharia genética em que a sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo alvo é alterada através da introdução de deleções, inserções ou substituições de bases na sequência de polinucleotídeos. Em alguns aspectos, a edição de genes mediada por CRISPR utiliza as vias de união de extremidade não homóloga (NHEJ) ou recombinação homóloga para realizar as edições. A regulação gênica se refere a aumentar ou diminuir a produção de produtos gênicos específicos, como proteínas ou RNA.

[0092] O termo “gRNA” ou “RNA guia”, como usado na presente invenção, se refere às sequências de RNA guia usadas para direcionar genes específicos para correção empregando a técnica de CRISPR. As técnicas de concepção de gRNAs e polinucleotídeos terapêuticos doadores para a especificidade do alvo são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, Doench, J., et al. Nature biotechnology 2014; 32(12):1262-7, Mohr, S. et al. (2016) FEBS Journal 283: 3232-38, and Graham, D., et al. Genome Biol. 2015; 16: 260. gRNA compreende ou, alternativamente, consiste essencialmente em, ou ainda consiste em um polinucleotídeo de fusão compreendendo CRISPR RNA (crRNA) e CRIPSPR RNA de ativação trans (tracrRNA); ou um polinucleotídeo compreendendo CRISPR RNA (crRNA) e CRIPSPR RNA transativador (tracrRNA). Em alguns aspectos, um gRNA é sintético (Kelley, M. et al. (2016) J of Biotechnology 233 (2016) 74-83). Como usado na presente invenção, um equivalente biológico de um gRNA inclui, mas não está limitado a polinucleotídeos ou moléculas de direcionamento que podem guiar um Cas9 ou equivalente do mesmo para uma sequência de nucleotídeos específica, como uma região específica do genoma de uma célula.

[0093] “Terapia citorredutora”, como usado na presente invenção, inclui, mas não está limitada a quimioterapia, crioterapia e radioterapia. Os agentes que atuam para reduzir a proliferação celular são conhecidos na técnica e amplamente utilizados. Os medicamentos quimioterápicos que matam as células cancerosas apenas quando estão se dividindo são denominados específicos do ciclo celular. Esses fármacos incluem agentes que atuam na fase-S, incluindo inibidores da topoisomerase e antimetabólitos.

[0094] Os inibidores da toposiomerase são fármacos que interferem na ação das enzimas topoisomerase (topoisomerase I e II). Durante o processo de quimioterapia, as enzimas topoisomerase controlam a manipulação da estrutura do DNA necessária para a replicação e, portanto, são específicas do ciclo celular. Exemplos de inibidores da topoisomerase I incluem os análogos do camptotecano listados acima, irinotecano e topotecano. Exemplos de inibidores da topoisomerase II incluem amsacrina, etoposídeo, fosfato de etoposídeo e teniposídeo.

[0095] Os antimetabólitos são geralmente análogos de substratos metabólicos normais, frequentemente interferindo nos processos envolvidos na replicação cromossômica. Eles atacam as células em fases muito específicas do ciclo. Os antimetabólitos incluem antagonistas do ácido fólico, por exemplo, metotrexato; antagonista de pirimidina, por exemplo, 5-fluorouracila, foxuridina, citarabina, capecitabina e gencitabina; antagonista de purina, por exemplo, 6-mercaptopurina e 6- tioguanina; inibidor da adenosina desaminase, por exemplo, cladribina, fludarabina, nelarabina e pentostatina; e semelhantes.

[0096] Os alcaloides vegetais são derivados de certos tipos de plantas. Os alcaloides da vinca são produzidos a partir da planta pervinca (Catharanthus rosea) os taxanos são feitos da casca da árvore Pacific Yew (taxus). Os alcaloides e taxanos da vinca também são conhecidos como agentes antimicrotúbulos. As podofilotoxinas são derivadas da planta da maçã de maio. Os análogos do camptotecano são derivados da “árvore feliz” asiática (Camptotheca acuminata) As podofilotoxinas e análogos do camptotecano também são classificados como inibidores da topoisomerase. Os alcaloides vegetais são geralmente específicos do ciclo celular.

[0097] Exemplos destes agentes incluem alcaloides de vinca, por exemplo, vincristina, vinblastina e vinorelbina; taxanos, por exemplo, paclitaxel e docetaxel; podofilotoxinas, por exemplo, etoposídeo e tenisopídeo; e análogos de camptotecano, por exemplo, irinotecano e topotecano.

[0098] A crioterapia inclui, mas não está limitada a, terapias que envolvem a diminuição da temperatura, por exemplo, terapia hipotérmica.

[0099] A radioterapia inclui, mas não está limitada a, exposição à radiação, por exemplo, radiação ionizante, radiação UV, como é conhecido na técnica. Dosagens exemplificadoras incluem, mas sem limitação, uma dose de radiação ionizante em uma faixa de pelo menos cerca de 2 Gy a não mais que cerca de 10 Gy e/ou uma dose de radiação ultravioleta em uma faixa de pelo menos cerca de 5 J/m2 a não mais do que cerca de 50 J/m2, geralmente cerca de 10 J/m2.

[0100] Como usado na presente invenção, o termo “marcador detectável” se refere a pelo menos um marcador capaz de, direta ou indiretamente, produzir um sinal detectável. Uma lista não exaustiva deste marcador inclui enzimas que produzem um sinal detectável, por exemplo, por colorimetria, fluorescência, luminescência, como peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, β-galactosidase, glicose-6-fosfato desidrogenase, cromóforos como fluorescente, luminescente corantes, grupos com densidade eletrônica detectada por microscopia eletrônica ou por sua propriedade elétrica, como condutividade, amperometria, voltametria, impedância, grupos detectáveis, por exemplo, cujas moléculas são de tamanho suficiente para induzir modificações detectáveis em suas propriedades físicas e/ou químicas, tal a detecção pode ser realizada por métodos ópticos, como difração, ressonância de plásmons de superfície, variação de superfície, a mudança do ângulo de contato ou métodos físicos, como espectroscopia de força atômica, efeito de túnel ou moléculas radioativas, como 32 P, 35 S ou 125 I.

[0101] Uma “quantidade eficaz” ou “quantidade eficaz” se refere à quantidade de um agente, ou quantidades combinadas de dois ou mais agentes, que, quando administrada para o tratamento de um mamífero ou outro sujeito, é suficiente para efetuar tal tratamento para a doença. A “quantidade eficaz” irá variar dependendo do(s) agente(s), da doença e sua gravidade e da idade, peso, etc., do sujeito em tratamento.

[0102] O termo “codificar” conforme aplicado a sequências de ácido nucleico se refere a um polinucleotídeo que é dito “codificar” um polipeptídeo se, em seu estado nativo ou quando manipulado por métodos bem conhecidos pelos versados na técnica, puder ser transcrito e/ou traduzido para produzir o mRNA para o polipeptídeo e/ou um fragmento do mesmo. A cadeia anti-sentido é o complemento de um tal ácido nucleico, e a sequência de codificação pode ser deduzida a partir da mesma.

[0103] Como usado na presente invenção, o termo “potencializador”, como usado na presente invenção, denota elementos de sequência que aumentam, aprimoram ou melhoram a transcrição de uma sequência de ácidos nucleicos independentemente da sua localização e orientação em relação à sequência de ácido nucleico a ser expressa. Um potencializador pode aumentar a transcrição de um único promotor ou simultaneamente de mais de um promotor. Contanto que esta funcionalidade de melhorar a transcrição seja retida ou substancialmente retida (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% da atividade de tipo selvagem, isto é, a atividade de um corpo inteiro), quaisquer variantes truncadas, mutadas ou modificadas de outra forma de uma sequência potencializadora de tipo selvagem também estão dentro da definição acima.

[0104] Em um aspecto, o termo “equivalente” ou “equivalente biológico”

de um anticorpo significa a capacidade do anticorpo de se ligar seletivamente à sua proteína epítopo ou fragmento da mesma, conforme medido por ELISA ou outros métodos adequados. Anticorpos biologicamente equivalentes incluem, mas sem limitação, aqueles anticorpos, peptídeos, fragmentos de anticorpos, variantes de anticorpos, derivados de anticorpos e miméticos de anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência.

[0105] Deve ser inferido sem recitação explícita e a menos que de outra forma pretendido, que quando a presente divulgação se refere a um polipeptídeo, proteína, polinucleotídeo ou anticorpo, um equivalente ou equivalente biologicamente de tal é pretendido dentro do escopo da presente tecnologia. Como usado na presente invenção, o termo “equivalente biológico do mesmo” se destina a ser sinônimo de “equivalente do mesmo” quando se refere a uma proteína, anticorpo, polipeptídeo ou ácido nucleico de referência, destina-se àqueles com homologia mínima, embora ainda mantendo a estrutura ou funcionalidade desejada. A menos que especificamente recitado aqui, está contemplado que qualquer polinucleotídeo, polipeptídeo ou proteína aqui mencionado também inclui seus equivalentes. Por exemplo, um equivalente pretende pelo menos cerca de 70% de homologia ou identidade, ou pelo menos 80% de homologia ou identidade e, alternativamente, ou pelo menos cerca de 85%, ou alternativamente, pelo menos cerca de 90%, ou alternativamente pelo menos cerca de 95%, ou alternativamente 98% de porcentagem de homologia ou identidade e exibe atividade biológica substancialmente equivalente à proteína, polipeptídeo ou ácido nucleico de referência. Alternativamente, quando se refere a polinucleotídeos, um equivalente dos mesmos é um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas com o polinucleotídeo de referência ou seu complemento.

[0106] Um polinucleotídeo ou região de polinucleotídeo (ou um polipeptídeo ou região de polipeptídeo) tendo uma certa porcentagem (por exemplo, 80%, 85%, 90% ou 95%) de “identidade de sequência” com outra sequência significa que, quando alinhada, essa porcentagem de bases (ou aminoácidos) é a mesma em comparação com as duas sequências. O alinhamento e a porcentagem de homologia ou de identidade de sequência podem ser determinados usando programas de software conhecidos na técnica, por exemplo aqueles descritos em Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1. De preferência, os parâmetros padrão são usados para alinhamento. Um programa de alinhamento preferido é o BLAST, usando parâmetros padrão. Em particular, os programas preferidos são BLASTN e BLASTP, usando os seguintes parâmetros padrão: Código genético = padrão; filtro = nenhum; fita = ambos; corte = 60; espectativa = 10; Matriz = BLOSUM62; Descrições = 50 sequências; classificar por = HIGH SCORE; Bancos de dados = não redundante, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + traduções CDS do GenBank + SwissProtein + SPupdate + PIR. Os detalhes desses programas podem ser encontrados no seguinte endereço de Internet: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST.

[0107] Como usado na presente invenção, o termo “expressão” se refere ao processo pelo qual os polinucleotídeos são transcritos em mRNA e/ou o processo pelo qual o mRNA transcrito é subsequentemente traduzido em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Se o polinucleotídeo for derivado de DNA genômico, a expressão pode incluir o splicing do mRNA em uma célula eucariótica. O nível de expressão de um gene pode ser determinado medindo a quantidade de mRNA ou proteína em uma amostra de célula ou tecido. Em um aspecto, o nível de expressão de um gene de uma amostra pode ser diretamente comparado ao nível de expressão desse gene de uma amostra de controle ou de referência. Em outro aspecto, o nível de expressão de um gene de uma amostra pode ser diretamente comparado ao nível de expressão desse gene da mesma amostra após a administração de um composto.

[0108] A frase “primeira linha” ou “segunda linha” ou “terceira linha” se refere à ordem de tratamento recebida por um paciente. Os regimes de terapia de primeira linha são tratamentos administrados em primeiro lugar, enquanto a terapia de segunda ou de terceira linha é administrada após a terapia de primeira linha ou após a terapia de segunda linha, respectivamente. O National Cancer Institute define a terapia de primeira linha como “o primeiro tratamento para uma doença ou condição”. Em pacientes com câncer, o tratamento primário pode ser cirurgia, quimioterapia, radioterapia ou uma combinação dessas terapias. A terapia de primeira linha também é referida aos versados na técnica como “terapia primária e tratamento primário”. Consulte o site do National Cancer Institute em www.cancer.gov, visitado pela última vez em 01 de maio de 2008. Normalmente, um paciente recebe um regime de quimioterapia subsequente porque o paciente não apresentou uma resposta clínica ou subclínica positiva à terapia de primeira linha ou a terapia de primeira linha foi interrompida.

[0109] Como usado na presente invenção, “homologia” ou “identidade”, porcentagem de “identidade” ou “similaridade”, quando usado no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências de polipeptídeos, se refere a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais ou têm uma porcentagem especificada de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos que são os mesmos, por exemplo, pelo menos 60% de identidade, de preferência, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou identidade superior sobre uma região especificada (por exemplo, sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo descrito na presente invenção ou sequência de aminoácidos de um anticorpo aqui descrito). A homologia pode ser determinada comparando uma posição em cada sequência que pode ser alinhada para efeitos de comparação. Quando uma posição na sequência comparada é ocupada pela mesma base ou aminoácido, então as moléculas são homólogas nessa posição.

Um grau de homologia entre as sequências é uma função do número de posições correspondentes ou homólogas compartilhadas pelas sequências.

O alinhamento e a porcentagem de homologia ou de identidade de sequência podem ser determinados usando programas de software conhecidos na técnica, por exemplo aqueles descritos em Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1. De preferência, os parâmetros padrão são usados para alinhamento.

Um programa de alinhamento preferido é o BLAST, usando parâmetros padrão.

Em particular, os programas preferidos são BLASTN e BLASTP, usando os seguintes parâmetros padrão: Código genético = padrão; filtro = nenhum; fita = ambos; corte = 60; espectativa = 10; Matriz = BLOSUM62; Descrições = 50 sequências; classificar por = HIGH SCORE; Bancos de dados = não redundante, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + traduções CDS do GenBank + SwissProtein + SPupdate + PIR.

Os detalhes desses programas podem ser encontrados no seguinte endereço de Internet: ncbi.nlm.nih.gov/cgi- bin/BLAST.

Os termos “homologia” ou “idêntico”, porcentagem de “identidade” ou “similaridade” também se referem a, ou podem ser aplicados a, o complemento de uma sequência de teste.

Os termos também incluem sequências que possuem deleções e/ou adições, bem como aquelas que possuem substituições.

Conforme descrito na presente invenção, os algoritmos preferidos podem ser responsáveis por lacunas e semelhantes.

De preferência, a identidade existe sobre uma região que tem pelo menos cerca de 25 aminoácidos ou nucleotídeos de comprimento, ou com mais preferência sobre uma região que tem pelo menos 50 a 100 aminoácidos ou nucleotídeos de comprimento.

Uma sequência “não relacionada” ou “não homóloga” compartilha menos de 40% de identidade ou, alternativamente, menos de 25% de identidade, com uma das sequências aqui divulgadas.

[0110] “Hibridização” se refere a uma reação na qual um ou mais polinucleotídeos reagem para formar um complexo que é estabilizado por meio de ligações de hidrogênio entre as bases dos resíduos de nucleotídeos. A ligação de hidrogênio pode ocorrer por emparelhamento de bases de Watson-Crick, ligação de Hoogstein ou de qualquer outra maneira específica de sequência. O complexo pode compreender duas fitas formando uma estrutura de duplexo, três ou mais fitas formando um complexo de fitas múltiplas, uma única fita auto-hibridizante ou qualquer combinação destas. Uma reação de hibridização pode constituir uma etapa de um processo mais extenso, como o início de uma reação de PCR ou a clivagem enzimática de um polinucleotídeo por uma ribozima.

[0111] Exemplos de condições de hibridização rigorosas incluem: temperaturas de incubação de cerca de 25 °C a cerca de 37 °C; concentrações de tampão de hibridização de cerca de 6x SSC a cerca de 10x SSC; concentrações de formamida de cerca de 0% a cerca de 25%; e soluções de lavagem de cerca de 4x SSC a cerca de 8x SSC. Exemplos de condições de hibridização moderadas incluem: temperaturas de incubação de cerca de 40 °C a cerca de 50 °C; concentrações de tampão de cerca de 9x SSC a cerca de 2x SSC; concentrações de formamida de cerca de 30% a cerca de 50%; e soluções de lavagem de cerca de 5x SSC a cerca de 2x SSC. Exemplos de condições rigorosas elevadas incluem: temperaturas de incubação de cerca de 55 °C a cerca de 68 °C; concentrações de tampão de cerca de 1x SSC a cerca de 0,1x SSC; concentrações de formamida de cerca de 55% a cerca de 75%; e soluções de lavagem de cerca de 1x SSC, 0,1x SSC ou água desionizada. Em geral, os tempos de incubação de hibridação são de 5 minutos a 24 horas, com 1, 2 ou mais etapas de lavagem, e os tempos de incubação de lavagem são de cerca de 1, 2 ou 15 minutos. SSC é NaCl 0,15 M e tampão de citrato 15 mM. Entende-se que equivalentes de SSC usando outros sistemas tampão podem ser empregados.

[0112] O termo “isolado”, como usado na presente invenção, se refere a moléculas ou materiais biológicos ou celulares sendo substancialmente isentos de outros materiais. Em um aspecto, o termo “isolado” se refere a ácido nucleico, como DNA ou RNA, ou proteína ou polipeptídeo (por exemplo, um anticorpo ou derivado do mesmo), ou célula ou organelo celular, ou tecido ou órgão, separado de outros DNAs ou RNAs, ou proteínas ou polipeptídeos, ou células ou organelas celulares, ou tecidos ou órgãos, respectivamente, que estão presentes na fonte natural. O termo “isolado” também se refere a um ácido nucleico ou peptídeo que é substancialmente livre de material celular, material viral ou meio de cultura quando produzido por técnicas de DNA recombinante ou precursores químicos ou outros produtos químicos quando sintetizado quimicamente. Além disso, um “ácido nucleico isolado” se destina a incluir fragmentos de ácido nucleico que não ocorrem naturalmente como fragmentos e não seriam encontrados no estado natural. O termo “isolado” também é usado na presente invenção para se referir a polipeptídeos que são isolados de outras proteínas celulares e se destina a abranger polipeptídeos purificados e recombinantes. O termo “isolado” também é usado na presente invenção para se referir a células ou tecidos que são isolados de outras células ou tecidos e se destina a abranger células ou tecidos cultivados e manipulados.

[0113] Como usado na presente invenção, o termo “célula isolada” geralmente se refere a uma célula que é substancialmente separada de outras células de um tecido.

[0114] “Células imunológicas” inclui, por exemplo, glóbulos brancos (leucócitos) que são derivados de células-tronco hematopoéticas (HSC) produzidas na medula óssea, linfócitos (células T, células B, células assassinas naturais (NK)) e células derivadas de mieloide (neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monócitos, macrófagos, células dendríticas).

[0115] Como usado na presente invenção, o termo “sequência de ligante”

se refere a qualquer sequência de aminoácidos que compreende 1 a 10, ou alternativamente, 8 aminoácidos ou, alternativamente, 6 aminoácidos ou, alternativamente, 5 aminoácidos que podem ser repetidos de 1 a 10, ou alternativamente a cerca de 8, ou alternativamente a cerca de 6, ou alternativamente cerca de 5 ou 4 ou alternativamente 3 ou, alternativamente, 2 vezes. Por exemplo, o ligante pode compreender até 15 resíduos de aminoácidos consistindo em um pentapeptídeo repetido três vezes. Em um aspecto, a sequência de ligante é um ligante de polipeptídeo flexível (Glycine4Serine)3 que compreende três cópias de gly- gly-gly-gly-ser.

[0116] Uma “célula normal correspondente ao tipo de tecido tumoral” se refere a uma célula normal de um mesmo tipo de tecido que o tecido tumoral. Um exemplo não limitante é uma célula pulmonar normal de um paciente com tumor no pulmão ou uma célula normal do cólon de um paciente com tumor no cólon.

[0117] Como usado na presente invenção, o termo “célula T” se refere a um tipo de linfócito que amadurece no timo. As células T desempenham um papel importante na imunidade mediada por células e se distinguem de outros linfócitos, como as células B, pela presença de um receptor de células T na superfície celular. As células T podem ser isoladas ou obtidas de uma fonte comercialmente disponível. “Célula T” inclui todos os tipos de células imunes que expressam CD3, incluindo células T auxiliares (células CD4+), células T citotóxicas (células CD8+), células T assassinas naturais, células T reguladoras (Treg) e células T gama-delta. Uma “célula citotóxica” inclui células T CD8+, células assassinas naturais (NK) e neutrófilos, cujas células são capazes de mediar as respostas de citotoxicidade. Exemplos não limitantes de linhagens de células T comercialmente disponíveis incluem as linhagens BCL2 (AAA) Jurkat (ATCC® CRL-2902™), BCL2 (S70A) Jurkat (ATCC® CRL-2900™), BCL2 (S87A) Jurkat (ATCC® CRL-2901™), BCL2 Jurkat (ATCC® CRL-2899™),

Neo Jurkat (ATCC® CRL-2898™), linhagem de células T humanas citotóxicas TALL-104 (ATCC # CRL-11386). Outros exemplos incluem, mas sem limitação linhagens de células T maduras, por exemplo, tais como Deglis, EBT-8, HPB-MLp-W, HUT 78, HUT 102, Karpas 384, Ki 225, My-La, Se-Ax, SKW-3, SMZ-1 and T34; and immature T- cell lines, e.g., ALL-SIL, Be13, CCRF-CEM, CML-T1, DND-41, DU.528, EU-9, HD-Mar, HPB-ALL, H-SB2, HT-1, JK-T1, Jurkat, Karpas 45, KE-37, KOPT-K1, K- T1, L-KAW, Loucy, MAT, MOLT-1, MOLT 3, MOLT-4, MOLT 13, MOLT- 16, MT-1, MT-ALL, P12/Ichikawa, Peer, PER0117, PER-255, PF-382, PFI- 285, RPMI-8402, ST-4, SUP-T1 to T14, TALL-1, TALL-101, TALL-103/2, TALL-104, TALL-105, TALL-106, TALL-107, TALL-197, TK-6, TLBR-1, -2, -3, e -4, CCRF-HSB-2 (CCL-120.1), J.RT3-T3.5 (ATCC TIB-153), J45.01 (ATCC CRL-1990), J.CaM1.6 (ATCC CRL-2063), RS4;11 (ATCC CRL- 1873), CCRF-CEM (ATCC CRM-CCL-119); e linhagens de linfoma cutâneo de células T, por exemplo, HuT78 (ATCC CRM-TIB-161), MJ[G11] (ATCC CRL-8294), HuT102 (ATCC TIB-162). As linhagens de células de leucemia Null, incluindo, mas não se limitando a REH, NALL-1, KM-3, L92-221, são uma outra fonte comercialmente disponível de células imunes, assim como as linhagens de células derivadas de outras leucemias e linfomas, como K562 eritroleucemia, leucemia monocítica THP-1, linfoma U937, eritroleucemia HEL, leucemia HL60, leucemia HMC-1, leucemia KG-1, mieloma U266. Fontes exemplificadoras não limitantes para tais linhagens de células comercialmente disponíveis incluem Type Culture Collection, or ATCC, (http://www.atcc.org/) and the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (https://www.dsmz.de/).

[0118] Como usado na presente invenção, o termo “célula NK”, também conhecido como célula assassina natural, se refere a um tipo de linfócito que se origina na medula óssea e desempenha um papel crítico no sistema imunológico inato. As células NK fornecem respostas imunológicas rápidas contra células infectadas por vírus, células de tumor ou outras células estressadas, mesmo na ausência de anticorpos e complexo de histocompatibilidade principal nas superfícies celulares. As células NK podem ser isoladas ou obtidas de uma fonte comercialmente disponível. Exemplos não limitantes de linhagens de células NK comerciais incluem as linhagens NK-92 (ATCC® CRL-2407™), NK-92MI (ATCC® CRL-2408™). Outros exemplos incluem, mas não estão limitados às linhagens NK HANK1, KHYG-1, NKL, NK-YS, NOI-90, e YT. Fontes exemplificadoras não limitantes para tais linhagens de células comercialmente disponíveis incluem Type Culture Collection, or ATCC, (http://www.atcc.org/) and the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (https://www.dsmz.de/).

[0119] Como usado na presente invenção em referência a um polinucleotídeo regulador, o termo “operacionalmente ligado” se refere a uma associação entre o polinucleotídeo regulador e a sequência de polinucleotídeos à qual está ligado de modo que, quando uma proteína específica se liga ao polinucleotídeo regulador, o polinucleotídeo ligado é transcrito.

[0120] Como usado na presente invenção, o termo “superexpressa” em relação a uma célula, um tecido ou um órgão expressa uma proteína em uma quantidade que é maior do que a quantidade que é produzida em uma célula de controle, um problema de controle ou um órgão. Uma proteína que é superexpressa pode ser endógena para a célula hospedeira ou exógena para a célula hospedeira.

[0121] Os termos “polinucleotídeo” e “oligonucleotídeo” são usados indistintamente e se referem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos ou análogos dos mesmos. Os polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional e pode desempenhar qualquer função, conhecida ou desconhecida. Os seguintes não são exemplos limitantes de polinucleotídeos: um gene ou fragmento de gene (por exemplo, uma sonda, primer, EST ou SAGE tag), exons, íntrons, RNA mensageiro

(mRNA), RNA de transferência, RNA ribossômico, RNAi, ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e primers. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeos. Se presente, as modificações na estrutura do nucleotídeo podem ser transmitidas antes ou depois da montagem do polinucleotídeo. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes de não nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode ser modificado adicionalmente após a polimerização, tal como por conjugação com um componente de marcação. O termo também se refere a moléculas de fita simples- ou dupla-. A menos que especificado ou exigido de outra forma, qualquer aspecto desta tecnologia que seja um polinucleotídeo abrange tanto a forma de fita dupla- como cada uma das duas formas de fita simples- complementares conhecidas ou previstas para compor a forma de fita dupla-.

[0122] Como usado na presente invenção, os termos “sequência de ácido nucleico” e “polinucleotídeo” são usados indistintamente para se referir a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, seja ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. Assim, este termo inclui, mas não está limitado a, DNA ou RNA de fita simples, dupla ou múltipla, DNA genômico, cDNA, híbridos de DNA-RNA ou um polímero compreendendo bases de purina e pirimidina ou outras bases naturais, químicas ou bases de nucleotídeos bioquimicamente modificadas, não naturais ou derivatizadas.

[0123] O termo “promotor”, como usado na presente invenção, se refere a qualquer sequência que regula a expressão de uma sequência de codificação, como um gene. Os promotores podem ser constitutivos, indutíveis, reprimíveis ou específicos do tecido, por exemplo. Um

“promotor” é uma sequência de controle que é uma região de uma sequência de polinucleotídeos na qual a iniciação e a taxa de transcrição são controladas. Ela pode conter elementos genéticos nos quais as proteínas e moléculas reguladoras podem se ligar, como a RNA polimerase e outros fatores de transcrição. Exemplos não limitantes de promotores incluem o promotor EF1 alfa e o promotor CMV. A sequência de EF1 alfa é conhecida na técnica (ver, por exemplo, addgene.org/11154/sequences/; ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/J04617, each last accessed on March 13, 2019, and Zheng and Baum (2014) Int’l. J. Med. Sci. 11(5):404-408). A sequência de promotor CMV é conhecida na técnica (ver, por exemplo, snapgene.com/resources/plasmid- files/?set=basic_cloning_vectors&plasmid=CMV_promoter, acessado pela última vez em 13 de março de 2019 e Zheng and Baum (2014), supra.).

[0124] Os termos “proteína”, “peptídeo” e “polipeptídeo” são usados indistintamente e em seu sentido mais amplo para se referir a um composto de duas ou mais subunidades de aminoácidos, análogos de aminoácidos ou peptidomiméticos. As subunidades podem ser ligadas por ligações peptídicas. Em outro aspecto, a subunidade pode ser ligada por outras ligações, por exemplo, éster, éter, etc. Uma proteína ou peptídeo deve conter pelo menos dois aminoácidos e nenhuma limitação é colocada no número máximo de aminoácidos que podem compreender uma sequência de proteína ou de peptídeo. Como usado na presente invenção, o termo “aminoácido” se refere a aminoácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo glicina e ambos os isômeros ópticos D e L, análogos de aminoácidos e peptidomiméticos.

[0125] Como usado na presente invenção, o termo “purificado” não requer pureza absoluta; em vez disso, é um termo relativo. Assim, por exemplo, um ácido nucleico purificado, peptídeo, proteína, complexos biológicos ou outro composto ativo é aquele que é isolado no todo ou em parte de proteínas ou outros contaminantes. Geralmente, os peptídeos, proteínas, complexos biológicos ou outros compostos ativos substancialmente purificados para uso na divulgação compreendem mais de 80% de todas as espécies macromoleculares presentes em uma preparação antes da mistura ou formulação do peptídeo, proteína, complexo biológico ou outro composto ativo com um veículo, excipiente, tampão, agente de aumento da absorção, estabilizador, conservante, adjuvante ou outro co-ingrediente farmacêutico em uma formulação farmacêutica completa para administração terapêutica. Mais tipicamente, o peptídeo, proteína, complexo biológico ou outro composto ativo é purificado para representar mais de 90%, muitas vezes mais de 95% de todas as espécies macromoleculares presentes em uma preparação purificada antes da mistura com outros ingredientes de formulação. Em outros casos, a preparação purificada pode ser essencialmente homogênea, em que outras espécies macromoleculares não são detectáveis por técnicas convencionais.

[0126] Como usado na presente invenção, o termo “marcador de purificação” se refere a pelo menos um marcador útil para purificação ou identificação. Uma lista não exaustiva deste marcador inclui His, lacZ, GST, proteína de ligação à maltose, NusA, BCCP, c-myc, CaM, FLAG, GFP, YFP, cherry, tioredoxina, poli(NANP), V5, Snap, HA, proteína de ligação à quitina, Softag 1, Softag 3, Strep ou proteína S. O marcador de fluorescência direto ou indireto adequado compreende FLAG, GFP, YFP, RFP, dTomato, cherry, Cy3, Cy 5, Cy 5.5, Cy 7, DNP, AMCA, Biotina, Digoxigenina, Tamra, Texas Red, rodamina, fluores Alexa, FITC, TRITC ou qualquer outro corante fluorescente ou hapteno.

[0127] Como usado na presente invenção, o termo “proteína recombinante” se refere a um polipeptídeo que é produzido por técnicas de DNA recombinante, em que geralmente, o DNA que codifica o polipeptídeo é inserido em um vetor de expressão adequado que por sua vez é usado para transformar uma célula hospedeira para produzir a proteína heteróloga.

[0128] Como usado na presente invenção, o termo “ligação específica” significa o contato entre um anticorpo e um antígeno com uma afinidade de ligação de pelo menos 10-6 M. Em certos aspectos, os anticorpos se ligam com afinidades de pelo menos cerca de 10-7 M, e de preferência 10- 8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M ou 10-12 M.

[0129] Um “tumor sólido” é uma massa de tecido anormal que geralmente não contém cistos ou áreas líquidas. Os tumores sólidos podem ser benignos ou malignos, metastáticos ou não metastáticos. Diferentes tipos de tumores sólidos são nomeados de acordo com o tipo de células que os formam. Exemplos de tumores sólidos incluem sarcomas, carcinomas e linfomas.

[0130] Como usado na presente invenção, o termo “gene suicida” é um gene capaz de induzir a apoptose celular; exemplos não limitantes incluem HSV-TK (timidina quinase do vírus Herpes simplex), citosina desaminase, nitro-redutase, carboxilesterase, citocromo P450 ou PNP (Nucleosídeo fosforilase de purina), EGFR truncado ou caspase induzível (“iCasp”). Os genes suicidas podem funcionar ao longo de uma variedade de vias e, em alguns casos, podem ser induzidos por um agente indutor, como uma pequena molécula. Por exemplo, o gene suicida iCasp compreende a porção de uma proteína caspase operacionalmente ligada a uma proteína otimizada para se ligar a um agente indutor; a introdução do agente indutor em uma célula que compreende o gene suicida resulta na ativação da caspase e na subsequente apoptose da referida célula.

[0131] O termo “transduzir” ou “transdução” conforme aplicado à produção de células receptoras de antígeno quimérico se refere ao processo pelo qual uma sequência de nucleotídeos estranha é introduzida em uma célula. Em algumas modalidades, esta transdução é feita por meio de um vetor.

[0132] Como usado na presente invenção, “tratar” ou “tratamento” de uma doença em um sujeito se refere a (1) prevenir que os sintomas ou doença ocorram em um sujeito que está predisposto ou ainda não apresenta sintomas da doença; (2) inibir a doença ou interromper seu desenvolvimento; ou (3) melhorar ou causar regressão da doença ou dos sintomas da doença. Conforme entendido na técnica, “tratamento” é uma abordagem para obter resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clínicos. Para os fins da presente tecnologia, os resultados benéficos ou desejados podem incluir um ou mais, mas sem limitação, alívio ou melhoria de um ou mais sintomas, diminuição da extensão de uma condição (incluindo uma doença), estado estabilizado (isto é, sem agravamento) de uma condição (incluindo doença), atraso ou desaceleração da condição (incluindo doença), progressão, melhoria ou paliação da condição (incluindo doença), estados e remissão (seja parcial ou total), sejam detectáveis ou indetectáveis. Os tratamentos contendo as composições e métodos divulgados podem ser terapia de primeira linha, segunda linha, terceira linha, quarta linha, quinta linha e se destinam a ser usadas como uma terapia única ou em combinação com outras terapias apropriadas. Em um aspecto, o termo “tratamento” ou “tratando” exclui prevenção ou profilaxia.

[0133] Como usado na presente invenção, o termo “vetor” se refere a um construto de ácido nucleico destinado a transferência entre diferentes hospedeiros, incluindo, mas não se limitando a um plasmídeo, um vírus, um cosmídeo, um fago, um BAC, um YAC, etc. Em algumas modalidades, vetores plasmídicos podem ser preparados a partir de vetores disponíveis comercialmente. Em outras modalidades, os vetores virais podem ser produzidos a partir de baculovírus, retrovírus, adenovírus, AAVs, etc. de acordo com técnicas conhecidas na técnica. Em uma modalidade, o vetor viral é um vetor lentiviral.

[0134] Como usado na presente invenção, o termo “NKG2D” se refere a uma proteína transmembrana pertencente à família CD94/NKG2 de receptores semelhantes à lectina do tipo C e codificada pelo gene KLRK, que está localizado no complexo do gene NK e/ou um equivalente biológico do mesmo. Sequências exemplificadoras não limitantes desta proteína ou do gene subjacente podem ser encontradas em Gene Cards ID: GC12M011728, HGNC: 18788, Entrez Gene: 22914, Ensembl: ENSG00000213809, OMIM: 611817, e UniProtKB: P26718, que são aqui incorporados por referência.

[0135] Como usado na presente invenção, os termos “BCMA” e “antígeno de maturação de células B” são usados indistintamente para se referir a uma proteína pertencente à superfamília TNF que reconhece o fator de ativação de células B (BAFF) e é codificada pelo gene TNFRSF17. Sequências exemplificadoras não limitantes desta proteína ou do gene subjacente podem ser encontradas em Gene Cards ID: GC16P012058, HGNC: 11913, Entrez Gene: 608, Ensembl: ENSG00000048462, OMIM: 109545, e UniProtKB: Q02223, que são aqui incorporados por referência.

[0136] Como usado na presente invenção, os termos “SLAMF7”, “CS1” e “CD319” são usados indistintamente para se referir a uma proteína conhecida por ser um marcador robusto de células plasmáticas normais e células plasmáticas malignas em mieloma múltiplo e codificado pelo gene SLAMF7. Sequências exemplificadoras não limitantes desta proteína ou do gene subjacente podem ser encontradas em Gene Cards ID: GC01P160709, HGNC: 21394, Entrez Gene: 57823, Ensembl: ENSG00000026751, OMIM: 606625, e UniProtKB: Q9NQ25, que são aqui incorporados por referência.

[0137] As sequências associadas a cada um dos números de acesso do GenBank listados acima e referências são aqui incorporadas por referência.

MODOS PARA REALIZAÇÃO DA DIVULGAÇÃO

[0138] A administração de moléculas imunorreguladoras tem sido usada como uma terapia contra o câncer. No entanto, devido a efeitos colaterais graves associados à administração sistêmica (Giovarelli, M. et al. (2000) J Immunol. 164:3200-3206; Lasek, W. et al. (2014) Cancer Immunol Immunother. 63: 419-435), a obtenção de altas concentrações dessas moléculas imunorreguladoras em tumores relevantes para atingir uma resposta imune eficaz tem sido difícil.

[0139] Devido aos resultados sem precedentes obtidos recentemente em linfomas de células B e leucemia usando tratamento autólogo com células T do receptor de antígeno quimérico geneticamente modificado (CAR) (Maude, S.L. et al. (2014) New Engl. J. Med. 371:1507-1517; Porter, D.L. et al. (2011) New Engl. J. Med. 365: 725-733), vários laboratórios começaram a aplicar esta abordagem a tumores sólidos, incluindo câncer de ovário, câncer de próstata e tumores pancreáticos. As células T modificadas por CAR combinam a especificidade de alvo independente de HLA de um anticorpo monoclonal com a atividade citolítica, proliferação e propriedades de homing de células T ativadas, mas não respondem à supressão do ponto de verificação. Devido à sua capacidade de matar os alvos que expressam o antígeno diretamente, as células T do CAR são altamente tóxicas para quaisquer células ou tecidos positivos para o antígeno, tornando-se um requisito para construir CARs com anticorpos altamente específicos do tumor. Até o momento, as células T modificadas com CAR para tumores sólidos humanos foram construídas contra o receptor α-folato, mesotelina e MUC-CD, PSMA e outros alvos, mas a maioria tem alguma expressão fora do alvo de antígeno em tecidos normais. Estes construtos não mostraram os mesmos resultados excepcionais em pacientes enfatizando a necessidade de estudos adicionais para identificar novos alvos e métodos de construção de células T de CAR que podem ser usados contra tumores sólidos.

[0140] Assim, esta divulgação fornece um receptor de antígeno quimérico (CAR) que compreende um domínio de ligação específico para um antígeno de câncer ou de tumor, que em alguns aspectos, é o domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo anti-BCMA, um vetor que codifica uma célula BsA-CAR que tem como alvo um tumor ou antígeno de câncer e secreta fragmentos de anticorpos solúveis e métodos e composições relacionados ao uso e produção dos mesmos.

Receptores de Antígenos Quiméricos e Usos dos Mesmos Componentes

[0141] A presente divulgação fornece receptores de antígenos quiméricos (CAR) que se ligam a um antígeno de câncer ou de tumor, o CAR compreendendo, ou consistindo essencialmente em, ou consistindo em, uma fração de ativação celular compreendendo um domínio extracelular, transmembrana e intracelular. O domínio extracelular compreende um elemento de ligação específico de alvo, de outra forma referido como o domínio de ligação ao antígeno. O domínio intracelular ou domínio citoplasmático compreende uma região de sinalização coestimuladora e uma porção de cadeia zeta. O CAR pode, opcionalmente, compreender adicionalmente um domínio espaçador de até 300 aminoácidos, de preferência, 10 a 100 aminoácidos, com mais preferência, 25 a 50 aminoácidos.

[0142] Domínio Espaçador. O CAR pode, opcionalmente, compreender ainda um domínio espaçador de até 300 aminoácidos, de preferência, 10 a 100 aminoácidos, com mais preferência, 25 a 50 aminoácidos. Por exemplo, o espaçador pode ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 aminoácidos. Um domínio espaçador pode compreender, por exemplo, uma porção de um domínio de Fc humano, um domínio de CH3 ou a região de dobradiça de qualquer imunoglobulina, tal como IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM, ou variantes das mesmas. Por exemplo, algumas modalidades podem compreender uma dobradiça de IgG4 com ou sem uma mutação S228P, L235E e/ou N297Q (de acordo com a numeração de Kabat). Espaçadores adicionais incluem, mas sem limitação regiões de dobradiça de CD4, CD8 e CD28. Em em

[0143] Domínio de Ligação ao Antígeno. Em certos aspectos, a presente divulgação fornece um CAR que compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste em um domínio de ligação ao antígeno específico para um antígeno de câncer ou de tumor. Os domínios de ligação ao antígeno podem ser de qualquer espécie apropriada, por exemplo, de murino, humano ou de uma sequência humanizada.

[0144] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste no domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo anti- BCMA ou um anticorpo que se liga a um antígeno relevante para BCMA. Os anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a esses antígenos estão disponíveis comercialmente. Os domínios de ligação ao antígeno podem ser de qualquer espécie apropriada, por exemplo, de murino, humano ou de uma sequência humanizada. Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno compreende a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve de um anticorpo para o antígeno de maturação de células B (BCMA) e/ou SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319) e/ou um equivalente de cada um dos mesmos. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno compreende, consiste ou consiste essencialmente em um fragmento do anticorpo específico do alvo (ou seja, um anticorpo para o antígeno de maturação de células B (BCMA) e/ou SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319) e/ou um equivalente de cada um dos mesmos), por exemplo, um scFv. Uma região de scFv pode compreender as regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e cadeias leve (VL) de imunoglobulinas, conectado a um peptídeo ligante curto. O peptídeo ligante pode ser de 1 a 50 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 aminoácidos. Em algumas modalidades, o ligante é rico em glicina, embora também possa conter serina ou treonina.

[0145] Em outro aspecto da presente divulgação, o domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de câncer ou tumor inclui uma ou mais das seguintes características: (a) a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia leve compreende uma ou mais CDRs que são pelo menos 80% idênticas a uma CDR de um domínio variável de cadeia leve de qualquer uma das sequências de cadeia leve divulgadas; (b) a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia pesada compreende uma ou mais CDRs que são pelo menos 80% idênticas a uma CDR de um domínio variável de cadeia pesada de qualquer uma das sequências de cadeia pesada divulgadas; (c) a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia leve é pelo menos 80% idêntica a um domínio variável de cadeia leve de qualquer uma das sequências de cadeia leve divulgadas; (d) a sequência de domínio variável de imunoglobulina de HC é pelo menos 80% idêntica a um domínio variável de cadeia pesada de qualquer uma das sequências de cadeia leve divulgadas; e (e) o anticorpo se liga a um epítopo que se sobrepõe a um epítopo ligado por qualquer uma das sequências divulgadas.

[0146] Exemplos adicionais de equivalentes incluem peptídeo tendo pelo menos 85%, ou alternativamente pelo menos 90%, ou alternativamente pelo menos 95%, ou alternativamente pelo menos 97% de identidade de aminoácidos com o peptídeo ou um polipeptídeo que é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de alto rigor ao complemento de um polinucleotídeo que codifica o domínio de ligação ao antígeno, em que as condições de alto rigor compreende temperaturas de incubação de cerca de 55 °C a cerca de 68 °C; concentrações de tampão de cerca de 1x SSC a cerca de 0,1x SSC; concentrações de formamida de cerca de 55% a cerca de 75%; e soluções de lavagem de cerca de 1x SSC, 0,1x SSC ou água desionizada.

[0147] Domínio transmembrana. O domínio transmembrana pode ser derivado de uma fonte natural ou sintética. Quando a fonte é natural, o domínio pode ser derivado de qualquer proteína ligada à membrana ou transmembrana. As regiões de transmembrana de uso particular nesta divulgação podem ser derivadas de CD8, CD28, CD3, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154, TCR. Alternativamente, o domínio transmembrana pode ser sintético, caso em que compreenderá predominantemente resíduos hidrofóbicos, tais como leucina e valina. De preferência, um tripleto de fenilalanina, triptofano e valina será encontrado em cada extremidade de um domínio transmembrana sintético. Opcionalmente, um ligante oligo- ou polipeptídico curto, de preferência, entre 2 e 10 aminoácidos de comprimento, pode formar a ligação entre o domínio transmembrana e o domínio de sinalização citoplasmático do CAR. Um dupleto de glicina- serina fornece um ligante particularmente adequado.

[0148] Domínio citoplasmático. O domínio citoplasmático ou domínio de sinalização intracelular do CAR é responsável pela ativação de pelo menos uma das funções efetoras tradicionais de uma célula imune na qual um CAR foi colocado. O domínio de sinalização intracelular se refere a uma porção de uma proteína que transduz o sinal da função efetora e direciona a célula imune para realizar sua função específica. Um domínio de sinalização inteiro ou uma porção truncada do mesmo pode ser usado, desde que a porção truncada seja suficiente para transduzir o sinal da função efetora. As sequências citoplasmáticas do TCR e co-receptores, bem como derivados ou variantes dos mesmos, podem funcionar como domínios de sinalização intracelular para uso em um CAR. Domínios de sinalização intracelular de uso particular nesta divulgação podem ser derivados de FcR, TCR, CD3, CDS, CD22, CD79a, CD79b, CD66d. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização do CAR pode compreender um domínio de sinalização CD3 ζ.

[0149] Uma vez que os sinais gerados por meio do TCR são insuficientes sozinhos para a ativação completa de uma célula T, um sinal secundário ou coestimulador também pode ser necessário. Assim, a região intracelular de uma molécula de sinalização coestimuladora, incluindo, mas não se limitando aos domínios intracelulares das proteínas CD27, CD28, 4-IBB (CD 137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno-1 associado à função linfocitária (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7- H3, ou um ligante que se liga especificamente a CD83, também podem ser incluídos no domínio citoplasmático do CAR. Por exemplo, um CAR pode compreender um, dois ou mais domínios coestimuladores, além de um domínio de sinalização (por exemplo, um domínio de sinalização CD3 ζ).

[0150] Em algumas modalidades, a porção de ativação celular do receptor de antígeno quimérico é um domínio de sinalização de células T compreendendo, ou alternativamente consistindo essencialmente em, ou ainda consistindo adicionalmente em, uma ou mais proteínas ou fragmentos das mesmas selecionados do grupo consistindo em proteína CD8, Proteína CD28, proteína 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1, CD2, CD7, CD27, LIGHT, NKG2C, B7-H3 e proteína CD3-zeta.

[0151] Em algumas modalidades, a porção de ativação celular do receptor de antígeno quimérico é um domínio de sinalização de células T compreendendo, ou alternativamente consistindo essencialmente em, ou ainda consistindo adicionalmente em, uma ou mais proteínas ou fragmentos das mesmas selecionados a partir do grupo que consiste na proteína CD8, proteína CD28, proteína 4-1BB e proteína CD3-zeta.

[0152] Em modalidades específicas, o CAR compreende ou, alternativamente, consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste em um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo direcionado a câncer ou tumor, um domínio de dobradiça CD8 α, um domínio transmembrana CD8 α, uma região de sinalização coestimuladora e um CD3 domínio de sinalização zeta. Em outras modalidades, a região de sinalização coestimuladora compreende uma ou ambas dentre uma região de sinalização coestimuladora CD28 e uma região de sinalização coestimuladora 4-1BB.

[0153] Em algumas modalidades, o CAR pode compreender adicionalmente um marcador detectável ou marcador de purificação. Em outro aspecto, os CARs conforme descritos na presente invenção estão contidos em uma composição, por exemplo, um veículo farmaceuticamente aceitável para diagnóstico ou terapia.

[0154] Mecanismos de Troca. Em algumas modalidades, o CAR também pode compreender um mecanismo de troca para controlar a expressão e/ou ativação do CAR. Por exemplo, um CAR pode compreender, consistir ou consistir essencialmente em um domínio extracelular, transmembrana e intracelular, em que o domínio extracelular compreende um elemento de ligação específico ao alvo que se liga a um marcador, domínio de ligação ou tag que é específico para um molécula diferente do antígeno alvo que é expresso na ou por uma célula alvo. Em tais modalidades, a especificidade do CAR é fornecida por um segundo construto que compreende, consiste ou consiste essencialmente em um domínio de ligação ao antígeno alvo e um domínio que é reconhecido ou se liga ao marcador, domínio de ligação ou indicador no CAR. Ver, por exemplo, WO 2013/044225, WO 2016/000304, WO 2015/057834, WO 2015/057852, WO 2016/070061, US 9.233.125, US 2016/0129109. Desta forma, uma célula T que expressa o CAR pode ser administrada a um sujeito, mas não pode se ligar a um antígeno alvo (isto é, BCMA) até que a segunda composição compreendendo um domínio de ligação específico de BCMA seja administrada.

[0155] Os CARs da presente divulgação podem, da mesma forma, exigir multimerização para ativar sua função (ver, por exemplo, US 2015/0368342, US 2016/0175359, US 2015/0368360) e/ou um sinal exógeno, como um fármaco de pequena molécula (US 2016/0166613, Yung et al., Science, 2015) a fim de induzir uma resposta de células T.

[0156] Além disso, os CARs divulgados podem compreender um “itrocador suicida” (também referido como um “gene suicida”) para induzir a morte celular das células de CAR após o tratamento (Buddee et al., PLoS One, 2013) ou para infrarregular a expressão do CAR após ligação ao antígeno alvo (WO 2016/011210). Um trocador suicida ou gene suicida exemplificador não limitante é iCasp.

[0157] Em algumas modalidades, o CAR pode compreender adicionalmente um marcador detectável ou marcador de purificação. Em outro aspecto, os CARs conforme descritos na presente invenção estão contidos em uma composição, por exemplo, um veículo farmaceuticamente aceitável para diagnóstico ou terapia.

[0158] Em certas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno do anticorpo alvo de tumor do CAR compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste em uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve que são opcionalmente ligadas por um peptídeo ligante. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada e/ou leve compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste nas regiões de CDR relevantes de um anticorpo para qualquer um dentre um antígeno de maturação de células B (BCMA) e/ou SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319), e/ou um equivalente de cada um dos mesmos. Em um aspecto, o anticorpo alvo de tumor tem como alvo BCMA. Em certas modalidades, o CAR compreende adicionalmente, ou alternativamente consiste adicionalmente essencialmente em, ou ainda consiste em, um polipeptídeo ligante localizado entre a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve. Em certas modalidades, o ligante é um ligante de glicina-serina. Em outras modalidades, o polipeptídeo ligante compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste na sequência (glicina-serina)n em que n é um número inteiro de 1 a 6.

[0159] Também são fornecidos ácidos nucleicos isolados que codificam os construtos de CAR. Os ácidos nucleicos podem compreender adicionalmente as sequências regulatórias necessárias, por exemplo, um promotor para expressão em uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula hospedeira de mamífero ou humana, como uma célula T. Em um aspecto, o promotor é um promotor CMV, MND ou EF1 alfa. Em um aspecto adicional, o polinucleotídeo de CAR adicional compreende um peptídeo marcador (por exemplo, GFP) que pode ser regulado a partir de um segundo elemento promotor, por exemplo, promotores de CMV, MND e EF1A, localizados 5’ em relação ao polinucleotídeo de codificação. Em um aspecto, o segundo promotor compreende um promotor EF1 alfa. Como é aparente para o versado na técnica, o(s) promotor(es) são selecionados para o sistema de expressão do hospedeiro e irão variar com o hospedeiro e o vetor de expressão e uso pretendido.

[0160] O ácido nucleico isolado pode ser inserido em um vetor de expressão, por exemplo, um vetor lentiviral ou vetor retroviral (entre os LTRs 5’ e 3’) ou um vetor de adenovírus ou quaisquer outros vetores que possam expressar um gene. A Figura 1A é um construto exemplificador desta divulgação. Como é aparente, quando usado clinicamente em um paciente humano, os marcadores ou indicadores de purificação serão omitidos do construto.

Processo para Preparação de Anticorpos

[0161] Os anticorpos para uso nesta divulgação podem ser adquiridos ou preparados com o uso dos métodos conhecidos na técnica e brevemente descritos na presente invenção. Se um novo antígeno for descoberto, será necessário fabricar anticorpos e domínios de ligação ao antígeno dos anticorpos. Sua fabricação e uso são bem conhecidos e divulgados, por exemplo, em Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999. Os anticorpos podem ser gerados com o uso dos métodos padrão conhecidos na técnica. Exemplos de anticorpos incluem (mas sem limitação) anticorpos monoclonais, de cadeia simples e fragmentos funcionais de anticorpos.

[0162] Os anticorpos podem ser produzidos em uma variedade de hospedeiros, por exemplo, cabras, coelhos, ratos, camundongos, humanos e outros. Eles podem ser imunizados por injeção com um antígeno alvo ou um fragmento ou oligopeptídeo do mesmo que tem propriedades imunogênicas, como um fragmento de terminal C, um câncer ou antígeno relevante para tumor ou um polipeptídeo isolado, como BCMA ou NKG2D. Dependendo da espécie hospedeira, vários adjuvantes podem ser adicionados e usados para aumentar uma resposta imunológica. Tais adjuvantes incluem, mas sem limitação géis minerais de Freund, como hidróxido de alumínio e substâncias ativas de superfície como lisolecitina, polióis plurônicos, polianions, peptídeos, emulsões de óleo, hemocianina de lapa de fechadura e dinitrofenol. Entre os adjuvantes usados em humanos, BCG (Bacillo Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum são particularmente úteis. Esta divulgação também fornece o polipeptídeo isolado e um adjuvante.

[0163] Em certos aspectos, os anticorpos da presente divulgação são policlonais, isto é, uma mistura de vários tipos de anticorpos com diferentes sequências de aminoácidos. Em um aspecto, o anticorpo policlonal compreende uma mistura de vários tipos de anticorpos com diferentes CDRs. Como tal, uma mistura de células que produzem diferentes anticorpos é cultivada, e um anticorpo purificado a partir da cultura resultante pode ser usado (ver WO 2004/061104).

[0164] Produção de Anticorpo Monoclonal. Os anticorpos monoclonais para um antígeno de câncer ou de tumor podem ser preparados usando qualquer técnica que proporcione a produção de moléculas de anticorpo por linhagens de células contínuas em cultura. Essas técnicas incluem, mas sem limitação técnica de hibridoma (Veja, por exemplo, Kohler & Milstein, Nature 256: 495-497 (1975)); the trioma technique; the human B-cell hybridoma technique (see, e.g., Kozbor et al., Immunol. Today 4: 72 (1983)) e a técnica de hibridoma EBV para produzir anticorpos monoclonais humanos (veja, por exemplo., Cole et al., in: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)). Os anticorpos monoclonais humanos podem ser utilizados na prática da presente tecnologia e podem ser produzidos usando hibridomas humanos (Veja, por exemplo, Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026-2030 (1983)) or by transforming human B-cells with Epstein Barr Virus in vitro (veja, por exemplo, Cole et al., em: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)). Por exemplo, uma população de ácidos nucleicos que codificam regiões de anticorpos pode ser isolada. A PCR utilizando primers derivados de sequências que codificam regiões conservadas de anticorpos é usada para amplificar sequências que codificam porções de anticorpos da população e, em seguida, reconstruir DNAs que codificam anticorpos ou fragmentos dos mesmos, tais como domínios variáveis, a partir das sequências amplificadas. Essas sequências amplificadas também podem ser fundidas a DNAs que codificam outras proteínas - por exemplo, um revestimento de bacteriófago ou uma proteína de superfície celular bacteriana - para expressão e exibição dos polipeptídeos de fusão em fagos ou bactérias.

As sequências amplificadas podem então ser expressas e ainda selecionadas ou isoladas com base, por exemplo, na afinidade do anticorpo expresso ou fragmento do mesmo para um antígeno ou epítopo presente no polipeptídeo de antígeno relevante de BCMA.

Alternativamente, os hibridomas que expressam anticorpos monoclonais podem ser preparados por imunização de um sujeito, por exemplo, com um polipeptídeo isolado compreendendo, ou alternativamente consistindo essencialmente em, ou ainda consistindo na sequência de aminoácidos do antígeno relevante ou um fragmento do mesmo, e então isolamento de hibridomas do baço do sujeito com o uso dos métodos de rotina.

Veja, por exemplo, Milstein et al., (Galfre and Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)). O rastreio dos hibridomas com o uso dos métodos padrão irá produzir anticorpos monoclonais de especificidade variada (isto é, para diferentes epítopos) e afinidade.

Um anticorpo monoclonal selecionado com as propriedades desejadas, por exemplo, uma ligação de antígeno relevante, pode ser (i) usado conforme expresso pelo hibridoma, (ii) ligado a uma molécula tal como polietileno glicol (PEG) para alterar suas propriedades, ou (iii ) um cDNA que codifica o anticorpo monoclonal pode ser isolado, sequenciado e manipulado de várias maneiras.

Em um aspecto, o anticorpo monoclonal é produzido por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal transgênico não humano, por exemplo, um camundongo transgênico, tendo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve fundido a uma célula imortalizada.

As técnicas de hibridoma incluem aquelas conhecidas na técnica e ensinadas em Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 349 (1988); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies And T-Cell Hybridomas, 563- 681 (1981).

[0165] Técnica de Exibição de Fago.

Como observado acima, os anticorpos da presente divulgação podem ser produzidos através da aplicação de DNA recombinante e tecnologia de exibição de fago.

Por exemplo, os anticorpos de BCMA podem ser preparados usando vários métodos de exibição de fago conhecidos na técnica.

Em métodos de exibição de fago, os domínios de anticorpo funcionais são exibidos na superfície de uma partícula de fago que carrega sequências de polinucleotídeos que os codificam.

O fago com uma propriedade de ligação desejada é selecionado a partir de um repertório ou biblioteca combinatória de anticorpos (por exemplo, de humano ou murino) selecionando diretamente com um antígeno, tipicamente um antígeno ligado ou capturado em uma superfície sólida ou grânulo.

Os fagos usados nestes métodos são tipicamente fagos filamentosos incluindo fd e M13 com Fab, Fv ou domínios de anticorpo de Fv estabilizado com dissulfeto são fundidos de forma recombinante com o gene III do fago ou à proteína do gene VIII.

Além disso, os métodos podem ser adaptados para a construção de bibliotecas de expressão de Fab (Veja, por exemplo, Huse et al., Science 246: 1275-1281, 1989) para permitir a identificação rápida e eficaz de fragmentos de Fab monoclonais com a especificidade desejada para um polipeptídeo de antígeno relevante, por exemplo, um polipeptídeo ou derivados, fragmentos, análogos ou homólogos dos mesmos.

Outros exemplos de métodos de exibição de fago que podem ser usados para produzir os anticorpos isolados da presente divulgação incluem aqueles divulgados em Huston et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

U.S.A., 85: 5879-5883 (1988); Chaudhary et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

U.S.A., 87: 1066-1070 (1990); Brinkman et al., J.

Immunol.

Methods 182: 41-50 (1995); Ames et al., J.

Immunol.

Methods 184: 177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur.

J.

Immunol. 24: 952-958 (1994); Persic et al., Gene 187: 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57: 191- 280 (1994); PCT/GB91/01134; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; WO 96/06213; WO 92/01047 (Medical Research Council et al.); WO

97/08320 (Morphosys); WO 92/01047 (CAT/MRC); WO 91/17271 (Affymax); e Patentes US n°s 5.698.426, 5.223.409, 5.403.484,

5.580.717, 5.427.908, 5.750.753, 5.821.047, 5.571.698, 5.427.908,

5.516.637, 5.780.225, 5.658.727 e 5.733.743.

[0166] Métodos úteis para exibir polipeptídeos na superfície de partículas de bacteriófago ao anexar os polipeptídeos através das ligações de dissulfeto foram descritas por Lohning, Patente US n° 6.753.136. Conforme descrito nas referências acima, após a seleção do fago, as regiões de codificação do anticorpo do fago podem ser isoladas e usadas para gerar anticorpos inteiros, incluindo anticorpos humanos, ou qualquer outro fragmento de ligação ao antígeno desejado, e expressas em qualquer hospedeiro desejado, incluindo células de mamífero, células de insetos, células vegetais, leveduras e bactérias. Por exemplo, técnicas para produzir os fragmentos Fab, Fab′ e F(ab′)2 de forma recombinante também podem ser empregues com o uso dos métodos conhecidos na técnica, tais como os divulgados no WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12: 864-869 (1992); Sawai et al., AJRI 34: 26-34 (1995); e Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988).

[0167] Geralmente, os anticorpos híbridos ou fragmentos de anticorpos híbridos que são clonados em um vetor de exibição podem ser selecionados contra o antígeno apropriado, a fim de identificar variantes que mantiveram boa atividade de ligação, porque o anticorpo ou fragmento de anticorpo estará presente na superfície da partícula de fago ou fagemídeo. Veja, por exemplo, Barbas III et al., Phage Display, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001). No entanto, outros formatos de vetor podem ser usados para este processo, como a clonagem da biblioteca de fragmentos de anticorpo em um vetor de fago lítico (sistemas T7 modificados ou Lambda Zap) para seleção e/ou triagem.

[0168] Métodos Alternativos de Produção de Anticorpos. Os anticorpos também podem ser produzidos induzindo produção in vivo na população de linfócitos ou por triagem de bibliotecas de imunoglobulinas recombinantes ou painéis de reagentes de ligação altamente específicos (Orlandi et al., PNAS 86: 3833-3837 (1989); Winter, G. et al., Nature, 349: 293-299 (1991)).

[0169] Alternativamente, podem ser utilizadas técnicas para a produção de anticorpos de cadeia simples. Os anticorpos de cadeia simples (scFvs) compreendem uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve conectada com um peptídeo ligante (tipicamente cerca de 5 a 25 aminoácidos de comprimento). No scFv, as regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve podem ser derivadas do mesmo anticorpo ou de anticorpos diferentes. Os scFvs podem ser sintetizados usando técnicas recombinantes, por exemplo, pela expressão de um vetor que codifica o scFv em um organismo hospedeiro, como E. coli. O DNA que codifica scFv pode ser obtido realizando a amplificação com o uso de um DNA parcial que codifica a sequência de aminoácidos inteira ou desejada de um DNA selecionado a partir de um DNA que codifica a cadeia pesada ou a região variável de cadeia pesada do anticorpo acima mencionado e um DNA que codifica a cadeia leve ou a região variável de cadeia leve da mesma como um modelo, por PCR com o uso de um par de primers que define ambas as extremidades do mesmo, e adicionalmente realizando a amplificação combinando um DNA que codifica uma porção de ligante de polipeptídeo e um par de primers que define ambas as extremidades dos mesmos, de modo a ligar ambas as extremidades do ligante à cadeia pesada e à cadeia leve, respectivamente. Um vetor de expressão contendo o DNA que codifica scFv e um hospedeiro transformado pelo vetor de expressão pode ser obtido de acordo com métodos convencionais conhecidos na técnica.

[0170] Os fragmentos de ligação ao antígeno também podem ser gerados, por exemplo, os fragmentos F(ab′)2 que podem ser produzidos por digestão com pepsina da molécula de anticorpo e os fragmentos Fab que podem ser gerados reduzindo as pontes de dissulfeto dos fragmentos F(ab′)2. Alternativamente, as bibliotecas de expressão de Fab podem ser construídas para permitir a identificação rápida e fácil dos fragmentos Fab monoclonais com a especificidade desejada (Huse et al., Science, 256: 1275-1281 (1989)).

[0171] Modificações de Anticorpos. Os anticorpos da presente divulgação podem ser multimerizados para aumentar a afinidade para um antígeno. O anticorpo a ser multimerizado pode ser um tipo de anticorpo ou uma pluralidade de anticorpos que reconhecem uma pluralidade de epítopos do mesmo antígeno. Como um método de multimerização do anticorpo, a ligação do domínio de IgG CH3 a duas moléculas de scFv, ligação a estreptavidina, introdução de um motivo hélice-volta-hélice e semelhantes podem ser exemplificados.

[0172] As composições de anticorpos aqui divulgadas podem estar na forma de um conjugado formado entre qualquer um desses anticorpos e outro agente (imunoconjugado). Em um aspecto, os anticorpos divulgados na presente invenção são conjugados com material radioativo. Em outro aspecto, os anticorpos aqui divulgados podem ser ligados a vários tipos de moléculas, como polietileno glicol (PEG).

[0173] Triagem de Anticorpos. Vários imunoensaios podem ser usados para o rastreio para identificar anticorpos com a especificidade desejada. Numerosos protocolos para ligação competitiva ou ensaios imunorradiométricos usando anticorpos policlonais ou monoclonais com especificidades estabelecidas são bem conhecidos na técnica. Tais imunoensaios envolvem tipicamente a medição da formação de complexo entre o antígeno relevante, ou qualquer fragmento ou oligopeptídeo do mesmo e seu anticorpo específico. Um imunoensaio de base monoclonal de dois locais utilizando anticorpos monoclonais específicos para dois epítopos de antígenos relevantes não interferentes pode ser usado, mas um ensaio de ligação competitiva também pode ser empregado (Maddox et al., J. Exp. Med., 158: 1211-1216 (1983)).

[0174] Purificação de Anticorpos. Os anticorpos aqui divulgados podem ser purificados até a homogeneidade. A separação e a purificação dos anticorpos podem ser realizadas empregando métodos convencionais de separação e purificação de proteínas.

[0175] Apenas a título de exemplo, o anticorpo pode ser separado e purificado selecionando e combinando apropriadamente o uso de colunas de cromatografia, filtros, ultrafiltração, precipitação de sal, diálise, eletroforese em gel de poliacrilamida preparativa, eletroforese de focagem isoelétrica e semelhantes. Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988).

[0176] Exemplos de cromatografia incluem cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de filtração em gel, cromatografia de fase reversa e cromatografia de adsorção. Em um aspecto, a cromatografia pode ser realizada empregando cromatografia líquida, como HPLC ou FPLC.

[0177] Em um aspecto, uma coluna de Proteína A ou uma coluna de Proteína G pode ser usada em cromatografia de afinidade. Outras colunas exemplificadoras incluem uma coluna de Proteína A, Hyper D, POROS, Sepharose FF (Pharmacia) e semelhantes.

Anticorpos Biespecíficos

[0178] Também são fornecidos aqui construtos de anticorpos biespecíficos que compreendem quaisquer antígenos de NKG2D ou de um antígeno tumoral, por exemplo, domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo anti-NKG2D e um tumor que tem como alvo o domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo. Os domínios de ligação ao antígeno podem ser de qualquer espécie apropriada, por exemplo, de murino, humano ou de uma sequência humanizada. Em um aspecto, o anticorpo alvo de tumor compreende anti-CS1 ou anti-BCMA. Também inclui qualquer molécula que se ligue a essas duas proteínas. Por exemplo, MICA, MICB e ULBPs. Em um aspecto, o CAR pode ser CS1 CAR e a parte biespecífica pode ser substituída por scFv anti-BCMA. Em um aspecto, o anticorpo alvo de tumor compreende anti-CS1 ou anti-BCMA. Um exemplo de tal é descrito em PCT/US2016/018955, depositado em 22 de fevereiro de 2016, incorporado aqui por referência incluindo especificamente o polinucleotídeo e a sequência de aminoácidos de tal.

[0179] Em um aspecto, pelo menos um dos dois domínios de ligação ao antígeno é específico para um antígeno que é coexpresso com um primeiro antígeno predeterminado. Por exemplo, no caso de MM, BCMA e CS1 são coexpressos em MM e CS1 foi selecionado para complementar o domínio de ligação ao antígeno de BCMA de um construto de CAR. Como alternativa, o BCMA pode complementar um CAR anti-CS1.

[0180] Em outro aspecto, os domínios de ligação ao antígeno compreendem, ou consistem essencialmente em, ou ainda consistem em um fragmento scFv, que é opcionalmente otimizado por códons. Em um aspecto adicional, os domínios de ligação ao antígeno biespecífico são as cadeias pesadas e leves variáveis que são unidas por um ligante de peptídeo. Em geral, os domínios de ligação ao antígeno podem ser unidos por um ligante de peptídeo, por exemplo, um ligante de proteína não imunogênica derivado de aldose de músculo humano35.

[0181] Também são fornecidos ácidos nucleicos isolados que codificam os anticorpos biespecíficos. Os ácidos nucleicos podem compreender adicionalmente as sequências regulatórias necessárias, por exemplo, um promotor para expressão em uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula hospedeira de mamífero ou humana, como uma célula T, e/ou um potencializador. Em um aspecto, o promotor é um CMV ou um promotor EF1 alfa. O ácido nucleico isolado pode compreender adicionalmente polinucleotídeos que codificam marcadores detectáveis, como GFP, que podem estar localizados a jusante do polinucleotídeo que codifica BsAb e regulados a partir de um elemento promotor separado, por exemplo, um promotor EF1 alfa. Como é aparente para o versado na técnica, o(s) promotor(es) são selecionados para o sistema de expressão do hospedeiro.

[0182] O ácido nucleico isolado pode ser inserido em um vetor de expressão, por exemplo, um vetor lentiviral, entre as LTRs 5’ e 3’. A Figura 1B é um construto de vetor lentiviral exemplificador desta divulgação. Como é evidente para o versado na técnica, os construtos podem não compreender um peptídeo marcador ou um marcador de purificação.

Construtos de BsAb-CAR

[0183] Em outro aspecto, são fornecidos aqui ácidos nucleicos isolados que codificam, em um construto, um construto de CAR e um anticorpo biespecífico conforme divulgado acima (“construto de BsAb-CAR”). Os domínios de ligação ao antígeno podem ser de qualquer espécie apropriada, por exemplo, de murino, humano ou de uma sequência humanizada. Em um aspecto, o ácido nucleico isolado codifica um fragmento de ligação ao antígeno que tem como alvo BCMA e um anticorpo biespecífico, por exemplo, um scFv de um anticorpo anti-CS1 e um scFv de um anticorpo anti-NKG2D, unidos por um ácido nucleico que codifica um ligante de proteína não imunogênica, como de aldose de músculo humano. Em um aspecto, o ácido nucleico que codifica o construto de CAR está localizado a 5 ‘em relação ao ácido nucleico que codifica o BsAb. Em um aspecto, um elemento T2A está localizado entre o polinucleotídeo de CAR localizado em 5’ e o BsAb localizado em 3’. Os ácidos nucleicos podem compreender adicionalmente as sequências regulatórias necessárias, por exemplo, um promotor para expressão em uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula hospedeira de mamífero ou humana, como uma célula T. Em um aspecto, o promotor é um EF1a ou um promotor de CMV localizado a 5’ em relação ao polinucleotídeo que codifica o CAR. Em um aspecto adicional, o ácido nucleico isolado pode compreender adicionalmente polinucleotídeos que codificam marcadores detectáveis, como GFP, que pode estar a jusante do polinucleotídeo de BsAb e sob o controle de um elemento promotor separado, por exemplo, um promotor EF1 alfa. Como é aparente para o versado na técnica, o(s) promotor(es) são selecionados para o sistema de expressão do hospedeiro.

[0184] O ácido nucleico isolado pode ser inserido em um vetor de expressão, por exemplo, um vetor lentiviral, entre as LTRs 5’ e 3’. A Figura 3A é um construto de vetor lentiviral exemplificador desta divulgação. Como é evidente para o versado na técnica, os construtos podem não compreender um peptídeo marcador ou um marcador de purificação.

Células Hospedeiras e Processos para Preparar CARs

[0185] Aspectos da presente divulgação se referem a uma célula isolada que compreende um CAR, um BsAb e um BsAb CAR e métodos de produção de tais células. A célula é uma célula procariótica ou eucariótica. Em um aspecto, a célula é uma célula T, uma célula B, uma célula NK, uma célula dendrítica, uma célula mieloide, um monócito, um macrófago, quaisquer subconjuntos dos mesmos ou qualquer outra célula imune. A célula eucariótica pode ser de qualquer espécie preferida, por exemplo, uma célula animal, uma célula de mamífero, como uma célula humana, felina ou canina. As células podem ser derivadas de pacientes, doadores ou linhagens de células, tais como aquelas disponíveis no mercado. As células podem ser autólogas ou alogênicas para o sujeito em tratamento.

[0186] Em modalidades específicas, a célula isolada compreende, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste em um CAR exógeno ou um CAR BsAb compreendendo, ou alternativamente consistindo essencialmente em, ou ainda consistindo ainda em, um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de câncer ou de tumor, um domínio de dobradiça CD8 α, um domínio transmembrana CD8 α, uma região de sinalização coestimuladora CD28 e/ou uma região de sinalização coestimuladora 4-1BB e um domínio de sinalização de CD3 zeta. Em uma modalidade separada, a célula isolada compreende adicionalmente um BsAb conforme divulgado na presente invenção. Em ainda outro aspecto, a célula compreende o BsAb conforme divulgado na presente invenção. Em certas modalidades, a célula isolada é uma célula T, por exemplo, uma célula T de animal, uma célula T de mamífero, uma célula T de felino, uma célula T de canino ou uma célula T de humano. Em certas modalidades, a célula isolada é uma célula NK, por exemplo, uma célula NK de animal, uma célula NK de mamífero, uma célula NK de felino, uma célula NK de canino ou uma célula NK de humano. Em certas modalidades, a célula isolada é uma célula B, por exemplo, uma célula B de animal, uma célula B de mamífero, uma célula B de felino, uma célula B de canino ou uma célula B de humano. É apreciado que as mesmas modalidades ou modalidades semelhantes para cada espécie se aplicam em relação às células dendríticas, células mieloides, monócitos, macrófagos, quaisquer subconjuntos destes ou das células T, células NK e células B descritas, e/ou qualquer outras células imunológicas. Em um aspecto, a célula é uma célula T que foi modificada para remover a expressão de CD52 usando tecnologia de edição de genes, por exemplo, CRISPR ou TALEN.

[0187] Em certas modalidades, os métodos de produção de células que expressam BsAb, CAR e/ou BsAb CAR são divulgados, o método compreendendo, ou, alternativamente, consistindo essencialmente ou ainda consistindo em transduzir uma população de células isoladas com uma sequência de ácido nucleico que codifica o BsAb, o CAR, o BsAb e o CAR, e/ou o BsAb CAR. Em um aspecto adicional, uma subpopulação de células que foram transduzidas com sucesso com a sequência de ácido nucleico é selecionada. Em algumas modalidades, as células isoladas são células T, uma célula T de animal, uma célula T de mamífero, uma célula T de felino, uma célula T de canino ou uma célula T de humano, produzindo assim o BsAb, o CAR, as células T BsAb e CAR e/ou BsAb CAR. Em certas modalidades, a célula isolada é uma célula NK, por exemplo, uma célula NK de animal, uma célula NK de mamífero, uma célula NK de felino, uma célula NK de canino ou uma célula NK de humano, produzindo assim o BsAb, o CAR, o BsAb e o CAR e/ou as células NK do BsAb CAR. Em algumas modalidades, as células isoladas são células B, uma célula B animal, uma célula B de mamífero, uma célula B felina, uma célula B canina ou uma célula B humana, produzindo assim o BsAb, o CAR, as células B BsAb e CAR e/ou BsAb CAR. É apreciado que as mesmas modalidades ou modalidades semelhantes para cada espécie se aplicam em relação às células dendríticas, células mieloides, monócitos, macrófagos, quaisquer subconjuntos destes ou das células T, células NK e células B descritas, e/ou qualquer outras células imunológicas. Em um aspecto, a célula é uma célula T que foi modificada para remover a expressão de CD52 usando tecnologia de edição de genes, por exemplo, CRISPR ou TALEN. Em um aspecto, as células são autólogas ou alogênicas para o sujeito em tratamento.

[0188] Fontes de Células Isoladas. Antes da expansão e modificação genética das células aqui divulgadas, as células podem ser obtidas de um sujeito - por exemplo, em modalidades que envolvem terapia autóloga - ou uma linhagem ou cultura de células comercialmente disponível, ou uma célula-tronco, como uma célula-tronco pluripotente induzida (iPSC).

[0189] As células podem ser obtidas de uma série de fontes em um sujeito, incluindo células mononucleares de sangue periférico, medula óssea, tecido de nódulo linfático, sangue do cordão umbilical, tecido do timo, tecido de um local de infecção, ascite, derrame pleural, tecido do baço e tumores.

[0190] Os métodos de isolamento de células relevantes são bem conhecidos na técnica e podem ser facilmente adaptados ao presente Pedido; um método exemplificador é descrito nos exemplos abaixo. Os métodos de isolamento para uso em relação a esta divulgação incluem, mas sem limitação Life Technologies Dynabeads® System; STEMcell Technologies EasySep™, RoboSep™, RosetteSep™, SepMate™; Kits de separação de células Miltenyi Biotec MACS™ e outros kits de separação e isolamento de células disponíveis comercialmente. Subpopulações particulares de células imunes podem ser isoladas através do uso de grânulos ou outros agentes de ligação disponíveis em tais kits específicos para marcadores de superfície celular únicos. Por exemplo, MACS™ CD4+ e CD8+ MicroBeads podem ser usados para isolar células T CD4+ e CD8+. Exemplos não limitantes alternativos de células que podem ser isoladas de acordo com técnicas conhecidas incluem células T volumosas, células T NK e células T gama delta.

[0191] Alternativamente, as células podem ser obtidas através de culturas de células disponíveis comercialmente, incluindo, mas não se limitando a, para células T, as linhagens BCL2 (AAA) Jurkat (ATCC® CRL-2902™), BCL2 (S70A) Jurkat (ATCC® CRL-2900™), BCL2 (S87A) Jurkat (ATCC® CRL-2901™), BCL2 Jurkat (ATCC® CRL-2899™), Neo Jurkat (ATCC® CRL-2898™); para células B, as linhagens AHH-1 (ATCC® CRL-8146™), BC-1 (ATCC® CRL-2230™), BC-2 (ATCC® CRL- 2231™), BC-3 (ATCC® CRL-2277™), CA46 (ATCC® CRL-1648™), DG-75 [D.G.-75] (ATCC® CRL-2625™), DS-1 (ATCC® CRL-11102™), EB-3 [EB3] (ATCC® CCL-85™), Z-138 (ATCC #CRL-3001), DB (ATCC CRL-2289), Toledo (ATCC CRL-2631), Pfiffer (ATCC CRL-2632), SR (ATCC CRL-2262),

JM-1 (ATCC CRL-10421), NFS-5 C-1 (ATCC CRL-1693); NFS-70 C10 (ATCC CRL-1694), NFS-25 C-3 (ATCC CRL-1695), e SUP-B15 (ATCC CRL- 1929); e, para células NK, as linhagens NK-92 (ATCC® CRL-2407™), NK- 92MI (ATCC® CRL-2408™). Outros exemplos incluem, mas sem limitação linhagens de células T maduras, por exemplo, Deglis, EBT-8, HPB-MLp- W, HUT 78, HUT 102, Karpas 384, Ki 225, My-La, Se-Ax, SKW-3, SMZ-1 e T34; immature T- cell lines, por exemplo, ALL-SIL, Be13, CCRF-CEM, CML-T1, DND-41, DU.528, EU-9, HD-Mar, HPB-ALL, H-SB2, HT-1, JK- T1, Jurkat, Karpas 45, KE-37, KOPT-K1, K-T1, L-KAW, Loucy, MAT, MOLT-1, MOLT 3, MOLT-4, MOLT 13, MOLT-16, MT-1, MT-ALL, P12/Ichikawa, Peer, PER0117, PER-255, PF-382, PFI-285, RPMI-8402, ST-4, SUP-T1 to T14, TALL-1, TALL-101, TALL-103/2, TALL-104, TALL- 105, TALL-106, TALL-107, TALL-197, TK-6, TLBR-1, -2, -3, e -4, CCRF- HSB-2 (CCL-120.1), J.RT3-T3.5 (ATCC TIB-153), J45.01 (ATCC CRL- 1990), J.CaM1.6 (ATCC CRL-2063), RS4;11 (ATCC CRL-1873), CCRF- CEM (ATCC CRM-CCL-119); linhagens de linfoma cutâneo de células T, por exemplo, HuT78 (ATCC CRM-TIB-161), MJ[G11] (ATCC CRL-8294), HuT102 (ATCC TIB-162); linhagens de células B derivadas de linfomas anaplásicos e de células grandes, por exemplo, DEL, DL-40, FE-PD, JB6, Karpas 299, Ki-JK, Mac-2A Ply1, SR-786, SU-DHL-1, -2, -4,-5,-6,-7,-8,- 9,-10, e -16, DOHH-2, NU-DHL-1, U-937, Granda 519, USC-DHL-1, RL; linfomas de Hodgkin, por exemplo, DEV, HD-70, HDLM-2, HD-MyZ, HKB-1, KM-H2, L 428, L 540, L1236, SBH-1, SUP-HD1, e SU/RH-HD-l; e linhagens NK como HANK1, KHYG-1, NKL, NK-YS, NOI-90, e YT.

As linhagens de células de leucemia Null, incluindo, mas não se limitando a REH, NALL-1, KM-3, L92-221, são uma outra fonte comercialmente disponível de células imunes, assim como as linhagens de células derivadas de outras leucemias e linfomas, como K562 eritroleucemia, leucemia monocítica THP-1, linfoma U937, eritroleucemia HEL, leucemia HL60, leucemia HMC-1, leucemia KG-1, mieloma U266. Fontes exemplificadoras não limitantes para tais linhagens de células comercialmente disponíveis incluem a American Type Culture Collection,

or ATCC, (atcc.org/) and the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (dsmz.de/).

[0192] Em algumas modalidades, as células T que expressam os CARs divulgadas podem ser ainda modificadas para reduzir ou eliminar a expressão de TCRs endógenos. A redução ou eliminação de TCRs endógenos pode reduzir os efeitos fora do alvo e aumentar a eficácia das células T. As células T estavelmente sem expressão de um TCR funcional podem ser produzidas com o uso de uma variedade de abordagens. As células T internalizam, classificam e degradam todo o receptor de células T como um complexo, com meia-vida de cerca de 10 horas em células T em repouso e 3 horas em células T estimuladas (von Essen, M. et al.

2004. J. Immunol. 173:384-393). O funcionamento adequado do complexo de TCR requer a razão estequiométrica adequada das proteínas que compõem o complexo de TCR. A função de TCR também requer duas proteínas de TCRzeta funcionais com motivos ITAM. A ativação de TCR após o acoplamento de seu ligante de peptídeo MHC requer o acoplamento de vários TCRs na mesma célula T, que todos devem sinalizar adequadamente. Assim, se um complexo de TCR é desestabilizado com proteínas que não se associam adequadamente ou não podem sinalizar de forma otimizada, a célula T não se tornará ativada o suficiente para iniciar uma resposta celular.

[0193] Consequentemente, em algumas modalidades, a expressão de TCR pode ser eliminada usando interferência de RNA (por exemplo, shRNA, siRNA, miRNA, etc.), CRISPR ou outros métodos que têm como alvo os ácidos nucleicos que codificam TCRs específicos (por exemplo, TCR-α e TCR-β) e/ou cadeias CD3 em células T primárias. Ao bloquear a expressão de uma ou mais dessas proteínas, a célula T não produzirá mais um ou mais dos componentes-chave do complexo de TCR, desestabilizando assim o complexo de TCR e evitando a expressão da superfície celular de um TCR funcional. Mesmo que alguns complexos de

TCR possam ser reciclados para a superfície da célula quando a interferência de RNA é usada, o RNA (por exemplo, shRNA, siRNA, miRNA, etc.) irá prevenir nova produção de proteínas de TCR, resultando na degradação e remoção de todo o complexo de TCR, resultando na produção de uma célula T com uma deficiência estável na expressão funcional de TCR.

[0194] A expressão de RNAs inibidores (por exemplo, shRNA, siRNA, miRNA, etc.) em células T primárias pode ser alcançada usando qualquer sistema de expressão convencional, por exemplo, um sistema de expressão lentiviral. Embora os lentivírus sejam úteis para direcionar as células T primárias em repouso, nem todas as células T expressarão os shRNAs. Algumas dessas células T podem não expressar quantidades suficientes de RNAs para permitir a inibição suficiente da expressão de TCR para alterar a atividade funcional da célula T. Assim, as células T que retêm a expressão de TCR moderada a alta após a transdução viral podem ser removidas, por exemplo, por classificação de células ou técnicas de separação, de modo que as células T restantes sejam deficientes em TCR ou CD3 de superfície celular, permitindo a expansão de uma população isolada de células T deficientes na expressão de TCR ou CD3 funcional.

[0195] A expressão de CRISPR em células T primárias pode ser alcançada usando sistemas convencionais de CRISPR/Cas e RNAs guia específicos para os TCRs alvos. Sistemas de expressão adequados, por exemplo, sistemas de expressão lentiviral ou adenoviral são conhecidos na técnica. Semelhante à liberação de RNAs inibidores, o sistema CRISPR pode ser usado para direcionar especificamente células T primárias em repouso ou outras células imunes adequadas para terapia com células de CAR. Além disso, na medida em que a edição de CRISPR não tem sucesso, as células podem ser selecionadas para o sucesso de acordo com os métodos divulgados acima. Por exemplo, como observado acima, as células T que retêm a expressão de TCR moderada a alta após a transdução viral podem ser removidas, por exemplo, por classificação de células ou técnicas de separação, de modo que as células T restantes sejam deficientes em TCR ou CD3 de superfície celular, permitindo a expansão de uma população isolada de células T deficientes na expressão de TCR ou CD3 funcional. É ainda apreciado que um construto de edição de CRISPR pode ser útil tanto na eliminação do TCR endógeno quanto na eliminação dos construtos de CAR aqui divulgados. Consequentemente, é apreciado que um sistema de CRISPR pode ser projetado para realizar um ou ambos os objetivos.

[0196] Vetores. As células de CAR podem ser preparadas usando vetores. Aspectos da presente divulgação se referem a uma sequência de ácido nucleico isolado que codifica (i) um CAR ou (ii) um polinucleotídeo que codifica uma molécula imunorreguladora e vetores compreendendo, ou alternativamente consistindo essencialmente em, ou ainda consistindo ainda em, um ou ambos destes ácidos nucleicos e/ou complementos e/ou equivalentes de cada um dos mesmos.

[0197] Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico isolada codifica um CAR compreendendo, ou alternativamente consistindo essencialmente em, ou ainda consistindo em um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo alvo de câncer ou de tumor, um domínio de dobradiça CD8 α, um domínio transmembrana CD8 α, uma região de sinalização coestimuladora de CD28 e/ou uma região de sinalização coestimuladora 4-1BB e um domínio de sinalização de CD3 zeta. Em modalidades específicas, a sequência de ácido nucleico isolada compreende, ou alternativamente consiste essencialmente na mesma, ou ainda consiste adicionalmente em, sequências que codificam (a) um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo alvo de câncer ou de tumor seguido por (b) um domínio de dobradiça CD8 α, (c) um domínio transmembrana CD8 α seguido por (d) uma região de sinalização coestimuladora de CD28 e/ou uma região de sinalização coestimuladora 4-1BB seguida por (e) um domínio de sinalização de CD3 zeta.

[0198] Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico isolada codifica um CAR e compreende, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste em, uma sequência de consenso de Kozak a montante da sequência que codifica o domínio de ligação ao antígeno do anticorpo alvo de câncer ou de tumor.

[0199] Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno tem como alvo BCMA.

[0200] Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste em um polinucleotídeo que codifica um anticorpo biespecífico. Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste nas regiões de CDR relevantes de um anticorpo para NKG2D e, opcionalmente, SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319), são opcionalmente códon otimizados, ou um equivalente de cada um dos mesmos. Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste nas regiões de CDR relevantes de um anticorpo para NKG2D e, opcionalmente, SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319), que são opcionalmente códon otimizados, ou um equivalente de cada um dos mesmos. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste na região variável de cadeia pesada e/ou de cadeia leve de um anticorpo para NKG2D e, opcionalmente, SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319), que são opcionalmente códon otimizados e/ou um equivalente de cada um dos mesmos. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende um fragmento variável de cadeia simples (scFv) derivado de um anticorpo para NKG2D e, opcionalmente, um fragmento variável de cadeia simples (scFv) derivado de SALMF7 (também conhecido como CS1 de CD319), (que são opcionalmente códon otimizados) e/ou equivalentes de cada um dos mesmos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste em uma sequência de polinucleotídeos que codifica o anticorpo biespecífico operativamente ligado a um promotor que pode ser gerado de acordo com o método divulgado acima.

[0201] Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende um marcador detectável e/ou um polinucleotídeo que confere resistência a antibióticos. Em um aspecto, o marcador ou polinucleotídeo são úteis para selecionar células transduzidas com sucesso com os ácidos nucleicos isolados.

[0202] Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico isolada está compreendida em um vetor. Em certas modalidades, o vetor é um plasmídeo. Em outras modalidades, o vetor é um vetor de lentivírus. Exemplos não limitantes de tais incluem, sem limitação, um vetor retroviral, um vetor lentiviral, um vetor adenoviral e um vetor viral adenoassociado. Em modalidades específicas, o vetor é um vetor lentiviral.

[0203] A preparação de vetores exemplificadores e a geração de células que expressam CAR usando os referidos vetores são discutidas em detalhes nos exemplos abaixo. Em resumo, a expressão de ácidos nucleicos naturais ou sintéticos que codificam CARs ou moléculas imunorreguladoras é tipicamente alcançada ligando operacionalmente um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de CAR ou porções do mesmo a um promotor, e incorporando o construto em um vetor de expressão. Um método semelhante pode ser usado para construir a sequência de ácido nucleico isolada compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma molécula imunorreguladora. Os vetores podem ser adequados para eucariótas de replicação e integração. Os métodos para a produção de células compreendendo vetores e/ou ácidos nucleicos exógenos são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York).

[0204] Em um aspecto, o termo “vetor” se refere a um vetor recombinante que retém a capacidade de infectar e transduzir células que não se dividem e/ou se dividem lentamente e se integra ao genoma da célula alvo. Em vários aspectos, o vetor é derivado de, ou baseado em, um vírus de tipo selvagem. Em outros aspectos, o vetor é derivado de, ou baseado em, um lentivírus de tipo selvagem. Exemplos de tais incluem, sem limitação, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da anemia infecciosa equina (EIAV), vírus da imunodeficiência símia (SIV) e vírus da imunodeficiência felina (FIV). Alternativamente, é contemplado que outro retrovírus pode ser usado como uma base para uma estrutura de vetor, tal como o vírus da leucemia murina (MLV). Será evidente que um vetor viral de acordo com a divulgação não precisa ser confinado aos componentes de um vírus específico. O vetor viral pode compreender componentes derivados de dois ou mais vírus diferentes e também pode compreender componentes sintéticos. Os componentes do vetor podem ser manipulados para obter as características desejadas, como a especificidade da célula alvo.

[0205] Os vetores recombinantes desta divulgação são derivados de primatas e não primatas. Exemplos de lentivírus de primatas incluem o vírus da imunodeficiência humana (HIV), o agente causador da síndrome da imunodeficiência adquirida humana (AIDS) e o vírus da imunodeficiência símia (SIV). O grupo lentiviral de não primata inclui o protótipo “vírus lento” do vírus visna/maedi (VMV), bem como o vírus da artrite-encefalite caprina relacionado (CAEV), vírus da anemia infecciosa equina (EIAV) e o vírus da imunodeficiência felina descrito mais recentemente (FIV) e vírus da imunodeficiência bovina (BIV). Os vetores lentivirais recombinantes da técnica anterior são conhecidos na técnica, por exemplo, consulte as Patentes US nºs. 6.924.123; 7.056.699;

7.419.829 e 7.442.551, aqui incorporados por referência.

[0206] A Patente US nº. 6.924.123 revela que certa sequência retroviral facilita a integração no genoma da célula alvo. Esta patente ensina que cada genoma retroviral compreende genes chamados gag, pol e env que codificam proteínas e enzimas de vírion. Esses genes são flanqueados em ambas as extremidades por regiões chamadas de repetições terminais longas (LTRs). As LTRs são responsáveis pela integração e transcrição pró-viral. Eles também servem como sequências potencializadoras- promotoras. Em outras palavras, as LTRs podem controlar a expressão dos genes virais. A encapsidação dos RNAs retrovirais ocorre em virtude de uma sequência de psi localizada na extremidade 5’ do genoma viral. As próprios LTRs são sequências idênticas que podem ser divididas em três elementos, chamados U3, R e U5. U3 é derivado da sequência única da extremidade 3’ do RNA. R é derivado de uma sequência repetida em ambas as extremidades do RNA, e U5 é derivado da sequência única da extremidade 5’ do RNA. Os tamanhos dos três elementos podem variar consideravelmente entre os diferentes retrovírus. Para o genoma viral, o local da adição poli (A) (terminação) está no limite entre R e U5 na LTR do lado direito. U3 contém a maioria dos elementos de controle da transcrição do pró-vírus, que incluem o promotor e múltiplas sequências potencializadoras responsivas às proteínas celulares e, em alguns casos, ativadoras da transcrição viral.

[0207] No que diz respeito aos próprios genes estruturais gag, pol e env, gag codifica a proteína estrutural interna do vírus. A proteína Gag é processada proteoliticamente nas proteínas maduras MA (matriz), CA (capsídeo) e NC (nucleocapsídeo). O gene pol codifica a transcriptase reversa (RT), que contém DNA polimerase, associada a RNase H e integrase (IN), que medeia a replicação do genoma.

[0208] Para a produção de partículas de vetor viral, o genoma de vetor de RNA é expresso a partir de um construto de DNA que o codifica, em uma célula hospedeira. Os componentes das partículas não codificadas pelo genoma do vetor são fornecidos em trans por sequências de ácido nucleico adicionais (o “sistema de empacotamento”, que geralmente inclui um ou ambos os genes gag/pol e env) expressos na célula hospedeira. O conjunto de sequências necessárias para a produção das partículas do vetor viral pode ser introduzido na célula hospedeira por transfecção transitória, ou pode ser integrado no genoma da célula hospedeira, ou pode ser fornecido em uma mistura de várias maneiras. As técnicas envolvidas são conhecidas dos versados na técnica.

[0209] Os vetores retrovirais para uso nesta divulgação incluem, mas sem limitaçãoo sistema “ViraPower” versões 4, 6 e 6.2 da série pLenti da Invitrogen. Fabricado pela Lentigen Corp ; pHIV-7-GFP, gerado laboratório e usado pelo City of Hope Research Institute; Vetor lentiviral “Lenti-X”, pLVX, fabricado por Clontech; pLKO.1-puro, fabricado por Sigma-Aldrich; pLemiR, fabricado pela Open Biosystems; e pLV, laboratório gerado e usado pela Charité Medical School, Institute of Virology (CBF), Berlin, Alemanha.

[0210] Outros métodos de introdução de ácidos nucleicos exógenos na técnica são conhecidos e incluem, mas não estão limitados à liberação de genes com o uso de um ou mais dentre eletroporação de RNA, nanotecnologia, vetores sleeping beauty, retrovírus e/ou adenovírus.

[0211] Independentemente do método usado para introduzir ácidos nucleicos exógenos em uma célula hospedeira ou, de outra forma, expor uma célula ao inibidor da presente divulgação, a fim de confirmar a presença da sequência de DNA recombinante na célula hospedeira, uma variedade de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios incluem, por exemplo, ensaios de “Biologia molecular” bem conhecidos dos versados na técnica, tais como Southern e Northern blotting, RT-PCR e PCR;

ensaios “bioquímicos”, como a detecção da presença ou ausência de um determinado peptídeo, por exemplo, por meios imunológicos (ELlSAs e Western blots) ou por ensaios aqui descritos para identificar os agentes que se enquadram no escopo da divulgação.

[0212] Vetor de Empacotamento e Linhagens de Células. Os ácidos nucleicos isolados podem ser empacotados em um sistema de empacotamento retroviral com o uso de um vetor de empacotamento e linhagens de células. O vetor de empacotamento inclui, mas não está limitado a vetor retroviral, vetor lentiviral, vetor adenoviral e vetor viral adenoassociado. O vetor de empacotamento contém elementos e sequências que facilitam a liberação de materiais genéticos nas células. Por exemplo, os construtos retrovirais são vetores de empacotamento que compreendem pelo menos uma sequência de DNA retroviral auxiliar derivada de um genoma retroviral incompetente para replicação que codifica em trans todas as proteínas do vírion necessárias para empacotar um vetor retroviral incompetente para replicação, e para produzir proteínas do vírion capazes de empacotar o vetor retroviral incompetente para replicação em titulações elevadas, sem a produção de vírus auxiliar competente para replicação. A sequência de DNA retroviral carece da região que codifica o potencializador e/ou promotor nativo da 5′ LTR viral do vírus, e carece da sequência de função psi responsável pelo empacotamento do genoma auxiliar e da 3′ LTR, mas codifica um sítio de poliadenilação estranho, por exemplo, o sítio de poliadenilação SV40 e um potencializador e/ou promotor estranho que dirige a transcrição eficiente em um tipo de célula onde a produção de vírus é desejada. O retrovírus é um vírus da leucemia, como o vírus da Leucemia Murina Moloney (MMLV), o vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) ou o vírus da Leucemia do Macaco Gibão (GALV). O potencializador e promotor estrangeiro podem ser o potencializador e o promotor imediato (IE) do citomegalovírus humano (HCMV), o potencializador e promotor (região U3) do vírus do sarcoma murino de Moloney (MMSV), a região U3 do vírus do sarcoma de Rous (RSV), a região U3 do vírus de formação de foco do baço (SFFV), ou o potencializador de HCMV IE unido ao promotor nativo do vírus da leucemia murina de Moloney (MMLV). O vetor de empacotamento retroviral pode consistir em duas sequências de DNA auxiliar retroviral codificadas por vetores de expressão baseados em plasmídeo, por exemplo, onde uma primeira sequência auxiliar contém um cDNA que codifica as proteínas gag e pol de MMLV ou GALV ecotrópico e uma segunda sequência auxiliar contém um cDNA que codifica a proteína env. O gene Env, que determina a faixa de hospedeiros, pode ser derivado dos genes que codificam as proteínas xenotrópicas, anfotrópicas, ecotrópicas, politrópicas (formadoras de foco de mink) ou proteínas env de vírus leucemia murina 10A1, ou o Vírus de Leucemia de Macaco Gibão (proteína env GALV, proteína env do vírus da imunodeficiência humano (gp160), proteína G do vírus do estomatito vesicular (VSV), produtos do gene env da leucemia de células T humanas (HTLV) tipo I e II, gene do envelope quimérico derivado de combinações de um ou mais dos genes env ou genes de envelope quiméricos mencionados anteriormente que codificam o citoplasma e a transmembrana dos produtos do gene env acima mencionados e um anticorpo monoclonal dirigido contra uma molécula de superfície específica em uma célula alvo desejada.

[0213] No processo de empacotamento, os vetores de empacotamento e vetores retrovirais são transitoriamente co-transfectados em uma primeira população de células de mamíferos que são capazes de produzir vírus, como células de rim embrionário humano, por exemplo células 293 (ATCC n°. CRL1573, ATCC, Rockville, Md.) para produzir sobrenadantes contendo retrovírus recombinantes de alta titulação. Em outro método da divulgação, esta primeira população de células transfectadas transitoriamente é então cocultivada com células alvo de mamíferos, por exemplo, linfócitos humanos, para transduzir as células alvo com o gene estranho em altas eficiências. Em ainda outro método da invenção, os sobrenadantes da primeira população de células transfectadas transitoriamente descritas acima são incubados com células alvo de mamífero, por exemplo, linfócitos humanos ou células-tronco hematopoiéticas, para transduzir as células alvo com o gene estranho em altas eficiências.

[0214] Em outro aspecto, os vetores de empacotamento são expressos de forma estável em uma primeira população de células de mamíferos que são capazes de produzir vírus, como células de rim embrionário humano, por exemplo, as células 293. Os vetores retrovirais ou lentivirais são introduzidos nas células por cotransfecção com um marcador selecionável ou infecção com vírus pseudotipado. Em ambos os casos, os vetores se integram. Alternativamente, os vetores podem ser introduzidos em um plasmídeo mantido de forma episomal. São produzidos sobrenadantes contendo retrovírus recombinantes de alta titulação.

[0215] Ativação e Expansão para Células de CAR. Quer antes ou depois da modificação genética das células para expressar um CAR desejável, as células podem ser ativadas e expandidas com o uso dos métodos geralmente conhecidos, tais como aqueles descritos nas Patentes US nºs.

6.352.694; 6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466;

6.905.681; 7.144.575; 7.067.318; 7.172.869; 7.232.566; 7.175.843;

5.883.223; 6.905.874; 6.797.514; 6.867.041 e referências como Lapateva et al. (2014) Crit Rev Oncog 19(1-2):121-32; Tam et al. (2003) Cytotherapy 5(3):259-72; Garcia-Marquez et al. (2014) Cytotherapy 16(11):1537-44. Estimulação com o antígeno relevante para o tumor ex vivo pode ativar e expandir a subpopulação celular de expressão de CAR selecionada. Alternativamente, as células podem ser ativadas in vivo por interação com um antígeno relevante para o tumor.

[0216] No caso de certas células imunes, as populações de células adicionais, ligantes solúveis e/ou citocinas ou agentes estimulantes podem ser necessários para ativar e expandir as células. Os reagentes relevantes são bem conhecidos na técnica e são selecionados de acordo com princípios imunológicos conhecidos. Por exemplo, o ligante CD-40 solúvel pode ser útil na ativação e expansão de certas populações de células B; da mesma forma, células alimentadoras irradiadas podem ser usadas no procedimento para ativação e expansão de células NK.

[0217] Os métodos de ativação de células relevantes são bem conhecidos na técnica e podem ser facilmente adaptados ao presente Pedido; um método exemplificador é descrito nos exemplos abaixo. Os métodos de isolamento para uso em relação a esta divulgação incluem, mas sem limitação kits de ativação e expansão Life Technologies Dynabeads® System; Kits de ativação BD Biosciences Phosflow™, kits de ativação/expansão Miltenyi Biotec MACS™ e outros kits de células disponíveis comercialmente específicos para frações de ativação da célula relevante. Subpopulações particulares de células imunes podem ser ativadas ou expandidas através do uso de grânulos ou outros agentes disponíveis em tais kits. Por exemplo, α-CD3/α-CD28 Dynabeads® podem ser usados para ativar e expandir uma população de células T isoladas.

Métodos de Uso

[0218] Aplicação Terapêutica. Os aspectos do método da presente divulgação se referem a métodos para inibir o crescimento de um tumor ou células cancerosas (por exemplo, células de MM) in vitro ou in vivo e/ou para o tratamento de um paciente com câncer em necessidade dos mesmos. Em algumas modalidades, o tumor é um tumor sólido. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer que afeta o sangue e/ou a medula óssea, por exemplo, MM. Em algumas modalidades, o câncer ou célula tumoral expressa ou superexpressa um antígeno de câncer ou de tumor, por exemplo, BCMA e/ou CS1. Quando praticado in vitro, os métodos fornecem ensaios in vitro para aplicação de medicina de precisão e ensaios úteis para testar novas combinações e terapias.

[0219] Em certas modalidades, esses métodos compreendem, ou alternativamente consistem essencialmente em, ou ainda consistem em, administrar ao sujeito ou paciente uma quantidade eficaz da célula isolada que compreende o CAR.

Em outras modalidades, esta célula isolada compreende ou expressa um CAR e/ou um anticorpo biespecífico.

Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno do CAR compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste nas regiões de CDR relevantes de um anticorpo para qualquer um de antígeno de maturação de células B (BCMA) e/ou SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319), e/ou um equivalente de cada um dos mesmos.

Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno do CAR compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste na região variável de cadeia pesada e/ou de cadeia leve de um anticorpo para qualquer um dentre antígeno de maturação de células B (BCMA) e/ou SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319) e/ou um equivalente de cada um dos mesmos.

Em ainda outras modalidades, a célula isolada é uma célula T ou uma célula NK.

Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste em um ligante NKG2D e, opcionalmente, um ligante SALMF7 (também conhecido como CS1 de CD319). Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste nas regiões de CDR relevantes de um anticorpo para NKG2D e, opcionalmente, SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319), ou um equivalente de cada um dos mesmos.

Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende, ou alternativamente consiste essencialmente deste, ou ainda consiste na região variável de cadeia pesada e/ou de cadeia leve de um anticorpo para NKG2D e, opcionalmente, SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319), e/ou um equivalente de cada um dos mesmos.

Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende um fragmento variável de cadeia simples (scFv) derivado de um anticorpo para NKG2D e, opcionalmente, um fragmento variável de cadeia simples (scFv) derivado de SALMF7 (também conhecido como CS1 de CD319), e/ou um equivalente de cada um dos mesmos. Em algumas modalidades, a célula isolada é autóloga para o sujeito ou paciente em tratamento. Em um aspecto adicional, o tumor expressa um câncer ou antígeno tumoral e o sujeito foi selecionado para a terapia por um diagnóstico, tal como o uso de um anticorpo que reconhece e se liga ao tumor ou aos antígenos relevantes para o câncer direcionados pelos CARs. O sujeito é um animal, um mamífero, um canino, um felino, um bovino, um equino, um murino ou um paciente humano.

[0220] As células de CAR, conforme divulgadas na presente invenção, podem ser administradas isoladamente ou em combinação com o anticorpo biespecífico divulgado na presente invenção, diluentes, terapêuticas anticâncer conhecidas e/ou com outros componentes, tais como citocinas ou outras populações de células que são imunorreguladoras. Elas podem ser administradas como uma terapia de primeira linha, uma terapia de segunda linha, uma terapia de terceira linha ou terapia adicional. Exemplos não limitantes de terapias adicionais incluem terapia citorredutora, como terapia de radiação, crioterapia ou quimioterapia ou produtos biológicos. Outros exemplos não limitantes incluem outros tipos de células relevantes, tais como células imunes não modificadas, células imunes modificadas compreendendo vetores que expressam uma ou mais moléculas imunorreguladoras ou células de CAR específicas para um antígeno diferente daqueles divulgados na presente invenção. Tal como acontece com as células de CAR da presente divulgação, em algumas modalidades, essas células podem ser autólogas ou alogênicas. Os regimes de tratamento apropriados serão determinados pelo médico assistente ou veterinário.

[0221] As composições farmacêuticas da presente divulgação podem ser administradas de uma maneira apropriada para a doença a ser tratada ou prevenida. A quantidade e a frequência de administração serão determinadas por fatores como a condição do paciente e o tipo e gravidade da doença do paciente, embora as dosagens apropriadas possam ser determinadas por ensaios clínicos. Em um aspecto, elas são administradas diretamente por injeção direta ou sistemicamente, como injeção intravenosa.

[0222] Os aspectos da divulgação fornecem um método exemplificador para determinar se um paciente tem probabilidade de responder à, ou não é provável que responda à, terapia com CAR. O método compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste em determinar a presença ou ausência de necrose em uma amostra de tumor isolada do paciente e quantificar a quantidade de câncer ou células de tumor expressas no antígeno de câncer ou de tumor. Em certas modalidades, o método compreende adicionalmente, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste em administrar uma quantidade eficaz da terapia com CAR ao paciente que provavelmente responderá à terapia com CAR. A terapia com CAR pode ser autóloga ou alogênica ao paciente e o paciente pode ser um sujeito portador de tumor sólido, animal ou humano.

[0223] As técnicas de coloração histológica para necrose são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, as manchas de hematoxilina e eosina, também conhecidas como “coloração de H&E”, são uma técnica comum para identificar a presença de necrose em tecidos, especialmente em crescimento tumorigênico ou canceroso. A coloração citoplasmática de H&E demonstra aumento da eosinofilia, atribuível em parte à perda de RNA citoplasmático e em parte a proteínas citoplasmáticas desnaturadas. Em colorações de tecido necrótico, o citoplasma frequentemente parece “comido por traças” devido à digestão enzimática de organelas citoplasmáticas. Figuras de mielina, calcificação e evidência de fagocitose em outras células também são marcas registradas de tecidos necróticos que podem ser detectados por coloração histológica. Os tecidos necróticos também têm marcas específicas na coloração nuclear, frequentemente demonstrando cariólise, picnose e cariorrexe como resultado da morte celular. Usando microscopia e quantificação manual ou automática de tais marcas necróticas, a relevância da terapia com CAR pode ser determinada. Os meios alternativos de detecção de crescimento tumorigênico ou canceroso ou tecidos necróticos em geral, incluindo, mas não se limitando a diagnósticos baseados em biomarcadores ou por imagem, também são igualmente relevantes para determinar se um paciente responderá a certos tipos de terapia com CAR e podem ser usados adequadamente.

Veículos

[0224] Os aspectos adicionais da divulgação se referem a composições compreendendo, ou alternativamente consistindo essencialmente em, ou ainda consistindo em, um veículo e um ou mais dos produtos - por exemplo, um CAR, uma célula isolada compreendendo um CAR, um ácido nucleico isolado, um vetor, uma célula isolada contendo o CAR e o anticorpo biespecífico divulgado na presente invenção e/ou ácidos nucleicos que os codificam - descritos nas modalidades aqui divulgadas. Em outros aspectos, a composição pode compreender adicionalmente uma molécula imunorreguladora e/ou um ácido nucleico isolado que compreende um polinucleotídeo que codifica um anticorpo biespecífico. Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou consiste adicionalmente nas regiões de CDR relevantes de um anticorpo para BCMA e/ou NKG2D, opcionalmente, SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319), ou um equivalente de cada um dos mesmos. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste na região variável de cadeia pesada e/ou de cadeia leve de um anticorpo para NKG2D, opcionalmente, SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319), que são opcionalmente códon otimizados e/ou um equivalente de cada um dos mesmos. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende um fragmento variável de cadeia simples (scFv) derivado de um anticorpo para NKG2D, opcionalmente, um fragmento variável de cadeia simples (scFv) derivado de SALMF7 (também conhecido como CS1 de CD319), (que são opcionalmente códon otimizados) e/ou equivalentes de cada um dos mesmos.

[0225] Resumidamente, as composições farmacêuticas da presente divulgação, incluindo, mas não se limitando a qualquer uma das composições reivindicadas como aqui descritas, em combinação com um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitáveis. Tais composições podem compreender tampões, tais como solução salina tamponada neutra, solução salina tamponada com fosfato e semelhantes; carboidratos, como glicose, manose, sacarose ou dextranos, manitol; proteínas; polipeptídeos ou aminoácidos, tais como glicina; antioxidantes; agentes quelantes como EDTA ou glutationa; adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio); e conservantes. As composições da presente divulgação podem ser formuladas para administração oral, intravenosa, tópica, enteral e/ou parenteral. Em certas modalidades, as composições da presente divulgação são formuladas para administração intravenosa.

[0226] A administração das células ou composições pode ser realizada em uma dose, continuamente ou intermitentemente ao longo do curso do tratamento e uma quantidade eficaz para atingir o benefício terapêutico desejado é fornecida. Os métodos de determinação do meio e dosagem de administração mais eficazes são conhecidos pelos versados na técnica e irão variar com a composição usada para a terapia, o propósito da terapia e o sujeito em tratamento. As administrações únicas ou múltiplas podem ser realizadas com o nível de dose e o padrão selecionado pelo médico assistente. As formulações de dosagem adequadas e métodos de administração dos agentes são conhecidos na técnica. Em um aspecto adicional, as células e a composição da divulgação podem ser administradas em combinação com outros tratamentos.

[0227] As células e as populações de células são administradas ao hospedeiro com o uso dos métodos conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em PCT/US2011/064191. Esta administração das células ou composições da divulgação pode ser feita para gerar um modelo animal da doença, distúrbio ou condição desejada para ensaios experimentais e de triagem.

Terapias de Combinação

[0228] As composições como aqui descritas podem ser administradas como primeira linha, segunda linha, terceira linha, quarta linha ou outra terapia e podem ser combinadas com intervenções citorredutivas. Elas podem ser administradas sequencialmente ou simultaneamente, conforme determinado pelo médico assistente. Em um aspecto, eles podem ser combinados com terapias que podem regular positivamente a expressão de um tumor ou outro antígeno ao qual o CAR e/ou o BsAb se ligam. Em um aspecto, alguns medicamentos clínicos podem aumentar os antígenos alvos. Por exemplo, a expressão de superfície de CS1 pode ser aumentada por Lenalidomida, um fármaco imunomodulador para mioma múltiplo que é aprovado pelo FDA, ver Wang et al. (2018) Clin. Cancer Res. Jan 1;24(1):106-119. Outro exemplo é o fármaco midostaurina aprovado pela FDA que aumenta a expressão de FLT3 quando o CAR-BsAb tem como alvo um antígeno de FLT3.

Kits

[0229] Conforme estabelecido na presente invenção, a presente divulgação fornece métodos para produzir e administrar células de CAR e/ou BsAb CAR. Em um aspecto particular, a presente divulgação fornece kits para realizar esses métodos, bem como instruções para realizar os métodos da presente divulgação, como coletar células e/ou tecidos e/ou realizar a triagem/transdução/etc. e/ou analisar os resultados.

[0230] Em um aspecto, o kit compreende, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste em, qualquer um dos ácidos nucleicos isolados aqui divulgados e/ou um vetor compreendendo o referido ácido nucleico e/ou células alogênicas isoladas, de preferência células T ou células NK, e/ou instruções sobre a obtenção de células autólogas de um paciente. Tal kit também pode compreender, ou alternativamente consistir essencialmente em, ou ainda compreender meios e outros reagentes apropriados para a transdução e/ou seleção e/ou ativação e/ou expansão de células que expressam CAR e/ou BsAb CAR, tais como aqueles divulgados aqui.

[0231] Em um aspecto, o kit compreende, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste em, um CAR isolado e/ou uma célula que expressa CAR BsAb ou população do mesmo. Em algumas modalidades, as células deste kit podem requerer ativação e/ou expansão antes da administração a um sujeito que precisa do mesmo. Em outras modalidades, o kit pode compreender adicionalmente, ou consistir essencialmente dele, meios e reagentes, tais como aqueles cobertos na divulgação acima, para ativar e/ou expandir o CAR isolado e/ou células que expressam o CAR BsAb. Em algumas modalidades, a célula deve ser usada para terapia com CAR. Em outras modalidades, o kit compreende instruções sobre a administração da célula isolada a um paciente com necessidade de terapia com CAR.

[0232] Os kits desta divulgação também podem compreender, por exemplo, um agente tamponante, um conservante ou um agente estabilizador de proteína. Os kits podem compreender adicionalmente componentes necessários para detectar o marcador detectável, por exemplo, uma enzima ou um substrato. Os kits também podem conter uma amostra de controle ou uma série de amostras de controle, que podem ser analisadas e comparadas com a amostra de teste. Cada componente de um kit pode ser colocado dentro de um recipiente individual e todos os vários recipientes podem estar dentro de um único pacote, junto com instruções para interpretar os resultados dos ensaios realizados com o uso do kit. Os kits da presente divulgação podem conter um produto escrito no, ou dentro do, recipiente do kit. O produto escrito descreve como usar os reagentes contidos no kit.

[0233] Conforme adequado, estes componentes de kit sugeridos podem ser embalados de uma maneira usual para uso por aqueles versados na técnica. Por exemplo, estes componentes de kit sugeridos podem ser fornecidos em solução ou como uma dispersão líquida ou semelhante.

[0234] Os exemplos a seguir são ilustrativos de procedimentos que podem ser usados em vários casos para levar a divulgação a efeito.

EXEMPLO 1 - Geração e Eficácia de Células T BsAb CAR

[0235] As células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) e os anticorpos biespecíficos (BsAb) são terapias aprovadas pela FDA e mostram um potencial curativo impressionante para o câncer. No entanto, na maioria dos casos, nenhum dos dois ainda demonstrou ser curativo. Isso pode ser devido em parte à duração das terapias, ou seja, as células T de CAR podem não sobreviver por tempo suficiente in vivo, e o BsAb têm meia-vida muito curta com um processo de fabricação caro e demorado, limitando assim sua eficácia e ampla aplicação. Aqui, os Requerentes criaram com sucesso uma plataforma para combinar a terapia com células de T CAR com a terapia com BsAb, ambas com potencial para efeitos de longa duração. Os requerentes testaram esta plataforma no cenário de mieloma múltiplo (MM), um câncer incurável com altas taxas de recorrência após as terapias atualmente aprovadas pela FDA.

Os requerentes validaram o conceito utilizando dois antígenos alvo de MM, CS1 e BCMA, e criaram um novo e eficaz construto lentiviral único para gerar células T BsAb-CAR expressando um BCMA CAR, bem como secretando um BSAb anti-NKG2D-anti-CS1 solúvel, com o primeiro atacando as células de tumor BCMA(+) MM e o último envolvendo todas células T assassinas naturais (NK) e células NK, para o propósito de promover sua atividade de citotoxicidade contra CS1(+) MM.

Esta modalidade imunológica multifacetada de “todas em um” fornece dois “fármacos vivos” simultaneamente, ou seja, células T de CAR e BsAb, capturando células efetoras imunes inatas e adaptativas direcionadas a diferentes antígenos alvos na mesma população maligna.

Os requerentes descobriram que, em comparação com as células T BCMA CAR ou células T transduzidas por BsAb, as células T BsAb-CAR secretavam mais IFN- e mostraram maior capacidade de desgranulação, enquanto exibiam citotoxicidade potencializada in vitro através do direcionamento de células de tumor MM, incluindo linhagens de células de MM e células de tumor MM primárias.

A expressão ectópica forçada de BCMA e CS1 em células alvo sem expressão endógena desses dois antígenos aumentou a lise das células alvo.

É importante ressaltar que o anti-NKG2D-anti-CS1 BsAb secretado pelas células T BCMA CAR atua de maneira autócrina para desencadear a proliferação de células T BCMA CAR in vitro e a sua proliferação e sobrevivência potencializadas in vivo, respectivamente, por meio da ativação da sinalização de NKG2D.

Esses efeitos multifacetados resultaram em uma forte atividade antitumoral in vivo.

Coletivamente, é fornecida aqui a evidência para a geração de imunoterapia contra o câncer de próxima geração, com a capacidade de combinar a terapia com células T de CAR e terapia de anticorpo biespecífico anti-NKG2D em uma única plataforma para maior duração e eficácia potencializada, bem como a capacidade de capturar atividade tumoral específica de células efetoras citolíticas inatas e adaptativas.

[0236] Cultura de células: As linhagens de células de MM.1S, H929, RPMI-8226 (linhagens de células de mieloma múltiplo humano) e K562 (linhagem de células eritroleucêmicas humanas) foram adquiridas junto à ATCC (Manassas, VA, EUA). Estas células foram cultivadas com meio RPMI 1640 (Sigma, St. Louis, EUA) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) (Invitrogen, CA, EUA) e 1% de Antibiótico-Antimicótico (Invitrogen). A linhagem de células 293T, que foi adquirida junto à ATCC e usada para a produção de lentivírus, foi cultivada em DMEM (Sigma) plus, os mesmos suplementos que em RPMI 1640. Células mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs) de dadores saudáveis e pacientes com MM foram isoladas por centrifugação em gradiente de densidade Ficoll- Paque Plus (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA), seguindo as instruções do fabricante. Células NK CD56+ humanas, Células NKT CD3+CD56+ e células T CD3+γöTCR+ foram isoladas usando kits de isolamento de células humanas NK, NKT e γöT (MACS, Miltenyi Biotech, Auburn, CA, EUA), respectivamente, de acordo com as instruções do fabricante. As amostras primárias de pacientes com MM foram fornecidas pelo Leukemia Tissue Bank Shared Resource do OSU Comprehensive Cancer Center e James Cancer Hospital. Todo o trabalho com seres humanos foi realizado de acordo com um protocolo aprovado pelo The Ohio State University Institutional Review Board (Conselho de Revisão Institucional da Universidade do Estado de Ohio).

[0237] Camundongos: Camundongos NSG de seis a 8 semanas de idade (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) foram adquiridos junto à Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, EUA) e foram usados para todos os estudos in vivo. Todo o trabalho com animais foi realizado de acordo com um protocolo aprovado pelo The Ohio State University Animal Care and Use Committee (Comitê de Tratamento e Uso da Universidade do Estado de Ohio). A progressão da doença de MM foi monitorada de perto e os dados de sobrevivência foram registrados. Os camundongos foram sacrificados após observação de paralisia dos membros posteriores,

letargia e óbvia perda de peso.

[0238] Geração de construtos BCMA-CAR, anti-NKG2D-anti-CS1 BsAb, e BsAb-BCMA CAR- lentiviral Para BCMA CAR, as sequências de domínio de codificação de BCMA para regiões variáveis de cadeias pesadas (VH) e leves (VL) foram derivadas de um hibridoma e recombinadas com o uso de um ligante. O fragmento VH-ligante-VL foi incorporado na estrutura com a porção CD28-CD3zeta. O fragmento nti- BCMA-scFv-CD28-CD3zeta foi subclonado no vetor lentiviral pCDH para criar um construto pCDH-BCMA CAR de segunda geração. Para fazer o construto lentiviral anti-NKG2D-anti-CS1 BsAb, dois fragmentos variáveis de cadeia simples códon otimizados (scFv) de um anticorpo monoclonal anti-CS129 e um anticorpo anti-NKG2D unido por um ligante de proteína não imunogênico derivado de aldose de músculo humano35 foram clonados no vetor lentiviral pCDH. Para BsAb-BCMA CAR “todas em um”, o cassete anti-BCMA-scFv-CD28- -T2A foi incorporado no pCDH anti-CS1-NKG2D BsAb-EF1a-GFP para construir um construto lentiviral pCDH-BCMA CAR-T2A-BsAb-EF1a-GFP completo.

[0239] Produção letiviral e transdução de células T: A transfecção e a infecção lentiviral foram realizadas conforme descrito em um protocolo relatado anteriormente 36,37.

[0240] Geração de células K562 expressando de forma estável os genes CS1 e BCMA: O construto pCDH-CMV-CS1-EF1α-GFP de comprimento total contendo sequências de codificação de CS1 humano foi relatado anteriormente30. Para produzir lentivírus, as células 293T foram co-transfectadas com o plasmídeo pCDH-CS1 ou um plasmídeo de vetor vazio pCDH com os plasmídeos de empacotamento pCMV-VSVG e pCMV- ® 2000 (Invitrogen). Em seguida, os sobrenadantes lentivirais foram colhidos e usados para infectar células K562 com o uso de um protocolo publicado anteriormente 36,38. As células GFP-positivas foram então classificadas com o uso de um classificador de células FACS Aria II (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). BCMA- K562 são células K562 transduzidas com um vetor que transporta o BCMA cDNA de comprimento total. A produção, infecção e classificação de lentivírus foram realizadas com o uso dos métodos descritos acima. As células CS1+BCMA+K562 foram geradas pela transdução de um construto lentiviral pCDH-CMV-BCMA- -GFP para as células CS1- K562 descritas acima. As células duplamente transduzidas foram coradas com um mAb APC-anti-BCMA e, em seguida, classificadas para população de GFP+BCMA+. Antes de serem usadas para experimentos, essas células GFP+BCMA+ duplamente positivas foram passadas várias vezes em cultura para assegurar a perda de células ligadas ao mAb anti- BCMA.

[0241] Análise de Citometria de Fluxo: A detecção da expressão de CAR na superfície celular foi realizada conforme relatado anteriormente 30. Os anticorpos usados neste estudo incluem: FITC e anticorpo policlonal (Fab)2 anti-camundongo de cabra marcado com biotina ou anticorpo policlonal normal de imunoglobulina G (IgG) de cabra (Jackson ImmunoResearch), aloficocianina estreptavidina conjugada a-(APC) (Jackson ImmunoResearch), estreptavidina conjugada a PerCP/Cy5.5 (Biolegend), PE, PerCP/Cy5.5 e BV421 anti-humano CD3 (hCD3, clone UCHT1 e SK7, BD Biosciences), APC e PE anti-hCD56 (clone TULY56 e CMSSB, eBioscience), FITC e PC5.5 anti-TCR pan γ/δ (clone IMMU510, Beckman Coulter, Inc. CA, USA), PC5 anti- Beckman), FITC anti-TCR Vγ9 (clone IMMU 360, Beckman) e Pacific Blue anti-TCR Vδ2 (clone IMMU 389, Beckman), não conjugado e APC-anti hNKG2D (clone 1D11BD Biosciences), PE-Cy7 anti-hCD8 (clone SK1, BD Biosciences), APC-Cy7 anti-hCD4 (clone SK3, BD Biosciences), BV421 anti-humano CD1d (clone CD1d42, BD OptiBuild), V450 anti-hCD11c (clone B-ly6, BD Horizon), APC-H7 anti-hCD19 (clone HIB19, BD Pharmingen), APC-H7 anti-hCD20 (clone 2H7, BD Biosciences), FITC anti-hCD45 (clone J.33, Beckman), biotina e FITC anti-hCD14 (clone

63D3 e M5E2, Biolegend), biotina e PE anti-hCD33 (clone P67.6, Biolegend, e WM53, BD Pharmingen), biotina anti-hCD66b (clone G10F5, Biolegend), não conjugado e PE-anti hCS1 (clone 162, eBioscience), APC- anti hBCMA (clone 19F2, Biolegend), PE-anti Ki67 (clone SolA15, BD Biosciences), PE-hCD69 (clone FN50, BD Biosciences). As células foram lavadas uma vez com PBS contendo 4% de albumina de soro bovino, coradas com anticorpos por 20 minutos à temperatura ambiente e analisadas com um citômetro de fluxo LSRII (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA).

[0242] Immunoblotting: Para detectar a expressão intracelular e a secreção do anticorpo biespecífico, as células T transduzidas por BsAb ou células T BsAb-CAR e sobrenadantes livres de células da cultura dessas células foram coletadas para Immunoblotting com o uso de mAb marcado com 6x-his (clone 4A12E4, Invitrogen). O Immunoblotting foi realizado de acordo com um protocolo padrão de Immunoblotting que os Requerentes anteriormente relataram 30,37. Para a detecção da expressão de CAR, as células T transduzidas por CAR foram lisadas e as proteínas foram extraídas para Immunoblotting camundongo anti-humano (BD Pharmingen), conforme relatado anteriormente 30,37.

[0243] Ensaio de citotoxicidade: as células foram marcadas com 51Cr e co-cultivadas com células T transduzidas em várias razões de efetor:alvo (E:T) no poços de placas de fundo em V de 96 poços a 37 °C por 4 h, seguido pela coleta de sobrenadantes para medir a liberação de 51Cr a partir de células alvo com o uso do contador TopCount (Canberra Packard). Ao estudar a capacidade do BsAb de envolver PBMC, células T CD3+, células T CD8+ NK foram isoladas de leucopacks encomendados junto à American Red Cross. As células T foram iniciadas com DynabeadsTM Human T-Activator CD3/CD28 (4 × 104/µL, Microesferas: T = 1:1) com IL-2 (500 U/mL) e IL-

15 (500 U/mL) por 5-14 dias antes do ensaio de liberação de Cr51 padrão de 4 horas descrito acima. As células NK humanas foram ativadas por IL-2 (500 U/mL) antes do ensaio de citotoxicidade. As células NKT CD3+CD56+ -GalCer (α- Galactosilceramida, KRN7000, Enzo Biochem Inc. NY, EUA. 100ng/mL) com IL-2 (100U/mL) 39 por 7 a 10 dias. Para ativação de células T CD3+ +, HMBPP ((E)-1-hidróxi-2-metil-2-butenil-4-pirofosfato, Sigma. 10nM) com IL-2 (100U/mL) 40,41 foram usadas e cultivadas por 14 dias. O protocolo para isolamento dessas células de leucopacks foi aprovado pelo The Ohio State University Institutional Review Board (Conselho de Revisão Institucional da Universidade do Estado de Ohio).

[0244] ELISA: A presença de IFN-γ humano em sobrenadantes de cultura foi avaliada por ensaio imunoenzimático (ELISA) com o uso de um kit da R&D Systems (Minneapolis, MN, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. Os níveis de IL-2 e TNF- cultura também foram avaliados por kits de ELISA (Thermo Fisher Scientific, MA, EUA). Para essas análises de ELISA, 2,5 × 105 células de uma linhagem de células de mieloma ou células de MM primárias de pacientes foram incubadas com 2,5 × 105 células T projetadas ou de controle em placas de fundo em V de 96 poços por 24 horas. Os dados foram lidos a 450 nm com o uso de um leitor de microplacas Synergy HT (Biotek, Winooski, VT, EUA).

[0245] Tratamento in vivo de camundongos portadores de MM e imageamento de bioluminescência: Células de mieloma MM.1S que expressam um gene de luciferase de pirilampo, MM.1S-GL3, foram descritos anteriormente30. Para construir um modelo de MM ortotópico de xenoenxerto, camundongos NSG (machos) foram injetados com 8 × 106 células de MM.1S-GL3 em 200 µL de solução salina através da veia da cauda i.v. no dia 0. Nos dias 10, 17 e 24, os camundongos foram administrados com (1) controle de veículo (solução salina) ou 10 × 106 células efetoras, incluindo (2) células T transduzidas de vetor vazio, (3) células T transduzidas por BsAb, (4) células T transduzidas por BCMA- CAR, (5) células T transduzidas sequencialmente com BsAb e BCMA- CAR, ou (6) células T transduzidas por BsAb-CAR, por injeção i.v. na veia da cauda, cada um em 200 µL de solução salina. Dez dias, 24 dias, 31 dias após a inoculação com células de MM.1S-GL3, D-luciferina (150 mg/kg de peso corporal; Gold Biotechnology) foi injetada intraperitonealmente em todos os camundongos. O imageamento foi realizado com o uso do In Vivo Imaging System (IVIS) com o software Living Image (PerkinElmer). No dia 80, desafiamos os camundongos sobreviventes com injeção i.v. na veia da cauda de 4 × 106 células de sobrevivência foram coletados e fechados no dia 140. Para investigar o efeito de BsAb, o experimento acima foi repetido na presença de PBMC com depleção de células mieloides humanas. Para este propósito, camundongos NSG foram injetados i.v. com 8 × 106 células de MM.1S- GL3 em 200 mL de solução salina via veia da cauda no dia 0. No dia 10, os camundongos foram administrados com 3 × 106 de várias células T transduzidas seguido por 3 × 106 CD33─CD14─CD66b─ PBMC humana, todas i.v.. No dia 17 e 24, os camundongos receberam 3 × 106 células T manipuladas i.v. geradas a partir do mesmo doador. No dia 10, dia 19, dia 28 e dia 37, os camundongos foram infundidos com D-luciferina e fotografados como descrito acima.

[0246] Imunossinapse detectada por microscopia de imunofluorescência: Principalmente para marcar o anti-NKG2D-anti- CS1 BsAb secretado, o sobrenadante de células T BsAb CAR foi coletado e corado por 6x-His Tag mAb (clone 4E3D10H2/E3, Invitrogen) a uma diluição de 1:500 por 1 hora em incubação a 37 °C e, em seguida, marcado com Alexa Fluor®350 (azul, Thermo Fisher Scientific, MA, EUA). Células de MM.1S foram colhidas e incubadas 45 minutos sob condições de crescimento com Corante Vermelho Profundo CellTrackerTM (20 µM,

Thermo Fisher Scientific). Para ver a sinapse imune, as células T BsAb- CAR (GFP, verde) ou as células T de controle transduzidas com vetor vazio (GFP, verde) foram cocultivadas com células de MM.1S (vermelho) e sobrenadante marcado com His Tag por 1 hora ou 24 horas. O imageamento por fluorescência de células vivas foi observado por Zeiss Microscope Systems (Zeiss Axio Observer Z1, Carl Zeiss Inc., NY, EUA). Para a gravação de vídeo, células T BsAb-CAR (GFP, verde) ou células T transduzidas por vetor vazio (GFP, verde) foram cocultivadas com células de MM.1S (vermelho) por 1 hora, e a microscopia foi usada para observar sinapse durante um período de 2 h.

[0247] Resultados: Geração de células T primárias que expressam CAR específico de BCMA e/ou o anticorpo biespecífico anti-NKG2D-anti-CS1: Os requerentes geraram um construto de BCMA-CAR específico com um esqueleto de vetor lentiviral, que consiste sequencialmente em um peptídeo de sinal (SP), uma região variável de cadeia pesada (VH), um ligante de glicina-serina (GS), uma região variável de cadeia leve (VL ), um requerentes projetaram o construto de anticorpo biespecífico anti- NKG2D-anti-CS1 (referido como “BsAb”) com uma estrutura de vetor lentiviral. Consistia em dois fragmentos variáveis de cadeia simples códon otimizados (scFv) de um anticorpo anti-NKG2D e um anticorpo monoclonal anti-CS1, unidos por um ligante de proteína não imunogênica derivada de aldose de músculo humano. Cada scFv contém uma cadeia pesada (VH) e uma cadeia leve (VL) correspondentes conectadas por um ligante de glicina-serina (GS) (Figura 1B). As mesmas células T do doador isoladas de um doador saudável e ativadas por grânulos de anticorpo anti-CD3/CD28 humano foram transduzidas com o vetor vazio (EV), o construto BsAb, o construto BCMA-CAR ou primeiro transduzido com o construto BsAb seguido sequencialmente por transdução com o construto BCMA-CAR (doravante referido como o construto BsAb-BCMA seq. trans. T). A expressão de BCMA CAR na superfície celular foi demonstrada pela coloração de células T transduzidas com anti-Fab, que detectou a expressão de scFv em mais de 80% das células T enriquecidas em FACS transduzidas com o construto BCMA CAR ou construtos de células T BsAb-BCMA seq. trans., enquanto a expressão permaneceu quase indetectável em células T não modificadas, em células T transduzidas por EV e em células T BsAb (Figura 1C). Para determinar se as células T BsAb e as células T BsAb- BCMA seq. trans. foram transduzidas com sucesso, os sobrenadantes livres de células de uma cultura de 4 dias foram colhidos e os péletes de células de uma cultura de 4 dias foram lisados. Ambos os sobrenadantes e lisados celulares foram então submetidos a Immunoblotting com o uso de um Ab marcado com 6x-his. Os resultados mostraram que as células T BsAb e as células T BsAb-BCMA seq. trans. produziram BsAb celulares e secretados, enquanto os controles de sobrenadantes e lisados de células T não modificados não produziram BsAb (Figura 1D).

[0248] BsAb-BCMA seq. trans. As células T são assassinas mais eficazes de MM do que as células T transduzidas com cada vetor individualmente in vitro: Uma vez que o BsAb continha uma porção do receptor anti- NKG2D e uma porção anti-CS1, os requerentes tentaram acionar a ativação do NKG2D em células imunes citolíticas NKG2D+ e testaram se ele simultaneamente envolve células de MM por meio do antígeno associado a MM, CS1. Os requerentes primeiro avaliaram a expressão de superfície de CS1 e BCMA em três linhagens de células de MM comumente usadas MM.1S, H929, RPMI-8226 e uma linhagem de células eritroleucêmicas humanas, K562, por análise de citometria de fluxo. Os resultados mostraram níveis variados de expressão de BCMA e CS1 nas quatro linhagens de células de MM. A linhagem de células de MM1.S MM tem altos níveis de expressão de BCMA e CS1; a linhagem de células H929 MM tem altos níveis de BCMA e níveis intermediários (int) de expressão de CS1; e a linhagem de células RPMI-8226 MM tem níveis intermediários de expressão de BCMA, enquanto sua expressão CS1 é muito baixa.

Como um controle negativo, a linhagem de células de eritroleucemia K562 não expressou CS1 nem BCMA na superfície celular (Figura 2A). Para determinar se as células T BSAb-BCMA seq. trans. mencionadas acima (com BCMA CAR e anti-NKG2D-anti-CS1 BsAb transduzidos sequencialmente) podem levar a uma lise de células de tumor mais eficiente das linhagens de células de MM, um padrão de ensaio de liberação de Cr51de 4 horas foi realizado, com o uso da linhagem de células de eritroleucemia K562 como controle alvo negativo.

Antes de gerar uma célula T BsAb-CAR manipulada por construto único, os Requerentes compararam a morte de células de tumor MM em cinco grupos de células T: (1) células T não modificadas, (2) células T transduzidas com vetor vazio (EV) (EV T), (3) células T transduzidas com anti-NKG2D-anti-CS1-BsAb (doravante referidas como T BsAb), (4) células T transduzidas por BCMA-CAR (doravante referidas como BCMA- CAR T) e (5) células T anti-NKG2D-anti-CS1 BsAb e células T transduzidas sequencialmente BCMA-CAR (referidas como BSAb-BCMA seq. trans.

T). Para as linhagens de células de MM alvo BCMAAltoCS1Alto MM.1S e BCMAAltoCS1int H929, as células T BSAb-BCMA seq. trans. produziram uma morte significativamente melhor do que as células T BsAb ou células T BCMA-CAR.

Para a linhagem de células de MM alvo BCMAintCS1baixo RPMI-8226, as células T BSAb-BCMA seq. trans. tiveram melhor desempenho do que as células T BsAb, mas não melhor do que as células T BCMA-CAR; É importante ressaltar que o direcionamento de antígeno único ou de combinação não teve atividade contra a linhagem de células alvo eritroleucêmicas de controle negativo K562 (Figura 2B). Importante observar que, as células T BCMA-CAR foram mais eficazes na lise de células alvo de MM quando comparadas aos efeitos das células T BsAb, células T EV e células T não modificadas.

A análise estatística indicou que os efeitos sinérgicos foram observados para os ensaios de citotoxicidade conduzidos com a população de células T BSAb-BCMA seq. trans. de células efetoras quando as linhagens de células alvo de MM expressaram níveis médios a altos de CS1 e BCMA (ou seja, MM1.S e

H929), enquanto este efeito não foi observado quando as células alvo expressaram níveis baixos ou médios dos dois antígenos (ou seja, RPMI- 8226) (Figura 2B).

[0249] Para determinar ainda mais a ativação das células T transduzidas acima após o reconhecimento de células de MM que expressam endogenamente CS1 e BCMA, os Requerentes mediram a secreção de IFN- -2 e TNF- modificadas, células T EV, células T BCMA-CAR, células T BsAb e células T BSAb-BCMA seq. trans.. A secreção de IFN- -BCMA seq. trans. foi significativamente maior do que as células T BsAb ou células T BCMA CAR individualmente quando cocultivadas com linhagens de células BCMAAltoCS1Alto MM.1S ou BCMAAltoCS1int H929 MM. Nas condições de cocultura com as linhagens de células BCMAintCS1baixo RPMI-8226 MM, a secreção de IFN- - BCMA seq. trans. foi significativamente maior do que as células T BsAb, mas não significativamente maior em comparação com as células T BCMA. Na condição de cocultura com as linhagens de células CS1─BCMA─ eritroleucêmicas K562 ou nenhuma célula alvo tumoral, as células T BsAb-BCMA seq. trans. não foram superiores para o direcionamento de antígeno único com células T BsAb ou células T BCMA-CAR (Figura 2C). A produção de IL-2 em células T BsAb, células T BCMA-CAR ou células T BSAb-BCMA seq. trans. foi dramaticamente maior do que as células T não modificadas ou células T EV quando cocultivadas com as linhagens de células de MM.1S, H929 ou RPMI-8226 MM, (Figura 2D). Curiosamente, mesmo em coculturas com a linhagem de células de eritroleucemia de controle negativo K562 ou sem células- alvo, as células T BsAb e as células BsAb-BCMA seq. trans. secretaram um alto nível de IL-2 que foi significativamente maior do que a secreção de IL-2 observada em células T BCMA CAR (Figura 2D), sugerindo que, pelo menos neste caso, o efeito parece resultar da presença do BsAb secretado em si, em vez das células alvo de MM. A secreção de TNF-

consistente com a secreção de IFN- resultados indicaram que, em comparação com células T BsAb ou células T BCMA-CAR, as células T BsAb-BCMA seq. trans. podem reconhecer mais especificamente as células alvo de MM, e se tornar mais ativadas após o reconhecimento dessas células de MM. Além disso, em comparação com outras condições, os Requerentes também notaram que o BsAb segregado de células T de BsAb ou células T BsAb-BCMA seq. trans. pareceram desencadear a ativação das células T independentemente da presença ou ausência de células de MM, como evidenciado por sua produção altamente abundante de IL-2 em comparação com as células T que não expressam a construção de BsAb (Figura 2D). Isto sugeriu que o receptor NKG2D expresso em células T CD8(+) citotóxicas estava sendo ativado pela presença do BsAb secretado.

[0250] Geração de células T BsAb-CAR manipuladas por construtos únicos para direcionar tanto BCMA quanto CS1 em MM: Os requerentes observaram que as células T que coexpressam BCMA-CAR e anti-NKG2D- anti-CS1 BsAb liberadas por dois construtos separados (ou seja, células TBsAb-BCMA seq. trans. ) foram superiores na morte de células de MM em comparação com células T que expressam BCMA-CAR ou BsAb. Um único construto que expressa tanto um BsAb quanto um CAR (referido daqui em diante como BsAb-CAR) seria mais prático na (1) produção da expressão eficaz de ambos os construtos em uma única célula T; (2) redução dos custos de fabricação; e (3) economia de tempo. Os requerentes, portanto, geraram um único construto de BsAb-CAR contendo ambas as partes em uma estrutura de vetor lentiviral conectado por T2A (Figura 3A). Para gerar células T primárias que expressam BsAb- CAR, os Requerentes utilizaram o mesmo método descrito acima e então determinaram se as células T transduzidas por BsAb-CAR foram transduzidas com sucesso. A expressão de superfície do CAR foi confirmada por análise de citometria de fluxo (Figura 21C) A proteína de fusão BsAb foi detectada com sucesso com o uso de um Ab marcado com

6x-his no dia 4 em ambos os lisados celulares e no meio sem soro (Figura 3B). Além disso, para medir dinamicamente a secreção de BsAb, os requerentes semearam novamente as células T BsAb-CAR em meio sem soro no dia 5 e, em seguida, coletaram os sobrenadantes livres de células às 12 h, 24 h, 48 h, 72 h e 96 h. Os resultados mostraram que a secreção de BsAb foi potente, pois a expressão começou antes das 12h e continuou a aumentar de maneira dependente do tempo (Figura 21A-B). Os requerentes, então, demonstraram que as células T BsAb-CAR não fracionadas mostraram morte significativamente superior de linhagens de células MM.1S BCMAAltoCS1Alto MM em comparação com a morte por células T EV e células T não modificadas (Figura 3C). Resultados semelhantes foram obtidos contra as linhagens de células alvo BCMAAltoCS1int H929 e BCMAintCS1baixo RPMI-8226 MM, enquanto não houve morte contra a linhagem de células de eritroleucemia de controle negativo K562 (Figura 21D). Como aproximadamente 80% das células T CD8+ têm expressão de alta densidade de superfície de NKG2D (vs. 30% de células T não fracionadas; Figura 11A), os Requerentes transduziram as células T CD8+ altamente enriquecidas com o construto BsAb-CAR. Talvez previsivelmente, os requerentes descobriram que essas células têm citotoxicidade mais alta do que as células T CD8+ BsAb e células T CD8+ BCMA-CAR, bem como mais de dois controles negativos, células T não modificadas e células T EV, contra a linhagem de células de MM BCMAAltoCS1Alto MM.1S (Figura 3D).

[0251] O BsAb secretado pelas células T de CAR requer que dois antígenos sejam funcionais: CS1 expresso em células de tumor e NKG2D expresso em células imunológicas. Os requerentes primeiro avaliaram as + +T, CD3+CD56+NKT, e CD3-CD56+NK entre PBMC, que representam aproximadamente 50%, 1%, 8% e 15% de PBMC, respectivamente (Figura 11A). Além disso, os Requerentes confirmaram que NKG2D é expresso em aproximadamente 30% das células T, 80% das células T CD8+, 70%

o um subconjunto determinar se as células imunes NKG2D+ acionam o anti-NKG2D-anti- CS1 BsAb, os Requerentes realizaram ensaios de liberação de cromo-51 por 4 horas conforme descrito acima na razão de 10 efetores (células T transduzidas ou não modificadas) para 1 célula alvo (MM.1S), mas adicionaram diferentes quantidades de PBMC humana, ou seja, 1-, 10-, 100- ou 200 vezes das células de tumor. Os requerentes levantaram a hipótese de que se o BsAb secretado pelas células T BsAb e/ou pelas células T BsAb-CAR estivessem recrutando células efetoras citolíticas NKG2D+ não transduzidas para a linhagem de células CS1+ MM alvo, a morte do alvo aumentaria com maior diluição da adição de PBMC não transduzidas. Em apoio à sua hipótese, como PBMC não transduzidas foram aumentadas, apenas as culturas contendo células T transduzidas que secretavam o BsAb (ou seja, células T BsAb e células T BsAb-CAR) mostraram citotoxicidade crescente contra as linhagens de células de MM BCMAaltoCS1alto MM.1S (Figura 3E). Previsivelmente, o efeito foi mais modesto contra as linhagens de células BCMAAltoCS1int H929 com menor expressão de CS1 do que a linhagem de células de MM MM.1S e estava ausente contra a linhagem de células alvo de MM BCMAintCS1baixo RPMI- 8226, Figura 12A, 12B).

[0252] Em seguida, os requerentes enriqueceram cada subconjunto de PBMC, ou seja, células NK, células NKT, células T CD8+, e células T -as com IL-2, CalCer mais IL-2, CD3/CD28 Dynabeads mais IL-2 e HMBPP mais IL-2, respectivamente, e transduziu-se cada um com um dos controles ou vetores experimentais, seguido por ensaio de citotoxicidade de liberação de Cr51 4 horas (Figura 3F, esquerda) ou 16 h (Figura 3F, direita) contra as linhagem de células de MM BCMAAltoCS1Alto MM.1S em uma razão de E:T de 5:1 para cada um. Em quatro ou mais horas de incubação, os resultados mostraram que as células T BsAb CAR têm citotoxicidade significativamente maior do que células idênticas transduzidas com os outros construtos, independentemente do subconjunto de células T ou do método de ativação (Figuras 3F e 14). É importante ressaltar que entre as populações de células T BsAb CAR examinadas, em comparação com as células de controle, as células T CD4+ BsAb CAR ativadas tiveram o menor aumento na atividade citotóxica (Figura 3F, direita e Figura 14), provavelmente devido, pelo menos em parte, à expressão de densidade de superfície relativamente baixa de NKG2D nesta população.

[0253] Para determinar se o BsAb segregado por células T BsAb-CAR pode induzir a formação de sinapses entre as células T BsAb-CAR e as células de MM.1S MM, uma análise de microscopia confocal foi conduzida após uma hora de coincubação. Quando foi observado um controle de cocultura de células T EV e células de MM.1S MM, não foram observadas sinapses (Figura 3G). Em contraste, as sinapses foram observadas durante a cocultura de células T BsAb-CAR e células de MM.1S MM (Figuras 3H).

[0254] Além disso, quando as coculturas de 24 horas de células BsAb CAR-T (verdes) com as células alvo MM.1S MM (vermelhas) foram observadas, os Requerentes notaram que apenas a população de BsAb CAR-T (verde) estava presente (Figura 15A-F); contudo, na co-cultura de células T EV e células alvos de MM.1S MM, tanto as células de MM.1S MM como as células T efetoras EV (verdes) ainda estavam presentes (Figura 15G-M).

[0255] O reconhecimento e a ativação funcionalmente potencializados de células T BsAb-CAR são dependentes de CS1 e BCMA: Para provar que o efeito citotóxico intensificado de células T BsAb-CAR dependia do direcionamento de antígenos tumorais, os Requerentes exploraram a seguir se a superexpressão forçada de CS1 e BCMA na linhagem de células K562 resistente a células T BsAb-CAR A poderia diminuir seu limiar de lise contra essa população efetora. Para este propósito, os Requerentes transduziram sequencialmente as células K562 com lentivírus que codificam CS1 e BCMA humanos (ou vetor vazio PCDH como controle) para gerar a linhagem de células K562 que expressa ectopicamente CS1 e BCMA (Figura 16). Depois de confirmar o sucesso da geração da linhagem de células alvo (Figura 4A), os Requerentes realizaram cs ensaios de liberação de Cr51 e os resultados indicaram que a superexpressão de CS1 e BCMA na linhagem de células de eritroleucemia K562 resultou em um aumento significativo na atividade citotóxica das células T BsAb-CAR contra esta linhagem de células K562 em comparação com a citotoxicidade com o uso das células T EV ( Figura 4B, linhas roxas). Em seguida, os requerentes realizaram ensaios de ELISA, que mostraram um aumento da secreção de IFN-γ e IL-2 em coculturas de células T BsAb-CAR e células K562-CS1-BCMA, em comparação com coculturas de células T EV com células K562-CS1- BCMA (Figura 4C, 4D). No entanto, não houve diferença na citotoxicidade, produção de IFN-γ e IL-2 entre as células T BsAb-CAR e células T EV quando foram incubadas com K562-PCDH (Figura 4B-D). Coletivamente, esses dados sugeriram que o aumento do reconhecimento, morte e secreção de citocinas de células alvo por células T BsAb-CAR ocorreram de uma maneira dependente de CS1 e BCMA.

[0256] O anti-NKG2D-anti-CS1 BsAb secretado potencializa a proliferação de células T de CAR in vitro e tanto a sobrevivência quanto a proliferação in vivo através da sinalização de NKG2D: Em alguns pacientes, as células T de CAR não sobrevivem por muito tempo, devido à capacidade limitada de expansão e sobrevivência, e isso pode limitar a eficácia dessas células

42. Inesperadamente, os Requerentes descobriram que o meio de cultura de células T transduzidas por BsAb e células T BsAb-CAR era mais acidótico em comparação com outras condições sem BsAb em pontos de tempo semelhantes, sugerindo uma taxa mais elevada de metabolismo celular (Figura 5A, parte superior). Esta observação é consistente com os dados descritos acima de que essas células transduzidas com BsAb podem secretar mais citocinas, mesmo sem células alvo ou com células alvo BCMA─CS1─ (Figura 2D). Os requerentes especularam que a expressão e a secreção do BsAb podem induzir a proliferação, sobrevivência e/ou ativação de células T. A enumeração de células confirmou que, em comparação com outras condições de cultura, aquelas contendo células T transduzidas com o construto BsAb ou BsAb-CAR de fato continham uma quantidade significativamente maior de células (Figura 5A, gráfico de barras), que resultou da proliferação de células T como documentado pelo rastreador de células violeta e mostrado como diluição V450 exibida em histogramas no painel inferior (Figura 5A, histograma).

[0257] Para confirmar estes resultados inesperados, os Requerentes adicionaram os sobrenadantes de culturas de células T BsAb-CAR mostradas na Figura 5A a condições de cultura de células que estavam sem BsAb, isto é, células T BCMA CAR, células T EV e células T não modificadas. De fato, a adição de sobrenadantes de culturas de células T BsAb-CAR resultou em um grau significativamente maior de metabolismo celular após 5 dias de incubação, conforme evidenciado pela cor amarela do meio como ocorre na renovação celular, em comparação com culturas de células T BCMA CAR, células T EV e células T não modificadas que não foram suplementadas com sobrenadantes do meio de células T BsAb-CAR (não mostrado). A enumeração de células confirmou que, em comparação com outras condições de cultura, aquelas suplementadas com meio de culturas de células T BsAb-CAR de fato continham uma quantidade significativamente maior de células (Figura 5B, parte superior), que resultou da proliferação de células T como documentado pelo rastreador de células violeta e mostrado como diluição V450 exibida em histogramas no painel inferior (Figura 5B, parte inferior). A coloração de Ki67 indicou que, nas culturas contendo células T BsAb ou células T BsAb-CAR, a grande maioria de células NKG2D+ estava proliferando, bem como quase metade de células NKG2D (Figura 5C e Figura 17A), indicando que as células NKG2D+ ativadas por BsAb podem, por sua vez, ativar células NKG2D, embora em menor grau. Além disso, o anticorpo bloqueador de NKG2D mitigou os efeitos proliferativos do BsAb secretado (Figura 5C quadro azul, Figura 17B). Uma análise de immunoblot foi realizada para determinar a fosforilação (p) da proteína AKT, confirmando que o BsAb secretado pode desencadear a proliferação celular de NKG2D+ e ativação sob condições de cultura de células T BsAb e T BsAb-CAR porque essas condições têm um nível mais alto de p-AKT (Figura 5D).

[0258] Os dados apresentados até agora apoiaram a noção de que a ativação das células imunes NKG2D+ pelo BsAb estavam ocorrendo através da via NKG2D. Em seguida, os requerentes perguntaram se a ativação estava ocorrendo via CS1, que é expressa não apenas nas células de MM, mas também nas células NK, NKT, T CD8+ e B ou seus subconjuntos. (Veillette and Guo Crit Rev Oncol Hematol. Outubro de 2013; 88(1):168-77. doi: 10.1016/j.critrevonc.2013.04.003. Epub 2013 Jun 2; Gogishvili et al. Blood. 28 de dezembro de 2017;130(26):2838-

2847. doi: 10.1182/blood-2017-04-778423. Epub 31 de outubro de 2017). Para determinar se o BsAb secretado também estava estimulando as células imunes de NKG2D+ por meio de sua expressão de CS1 e via a sinalização de CS1+, os Requerentes bloquearam em seguida esta via com o uso de um anticorpo de bloqueio anti-CS1. Os requerentes descobriram que o bloqueio de CS1 não afetou o estado de ativação das células imunes (Figura 17C). Além disso, os requerentes realizaram bloqueio duplo de NKG2D e CS1 e os resultados demonstraram que não houve diferença em comparação com o bloqueio único de NKG2D (dados não mostrados). Coletivamente, esses dados sugerem que a ativação de células imunes que secretam BsAb ocorre apenas por meio da via de sinalização de NKG2D.

[0259] Com base nas descobertas acima, os Requerentes previram que em coculturas de células T com a população alvo, células de MM.1S MM, a ativação imune não seria estritamente dependente de NKG2D, nem restrita ao subconjunto de NKG2D+ de células T. Por exemplo, quando as células T BsAb e T BsAb-CAR foram cocultivadas com células de MM MM.1S, ambas as frações de NKG2D+ (vermelho na Figura 5E; 83% a 94%) e NKG2D (verde na Figura 5E; 79% a 87%) de células T CD3+ mostraram extensa proliferação medida pela coloração de Ki67. Da mesma forma, para células T CD3+ que expressam apenas o BCMA CAR (denotado na Figura 5E como Fab+) ambas as frações de NKG2D+ (Vermelho; 90,4%) e NKG2D- (Verde; 85,8%) de células T CD3+ mostraram extensa proliferação, conforme medido pela coloração de Ki67, embora ligeiramente menos do que foi visto com ambas as células T NKG2D+ e NKG2D- BsAb-CAR.

[0260] Para investigar a capacidade das células T transduzidas de sobreviverem in vitro, os requerentes cultivaram várias células T transduzidas na presença ou ausência de IL-2. Sob a condição de IL-2, todas as células apresentaram alta expressão de Ki67 e baixa expressão de Anexina V e/ou Sytox Azul (Figura 6a). Curiosamente, na condição de deficiência de IL-2 (Figura 6b), apenas as células T BsAb e as células T BsAb-CAR (que secretam o BsAb e ativam as células T via NKG2D) mostraram melhor capacidade de proliferação como cerca de 80% da expressão de Ki67, que é consistente com os dados apresentados na Figura 2D, e com a apoptose e morte celular reduzidas, conforme ilustrado pela baixa expressão de Anexina V e/ou coloração com Sytox Azul (Figura 6b). Estes resultados são comparados com os outros três grupos (células T não modificadas, células T EV e células T BCMA-CAR, também na Figura 6C. Portanto, BsAb-CAR T potencializou a proliferação celular e aumentou a sobrevivência celular, muito provavelmente por meio da via de sinalização de NKG2D.

[0261] Para comparar a sobrevivência e proliferação de células T não modificadas, células T EV, células T BCMA CAR e células T BsAb-CAR in vivo, os requerentes injetaram (i.v.) essas células humanas em camundongos NSG imunodeficientes (Figura 7A, superior). A coloração de fundo antes da injeção i.v. das células humanas também foi avaliada no dia -1 (Figura 7A e Figura 18). No dia +1, os camundongos que receberam cada injeção de células T humanas mostraram expressão de CD3 humana igual, e as duas populações de células T de CAR também foram identificadas por sua expressão de F(ab)2. Além disso, o marcador de ativação CD69 foi detectado em 97% de todas as quatro populações de células T isoladas dos camundongos NSG (Figura 7A e Figura 18). Curiosamente, 14 dias após as infusões de células T, apenas o grupo de células T BsAb-CAR reteve sua alta coexpressão de CD3 e CD69, enquanto houve redução substancial da expressão de CD69 nos outros três grupos (Figura 7A e Figura 18). As análises estatísticas indicaram que a porcentagem do dia +14 de células T CD3 e CD3+CD69+ no grupo de células T BsAb-CAR foram significativamente maiores do que os outros 3 grupos (Figura 7B e 7C). Trinta e cinco dias após as várias injeções de células T transduzidas, os histogramas mostraram que apenas os camundongos injetados com células T BsAb-CAR ainda possuíam altas porcentagens de células T hCD3 (Figura 7B). Os dados de proliferação in vivo mostraram que Ki67+CD69+ a porcentagem foi de cerca de 61,1%, o que foi significativamente maior do que os três outros grupos que receberam células T não transduzidas ou transduzidas (painéis roxos da Figura 7a, Figura 7c). Além disso, os requerentes também determinaram a sobrevivência de células T BsAb-CAR in vivo e observaram que a porcentagem de células T BsAb-CAR vivas (Anexo VSytox Azul) foi de aproximadamente 87%, e a porcentagem de células T BsAb-CAR mortas (Anexina V+Sytox Azul+) foi de aproximadamente 5%. As análises estatísticas indicaram que as células T BsAb-CAR possuíam uma fração maior de células vivas e uma fração menor de células mortas em comparação com os outros três grupos (Figura 7D). Em conjunto, as células T BsAb-CAR não mostram apenas o aumento da proliferação celular através da via de sinalização de NKG2D in vitro, mas também demonstram proliferação e sobrevivência potencializadas in vivo, quando comparado aos outros grupos de células injetadas (incluindo células T BCMA CAR).

[0262] Melhor reconhecimento e morte de células de mieloma primárias por células T BsAb-CAR ex vivo: Para avaliar a relevância clínica das células T BsAb-CAR, os Requerentes investigaram se elas poderiam reconhecer e matar de forma eficiente as as células de MM isoladas de pacientes e potencializar a produção ex vivo de IFN-. As células de MM CD138+ primárias obtidas de medula óssea de oito pacientes foram isoladas com o uso de seleção magnética positiva, e citometria de fluxo foi usada para avaliar sua expressão de superfície de BCMA e CS1 (Figura 8A). Com o uso de um ensaio de liberação de Cr51 realizado na ausência de PBMC autólogas, os Requerentes observaram que as células de MM de pacientes eram altamente resistentes à lise mediada por células T transduzidas por EV em todos os oito pacientes. Em comparação com as células T BCMA CAR ou células T BsAb, as células T BsAb-CAR mostraram citotoxicidade significativamente maior em todos os oito pacientes que foram testados, incluindo o paciente 1 cujas células de tumor tinham expressão de densidade superficial muito baixa de CS1. Não há diferença significativa na atividade citolítica entre as células T BsAb-CAR e as células T BsAb- BCMA seq. trans. (Figura 8B). Os candidatos também mediram IFN- após 24 horas em um ensaio de cocultura semelhante; as células T BsAb- CAR também secretaram níveis significativamente mais elevados de IFN- células T BCMA-CAR (Figura 8C). Estas descobertas demonstram que as células T BsAb-CAR possuem excelente capacidade de erradicar as células de MM do paciente ex vivo.

[0263] As células T BsAb-CAR inibem o crescimento tumoral de MM e prolongam a sobrevivência de camundongos portadores de tumor em um modelo de MM de xenoenxerto ortotópico: Para abordar ainda mais a aplicação terapêutica potencial de células T BsAb-CAR, os Requerentes examinaram sua atividade antitumoral em um modelo de camundongo NSG enxertado com MM.1S MM. A injeção intravenosa de células de MM.1S MM tem sido amplamente usada para estabelecer um modelo de xenoenxerto de camundongo com MM, porque isso pode levar ao enxerto da medula óssea, bem como ao estabelecimento consistente de lesões líticas ósseas multifocais, que recapitulam de perto o MM humano 43,44.

Para facilitar o monitoramento do crescimento do tumor, os Requerentes projetaram as células de MM.1S MM para expressar GFP e luciferase de pirilampo por infecção retroviral e usaram injeção i.v. de 8 x 106 dessas células de MM para enxertar camundongos NSG no dia 0, conforme relatado anteriormente 30. Esses camundongos foram então infundidos em três ocasiões (dia 10, dia 17 e dia 24) com solução salina i.v. ou 1 x 107 de células T EV, 1 x 107 de células T BsAb, 1 x 107 de células T BCMA CAR, 1 x 107 de células T BsAb-BCMA seq. trans. ou 1 x 107 de células T BsAb-CAR. Para os camundongos que sobreviveram até o dia 80, os requerentes coletaram linfócitos de sangue periférico e desafiaram novamente os camundongos com 1 x 104 de células de MM.1S MM. O imageamento de bioluminescência foi usado para monitorar o crescimento de MM.1S MM e mostra a progressão da doença no início até o dia 31 em todos os seis grupos de tratamento (Figura 9A). Com o uso de um anticorpo anti-F(ab)2 para identificar as células T BCMA CAR, os requerentes notaram no dia 80 que as porcentagens de células T BsAb- BCMA seq. trans. e células T BsAb-CAR foram significativamente maiores no sangue de camundongos MM.1S MM do que BCMA CAR T (Figura 9B), enquanto a contagem total de linfócitos em cada camundongo foi semelhante (dados não mostrados). O Immunoblotting indicou o soro de camundongos MM.1S MM do dia 80 tratados com células T BsAb-BCMA seq. trans. ou as células T BsAb-CAR ainda continham o BsAb segregado (não mostrado). No dia 80, os camundongos MM.1S MM tratados com as células T BsAb-BCMA seq. trans. ou com as células T BsAb-CAR tiveram uma sobrevivência significativamente prolongada em comparação com camundongos semelhantes tratados com controle de solução salina, células T EV ou células T BsAb. Os camundongos MM.1S MM tratados com células T BCMA CAR tiveram um desempenho ligeiramente pior do que os camundongos MM MM.1S tratados com células T BsAb-BCMA seq. trans. ou com células T BsAb-CAR (Figura 9D). No dia 140 (60 dias após o primeiro novo desafio tumoral), todos os cinco camundongos MM.1S MM tratados com o grupo BsAb-CAR T sobreviveram (Figura 9D). Estes dados de sobrevivência após o novo desafio do tumor provavelmente potencializaram a sobrevivência in vivo e potencializaram a proliferação in vivo das células T BsAb-CAR observadas acima na Figura

7. No geral, esses resultados indicam que as células T BsAb-CAR são superiores às outras populações de células T não transduzidas ou transduzidas em sua capacidade de inibir o crescimento do tumor MM e prolongar a sobrevivência de camundongos com tumor em modelo de xenoenxerto MM ortotópico.

[0264] A fim de determinar a relevância de linfócitos NKG2D+ não transduzidos humanos no modelo de xenoenxerto MM ortotópico (ou seja, a contrapartida in vivo para o experimento in vitro mostrado na Figura 3E), os Requerentes examinaram em seguida a eficácia antitumoral de controle de solução salina, células T EV, células T BCMA CAR ou células T BsAb-CAR em camundongos NSG portadores de MM.1S MM enquanto coinjetam PBMC depletadas com células mieloides isoladas do mesmo dador. A depleção de células mieloides por classificação foi realizada para evitar GVHD (Figuras 10A, 10B). O esquema para injeção de células de MM.1S MM, linfócitos humanos normais e várias células T transduzidas é mostrado na Figura 10A, assim como a imagem que documenta a progressão do MM ao longo do dia 37. As Figuras 10B e 10C ilustram a porcentagem de linfócitos humanos detectados no sangue desses camundongos. Com tempo adicional sob essas condições, os Requerentes encontraram uma diferença dramática entre camundongos tratados com células T BCMA CAR (que não secretam o BsAb; 0% de sobrevivência no dia 100) e camundongos tratados com células T BsAb-CAR (que secretam o BsAb; 100% de sobrevivência no dia 140; Figura 10D). Esses dados sugerem que quanto mais células imunes de NKG2D+ estiverem envolvidas, melhor será a eficácia das células T BsAb-CAR para a erradicação do tumor.

Equivalentes

[0265] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm os mesmos significados como comumente entendidos por alguém versado na técnica à qual esta tecnologia pertence.

[0266] A presente tecnologia descrita ilustrativamente na presente invenção pode ser praticada adequadamente na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações, não especificamente divulgados na presente invenção. Assim, por exemplo, os termos “compreendendo”, “incluindo”, “contendo”, etc. deve ser lido de forma expansiva e sem limitação. Além disso, os termos e expressões empregados na presente invenção foram usados como termos de descrição e não de limitação, e não há intenção no uso de tais termos e expressões de excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou porções dos mesmos, mas é reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do escopo da presente tecnologia reivindicada.

[0267] Assim, deve ser entendido que os materiais, métodos e exemplos fornecidos aqui são representativos dos aspectos preferidos, são exemplificadores e não se destinam a ser limitações do escopo da presente tecnologia.

[0268] A presente tecnologia foi descrita ampla e genericamente na presente invenção. Cada uma das espécies mais restritas e agrupamentos subgenéricos que se enquadram na divulgação genérica também fazem parte da presente tecnologia. Isso inclui a descrição genérica da presente tecnologia com uma condição ou limitação negativa removendo qualquer assunto do gênero, independentemente do material excisado ser ou não especificamente citado na presente invenção.

[0269] Além disso, quando as características ou aspectos da presente tecnologia são descritos em termos de grupos de Markush, aqueles versados na técnica reconhecerão que a presente tecnologia também é descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo de Markush.

[0270] Todas as publicações, Pedidos de Patentes, Patentes e outras referências aqui mencionadas são expressamente incorporados por referência em sua totalidade, na mesma medida como se cada um fosse incorporado por referência individualmente. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo as definições, irá controlar.

[0271] Outros aspectos são apresentados nas Reivindicações a seguir.

Referências

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS PARCIAL

[0272] ScFv BCMA exemplificador:

[0273] Cadeia pesada de scFv de sequência 1 anti-BCMA

ATGGGATGGAGCTCTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACA GGTGTCCACCAGATTCAGCTGGTGCAGAGCGGCCCTGAGCTGAAGAAA CCCGGCGAGACAGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTC CGGCACTACAGCATGAACTGGGTGAAACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTG AAGTGGATGGGCCGGATCAACACCGAGAGCGGCGTGCCCATCTACGCC GACGACTTCAAGGGCAGATTCGCCTTCAGCGTGGAAACCAGCGCCAGC ACCGCCTACCTGGTGATCAACAACCTGAAGGACGAGGATACCGCCAGCT ACTTCTGCAGCAACGACTACCTGTACAGCCTGGACTTCTGGGGCCAGGG CACCGCCCTGACCGTGTCCAGC

[0274] Cadeia leve de scFv de sequência 1 anti-BCMA

GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCCCCAGCCTGGCCATGTCTCT GGGCAAGAGAGCCACCATCAGCTGCCGGGCCAGCGAGAGCGTGACCAT CCTGGGCAGCCACCTGATCTACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCCAGCC CCCCACCCTGCTGATCCAGCTGGCTAGCAATGTGCAGACCGGCGTGCC CGCCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCAGAACCGACTTCACCCTGACCAT CGACCCCGTGGAAGAGGACGACGTGGCCGTGTACTACTGCCTGCAGAG CCGGACCATCCCCCGGACCTTTGGCGGAGGAACAAAGCTGGAAATCAA G

[0275] Cadeia pesada de scFv de sequência 2 anti-BCMA

ATGGGATGGAGCTCTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACA GGTGTCCACCAGATTCAGCTGGTGCAGAGCGGCCCTGAGCTGAAGAAA CCCGGCGAGACAGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTC ACCGACTACAGCATCAACTGGGTGAAAAGAGCCCCTGGCAAGGGCCTG AAGTGGATGGGCTGGATCAACACCGAGACAAGAGAGCCCGCCTACGCC TACGACTTCCGGGGCAGATTCGCCTTCAGCCTGGAAACCAGCGCCAGCA CCGCCTACCTGCAGATCAACAACCTGAAGTACGAGGACACCGCCACCTA CTTTTGCGCCCTGGACTACAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGG CACCAGCGTGACCGTGTCCAGC

[0276] Cadeia leve de scFv de sequência 2 anti-BCMA

GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCCCCAGCCTGGCCATGTCTCT GGGCAAGAGAGCCACCATCAGCTGCCGGGCCAGCGAGAGCGTGACCAT CCTGGGCAGCCACCTGATCCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCC CCCCACCCTGCTGATCCAGCTCGCCAGCAATGTGCAGACCGGCGTGCC CGCCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCAGAACCGACTTCACCCTGACCAT CGACCCCGTGGAAGAGGACGACGTGGCCGTGTACTACTGCCTGCAGAG CCGGACCATCCCCCGGACCTTTGGCGGAGGCACCAAACTGGAAATCAA G

[0277] Sequência de DNA de cadeia pesada de scFv Anti-CS-1

AGCGTTACCG TGAGTACAGG CCAGGGCTGG TATGACATGG CACGTACAGC CATCATGACC TCGCGCGCAT GTTACTACGT CGCGTCAGAT GAATCGACGC CTTCCTCGCT GCAAATGTAT GCAACCTCCA GCAGCAAAGA TGTTACCCTG ACCGCAAAGG ACAAGTTTAA ACAGAATTTG CGTACGGAGA GTGACTCCCC GCACATCATG GGAATCTGGG AGTTGGGTCA GGGGCCTCGT CAGAAGGTAT GGAACATGTG GTATACAACT TTTTCGTACG GCTCAGCAAA ATGCAGCTTG AAAGTGTCGG CAGGTCCGCG CGTGCTGGAG GCCGGTCCGC AGCAGCTGCA AGTCCAGTCT

[0278] Sequência de DNA de cadeia leve de scFv Anti-CS-1

AAACTTGAGT TGAAGACCGG TGCCGGCTTC ACCTTACCGA CCAGTTATCA TCAACAATGC TATTACGTGG CCCTGGACGA AGCACAGGTG AATTCAATTA CGTTTACGTT TGATACCGGC TCTGGCAGCG GTACATTTCG TGATCCCGTG GGCACTTACC GCTATTCGGC GAGTTATATC TTGCTGAAAC CTTCCCAAGG TCCGAAACAG CAGTACTGGG CGGTTGGCAC CATTGTAGAC CAATCAGCCA AATGTACAAT CTCGGTTCGC GATGGTGTCA GTACGTCGAT GTCTAAGCAG TCACAGACAA TGGTTATCGA T

[0279] Sequência de DNA de cadeia pesada Anti-NKG2D

CAAGTGCAGC TGGTTGAATC CGGTGGCGGT CTGGTCAAGC CGGGCGGCTC TTTGCGTCTG AGCTGTGCCG CGTCGGGTTT TACCTTCAGC TCTTATGGTA TGCATTGGGT GCGTCAGGCG CCTGGCAAAG GTCTGGAGTG GGTTGCGTTC ATCCGCTACG ATGGGTCTAA CAAATATTAT GCCGACTCAG TAAAAGGACG CTTCACTATT AGCCGCGACA ATAGCAAAAA TACCCTGTAC CTGCAAATGA ATAGCCTGCG CGCCGAAGAT ACCGCCGTTT ACTATTGCGC TAAAGATCGT GGCCTGGGTG ATGGTACGTA CTTCGATTAC TGGGGTCAGG GCACCACCGT TACCGTTAGT TCA

[0280] Sequência de DNA de cadeia leve Anti-NKG2D

CAGTCAGCGC TTACGCAGCC GGCGTCGGTG TCGGGTTCCC CGGGTCAGTC GATCACGATC AGCTGTAGTG GGAGCAGCTC CAACATCGGT AACAACGCAG TGAACTGGTA TCAGCAACTG CCGGGAAAAG CGCCGAAACT GCTGATTTAC TATGATGATT TGCTGCCAAG TGGAGTTAGT GACCGCTTTT CCGGCAGTAA ATCGGGTACC TCGGCTTTTC TGGCTATTTC GGGTCTCCAG AGCGAGGATG AAGCTGATTA TTATTGCGCC GCATGGGATG ATAGCTTAAA TGGCCCAGTT TTTGGCGGCG GTACTAAACT GACCGTGCTG

[0281] Ligante

GGCGGTGGCGGTTCTGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGTGGCGG TTCT

[0282] Cadeia Pesada Anti-NKG2D

CAAGTGCAGCTGGTTGAATCCGGTGGCGGTCTGGTCAAGCCG GGCGGCTCTTTGCGTCTGAGCTGTGCCGCGTCGGGTTTTACCTTCAGCT CTTATGGTATGCATTGGGTGCGTCAGGCGCCTGGCAAAGGTCTGGAGTG GGTTGCGTTCATCCGCTACGATGGGTCTAACAAATATTATGCCGACTCAG TAAAAGGACGCTTCACTATTAGCCGCGACAATAGCAAAAATACCCTGTAC CTGCAAATGAATAGCCTGCGCGCCGAAGATACCGCCGTTTACTATTGCG CTAAAGATCGTGGCCTGGGTGATGGTACGTACTTCGATTACTGGGGTCA GGGCACCACCGTTACCGTTAGTTCAGGTGGGGGCGGCTCT

[0283] Cadeia leve anti-NKG2D

CAGCGCTTACGCAGCCGGCGTCGGTGTCGGGTTCCCCGGGTC AGTCGATCACGATCAGCTGTAGTGGGAGCAGCTCCAACATCGGTAACAA CGCAGTGAACTGGTATCAGCAACTGCCGGGAAAAGCGCCGAAACTGCT GATTTACTATGATGATTTGCTGCCAAGTGGAGTTAGTGACCGCTTTTCCG GCAGTAAATCGGGTACCTCGGCTTTTCTGGCTATTTCGGGTCTCCAGAG CGAGGATGAAGCTGATTATTATTGCGCCGCATGGGATGATAGCTTAAATG GCCCAGTTTTTGGCGGCGGTACTAAACTGACCGTGCTG

[0284] Sequências de HMA

CCGAGCGGCCAGGCGGGCGCGGCGGCATCGGAGTCCCTGTTT GTGTCAAATCACGCCTAC

[0285] Cadeia Pesada Anti-CS1

CTCCGTGACGGTGTCGACGGGCCAAGGATGGTACGATATGGCA CGGACCGCGATTATGACATCGCGGGCGTGCTATTACGTGGCCAGCGAT GAGTCGACCCCTTCCTCTCTGCAAATGTATGCCACCTCCTCTTCAAAAGA CGTGACTCTGACTGCGAAAGACAAATTTAAACAGAATCTGCGCACCGAAA GCGATAGCCCACATATCATGGGCATCTGGGAACTGGGCCAGGGCCCCC GCCAGAAAGTGTGGAACATGTGGTACACCACCTTCAGCTATGGTTCGGC CAAATGTTCCCTGAAGGTATCAGCCGGCCCGCGCGTTCTTGAGGCGGGT CCGCAGCAGCTGCAGGTACAGAGC

[0286] Cadeia leve anti-CS1

AAACTGGAACTCAAGACGGGTGCGGGATTTACCCTCCCTACGA GCTATCACCAGCAGTGCTATTACGTGGCGCTTGACGAAGCGCAGGTGAA CTCTATTACCTTTACCTTTGATACAGGATCAGGCAGCGGTACGTTCCGTG ATCCGGTAGGTACGTACCGGTATAGTGCAAGCTATATCCTTCTGAAACCT TCTCAGGGTCCGAAACAGCAGTACTGGGCGGTGGGAACGATCGTGGAC CAGTCTGCCAAATGTACAATTTCAGTTCGCGACGGAGTTAGCACCTCCAT GAGCAAGCAGTCCCAAACCATGGTGATTGACTCT

[0287] Sequência 2 de cadeia pesada anti-BCMA

CAGATTCAGCTGGTGCAGAGCGGCCCTGAGCTGAAGAAACCCG GCGAGACAGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGA CTACAGCATCAACTGGGTGAAAAGAGCCCCTGGCAAGGGCCTGAAGTG GATGGGCTGGATCAACACCGAGACAAGAGAGCCCGCCTACGCCTACGA CTTCCGGGGCAGATTCGCCTTCAGCCTGGAAACCAGCGCCAGCACCGC CTACCTGCAGATCAACAACCTGAAGTACGAGGACACCGCCACCTACTTTT GCGCCCTGGACTACAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCA GCGTGACCGTGTCCAGC

[0288] Sequência 2 de cadeia leve anti-BCMA

GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCCCCAGCCTGGCCATGTCTC TGGGCAAGAGAGCCACCATCAGCTGCCGGGCCAGCGAGAGCGTGACCA TCCTGGGCAGCCACCTGATCCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGC CCCCCACCCTGCTGATCCAGCTCGCCAGCAATGTGCAGACCGGCGTGC CCGCCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCAGAACCGACTTCACCCTGACCA TCGACCCCGTGGAAGAGGACGACGTGGCCGTGTACTACTGCCTGCAGA GCCGGACCATCCCCCGGACCTTTGGCGGAGGCACCAAACTGGAAATCA AG

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Vetor, caracterizado por que compreende: um polinucleotídeo que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) que compreende: (a) um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo alvo de câncer ou de tumor; (b) um domínio de dobradiça; (c) um domínio transmembrana; (d) e um domínio intracelular; e um polinucleotídeo que codifica um anticorpo biespecífico que compreende um domínio de ligação ao antígeno que reconhece e se liga a NKG2D.

2. Vetor, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o CAR compreende: (a) um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo alvo de câncer ou de tumor; (b) um domínio de dobradiça CD8 α; (c) um domínio transmembrana CD8 α; (d) uma região de sinalização coestimuladora de CD28 e/ou uma região de sinalização coestimuladora de 4-1BB; e (e) um domínio de sinalização de CD3 zeta.

3. Vetor, de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, caracterizado por que o anticorpo alvo de câncer ou de tumor tem como alvo o antígeno de maturação de células B (BCMA) e/ou SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319) e/ou um equivalente de cada um dos mesmos.

4. Vetor, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 3, caracterizado por que o anticorpo biespecífico compreende um ligante de NKG2D ou um anti-NKG2D scFv e um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo anti-SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319), e/ou um equivalente cada um dos mesmos.

5. Vetor, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 3, caracterizado por que o anticorpo biespecífico compreende regiões de

CDR de um anticorpo para NKG2D e um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo anti-SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319) e/ou um equivalente de cada um dos mesmos.

6. Vetor, de acordo com a Reivindicação 5, caracterizado por que o anticorpo biespecífico compreende a região variável de cadeia pesada e de cadeia leve de um anticorpo para NKG2D e um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo anti-SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319) e/ou um equivalente de cada um dos mesmos.

7. Vetor, de acordo com a Reivindicação 5 ou 6, caracterizado por que o anticorpo biespecífico compreende um fragmento variável de cadeia simples (scFV) derivado de um anticorpo para NKG2D, opcionalmente, um fragmento variável de cadeia simples (scFv) derivado de um anticorpo anti-SALMF7 (também conhecido como CS1 de CD319), e/ou um equivalente de cada um dos mesmos.

8. Vetor, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 7, caracterizado por que o vetor é um plasmídeo e, opcionalmente, um promotor para regular a expressão do polinucleotídeo.

9. Vetor, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 7, caracterizado por que o vetor é um vetor viral selecionado do grupo dentre um vetor retroviral, um vetor lentiviral, um vetor adenoviral e um vetor viral adenoassociado e, opcionalmente, um promotor para regular a expressão do polinucleotídeo.

10. Célula Isolada, caracterizada por que compreende o vetor conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 9.

11. Célula Isolada, de acordo com a Reivindicação 10, caracterizada por que a célula é uma célula procariótica ou uma célula eucariótica.

12. Célula Isolada, de acordo com a Reivindicação 11, caracterizada por que a célula é uma célula eucariótica.

13. Célula Isolada, de acordo com a Reivindicação 12, caracterizada por que a célula eucariótica é selecionada dentre uma célula de animal, uma célula de mamífero, uma célula bovina, uma célula felina, uma célula canina, uma célula de murino, uma célula de equino ou uma célula humana.

14. Célula Isolada, de acordo com a Reivindicação 12 ou 13, caracterizada por que a célula eucariótica é uma célula imune, opcionalmente uma célula T, uma célula B, uma célula NK, uma célula dendrítica, uma célula mieloide, um monócito ou um macrófago.

15. Célula Isolada, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 10 a 14, caracterizada por que a célula isolada expressa o CAR e secreta o anticorpo biespecífico.

16. Composição, caracterizada por que compreende o vetor conforme definido em qualquer uma das Reivindicações 1 a 9 e/ou a célula isolada conforme definida em qualquer uma das Reivindicações 10 a 15 e, opcionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável.

17. Complexo Isolado, compreendendo uma célula isolada, conforme definida em qualquer uma das Reivindicações de 10 a 15, ligada a uma célula que expressa um antígeno de câncer ou de tumor, opcionalmente, caracterizado por que o antígeno de câncer ou de tumor é NKG2D e/ou SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319), e/ou um equivalente de cada um dos mesmos.

18. Complexo Isolado, compreendendo a célula isolada, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 10 a 15, ligada a um antígeno de câncer ou de tumor ou um fragmento do mesmo, opcionalmente, caracterizado por que o antígeno de câncer ou de tumor é BCMA ou SLAMF7 (também conhecido como CS1 ou CD319) e/ou um equivalente de cada um dos mesmos.

19. Método, para produção de célula que expressa CAR, caracterizado por que compreende a transdução de uma célula isolada com vetor, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 9.

20. Método, conforme definido na Reivindicação 18, caracterizado por que as células isoladas são selecionadas a partir de um grupo que consiste em células T, células B, células NK, células dendríticas, células mieloides, monócitos ou macrófagos.

21. Método, para inibição de crescimento de célula de câncer ou de tumor que expressa um antígeno de câncer ou de tumor, caracterizado por que compreende o contato da célula de câncer ou de tumor com a célula isolada, conforme definida em qualquer uma das Reivindicações de 10 a 15.

22. Método, de acordo com a Reivindicação 21, caracterizado por que o contato é in vitro ou in vivo.

23. Método, de acordo com a Reivindicação 22, caracterizado por que o contato é in vivo e as células isoladas são autólogas ou alogênicas para um sujeito em tratamento.

24. Método, de acordo com a Reivindicação 21, caracterizado por que o contato é in vivo e as células isoladas são alogênicas para um sujeito em tratamento.

25. Método, de acordo com a Reivindicação 23 ou 24, caracterizado por que compreende adicionalmente a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de uma terapia citorredutora ou quimioterapia ou terapia que suprarregula a expressão de um antígeno alvo.

26. Método, de acordo com a Reivindicação 25, caracterizado por que a terapia citorredutora compreende quimioterapia, crioterapia, hipertermia, terapia alvo e/ou radioterapia.

27. Método, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 21 a 26, caracterizado por que o sujeito é um mamífero, canino, felino, equino, murino ou paciente humano.

28. Kit, caracterizado por que compreende uma composição conforme aqui divulgada e, opcionalmente, instruções para uso.