BR112020015473A2 - Prevenção de inclusão de éxon 7 e/ou éxon 8 em um mrna de proteína precursora de amiloide (app) - Google Patents

Abstract

a invenção se refere a distúrbios neurodegenerativos e, em particular, a novos oligonucleotídeos para tratar tais condições, por exemplo, doença de alzheimer. a invenção fornece novos oligonucleotídeos antissentido e a composições compreendendo esses oligos e a terapias e métodos para tratar distúrbios neurodegenerativos. a invenção inclui técnicas de edição de genoma para alcançar resultados semelhantes ao uso de novos oligonucleotídeos antissentido.

Description

“PREVENÇÃO DE INCLUSÃO DE ÉXON 7 E/OU ÉXON 8 EM UM MRNA DE PROTEÍNA PRECURSORA DE AMILOIDE (APP)”

[001] A invenção se refere a distúrbios neurodegenerativos e, em particular, a novos oligonucleotídeos para tratar tais condições, por exemplo, doença de Alzheimer. A invenção está particularmente envolvida com novos oligonucleotídeos antissentido e a composições compreendendo esses oligos e a terapias e métodos para tratar distúrbios neurodegenerativos. À invenção se estende ao uso de técnicas de edição de genoma para alcançar resultados semelhantes ao uso de novos oligonucleotídeos antissentido.

[002] O splicing alternativo de MRNAs é um contribuinte principal para a complexidade do cérebro [1]. Muito embora a função e o papel precisos de transcritos de mMRNA spliced alternativamente não sejam totalmente compreendidos, alguns destes mMRNAs alternadamente spliced têm sido ligados à manifestação e/ou progressão de distúrbios cerebrais neurodegenerativos [2]. O distúrbio cerebral neurodegenerativo mais comum é a doença de Alzheimer (AD) e, de acordo com a sociedade de Alzheimer, existem 36 milhões de pessoas com AD em todo o mundo e este número é esperado dobrar a cada 20 anos. Em AD, as propriedades funcionais dos neurônios diminuem progressivamente, com perda significativa de projeções neuronais, conexões e, finalmente, degeneração neuronal. Acredita-se que uma mistura de envelhecimento, genética e fatores ambientais contribua para a manifestação e progressão da doença [3].

[003] Um fenótipo característico de cérebros de AD é a presença de placas amiloides extracelulares compostas pela deposição de peptídeos beta amiloides (AB). Esses peptídeos são gerados como um subproduto do processamento proteolítico da Proteína Precursora de Amiloide (APP) e são considerados ser um contribuinte significativo para a doença [4] APP em humanos é codificada por um gene simples de 18 éxons [3] que está çocaçizadp no cromossomo 21g921.3 [5, 6] e é expresso em muitos tipos de tecido [7]. APP pertence a uma família de proteínas transmembranares de passagem simples tipo | com um grande domínio extracelular e uma pequena cauda citoplasmática [8, 9]. Splicing diferencial de MRNA de APP gera várias variantes de splice com as principais isoformas produzindo proteínas de 695, 751 e 770 aminoácidos. As isoformas APP695 e APP751 são produzidas como resultado de splicing fora de éxons 7 (APP751) ou éxons 7 e 8 (APP695), respectivamente, ao passo que APP770 contém ambos estes éxons [10, 11]. Éxon 7 codifica para um domínio inibidor de protease tipo Kunitz (KPI) e éxon 8 codifica para um domínio que compartilha homologia com o antígeno OX-2 de células linfoides derivadas de timo [10, 11].

[004] Embora APP seja expressa de maneira onipresente, as diferentes variantes de mMRNA são expressas em diferentes quantidades em diferentes tipos de células. As células não neuronais expressam principalmente APP 751 e 770 [12] ao passo que APP695 é encontrada em grande abundância dentro de neurônios [8] No entanto, no cérebro em envelhecimento ou no cérebro de pacientes de AD, bem como em resposta à estimulação do receptor de NMDA (N-metil-D-aspartato), há uma redução de APP695 e um aumento nas isoformas mais longas [13-20]. Suporte adicional à hipótese de que um deslocamento na expressão de isoforma é de significância para a progressão de AD vem de um relatório que mostra que a expressão de um micro RNA (miR-124) regulando a proteína de ligação ao trato de polipirimidina —“PTBP1 (uma ribonucleoproteina nuclear heterogênea responsável pela exclusão de éxons 7 e 8 do mMRNA da APP) é reduzida em pacientes de AD [21].

[005] Muito embora o padrão de splicing da APP pareça mudar em AD, a função precisa das três isoformas diferentes ainda não está clara. No entanto, há evidência ligando um deslocamento nos níveis de expressão das diferentes isoformas em condições patológicas. Por exemplo, a ativação prolongada dos receptores de glutamato de NMDA aumenta os níveis de APP751, mas não APP695, aumentando também os níveis de AB [22]. De modo interessante, foi mostrado ainda que o deslocamento na expressão de

APP695 para a isoforma APP751 precede o aumento dos níveis de AE, sugerindo que o acúmulo de AB se correlaciona com um aumento da isoforma APP751 [13, 23, 24]. Além das evidências vinculando a diminuição na expressão de APP695 à progressão de AD, também foi mostrado que ABR, assim como o domínio intracelular de APP (AICD), dois produtos proteolíticos muito importantes de APP, são produzidos preferencialmente de APP695 [25]. Isso foi surpreendente, uma vez que uma redução de APP695 em pacientes de AD também sugeriria uma diminuição no acúmulo de peptídeos AB. Uma possível explanação de como uma redução em APP695 pode contribuir para a progressão da AD, muito embora a produção de AB aumente, vem de relatórios mostrando que a localização nuclear e a subsequente regulação da expressão de gene do fragmento intracelular de AICD estão ligadas ao processamento de APP695 pela via amiloidogênica [25-28].

[006] Uma vez no núcleo, AICD desloca histona deacetilases em genes alvo, tal como Neprilysin (NEP), uma metaloprotease dependente de Zinco responsável pela degradação de AB [25]. Esses dados sugerem que o fragmento de AICD produzido pelo processamento proteolítico de APP695 regula a expressão de genes que poderiam potencialmente proteger contra os efeitos tóxicos de AB. Nesse caso, níveis aumentados de APP751 em pacientes de AD podem disparar o acúmulo de AB não induzindo o processamento amiloidogênico de APP, mas em vez disso interrompendo a regulação homeostática de níveis de AB, intensificando sua toxicidade, através da regulação da transcrição de gene.

[007] Em vista do acima, há, portanto, uma necessidade de proporcionar terapias melhoradas para o tratamento de distúrbios neurodegenerativos, tal como a doença de Alzheimer.

[008] Como descrito nos Exemplos, os inventores investigaram como oligonucleotídeos antissentido modificados complementares (AONs) podem direcionar o processamento de mMRNA de APP para promover a exclusão de éxons 7 e 8 via exclusão de éxon. Eles projetaram oligômeros de fosfolodiamidato morfolino (PMOs) complementares a vários sítios dentro dos éxons 7 e 8, e também em torno das junções splice dos éxons 7 e 8, e os testaram na linhagem de célula de neuroblastoma humana SH-SY5Y para identificar as melhores sequências candidatas. Notavelmente, os resultados mostraram exclusão completa de ambos os éxons 7 e 8 nos níveis de MRNA após 48 horas e um aumento substancial da isoforma mais curta, APP695, no nível de proteína após 72 horas. Esses resultados mostram a viabilidade do uso de oligonucleotídeos antissentido para alterar o processamento de mMRNA de APP, fornecendo uma abordagem terapêutica alternativa para AD.

[009] Assim, em um primeiro aspecto da invenção, é fornecido um oligonucleotídeo antissentido (AON) capaz de reduzir ou impedir a inclusão do éxon 7 e/ou éxon 8 em um mRNA de proteína precursora de amioide (APP) produzido por splicing a partir de um transcrito de APP.

[0010] Vantajosamente, e de preferência os Exemplos descrevem como o AON de acordo com o primeiro aspecto pode ser usado para promover exclusão de éxon para aumentar a expressão da isoforma de mMRNA de APP695 e reduzir a quantidade das isoformas APP751 e APP770. O objetivo principal era projetar AONs que direcionasse dois éxons spliced alternativamente de APP, isto é, éxons 7 e 8. Os inventores projetaram cinco AONs direcionando éxon 7 e quatro AONs direcionando éxon 8. Dois dos PMOs mais potentes foram selecionados, um para cada éxon (PMO 7.2 e PMO

8.2) e os inventores mostraram que é surpreendentemente possível conseguir 100% de exclusão dos éxons alvo em concentrações de AON relativamente baixas. Mais ainda, os inventores também mostraram que a abundância de APP695 que foi observada no nível de MRNA também era aparente no nível de proteína quando os AONs eram usados em combinação. Os dados demonstram claramente que a restauração dos níveis de APP695 in vitro usando AONs é viável e, assim, pode-se ser otimista da implementação das estratégias descritas aqui como uma abordagem terapêutica para distúrbios neurodegenerativos, tal como Doença de Alzheimer.

[0011] Num segundo aspecto, é fornecido um oligonucleotídeo antissentido (AON) de acordo com o primeiro aspecto, para uso em terapia ou diagnóstico.

[0012] Num terceiro aspecto, é fornecido um oligonucleotídeo antissentido (AON) de acordo com o primeiro aspecto, para uso no tratamento, na prevenção ou na melhoria de um distúrbio neurodegenerativo.

[0013] Em um quarto aspecto, é fornecido um método para tratar, melhorar ou prevenir um distúrbio neurodegenerativo em um sujeito, o método compreendendo administrar a um sujeito em necessidade de tal tratamento uma quantidade terapeuticamente eficaz de um oligonucleotídeo antissentido (AON) de acordo com o primeiro aspecto.

[0014] De preferência, o distúrbio neurodegenerativo é doença de Alzheimer.

[0015] Como aqui descrito, os inventores desenvolveram uma estratégia eficaz que modifica a razão de variantes splice de APP em vez de reduzir a quantidade de expressão global. Como tal, a estratégia é baseada em permitir a expressão de APP e aumentar a concentração relativa da isoforma APP695 (que carece dos éxons 7 e 8), embora diminuindo simultaneamente a quantidade da isoforma APP751 (que carece do éxon 7, mas inclui o éxon 8) e da isoforma APP770 (que inclui ambos os éxons 7 e 8) pulando os éxons 7 e/ou 8 em qualquer isoforma pré-mRNA de APP que se sabe existir. Uma estratégia que é usada para alterar a expressão de gene e a produção de uma proteína específica é o uso dos oligonucleotídeos antissentido modificados (AONs) de acordo com a invenção que ligam uma região alvo, preferencialmente da maneira Watson-Crick padrão, para interferir com transcrição de RNA, splicing de pré-mRNA ou tradução de MRNA. AONs que causam o salto de éxons que abrigam mutações patológicas estão atualmente sendo experimentados para tratar Distrofia Muscular de Duchenne (DMD). Um pré-requisito para essa abordagem é que os éxons flanqueando o(s) éxon(s) a serem pulados estejam no quadro. Em outras palavras, a junção de éxons flanqueadores não deve interromper o quadro de leitura da proteína de comprimento total, para evitar incorporação de códons a jusante codificando para aminoácidos diferentes da proteína tipo selvagem, ou mesmo códons de parada.

[0016] De preferência em uma modalidade, o oligonucleotídeo antissentido (AON) da invenção é capaz de reduzir ou impedir a inclusão do éxon 7 em um mRNA de proteína precursora de amiloide (APP) produzido por splicing de um transcrito de APP. De preferência, portanto, o AON é usado para pular o éxon 7 para tratar, melhorar ou prevenir o distúrbio neurodegenerativo. A sequência nucleotídica de uma modalidade de éxon 7 do gene da proteína precursora de amiloide humana (APP) (RefSegq: NM 000484.3) é de 168 nucleotídeos de comprimento e é fornecida aqui como SEQ ID No: 1, como a seguir:

AGGTGTGCTCTGAACAAGCCGAGACGGGGCCGTGCCGAGCAA TGATCTCCCGCTGGTACTTTGATGTGACTGAAGGGAAGTGTGCCCCATTCT TTTACGGCGGATGTGGCGGCAACCGGAACAACTTTGACACAGAAGAGTAC

TGCATGGCCGTGTGTGGCAGCGCCA [SEQ ID No: 1]

[0017] A sequência peptídica codificada por uma modalidade do éxon 7 da proteína APP é de 57 aminoácidos de comprimento e é aqui fornecida como SEQ ID No: 2, como a seguir:

EVCSEQAETGPCRAMISRWYFDVTEGKCAPFFYGGCGGNRNNFD

TEEYCMAVCGSAM [SEQ ID No:2]

[0018] De preferência, em outra modalidade, o oligonucleotídeo antissentido (AON) é capaz de reduzir ou impedir a inclusão do éxon 8 em um mMRNA de proteína precursora de amiloide (APP) produzido por splicing de um transcrito de APP. De preferência, portanto, o AON é usado para pular o éxon 8 para tratar, melhorar ou prevenir o distúrbio neurodegenerativo. A sequência nucleotídica de uma modalidade do éxon 8 do gene APP humano é de 57

7I64 nucleotídeos de comprimento e é aqui fornecida como SEQ ID No: 3, como a seguir:

TGTCCCAAAGTTTACTCAAGACTACCCAGGAACCTCTTGCCCGA

GATCCTGTTAAAC [SEQ ID No: 3]

[0019] A sequência peptídica codificada por uma modalidade do éxon 8 da proteína APP é de 20 aminoácidos de comprimento e é aqui fornecida como SEQ ID No: 4, como a seguir:

MSQSLLKTTQEPLARDPVKL [SEQ |D No: 4]

[0020] Os inventores da presente invenção procuraram explorar o potencial de AONs pulando éxon como uma estratégia elegante para tratar de distúrbios neurodegenerativos, tal como a doença de Alzheimer. A abordagem explora pular o éxon 7 e/ou 8 da APP (numerado de acordo com a nomenclatura canônica de APP). Em uma modalidade mais preferida, pelo menos dois AONs são utilizados, um primeiro AON que reduz ou impede a inclusão do éxon 7 em um mRNA de APP produzido por splicing de um transcrito de APP e um segundo AON que reduz ou impede a inclusão do éxon 8 em um mRNA de APP. Nesse cenário, uma proteína feita pulando os éxons 7 e 8 compreende, de preferência, as seguintes características: 1) éxon 6 é unido ao éxon 9 mantendo o quadro de leitura e resultando em uma proteína com 695 aminoácidos que é denominada “APP695” neste documento; 2) o domínio inibidor da protease tipo Kunitz (KPI), que está dentro do éxon 7, é removido; e/ou 3) um domínio compartilhando homologia com o antígeno OX-2 de células linfoides derivadas de timo que está dentro do éxon 8 é removido.

[0021] O processo aqui utilizado é sabido ocorrer na natureza em numerosos genes supreendentes, sob a influência de fatores associados ao estado de diferenciação de uma célula, da idade, do estado nutricional e de outros fatores químicos ou biológicos. Splicing pré-mRNA também pode ser manipulado à vontade, por exemplo, modulando a seleção do sítio de splicing pela maquinaria de splicing endógena. A seleção do sítio de splicing pode, por exemplo, ser modulada usando AONs que interferem na ligação de componentes da maquinaria de splicing a um sítio de splicing, um chamado ponto de ramificação, um trato de polipirimidina e/ou regiões afetando a seleção do sítio de splice. Tais regiões são conhecidas como intensificadores de splicing e silenciadores de splicing que podem estar localizados em éxons ou íntrons. Daí, existem intensificadores de sítio de splice intrônicos e exônicos (ISEs e ESEs) e silenciadores de sítios de splice intrônicos ou exônicos (ISSs e ESSs) Também é possível modular spliing de uma maneira (semi)quantitativa.

[0022] Os inventores testaram inúmeros AONs ligando a regiões alvo localizadas dentro dos éxons 7 e 8, bem como a sequências de ponte do íntron 6-7 e éxon 7, sequências de ponte do éxon 7 e do íntron 7-8, sequências de ponte do íntron 7-8 e éxon 8 e sequências de ponte do éxon 8 e do íntron 8-

9. Deve ser apreciado que os íntrons são nomeados de acordo com os éxons que eles separam, isto é, íntron 6-7 é o íntron entre o éxon 6 e o éxon 7, o íntron 7-8 é o íntron entre o éxon 7 e o éxon 8 e o íntron 8-9 é o íntron entre o éxon 8 e o éxon 9.

[0023] De preferência, portanto, o AON do primeiro aspecto é capaz de ligar e/ou é complementar a uma região alvo dentro de:- (i) a parte 3 'do íntron 6-7 e/ou a parte 5' do éxon 7 do gene de APP; (ii) éxon 7 do gene de APP; (iii) a parte 3' do éxon 7 e/ou a parte 5' do íntron 7-8 do gene de APP; (i) gene de APP; (ii) a parte 3' do íntron 7-8 e/ou a parte 5' do éxon 8 do gene de APP; (iii) éxon 8 do gene de APP; e/ou (iv) a parte 3' do éxon 8 e/ou a parte 5' do íntron 8-9 do gene de APP.

[0024] “Numa modalidade preferida, o AON tem no máximo 4 ou menos — incompatibilidades com sua região alvo complementar, preferencialmente 3 ou menos, mais preferencialmente 2 ou menos, ainda mais preferencialmente 1 ou nenhuma incompatibilidade.

[0025] Numa modalidade preferida adicional o AON é complementar a pelo menos 8 nucleotídeos na região alvo, preferencialmente de 8 a 50 nucleotídeos, mais preferencialmente de 12 a 50 nucleotídeos, na região alvo.

[0026] “Numa modalidade, o AON tem um comprimento de 18 a 42 nucleotídeos, preferencialmente de 22 a 42, mais preferencialmente de 27 a 39 nucleotídeos de comprimento.

[0027] Em uma modalidade na qual o oligonucleotídeo antissentido (AON) é capaz de reduzir ou impedir a inclusão do éxon 7 em um MRNA de APP produzido por splicing de um transcrito de APP (isto é, resulta em pular o éxon 7), a região alvo para o AON está entre 150 nucleotídeos a montante da junção do íntron 6/éxon 7 (-150) e 150 nucleotídeos a jusante da junção do éxon 7/íntron 7 (+150). A sequência nucleotídica de uma modalidade da região alvo para o AON é fornecida aqui como SEQ ID No: 27, como a seguir (na qual as bases em letras maiúsculas denotam éxon 7 e as bases em letras minúsculas denotam os íntrons de cada lado): taaattcctcagtaaatgtttagtagatgctacctaataaaccagtecaggttaccactaggaga attaaaagaagtaaacgtgatatacatgaacagagagacagtgcctttteatgctaaatgtagttecccacatete ctetgattagAGGTGTGCTCTGAACAAGCCGAGACGGGGCCGTGCCGAGCAAT

GATCTCCCGCTGGTACTTTGATGTGACTGAAGGGAAGTGTGCCCCATTCTT

TTACGGCGGATGTGGCGGCAACCGGAACAACTTTGACACAGAAGAGTACT GCATGGCCGTGTGTGGCAGCGCCAgtaagtggacccttcttegagectagecacctttegtete tctegecactgactctactttttataacagattgattttectagttcttaggaaatgggcctattgctaccactaaccac atttctgtecacttetetaatigcteagagt [SEQ |D No: 27]

[0028] Daí, de preferência a sequência nucleotídica da região alvo para o AON compreende substancialmente SEQ ID No: 27, ou um fragmento ou variante da mesma.

[0029] Numa modalidade preferida, a região alvo de AON abrange nucleotídeos a montante e 150 nucleotídeos a jusante do éxon 7 do gene de APP humano (-15 a +50) e é representada como SEQ ID NO: 5 (como representado na Figura 2).

[0030] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeo do AON (chamada “PMO 7.1”) tem 30 nucleotídeos de comprimento e é fornecida aqui como SEQ ID No: 6, como a seguir:

ACGGCCCCGTCTCGGCTTGTTCAGAGCACA [SEQ ID No: 6]

[0031] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeo do AON (chamada “PMO 7.2”) tem 30 nucleotídeos de comprimento e é fornecida aqui como SEQ ID No: 7, como a seguir:

CACACTTCCCTTCAGTCACATCAAAGTACC [SEQ |D No: 7]

[0032] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeo do AON (chamada “PMO 7.3”) tem 30 nucleotídeos de comprimento e é fornecida aqui como SEQ ID No: 8, como a seguir:

TTGTTCCGGTTGCCGCCACATCCGCCGTAA [SEQ ID No: 8]

[0033] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeo do AON (chamada “PMO 7.4") tem 30 nucleotídeos de comprimento e é fornecida aqui como SEQ ID No: 9, como a seguir:

ACGGCCATGCAGTACTCTTCTGTGTCAAAG [SEQ ID No: 9]

[0034] Em uma modalidade, a sequência nucleotídica do AON (chamada "PMO 7.5") tem 30 nucleotídeos de comprimento e é fornecida aqui como SEQ ID No: 10, conforme a seguir (na qual as bases em letras maiúsculas denotam bases de alvo do éxon 7 e as bases em letras minúsculas denotam bases de alvo de íntron): caggctegaagaagggtecacttacTSGCG [SEQ ID No: 10]

[0035] Assim, em uma modalidade particularmente preferida, o AON é complementar a uma região alvo dentro ou adjacente ao éxon 7 e compreende uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9 e 10. Numa modalidade mais preferida, o AON compreende uma sequência nucleotídica selecionada de SEQ ID NO: 6,7,8 e

9. O AON mais eficaz para conferir o pular o éxon 7 foi o PMO 7.2 e, assim, SEQ ID No: 7 é a mais preferida.

[0036] Daí, em ainda outro aspecto da presente invenção, é fornecido um AON capaz de reduzir ou impedir a inclusão do éxon 7 em um MRNA de APP produzido por splicing de um transcrito de APP, em que o AON é capaz de ligar e/ou é complementar a uma região alvo dentro de SEQ ID NO: 5, opcionalmente, em que o AON compreende uma sequência nucleotídica selecionada de SEQ ID NO: 6, 7, 8, 92 0u 10.

[0037] Em outro aspecto preferido, o AON de acordo com a presente invenção compreende uma sequência nucleotídica que é complementar a pelo menos 8 nucleotídeos na sequência de SEQ ID NO: 5 e em que o oligonucleotídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 6,7,8,9 ou 10.

[0038] Em uma modalidade na qual o oligonucleotídeo antissentido (AON) é capaz de reduzir ou impedir a inclusão do éxon 8 em um mMRNA de APP produzido por splicing de um transcrito de APP (isto é, resulta em pular o éxon 8), a região alvo para o AON está entre 150 nucleotídeos a montante da junção do íntron 7/éxon 8 (-150) e 150 nucleotídeos a jusante da junção do éxon 8/íntron 8 (+150). A sequência nucleotídica de uma modalidade da região alvo para o AON é fornecida aqui como SEQ ID No: 28, como a seguir (na qual as bases em letras maiúsculas denotam éxon 8 e as bases em letras minúsculas denotam os íntrons de cada lado): atattcattttagttttatiggagggaccaaacctaagtgagtgattttatttattagattatttttttatea gtggactegtgcatttcagecateatteccatagtttetetttttatttttagttatattctettatittttecataa TSTCCC

AAAGTTTACTCAAGACTACCCAGGAACCTCTTGCCCGAGATCCTGTTAAAC gtacgttgtcattcacctgagggaagggaagaggggaggaggatgactgacttagttcacataactcecageatcea tcaccttetttacatggttttatatitettgaacacctatettagtaaaatatttetteccattaccttacttataa [SEQ ID No: 28]

[0039] Daí, de preferência a sequência nucleotídica da região alvo para o AON compreende substancialmente SEQ ID No: 28, ou um fragmento ou variante da mesma.

[0040] Numa modalidade preferida, a região alvo de AON abrange nucleotídeos 50 nucleotídeos a montante e 50 nucleotídeos a jusante do éxon 8 do gene de APP humano (-50 a +50) e é representada como SEQ ID NO: 11 (como representado na Figura 2).

[0041] Em uma modalidade, a sequência nucleotídica do AON (chamada "PMO 8.1") tem 25 nucleotídeos de comprimento e é fornecida aqui como SEQ ID No: 12, conforme a seguir (na qual as bases em letras maiúsculas denotam bases de alvo do éxon 8 e as bases em letras minúsculas denotam bases de alvo de íntron): AAACTTTGGGACActatggaaaaaa [SEQ ID No: 12]

[0042] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeo do AON (chamada “PMO 8.2”) tem 25 nucleotídeos de comprimento e é fornecida aqui como SEQ ID No: 13, como a seguir:

AAGAGGTTCCTGGGTAGTCTTGAGT [SEQ ID No: 13]

[0043] Em uma modalidade, a sequência nucleotídica do AON (chamada "PMO 8.3") tem 25 nucleotídeos de comprimento e é fornecida aqui como SEQ ID No: 14, conforme a seguir (na qual as bases em letras maiúsculas denotam bases de alvo do éxon 8 e as bases em letras minúsculas denotam bases de alvo de íntron): acgtacGTTTAACAGGATCTCGGGC [SEQ ID No: 14]

[0044] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeo do AON (chamada “PMO 8.4”) tem 25 nucleotídeos de comprimento e é fornecida aqui como SEQ ID No: 15, como a seguir: cttecctteccteaggtgaatgaca [SEQ ID No: 15]

[0045] Assim, em uma modalidade particularmente preferida, o AON é complementar a uma região alvo dentro ou adjacente ao éxon 8 e compreende uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 12, 13, 14 e 15. Numa modalidade mais preferida, o AON compreende uma sequência nucleotídica selecionada de SEQ ID NO: 12 e 13. O AON mais eficaz para conferir o pular o éxon 8 foi o PMO 8.2 e, assim, SEQ ID No: 13 é a mais preferida.

[0046] Daí, em ainda outro aspecto da presente invenção, é fornecido um AON capaz de reduzir ou impedir a inclusão do éxon 8 em um mMRNA de APP produzido por splicing de um transcrito de APP, em que o AON é capaz de ligar e/ou é complementar a uma região alvo dentro de SEQ ID NO: 11, opcionalmente, em que o AON compreende uma sequência nucleotídica selecionada de SEQ ID NO: 12, 13, 14 ou 15.

[0047] Em outro aspecto preferido, o AON de acordo com a presente invenção compreende uma sequência nucleotídica que é complementar a pelo menos 8 nucleotídeos na sequência de SEQ ID NO: 11 e em que o oligonucleotídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 12, 13, 14 ou 15.

[0048] Num quinto aspecto, é fornecido um oligonucleotídeo antissentido (AON) compreendendo uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14 e 15.

[0049] Quando utilizado em terapia para tratar o distúrbio neurodegenerativo, é preferível que um ou mais AON causando salto do éxon 7 sejam utilizados em combinação com um ou mais AON causando salto do éxon

8. Por exemplo, de preferência qualguer um dos AON compreendendo uma sequência nucleotídica selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9 e 10, que demonstrou causar salto do éxon 7, pode ser usado em combinação com qualquer um dos AON compreendendo uma sequência nucleotídica selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 12, 13, 14 ou 15, que demonstrou causar salto do éxon 8. O AON de salto do éxon 7 mais preferido é SEQ ID No: 7 e o AON de salto do éxon 8 mais preferido é SEQ ID No: 13 e, assim, estes são mais preferencialmente utilizados em combinação um com o outro.

[0050] Em um sexto aspecto, a invenção também fornece um método para prevenir ou reduzir inclusão do éxon 7 e/ou éxon 8 em um mRNA de APP humano, quando o referido MRNA é produzido por splicing de um transcrito de RNA, o método compreendendo contatar um ou mais AON de acordo com à invenção com uma célula, um tecido, in vitro ou ex vivo, ou um sujeito humano vivo compreendendo tal célula, sob condições propícias à captação dos um ou mais AON por essa célula, e permitir que o splicing ocorra.

[0051] Em um sétimo aspecto, a invenção também se refere a um método para fazer uma proteína APP humana truncada internamente carecendo da região codificada pelo éxon 7 e/ou éxon 8 em um gene de APP humano, o método compreendendo contatar um ou mais AON de acordo com a invenção com uma célula que expressa o gene de APP humano em condições propícias à captação dos um ou mais AON, permitir que o gene APP seja expresso, pelo que o pré-mRNA de APP é spliced pelo maquinaria de splicing da célula, desse modo produzindo MRNAs, em que o éxon 7 e/ou o éxon 8 não estão incluídos e permitir que o referido MRNA seja traduzido na proteína truncada internamente.

[0052] — Numa modalidade preferida, o método do sétimo aspecto é realizado no cérebro de um sujeito.

[0053] Numa modalidade preferida, a proteina APP humana truncada internamente é APP695 humana.

[0054] A invenção permite projetar um oligonucleotídeo com cinética de ligação de RNA e/ou propriedades termodinâmicas aceitáveis. À cinética de ligação de RNA e/ou as propriedades termodinâmicas são pelo menos em parte determinadas pela temperatura de fusão de um oligonucleotídeo (Tm; calculada com a calculadora de propriedades de oligonucleotídeo (www.unc.edu/-cail/biotool/oligo/index.html) para RNA de fita simples usando os modelos básicos de Tm e de vizinho mais próximo) e/ou a energia livre do complexo de éxon alvo de AON (usando a versão 4.5 de estrutura de RNA). Se uma Tm for alta demais, espera-se que oO oligonucleotídeo seja menos específico. Uma Tm aceitável e a energia livre dependem da sequência do oligonucleotídeo, da química da espinha dorsal (fosfodiéster, fosforotioato, fosforamidato, peptídeo-ácido nucleico, etc.), da natureza da fração de açúcar (ribose, desoxirribose, ribose substituída, ponte intramolecular) e modificação química da nucleobase. Portanto, a faixa de Tm pode variar amplamente.

[0055] De preferência, o AON causa uma taxa de salto de éxon de pelo menos 50%, 60%, 70% ou 80%. Mais preferencialmente, o AON causa uma taxa de salto de éxon de pelo menos 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100%.

[0056] A porcentagem ou eficiência de salto de éxon pode ser calculada determinando a concentração de todas as bandas amplificadas dividida pela concentração da banda amplificada reduzida (livre de éxon 7 e/ou éxon 8), após um dado número de ciclos de PCR vezes 100%, para qualquer conjunto de iniciador dado, desde que o número de ciclos seja tal que a amplificação ainda esteja na fase exponencial. A quantificação pode ser realizada usando o Agilent 2100 Bioanalyzer em combinação com o kit DNA1000, embora o versado na técnica aprecie outros métodos padrão que poderiam ser usados.

[0057] De preferência, um AON de acordo com a invenção, que compreende uma sequência que é complementar a uma região alvo de nucleotídeo, como mostrado em SEQ ID NO: 5 (éxon 7) ou 11 (éxon 8), é tal que a parte complementar é pelo menos cerca de 80%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90%, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 95%, mesmo mais preferencialmente pelo menos cerca de 98% e mais preferencialmente cerca de 100% complementar à sequência alvo. Assim, não é absolutamente necessário que todas as bases na região de complementaridade sejam capazes de emparelhar com bases na cadeia oposta. Por exemplo, ao projetar o oligonucleotídeo, pode-se querer incorporar um resíduo que não emparelha a base com a base na fita complementar. Podem ser permitidas incompatibilidades, até certo ponto, se nas circunstâncias da célula, o trecho de nucleotídeos for suficientemente capaz de hibridizar com a parte complementar. Nesse contexto, “suficientemente” pode significar que os AONs de acordo com a invenção são capazes de induzir salto de éxon do éxon 7 e/ou éxon 8.

[0058] O salto de éxon alvo pode ser convenientemente avaliado por PCR/Bioanalyzer, opcionalmente ddPCR. As regiões complementares são preferencialmente projetadas de modo que, quando combinadas, elas sejam específicas para o éxon no pré-mRNA. Essa especificidade pode ser criada com vários comprimentos de regiões complementares, pois isto depende das sequências reais em outras moléculas de (pré-)MRNA no sistema. O risco de que o oligonucleotídeo também seja capaz de hibridizar com uma ou mais outras moléculas de pré-mRNA diminui com o aumento de tamanho do oligonucleotídeo, embora o comprimento não deva ser longo demais para criar problemas com capacidade de fabricação, purificação e/ou analítica.

[0059] É claro que oligonucleotidecos — compreendendo incompatibilidades na região de complementaridade, mas que retêm a capacidade de hibridizar e/ou ligar à(s) região(ões) alvo no pré-mRNA, podem ser utilizados na presente invenção. No entanto, preferencialmente pelo menos as partes complementares não compreendem essas incompatibilidades, uma vez que estas têm tipicamente uma eficiência mais alta e uma especificidade mais alta do que os oligonucleotídeos tendo essas incompatibilidades em uma ou mais regiões complementares. Pensa-se que intensidades de hibridização mais altas (isto é, aumento do número de interações com a fita oposta) são favoráveis em aumentar a eficiência do processo de interferir com a maquinaria de splicing do sistema. Preferencialmente, a complementaridade é de 90% a 100%. Em geral, isso permite 1 ou 2 incompatibiidades em um oligonucleotídeo de 20 nucleotídeos e 5 ou menos em um AON de 50 nucleotídeos.

[0060] Um AON de acordo com a invenção pode ser mais longo que a região complementar no alvo tendo extremidades de não emparelhamento de base ou extremidades “pendentes”. É preferível que essa “pendência', que pode estar no sítio 5' ou no sítio 3 ou em ambos, seja reduzida até um mínimo, pois bases não complementares nas extremidades do AON podem reduzir a especificidade de ligação e/ou a intensidade de ligação do AON ao alvo.

[0061] De preferência, o comprimento da parte complementar do oligonucleotídeo é o mesmo que o comprimento do oligonucleotídeo, o que significa que não existem extremidades 5' ou 3' do oligo que não formam um par de bases com o NA alvo. Assim, um comprimento preferido para um oligonucleotídeo da invenção é de 50 nucleotídeos ou menos, por exemplo, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 ou 48 nucleotídeos. Foram obtidos resultados particularmente bons com AONs tendo um comprimento de a 35 nucleotídeos, mais particularmente tendo um comprimento de 25 ou 30 nucleotídeos. Um AON de salto de éxon de acordo com a invenção pode conter um ou mais nucleotídeos de DNA (consequentemente, um resíduo “U” de RNA será um resíduo “t” como equivalente de DNA), mas, idealmente, não consiste unicamente em nucleotídeos de DNA (devido a efeitos ruins ou ausentes).

Oligonucleotídeos de RNA (incluindo RNA modificado) são preferidos para fins de saltar éxon.

[0062] O knock down total de RNA de APP nunca foi testado em humanos e pode estar associado a efeitos adversos severos. Portanto, AONs de salto de éxon que não causam knock down de RNA de APP total isolado significativo são fortemente preferidos de acordo com a invenção. siRNAs destinados à destruição, os chamados 'gapmers' invocando quebra mediada pela RNase H ou quaisquer outros AONs causando knock-down total de APP não são preferidos, de acordo com a invenção.

[0063] É preferido que um AON de salto de éxon da invenção compreenda um ou mais nucleotídeos que são modificados para aumentar a resistência à nuclease e/ou aumentar a afinidade do AON para a sequência alvo. Portanto, em uma modalidade preferida, a sequência de AON compreende pelo menos um análogo de nucleotídeo ou equivalente, em que um análogo de nucleotídeo ou equivalente é definido como um resíduo tendo uma base modificada e/ou uma espinha dorsal modificada e/ou uma ligação internucleosídeo não natural ou uma combinação destas modificações.

[0064] — AONs preferidos são oligorribonucleotídeos e, idealmente, estes têm ligações internucleosídicas que são quimicamente modificadas (de preferência com ligações fosforoticato). A modificação do açúcar ribose também é útil, por exemplo, com uma modificação 2'-0-alquil (idealmente 2'-0- metil).

[0065] Numa modalidade preferida, o análogo de nucleotídeo ou equivalente compreende uma espinha dorsal modificada. Exemplos de tais espinhas dorsais são fornecidos por espinhas dorsais de morfolino, espinhas dorsais de carbamato, espinhas dorsais de siloxano, espinhas dorsais de sulfeto, sulfóxido e sulfona, espinhas dorsais de formacetil e tioformacetil, espinhas dorsais de metilenoformacetil, espinhas dorsais de riboacetila, espinhas dorsais contendo alceno, espinhas dorsais de sulfamato, sulfonato e sulfonamida, espinhas dorsais de metilenoimino e smetileno-hidrazino e espinhas dorsais de amida. Oligômeros de fosforodiamidato morfolino são oligonucleotídeos de espinha dorsal modificados que foram previamente investigados como agentes antissentido. Também estão previstas espinhas dorsais conjugadas de DNA triciclo e peptídeo.

[0066] Oligonucleotídeos de morfolino têm uma espinha dorsal não carregada na qual o açúcar desoxirribose de DNA é substituído por um anel de seis membros e a ligação fosfodiéster é substituída por uma ligação fosforodiamidato. Oligonucleotídeos de morfolino são resistentes à degradação enzimática e parecem funcionar como agentes antissentido ao interromper a tradução ou interferir com o splicing de pré-mRNA, em vez de ativar a RNase H. Os oligonucleotídeos de morfolino foram distribuídos com sucesso para células de cultura de tecidos por métodos que perturbam fisicamente a membrana celular e um estudo comparando vários desses métodos descobriu que o carregamento por raspagem era o método de distribuição mais eficiente. No entanto, como a espinha dorsal de morfolino não é carregado, lipídeos catiônicos não são mediadores eficazes de captação de oligonucleotídeo de morfolino em células. De acordo com uma modalidade da invenção, a ligação entre os resíduos em uma espinha dorsal não inclui um átomo de fósforo, tal como uma ligação que é formada por ligações internucleosídicas de alquil ou cicloalquil de cadeia curta, ligações internucleosídicas de alquil ou cicloalquil de heteroátomo misturadas, ou uma ou ligações internucleosídicas heteroatômicas ou heterocíclicas de cadeia curta. De acordo com essa modalidade, um análogo de nucleotídeo preferido ou equivalente compreende um Ácido Nucleico Peptídico (PNA) tendo uma espinha dorsal de poliamida modificada

[29]. Moléculas à base de PNA são verdadeiras imitações de moléculas de DNA em termos de reconhecimento de par de base. A espinha dorsal do PNA é composta por unidades de N-(2-aminoetil)-glicina ligadas por ligações peptídicas, em que as nucleobases são ligadas à espinha dorsal por ligações metileno carbonil. Uma espinha dorsal alternativa compreende um monômero de pirrolidina PNA estendido de um carbono [30]. Como a espinha dorsal de uma molécula de PNA não contém grupos fosfato carregados, híbridos de PNA-NA são geralmente mais estáveis que híbridos de RNA-RNA ou RNA- DNA, respectivamente [31].

[0067] De acordo com outra modalidade da invenção, a espinha dorsal compreende um análogo de nucleotídeo morfolino ou equivalente, no qual o açúcar ribose ou desoxirribose é substituído por um anel morfolino de 6 membros. Um análogo de nucleotídeo ou equivalente mais preferido compreende um oligôêômero de fosforodiamidato morfolino (PMO), no qual o açúcar ribose ou desoxirribose é substituído por um anel morfolino de 6 membros e a ligação fosfodiéster aniônica entre os anéis morfolino adjacentes é substituído por uma ligação fosforodiamidato não iônico.

[0068] Em ainda uma modalidade adicional, um análogo de nucleotídeo ou equivalente da invenção compreende uma substituição de um dos oxigênios não de ponte na ligação fosfodiéster. Essa modificação desestabiliza ligeiramente o emparelhamento de bases, mas adiciona resistência significativa à degradação da nuclease. Um análogo de nucleotídeo preferido ou equivalente compreende fosforoticato, fosforoticato quiral, fosforoditioato, fosfotriéster, aminoalquilfosfotriéster, H-fosfonato, metil e outro alquil fosfonato incluindo 3'-alquileno fosfonato, 5'-alquileno fosfonato e fosfonato quiral, fosfinato, fosforamidato incluindo 3'-amino fosforamidato e aminoalquilfosforamidato, tionofosforamidato, tionoalquilfosfonato, tionoalquilfosfotriéster, selenofosfato ou boranofosfato.

[0069] Um análogo de nucleotídeo preferido ou equivalente da invenção compreende uma ou mais frações de açúcar que são mono ou dissubstituídas na posição 2', 3' e/ou 5', tal como um -OH; -F; (C1-C10) alquil, alquenil, alquinil, alcanil, alil ou aralquil inferior linear ou ramificado substituído ou não substituído, que podem ser interrompidas por um ou mais heteroátomos; 0-, S- ou N-alquil; 0-, S- ou N-alquenil; 0-, S- ou N-alquinil; 0-, S- ou N-alil; O-alquil-O-alquil, -metóxi, -aminopropóxi; metoxietóxi; -dimetilamino- oxietóxi; e -dimetilaminoetoxietóxi. A fração açúcar pode ser uma furanose ou um derivado da mesma, ou uma desoxifuranose ou um derivado da mesma, preferencialmente ribose ou derivado da mesma, ou desoxirribose ou derivado do mesmo. Uma fração de açúcar derivatizada preferida compreende um Ácido Nucleico Bloqueado (LNA), no qual o átomo 2'-carbono está ligado ao átomo de carbono 3' ou 4' do anel de açúcar, desse modo, formando uma fração de açúcar bicíclica. Um LNA preferido compreende ácido nucleico em ponte 2'-0, 4'-C-etileno [32]. Essas substituições tornam o análogo de nucleotídeo ou equivalente resistente a RNase H e nuclease e aumentam a afinidade para o RNA alvo.

[0070] É entendido por um versado na técnica que não é necessário que todas as ligações internucleosídicas em um AON sejam modificadas. Por exemplo, algumas ligações internucleosídicas podem ser não modificadas, ao passo que outras ligações internucleosídicas são modificadas. AONs compreendendo uma espinha dorsal consistindo em uma forma de ligações internucleosídicas (modificadas), múltiplas formas de ligações internucleosídicas — (modificadas), — distribuídas — uniformemente ou não uniformemente ao longo do comprimento do AON são todos abrangidos pela presente invenção. Além disso, qualquer modalidade de modificação de espinha dorsal (uniforme, não uniforme, monoforma ou pluriforme e todas as permutações das mesmas) pode ser combinada com qualquer forma ou de modificações ou análogos de açúcares ou nucleosídeos mencionados abaixo.

[0071] Uma espinha dorsal especialmente preferida para os AONs de acordo com a invenção é uma espinha dorsal uniforme (toda) de fosforotioato (PS). Em outra modalidade, um análogo de nucleotídeo ou equivalente da invenção compreende uma ou mais modificações ou substituições de bases. Bases modificadas compreendem bases sintéticas e naturais, tal como inosina, xantina, hipoxantina e outros derivados -aza, deaza, -hidróxi, -halo, -tio, tiol, -alquil, -alquenil, - alquinil, derivados de tioalquil de bases de pirimidina e purina que são ou serão conhecidos na técnica.

[0072] É entendido pelos versados na técnica que não é necessário que todas as posições em um AON sejam modificadas uniformemente. Além disso, mais de um dos análogos ou equivalentes acima mencionados podem ser incorporados em um único AON ou mesmo em uma única posição dentro de um AON. Em certas modalidades, um AON da invenção tem pelo menos dois tipos diferentes de análogos ou equivalentes.

[0073] De acordo com outra modalidade, AONs de acordo com a invenção compreendem um AON 2'-0 alquil (de preferência inferior) fosforotioato, tal como 2'-O-metil ribose modificada (RNA), 2'-0-metoxietil ribose modificada, 2-0 etil ribose modificada, 2'-0-propil ribose modificada e/ou derivados substituídos destas modificações, tal como derivados halogenados.

[0074] Um formato de AON eficaz e preferido de acordo com a invenção compreende frações 2'-0-metil ribose modificadas com uma espinha dorsal de fosforotioato, preferencialmente em que substancialmente todas as frações ribose são 2'-O-metil e substancialmente todas as ligações internucleosídicas são ligações fosforotioato. Também será entendido por um versado na técnica que diferentes AONs podem ser combinados para saltar eficientemente o éxon 7 e/ou éxon 8 do gene de APP. Uma combinação de dois AONs pode ser usada em um método da invenção, tal como dois AONs, três AONs diferentes, quatro AONs diferentes ou cinco AONs diferentes visando as mesmas ou diferentes regiões de alvo do éxon 7 e éxon 8 (ver Figura 2), desde que pelo menos um AON seja um de acordo com a invenção. Um AON pode ser ligado a uma fração que intensifica a captação do AON em células, preferencialmente células cerebrais.

[0075] Exemplos de tais frações são colesteróis, carboidratos, vitaminas, biotina, lipídeos, fosfolipídeos, peptídeos penetrando em células incluindo, mas não se limitando a, antennapedia, TAT, transportan e aminoácidos carregados positivamente, tal como oligoarginina, poliarginina, oligolisina ou polilisina, antígeno, domínios de ligação de antígeno, tal como fornecidas por um anticorpo, um fragmento Fab de um anticorpo ou um domínio de ligação de antígeno de cadeia simples, tal como um domínio de ligação de antígeno de domínio simples de camelídeo ou um scFv.

[0076] Um AON de salto de éxon de acordo com a invenção pode ser um AON nu (ginótico) ou na forma de um conjugado, uma nanopartícula ou expresso a partir de um vetor (AON vetorizado). O AON de salto de éxon pode ser administrado usando meios adequados conhecidos na técnica. Quando o AON de salto de éxon é um AON vetorizado, ele pode, por exemplo, ser fornecido a um indivíduo ou uma célula, tecido ou órgão do referido indivíduo na forma de um vetor de expressão em que o vetor de expressão codifica um transcrito compreendendo o referido AON. O vetor de expressão é preferencialmente introduzido em uma célula, tecido, órgão ou indivíduo via um veículo de distribuição de gene, tal como um vetor viral. Em uma modalidade preferida, é fornecido um vetor de expressão de base viral compreendendo um cassete de expressão ou um cassete de transcrição que aciona a expressão ou transcrição de um AON de salto de éxon como aqui identificado. Por conseguinte, a presente invenção fornece um vetor viral expressando um AON de salto de éxon de acordo com a invenção quando colocado em condições conducentes à expressão do AON de salto de éxon. Uma célula pode ser fornecida com um AON de salto de éxon capaz de interferir com sequências essenciais para, ou pelo menos conducentes à, inclusão do éxon 7 e/ou éxon 8, de modo que tal interferência impeça, ou pelo menos reduza, a inclusão do éxon 7/8 no mMRNA de APP, por exemplo, por expressão de AON derivada de plasmídeo ou expressão viral fornecida por vetores baseados em vírus de adenovírus ou adeno-associados. A expressão pode ser conduzida por um promotor da polimerase Ill, tal como um promotor de RNA UI, um U6 ou um U7. Um veículo de distribuição preferido é um vetor viral, tal como um vetor de vírus adeno-associado (AAV), ou um vetor retroviral, tal como um vetor de lentivírus e similares. Além disso, plasmídeos, cromossomos artificiais, plasmídeos utilizáveis para recombinação homóloga direcionada e integração no genoma de células de mamíferos (preferenciamente humanos) podem ser adequadamente aplicados para distribuição de um AON como aqui definido.

Preferidos para a presente invenção são aqueles vetores em que a transcrição é conduzida de promotores Pol-lll e/ou em que os transcritos estão na forma de fusões com transcritos Ul ou U7, que produzem bons resultados para distribuir pequenos transcritos. Está dentro da habilidade do artesão projetar transcritos adequados. Preferidas são transcritos conduzidos por Pol-lll. De preferência, na forma de um transcrito de fusão com um transcrito UIl ou U7. Tais fusões podem ser geradas como descrito na técnica [33, 34].

[0077] Um sistema de expressão de AON preferido é um vetor baseado em vírus associado a adenovírus (AAV). Foram desenvolvidos vetores baseados em AAV de cadeia simples e cadeia dupla que podem ser usados para expressão prolongada de sequências de AON para pular com alta eficiência éxon de APP 17. Um vector à base de AAV preferido, por exemplo, compreende um cassete de expressão que é conduzido por um promotor da polimerase Ill (Pol Ill). Um promotor Pol Ill preferido é, por exemplo, um promotor de RNA UI, um U6 ou um U7. A invenção também fornece, portanto, um vetor de base viral, compreendendo um cassete de expressão conduzido por promotor de Pol Ill para expressão de um AON da invenção para induzir salto do éxon 7 e/ou éxon 8 de APP.

[0078] Um vetorde AAV de acordo com a presente invenção é um vetor de AAV recombinante e se refere a um vetor de AAV compreendendo parte de um genoma de AAV compreendendo um AON de salto de éxon codificado de acordo com a invenção encapsidado em uma casca de proteína de proteína de capsídeo derivada de um sorotipo de AAV, como representado em outro lugar aqui. Parte de um genoma de AAV pode conter repetições terminais invertidas (ITR) derivadas de um sorotipo de vírus adeno-associado, tal como AAV1, AAV2, AAV3, AAVA4, AAV5, AAV8, AAVA9 e outros. A casca de proteína compreendida de proteína de capsídeo pode ser derivada de um sorotipo de AAV, tal como AAV1, 2, 3, 4, 5, 8, 9 e outros. Uma casca de proteína também pode ser chamada de uma casca de proteína de capsídeo. O vetor AAV pode ter um ou de preferência todos os genes de AAV do tipo selvagem deletados, mas ainda pode compreender sequências de aminoácidos de ITR funcionais. Sequências de ITR funcionais são necessárias para a replicação, resgate e empacotamento de vírions de AAV. As sequências de ITR podem ser sequências tipo selvagem ou podem ter pelo menos 80%, 85%, 90%, 95 ou 100% de identidade de sequência com sequências tipo selvagem ou podem ser alteradas por, por exemplo, inserção, mutação, deleção ou substituição de nucleotídeos, desde que elas permaneçam funcionais. Nesse contexto, funcionalidade se refere à capacidade de dirigir o empacotamento do genoma para a casca de capsídeo e, em seguida, permitir que a expressão na célula hospedeira seja infectada ou na célula alvo. No contexto da presente invenção, uma casca de proteína de capsídeo pode ser de um sorotipo diferente do ITR de genoma de vetor de AAV. Um vetor de AAV de acordo com a presente invenção pode, assim, ser composto de uma casca de proteína de capsídeo, isto é, o capsídeo icosaédrico, que compreende proteínas de capsídeo (VP1, VP2 e/ou VP3) de um sorotipo de AAV, por exemplo, sorotipo 2 de AAV, ao passo que as sequências de ITRs contidas nesse vetor de AAV5 podem ser qualquer dos sorotipos de AAV descritos acima, incluindo um vetor de AAV2. Um "vetor de AAV2" compreende, assim, uma casca de proteína de capsídeo de sorotipo 2 de AAV, enquanto, por exemplo, um "vetor de AAV5" compreende uma casca de proteína de capsídeo de sorotipo 5 de AAV, pelo que qualquer um pode encapsidar qualquer ITR de genoma de vetor de AAV de acordo com a invenção.

[0079] De preferência, um vetor de AAV recombinante de acordo com a presente invenção compreende uma casca de proteína de capsídeo de sorotipo 2, 5, 8 de AAV ou sorotipo 9 de AAV, em que o genoma de AAV ou ITRs presentes no referido vetor de AAV são derivados do sorotipo 2, 5, 8 de AAV ou sorotipo 9 de AAV; esse vetor de AAV é referido como um vetor AAV2/2, AAV 2/5, AAV2/8, AAV2/9, AAV5/2, AAV5/5, AAV5/8, AAV 5/9, AAV8/2, AAV 8/5, AAV8/8, AAV8/9, AAV9/2, AAV9/5, AAV9/8 ou um AAV9/9, respectivamente.

[0080] Mais preferencialmente, um vetor de AAV recombinante de acordo com a presente invenção tem tropismo para células neuronais e compreende uma casca de proteína de capsídeo do sorotipo de AAV, incluindo sorotipos 1, 2, 5, 7 e 8. O genoma de AAV ou IT s presentes no referido vetor podem ser derivados do mesmo ou de um sorotipo diferente, tal como sorotipo 2 de AAV; esse vetor é referido como, por exemplo, um vetor de AAV 2/8 ou AAV 2/9.

[0081] Mais recentemente, foi relatado que AAV 9 possui excelente tropismo para células neuronais no cérebro de primatas [35]. Daí, a presente invenção fornece vetores de AAV recombinantes para distribuir construtos expressando AON para células neuronais no cérebro de pacientes de AD, compreendendo sorotipos 1, 2, 5,7, 8 e 9, incluindo vetores quiméricos de rAAV com tropismo semelhante.

[0082] A fim de melhorar especificidade e reduzir toxicidade, podem ser selecionados promotores específicos do tipo de célula que favorecem, por exemplo, a expressão neuronal sobre a expressão glial ou de oligodendrócitos.

[0083] Vários métodos de distribuição, incluindo métodos de distribuição intraventricular, intratecal, intraparenquimal, intranasal, assim como sistêmica, incluindo intravenosa, subcutânea são contemplados pela presente invenção. Resultados particularmente bons foram obtidos em estudos clínicos em que pacientes foram dosados com AONs por injeções intratecais. Após injeção intratecal, AONs viajam para o cérebro, onde eles difundem para várias regiões do cérebro, seguidos pela absorção por uma ampla variedade de tipos de células.

[0084] Um método que foi relatado intensificar a expressão neuronal em adultos é o uso de manitol para relaxar a barreira hematoencefálica e permitir entrada de vetor no CNS [36].

[0085] Uma molécula de ácido nucleico codificando um AON de salto de éxon de acordo com a presente invenção representada por uma sequência de ácido nucleico de escolha é preferencialmente inserida entre o genoma de AAV ou sequências de ITR conforme identificado acima, por exemplo, um construto de expressão compreendendo um elemento regulador de expressão operavelmente ligado a uma sequência de codificação e uma sequência de terminação 3'. "Funções auxiliares de AAV" se referem geralmente a funções de AAV correspondentes necessárias para replicação e empacotamento de AAV fornecidas ao vetor de AAV em trans. Funções auxiliares de AAV complementam as funções de AAV que estão ausentes no vetor de AAV, mas elas carecem de ITRs de AAV (que são fornecidas pelo genoma do vetor de AAV). As funções auxiliares de AAV incluem os dois principais ORFs de AAV, nomeadamente a região de codificação rep e a região de codificação cap ou sequências substancialmente idênticas funcionais das mesmas. As regiões Rep e Cap são bem conhecidas na arte [37]. As funções auxiliares de AAV podem ser fornecidas em um construto auxiliar de AAV, que pode ser um plasmídeo. A introdução do construto auxiliar na célula hospedeira pode ocorrer, por exemplo, por transformação, transfecção ou transdução antes ou simultaneamente à introdução do genoma de AAV presente no vetor de AAV, conforme aqui identificado. Os construtos auxiliares de AAV da invenção podem assim ser escolhidos de modo que eles produzam a combinação desejada de sorotipos para a casca de proteína de capsídeo do vetor de AAV, por um lado, e para o genoma de AAV presente na referida replicação e empacotamento do vetor de AAV, por outro lado.

[0086] O “vírus auxiliar de AAV” fornece funções adicionais necessárias para replicação e empacotamento de AAV. Vírus auxiliares de AAV adequados incluem adenovírus, vírus herpes simplex (tal como HSV tipos 1e2) e vírus de vaccinia. As funções adicionais fornecidas pelo vírus auxiliar também podem ser introduzidas na célula hospedeira através de vetores, conforme descrito na US 6.531.456 (incorporada aqui por referência). Preferencialmente, um genoma de AAV como presente em um vetor de AAV recombinante de acordo com a presente invenção não compreende quaisquer sequências de nucleotídeos codificando proteínas virais, tal como genes rep (replicação) ou cap (capsídeo) de AAV. Um genoma de AAV pode ainda compreender um gene marcador ou repórter, tal como um gene codificando, por exemplo, um gene de resistência a antibiótico, uma proteína fluorescente (por exemplo, gfp) ou um gene codificando um produto quimicamente, enzimaticamente ou de outro modo detectável e/ou selecionável (por exemplo, lacZ , aph, etc.) conhecido na arte.

[0087] AONs gimnóticos em solução aquosa são prontamente absorvidos pela maioria das células in vivo e geralmente dissolver os AONs de acordo com a invenção em uma solução isotônica (salina) será suficiente para atingir as células alvo, tal como células neuronais no cérebro humano. Alternativamente, AONs gimnóticos da invenção podem ser formulados utilizando excipientes, aditivos, estabilizadores e similares farmaceuticamente aceitáveis. AONs gimnóticos podem também ser formulados com qualquer dos auxiliares de transfecção mencionados abaixo.

[0088] O salto do éxon 7, mas não do éxon 8, ocorre in vivo. No entanto, se referindo às Figuras 5A e 5B, além disso, um novo produto correspondente a um mRNA de APP incluindo éxon 8, mas não éxon 7, foi surpreendentemente gerado. Esse mRNA não foi descrito anteriormente e provavelmente ele corresponde a uma variante não fisiológica, pois ele não foi encontrado in vivo até hoje.

[0089] A sequência nucleotídica de uma modalidade do novo mMRNA de APP que inclui éxon 8, mas exclui éxon 7, do gene da proteína precursora de amiloide humana (APP) é de 2.145 nucleotídeos de comprimento e é fornecida aqui como SEQ ID No: 21, como a seguir:

ATGCTGCCCGGTTTGGCACTGCTCCTGCTGGCCGCCTGGACGG CTCGGGCGCTGGAGGTACCCACTGATGGTAATGCTGGCCTGCTGGCTGA ACCCCAGATTGCCATGTTCTGTGGCAGACTGAACATGCACATGAATGTCCA GAATGGGAAGTGGGATTCAGATCCATCAGGGACCAAAACCTGCATTGATA CCAAGGAAGGCATCCTGCAGTATTGCCAAGAAGTCTACCCTGAACTGCAG ATCACCAATGTGGTAGAAGCCAACCAACCAGTGACCATCCAGAACTGGTG CAAGCGGGGCCGCAAGCAGTGCAAGACCCATCCCCACTTTGTGATTCCCT ACCGCTGCTTAGTTGGTGAGTTTGTAAGTGATGCCCTTCTCGTTCCTGACA AGTGCAAATTCTTACACCAGGAGAGGATGGATGTTTGCGAAACTCATCTTC ACTGGCACACCGTCGCCAAAGAGACATGCAGTGAGAAGAGTACCAACTTG CATGACTACGGCATGTTGCTGCCCTGCGGAATTGACAAGTTCCGAGGGGT AGAGTTTGTGTGTTGCCCACTGGCTGAAGAAAGTGACAATGTGGATTCTGC TGATGCGGAGGAGGATGACTCGGATGTCTGGTGGGGCGGAGCAGACACA GACTATGCAGATGGGAGTGAAGACAAAGTAGTAGAAGTAGCAGAGGAGGA AGAAGTGGCTGAGGTGGAAGAAGAAGAAGCCGATGATGACGAGGACGAT GAGGATGGTGATGAGGTAGAGGAAGAGGCTGAGGAACCCTACGAAGAAG CCACAGAGAGAACCACCAGCATTGCCACCACCACCACCACCACCACAGAG TCTGTGGAAGAGGTGGTTCGAGTGTCCCAAAGTTTACTCAAGACTACCCA GGAACCTCTTGCCCGAGATCCTGTTAAACTTCCTACAACAGCAGCCAGTAC CCCTGATGCCGTTGACAAGTATCTEGAGACACCTGGGGATGAGAATGAAC ATGCCCATTTCCAGAAAGCCAAAGAGAGGCTTGAGGCCAAGCACCGAGAG AGAATGTCCCAGGTCATGAGAGAATGGGAAGAGGCAGAACGTCAAGCAAA GAACTTGCCTAAAGCTGATAAGAAGGCAGTTATCCAGCATTTCCAGGAGAA AGTGGAATCTTTGGAACAGGAAGCAGCCAACGAGAGACAGCAGCTGGTG GAGACACACATGGCCAGAGTGGAAGCCATGCTCAATGACCGCCGCCGCC TGGCCCTGGAGAACTACATCACCGCTCTGCAGGCTGTTCCTCCTCGGCCT CGTCACGTGTTCAATATGCTAAAGAAGTATGTCCGCGCAGAACAGAAGGA CAGACAGCACACCCTAAAGCATTTCGAGCATGTGCGCATGGTGGATCCCA AGAAAGCCGCTCAGATCCGGTCCCAGGTTATGACACACCTCCGTGTGATT TATGAGCGCATGAATCAGTCTCTCTCCCTGCTCTACAACGTGCCTGCAGTG GCCGAGGAGATTCAGGATGAAGTTGATGAGCTGCTTCAGAAAGAGCAAAA CTATTCAGATGACGTCTTGGCCAACATGATTAGTGAACCAAGGATCAGTTA CGGAAACGATGCTCTCATGCCATCTTTGACCGAAACGAAAACCACCGTGG AGCTCCTTCCCGTGAATGGAGAGTTCAGCCTGGACGATCTCCAGCCGTGG CATTCTTTTGGGGCTGACTCTGTGCCAGCCAACACAGAAAACGAAGTTGA GCCTGTTGATGCCCGCCCTGCTGCCGACCGAGGACTGACCACTCGACCA GGTTCTGGGTTGACAAATATCAAGACGGAGGAGATCTCTGAAGTGAAGAT GGATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTTCATCATCAAAAATT GGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCAATCATTGGACT CATGGTGGGCGGTGTTGTCATAGCGACAGTGATCGTCATCACCTTGGTGA TGCTGAAGAAGAAACAGTACACATCCATTCATCATGGTGTGGTGGAGGTTG ACGCCGCTGTCACCCCAGAGGAGCGCCACCTGTCCAAGATGCAGCAGAA

CGGCTACGAAAATCCAACCTACAAGTTCTTTGAGCAGATGCAGAACTAG [SEQ ID No: 21]

[0090] A sequência peptídica codificada por uma modalidade do novo mMRNA de APP que inclui éxon 8, mas exclui éxon 7, do gene da proteína precursora de amiloide humana (APP) é de 714 aminoácidos de comprimento e é fornecida aqui como SEQ ID No: 22, como a seguir:

MLPGLALLLLAAWTARALEVPTDGNAGLLAEPQIAMFCGRLNMHM NVOQNGKWDSDPSGTKTCIDTKEGILQY CQEVYPELQITNVVEANQPVTIQNW CKRGRKQCKTHPHFVIPYRCLVGEFVSDALLVPDKCKFLHQERMDVCETHLH WHTVAKETCSEKSTNLHDYGMLLPCGIDKFRGVEFVCCPLAEESDNVDSADA EEDDSDVWWGGADTDYADGSEDKVVEVAEEEEVAEVEEEEADDDEDDEDG DEVEEEAEEPYEEATERTTSIATTTTTTTESVEEVVRVSOQOSLLKTTQEPLARDP VKLPTTAASTPDAVDKYLETPGDENEHAHFQKAKERLEAKHRERMSQVMRE WEEAERQAKNLPKADKKAVIQHFQEKVESLEQEAANERQQLVETHMARVEA MLNDRRRLALENYITALQAVPPRPRHVFNMLKKYVRAEQKDRQHTLKHFEHV RMVDPKKAAQIRSQVMTHLRVIYERMNOQSLSLLYNVPAVAEEIQDEVDELLQK EQNYSDDVLANMISEPRISYGNDALMPSLTETKTTVELLPVNGEFSLDDLQPW HSFGADSVPANTENEVEPVDARPAADRGLTTRPGSGLTNIKTEEISEVKMDAE FRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIATVIVITLVMLKKKQY

TSIHHGVVEVDAAVTPEERHLSKMQQNGYENPTYKFFEQMOQN [SEQ |D No: 22]

[0091] Assim, de acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um polipeptídeo de APP humano isolado compreendendo uma sequência de aminoácido substancialmente como estabelecido na SEQ ID No: 22, ou uma variante ou um fragmento da mesma.

[0092] Em um aspecto adicional, é fornecido um polipeptídeo de APP humano isolado compreendendo uma sequência de aminoácido substancialmente como estabelecido na SEQ ID No: 22, ou uma variante ou um fragmento da mesma, para uso em terapia.

[0093] Em ainda outro aspecto, é fornecido um polipeptídeo de APP humano isolado compreendendo uma sequência de aminoácido substancialmente conforme estabelecido na SEQ ID No: 22, ou uma variante ou fragmento da mesma, para uso no tratamento, na prevenção ou na melhoria de distúrbio neurodegenerativo, preferencialmente doença de Alzheimer.

[0094] O polipeptídeo de APP humano isolado é preferivelmente codificado por uma sequência de aminoácido substancialmente como estabelecido na SEQ ID No: 21, ou uma variante ou um fragmento da mesma.

[0095] Será apreciado que o oligonucleotídeo antissentido (AON) de acordo com a invenção pode ser usado em um medicamento que pode ser usado em uma monoterapia (isto é, uso do AON do primeiro aspecto), para tratar, melhorar ou prevenir distúrbios neurodegenerativos, tais como a doença de Alzheimer. Os inventores acreditam que direcionando o éxon 7 para pular pode ser suficiente para pular o 8 também. No entanto, como discutido acima, é preferido que pelo menos um AON para induzir salto do éxon 7 seja usado em combinação com pelo menos um AON para induzir salto do éxon 8. Alternativamente, o AON de acordo com a invenção pode ser usado como adjuvante ou em combinação com terapias conhecidas para tratar, melhorar ou prevenir distúrbios neurodegenerativos (por exemplo, doença de Alzheimer), tal como outros inibidores da acetilcolinesterase.

[0096] Os AONs de acordo com a invenção podem ser combinados em composições com várias formas diferentes dependendo, em particular, da maneira como a composição é usada. Assim, por exemplo, a composição pode estar na forma de um pó, comprimido, cápsula, líquido,

unguento, creme, gel, hidrogel, aerossol, aspersão, solução micelar, emplastro transdérmico, suspensão de lipossomas ou qualquer outra forma adequada que possa ser administrada a uma pessoa ou animal que necessite de tratamento. Será apreciado que o veículo de medicamentos de acordo com a invenção deve ser um que seja bem tolerado pelo sujeito a quem ele é dado e, de preferência, permita a distribuição dos AONs através da barreira hematoencefálica.

[0097] “Medicamentos compreendendo o AON de acordo com a invenção podem ser usados de inúmeras maneiras. Por exemplo, a administração oral pode ser necessária, em cujo caso o AON pode estar contido dentro de uma composição que pode, por exemplo, ser ingerida oralmente na forma de um comprimido, cápsula ou líquido. Uma opção alternativa para administrar o AON seria usar um spray nasal, uma vez que administração por spray nasal atinge o cérebro mais rápido e mais eficientemente do que formas orais ou intravenosas de administração (ver http://memoryzine.com/2010/07/26/nose-sprays-cross-blood-brain-barrier- faster-and-safer/). Assim, composições compreendendo o AON da invenção podem ser administradas por inalação (por exemplo, intranasalmente). As composições também podem ser formuladas para uso tópico. Por exemplo, cremes ou unguentos podem ser aplicados à pele, por exemplo, adjacente ao cérebro.

[0098] O AON de acordo com a invenção também pode ser incorporado dentro de um dispositivo de liberação lenta ou retardada. Tais dispositivos podem, por exemplo, ser inseridos sobre ou sob a pele e o medicamento pode ser liberado durante semanas ou mesmo meses. O dispositivo pode estar localizado pelo menos adjacente ao sítio de tratamento, por exemplo, a cabeça e o cérebro. Tais dispositivos podem ser particularmente vantajosos quando tratamento a longo prazo com o pelo menos um oligonucleotídeo antissentido (AON) de acordo com a invenção é necessário e que normalmente necessitaria de administração frequente (por exemplo, pelo menos injeção diária).

[0099] Em outra modalidade, é preferida a administração intratecal do AON.

[00100] Em uma modalidade preferida, medicamentos de acordo com a invenção podem ser administrados a um sujeito por injeção na corrente sanguínea ou diretamente em um sítio necessitando de tratamento. Por exemplo, o medicamento pode ser injetado pelo menos adjacente ao cérebro. As injeções podem ser intravenosas (bolus ou infusão) ou subcutâneas (bolus ou infusão) ou intradérmicas (bolus ou infusão).

[00101] Será apreciado que a quantidade do AON que é necessária é determinada por sua atividade biológica e biodisponibilidade, o que, por sua vez, depende do modo de administração, das propriedades físico- químicas do AON e se ele está sendo usado como uma monoterapia ou em uma terapia combinada. A frequência de administração será também influenciada pela meia vida do AON dentro do sujeito sendo tratado.

[00102] Como descrito no Exemplo 2, os inventores investigaram as quantidades eficazes dos AONs que podem ser usadas para causar salto de éxon. Como mostrado na Figura 6, os inventores investigaram dosagens eficazes de um dos AONs de salto de éxon 7 (isto é, PMO 7.2) e um dos AONs de salto de éxon 8 (isto é, PMO 8.2).

[00103] Preferencialmente, pelo menos 5OnM, mais preferencialmente pelo menos 100nM, ainda mais preferencialmente pelo menos 150nM e ainda mais preferencialmente pelo menos 200nM e ainda mais preferencialmente pelo menos 250nM do AON causando o salto do éxon 7 são administrados. De preferência, menos de 3.000nM, mais preferencialmente menos de 2.000nM e ainda mais preferencialmente menos de 1.000nM e ainda mais preferencialmente menos de 750nM do AON causando salto do éxon 7 são administrados. De preferência, o AON causando o salto do éxon 7 é SEQ ID No: 7 (PMO 7.2).

[00104] Preferencialmente, pelo menos 100nM, mais preferencialmente pelo menos 200nM, ainda mais preferencialmente pelo menos 300nM e ainda mais preferencialmente pelo menos 400nM e ainda mais preferencialmente pelo menos 500nM do AON causando o salto do éxon 8 são administrados. De preferência, menos de 3.000nM, mais preferencialmente menos de 2.000nM e ainda mais preferencialmente menos de 1.000nM e ainda mais preferencialmente menos de 750nM do AON causando salto do éxon 8 são administrados. De preferência, o AON causando o salto do éxon 8 é SEQ ID No: 13 (PMO 8.2). Preferencialmente, pelo menos 500 nM de cada AON são administrados.

[00105] Dosagens ideais a serem administradas podem ser determinadas pelos versados na técnica e variarão com o AON particular em uso, a intensidade da composição farmacêutica, o modo de administração e o avanço da doença neurodegenerativa. Fatores adicionais, dependendo do sujeito particular sendo tratado, resultarão em uma necessidade de ajustar as dosagens, incluindo idade do sujeito, peso, gênero, dieta e tempo de administração.

[00106] Geralmente, uma dose diária entre 0,001 ug/kg de peso corporal e 10 mg/kg de peso corporal do AON de acordo com a invenção pode ser usada para tratar, melhorar ou prevenir doença neurodegenerativa, dependendo de cujo oligonucleotídeo antissentido (AON) seja usado. Mais preferencialmente, a dose diária está entre 0,01ug/kg de peso corporal e 1 mg/kg de peso corporal e, mais preferencialmente, entre aproximadamente 0,1ug/kg e 10ug/Kkg de peso corporal.

[00107] O AON pode ser administrado antes, durante ou após o início da doença neurodegenerativa. Doses diárias podem ser administradas como uma única administração (por exemplo, uma injeção única diária ou inalação de um spray nasal). —Alternativamente, o AON pode necessitar de administração duas vezes ou mais vezes durante um dia. Como um exemplo, pelo menos um oligonucleotídeo antissentido (AON) pode ser administrado como duas (ou mais dependendo da severidade da doença neurodegenerativa sendo tratada) doses diárias entre 0,07 ug e 700 mg (isto é, assumindo um peso corporal de 70 kg). Um paciente recebendo tratamento pode tomar uma primeira dose ao acordar e, depois, uma segunda dose à noite (se em um regime de duas doses) ou em intervalos de 3 ou 4 horas depois disso. Alternativamente, pode ser usado um dispositivo de liberação lenta para fornecer doses ideais de oiligonucleotídeo antissentido (AON) de acordo com a invenção a um paciente sem a necessidade de administrar doses repetidas.

[00108] Podem ser usados procedimentos conhecidos, tal como aqueles convencionalmente usados pela indústria farmacêutica (por exemplo, experimentação in vivo, experimentos clínicos, etc.) para formar formulações específicas dos um ou mais AON de acordo com a invenção e regimes terapêuticos precisos (tal como doses diárias dos agentes e a frequência de administração). Os inventores acreditam que eles sejam os primeiros a sugerir uma composição de doença antineurodegenerativa, com base no uso dos oligonucleotídeos antissentido (AONs) da invenção.

[00109] Daí, em um oitavo aspecto da invenção, é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do oligonucleotídeo antissentido (AON) de acordo com o primeiro aspecto e, opcionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00110] A composição farmacêutica é, de preferência, uma composição de doença antineurodegenerativa, isto é, uma formulação farmacêutica usada na melhoria terapêutica, na prevenção ou no tratamento de um distúrbio neurodegenerativo em um sujeito, tal como doença de Alzheimer.

[00111] A invenção também fornece em um nono aspecto, um processo para fazer a composição farmacêutica de acordo com o oitavo aspecto, o processo compreendendo combinar uma quantidade terapeuticamente eficaz do oligonucleotídeo antissentido (AON) de acordo com o primeiro aspecto, com um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00112] Numa modalidade particularmente preferida, o AON é complementar a uma região alvo dentro do ou adjacente ao éxon 7 e é selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9 e 10. Em uma modalidade particularmente preferida, o AON é complementar a uma região alvo dentro do ou adjacente ao éxon 8 e é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 12, 13, 14 e 15. De preferência, a composição compreende um ou mais AON para causar o salto do éxon 7 em combinação com um ou mais AON para causar o salto do éxon 8. Por exemplo, de preferência qualquer um dos AON selecionados do grupo consistindo em SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9 e 10, que mostrou causar salto do éxon 7 pode ser usado em combinação com qualquer um dos AON selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO: 12, 13, 14 ou 15, que mostrou causar salto do éxon 8. O AON de salto do éxon 7 mais preferido é SEQ ID No: 7 e o AON de salto do éxon 8 mais preferido é SEQ ID No: 13 e, assim, estes são mais preferencialmente utilizados em combinação um com o outro na composição do oitavo aspecto.

[00113] Um “sujeito” pode ser um vertebrado, mamífero ou animal doméstico. Assim, medicamentos de acordo com a invenção podem ser usados para tratar qualquer mamífero, por exemplo, gado (por exemplo, um cavalo), animais de estimação, ou podem ser usados em outras aplicações veterinárias. Mais preferencialmente, no entanto, o sujeito é um ser humano.

[00114] Uma “quantidade terapeuticamente eficazr do AON é qualquer quantidade que, quando administrada a um sujeito, é a quantidade de agente ativo que é necessária para tratar a condição de distúrbio neurodegenerativo, ou produzir o efeito desejado.

[00115] Por exemplo, a quantidade terapeuticamente eficaz do AON usado pode ser de cerca de 0,001 mg a cerca de 800 mg e, preferencialmente, de cerca de 0,01 mg a cerca de 500 mg. É preferido que a quantidade do oligonucleotídeo antissentido (AON) seja uma quantidade de cerca de 0,1 mg a cerca de 100 mg.

[00116] Um "veículo farmaceuticamente aceitável”, como chamado no presente documento, é qualquer composto conhecido ou combinação de compostos conhecidos que são conhecidos pelos versados na técnica como sendo úteis na formulação de composições farmacêuticas.

[00117] Em uma modalidade, o veículo farmaceuticamente aceitável pode ser um sólido e a composição pode estar na forma de um pó ou comprimido. Um veículo sólido farmaceuticamente aceitável pode incluir uma ou mais substâncias que também podem agir como agentes aromatizantes, lubrificantes, solubilizantes, agentes de suspensão, corantes, enchimentos, deslizantes, auxiliares de compressão, ligantes inertes, edulcorantes, conservantes, revestimentos ou agentes de desintegração de comprimido. O veículo também pode ser um material de encapsulação. Em pós, o veículo é um sólido finamente dividido que está em mistura com os agentes ativos finamente divididos de acordo com a invenção. Em comprimidos, o agente ativo (isto é, pelo menos um oligonucleotídeo antissentido (AON)) pode ser misturado com um veículo tendo as propriedades de compressão necessárias em proporções adequadas e compactado na forma e no tamanho desejados. Os pós e comprimidos contêm, preferencialmente, até 99% dos agentes ativos. Veículos sólidos adequados incluem, por exemplo, fosfato de cálcio, estearato de magnésio, talco, açúcares, lactose, dextrina, amido, gelatina, celulose, polivinilpirrolidina, ceras de baixo ponto de fusão e resinas de troca iônica. Em outra modalidade, o veículo farmacêutico pode ser um gel e a composição pode estar na forma de um creme ou semelhante.

[00118] Contudo, o veículo farmacêutico pode ser um líquido e a composição farmacêutica está na forma de uma solução. Veículos líquidos são usados na preparação de soluções, suspensões, emulsões, xaropes, elixires e composições pressurizadas. O agente ativo de acordo com a invenção (o AON) pode ser dissolvido ou suspenso em um veículo líquido farmaceuticamente aceitável tal como água, um solvente orgânico, uma mistura de ambos ou óleos ou gorduras farmaceuticamente aceitáveis. O veículo líquido pode conter outros aditivos farmacêuticos adequados, tais como solubilizantes, emulsionantes, tampões, conservantes, edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes de suspensão, agentes espessantes, cores, reguladores “de viscosidade, estabilizadores ou reguladores de osmose. Exemplos adequados de veículos líquidos para administração oral e parentérica incluem água (contendo parcialmente aditivos como acima, por exemplo, derivados de celulose, preferencialmente solução de carboximetilcelulose de sódio), álcoois (incluindo álcoois mono-hídricos e álcoois poli-hídricos, por exemplo, glicóis) e seus derivados e óleos (por exemplo, óleo de coco fracionado e óleo de amendoim). Para administração parenteral, o veículo também pode ser um éster oleoso, tal como oleato de etila e miristato de isopropila. Veículos líquidos estéreis são úteis em composições de forma líquida estéreis para administração parenteral. O veículo líquido para composições pressurizadas pode ser um hidrocarboneto halogenado ou outro propelente farmaceuticamente aceitável.

[00119] Composições farmacêuticas líquidas, que são soluções ou suspensões estéreis, podem ser usadas, por exemplo, por injeção intramuscular, intratecal, epidural, intraperitoneal, intravenosa e particularmente subcutânea. Os um ou mais AON podem ser preparados como uma composição sólida estéril que pode ser dissolvida ou suspensa na hora da administração usando água estéril, salina ou outro meio injetável estéril apropriado.

[00120] O pelo menos um oligonucleotídeo antissentido (AON) e as composições da invenção podem ser administrados oralmente sob a forma de uma solução ou suspensão estéril que contém outros solutos ou agentes de suspensão (por exemplo, salina ou glicose suficientes para tornar a solução isotônica), sais biliares, acácia, gelatina, monoleato de sorbitano, polissorbato 80 (ésteres oleato de sorbitol e seus anidridos copolimerizados com óxido de etileno) e semelhantes. O pelo menos um oligonucleotídeo antisense (AON) usado de acordo com a invenção também pode ser administrado oralmente, na forma de composição líquida ou sólida. As composições adequadas para administração oral incluem formas sólidas, tais como pílulas, cápsulas, grânulos, comprimidos e pós, e formas líquidas, tal como soluções, xaropes, elixires e suspensões. Formas úteis para administração parenteral incluem soluções, emulsões e suspensões estéreis.

[00121] Os inventores contempla o uso de ferramentas de edição de genoma, tal como CRISPR, para modificar as sequências alvo descritas neste documento, bem como introduzir inserções/deleções no aceitador de splice e sítios doadores de splice, a fim de imitar os resultados exibidos usando os AONs aqui descritos.

[00122] Em outro aspecto, é fornecido um método para fazer uma proteína de APP humana truncada internamente carecendo da região codificada pelo éxon 7 e/ou éxon 8 em um gene de APP humano, o método compreendendo: - (i) deletar o éxon 7 e/ou éxon 8 da sequência de codificação de APP endógena, (ii) substituir a sequência de codificação de APP endógena por sequência de codificação de APP exógena que carece do éxon 7 e/ou éxon 8, ou (iii) modificar sítios aceitadores de splice e/ou doadores de splice correspondendo ao éxon 7 e/ou éxon 8 na sequência de codificação de APP endógena; e permitir que o gene de APP seja expresso, pelo que um pré-mRNA de APP é spliced pela maquinaria de splicing da célula, desse modo produzindo MRNAs, em que o éxon 7 e/ou éxon 8 não estão incluídos e permitindo que o referido mMRNA seja traduzido na proteína de APP humana inernamente truncada.

[00123] De preferência, o método compreende o uso de uma técnica de edição de genoma, tal como CRISPR ou integração direcionada independente de homologia (HITI). Numa modalidade, CRISPR pode ser usado para deletar éxons 7 e/ou 8, preferencialmente de células neuronais. Em outra modalidade, HITI pode ser usada para substituir o gene de APP endógeno por CDNA que carece de éxons 7 e/ou 8. Em outras palavras, um “knock-in” de um gene sintético que carece dos éxons 7 e/ou 8 é realizado de preferência. Alternativamente, o método pode compreender realizar um knock-in de um mini gene no íntron 6-7, que compreende um forte sítio aceitador de splice seguido por um cDNA de éxons 9-18. Isso desviaria a transcrição dos éxons 7 e 8 e, desse modo, produziria o 695cDNA. O método pode ser realizado in vivo, in vitro ou ex vivo.

[00124] Será apreciado que a invenção se estende a qualquer ácido nucleico ou peptídeo ou variante, derivado ou análogo dos mesmos que compreende substancialmente as sequências de aminoácido ou ácido nucleico de qualquer das sequências aqui referidas, incluindo variantes funcionais ou fragmentos funcionais das mesmas. Os termos “substancialmente a sequência de aminoácido/nucleotídeo/peptídeo”, “variante funcional” e “fragmento funcional” podem ser uma sequência que tenha pelo menos 40% de identidade de sequência com as sequências de aminoácido/nucleotídeo/peptídeo de qualquer uma das sequências aqui referidas, por exemplo, 40% de identidade com a sequência aqui identificada e assim por diante.

[00125] Sequências de aminoácido/polinucleotídeo/polipeptídeo com uma identidade de sequência que é maior que 65%, mais preferencialmente maior que 70%, ainda mais preferencialmente maior que 75% e ainda mais preferencialmente maior que 80% de identidade de sequência para qualquer das sequências referidas também são contempladas. De preferência, a sequência de aminoácido/polinucleotídeo/polipeptídeo tem pelo menos 85% de identidade com qualquer das sequências referidas, mais preferencialmente pelo menos 90% de identidade, ainda mais preferencialmente pelo menos 92% de identidade, ainda mais preferencialmente pelo menos 95% de identidade, ainda mais preferencialmente = pelo menos 97% de identidade, ainda mais preferencialmente pelo menos 98% de identidade e, mais preferencialmente,

pelo menos 99% de identidade com qualquer das sequências aqui referidas.

[00126] O técnico qualificado apreciará como calcular a identidade percentual entre duas sequências de aminoácido/polinucleotídeo/polipeptídeo. A fim de calcular a identidade percentual entre duas sequências de aminoácidos/polinucleotídeo/polipeptídeo, primeiro deve ser preparado um alinhamento das duas sequências, seguido pelo cálculo do valor de identidade de sequência. A identidade percentual para duas sequências pode assumir valores diferentes dependendo:- (i) do método usado para alinhar as sequências, por exemplo, ClustalW, BLAST, FASTA, Smith-Waterman (implementado em diferentes programas) ou alinhamento estrutural de comparação 3D; e (ii) os parâmetros usados pelo método de alinhamento, por exemplo, alinhamento local versus global, a matriz de escore de par usada (por exemplo, BLOSUM62, PAM250, Gonnet etc.) e penalidade de gap, por exemplo, forma e constantes funcionais.

[00127] Tendo feito o alinhamento, existem muitas maneiras diferentes de calcular a identidade percentual entre as duas sequências. Por exemplo, pode-se dividir o número de identidades: (i) pelo comprimento da sequência mais curta; (ii) pelo comprimento de alinhamento; (ili) pelo comprimento médio de sequência; (iv) pelo número de posições sem gap; ou (iv) pelo número de posições equivalentes excluindo pendentes. Além disso, será apreciado que identidade percentual também é fortemente dependente do comprimento. Portanto, quanto mais curto for um par de sequências, mais alta será a identidade de sequência que se espera que ocorra por acaso.

[00128] Daí, será apreciado que o alinhamento preciso de proteínas ou sequências de DNA é um processo complexo. O popular programa de alinhamento múltiplo ClustalW [38, 39] é uma maneira preferida para gerar múltiplos alinhamentos de proteínas ou DNA de acordo com a invenção. Os parâmetros adequados para ClustalW podem ser os seguintes: Para alinhamentos de DNA: Penalidade Gap Aberto = 15,0, Penalidade de Extensão de Gap = 6,66 e Matriz = Identidade. Para alinhamentos de proteínas: Penalidade de Gap Aberto = 10,0, Penalidade de Extensão de Gap = 0,2 e Matriz = Gonnet. Para alinhamentos de DNA e Proteínas: ENDGAP = -1 e GAPDIST = 4. Aqueles versados na técnica estarão cientes de que pode ser necessário variar esses e outros parâmetros para alinhamento ideal da sequência.

[00129] De preferência, o cálculo de identidades percentuais entre duas sequências de aminoácido/polinucleotídeo/polipeptídeo pode, então, ser calculado desse alinhamento como (N/T)*100, em que N é o número de posições nas quais as sequências compartilham um resíduo idêntico e Té o número total de posições comparadas, incluindo gaps, mas excluindo pendentes. Portanto, um método mais preferido para calcular identidade percentual entre duas sequências compreende (i) preparar um alinhamento de sequência usando o programa ClustalW usando um conjunto adequado de parâmetros, por exemplo, como estabelecido acima; e (ii) inserir os valores de N e T na seguinte fórmula: - Identidade de Sequência = (N/T)*100.

[00130] Métodos alternatiros para identificar sequências semelhantes serão conhecidos pelos especialistas na técnica. Por exemplo, uma sequência nucleotídica substancialmente semelhante será codificada por uma sequência que hibridiza com sequências de DNA ou seus complementos sob condições rigorosas. Por condições rigorosas, queremos dizer que o nucleotídeo hibridiza com DNA ou RNA ligado a filtro em 3x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido por pelo menos uma lavagem em 0,2x SSC/0,1% SDS a aproximadamente 20-65ºC. Alternativamente, um polipeptídeo substancialmente semelhante pode diferir em pelo menos 1, mas menos de 5, 10, 20, 50 ou 100 aminoácidos das sequências mostradas aqui.

[00131] Devido à degenerescência do código genético, é claro que qualquer sequência de ácido nucleico aqui descrita poderia ser variada ou mudada sem afetar substancialmente a sequência da proteína codificada pela mesma, para fornecer uma variante funcional da mesma. Variantes nucleotídicas adequadas são aquelas tendo uma sequência alterada pela substituição de diferentes códons que codificam o mesmo aminoácido dentro da sequência, produzindo assim uma mudança silenciosa. Outras variantes adequadas são aquelas tendo sequências nucleotídicas homólogas, mas compreendendo toda a, ou parte da, sequência que são alteradas pela substituição de diferentes códons que codificam um aminoácido com uma cadeia lateral de propriedades biofísicas semelhantes ao aminoácido que ele substitui, para produzir uma mudança conservativa. Por exemplo, pequenos aminoácidos hidrofóbicos não polares incluem glicina, alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina e metionina. Aminoácidos hidrofóbicos não polares grandes incluem fenilalanina, triptofano e tirosina. Os aminoácidos polares neutros incluem serina, treonina, cisteína, asparagina e glutamina. Os aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem lisina, arginina e histidina. Os aminoácidos carregados negativamente (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. Portanto, será apreciado quais aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido tendo propriedades biofísicas semelhantes e o técnico especializado conhecerá as sequências nucleotídicas codificando estes aminoácidos.

[00132] Todas as características descritas no presente documento (incluindo quaisquer reivindicações anexas, resumo e desenhos) e/ou todas as etapas de qualquer método ou processo assim revelado, podem ser combinadas com qualquer dos aspectos acima em qualquer combinação, exceto combinações em que pelo menos algumas dessas características e/ou etapas são mutuamente exclusivas.

[00133] Para uma melhor compreensão da invenção, e para mostrar como modalidades da mesma podem ser efetivadas, será agora feita referência, a título de exemplo, às Figuras anexas, nas quais:-

[00134] Figura 1 mostra uma predição de potenciais intensificadores de splicing exônico (ESEs) e silenciadores/supressores de splicing exônico (ESSs) para o éxon 7 (Figura 1A) e éxon 8 (Figura 1B) usando o Human Splicing Finder 2.4;

[00135] Figura 2 mostra uma ilustração da organização genômica do gene da Proteína Precursora de Amiloide (APP) e a localização de oligonucleotídeos antissentido oligonucleotídeos antissentido (AONs) em relação aos éxons alvo 7 (SEQ ID No: 5) e 8 (SEQ ID No: 11). Sequências exônicas são representadas com letras maiúsculas e sequências intrônicas são apresentadas com letras minúsculas. Cinco sequências (PMO 7.1, 7.2, 7.3, 7.4 e 7.5) foram escolhidas para atingir o éxon 7 e quatro sequências (PMO 8.1,

8.2, 8.3 e 8.4) foram escolhidas para atingir o éxon 8. As sequências de oligonucleotídeos fosforodiamidato morfolino antissentido (isto é, PMO) produzidas são mostradas em caixas coloridas;

[00136] Figura 3 mostra uma seleção da estrutura mais termodinamicamente favorável para o éxon 7 de APP, flanqueada por 50 nucleotídeos de sequências intrônicas usando análise mfold e ilustra os sítios de alvo para PMOs projetados mostrados na Figura 2 (as linhas coloridas representam os PMOs alinhados aos seus sítios alvo correspondentes);

[00137] Figura 4 mostra uma seleção da estrutura mais termodinamicamente favorável para o éxon 8 de APP, flanqueada por 50 nucleotídeos de sequências intrônicas por mfold e ilustra os sítios alvo para os PMOs projetados mostrados na Figura 2 (as linhas coloridas representam os PMOs alinhados aos seus sítios alvo correspondentes);

[00138] Figura 5(A) mostra um gel de agarose ilustrando os produtos de RT-PCR de mRNAs isolados de células não transfectadas (Bruto), células transfectadas com um PMO de controle (E2) e células transfectadas com 500nM de PMOs 7.2, 8.2 e uma combinação de PMOs 7.2 e 8.2 (500NM cada). Figuras 5(B)-(C) mostram que a quantidade relativa de cada transcrito foi calculada como uma razão entre a intensidade de cada produto de PCR e a intensidade de todos os produtos de PCR combinados. (B) Transfecção de 500nM dos PMOs 7.1, 7.2, 7.3 e 7.4 aumentou a expressão relativa de APP695 e promoveu a exclusão do éxon 7, ao passo que PMO 7.5 não exibiu atividade significativa. (C) Transfecção de 500nM dos PMOs 8.1, 8.2 e 8.3 promoveu a exclusão dos éxons 7 e 8 predominantemente de APP770 e menos de APP751, aumentando a quantidade relativa de APP695, ao passo que PMO

8.4 promoveu a exclusão do éxon 8 apenas de APP751. n=3 experimentos independentes para todas as condições. *** p<0,0001, **p<0,0014, *p=0,0248, n=3 para todas as condições;

[00139] Figura 6 mostra a quantificação da quantidade relativa das diferentes isoformas de APP por RT-PCR de SH-SY5Y transfectada com quantidades crescentes de PMOs 7.2, 8.2 e uma combinação de ambas. (A) Transfecção de 250nM de PMO 7.2 é suficiente para induzir salto do éxon 7 de APP77O e 500nM de ambas, APP770 e APP695. (B) Transfecção de 500nM de PMO 8.2 é suficiente para induzir salto dos éxons 7 e 8 de APP770 e aumentar a quantidade relativa de APP 695. (C) Transfecção de 7.2 e 8.2 reduz efetivamente os níveis de APP770 e 751 em concentrações relativamente baixas (5O0O0nM cada);

[00140] Figura 7 (A) mostra uma imagem representativa de um western blot ilustrando os níveis de proteína de APP de homogenatos de células não transfectadas (Branco), células transfectadas com um PMO de controle (E2) e células transfectadas com 500nM de PMOs 7.2, 8.2 e uma combinação de 7,2 e 8,2 (500nM cada). (B) A quantidade relativa de APP695 calculada como uma razão da intensidade de APP695 sobre a intensidade de todos os produtos de APP mostrou um aumento significativo de APP695 em células transfectadas com os PMOs projetados. ***p=0,0001, n=3 para todas as condições; e

[00141] Figura 8 mostra níveis de expressão de gene de NEP por qPCR de células de neuroblastoma SH-SY5Y transfectadas com PMOs 7.2, 8.2 e uma combinação de ambos. A transfecção dos PMOs intensifica os níveis de expressão de NEP em comparação com células não transfectadas ou células transfectadas com um PMO de controle.

Exemplos

[00142] Um contribuidor significativo para a manifestação e progressão de AD é o acúmulo de beta amiloide produzido pelo processamento proteolítico de APP. No cérebro, três transcritos principais de APP foram identificados, gerados de splicing alternativo, seja do éxon 7 (APP751) como dos éxons 7 e 8 (APP695). Muito embora em condições fisiológicas o transcrito predominante no cérebro seja APP695, um aumento significativo nos níveis dos transcritos mais longos (APP751, bem como a APP770 de comprimento total contendo ambos os éxons 7 e 8) tem sido associado à progressão de AD. Como descrito abaixo, os inventores projetaram oligonucleotídeos antissentido de fosforodiamidato morfolino (PMOs) para induzir salto dos éxons 7 e B e restaurar o padrão de splicing não associado a doença de APP. A capacidade de vários PMOs induzirem salto de éxons 7 e 8 foi testada in vitro em células de neuroblastoma humano SH-SY5Y que expressam todas as três isoformas. Os inventores identificaram oligonucleotídeos antissentido que reduzem eficientemente a inclusão dos éxons 7 e 8 do MRNA maduro que resultou na elevada expressão de proteína APP695 com uma diminuição associada em APP751 e APP770. Este estudo demonstra a viabilidade dessa abordagem de salto de éxon para alterar splicing de APP na AD.

Materiais e Métodos Projeto do Oligonucleotídeo Antissentido (AON)

[00143] AONs foram projetados para éxons 7 e 8 do gene de APP humano usando conhecimento de motifs de ligação de proteína SR putativa que estão implicados em splicing de pré-mRNA, conforme predito pelo Human Splicing Finder 2.4.1 [40] análise de sequências de éxon/íntron e estrutura secundária via MFold [41] e cálculos das energias de ligação de alvo AON como predito por Sfold [42]. Para a análise, foram utilizados os éxons correspondentes juntamente com 50 nucleotídeos 3' e 5' dos exons. Todos os AONs foram sintetizados como PMOs por GeneTools, LLC.

Cultura e Transfecção de Célula

[00144] Células SH-SYSY do Neuroblastoma Humano foram cultivadas em meio de cultura completo DMEM - DMEM Alta Glicose (SIGMA) suplementadi com 10% FBS (GIBCO), 1x PenStrep (GIBCO), 1x Aminoácidos Não Essenciais (SIGMA) e 1x GlutaMAX (GIBCO) e incubadas a 37ºC com 5% CO;>. As células foram semeadas em placas de 12 poços em meio de cultura completo de DMEM alta glicose para transfecções. Células não diferenciadas foram transfectadas com Endoporter/DMSO (Gene Tools) a uma razão de 6 ul de Endoporter por 1 ml de meio, de acordo com as instruções do fabricante. Concentrações de PMO variaram de 50NM a 1UuM.

Extração de RNA e RT-PCR

[00145] Células foram tipicamente incubadas por 24 horas pós- transfecção antes que RNA fosse extraído pelo kit RNeasy (Qiagen) conforme as instruções do fabricante. RNA foi quantificado em um nanodrop e 500ng foram utilizados para uma reação de RT-PCR com o kit GeneScript RT-PCR (Genesys), de acordo com as instruções do fabricante. As sequências iniciadoras utilizadas foram: fRT — GTGATGAGGTAGAGGAAGAGG (SEQ |D No: 16), rRT — GTTGTAGAGCAGGGAGAGAG (SEQ ID No: 17).

[00146] As condições de RT PCR foram: transcrição reversa a 45ºC por 30 min., seguida por: desnaturação inicial 92ºC por 2 min., 10 ciclos de desnaturação 92ºC por 30s, recozimento 62ºC por 30s, extensão 68ºC por 45s, 25 ciclos de desnaturação 92ºC por 30s, recozimento 62ºC por 30s, extensão a 68ºC por 45s + 5 s/ciclo, seguido de extensão final a 68ºC por 10 min., retenção a 4ºC infinita.

[00147] Uma alíquota de 1ul do produto de RT-PCR foi usada como modelo para uma reação de PCR aninhada de segundo round de 30 ciclos usando 2x PCR Master Mix (Quantig Ltd.). As sequências iniciadoras aninhadas usadas foram: fNes — CACAGAGAGAACCACCAGCA (SEQ ID No: 18), rNes —- CTTGACGTTCTGCCTCTTCC (SEQ ID No: 19).

[00148] As condições de PCR de Nester foram: desnaturação inicial 92ºC por 5 min., desnaturação de 30 ciclos 92ºC por 30s, recozimento 60ºC por 30s, extensão 68ºC por 45s, seguidas de uma extensão final a 68ºC por 10 min., retenção 4ºC infinita.

[00149] Produtos de PCR foram analisados em um gel de agarose a 1% (p/v) em tampão de TAE e os produtos foram visualizados com SyBr Safe. Os níveis de salto de éxon foram determinados por análise dos géis de PCR por análise densitométrica com imagem J de Fiji [43].

Western Blotting

[00150] Amostras de proteína foram preparadas por lise de células SH-SY5Y 72 horas após transfecção, com tampão RIPA (NaCl 150 mM, EDTA mM, HEPES 50 mM, NP-40 1% (v/v), 0,5% (p/v), sódio Deoxicolato, 0,1% (p/v) SDS) com um coquetel de inibidor de protease (Roche). Amostras de proteína foram preparadas em tampão de amostra 1x LDS e 1x Agente redutor (Invitrogen) antes de serem desnaturadas a 75ºC por 8 minutos.

[00151] As amostras foram resolvidas em géis de Tris-Glicina 10% (p/v) e transferidas para uma membrana de nitrocelulose 0,45 uM Amersham Protran (GE Life Sciences). Membranas foram bloqueadas por 1 hora em TBS contendo 0,05% (v/v) Tween-20 e 2,5% (p/v) de leite em pó seco. Membranas foram, então, incubadas com o anticorpo N terminal Anti-APP MAb 348 (Sigma Aldrich) a uma diluição de 1:1.000 durante a noite a 4ºC em tampão de bloqueio antes de serem lavadas com TBS e, então, incubadas com um anticorpo secundário de IgG Dylight 680 anticamundongo (Cell Signalling) 1:5.000 em TBS contendo 2,5% de leite em pó seco (p/v). A detecção foi realizada usando o sistema de imageamento infravermelho Odyssey de LI- COR biosciences e análise densitométrica foi realizada com imagem J de Fiji

[43].

Modificando Expressão de Neprilisina e APP 1) Síntese de CDNA

[00152] Para cada reação de síntese de cDNA, 0,5 ug de iniciadores aleatórios (Invitrogen), 0,5 ug de Oligo(dT) (Promega) e 600 ng de

RNA foram adicionados a um único tubo, perfazendo o volume de 10ul com água de grau molecular HyPure (LifeSciences). A mistura de reação foi incubada a 70ºC por 5 minutos antes de ser colocada em gelo. Uma mistura principal contendo tampão GoScript 5x (Promega), enzima GoScript (Promega), MgCl2 2,5 mM (Promega), dNTP 0,5 mM (Promega) e água de grau molecular HyPure (LifeSciences) composta até 15ul foi adicionada a cada reação e passada em uma reação de síntese de cDNA. As condições de síntese do cDNA foram: recozimento 25ºC 5 min., extensão 42ºC 1 hora, inativação da transcriptase reversa 70ºC 15 min., retenção a 4ºC infinita. RNA de 3 replicatas biológicas para cada condição (7, 8, 7+8, E2, Branco) foi usado para realizar esta síntese de cDNA.

2) qPCR

[00153] cDNA foi diluído até a concentração necessária e adicionado a um poço de uma placa de 384 poços, seguido pela adição da mistura principal necessária. As misturas principais consistiram em 2x Light Cycler 480 Syber green | (Roche) e 0,5 uM de iniciadores apropriados (Sigma). As sequências de iniciadores são descritas abaixo: NEP: F-CCTGGAGATTCATAATGGATCTTGT (SEQ ID No: 23) R-ARMAGGGCCTTGCGGAAAG (SEQ ID No: 24) APP: F-GATCCATCAGGGACCAAAAC (SEQ ID No: 25) R-AGCGGTAGGGAATCACAAAG (SEQ |D No: 26)

[00154] Três replicatas biológicas foram usadas para cada condição e, para cada uma dessas replicatas biológicas, três replicatas técnicas foram realizadas.

[00155] A expressão de pelo menos um gene de interesse e um gene housekeeping foi estudada em cada experimento e padrões variando de 1/20 a 1/2.500 foram usados para permitir análise dos resultados. qPCR foi executada em uma máquina de qPCR LightCycler480 (Roche). As condições de PCR foram: pré-incubação 95ºC 5min., 40 ciclos de amplificação 95ºC 15 s, 60ºC s, 72ºC 15 s. qPCR foi analisada usando o software LightCycler480

(Roche).

Exemplo 1 - Projeto de oligonucleotídeos antissentido (AONs)

[00156] Como as isoformas APP695 e APP751 são produzidas como resultado d de splicing out do éxon 7 (APP751) ou dos éxons 7 e 8 (APP695), respectivamente, um conjunto exclusivo de AONs foi projetado para atingir estes dois éxons. Com referência primeiro à Figura 1, cada sequência de éxon foi analisada quanto à presença de intensificadores de splicing exônico (ESEs) e supressores ou silenciadores de splicing exônic (ESS) usando Human Splicing Finder 2.4.1. Com referência à Figura 2, para induzir salto de éxon, um AON foi projetado para atingir especificamente ESEs, evitando ESSs, se possível. Usando a saída do Human Splicing Finder 2.4.1, foram projetados vários AONs 25mer ou 30mer visando ambos os éxons.

[00157] Foi previamente estabelecido que um AON mais eficaz teria suas extremidades em estruturas de alça aberta, pois isto permite invasão de fita mais fácil e ligaria a sequências de conformação abertas mais prontamente [44]. Com referência às Figuras 3 e 4, respectivamente, a estrutura secundária predita do pré-mRNA foi, portanto, avaliada para o éxon 7 e éxon 8 usando mfold e os sítios de ligação dos AONs projetados plotados.

[00158] Além da conformação aberta da sequência alvo, AONs que ligam mais fortemente a seu alvo são preditos serem mais eficazes [44]. Análise termodinâmica da ligação dos AONs projetados ao seu alvo foi realizada usando sfold e os resultados estão resumidos na Tabela 1.

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PMO 7.5 = SEQ ID No: 10 PMO 8.1 = SEQ ID No: 12 PMO 8.2 = SEQ ID No: 13 PMO 8.3 = SEQ ID No: 14 PMO 8.4 = SEQ ID No: 15

[00159] A análise geral mostrou que todas as sequências alvo de AONs projetados ricas em motivos de intensificadores de splicing exônico (ESE) têm uma alta proporção de seu alvo em conformações abertas, com todas, exceto uma, tendo pelo menos uma extremidade em uma estrutura de alça aberta predita e elas todas ligam fortemente ao seu alvo (ver Figuras 3, 4 e Tabela 1). Como as químicas de PMO foram usadas neste trabalho, o teor %GC (idealmente 40-60%) para cada AON projetado, o comprimento de qualquer trecho G contíguo (menos de 4) e o grau de autocomplementaridade (pouca ou nenhuma) também foram levados em consideração, uma vez que se acreditava que estes fatores tinham um efeito significativo no rendimento da síntese, na solubilidade e na eficácia.

Exemplo 2 - Eficiência dos PMOs que promovem exclusão dos éxons 7 e 8 no MRNA de APP

[00160] Os inventores testaram a seguir a atividade de cinco PMOs direcionados ao éxon 7 e quatro PMOs direcionados ao éxon 8, realizando PCR de transcrição reversa (RT-PCR) de mRNA isolado de células de neuroblastoma humano SH-SY5Y tratadas com cada PMO a 500nM por 48 horas. SH-SY5Y foram usadas para este trabalho devido à sua semelhança com células neuronais humanas primárias e porque elas expressam todas as três variantes neuronais de MRNA de APP [45].

[00161] Primeiro, os inventores examinaram a atividade de PMOs visando o éxon 7. Com referência à Figura 5A, a transfecção de células SH- SY5Y com 500nM de PMO foi seguida por uma RT-PCR aninhada projetada para detectar as três variantes de APP em uma reação. Para quantificar a atividade dos PMOs, a intensidade da banda característica para cada variante de mRNA foi medida usando densitometria e foi subsequentemente calculada como uma porcentagem sobre a intensidade de todos os produtos de PCR. Para fins de consistência, as culturas foram renovadas após 25-30 passagens e cada gráfico apresentado aqui é a média de três experimentos independentes realizados na mesma batelada de células. As quantidades relativas das três isoformas foram APP770: 34,1+3,3%, APP751: 44,6+0,9% e APP695: 21,2+2,6% para células de controle (não transfectadas) e APP770: 31,8+2%, APP751: 45,4+1,2% e APP695: 23,2+1,6% para células transfectadas com um PMO de controle (E2, direcionado o gene da distrofina humana). A sequência deste PMO de controle é CCAGCCCATCTTCTCCTGGTCCTGG (SEQ ID No: 20).

[00162] Com referência à Figura 5B, os resultados mostraram que PMOs 7.1, 7.2, 7.3 e 74, quando usados a 500 nM, reduziram significativamente a inclusão do éxon 7 na transcrição, aumentando a quantidade de APP695 para 71,5+3,2%, 75,9+4,1%, 64,1+2,4% e 74,7+0,1%, respectivamente, comparados ao controle (p<£0,0001, n=3). PMO 7,5 não afetou o padrão de splicing do mMRNA de APP tanto quanto os outros e a quantidade de APP695 era semelhante às condições de controle (28,6+4,6%, p=0,656, n=3).

[00163] Com referência às Figuras 5A e 5B, além disso, um novo produto correspondente a um mMRNA de APP incluindo éxon 8, mas não éxon 7, foi surpreendentemente gerado. Esse mRNA não foi descrito anteriormente e provavelmente ele corresponde a uma variante não fisiológica.

[00164] Em seguida, os inventores examinaram a atividade de quatro PMOs visando o éxon 8 em células SH-SY5Y transfectadas com 500nNM de cada oligo. Com referência às Figuras 5A e 5C, os resultados mostraram que PMOs 8.1, 8.2 e 8.3 induziram com eficiência a exclusão do éxon 8 e nenhuma banda detectável correspondente à APP 770 pôde ser detectada. À quantificação dos produtos de PCR mostrou que a quantidade relativa de APP751 foi diminuída para PMOs 8.1 e 8.2, mas menos para PMO 8.3

(31,9+0,3%, 35,8+0,2% e 39,8+1,02%, respectivamente, em comparação com C: 44,6+0,9%, p=0,0014, 0,025 e p>0,05, respectivamente, n=3). Surpreendentemente, um aumento nos níveis relativos do transcrito de APP695 mais curto foi mais proeminente para PMOs 8.1, 8.2 e 8.3 (64,1+0,3%, 68+0,2% e 60+1,02%, respectivamente, em comparação com C: 21,2+2,6%. p<0,0001, n=3) sugerindo uma possível ligação entre splicing do éxon 7 com o éxon 8.

[00165] Semelhante aos outros PMOs, o PMO 8.4 aumentou os níveis de APP695 (54,7+0,01% em comparação com C: 21,2+2,6%, p<0.0001, n=3) e reduziu a quantidade relativa de APP751 (APP751: 10,5+0,6% em comparação para C: 44,6+0,9%, p<0,0001, n=3). Surpreendentemente, no entanto, a expressão relativa de APP770 não foi afetada (34,7+0,6% em comparação com o controle 34,1+3,37), sugerindo que esse PMO poderia atingir apenas APP751.

[00166] Tendo demonstrado que os PMOs aqui descritos podem efetivamente induzir o salto dos éxons alvo 7 e 8, os inventores selecionaram PMOs 7.2 e 8.2 e investigaram com mais detalhes sua eficiência na promoção da exclusão de seus éxons alvo. Para fazer isso, células de SH-SY5Y foram transfectadas com concentrações crescentes de PMOs e RT-PCR de mRNA colhido das células transfectadas foi realizada para avaliar a extensão do salto de éxon, como mostrado nas Figuras 6A e 6B). Primeiro, com referência à Figura 6A, os inventores calcularam a quantidade relativa da variante de comprimento total (APP770 que inclui éxon 7), em células SH-SY5Y transfectadas com 50nM, 250nM, 500nM, 500nM, 750nM e 1.000nM de PMO

7.2. Os resultados mostraram que a expressão de APP770 foi semelhante entre células transfectadas com 50NM de PMO oligo e controle (38,1+2,5% e 41,3+1,4%, respectivamente), ao passo que a transfecção com 250nM de PMO

7.2 ou superior foi suficiente para abolir completamente a inclusão do éxon 7 de APP751. De modo interessante, o salto do éxon 7 de APP751 exigiu concentrações mais altas do PMO (500nM). Finalmente, os inventores também notaram que em concentrações mais altas do oligonucleotídeo (1UM), o éxon 8 também foi excluído, como mostrado na Figura 6A, sugerindo novamente uma ligação entre o splicing dos éxons 7 e 8.

[00167] Em seguida, com referência à Figura 6B, os inventores avaliaram a eficiência da exclusão do éxon 8 por PMO 8.2. Os resultados mostraram que o salto completo do éxon 8 de APP770 foi alcançado com transfecção de 500nM do oligonucleotídeo. Consistente com observações anteriores, os inventores notaram novamente um aumento progressivo da quantidade relativa de APP695 em vez da isoforma APP751 esperada (32,62%, 39,81,2%, 44,1+1,2%, 47,2+0,9% e 50,38+0,5%50 com 50nM, 250nM, 500nM, 750nNM e 1.000nM, respectivamente, para APP695 e 43,12+11,2%, 42,3+10,4%, 51,8+12,5%, 52,8+5,9% e 49,6+4,2% para 50nM, 500nM, 750nM e 1.000nM, respectivamente, para APP751). Esses resultados sugerem que os oligonucleotídeos que foram projetados estavam induzindo eficientemente o salto do éxon de seus alvos, eliminando a inclusão dos éxons 7eê8.

[00168] Os inventores, então, foram examinar se uma combinação de ambos os oligonucleotídeos antissentido ótimos, PMOs 7.2 e 8.2, seria eficaz na indução da exclusão de ambos os éxons. Para fazer isso, células SH- SY5Y foram transfectadas com várias concentrações de concentrações equimolares de uma combinação de PMOs 7.2 e 8.2 e comparadas com os níveis relativos de variantes de APP por RT-PCR.

[00169] Com referência à Figura 6C, os resultados mostraram que a combinação de ambos os PMOs induziu uma redução dependente da concentração de APP770 (de 14,8+2,7% a 11,7+2,2% a 50nNM, 3,9+3,4% a 100NM e O em concentrações mais altas) e APP751 (de 37,8+2,3% a 37,5+1,1% a 50NM, 22,9+1,7% a 100NM, 3,5+4,9% a 500NM e O em concentrações mais altas) com um aumento relativo em APP695 (de 47,3t5% a 50,7+3,1% a 5O0NM, 73+2,8% a 100nM, 96,4+4,9% a 500nNM e 100% a concentrações mais elevadas).

Exemplo 3 - Exame de concentrações de proteínas resultantes de salto de éxon

[00170] Tendo demonstrado que os PMOs que foram projetados poderiam efetivamente induzir o salto de seus éxons alvo no nível de mMRNA, os inventores, então, examinaram os níveis de proteína produzidos pelas três variantes de MRNA para assegurar que os eventos de salto de éxon no nível de mRNA também poderiam ser observado ao nível de proteína. Para fazer isso, células SH-SY5Y foram transfectadas com 1 uM de PMO 7.2, PMO 8.2 e sua combinação por 72 h antes da lise e seus extratos de proteína foram sondados com um anticorpo que detecta todas as variantes de APP.

[00171] Conforme mostrado na Figura 7, APP770 e APP751 são muito semelhantes em tamanho e não poderiam ser separados nos "western blots" (Figura 7A). Assim, eles mediram a quantidade relativa de APP695 sobre o total de APP. Seus resultados mostraram que o deslocamento em APP695 que foi detectado das RT-PCRs também se refletiu no nível de proteína. À quantidade relativa de APP695 em células transfectadas com PMO 7.2 foi aumentada significativamente (77,49+3,7%, p=0,0001, n=3) em comparação com as células de controle e transfectadas E2 (57,7+2,5% e 553%, respectivamente). Da mesma forma, em células transfectadas com PMO 8.2, a quantidade relativa de APP695 também foi aumentada (72,1+4%, p=0,001, n=3), confirmando as observações anteriores de que, no nível de mMRNA, o salto do éxon 8 resulta em um aumento de APP695 em vez de APP751. Finalmente, em células transfectadas com ambos os PMOs, a quantidade relativa de APP695 sobre a APP total foi de 86,6+2,8% (p=0,0001, n=3).

Exemplo 4 - Modificando a Expressão de Neprilisina e APP.

[00172] Com referência à Figura 8, os inventores continuaram a investigar o tratamento de células de neuroblastoma com os PMOs projetados e demonstraram um aumento na expressão de dois genes marcadores candidatos, isto é, Neprilisina (NEP) e a própria APP. Neprilisina é uma metaloprotease dependente de zinco, que inativa (isto é, cliva) vários peptídeos, incluindo amiloide beta (AB). Foi sugerido que sua expressão depende de APP695, a pequena isoforma de APP que os inventores estão tentando enriquecer. Sua conexão com a degradação de amiloide beta mostra como o enriquecimento de APP695 pode beneficiar pacientes de AD. O aumento da expressão de APP também foi associado a APP695 e os resultados mostrados na Figura 8 confirmam que outro alvo transcricional de APP695 responde adequadamente quando a razão é deslocada. Esses resultados demonstram que os efeitos a jusante preditos estão sendo exibidos pela influência dos PMOs aqui descritos.

Exemplo 5 - CRISPR

[00173] Os inventores contemplam o uso da ferramenta de edição de genoma, CRISPR, para modificar as sequências alvo, bem como introduzir inserções/deleções nos sítios aceitadores e doadores de splicing a fim de imitar os resultados exibidos usando os PMOs aqui descritos. Além disso, CRISPR também pode ser usado para (i) tentar deletar ambos os éxons de células neuronais, ou (ii) substituir o gene endógeno por um cDNA sem os éxons 7 e 8 usando integração direcionada independente de homologia (HITI). Em outras palavras, um “knock-in” de um gene sintético que carece de éxons 7 e 8 poderia ser realizado. Alternativamente, é possível inserir remover um mini gene no íntron 6-7 que terá um forte sítio aceitador de splice seguido por um CDNA de éxons 9-18. Isso ignoraria a transcrição dos éxons 7 e 8 e produziria o 695cDNA.

Discussão

[00174] Os resultados mostram que oligonucleotídeos complementares modificados (isto é, os PMOs aqui descritos) podem ser eficientemente usados para aumentar a expressão da variante de MRNA APP695 em células de neuroblastoma. O objetivo principal era projetar PMOs que visassem dois éxons de APP alternativamente spliced, isto é, éxons 7 e 8. Os inventores projetaram cinco PMOs visando o éxon 7 e quatro PMOs visando o éxon 8. Dois dos PMOs projetados foram menos ativos na indução de salto de éxon de seus alvos do que os outros. Dois dos PMOs mais potentes foram selecionados, um para cada éxon (PMO 7.2 e PMO 8.2), e os inventores mostraram que é possível atingir 100% de salto dos éxons alvo, mesmo em concentrações relativamente baixas. Além disso, os inventores também mostraram que a abundância de APP695 que foi observada no nível de mRNA também era aparente no nível de proteína quando os PMOs ótimos eram usados em combinação.

[00175] Esses dados demonstram claramente que a restauração dos níveis de APP695 in vitro usando PMOs é viável e, portanto, pode-se estar otimista da implementação das estratégias descritas aqui como uma abordagem terapêutica para a AD. A fim de ser capaz de usar PMOs direcionados ao cérebro, quantidades significativas de PMOs precisam ser distribuídas no cérebro. Embora PMOs não atravessem prontamente a barreira hematoencefálica, várias estratégias foram descritas para fornecer AONs ao cérebro, superando a barreira hematoencefálica que ainda está para ser testada em sujeitos humanos [46-48].

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Claims (38)

REIVINDICAÇÕES

1. —Oligonucleotídeo antissentido (AON), caracterizado pelo fato de que é capaz de reduzir ou impedir a inclusão do éxon 7 e/ou éxon 8 em um MRNA de proteína precursora de amioide (APP) produzido por splicing a partir de um transcrito de APP.

2. — AON, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o AON promove salto de éxon para aumentar a expressão da isoforma de mRNA de APP695 e reduz a quantidade das isoformas APP751 e APP770.

3. AON, de acordo com qualquer da reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o AON é capaz de reduzir ou prevenir inclusão do éxon 7 em um mRNA de proteína precursora de amiloide (APP) produzido por splicing de um transcrito de APP.

4. AON, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o AON é capaz de reduzir ou prevenir inclusão do éxon 8 em um mRNA de proteína precursora de amiloide (APP) produzido por splicing de um transcrito de APP.

5. — AON, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que uma proteína feita pulando os éxons 7 e 8 compreende as seguintes características: 1) éxon 6 é unido ao éxon 9 mantendo o quadro de leitura e resultando em uma proteína com 695 aminoácidos que é denominada “APP695” neste documento; 2) o domínio inibidor da protease tipo Kunitz (KPI), que está dentro do éxon 7, é removido; e/ou 3) um domínio compartilhando homologia com o antígeno OX-2 de células linfoides derivadas de timo que está dentro do éxon 8 é removido.

6. — AON, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o AON é capaz de ligar a e/ou é complementar a uma região alvo dentro de:- (i) a parte 3' do íntron 6-7 e/ou a parte 5' do éxon 7 do gene de APP; (ii) éxon 7 do gene de APP; (iii) a parte 3' do éxon 7 e/ou a parte 5' do íntron 7-8 do gene de APP; (iv) a parte 3' do íntron 7-8 e/ou a parte 5' do éxon 8 do gene de APP; (v) éxon 8 do gene de APP; e/ou (vi) a parte 3' do éxon 8 e/ou a parte 5' do íntron 8-9 do gene de APP.

7. — AON, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o AON tem no máximo 4 ou menos incompatibilidades com sua região alvo complementar, ou 3 ou menos, ou 2 ou menos, ou | ou nenhuma incompatibilidade.

8. AON, de acordo com qualquer da reivindicação 6 ou reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o AON é complementar a pelo menos 8 nucleotídeos na região alvo, ou de 8 a 50 nucleotídeos ou de 12 a 50 nucleotídeos na região alvo.

9. AON, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que o AON tem um comprimento de 18 a 42 nucleotídeos, ou de 22 a 42, ou de 27 a 39 nucleotídeos.

10. AON, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizado pelo fato de que quando o AON é capaz de reduzir ou prevenir inclusão do éxon 7 em um mRNA de APP produzido por splicing de um transcrito de APP, a região alvo para o AON está entre 150 nucleotídeos a montante da junção íntron 6/éxon 7 (-150) e 150 nucleotídeos a jusante da junção éxon 7/íntron 7 (+150).

11. AON, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a região alvo de AON abrange 15 nucleotídeos a montante e 150 nucleotídeos a jusante do éxon 7 do gene de APP humano (-15 a +50) e é representada como SEQ ID NO: 5.

12. AON, de acordo com qualquer da reivindicação 10 ou reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o AON é complementar a uma região alvo dentro do ou adjacente ao éxon 7 e compreende uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 6, 7,8,9e10.

13. AON, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o AON compreende uma sequência nucleotídica de SEQ ID No: 7.

14. AON, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizado pelo fato de que quando o AON é capaz de reduzir ou prevenir inclusão do éxon 8 em um mRNA de APP produzido por splicing de um transcrito de APP, a região alvo para o AON está entre 150 nucleotídeos a montante da junção do íntron 7/éxon 8 (-150) e 150 nucleotídeos a jusante da junção do éxon 8/íntron 8 (+150).

15. AON, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a região alvo de AON abrange nucleotídeos 50 nucleotídeos a montante e 50 nucleotídeos a jusante do éxon 8 do gene de APP humano (-50 a +50) e é representada como SEQ ID NO: 11.

16. AON, de acordo com qualquer da reivindicação 14 ou reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o AON é complementar a uma região alvo dentro do ou adjacente ao éxon 8 e compreende uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 12, 13, 14 e 15.

17. AON, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o AON compreende uma sequência nucleotídica de SEQ ID No: 13.

18. AON, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que o AON é um oligorribonucleotídeo.

19. AON, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o AON compreende ligações internucleosídicas que são quimicamente modificadas, preferencialmente com ligações fosforotioato.

20. AON, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que o AON compreende um oligôêômero fosforodiamidato morfolino (PMO).

21. Oligonucleotídeo antissentido (AON), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que é para uso em terapia ou diagnóstico.

22. Oligonucleotídeo antissentido (AON), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento, na prevenção ou na melhora de um distúrbio neurodegenerativo.

23. AON para uso, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o distúrbio neurodegenerativo é doença de Alzheimer.

24. AON para uso, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado pelo fato de que um ou mais AON para causar salto de éxon 7 são usados em combinação com um ou mais AON para causar salto do éxon 8.

25. AON para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 23, caracterizado pelo fato de que qualquer um dos AON selecionados do grupo consistindo em SEQ ID NO: 6, 7, 8, 96 10 é usado em combinação com qualquer um dos AON selecionados do grupo consistindo em SEQ ID NO: 12, 13, 14 ou 15.

26. Oligonucleotídeo antissentido (AON), caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14 e 15.

27. Polipeptídeo de APP humano isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido substancialmente como estabelecido em SEQ ID No: 22, ou uma variante ou um fragmento da mesma.

28. Polipeptídeco de APP humano isolado, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é codificado por uma sequência nucleotídica substancialmente conforme estabelecido em SEQ ID No: 21, ou uma variante ou fragmento da mesma.

29. Polipeptídeo APP humano isolado, de acordo com qualquer da reivindicação 27 ou reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que é para uso em terapia.

30. Polipeptídeo de APP humano isolado, de acordo com qualquer da reivindicação 27 ou reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento, na prevenção ou melhora do distúrbio neurodegenerativo, preferencialmente doença de Alzheimer.

31. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do oligonucleotídeo antissentido (AON) conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1- e, opcionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável.

32. Processo para produzir a composição farmacêutica da reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o processo compreende combinar uma quantidade terapeuticamente eficaz do oligonucleotídeo antissentido (AON) conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1- 20 com um veículo farmaceuticamente aceitável.

33. Método para prevenir ou reduzir inclusão do éxon 7 e/ou éxon 8 em um mRNA de APP humano, quando o referido MRNA é produzido por splicing de um transcrito de RNA, caracterizado pelo fato de que compreende contatar um ou mais AON conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-20 com uma célula, um tecido, in vitro ou ex vivo, ou um sujeito humano vivo compreendendo tal célula, sob condições propícias à captação dos um ou mais AON por essa célula, e permitir que o splicing ocorra.

34. Método para fazer uma proteína APP humana truncada internamente carecendo da região codificada pelo éxon 7 e/ou éxon 8 em um gene de APP humano, o método caracterizado pelo fato de que compreende contatar um ou mais AON conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-20 com uma célula que expressa o gene de APP humano em condições propícias à captação dos um ou mais AON, permitir que o gene APP seja expresso, pelo que o pré-mRNA de APP é spliced pelo maquinaria de splicing da célula, desse modo produzindo mMRNAs, em que o éxon 7 e/ou o éxon 8 não estão incluídos e permitir que o referido MRNA seja traduzido na proteína truncada internamente.

35. Método para fazer uma proteína de APP humana truncada internamente carecendo da região codificada pelo éxon 7 e/ou éxon 8 em um gene de APP humano, caracterizado pelo fato de que compreende:- (i) deletar o éxon 7 e/ou éxon 8 da sequência de codificação de APP endógena, ou (ii) substituir a sequência de codificação de APP endógena por sequência de codificação de APP exógena que carece do éxon 7 e/ou éxon 8, ou (iii) modificar sítios aceitadores de splice e/ou doadores de splice correspondendo ao éxon 7 e/ou éxon 8 na sequência de codificação de APP endógena; e permitir que o gene de APP seja expresso, pelo que um pré- mMRNA de APP é spliced pela maquinaria de splicing da célula, desse modo produzindo MRNAs, em que o éxon 7 e/ou éxon 8 não estão incluídos e permitindo que o referido MRNA seja traduzido na proteína de APP humana inernamente truncada.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que CRISPR pode ser usado para deletar éxons 7 e/ou 8, preferencialmente de células neuronais.

37. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que HITI é usado para substituir o gene de APP endógeno por cDNA que carece de éxons 7 e/ou 8.

38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 37, caracterizado pelo fato de que é realizado um “knock-in” de um gene sintético que carece de éxons 7 e/ou 8, ou o método compreende realizar um knock-in de um mini gene no íntron 6-7 que compreende um sítio aceitador de splice forte seguido por um cDNA dos éxons 9-18.