BR112020010864A2 - receptor olfativo envolvido na percepção de fragrância de almíscar e uso do mesmo - Google Patents

Abstract

A invenção refere-se à identificação de OR5A2 como um Receptor Olfativo que se liga a almíscar natural e almíscares sintéticos. A invenção abrange o uso da interação de polipeptídeos de OR5A2 e nitroalmíscar, almíscar policíclico, almíscar macrocíclico e almíscares alicíclicos como a base de ensaios de triagem para agentes que modulam especificamente a atividade do OR da invenção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “RECEPTOR

OLFATIVO ENVOLVIDO NA PERCEPÇÃO DE FRAGRÂNCIA DE ALMÍSCAR E USO DO MESMO” Campo da Invenção

[001] O campo da técnica se refere à caracterização de receptores olfativos. Em particular, a presente invenção se refere ao receptor olfativo cinco, subfamília A, membro dois, isto é, OR5A2, e à identificação de seus ligantes que correspondem a almíscar natural ou almíscares sintéticos. A presente invenção fornece ensaios e métodos de triagem que podem ser usados para identificar compostos com a capacidade para ativar, imitar, bloquear, inibir, modular e/ou intensificar a atividade desse receptor (OR5A2).

Antecedentes da Invenção Receptores Olfativos

[002] Os genes que codificam receptores olfativos (ORs) representam a maior família de genes (3% do genoma inteiro) no corpo humano dedicada a uma única função fisiológica. Esses ORs pertencem à superfamília de receptores acoplados à proteína G (GPCRs). GPCRs são receptores de membrana localizados na superfície de muitos tipos de células diferentes. Os recursos comuns desses receptores consistem em sete vãos transmembranares que formam um cilindro dentro da membrana celular e em sua capacidade para interagir com GTPase heterotrimérica e transduzindo, assim, um sinal mediante a ligação de seus ativadores.

[003] No genoma humano, cerca de 1.000 sequências contendo assinaturas características de receptores olfativos foram encontradas. Entretanto, 60% dessas parecem codificar pseudogenes não funcionais, deixando, assim, seres humanos com cerca de 400 proteínas de OR funcionais diferentes.

[004] Com base nas análises filogenéticas, os ORs de mamífero podem ser classificados em dois grupos diferentes: classe I e classe II. Os ORs de classe 1, também chamados de “receptores do tipo peixe”, formam um grupo homogêneo que está mais estreitamente relacionado a ORs encontrados em peixes e se presume, portanto, que representam uma relíquia conservada mantida por toda a evolução dos vertebrados. A persistência desse grupo de ORs ancestrais sugere que os mesmos desempenham um papel importante na percepção química de mamíferos. Em contraste com os ORs do tipo peixe, os ORs de classe 2 apareceram primeiro em vertebrados tetrápodes e se expandiram para formar a maior parte do repertório de OR presentemente conhecido em seres humanos. Os ORs de classe 2 representam provavelmente uma adaptação à vida terrestre em que a detecção de odorizante transportado pelo ar é exigida. Nos mamíferos, a maior parte dos ORs pertencem à classe II, mas os mamíferos também têm ORs de classe I.

Mecanismos de Percepção de Odor.

[005] Receptores de odorizante são expressos em neurônios sensoriais olfativos especializados (OSNs) localizados no topo da cavidade nasal em uma pequena área que constitui o epitélio olfativo. Extensões filiformes em uma extremidade dessas células contêm os ORs em sua superfície e flutuam no muco nasal em que os odorizantes são dissolvidos. Na extremidade oposta, o OSN estende seu axônio através do osso etmoide na base do crânio para conectar ao bulbo olfativo uma pequena região do cérebro dedicada à integração dos estímulos olfativos. Um recurso notável das dezenas de milhões de OSN espalhados por todo o epitélio olfativo é que cada um expressa apenas um dos aproximadamente 400 genes de OR disponíveis no genoma humano. Em OSN, a ativação do OR promove a ativação de uma proteína G específica olfativa (Galfa-olf) que estimula uma adenilato ciclase do tipo III a produzir AMP cíclico; isso desempenha o papel de um segundo mensageiro. Mediante a ligação a um canal de cátion dependente de cAMP, esse mensageiro induz a entrada de cálcio na célula. O cálcio causa a abertura de outro canal que promove a saída de íons de cloreto e, portanto, ativa uma ação potencial do neurônio levando a um sinal para a respectiva área do cérebro. Cada OR tem a capacidade para interagir com diferentes moléculas, e cada molécula de odorizante pode ativar mais do que um OR. Assim,

a percepção de odor não depende da ativação simples de um único OR, mas, em vez disso, de múltiplas ativações de diversos ORs. Com um agrupamento de aproximadamente 400 ORs, o número de combinações possíveis é quase infinito, explicando, assim, as propriedades de discriminação notáveis do sistema olfativo.

Caracterização de Moléculas de Odorizante com ORs

[006] Linhagens celulares cultivadas foram amplamente usadas para caracterizar e estudar receptores de interesse em contextos acadêmicos e industriais. Essa abordagem envolve a introdução do gene correspondente nas células e a promoção subsequente de sua superexpressão estável ou temporária. A atividade do receptor pode ser monitorada com o uso de um ensaio funcional. O uso de linhagens celulares fáceis de cultivar juntamente com ensaios funcionais fáceis de executar facilita vários milhares de medições por dia. Tipicamente, na indústria farmacêutica, é comum testar bibliotecas de milhões de compostos por dia em receptores não olfativos. A produção de cAMP que surge na célula mediante a ativação do OR por suas moléculas de odorizante pode ser detectada por uma abordagem indireta que consiste no uso de um gene-repórter, conforme descrito em (Saito et al., 2004 Cell Volume 119, 679 a 691).

Esse gene é colocado sob o controle de um promotor induzível por cAMP e é expresso apenas mediante a indução por cAMP.

Diferentes genes podem ser usados para esse propósito, mas um dos mais populares codifica a proteína que produz luz luciferase. Enquanto cliva seu substrato, luciferina, essa enzima libera luz que é prontamente detectada e quantificada.

A intensidade de luz emitida reflete a quantidade de luciferase produzida, que é proporcional ao aumento de cAMP e, portanto, diretamente relacionada à atividade do receptor. Uma das vantagens dos ensaios de gene-repórter é dependente da amplificação de sinal entre a ativação de receptor e produção de repórter. Isso torna o ensaio particularmente sensível a respostas fracas que quase não podem ser detectadas por outros ensaios funcionais.

[007] Outros ensaios funcionais foram também usados para demonstrar a ativação de um OR por seu ligante de odorizante. Um desses ensaios consiste no monitoramento do aumento no cálcio citosólico que ocorre mediante a ativação do receptor (Krautwurtz D. et al. 1998. Cell 95, 917 a 26).

[008] Identificações de ativadores de OR humanos também foram relatadas. Exemplos de OR humano deorfanizado são dados em Fujita Y et al. 2007. J. Recept. Signal.

Transduct. Res. 27, 323 a 34; Keller A. et al. 2007. Nature 449, 468 a 72; Matarazzo V. et al. 2005. Chem. Senses 30, 195 a 207; Saito H. et al. 2009. Sci. Signal. 2, 1 a 14; Sanz G. et al. 2005. Chem. Senses 30, 69 a 80; Schmiedeberg K. et al. 2007. J Struct. Biol. 159, 400 a 12. ; Shirokova

E. et al. 2004. J. Biol. Chem. 280, 11807 a 15. ; Spehr M.

et al. 2003. Science 299, 2054 a 58; Wetzel, K. et al. 1999.

J. Neurosci. 19, 7426 a 33; WO 2006/094704; Shirasu et al.

2014 Neuron 81, 165 a 78.

[009] Para vários dos receptores, mais do que um ligante foi identificado. O odorizante que ativa o mesmo OR pode pertencer a diferentes famílias de odorizantes, tais como álcool, aldeído, ésteres, etc. (Sanz G. et al. 2005.

Chem. Senses 30, 69 a 80; Saito H. et al. 2009. Sci. Signal.

2, 1 a 14).

Almíscares

[010] Almíscares são conhecidos por terem sido usados na medicina e como fragrância por mais de 5.000 anos por causa de seu aroma fascinante e efeitos fisiológicos.

Atualmente, odores de almíscar são amplamente usados na indústria de cosméticos e perfume por causa de seu calor, elegância e aroma animal assim como por suas propriedades fixadoras.

[011] O primeiro composto de almíscar natural, Muscona, foi relatado em 1906 por Walbaum como o principal fragrante presente em secreções do cervo almiscarado.

Muscona apresenta uma estrutura de cetona macrocíclica exclusiva com um anel com 15 membros e tem propriedades atraentes para fêmeas sugerindo que a mesma é o feromônio masculino no cervo almiscarado. Desde então, inúmeros compostos com um aroma almiscarado foram purificados de plantas e animais como civeta-africana, musaranho e rato almiscarado. Entretanto, suas funções fisiológicas nessas espécies não foram investigadas.

[012] No passado, o cervo almiscarado foi a principal fonte de almíscar natural usado na fabricação de substâncias aromáticas. Sua raridade e alto preço apresentaram um incentivo para substituir almíscares naturais com almíscares sintéticos bem antes da questão de conservação da espécie de cervo almiscarado; que se tornou posteriormente uma preocupação prioritária. O primeiro composto de almíscar sintético, o “nitroalmíscar”, apareceu no século 19 por acidente: Albert Baur, que queria encontrar um modo de obter um explosivo potente e seguro, tal como trinitrotolueno (TNT), obteve, em vez disso, uma substância de forte cheiro de almíscar. Desde então, muitos compostos que imitam o aroma de Muscona foram sintetizados e usados na perfumaria como notas de base de muitas formulações comerciais. Esses compostos são parte de quatro grupos estruturalmente diversos de produtos químicos: nitroalmíscares, almíscares policíclicos, almíscares macrocíclicos e almíscares lineares/alicíclicos.

[013] Os nitroalmíscares pertencem aos derivados de nitrofenila, que são tecnicamente fáceis de fabricar. Os mesmos foram a primeira geração de almíscares sintéticos e foram massivamente usados na perfumaria até a década de 1950.

Nitroalmíscares referem-se, de modo geral, aos cinco compostos fragrantes mais comercialmente relevantes: cetona de almíscar (4-terc-butil-2,6-dimetil-3,5- dinitroacetofenona), ambreta de almíscar (2,6-dinitro-3- metoxi-4-terc-butiltolueno), mosqueno de almíscar (1,1,3,3,5-pentametil-4,6-dinitro-2H-indeno), tibetano de almíscar (1-terc-butil-3,4,5-trimetil-2,6-dinitrobenzeno) e xileno de almíscar (1-terc-butil-3,5-dimetil-2,4,6- trinitrobenzeno). Nessa família, cetona de almíscar foi usada em perfumes caros e famosos, tais como Chanel n°5, e foi considerada o cheiro de referência do almíscar, já que a mesma se assemelha estreitamente à muscona. Desde 1995, ambreta de almíscar foi banida por lei nos cosméticos pela União Europeia por causa de seus efeitos fotoalergênicos, carcinogênicos e neurotóxicos. A produção de tibeteno de almíscar e mosqueno de almíscar diminuiu nos últimos anos devido a preocupações quanto à sua toxicidade, bioacumulação e persistência no ambiente e ao banimento da União Europeia resultante no uso desses almíscares em cosméticos. Cetona de almíscar e xileno de almíscar continuam a ser usados como aditivos em detergentes, produtos de limpeza doméstica e outros produtos não cosméticos fragrantes. Devido ao fato de que os consumidores gostaram do cheiro doce de nitroalmíscar em pó e de que algumas fragrâncias legendárias foram construídas com nitroalmíscares, os cientistas tiveram que encontrar algum substituto para os nitroalmíscares.

[014] Na década de 1950, almíscares policíclicos foram desenvolvidos com base em materiais à base de petroquímico. Estruturalmente, os mesmos são formados por uma estrutura de núcleo bicíclica, tal como tipo indano ou tetralina, que é substituída por uma combinação de um grupo acetila ou um anel de pirano em combinação com grupos metila, isopropila e/ou t-butila. As grandes vantagens dessa família são ser mais estável, menos reativa para uso funcional na perfumaria e mais barata do que nitroalmíscares. Seu alto efeito fixador assim como forte cheiro almiscarado, doce, com odor âmbar e em pó seco contribuem para seu sucesso. O almíscar policíclico mais amplamente usado é Galaxolide® seguido por Tonalide®, são os dois produtos de maior volume no grupo de almíscares policíclicos, representando cerca de 95% do mercado da UE. Devido a essas altas quantidades produzidas e consumidas assim como a sua alta biopersistência, essas substâncias são, atualmente, ubíquas.

De fato, as mesmas podem ser detectadas em várias amostras ambientais e humanas, tais como água, sangue, leite materno, sedimentos e organismos, tais como várias espécies de peixes.

Além disso, as mesmas apresentam um alto nível de lipofilicidade e se acumulam facilmente em tecidos adiposos causando modificação da cadeia alimentar. Quanto a nitroalmíscares, a segurança da absorção dessas substâncias, não apenas por meio de contato dérmico, está sob discussão, embora alguns estudos em animais e bioensaios sugiram ainda que Galaxolide® pode ter efeitos de ruptura de hormônio.

[015] Um terceiro grupo de substitutos sintéticos de almíscar, almíscares macrocíclicos, foi sintetizado em

1926. Essas moléculas são bastante similares àquelas do almíscar natural e são claramente superiores, em termos de características de odor, a outros almíscares artificiais.

Todos os membros dessa classe possuem pelo menos um anel único composto de mais do que 6 carbonos (frequentemente 10 a 15). No passado, devido ao custo de produção relativamente alto, os mesmos foram menos extensivamente usados na formulação de perfume exceto para uma composição muito exclusiva. Embora ainda haja muito poucas informações disponíveis sobre almíscares macrocíclicos, esses compostos parecem ser mais ecológicos. Além disso, até o momento, nenhum relatório demonstrou qualquer efeito adverso de almíscar macrocíclico na saúde humana. Por essas razões, foi observado que a produção mundial de almíscares macrocíclicos sintéticos tende a aumentar atualmente.

[016] Almíscares alicíclicos, conhecidos de outro como como éster cicloalquílico ou almíscares lineares, são uma classe relativamente inovadora de compostos de almíscar com uma estrutura dramaticamente diferente (ésteres alquílicos modificados) em relação a outros almíscares anteriormente descritos. O primeiro composto dessa classe foi introduzido em 1975 com Cicloalmíscar, que tem um cheiro almiscarado, em pó, quente com notas de fruta e morangos.

Esse composto nunca entrou no mercado devido a seu preço não competitivo. Cerca de 15 anos depois, Helvetolida, um novo composto dessa classe, foi produzida em uma escala comercial.

Romandolida, um almíscar alicíclico mais ambreta e menos frutado em comparação à Helvetolida foi introduzida dez anos depois. O uso desses almíscares é ainda muito limitado, e os mesmos foram detectados em algumas águas superficiais. Em geral, pouco se sabe sobre esses almíscares e considerações similares àquelas em almíscares policíclicos podem ser obtidas. Entretanto, de acordo com diferentes estudos, Romandolida é prontamente biodegradável, portanto, não é atualmente esperado encontrar almíscares lineares a níveis detectáveis no ambiente.

[017] Almíscar é uma classe inteira de substâncias fragrantes usadas como notas de base na perfumaria. Já que o uso de nitroalmíscares e almíscares policíclicos sintéticos foi reduzido nos últimos anos por causa de suas propriedades que danificam a saúde e o ambiente, o mesmo permanece a matéria-prima mais comumente usada presente em quase todas as composições fragrantes. Suas propriedades exclusivas para equilibrar a composição, para adicionar um toque sutil de sensualidade e calor e para reduzir a taxa de evaporação tornam o mesmo um componente crucial indispensável na indústria de perfume. Portanto, há uma necessidade real do desenvolvimento e da identificação de novos almíscares não tóxicos biodegradáveis ou compostos que intensificam a percepção dos mesmos. Diferentes estratégias/métodos foram desenvolvidos no passado para revelar a fragrância ou composto de almíscar que ativa, imita, bloqueia, inibe, modula ou intensifica a percepção de almíscar (Akuhara et al. 2016 J Neurosci. 36(16), 4482 a 91; Shirasu et al. 2014 Neuron 81, 165 a 78; WO 2016/201152A1; WO 2015/020158 A1). Os mesmos são todos baseados no uso dos dois receptores olfativos identificados em camundongos, olfr1440 (MOR215-1) ou olfr96 (MOR221-1), e seus ortólogos humanos, OR11A1 ou OR5AN1, como receptores específicos para almíscar.

Sumário da Invenção

[018] Na presente invenção, foi surpreendentemente revelado que um receptor olfativo, que pertence à classe 2 de OR, é ativado pelos quatro diferentes grupos estruturalmente diversos de almíscares anteriormente descritos. Até o momento, nenhum dos receptores de almíscar anteriormente identificados mostrou tais níveis de responsividade para todos os quatros grupos. Dada a importância do almíscar na vida diária, essa revelação inesperada permitiria a identificação de compostos de almíscar mais segura, ecologicamente benigna e útil para as empresas de perfumes e sabores.

[019] A presente invenção refere-se à identificação de um novo receptor olfativo (OR) que pertence à classe 2 de OR, a saber, OR5A2 (o OR da invenção), como receptor natural para todo o grupo estruturalmente diverso de produtos químicos que compreendem nitroalmíscares, almíscares policíclicos, almíscares macrocíclicos e almíscares lineares. De preferência, o OR5A2 é definido no presente documento pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 ou sequências de polipeptídeos que têm pelo menos 80, de preferência, pelo menos 85% ou 86% de identidade de aminoácidos e, mais preferencialmente, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais, incluindo 100% de identidade de aminoácidos com a SEQ ID NO:2, que têm a capacidade para serem ativadas por compostos de almíscar. A invenção abrange o uso da interação desses polipeptídeos de OR e compostos de almíscar como a base de ensaios de triagem para agentes que ativam, imitam, bloqueiam, inibem, modulam ou intensificam a atividade do receptor OR5A2 conforme definido no presente documento.

[020] A invenção fornece adicionalmente um receptor quimérico que compreende a região central de OR5A2, que abrange os domínios transmembranares 2 a 7, definidos pelo

SEQ de aminoácidos ID NO:11, que é fundido em sua terminação N à porção química extracelular N-terminal, ao domínio transmembranar 1 e à alça intracelular 1, de um receptor acoplado à proteína G; e que é fundido em sua terminação C à extremidade C-terminal intracelular de um receptor de proteína G. Nas modalidades preferenciais, o dito receptor acoplado à proteína G é um receptor olfativo ou o receptor OR2A5 definido pela SEQ ID NO:12. São também fornecidos o uso de tal receptor quimérico para identificar moduladores de OR5A2 e o uso da região central de OR5A2, abrangendo os domínios transmembranares 2 a 7, definidos pela SEQ de aminoácidos ID NO:11 ou uma sequência de polipeptídeos que tem pelo menos 95% de identidade de aminoácidos e, de preferência, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais, incluindo 100%, de identidade de aminoácidos com a SEQ ID NO:11, para identificar agentes que interferem com a ligação entre o dito receptor OR5A2 e compostos de almíscar.

[021] A invenção também abrange kits para realizar métodos de triagem com base na interação do receptor OR5A2 (SEQ ID NO:2) ou da região central (região transmembranar 2 a 7 – SEQ ID NO:11) do receptor OR5A2 conforme definido no presente documento com os compostos de almíscar.

[022] A invenção abrange um método para identificar um agente ou uma amostra contendo um ou mais agentes que modula a atividade do receptor OR5A2 conforme definido no presente documento, sendo que o dito método compreende: a) colocar o polipeptídeo de OR conforme definido no presente documento, que pode ser o receptor OR5A2 conforme definido no presente documento (SEQ ID NO:2), sua região central (SEQ ID NO:11) ou um receptor quimérico que compreende a dita região central (consultar, por exemplo, a SEQ ID NO:10), em contato com um agente ou uma amostra; b) medir um atividade de sinalização do dito polipeptídeo de OR na presença do dito agente ou amostra; e c) comparar a atividade medida na presença do dito agente ou amostra à atividade medida em uma reação em que o dito polipeptídeo de OR é colocado em contato com um ou mais compostos de almíscar em sua EC50, em que o dito agente ou amostra é identificada como um agente ou uma amostra que modula a atividade do receptor OR5A2 conforme definido no presente documento quando a quantidade da atividade medida na presença do agente ou amostra é pelo menos 10% da quantidade induzida pelo dito composto (ou compostos) de almíscar em sua EC50.

[023] A invenção abrange adicionalmente um método para identificar um agente ou uma amostra contendo um ou mais agentes que modula a atividade do receptor OR5A2 conforme definido no presente documento, sendo que o dito método compreende: a) colocar o dito polipeptídeo de OR em contato com um ou mais compostos de almíscar conforme definido no presente documento na presença e na ausência de um agente ou amostra; e b) medir uma atividade de sinalização do polipeptídeo de OR conforme definido no presente documento, que pode ser o receptor OR5A2 conforme definido no presente documento (SEQ ID NO:2), sua região central (SEQ ID NO:11) ou um receptor quimérico que compreende a dita região central e c) comparar a quantidade da dita atividade medida em uma reação contendo o dito polipeptídeo de OR e composto (ou compostos) de almíscar sem o agente ou amostra à quantidade da dita atividade medida em uma reação contendo o dito polipeptídeo de OR, composto de almíscar e o dito agente ou amostra, em que uma alteração na atividade na presença do agente ou amostra em relação à atividade na ausência do agente ou amostra identifica o dito agente ou amostra como um agente ou amostra que modula a atividade do receptor OR5A2 conforme definido no presente documento.

[024] A invenção abrange adicionalmente um método para identificar um agente ou uma amostra, contendo um ou mais agente, que aumenta a atividade do receptor OR5A2 conforme definido no presente documento, sendo que o dito método compreende: a) colocar o polipeptídeo de OR conforme definido no presente documento, que pode ser o receptor OR5A2 conforme definido no presente documento (SEQ ID NO:2), sua região central (SEQ ID NO:11) ou um receptor quimérico que compreende a dita região central, em contato com um ou mais compostos de almíscar conforme definido no presente documento na presença e na ausência de um agente ou amostra, sob condições que permitem a ativação do dito polipeptídeo de OR pelo dito composto (ou compostos) de almíscar; e b) medir uma atividade de sinalização do dito polipeptídeo de OR, em que uma alteração na atividade na presença do dito agente ou amostra em relação à atividade na ausência do dito agente ou amostra identifica o dito agente ou amostra como um agente ou amostra que aumenta a atividade do receptor OR5A2 conforme definido no presente documento.

[025] A invenção abrange adicionalmente um método para identificar um agente ou uma amostra, contendo um ou mais agente, que diminui a atividade do receptor OR5A2 conforme definido no presente documento, sendo que o dito método compreende: a) colocar o polipeptídeo de OR conforme definido no presente documento, que pode ser o receptor OR5A2 conforme definido no presente documento (SEQ ID NO:2), sua região central (SEQ ID NO:11) ou um receptor quimérico que compreende a dita região central, em contato com um ou mais compostos de almíscar conforme definido no presente documento na presença e na ausência de um agente ou amostra, sob condições que permitem a ativação do dito polipeptídeo de OR pelo dito composto (ou compostos) de almíscar; e b) medir uma atividade de sinalização do dito polipeptídeo de OR, em que uma alteração na atividade na presença do dito agente ou amostra em relação à atividade na ausência do dito agente ou amostra identifica o dito agente ou amostra como um agente ou uma amostra que diminui a atividade do receptor OR5A2 conforme definido no presente documento.

[026] A invenção abrange um método para identificar um agente ou uma amostra, contendo um ou mais agentes que modula a atividade do receptor OR5A2 conforme definido no presente documento, sendo que o dito método compreende: a) colocar o polipeptídeo de OR conforme definido no presente documento, que pode ser o receptor OR5A2 conforme definido no presente documento (SEQ ID NO:2), sua região central (SEQ ID NO:11) ou um receptor quimérico que compreende a dita região central, em contato com um agente ou amostra; b) medir a ligação do dito agente ou amostra ao dito polipeptídeo de OR; e c) comparar a ligação do dito agente ou amostra à ligação do dito polipeptídeo de OR a um ou mais compostos de almíscar conforme definido no presente documento em sua EC50, em que o dito agente ou amostra é identificada como um agente ou uma amostra que modula a atividade do receptor OR5A2 conforme definido no presente documento quando a quantidade da ligação do dito agente ou amostra é pelo menos 10% da quantidade de ligação do dito composto (ou compostos) de almíscar presente em sua EC50.

[027] A invenção abrange adicionalmente um método para identificar um agente ou uma amostra contendo um ou mais agentes que modulam a interação entre um ou mais compostos de almíscar conforme definido no presente documento e o receptor OR5A2 conforme definido no presente documento, sendo que o dito método compreende: a) colocar o polipeptídeo de OR conforme definido no presente documento, que pode ser o receptor OR5A2 conforme definido no presente documento (SEQ ID NO:2), sua região central (SEQ ID NO:11) ou um receptor quimérico que compreende a dita região central, em contato com o dito composto (ou compostos) de almíscar na presença e ausência de um agente ou amostra sob condições que permitem a ligação do dito composto (ou compostos) de almíscar ao dito polipeptídeo de OR; e b) medir a ligação do polipeptídeo de OR ao dito composto (ou compostos) de almíscar, em que uma modulação na ligação na presença do agente ou amostra, em relação à ligação na ausência do agente ou amostra, identifica o dito agente ou amostra como um agente ou uma amostra que modula a interação entre um ou mais compostos de almíscar conforme definido no presente documento e o receptor OR5A2 conforme definido no presente documento.

[028] De acordo com a presente invenção, ao usar métodos de ligação, o um ou mais compostos de almíscar podem ser detectavelmente marcados. Nos ditos métodos, o composto (ou compostos) de almíscar pode ser detectavelmente marcado com uma porção química selecionada a partir do grupo que consiste em um radioisótopo, um fluoróforo e uma terminação brusca de fluorescência.

[029] Em uma modalidade de qualquer um dos métodos anteriores, o contato é realizado dentro ou sobre uma célula que expressa o polipeptídeo de OR conforme definido no presente documento, que pode ser o receptor OR5A2 conforme definido no presente documento (SEQ ID NO:2), sua região central (SEQ ID NO:11) ou um receptor quimérico que compreende a dita região central. De acordo com a presente invenção, a dita célula podem ser, porém sem limitação, células renais embrionárias humanas (HEK293), células de hamster chinês (CHO), células de macaco (COS), células olfativas primárias, células de Xenopus, células de inseto, levedura ou bactérias.

[030] Em outra modalidade de qualquer um dos métodos anteriores, o contato é realizado dentro ou sobre lipossomas sintéticos (consultar Tajib et al., 2000, Nature Biotechnology 18: 649 a 654, que está incorporado ao presente documento a título de referência) ou membranas de germinação induzida por vírus contendo o polipeptídeo de OR conforme definido no presente documento, que pode ser o receptor OR5A2 conforme definido no presente documento (SEQ ID NO:2), sua região central (SEQ ID NO:11) ou um receptor quimérico que compreende a dita região central (consultar o documento no WO0102551, 2001, incorporado ao presente documento a título de referência).

[031] Em outra modalidade de qualquer um dos métodos anteriores, o método é realizado com o uso de uma fração de membrana de células que expressam o polipeptídeo de OR conforme definido no presente documento, que pode ser o receptor OR5A2 conforme definido no presente documento (SEQ ID NO:2), sua região central (SEQ ID NO:11) ou um receptor quimérico que compreende a dita região central.

[032] Em uma modalidade preferencial de um dos métodos anteriores, o método é realizado em um chip de proteína.

[033] Em outra modalidade preferencial de um dos métodos anteriores, a medição é realizada com o uso de um método selecionado dentre deslocamento de marcação, ressonância plasmônica de superfície, transferência de energia de ressonância por fluorescência, terminação brusca de fluorescência e polarização de fluorescência.

[034] Em outra modalidade de um dos métodos anteriores, o agente é selecionado a partir do grupo que consiste em um peptídeo, um polipeptídeo, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, um lipídio, um carboidrato, um ácido nucleico e uma molécula orgânica pequena.

[035] De acordo com a presente invenção, quando um ensaio funcional é usado, a etapa de medir uma atividade de sinalização do receptor OR5A2 conforme definido no presente documento pode compreender detectar uma alteração no nível de um segundo mensageiro.

[036] Em outra modalidade, a etapa de medir uma atividade de sinalização compreende a medição de ligação/acoplamento ou troca do nucleotídeo guanina, atividade de adenilato ciclase, cAMP, atividade da Proteína Quinase C, quebra de fosfatidilinosotol de atividade da Proteína Quinase A, diacilglicerol, trifosfato de inositol, cálcio intracelular, fluxo de cálcio, ácido araquidônico, atividade de MAP quinase, atividade de tirosina quinase, ensaio de melanóforo, ensaio de inicialização de receptor ou expressão de gene-repórter. Quando a troca ou ligação/acoplamento de proteína G é medida, de todas as subunidades G possíveis, de preferência, os comportamentos da subunidade alfa-olf da proteína G de ligação a GTP (olfativa), também G-olf, são estudados. A sequência da subunidade G-olf humana foi anteriormente depositada no Genebank sob número de acesso L10665. Entretanto, as subunidades G-olf de outras espécies podem ser usadas e estudadas.

[037] Em uma modalidade preferencial, a medição da atividade de sinalização compreende usar um ensaio de fluorescência ou luminescência. Os ensaios de fluorescência e luminescência podem compreender o uso de fluóforos sensíveis a Ca2+ incluindo fluo3, Fluo4 ou Fura, (Molecular probes); família Ca3-e Ca6-kit (Molecular Device) e aequorina. Ademais, os ditos ensaios podem aplicar um leitor fluorométrico ou luminescente automatizado, tal como FDSS (Hammamatsu) ou FLIPR (Molecular Device).

[038] A invenção abrange adicionalmente um método para modular a atividade do receptor OR5A2 conforme definido no presente documento em uma célula, sendo que o dito método compreende a etapa de entregar à dita célula um composto de almíscar conforme definido no presente documento ou um agente que modula a atividade do polipeptídeo de OR conforme definido no presente documento, que pode ser o receptor OR5A2 conforme definido no presente documento (SEQ ID NO:2), sua região central (SEQ ID NO:11) ou um receptor quimérico que compreende a dita região central, de modo que a atividade do OR seja modulada.

[039] Em outra modalidade de qualquer um dos métodos anteriores, o método é um método de triagem de alto rendimento.

[040] Em outra modalidade de qualquer um dos métodos anteriores, o agente é parte de uma biblioteca química ou extratos de órgãos animais.

[041] De acordo com a presente invenção, o agente identificado ou detectado por qualquer um dos métodos anteriores, ou a composição que compreende o dito agente, pode ser usado para encontrar novos compostos de almíscar.

Alternativamente, esses podem ser usados para a preparação de ativadores de odorizante ou intensificador de odorizante.

Por exemplo, um ativador ou intensificador de OR pode ser usado como um desodorante. Um ativador ou intensificador de OR pode ser adicionado a uma formulação de fragrância ou perfume já usada como um desodorante para reforçar sua eficácia.

[042] A presente invenção também abrange uma composição que compreende o polipeptídeo de OR isolado e um composto de almíscar.

[043] A presente invenção refere-se adicionalmente ao uso de compostos de almíscar para a produção de um kit para triar agentes que modulam a sinalização do receptor OR5A2 conforme definido no presente documento ou em combinação com o receptor OR5A2 conforme definido no presente documento para a produção de um kit para triar ativadores de odorizante ou intensificadores de odorizante.

[044] Adicionalmente, a presente invenção abrange o uso de um composto de almíscar comercialmente ou não comercialmente disponível como um ligante para o receptor OR5A2 conforme definido no presente documento.

[045] A invenção abrange adicionalmente um kit que compreende o polipeptídeo de OR5A2 isolado, um ou mais compostos de almíscar conforme definido no presente documento e materiais de embalagem para os mesmos; um polinucleotídeo isolado que codifica o polipeptídeo de OR conforme definido no presente documento, que pode ser o receptor OR5A2 conforme definido no presente documento (SEQ ID NO:2), sua região central (SEQ ID NO:11) ou um receptor quimérico que compreende a dita região central, um ou mais compostos de almíscar e materiais de embalagem para os mesmos; um kit que compreende uma célula que expressa o dito polipeptídeo de OR ou membranas da mesma ou diversas células que expressam o dito polipeptídeo de OR ou membranas das mesmas, um ou mais compostos de almíscar conforme definido no presente documento e materiais de embalagem para os mesmos. A dita célula (ou células) pode ser transformada com um polinucleotídeo que codifica o dito OR. Em uma modalidade preferencial, o dito kit abrange o receptor OR5A2 conforme definido no presente documento ou qualquer variante do dito OR e um ou mais compostos de almíscar conforme definido no presente documento.

[046] A invenção fornece, portanto, os seguintes aspectos:

[047] Aspecto 1. Uso do polipeptídeo de OR5A2 definido pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de polipeptídeos que tem pelo menos 80% de identidade de aminoácidos e, de preferência, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais, incluindo 100% de identidade de aminoácidos, com a SEQ ID NO: 2, para identificar agentes que interferem com a ligação entre o dito receptor OR5A2 e um ou mais compostos de almíscar.

[048] Aspecto 2. Um método para identificar um agente ou uma amostra contendo um ou mais agentes que modulam a atividade do polipeptídeo de OR5A2, sendo que o método compreende:

[049] a) colocar o polipeptídeo de OR5A2 em contato com o dito agente ou amostra;

[050] b) medir a atividade de sinalização do dito polipeptídeo de OR5A2 na presença do dito agente ou amostra; e

[051] c) comparar a atividade ,medida na presença do dito agente ou amostra à atividade medida em uma reação em que o dito polipeptídeo de OR5A2 é colocado em contato com um ou mais compostos de almíscar em sua EC50, em que o dito agente ou amostra é identificada como um agente ou uma amostra, que modula a atividade do receptor OR5A2 conforme definido no presente documento quando a quantidade da atividade medida na presença do agente ou amostra é pelo menos 10% da quantidade induzida pelo dito composto (ou compostos) de almíscar em sua EC50.

[052] Aspecto 3. Um método para identificar um agente ou uma amostra contendo um ou mais agentes que modulam a atividade do receptor OR5A2 conforme definido no presente documento, sendo que o dito método compreende: a) colocar o dito polipeptídeo de OR5A2 em contato com um ou mais compostos de almíscar conforme definido no presente documento na presença e na ausência de um agente ou amostra; e b) medir uma atividade de sinalização do dito polipeptídeo de OR5A2, e c) comparar a quantidade da dita atividade medida em uma reação contendo o dito polipeptídeo de OR5A2 e composto (ou compostos) de almíscar sem o agente ou amostra à quantidade da dita atividade medida em uma reação contendo o dito polipeptídeo de OR5A2, composto de almíscar e o dito agente ou amostra, em que uma alteração na atividade na presença do agente ou amostra em relação à atividade na ausência do agente ou amostra identifica o dito agente ou amostra como um agente ou amostra que modula a atividade do receptor OR5A2 conforme definido no presente documento.

[053] Aspecto 4. O método de acordo com o aspecto 3, em que um aumento na atividade na presença do dito agente ou amostra em relação à atividade na ausência do dito agente ou amostra identifica o dito agente ou amostra como um agente ou amostra que aumenta a atividade do receptor OR5A2 conforme definido no presente documento.

[054] Aspecto 5. O método de acordo com o aspecto 3, em que uma diminuição na atividade na presença do dito agente ou amostra em relação à atividade na ausência do dito agente ou amostra identifica o dito agente ou amostra como um agente ou uma amostra que diminui a atividade do receptor

OR5A2 conforme definido no presente documento.

[055] Aspecto 6. Um método para identificar um agente ou uma amostra contendo um ou mais agentes que modula a atividade do receptor OR5A2 conforme definido no presente documento, sendo que o dito método compreende: a) colocar o dito polipeptídeo de OR5A2 em contato com um agente ou amostra; b) medir a ligação do dito agente ou amostra ao dito polipeptídeo de OR5A2; e c) comparar a ligação do dito agente ou amostra à ligação do dito polipeptídeo de OR5A2 a um ou mais compostos de almíscar conforme definido no presente documento em sua EC50, em que o dito agente ou amostra é identificada como um agente ou uma amostra que modula a atividade do receptor OR5A2 conforme definido no presente documento quando a quantidade da ligação do dito agente ou amostra é pelo menos 10% da quantidade de ligação do dito composto (ou compostos) de almíscar presente em sua EC50.

[056] Aspecto 7. Um método para identificar um agente ou uma amostra contendo um ou mais agentes que modulam a interação entre um ou mais compostos de almíscar conforme definido no presente documento e o receptor OR5A2 conforme definido no presente documento, sendo que o dito método é compreende: a) colocar o dito polipeptídeo de OR5A2 em contato com o dito composto (ou compostos) de almíscar na presença e ausência de um agente ou amostra sob condições que permitem a ligação do dito composto (ou compostos) de almíscar ao dito polipeptídeo de OR5A2; e b) medir a ligação do polipeptídeo de OR5A2 ao dito composto (ou compostos) de almíscar, em que uma modulação na ligação na presença do agente ou amostra, em relação à ligação na ausência do agente ou amostra, identifica o dito agente ou amostra como um agente ou uma amostra que modula a interação entre um ou mais compostos de almíscar conforme definido no presente documento e o receptor OR5A2 conforme definido no presente documento.

[057] Aspecto 8. O método de acordo com o aspecto 7, em que um aumento na ligação na presença do dito agente ou amostra em relação à ligação na ausência do dito agente ou amostra identifica o dito agente ou amostra como um agente ou amostra que aumenta a ligação do receptor OR5A2 conforme definido no presente documento.

[058] Aspecto 9. O método de acordo com o aspecto 7, em que uma diminuição na ligação na presença do dito agente ou amostra em relação à ligação na ausência do dito agente ou amostra identifica o dito agente ou amostra como um agente ou uma amostra que diminui a ligação do receptor OR5A2 conforme definido no presente documento.

[059] Aspecto 10. O método de acordo com qualquer um dos aspectos 2 a 9, em que o um ou mais compostos de almíscar são detectavelmente marcados, de preferência, com uma porção química selecionada a partir do grupo que consiste em um radioisótopo, um fluoróforo e uma terminação brusca de fluorescência.

[060] Aspecto 11. O método de acordo com qualquer um dos aspectos 2 a 10, em que o contato é realizado dentro ou sobre uma célula que expressa o dito polipeptídeo de OR5A2, de preferência, em que a dita célula é selecionada dentre: células renais embrionárias humanas (HEK293), células de hamster chinês (CHO), células de macaco (COS), células olfativas primárias, células de Xenopus, células de inseto, levedura ou bactérias.

[061] Aspecto 12. O método de acordo com qualquer um dos aspectos 2 a 11, em que o contato é realizado dentro ou sobre os lipossomas sintéticos ou membranas de germinação induzida por vírus contendo um polipeptídeo de OR5A2.

[062] Aspecto 13. O método de acordo com qualquer um dos aspectos 2 a 12, em que o método é realizado com o uso de uma fração de membrana de células que expressam o dito polipeptídeo de OR5A2 ou em um chip de proteína.

[063] Aspecto 14. O método de acordo com qualquer um dos aspectos 2 a 13, em que a medição é realizada com o uso de um método selecionado dentre deslocamento de marcação, ressonância plasmônica de superfície, transferência de energia de ressonância por fluorescência, terminação brusca de fluorescência e polarização de fluorescência.

[064] Aspecto 15. O método de acordo com qualquer um dos aspectos 2 a 14, em que o agente é selecionado a partir do grupo que compreende: um peptídeo, um polipeptídeo, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, um lipídio, um carboidrato, um ácido nucleico e uma molécula orgânica pequena.

[065] Aspecto 16. O método de acordo com qualquer um dos aspectos 2 a 15, em que a etapa de medir uma atividade de sinalização do receptor OR5A2 conforme definido no presente documento compreende detectar uma alteração no nível de um segundo mensageiro.

[066] Aspecto 17. O método de acordo com qualquer um dos aspectos 2 a 16, em que medir a atividade de sinalização compreende usar um ensaio de fluorescência ou luminescência, de preferência, o uso de fluoróforos sensíveis a Ca2+ incluindo fluo3, Fluo4 ou Fura; aequorina ou família Ca3-e Ca6-kit, ou em que os ditos ensaios aplicam um leitor fluorométrico ou luminescente automatizado, tal como FDSS ou FLIPR.

[067] Aspecto 18. O método de acordo com qualquer um dos aspectos 2 a 17, em que o método é um método de triagem de alto rendimento.

[068] Aspecto 19. O método de acordo com qualquer um dos aspectos 2 a 18, em que o agente é parte de uma biblioteca química ou extratos de órgãos animais.

[069] Aspecto 20. Um método para modular a atividade do receptor OR5A2 conforme definido no presente documento em uma célula, sendo que o dito método compreende a etapa de entregar à dita célula um composto de almíscar ou um agente que modula a atividade do dito polipeptídeo de OR5A2, de modo que a atividade do OR5A2 seja modulada.

[070] Aspecto 21. Um método para a preparação de um ativador de odorizante, intensificador de odorizante ou desodorante que compreende as etapas de:

[071] a) identificar um agente candidato, de acordo com qualquer um dos métodos dos aspectos 3 a 20, e

[072] b) adicionar o dito agente a uma composição para uso como ativador de odorizante, intensificador de odorizante ou um desodorante.

[073] Aspecto 22. Um kit que compreende um polipeptídeo de OR5A2 isolado, um ou mais compostos de almíscar e materiais de embalagem para os mesmos.

[074] Aspecto 23. Um kit que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica o polipeptídeo de OR5A2, um ou mais compostos de almíscar e materiais de embalagem para os mesmos.

[075] Aspecto 24. Um kit que compreende: uma célula que expressa o dito polipeptídeo de OR5A2, ou membranas da mesma, ou diversas células que expressam o polipeptídeo de OR5A2, ou membranas das mesmas; um ou mais compostos de almíscar conforme definido no presente documento e materiais de embalagem para os mesmos.

[076] Aspecto 25. Uso do kit de acordo com qualquer um dos aspectos 22 a 24 para triar agentes que modulam a sinalização do receptor OR5A2, de preferência, para triar agentes que podem ser usados como ativadores de odorizante, intensificadores de odorizante ou desodorantes.

[077] Aspecto 26. Uso de um composto de almíscar como um ligante para o receptor OR5A2.

[078] Aspecto 27. Uso dos kits de acordo com qualquer um dos aspectos 22 a 26 para realizar métodos de triagem com base na interação do receptor OR5A2 com um ou mais compostos de almíscar.

[079] Aspecto 28. Uso ou método de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores, em que os ditos compostos de almíscar são selecionados a partir do grupo que compreende: compostos de nitroalmíscar, compostos de almíscar lineares, compostos de almíscar policíclicos e compostos de almíscar macrocíclicos.

[080] Aspecto 29. Uso ou método de acordo com o aspecto 28, em que os ditos compostos de nitroalmíscar e/ou os ditos compostos de almíscar lineares e/ou os ditos compostos de almíscar policíclicos e/ou os ditos compostos de almíscar macrocíclicos são selecionados a partir do grupo de moléculas representadas na Tabela 2.

Breve Descrição das Figuras

[081] Figura 1: A. Análise de resposta à concentração do OR da invenção (a saber OR5A2, OR5A2 variante_1) com diferentes ativadores correspondendo a seis almíscares diferentes representativos dos quatro grupos estruturalmente diversos de almíscares (almíscares macrocíclicos: Oxalida T e Cervolida; almíscares policíclicos: Cashmeran e Fantolida; nitroalmíscar: Mosqueno, almíscares alicíclicos: Silcolida). Essas análises foram realizadas de acordo com o procedimento descrito em “Procedimento experimental”. pEFIBRHO corresponde ao vetor vazio e é usado como controle. B. Estrutura do almíscar diferente usado na análise de resposta à concentração (Figura 1A).

[082] Figura 2: A. ClustalW2 é usado para o alinhamento de sequências de polipeptídeos de proteínas de OR5A2 variante_1 (SEQ ID NO:2), OR5A2 variante_2 (SEQ ID NO:4), OR5AN1 (SEQ ID NO:7), OR11A1 (SEQ ID NO:8) e OR5A1 (SEQ ID NO:9). As caixas pretas representam nucleotídeos idênticos e motivos conservados nos cinco ORs diferentes. B.

Matriz de distância que mostra que o OR5A2 está mais próximo do OR5A1, um receptor ativado por beta-ionona, do que do OR5AN1 ou OR11A1, dois receptores conhecidos por responderem a algumas subfamílias de almíscar.

[083] Figura 3: A. Análise de resposta à concentração do OR da invenção (isto é, OR5A2 conforme definido no presente documento), OR5AN1, OR11A1 e OR5A1 com Beta-ionona, o ativador descrito de OR5A1. pEFIBRHO corresponde ao vetor vazio e é usado como controle. Os resultados indicam que Beta-ionona tem a capacidade de ativar apenas OR5A1. B. Análise de resposta à concentração do OR da invenção (isto é, OR5A2 conforme definido no presente documento), OR5AN1, OR11A1 e OR5A1 com etil-fenchol, o ativador descrito de OR11A1. pEFIBRHO corresponde ao vetor vazio e é usado como controle. Os resultados indicam que etil-fenchol tem a capacidade de ativar apenas OR11A1.

[084] Figura 4: BLASTP é usado para o alinhamento de sequências de polipeptídeos de OR5A2 variante_1 (SEQ ID NO:2) e OR5A2 variante 2 (SEQ ID NO:4). O alinhamento de sequências de proteínas mostra uma substituição de aminoácido (em negrito, sublinhada): prolina (P) é substituída por leucina (L) na posição 172.

[085] Figura 5: Análise de resposta à concentração do OR da invenção (isto é, OR5A2 variante_1), OR5A2 variante_2 e vetor vazio pEFIBRHO com diferentes ativadores correspondendo a seis almíscares diferentes representativos dos quatro grupos estruturalmente diversos de almíscares (Xileno de Almíscar, Serenolida, Galaxolide®, Velviona, Cashmeran, Cetona de Almíscar). Apenas OR5A2 variante_1 mostra curvas de resposta à dosagem ao almíscar diferente testado.

[086] Figura 6: A. ClustalW2 é usado para alinhamento de sequências de polipeptídeos de proteínas de OR5A2 variante_1 (OR5A2) (SEQ ID NO:2) e do OR5A2 quimérico_variante 1 (SEQ ID NO:2). As caixas pretas representam nucleotídeos idênticos e motivos conservados nos diferentes ORs. B. Análise de resposta à concentração do OR5A2 quimérico_variante 1 e do OR2A5 com diferentes ativadores correspondendo a seis almíscares diferentes representativos dos quatro grupos estruturalmente diversos de almíscares (Xileno de Almíscar, Serenolida, Galaxolide®, Velviona, Cashmeran, Cetona de Almíscar). Apenas o OR5A2 quimérico_variante 1 (painel esquerdo), mas não o OR2A5 (painel direito) mostra curvas de resposta à dosagem aos diferentes almíscares testados. C. Análise de resposta à concentração do OR5A2 quimérico_variante 1 com Beta-ionona e etil-fenchol, os ativadores descritos de OR5A1 e OR11A1.

pEFIBRHO corresponde ao vetor vazio e é usado como controle.

Os resultados indicam que Beta-ionona e etil-fenchol não têm a capacidade para ativar o OR5A2 quimérico_variante 1. O OR5A2 quimérico_variante 1 (consultar a SEQ ID NO:10) tem a mesma especificidade que o OR da invenção.

[087] Figura 7: Curvas de resposta à dosagem de (A) Ambreta de Almíscar e (B) Mosqueno nos receptores OR5A2, OR5A1, OR5AN1 e OR11A1.

[088] Figura 8: Curvas de resposta à dosagem de (A) Silcolida e (B) Serenolida nos receptores OR5A2, OR5A1, OR5AN1 e OR11A1.

[089] Figura 9: Curvas de resposta à dosagem de (A) Cashmeran, (B) Fixal e (C) Galaxolide® nos receptores OR5A2, OR5A1, OR5AN1 e OR11A1.

[090] Figura 10: Curvas de resposta à dosagem de (A) Brassilato de Etileno, (B) Ambretolida e (C) Cervolida nos receptores OR5A2, OR5A1, OR5AN1 e OR11A1.

Descrição Detalhada da Invenção Definições

[091] Conforme usado no presente documento, o termo “polipeptídeos de Receptor Olfativo (ORs)”, de modo geral, refere-se a polipeptídeos da família de receptores acoplados à proteína G principalmente expressos por neurônios olfativos. ORs podem ter a capacidade para interagir com moléculas de odorizante e transduzir o sinal de odorizante.

[092] Os termos “Receptor olfativo (OR) de acordo com a invenção” ou “polipeptídeos de Receptor Olfativo de acordo com a invenção” ou “OR da invenção” ou “receptor OR5A2 conforme definido no presente documento” ou “o dito polipeptídeo de OR” denotam o receptor olfativo família cinco subfamília A membro dois incluindo variantes de haplótipo, tais como, porém sem limitação, “OR5A2_variante_1” e “OR5A2_variante_2”, correspondendo às sequências de polipeptídeos referidas na “lista de sequências” SEQ ID NO:2 e 4, respectivamente, que têm a capacidade para serem ativadas pelo composto (ou compostos) de almíscar conforme definido no presente documento.

Os exemplos do receptor OR5A2 conforme definido no presente documento incluem, porém sem limitação, polipeptídeos que têm pelo menos 80%, pelo menos

85%, ou 86% de identidade de aminoácidos e, de preferência,

90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais, incluindo 100% de identidade de aminoácidos, com a sequência representada na

“lista de sequências” (SEQ ID NO:2) que mantém a capacidade para ser ativada pelo composto (ou compostos) de almíscar conforme definido no presente documento.

A dita homologia pode se referir ao polipeptídeo inteiro ou apenas parte do polipeptídeo, tal como o domínio de CDR (domínio de ligação de ligante do receptor). De acordo com Pilpel e Lancet

(Protein Science 8:969 a 977, 1999), o domínio de CDR de um

GPCR pode ser definido seguindo as indicações publicadas:

TM3-#4, TM3-#8, TM3-#11, TM3-#12, TM3-#15, TM4-#11, TM4-#15,

TM4-#19, TM4-#22, TM4-#23, TM4-#26, TM5-#3, TM5-#6, TM5-#7,

TM5-#10, TM5-#11 e TM5-#13, em que TMx indica a região transmembranar do dito receptor, e # indica a posição de aminoácido dentro da dita região.

Mais especificamente, os inventores identificaram a região que cobre TM2 a 7 do OR como sendo particularmente importante para a especificidade para compostos de almíscar conforme definido no presente documento. A dita região é definida pela SEQ ID NO:11. Um exemplo específico de uma variante que tem um alto grau de identidade com o polipeptídeo de OR5A2 da invenção é representado pela SEQ ID NO:4 e denotado como OR5A2_variante_2. O dito termo polipeptídeo de OR da invenção também abrange “polipeptídeos ou receptores quiméricos OR5A2” conforme definido no presente documento.

[093] Conforme usado no presente documento, o termo “polinucleotídeo de OR5A2” refere-se a um polinucleotídeo que codifica os polipeptídeos de OR5A2 conforme definido no presente documento. De preferência, o dito polinucleotídeo tem uma identidade de pelo menos 86% ou mais, de preferência, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais, incluindo 100% de identidade de ácidos nucleicos, com a sequência representada pela SEQ ID NO:1 (que codifica o OR5A2 variante 1) ou SEQ ID NO:3 (que codifica o OR5A2 variante 2).

[094] Conforme usado no presente documento, o termo “polipeptídeo ou receptor quimérico OR5A2” refere-se a um receptor que compreende a região central do receptor OR5A2, abrangendo os domínios transmembranares 2 a 7 definidos pela sequência de aminoácidos ID NO:11 ou uma sequência que tem pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência, incluindo 100% de identidade. Tais receptores quiméricos podem compreender adicionalmente a cadeia principal de um receptor acoplado à proteína G, mais preferencialmente, de um receptor olfativo. Mais particularmente, tal receptor quimérico OR5A2 compreende a região central TM2 a TM7 do receptor OR5A2 (SEQ ID NO:11), fundido em sua terminação N à porção química extracelular N- terminal, ao domínio transmembranar 1 e à alça intracelular 1, de um receptor acoplado à proteína G e fundido em sua terminação C à extremidade C-terminal intracelular de um receptor de proteína G. O dito receptor acoplado à proteína G é, de preferência, um receptor olfativo. Um exemplo particular de tal receptor quimérico OR5A2 é definido pela SEQ ID NO:10.

[095] Conforme usado no presente documento, o termo “ligação de OR” refere-se à ligação específica de uma molécula de odorizante por um polipeptídeo de OR conforme definido no presente documento. Os exemplos de moléculas de odorizante incluem, porém sem limitação, compostos de almíscar das quatro diferentes subfamílias: nitroalmíscares, almíscares macrocíclicos, almíscares lineares, almíscares policíclicos.

[096] Conforme usado no presente documento, o termo “atividade de sinalização de OR” refere-se à iniciação ou propagação da sinalização por um polipeptídeo de OR conforme definido no presente documento. A atividade de sinalização de OR é monitorada medindo-se uma etapa detectável em uma cascata de sinalização analisando-se um ou mais dos seguintes: estimulação de GDP para troca de GTP em uma proteína G e mais particularmente G-olf; alteração da atividade de adenilato ciclase; modulação da proteína quinase C; modulação da proteína quinase A; quebra de fosfatidilinositol (gerando segundos mensageiros diacilglicerol e trifosfato de inositol); fluxo de cálcio intracelular; ativação de MAP quinases; modulação de tirosina quinases; ensaio de internalização; modulação de gene ou atividade de gene-repórter; ou ensaio de melanóforo.

Uma etapa detectável em uma cascata de sinalização é considerada iniciada ou mediada se a atividade mensurável é alterada em 10% ou mais acima ou abaixo de uma linha de base estabelecida na ausência substancial de um composto de almíscar em relação a qualquer um dos ensaios de atividade de OR descritos no presente documento. A atividade mensurável pode ser medida diretamente, como, por exemplo, na medição de níveis de cAMP ou diacilglicerol. Alternativamente, a atividade mensurável pode ser indiretamente medida, como, por exemplo, em um ensaio de gene-repórter. Para a maioria desses ensaios, kits estão comercialmente disponíveis.

[097] Conforme usado no presente documento, o termo “composto (ou compostos) de almíscar” refere-se a um ou mais compostos que têm uma descrição organoléptica reminiscente do cheiro da substância de forte cheiro secretada pelo cervo almiscarado macho. Os ditos compostos são uma classe de substâncias fragrantes que poderiam ser usadas como notas de base na perfumaria.

[098] De preferência, os compostos de almíscar conforme definido no presente documento abrangem compostos de almíscar sintéticos ou compostos de almíscar naturais ou compostos de almíscar comercialmente ou ainda não comercialmente disponíveis dentro ou não dos quatro grupos estruturalmente diversos dos seguintes produtos químicos: nitroalmíscares, almíscares policíclicos, almíscares macrocíclicos e almíscares lineares/alicíclicos.

[099] Mais preferencialmente, os compostos de almíscar conforme definido no presente documento abrangem compostos de almíscar sintéticos ou compostos de almíscar naturais ou compostos de almíscar comercialmente ou ainda não comercialmente disponíveis dentro dos quatro grupos estruturalmente diversos dos seguintes produtos químicos: nitroalmíscares, almíscares policíclicos, almíscares macrocíclicos e almíscares lineares/alicíclicos.

[100] Conforme usado no presente documento, os “nitroalmíscares” pertencem aos derivados de nitrofenila.

Preferencialmente, nitroalmíscares referem-se, de modo geral, aos cinco compostos fragrantes mais comercialmente relevantes: cetona de almíscar (4-terc-butil-2,6-dimetil- 3,5-dinitroacetofenona), ambreta de almíscar (2,6-dinitro- 3-metoxi-4-terc-butiltolueno), mosqueno de almíscar

(1,1,3,3,5-pentametil-4,6-dinitro-2H-indeno), tibetano de almíscar (1-terc-butil-3,4,5-trimetil-2,6-dinitrobenzeno) e xileno de almíscar (1-terc-butil-3,5-dimetil-2,4,6- trinitrobenzeno). Mais preferencialmente, nitroalmíscares referem-se à cetona de almíscar (4-terc-butil-2,6-dimetil- 3,5-dinitroacetofenona), ambreta de almíscar (2,6-dinitro- 3-metoxi-4-terc-butiltolueno), mosqueno de almíscar (1,1,3,3,5-pentametil-4,6-dinitro-2H-indeno) e xilol de almíscar (1-terc-butil-3,5-dimetil-2,4,6-trinitrobenzeno).

[101] Conforme usado no presente documento, os “almíscares policíclicos” são formados por uma estrutura de núcleo bicíclica, tal como tipo indano ou tetralina, que é substituída por uma combinação de um grupo acetila ou um anel de pirano em combinação com grupos metila, isopropila e/ou t-butila. De preferência, almíscares policíclicos referem-se à crisolida, tonalide®, fantolida, cashmeran, galaxolide®, traseolida, moxalona, vernolida e fixal.

[102] Conforme usado no presente documento, o termo “almíscares macrocíclicos” possui pelo menos um anel único composto de mais do que 6 carbonos (frequentemente 10 a 15).

De preferência, almíscares macrocíclicos referem-se a brassilato de etileno, tibetolida, também conhecida como exaltolida, 1,16-hexadecalactona, exaltenona, globanona, também conhecida como anialmíscar, almíscar R1, velviona, ciclopentadecanona, muscona, civetona, almíscar MC4,

cervolida, ω-6-hexadecenlactona, nirvanolida, isoambretolida, habanolida, almíscar 77 e oxalida T.

[103] Conforme usado no presente documento, os “almíscares lineares/alicíclicos” conhecidos de outro modo como éster cicloalquílico são uma classe de compostos de almíscar com uma estrutura correspondendo a ésteres alquílicos modificados. De preferência, almíscares lineares referem-se a almíscar de proprionato de ciclopentanila, serenolida, silcolida e helvetolida.

[104] Um “intensificador” conforme definido no presente documento é uma molécula que modula ou intensifica a percepção de um odor produzido por uma ou mais moléculas de odorizante. Um intensificador pode atuar interagindo-se com um OR que transduz o dito ou interagindo-se com o ligante natural para o receptor. Um “intensificador” da invenção pode aumentar a resposta intracelular induzida por um agonista, por exemplo, um almíscar presente em um perfume, em pelo menos 10%, de preferência, 15 a 25%, mais preferencialmente, 25 a 50% e, com a maior preferência, 50 a 100%. Um intensificador, útil de acordo com a presente invenção, inclui, porém sem limitação, moléculas pequenas, aptâmero, fotoaptâmero, ligante natural modificado, etc. que se liga especificamente a pelo menos uma porção de um OR que é exigido para a transdução de sinal através de compostos de almíscar (tais como o sítio de ligação de ligante). De preferência, o agente ativador é volátil ou pode ser tornado volátil em combinação com solventes ou aditivos apropriados.

[105] Conforme usado no presente documento, um “agonista” é um ligante que se liga a um receptor e imita a resposta intracelular induzida por um ligante natural ou outro agonista de identificação, por exemplo, um novo composto presente na biblioteca.

[106] Conforme usado no presente documento, um “modulador” refere-se a um composto que aumenta ou diminui a expressão de superfície celular de um receptor da invenção, aumenta ou diminui a ligação de um ligante ao OR5A2 conforme definido no presente documento ou qualquer composto que aumenta ou diminui a resposta intracelular iniciada por uma forma ativa do OR5A2 conforme definido no presente documento, ou na presença ou na ausência de um ligante para o receptor, por exemplo, um composto de almíscar presente em um perfume.

Um modulador inclui um agonista, ou intensificador, conforme definido no presente documento. Um modulador pode ser, por exemplo, uma molécula pequena, um polipeptídeo, um peptídeo, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, um lipídio, um carboidrato, um ácido nucleico, um aptâmero, um fotoaptâmero ou um composto químico pequeno ou molécula orgânica pequena. Moduladores candidatos podem ser compostos naturais ou sintéticos, incluindo, por exemplo, moléculas pequenas sintéticas, compostos contidos em extratos de animal, planta, células bacterianas ou fúngicas, assim como meio condicionado a partir de tais células.

[107] Conforme usado no presente documento, os termos “aumento” e “diminuição” referem-se a uma alteração na quantidade de ligação de ligante ao OR5A2 conforme definido no presente documento e/ou célula sinalizando através de ORs da invenção em pelo menos 10%. Um “aumento” ou “diminuição” na ligação ou sinalização é, de preferência, medida em resposta ao contato do OR5A2 conforme definido no presente documento com um ligante na presença de um modulador candidato, em que a alteração na ligação ou sinalização é relativa à ligação ou sinalização na ausência do modulador candidato.

[108] Conforme usado no presente documento, o termo “molécula pequena” refere-se a um composto que tem uma massa molecular menor do que 3.000 Daltons, de preferência, menor do que 2.000 ou 1.500, ainda mais preferencialmente, menor do que 1000 e, com a maior preferência, menor do que 600 Daltons. Uma “molécula orgânica pequena” é uma molécula pequena que compreende carbono.

[109] Conforme usado no presente documento, os termos “alteração”, “diferença”, “diminuição” ou “aumento” conforme aplicado, por exemplo, à atividade de sinalização ou ligação ou quantidade de uma substância referem-se a um aumento ou diminuição de pelo menos 10% na ligação, atividade de sinalização ou, por exemplo, nível de mRNA, polipeptídeo ou ligante em relação a um padrão em um determinado ensaio.

[110] Conforme usado no presente documento, o termo “condições que permitem a ligação do composto de almíscar ao OR5A2 conforme definido no presente documento” refere-se a condições de, por exemplo, temperatura, concentração de sal, pH e concentração de proteína sob as quais o dito OR se liga a um composto de almíscar. As condições de ligação exatas dependerão da natureza do ensaio, por exemplo, se o ensaio usa células viáveis ou apenas uma fração de membrana das células.

[111] Conforme usado no presente documento, o termo “agente” refere-se a moléculas selecionadas a partir do grupo que compreende: um peptídeo, um polipeptídeo, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, um lipídio, um carboidrato, um ácido nucleico e uma molécula orgânica pequena.

[112] Conforme usado no presente documento, o termo “amostra” refere-se à fonte de moléculas que são testadas quanto à presença de um agente ou composto modulador que modula a ligação a ou atividade de sinalização do OR5A2 conforme definido no presente documento. Uma amostra pode ser uma amostra ambiental, um extrato natural de animal, planta, células de levedura ou bacterianas, uma amostra clínica, uma amostra sintética ou um meio condicionado de células recombinantes ou de um processo de fermentação.

[113] Conforme usado no presente documento, o termo “fração de membrana” refere-se a uma preparação de membranas de lipídio celulares contendo o OR5A2 conforme definido no presente documento. Como o termo é usado no presente documento, uma “fração de membrana” é distinta de um homogenato celular, em que pelo menos uma porção (isto é, pelo menos 10% e, de preferência, mais) de constituintes celulares associados a não membrana foi removida. O termo “associado à membrana” refere-se àqueles constituintes celulares que são integrados a uma membrana de lipídio ou são fisicamente associados a um componente que é integrado a uma membrana de lipídio.

[114] Conforme usado no presente documento, o termo “segundo ensaio de mensageiro”, de preferência, compreende a medição da ligação ou troca do nucleotídeo guanina, adenilato ciclase, cAMP intracelular, fosfato de inositol intracelular, concentração de diacilglicerol intracelular, concentração de ácido araquidônico, MAP quinase (ou quinases) ou tirosina quinase (ou quinases), atividade da proteína quinase C ou expressão de gene-repórter ou um ensaio à base de aequorina de acordo com os métodos conhecidos na técnica e definidos no presente documento.

[115] Conforme usado no presente documento, o termo “segundo mensageiro” refere-se a uma molécula, gerada ou feita variar em concentração pela ativação de um Receptor Acoplado à Proteína G que participa na transdução de um sinal do GPCR. Os exemplos não limitantes de segundos mensageiros incluem cAMP, diacilglicerol, trifosfato de inositol, liberação de ácido araquidônico, trifosfato de inositol e cálcio intracelular. O termo “alteração no nível de um segundo mensageiro” refere-se a um aumento ou uma diminuição de pelo menos 10% no nível detectado de um determinado segundo mensageiro em relação à quantidade detectada em um ensaio realizado na ausência de um modulador candidato.

[116] Conforme usado no presente documento, o termo “ensaio à base de aequorina” refere-se a um ensaio para atividade de GPCR que mede o fluxo de cálcio intracelular induzido por GPCRs ativados, em que o fluxo de cálcio intracelular é medido pela luminescência de aequorina expressa na célula.

[117] Conforme usado no presente documento, o termo “ligação” refere-se à associação física de uma molécula (por exemplo, um ligante, tal como um composto de almíscar ou um anticorpo) com um receptor (por exemplo, os OR5A2s da invenção conforme definido no presente documento). Como o termo é usado no presente documento, a ligação é “específica” se a mesma ocorrer com uma EC50 ou uma Kd de 1 mM ou menos, geralmente na faixa de 1 mM a 10 nM, por exemplo, a ligação é específica se a EC50 ou Kd for 1 mM, 500 µM, 100 µM, 10 µM,

9,5 µM, 9 µM, 8,5 µM, 8 µM, 7,5 µM, 7 µM, 6,5 µM, 6 µM, 5,5 µM, 5 µM, 4,5 µM, 4 µM, 3,5 µM, 3 µM, 2,5 µM, 2 µM, 1,5 µM, 1 µM, 750 nM, 500 nM, 250 nM ou 100 nM ou menos.

[118] Conforme usado no presente documento, o termo “EC50” refere-se a essa concentração de um composto no qual uma determinada atividade, incluindo a ligação de um composto de almíscar ou outro ligante e uma atividade funcional de um OR, é 50% do máximo para essa atividade de OR mensurável com o uso do mesmo ensaio na ausência do composto. Dito de modo diferente, a “EC50” é a concentração do composto que gera ativação de 50%, quando ativação de 100% é definida na quantidade de atividade que não aumenta com a adição de mais agonista.

[119] Conforme usado no presente documento, o termo “saturação” refere-se à concentração de um composto de almíscar em que aumentos adicionais na concentração de ligante falham em aumentar a ligação de ligante ou atividade de sinalização específica para OR.

[120] Conforme usado no presente documento, o termo “aumento na ligação” refere-se a um aumento de pelo menos 10% na quantidade de ligação de ligante detectada em um determinado ensaio com um modulador conhecido ou suspeito do OR5A2 conforme definido no presente documento em relação à ligação detectada em um ensaio que não tem o modulador conhecido ou suspeito.

[121] Conforme usado no presente documento, o termo “receptor acoplado à proteína G” ou “GPCR” refere-se a um polipeptídeo associado à membrana com 7 domínios transmembranares helicoidais alfa. GPCR’s funcionais se associam a um ligante ou agonista e também se associam a e ativam proteínas G. O OR5A2 conforme definido no presente documento pertence à família de GPCRs.

[122] Conforme usado no presente documento, o termo “anticorpo” é a molécula de imunoglobulina convencional, assim como fragmentos da mesma que são especificamente reativos com um dos polipeptídeos em questão. Os anticorpos podem ser fragmentados com o uso de técnicas convencionais e os fragmentos triados quanto à sua utilidade da mesma maneira conforme descrito no presente documento abaixo para anticorpos inteiros. Por exemplo, os fragmentos F(ab)2 podem ser gerados pelo tratamento do anticorpo com pepsina. O fragmento F(ab)2 resultante pode ser tratado para reduzir pontes de dissulfeto para produzir fragmentos Fab. O anticorpo da presente invenção é adicionalmente destinado a incluir moléculas biespecíficas, de cadeia única e quiméricas e humanizadas que têm afinidade para um polipeptídeo conferida por pelo menos uma região CDR do anticorpo. Nas modalidades preferenciais, o anticorpo compreende adicionalmente uma marcação ligada ao mesmo e com a capacidade para ser detectada, (por exemplo, a marcação pode ser um radioisótopo, composto fluorescente, composto quemiluminescente, enzima ou cofator de enzima). Os anticorpos, monoclonais ou policlonais e uma porção hipervariável dos mesmos (FAB, FAB’’, etc.) assim como a célula de hibridoma que produz os anticorpos são um aspecto adicional da presente invenção que encontram uma aplicação industrial específica no campo de diagnósticos e monitoramento de doenças específicas, de preferência, aquelas descritas posteriormente. Os inibidores de acordo com a invenção incluem, porém sem limitação, anticorpos monoclonais ou policlonais marcados ou porções hipervariáveis dos anticorpos.

[123] Conforme usado no presente documento, o termo “atividade constitutiva de OR” refere-se a uma atividade mensurável de um receptor olfativo expresso em uma célula que ocorre espontaneamente sem a adição de um ligante ao dito receptor olfativo.

[124] A invenção refere-se à constatação de que um ou mais compostos de almíscar têm a capacidade para ativar o receptor olfativo OR5A2 específico presente no epitélio nasal humano, chamado de polipeptídeo de OR5A2 conforme definido no presente documento. A interação de OR5A2/composto (ou compostos) de almíscar é útil para ensaios de triagem para agentes que modulam tal interação e, assim, a função do OR5A2. Essa interação de OR5A2/composto (ou compostos) de almíscar também fornece a identificação de moduladores, novos agonistas que poderiam de interesse na indústria. Inesperadamente, o receptor olfativo OR5A2 é o único OR que pode ser ativado por todas as classes conhecidas de compostos de almíscar conforme definido no presente documento.

Ensaios para a Identificação de Agentes que Modulam a Atividade de ORs

[125] Os agentes que modulam a atividade de ORs podem ser identificados de vários modos que podem tirar vantagem da interação dos ditos receptores com compostos de almíscar. Por exemplo, a capacidade para reconstituir a ligação de OR5A2/composto (ou compostos) de almíscar ou in vitro, em células cultivadas, ou in vivo fornece um alvo para a identificação de agentes que modulam essa ligação. Os moduladores da ligação de OR/almíscares podem, então, ser triados com o uso de um ensaio de ligação ou um ensaio funcional que mede a sinalização a jusante através do dito receptor. Tanto os ensaios de ligação quanto os ensaios funcionais são validados com o uso de compostos de almíscar.

[126] Outra abordagem que usa a interação de OR5A2/composto (ou compostos) de almíscar mais diretamente para identificar agentes que modulam a função de OR5A2 mede as alterações da sinalização a jusante de OR5A2 induzida por agentes candidatos ou moduladores candidatos. Esses ensaios funcionais podem ser realizados em frações de membrana celular isoladas ou em células que expressam o receptor em suas superfícies.

[127] A descrição a seguir fornece os métodos para ensaios funcionais e de ligação com base na interação de OR5A2 e um ou mais compostos de almíscar.

[128] A. Polipeptídeos de OR.

[129] • Ensaios que usam a interação do polipeptídeo de OR e compostos de almíscar conforme definido no presente documento exigem uma fonte de polipeptídeo de OR. O polinucleotídeo e as sequências de polipeptídeos de ORs humanos são apresentados no presente documento na “lista de sequências”. O OR5A2 humano está também disponível nos números de acesso ao banco de dados GenBank NM_ 001001954.1 (SEQ ID N°1), NM_001001954.1.1:c.515C>T (SEQ ID N°3). As sequências de polipeptídeos são também registradas nos números de acesso Q8NGI9, VAR_024097, respectivamente, no banco de dados Uniprot.

[130] Os especialistas no assunto podem amplificar prontamente uma sequência de OR a partir de uma amostra contendo mRNA que codifica a proteína através de técnicas de clonagem molecular e PCR básicas com o uso de iniciadores ou sondas projetadas a partir das sequências conhecidas.

Também, já que os genes de OR são genes sem íntron, especialistas no assunto podem amplificar uma sequência de

OR a partir do DNA genômico.

[131] A expressão de polipeptídeos recombinantes é bem conhecida na técnica. Os especialistas no assunto podem selecionar prontamente vetores e sequências de controle de expressão para a expressão de polipeptídeos de OR de acordo com a invenção em células eucarióticas ou procarióticas. Os polipeptídeos de OR estão, de preferência, associados à membrana celular ou lipossomas sintéticos a fim de ter função de sinalização ou ligação. Os métodos para a preparação de frações de membrana celular são bem conhecidos na técnica, por exemplo, o método relatado por Hubbard & Cohn, 1975, J.

Cell Biol. 64: 461 a 479, que está incorporado ao presente documento a título de referência. A fim de produzir membranas que compreendem polipeptídeos de OR, pode-se, por exemplo, aplicar tais técnicas de isolamento de membrana a células que expressam endógena ou recombinantemente um dos polipeptídeos de OR da invenção. Alternativamente, os polipeptídeos de OR podem ser integrados às preparações de membrana pela diluição de solução detergente do polipeptídeo (consultar, por exemplo, Salamon et al., 1996, Biophys. J.

71:283 a 294, que está incorporado ao presente documento a título de referência).

B. Compostos de Almíscar.

[132] A estrutura de moléculas de almíscar sé bem conhecida por especialistas no assunto. Adicionalmente, os especialistas no assunto podem derivar facilmente almíscar equivalente da dita estrutura e podem testar facilmente se os ditos equivalentes têm a capacidade para ligar e/ou modular o polipeptídeo de OR5A2 conforme definido no presente documento. Os compostos de almíscar podem ser isolados de amostras naturais ou quimicamente sintetizados.

[133] Os métodos que podem ser usados para quantificar os ditos compostos podem ser, porém sem limitação, a) para extração e purificação: extração de solvente, extração de óleo, extração de vapor, extração supercrítica de CO2, cromatografia líquida, destilação, cromatografia gasosa; b) para quantificação: cromatografia gasosa, cromatografia líquida e espectrometria de massa. Os ditos métodos são bem conhecidos na técnica.

[134] Os compostos de almíscar podem ser usados em forma purificada ou usado como composições. As quantidades do almíscar necessárias em um determinado ensaio funcional ou de ligação de acordo com a invenção variarão dependendo do ensaio. Se necessário para um determinado ensaio, um composto de almíscar pode ser marcado pela incorporação ou adição de marcações radioativas conforme apontado acima.

C. Ensaios para Identificar Moduladores da Atividade de ORs

[135] A revelação de que os compostos de almíscar dos quatro grupos de produtos químicos estruturalmente diversos atualmente conhecidos são ligantes do OR5A2 conforme definido no presente documento, pertencendo à família de receptor olfativo de classe 2 permite o desenvolvimento de ensaios de triagem para identificar agonistas e moduladores da dita atividade de OR’s. Os ensaios de triagem terão duas abordagens gerais.

[136] 1) Ensaios de ligação de ligante, em que as células que expressam o dito OR5A2, extratos de membra de tais células ou membranas de lipídio imobilizadas que compreende o dito OR5A2 são expostas a um ou mais compostos de almíscar marcados conforme definido no presente documento, conhecidos por ligar o dito OR5A2 e um composto candidato. Após a incubação, a mistura de reação é medida para a ligação específica do composto (ou compostos) de almíscar marcado ao dito OR5A2. Os compostos que interferem com ou deslocam o composto (ou compostos) de almíscar marcado do OR5A2 podem ser identificados como moduladores, de preferência, intensificador da atividade de OR5A2. A análise funcional pode ser realizada em compostos positivos para determinar em qual dessas categorias os mesmos se encaixam.

[137] A ligação de um composto pode ser classificada em 3 categorias principais: ligação competitiva, ligação não competitiva e ligação incompetitiva. Um composto de ligação competitiva se assemelha a um segundo composto (de referência) e se liga ao mesmo bolso de ligação de uma molécula-alvo (aqui, receptor). Mediante a adição, o composto de ligação competitiva desloca o dito segundo composto do dito alvo. Um composto de ligação não competitiva não se liga ao mesmo bolso de ligação da molécula-alvo como um segundo composto (de referência), mas pode interagir com o efeito do dito segundo composto na dita molécula-alvo. O segundo composto não é deslocado mediante a adição do composto de ligação não competitiva. Um composto de ligação incompetitiva se liga à molécula-alvo quando um segundo composto já está ligado. Ligação cooperativa significa que um composto facilita a ligação de outro composto que pode ser um composto de referência. O efeito cooperativo é, assim, visto na análise da Kd do dito outro composto.

[138] 2) Ensaios funcionais, em que uma atividade de sinalização de OR5A2 conforme definido no presente documento é medida.

[139] Para a triagem de agonista, as células que expressam o dito OR5A2 ou membranas preparadas a partir das mesmas são incubadas com um composto candidato, e uma atividade de sinalização do dito OR5A2 é medida. Os ensaios são validados com o uso de um ou mais compostos de almíscar conforme definido no presente documento, como agonista (ou agonistas), e a atividade induzida por compostos que modulam a atividade de receptor é comparada a esta induzida pelo composto (ou compostos) de almíscar. Um agonista ou agonista parcial terá uma atividade biológica máxima que corresponde a pelo menos 10% da atividade máxima do composto (ou compostos) de almíscar quando o agonista ou agonista parcial está presente a 100 µM ou menos e, de preferência, terá 50%, 75%, 100% ou mais, incluindo 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes ou mais atividade do que o composto (ou compostos) de almíscar.

Ensaios de Deslocamento e Ligação de Ligante:

[140] Pode-se usar o polipeptídeo de OR5A2 conforme definido no presente documento expresso em uma célula, ou membranas isoladas contendo tal polipeptídeo de OR5A2, juntamente com um ou mais compostos de almíscar conforme definido no presente documento a fim de triar por compostos que intensificam a ligação de compostos de almíscar a polipeptídeos de OR. Quando identificados em um ensaio que mede a ligação ou o deslocamento composto de almíscar apenas, os compostos terão que ser submetidos a um teste funcional para determinar se os mesmos atuam como agonistas, antagonistas ou agonistas inversos.

[141] Para experimentos de deslocamento, as células que expressam o dito polipeptídeo de OR5A2 (geralmente 25.000 células por ensaio ou 1 a 100 µg de extratos de membrana) são incubadas em tampão de ligação (por exemplo, Hepes 50 mM pH 7,4; CaCl2 1 mM; Albumina Sérica Bovina 0,5% (BSA) Isenta de Ácido Graxo; e MgCl 2 0,5 mM) por 1,5 h (a, por exemplo, 27 °C) com o composto de almíscar marcado na presença ou na ausência de concentrações crescentes de um modulador candidato. Para validar e calibrar o ensaio, reações de competição com o uso de concentrações crescentes de almíscar não marcado podem ser realizadas. Após a incubação, as células são lavadas extensivamente, e o composto de almíscar marcado ligado é medido conforme apropriado para a determinada marcação (por exemplo, contagem de cintilação, ensaio de enzima, fluorescência, etc.). Uma diminuição de pelo menos 10% na quantidade de composto de almíscar marcado ligado na presença do modulador candidato indica o deslocamento da ligação pelo modulador candidato. Considera- se que os moduladores candidatos se ligam especificamente nesses ou em outros ensaios descritos no presente documento se os mesmos deslocarem 50% do composto de almíscar marcado.

[142] Alternativamente, ligação ou deslocamento da ligação pode ser monitorado por ressonância plasmônica de superfície (SPR). Ensaios de ressonância plasmônica de superfície podem ser usados como um método quantitativa para medir a ligação entre duas moléculas pela alteração na massa próxima a um sensor imobilizado causado pela ligação ou perda de ligação do composto de almíscar da fase aquosa ao dito polipeptídeo de OR5A2 imobilizado em uma membrana no sensor.

Essa alteração na massa é medida como unidades de ressonância versus tempo após a injeção ou remoção do almíscar ou modulador candidato e é medida com o uso de um Biossensor

Biacore (Biacore AB). Os polipeptídeos de OR5A2 conforme definido no presente documento podem ser imobilizados em um chip de sensor (por exemplo, chip CM5 de grau de pesquisa; Biacore AB) em uma membrana de lipídio de filme fino de acordo com os métodos descritos por Salamon et al. (Salamon et al., 1996, Biophys J. 71: 283 a 294; Salamon et al., 2001, Biophys. J. 80: 1.557 a 1.567; Salamon et al., 1999, Trends Biochem. Sci. 24: 213 a 219, cada um dos quais está incorporado ao presente documento a título de referência).

Sarrio et al. demonstraram que SPR pode ser usado para detectar a ligação de ligante ao receptor de adenosina GPCR A(1) imobilizado em uma camada de lipídio no chip (Sarrio et al., 2000, Mol. Cell. Biol. 20: 5.164 a 5.174, incorporado ao presente documento a título de referência). As condições para a ligação de almíscar ao dito OR5A2 em um ensaio de SPR podem ser submetidas a ajuste fino por especialistas no assunto com o uso das condições relatadas por Sarrio et al.

como um ponto de partida.

[143] SPR pode avaliar moduladores da ligação em pelo menos dois modos. Primeiro, um ou mais compostos de almíscar conforme definido no presente documento podem ser pré-ligados ao polipeptídeo de OR5A2 imobilizado conforme definido no presente documento, seguido pela injeção do modulador candidato a uma taxa de fluxo de aproximadamente 10 µl/min e uma concentração na faixa de 1 nM a 1.000 µM, de preferência, cerca de 100 µM. O deslocamento do composto (ou compostos) de almíscar ligado pode ser quantificado, permitindo a detecção da ligação de modulador.

Alternativamente, o composto (ou compostos) de almíscar ligado à membrana pode ser pré-incubado com um modulador candidato e desafiado com o composto (ou compostos) de almíscar. Uma diferença na ligação de almíscar ao dito OR5A2 exposta ao modulador em relação a esta em um chip não pré- exposto ao modulador demonstrará a ligação. Em qualquer um dos ensaios, uma diminuição de 10% ou mais na quantidade de composto (ou compostos) de almíscar ligado na presença do modulador candidato, em relação à quantidade do composto (ou compostos) de almíscar ligado na ausência do modulador candidato indica que o modulador candidato inibe a interação do dito OR5A2 e do dito composto (ou compostos) de almíscar.

Um sistema Biacore pode ser plugado a um sistema que identifica o modulador candidato, tal como espectrometria de massa ou cromatografia gasosa.

[144] Outro método para medir a inibição da ligação de compostos de almíscar conforme definido no presente documento ao receptor OR5A2 conforme definido no presente documento usa transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET). FRET é um fenômeno mecânico quântico que ocorre entre um doador de fluorescência (D) e um aceitante de fluorescência (A) em proximidade estreita um ao outro (usualmente < 100 A de separação) se o espectro de emissão de D sobrepuser o espectro de excitação de A. As moléculas a serem testadas, por exemplo, um ou mais compostos de almíscar e um polipeptídeo de OR5A2, são marcadas com um par complementar de fluoróforos doador e aceitante. Embora próximos um ao outro devido à interação de OR5A2/composto (ou compostos) de almíscar, a fluorescência emitida mediante a excitação do fluoróforo doador terá um comprimento de onda diferente desta emitida em resposta ao comprimento de onda de excitação quando as moléculas não são ligadas, permitindo, assim, a quantificação de polipeptídeos ligados versus não ligados pela medição da intensidade de emissão em cada comprimento de onda. Os pares de doador/aceitante de fluoróforos com os quais se marca as moléculas-alvo são bem conhecidos na técnica.

[145] Uma variação em FRET usa terminação brusca de fluorescência para monitorar as interações moleculares. Uma molécula no par interativo pode ser marcada com um fluoróforo, e a outra com uma molécula que termina bruscamente a fluorescência do fluoróforo quando colocada em aposição próxima com o mesmo. Uma alteração na fluorescência mediante excitação é indicativa de uma alteração na associação das moléculas etiquetadas com o fluoróforo: par de terminação brusca. Geralmente, um aumento na fluorescência do polipeptídeo de OR5A2 marcado é indicativo de que composto (ou compostos) de almíscar que porta a terminação brusca foi deslocado. Para ensaios de terminação brusca, um aumento de 10% ou mais na intensidade de emissão fluorescente em amostras contendo um modulador candidato, em relação às amostras sem o modulador candidato, indica que o modulador candidato inibe a interação de OR5A2/ composto (ou compostos) de almíscar.

[146] A Transferência de Energia de Ressonância de Bioluminescência (BRET) é um sistema para monitorar as interações intermoleculares in vivo. O ensaio é baseado na transferência de energia não radioativa entre proteínas de fusão contendo Renila luciferase (Rluc) e, por exemplo, Proteína Amarela Fluorescente (YPF) ou Proteína Verde Fluorescente (GFP). O sinal de BRET é gerado pela oxidação de um substrato derivado de coelenterazina. O dito sistema pode aplicar um substrato derivado de coelenterazina não tóxico permeável à célula DeepBlueCTM (DBC) e um mutante da Proteína Verde Fluorescente (GFP) como aceitante. Quando o doador e o aceitante estão em proximidade estreita, a energia resultante da degradação catalítica do DBC é transferida de Rluc para GFP que emitirá, então, fluorescência em seu comprimento de onda característico. Esse método permite uma distância entre as duas moléculas testadas e é independente de ângulo de fluoróforo.

[147] Adicionalmente aos métodos de ressonância plasmônica de superfície, FRET e BRET, a medição de polarização de fluorescência é útil para a quantificação da ligação de almíscar/receptor. O valor de polarização de fluorescência para uma molécula fluorescentemente etiquetada no tempo de correlação rotacional ou taxa de revolução. Os complexos de proteína, tais como aqueles formados por um OR5A2 que se associa a um ou mais composto (ou compostos) de almíscar fluorescentemente marcado, têm valores de polarização mais altos do que o composto (ou compostos) de almíscar marcado não complexado. A inclusão de um modulador candidato da interação de OR5A2/composto (ou compostos) de almíscar resulta em um aumento (ativador) ou uma diminuição (inibidor) na polarização de fluorescência, em relação a uma mistura sem o modulador candidato, por exemplo, se o inibidor candidato romper ou inibir a interação do OR5A2 com o composto (ou compostos) de almíscar. A polarização de fluorescência é bem adequada para a identificação de moléculas pequenas que rompem a formação de complexos de polipeptídeos ou proteínas. Uma modulação de 10% ou mais na polarização de fluorescência em amostras contendo um modulador candidato, em relação à polarização de fluorescência em uma amostra que não tem o modulador candidato, indica que o modulador candidato modula a interação de OR5A2/composto (ou compostos) de almíscar.

[148] Outra alternativa para monitorar interações de OR5A2/composto (ou compostos) de almíscar usa um ensaio de biossensor. Biossensores ICS foram descritos por AMBRI (Australian Membrane Biotechnology Research Institute; http//www.ambri.com.au/). Nessa tecnologia, a associação de moléculas, tais como um OR e um composto de almíscar, é acoplada ao fechamento de canais de íons facilitados por gramacidina em bicamadas de membrana suspensas e, assim, a uma alteração mensurável na admitância (similar à impedância) desse biossensor. Essa abordagem é linear ao longo de seis ordens de magnitude de alteração de admitância e é idealmente adequada para triagem de alto rendimento em grande escala de bibliotecas combinatórias de moléculas pequenas. Uma alteração de 10% ou mais (aumento ou diminuição) na admitância em uma amostra contendo um modulador candidato, em relação à admitância de uma amostra que não tem o modulador candidato, indica que o modulador candidato impacta a interação de OR5A2 e composto (ou compostos) de almíscar.

[149] É importante notar que, em ensaios da interação de ácido-proteína, é possível que um modulador da interação não precise necessariamente interagir diretamente com o domínio (ou domínios) das proteínas que interagem fisicamente. É também possível que um modulador interaja em uma localização removida do sítio de interação de ácido- proteína e cause, por exemplo, uma alteração conformacional nos polipeptídeos de OR5A2. Moduladores (inibidores ou agonistas) que atuam dessa maneira são, no entanto, de interesse como agentes para modular a atividade de OR5A2.

[150] Qualquer um dos ensaios de ligação descritos pode ser usado para determinar a presença de um agente em uma amostra, por exemplo, uma amostra de tecido, que se liga ao polipeptídeo de OR5A2 conforme definido no presente documento, ou que afeta a ligação de um ou mais compostos de almíscar ao dito OR5A2. Para fazer isso, os polipeptídeos de OR5A2 são reagidos com um ou mais compostos de almíscar ou outro ligante na presença ou na ausência da amostra, e a dita ligação de composto (ou compostos) de almíscar ou ligante é medida conforme for apropriado para o ensaio de ligação sendo usado. Uma modulação de 10% ou mais na ligação do dito composto (ou compostos) de almíscar ou outro ligante indica que a amostra contém um agente que modula a ligação de composto de almíscar ou ligante aos polipeptídeo de OR5A2.

Chips de Proteínas

[151] Os métodos conforme definido no presente documento podem ser aplicados em chips de proteína. O dito chip de proteína pode ser, porém sem limitação, uma lâmina de vidro ou uma membrana de nitrocelulose. Os métodos baseados em arranjo para chips de proteína são bem conhecidos na técnica. Os arranjos de proteína, de preferência, compreendem um ou mais polipeptídeos de OR5A2 conforme definido no presente documento ou fragmentos dos mesmos que são responsáveis pela ligação com composto de almíscar, tais como a região central TM 2 a 7 do dito polipeptídeo de OR.

O chip de proteína compreende, de preferência, todos os polipeptídeos de OR5A2 variantes ou polipeptídeos quiméricos conforme definido no presente documento ou fragmentos dos mesmos que são responsáveis pela ligação com o composto (ou compostos) de almíscar.

Ensaios Funcionais da Atividade de Receptor

[152] Uma lista não exaustiva de ensaios funcionais é detalhada nessa seção: I. Ensaios de Ligação de GTPase/GTP:

[153] Para GPCRs, tais como polipeptídeos de OR, uma medição da atividade de receptor é a ligação de GTP por membranas celulares contendo receptores. No método descrito por Traynor e Nahorski, 1995, Mol. Pharmacol. 47: 848 a 854, incorporado ao presente documento a título de referência, mede-se essencialmente o acoplamento de proteína G a membranas medindo-se a ligação de GTP marcado à membrana.

Para ensaios de ligação a GTP, membranas isoladas de células que expressam o receptor são incubadas em um tampão contendo geralmente HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM e MgCl2 10 mM, 35S-GTP S 80 pM e GDP 3 µM. A mistura de ensaio é incubada por um período de tempo a uma determinada temperatura, por exemplo, 60 minutos a 30 °C, após os quais, GTP marcado não ligado é removido por filtração em filtros GF/B. GTP marcado ligado é medido por contagem por cintilação líquida. A fim de avaliar a modulação da atividade de OR5A2 induzida por composto de almíscar, membranas preparadas a partir de células que expressam um polipeptídeo de OR5A2 conforme definido no presente documento são misturadas com um ou mais compostos de almíscar conforme definido no presente documento, e o ensaio de ligação de GTP é realizado na presença e na ausência de um modulador candidato da atividade de OR5A2. Uma modulação de 10% ou mais na ligação de GTP marcado conforme medido por contagem por cintilação em um ensaio desse tipo contendo o modulador candidato, em relação a um ensaio sem o modulador indica que o modulador candidato inibe ou ativa a atividade de OR5A2.

[154] Um ensaio de ligação a GTP similar pode ser realizado sem o composto (ou compostos) de almíscar para identificar os compostos que atuam como agonistas. Nesse caso, a ligação a GTP estimulada por composto de almíscar é usada como um padrão. Um composto é considerado um agonista se o mesmo induzir pelo menos 50% do nível de ligação a GTP induzida pelo composto (ou compostos) de almíscar quando o composto (ou compostos) está presente a 1 mM ou menos e, de preferência, induzir um nível maior ou igual a este induzido pelo composto (ou compostos) de almíscar.

[155] A atividade de GTPase é medida incubando-se as membranas contendo um polipeptídeo de OR com gama-32P- GTP. GTPase ativa liberará a marcação como fosfato inorgânico, que é detectado pela separação de fosfato inorgânico livre em uma suspensão 5% de carvão vegetal ativado em H3PO4 20 mM, seguido por contagem por cintilação.

Os controles incluem ensaios que usam membranas isoladas de células que não expressam OR (com transfecção simulada), a fim de excluir possíveis efeitos não específicos do composto candidato.

[156] A fim de avaliar o efeito de um modulador candidato na atividade de GTPase regulada por OR5A2, amostras de membrana são incubadas com um ou mais compostos de almíscar conforme definido no presente documento, com e sem o modulador, seguido pelo ensaio de GTPase. Uma alteração (aumento ou diminuição) de 10% ou mais no nível de ligação a GTP ou atividade de GTPase em relação às amostras sem modulador é indicativa da modulação de composto de almíscar por um modulador candidato.

II. Ensaios de Ativação de Trajetória a Jusante: A. Fluxo de Cálcio - O Ensaio Baseado em Aequorina.

[157] O ensaio de aequorina tira vantagem da responsividade da apoaequorina mitocondrial ou citoplasmática à liberação de cálcio intracelular ou fluxo de cálcio (entrada) induzido pela ativação de GPCRs (Stables et al., 1997, Anal. Biochem. 252:115 a 126; Detheux et al.,

2000, J. Exp. Med., 192 1.501 a 1.508; ambos os quais estão incorporados ao presente documento a título de referência).

Em suma, clones que expressam OR são transfectados para coexpressar apoaequorina mitocondrial ou citoplasmática e G- alfa-16 ou G-olf. As células são incubadas com Coelenterazina H 5 µM ou derivados (Molecular Probes) por 4 horas à temperatura ambiente, lavadas em meio de cultura DMEM-F12 e ressuspensas a uma concentração de 0,5 x 106 células/ml. As células são, então, misturadas com peptídeos agonistas de teste, e a emissão de luz pela aequorina é registrada com um luminômetro por 30 segundos. Os resultados são expressos como Unidades de Luz Relativas (RLU). Os controles incluem ensaios que usam membranas isoladas de células que não expressam C356 (com transfecção simulada), a fim de excluir possíveis efeitos não específicos do composto candidato.

[158] A atividade de aequorina ou níveis de cálcio intracelular são “alterados” se a intensidade de luz aumentar ou diminuir em 10% ou mais em uma amostra de células, que expressam um polipeptídeo de OR e tratadas com um modulador candidato, em relação a uma amostra de células que expressam o polipeptídeo de OR, mas não são tratadas com o modulador candidato ou em relação a uma amostra de células que não expressam o polipeptídeo de OR (células com transfecção simulada), mas tratadas com o modulador candidato.

[159] Quando realizado na ausência de um composto de almíscar conforme definido no presente documento, o ensaio pode ser usado para identificar um agonista ou agonista inverso da atividade de OR5A2. Quando o ensaio é realizado na presença de um composto de almíscar conforme definido no presente documento, o mesmo pode ser usado para avaliar um intensificador da atividade de OR5A2.

[160] 1) um ensaio baseado em Fluo3, Fluo4, Fura2, Calcium3 ou Calcium6.

[161] Os ensaios baseados em fluorescência tiram vantagem de fluxos de cálcio disparados pela ativação de receptor: ou entrada de cálcio através de CNG, por exemplo, ou liberação de cálcio do retículo endoplasmático. Alguns fluoróforos incluindo, porém sem limitação, séries de kit Fluo3, Fluo4 e Fura2 (Molecular Probes) e Calcum3 ou Calcium6 (Molecular Device) são conhecidos por se ligarem a cálcio.

Tais complexos de fluoróforo-cálcio emitem fluorescência em comprimentos de onda específicos. Assim, mediante a ativação de um receptor acoplado à proteína G, o cálcio liberado do retículo endoplasmático ou inserido através de CNG se liga ao fluoróforo levando à emissão de fluorescência específica.

As células que expressam OR são incubadas por 30 a 60 minutos com uma solução de fluoróforo 1 a 8 µM a 37°C. Após a lavagem minuciosa com tampão salino, 50 µl do mesmo tampão são vertidos em cada poço contendo as células (6 a 1.536). Os agonistas testados são, então, injetados em tais células carregadas, e a ativação de um OR é seguida pela medição de fluorescência.

[162] Os níveis de cálcio intracelular são “alterados” se a intensidade de fluorescência aumentar ou diminuir em 10% ou mais em uma amostra de células, que expressam um polipeptídeo de OR5A2 conforme definido no presente documento e tratadas com um modulador candidato, em relação a uma amostra de células que expressam um polipeptídeo de OR5A2, mas não são tratadas com o modulador candidato ou em relação a uma amostra de células que não expressam um polipeptídeo de OR5A2 (células com transfecção simulada), mas tratadas com o modulador candidato.

[163] 2) Ensaio de membrana de despolarização/hiperpolarização (fluoróforo DiBac, por exemplo).

[164] O princípio desse ensaio é seguir a despolarização da membrana celular. A sonda aniônica DiBAC4(3) se divide entre compartimentos intra e extracelulares de uma maneira dependente de potencial de membrana. Com potencial de membrana crescente (despolarização), a sonda se divide adicionalmente na célula resultando em um aumento da fluorescência. Inversamente, a hiperpolarização leva a uma diminuição da fluorescência devido à extrusão de corante.

[165] A sonda DiBAC4(3) é excitada com um comprimento de onda de 488 nm e emite a um comprimentos de onda de 540 nm.

[166] No dia do experimento, adicionar a glicose ao tampão de ensaio (tampão salino) a uma concentração final de 10 mM e a sonda DiBAC4(3) a uma concentração final de 5 µM.

Manter o tampão de ensaio a 37°C. Remover o meio de cultura celular e enxaguar duas vezes cada poço contendo células que expressam OR com 200 µl de tampão de ensaio pré-aquecido.

Colocar 180 µl de Tampão de ensaio contendo DiBAC4(3) e incubar as células por 30 min na temperatura apropriada.

Placas de células estarão prontas para ensaio após esses 30 min de incubação. Coletar a linha de base por 2 min antes de qualquer adição. Adicionar 20 µl de moduladores candidatos ao poço apropriado e coletar os dados por mais 25 min.

[167] A polarização de membrana é “alterada” se a intensidade de fluorescência aumentar ou diminuir em 10% ou mais em uma amostra de células, que expressam um polipeptídeo de OR5A2 conforme definido no presente documento e tratadas com um modulador candidato, em relação a uma amostra de células que expressam um polipeptídeo de OR5A2, mas não são tratadas com o modulador candidato ou em relação a uma amostra de células que não expressam um polipeptídeo de OR5A2 (células com transfecção simulada), mas tratadas com o modulador candidato.

[168] 3) Ensaio de melanóforo. O ensaio de melanóforo é um ensaio baseado em cor. Basicamente, as células usadas para esse ensaio são derivadas da pele da rã Xenopus Laevis. Essas células imortalizadas contêm melanossomas, que são organelas contendo pigmento escuro. A ativação de GPCR endógeno ou recombinante que dispara a ativação de adenilato ciclase ou fosfolipase C leva à dispersão de melanossoma e, portanto, escurecimento da célula. Alternativamente, um GPCR que inibe adenilato ciclase ou fosfolipase C leva ao clareamento de célula.

Assim, em vez de medir as concentrações do segundo mensageiro, pode-se determinar facilmente a ocorrência observando-se a alteração de coloração de célula. Essa alteração de cor pode ser facilmente quantificada em um leitor de microplaca medindo-se a absorbância a 650 nM ou por examinação em um sistema de imaginologia de vídeo.

B. Ensaio de Adenilato Ciclase:

[169] Os ensaios para atividade de adenilato ciclase são descritos por Kenimer & Nirenberg, 1981, Mol.

Pharmacol. 20: 585 a 591, incorporado ao presente documento a título de referência. Esse ensaio é uma modificação do ensaio ensinado por Solomon et al., 1974, Anal. Biochem. 58: 541 a 548, também incorporado ao presente documento a título de referência. Em suma, reações de 100 µl contêm Tris-Hcl 50 mM (pH 7,5), MgCl2 5 mM, fosfato de creatina 20 mM (sal dissódico), 10 unidades (71 µg de proteína) de creatina fosfoquinase, -32P-ATP 1 mM (sal tetrassódico, 2 µCi), AMP cíclico 0,5 mM, AMP cíclico marcado com G-3H (aproximadamente

10.000 cpm), Ro20-1724 0,5 mM, etanol 0,25% e 50 a 200 µg de homogenato de proteína a serem testados (isto é, homogenato de células que expressam ou não expressam um polipeptídeo de OR, tratado ou não tratado com ácido carboxílico com ou sem um modulador candidato). Reaction mixtures are generally incubated at 37oC for 6 minutes. Após a incubação, as misturas de reação são desproteinizadas pela adição de 0,9 ml de ácido tricloroacético 6%. Tubos são centrifugados a

1.800 x g por 20 minutos, e cada solução de sobrenadante é adicionada a uma coluna Dowex AG50W-X4. A fração de cAMP da coluna é eluída com 4 ml de HCl de imidazol 0,1 mM (pH 7,5) em um frasco de contagem. Os ensaios devem ser realizados em triplicata. As reações de controle também devem ser realizadas com o uso de homogenato de proteína de células que não expressam um polipeptídeo de OR.

[170] Os ensaios devem ser realizados com o uso de células ou extratos de células que expressam um polipeptídeo de OR5A2 conforme definido no presente documento, tratados ou não tratados com um ou mais compostos de almíscar conforme definido no presente documento com ou sem um modulador candidato. As reações de controle devem ser realizadas com o uso de células com transfecção simulada ou extratos das mesmas a fim de excluir possíveis efeitos não específicos de alguns moduladores candidatos.

[171] De acordo com a invenção, a atividade de adenilato ciclase é “alterada” se a mesma aumentar ou diminuir em 10% ou mais em uma amostra retirada de células tratadas com um modulador candidato da atividade de OR5A2, em relação a uma amostra similar de células não tratadas com o modulador candidato ou em relação a uma amostra de células que não expressam um polipeptídeo de OR5A2 (células com transfecção simulada), mas tratadas com o modulador candidato. Alternativamente, uma diminuição da atividade em 10% ou mais pelo modulador candidato de polipeptídeos de OR5A2 em uma amostra tratada com um composto de referência pode ser testada.

C. Ensaio de cAMP:

[172] cAMP intracelular é medido com o uso de um radioimunoensaio de cAMP (RIA) ou proteína de ligação a cAMP de acordo com os métodos amplamente conhecidos na técnica.

Por exemplo, Horton & Baxendale, 1995, Methods Mol. Biol.

41: 91 a 105, que está incorporado ao presente documento a título de referência, descreve um RIA para cAMP.

[173] Vários kits para a medição de cAMP estão comercialmente disponíveis, tais como o ensaio homogêneo baseado em Polarização de Fluorescência de Alta Eficiência comercializado pela LJL Biosystems e NEN Life Science Products. As reações de controle devem ser realizadas com o uso de extratos de células com transfecção simulada para excluir efeitos não específicos possíveis de alguns moduladores candidatos.

[174] Os ensaios devem ser realizados com o uso de células ou extratos de células que expressam um polipeptídeo de OR5A2 conforme definido no presente documento, tratados ou não tratados com um composto de almíscar com ou sem um modulador candidato. As reações de controle devem ser realizadas com o uso de células com transfecção simulada ou extratos das mesmas a fim de excluir possíveis efeitos não específicos de alguns moduladores candidatos.

[175] O nível de cAMP é “alterado” se o nível de cAMP detectado em células, que expressam um polipeptídeo de OR5A2 conforme definido no presente documento e tratadas com um modulador candidato da atividade de OR5A2 (ou em extratos de tais células), com o uso do ensaio baseado em RIA de Horton & Baxendale, 1995, supra, aumenta ou diminui em pelo menos 10% em relação ao nível de cAMP em células similares não tratadas com o modulador candidato.

D. Quebra de fosfolipídio, produção de DAG e níveis de Tripolifosfato de Inositol:

[176] Os receptores que ativam a quebra de fosfolipídios podem ser monitorados para alterações devido à atividade de moduladores conhecidos ou suspeitos de um OR monitorando-se a quebra de fosfolipídios e a produção resultante de segundos mensageiros DAG e/ou trifosfato de inositol (IP3). Os métodos para medir cada um desses são descritos em Phospholipid Signaling Protocols, editado por Ian M. Bird. Totowa, NJ, Humana Press, 1998, que está incorporado ao presente documento a título de referência.

Consultar também Rudolph et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:

1.1824 a 1.1831, incorporado ao presente documento a título de referência, que também descreve um ensaio para quebra de fosfatidilinositol. Os ensaios devem ser realizados com o uso de células ou extratos de células que expressam um polipeptídeo de OR5A2 conforme definido no presente documento, tratados ou não tratados com um ou mais compostos de almíscar conforme definido no presente documento com ou sem um modulador candidato. As reações de controle devem ser realizadas com o uso de células com transfecção simulada ou extratos das mesmas a fim de excluir possíveis efeitos não específicos de alguns moduladores candidatos.

[177] De acordo com a invenção, a quebra de fosfatidilinositol e os níveis de diacilglicerol e/ou trifosfato de inositol são “alterados” se os mesmos aumentarem ou diminuírem em pelo menos 10% em uma amostra de células que expressam um polipeptídeo de OR5A2 e tratadas com um modulador candidato na presença ou na ausência de um ou mais compostos de almíscar, em relação ao nível observado em uma amostra de células que expressam um polipeptídeo carboxílico que não é tratado com o modulador candidato.

E. Ensaios de ativação de PKC:

[178] Tirosina quinases de receptor de fator de crescimento tendem a sinalizar por meio de uma trajetória que envolve a ativação da Proteína Quinase C (PKC), que é uma família de proteínas Quinase ativadas por fosfolipídio e cálcio. A ativação de PKC resulta ultimamente na transcrição de um arranjo de genes que codificam fator de transcrição de proto-oncogene, incluindo c-fos, c-myc e c- jun, proteases, inibidores de protease, incluindo colagenase tipo I e inibidor de ativador de plasminogênio e moléculas de adesão, incluindo a molécula de adesão intracelular I (ICAM I). Ensaios projetados para detectar aumentos em produtos de gene induzidos por PKC podem ser usados para monitorar a ativação de PKC e, assim, a atividade de receptor. Adicionalmente, a atividade de receptores que sinalizam por meio de PKC pode ser monitorada através do uso de construtos de gene-repórter acionados pelas sequências de controle de genes ativados pela ativação de PKC. Esse tipo de ensaio baseado em gene-repórter é discutido em mais detalhes abaixo.

[179] Para uma medição mais direta da atividade de PKC, o método de Kikkawa et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 13341, incorporado ao presente documento a título de referência, pode ser usado. Esse ensaio mede a fosforilação de um peptídeo de substrato de PKC, que é subsequentemente separado pela ligação a papel de fosfocelulose. Esse sistema de ensaio de PKC pode ser usado para medir a atividade de quinase purificada ou a atividade em extratos celulares brutos. A amostra da proteína quinase C pode ser diluída em HEPES 20 mM/DTT 2 mM imediatamente antes do ensaio.

[180] O substrato para o ensaio é o peptídeo Ac- FKKSFKL-NH2 (SEQ ID NO:5), derivado da proteína de substrato de proteína quinase C rica em alanina miristoilada (MARCKS).

A Km da enzima para esse peptídeo é aproximadamente 50 µM.

Outros peptídeos seletivos de proteína quinase C básicos conhecidos na técnica podem também ser usados, a uma concentração de pelo menos 2 a 3 vezes sua Km. Os cofatores exigidos para o ensaio incluem cálcio, magnésio, ATP, fosfatidilserina e diacilglicerol. Dependendo da intenção do usuário, o ensaio pode ser realizado para determinar a quantidade de PKC presente (condições de ativação) ou a quantidade de PCK ativa presente (condições de não ativação).

Para a maioria do propósito de acordo com a invenção, condições de não ativação serão usadas, de modo que a PKC que está ativa na amostra quando a mesma é isolada seja medida, em vez de medir a PKC que pode ser ativada. Para condições de não ativação, cálcio é omitido no ensaio em favor de EGTA.

[181] O ensaio é realizado em uma mistura contendo

HEPES 20 mM, pH 7,4, DTT 1 a 2 mM, MgCl2 5 mM, ATP 100 µM, -32P-ATP ~1 µCi, 100 µg/ml de substrato de peptídeo (~100 µM), membranas de 140 µM/fosfatidilserina 3,8 µM/diacilglicerol e cálcio 100 µM (ou, com a maior preferência, EGTA 500 µM). 48 µl da amostra, diluídos em HEPES 20 mM, pH 7,4, DTT 2 mM são usados em um volume de reação final de 80 µl. As reações são realizadas a 30 °C por 5 a 10 minutos, seguido pela adição de 25 µl de uma solução contendo ATP 100 mM e EDTA 100 mM com um valor de pH de 8,0, que interrompe as reações.

[182] Após a reação ser interrompida, uma porção (85µl) de cada reação é pingada sobre um filtro de fosfato de celulose Whatman P81, seguido por lavagens: quatro vezes 500 ml de ácido fosfórico 0,4%, (5 a 10 min por lavagem); e uma lavagem final em 500 ml de EtOH 95%, por 2 a 5 min. A radioatividade de ligação é medida por contagem por cintilação. A atividade específica (cpm/nmol) do ATP marcado é determinada pingando-se uma amostra da reação em papel P81 e contando sem lavagem. As unidades de atividade de PKC, definidas como nmol de fosfato transferido por min, são calculadas da seguinte forma:

[183] A atividade, em UNIDADES (nmol/min), é: =_(cpm em papel) x (105µl totais/85µl pingados)___ (tempo de ensaio, min) (atividade específica de ATP cpm/nmol).

[184] Um ensaio alternativo pode ser realizado com o uso de um Kit de Ensaio de Proteína Quinase C vendido pela PanVera (no de catálogo P2747).

[185] Os ensaios são realizados em extratos de células que expressam um polipeptídeo de OR5A2 conforme definido no presente documento, tratados ou não tratados com um ou mais compostos de almíscar conforme definido no presente documento com ou sem um modulador candidato. As reações de controle devem ser realizadas com o uso de células com transfecção simulada ou extratos das mesmas a fim de excluir possíveis efeitos não específicos de alguns moduladores candidatos.

[186] De acordo com a invenção, a atividade de PKC é “alterada” por um modulador candidato quando as unidades de PKC medida por qualquer um dos ensaios descritos acima aumentam ou diminuem em pelo menos 10%, em extratos de células que expressam um polipeptídeo de OR5A2 e tratados com um modulador candidato, em relação a uma reação realizada em uma amostra similar de células não tratadas com um modulador candidato.

F. Ensaios de ativação de PKA

[187] A atividade de PKA pode ser avaliada com o uso de qualquer um dos diversos kits comercialmente disponíveis, por exemplo, a partir do kit de ensaio de PKA molecular device IMAP ou do kit de ensaio de PKA promega

ProFluor.

[188] Os ensaios devem ser realizados com o uso de células ou extratos de células que expressam um polipeptídeo de OR5A2 conforme definido no presente documento, tratados ou não tratados com um ou mais compostos de almíscar conforme definido no presente documento com ou sem um modulador candidato. As reações de controle devem ser realizadas com o uso de células com transfecção simulada ou extratos das mesmas a fim de excluir possíveis efeitos não específicos de alguns moduladores candidatos.

[189] A atividade de PKA é “alterada” se o nível de atividade for aumentado ou diminuído em 10% ou mais em uma amostra de células, que expressam um polipeptídeo de OR, tratadas com um modulador candidato em relação à atividade de PKA quinase em uma amostra de células similares não tratadas com o modulador candidato.

G. Ensaios de quinase:

[190] A atividade de MAP quinase pode ser avaliada com o uso de qualquer um dos diversos kits comercialmente disponíveis, por exemplo, o kit de ensaio p38 MAP Kinase vendido pela New England Biolabs (no de catálogo 9820) ou os ensaios FlashPlateTM MAP Kinase vendidos pela Perkin-Elmer Life Sciences.

[191] Os ensaios devem ser realizados com o uso de células ou extratos de células que expressam um polipeptídeo de OR5A2 conforme definido no presente documento, tratados ou não tratados com um ou mais compostos de almíscar conforme definido no presente documento com ou sem um modulador candidato. As reações de controle devem ser realizadas com o uso de células com transfecção simulada ou extratos das mesmas a fim de excluir possíveis efeitos não específicos de alguns moduladores candidatos.

[192] A atividade de MAP Quinase é “alterada” se o nível de atividade for aumentado ou diminuído em 10% ou mais em uma amostra de células, que expressam um polipeptídeo de OR5A2 conforme definido no presente documento, tratadas com um modulador candidato em relação à atividade de MAP quinase em uma amostra de células similares não tratadas com o modulador candidato.

[193] Os ensaios diretos para a atividade de tirosina quinase que usam substratos de tirosina quinase sintéticos ou naturais e fosfato marcado são bem conhecidos, assim como ensaios similares para outros tipos de quinases (por exemplo, Ser/Thr quinases). Os ensaios de quinase podem ser realizados com quinases purificadas e extratos brutos preparados a partir de células que expressam um polipeptídeo de OR5A2 conforme definido no presente documento, tratadas com ou sem um composto de almíscar, com ou sem um modulador candidato. As reações de controle devem ser realizadas com o uso de células com transfecção simulada ou extratos das mesmas a fim de excluir possíveis efeitos não específicos de alguns moduladores candidatos. Os substratos podem ser proteína de comprimento total ou peptídeos sintéticos que representam o substrato. Pinna & Ruzzene (1996, Biochem.

Biophys. Acta 1314: 191 a225, incorporado ao presente a título de referência) listam vários sítios de substrato de fosforilação úteis para medir as atividades de quinase.

Vários peptídeos de substrato de quinase estão comercialmente disponíveis. Um que é particularmente útil é o “peptídeo relacionada a Src”, (RRLIEDAEYAARG (SEQ ID NO:6); disponível junto à Sigma no A7433), que é um substrato para muitas tirosina quinases receptoras e não receptoras. Devido ao fato de que o ensaio descrito abaixo exige a ligação de substratos de peptídeo a filtros, os substratos de peptídeo devem ter uma carga líquida positiva para facilitar a ligação. Geralmente, os substratos de peptídeo devem ter pelo menos 2 resíduos básicos e uma terminação de amino livre. As reações geralmente usam uma concentração de peptídeo de 0,7 a 1,5mM.

[194] Os ensaios são geralmente executados em um volume de 25µl compreendendo 5µl de tampão de quinase 5X (5mg/ml de BSA, Tris-Cl150 mM (pH 7,5), MgCl2 100mM; dependendo da quinase exata avaliada, MnCl2 pode ser usado no lugar ou adicionalmente ao MgCl2), 5µl de ATP 1,0mM (concentração final de 0,2mM), gama-32P-ATP (100 a 500 cpm/pmol), 3µl de substrato de peptídeo 10mM (concentração final de 1,2mM), extrato celular contendo quinase a ser testado (extratos celulares usados para ensaios de quinase devem conter um inibidor de fosfatase (por exemplo, ortovanadato de sódio 0,1 a 1mM)) e H2O a 25µl. As reações são realizadas a 30°C e são iniciadas pela adição do extrato celular.

[195] Reações de quinase são realizadas por 30 segundos a cerca de 30 minutos, seguido pela adição de 45 µl de ácido tricloroacético 10% (TCA) gelado. As amostras são giradas por 2 minutos em uma microcentrífuga, e 35 µl do sobrenadante são pingados em círculos de filtro de fosfato de celulose Whatman P81. Os filtros são lavados três vezes com 500 ml de ácido fosfórico 0,5% frio, seguido por uma lavagem com 200 ml de acetona à temperatura ambiente por 5 minutos. Os filtros são secos, e 32P incorporado é medido por contagem por cintilação. A atividade específica de ATP na reação de quinase (por exemplo, em cpm/pmol) é determinada pongando-se uma pequena amostra (2 a 5 µl) da reação em um círculo de filtro P81 e contando diretamente, sem lavagem.

As contagens por minuto obtidas na reação de quinase (menos o branco) são, então, divididas pela atividade específica para determinar os moles de fosfato transferidos na reação.

[196] Os ensaios devem ser realizados com o uso de células ou extratos de células que expressam um polipeptídeo de OR5A2 conforme definido no presente documento, tratados ou não tratados com um composto de almíscar com ou sem um modulador candidato. As reações de controle devem ser realizadas com o uso de células com transfecção simulada ou extratos das mesmas a fim de excluir possíveis efeitos não específicos de alguns moduladores candidatos.

[197] A atividade de tirosina quinase é “alterada” se o nível de atividade de quinase for aumentado ou diminuído em 10% ou mais em uma amostra de células, que expressam um polipeptídeo de OR5A2, tratadas com um modulador candidato em relação à atividade de quinase em uma amostra de células similares não tratadas com o modulador candidato.

H. Repórteres Transcricionais para Ativação de Trajetória a Jusante:

[198] O sinal intracelular iniciado pela ligação de um modulador a um receptor, por exemplo, o polipeptídeo de OR5A2 conforme definido no presente documento, define em movimento uma cascata de eventos intracelulares, cuja consequência final é uma alteração rápida e detectável na transcrição e/ou tradução de um ou mais genes. A atividade do receptor pode, portanto, ser monitorada medindo-se a expressão de um gene-repórter acionado pelas sequências de controle responsivas à ativação de OR5A2.

[199] Conforme usado no presente documento, “promotor” refere-se a elementos de controle transcricional necessários para regulação mediada por receptor da expressão de genes, incluindo não apenas o promotor basal, como também quaisquer intensificadores ou sítios de ligação a fator de transcrição necessários para a expressão regulada por receptor. Selecionando-se promotores que são responsivos aos sinais intracelulares resultando da ligação de agonista e ligando de maneira funcional os promotores selecionados a gene-repórteres cuja transcrição, tradução ou atividade final é prontamente detectável e mensurável, o ensaio de repórter baseado em transcrição fornece uma indicação rápida de se um determinado receptor é ativado.

[200] Genes-repórter, tais como luciferase, Cloranfenicol Acetil Transferase (CAT), Proteína Verde Fluorescente (GFP), beta-lactamase ou beta-galactosidase são bem conhecidos na técnica, assim como ensaios para a detecção de seus produtos.

[201] Genes particularmente bem adequados para monitorar a atividade de receptor são genes “precoces imediatos”, que são rapidamente induzidos, geralmente dentro dos minutos de contato entre o receptor e a proteína efetora ou ligante. A indução da transcrição de gene precoce imediato não exige a síntese de novas proteínas reguladoras.

Adicionalmente à responsividade rápida à ligação de ligante, as características de genes preferenciais úteis para produzir construtos de repórter incluem: expressão baixa ou indetectável em células quiescentes; indução que é temporária e independente de nova síntese de proteína; o desligamento subsequente da transcrição exige nova síntese de proteína; e os mRNAs transcritos a partir desses genes têm uma meia-vida curta. É preferencial, mas não necessário, que um elemento de controle transcricional tenha todas essas propriedades para que o mesmo seja útil.

[202] A fim de avaliar a atividade de OR5A2 com um construto de repórter transcricional responsivo a almíscar, células que expressam estavelmente um polipeptídeo de OR5A2 conforme definido no presente documento são estavelmente transfectadas com o construto de repórter. Para triar por agonistas, células não tratadas são expostas a moduladores candidatos ou expostas a um ou mais compostos de almíscar conforme definido no presente documento, e a expressão do repórter é medida. As culturas tratadas com composto de almíscar- servem como um padrão para o nível de transcrição induzida por um agonista conhecido. Um aumento de pelo menos 10% na expressão de repórter na presença de um modulador candidato em comparação à expressão de repórter na ausência de qualquer modulador indica que o candidato é um modulador da atividade de OR5A2. Um agonista induzirá pelo menos tanto quando e, de preferência, a mesma quantidade ou mais expressão de repórter do que o composto (ou compostos) de almíscar. Os agonistas parciais podem ativar o receptor menos em comparação ao almíscar. Essa abordagem pode também ser usada para triar por agonistas inversos em que células expressam um polipeptídeo de OR5A2 conforme definido no presente documento a níveis de modo que haja uma atividade basal elevada do repórter na ausência do composto (ou compostos) de almíscar ou outros agonistas. Uma doença na atividade de repórter de 10% ou mais na presença de um modulador candidato, em relação a sua ausência, indica que o composto é um agonista inverso.

[203] Para triar por um intensificador, as células que expressam um polipeptídeo de OR5A2 conforme definido no presente documento e que portam o construto de repórter são expostas a um ou mais compostos de almíscar (ou outro agonista) na presença ou ausência de um modulador candidato.

Um aumento de 10% ou mais na expressão de repórter na presença do modulador candidato, em relação à ausência do modulador candidato, indica que o candidato é um intensificador da atividade de OR5A2.

[204] Os controles para ensaios de transcrição incluem células que não expressam um polipeptídeo de OR5A2 conforme definido no presente documento, mas portam o construto de repórter, assim como células com um promotor menos construto de repórter. Os compostos que são identificados como moduladores de transcrição regulada por OR5A2 devem também ser analisados para determinar se os mesmos afetam a transcrição acionada por sequências reguladoras e por outros receptores, a fim de determinar a especificidade e o espectro de sua atividade.

[205] O ensaio de repórter transcricional e a maioria dos ensaios baseados em célula são bem adequados para bibliotecas de triagem de compostos químicos para aqueles que modulam a atividade de OR5A2. As bibliotecas podem ser, por exemplo, bibliotecas de fontes naturais, por exemplo, plantas, animais, bactérias, etc.

Modulatores Candidatos Úteis de Acordo com a Invenção

[206] Os moduladores candidatos podem ser triados a partir de grandes bibliotecas de compostos sintéticos ou naturais. Inúmeros meios são atualmente usados para síntese aleatória e direcionada de vários tipos de compostos. As bibliotecas de compostos sintéticos estão comercialmente disponíveis a partir de várias empresas incluindo, por exemplo, Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, Reino Unido), Comgenex (Princeton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH) e Microsource (New Milford, CT). Uma biblioteca química rara está disponível junto à Aldrich (Milwaukee, WI). Bibliotecas combinatórias de moléculas orgânicas pequenas estão disponíveis e podem ser preparadas.

Alternativamente, as bibliotecas de compostos naturais na forma de extratos bacterianos, fúngicos, vegetais e animais estão disponíveis junto à, por exemplo, Pan Laboratories

(Bothell, WA) ou MycoSearch (NC), ou são prontamente produzíveis por métodos bem conhecidos na técnica.

Adicionalmente, bibliotecas e compostos naturais e sinteticamente produzidos são prontamente modificados através de meios químicos, físicos e bioquímicos convencionais.

Exemplos Procedimentos Experimentais: Cultura Celular e Geração de Linhagem Celular

[207] Células HEK293T-RTP1A1/RTP2 foram mantidas em meio essencial mínimo (EMEM, Lonza) contendo soro fetal bovino 10% (M10). Essas células foram geradas transfectando- se HEK293T com um vetor de expressão contendo as sequências das proteínas chaperona RTP1A1 e RTP2 e um gene de resistência para puromicina, com o uso de Lipofectamina 2000.

A população de células recombinantes, usada nesses experimentos, foi selecionada adicionando-se 10 µg/ml de puromicina ao meio de cultura e subsequentemente subclonada (WO 2014/191047 A1).

Diluição de Molécula de Odorizante

[208] Moléculas de odorizante foram diluídos a uma concentração de 1 mol/litro (M) em sulfóxido de dimetila (DMSO) para gerar soluções de estoque.

[209] Para experimentos de triagem, soluções de estoque de moléculas de odorizante foram diluídas em EMEM disposto em placas de 96 poços. Placas contendo os compostos testados (1 composto/poço) a uma concentração de 2mM, uma concentração de 632µM e uma concentração de 200µM foram preparadas.

[210] Para análise de resposta à concentração, diluições em série das moléculas testadas foram preparadas a partir de soluções de estoque em EMEM colocado em placas de 96 poços.

Ensaio de Luciferase

[211] Para a triagem de deorfanização inicial e análise de resposta à dosagem, um ensaio de gene-repórter baseado em Luciferase (Promega, Leiden, Holanda) foi usado.

Em suma, células foram colocadas em placas de 96 poços revestidos com Poli-D-lisina e transfectadas com um plasmídeo contendo a CRE-luciferase e um plasmídeo contendo o receptor olfativo. Dezesseis horas após a transfecção, o meio de cultura foi substituído por EMEM isento de soro contendo os compostos testados a uma concentração determinada. Após quatro horas de incubação a 37°C, as células foram lisadas e processadas para medição de luminescência. A emissão de luminescência foi registrada. Os resultados foram expressos como atividade de luciferase (Unidade de Fluorescência Relativa (RLU)) ou como porcentagem da resposta induzida por 10 µM do ativador de adenilato ciclase Forscolina. Um plasmídeo vazio é usado como o controle negativo.

Exemplo 1: Triagem de Bibliotecas de Moléculas de Odorizante

[212] Bibliotecas de compostos odorizantes contendo almíscares e outros tipos de compostos foram usadas para identificar ativadores do OR da invenção. A campanha de deorfanização foi realizada no OR da invenção com uma série de 891 compostos odorizantes. Almíscares dos quatro grupos estruturalmente diferentes foram incluídos nos 891 odorizantes testados (Tabela 1).

[213] Cada composto foi testado em 3 diferentes concentrações (1mM, 316µM, 100µM). Os diferentes compostos das bibliotecas testadas foram dispostos na mesma concentração em placas de 96 poços (1 molécula/poço) contendo células que expressam o OR da invenção. A atividade dos compostos testados foi medida com o uso da atividade de luciferase conforme explicado acima. A atividade de luciferase média induzida pelos compostos testados e o desvio padrão associado foram determinados. Os compostos putativamente ativos (acertos) foram definidos como compostos que induzem uma atividade de luciferase maior ou igual à média + 2 desvios padrão.

[214] Nessas condições experimentais, o OR testado (que corresponde ao OR da invenção, a saber: OR5A2, em particular, OR5A2_variant 1) revelou, portanto, responder específica e exclusivamente a diferentes almíscares: serenolida, brassilato de etileno e malaxona. A Tabela 1 resume a lista completa de compostos odorizantes testados quanto à deorfanização do OR da invenção. Os resultados mostram claramente que, dentre os 891 compostos testados, o OR da invenção é apenas ativado por almíscares macrocíclicos, almíscares policíclicos, nitroalmíscares e almíscares lineares. Esse resultado é ainda mais surpreendente já que OR5A2 foi anteriormente excluído como um receptor específico para almíscar por 2 publicações diferentes (Shirasu et al.

2014 Neuron 81, 165 a 178; Figura 5F suplementar, Sato- Akuhara N et al. 2016 J Neurosci. 36(16), 4.482 a 4.491).

Exemplo 2: Análises de Resposta à Concentração de Interações de Ligante de Almíscar-OR

[215] A fim de validar os acertos anteriormente mencionados, as análises de resposta à concentração com o uso do ensaio de repórter à base de luciferase foram alcançadas com o uso de diluições em série semilogarítmicas de moléculas de acerto, de 1 mM a 316 nM, no OR5A2_variante

1. Nessas análises, foram também incluídos ORs anteriormente descritos como receptores específicos para almíscar OR5AN1 (SEQ ID NO:7) (WO 2015/020158 A1, Shirasu et al. 2014 Neuron 81, 165 a 178, Sato-Akuhara N et al. 2016 J Neurosci. 36(16),

4.482 a 4.491) e OR11A1 (SEQ ID NO:8) (WO 2016/201152 A1).

Pela análise filogênica, constatou-se que o gene de OR mais similar a OR5A2 foi OR5A1 (SEQ ID NO:9) com 71% de identidade de ácido nucleico e 67% de identidade de aminoácidos (Figuras 2A-B). Portanto, OR5A1 foi incluído nas análises. 35 compostos de almíscar dos quatro grupos químicos estruturalmente diferentes anteriormente descritos foram testados nas análises de resposta à concentração (Tabela 2).

Em cada experimento, um vetor vazio foi usado como o controle negativo (pEFIBRHO). Curvas de resposta à concentração representativas que usam os compostos de almíscar são dadas na Figura 1A. A Figura 1B mostra suas estruturas. Resultados completos incluindo a EC50 calculada são dados na Tabela 2; as caixas cinzas representam experimentos negativos, nenhuma ativação após testagem.

[216] Como exemplos, curvas de resposta à concentração de (A) Ambreta de Almíscar e (B) Mosqueno nos receptores OR5A2, OR5A1, OR5AN1 e OR11A1 são ilustradas na Figura 7. Curvas de resposta à concentração de (A) Silcolida e (B) Serenolida nos receptores OR5A2, OR5A1, OR5AN1 e OR11A1 são mostradas na Figura 8. Curvas de resposta à concentração de (A) Cashmeran, (B) Fixal e (C) Galaxolida nos receptores OR5A2, OR5A1, OR5AN1 e OR11A1 são mostradas na Figura 9.

Curvas de resposta à concentração de (A) Brassilato de Etileno, (B) Ambretolida e (C) Cervolida nos receptores OR5A2, OR5A1, OR5AN1 e OR11A1 são mostradas na Figura 10.

[217] Foi observado que o OR da invenção (a saber,

OR5A2) é ativado pelos compostos de almíscar que pertencem aos 4 grupos de produtos químicos descritos anteriormente.

OR5A1, o parólogo mais próximo de OR5A2, não foi ativado por qualquer um dos compostos de almíscar testados. Além disso, ORs específicos para almíscar (OR5AN1 e OR11A1) respondem principalmente a nitroalmíscares e almíscares macrocíclicos ou almíscares policíclicos e nitroalmíscares, respectivamente (Tabelas 2). Nenhum dos compostos de almíscar testados teve a capacidade para ativar exclusivamente OR5AN1. Ademais, os resultados indicam que o OR da invenção (a saber, OR5A2) é o único OR ativado pela família de almíscar linear, conhecida por ser mais ecológica.

[218] O OR da invenção está, portanto, envolvido na percepção de todos os tipos de almíscares e constitui um receptor candidato valioso para identificar um composto que ativa, imita, bloqueia, inibe, modula e/ou intensifica a percepção de fragrâncias de almíscar.

Exemplo 3: Análise de Respostas à Dosagem da Interação de Ligantes Específicos para OR11A1 e OR5A1-OR.

[219] O alinhamento de sequências de aminoácidos mostra 67% de identidade entre OR5A1 e OR5A2, 58% com OR5AN1 e 41% com OR11A1 (Figuras 2 A e B). Para solucionar adicionalmente a questão de quão bem a paralogia prevê a funcionalidade e a seletividade, comparou-se a resposta desses Ors à beta-ionona e 2-etil fenchol, os dois agonistas bem conhecidos de OR5A1 e OR11A1, respectivamente (Jaeger et al., 2013; Adipietro et al., 2012). Esses compostos foram testados na análise de resposta à concentração em ensaios de luciferase, conforme anteriormente descrito. Em cada experimento, um vetor vazio foi usado como o controle negativo (pEFIBRHO). Curvas de resposta à concentração representativas são dadas nas Figuras 3 A e B.

[220] Foi observado que OR5A1, o parálogo mais próximo de OR5A2, e OR11A1 são, ambos, ativados por seu próprio agonista cognato. Ao contrário, nessas condições experimentais, o OR da invenção (a saber, OR5A2) assim como OR5AN1 não são estimulados por beta-ionona nem por 2 etil- fenchol, ambos mostrando curvas de resposta à concentração similares ao vetor vazio.

[221] Em conjunto, esses resultados indicam que OR5A1 e OR5A2, embora membros da mesma subfamília, mostram diferente especificidade de agonista (beta-ionona versus almíscar) indicando que que a similaridade de aminoácidos não prevê robustamente a funcionalidade e seletividade de OR entre parálogos.

Exemplo 4: Análise de Resposta à Dosagem da Interação de Ligante-Haplótipos de OR

[222] Os genes de OR são altamente variáveis, com muitos alelos resultando em diferenças na percepção de cheiro pessoa para pessoa. Essas diferenças podem ser atribuídas a variações genéticas como, por exemplo, polimorfismos de nucleotídeo. Com o uso do banco de dados HORDE (The Human Olfactory Data Explorer, https://genome.weizmann.ac.il/horde/), constatou-se que 5 variantes de proteína (haplótipos) de OR da invenção (a saber, OR5A2, OR5A2 variante_1) foram identificadas na população. O haplótipo mais frequente, presente a uma frequência de 79,72%, foi usado nos exemplos anteriores (OR5A2-variante_1; SEQ ID NO:1) e é sensível a compostos de almíscar. O segundo haplótipo, presente em 16,59%, codifica uma substituição de prolina por leucina na posição 172 (P172L, OR5A2_variante 2; SEQ ID NO:3). Em conjunto, os 2 haplótipos são expressos em mais do que 96% da população. O alinhamento de aminoácidos dos 2 haplótipos é representado na Figura 4.

[223] Para testar se a substituição poderia impactar a sensibilidade a almíscar, ensaios de luciferase foram realizados conforme descrito anteriormente após a transfecção de ambas as variantes de OR5A2. As células foram tratadas com diluições em série semilogarítmicas de compostos de almíscar dos quatro grupos estruturalmente diferentes descritos anteriormente. Em cada experimento, um vetor vazio foi usado como o controle negativo (pEFIBRHO).

Curvas de resposta à concentração representativas são dadas na Figura 5.

[224] Esses resultados experimentais indicam que OR5A2_variante 2 não é ativado pelos compostos de almíscar (xileno de almíscar, serenolida, galaxolide®, velviona, cashmeran, cetona de almíscar), diferentemente do outro haplótipo do receptor da invenção. Nesses experimentos, OR5A2_variante 1 mostra curvas de resposta à concentração similares àquelas obtidas no exemplo 2. Em geral, essas observações sugerem claramente que o haplótipo com a substituição na posição 172 (P172L) perde sua capacidade para ser ativado por compostos de almíscar. Essa observação poderia explicar o motivo de diferentes estudos, até o momento, excluírem o OR da invenção como um receptor de almíscar (Shirasu et al. 2014 Neuron 81, 165 a 178; Figura 5F suplementar, Sato-Akuhara N et al. 2016 J Neurosci. 36(16), 4.482 a 4.491).

Exemplo 5: Análise de Resposta à Dosagem da Interação de Ligante-_OR5A2 Quimérico Variante 1

[225] Em 1998, Krautwurst e colaboradores forneceram um sistema modelo para o estudo da especificidade de ligante e relações de estrutura-função para receptores olfativos (Krautwurst et al., 1998 Cell 95, 917 a 9). Os mesmos mostraram que o reconhecimento de ligante por receptores olfativos foi significativamente conferido pela região de proteína indo do domínio transmembranar 2 (TM2) para o domínio transmembranar 7 (TM7). Com base em sua publicação, um receptor olfativo OR5A2 quimérico_variante 1 foi criado contendo a sequência de aminoácidos TM2-TM7 do OR5A2_variante 1 flanqueada pela sequência N-terminal e C- terminal do receptor olfativo OR2A5 (consultar a SEQ ID NO: 12). Esse receptor OR5A2 quimérico_variante 1 compartilhou 86 por cento de identidade com o receptor OR5A2 nativo_variante 1 (FIGURA 6 A e SEQ ID NO: 10).

[226] Para testar se a substituição de aminoácidos poderia impactar a especificidade e sensibilidade a almíscar e validar o modelo de Krautwurst, ensaios de luciferase foram realizados conforme descrito anteriormente após a transfecção do OR5A2 quimérico_variante 1. As células foram tratadas com diluições em série semilogarítmicas de compostos de almíscar dos quatro grupos estruturalmente diferentes descritos anteriormente.

[227] Em cada experimento, um vetor vazio foi usado como o controle negativo (pEFIBRHO). Além disso, essas células foram tratadas com beta-ionona e 2 etil-fenchol, 2 compostos que não têm a capacidade para ativar o receptor OR5A2 originário (consultar a Figura 2 A e B). Curvas de resposta à concentração representativas são dadas na Figura 6 B e C.

[228] Em conjunto, esses resultados indicam que um OR5A2 quimérico_variante 1, embora compartilhando 86% de identidade, responde a todos os tipos de almíscares testados.

Adicionalmente, o OR5A2 quimérico_variante 1 não é ativado por beta-ionona ou 2 etil-fenchol indicando que esse receptor quimérico tem a mesma especificidade do que o receptor OR5A2 e representa um receptor candidato valioso para a identificação de compostos que ativa, imita, bloqueia, inibe, modula e/ou intensifica a percepção de fragrâncias de almíscar.

Tabela 1: Lista Completa de Moléculas de Odorizante Testadas no OR da Invenção: Vanilina no 1 CEDRÓXIDO DIMETIL BENZIL GRISALVA Vanilina no 2 ACETADO DE CEDRILA CARBINOL ACETATO DE GUAIAÍLA Fenchona (+) LÍQUIDO BUTIRATO DE DIMETIL HELVETOLIDO óxido de rosa (-) CETALOX BENZIL CARBINILA HEPTALACTONA GAMA 2,3-dimetilpirazina CETONAL OCTENONA DE DIMETILA HERBAVERT

ACETAL CD CETONA V DIMETIL FENIL ETIL HERCOLYN DE ACETAL R CINAMATO DE CINAMILA CARBINOL HEXENOL-2-TRANS

ACETATO PA DESTILADO DIMIRCETOL ACETATO DE HEXENILA ACETOÍNA CITRAL DIMETIL DIONA CIS & TRANS CARIOFENILENO DE ACETAL DIPENTENO BENZOATO DE HEXENIL- ACETILA ISOBUTIRATO DE DODECALACTONA DELTA 3-CIS ADOXAL CITRONELILA DODECALACTONA GAMMA BUTIRATO DE HEXENIL- ÁLCOOL C 6 HEXÍLICO OXIACETALDEÍDO DE ELINTAAL 3-CIS

CITRONELILA BENZOATO DE ETILA HEXENOATO DE ALDEÍDO C 9 ISONONÍLICO PROPIONATO DE DE CAPRILATO DE ETILA HEXENIL-3-CIS

CITRONELILA CINAMATO DE ETILA ISOBUTIRATO DE

CAPROATO DE ALILA CLARITONA ETIL ISOAMIL CETONA HEXENIL-3-CIS

AMBRINOL CLONAL ETIL LINALOL BENZOATO DE HEXILA BENZOATO DE AMILA CONIFERANO ACETASTO DE ETIL BUTIRATO DE HEXILA ACETATO DE AMIL

FENILA CORANOL LINALILA PROPIONATO DE HEXILA AFERMATO COUMAREX I MOD METIL-2-BUTIRATO DE ALDEÍDO DIMETAL

AURANTIOL PURO CICLEMONA A ETILA ACETAL HIDROTRÓPICO ACETONA DE BENZILA CICLOGALBANATO OENANTATO DE ETILA HIDROXICITRONELAL ACETATO DE CICLO- PELARGONATO DE ETILA DIMETIL ACETAL BENZOATO DE BENZILA HEXIL ETILA PROPIONATO DE ETILA INDOFLOR BUTIRATO DE BENZILA SALICILATO DE CICLO- SALICILATO DE ETILA INDOLENO ISOBUTIRADO DE HEXILA FARNESENO IRALIA PURA BENZILA CIMENO PARA FENCHONA ALFA IRONE F ÉTER BENZIL METÍLICO DECALACTONA DELTA ACETATO DE FENCHILA ISO JASMONA FR ACETATO DE BENZIL FENILA DECALACTONA GAMA ÁLCOOL FENCHÍLICO BUTIRATO DE ISOAMILA

BERRYFLOR DECATONA FLORAMATO FR BISABOLENO DECENAL-4-TRANS FLOROPAL ISOBUTIRATO DE DELTA-3 CARENO ISOBORNILA

BOISIRIS FOLENOX ÉTER DIBENZÍLICO ISOBUTIRATO DE ACETATO DE BORNILA FOLIONA AMBRATO DE DI-HIDRO ISOBUTILA LÍQUIDO FOLROSIA LINALOL DE DI-HIDRO ACETATO DE ISOBUTIL ACETATO DE BUTILA FRESCOMENTO TERPINEOL DE DI- FENILA BUTIL HIDROXI GALBANONA PURA HIDRO SALICILATO DE TOLUENO GERANIL ACETONA ANTRANILATO DE ISOBUTILA CASSIONA FIRMENICH ISOBUTIRATO DE DIMETILA ISOCICLOCITRAL CEDRENO LAVADO GERANILA ISONONANOL

ACETATO DE ACETATO DE FENIL Sulfeto de farnesol ISONONANILA PURO PROPILA hidrogênio Floridila ISOPENTIRATO ÁLCOOL FENIL metanotiol Florimoss ÁLCOOL ISOPROPÍLICO PROPÍLICO Benzil mercaptano γ-undecalactona MIRISTATO DE PINOACETALDEÍDO 3-mercapto-2-metil- Georgiwood ISOPROPILA POIRENATA 1-butanol Geranodila ISOPROPIL QUINOLINA ACETATO DE PRENILA 3-mercapto-3-metil- Heliotropina ISOPULEGOL PROPIL DIANTILIS 1-hexanol Isobutavano JASMOLACTONA RADJANOL SUPER ácido 2- isoraldeína JASMONA CIS RHUBOFIX mercaptoacético limoneno JASMONILA RHUBOFLOR Sulfeto de dimetila 10-undecilenato de JASMOPIRANO FORTE T ROSAPHEN sulfeto de dialila metila KOHINOOL ACETAL DE RUM 1-BUTILAMINA cinamato de metila LAITONA SCENTENAL trimetilamina Di-hidrojasmonato de ACETAL DE FOLHA PROPIONATO DE Trimetilamina metila LIFFAROME GIV ESTIRALILA 1,5-diaminopentano Salicilato de metila ÓXIDO DE CAL SIRINGALDEÍDO indol undecanoato de LIMETOL SIVERTAL escatol metila ÓXIDO DE LINALOL TANGERINOL ácido 3-metil-2- Almíscar R1 CINAMATO DE LINALILA TERPINENO GAMA hexenoico* NECTARILA FORMATO DE LINALILA TERPINOLENA ácido 3-hidroxi-3- Nirvanolida TETRA-HIDRO CITRAL metil-hexanoico Opalal

ISOBUTIRATO DE LINALILA TRIACETINA (E),(E)-2,4- pandanol Decadienal PROPIONATO DE CITRATO DE TRIETILA Paradisamida LINALILA Geosmina VELOUTONA Éter p-cresil MAGNOLAN amônia metílico

VERDALIA ISOBUTIRATO DE Zinarina Peonile

VERDANTIOL MALTILA 1-ciclo-hexiletanol Pepperwood

VERNALDEÍDO ACETATO DE METANILA acetato de 1-ciclo- Pharaone

VERTOFIX COEUR METIL CAMOMILA hexiletila ACETATO DE Pomarose ALDEÍDO METIL butirato de 1-ciclo- VETIVERILA radjanol CINÂMICO hexiletila VETINAL Rossitol ÉTER METIL propionato de 1- VIOLIFF ciclo-hexiletila Serenolida DIFENÍLICO VIRIDINA sinodor METIL HEPTENONA PURA 10-undecenal AQUANTRAAL 10-undecenol Spirogalbanone LINOLEATO DE METILA (FLEURANTIOL) Stemone ACETATO DE METIL ácido 10- ARBOROMA undecilênico super muguet FENILA AVALONA Argarbois Tanaisone LACTONA DE LEITE ÁLCOOL DE Aldeído MNA Acetato de α- 2067 CARIOFENILENO Ambrofix terpinila

MUSCONA CISTULAC Anapear acetato de tetra- ACETATO DE MIRALDILA CORNOLINA hidrolinalila NEROLIDOL EXTRA Anjeruk ACETATO DE DECILA Tibetolida NEROLIDOL SINTÉTICO Azurona 2-FENILBUTIRATO DE Tonkarose NEROLIDILA Belambre ETILA tridec-2-eno nitrila NEROLIONA cinamato de benzila FORMATO DE INONILA trimofix ACETATO DE NERILA HC Salicilato de PROPIONATO DE Ultravanil NONADIENOL-2,6 benzila INONILA Undecanal ACETATO DE NOPILA beta-pineno MEVANTRAAL ácido undecanoico OCTALACTONA GAMA bourgeonal ACETATO DE OCTILA undecanol ONCIDAL Camonal BENZOATO DE PRENILA Undecavertol ORIVONA acetato de cis-3- FTALETO DE Acetato de verdila hexenila FORMATO DE PROPILIDENO Propionato de OXIOCTALINA Salicilato de cis-3- FLEURANILA verdila hexenila PARSOL 1789 UNDECATRIENO Yara-yara Citral PEOMOSA PROPRIONATO DE CIS- Tonalide® cosmona PERANAT 3-HEXENILA Galaxolide® Ciprisato ÁLCOOL FENÓXI TIGLATO DE CIS-3- Tibetolida ETÍLICO HEXENILA fumarato de di- hexila Cetona de almíscar FORMATO DE FENIL Citronelol Di-hidrofarnesal Xileno de almíscar ETILA Linalol Di-hidromircenol Cashmeran ISOVALERATO DE FENIL Mentona ETILA Acetato de di- Ambretolida Cantoxal CRISTAIS DE hidromircenila Brassilato de lilial etileno SALICILATO DE FENIL Dupical Mefranal Habanolida ETILA monofenoxiacetato de Cariofileno etilenoglicol Velviona

Exaltolida Ácido fenilacético Verdilyn Heptona Almíscar MC4 Borneol Fenilacetaldeído Jasmacicleno Muscenona δ-undecalactona Gardamida Acetato de Hexadecanolida Pivacicleno Vethymine isobornila Ciclopentadecanona Neocaspireno Citronelal Cânfora Almíscar R1 Buccoxime Citronelil nitrila Carvacrol Cervolida Labienoxime Geranil nitrila 1,8-cineol Traseolida Hexanoato de etila Hipo-lem Cistulato Cosmona Glicidato de etil Lemonile Cressanther Nirvanolida metil fenila Acetato de mircenila Herboxano Moxalona Glicidato de etil Iso-butirato de α- d-limoneno Freesiol fenila terpinila Mentol bourgeonal Nonalactona Metil pamplemousse Mirceno Florosa Octa-hidrocumarina Rhubafuran Ocimeno Hidroxicitronelal a-damascona Tioterpineol α-pineno Cíclame aldeído β-damascona Nootcatona Plicatona Lilial δ-damascona Alicato Terpinen-4-ol Liral Damascenona Decanal Thujone Majantol Manzanato Frescile Timol Mayol Applinal Acetato de linalila Benzoato de metila Silvial Ortolato Mandarina aldeído a-ionona Florhydral Glicolato de alil Acetato de veticol β-ionona Furnisal amila 9-decenal α-iso-metilionona Empetal Ciclo- Undeceno-2-nitrila α-irona hexilpropionato de Eugenol Di-hidro-β-ionona Super muguet alila Geraniol Isoeugenol Nitrila de violeta Heptanoato de alila Acetato de geranila Metilisoeugenol Rosyrane Fruitato Acetato de Benzilisoeugenol tiglato de cis-3- Frutonile forte hexenila citronelila Herbanato Di-hidroeugenol Pelargeno Nerol Metil laitona Metil diantilis Tuberato de metila Feniletanol Etil laitona Álcool cinâmico Dispirona Acetato de fenil etila Givescone Cinamaldeído Anisaldeído Tetra-hidrogeraniol Malonato de dietila Nitrila de cinamila Álcool anísico Tetra-hidrolinalol Acetoacetato de Cuminaldeído Nitrila anísica etila Benzofenona Nitrila de cominho a-terpineol Acetato de hexila Óxido de difenila Anetol Álcool benzílico Acetato de isoamila Óxido de rosa Di-hidroanetol Nerolina β- 9-decen-1-ol Toscanol Metil naftil cetona fenoxietilisobutirat Acetato de dimetil o Metilchavicol Aldeído benzil carbinila Felandreno propilenoglicol Cetona de framboesa Mefrosol Safraleína acetal hidrotrópico Butirato de etila Safranato de etila Vanilina Florocicleno Éster de pera Pivarose Etilvanilina Antranilato de Âmbar cetal metila Anther Maltol Ambermax Calixol Radjanol Etilmaltol Cedramber Gyrane Hindinol Levistamel Karanal Salicilato de hexila Polysantol Cumarina Ambrocenida Salicilato de amila Sandalore Para- Ambercore Glicolierral Ebanol metilacetofenona Metambrato Florano Osyrol Para- Okoumal Gardocicleno Javanol metoxiacetofenona Spirambrene Rosacetol Isobornilciclo- Epijasmonato de Undecatrieno metila Cedrol hexanol Cis-3-hexenol Aldeído amil Metil cedril cetona Calone 2,6-nonadienal cinâmico Felvinona Marenil Carbonato de metil Aldeído hexil Azarbre Melonal octina cinâmico floral ozônio Boisambrene Acetato de Di-hidroisojasmonato Maceal Timberol estralilila Acetato de benzila Helional Kefalis Dynascone Propionato de l-carvona Koavone Reseda Body benzila d-carvona Acetato de amborila Ligustral Di-hidrojasmona 1-nonanol Iso-longifolanona Verdoracina Jessato Indol Ciclisona Chrysanthal Quintona Escatol Isoambois Beauvertate Jasmatona Indoclear PTBCHA Pecíolo

PTBCHA cis elevado p-Cresol 2-Metillbutirato de 2-Isobutiltiazol Evernyl Ácido ciclo- metila 2,2’- Isobutilquinoleno hexanoacético 3- (Ditiodimetileno)dif Tetra-hidronaftol Acetato de ciclo- (Metiltio)propionato urano o-cresol hexila de metila Trans-2,cis-4- Propenilguaetol p-Cimeno Metil b-naftil decadienoato de Hexanal cetona etila 2-cumarona -Decalactona Fenilacetato de 2-etil-3,5- Acetal Malato de dietila metila dimetilpirazina Acetaldeído Malonato de dietila Isovalerato de 5-Etil-3-hidroxi-4- Acetaldeído, solução metila metil-2(5H)-furanona de 50% em peso em Sebacato de dietila Ácido 2- 2-etil-3- etanol L-tartrato de metilpentanoico metilpirazina Sulfeto de animônio dietila Octanoato de hexila p-Etilfenol 3-Metil-1-butanol Di-hidrocarveol -Nonalactona Sulfeto de furfuril Benzoato de isoamila p-Dimetoxibenzeno Acetato de nonila metila -Arnilcinanaldeído 2,6-Dimetil-5- Ácido octanoico 2-Furil metil cetona Cinamato de isoamila heptenal Isobutirato de trans-2-Heptenal Álcool - Succinato de dimetila octila 3,4-Hexanodiona amilcinamílico Acrilato de etila Propionato de octila Ácido 3-hexenoico Formato de isoamila p-Anisato de etila Ácido oleico Isobutirato de 2-Furoato de amila hexila Isobutirato de etila Acetato de linalila hexanoato de amila 4-Hidroxi-2,5- Miristato de etila ω-Pentadecalactona Laurato de isoamila dimetil-3(2H)- Nonanoato de etila 2,3-Pentanodiona Octanoato de amila furanona Palmitato de etila 2,3-Pentanodiona, Octanoato de natural p-Menta-8-tiol-3-ona isoamila Piruvato de etila Ácido 2- Ácido 4-pentenoico Salicilato de Tiglato de etila mercaptopropiônico Cinamato de fenetila isoamila Valerato de etila 2-metoxi-3- 2-Furoato de Isovalerato de Isovalerato de etila metilpirazina fenetila isoamila Etil vanilina Ácido 3- Ácido fenoxiacético Acetato de anisila Eucaliptol metilcrotônico 1-Fenil-3-metil-3- Benzaldeído Eugenol 2-Metil-3-furantiol pentanol Ácido benzoico Isoeugenol 1-Metilnaftaleno 2- Benzil mercaptano Metil eugenol Fenilpropionaldeído Ácido trans-2-metil- isoborneol Metil isoeugenol (1S)-(-)- -Pineno 2-pentenoico 2-Butanona Álcool fenchílico (1S)-(-)- -Pineno 5-Metil-2-fenil-2- Acetoacetato de Acetato de furfurila hexenal Piperina isobutila Óleo de gerânio 4-Metil-2-fenil-2- Piperonal, natural Álcool isobutílico Benzoato de geranila pentenal Propionaldeído Benzoato de 2,3-Heptanodiona Dissulfeto de metil 1-Propanol propila isobutila 4-Heptanona Álcool p- Acetato de 4-metil- Butirilacetato de ω-6-Hexadecenlactona isopropilbenzílico 5-tiazoltetanol butila, natural Hexanal Butirato de Formato de butila Isopentilamina Ácido hexanoico isopropila Laurato de butila Fenetilamina trans-2-hexenal, Isobutirato de Levulinato de butila 2-fenil-2-butenal natural propila Álcool - 1-Fenil-1,2- cis-3-Hexen-1-ol Hexanoato de propila isobutilfenetílico, propanodiona Octanoato de hexila Acetato de natural Estireno Ácido láurico isopulegila Propionato de Tetra-hidro-4-metil- Aldeído láurico Piruvaldeído isobutila 2-(2.metil-2-propen- (R)-(+)-Limoneno Salicilaldeído 1-ila) 10-Undecenoato de butila Maltol Escatol pirano Isobutiraldeído L-Mentol -Terpineol Ácido undecanoico Ácid butírico L-Mentona Álcool tetra- 2,6-Xilenol Acetato de metila hidrofurfurílico 2-Acetilpiridina Ácido isobutírico p-Anisato de metila Timol cis-4-Decenal Tributirina 4-Metilanisol Acetato de p-tolila 4,5-Di-hidro- (+)-canfeno Antranilato de Fenilacetato de p- 3(H)tiofenona 4-Carvomentenol, metila tolila 2,4-Dimetil-5- natural Benzoato de metila undecanal acetiltiazol D-Carvona Álcool - Valeraldeído 3,5-Dimetil-1,2- Cinamaldeído metilbenzílico Ácido valérico ciclopentadiona Acetato de cinamila Butirato de metila Vanilina (sigma) Dissulfeto de Citral Cinamato de metila 2-acetilpirazina trimetila Citral dimetil acetal 2-Furoato de metila Butilamina 2-mercaptopropionato Laurato de metila 2-Isobutil-3- de etila Óleo de conhaque metoxipirazina

3-Metilbutanoato de propil mercaptano tiglato de furfurila Pirrolidina citronelila 1-Furfuril pirrol 3,5,5-Trimetil- Diacetina cis-4-Heptenal hexanal Tiglato de isobutila Lactona de ácido 4- 3-Acetil-2,5-dimeti- Tiglato de hexila hidroxibutanoico itiofeno Tiglato de metila -Undecalactona 1,3 Butanoditiol butirato de 2-metoxipirazina Ácido ciclo- furfurila 5H-5-Metil-6,7-di- hexanocarbocílico Heptenoato de hidrociclopenta- 3-Decen-2-ona furfutila [b]pirazina 3-Heptanol Estearato de metila 2-metilpirazina -Terpineno Decanoato de metila 2-Naftalenotiol 1,3-Propanoditiol (p-toliloxi)acetato 5,6,7,8-Tetra- 2,5-Xilenol de metila hidroquinoxalina 4-(Metiltio)butanol Fenchona (-) 2-Acetil-3,5(ou 6)- D-Xilose 3-Metil-3-pentanol dimetilpirazina 2-Acetil-5- Acetovanilona 3-Butilidenoftalida metilfurano 2-Butanol Trans-3-hexenoato de Tiazol (±)-2- etila Benzenotiol Hidroxicaproato de Ácido heptanoico Di-hidro β-ionona etila 4-Hexen-3-ona 2-Metilbutirato de β-Bromoestireno, Trans-2-butenoato de fenetila misturas de isômeros hexila 4,5-Dimetil-3- Tridecanal -Nonalactona hidroxi-2,5-di- Tetra-hidro mircenol 4-(Metiltio)-2- hidrofuran-2-ona Ftalato de dietila butanona Acetato de 2- Galaxolida Safranal metilbutila 1,4 Butanoditiol Acetato de fenchila 3-Metil-2-buten-1-ol 3-etilpiridina 4-Propilfenol Octanoato de 4-Alil-2,6- furfurila dimetoxifenol 2-Heptilfurano 2,5-Dimetil-4- 2-lsopropil-5-metil- metoxi-3(2H)furanona 2-hexenal Tiglato de 1-etil- 3-Octen-2-ona hexila 3-Penten-2-ona 2-Metilbutirato de 2-Undecenal isopropila 3-Hidroxibutirato de 2-Metilpentanoato de etila metila Trans-2-butenoato de Nicotinato de metila isobutila 3-Nonenoato de 2-metoxi-3- metila isobutilpirazina Trans-2-octenoato de 3-(Metiltio)-1- metila hexanol Sorbato de metila Fenilacetato de Fenilacetato de hexila anisila 2-Isopropilfenol Lactato de L/- isobutirato de Mentila maltila Isobutirato de Ácido 4- vanilina metilpentanoico Mentalactona 1-Butanotiol Octa-hidrocumarina Trans-2-butenoato de 2-Pentanotiol etila 2-Acetil-2-tiazolina Etil maltol 3-Careno 2-Metilpentanoato de Dissulfeto de etila isopropila Estearato de etila 1,4-Ditiano Undecanoato de etila Sulfeto de etil 2-, 3- e 10- metila Mercaptopinano 2,6-Dimetiltiofenol Isovalerato de 2- Butirato de 2- metilbutila Pentila 1,9-Nonanoditiol 4-Hidroxibenzaldeído 1,8-Octanoditiol Siringaldeído 2-Furoato de octila

Tabela 2: lista completa de compostos de almíscar testados no OR da invenção, OR5A1,

OR5AN1, OR11A1 (cinza representa experimentos negativos, nenhuma ativação após teste)

Propriedades OR5AN OR11A Nome organoléptica Estrutura Classe OR5A2 OR5A1 1 1 s ambreta cetona de Nitro Mmsqueno -5,73 almíscar doce Almíscar em pós seca

Almíscar Cetona de graxo Nitro -3,97 -6,54 almíscar saponáceo Almíscar seco em pó

Almíscar Xilol de saponáceo Nitro -5,73 -6,18 -5,73 almíscar doce seco Almíscar graxo

Semente de Ambreta de Nitro ambreta doce -5.06 -3,16 almíscar Almíscar almiscarada

Ambreta de almíscar Brassilato de Policíclic floral doce -4.31 -4.18 etileno o em pó amadeirada

Almíscar Tibetolida = animal em pó Policíclic -4.36 -4.06 Exaltolida natural o frutado almíscar doce 1,16- Policíclic bálsamo âmbar -4.39 -3.49 Hexadecalactona o animal

Almíscar animal Policíclic Exaltenona natural -4.81 -5.73 o animal natural

Globanona almíscar Policíclic -5.4 -5.65 (Animusk) floral o almíscar de incenso Policíclic Almíscar R1 -4.72 -4.02 oleoso doce o âmbar animal almíscar em Policíclic Velviona pó seco âmbar -4.54 -4.31 o de civeta almíscar em Ciclopentadecano pó animal Policíclic 6 -4.95 na natural o oleoso

Almíscar doce Policíclic Muscona animal em pó -5.25 -5.37 o natural graxo almíscar puro Policíclic - Civetona seco animal -5.29 o 5.325 doce almíscar Policíclic Almíscar MC4 ceroso puro -4.42 -4.12 o doce animal brassilato de almíscar Policíclic Cervolida -4.52 -4.13 amadeirado o doce frutado

Âmbar de ω-6- almíscar Policíclic -5.17 -4.68 Hexadecenlactona saponáceo o doce frutado odor almiscarado intenso, Policíclic nirvanolida frutado, em -4.71 -3.38 o pó com nuances lactônicas ambreta de almíscar doce Policíclic Isoambretolida -4.72 frutada o cerosa

Policíclic Habanolida almíscar -4.79 -4.18 o nota Policíclic Almíscar 77 semelhante a -5.29 -5,04 o almíscar

Policíclic Oxalida T -5.08 -4.49 o almíscar animal de cedro de Policíclic Crisolida -4.65 -3.92 âmbar o cinzento amadeirado almíscar frutado de Policíclic Tonalide® -6.12 -4.74 âmbar doce o forte em pó almíscar doce forte de Policíclic Fantolida -5.34 -5.12 âmbar em pó o frutado almíscar picante rico Policíclic Cashmeran -4.75 -4.67 amadeirado o puro almíscar floral doce Policíclic Galaxolide® -5.98 difusivo o forte almíscar de âmbar doce Policíclic Traseolida -5.71 -5.15 seco herbal o cremoso

Moxalone® é um ingrediente Policíclic Moxalona -4.53 -3.51 de fragrância o de almíscar da Givaudan ambreta de almíscar Policíclic Vernolida -5.17 -4.81 intensq doce o macrocíclica notas de odor semelhante a almíscar, de Policíclic Fixal calor -4.99 -5.05 o bastante natural, potente

Almíscar de proprionato de Almíscar doce Linear -4.55 ciclopentenila serenolida almíscar Linear -4.66

Sylkolide™ é Silcolida um almíscar Linear -4.75 da Givaudan almiscarado, Helvetolide Linear -3.86 ambreta, pera

SEQ ID N°1; OR5A2_variante 1 P172; OR5A2 Sequência de Nucleotídeos

ATGGCTGTAGGAAGGAACAACACAATTGTGACAAAATTCATTCTCCTGGGACTT TCAGACCATCCTCAAATGAAGATTTTCCTTTTCATGTTATTTCTGGGGCTCTACCTCCT GACGTTGGCCTGGAACTTAAGCCTCATTGCCCTCATTAAGATGGACTCTCACCTGCACA TGCCCATGTACTTCTTCCTCAGTAACCTGTCCTTCCTGGACATCTGCTATGTGTCCTCC ACCGCCCCTAAGATGCTGTCTGACATCATCACAGAGCAGAAAACCATTTCCTTTGTTGG CTGTGCCACTCAGTACTTTGTCTTCTGTGGGATGGGGCTGACTGAATGCTTTCTCCTGG CAGCTATGGCCTATGACCGGTATGCTGCAATCTGCAACCCCTTGCTTTACACAGTCCTC ATATCCCATACACTTTGTTTAAAGATGGTGGTTGGCGCCTATGTGGGTGGATTCCTTAG TTCTTTCATTGAAACATACTCTGTCTATCAGCATGATTTCTGTGGGCCCTATATGATCA ACCACTTTTTCTGTGACCTCCCTCCAGTCCTGGCTCTGTCCTGCTCTGATACCTTCACC AGCGAGGTGGTGACCTTCATAGTCAGTGTTGTCGTTGGAATAGTGTCTGTGCTAGTGGT CCTCATCTCTTATGGTTACATTGTTGCTGCTGTTGTGAAGATCAGCTCAGCTACAGGTA GGACAAAGGCCTTCAGCACTTGTGCCTCTCACCTGACTGCTGTGACCCTCTTCTATGGT TCTGGATTCTTCATGTACATGCGACCCAGTTCCAGCTACTCCCTAAACAGGGACAAGGT GGTGTCCATATTCTATGCCTTGGTGATCCCCGTGGTGAATCCCATCATCTACAGTTTTA GGAATAAGGAGATTAAAAATGCCATGAGGAAAGCCATGGAAAGGGACCCCGGGATTTCT

CACGGTGGACCATTCATTTTTATGACCTTGGGCTAA SEQ ID N°2; OR5A2_variante 1 P172; OR5A2 Tradução

MAVGRNNTIVTKFILLGLSDHPQMKIFLFMLFLGLYLLTLAWNLSLIALIKMDS HLHMPMYFFLSNLSFLDICYVSSTAPKMLSDIITEQKTISFVGCATQYFVFCGMGLTEC FLLAAMAYDRYAAICNPLLYTVLISHTLCLKMVVGAYVGGFLSSFIETYSVYQHDFCGP YMINHFFCDLPPVLALSCSDTFTSEVVTFIVSVVVGIVSVLVVLISYGYIVAAVVKISS ATGRTKAFSTCASHLTAVTLFYGSGFFMYMRPSSSYSLNRDKVVSIFYALVIPVVNPII

YSFRNKEIKNAMRKAMERDPGISHGGPFIFMTLG SEQ ID N°3; OR5A2_variante 2 P172L Sequência de Nucleotídeos

ATGGCTGTAGGAAGGAACAACACAATTGTGACAAAATTCATTCTCCTGGGACTT TCAGACCATCCTCAAATGAAGATTTTCCTTTTCATGTTATTTCTGGGGCTCTACCTCCT GACGTTGGCCTGGAACTTAAGCCTCATTGCCCTCATTAAGATGGACTCTCACCTGCACA TGCCCATGTACTTCTTCCTCAGTAACCTGTCCTTCCTGGACATCTGCTATGTGTCCTCC ACCGCCCCTAAGATGCTGTCTGACATCATCACAGAGCAGAAAACCATTTCCTTTGTTGG CTGTGCCACTCAGTACTTTGTCTTCTGTGGGATGGGGCTGACTGAATGCTTTCTCCTGG CAGCTATGGCCTATGACCGGTATGCTGCAATCTGCAACCCCTTGCTTTACACAGTCCTC ATATCCCATACACTTTGTTTAAAGATGGTGGTTGGCGCCTATGTGGGTGGATTCCTTAG TTCTTTCATTGAAACATACTCTGTCTATCAGCATGATTTCTGTGGGCTCTATATGATCA ACCACTTTTTCTGTGACCTCCCTCCAGTCCTGGCTCTGTCCTGCTCTGATACCTTCACC AGCGAGGTGGTGACCTTCATAGTCAGTGTTGTCGTTGGAATAGTGTCTGTGCTAGTGGT CCTCATCTCTTATGGTTACATTGTTGCTGCTGTTGTGAAGATCAGCTCAGCTACAGGTA GGACAAAGGCCTTCAGCACTTGTGCCTCTCACCTGACTGCTGTGACCCTCTTCTATGGT TCTGGATTCTTCATGTACATGCGACCCAGTTCCAGCTACTCCCTAAACAGGGACAAGGT GGTGTCCATATTCTATGCCTTGGTGATCCCCGTGGTGAATCCCATCATCTACAGTTTTA GGAATAAGGAGATTAAAAATGCCATGAGGAAAGCCATGGAAAGGGACCCCGGGATTTCT

CACGGTGGACCATTCATTTTTATGACCTTGGGCTAA SEQ ID N°4; OR5A2_variante 2 P172L Tradução

MAVGRNNTIVTKFILLGLSDHPQMKIFLFMLFLGLYLLTLAWNLSLIALIKMDS HLHMPMYFFLSNLSFLDICYVSSTAPKMLSDIITEQKTISFVGCATQYFVFCGMGLTEC FLLAAMAYDRYAAICNPLLYTVLISHTLCLKMVVGAYVGGFLSSFIETYSVYQHDFCGL YMINHFFCDLPPVLALSCSDTFTSEVVTFIVSVVVGIVSVLVVLISYGYIVAAVVKISS ATGRTKAFSTCASHLTAVTLFYGSGFFMYMRPSSSYSLNRDKVVSIFYALVIPVVNPII

YSFRNKEIKNAMRKAMERDPGISHGGPFIFMTLG SEQ ID N°5 Ac-FKKSFKL-NH2 SEQ ID N°6

RRLIEDAEYAARG SEQ ID N°7; OR5AN1

MTGGGNITEITYFILLGFSDFPRIIKVLFTIFLVIYITSLAWNLSLIVLIRMDS HLHTPMYFFLSNLSFIDVCYISSTVPKMLSNLLQGQQTITFVGCIIQYFIFSTMGLSES CLMTAMAYDRYAAICNPLLYSSIMSPTLCVWMVLGAYMTGLTASLFQIGALLQLHFCGS NVIRHFFCDMPQLLILSCTDTFFVQVMTAILTMFFGIASALVIMISYGYIGISIMKITS AKGRSKAFNTCASHLTAVSLFYTSGIFVYLSSSSGGSSSFDRFASVFYTVVIPMLNPLI

YSLRNKEIKDALKRLQKRKCC SEQ ID N°8; OR11A1

MEIVSTGNETITEFVLLGFYDIPELHFLFFIVFTAVYVFIIIGNMLIIVAVVSS QRLHKPMYIFLANLSFLDILYTSAVMPKMLEGFLQEATISVAGCLLQFFIFGSLATAEC LLLAVMAYDRYLAICYPLHYPLLMGPRRYMGLVVTTWLSGFVVDGLVVALVAQLRFCGP NHIDQFYCDFMLFVGLACSDPRVAQVTTLILSVFCLTIPFGLILTSYARIVVAVLRVPA GASRRRAFSTCSSHLAVVTTFYGTLMIFYVAPSAVHSQLLSKVFSLLYTVVTPLFNPVI

YTMRNKEVHQALRKILCIKQTETLD SEQ ID N°9; OR5A1

MSITKAWNSSSVTMFILLGFTDHPELQALLFVTFLGIYLTTLAWNLALIFLIRG DTHLHTPMYFFLSNLSFIDICYSSAVAPNMLTDFFWEQKTISFVGCAAQFFFFVGMGLS ECLLLTAMAYDRYAAISSPLLYPTIMTQGLCTRMVVGAYVGGFLSSLIQASSIFRLHFC GPNIINHFFCDLPPVLALSCSDTFLSQVVNFLVVVTVGGTSFLQLLISYGYIVSAVLKI PSAEGRWKACNTCASHLMVVTLLFGTALFVYLRPSSSYLLGRDKVVSVFYSLVIPMLNP

LIYSLRNKEIKDALWKVLERKKVFS SEQ ID N°10; OR5A2 quimérico_variante 1

MTKNQTWVTEFILLGFPLSLRIQMLLSGLFSLLYVFTLLGNGAILGLIWLDSRL HTPMYFFLSNLSFLDICYVSSTAPKMLSDIITEQKTISFVGCATQYFVFCGMGLTECFL LAAMAYDRYAAICNPLLYTVLISHTLCLKMVVGAYVGGFLSSFIETYSVYQHDFCGPYM INHFFCDLPPVLALSCSDTFTSEVVTFIVSVVVGIVSVLVVLISYGYIVAAVVKISSAT GRTKAFSTCASHLTAVTLFYGSGFFMYMRPSSSYSLNRDKVVSIFYALVIPVVNPLIYS

LRNAEVKGALKRVLWKQRSK SEQ ID NO°11; região TM2-TM7 de OR5A2

PMYFFLSNLSFLDICYVSSTAPKMLSDIITEQKTISFVGCATQYFVFCGMGLTE CFLLAAMAYDRYAAICNPLLYTVLISHTLCLKMVVGAYVGGFLSSFIETYSVYQHDFCG PYMINHFFCDLPPVLALSCSDTFTSEVVTFIVSVVVGIVSVLVVLISYGYIVAAVVKIS

SATGRTKAFSTCASHLTAVTLFYGSGFFMYMRPSSSYSLNRDKVVSIFYALVIPVV SEQ ID NO°12; OR2A5

MTKNQTWVTEFILLGFPLSLRIQMLLSGLFSLLYVFTLLGNGAILGLIWLDSRL HTPMYFFLSHLAIIDISYASNNVPKMLTNLGLNKRKTISFVPCTMQTFLYMAFAHTECL ILVMMSYDRYMAVCHPLQYSVIMRWGVCTVLAVTSWACGSLLALVHVVLILRLPFCGPH EINHFFCEILSVLKLACADTWLNQVVIFASSVFILVGPLCLVLVSYSRILAAILRIQSG EGRRKAFSTCSSHLCMVGLFFGSTIVMYMAPKSRHPEEQQKVLSLFYSLFNPMLNPLIY SLRNAEVKGALKRVLWKQRSK

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES

1. Receptor quimérico caracterizado pelo fato de que compreende a região central de OR5A2, que abrange os domínios transmembranares 2 a 7, definidos pela sequência de aminoácidos ID NO:11, que é fundido em sua terminação N à porção química extracelular N-terminal, ao domínio transmembranar 1 e à alça intracelular 1, de um receptor acoplado à proteína G; e que é fundido em sua terminação C à extremidade C-terminal intracelular de um receptor acoplado à proteína G.

2. Receptor quimérico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito receptor acoplado à proteína G é um receptor olfativo.

3. Receptor quimérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o dito receptor acoplado à proteína G é o receptor OR2A5 definido pela SEQ ID NO:12.

4. Uso do receptor quimérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que se destina a identificar moduladores de OR5A2.

5. Uso da região central de OR5A2, que abrange os domínios transmembranares 2 a 7, definidos pela sequência de aminoácidos ID n° 11 ou uma sequência de polipeptídeos que tem pelo menos 95% de identidade de aminoácido e, de preferência, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais, incluindo 100%, de identidade de aminoácido com a SEQ ID NO. 11, caracterizado pelo fato de que se destina a identificar agentes que interferem com a ligação entre o dito receptor OR5A2 e compostos de almíscar.

6. Uso do polipeptídeo de OR5A2 definido pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 ou uma sequência de polipeptídeos que tem pelo menos 80% de identidade de aminoácidos e, de preferência, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais, incluindo 100%, de identidade de aminoácidos com a SEQ ID NO:2, caracterizado pelo fato de que se destina a identificar agentes que interferem com a ligação entre o dito receptor OR5A2 e compostos de almíscar.

7. Método para identificar um agente ou uma amostra contendo um ou mais agentes que interferem na ligação entre o dito receptor OR5A2 e os compostos de almíscar, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que compreende: a) colocar o polipeptídeo de OR5A2 em contato com o dito agente ou amostra; b) medir a atividade de sinalização do dito polipeptídeo de OR5A2 na presença do dito agente ou amostra; e c) comparar a atividade medida na presença do dito agente ou amostra à atividade medida em uma reação em que o dito polipeptídeo de OR5A2 é colocado em contato com um ou mais compostos de almíscar em sua EC50, em que o dito agente ou amostra é identificada como um agente ou uma amostra, que modula a atividade do receptor OR5A2 conforme definido no presente documento quando a quantidade da atividade medida na presença do agente ou amostra é pelo menos 10% da quantidade induzida pelo dito composto (ou compostos) de almíscar em sua EC50.

8. Método para identificar um agente ou uma amostra contendo um ou mais agentes que modulam a atividade do receptor OR5A2, conforme definido no presente documento, sendo que o dito método é caracterizado pelo fato de que compreende: a) colocar o dito polipeptídeo de OR5A2 em contato com um ou mais compostos de almíscar, conforme definido no presente documento, na presença e na ausência de um agente ou amostra; e b) medir uma atividade de sinalização do dito polipeptídeo de OR5A2, e c) comparar a quantidade da dita atividade medida em uma reação contendo o dito polipeptídeo de OR5A2 e composto (ou compostos) de almíscar sem o agente ou amostra à quantidade da dita atividade medida em uma reação contendo o dito polipeptídeo de OR5A2, composto de almíscar e o dito agente ou amostra, em que uma alteração na atividade na presença do agente ou amostra em relação à atividade na ausência do agente ou amostra identifica o dito agente ou amostra como um agente ou amostra que modula a atividade do receptor OR5A2, conforme definido no presente documento.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que um aumento na atividade na presença do dito agente ou amostra em relação à atividade na ausência do dito agente ou amostra identifica o dito agente ou amostra como um agente ou amostra que aumenta a atividade do receptor OR5A2, conforme definido no presente documento.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que uma diminuição na atividade na presença do dito agente ou amostra em relação à atividade na ausência do dito agente ou amostra identifica o dito agente ou amostra como um agente ou uma amostra que diminui a atividade do receptor OR5A2, conforme definido no presente documento.

11. Método para identificar um agente ou uma amostra contendo um ou mais agentes que modulam a atividade do receptor OR5A2, conforme definido no presente documento, sendo que o dito método é caracterizado pelo fato de que compreende: a) colocar o dito polipeptídeo de OR5A2 em contato com um agente ou amostra; b) medir a ligação do dito agente ou amostra ao dito polipeptídeo de OR5A2; e c) comparar a ligação do dito agente ou amostra à ligação do dito polipeptídeo de OR5A2 a um ou mais compostos de almíscar, conforme definido no presente documento, em sua EC50, em que o dito agente ou amostra é identificada como um agente ou uma amostra que modula a atividade do receptor OR5A2, conforme definido no presente documento, quando a quantidade da ligação do dito agente ou amostra é pelo menos 10% da quantidade de ligação do dito composto (ou compostos) de almíscar presente em sua EC50.

12. Método para identificar um agente ou uma amostra contendo um ou mais agentes que modulam a interação entre um ou mais compostos de almíscar, conforme definido no presente documento, e o receptor OR5A2, conforme definido no presente documento, sendo que o dito método é caracterizado pelo fato de que compreende: a) colocar o dito polipeptídeo de OR5A2 em contato com o dito composto (ou compostos) de almíscar na presença e ausência de um agente ou amostra sob condições que permitem a ligação do dito composto (ou compostos) de almíscar ao dito polipeptídeo de OR5A2; e b) medir a ligação do polipeptídeo de OR5A2 ao dito composto (ou compostos) de almíscar, em que uma modulação na ligação na presença do agente ou amostra, em relação à ligação na ausência do agente ou amostra, identifica o dito agente ou amostra como um agente ou uma amostra que modula a interação entre um ou mais compostos de almíscar, conforme definido no presente documento, e o receptor OR5A2, conforme definido no presente documento.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12,

caracterizado pelo fato de que um aumento na ligação na presença do dito agente ou amostra em relação à ligação na ausência do dito agente ou amostra identifica o dito agente ou amostra como um agente ou amostra que aumenta a ligação do receptor OR5A2, conforme definido no presente documento.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que uma diminuição na ligação na presença do dito agente ou amostra em relação à ligação na ausência do dito agente ou amostra identifica o dito agente ou amostra como um agente ou uma amostra que diminui a ligação do receptor OR5A2, conforme definido no presente documento.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 14, caracterizado pelo fato de que o um ou mais compostos de almíscar são detectavelmente marcados, de preferência, com uma porção química selecionada a partir do grupo que consiste em um radioisótopo, um fluoróforo e uma terminação brusca de fluorescência.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 15, caracterizado pelo fato de que o contato é realizado dentro ou sobre uma célula que expressa o dito polipeptídeo de OR5A2, de preferência, em que a dita célula é selecionada dentre:células renais embrionárias humanas (HEK293), células de hamster chinês (CHO), células de macaco (COS), células olfativas primárias, células de

Xenopus, células de inseto, levedura ou bactérias.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 16, caracterizado pelo fato de que a medição é realizada com o uso de um método selecionado dentre deslocamento de marcação, ressonância plasmônica de superfície, transferência de energia de ressonância por fluorescência, terminação brusca de fluorescência e polarização de fluorescência.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 17, caracterizado pelo fato de que a etapa de medir uma atividade de sinalização do receptor OR5A2, conforme definido no presente documento, compreende detectar uma alteração no nível de um segundo mensageiro.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 18, caracterizado pelo fato de que medir a atividade de sinalização compreende usar um ensaio de fluorescência ou luminescência, de preferência, o uso de fluoróforos sensíveis a Ca2+ incluindo fluo3, Fluo4 ou Fura- 2; aequorina ou família Ca3-e Ca6-kit, ou em que os ditos ensaios aplicam um leitor fluorométrico ou luminescente automatizado, tal como FDSS ou FLIPR.

20. Método caracterizado pelo fato de que se destina à preparação de um ativador de odorizante, intensificador de odorizante ou desodorante que compreende as etapas de: a) identificar um agente candidato, de acordo com um dos métodos, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 19, e b) adicionar o dito agente a uma composição para uso como ativador de odorizante, intensificador de odorizante ou um desodorante.