発明の概要
本発明において、驚くべきことに、ORのクラス2に属する嗅覚受容体が、前述の構造的に多様な4つの異なるムスク群によって活性化されることが発見された。これまでのところ、以前に同定されたムスクの受容体のいずれも、4つのグループすべてに対してそのようなレベルの応答性を示していなかった。私たちの日常生活におけるムスクの重要性を考えると、この予想外の発見は、より安全で、生態学的に良性で、調香師および香料会社にとって有用なムスク化合物の同定を可能にするであろう。
本発明は、ニトロムスク、多環式ムスク、大環状ムスクおよび直鎖状ムスクを含むすべての構造的に多様な化学物質群の天然受容体として、ORのクラス2に属する新規な嗅覚受容体(OR)、すなわちOR5A2(本発明のOR)の同定に関する。好ましくは、OR5A2は、配列番号2のアミノ酸配列、または配列番号2に対する、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%または86%のアミノ酸同一性、より好ましくは90%、95%、96%、97%、98%、99%以上(100%を含む)のアミノ酸同一性を有する、ポリペプチド配列によって本明細書で定義され、ムスク化合物によって活性化されうる。本発明は、本明細書で定義されるOR5A2受容体の活性を活性化、模倣、ブロック、阻害、調節または増強する剤のスクリーニングアッセイの基礎として、これらのORポリペプチドとムスク化合物の相互作用を使用することを包含する。
本発明はさらに、アミノ酸配列番号11によって定義される膜貫通ドメイン2~7を包含するOR5A2の中央領域を含むキメラ受容体を提供し、この受容体は、そのN末端がGタンパク質共役型受容体のN末端細胞外部位、膜貫通ドメイン1および細胞内ループ1に融合されており;そしてそのC末端がGタンパク質共役型受容体の細胞内C末端エンドに融合されている。好ましい実施形態では、前記Gタンパク質共役型受容体は、嗅覚受容体または配列番号12で定義されるOR2A5受容体である。また、前記OR5A2のモジュレーターを同定するためのかかるキメラ受容体の使用、ならびに前記OR5A2受容体とムスク化合物との間の結合を妨害する剤を同定するための、アミノ酸配列番号11または配列番号11に対して少なくとも95%のアミノ酸同一性、好ましくは96%、97%、98%、99%以上(100%を含む)のアミノ酸同一性を含むポリペプチド配列によって定義される膜貫通ドメイン2~7を包含するOR5A2の中央領域の使用も提供する。
本発明はまた、本明細書で定義されるOR5A2受容体(配列番号2)またはその受容体の中央領域(膜貫通領域2~7-配列番号11)とムスク化合物との相互作用に基づくスクリーニング方法を実行するためのキットを包含する。
本発明は、本明細書で定義されるOR5A2受容体の活性を調節する剤または1つ以上の剤を含むサンプルを同定する方法を包含し、前記方法は以下を含む:a)本明細書で定義されるORポリペプチドを剤またはサンプルに接触させる工程、ORポリペプチドは、本明細書で定義されるOR5A2受容体(配列番号2)、その中央領域(配列番号11)または前記中央領域を含むキメラ受容体(例えば、配列番号10)のいずれかであり得る;b)前記剤またはサンプルの存在下で、前記ORポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程;およびc)前記剤またはサンプルの存在下で測定された活性を、前記ORポリペプチドが、前記1つ以上のムスク化合物と接触する反応において測定されたEC50での活性と比較する工程であって、前記剤またはサンプルは、剤またはサンプルの存在下で測定された活性の量が、EC50での前記ムスク化合物によって誘導された量の少なくとも10%であるときに、本明細書で定義されるOR5A2受容体の活性を調節する剤またはサンプルとして同定される、工程。
本発明はさらに、本明細書で定義されるOR5A2受容体の活性を調節する剤または1つ以上の剤を含むサンプルを同定する方法を包含し、前記方法は以下を含む:a)前記ORポリペプチドを、剤またはサンプルの存在下および剤およびサンプルの非存在下で、本明細書で定義される1つ以上のムスク化合物と接触させる工程;およびb)本明細書で定義されるORポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程であって、ORポリペプチドは、本明細書で定義されるOR5A2受容体(配列番号2)、その中央領域(配列番号11)または前記中央領域を含むキメラ受容体のいずれかであり得る;およびc)前記剤およびサンプルを含まない前記ORポリペプチドとムスク化合物を含む反応において測定された前記活性の量を前記ORポリペプチド、ムスク化合物および前記剤またはサンプルを含む反応において測定された前記活性の量と比較する工程であって、前記剤およびサンプルの非存在下における活性に対する前記剤またはサンプルの存在下における活性の変化が、本明細書で定義されるOR5A2受容体の活性を調節する剤またはサンプルとして、前記剤またはサンプルを同定する工程。
本発明はさらに、本明細書で定義されるOR5A2受容体の活性を増加させる剤または1種以上の剤を含むサンプルを同定する方法を包含し、前記方法は以下を含む:a)剤またはサンプルの存在下ならびに剤およびサンプルの非存在下で、前記ムスク化合物による前記ORポリペプチドの活性化を可能にする条件下で、本明細書で定義されるORポリペプチドを、本明細書で定義される1種以上のムスク化合物と接触させる工程、ORポリペプチドは、本明細書で定義されるOR5A2受容体(配列番号2)、その中央領域(配列番号11)または前記中央領域を含むキメラ受容体のいずれかであり得る;およびb)前記ORポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程であって、前記剤およびサンプルの非存在下での活性に対する前記剤またはサンプルの存在下での活性の変化が、前記剤またはサンプルを本明細書で定義されるOR5A2受容体の活性を増加させる剤またはサンプルとして同定する工程。
本発明はさらに、本明細書で定義されるOR5A2受容体の活性を低下させる剤または1種以上の剤を含むサンプルを同定する方法を包含し、前記方法は以下を含む:a)剤またはサンプルの存在下および剤およびサンプルの非存在下で、前記ムスク化合物による前記ORポリペプチドの活性化を可能にする条件下で、本明細書で定義されるORポリペプチドを、本明細書で定義される1種以上のムスク化合物と接触させる工程、ORポリペプチドは、本明細書で定義されるOR5A2受容体(配列番号2)、その中央領域(配列番号11)または前記中央領域を含むキメラ受容体のいずれかであり得る;およびb)前記ORポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程であって、前記剤およびサンプルの非存在下での活性に対する前記剤またはサンプルの存在下での活性の変化が、前記剤またはサンプルを本明細書で定義されるOR5A2受容体の活性を低下させる剤またはサンプルとして同定する工程。
本発明は、本明細書で定義されるOR5A2受容体の活性を調節する剤または1つ以上の剤を含むサンプルを同定する方法を包含し、前記方法は、以下を含む:a)本明細書で定義されるORポリペプチドを、剤またはサンプルと接触させる工程、ORポリペプチドは、本明細書で定義されるOR5A2受容体(配列番号2)、その中央領域(配列番号11)または前記中央領域を含むキメラ受容体のいずれかであり得る;b)前記剤またはサンプルと前記ORポリペプチドとの結合を測定する工程;、およびc)本明細書で定義される1つ以上のムスク化合物に対する、前記剤またはサンプルとの結合を前記ORポリペプチドとのEC50での結合と比較する工程であって、前記剤またはサンプルの結合量が、そのEC50で存在する前記ムスク化合物の結合量の少なくとも10%であるとき、前記剤またはサンプルは、本明細書で定義されるOR5A2受容体の活性を調節する剤またはサンプルとして同定される工程。
本発明はさらに、本明細書に定義される1つ以上のムスク化合物と本明細書に定義されるOR5A2受容体との間の相互作用を調節する剤または1つ以上の剤を含むサンプルを同定する方法を包含し、前記方法は以下を含む:a)剤またはサンプルの存在下ならびに剤およびサンプルの非存在下、前記ムスク化合物の結合を可能にする条件下で、本明細書に定義されるORポリペプチドを前記ムスク化合物に接触させる工程、ORポリペプチドは、本明細書に定義されるOR5A2受容体(配列番号2)、その中央領域(配列番号:11)または前記中央領域を含むキメラ受容体のいずれかであり得る;およびb)前記ORポリペプチドと前記ムスク化合物との結合を測定する工程であって、剤およびサンプルの非存在下での結合に対する剤またはサンプルの存在下での結合のモジュレーションが、前記剤またはサンプルが、本明細書で定義される1つ以上のムスク化合物と本明細書で定義されるOR5A2受容体との間の相互作用を調節する剤またはサンプルとして、前記剤またはサンプルを同定する工程。
本発明によれば、結合方法を使用する場合、1種以上のムスク化合物を検出可能に標識することができる。前記方法において、前記ムスク化合物は、放射性同位体、蛍光体および蛍光消光剤からなる群から選択される部分を用いて検出可能に標識されていてもよい。
先行する方法のいずれかの一実施形態において、接触は、本明細書で定義されるORポリペプチドを発現する細胞内または細胞上で行われ、ORポリペプチドは、本明細書で定義されるOR5A2受容体(配列番号2)、その中央領域(配列番号11)または前記中央領域を構成するキメラ受容体のいずれかであり得る。本発明によれば、前記細胞は、ヒト胚性腎臓細胞(HEK293)、チャイニーズハムスター細胞(CHO)、サル細胞(COS)、一次嗅覚細胞、アフリカツメガエル細胞、昆虫細胞、酵母または細菌であってもよいが、これらに限定されない。
先行する方法のいずれかの別の実施形態では、接触は、本明細書に定義されるORポリペプチドを含む、合成リポソーム(Tajib et al. 2000年、Nature Biotechnology 18: 649-654、参照により本明細書に組み込まれる)またはウイルス誘発出芽膜中で、またはその上で行われ、該ORポリペプチドは、本明細書に定義されるOR5A2受容体(配列番号2)、その中央領域(配列番号11)、または前記中央領域を構成するキメラ受容体(WO0102551、2001年、参照により本明細書に組み込まれる)のいずれかであり得る。
先行する方法のいずれかの別の実施形態では、方法は、本明細書で定義されるORポリペプチドを発現する細胞からの膜画分を用いて実施され、該ORポリペプチドは、本明細書で定義されるOR5A2受容体(配列番号2)、その中央領域(配列番号11)、または前記中央領域を構成するキメラ受容体のいずれかであり得る。
先行する方法のいずれかの好ましい実施形態では、方法は、プロテインチップ上で実施される。
先行する方法のいずれか1つの別の好ましい実施形態では、測定は、ラベル置換、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光消光、および蛍光偏光から選択される方法を用いて行われる。
先行する方法のいずれかの別の実施形態では、剤は、ペプチド、ポリペプチド、抗体またはその抗原結合フラグメント、脂質、炭水化物、核酸、および有機低分子からなる群から選択される。
本発明によれば、機能的アッセイが使用される場合、本明細書で定義されるOR5A2受容体のシグナル伝達活性を測定するステップは、セカンドメッセンジャーのレベルの変化を検出することを含んでもよい。
別の実施形態では、シグナル伝達活性を測定するステップは、グアニンヌクレオチド結合/共役または交換、アデニル酸シクラーゼ活性、cAMP、プロテインキナーゼC活性、プロテインキナーゼA活性ホスファチジルイノシトール分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウム、カルシウムフラックス、アラキドン酸、MAPキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性、メラノフォアアッセイ、受容体初期化アッセイ、またはレポーター遺伝子発現の測定を含む。Gタンパク質の結合/共役または交換を測定する場合、可能な全てのGαサブユニットのうち、好ましくはGTP結合タンパク質のGタンパク質のアルファー-olfサブユニット(嗅覚)、G-olfともいう、の挙動を調べる。ヒトG-olfサブユニットの配列は、アクセッション番号L10665で以前にGenebankに寄託されている。しかしながら、他の種のG-olfサブユニットを使用し、研究してもよい。
好ましい実施形態では、シグナル伝達活性の測定は、蛍光または発光アッセイを使用することを含む。蛍光アッセイおよび発光アッセイは、fluo3、Fluo4またはFura(分子プローブ);Ca3およびCa6-kitファミリー(分子デバイス)、およびエクオリン(aequorin)などのCa2+感受性蛍光体の使用を含んでもよい。さらに、前記アッセイは、FDSS(Hammamatsu)またはFLIPR(分子デバイス)などの自動化された蛍光または発光リーダーを適用してもよい。
本発明はさらに、細胞内で本明細書で定義されるOR5A2受容体の活性を調節する方法を包含し、前記方法は、ORの活性が調節されるように、本明細書で定義されるムスク化合物または本明細書で定義されるORポリペプチドの活性を調節する剤を前記細胞に送達するステップを含み、ORポリペプチドは、本明細書で定義されるOR5A2受容体(配列番号2)、その中央領域(配列番号11)または前記中央領域を含むキメラ受容体のいずれかであり得る。
先行する方法のいずれか1つの別の実施形態において、方法は、ハイスループットスクリーニング方法である。
先行する方法のいずれか1つの別の実施形態において、前記剤は、化学ライブラリーまたは動物器官抽出物の一部である。
本発明によれば、先行する方法のいずれかによって同定または検出された剤、または前記剤を含む組成物は、新規なムスク化合物を見出すために使用してもよい。あるいは、これらを臭気活性化剤または臭気増強剤の調製に使用してもよい。例えば、OR活性化剤または増強剤を消臭剤として使用してもよい。OR活性化剤または増強剤は、既に消臭剤として使用されている香料または香水の製剤に、その効力を強化するために添加してもよい。
本発明はまた、単離されたORポリペプチドとムスク化合物を含む組成物を包含する。
本発明はさらに、本明細書で定義されるOR5A2受容体のシグナル伝達を調節する剤をスクリーニングするためのキットの製造のためのムスク化合物の使用、または臭気活性化剤または臭気増強剤をスクリーニングするためのキットの製造のための本明細書で定義されるOR5A2受容体と併用するムスク化合物の使用にも関する。
さらに、本発明は、本明細書で定義されるOR5A2受容体のためのリガンドとして、商業的または非商業的に入手可能なムスク化合物の使用を包含する。
本発明はさらに、単離されたOR5A2ポリペプチド、本明細書に定義された1つ以上のムスク化合物、およびそのための包装材料を含むキット;本明細書に定義されたORポリペプチド(本明細書に定義されたOR5A2受容体(配列番号2)、その中央領域(配列番号11)、または前記中央領域を含むキメラ受容体のいずれかであり得る)をコードする単離されたポリヌクレオチド、1つ以上のムスク化合物、およびそのための包装材料;前記ORポリペプチドを発現する細胞またはその膜、または前記ORポリペプチドを発現する複数の細胞またはその膜、本明細書で定義される1つ以上のムスク化合物、およびそのための包装材料を含むキットを包含する。前記細胞は、前記ORをコードするポリヌクレオチドで形質転換されてもよい。好ましい実施形態では、前記キットは、本明細書で定義されるOR5A2受容体、または前記ORの任意の変異体、および本明細書で定義される1つ以上のムスク化合物を包含する。
したがって、本発明は、以下の態様を提供する。
態様1.前記OR5A2受容体と1つ以上のムスク化合物との間の結合を妨害する剤を同定するための、配列番号2のアミノ酸配列、または配列番号2に対して少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド配列、好ましくは90%、95%、96%、97%、98%、99%以上(100%を含む)のアミノ酸同一性を有するポリペプチド配列によって定義されるOR5A2ポリペプチドの使用。
態様2.OR5A2ポリペプチドの活性を調節する、剤または1つ以上の剤を含むサンプルを同定する方法であって、前記方法は以下を含む:
a)OR5A2ポリペプチドを前記剤またはサンプルと接触させる工程;
b)前記剤またはサンプルの存在下で前記OR5A2ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程;および
c)前記剤またはサンプルの存在下で測定された活性を、前記OR5A2ポリペプチドが1つ以上のムスク化合物と接触する反応において測定されたEC50での活性と比較する工程であって、前記剤またはサンプルは、剤またはサンプルの存在下で測定された活性の量が、EC50での前記ムスク化合物によって誘導された量の少なくとも10%であるときに、本明細書で定義されるOR5A2受容体の活性を調節する剤またはサンプルとして同定される、工程。
態様3.本明細書に定義されるOR5A2受容体の活性を調節する剤または1つ以上の剤を含むサンプルを同定する方法であって、前記方法は以下を含む:
a)前記OR5A2ポリペプチドを、剤またはサンプルの存在下および剤およびサンプルの非存在下で、本明細書に定義される1種以上のムスク化合物と接触させる工程;および
b)前記OR5A2ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程、および
c)剤およびサンプルを含まない前記OR5A2ポリペプチドおよびムスク化合物を含む反応において測定された前記活性の量を、前記OR5A2ポリペプチド、ムスク化合物および前記剤またはサンプルを含む反応において測定された前記活性の量と比較する工程であって、前記剤およびサンプルの非存在下における活性に対する前記剤またはサンプルの存在下における活性の変化が、本明細書で定義されるOR5A2受容体の活性を調節する剤またはサンプルとして、前記剤またはサンプルを同定する工程。
態様4.前記剤およびサンプルの非存在下での活性に対する前記剤またはサンプルの存在下での活性の増加が、本明細書で定義されるOR5A2受容体の活性を増加させる剤またはサンプルとして前記剤またはサンプルを同定する、態様3に記載の方法。
態様5.前記剤およびサンプルの非存在下での活性に対する前記剤またはサンプルの存在下での活性の減少が、本明細書で定義されるOR5A2受容体の活性を減少させる剤またはサンプルとして前記剤またはサンプルを同定する、態様3に記載方法。
態様6.本明細書で定義されるOR5A2受容体の活性を調節する剤または1つ以上の剤を含むサンプルを同定する方法であって、前記方法は以下を含む:a)前記OR5A2ポリペプチドを剤またはサンプルと接触させる工程;b)前記剤またはサンプルと前記OR5A2ポリペプチドとの結合を測定する工程;およびc)本明細書で定義される1つ以上のムスク化合物に対する、前記剤またはサンプルとの結合を前記OR5A2ポリペプチドとのEC50での結合と比較する工程であって、前記剤またはサンプルの結合量が、そのEC50で存在する前記ムスク化合物の結合量の少なくとも10%であるとき、前記剤またはサンプルは、本明細書で定義されるOR5A2受容体の活性を調節する剤またはサンプルとして同定される工程。
態様7.本明細書で定義される1つ以上のムスク化合物と本明細書で定義されるOR5A2受容体との間の相互作用を調節する剤または1つ以上の剤を含むサンプルを同定する方法であって、前記方法は以下を含む:a)前記ムスク化合物の前記OR5A2ポリペプチドへ結合を可能にする条件下、剤またはサンプルの存在下ならびに剤およびサンプルの非存在下で、前記OR5A2ポリペプチドを前記ムスク化合物と接触させる工程;およびb)前記OR5A2ポリペプチドと前記ムスク化合物の結合を測定する工程であって、剤およびサンプルの非存在下での結合に対する剤またはサンプルの存在下での結合のモジュレーションが、前記剤またはサンプルが、本明細書で定義される1つ以上のムスク化合物と本明細書で定義されるOR5A2受容体との間の相互作用を調節する剤またはサンプルとして、前記剤またはサンプルを同定する工程。
態様8.前記剤およびサンプルの非存在下での結合に対する前記剤またはサンプルの存在下での結合の増加が、本明細書で定義されるOR5A2受容体の結合を増加させる剤またはサンプルとして前記剤またはサンプルを同定する、態様7に記載の方法。
態様9.前記剤およびサンプルの非存在下での結合に対する前記剤またはサンプルの存在下での結合の減少が、本明細書で定義されるOR5A2受容体の結合を減少させる剤またはサンプルとして前記剤またはサンプルを同定する、態様7に記載の方法。
態様10.1つ以上のムスク化合物が、好ましくは、放射性同位体、蛍光体および蛍光消光剤からなる群から選択される部分で検出可能に標識されている、態様2~9のいずれか1つに記載の方法。
態様11.接触が、前記OR5A2ポリペプチドを発現する細胞中、または細胞上で行われる、好ましくは、前記細胞が、ヒト胚性腎臓細胞(HEK293)、チャイニーズハムスター細胞(CHO)、サル細胞(COS)、一次嗅覚細胞、アフリカツメガエル細胞、昆虫細胞、酵母または細菌から選択される、態様2~10のいずれか1つに記載の方法。
態様12.接触が、OR5A2ポリペプチドを含む合成リポソームまたはウイルス誘導出芽膜中、またはその上で行われる、態様2~11のいずれか1つに記載の方法。
態様13.方法が、前記OR5A2ポリペプチドを発現する細胞からの膜画分を用いて、またはプロテインチップ上で行われる、態様2~12のいずれか1つに記載の方法。
態様14.測定が、ラベル置換、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光消光および蛍光偏光から選択される方法を用いて行われる、態様2~13のいずれか1つに記載の方法。
態様15.剤が、ペプチド、ポリペプチド、抗体または抗原結合フラグメント、脂質、炭水化物、核酸、および有機低分子からなる群から選択される、態様2~14のいずれか1つに記載の方法。
態様16.本明細書で定義されるOR5A2受容体のシグナル伝達活性を測定するステップが、セカンドメッセンジャーのレベルの変化を検出することを含む、態様2~14のいずれか1つに記載の方法。
態様17.シグナリング伝達活性を測定することが、蛍光または発光アッセイを使用すること、好ましくはfluo3、Fluo4もしくはFura-2;Ca3およびCa6キットファミリーもしくはエクオリンを含むCa2+感受性蛍光体の使用を含む、または前記アッセイがFDSSまたはFLIPRなどの自動化された蛍光または発光リーダーを適用する、態様2~16のいずれか1つに記載の方法。
態様18.前記方法がハイスループットスクリーニング方法である、態様2~17のいずれか1つに記載の方法。
態様19.剤が化学ライブラリーまたは動物器官抽出物の一部である、態様2~18のいずれか1つに記載の方法。
態様20.本明細書で定義されるOR5A2受容体の活性を細胞内で調節する方法であって、前記方法は、OR5A2の活性が調節されるように、前記細胞にムスク化合物または前記OR5A2ポリペプチドの活性を調節する剤を送達するステップを含む、方法。
態様21.臭気活性化剤、臭気増強剤、または消臭剤を調製する方法であって、以下のステップを含む:
a)態様3~20のいずれか1つの方法に記載の候補剤を同定する工程、および
b)前記剤を、臭気活性化剤、臭気増強剤または消臭剤として使用するための組成物に添加する工程。
態様22.単離されたOR5A2ポリペプチド、1つ以上のムスク化合物、およびそのための包装材料を含むキット。
態様23.OR5A2ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、1つ以上のムスク化合物、およびそのための包装材料を含むキット。
態様24.前記OR5A2ポリペプチドを発現する細胞もしくはその膜、またはOR5A2ポリペプチドを発現する複数の細胞もしくはその膜、本明細書で定義される1つ以上のムスク化合物、およびそのための包装材料を含むキット。
態様25.OR5A2受容体のシグナル伝達を調節する剤をスクリーニングするための、好ましくは、臭気活性化剤、臭気増強剤または消臭剤として使用しうる剤のスクリーニングのための、態様22~24のいずれか1つに記載のキットの使用。
態様26.OR5A2受容体のリガンドとしてのムスク化合物の使用。
態様27.OR5A2受容体と1つ以上のムスク化合物との相互作用に基づくスクリーニング方法を実行するための、態様22~26のいずれか1つに記載のキットの使用。
態様28.前記ムスク化合物が、ニトロムスク化合物、直鎖状ムスク化合物、多環式ムスク化合物および大環状ムスク化合物からなる群から選択される、先行する態様のいずれかに記載の使用または方法。
態様29.前記ニトロムスク化合物および/または前記直鎖状ムスク化合物および/または前記多環式ムスク化合物および/または前記大環状ムスク化合物が、表2に示される分子の群から選択される、態様28に記載の使用または方法。
図1:A.4つの構造的に多様なムスク群の代表的な6つの異なるムスク(大環状ムスク:オキサリドTとセルボライド;多環式ムスク:カシメランとファントライド;ニトロムスク:モスケン、脂環状ムスク:シルコライド)に対応する異なる活性化剤を用いた本発明のOR(すなわちOR5A2、OR5A2変異体_1)の濃度反応解析。これらの解析は、「実験手順」に記載されている手順に従って実施した。pEFIBRHOは空ベクターに相当し、コントロールとして使用した。B.濃度反応解析に用いた様々なムスクの構造(図1A)
図1:A.4つの構造的に多様なムスク群の代表的な6つの異なるムスク(大環状ムスク:オキサリドTとセルボライド;多環式ムスク:カシメランとファントライド;ニトロムスク:モスケン、脂環状ムスク:シルコライド)に対応する異なる活性化剤を用いた本発明のOR(すなわちOR5A2、OR5A2変異体_1)の濃度反応解析。これらの解析は、「実験手順」に記載されている手順に従って実施した。pEFIBRHOは空ベクターに相当し、コントロールとして使用した。B.濃度反応解析に用いた様々なムスクの構造(図1A)
図2:A.OR5A2変異体_1(配列番号2)、OR5A2変異体_2(配列番号4)、OR5AN1(配列番号7)、OR11A1(配列番号8)、およびOR5A1(配列番号9)タンパク質のポリペプチド配列のアラインメントにクラスタル(Clustal)W2を使用した。黒いボックスは、5つの異なるORにおける同一のヌクレオチドおよび保存されたモチーフを示す。B.OR5A2が、いくつかのムスクサブファミリーに応答することが知られている2つの受容体であるOR5AN1またはOR11A1よりも、ベータ-イオノンによって活性化される受容体であるOR5A1に近いことを示す距離行列(distance matrix)。
図2:A.OR5A2変異体_1(配列番号2)、OR5A2変異体_2(配列番号4)、OR5AN1(配列番号7)、OR11A1(配列番号8)、およびOR5A1(配列番号9)タンパク質のポリペプチド配列のアラインメントにクラスタル(Clustal)W2を使用した。黒いボックスは、5つの異なるORにおける同一のヌクレオチドおよび保存されたモチーフを示す。B.OR5A2が、いくつかのムスクサブファミリーに応答することが知られている2つの受容体であるOR5AN1またはOR11A1よりも、ベータ-イオノンによって活性化される受容体であるOR5A1に近いことを示す距離行列(distance matrix)。
図3:A.記載されたOR5A1の活性化剤であるベータ-イオノンを用いた、本発明のOR(すなわち、本明細書で定義されるOR5A2)、OR5AN1、OR11A1、およびOR5A1の濃度反応解析。pEFIBRHOは空ベクターに相当し、コントロールとして使用する。結果は、ベータ-イオノンがOR5A1のみを活性化できることを示している。B.記載されたOR5A1の活性化剤であるエチル-フェンコールを用いた、本発明のOR(すなわち、本明細書で定義されるOR5A2)、OR5AN1、OR11A1、およびOR5A1の濃度反応解析。pEFIBRHOは空ベクターに相当し、コントロールとして使用する。結果は、エチルフェンコールがOR11A1のみを活性化できることを示している。
図4:OR5A2変異体_1(配列番号2)およびOR5A2変異体2(配列番号4)のポリペプチド配列アラインメントにBLASTPを使用する。タンパク質の配列アラインメントは、1つのアミノ酸置換(太字、下線)を示している:プロリン(P)は、位置172でロイシン(L)に置換されている。
図5:4つの構造的に多様なムスク群の代表的な6つの異なるムスク(ムスクキシレン、セレノライド、ガラクソリド(登録商標)、ベルビオーネ、カシメラン、ムスクケトン)に対応する異なる活性化剤を用いた、本発明のOR(すなわち、OR5A2変異体_1)、OR5A2変異体_2、および空ベクターpEFIBRHOの濃度反応解析。OR5A2変異体_1のみ、種々の被験ムスクに対して用量反応曲線を示す。
図5:4つの構造的に多様なムスク群の代表的な6つの異なるムスク(ムスクキシレン、セレノライド、ガラクソリド(登録商標)、ベルビオーネ、カシメラン、ムスクケトン)に対応する異なる活性化剤を用いた、本発明のOR(すなわち、OR5A2変異体_1)、OR5A2変異体_2、および空ベクターpEFIBRHOの濃度反応解析。OR5A2変異体_1のみ、種々の被験ムスクに対して用量反応曲線を示す。
図5:4つの構造的に多様なムスク群の代表的な6つの異なるムスク(ムスクキシレン、セレノライド、ガラクソリド(登録商標)、ベルビオーネ、カシメラン、ムスクケトン)に対応する異なる活性化剤を用いた、本発明のOR(すなわち、OR5A2変異体_1)、OR5A2変異体_2、および空ベクターpEFIBRHOの濃度反応解析。OR5A2変異体_1のみ、種々の被験ムスクに対して用量反応曲線を示す。
図5:4つの構造的に多様なムスク群の代表的な6つの異なるムスク(ムスクキシレン、セレノライド、ガラクソリド(登録商標)、ベルビオーネ、カシメラン、ムスクケトン)に対応する異なる活性化剤を用いた、本発明のOR(すなわち、OR5A2変異体_1)、OR5A2変異体_2、および空ベクターpEFIBRHOの濃度反応解析。OR5A2変異体_1のみ、種々の被験ムスクに対して用量反応曲線を示す。
図5:4つの構造的に多様なムスク群の代表的な6つの異なるムスク(ムスクキシレン、セレノライド、ガラクソリド(登録商標)、ベルビオーネ、カシメラン、ムスクケトン)に対応する異なる活性化剤を用いた、本発明のOR(すなわち、OR5A2変異体_1)、OR5A2変異体_2、および空ベクターpEFIBRHOの濃度反応解析。OR5A2変異体_1のみ、種々の被験ムスクに対して用量反応曲線を示す。
図5:4つの構造的に多様なムスク群の代表的な6つの異なるムスク(ムスクキシレン、セレノライド、ガラクソリド(登録商標)、ベルビオーネ、カシメラン、ムスクケトン)に対応する異なる活性化剤を用いた、本発明のOR(すなわち、OR5A2変異体_1)、OR5A2変異体_2、および空ベクターpEFIBRHOの濃度反応解析。OR5A2変異体_1のみ、種々の被験ムスクに対して用量反応曲線を示す。
図6:A.OR5A2変異体_1(OR5A2)(配列番号2)およびキメラOR5A2_変異体 1(配列番号2)タンパク質のポリペプチド配列のアラインメントにClustalW2を使用する。黒いボックスは、異なるORにおける同一のヌクレオチドおよび保存されたモチーフを表す。B.4つの構造的に多様なムスク群の代表的な6つの異なるムスク(ムスクキシレン、セレノライド、ガラクソリド(登録商標)、ベルビオーネ、カシメラン、ムスクケトン)に対応する異なる活性化剤を用いた、キメラOR5A2_変異体1およびOR2A5の濃度反応解析。OR2A5(右パネル)ではなく、キメラOR5A2_変異体1(左パネル)のみが、種々の被験ムスクに対して用量反応曲線を示す。C.OR5A1とOR11A1の活性化剤として記載されているベータ-イオノンとエチルフェンコールを用いた、キメラOR5A2_変異体1の濃度反応解析。pEFIBRHOは空ベクターに相当し、コントロールとして使用する。結果は、ベータ-イオノンおよびエチル-フェンコールがキメラOR5A2_変異体1を活性化することができないことを示している。キメラOR5A2_変異体1(cf.配列番号10)は、本発明のORと同じ特異性を有する。
図6:A.OR5A2変異体_1(OR5A2)(配列番号2)およびキメラOR5A2_変異体 1(配列番号2)タンパク質のポリペプチド配列のアラインメントにClustalW2を使用する。黒いボックスは、異なるORにおける同一のヌクレオチドおよび保存されたモチーフを表す。B.4つの構造的に多様なムスク群の代表的な6つの異なるムスク(ムスクキシレン、セレノライド、ガラクソリド(登録商標)、ベルビオーネ、カシメラン、ムスクケトン)に対応する異なる活性化剤を用いた、キメラOR5A2_変異体1およびOR2A5の濃度反応解析。OR2A5(右パネル)ではなく、キメラOR5A2_変異体1(左パネル)のみが、種々の被験ムスクに対して用量反応曲線を示す。C.OR5A1とOR11A1の活性化剤として記載されているベータ-イオノンとエチルフェンコールを用いた、キメラOR5A2_変異体1の濃度反応解析。pEFIBRHOは空ベクターに相当し、コントロールとして使用する。結果は、ベータ-イオノンおよびエチル-フェンコールがキメラOR5A2_変異体1を活性化することができないことを示している。キメラOR5A2_変異体1(cf.配列番号10)は、本発明のORと同じ特異性を有する。
図6:A.OR5A2変異体_1(OR5A2)(配列番号2)およびキメラOR5A2_変異体 1(配列番号2)タンパク質のポリペプチド配列のアラインメントにClustalW2を使用する。黒いボックスは、異なるORにおける同一のヌクレオチドおよび保存されたモチーフを表す。B.4つの構造的に多様なムスク群の代表的な6つの異なるムスク(ムスクキシレン、セレノライド、ガラクソリド(登録商標)、ベルビオーネ、カシメラン、ムスクケトン)に対応する異なる活性化剤を用いた、キメラOR5A2_変異体1およびOR2A5の濃度反応解析。OR2A5(右パネル)ではなく、キメラOR5A2_変異体1(左パネル)のみが、種々の被験ムスクに対して用量反応曲線を示す。C.OR5A1とOR11A1の活性化剤として記載されているベータ-イオノンとエチルフェンコールを用いた、キメラOR5A2_変異体1の濃度反応解析。pEFIBRHOは空ベクターに相当し、コントロールとして使用する。結果は、ベータ-イオノンおよびエチル-フェンコールがキメラOR5A2_変異体1を活性化することができないことを示している。キメラOR5A2_変異体1(cf.配列番号10)は、本発明のORと同じ特異性を有する。
図7:受容体OR5A2、OR5A1、OR5AN1およびOR11A1に対する(A)ムスクアンブレットおよび(B)モスケンの用量反応曲線。
図8:受容体OR5A2、OR5A1、OR5AN1及びOR11A1に対する(A)シルコライド及び(B)セレノライドの用量反応曲線。
図9:受容体OR5A2、OR5A1、OR5AN1およびOR11A1に対する(A)カシメラン、(B)フィクサルおよび(C)ガラクソリド(登録商標)の用量反応曲線。
図9:受容体OR5A2、OR5A1、OR5AN1およびOR11A1に対する(A)カシメラン、(B)フィクサルおよび(C)ガラクソリド(登録商標)の用量反応曲線。
図10:受容体OR5A2、OR5A1、OR5AN1およびOR11A1に対する(A)エチレンブラシレート、(B)アンブレトリドおよび(C)セルボライドの用量反応曲線。
図10:受容体OR5A2、OR5A1、OR5AN1およびOR11A1に対する(A)エチレンブラシレート、(B)アンブレトリドおよび(C)セルボライドの用量反応曲線。
発明の詳細な説明
定義
本明細書で使用される、用語「嗅覚受容体ポリペプチド(OR)」は、一般に、嗅覚ニューロンによって主に発現されるGタンパク質共役型受容体ファミリーからのポリペプチドを指す。ORは、臭気分子と相互作用し、臭気信号を伝達する能力を有している可能性がある。
用語「本発明に記載の嗅覚受容体(OR)」または「本発明に記載の嗅覚受容体ポリペプチド」または「本発明のOR」または「本明細書で定義されるOR5A2受容体」または「前記ORポリペプチド」は、限定されないが、本明細書で定義されるムスク化合物によって活性化されうる、「配列表」の配列番号2および4で参照されるポリペプチド配列にそれぞれ対応する、「OR5A2_変異体_1」および「OR5A2_変異体_2」などのハプロタイプ変異体を含む嗅覚受容体ファミリー5サブファミリーAメンバー2を表す。本明細書で定義されるOR5A2受容体としては、本明細書で定義されるムスク化合物によって活性化される能力を維持する「配列表」の(配列番号2)で表される配列に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、または86%のアミノ酸同一性、好ましくは90%、95%、96%、97%、98%、99%以上(100%を含む)のアミノ酸同一性を有するポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。前記相同性は、ポリペプチド全体に関連していてもよいし、CDRドメイン(受容体のリガンド結合ドメイン)などのポリペプチドの一部のみに関連していてもよい。PilpelおよびLancet(Protein Science 8:969-977, 1999)によれば、GPCRのCDRドメインは、公表されている適用に従って定義され得る。TM3-#4、TM3-#8、TM3-#11、TM3-#12、TM3-#15、TM4-#11、TM4-#15、TM4-#19、TM4-#22、TM4-#23、TM4-#26、TM5-#3、TM5-#6、TM5-#7、TM5-#10、TM5-#11、およびTM5-#13であり、ここで、TMxは前記受容体の膜貫通領域を示し、#は前記領域内のアミノ酸位置を示す。より具体的には、本発明者らは、本明細書で定義されるムスク化合物の特異性にとって特に重要として、ORのTM2~7を覆う領域を同定している。前記領域は、配列番号11によって定義される。本発明のOR5A2ポリペプチドと高い同一性を有する変異体の特定の例は、配列番号4で表され、OR5A2_変異体_2として示される。前記用語本発明のORポリペプチドはまた、本明細書で定義される「OR5A2キメラ受容体またはポリペプチド」を包含する。
本明細書で使用されるように、用語「OR5A2ポリヌクレオチド」は、本明細書で定義されるOR5A2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、配列番号1(OR5A2変異体1をコードする)または配列番号3(OR5A2変異体2をコードする)で表される配列に対して、少なくとも86%以上、好ましくは90%、95%、96%、97%、98%、99%以上(100%を含む)の核酸同一性を有する。
本明細書で使用されるように、用語「OR5A2キメラ受容体またはポリペプチド」は、アミノ酸配列番号11によって定義される膜貫通ドメイン2~7を包含する、OR5A2受容体の中央領域を含む受容体、または少なくとも95%、96%、97%、98%、99%以上(100%を含む)の配列同一性を有する配列を意味する。そのようなキメラ受容体は、さらにGタンパク質共役型受容体、より好ましくは嗅覚受容体の骨格を含むことができる。より好ましくは、そのようなキメラOR5A2受容体は、OR5A2受容体(配列番号11)のTM2~TM7中央領域を含み、そのN末端でGタンパク質共役型受容体のN末端細胞外部位、膜貫通ドメイン1および細胞内ループ1に融合され、そのC末端でGタンパク質受容体の細胞内C末端エンドに融合されている。前記Gタンパク質共役型受容体は、好ましくは嗅覚受容体である。そのようなキメラOR5A2受容体の特定の例は、配列番号10によって定義される。
本明細書で使用されるように、用語「OR結合」は、本明細書で定義されるように、ORポリペプチドによる臭気分子の特異的な結合を指す。臭気分子としては、ニトロムスク、大環状ムスク、直鎖状ムスク、多環式ムスクの4つの異なるサブファミリーのムスク化合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本明細書で使用されるように、用語「ORシグナル伝達活性」は、本明細書で定義されるORポリペプチドによるシグナル伝達の開始または伝播を指す。ORシグナル伝達活性は、以下Gタンパク質、特にG-olf上でのGTP交換のためのGDPの刺激;アデニル酸シクラーゼ活性の変化;プロテインキナーゼCの調節;プロテインキナーゼAの調節;ホスファチジルイノシトール分解(セカンドメッセンジャーであるジアシルグリセロール、およびイノシトール三リン酸を生成する);細胞内カルシウムフラックス;MAPキナーゼの活性化;チロシンキナーゼの調節;内在化アッセイ;遺伝子またはレポーター遺伝子活性の調節;またはメラノフォアアッセイ、のうちの1つ以上をアッセイすることによるシグナル伝達カスケードにおける検出可能なステップを測定することによりモニターされる。シグナル伝達カスケードにおける検出可能なステップは、測定可能な活性が、本明細書に記載されたいずれかのOR活性アッセイに対して、ムスク化合物の実質的非存在下で確立されたベースラインより10%以上、またはそれ以下で変化した場合、開始または媒介されたとみなされる。測定可能な活性は、例えば、cAMPまたはジアシルグリセロールレベルの測定のように、直接測定することができる。あるいは、測定可能な活性は、例えばレポーター遺伝子アッセイのように、間接的に測定することができる。これらのアッセイのほとんどについては、キットが市販されている。
本明細書で使用されるように、用語「ムスク化合物」は、雄のジャコウジカによって分泌される強く匂う物質の匂いを連想させる感覚刺激性の性状を有する1つ以上の化合物を指す。前記化合物は、香料のベースノートとして使用される可能性のある香気物質の一群である。
好ましくは、本明細書で定義されるムスク化合物は、以下の化学物質:ニトロムスク、多環式ムスク、大環状ムスク、および直鎖状/脂環式ムスクの4つの構造的に多様なグループの中に入るか、または入らない、合成ムスク化合物、天然ムスク化合物、または商業的に入手可能もしくはまだ商業的に入手可能でないムスク化合物を包含する。
より好ましくは、本明細書で定義されるムスク化合物は、以下の化学物質:ニトロムスク、多環式ムスク、大環状ムスク、および直鎖状/脂環式ムスクの4つの構造的に多様なグループの中に入る、合成ムスク化合物、天然ムスク化合物、または商業的に入手可能もしくはまだ商業的に入手可能でないムスク化合物を包含する。
本明細書で使用されるように、「ニトロムスク」は、ニトロフェニル誘導体に属する。好ましくは、ニトロムスクは、一般に、商業的に関連性の高い5つの香料化合物:ムスクケトン(4-tert-ブチル-2,6-ジメチル-3,5-ジニトロアセトフェノン)、ムスクアンブレット(2,6-ジニトロ-3-メトキシ-4-tert-ブチルトルエン)、ムスクモスケン(1,1,3,3,5-ペンタメチル-4,6-ジニトロ-2H-インデン)、ムスクチベテン(1-tert-ブチル-3,4,5-トリメチル-2,6-ジニトロベンゼン)、ムスクキシレン(1-tert-ブチル-3,5-ジメチル-2,4,6-トリニトロベンゼン)を指す。より好ましくは、ニトロムスクは、ムスクケトン(4-tert-ブチル-2,6-ジメチル-3,5-ジニトロアセトフェノン)、ムスクアンブレット(2,6-ジニトロ-3-メトキシ-4-tert-ブチルトルエン)およびムスクモスケン(1,1,3,3,5-ペンタメチル-4,6-ジニトロ-2H-インデン)、およびムスクキシロール(1-tert-ブチル-3,5-ジメチル-2,4,6-トリニトロベンゼン)を指す。
本明細書で使用されるように、「多環式ムスク」は、アセチル基の組み合わせまたはメチル基、イソプロピル基および/またはt-ブチル基を組み合わせたピラン環で置換されたインデン型またはテトラリン型などの二環式のコア構造によって形成される。好ましくは、多環式ムスクとは、クリソライド、トナライド(登録商標)、ファントライド、カシメラン、ガラクソリド(登録商標)、トラセオライド、モキサロン、ベルノライドおよびフィクサルを指す。
本明細書で使用されるように、用語「大環状ムスク」は、6を超える(多くの場合、10~15)の炭素からなる少なくとも1つの環を有する。好ましくは、大環状ムスクは、エチレンブラシレート、エグザルトリドとしても知られるチベトリド、1,16-ヘキサデカラクトン、エグザルテノン、アニムスクとしても知られるグロバノン、ムスクR1、ベルビオーネ、シクロペンタデカノン、ムスコン、シベトン、ムスクMC4、セルボライド、ω-6-ヘキサデセンラクトン、ニルバノリド、イソアンブレトリド、ハバノリド、ムスク77、およびオキザリドTを指す。
本明細書で使用されるように、「直鎖状/脂環式ムスク」は、別の意味でシクロアルキルエステルとして知られる、修飾アルキルエステルに対応する構造を有するムスク化合物の一群である。好ましくは、直鎖状ムスクは、シクロペンテニルプロピオネートムスク、セレノライド、シルコライドおよびヘルベトリドを指す。
本明細書で定義される「増強剤」とは、1つ以上の臭気分子によって誘発される臭気の知覚を調節または増強する分子である。増強剤は、前記臭気を伝達するORと相互作用することによって、または受容体の天然リガンドと相互作用することによって作用し得る。本発明の「増強剤」は、アゴニスト、例えば香水に存在するムスクによって誘導される細胞内反応を、少なくとも10%、好ましくは15~25%、より好ましくは25~50%、最も好ましくは50~100%増加させることができる。本発明に記載の有用な増強剤は、ムスク化合物を介したシグナル伝達に必要なORの少なくとも一部(リガンド結合部位など)に特異的に結合する低分子、アプタマー、フォトアプタマー、修飾天然リガンドなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、活性化剤は揮発性であるか、または適切な溶媒または添加剤と組み合わせて揮発性にすることができる。
本明細書で使用されるように、「アゴニスト」は、受容体に結合し、天然のリガンドまたは別の同定アゴニスト、例えばライブラリーに存在する新規化合物によって誘導される細胞内反応を模倣するリガンドである。
本明細書で使用されるように、「モジュレーター」とは、本発明の受容体の細胞表面発現を増加または減少させる化合物、本明細書で定義されるOR5A2に対するリガンドの結合を増加または減少させる化合物、または受容体に対するリガンドの存在下または非存在下で、本明細書で定義されるOR5A2の活性型によって開始される細胞内反応を増加または減少させる化合物、例えば香水に存在するムスク化合物を指す。モジュレーターは、本明細書で定義されるアゴニスト、または増強剤を含む。モジュレーターは、例えば、低分子、ポリペプチド、ペプチド、抗体またはその抗原結合フラグメント、脂質、炭水化物、核酸、アプタマー、フォトアプタマー、または低分子化合物または有機低分子であり得る。候補となるモジュレーターは、天然または合成化合物であってもよく、例えば、合成低分子、動物、植物、細菌または真菌細胞の抽出物に含まれる化合物、およびそのような細胞からの馴化培地が挙げられる。
本明細書で使用されるように、用語「増加」および「減少」は、本明細書で定義されるOR5A2へのリガンド結合、および/または本発明のORを介した細胞シグナル伝達の少なくとも10%の量の変化を指す。結合またはシグナル伝達の「増加」または「減少」は、好ましくは、候補モジュレーターの存在下で、本明細書で定義されるOR5A2をリガンドと接触させることに対する反応を測定する。ここで、結合またはシグナル伝達の変化は、候補モジュレーターの非存在下での結合またはシグナル伝達に対する相対的なものである。
本明細書で使用されるように、用語「低分子」は、30000ダルトン未満、好ましくは2000または1500未満、さらに好ましくは1000未満、最も好ましくは600ダルトン未満の分子量を有する化合物を指す。「有機低分子」とは、炭素を含む低分子である。
本明細書で使用されるように、用語「変化」、「差」、「減少」または「増加」は、例えば、物質の結合またはシグナル伝達活性または量に適用され、所定のアッセイにおける標準物質に対する結合、シグナル伝達活性、または例えばmRNA、ポリペプチドまたはリガンドのレベルの少なくとも10%の増加または減少を指す。
本明細書で使用されるように、用語「ムスク化合物の本明細書で定義されるOR5A2への結合を可能にする条件」とは、前記ORがムスク化合物を結合する条件下での例えば、温度、塩濃度、pHおよびタンパク質濃度の条件を指す。正確な結合条件は、例えば、アッセイが生菌細胞を使用するか、細胞の膜画分のみを使用するかなど、アッセイの性質に応じて変わる。
本明細書で使用されるように、用語「剤」は、ペプチド、ポリペプチド、抗体またはその抗原結合フラグメント、脂質、炭水化物、核酸および有機低分子を含む群から選択される分子を指す。
本明細書で使用されるように、用語「サンプル」は、本明細書で定義されるOR5A2への結合またはシグナル伝達活性を調節する剤またはモジュレーター化合物の存在について試験される分子の供給源を指す。サンプルは、環境サンプル、動物、植物、酵母または細菌細胞の天然抽出物、臨床サンプル、合成サンプル、または組換え細胞からのまたは発酵プロセスからの馴化培地であり得る。
本明細書で使用されるように、用語「膜画分」は、本明細書で定義されるOR5A2を含む細胞脂質膜の調製物を指す。本明細書で使用される時、「膜画分」は、非膜関連細胞構成成分の少なくとも一部(すなわち、少なくとも10%、好ましくはそれ以上)が除去されているという点で、細胞ホモジネートとは異なる。用語「膜関連」は、脂質膜に組み込まれているか、または脂質膜に組み込まれている成分と物理的に関連しているそれらの細胞構成成分を指す。
本明細書で使用されるように、用語「セカンドメッセンジャーアッセイ」は、好ましくは、グアニンヌクレオチド結合もしくは交換、アデニル酸シクラーゼ、細胞内cAMP、細胞内イノシトールリン酸、細胞内ジアシルグリセロール濃度、アラキドン酸濃度、MAPキナーゼもしくはチロシンキナーゼ、プロテインキナーゼC活性またはレポーター遺伝子発現の測定、あるいは当技術分野で知られており、本明細書で定義される方法に記載のエクオリンベースのアッセイを含む。
本明細書で使用されるように、用語「セカンドメッセンジャー」は、GPCRからのシグナルの伝達に関与するGタンパク質共役型受容体の活性化によって生成された、または濃度が変化するように引き起こされた分子を指す。セカンドメッセンジャーの非限定的な例としては、cAMP、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、アラキドン酸放出、イノシトール三リン酸および細胞内カルシウムが挙げられる。用語「セカンドメッセンジャーのレベルの変化」とは、候補モジュレーターの非存在下で実施したアッセイで検出された量に対する、所定のセカンドメッセンジャーの検出されたレベルの少なくとも10%の増加または減少を指す。
本明細書で使用されるように、用語「エクオリンベースのアッセイ」は、活性化されたGPCRによって誘導される細胞内カルシウムフラックスを測定するGPCR活性のためのアッセイを指し、ここで、細胞内カルシウムフラックスは、細胞内で発現されたエクオリンの発光によって測定する。
本明細書で使用されるように、用語「結合」は、分子(例えば、ムスク化合物または抗体などのリガンド)と受容体(例えば、本明細書で定義される本発明のOR5A2)との物理的なアソシエーションを指す。該用語が本明細書で使用される時、EC50またはKdが1mM未満、一般的には1mMから10nMの範囲で起こる場合は、結合は「特異的」であり、例えば、EC50またはKdが1mM、500μM、100μM、10μM、9.5μM、9μM、8.5μM、8μM、7.5μM、7μM、6.5μM、6μM、5.5μM、5μM、4.5μM、4μM、3.5μM、3μM、2.5μM、2μM、1.5μM、1μM、750nM、500nM、250nMまたは100nM以下である場合は、結合は特異的である。
本明細書で使用されるように、用語「EC50」は、ムスク化合物または他のリガンドの結合およびORの機能活性などの所定の活性が、化合物の非存在下で同じアッセイを使用して測定可能なOR活性の最大値の50%である化合物の濃度を指す。別の言い方をすれば、「EC50」は、100%活性化が、より多くのアゴニストを加えても増加しない活性の量に設定されている場合に、50%活性化を与える化合物の濃度である。
本明細書で使用されるように、用語「飽和」は、リガンド濃度のさらなる増加がリガンドの結合またはOR特異的シグナル伝達活性を増加させることができないムスク化合物の濃度を指す。
本明細書で使用されるように、用語「結合の増加」とは、本明細書で定義されるOR5A2の公知または疑わしいモジュレーターを用いた所定のアッセイで検出されたリガンド結合の量が、その公知または疑わしいモジュレーターを欠いたアッセイで検出された結合に対して、少なくとも10%増加したことを指す。
本明細書で使用されるように、用語「Gタンパク質共役型受容体」または「GPCR」は、7つのアルファーらせん状の膜貫通ドメインを有する膜関連ポリペプチドを指す。機能的なGPCRは、リガンドまたはアゴニストと関連し、またGタンパク質と関連し、活性化する。本明細書で定義されるOR5A2は、GPCRのファミリーに属する。
本明細書で使用されるように、用語「抗体」は、従来の免疫グロブリン分子、および対象となるポリペプチドの1つとも特異的に反応性を有するそのフラグメントである。抗体は、従来の技術ならびに全体の抗体について以下に記載するのと同様の方法で、有用性をスクリーニングされたフラグメントを用いてフラグメント化することができる。例えば、抗体をペプシンで処理することにより、F(ab)2フラグメントを生成することができる。得られたF(ab)2フラグメントは、ジスルフィド橋を減少させるように処理することにより、Fabフラグメントを生成することができる。本発明の抗体は、抗体の少なくとも1つのCDR領域によって付与されるポリペプチドに対する親和性を有する、二重特異性、単鎖およびキメラ化分子およびヒト化分子をさらに含むことが意図される。好ましい実施形態では、抗体はさらに、それに取り付けられた、検出可能なラベル(例えば、ラベルは、放射性同位体、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る)を含む。抗体、モノクローナルまたはポリクローナル、およびそれらの超可変部分(FAB、FAB’’など)、ならびに抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、特定の疾患の診断およびモニタリングの分野において特定の産業上の応用を見出す本発明のさらなる態様であり、好ましくは、以下に記載するものである。本発明に記載の阻害剤としては、標識されたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、または抗体の超可変部分が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるように、用語「OR構成的活性」とは、前記嗅覚受容体に対するリガンドの添加なしに自然発生的に起こる、細胞に発現した嗅覚受容体の測定可能な活性を指す。
本発明は、1つ以上のムスク化合物が、本明細書で定義されるOR5A2ポリペプチドと呼ばれる、ヒト鼻上皮に存在する特定のOR5A2嗅覚受容体を活性化することができることを見いだしたことに関する。このOR5A2/ムスク化合物の相互作用は、そのような相互作用およびそれによるOR5A2の機能を調節する剤のスクリーニングアッセイに有用である。このOR5A2/ムスク化合物相互作用はまた、産業に関心を持たれ得るモジュレーター、新規アゴニストの同定を提供する。意外なことに、OR5A2嗅覚受容体は、本明細書に定義されるムスク化合物のすべての公知のクラスによって活性化され得る唯一のORである。
ORの活性を調節する剤の同定のためのアッセイ
ORの活性を調節する剤は、前記受容体とムスク化合物との相互作用を利用する多くの方法で同定することができる。例えば、インビトロ、培養細胞上、またはインビボのいずれかで結合したOR5A2/ムスク化合物を再構成する能力は、その結合を調節する剤を同定するための標的を提供する。その後、OR/ムスク結合のモジュレーターは、結合アッセイまたは前記受容体を介した下流のシグナル伝達を測定する機能的アッセイを使用してスクリーニングすることができる。結合アッセイおよび機能的アッセイの両方とも、ムスク化合物を用いて検証される。
OR5A2機能を調節する剤を同定するためにOR5A2/ムスク化合物の相互作用をより直接的に使用する別のアプローチは、候補剤または候補モジュレーターによって誘導されるOR5A2下流シグナル伝達の変化を測定する。これらの機能的アッセイは、単離された細胞膜画分、またはその表面で受容体を発現する細胞において実施することができる。
以下の記述は、OR5A2と1つ以上のムスク化合物との相互作用に基づく結合アッセイおよび機能的アッセイの両方の方法を提供する。
A.ORポリペプチド
本明細書で定義されるORポリペプチドとムスク化合物との相互作用を使用するアッセイは、ORポリペプチドの供給源を必要とする。ヒトORのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、本明細書中の「配列表」に示されている。ヒトOR5A2は、GenBankデータベースアクセッション番号NM_001001954.1(配列番号1)、NM_001001954.1:c.515C>T(配列番号3)でも入手できる。これらのポリペプチド配列はまた、Uniprotデータベースにおいてアクセッション番号Q8NGI9,VAR_024097でそれぞれ記録されている。
当業者であれば、公知の配列から設計されたプライマーまたはプローブを用い基本的なPCRおよび分子クローニング技術を介して、タンパク質をコードするmRNAを含むサンプルから容易にOR配列を増幅することができる。また、OR遺伝子はイントロンレス遺伝子であるため、当業者であればゲノムDNAからOR配列を増幅することができる。
組換えポリペプチドの発現は当技術分野で周知である。当業者は、真核生物または原核生物細胞における本発明に記載のORポリペプチドの発現のためのベクターおよび発現制御配列を容易に選択することができる。ORポリペプチドは、好ましくは、結合機能またはシグナル伝達機能を有するために、細胞膜または合成リポソームに付随している。細胞膜画分の調製のための方法は、当技術分野でよく知られており、例えば、Hubbard & Cohn, 1975, J. Cell Biol. 64: 461-479によって報告された方法が参照により本明細書に組み込まれる。ORポリペプチドを含む膜を製造するために、例えば、本発明のORポリペプチドの1つを内因性にまたは組換え的に発現する細胞に、そのような膜単離技術を適用することができる。あるいは、ORポリペプチドは、ポリペプチドのデタージェント溶液を希釈することにより、膜調製物に組み込むことができる(例えば、Salamon et al., 1996, Biophys. J. 71:283-294、参照により本明細書に組み込まれる)。
B.ムスク化合物
ムスク分子の構造は、当業者にはよく知られている。さらに、当業者であれば、前記構造から等価なムスクを容易に導出することができ、前記等価物が本明細書で定義されるOR5A2ポリペプチドに結合および/または調節することができるかどうかを容易に試験することができる。ムスク化合物は、天然サンプルから単離されてもよいし、化学的に合成されてもよい。
前記化合物を定量するために使用しうる方法は、a)抽出および精製のための方法:溶媒抽出、油抽出、蒸気抽出、CO2超臨界抽出、液体クロマトグラフィー、蒸留、ガスクロマトグラフィー;b)定量のための方法:ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーおよび質量分析、であってもよいが、これらに限定されない。前記の方法は、当技術分野でよく知られている。
ムスク化合物は、精製された形態で使用されてもよいし、組成物として使用されてもよい。所定の結合アッセイまたは本発明に記載の機能性アッセイにおいて必要とされるムスクの量は、アッセイによって変わるだろう。所定のアッセイに必要であれば、ムスク化合物は、上で指摘したように、放射性ラベルの組み込みまたは添加によって標識することができる。
C.OR活性のモジュレーターを同定するためのアッセイ
現在知られている4つの構造的に多様な化学物質群のムスク化合物が、クラス2の嗅覚受容体ファミリーに属する、本明細書で定義されるOR5A2のリガンドであるという発見は、前記ORの活性のアゴニストおよびモジュレーターを同定するためのスクリーニングアッセイの開発を可能にする。スクリーニングアッセイは、2つの一般的なアプローチを有するだろう。
1)前記OR5A2を発現する細胞、かかる細胞からの膜抽出物、または前記OR5A2を含む固定化脂質膜を、前記OR5A2と候補化合物を結合することが知られている本明細書で定義されている1つ以上の標識ムスク化合物に曝露する、リガンド結合アッセイ。インキュベーション後、反応混合物を測定し、標識ムスク化合物が前記OR5A2に特異的に結合しているかどうかを測定する。標識されたムスク化合物がOR5A2を妨害するか、またはOR5A2から置換する化合物は、モジュレーター、好ましくはOR5A2活性の増強剤として同定することができる。肯定的な化合物について機能分析を実施して、それらがこれらのカテゴリーのうちのどのカテゴリーに適合するかを決定することができる。
化合物の結合は、競合的結合、非競合的結合および不競合的結合の3つの主要なカテゴリーに分類することができる。競合的結合化合物は、第二の(参照)化合物に似ており、標的分子(ここでは受容体)の同じ結合ポケットに結合する。添加されると、競合的結合化合物は、前記第二の化合物を前記標的から置換させる。非競合的結合化合物は、第二の(参照)化合物と同じ標的分子の結合ポケットには結合しないが、前記第二の化合物の前記標的分子に対する効果と相互作用してもよい。第二の化合物は、非競合的結合化合物の添加時に置換されない。不競合的結合化合物は、第二の化合物が既に結合しているときに標的分子に結合する。協調的結合とは、ある化合物が、参照化合物であってもよい別の化合物の結合を促進することを意味する。協調的効果は、このようにして、前記他の化合物のKdの分析に見られる。
2)本明細書で定義されるOR5A2のシグナル伝達活性を測定する機能的アッセイ。
アゴニストスクリーニングのために、前記OR5A2を発現する細胞またはそれらから調製された膜を候補化合物とインキュベートし、前記OR5A2のシグナル伝達活性を測定する。アッセイは、アゴニストとして本明細書で定義される1つ以上のムスク化合物を用いて検証され、受容体活性を調節する化合物によって誘導された活性を、ムスク化合物によって誘導された活性と比較する。アゴニストまたは部分アゴニストは、アゴニストまたは部分アゴニストが100μM以下で存在する場合、ムスク化合物の最大活性の少なくとも10%に対応する最大生物学的活性を有し、好ましくは、ムスク化合物の50%、75%、100%以上の活性、ムスク化合物より2倍、5倍、10倍以上の活性を有するだろう。
リガンド結合および置換アッセイ:
ムスク化合物のORポリペプチドへの結合を増強する化合物をスクリーニングするために、細胞内で発現した本明細書で定義されるOR5A2ポリペプチド、またはそのようなOR5A2ポリペプチドを含む単離した膜を、本明細書で定義される1つ以上のムスク化合物とともに使用することができる。結合またはムスク化合物の置換を単独で測定するアッセイにおいて同定された場合、化合物は、それらがアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストとして作用するかどうかを決定するために、機能性試験を受けなければならない。
置換実験のために、前記OR5A2ポリペプチドを発現する細胞(一般に、アッセイあたり25,000細胞または膜抽出物1~100μg)を、結合緩衝液(例えば、50mM Hepes pH7.4;1mM CaCl2;0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)脂肪酸フリー;および0.5mM MgCl2)中で、候補モジュレーターの増加する濃度の存在下または非存在下で、標識されたムスク化合物と1.5時間(例えば、27℃で)インキュベートする。アッセイを検証し、較正するために、標識されていないムスクの増加する濃度を用いた対照競合反応を行うことができる。インキュベーション後、細胞を広範囲に洗浄し、結合した標識ムスク化合物を、所与の標識に適した方法(例えば、シンチレーションカウント、酵素アッセイ、蛍光など)で測定する。候補モジュレーターの存在下で結合した標識されたムスク化合物の量の少なくとも10%の減少は、候補モジュレーターによる結合の置換を示す。候補モジュレーターは、標識されたムスク化合物の50%を置換させる場合、本明細書に記載されたこのアッセイまたは他のアッセイにおいて特異的に結合すると考えられる。
あるいは、結合または結合の置換は、表面プラズモン共鳴(SPR)によってモニターすることができる。表面プラズモン共鳴アッセイは、水相からのムスク化合物の、センサー上の膜に固定化された前記OR5A2ポリペプチドへの結合または損失によって生じる固定化センサー近傍の質量の変化によって、2つの分子間の結合を測定する定量的な方法として使用することができる。この質量の変化は、ムスクまたは候補モジュレーターの注入または除去後の時間に対する共鳴単位として測定され、Biacore Biosenser(Biacore AB)を用いて測定される。本明細書で定義されるOR5A2ポリペプチドは、Salamonらにより記載された方法(Salamon et al., 1996, Biophys J. 71: 283-294; Salamon et al., 2001, Biophys. J. 80: 1557-1567; Salamon et al., 1999, Trends Biochem. Sci. 24: 213-219、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる)に従って、薄層脂質膜中でセンサーチップ(例えば、research grade CM5 chip; Biacore AB)上に固定化しうる。Sarrioらは、チップ上の脂質層に固定化されたGPCR A(1)アデノシン受容体へのリガンド結合を検出するためにSPRを使用できることを実証した(Sarrio et al., 2000, Mol. Cell. Biol. 20: 5164-5174、参照により本明細書に組み込まれる)。SPRアッセイにおける前記OR5A2へのムスクの結合のための条件は、Sarrrioらによって報告された条件を出発点として使用して、当業者によって微調整することができる。
SPRは、少なくとも2つの方法で結合のモジュレーターをアッセイすることができる。まず、本明細書で定義される1つ以上のムスク化合物を、固定化された本明細書で定義されるOR5A2ポリペプチドに予め結合させることができ、次いで、約10μl/分の流速で、1nMから1000μMの範囲の濃度、好ましくは約100μMで、候補モジュレーターを注入する。結合したムスク化合物の置換を定量化し、モジュレーター結合の検出を可能にする。あるいは、膜結合したムスク化合物は、候補モジュレーターとプレインキュベートし、ムスク化合物でチャレンジすることができる。モジュレーターに曝露された前記OR5A2に対するムスクの結合が、モジュレーターに事前に曝露されていないチップ上のものと比較して差があることは、結合を示すことになる。いずれのアッセイにおいても、候補モジュレーターの存在下で結合したムスク化合物の量が、候補モジュレーターの非存在下で結合したムスク化合物の量と比較して10%以上減少することは、候補モジュレーターが前記OR5A2と前記ムスク化合物との相互作用を阻害していることを示す。Biacoreシステムは、質量分析、またはガスクロマトグラフィーなどの候補モジュレーターを同定するシステムに接続することができる。
本明細書で定義されるムスク化合物の本明細書で定義されるOR5A2受容体への結合の阻害を測定する別の方法は、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を使用する。FRETは、蛍光ドナー(D)の発光スペクトルが蛍光アクセプター(A)の励起スペクトルと重なる場合に、互いに近接した(通常は100A未満の分離)DとAとの間で起こる量子力学的現象である。試験される分子、例えば、1つ以上のムスク化合物とOR5A2ポリペプチドは、相補的なドナー蛍光体とアクセプター蛍光体のペアで標識されている。OR5A2/ムスク化合物の相互作用により互いに近接している間、ドナー蛍光体の励起時に放出される蛍光は、分子が結合していないときの励起波長に応答して放出される蛍光とは異なる波長を有することになり、したがって、各波長での放出強度の測定により、結合したポリペプチドと結合していないポリペプチドの定量化を可能にする。標的分子を標識するドナー/アクセプターペアの蛍光体は、当技術分野でよく知られている。
FRETのバリエーションの一つは、分子間相互作用をモニターするために蛍光消光を使用する。相互作用するペアの一方の分子は蛍光体で標識され、もう一方の分子は蛍光体と近接した状態で蛍光体の蛍光を消光する分子で標識されうる。励起時の蛍光の変化は、蛍光体でタグ付けされた分子と蛍光体:消光ペアのアソシエーションの変化を示している。一般的に、標識されたOR5A2ポリペプチドの蛍光の増加は、消光剤を有するムスク化合物が置換されたことを示している。消光アッセイでは、候補モジュレーターを含むサンプル中の蛍光発光強度が、候補モジュレーターを含まないサンプルと比較して10%以上増加することは、候補モジュレーターがOR5A2/ムスク化合物の相互作用を阻害していることを示している。
生物発光共鳴エネルギー転移(BRET)は、インビボでの分子間相互作用をモニターするためのシステムである。このアッセイは、レニラ・ルシフェラーゼ(Rluc)と、例えば黄色蛍光タンパク質(YPF)または緑色蛍光タンパク質(GFP)を含む融合タンパク質間の非放射エネルギー転移に基づいている。BRETシグナルは、セレンテラジン誘導体基質の酸化によって生成される。前記システムは、細胞透過性で毒性のないセレンテラジン誘導体基質DeepBlueCTM(DBC)および緑色蛍光タンパク質(GFP)の変異体をアクセプターとして適用してもよい。ドナーとアクセプターが近接している場合、DBCの触媒分解から生じるエネルギーは、RlucからGFPに転移され、GFPはその特徴的な波長で蛍光を発するようになる。この方法では、試験した2つの分子間の距離をより長くすることができ、蛍光体の角度に依存しない。
表面プラズモン共鳴法、FRET法およびBRET法に加えて、蛍光偏光測定は、ムスク/受容体結合の定量に有用である。蛍光標識された分子の蛍光偏光値は、回転相関時間またはタンブリング速度に依存する。1つ以上の蛍光標識されたムスク化合物と結合したOR5A2によって形成されるようなタンパク質複合体は、複合体化されていない標識されたムスク化合物よりも高い偏光値を有する。OR5A2/ムスク化合物相互作用の候補モジュレーターを含むことは、候補モジュレーターを含まない混合物と比較して、蛍光偏光の増加(活性化)または減少(阻害)をもたらす、例えば、候補阻害剤がOR5A2とムスク化合物の相互作用を破壊または阻害する場合。蛍光偏光は、ポリペプチドまたはタンパク質複合体の形成を破壊する低分子の同定に好適である。候補モジュレーターを欠いたサンプルにおける蛍光偏光と比較して、候補モジュレーターを含むサンプルにおける蛍光偏光の10%以上のモジュレーションは、候補モジュレーターがOR5A2/ムスク化合物の相互作用を調節していることを示している。
OR5A2/ムスク化合物相互作用をモニターするためのもう一つの代替手段は、バイオセンサーアッセイを使用する。ICSバイオセンサーは、AMBRI(Australian Membrane Biotechnology Research Institute; http//www.ambri.com.au/)により説明されている。この技術では、ORやムスク化合物などの分子のアソシエーションは、懸濁膜二重層中のグラマシジンで促進されたイオンチャネルの閉鎖と結びつき、バイオセンサーのアドミタンス(インピーダンスに類似)の測定可能な変化につながる。このアプローチは、アドミタンス変化の6桁の大きさにわたって線形であり、低分子コンビナトリアルライブラリーの大規模で高スループットのスクリーニングに理想的である。候補モジュレーターを含まないサンプルのアドミタンスと比較して、候補モジュレーターを含むサンプルのアドミタンスの10%以上の変化(増加または減少)は、候補モジュレーターがOR5A2とムスク化合物の相互作用に影響を与えていることを示している。
酸-タンパク質相互作用のアッセイにおいて、相互作用のモジュレーターは、必ずしも物理的に相互作用するタンパク質のドメインと直接相互作用する必要がない可能性があることに注意することが重要である。モジュレーターが、酸-タンパク質相互作用の部位から離れた場所で相互作用し、例えば、OR5A2ポリペプチドにおけるコンフォメーション変化を引き起こすことも可能である。このように作用する調節剤(阻害剤またはアゴニスト)は、それにもかかわらず、OR5A2の活性を調節する剤として興味深い。
記載された結合アッセイのいずれかは、本明細書で定義されるOR5A2ポリペプチドに結合する、または1つ以上のムスク化合物の前記OR5A2への結合に影響を与える、サンプル、例えば組織サンプル中の剤の存在を決定するために使用することができる。そのためには、OR5A2ポリペプチドを、サンプルの存在下または非存在下で、1種以上のムスク化合物または別のリガンドと反応させ、前記ムスク化合物またはリガンドの結合を、使用される結合アッセイに適切に測定する。前記ムスク化合物または他のリガンドの結合における10%以上のモジュレーションは、サンプルがムスク化合物またはリガンドのOR5A2ポリペプチドへの結合を調節する剤を含むことを示す。
プロテインチップ
本明細書で定義される方法を、プロテインチップに適用してもよい。前記プロテインチップは、スライドガラスまたはニトロセルロース膜であってもよいが、これに限定されない。プロテインチップのためのアレイベースの方法は、当技術分野でよく知られている。タンパク質アレイは、好ましくは、本明細書で定義される1つ以上のOR5A2ポリペプチドまたは前記ORポリペプチドのTM2~7中央領域などのムスク化合物との結合に関与するフラグメントを含む。プロテインチップは、好ましくは、本明細書で定義される全ての変異体OR5A2ポリペプチドまたはキメラポリペプチド、またはムスク化合物との結合に関与するそれらのフラグメントを含む。
受容体活性の機能的アッセイ
機能的アッセイの非網羅的なリストは、このセクションで詳述されている:
i.GTPase/GTP結合アッセイ:
ORポリペプチドなどのGPCRについては、受容体活性の指標は、受容体を含む細胞膜によるGTPの結合である。Traynor and Nahorski, 1995, Mol. Pharmacol. 47: 848-854(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている方法では、実質的に、標識されたGTPの膜への結合を測定することによって、膜へのGタンパク質のカップリングを測定する。GTP結合アッセイのために、受容体を発現する細胞から単離した膜を、一般に20mM HEPES、pH7.4、100mM NaCl、および10mM MgCl2、80pM 35S-GTPγSおよび3μM GDPを含む緩衝液中でインキュベートする。アッセイ混合物は、所定の温度で一定時間、例えば30℃で60分間、インキュベートし、その後GF/Bフィルター上でろ過することにより、結合していない標識GTPが除去される。結合された、標識されたGTPを、液体シンチレーションカウントによって測定する。ムスク化合物誘発性OR5A2活性のモジュレーションをアッセイするために、本明細書で定義されるOR5A2ポリペプチドを発現する細胞から調製した膜を、本明細書で定義される1種以上のムスク化合物と混合し、OR5A2活性の候補モジュレーターの存在下および非存在下でGTP結合アッセイを実施する。候補モジュレーターを含むこの種のアッセイにおいて、モジュレーターを含まないアッセイと比較して、シンチレーションカウントによって測定される標識GTP結合における10%以上のモジュレーションは、候補モジュレーターがOR5A2活性を阻害または活性化することを示す。
同様のGTP結合アッセイは、アゴニストとして作用する化合物を同定するために、ムスク化合物なしで実施することができる。この場合、ムスク化合物で刺激されたGTP結合が標準として使用される。化合物が1mM以下で存在するときに、ムスク化合物によって誘導されるGTP結合のレベルの少なくとも50%を誘導し、好ましくはムスク化合物によって誘導されるレベルと同じかそれよりも高いレベルを誘導する場合、化合物はアゴニストとみなされる。
GTPase活性は、ORポリペプチドを含む膜をガンマ-32P-GTPでインキュベートすることにより測定する。活性GTPaseは、20mM H3PO4中の活性炭の5%懸濁液中の遊離無機ホスフェートの分離によって検出される無機ホスフェートとしてラベルを放出し、その後、シンチレーションカウントを行う。コントロールとしては、候補化合物の潜在的な非特異的効果を除外するために、ORを発現していない細胞(モックトランスフェクトされた)から分離された膜を使用したアッセイが挙げられる。
OR5A2-調節されたGTPase活性に対する候補モジュレーターの効果をアッセイするために、膜サンプルを、モジュレーターを伴うまたは伴わないでで、本明細書で定義される1種以上のムスク化合物でインキュベートし、次いでGTPaseアッセイを行う。モジュレーターを含まないサンプルと比較して、GTP結合またはGTPase活性のレベルの10%以上の変化(増加または減少)は、候補モジュレーターによるムスク化合物のモジュレーションを示す。
ii.下流経路活性化アッセイ:
a.カルシウムフラックス-エクオリンベースのアッセイ。
エクオリンアッセイは、GPCRの活性化によって誘導される細胞内カルシウム放出またはカルシウムフラックス(入口)に対するミトコンドリアまたは細胞質アポエクオリンの応答性を利用する(Stables et al., 1997, Anal. Biochem. 252:115-126; Detheux et al., 2000, J. Exp. Med., 192 1501-1508;その両方が参照により本明細書に組み込まれる)。簡単に説明すると、ORを発現するクローンを、ミトコンドリアまたは細胞質アポエクオリンおよびG-アルファ-16またはG-olfを共発現するようにトランスフェクトする。細胞を、5μMセレンテラジンHまたはその誘導体(分子プローブ)で室温で4時間インキュベートし、DMEM-F12培地で洗浄し、0.5×106細胞/mlの濃度で再懸濁する。次に細胞をテストアゴニストペプチドと混合し、エクオリンによる発光を30秒間ルミノメーターで記録する。結果は、相対光単位(RLU)として表される。コントロールとしては、候補化合物の潜在的な非特異的効果を除外するために、C356を発現していない細胞(モックトランスフェクトされた)から単離された膜を用いたアッセイが挙げられる。
ORポリペプチドを発現し候補モジュレーターで処理した細胞のサンプルにおける光強度が、ORポリペプチドを発現しているが候補モジュレーターで処理していない細胞のサンプル、またはORポリペプチドを発現していない(モックトランスフェクト細胞)が候補モジュレーターで処理した細胞のサンプルと比較して、10%以上増加または減少した場合に、エクオリン活性または細胞内カルシウムレベルが「変化」している。
本明細書で定義されるムスク化合物の非存在下で実施される場合、アッセイは、OR5A2活性のアゴニストまたはインバースアゴニストを同定するために使用することができる。本明細書で定義されるムスク化合物の存在下でアッセイを行う場合、OR5A2活性の増強剤をアッセイするために使用することができる。
1)Fluo3、Fluo4、Fura2、Calcium3またはCalcium6ベースのアッセイ。
蛍光ベースのアッセイは、受容体の活性化によって誘発されるカルシウムフラックスを利用する:例えば、CNGを介したカルシウムの流入または小胞体からのカルシウムの放出のいずれかを利用する。限定されないが、Fluo3、Fluo4およびFura2(分子プローブ)などのいくつかの蛍光体、ならびにCalcum3またはCalcium6キットシリーズ(分子デバイス)は、カルシウムと結合することが知られている。このような蛍光体-カルシウム複合体は、特定の波長で蛍光を発する。これにより、Gタンパク質共役型受容体が活性化されると、小胞体から放出されたカルシウムまたはCNGを介して侵入したカルシウムが蛍光体と結合し、特異的な蛍光を発するようになる。ORを過剰発現させた細胞を1~8μMの蛍光体溶液で30~60分間、37℃でインキュベートする。生理食塩水バッファーで完全に洗浄した後、同じバッファーの50μlを細胞を含む各ウェルに注ぐ(6~1536)。次にテストアゴニストをそのような負荷された細胞に注入し、ORの活性化は、蛍光測定に続いて行われる。
本明細書で定義されるOR5A2ポリペプチドを発現し候補モジュレーターで処理された細胞のサンプルにおいて、蛍光強度が、OR5A2ポリペプチドを発現しているが候補モジュレーターで処理されていない細胞のサンプル、またはOR5A2ポリペプチドを発現していない(モックトランスフェクトされた細胞)が候補モジュレーターで処理された細胞のサンプルと比較して、10%以上増加または減少する場合に、細胞内カルシウムレベルが「変化」している。
2)脱分極/過分極膜アッセイ(例えばDiBac蛍光体)。
このアッセイの原理は、細胞膜の脱分極に従うことにある。アニオン性プローブDiBAC4(3)は、膜電位に依存して細胞内と細胞外の区画を分割する。膜電位の上昇(脱分極)に伴い、プローブはさらに細胞内に分裂し、その結果、蛍光が増加する。逆に、過分極すると、色素の押し出しにより蛍光が減少する。
DiBAC4(3)プローブは488nmの波長で励起され、540nmの波長で発光する。
実験当日、グルコースを最終濃度10mMに、DiBAC4(3)プローブを最終濃度5μMになるようにアッセイバッファー(生理食塩水バッファー)に添加する。アッセイバッファーを37℃で維持する。細胞培養液を取り除き、OR過剰発現細胞を含む各ウェルを200μlの予熱アッセイバッファーで2回すすぐ。DiBAC4(3)を含むアッセイバッファーを180μl入れ、細胞を適当な温度で30分間インキュベートする。30分間のインキュベーション後、細胞プレートはアッセイの準備ができている。添加前にベースラインを2分間採取する。20μlの候補モジュレーターを適切なウェルに添加し、さらに25分間データを収集する。
本明細書で定義されるOR5A2ポリペプチドを発現し候補モジュレーターで処理された細胞のサンプルにおいて、蛍光強度が、OR5A2ポリペプチドを発現しているが候補モジュレーターで処理されていない細胞のサンプル、またはOR5A2ポリペプチドを発現していない(モックトランスフェクト細胞)が候補モジュレーターで処理された細胞のサンプルと比較して、10%以上増加または減少した場合に、膜分極は「変化」している。
3)メラノフォアアッセイ。メラノフォアアアッセイは、カラーベースのアッセイである。基本的にこのアッセイに使用される細胞は、カエル、アフリカツメガエル(Xenopus Laevis)の皮膚に由来している。これらの不死化細胞にはメラノソームが含まれており、これは暗い色素を含む小器官である。アデニル酸シクラーゼまたはホスホリパーゼCの活性化を引き起こす内因性または組換えGPCRの活性化は、メラノソームの分散、その結果細胞の黒化につながる。あるいは、アデニル酸シクラーゼまたはホスホリパーゼCを阻害するGPCRは、細胞を明るくすることにつながる。これにより、セカンドメッセンジャーの濃度を測定するのではなく、細胞の色変化を観察してピンポイントでヒットすることが容易になる。この色の変化は、650nMの吸光度を測定するマイクロプレートリーダーまたはビデオイメージングシステムで検査することで容易に定量化することができる。
b.アデニル酸シクラーゼアッセイ。
アデニル酸シクラーゼ活性のためのアッセイは、Kenimer & Nirenberg, 1981, Mol. Pharmacol. 20: 585-591、に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。そのアッセイは、Solomon et al., 1974, Anal. Biochem. 58: 541-548、によって教示されたアッセイの改変であり、これも参照により本明細書に組み込まれる。簡単に説明すると、100μlの反応は、50mM Tris-Hcl(pH7.5)、5mM MgCl2、20mMクレアチンホスフェート(二ナトリウム塩)、クレアチンホスホキナーゼの10単位(71μgのタンパク質)、1mM α-32P-ATP(四ナトリウム塩、2μCi)、0.5mMサイクリックAMP、G-3H標識サイクリックAMP(約10,000cpm)、0.5mM Ro20-1724、0.25%エタノール、および50~200μgの試験されるタンパク質ホモジネート(すなわち、ORポリペプチドを発現するまたは発現しない、カルボン酸で処理されたまたは処理されていない、候補モジュレーターを含むまたは含まない、細胞からのホモジネート)を含む。反応混合物は、一般に37℃で6分間インキュベートされる。インキュベーションに続いて、反応混合物は、0.9mlの6%冷トリクロロ酢酸の添加によって脱タンパク化される。チューブを1800×gで20分間遠心分離し、各上清溶液をDowex AG50W-X4カラムに添加する。カラムからのcAMP画分は、0.1mMイミダゾール-HCl(pH7.5)の4mlでカウントバイアルに溶出される。アッセイは3回行うべきである。コントロール反応は、ORポリペプチドを発現しない細胞からのタンパク質ホモジネートを使用しても行うべきである。
アッセイは、本明細書で定義されるOR5A2ポリペプチドを発現する、本明細書で定義される1つ以上のムスク化合物で処理したか処理していないか、候補モジュレーターを含むか含まない、細胞または細胞の抽出物を用いて行うべきである。コントロール反応は、いくつかの候補モジュレーターの潜在的非特異的効果を除外するために、モックトランスフェクトされた細胞、またはそれらからの抽出物を用いて実施すべきである。
本発明によれば、OR5A2活性の候補モジュレーターで処理した細胞から採取したサンプルにおけるアデニル酸シクラーゼ活性が、候補モジュレーターで処理していない細胞の類似サンプル、またはOR5A2ポリペプチドを発現していない(モックトランスフェクト細胞)が候補モジュレーターで処理した細胞のサンプルと比較して、10%以上増加または減少する場合、アデニル酸シクラーゼ活性が「変化」している。あるいは、参照化合物で処理したサンプルにおけるOR5A2ポリペプチドの候補モジュレーターによる10%以上の活性の減少を試験してもよい。
c.cAMPアッセイ:
細胞内cAMPは、当技術分野で広く知られている方法に従って、cAMPラジオイムノアッセイ(RIA)またはcAMP結合タンパク質を用いて測定される。例えば、Horton & Baxendale, 1995, Methods Mol. Biol. 41: 91-105(参照により本明細書に組み込まれる)には、cAMPのためのRIAが記載されている。
cAMPの測定のための多くのキット、例えば、LJL BiosystemsおよびNEN Life Science Productsから販売されている高効率蛍光偏光ベースのホモジニアスアッセイなどが市販されている。コントロール反応は、いくつかの候補モジュレーターの潜在的な非特異的効果を除外するために、モックトランスフェクトした細胞の抽出物を用いて実施すべきである。
アッセイは、本明細書で定義されるOR5A2ポリペプチドを発現する、ムスク化合物で処理したまたは処理していない、候補モジュレーターを含むまたは含まない、細胞または細胞の抽出物を用いて実施すべきである。コントロール反応は、いくつかの候補モジュレーターの潜在的非特異的効果を除外するために、モックトランスフェクトされた細胞またはそれらからの抽出物を用いて実施すべきである。
本明細書で定義されるOR5A2ポリペプチドを発現し、OR5A2活性の候補モジュレーターで処理された細胞(またはそのような細胞の抽出物中)において、Horton&Baxendale,1995,supraのRIAベースのアッセイを使用して検出されるcAMPのレベルが、候補モジュレーターで処理されていない類似の細胞におけるcAMPレベルと比較して、少なくとも10%増加または減少する場合、cAMPのレベルが「変化」している。
d.リン脂質の分解、DAG産生およびイノシトール三リン酸レベル:
リン脂質の分解を活性化する受容体は、リン脂質の分解、およびその結果として生じるセカンドメッセンジャーDAGおよび/またはイノシトール三リン酸(IP3)の産生をモニターすることによって、公知または疑わしいORのモジュレーターの活性による変化をモニターすることができる。これらのそれぞれを測定する方法は、Ian M.Birdによって編集されたPhospholipid Signaling Protocols、Totowa, NJ, Humana Press, 1998,に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。ホスファチジルイノシトール分解のためのアッセイについても記載されているRudolph et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 11824-11831も参照、参照により本明細書に組み込まれる。アッセイは、本明細書で定義されるOR5A2ポリペプチドを発現する、本明細書で定義される1つ以上のムスク化合物で処理したまたは処理していない、候補モジュレーターを含むまたは含まない、細胞または細胞の抽出物を用いて実施すべきである。コントロール反応は、いくつかの候補モジュレーターの潜在的な非特異的効果を除外するために、モックトランスフェクトされた細胞、またはそれらからの抽出物を用いて実施すべきである。
本発明によれば、OR5A2ポリペプチドを発現し、1つ以上のムスク化合物の存在下または非存在下で候補モジュレーターで処理された細胞からのサンプルにおいて、ホスファチジルイノシトール分解、およびジアシルグリセロールおよび/またはイノシトール三リン酸のレベルが、候補モジュレーターで処理されていないカルボキシルポリペプチドを発現する細胞からのサンプルで観察されるレベルと比較して、少なくとも10%増加または減少する場合、「変化」している。
e.PKC活性化アッセイ:
成長因子受容体チロシンキナーゼは、リン脂質およびカルシウムで活性化されたプロテインキナーゼのファミリーであるプロテインキナーゼC(PKC)の活性化を含む経路を介してシグナル伝達する傾向がある。PKCの活性化は最終的に、c-fos、c-mycおよびc-junなどの癌原遺伝子転写因子をコードする遺伝子、プロテアーゼ、コラゲナーゼタイプIやプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤などのプロテアーゼ阻害剤および細胞内接着分子I(ICAM I)などの接着分子の配列の転写をもたらす。PKCによって誘導される遺伝子産物の増加を検出するように設計されたアッセイは、PKC活性化およびそれによる受容体活性をモニターするために使用することができる。さらに、PKCを介してシグナルを発する受容体の活性は、PKC活性化によって活性化された遺伝子の制御配列によって駆動されるレポーター遺伝子構築物の使用によってモニターすることができる。このタイプのレポーター遺伝子に基づくアッセイは、以下でより詳細に論じられる。
PKC活性のより直接的な測定については、Kikkawa et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 13341(参照により本明細書に組み込まれる)の方法を使用することができる。このアッセイは、PKC基質ペプチドのリン酸化を測定するものであり、これは、その後、ホスホセルロース紙に結合することによって分離される。このPKCアッセイ系は、精製キナーゼの活性、または粗細胞抽出物中の活性を測定するために使用することができる。プロテインキナーゼCサンプルは、アッセイ直前に20mM HEPES/2mM DTTで希釈することができる。
アッセイの基質は、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼC基質タンパク質(MARCKS)に由来するペプチドAc-FKKSFKL-NH2(配列番号5)である。このペプチドに対する酵素のKmは約50μMである。他の塩基性、当技術分野で知られているプロテインキナーゼC選択性ペプチドもまた、そのKmの少なくとも2~3倍の濃度で使用することができる。アッセイに必要な補因子としては、カルシウム、マグネシウム、ATP、ホスファチジルセリンおよびジアシルグリセロールなどが挙げられる。使用者の意図に応じて、アッセイは、存在するPKCの量(活性化条件)または存在する活性PCKの量(非活性化条件)を決定するために実施することができる。本発明に記載のほとんどの目的では、活性化できるPKCを測定するのではなく、単離されたときにサンプル中で活性化されているPKCを測定するような、非活性化条件が使用される。非活性化条件については、カルシウムは、EGTAを選択して、アッセイにおいて除去される。
アッセイは、20mM HEPES、pH 7.4、1-2mM DTT、5mM MgCl2、100μM ATP、~1μCi γ-32P-ATP、100μg/mlペプチド基質(~100μM)、140μM/3.8μMホスファチジルセリン/ジアシルグリセロール膜、および100μMカルシウム(または最も好ましくは500μM EGTA)を含む混合物中で実施される。20mM HEPES、pH7.4、2mM DTTで希釈したサンプル48μlを最終反応量80μlで使用する。反応は30℃で5~10分間行い、その後、100mM ATPと100mM EDTAを含む溶液25μlをpH値8.0で添加して反応を停止させる。
反応停止後、各反応の一部(85μl)をワットマンP81リン酸セルロースフィルター上にスポッティングし、次いで洗浄する:0.4%リン酸500mlを4回(1回の洗浄につき5-10分);および500ml 95%EtOH中で2-5分間の最終洗浄を行う。結合放射能は、シンチレーションカウントによって測定する。標識されたATPの比活性(cpm/nmol)は、P81紙に反応のサンプルをスポッティングし、洗浄せずにカウントすることによって決定する。PKC活性の単位は、1分間に転移されたホスフェートnmolとして定義し、次のように計算する:
活性は、ユニット(nmol/min)で表される:
=(ペーパー上のcpm)x(合計105μl/85μlの斑点)
(アッセイ時間、分)(ATPの比活性cpm/nmol)
代替のアッセイは、PanVeraから販売されているProtein Kinase C Assay Kit(Cat.#P2747)を用いて実施することができる。
アッセイは、本明細書で定義されるOR5A2ポリペプチドを発現する、本明細書で定義される1つ以上のムスク化合物で処理したか処理していないか、候補モジュレーターを含むか含まない細胞からの抽出物において実施すべきである。コントロール反応は、いくつかの候補モジュレーターの潜在的な非特異的効果を除外するために、モックトランスフェクトされた細胞、またはそれらからの抽出物を用いて実施すべきである。
本発明によれば、OR5A2ポリペプチドを発現し、候補モジュレーターで処理された細胞からの抽出物における上記のいずれかのアッセイによって測定されたPKCの単位が、候補モジュレーターで処理されていない細胞からの類似のサンプルで行われた反応と比較して、少なくとも10%増加または減少するときに、PKC活性は候補モジュレーターによって「変化」している。
f.PKA活性化アッセイ
PKA活性は、市販されているいくつかのキットのいずれか、例えば、molecular deviceのIMAP PKAアッセイキット、またはpromegaのProFluor PKAアッセイキットなどを用いてアッセイすることができる。
アッセイは、本明細書で定義されるOR5A2ポリペプチドを発現する、本明細書で定義される1つ以上のムスク化合物で処理したか処理していないか、候補モジュレーターを含むか含まない、細胞または細胞の抽出物を用いて実施すべきである。コントロール反応は、いくつかの候補モジュレーターの潜在的な非特異的効果を除外するために、モックトランスフェクトされた細胞、またはそれらからの抽出物を用いて実施すべきである。
候補モジュレーターで処理したORポリペプチドを発現する細胞からのサンプルにおけるPKA活性のレベルが、候補モジュレーターで処理していない類似の細胞からのサンプルにおけるPKAキナーゼ活性と比較して、10%以上増加または減少した場合、PKA活性が「変化」している。
g.キナーゼアッセイ:
MAPキナーゼ活性は、市販されているいくつかのキット、例えば、New England Biolabsから販売されているp38 MAPキナーゼアッセイキット(Cat # 9820)、またはPerkin-Elmer Life Sciencesから販売されているFlashPlateTM MAPキナーゼアッセイキット、のいずれかを用いてアッセイすることができる。
アッセイは、本明細書で定義されるOR5A2ポリペプチドを発現する、本明細書で定義される1つ以上のムスク化合物で処理したか処理していないか、候補モジュレーターを含むか含まない、細胞または細胞の抽出物を用いて実施すべきである。コントロール反応は、いくつかの候補モジュレーターの潜在的な非特異的効果を除外するために、モックトランスフェクトされた細胞、またはそれらからの抽出物を用いて実施すべきである。
本明細書で定義されるOR5A2ポリペプチドを発現する、候補モジュレーターで処理した細胞からのサンプルにおけるMAPキナーゼ活性のレベルが、候補モジュレーターで処理していない類似の細胞からのサンプルにおけるMAPキナーゼ活性と比較して、10%以上増加または減少した場合、MAPキナーゼ活性が「変化」している。
公知の合成または天然のチロシンキナーゼ基質および標識ホスフェートを用いたチロシンキナーゼ活性の直接アッセイは、他のタイプのキナーゼ(例えば、Ser/Thrキナーゼ)の類似のアッセイのようによく知られている。キナーゼアッセイは、本明細書で定義されるOR5A2ポリペプチドを発現する、ムスク化合物で処理したか処理していないか、候補モジュレーターを含むか含まない、細胞から調製した精製キナーゼおよび粗抽出物の両方を用いて行うことができる。コントロール反応は、いくつかの候補モジュレーターの潜在的な非特異的効果を除外するために、モックトランスフェクトされた細胞、またはそれらからの抽出物を用いて実施すべきである。基質は、全長タンパク質または基質を代表する合成ペプチドのいずれかである。Pinna&Ruzzene(1996, Biochem. Biophys. Acta 1314. 191-225、参照により本明細書に組み込まれる)は、キナーゼ活性の測定に有用な多数のリン酸化基質部位を列挙している。多くのキナーゼ基質ペプチドが市販されている。特に有用なものの一つは、「Src関連ペプチド」(RRLIEDAEYAARG(配列番号6);Sigmaから入手可能、#A7433)であり、これは多くの受容体および非受容体チロシンキナーゼの基質である。以下に記載されるアッセイは、ペプチド基質をフィルターに結合させることを必要とするので、ペプチド基質は、結合を促進するために正味の正電荷を有するべきである。一般に、ペプチド基質は、少なくとも2つの塩基性残基および遊離アミノ末端を有するべきである。反応は一般的に0.7~1.5mMのペプチド濃度を使用する。
アッセイは、通常、5Xキナーゼバッファー(5mg/mL BSA、150mM Tris-Cl(pH7.5)、100mM MgCl2;アッセイしたキナーゼに応じて、MgCl2の代わりに、またはMgCl2に加えてMnCl2を使用しうる)5μl、1.0mM ATP(最終濃度0.2mM)5μl、ガンマ-32P-ATP(100-500cpm/pmol)、10mMペプチド基質(最終濃度1.2mM)3μl、テストされるキナーゼを含む細胞抽出物(キナーゼアッセイに使用する細胞抽出物は、ホスファターゼ阻害剤(例えば、0.1-1mMオルトバナジン酸ナトリウム)を含むべきである)及び25μlにする水を含む25μlの量で実施される。反応は30℃で行われ、細胞抽出物の添加によって開始される。
キナーゼ反応を30秒~約30分間行い、次いで氷冷10%トリクロロ酢酸(TCA)を45μl添加する。サンプルをマイクロ遠心分離機で2分間スピンさせ、上清の35μlをWhatman P81セルロースホスフェートフィルターサークル上にスポッティングする。フィルターを500mlの0.5%冷リン酸で3回洗浄し、次いで200mlのアセトンで1回室温で5分間洗浄する。フィルターを乾燥させ、取り込まれた32Pをシンチレーションカウントによって測定する。キナーゼ反応におけるATPの比活性(例えば、cpm/pmolで)は、反応の少量のサンプル(2~5μl)をP81フィルターサークル上にスポッティングし、洗浄せずに直接計数することによって決定される。キナーゼ反応で得られた1分あたりのカウント数(マイナスブランク)を比活性で割って、反応中に移行したホスフェートのモル数を決定する。
アッセイは、本明細書で定義されるOR5A2ポリペプチドを発現する、ムスク化合物で処理したか処理していないか、候補モジュレーターを含むか含まない、細胞または細胞からの抽出物を用いて実施されるべきである。コントロール反応は、いくつかの候補モジュレーターの潜在的な非特異的効果を除外するために、モックトランスフェクトされた細胞、またはそれらからの抽出物を用いて実施すべきである。
ORポリペプチドを発現する候補モジュレーターで処理した細胞からのサンプルにおけるキナーゼ活性のレベルが、候補モジュレーターで処理していない類似の細胞からのサンプルにおけるチロシンキナーゼ活性と比較して、10%以上増加または減少した場合、チロシンキナーゼ活性が「変化」している。
h.下流経路活性化のための転写レポーター:
受容体、例えば本明細書で定義されるOR5A2ポリペプチドへのモジュレーターの結合によって開始される細胞内シグナルは、細胞内イベントのカスケードを動かし、その最終的な結果は、1つ以上の遺伝子の転写および/または翻訳における迅速かつ検出可能な変化である。したがって、受容体の活性は、OR5A2の活性化に応答する制御配列によって駆動されるレポーター遺伝子の発現を測定することによってモニターすることができる。
本明細書で使用されるように、「プロモーター」とは、受容体媒介による遺伝子発現の調節に必要な転写制御要素を指し、基底プロモーターだけでなく、受容体調節された発現に必要な任意の増強剤または転写因子結合部位も含む。アゴニスト結合から生じる細胞内シグナルに応答するプロモーターを選択し、選択したプロモーターを、転写、翻訳または最終的な活性が容易に検出可能で測定可能なレポーター遺伝子に操作的にリンクさせることにより、転写ベースのレポーターアッセイは、所定の受容体が活性化されているかどうかの迅速な指示を提供する。
ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、ベータ-ラクタマーゼまたはベータ-ガラクトシダーゼなどのレポーター遺伝子は、それらの産物の検出のためのアッセイと同様に、当技術分野でよく知られている。
受容体活性をモニターするのに特に適した遺伝子は、「最初期」遺伝子であり、受容体とエフェクタータンパク質またはリガンドとの接触から一般的に数分以内に速やかに誘導される。即時初期遺伝子の転写の誘導は、新しい調節タンパク質の合成を必要としない。リガンド結合に対する迅速な応答性に加えて、レポーター構築物を作るのに有用な好ましい遺伝子の特徴としては:休止期細胞における低発現または検出不可能な発現;一過性であり、新しいタンパク質合成に依存しない誘導;転写のその後の遮断は、新しいタンパク質合成を必要とする;およびこれらの遺伝子から転写されたmRNAは、短い半減期を有する、が挙げられる。転写制御エレメントが有用であるためには、転写制御エレメントがこれらの特性をすべて有することが好ましいが、必須ではない。
ムスク応答性転写レポーター構築物を用いてOR5A2活性をアッセイするために、本明細書で定義されるOR5A2ポリペプチドを安定的に発現する細胞を、レポーター構築物で安定的にトランスフェクトする。アゴニストをスクリーニングするために、未処理の細胞を候補モジュレーターに曝露するか、または本明細書で定義される1つ以上のムスク化合物に曝露し、レポーターの発現を測定する。ムスク化合物で処理した培養物は、公知のアゴニストによって誘導される転写のレベルの基準として機能する。いずれのモジュレーターも存在しない場合のレポーター発現と比較して、候補モジュレーターの存在下でのレポーター発現の少なくとも10%の増加は、候補がOR5A2活性のモジュレーターであることを示す。アゴニストは、ムスク化合物よりも少なくとも多く、好ましくは同量以上のレポーター発現を誘導する。部分的なアゴニストは、ムスクと比較して受容体の活性化が少ないかもしれない。このアプローチはまた、細胞が、ムスク化合物または他のアゴニストの非存在下でレポーターの基礎活性の上昇があるようなレベルで本明細書で定義されるOR5A2ポリペプチドを発現するインバースアゴニストをスクリーニングするために使用することができる。候補モジュレーターの非存在下におけるレポーター活性と比べて、候補モジュレーターの存在下でのレポーター活性の10%以上の減少は、その化合物がインバースアゴニストであることを示す。
増強剤をスクリーニングするために、本明細書で定義されるOR5A2ポリペプチドを発現し、レポーター構築物を担持する細胞を、候補モジュレーターの存在下および非存在下で、1つ以上のムスク化合物(または他のアゴニスト)に曝露する。候補モジュレーターの非存在下におけるレポーター発現と比べて、候補モジュレーターの存在下でのレポーター発現の10%以上の増加は、候補モジュレーターがOR5A2活性の増強剤であることを示す。
転写アッセイのためのコントロールは、本明細書で定義されるOR5A2ポリペプチドを発現していないがレポーター構築物を担持する細胞、ならびにプロモーターを伴うレポーター構築物がほとんどない細胞が挙げられる。OR5A2制御転写のモジュレーターとして同定された化合物もまた、それらの活性の特異性およびスペクトルを決定するために、それらが他の調節配列および他の受容体によって駆動される転写に影響を与えるかどうかを決定するために分析すべきである。
転写レポーターアッセイ、およびほとんどの細胞ベースのアッセイは、OR5A2活性を調節する化合物の化学物質ライブラリーをスクリーニングするのに好適である。ライブラリーは、例えば、天然の供給源、例えば植物、動物、細菌などからのライブラリーであってもよい。
本発明による有用な候補モジュレーター
候補モジュレーターは、合成化合物または天然化合物の大規模なライブラリーからスクリーニングすることができる。現在、様々な種類の化合物のランダム合成および指示された合成のために多くの手段が使用されている。合成化合物ライブラリーは、例えば、Maybridge Chemical Co.(Trevillet,Cornwall,UK)、Comgenex(Princeton,NJ)、Brandon Associates(Merrimack,NH)、およびMicrosource(New Milford,CT)など多くの会社から市販されている。希少化学物質ライブラリーは、Aldrich(Milwaukee,WI)から入手可能である。有機低分子のコンビナトリアルライブラリーが利用可能であり、調製することができる。あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形での天然化合物のライブラリーは、例えば、Pan Laboratories(Bothell,WA)またはMycoSearch(NC)から入手可能であり、または当技術分野で周知の方法で容易に製造可能である。さらに、天然および合成的に生産されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手段によって容易に修飾される。
実験手順:
細胞培養および細胞株作製
HEK293T-RTP1A1/RTP2細胞を、10%ウシ胎児血清(M10)を含むミニマムエッセンシャル培地(EMEM、Lonza)中で維持した。これらの細胞は、HEK293Tを、リポフェクタミン2000を用いて、シャペロンタンパク質RTP1A1およびRTP2の配列およびプロマイシンに対する抵抗性遺伝子を含む発現ベクターでトランスフェクトすることによって生成した。これらの実験で使用した組換え細胞集団は、培地に10μg/mlのプロマイシンを添加して選択し、その後サブクローニングした(WO2014/191047 A1)。
臭気分子希釈
臭気分子をジメチルスルホキシド(DMSO)で1モル/リットル(M)の濃度に希釈してストック溶液を作製した。
スクリーニング実験のために、臭気分子のストック溶液をEMEMで希釈し、96ウェルプレート中にディスポーズした。濃度2mM、濃度632μM、濃度200μMの被験化合物(1化合物/ウェル)を含むプレートを調製した。
濃度反応解析のために、96ウェルプレートにプレートしたEMEM中のストック溶液から被験分子の連続希釈液を調製した。
ルシフェラーゼ測定
最初の脱オルファン化スクリーニングおよび用量反応解析には、ルシフェラーゼをベースとした遺伝子レポーターアッセイ(Promega,Leiden,オランダ)を用いた。簡単に言うと、細胞をポリ-D-リジンでコーティングした96ウェル上にプレート(platted)し、CRE-ルシフェラーゼを含むプラスミドと嗅覚受容体を含むプラスミドでトランスフェクションした。トランスフェクションの16時間後、培地を、決定された濃度で被験化合物を含む無血清EMEMで置換した。37℃度で4時間インキュベーションした後、細胞を溶解し、ルミネッセンス測定のために処理した。ルミネッセンス発光を記録した。結果は、ルシフェラーゼ活性(相対蛍光単位(RLU))として、または10μMのアデニル酸シクラーゼ活性化剤フォルスコリンによって誘導された応答のパーセンテージとして表された。空のプラスミドをネガティブコントロールとして使用する。
実施例1:臭気分子ライブラリーのスクリーニング
本発明のORの活性化剤を同定するために、ムスクおよび他の種類の化合物を含む臭気化合物ライブラリーを使用した。本発明のORについて、一連の891の臭気化合物を用いて脱オルファン化キャンペーンを実施した。4つの構造的に異なるグループからのムスクが、891の被験臭気物質に含まれていた(表1)。
各化合物は、3つの異なる濃度(1mM、316μM、100μM)で試験した。試験したライブラリーの異なる化合物を、本発明のORを発現する細胞を含む96ウェルプレート(1分子/ウェル)に同濃度でディスポーズした。試験した化合物の活性は、上記で説明したようにルシフェラーゼ活性を用いて測定した。試験した化合物によって誘導されたルシフェラーゼ活性の中央値および関連する標準偏差を決定した。暫定的に活性な化合物(ヒット)は、中央値+2標準偏差以上のルシフェラーゼ活性を誘導する化合物として定義した。
これらの実験条件において、被験OR(本発明のORに対応するもの、すなわち、OR5A2、特にOR5A2_変異体1)は、したがって、異なるムスク:セレノライド、エチレンブラキシレート、およびマラキソンに特異的かつ排他的に反応することが判明した。表1は、本発明のORの脱オルファン化のために被験臭気化合物の完全なリストを要約している。結果は、891の被験化合物のうち、大環状ムスク、多環式ムスク、ニトロムスクおよび直鎖状ムスクのみが本発明のORを活性化することを明確に示している。OR5A2が以前に2つの異なる出版物(Shirasu et al. 2014 Neuron 81, 165-78; Figure 5F supplemental, Sato-Akuhara N et al. 2016 J Neurosci. 36(16), 4482-91)によってムスク特異的受容体としては除外されていたので、この結果はすべて驚くべきことである。
実施例2:ムスクのリガンド-OR相互作用の濃度反応解析
前述のヒットを検証するために、ルシフェラーゼベースのレポーターアッセイを用いた濃度反応解析を、OR5A2_変異体1上で1mMから316nMまでのヒット分子の半対数の連続希釈を用いて達成した。これらの解析において、我々はまた、以前にムスク特異的受容体として記載されたOR5AN1(配列番号7)(WO 2015/020158 A1, Shirasu et al. 2014 Neuron 81, 165-78, Sato-Akuhara N et al. 2016 J Neurosci. 36(16), 4482-91)およびOR11A1(配列番号8)(WO2016/201152 A1)を挙げた。系統解析により、OR5A2と最も類似するOR遺伝子は、核酸同一性71%、アミノ酸同一性67%のOR5A1(配列番号9)であることが判明した(図2A-B)。したがって、OR5A1は解析に含まれていた。以前に記載した4つの構造的に異なる化学グループからの35のムスク化合物を、濃度反応分析において試験した(表2)。各実験において、空ベクターをネガティブコントロール(pEFIBRHO)として使用した。ムスク化合物を用いた代表的な濃度反応曲線を図1Aに示す。図1Bはそれらの構造を示す。計算されたEC50を含む完全な結果を表2に示す;灰色のボックスはネガティブ実験を表し、試験後に活性化しなかった。
例として、受容体OR5A2、OR5A1、OR5AN1、OR11A1に対する(A)ムスクアンブレットと(B)モスケンの濃度反応曲線を図7に示す。受容体OR5A2、OR5A1、OR5AN1およびOR11A1に対する(A)シルコライドおよび(B)セレノライドの濃度反応曲線を図8に示す。受容体OR5A2、OR5A1、OR5AN1およびOR11A1に対する(A)カシメラン、(B)フィクサルおよび(C)ガラクソリドの濃度反応曲線を図9に示す。受容体OR5A2、OR5A1、OR5AN1及びOR11A1に対する(A)エチレンブラシレート、(B)アンブレトリド及び(C)セルボライドの濃度反応曲線を図10に示す。
本発明のOR(すなわちOR5A2)は、前記4化合物群に属するムスク化合物によって活性化されることが観察された。OR5A2の最も近いパラログであるOR5A1は、試験したいずれのムスク化合物によっても活性化されなかった。さらに、ムスク特異的なOR(OR5AN1とOR11A1)は、主にニトロムスクと大環状ムスク、または多環式ムスクとニトロムスクにそれぞれ反応した(表2)。試験したムスク化合物はいずれもOR5AN1のみを活性化することができなかった。さらに、我々の結果は、本発明のOR(すなわちOR5A2)が、より環境に優しいことが知られている直鎖状ムスクファミリーによって活性化された唯一のORであることを示している。
したがって、本発明のORは、あらゆるタイプのムスクの知覚に関与しており、ムスクの香りの知覚を活性化、模倣、ブロック、阻害、調節および/または増強する化合物を同定するための貴重な候補受容体を構成している。
実施例3:OR11A1およびOR5A1特異的リガンド-OR相互作用の用量反応解析
アミノ酸配列のアラインメントにより、OR5A1とOR5A2は67%、OR5AN1は58%、OR11A1は41%の同一性を示した(図2 A-B)。パラロジが機能性および選択性をどの程度予測するかという疑問にさらに取り組むために、OR5A1およびOR11A1の2つのよく知られたアゴニストであるベータ-イオノンおよび2-エチルフェンコールに対するこれらのORの応答を、それぞれ比較した(Jaeger et al., 2013; Adipietro et al., 2012)。これらの化合物を、以前に記載したように、ルシフェラーゼアッセイにおける濃度反応分析において試験した。各実験において、空ベクターをネガティブコントロール(pEFIBRHO)として使用した。代表的な濃度反応曲線を図3A-Bに示す。
OR5A2の最も近いパラログであるOR5A1とOR11A1の両方が、それ自身のコグナートアゴニストによって活性化されていることが観察された。逆に、これらの実験条件では、本発明のOR(すなわちOR5A2)およびOR5AN1は、ベータ-イオノンによっても2エチル-フェンコールによっても刺激されず、両方とも空ベクターと同様の濃度応答曲線を示した。
これらの結果から、OR5A1とOR5A2は、同じサブファミリーのメンバーでありながら、異なるアゴニスト特異性(ベータ-イオノンとムスク)を示し、アミノ酸の類似性は、パラログ間のOR選択性と機能性をロバストに予測しないことを示している。
実施例4:リガンド-ORハプロタイプ相互作用の用量反応解析
OR遺伝子は非常に可変性が高く、多くの対立遺伝子が人によって嗅覚の違いをもたらす。これらの違いは、例えばヌクレオチド多型のような遺伝的変異に起因しうる。HORDEデータベース(The Human Olfactory Data Explorer, https://genome.weizmann.ac.il/horde/)を用いて、本発明のORの5つのタンパク質変異体(ハプロタイプ)(すなわち、OR5A2、OR5A2変異体_1)が集団で同定されたことを見出した。79,72%の頻度で存在する最も頻度の高いハプロタイプは、先の実施例で使用されたもの(OR5A2-変異体_1;配列番号1)であり、ムスク化合物に感受性である。16,59%の頻度で存在する第二のハプロタイプは、172の位置でのプロリンからロイシンへの置換をコードする(P172L、OR5A2_変異体2;配列番号3)。2つのハプロタイプを合わせると、この2つのハプロタイプは集団の96%以上で発現している。2つのハプロタイプのアミノ酸配列を図4に示す。
置換がムスク感受性に影響を与えうるかどうかをテストするために、OR5A2の両方の変異体をトランスフェクションした後、ルシフェラーゼアッセイを先に記載したように行った。細胞を、先に説明した4つの構造的に異なるグループからのムスク化合物の半対数の連続希釈液で処理した。各実験において、空ベクターをネガティブコントロール(pEFIBRHO)として使用した。代表的な濃度反応曲線を図5に示す。
これらの実験結果は、本発明の受容体の他のハプロタイプとは異なり、OR5A2_変異体2がムスク化合物(ムスクキシレン、セレノライド、ガラクソリド(登録商標)、ベルビオーネ、カシメラン、ムスクケトン)によって活性化されないことを示している。これらの実験において、OR5A2_変異体1は、実施例2で得られたものと同様の濃度反応曲線を示す。全体として、これらの観察は、位置172(P172L)の置換を有するハプロタイプが、ムスク化合物によって活性化される能力を失うことを明確に示唆している。この観察は、異なる研究が、これまでのところ、本発明のORをムスク受容体として除外している理由を説明し得る(Shirasu et al. 2014 Neuron 81, 165-78; Figure 5F supplemental, Sato-Akuhara N et al. 2016 J Neurosci. 36(16), 4482-91)。
実施例5:リガンド-キメラ型_OR5A2変異体1相互作用の用量反応解析
1998年、クラオトヴルストらは、嗅覚受容体のリガンド特異性および構造機能関係を研究するためのモデルシステムを提供した(Krautwurst et al., 1998 Cell 95, 917-26)。彼らは、嗅覚受容体によるリガンド認識は、膜貫通ドメイン2(TM2)から膜貫通ドメイン7(TM7)に向かうタンパク質領域によって大部分が付与されていることを示した。その発表に基づき、嗅覚受容体OR2A5(配列番号12参照)のN末端およびC末端配列を挟んだOR5A2_変異体1のTM2-TM7アミノ酸配列を含むキメラOR5A2_変異体1嗅覚受容体を作製した。このキメラOR5A2_変異体1受容体は、ネイティブのOR5A2_変異体1受容体と86%の同一性を共有していた(図6Aおよび配列番号10)。
アミノ酸置換がムスクの感受性および特異性に影響を与え得るかどうか、およびクラオトヴルストのモデルを検証するために、キメラ型OR5A2_変異体1をトランスフェクションした後、ルシフェラーゼアッセイを前記のように行った。細胞を、先に記載した4つの構造的に異なるグループからのムスク化合物の半対数の連続希釈液で処理した。
各実験において、空ベクターをネガティブコントロール(pEFIBRHO)として使用した。さらに、これらの細胞を、起源のOR5A2受容体を活性化することができない2つの化合物であるベータ-イオノンおよび2エチル-フェンコールで処理した(図2A-B参照)。代表的な濃度反応曲線を図6B-Cに示す。
これらの結果から、キメラOR5A2_変異体1は、86%の同一性しか共有していないにもかかわらず、テストしたすべてのタイプのムスクに反応することが示されている。さらに、キメラOR5A2_変異体1はベータ-イオノンや2エチルフェンコールによって活性化されないことから、このキメラ受容体はOR5A2受容体と同じ特異性を持ち、ムスクの香りの知覚を活性化、模倣、ブロック、阻害、調節、および/または増強する化合物を同定するための貴重な候補受容体であることが示された。