BR112020010410A2 - análogos de incretina e o uso dos mesmos - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a análogos de incretina que têm atividade em cada um dos receptores de GIP, GLP-1 e glucagon. Os análogos de incretina possuem características estruturais que resultam em atividade equilibrada e duração estendida de ação em cada um desses receptores. Também são providos métodos para o tratamento de doenças como diabetes mellitus, dislipidemia, doença hepática gordurosa, síndrome metabólica, esteato hepatite não alcoólica e obesidade.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANÁLO- GOS DE INCRETINA E O USO DOS MESMOS".

[0001] A presente invenção refere-se a análogos de incretina tendo atividade em cada polipeptídeo insulinotrópico dependente de glicose (GIP), peptídeo-1 tipo glucagon (GLP-1) e receptores glucagon. Os aná- logos de incretina descritos aqui podem ter características estruturais que proporcionam atividade equilibrada e têm duração estendida de ação em cada um desses receptores. Tais análogos de incretina podem ser úteis para o tratamento de distúrbios como diabetes mellitus tipo 2 (T2DM), dislipidemia, síndrome metabólica, doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), esteato hepatite não alcoólica (NASH) e/ou obe- sidade.

[0002] Nas últimas décadas, a prevalência de diabetes continuou a aumentar. O T2DM é a forma mais comum de diabetes, representando cerca de 90% de todo o diabetes. T2DM é caracterizado por altos níveis de glicose no sangue causados pela resistência à insulina. O padrão atual de cuidado para o T2DM inclui dieta e exercícios, bem como tra- tamento com medicamentos orais e medicamentos injetáveis de redu- ção de glicose, incluindo terapias à base de incretina, tais como agonis- tas do receptor de GLP-1.

[0003] GLP-1 é um peptídeo de 36 aminoácidos, o maior fragmento biologicamente ativo do qual é produzido como um peptídeo amidado C-terminal de 30-aminoácidos (GLP-17-36; ID SEQ Nº.: 2), que estimula a secreção de insulina dependente de glicose e que previne a hipergli- cemia em diabéticos. Uma variedade de análogos de GLP-1 está atual- mente disponível para o tratamento de T2DM, incluindo dulaglutida, exe- natida e liraglutida. Muitos agonistas do receptor de GLP-1 atualmente comercializados, no entanto, são de dose limitada por efeitos colaterais gastrointestinais, tais como náuseas e vômitos. Quando o tratamento com medicamentos orais e terapias à base de incretina são insuficien- tes, o tratamento com insulina é considerado. Apesar das opções de tratamento disponíveis, um número significante de indivíduos rece- bendo terapias aprovadas não estão alcançando as metas de controle glicêmico (veja, por exemplo, Casagrande et al. (2013) Diabetes Care 36:2271-2279).

[0004] Diabetes descontrolada pode levar a uma ou mais condições que impactam a morbidade e a mortalidade desses indivíduos. Um dos principais fatores de risco para o T2DM é a obesidade e a maioria dos indivíduos com T2DM (-90%) estão acima do peso ou obesos. Está do- cumentado que uma diminuição da adiposidade corporal levará à me- lhora das comorbidades associadas à obesidade, incluindo hiperglice- mia e eventos cardiovasculares. Portanto, terapias eficazes no controle da glicose e redução de peso são necessárias para um melhor gerenci- amento da doença.

[0005] Em vista disso, novas terapias em estudo incluem compostos com atividade não apenas em um receptor de GLP-1, mas também ati- vidade em um ou mais receptores, como os receptores de GIP e/ou glu- cagon. De fato, certos compostos foram descritos como tendo atividade agonista tripla (ou seja, atividade em cada um dos receptores de gluca- gon, GLP-1 e GIP). Por exemplo, a Publicação do Pedido Internacional de Patente Nº. WO 2015/067716 descreve análogos de glucagon tendo tripla atividade agonista. Da mesma forma, o Pedido Internacional de Patente Nº. WO 2016/198624 descreve análogos de exendina-4, em si um análogo de GLP-1, tendo atividade agonista tripla. Da mesma forma, os Pedidos Internacionais de Patente Nº. WO 2014/049610 e WO 2017/116204 descrevem uma variedade de análogos tendo atividade agonista tripla. Além disso, o Pedido Internacional de Patente Nº. WO 2017/153375 descreve coagonistas do glucagon e do GLP-1 que tam- bém são declarados como tendo atividade GIP.

[0006] No entanto, permanece uma necessidade de tratamentos, especialmente para T2DM, capazes de prover um controle da glicose eficaz, com benefícios de perda de peso e um perfil de efeito colateral favorável. Há também a necessidade de agentes terapêuticos disponí- veis para uso com duração suficientemente prolongada de ação para permitir dosagem tão infrequente quanto uma vez por dia, três vezes por semana, duas vezes por semana ou uma vez por semana.

[0007] Os análogos de incretina descritos aqui buscam atender às necessidades acima. Assim, esta divulgação descreve análogos de in- cretina com atividade em cada um dos receptores de GIP, GLP-1 e glu- cagon. Vantajosamente, os análogos de incretina descritos aqui têm ati- vidade equilibrada, permitindo a administração de doses que proporcio- nam atividade suficiente em cada receptor para prover os benefícios do agonismo desse receptor, enquanto evita efeitos colaterais indesejados associados a atividade excessiva. Além disso, os análogos de incretina descritos aqui têm longa duração de ação em cada um dos receptores de GIP, GLP-1 e glucagon, permitindo a dosagem tão infrequentemente quanto uma vez por dia, três vezes por semana, duas vezes por semana ou uma vez por semana. Desta maneira, os análogos de incretina resul- tam em controle melhorado da glicose, benefícios metabólicos, tais como redução do peso corporal e/ou composição corporal melhorada, benefícios lipídicos, tais como a redução da subtilisina conversase pro proteína / kexina tipo 9 (PCSK9), e/ou outros benefícios, tais como au- mento da massa óssea ou formação óssea ou diminuição da reabsorção óssea. Esta divulgação também descreve tratamentos eficazes para ou- tros transtornos ou condições, incluindo obesidade, NAFLD, NASH, dis- lipidemia e/ou transtorno metabólico.

[0008] Em uma configuração da presente invenção, provê-se um análogo de incretina que inclui a fórmula: YX2X3GTX6sTSDYSIX13aLDKX:7AQX25AFIEYLLEGGPSSGAPPPS onde X,> é Aib, X; é Q ou H, Xsé aMeF ou aMeF(2F), X13 é L ou aMeL, X17 é qualquer aminoácido com um grupo funcional disponível para con- jugação, onde o grupo funcional é conjugado a um ácido graxo C16-C22, X2o é Aib, Q ou H (ID SEQ Nº. 5) e o aminoácido C-terminal é opcional- mente amidado, em um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

[0009] Em outra configuração, um método é provido para o trata- mento de uma doença tal como dislipidemia, doença hepática gordu- rosa, síndrome metabólica, NASH, obesidade e T2DM. Tais métodos podem incluir pelo menos uma etapa de administração a um indivíduo necessitado de uma quantidade efetiva de um análogo de incretina des- crito aqui. Em alguns casos, a doença é doença hepática gordurosa, obesidade, NASH ou T2DM.

[0010] Em outra configuração, um análogo de incretina, como aqui descrito, é provido para uso em terapia. Por exemplo, um análogo de incretina como aqui descrito é provido para uso no tratamento de uma doença, tal como dislipidemia, doença hepática gordurosa, síndrome metabólica, NASH, obesidade e T2DM. Em alguns casos, a doença é doença hepática gordurosa, obesidade, NASH ou T2DM.

[0011] Em outra configuração, um análogo de incretina, como aqui descrito, é provido para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento de dislipidemia, doença hepática gordurosa, síndrome me- tabólica, NASH, obesidade e T2DM. Em alguns casos, a doença é do- ença hepática gordurosa, obesidade, NASH ou T2DM.

[0012] Em outra configuração, é provida uma composição farma- cêutica que inclui um análogo de incretina como aqui descrito e um veículo, diluente ou excipiente farmacêuticamente aceitável.

[0013] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e ci- entíficos aqui utilizados têm o mesmo significado comumente compre- endido por uma pessoa versada na técnica a que a divulgação é perti-

nente. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equiva- lentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou em testes dos análogos de incretina, composições farmacêuticas e métodos, os métodos e materiais preferidos são aqui descritos.

[0014] Além disso, a referência a um elemento pelo artigo indefinido "uma" ou "um" não exclui a possibilidade de que mais de um elemento esteja presente, a menos que o contexto exija claramente que haja um e apenas um elemento. O artigo indefinido "uma" ou "um" então geral- mente significa "pelo menos um(a)".

[0015] GIP é um peptídeo de 42 aminoácidos (IQ SEQ Nº.:4) e é uma incretina, que desempenha um papel fisiológico na homeostase de glicose estimulando a secreção de insulina de células beta pancreáticas na presença de glicose.

[0016] GLP-1 é um peptídeo de 36 aminoácidos (ID SEQ Nº.:2) e também é uma incretina, que estimula a secreção de insulina glicose dependente e que tem sido apresentada para prevenir hiperglicemia em diabéticos.

[0017] Glucagon é um peptídeo de 29 aminoácidos (ID SEQ Nº .:1) que ajuda a manter a glicose do sangue, ligando e ativando receptores de glucagon em hepatócitos, fazendo com que o fígado libere glicose — armazenada na forma de glicogênio — através de um processo chamado glicogenólise.

[0018] Oxintomodulina (OXM) é um peptídeo de 37 aminoácidos, in- cluindo não apenas a sequência de 29 aminoácidos de glucagon, mas também uma extensão terminal de carbóxi octapeptídeos (ID SEQ Nº.:3) que ativa tanto os receptores de glucagon como os de GLP-1, com uma potência levemente maior para o receptor de glucagon sobre o receptor de GLP-1.

[0019] Além do T2DM, incretinas e análogos destas tendo atividade em um ou mais dos receptores de GIP, GLP-1 e/ou glucagon, têm sido descritos como tendo um potencial de valor terapêutico em uma série de outras condições, doenças ou transtornos, incluindo, por exemplo, obesidade, NAFLD e NASH, dislipidemia, síndrome metabólica, trans- tornos relacionados aos ossos, doença de Alzheimer e doença de Par- kinson. Veja, por exemplo, Jall et al. (2017) Mol. Metab. 6:440-446; Car- bone et al. (2016) J. Gastroenterol. Hepatol. 31:23-31; Finan et al. (2016) Trends Mol. Med. 22:359-376; Choi et al. (2017) "Potent body weight loss and efficacy in a NASH animal model by a novel long-acting GLP-1/Glucagon/GIP triple-agonist (HM15211)”, ADA Poster 1139-P; Ding (2008) J. Bone Miner. Res. 23:536-543; Tai et al. (2018) Brain Res. 1678:64-74; Múller et al. (2017) Physiol. Rev. 97:721-766; Finan et al. (2013) Sci. Transl. Med. 5:209; Hólscher (2014) Biochem. Soc. Trans. 42:593-600.

[0020] Tal como aqui utilizado, "cerca" significa dentro de uma faixa estatisticamente significativa de um valor ou valores tais como, por exemplo, uma concentração declarada, comprimento, peso molecular, pH, identidade de sequência, período de tempo, temperatura ou volume. Tal valor ou faixa pode estar dentro de uma ordem de magnitude tipica- mente dentro de 20%, mais tipicamente dentro de 10%, e ainda mais tipicamente dentro de 5% de um determinado valor ou intervalo. A vari- ação permitida englobada pelo "cerca" dependerá do sistema específico em estudo, podendo ser facilmente avaliada por aquele versado na téc- nica.

[0021] Tal como aqui utilizado e em referência a um ou mais dos receptores de GIP, GLP-1 ou glucagon, "atividade", "ativar", "ativação" e similares, significa a capacidade de um composto, tais como os análogos de incretina aqui descritos, em se ligar e induzir uma resposta aos receptores(s), conforme medido por meio de ensaios conhecidos natécnica, como os ensaios in vitro descritos abaixo.

[0022] Tal como aqui utilizado, "aminoácido com um grupo funcional disponível para conjugação" significa qualquer aminoácido natural ou não natural, com um grupo funcional que pode ser conjugado a ácidos graxos por meio de, por exemplo, um ligante. Exemplos de tais grupos funcionais incluem, mas não se limitam a, alquinila, alquenila, amino, azida, bromo, carboxila, cloro, iodo e grupos tiol. Exemplos de aminoá- cidos naturais, incluindo tais grupos funcionais, incluem K (amino), C (tiol), E (carboxila) e D (carboxila).

[0023] Tal como aqui utilizado, " ácido graxo C16-C22 " significa um ácido carboxílico tendo entre 16 e 22 átomos de carbono. O ácido graxo C16-C22 adequado para uso aqui pode ser um monoácido saturado ou um diácido saturado. Tal como aqui utilizado, "saturado" significa que o ácido graxo não contém ligações duplas ou triplas carbono-carbono.

[0024] Tal como aqui utilizado, "quantidade efetiva" significa uma quantidade, concentração ou dose de um ou mais análogos de incretina aqui descritos, ou um sal farmacêutico aceitável deste, que, após uma única ou múltiplas administrações de doses a um indivíduo necessitado, proporciona um efeito desejado em tal indivíduo sob diagnóstico ou tra- tamento. Uma quantidade efetiva pode ser prontamente determinada por aquele versado na técnica através do uso de técnicas conhecidas e observando resultados obtidos em circunstâncias análogas. Na deter- minação da quantidade efetiva para um indivíduo, uma série de fatores são considerados incluindo, mas não se limitando a, a espécie de ma- mífero; seu tamanho, idade e saúde geral; ao transtorno ou doença es- pecífica envolvida; o grau ou o envolvimento ou a gravidade da doença ou transtorno; a resposta do paciente individualmente; o análogo de in- cretina particularmente administrado; o modo de administração; as ca- racterísticas de biodisponibilidade da preparação administrada; o re- gime de dose selecionado; o uso de medicação concomitante; e outras circunstâncias relevantes.

[0025] Tal como aqui utilizado, "duração estendida da ação" signi- fica que a afinidade de ligação e a atividade para um análogo de incre- tina continua por um período de tempo maior do que os peptídeos nati- vos humanos de GIP, GLP-1 e glucagon, permitindo a dosagem pelo menos tão infrequente como uma vez por dia ou mesmo três vezes por semana, duas vezes por semana ou uma vez por semana. O perfil de ação temporal do análogo de incretina pode ser medido usando méto- dos de teste farmacocinéticos conhecidos, tais como os utilizados nos exemplos abaixo.

[0026] Tal como aqui utilizado, " análogo de incretina " significa um composto com similaridades estruturais, mas múltiplas diferenças de cada GIP, GLP-1 e glucagon, especialmente GIP humano (ID SEQ Nº.:4), GLP-1 (ID SEQ Nº.:2) e glucagon (ID SEQ Nº .:1). Os análogos de incretina descritos aqui incluem sequências de aminoácidos, resul- tando em compostos com afinidade e atividade em cada um dos recep- tores de GIP, GLP-1 e glucagon (ou seja, atividade agonista tripla).

[0027] Tal como aqui utilizado, "indivíduo em necessidade" significa um mamífero, tal como um humano, com uma condição, doença, trans- torno ou sintoma, requerendo tratamento ou terapia, incluindo, por exemplo, aqueles listados aqui.

[0028] Tal como aqui utilizado, "trato", "tratando", "tratar" e afins sig- nifica conter, retardar, parar ou reverter a progressão ou severidade de uma condição, doença, transtorno ou sintoma existente.

[0029] Tal como aqui usado e com referência a um análogo incre- tina, "atividade agonista tripla" significa um análogo de incretina com atividade em cada um dos receptores de GIP, GLP-1 e glucagon, espe- cialmente um análogo com uma atividade equilibrada e suficiente em cada receptor para prover os benefícios de agonismo desse receptor, evitando efeitos colaterais indesejados associados a atividade exces-

siva. Além disso, os análogos de incretina tendo atividade agonista tri- pla, tem duração estendida de ação em cada um dos receptores de GIP, GLP-1 e glucagon, o que permite vantajosamente a dosagem tão infre- quente quanto uma vez por dia, três vezes por semana, duas vezes por semana ou uma vez por semana.

[0030] Tal como aqui utilizado, "tratando" ou "tratar" significa conter, retardar, parar ou reverter a progressão ou severidade de uma condi- ção, doença, transtorno ou sintoma existente.

[0031] Tal como aqui usado e com referência a um análogo incre- tina, "atividade agonista tripla" significa um análogo de incretina com atividade em cada um dos receptores de GIP, GLP-1 e glucagon, espe- cialmente um análogo com uma atividade equilibrada e suficiente em cada receptor para prover os benefícios de agonismo desse receptor, evitando efeitos colaterais indesejados associados a atividade exces- siva. Além disso, os análogos de incretina tendo atividade agonista tri- pla, tem duração estendida de ação em cada um dos receptores de GIP, GLP-1 e glucagon, o que permite vantajosamente a dosagem tão infre- quente quanto uma vez por dia, três vezes por semana, duas vezes por semana ou uma vez por semana.

[0032] As características estruturais dos análogos de incretina aqui descritos resultam em análogos tendo atividade suficiente em cada um dos receptores de GIP, GLP-1 e glucagon, para obter os efeitos favorá- veis da atividade em cada receptor (ou seja, atividade agonista tripla), mas não tanta atividade em qualquer um dos receptores para sobrecar- regar a atividade em ambos os dos dois receptores, ou resultar em efei- tos colaterais indesejáveis quando administrados em uma dose sufici- ente para resultar em atividade em todos os três receptores. Exemplos não limitantes de tais características estruturais em determinadas con- figurações e com referência a ID SEQ ID Nº.:5, incluem aMeF ou aMeF(2F) na posição 6, que descobriu-se contribuir para a atividade ideal de glucagon, L ou aMeL na posição 13, que descobriu-se contribuir para a atividade ideal de glucagon e GIP; Aib na posição 20, que des- cobriu-se contribuir para a atividade ideal de GIP; acilação na posição 17, que descobriu-se contribuir para a atividade de glucagon ideal; e Y na posição 25, que descobriu-se contribuir para a atividade ideal de glu- cagon e/ou GIP. Outros exemplos de tais características estruturais in- cluem os aminoácidos descritos aqui nas posições 22, 24 e 28-39, que descobriu-se contribuir para a ligação e potência ideais para todos os três receptores.

[0033] As características estruturais dos análogos de incretina des- critos aqui, também resultam em análogos com muitos outros atributos benéficos relevantes para sua capacidade de desenvolvimento como tratamentos terapêuticos, incluindo melhorar a solubilidade dos análo- gos em soluções aquosas, melhorar a estabilidade da formulação quíi- mica e física, estender o perfil farmacocinético e minimizar o potencial de imunogenicidade. Exemplos não limitantes de características estru- turais particulares que resultam em tais atributos, incluem a acilação na posição 17 com um ácido graxo C2o, o que contribui para perfis farma- cocinéticos ideais (PK) e capacidade de desenvolvimento; Aib ou H na posição 20, o que contribui para perfis PK ideais e capacidade de de- senvolvimento; e os aminoácidos aqui descritos nas posições 22, 24 e 28-39, que contribuem para PK, imunogenicidade, desenvolvimento e estabilidade melhorados.

[0034] Deve-se notar que as listas anteriores de características es- truturais são exemplares e não abrangentes, e que a combinação de características benéficas de análogos exemplares aqui descritos não é o resultado de qualquer modificação isolada, mas sim alcançada atra- vés das novas combinações das características estruturais aqui descri- tas. Além disso, os efeitos acima descritos das listas anteriores de mo-

dificações não são exclusivos, pois muitas dessas modificações tam- bém têm outros efeitos importantes para as características dos compos- tos aqui descritos, conforme descrito abaixo.

[0035] As sequências de aminoácidos de análogos de incretina aqui descritos incorporam aminoácidos ocorrendo naturalmente, tipicamente representados aqui usando códigos de uma letra padrões (por exemplo, L = leucina), bem como resíduos alfa-metil substituídos de aminoácidos naturais (por exemplo, a-metil leucina (aMeL), a-metil lisina (aMeK), a- metil fenilanina (aMeF) e a-metil 2-fluorofenil anilanina (aMeF(2F)), e alguns outros aminoácidos não naturais, tais como o ácido alfa amino isobutírico (Aib). As estruturas desses aminoácidos estão representa- das abaixo: aMeL aMeK Aib aMeF aMeF(2F) o” F. Ao ! 2 > H e H é 9 n Nº oH “ ” oH o . on 5 1 o

[0036] Como observado acima, os análogos de incretina aqui des- critos têm similaridades estruturais, mas muitas diferenças estruturais, com qualquer um dos peptídeos humanos nativos. Por exemplo, quando comparado com GIP (ID SEQ Nº.:4) humano nativo, os análogos de in- cretina aqui descritos incluem modificações em uma ou mais das posi- ções 2, 3, 6, 7, 13, 14, 17, 18-21, 23-25, 28-29 e 30-42. Em alguns ca- Sos, os análogos de incretina aqui descritos incluem modificações nos aminoácidos do GIP (ID SEQ Nº.:4) humano nativo em cada uma das posições 2, 3, 6, 7, 13, 14, 17, 18, 21, 23-25, 29 e 30-42. Em certos casos, os análogos de incretina aqui descritos incluem as seguintes mo- dificações de aminoácidos: Aib na posição 2; Q ou H na posição 3; aAMeF ou aMeF(2F) na posição 6; T na posição 7; L ou aMeL na posição 13; L na posição 14; um resíduo K modificado na posição 17, que é modifi- cado através da conjugação ao grupo épsilon-amino da cadeia lateral K com um ácido graxo C16 a C22, opcionalmente através do uso de um ligante; A na posição 18; Q na posição 19; Aib, Q ou H na posição 20; A na posição 21; | na posição 23; E na posição 24; Y na posição 25; E na posição 28; G na posição 29; e substituição dos aminoácidos nas posições 30 - 42 com a seguinte sequência de aminoácidos: GPSSGA- PPPS (ID SEQ Nº.:12) (e análogos truncados da cauda). Em ainda ou- tros casos, os análogos de incretina aqui descritos são amidados. Além das modificações aqui descritas, os análogos de incretina descritos aqui podem incluir uma ou mais modificações adicionais de aminoácidos, desde que, no entanto, os análogos permaneçam capazes de ligar e ativar cada um dos receptores de GIP, GLP-1 e glucagon.

[0037] Como observado acima, os análogos de incretina descritos aqui incluem uma porção de ácido graxo conjugado, por exemplo, por meio de um ligante a um aminoácido natural ou não natural com um grupo funcional disponível para conjugação. Essa conjugação às vezes é referida como acilação. Em certos casos, o aminoácido com um grupo funcional disponível para conjugação pode ser K, C, E e D. Em casos particulares, o aminoácido com um grupo funcional disponível para con- jugação é K, onde a conjugação é no grupo épsilon-amino da cadeia lateral K.

[0038] A acilação dos análogos de incretina aqui descritos é na po- sição 17 em ID SEQ Nº.:5, que foi determinada como o local ideal para a inclusão desta estrutura. O ácido graxo, e em certas configurações da invenção o ligante, atuam como ligantes de albumina e provêm o poten- cial para gerar compostos de longa atuação.

[0039] Os análogos de incretina descritos aqui, utiizam um ácido graxo C16-C22 quimicamente conjugado ao grupo funcional de um ami- noácido, tanto por uma ligação direta, como por um ligante. O compri- mento e a composição do ácido graxo impactam a meia-vida dos aná- logos de incretina, sua potência em modelos animais in vivo e sua solu- bilidade e estabilidade. A conjugação a um monoácido ou diácido graxo saturado C16-C22 resulta em análogos de incretina que exibem meia-vida desejável, potência desejável em modelos animais in vivo e caracterís- ticas desejáveis de solubilidade e estabilidade.

[0040] Exemplos de ácidos graxos saturados C16-C22 para uso aqui incluem mas não são limitados a, ácido palmítico (ácido hexadecanóico) (monoácido C16 ), ácido hexadecanodióico (diácido C16), ácido margá- rico (ácido heptadecanóico)(monoácido C'17), ácido heptadecanodióico (diácido C17), ácido esteárico (monoácido C18), ácido octadecanodióico (diácido C18 ), ácido nonadecílico (ácido nonadecanóico)( monoácido C19), ácido nonadecanodióico (diácido C19), ácido araquidônico (ácido eicosanóico)(monoácido Co), ácido eicosanodióico (diácido C29), ácido heneicosílico (ácido heneicosanóico)( monoácido C21), ácido heneicosa- nodióico (diácido C21), ácido behênico (ácido docosanóico)( monoácido C22), ácido docosanodióico (diácido C22), incluindo derivados ramificados e substituídos dos mesmos.

[0041] Em certos casos, o ácido graxo C16-C22 pode ser um monoá- cido C16 saturado, um diácido C138 saturado, um monoácido C19 saturado, um diácido C19 saturado, um monoácido C205 saturado, um diácido C2o saturado e derivados ramificados e substituídos destes. Em casos mais particulares, o ácido graxo C16-C22 pode ser ácido esteárico, ácido ara- quidônico ou ácido eicosanodióico, especialmente ácido araquidônico.

[0042] Em alguns casos, o ligante pode ter de um a quatro aminoá- cidos, um carboxilato de amino polietilenoglicol, ou misturas destes. Em certos casos, o carboxilato de amino polietilenoglicol tem a seguinte es- trutura:

HNH-CH2-CH2-[0-CH2-CH2]Jm-0-(CH2)5-COXn-OH, onde m é um número inteiro de 1 a 12, n é qualquer número inteiro entre 1al2epéilou?.

[0043] Em certos casos, o ligante pode ter um ou mais porções de (2-[2-(2-amino-etóxi) - acetila), opcionalmente em combinação com um até quatro aminoácidos.

[0044] Nos casos em que o ligante inclui pelo menos um aminoá- cido, o aminoácido pode ser de um a quatro resíduos de Glu ou yGlu aminoácidos. Em alguns casos, o ligante pode incluir um ou dois resí- duos de Glu ou yGlu aminoácidos, incluindo as formas D destes. Por exemplo, o ligante pode incluir um ou dois resíduos de yGlu aminoáci- dos. Alternativamente, o ligante pode incluir um a quatro resíduos de aminoácidos (tais como, por exemplo, Glu ou yGlu aminoácidos) usados em combinação com até trinta e seis porções de (2-[2-( 2-amino-etóxi) - etóxi] -acetila). Especificamente, o ligante pode ser combinações de um a quatro E ou yvE aminoácidos e de uma a quatro porções de (2-[2- amino-etóxi) - etóxi] - acetila). Em outros casos, o ligante pode ser com- binações de um ou dois yGlu aminoácidos e uma ou duas porções de (2- [2-amino- etóxi) -etóxi] - acetila).

[0045] Em um caso específico, os análogos de incretina aqui des- critos tem ligante e componentes de ácido graxo tendo a estrutura da seguinte fórmula: (2-[2-(2-amino-etóxi) -etóxi] -acetila)a-(yGlu))-CO-(CH2).-CO>2H, onde a é 1 ou2,bé 1ou2ecé16ou18. Em um caso particular, a é 2,bé 1Tecé18, cuja estrutura está representada abaixo: o no. o, pet A A Ço

[0046] Em outro caso específico, a é 1,bé 2e c é 18, cuja estrutura está representada abaixo:

Ho o 0% oH

[0047] Em outro caso específico, a é 0, bé 2e c é 18, cuja estrutura está representada abaixo: so HO 0, A A o o ADO H o 07 "oH

[0048] Em outro caso específico, a é 0, bé 2e c é 18, cuja estrutura está representada abaixo: Ão N Le on ; Ao EF N atari

[0049] Como mostrado nas estruturas químicas dos Exemplos 1-6 abaixo, as porções de ácido graxo - ligante descritos acima, podem es- tar ligados ao grupo épsilon (e€)-amino da cadeia lateral (K) de lisina.

[0050] A afinidade dos análogos de incretina aqui descritos para cada um dos receptores de GIP, GLP-1 e glucagon pode ser medida usando métodos conhecidos na técnica para medir níveis de ligação de receptores, incluindo, por exemplo, aqueles descritos nos exemplos abaixo, e é comumente expressa como um valor de constante de inibi- ção (Ki). A atividade dos análogos de incretina descritos aqui em cada um dos receptores também pode ser medida utilizando métodos conhe- cidos na técnica, incluindo, por exemplo, os ensaios de atividade in vitro descritos abaixo, e é comumente expressa como um valor de concen- tração 50 efetiva (EC5o), que é a concentração de composto causando simulação meia-máxima em uma curva de resposta de dose.

[0051] Os análogos de incretina descritos aqui podem ser formula- dos como composições farmacêuticas, que podem ser administradas por rotas parenterais (por exemplo, subcutânea, intravenosa, intraperi- toneal, intramuscular ou transdérmica). Tais composições farmacêuti- cas e as técnicas para preparar estas são bem conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Remington: “The Science and Practice of Pharmacy“ (Troy, Ed., 21st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006). Em casos particulares, análogos de incretina são administrados via subcutânea.

[0052] Os análogos de incretina aqui descritos podem reagir com qualquer um dos numerosos ácidos / bases inorgânicos e orgânicos, para formar sais de adição de ácido / base aceitáveis farmaceutica- mente. Sais farmaceuticamente aceitáveis e técnicas comuns para pre- pará-los são bem conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Stahl, et al., “Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use”, 2º Edição Revisada (Wiley-VCH, 2011)). Sais farmaceuticamente acei- táveis para uso aqui incluem sais de sódio, trifluoro acetato, cloridrato e acetato.

[0053] Esta divulgação também provê e, portanto, abrange novos intermediários e métodos de sintetizar os análogos de incretina descri- tos aqui, ou um sal farmacêutico aceitável destes. Os intermediários e análogos de incretina descritos aqui podem ser preparados por uma va- riedade de métodos conhecidos da técnica. Por exemplo, um método usando síntese química é ilustrado nos exemplos abaixo. As etapas de síntese específicas para cada uma das rotas descritas, podem ser com- binadas de diferentes maneiras para preparar análogos de incretina descritos aqui. Os reagentes e matérias primas estão prontamente dis- poníveis para aquele versado na técnica.

[0054] Certos análogos de incretina aqui descritos são geralmente eficazes por uma ampla faixa de dosagem. Por exemplo, as doses para administração uma vez por semana podem cair dentro de um intervalo de cerca de 0,01 a cerca de 30 mg/pessoa/semana, dentro de um inter- valo de cerca de 0,1 a cerca de 10 mg/pessoa/semana ou mesmo dentro de um intervalo de cerca de 0,1 a cerca de 3 mg/pessoa/semana. Assim, os análogos de incretina descritos aqui podem ser dosados diariamente, três vezes por semana, duas vezes por semana ou uma vez por se- mana, especialmente administração uma vez por semana.

[0055] Os análogos de incretina aqui descritos podem ser usados para tratar uma variedade de condições, transtornos, doenças ou sinto- mas. Em particular, são providos métodos para o tratamento do TºDM em um indivíduo, sendo que tais métodos incluem pelo menos uma etapa de administrar a um indivíduo que necessita desse tratamento, uma quantidade efetiva de um análogo de incretina aqui descrito, ou seu sal farmaceuticamente aceitável.

[0056] Adicionalmente, são providos métodos para o tratamento da obesidade em um indivíduo, sendo que tais métodos incluem pelo me- nos uma etapa de administrar a um indivíduo que necessita desse tra- tamento, uma quantidade efetiva de um análogo de incretina aqui des- crito, ou seu sal farmaceuticamente aceitável.

[0057] Adicionalmente, são providos métodos para induzir a perda de peso não terapêutica em um indivíduo, sendo que tais métodos in- cluem pelo menos uma etapa de administrar a um indivíduo que neces- sita desse tratamento, uma quantidade efetiva de um análogo de incre- tina descrito aqui, ou seu sal farmaceuticamente aceitável.

[0058] Adicionalmente, são providos métodos para tratar síndrome metabólica em um indivíduo, sendo que tais métodos incluem pelo me- nos uma etapa de administrar a um indivíduo que necessita de tal trata- mento, uma quantidade efetiva de um análogo de incretina descrito aqui, ou seu sal farmaceuticamente aceitável.

[0059] Adicionalmente, são providos métodos para tratar NASH em um indivíduo, sendo que tais métodos incluem pelo menos uma etapa de administrar a um indivíduo que necessita de tal tratamento, uma quantidade efetiva de um análogo de incretina descrito aqui, ou seu sal farmaceuticamente aceitável.

[0060] Adicionalmente, são providos métodos para tratar FLD em um indivíduo, sendo que tais métodos incluem pelo menos uma etapa de administrar a um indivíduo que necessita de tal tratamento, uma quantidade efetiva de um análogo de incretina descrito aqui, ou seu sal farmaceuticamente aceitável.

[0061] Nesses métodos, a eficácia dos análogos de incretina pode ser avaliada por, por exemplo, observar uma redução significativa da glicose no sangue, observar um aumento significativo da insulina, observar uma redução significativa no HbAlc e/ou observar uma redução significativa no peso corporal.

[0062] Alternativamente, os análogos de incretina aqui descritos ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser usados para melho- rar a força óssea em um indivíduo em necessidade desta. Em alguns casos, o indivíduo necessitado tem hipo-osteose ou hipo-osteoidose, ou está se recuperando de fratura óssea, procedimento ortótico, implante de próteses, implante dentário e/ou fusão espinhal. Os análogos de in- cretina descritos aqui também podem ser usados para tratar outros transtornos, como a doença de Parkinson ou a doença de Alzheimer.

SINTESE DE PEPTÍDEO Exemplo1:

[0063] O Exemplo 1 é um composto representado pela seguinte descrição: Y-Aib-QGT-aMeF-TSDYSILLDKK((2-[2-(2-amino-etóxi)-etóxi] -acetila)2- (YGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-Aib-AFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH2 (ID SEQ Nº.:6).

[0064] Abaixo está uma representação da estrutura do Exemplo 1 usando os códigos padrões de letra única para aminoácidos, com exce- ção dos resíduos Aib2, aMeF6, K17 e Aib20, onde as estruturas desses resíduos de aminoácidos foram expandidas:

o fo ps a rg anna ” o JS ro, vga ae aus rat fg ariano A

[0065] O esqueleto peptídico do Exemplo 1 é sintetizado usando a química de fluorenil metilóxi carbonila (Fmoc) / terc-Butila (t-Bu) em um sintetizador de peptídeo Symphony X (Protein Technologies, Inc. Tuc- son, AZ).

[0066] A resina consiste em poliestireno reticulado com 1% de DVB (Resina de Baixo Carregamento Fmoc-Rink-MBHA, malha 100-200, EMD Millipore) em uma substituição de 0,3-0,4 meq/g. Grupos de pro- teção de cadeia lateral padrões são usados. Fmoc-Lys(Mtt)-OH) é usado para a lisina na posição 17 e Boc-Tir(tBu)-OH) é usado para a tirosina na posição 1. Os grupos Fmoc são removidos antes de cada etapa de acoplamento (2 x 7 minutos) usando 20% de piperidina em DMF. Todos os acoplamentos de aminoácidos padrões são realizados durante 1 hora para uma amina primária, e 3 horas para uma amina secundária, usando uma relação molar igual de aminoácido Fmoc (0,3 mM), di-isopropil carbodiimida (0,9 mM) e oxima (0,9 mM), com um ex- cesso molar de 9 vezes sobre o carregamento teórico de peptídeo. Ex- ceções são os acoplamentos aos aminoácidos Ca-metilados, que são acoplados por 3 horas. Após a síntese do esqueleto peptídico estar completa, a resina é rigorosamente lavada com DCM por 6 vezes para remover a DMF residual. O grupo protetor Mtt na lisina na posição 17 é seletivamente removido da resina peptídica usando dois tratamentos de 30% de hexafluoroisopropanol (Oakwood Chemicals) em DCM (trata- mento de 2 x 40 minutos).

[0067] A anexação subsequente da porção de ligante de ácido graxo é realizada pelo acoplamento de ácido 2-[2-(2-Fmoc-amino-

etóxi)-etóxil- acético (Fmoc-AEEA-OH, ChemPep, Inc.), a-t-butilo éster do ácido Fmoc-glutâmico (Fmoc-Glu-OtBu, Ark Pharm, Inc.), ácido mono-OtBu-eicosanodióico (WuXi AppTec, Xangai, China). Excesso de 3 vezes dos reagentes (AA: PiAOP: DIPEA = 1:1:1 mol/mol) são usados para cada acoplamento de 1 hora de duração.

[0068] Após a síntese estar completa, a resina peptídica é lavada com DCM e então rigorosamente seca ao ar. A resina seca é tratada com 10 ml de coquetel de clivagem (ácido trifluoro acético: água: triiso- propil silano, 95:2.5:2.5 v/v) por 2 horas, à temperatura ambiente. A re- sina é filtrada, lavada duas vezes cada com 2 ml de TFA puro, e os filtrados combinados são tratados com éter dietil frio por 5 vezes (-20ºC) para precipitar o peptídeo bruto. A suspensão peptídeo/éter é então cen- trifugada a 3500 rpm por 2 min para formar uma pelota sólida, o sobre- nadante é decantado, e a pelota sólida é triturada com éter duas vezes adicionais e secada em vácuo. O peptídeo bruto é solubilizado em uma mistura de 20% de acetonitrila / 20% de ácido acético / 60% de água e purificado por RP-HPLC em uma coluna preparatória Luna de 5 um de fenil-hexila (21 x 250 mm, Fenomenex) com gradientes lineares de 100% de acetonitrila e sistema tampão 0,1% TFA/água (30-50% de ace- tonitrila em 60 min). A pureza do peptídeo é avaliada utilizando-se RP- HPLC analítico e os critérios de agrupamento são >95%. A pureza prin- cipal do pool do Exemplo 1 é de 99,2%. A liofilização subsequente do pool de produto principal final produz um sal TFA de peptídeo liofilizado. O peso molecular é determinado por LC-MS (obs.: M+4H+/4 =1219,9; Calculado M+4H+/4 =1220,1). Exemplo 2:

[0069] O Exemplo 2 é um composto representado pela seguinte descrição: Y-Aib-QGT-aMeF-TSDYSI- aMeL-LDKK ((2-[2-(2-amino-etóxi) -etóxil- acetila)>-(yGlu)-CO-(CH2):8-CO2H)AQ-Aib-AFIEYLLEGGPSSGAPPPS-

NH2(ID SEQ ID Nº.:7).

[0070] Abaixo está uma representação da estrutura do Exemplo 2 usando os códigos padrões de letra única para aminoácidos, com exce- ção dos resíduos Aib2, aMeF6, aMeL13, K17 e Aib20, onde as estrutu- ras desses resíduos de aminoácidos foram expandidas: o Avon ra o 8 o EJA ÇAA o A o Am o O NX o

[0071] Processos similares a aqueles descritos acima para o Exem- plo 1 foram usados para sintetizar o esqueleto peptídico, conjugar por- ções de ligante-ácido graxo, examinar a pureza e confirmar o peso mo- lecular do Exemplo 2. Exemplo 3:

[0072] O Exemplo 3 é um composto representado pela seguinte descrição: Y-Aib-HGT - aMeF(2F)-TSDYSILLDKK ((2-[2- (2-amino-etóxi) -etóxi ] - acetil)>-(yGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-Aib-AFIEYLLEGGPSSGAPPPS- NH2(ID SEQ Nº:8).

[0073] Abaixo está uma representação da estrutura do Exemplo 3 usando os códigos padrões de letra única para aminoácidos, com exce- ção dos resíduos Aib2, aMeF(2F)6, K17 e Aib20, onde as estruturas desses resíduos de aminoácidos foram expandidas: quo pt aan 1 AD A ” mafra Aroma ae hrssievecscorssaarsr A na,

[0074] Processos similares a aqueles descritos acima para o Exem- plo 1 foram usados para sintetizar o esqueleto peptídico, conjugar por- ções de ligante-ácido graxo, examinar a pureza e confirmar o peso mo- lecular do Exemplo 3. Exemplo 4:

[0075] O Exemplo 4 é um composto representado pela seguinte descrição: Y-Aib-QGT-aMeF(2F) -TSDYSILLDKK ((2- [2- (2-amino-etóxi) -etóxi] - acetil) - (yGlu) -CO-(CH2):8-CO2H) AQ-Aib-AFIEYLLEGGPSSGAPPPS- NH2(ID SEQ Nº.:9).

[0076] Abaixo está uma representação da estrutura do Exemplo 4 usando os códigos padrões de letra única para aminoácidos, com exce- ção dos resíduos Aib2, aMeF(2F)6, K17 e Aib20, onde as estruturas desses resíduos de aminoácidos foram expandidas: poemas CA do Sor ' o

À Y O f e sf fgsen, arasstaas gos a raeasscesaa q

[0077] Processos similares a aqueles descritos acima para o Exem- plo 1 foram usados para sintetizar o esqueleto peptídico, conjugar por- ções de ligante-ácido graxo, examinar a pureza e confirmar o peso mo- lecular do Exemplo 4. Exemplo 5:

[0078] O Exemplo 5 é um composto representado pela seguinte descrição: Y-Aib-OGT-aMeF(2F) -TSDYSILLDKK ((2-[2-(2-amino-etoxiy) -etóxi] - acetil) - (yGlu) -CO- (CH2)18 -CO2H) AQQAFIEYLLEGGPSSGAPPPS- NH>2 (ID SEQ Nº.:10).

[0079] Abaixo está uma representação da estrutura do Exemplo 5 usando os códigos padrões de letra única para aminoácidos, com exce- ção dos resíduos Aib2, aMeF(2F)6 e K17 onde as estruturas desses resíduos de aminoácidos foram expandidas: o oH

EIXO ô PRENADOO,

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[0080] Processos similares a aqueles descritos acima para o Exem- plo 1 foram usados para sintetizar o esqueleto peptídico, conjugar por- ções de ligante-ácido graxo, examinar a pureza e confirmar o peso mo- lecular do Exemplo 5. Exemplo 6:

[0081] O Exemplo 6 é um composto representado pela seguinte descrição: Y-Aib-QGT-aMeF(2F) -TSDYSILLDKK ((2- [2-(2-amino-etóxi) -etóxi] - acetil) - (yGlu) -CO-(CH2):'s-CO2H)AQHAFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH?2 (ID SEQ Nº.:11).

[0082] Abaixo está uma representação da estrutura do Exemplo 6 usando os códigos padrões de letra única para aminoácidos, com exce- ção dos resíduos Aib2, aMeF(2F)6 e K17 onde as estruturas desses resíduos de aminoácidos foram expandidas:

o Ja aa a Gn. do A O f vo O Lv

[0083] Processos similares a aqueles descritos acima para o Exem- plo 1 foram usados para sintetizar o esqueleto peptídico, conjugar por- ções de ligante-ácido graxo, examinar a pureza e confirmar o peso mo- lecular do Exemplo 6.

FUNÇÃO IN VITRO Afinidade de ligação:

[0084] Ensaios de ligação de competição radioligando são executa- dos para determinar a constante de dissociação de equilíbrio para com- postos de exemplo e moléculas comparadoras. Tais ensaios usam mé- todos do ensaio de proximidade de cintilação (SPA) e membranas pre- paradas a partir de células HEK293 transfectadas que super expressam o receptor de GIP humano (GIPR), receptor de GLP-1 (GLP-1R) ou re- ceptor de glucagon humano (GcgR).

[0085] Os ensaios são realizados na presença de bacitracina como um agente de bloqueio não específico, para evitar que as porções aci- ladas de análogos de teste se vinculem a componentes proteicos usa- dos em tampões de ensaio padrão (por exemplo, albumina).

[0086] As curvas de competição são plotadas a partir da inibição es- pecífica percentual (eixo y) versus o logaritmo da concentração do com- posto (eixo x) e analisadas usando um ajuste de regressão não linear de quatro parâmetros, com inclinação variável (ABase ou Genedata). Os valores de Ki são calculados de acordo com a equação Ki = IC5o/(1+(D/Ka)), onde IC50o é a concentração de composto resultante em inibição de 50% de ligação, D é a concentração de radioligando usado no ensaio e Kia é a constante de dissociação de equilíbrio para o receptor e o radioligando, determinado a partir da análise de ligação de saturação (apresentada na Tabela 1 abaixo). Tabela 1: Constantes de Dissociação de Equilíbrio (Ka) Determinados a partir da Análise de Ligação de Saturação.

[0087] Os valores de K; de análogos exemplares e moléculas com- paradoras são apresentados na Tabela 2. Tabela 2: Afinidade de Ligação (Ki), in vitro, de Exemplos e Compara- dores para GIPR, GLP-1R e GcgR Humanos.

O ME [ros ares er Taeeg o A Ed NOTA: Um qualificador (>) indica que os dados não atingiram 50% de inibição em relação à ligação máxima, pelo qual o Ki foi calculado utilizando-se a maior concentração testada no ensaio. n=1/x significa que apenas um valor do número total de réplicas (x) é usado para expressar a média. O SEM só é calculado quando n=2 ou existem resultados não qualificados maiores.

[0088] Como visto na Tabela 2, os análogos exemplares têm afini- dade de ligação em cada um dos receptores de GIP, GLP-1 e Gcg. Atividade funcional

[0089] A atividade funcional é determinada em linhas de células clo- nais HEK-293 expressando GIPR-R- GLP-1R e GcgR. Cada linha celu- lar de super expressão do receptor é tratada com peptídeo (CRC de 20 pontos, 2,75 vezes de diluição direta com Labcyte Echo) em DMEM (Gibco Catft 31053) complementado com 1X GlutaMAXTY (Gibco Cat! 35050), 0,25% FBS (Soro Bovino Fetal, Gibco Cat ft 26400), 0,05% por- ção V de BSA (Bovine Serum Albumin, Gibco Cat ft 15260), 250 uM IBMX e 20 mM HEPES (Gibco Cat f 15630), em um volume de ensaio de 20 ul.

[0090] Após uma incubação de 60 minutos à temperatura ambiente, o aumento resultante do cAMP intracelular é determinado quantitativa- mente usando o kit de ensaio CisBio cAMP Dynamic 2 HTRF (62AM4PEJ). Resumidamente, os níveis de CAMP dentro da célula são detectados adicionando o conjugado cAMP-d2 no tampão de lise celu- lar, seguido pelo anticorpo anti-cAMP-Eu*?*-Cryptate, também no tam- pão de lise celular. O ensaio competitivo resultante é incubado por pelo menos 60 minutos, à temperatura ambiente e então detectado usando um Instrumento PerkinElmer EnvisionO, com excitação a 320 nm e emissão a 665 nm e 620 nm. As unidades de Envision (emissão a 665nNm/620nm*10.000) são inversamente proporcionais à quantidade de cAMP presente e foram convertidas em cAMP nM por poço usando uma curva padrão cAMP.

[0091] A quantidade de CAMP gerado (nM) em cada poço é conver- tida em um percentual de resposta máxima observada com GLP-1 (7- 36)NH2 humano, ou Gcg humano ou GIP (1-42)NH2 humano. Um valor relativo de EC5o é derivado da análise de regressão não linear usando a resposta máxima percentual versus a concentração de peptídeo adi- cionado, ajustado em uma equação logística de quatro parâmetros.

[0092] Os dados para análogos exemplares e hGIP(1-42)NH>, hGLP-1(7-36)NH>? e hGcg são apresentados na Tabela 3 abaixo.

Tabela 3: Potência CAMP Funcional (EC5so) para Análogos Exemplares e Comparadores na Presença de FBS e BSA.

LL ESFRIAR

FR TR | RGEP amido Joop oBtA | poem eso Tee ESTES THURSO [TST ITESEN [TOS TI0ES [7565 IOES 1500555 NOTA: Determinação de EC5so do GLP-1 (7-36)NH2 humano no GLP-1R humano, Gcg humano no GcegR humano e GIP (1-42)NH2 humano no GIP-R humano: as faixas de concentração de peptídeos foram de 448 PM a 99,5 nM. Determinação de ECs5o de Exemplos em GLP-1R hu- mano, GcgR humano e GIP-R humano: as faixas de concentração de peptídeos foram de 51,5 fM a 11,4 uM.

[0093] Como visto na Tabela 3, na presença de FBS e BSA, os aná- logos exemplares têm atividades agonistas, como determinadas pelos ensaios de CAMP de GIP-R, GLP-1R e GcgR humanos, que são inferi- ores aos ligantes nativos.

[0094] Um conjunto adicional de ensaios CAMP são conduzidos em células HEK293 expressando os receptores de GLP-1, GIP e glucagon humano. Utilizando métodos homogêneos de fluorescência resolvidas pelo tempo, são realizados ensaios para determinar a potência intrín- seca de análogos exemplares e moléculas comparadoras, realizados na presença de caseína (em vez de albumina sérica) como um bloqueador inespecífico, que não interage com as porções de ácidos graxos das moléculas analisadas.

[0095] Os níveis intracelulares de CAMP são determinados por ex- trapolação usando uma curva padrão. As curvas de resposta de dose dos compostos são plotadas como a porcentagem de estimulação nor- malizada para valores mínimos (somente tampão) e máximos (concen- tração máxima de cada ligante de controle) e analisadas usando um ajuste de regressão não linear de quatro parâmetros, com uma inclina- ção variável (Genedata Screener 13). EC50 é a concentração de com- posto causando simulação meia-máxima em uma curva de resposta de dose.

[0096] Os dados são fornecidos abaixo na Tabela 4. Tabela 4: Ativação Funcional de hGLP-1R, hGIPR, hGcgR na Presença de 0,1 % de Caseína LL AFETINEETO — o ERR ER Ter hGcg | 0.019 (0.00356, 163) | [AGP amiga Jotss mostra Exemplo 5 0,0343 (0.00555, 4) 0,0306 (0.00998, 5) 0,103 (0.0263, 4)

[0097] Como visto na Tabela 4, análogos exemplares estimulam CAMP de receptores de GIP, GLP-1 e glucagon humanos, na presença de 0,1% de caseína.

[0098] ID SEQ ID Nº.:1 — glucagon humano

HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT

[0099] ID SEQ Nº.:2 — GLP-1 (7-36) amida humano HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2

[0100] ID SEQ ID Nº.:3 — OXM humano

HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA

[0101] ID SEQ Nº.:4 — GIP humano

YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITO

[0102] SEQ ID NO:5 —Análogo de incretina YX2X3GTX6sTSDYSIX13LDKX:7AQX25AFIEYLLEGGPSSGAPPPS em que X2 É Aib, X; é QouH, Xe é aMeF ou aMeF(2F), X13 é L ou aMeL, X17 é qualquer aminoácido com um grupo funcional disponível para conjugação, onde o grupo funcional é conjugado a um ácido graxo C16-Ca>, X2o é Aib, Qou H,

[0103] ID SEQ Nº .:6 — Análogo de incretina Y-Aib-QGT-aMeF-TSDYSILLDKK ((2-[2-(2-amino-etóxi) - etóxi] - acetil) 2- (yGlu) -CO-(CH2)1s-CO2H) AQ-Aib-AFIEYLLEGGPSSGAP- PPS-NH>

[0104] ID SEQ Nº:7 — Análogo de incretina Y-Aib-QGT-aMeF-TSDYSI-aMeL-LDKK ((2-[2-(2-amino-etóxi) - etóxi] -acetil)2 -(yYGlu) -CO-(CH2):«a-CO2H) AQ-AIb-AFIEYLLEGGPSS- GAPPPS-NH2

[0105] ID SEQ ID Nº:8 — Análogo de incretina Y-Aib-HGT-aMeF(2F)-TSDYSILLDKK ((2-[2-(2-amino-etóxi) - etóxi] -acetil)2 -(yGlu) -CO- (CH2):8-CO2H) AQ -Aib- AFIEYLLEGGPSS- GAPPPS-NH>

[0106] ID SEQ Nº.:9 — Análogo de incretina Y-Aib-QGT- aMeF(2F)-TSDYSILLDKK ((2-[2-(2-amino-etóxi) - etóxi] -acetil) -(yGlu) -CO- (CH2):s-CO2H) AQ-AIib-AFIEYLLEGGPSS- GAPPPS-NH>

[0107] ID SEQ Nº.:10 — Análogo de incretina Y-Aib - QGT-aMeF(2F) -TSDYSILLDKK ((2-[2-(2-amino-etóxi) - etóxi] -acetil) - (yGlu) -CO-(CH2):s-CO2H) AQQAFIEYLLEGGPSSGAP- PPS-NH>

[0108] ID SEQ Nº.:11 — Análogo de incretina

Y-Aib-QGT-aMeF(2F) -TSDYSILLDKK ((2-[2-(2-amino-etóxi) - etóxi] - acetil) -(yGlu) -CO-(CH2):«s-CO2H) AQHAFIEYLLEGGPSSGAP- PPS-NH>2

[0109] ID SEQ Nº.:12 — sequência artificial

GPSSGAPPPS

Claims (28)

REIVINDICAÇÕES

1. Análogo de incretina, caracterizado pelo fato de que com- preende: YX2KX3GTX6sTSDYSIX1aL DKX:7AQX25AFIEYLLEGGPSSGAPPPS, em que X2 É Aib, X; é QouH, Xe é aMeF ou aMeF(2F), X13 é L ou aMeL, X17 é qualquer aminoácido com um grupo funcional disponível para conjugação e o grupo funcional é conjugado a um ácido graxo C16-C22, X2o é Aib, Qou H, (ID SEQ Nº.:5), e o aminoácido de terminal-C é opcionalmente amidado; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

2. Análogo de incretina, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que o aminoácido com um grupo funcional dis- ponível para conjugação na posição X17 é selecionado do grupo consis- tinddo em K, C, Ee D.

3. Análogo de incretina, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que o aminoácido com um grupo funcional dis- ponível para conjugação na posição X17 é K.

4. Análogo de incretina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o aminoácido com um grupo funcional disponível para conjugação na posição X17 e o ácido graxo C16-C22 são conjugados por um ligante entre aminoácido e o ácido graxo.

5. Análogo de incretina, de acordo com a reivindicação 4, ca- racterizado pelo fato de que o ligante compreende um a quatro aminoá- cidos.

6. Análogo de incretina, de acordo com a reivindicação 5, ca- racterizado pelo fato de que os aminoácidos são Glu ou yGlu.

7. Análogo de incretina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que o ligante ademais compreende a seguinte estrutura: H-INH-CH2-CH2-[0-CH2-CH2]Jm-0-(CH2)p-COn-OH, em que m é qualquer número inteiro de 1 a 12, n é qualquer número inteiro de 1a 12e pé 1 ou 2.

8. Análogo de incretina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pelo fato de que o ligante ademais compreende uma a quatro porções de (2-[2- (2-amino-etóxi) -etóxi] -ace- tila).

9. Análogo de incretina, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que X17 é K quimicamente modificada através da conjugação a um grupo épsilon-amino de uma cadeia lateral de K com a seguinte estrutura: (2- [2- (2-amino-etóxi) - etóxi] -acetila)a-(yGlu),-CO-(CH2).-CO2H, em que a é 0, 1 ou 2, bé 1 ou 2ecé um número inteiro entre 16 e 18.

10. Análogo de incretina, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a é 1.

11. Análogo de incretina, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a é 2.

12. Análogo de incretina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que b é 1.

13. Análogo de incretina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que bé 2.

14. Análogo de incretina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizado pelo fato de que c é 18.

15. Análogo de incretina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que X1:3 é aMeL.

16. Análogo de incretina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que X:13 é L.

17. Análogo de incretina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que X:3 é Q.

18. Análogo de incretina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que X13 é H.

19. Análogo de incretina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que Xs é aMeF.

20. Análogo de incretina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que Xs: é aMeF(2F).

21. Análogo de incretina, caracterizado pelo fato de que pos- sui a fórmula selecionada a partir do grupo consistindo em ID SEQ Nº.:

511.

22. Método de tratar uma doença selecionada a partir do grupo consistindo em T2DM, obesidade, doença hepática gordurosa, NASH, dislipidemia e síndrome metabólica, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de administrar a um indivíduo em necessi- dade, uma quantidade efetiva de um análogo de incretina como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21.

23. Método de tratar diabetes mellitus tipo Il, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de administrar a um indivíduo em necessidade, uma quantidade efetiva de um análogo de incretina como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21.

24. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: um análogo de incretina como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21; e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente acei- tável.

25. Análogo de incretina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que para uso no trata- mento de uma doença selecionada a partir do grupo consistindo em di- abetes mellitus, dislipidemia, doença hepática gordurosa, síndrome me- tabólica, esteato hepatite não alcoólica e obesidade.

26. Análogo de incretina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que é para uso no tra- tamento de diabetes mellitus tipo Il.

27. Uso de um análogo de incretina como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para tratar uma doença selecionada a partir do grupo consistindo em diabetes mellitus, dislipidemia, doença hepática gordurosa, síndrome metabólica, esteato hepatite não alcoó- lica e obesidade.

28. Uso de um análogo de incretina como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para tratar diabetes mellitus tipo Il.