BR112020009876A2 - agentes de imageamento - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere a derivados de 4-(furo[3,2-c]piridin-4-il) radiomarcados e seu uso como marcadores radioativos e, em particular, seu uso como agentes de imageamento.

Description

“AGENTES DE IMAGEAMENTO” CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção se refere a derivados de 4-(furo[3,2-c]piridin-4-il) radiomarcados e seu uso como marcadores radioativos e, em particular, como agentes de imageamento.

[0002] Em particular, a presente invenção se refere a compostos 6-[2-(fluorometil)- 4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil]-1,5-dimetilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona radiomarcados, e seu uso como marcadores radioativos e, em particular, como agentes de imageamento.

[0003] Mais particularmente, a invenção se refere ao uso de compostos 6-[2- (fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil]-1,5-dimetilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona radiomarcados como agentes de imageamento por PET.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0004] Os neurônios dopaminérgicos no cérebro humano desempenham um papel central na saúde e função do cérebro. A neurotransmissão dopaminérgica é importante para o movimento, cognição e comportamento de recompensa. Foram identificados cinco neurorreceptores dopaminérgicos pós-sinápticos (D1-D5).

[0005] A dopamina monoamina atua através de duas famílias de GPCRs para modular a função motora, mecanismos de recompensa, processos cognitivos e outras funções fisiológicas. Especificamente, a dopamina atua sobre os neurônios via tipo D1, compreendendo dopamina D1 e D5, receptores que se acoplam principalmente à proteína Gs G e, desse modo, estimulam a produção de cAMP, e D2, que compreende D2, D3 e D4, receptores que se acoplam a proteínas Gi/q G, e que atenuam a produção de cAMP. Esses receptores são amplamente expressos em diferentes regiões do cérebro.

[0006] Os medicamentos com base nos modos antagonista e agonista de ação dos receptores dopaminérgicos foram desenvolvidos para a doença de Parkinson, síndrome da esquizofrenia das pernas inquietas e TDAH, como relatado em Stocchi, F. et al. Advances in dopamine receptor agonists for the treatment of Parkinson's disease. Expert Opin Pharmacother 2016, 17 (14), 1889-1902; Buckley, P. F. Broad therapeutic uses of atypical antipsychotic medications. Biol Psychiatry 2001, 50 (11), 912-924; e Davidson, M. A. ADHD em adultos: uma revisão da literatura. J Atten Disord 2008, 11 (6), 628-641.

[0007] Para alguns GPCRs, entretanto, foi um desafio para o desenvolvimento de pequenas moléculas ou para alcançar seletividade suficiente devido ao alto grau de homologia no sítio de ligação ao ligante entre os subtipos, por exemplo, dopamina D1 e D5 (tipo D1) ou D2 e D3 e, portanto, os medicamentos existentes não são completamente desprovidos de efeitos colaterais.

[0008] Apesar de muitos esforços nos últimos 15 anos para diminuir o atrito no desenvolvimento de fármacos, ainda há menos de 10 % de chance de que um fármaco que entra nos ensaios clínicos chegue ao mercado. O atrito é mais alto para o desenvolvimento de fármacos oncológicos e do SNC, em particular com novos alvos com compreensão limitada da biologia. Para reduzir o desgaste de fármacos em ensaios clínicos, há uma clara necessidade de desenvolver ferramentas de avaliação translacional confiáveis que permitam decisões mais rápidas e melhores, conforme ilustrado em Woodcock, J. e al. The FDA critical path initiative and its influence on new drug development. Annu Rev Med 2008, 59, 1-12.

[0009] Porque acessar tecidos cerebrais em humanos vivos não é possível, o desenvolvimento de tais ferramentas translacionais para apoiar a descoberta de fármaco no SNC tem que confiar, entre outras, em técnicas não invasivas como imageamento in vivo. Nos últimos anos, o uso de imageamento por tomografia por emissão de pósitron (PET) de desenvolveu extensivamente para apoiar a descoberta de fármaco no SNC.

[0010] A PET é uma técnica precisa e sofisticada baseada em isótopos produzidos em um cíclotron. Um radionuclídeo emissor de pósitron é introduzido, por exemplo, por injeção, e se acumula no tecido alvo. Quando se decompõe emite um pósitron que se combina prontamente com um elétron próximo, resultando na emissão simultânea de dois raios gama identificáveis em direções opostas. Eles são detectados por uma câmera de PET e fornecem uma indicação precisa de sua origem. A PET é uma técnica muito sensível e, portanto, requer uma pequena quantidade de compostos radiomarcados que são chamados de marcadores de PET ou agentes de imageamento por PET ou ligantes de PET.

[0011] O imageamento por PET é particularmente bem adequada pois se baseia na incorporação de radioisótopos de átomos que estão presentes na maioria dos candidatos de fármaco de molécula pequena. Pode fornecer informações quantitativas para apoiar o processo de tomada de decisão em diferentes estágios de desenvolvimento de fármaco clínico e pré-clínico.

[0012] Por exemplo, o imageamento por PET pode fornecer informações farmacocinéticas cerebrais em indivíduos vivos. Através de radiomarcação direta de um candidato de fármaco, informações em relação à penetração da barreira hematoencefálica (BBB) tanto em indivíduos saudáveis quanto doentes pode ser obtida.

[0013] O desenvolvimento de um agente de imageamento por PET validado para a proteína/receptor direcionado pelo programa de desenvolvimento de fármacos também oferece a oportunidade de avaliar, através de estudos de bloqueio, a ocupação ou o envolvimento de um candidato ao fármaco. Esses estudos podem fornecer informações críticas, como a relação entre ocupação alvo e dose administrada, bem como a cinética de ocupação alvo. Quando obtidas na fase I do desenvolvimento clínico, essas informações podem ser tomadas para selecionar a faixa de doses e o regime mais adequados para os estudos de POC na fase II.

[0014] Os estudos de imageamento por PET pode também fornecer algumas informações sobre o mecanismo de ação de um candidato a fármaco e podem permitir a estratificação do paciente, o monitoramento da progressão da doença ou podem ser usados para a prova da farmacologia ou como objetivos finais nos estudos de POC na Fase II.

[0015] A concepção dos agentes de imageamento por PET requer compostos com propriedades específicas que não estão necessariamente alinhadas com as propriedades dos candidatos de fármaco.

[0016] As propriedades ideais necessárias para que os compostos sejam adequados como agentes de imageamento por PET foram relatadas em Zhang, L et al. Strategies to facilitate the discovery of novel CNS PET ligands. EJNMMI Radiopharmacy and Chemistry 2016, 1 (13), 1 - 12; Need, A et al. Approaches for the discovery of novel positron emission tomography radiotracers for brain imaging. Clin. Transl. Imaging 2017, 5 (3), 265 - 274; Pike, V. W. Considerations in the development of reversibly binding PET radioligands for brain imaging. Curr Med Chem. 2016, 23 (18), 1818 - 1869; Zhang, L. et al. Design and selection parameters to accelerate the discovery of novel central nervous system PET ligands and their application in the development of a novel phosphodiesterase 2A PET ligand. J Med Chem. 2013, 56 (11), 4568 - 4579. Entretanto, a combinação apropriada dessas propriedades é muitas vezes complicada para alcançar.

[0017] Além disso, além do imageamento in vivo, os marcadores radioativos que podem ser usados in vitro ou ex vivo, por exemplo, na autorradiografia de tecidos animais, são igualmente importantes na tomada de decisão sobre o desenvolvimento de fármaco. Esses estudos ajudam a entender o mecanismo de ação dos compostos que modulam um receptor específico ligado a uma ou mais doenças, ou a entender as mudanças na densidade alvo resultantes da ação farmacológica do composto.

[0018] Os receptores tipo D1 estão envolvidos em inúmeras funções fisiológicas e processos comportamentais. Por exemplo, eles estão envolvidos na plasticidade sináptica, função cognitiva e funções motoras direcionadas a objetivos, mas também em processos de recompensa. Devido ao seu papel em vários processos fisiológicos/neurológicos, os receptores do tipo D1 foram implicados em uma variedade de distúrbios, incluindo sintomas cognitivos e negativos na esquizofrenia, comprometimento cognitivo relacionado à terapia antipsicótica clássica, impulsividade, distúrbio da atenção com hiperatividade (TDAH), doença de Parkinson e distúrbios do movimento relacionados, distonia, doença de Huntington, demência com corpo de Lewy, doença de Alzheimer, declínio cognitivo relacionado à idade, comprometimento cognitivo leve (MCI), distúrbios do sono por dependência de fármacos e apatia.

[0019] Alguns agentes de imageamento por PET foram desenvolvidos para subtipos de neurorreceptores dopaminérgicos, como relatado, O., et al. Radioligands for the dopamine receptor subtypes. J Labelled Comp Radiopharm 2013, 56(3 - 4), 130 - 148.

[0020] Entretanto, esses agentes de imageamento por PET apresentam certas desvantagens, como falta de seletividade para os receptores do tipo D1, em particular no neocórtex do cérebro, propriedades farmacocinéticas não adequadas ou geração de metabólitos radioativos que penetram na barreira hematoencefálica e podem prejudicar a quantificação de medidas.

[0021] A maioria desses agentes de imageamento por PET também são com base em antagonistas ao invés de agonistas.

[0022] Portanto, é desejável desenvolver agentes de imageamento agonista ortostérico de receptores tipo D1, em particular agentes de imageamento por PET, porque seriam mais sensíveis aos moduladores D1 ortostéricos, bem como aos níveis de dopamina, o ligante D1 endógeno. Isso poderia permitir um estudo mais preciso do efeito dos fármacos direcionados a esse sítio do receptor e determinar alterações na estimulação do receptor nos estados de doença.

[0023] Nos últimos anos, houve um interesse renovado em desenvolver agonistas ortostéricos tipo D1 seletivos não catecóis ou moduladores alostéricos que modulam a atividade de receptores de dopamina, em particular receptor D1, e que podem ser usados para tratar distúrbios mediados por D1.

[0024] Os ligantes ortostéricos não catecóis de D1 são, por exemplo, descritos em Pedido de Patente Internacional publicado sob n° WO 2014/072881.

[0025] Os moduladores alostéricos tipo D1 são, por exemplo, descritos em Pedidos de Patente Internacionais publicados sob n° WO 2014/193781 e n° WO 2016/055479.

[0026] Dado esse interesse renovado, são necessários para agentes de imageamento tipo D1 seletivos, em particular agentes de imageamento por PET tipo D1 que podem ser usados em teste in vitro, ex vivo ou in vivo e também em estudos clínicos em humanos, para apoiar a desenvolvimento de candidatos a fármacos ou delinear os papéis dos receptores D1 em patologias de interesse.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0027] Um objetivo da presente invenção é, portanto, fornecer compostos que são agonistas seletivos de receptor tipo D1 e que são úteis como marcadores radioativos, em particular como agentes de imageamento por PET.

[0028] Também é um objetivo da presente invenção fornecer um método de imageamento e quantificar a expressão do receptor D1 usando os compostos de acordo com a presente invenção.

[0029] Um outro objetivo da presente invenção é fornecer métodos para detecção in vitro ou ex vivo e quantificação da densidade de receptor tipo D1 disponível em tecidos cerebrais, com ou sem um ligante endógeno ou exógeno, cujo método compreende tratar o tecido com um composto radiomarcado de acordo com a presente invenção e medir o nível de ligação do dito composto radiomarcado.

[0030] Um outro objetivo da presente invenção é fornecer métodos para detecção in vivo e quantificação da densidade de receptor tipo D1 disponível no cérebro, com ou sem um ligante endógeno ou exógeno, cujo método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um composto radiomarcado de acordo com a presente invenção e medir o nível de captação cerebral do dito composto radiomarcado em uma região relevante de interesse.

[0031] Um objetivo adicional da presente invenção é fornecer um método para detecção in vitro ou ex vivo e quantificação do efeito de um PAM de D1 na disponibilidade do receptor D1 em tecidos cerebrais, cujo método compreende tratar o tecido com um composto radiomarcado de acordo com a presente invenção em combinação com um PAM de D1 e detectar o aumento da ligação do dito composto radiomarcado em presença do PAM.

[0032] Ainda um outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para detecção in vivo e quantificação do efeito de um PAM de D1 na disponibilidade do receptor D1 no cérebro de um indivíduo, cujo método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um composto radiomarcado de acordo com a presente invenção, em combinação com a administração de um PAM de D1 e detectar o aumento da captação cerebral do dito composto radiomarcado em uma região relevante de interesse em comparação com condições de linha de base.

[0033] Outros aspectos da invenção tornar-se-ão evidentes a partir da descrição detalhada.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0034] A Figura 1 mostra o resultado de um ensaio funcional do receptor D1 com base em célula com um composto da fórmula (I), como descrito aqui abaixo.

[0035] A Figura 2 mostra imageamento por PET in vivo do cérebro em macaco usando um composto radiomarcado da fórmula (I) como descrito aqui abaixo.

[0036] A Figura 3 mostra experiências de ligação in vitro com um composto radiomarcado da fórmula (I) como descrito aqui abaixo, e antagonista D1 radiomarcado para receptor D1 recombinante humano na ausência ou na presença de um PAM de D1.

[0037] A Figura 4 mostra experiências de ligação ex vivo de autorradiografia com um composto radiomarcado da fórmula (I) em tecidos cerebrais de primata não humano (NHP), na ausência ou na presença de um PAM de D1.

[0038] A Figura 5 mostra imageamento por PET in vivo do cérebro realizado em macacos na presença de um composto radiomarcado da fórmula (I) com ou sem um PAM de D1, e curvas de atividade de tempo associadas ao valor de captação padronizado (SUV).

[0039] A Figura 6 é um gráfico de potencialização que mostra o aumento de volume de distribuição (VT) de um composto radiomarcado da fórmula (I) em diferentes regiões do cérebro após dosagem in vivo com um PAM de D1.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0040] A presente invenção se refere a um composto da fórmula (I), que é radiomarcado, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo,

[0041] Em particular, a presente invenção se refere a um composto da fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que pelo menos um do hidrogênio é 3H; ou pelo menos um dos carbonos é um 11C; ou o átomo de flúor é um 18F.

[0042] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um composto da fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que um do carbono é um 11C, aqui depois denominado como composto da fórmula (Ia).

[0043] Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a um composto da fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que a flurorina é um 18F, aqui depois denominado como composto da fórmula (Ib).

[0044] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a um composto da fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que um ou mais dos hidrogênios é 3H, aqui depois denominado como composto da fórmula (Ic),

[0045] O termo “radiomarcado” como usado aqui com referência a um composto específico significa marcado com um isótopo radioativo.

[0046] Um isótopo radioativo é uma das várias espécies de um elemento químico com massas diferentes cujos núcleos são instáveis e dissipam o excesso de energia emitindo espontaneamente radiação sob a forma de raios alfa, beta e gama. Exemplos específicos de isótopos radioativos de acordo com a presente invenção são 3H, 18F, e 11C.

[0047] A presente invenção inclui dentro de seu escopo sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da fórmula (I) acima. Para o uso em medicina, os sais dos compostos da fórmula (I) serão sais farmaceuticamente aceitáveis. Outros sais podem, entretanto, ser úteis na preparação dos compostos de uso na invenção ou de seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Os princípios padrão subjacentes à seleção e preparação de sais farmaceuticamente aceitáveis são descritos, por exemplo, em Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, ed. P.H. Stahl & C.G. Wermuth, Wiley-VCH, 2002.

[0048] Em relação a presente invenção, a referência a um composto ou compostos é intencionada a abranger esse composto em cada uma de suas possíveis formas isoméricas e misturas do mesmo, a menos que a forma isomérica específica seja denominada especificamente.

[0049] Em particular, a referência ao composto ou compostos é intencionada a abranger esse composto em cada um de seus possíveis atropoisômeros.

[0050] Os atropoisômeros são estereoisômeros que surgem por causa de rotação dificultada em torno de uma ligação simples, onde as diferenças de energia devido à tensão estérica ou outros contribuintes criam uma barreira à rotação que é alta o suficiente para permitir o isolamento de confórmeros individuais (consultar, por exemplo, Bringmann G. et al. Atroposelective Synthesis of Axially Chiral Biaryl Compounds. Edição Internacional da Angewandte Chemie. (2005) 44 (34): 5384- 5427)

[0051] Os atropoisômeros são geralmente identificados como isômero (+) e (−) e sua configuração é determinada medindo-se a rotação óptica [α]D do composto em um polarímetro de acordo com métodos bem conhecidos pela pessoa versada na técnica.

[0052] Em uma modalidade, a presente invenção se refere ao composto radiomarcado da fórmula (I) que é uma mistura 50:50 de atropisômeros (+) e (−). Em uma modalidade particular, a presente invenção se refere ao composto radiomarcado da fórmula (I) que consiste essencialmente em atropisômero (−).

[0053] O termo “consistindo essencialmente” por referência a um atropoisômero significa que o atropisômero está presente em uma razão de pelo menos 95:5 em relação ao outro atropoisômero.

[0054] Os compostos radiomarcados da fórmula (I) de acordo com a presente invenção são agonistas ortostéricos de D1. Eles são particularmente vantajosos porque são seletivos para os receptores do tipo D1 em comparação com os marcadores D1 radiomarcados existentes que também se ligam ao receptor da serotonina 5-HT2A.

[0055] Consequentemente, em uma modalidade, a presente invenção se refere a compostos da fórmula(I) como aqui descritos que são agonistas ortostéricos seletivos de receptor tipo D1.

[0056] Tipicamente, os compostos da fórmula (I) como descritos aqui têm uma afinidade para os receptores tipo D1, expressados na forma de um valor de pKi, que é pelo menos de cerca de 8, preferencialmente pelo menos de cerca de 9. Isso significa que os compostos da fórmula (I) como descritos aqui têm uma afinidade na faixa de nanomolar baixo para esses receptores. Valores específicos são fornecidos na seção experimental.

[0057] Será entendido pela pessoa versada na técnica que valores de pKi obtidos com compostos não radiomarcados da fórmula (I) são transponíveis aos compostos radiomarcados correspondentes.

[0058] Os ensaios de ligação de radioligante competitivo foram realizados para medir a afinidade de compostos da fórmula (I) para receptor D1 e avaliar sua seletividade em relação a um grande painel de 80 alvos biológicos relacionados e não relacionados. Foi mostrado que os compostos da fórmula (I) se ligam aos receptores D1 e D5 (aqui depois denominados como “receptores tipo D1”) com uma afinidade na faixa subnanomolar e não se ligam significantemente a qualquer um dos outros alvos testados.

[0059] Além disso, como mostrado na Figura 1 e como mais detalhado na seção experimental, atividade e potência de compostos da fórmula (I) em um ensaio funcional com base em célula D1 foram realizadas e comparadas com dopamina, o ligante agonista endógeno de receptor D1. Neste ensaio, foi mostrado que o receptor D1 foi ativado in vitro pelo composto da fórmula (I) provavelmente pela dopamina. Além disso, os compostos de acordo com a invenção exibem uma potência melhor (valor de pEC50 de pelo menos 8) como em comparação com a dopamina ligante endógena. Valores específicos e condições são mais detalhados na seção experimental.

[0060] As evidências mencionadas aqui acima e na seção experimental apoiam o fato de que compostos radiomarcados da fórmula (I) são ligantes agonistas seletivos de receptores tipo D1.

[0061] Isso torna os compostos radiomarcados da fórmula (I) como descritos aqui particularmente adequados para o uso em estudos de imageamento por PET sozinhos ou em combinação com moduladores alostéricos ou ortostéricos D1 desenvolvidos para o tratamento de doenças mediadas por D1.

[0062] Em uma outra modalidade, a presente invenção se refere ao uso de compostos radiomarcados da fórmula (I) como aqui descrito para estudos in vitro ou ex vivo.

[0063] Em um aspecto particular de acordo com essa modalidade, a presente invenção se refere ao uso de compostos da fórmula (Ic) em estudos in vitro ou ex vivo.

[0064] A presente invenção também se refere a um método de detectar a expressão do receptor D1 no cérebro que compreende a incubação in vitro ou ex vivo de uma quantidade detectável de um composto radiomarcado da fórmula (I), como descrito aqui, e detectar o dito composto radiomarcado.

[0065] Tal método permite a quantificação da densidade de receptor D1 disponível em doenças em que os receptores D1 desempenham um papel.

[0066] O gráfico na Figura 4 mostra que o composto da fórmula (Ic) significantemente se liga em putâmen caudato compatível com níveis mais altos de expressão de receptor D1 encontrados na região estriada de tecido cerebral.

[0067] Em uma outra modalidade, a presente invenção se refere ao composto da fórmula (I) para o uso em estudos de imageamento por PET in vivo. Em um aspecto desta modalidade, a presente invenção se refere ao composto da fórmula (Ia) ou (Ib) para o uso em estudos de imageamento por PET in vivo.

[0068] Em uma outra modalidade, a presente invenção se refere ao composto da fórmula (I) para o uso em imageamento por PET in vivo.

[0069] A Figura 2 mostra imageamento por PET realizado com o composto da fórmula (Ia) em um macaco cinomolgos e que demonstra um padrão de captação compatível com a distribuição relatada de receptores tipo D1 no cérebro.

[0070] Em um aspecto particular desta modalidade, a presente invenção se refere aos compostos da fórmula (I) para o uso em um método de diagnósticos in vivo de distúrbios mediados por D1.

[0071] Em um outro aspecto particular desta modalidade, a presente invenção se refere aos compostos da fórmula (I) como aqui descrito para o uso em um método de quantificação in vivo da densidade de receptor D1 disponível em doenças em que receptores D1 desempenham um papel.

[0072] A presente invenção também abrange dentro de seu escopo um método de imageamento in vivo e detecção de distúrbios neurológicos mediados pelo receptor D1 que compreende administrar uma quantidade detectável de um composto radiomarcado da fórmula (I), como descrito aqui, a um indivíduo em necessidade do mesmo, ou seu sal farmaceuticamente aceitável, e detectar o composto radiomarcado ligado ao receptor D1.

[0073] Alguns estudos in vivo foram realizados com composto radiomarcado da fórmula (I), e em particular com o composto da fórmula (Ia), que mostra que não há metabólito lipofílico associado que pode penetrar a barreira hematoencefálica e, portanto, afetar a quantificação da densidade do receptor D1 em estudos de imageamento por PET in vivo.

[0074] Ainda em uma outra modalidade, a presente invenção se refere ao uso de compostos da fórmula (I) para quantificar in vitro ou ex vivo o engate alvo de ligantes ortostéricos D1.

[0075] A presente invenção ainda se refere a um método in vitro ou ex vivo de medir o engate alvo de ligantes ortostéricos endógenos ou exógenos de receptor D1.

[0076] Ainda em uma outra modalidade, a presente invenção se refere aos compostos da fórmula (I) como descrito aqui para o uso em um método de imageamento in vivo e medir o engate alvo de agonistas ortostéricos de receptor tipo D1. Em um aspecto particular desta modalidade, a presente invenção se refere a um composto da fórmula (Ia ou Ib) para o uso em um método de imageamento in vivo e medir o engate alvo de um agonista ortostérico de receptor tipo D1.

[0077] O termo “engate alvo” como usado aqui significa uma molécula exógena ou endógena interagindo com seu alvo proteico intencionado (receptor tipo D1) ortostericamente ou aloestericamente e conseguir um evento biológico a justante.

[0078] Além disso, descobrimos surpreendentemente que alguns compostos radiomarcados de fórmula (I) como aqui descritos são adequados para quantificar o efeito de compostos que são moduladores alostéricos positivos do receptor D1 em in vitro, ex vivo e in vivo.

[0079] O termo “moduladores alostéricos” significa um composto que se liga aos locais alvo distintos a partir do agonista natural ortostérico mas que induzem uma mudança conformacional no GPCR, desse modo, modelando aloestericamente a função do receptor.

[0080] Os moduladores alostéricos positivos (PAM) potencializam a atividade do ligante endógeno ou a atividade de um agonista ortostérico exógeno.

[0081] Porque PAMs de D1 agem no receptor D1 de um diferente sítio de ligação do que o sítio ortoestérico do ligante endógeno/exógeno, é desejável ter uma maneira para quantificar o efeito real desses compostos no receptor D1 em ordem, por exemplo, para ser capaz de otimizar a dose eficaz do composto de PAM de D1 que será necessário para obter o efeito terapêutico necessário nas doenças mediadas por D1.

[0082] Portanto, em uma modalidade particular, a presente invenção se refere ao uso de compostos da fórmula (I) como descrito aqui para quantificação in vitro ou ex vivo do efeito de PAM de D1 no receptor D1.

[0083] Em um aspecto desta modalidade, a presente invenção se refere ao uso de um composto da fórmula (Ic) na quantificação in vitro do efeito de PAM de D1 no receptor D1. Como exibido na Figura 3, composto de PAM de D1 melhorou significativamente as propriedades de ligação do composto de fórmula (Ic).

[0084] Em um aspecto desta modalidade, a presente invenção se refere ao uso de um composto da fórmula (Ic) na quantificação ex vivo do efeito de PAM de D1 no receptor D1. Em particular, a presente invenção se refere ao uso de um composto da fórmula (Ic) na quantificação por autorradiografia do efeito de PAM de D1 no receptor

D1.

[0085] A Figura 4 mostra por autorradiografia que, na presença de um composto de PAM de D1, a ligação específica do composto (−)-Ic medida em fatias de cérebro de NHP aumenta significativamente.

[0086] A presente invenção, portanto, também abrange dentro de seu escopo um método para detecção e quantificação in vitro ou autorradiografia da expressão de receptores do tipo D1 e do efeito de um modulador alostérico D1 na linha de células que expressam o receptor D1 ou em tecidos cerebrais.

[0087] Os métodos de ligação a radioligante ou autorradiografia in vitro compreendem o tratamento da amostra biológica com um composto radiomarcado de acordo com a presente invenção na presença ou na ausência de um ligante ortostérico ou alostérico tipo D1 ou D1 e quantificação da expressão do receptor tipo D1 ou efeito de moduladores alostéricos por medir o composto radiomarcado ligado resultante da presente invenção.

[0088] Em uma outra modalidade particular, a presente invenção se refere a um composto da fórmula (Ia) ou (Ib) para o uso na quantificação in vivo do efeito de PAM de D1 no receptor D1.

[0089] Portanto, a presente invenção também abrange dentro de seu escopo compostos da fórmula (Ia) ou (Ib) para o uso na detecção in vivo e quantificação da expressão de receptores tipo D1 e do efeito de um modulador alostérico de D1.

[0090] Em uma modalidade particular, a presente invenção se refere a um composto da fórmula (Ib) para o uso na detecção in vivo e quantificação da expressão de receptores tipo D1 e do efeito de um modulador alostérico de D1.

[0091] Como exibido na Figura 5, composto de PAM de D1 melhorou significativamente as propriedades de ligação do composto de fórmula (Ib), em particular o composto de fórmula (−)-(Ib). O efeito de potencialização desse PAM de D1 é mostrado na Figura 6.

[0092] Quando referência é feita aqui a “indivíduo”, pretende-se referir-se a um humano, rato, camundongo, gato, cachorro, cavalo, ovelha, vaca, primata humano ou não humano, aviário ou anfíbio. De preferência, é feita referência a um rato, primata humano ou não humano ou humano.

[0093] Para estudos de imageamento e, em particular, imageamento por PET estudos em in vivo, compostos radiomarcados da fórmula (I) ou seu sal farmaceuticamente aceitável do mesmo pode ser administrado na forma de uma composição farmacêutica.

[0094] Portanto, uma outra modalidade da presente invenção se refere uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade detectável de um composto da fórmula (I), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em combinação com um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

[0095] O termo “quantidade detectável” como usado aqui significa uma quantidade de composto necessária para ser detectada pelo método de detecção escolhido. Geralmente, tal quantidade detectável será determinada pela pessoa versada na técnica com base no composto e no método de detecção usado.

[0096] A presente invenção, portanto, também abrange dentro de seu escopo, compostos da fórmula (I) e sua composição farmacêutica, para o uso no diagnóstico in vivo de distúrbios mediados por D1.

[0097] Os compostos radiomarcados da fórmula (I) como descritos aqui foram feitos de acordo com os métodos que são ainda detalhados na seção experimental.

[0098] Os compostos da fórmula (Ia) e (Ib) foram preparados através de uma síntese de multi-etapa do composto de acetato 2-(3,5-dimetil-2,6-dioxo-1-((2- (trimetilsilil)etoxi)metil)-1,2,3,6-tetra-hidropirimidin-4-il)-5-(furo[3,2-c]piridin-4- iloxi)benzila, a13

[0099] referidos em seguida como intermediário a13. As condições de reação são mais detalhadas na seção experimental.

[0100] O composto da fórmula (Ic) é preparado por tritiação do composto 6-[2- (fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil]-1,5-dimetilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona (I) na presença de catalisador de Kerr de acordo com os métodos conhecidos para a pessoa versada na técnica e como mais detalhado daqui em diante na seção experimental.

SEÇÃO EXPERIMENTAL I. Síntese DE composto da fórmula (I) A. Abreviações/reagentes concorrentes

[0101] Ac: acetil

[0102] Boc: terc-Butiloxicarbonila

[0103] Salmoura: Solução de cloreto de sódio aquosa saturada

[0104] Bz: benzoíla

[0105] cAMP: Monofosfato cíclico de adenosina

[0106] DAST: Trifluoreto de dietilaminosulfur

[0107] DCM: Diclorometano

[0108] DEA: Dietilamina

[0109] DMAP: 4-dimetilaminopiridina

[0110] DMSO: Dimetilsulfóxido

[0111] dppf: 1,1’-Bis(difenilfosfino)ferroceno

[0112] pEC50: Concentração que produz 50 % da resposta máxima

[0113] Erel: eficácia relativa

[0114] ES+: Ionização positiva de eletropulverização

[0115] ESI: Ionização de eletropulverização

[0116] Et: Etila

[0117] EtOH: Etanol

[0118] Et2O: Éter dietílico

[0119] EtOAc: Acetato de etila

[0120] h: Hora

[0121] (h)D1R: receptor D1 de dopamina humana

[0122] (h)D5R: receptor D5 de dopamina (humana)

[0123] HEK: células renais embrionárias humanas

[0124] HEPES: ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônico

[0125] HPLC: Cromatografia Líquida de Alta Pressão

[0126] HTRF: fluorescência homogênea resolvida no tempo

[0127] LC: Cromatografia Líquida

[0128] LCMS: Espectrometria em Massa por Cromatografia Líquida

[0129] LDA: Lítio di-isopropilamida

[0130] MeOH: Metanol

[0131] min.: minutos

[0132] NHP: primata não humano

[0133] NMR: Ressonância magnética nuclear

[0134] PAM: Modulador Alostérico Positivo

[0135] iPrOH: isopropanol

[0136] rt: temperatura ambiente

[0137] RV: Vaso de reação

[0138] SEM: 2-(Trimetilsilil)etoximetil

[0139] SFC: Cromatografia de Fluido Supercrítico

[0140] SPE: Extração de Fase Sólida

[0141] SUV: valor de captação padronizado

[0142] TAC: Curva Atividade-Tempo

[0143] TEA: Trietilamina

[0144] TFA: Ácido trifluoroacético

[0145] THF: Tetraidrofurano

[0146] TLC: Cromatografia em Camada Fina

[0147] WFI: Água para Injeção

[0148] B. Métodos analíticos

[0149] Todas as reações envolvendo ar ou reagentes sensíveis à umidade foram realizados sob uma atmosfera de nitrogênio ou argônio usando solventes secos e artigo de vidro. As experiências que requerem irradiação de micro-ondas são realizadas em um forno de micro-ondas Biotage Initiator Sixty atualizado com a versão

2.0 do software operacional. As experiências são realizadas para atingir a temperatura necessária o mais rápido possível (potência máxima de irradiação: 400 W, sem refrigeração externa). Os solventes e reagentes comerciais foram geralmente usados sem purificação adicional, incluindo solventes anidros quando apropriado (geralmente produtos Sure-Seal™ da Aldrich Chemical Company ou AcroSeal™ da ACROS Organics). Em geral, as reações foram monitoradas por cromatografia em camada fina, análises de HPLC ou por espectrometria de massa. i) As análises de HPLC são realizadas como a seguir: Método A: Ácido

[0150] A análise de HPLC é realizada com sistema de HPLC Shimadzu equipado com módulo CHT LC-2010, detector de matriz de fotodiodo SPD-M20A (210 - 400 nm), usando-se coluna YMC Triart C-18 (150 X 4,6) mm 3μ. A eluição por gradiente é feita com formiato de amônio 5 mM em água + ácido fórmico a 0,1 % (Fase A), e Acetonitrila + solvente A a 5 % + ácido fórmico a 0,1 % (Fase B), com gradiente 5 - 95 % de B em 8,0 min de espera até 13,0 min, 5 % de B a 15,0 min de espera até 18,0 min. Taxa de fluxo de HPLC: 1,0 mL/min, volume de injeção: 10 µL. Método B: Básico

[0151] A análise de HPLC é realizada com Sistema de HPLC Shimadzu equipado com módulo CHT LC-2010, detector de matriz de fotodiodo SPD-M20A (210 - 400 nm), usando-se coluna YMC Triart C-18 (150 X 4,6) mm 3μ. A eluição por gradiente é feita com formiato de amônio 5 mM em água + amônia a 0,1 % (Fase A), e Acetonitrila + solvente A a 5 % + amônia a 0,1 % (Fase B), com gradiente 5 - 95 % em 8,0 min de espera até 13,0 min, 5 % de B a 15,0 min de espera até 18,0 min. Taxa de fluxo de HPLC.

[0152] Será evidente para uma pessoa versada na técnica que diferentes tempos de retenção (RT) podem ser obtidos para dados de LC se diferentes condições analíticas forem usadas.

[0153] ii) Medições espectrométricas em massa em modo de LCMS são realizadas como a seguir:

Método A: Ácido

[0154] O espectrômetro de massa com um único quadrupolo Shimadzu 2010EV é usado para análise de LC-MS. Esse espectrômetro é equipado com uma fonte de ESI e bomba de gradiente binário LC-20AD, detector de matriz de fotodiodo SPD-M20A (210 - 400 nm). Os dados são adquiridos em uma varredura de MS completa de m/z 70 a 1200 em modo positivo e negativo. A análise de fase reversa é realizada usando- se coluna Waters XBridge C 18 (30 X 2,1) mm 2,5 µ. A eluição por gradiente é feita com formiato de amônio 5 mM em água + ácido fórmico a 0,1 % (Fase A) e Acetonitrila + solvente A a 5 % + ácido fórmico a 0,1 % (Fase B), com gradiente 5 - 95 %B em 4,0 min de espera até 5,0 min, 5 % de B a 5,1 min de espera até 6,5 min. Taxa de fluxo de HPLC: 1,0 mL/min, volume de injeção: 5 µL.

[0155] Parâmetros de MS: Tensão do detector 1,5 kV. Temperatura do bloco de origem 200 °C. Temperatura de dissolução 240 °C. Fluxo de gás de nebulização 1,2 L/min (Nitrogênio). Os dados são adquiridos em uma varredura de MS completa de m/z 70 a 1200 em modo positivo e negativo. Método B: Básico

[0156] O espectrômetro de massa com um único quadrupolo Shimadzu 2010EV é usado para análise de LC-MS. Esse espectrômetro é equipado com uma fonte de ESI e bomba de gradiente binário LC-20AD, detector de matriz de fotodiodo SPD-M20A (210 - 400 nm). Os dados são adquiridos em uma varredura de MS completa de m/z 70 a 1200 em modo positivo e negativo. A análise de fase reversa é realizada usando- se coluna Waters XBridge C 18 (30 X 2,1) mm 2,5 µ. A eluição por gradiente é feita com formiato de amônio 5 mM em água + amônia a 0,1 % (solvente A), ou Acetonitrila + solvente A a 5 % + amônia a 0,1 % (solvente B), com gradiente 5 - 95 % de B em 4,0 min de espera até 5,0 min, 5 % de B a 5,1 min de espera até 6,5 min. Taxa de fluxo de HPLC: 1,0 mL/min, volume de injeção: 5 µL.

[0157] Parâmetros de MS: tensão do detector 1,5 kV. Temperatura do bloco de origem 200 °C. Temperatura de dissolução 240 °C. Fluxo de gás de nebulização 1,2 L/min (Nitrogênio). Os dados são adquiridos em uma varredura de MS completa de m/z 70 a 1200 em modo positivo e negativo.

[0158] Os espectros de RMN são registrados em um espectrômetro de RMN Varian MR 400 MHz equipado com um software Linux 3.2 com sistema operacional Redhat enterprise Linux 5.1 e cabeça de sonda inversa 1H/13C de 5 mm, ou RMN Varian VRMN 400 MHz equipado com software Linux 3.2 com sistema operacional Redhat enterprise Linux 6,3 e cabeça de sonda tripla inversa 1H/13C/19F de 5 mm. Os compostos são estudados em solventes deuterados como DMSO-d6, CDCl3, MeOD ou D2O a uma temperatura de sonda de 300 K e a uma concentração em torno de 4 - 5 mg/mL. O instrumento está bloqueado no sinal de deutério do solvente deuterado usado. Os desvios químicos são dados em ppm no campo inferior do TMS (tetrametilsilano), tomado como padrão interno.

[0159] As rotações ópticas ([α]D) foram medidas em um polarímetro PERKIN- ELMER 341 em uma cubeta (l=1 dm) a uma concentração de 10 mg/mL, a uma temperatura mencionada nos exemplos específicos, a 589 nm (lâmpada de sódio).

[0160] iii) Purificação preparativa é realizada usando-se usando os seguintes sistemas nas condições básica e neutra ácida:

[0161] Sistema A. Sistema de HPLC de Preparação para ÁGUAS:

[0162] A HPLC preparativa para águas equipada com módulo de bomba binária 2545 com detector PDA 2998 e composto por 2767 gerenciador de amostras. O detector quádruplo único Waters 3100 é usado para o gatilho de detecção e coleta.

[0163] A HPLC preparatória para Shimadzu consiste em uma bomba LC8A binária e um detector SPD M20A PDA com injeção manual e coleta manual de frações.

[0164] A purificação é realizada usando as seguintes colunas para os dois sistemas acima:

[0165] Phenomenex, Fusão de Sinergia C18, (100 X 30) mm , 4 μ

[0166] YMC ODS (500 X 30) mm 10 μ.

[0167] YMC Triart (250 X 30)mm 10 μ.

[0168] Sistema B. Purificação em SFC

[0169] O sistema preparatório Thar SFC 100 é composto por bomba de cossolvente 2545 e bomba de CO2, forno de coluna, amostrador automático 2767 e coletor de frações, ABPR para manter a pressão do sistema, detector PDA 2998. O sistema é controlado pelo software Masslynx V4.1. As colunas para SFC são selecionadas entre as listadas abaixo:

[0170] Virdis, 2-Etil piridina (250 X 30) mm, 5µ

[0171] Virdis, CSH Fluro Fenil (250 X 30) mm, 5µ

[0172] Phenomenex Luna Hilic (250 X 30) mm, 5µ

[0173] YMC, Ciano (250 X 19) mm, 5µ

[0174] YMC, Diol (250 X 30) mm, 10µ

[0175] Chiralpak IA (250 X 30) mm, 5µ

[0176] C. Síntese DE intermediários

[0177] C.1. Síntese DE 6-bromo-1,5-dimetil-3-(2-trimetilsililetoximetil)pirimidina- 2,4-diona a1 a1

[0178] a1 é divulgado em e preparado de acordo com o método descrito em pedido de patente internacional publicado sob o n° WO2014/072881.

[0179] RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 5,21 (s, 2H), 3,56 (t, J = 7,83 Hz, 2H), 3,52 (s, 3H), 1,99 (s, 3H), 0,83 (t, J = 7,83 Hz, 2H), -0,04 (s, 9H).

[0180] C.2. Síntese de 6-iodo-5-metilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona a6.

a2 a3 a4 a5 a6

[0181] C.2.1. Síntese de 5-metilpirimidina-2,4,6(1H,3H,5H)-triona a3

[0182] Para uma solução de Na (3,18 g, 137 mmol) em MeOH (500 mL), ureia (8,28 g, 137 mmol) foi adicionada seguida por adição de dietil 2-metilpropanodioato a2 (20,0 g, 114 mmol). A mistura de reação foi aquecida para refluxo durante 16 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC e LCMS. Após a conclusão, a mistura de reação foi concentrada sob vácuo. O resíduo foi acidificado até pH 3 com uma solução aquosa de 2N de HCl, em seguida, arrefecido a -10 °C e agitado na mesma temperatura durante 3 h. A mistura de reação foi filtrada, lavada com água fria (50 mL), Et2O (100 mL) e hexanos (100 mL). O produto bruto obtido foi seco sob vácuo para proporcionar 15 g de 5-metilpirimidina-2,4,6(1H,3H,5H)-triona a3 como um sólido bruto.

[0183] Rendimento (bruto): 92 %

[0184] LCMS (ES+): 143 (M+H)+.

[0185] RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,07 (s, 2H), 3,63 (q, J = 6,80 Hz, 1H), 1,29 (d, J = 6,80 Hz, 3H).

[0186] C.2.2. Síntese de 2,4,6-tricloro-5-metilpirimidina a4

[0187] Para uma solução de 5-metilpirimidina-2,4,6(1H,3H,5H)-triona a3 (15,0 g, 105 mmol) em POCl3 (158 g, 1035 mmol) foi adicionado H3PO4 (2 mL) e a mistura de reação foi aquecida a 100 °C durante 45 min. O progresso da reação foi monitorado por TLC. Após a conclusão, a mistura de reação foi vertida em gelo, filtrada e seca sob vácuo para proporcionar 8 g de bruto 2,4,6-tricloro-5-metilpirimidina a4 como um sólido bruto, que foi usado na próxima etapa sem qualquer purificação adicional.

[0188] C.2.3. Síntese de 6-cloro-5-metilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona a5

[0189] Uma solução agitada de 2,4,6-tricloro-5-metilpirimidina bruto a4 (8,00 g, 40,8 mmol) em uma solução aquosa a 10 % de NaOH (75 mL) foi aquecida para refluxo durante 1,5 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC e LCMS. Após a conclusão, a mistura de reação foi acidificada até pH 2 com uma solução aquosa 2N de HCl, filtrada e seca sob vácuo para proporcionar 4,8 g de 6-cloro-5-metilpirimidina- 2,4(1H,3H)-diona a5 como um sólido bruto, que foi usado na próxima etapa sem qualquer purificação adicional.

[0190] Rendimento (bruto): 21 %

[0191] RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,78 (s, 1H), 11,29 (s, 1H), 1,80 (s, 3H).

[0192] C.2.4. Síntese de 6-iodo-5-metilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona a6

[0193] Uma solução agitada de 6-cloro-5-metilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona a5 (4,80 g, 0,30 mmol) e NaI (23,4 g, 150 mmol) em HI (60 mL) foi agitada em tubo vedado na temperatura ambiente durante 66 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC e LCMS. Após a conclusão, a mistura de reação foi filtrada e lavada com água fria (50 mL) e seca sob vácuo para proporcionar 2,1 g de 6-iodo-5-metilpirimidina-2,4(1H,3H)- diona a6 foi isolada como um sólido marrom, que foi usado na próxima etapa sem qualquer purificação adicional.

[0194] LCMS (ES+): 253 (M+H)+.

[0195] RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,21 (s, 1H), 1,90 (s, 3H).

[0196] C.3. Síntese de acetato DE 5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)-2-(4,4,5,5- tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)benzilA a12

[0197] a12 foi preparado a partir do composto a7 através de uma síntese de várias etapas de acordo com procedimentos análogos aos descritos em pedido de patente internacional WO2014/072881, e como especificamente apresentado a seguir.

[0198] C.3.1. Síntese de 4-(4-bromo-3-metilfenoxi)furo[3,2-c]piridina a8

[0199] Para uma solução de 4-clorofuro[3,2-c]piridina a7 (12 g, 78,1 mmol) e 4- bromo-3-metilfenol (17,5 g, 93,7 mmol) em DMSO (300 mL), Cs2CO3 (63,4 g, 195 mmol) foi adicionado e a mistura de reação foi aquecida a 125 °C durante 16 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC e LCMS. Após a conclusão, a mistura de reação foi vertida em gelo e filtrada. O resíduo foi dissolvido em EtOAc (100 mL) e lavada com salmoura (2 × 100 mL). A camada orgânica foi separada, seca sobre anidro Na2SO4 e concentrada sob vácuo. O produto bruto obtido foi purificado por trituração com Et2O a 1 % em pentano (100 mL) para proporcionar 12,6 g de 4-(4-

bromo-3-metilfenoxi)furo[3,2-c]piridina a8 como um sólido bege.

[0200] Rendimento: 53 %

[0201] LCMS (ES+): 304 (M+H)+.

[0202] RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,14 (s, 1H), 7,96 (d, J = 6,00 Hz, 1H), 7,61 (d, J = 8,80 Hz, 1H), 7,46 (d, J = 5,60 Hz, 1H), 7,25 (d, J = 1,20 Hz, 1H), 7,10 (s, 1H), 7,04 - 6,98 (m, 1H), 2,34 (s, 3H).

[0203] C.3.2. Síntese de 4-(4-bromo-3-(bromometil)fenoxi)furo[3,2-c]piridina a9

[0204] Para uma solução de 4-(4-bromo-3-metilfenoxi)furo[3,2-c]piridina a8 (12,5 g, 41,1 mmol) em CCl4 (250 mL) foram adicionados NBS (8,05 g, 45,2 mmol) e Bz2O2 (1,99 g, 8,22 mmol). A mistura de reação foi aquecida a 80 °C durante 12 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC e LCMS. Após a conclusão, a mistura de reação foi diluída com DCM (100 mL) e água (100 mL). A camada orgânica foi lavada com uma solução aquosa 1N de NaOH (50 mL) e salmoura (50 mL), seca em anidro Na2SO4 e concentrada sob vácuo para proporcionar 22 g de 4-(4-bromo-3- (bromometil)fenoxi)furo[3,2-c]piridina a9 como um semissólido marrom, que foi usado na próxima etapa sem qualquer purificação adicional.

[0205] LCMS (ES+): 284 (M+H)+.

[0206] C.3.3. Síntese de (2-bromo-5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)metanol a10

[0207] Para uma solução de 4-(4-bromo-3-(bromometil)fenoxi)furo[3,2-c]piridina a9 (22,0 g, 57,4 mmol) em DMF (80 mL), NaOAc (23,0 g, 287 mmol) foi adicionado e a mistura de reação foi aquecida a 80 °C durante 3 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC e LCMS. Após a conclusão, a mistura de reação foi diluída com DCM (100 mL) e água (50 mL). A camada orgânica foi seca em anidro Na2SO4 e concentrada sob vácuo. O resíduo foi dissolvido em MeOH (50 mL) seguido por adição de uma solução aquosa 1N de NaOH (20 mL). A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 1 h. A mistura de reação foi concentrada sob vácuo. O resíduo foi diluído com água (100 mL) e extraído com EtOAc (3 × 40 mL). A camada orgânica foi seca em anidro Na2SO4 e concentrada sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna usando ETOAc a 20 % em hexanos como eluente para produzir 3,5 g de (2-bromo-5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)metanol a10 como um sólido bruto.

[0208] Rendimento: 19 %

[0209] LCMS (ES+): 320 (M+H)+.

[0210] RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,14 (d, J = 2,40 Hz, 1H), 7,96 (d, J = 5,60 Hz, 1H), 7,61 (d, J = 8,80 Hz, 1H), 7,48 (d, J = 6,00 Hz, 1H), 7,32 (d, J = 2,80 Hz, 1H), 7,12 - 7,08 (m, 2H), 5,51 (t, J = 5,60 Hz, 1H), 4,51 (d, J = 5,60 Hz, 2H).

[0211] C.3.4. Síntese de acetato DE 2-bromo-5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)benzilA a11

[0212] Para uma solução de (2-bromo-5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)metanol a10 (3,50 g, 11,0 mmol) em THF (50 mL), piridina (2,60 g, 33,0 mmol) foi adicionada à 0 °C e a mistura de reação foi agitada na mesma temperatura durante 10 min. Cloreto de acetil (1,73 g, 22,0 mmol) foi adicionado às gotas a 0 °C e a mistura de reação foi aquecida a 100 °C durante 16 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC e LCMS. Após a conclusão, a mistura de reação foi neutralizada com uma solução saturada aquosa de NaHCO3 e extraída com EtOAc (50 mL). A camada orgânica foi sucessivamente lavada com água (50 mL) e salmoura (10 mL), seca em anidro Na2SO4 e concentrada sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna usando EtOAc a 2 a 5 % em hexanos como eluente para proporcionar 4 g de acetato de 2-bromo-5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)benzila a11 como líquido incolor.

[0213] Rendimento: 98 %

[0214] LCMS (ES+): 362 (M+H)+.

[0215] RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,14 (d, J = 2,00 Hz, 1H), 7,95 (d, J = 6,00 Hz, 1H), 7,69 (d, J = 8,80 Hz, 1H), 7,49 - 7,45 (m, 1H), 7,35 (d, J = 2,80 Hz, 1H), 7,20 - 7,17 (m, 1H), 7,14 - 7,11 (m, 1H), 5,10 (s, 2H), 2,07 (s, 3H).

[0216] C.3.5. Síntese de acetato DE 5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)-2-(4,4,5,5- tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)benzilA a12

[0217] Para uma solução de acetato de 2-bromo-5-(furo[3,2-c]piridin-4- iloxi)benzila a11 (4 g, 11,1 mmol) e 4,4,5,5-tetrametil-2-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2- dioxaborolan-2-il)-1,3,2-dioxaborolano (3,66 g, 14,4 mmol) em dioxano (50 mL) foi adicionado KOAc (3,26 g, 33,3 mmol). A mistura de reação foi purgada com argônio durante 30 min, em seguida, PdCl2(dppf). DCM (2,70 g, 3,33 mmol) foi adicionado e a mistura de reação foi purgada novamente com argônio durante 5 min. A mistura de reação foi aquecida a 110 °C durante 16 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC e LCMS. Após a conclusão, a mistura de reação foi diluída com EtOAc (50 mL) e filtrada através de Celite®. O filtrado foi concentrado sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna usando EtOAc a 10 a 12 % em hexanos para proporcionar 4,1 g de acetato de 5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)-2-(4,4,5,5-tetrametil- 1,3,2-dioxaborolan-2-il)benzila a12 foi isolado como um sólido branco amarelado.

[0218] LCMS (ES+): 410 (M+H)+.

[0219] C4. Síntese de acetato DE 2-(3,5-dimetil-2,6-dioxo-1-((2- (trimetilsilil)ETOXI)METIL)-1,2,3,6-tetra-hidropirimidin-4-il)-5-(furo[3,2-c]piridin-4- iloxi)benzilA a13, a13_Atropoisômero_1 e a13_Atropoisômero_2 a1 a12 a13

[0220] Para uma solução de acetato de 5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)-2-(4,4,5,5- tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)benzila a12 (200 mg, 0,49 mmol) e 6-bromo-1,5- dimetil-3-(2-trimetilsililetoximetil)pirimidina-2,4-diona a1 (130 mg, 0,38 mmol) em dioxano (9 mL) e água (1 mL) foi adicionado K2CO3 (160 mg, 1,13 mmol). A mistura de reação foi purgada com argônio durante 30 min. PdCl2(dppf). DCM (90 mg, 0,11 mmol) foi adicionado e a mistura de reação foi purgada novamente com argônio durante 5 min. A mistura de reação foi aquecida sob irradiações de micro-ondas a 120 °C durante 2 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC e LCMS. A reação foi repetida em 13 × 0,20 g e as misturas brutas das 14 reações foram combinadas. A mistura de reação foi diluída com EtOAc (150 mL), filtrada através de Celite® e lavada com EtOAc (250 mL). O filtrado foi concentrado sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna usando EtOAc a 20 a 40 % em hexanos como eluente para proporcionar 827 mg de acetato de 2-(3,5-dimetil-2,6-dioxo-1-((2- (trimetilsilil)etoxi)metil)-1,2,3,6-tetra-hidropirimidin-4-il)-5-(furo[3,2-c]piridin-4- iloxi)benzila a13 como um sólido branco amarelado, que é uma mistura racêmica de atropisômeros (+) e (−).

[0221] Rendimento: 31 %

[0222] LCMS (ES+): 494 (M+H-SiMe3)+.

[0223] RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,18 (d, J = 1,96 Hz, 1H), 8,05 (d, J = 5,87 Hz, 1H), 7,54 (dd, J = 5,87, 0,98 Hz, 1H), 7,49 (s, 1H), 7,44 (s, 2H), 7,14 - 7,12 (m, 1H), 5,76 (s, 2H), 5,32 (s, 2H), 3,68 - 3,59 (m, 2H), 2,97 (s, 3H), 1,95 (s, 3H), 1,55 (s, 3H), 1,17 (t, J = 7,09 Hz, 2H), -0,01 (s, 9H).

[0224] Separação quiral (LC, YMC Chiralart Cellulose-SC, 250*4,6 mm, 1 mL/min, 252 nm, 25 °C, eluente: n-hexanos a 50 % (com DEA a 0,1 %), iPrOH a 50 %) de 500 mg de racemato de acetato 2-(3,5-dimetil-2,6-dioxo-1-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil))- 1,2,3,6-tetra-hidropirimidin-4-il)-5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)benzila a13 proporcionou:

[0225] - 151 mg de acetato de 2-(3,5-dimetil-2,6-dioxo-1-((2- (trimetilsilil)etoxi)metil))-1,2,3,6-tetra-hidropirimidin-4-il)-5-(furo[3,2-c]piridin-4- iloxi)benzila (a13_atropisômero 1) como um sólido bruto.

[0226] Rendimento: 30 %

[0227] LCMS (ES+): 494 (M+H-SiMe3)+.

[0228] Análise quiral (LC, YMC Chiralart Cellulose-SC, 250*4,6 mm, 1 mL/min, 252 nm, eluente: n-hexanos a 50 % (com DEA a 0,1 %), iPrOH a 50 %) RT 28,93 min, 98,5 % de ee.

[0229] - 152 mg de acetato de 2-(3,5-dimetil-2,6-dioxo-1-((2- (trimetilsilil)etoxi)metil))-1,2,3,6-tetra-hidropirimidin-4-il)-5-(furo[3,2-c]piridin-4- iloxi)benzila (a13_atropisômero 2) como um sólido bruto.

[0230] Rendimento: 30 %

[0231] LCMS (ES+): 494 (M+H-SiMe3)+.

[0232] Análise quiral (LC, YMC Chiralart Cellulose-SC, 250*4,6 mm, 1 mL/min, 252 nm, eluente: n-hexanos a 50 % (com DEA a 0,1 %), iPrOH a 50 %) RT 31,28 min, 92,5

% de ee.

[0233] Configuração particular (+) ou (−) dos respectivos atropoisômeros não foi atribuída neste estágio.

[0234] D. Síntese de compostos da fórmula (I)

[0235] D.1. Síntese de 6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-1,5- dimetilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona (+)-(I) e (−)-(I).

[0236] D.1.1. Síntese de 6-(4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)-2-(hidroximetil)fenil)-1,5- dimetil-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil))pirimidina-2,4(1H,3H)-diona a14_Atropoisômero 1 e DE a14_Atropoisômero 2

[0237] Para uma solução de acetato de 2-(3,5-dimetil-2,6-dioxo-1-((2- (trimetilsilil)etoxi)metil))-1,2,3,6-tetra-hidropirimidin-4-il)-5-(furo[3,2-c]piridin-4- iloxi)benzila a13_Atropoisômero 1 (151 mg, 0,27 mmol) em THF (7,71 mL) e água (860 µL) foi adicionado NaOH (50 mg, 1,36 mmol). A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 16 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC e LCMS. Após a conclusão, a mistura de reação foi concentrada sob vácuo. O resíduo foi diluído com água (15 mL) e extraído com EtOAc (2 × 50 mL). A camada orgânica foi lavada com salmoura (10 mL), seca em anidro Na2SO4 e concentrada sob vácuo para proporcionar 124 mg de 6-(4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)-2-(hidroximetil)fenil)-1,5- dimetil-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil))pirimidina-2,4(1H,3H)-diona a14_Atropoisômero

1 como um líquido marrom claro, que foi usado na próxima etapa sem qualquer purificação adicional.

[0238] Rendimento (bruto): 90 %

[0239] LCMS (ES+): 510 (M+H)+.

[0240] 6-(4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)-2-(hidroximetil)fenil)-1,5-dimetil-3-((2- (trimetilsilil)etoxi)metil))pirimidina-2,4(1H,3H)-diona a14_Atropoisômero 2

[0241] Composto a14_Atropoisômero 2 pode ser sintetizado de acordo com o mesmo método usando acetato de 2-(3,5-dimetil-2,6-dioxo-1-((2- (trimetilsilil)etoxi)metil))-1,2,3,6-tetra-hidropirimidin-4-il)-5-(furo[3,2-c]piridin-4- iloxi)benzila a13_Atropoisômero 1 como material de partida.

[0242] Rendimento(bruto): 93 %.

[0243] LCMS (ES+): 510 (M+H)+.

[0244] Configuração particular (+) ou (−) dos respectivos atropoisômeros não foi atribuída neste estágio.

[0245] D.1.2. Síntese de 6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-1,5- dimetil-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil))pirimidina-2,4(1H,3H)-diona a15_Atropoisômero 1 e a15_Atropoisômero 2

[0246] Para uma solução de 6-(4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)-2-(hidroximetil)fenil)- 1,5-dimetil-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil))pirimidina-2,4(1H,3H)-diona a14_Atropoisômero 1 (0,13 g, 0,25 mmol) em DCM (3 mL) foi adicionado DAST (0,20 g, 1,23 mmol) a 0 °C. A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 2 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC e LCMS. Após a conclusão, a mistura de reação foi rapidamente arrefecida com uma solução saturada aquosa de NaHCO3 (2 mL) e extraída com EtOAc (2 × 10 mL). A camada orgânica foi sucessivamente lavada com água (10 mL) e salmoura (5 mL), seca em anidro Na2SO4 e concentrada sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna usando EtOAc a 20 a 30 % em hexanos como eluente para proporcionar 74 mg de 6- (2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-1,5-dimetil-3-((2- (trimetilsilil)etoxi)metil))pirimidina-2,4(1H,3H)-diona a15_Atropoisômero 1 como um sólido branco amarelado.

[0247] Rendimento: 59 %

[0248] LCMS (ES+): 512 (M+H)+.

[0249] RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,18 (d, J = 2,45 Hz, 1H), 8,05 (d, J = 5,87 Hz, 1H), 7,58 - 7,53 (m, 2H), 7,48 (s, 2H), 7,16 - 7,12 (m, 1H), 5,39 (d, J = 2,45 Hz, 1H), 5,32 (s, 2H), 5,27 (s, 1H), 3,69 - 3,62 (m, 2H), 2,93 (s, 3H), 1,54 (s, 3H), 0,92 - 0,84 (m, 2H), 0,03 (s, 9H).

[0250] 6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-1,5-dimetil-3-((2- (trimetilsilil)etoxi)metil))pirimidina-2,4(1H,3H)-diona a15_Atropoisômero 2

[0251] Composto a15_Atropoisômero 2 pode ser sintetizado de acordo com o mesmo método usando 6-(4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)-2-(hidroximetil)fenil)-1,5- dimetil-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil))pirimidina-2,4(1H,3H)-diona a14_Atropoisômero 2 como material de partida.

[0252] Rendimento: 58 %

[0253] LCMS (ES+): 512 (M+H)+.

[0254] RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,18 (d, J = 2,45 Hz, 1H), 8,05 (d, J = 5,87 Hz, 1H), 7,58 - 7,53 (m, 2H), 7,48 (s, 2H), 7,16 - 7,12 (m, 1H), 5,39 (d, J = 2,45 Hz, 1H), 5,32 (s, 2H), 5,27 (s, 1H), 3,69 - 3,62 (m, 2H), 2,93 (s, 3H), 1,54 (s, 3H), 0,92 - 0,84 (m, 2H), 0,03 (s, 9H).

[0255] Configuração particular (+) ou (−) dos respectivos atropoisômeros não foi atribuída neste estágio.

[0256] D.1.3. Síntese de 6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-1,5- dimetilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona (+)-(I) e (−)-(I)

[0257] Para uma solução de 6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)- 1,5-dimetil-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil))pirimidina-2,4(1H,3H)-diona a15_Atropoisômero 1 (0,07 g, 0,15 mmol) em DCM (1 mL) foi adicionado TFA (1 mL) a 0 °C. A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 2 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC e LCMS. Após a conclusão, a mistura de reação foi concentrada sob vácuo. O resíduo foi dissolvido em CH3CN (1 mL) e um solução aquosa de amônia a 25 % (1 mL). A mistura de reação foi agitada durante 30 min, em seguida, filtrada, lavada com água fria (2 mL) e seca sob vácuo. O resíduo foi purificado por trituração com DCM:pentano (1:4, 2,5 mL) e seco sob vácuo para proporcionar 20 mg de atropisômero (+) de 6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4- iloxi)fenil)-1,5-dimetilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona (+)-(I) como um sólido branco amarelado.

[0258] Rendimento: 36 %

[0259] Pureza de HPLC: 97,5 %

[0260] LCMS (ES+): 382 (M+H)+.

[0261] RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,48 (s, 1H), 8,16 - 8,19 (m, 1H), 8,05 (d, J = 5,87 Hz, 1H), 7,56 - 7,52 (m, 2H), 7,49 - 7,44 (m, 2H), 7,13 (d, J = 1,47 Hz, 1H), 5,39 (d, J = 3,42 Hz, 1H), 5,27 (d, J = 2,93 Hz, 1H), 2,86 (s, 3H), 1,48 (s, 3H).

[0262] [α]D (MeOH, 30 °C) = +14,7

[0263] 6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-1,5-dimetilpirimidina- 2,4(1H,3H)-diona (I) atropisômero (−), ((−)-I)

[0264] Composto (−)-I pode ser sintetizado de acordo com o mesmo método usando 6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-1,5-dimetil-3-((2- (trimetilsilil)etoxi)metil))pirimidina-2,4(1H,3H)-diona a15_Atropoisômero 2 como material de partida.

[0265] Pureza de HPLC: 99,8 %

[0266] LCMS (ES+): 382 (M+H)+.

[0267] RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,48 (s, 1H), 8,19 - 8,16 (m, 1H), 8,05 (d, J = 5,87 Hz, 1H), 7,56 - 7,52 (m, 2H), 7,46 (brs, 2H), 7,13 (d, J = 1,47 Hz, 1H), 5,39 (d, J = 3,42 Hz, 1H), 5,27 (d, J = 2,93 Hz, 1H), 2,86 (s, 3H), 1,48 (s, 3H).

[0268] [α]D (MeOH, 30 °C) = -8,3

[0269] D.2. Síntese de atropoisômero (−) DE [11C]-6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2- c]piridin-4-iloxi)fenil)-1,5-dimetilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona (Ia), (−)-(Ia)

a10 a16 a17 a18 Ia

[0270] D.2.1. Síntese de 4-(4-bromo-3-(fluorometil)fenoxi)furo[3,2-c]piridina a16

[0271] Para uma solução de (2-bromo-5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)metanol a10 (5 g, 15,7 mmol) em DCM (100 mL) foi adicionado DAST (10 g, 62,8 mmol) a 0 °C, em seguida, a mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 2 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC e LCMS. Após a conclusão, a mistura de reação foi rapidamente arrefecida com uma solução saturada aquosa de NaHCO3 (20 mL) e extraída com DCM (100 mL). A camada orgânica foi seca em anidro Na2SO4 e concentrada sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna usando EtOAc a 10 a 15 % em hexanos como eluente para proporcionar 2,1 g de 4-(4-bromo-3-(fluorometil)fenoxi)furo[3,2-c]piridina a16 como um sólido branco amarelado.

[0272] Rendimento: 41 %

[0273] LCMS (ES+): 322 (M+H)+.

[0274] RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,99 (d, J = 6,00 Hz, 1H), 7,68 - 7,64 (m, 1H), 7,59 (d, J = 8,80 Hz, 1H), 7,38 - 7,36 (m, 1H), 7,22 (d, J = 5,60 Hz, 1H), 7,14 - 7,10 (m, 1H), 6,91 (s, 1H), 5,46 (d, J = 46,8 Hz, 2H).

[0275] D.2.2. Síntese de 4-(3-(fluorometil)-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2- dioxaborolan-2-il)fenoxi)furo[3,2-c]piridina a17

[0276] Para uma solução de 4-(4-bromo-3-(fluorometil)fenoxi)furo[3,2-c]piridina a16 (2 g, 6,23 mmol) e 4,4,5,5-tetrametil-2-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)- 1,3,2-dioxaborolano (2,05 g, 8,09 mmol) em dioxano (50 mL) foi adicionado KOAc (1,83 g, 18,6 mmol), em seguida, a reação foi purgada com argônio durante 30 min. PdCl2(dppf) (1,52 g, 1,86 mmol) foi adicionado e a mistura de reação foi purgada novamente com argônio durante 5 min. A mistura de reação foi aquecida a 100 °C durante 12 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC e LCMS. Após a conclusão, a mistura de reação foi filtrada através de Celite® e lavada com EtOAc (100 mL). O filtrado foi concentrado sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna usando EtOAc a 10 % em hexanos como eluente para proporcionar 2,1 g de 4-(3-(fluorometil)-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenoxi)furo[3,2- c]piridina a17 como um sólido branco amarelado.

[0277] Rendimento: 91 %

[0278] RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,16 - 8,14 (m, 1H), 7,98 (d, J = 5,20 Hz, 1H), 7,79 (d, J = 8,40 Hz, 1H), 7,49 (d, J = 6,00 Hz, 1H), 7,32 - 7,28 (m, 1H), 7,24 - 7,20 (m, 1H), 7,09 (s, 1H), 5,65 (d, J = 47,6 Hz, 2H), 1,31 (s, 12H).

[0279] D.2.3. Síntese de 6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-5- metilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona a18

[0280] Para uma solução de 4-(3-(fluorometil)-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2- dioxaborolan-2-il)fenoxi)furo[3,2-c]piridina a17 (100 mg, 0,27 mmol) e 6-iodo-5- metilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona a6 (130 mg, 0,54 mmol) em dioxano (10 mL) e água (1 mL) foi adicionado K2CO3 (110 mg, 0,81 mmol) e a reação foi purgada com argônio durante 30 min. PdCl2(dppf) (60 mg, 0,08 mmol) foi adicionado e a mistura de reação foi purgada novamente com argônio durante 5 min. A mistura de reação foi aquecida a 80 °C durante 1 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC e LCMS. Após a conclusão, a mistura de reação foi filtrada através de Celite®. O filtrado foi concentrado sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna usando EtOAc a 50 a 60 % em hexanos como eluente para proporcionar 20 mg de 6-(2-(fluorometil)-4- (furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-5-metilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona a18 como um sólido branco amarelado.

[0281] Rendimento: 21 %

[0282] Pureza de HPLC: 98,4 %

[0283] LCMS (ES+): 368 (M+H)+.

[0284] RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,18 (s, 1H), 10,85 (s, 1H), 8,17 (d, J = 2,00 Hz, 1H), 8,02 (d, J = 6,00 Hz, 1H), 7,52 (d, J = 6,00 Hz, 1H), 7,45 - 7,37 (m, 3H), 7,11 (d, J = 1,60 Hz, 1H), 5,36 (d, J = 46,8 Hz, 2H), 1,51 (s, 3H).

[0285] D.2.4. Síntese de atropisômero (−) DE [11C]-6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2- c]piridin-4-iloxi)fenil)-1,5-dimetilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona (Ia), (−)-(Ia).

[0286] [11C]-(6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)-1,5- dimetilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona) como uma mistura de dois atropoisômeros foi preparada partindo do precursor a18 e [11C]metano. O [11C]metano foi produzido em um cíclotron GE PETtrace irradiando-se o alvo de gás contendo uma mistura de hidrogênio a 10 % em gás de nitrogênio com um feixe de próton 16,5 MeV, produzindo [11C]metano através de reação nuclear 14N(p, α)11C e reação subsequente no alvo de carbono-11 com nitrogênio para formar metano.

[0287] O [11C]metano produzido foi, em seguida, retido a cerca de -180 ºC em uma armadilha de HayeSep que é subsequentemente lavada com hélio para remover traços de hidrogênio e nitrogênio. O [11C]metano retido depois foi liberado sob aquecimento em um sistema de recirculação onde foi reagido com vapor de iodo a aproximadamente 720 ºC para produzir iodeto de metila [11C]. Após a recirculação, o iodeto de metila [11C] foi passado em uma corrente de hélio através de uma coluna contendo triflato de prata aquecido em um veículo inerte para produzir o agente de marcação, triflato de metila [11C]. Esse por sua vez, foi retido em uma solução contendo o precursor não marcado a18, 0,2 - 0,4 mg, 4 - 5 µl de NaOH aquoso 0,5M e 600 - 700 µl de acetona.

[0288] Depois de cerca de 120 segundos a mistura de reação foi diluída com água e transferida em uma coluna semipreparativa XBridge C18 (200×10 mm, 5 µm) e eluído com uma mistura de acetonitrila e NH4OH aquoso (0,15 %) 29:71 a um fluxo de 7 mL/min. O efluente foi monitorado com radioatividade e detector de UV conectado sequencialmente, com detector de UV ajustado a 254 nm. O pico contendo produto radioativo marcado foi coletado, diluído em cerca de 50 ml de água estéril e passaram através de cartucho Waters Oasis 3cc SPE para reter o produto. O cartucho depois foi lavado com 8 mL de água estéril e o produto eluído com cerca de 1,1 ml de etanol a 96 % em um frasco contendo 12 ml de solução salina. O produto depois foi filtrado através de um filtro estéril de 0,22 µm (Millex GV). A amostra para controle de qualidade foi retirada do frasco do produto após a filtração. A pureza radioquímica foi determinada usando um sistema de HPLC padrão, com radioatividade e detector de UV conectado em série, usando coluna analítica XBridge C18 (150×4,6 mm, 5 µm) com acetonitrila/NH4OH aquoso (0,15 %) 25:75 como fase móvel, com detector de UV ajustado para 254 nm.

[0289] Como os dois atropoisômeros não podem ser separados em uma coluna regular de HPLC C18, um método de separação quiral foi desenvolvido para sua separação.

[0290] Para o isolamento de atropisômero (−) de (Ia), a HPLC semipreparativa foi realizado usando coluna Chiralpak IA (250 x 10 mm, 5 µm) usando mistura de acetonitrila/etanol 7:93 como fase móvel, a um fluxo de 5 mL/min, com detector de UV ajustado para 254 nm. A reação em si e a formulação do produto foram realizadas como descrito acima.

[0291] As purezas radioquímicas e atropoisoméricas foram determinadas usando um sistema de HPLC padrão equipado com o campo analítico Chiralpak IA-3, eluído com MeCN/EtOH 7:93 fase móvel a um fluxo de 1 ml/min, com detector de UV ajustado para 254 nm (tempo de retenção de (-)-Ia = 7,2 minutos, ee >99 %).

[0292] D.3. Síntese de atropisômero (−) DE [18F]-6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2- c]piridin-4-iloxi)fenil)-1,5-dimetilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona (Ib), (−)-(Ib)

a13 a19 a20 a21 a22 (Ib)

[0293] D.3.1. Síntese de 2-(3,5-dimetil-2,6-dioxo-1,2,3,6-tetra-hidropirimidin-4-il)- 5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)benzil acetato a19

[0294] Para uma solução de 2-(3,5-dimetil-2,6-dioxo-1-((2- (trimetilsilil)etoxi)metil))-1,2,3,6-tetra-hidropirimidin-4-il)-5-(furo[3,2-c]piridin-4- iloxi)benzil acetato a13 (2,60 g, 4,71 mmol) em DCM (50 mL) foi adicionado TFA (26,0 mL, 350 mmol) foi adicionado a 0 °C, em seguida, a mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 2 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC e LCMS. Após a conclusão, a mistura de reação foi concentrada sob vácuo. O resíduo foi dissolvido em uma mistura acetonitrila:amônia (1:1, 10 mL) e agitado durante 30 min. A mistura de reação foi filtrada, lavada com água fria (20 mL) e pentano (20 mL) e seca sob vácuo para proporcionar 1,6 g de acetato de 2-(3,5-dimetil-2,6-dioxo- 1,2,3,6-tetra-hidropirimidin-4-il)-5-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)benzila a19 como um sólido branco amarelado, que foi usado na próxima etapa sem qualquer purificação adicional.

[0295] Rendimento(bruto): 81 %

[0296] LCMS (ES+): 422 (M+H)+.

[0297] RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,47(s, 1H), 8,18 (d, J = 1,96 Hz, 1H), 8,05 (d, J = 5,87 Hz, 1H), 7,54 (dd, J = 5,87, 0,98 Hz, 1H), 7,48 (s, 1H), 7,45 - 7,41 (m, 2H), 7,13 (s, 1H), 5,02 - 4,97 (m, 1H), 4,97 - 4,91 (m, 1H), 2,90 (s, 3H), 1,97 (s, 3H), 1,50 (s, 3H).

[0298] D.3.2. Síntese de terc-butil 4-(2-(acetoximetil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4- iloxi)fenil)-3,5-dimetil-2,6-dioxo-3,6-di-hidropirimidina-1(2H)-carboxilato a20

[0299] Acetato de 2-(3,5-dimetil-2,6-dioxo-1,2,3,6-tetra-hidropirimidin-4-il)-5- (furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)benzila a19 (1,60 g, 3,80 mmol), (Boc)2O (1,57 mL, 6,83 mmol), Trietilamina (0,64 mL, 4,56 mmol) e DMAP (0,05 g, 0,38 mmol) foram dissolvido em THF (33,3 mL) e a mistura de reação foi aquecida a 70 °C durante 16 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC e LCMS. Após a conclusão, a mistura de reação foi concentrada sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna usando EtOAc a 70 a 80 % em hexanos como eluente para proporcionar 1,1 g de terc-butil 4-(2-(acetoximetil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)fenil)- 3,5-dimetil-2,6-dioxo-3,6-di-hidropirimidina-1(2H)-carboxilato a20 como um sólido branco amarelado.

[0300] Rendimento: 56 %

[0301] LCMS (ES+): 522 (M+H)+.

[0302] RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,17 (d, J = 1,96 Hz, 1H), 8,04 (d, J = 5,87 Hz, 1H), 7,52 (d, J = 5,87 Hz, 1H), 7,40 (d, J = 8,31Hz, 2H), 7,34 - 7,30 (m, 1H), 7,10 (d, J = 1,47 Hz, 1H), 4,33 - 4,38 (m, 2H), 2,94 (s, 3H), 1,95 (s, 3H), 1,55 (s, 9H), 1,52 (s, 3H).

[0303] D.3.3. Síntese de terc-butil 4-(4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)-2- (hidroximetil)fenil)-3,5-dimetil-2,6-dioxo-3,6-di-hidropirimidina-1(2H)-carboxilato a21

[0304] Uma solução de terc-butil 4-(2-(acetoximetil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4- iloxi)fenil)-3,5-dimetil-2,6-dioxo-3,6-di-hidropirimidina-1(2H)-carboxilato a20 (1,1 g, 2,11 mmol) em THF (15 mL) e água (2 mL) foi adicionado NaOH (90 mg, 2,32 mmol), em seguida, a mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 16 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC e LCMS. Após a conclusão, a mistura de reação foi concentrada sob vácuo. O resíduo foi extraído com EtOAc (2 × 50 mL). A camada orgânica foi seca em anidro Na2SO4 e concentrada sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna usando EtOAc a 50 % em hexanos como eluente para proporcionar 300 mg de terc-butil 4-(4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)-2- (hidroximetil)fenil)-3,5-dimetil-2,6-dioxo-3,6-di-hidropirimidina-1(2H)-carboxilato a21 como um sólido bruto.

[0305] Rendimento: 30 %

[0306] LCMS (ES+): 480 (M+H)+.

[0307] RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,14 (s, 1H), 8,01 (d, J = 5,87 Hz, 1H), 7,50 (d, J = 5,87 Hz, 1H), 7,40 - 7,34 (m, 2H), 7,32 - 7,27 (m, 1H), 7,08 (s, 1H), 5,37 (t, J = 5,62 Hz, 1H), 4,36 - 4,29 (m, 2H), 2,91 (s, 3H), 1,52 (s, 9H), 1,49 (s, 3H).

[0308] D.3.4. Síntese de terc-butil 4-(2-(clorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4- iloxi)fenil)-3,5-dimetil-2,6-dioxo-3,6-di-hidropirimidina-1(2H)-carboxilato a22

[0309] Para uma solução de terc-butil 4-(4-(furo[3,2-c]piridin-4-iloxi)-2- (hidroximetil)fenil)-3,5-dimetil-2,6-dioxo-3,6-di-hidropirimidina-1(2H)-carboxilato a21 (300 mg, 0,63 mmol) em DCM (5 mL) foi adicionado uma solução de SOCl2 (0,09 g, 0,75 mmol) DCM (1 mL) a 0 °C, em seguida, a mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 1 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC e LCMS. Após a conclusão, a mistura de reação foi rapidamente arrefecida com uma solução saturada aquosa de NaHCO3 (5 mL) e extraída com DCM (2 × 20 mL). A camada orgânica foi seca em anidro Na2SO4 e concentrada sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna usando EtOAc a 50 a 55 % em hexanos como eluente para proporcionar 150 mg de terc-butil 4-(2-(clorometil)-4-(furo[3,2-c]piridin-4- iloxi)fenil)-3,5-dimetil-2,6-dioxo-3,6-di-hidropirimidina-1(2H)-carboxilato a22 como um sólido bruto.

[0310] Rendimento: 48 %

[0311] Pureza de HPLC: 98,4 %

[0312] LCMS (ES+): 498 (M+H)+.

[0313] RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,18 (d, J = 1,96 Hz, 1H), 8,05 (d, J = 5,87 Hz, 1H), 7,57 (d, J = 1,96 Hz, 1H), 7,54 (d, J = 5,38 Hz, 1H), 7,51 - 7,48 (m, 1H), 7,46 - 7,43 (m, 1H), 7,13 (d, J = 1,47 Hz, 1H), 4,72 (s, 2H), 2,93 (s, 3H), 1,56 (s, 9H), 1,55 (brs, 3H).

[0314] D.3.5. Síntese de atropisômero (−) DE [18F]-6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2- c]piridin-4-iloxi)fenil)-1,5-dimetilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona (Ib), (−)-(Ib)

[0315] Em um procedimento típico, [18F]fluoreto em um frasco de remessa (água-

alvo obtida de uma instalação de ciclótron) é transferido e retido em um cartucho de troca iônica. Em seguida, elui-se com uma solução de carbonato de potássio e Kryptofix 222 no vaso de reação (RV1) do módulo TRACERlab ®. A solução é primeiramente evaporada por aquecimento a 95 °C por 4 min sob vácuo e fluxo de hélio. Adiciona-se acetonitrila (1 mL) ao RV1 e a evaporação é continuada nas mesmas condições durante 2 min sob vácuo. Após uma segunda adição de acetonitrila (1 mL), a evaporação final é realizada a 95 °C por 2 min sob vácuo e fluxo de hélio. O reator é, em seguida, arrefecido a 50 °C.

[0316] Uma solução do precursor a22 (0,7 mg) em acetonitrila anidro é adicionada ao vaso de reação e a mistura de reação é aquecida a 80 °C por 5 min. Após 5 minutos, o reator é arrefecido a 70 °C, o ácido clorídrico (1M) é adicionado e aquecido a 70 °C por 4 minutos antes de ser arrefecido a 40 °C e diluído com WFI. A mistura é transferida do RV1 para um cartucho intermediário de extração em fase sólida (SPE, Oasis HLB light). O RV1 é enxaguado com metanol e transferido através do SPE para eluir o produto para o RV2, pré-cheio com WFI. Todo o conteúdo de RV2 é transferido para o circuito injetor de HPLC para purificação.

[0317] O isolamento de (−)-Ib é realizado por HPLC usando uma coluna semipreparativa Chiralcel OJ-H (5 µm, 250 x 10 mm) e Phenomenex Luna C18 (2) (10 μm, 250 x10 mm) e eluído com uma mistura de solução de acetonitrila/acetato de amônio (5 mM) (40/60, v/v) a uma taxa de fluxo de 4 mL/min. A fração do produto é coletada em Frasco 1, contendo 25 mL de ácido ascórbico em WFI. A mistura do produto diluído é passada através de um cartucho de extração de fase sólida tC18 e o cartucho é enxaguado com 10 mL de ácido ascórbico em WFI. O produto radiomarcado é eluído a partir do cartucho de SPE com 1 mL de etanol de grau de USP à prova de 200 no frasco de formulação, pré-carregado com 10 mL de base de formulação. O cartucho é enxaguado com 4 mL de base de formulação e o enxague é misturado com o conteúdo do frasco de formulação. A solução resultante é passada através de um filtro de membrana esterilizante 0,2 μm em um frasco estéril e ventilado por filtro (frasco do produto final, FPV).

[0318] A pureza radioquímica foi determinada usando um sistema de HPLC padrão, com radioatividade e detector de UV conectado em série, usando coluna analítica Kinetex EVO C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm) com MeOH/NH4OAc 50/50 5 mM, aumentando para 80/20 em 15 minutos, como fase móvel, com detector de UV ajustado para 254 nm (tempo de retenção de (-)-1b = 9,7 minutos, pureza radioquímica 99 %)

[0319] A pureza atropoisomérica foi determinada usando um sistema de HPLC padrão, com radioatividade e detector de UV conectados em série, usando a coluna analítica chiralpak OJ-Hc (250 x 4,6 mm, 5 µM), eluída com fase móvel MeCN/NH4OAc 40/60 5 mM a um fluxo de 1 ml/min, com detector de UV ajustado para 254 nm (tempo de retenção de (-)-1a = 10,1 minutos, ee > 99 %).

[0320] D.4. Síntese de atropisômero (−) DE [3H]-6-(2-(fluorometil)-4-(furo[3,2- c]piridin-4-iloxi)fenil)-1,5-dimetilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona (Ic), (−)-(Ic)

[0321] Composto da fórmula (-)-(I) (2 mg), catalisador de Kerr (2 mg), e diclorometano (1 mL) foram combinados em um frasco de tritiação e agitado sob 5Ci de gás de trítio durante 2,5 horas. Trítio lábil foi removido pelas evaporações repetidas até a secura de etanol. Os resíduos foram dissolvidos em etanol (20 mL). O produto bruto (−)-(Ic) foi purificado por HPLC usando uma coluna Gemini C18 5 µ 250 x 10 mm, Água + TFA (0,1 %) como eluente A, Acetonitrila + TFA (0,1 %) como eluente B, 20 % de B a 100 % de B sobre 60 min como gradiente a taxa de fluxo de 3 mL/min. (−)-(Ic) foi coletado, evaporado rotativamente à secura e dissolvido em etanol (20 mL).

[0322] A pureza radioquímica de (−)-(Ic), determinada por Cromatografia Líquida de alto desempenho, foi medida usando uma coluna analítica inertsil ODS3 (150 x 4,6 mm, 5 µM), eluída com água/TFA como eluente A e CH3CN/TFA como fase eluente B a um fluxo de 1 mL/min (gradiente variando de 20 % de B a t=0 a 100 % de B a t= 20 minutos) com um detector de radioatividade (tempo de retenção de (-)-(Ic) = 12,9 minutos, pureza radioquímica = 99,4 %).

[0323] LCMS (ES+): Íon principal a 384 (M+H)+ compatível com incorporação de principalmente 1 trítio e uma atividade específica medida a 18 Ci/mmol.

[0324] E. BIOLOGIA

[0325] Para avaliar a atividade do composto (I) no receptor D1, testamos em um ensaio funcional. O ensaio funcional mede a estimulação da produção de monofosfato cíclico de adenosina (cAMP) no ensaio de fluorescência homogênea resolvida no tempo (HTRF), com o aumento máximo em cAMP aumentando-se concentrações do agonista endógeno, dopamina, definido como 100 % de ativação do receptor D1. Quando testado, o composto (±)-(I) exibe efeito significante como agonista direto.

[0326] Para avaliar afinidade e seletividade do composto (I) para D1, foi testado em ensaios de ligação de radioligante competitivo. Ensaios de ligação de radioligante competitivo foram, em seguida, usados para medir (±)-I afinidade para receptor D1 e avaliar sua seletividade em relação a um grande painel de 80 alvos relacionados e não relacionados. Composto (±)-(I) se liga aos receptores D1 e D5 com uma afinidade na faixa subnanomolar e não se ligam significantemente a qualquer um dos outros alvos testados.

[0327] Composto (−)-(I) foi, em seguida, tritiado para medir e comparar: 1) propriedades de ligação de radioligante de um antagonista D1conhecido [³H]SCH23390 e de composto agonista D1 da fórmula (−)-(Ic), e 2) a capacidade de moduladores alostéricos positivos D1 (PAM) para potencializar ligação de agonista ou antagonista ao receptor D1 (D1R). Medimos a potencialização induzida por PAM de D1 como um aumento em ligação de radioligante na membrana celular que expressa D1R humano ou em fatias cerebrais de primatas não humanos (NHP) por autorradiografia.

[0328] As condições particulares do ensaio em que o composto foi testado são descritas aqui abaixo.

[0329] E.1. Materiais e métodos

[0330] A transfecção transitória de dopamina humana D1R foi realizada com o vetor pcDNA3.1 em células renais embrionárias humanas (hD1R de HEK).

[0331] Seções do cérebro de Macaca mulata, primatas não humanos (NHP) foram fornecidas por Motac (Bordeaux, França), onde todas as experiências com animais foram realizadas de acordo com a orientação e legislação ética de uso animal europeu.

[0332] O composto antagonista D1 é [³H]SCH23390 (atividade específica de 73

Ci/mmol) que foi obtida de Perkin Elmer (Zaventem, Bélgica).

[0333] O kit de ensaio dinâmico de HTRF cAMP, células SK-N-MC de neuroepitelioma humano e todos os outros reagentes eram de grau analítico, obtidos de fontes comerciais convencionais e usados seguindo as recomendações dos fabricantes.

[0334] Os dados foram analisados nos softwares Excel e Graphpad Prism®. KD, Bmax, pIC50 e pEC50 e Erel foram medidos por ajuste computadorizado de curvas de acordo com as equações que descrevem os diferentes modelos competitivos e alostéricos de ligação e atividade funcional.

[0335] E.2. ensaio funcional D1 cAMP DE HTRF

[0336] A Dopamina D1R sendo acoplada à proteína G tipo Gs, sua ativação desencadeia um aumento na concentração intracelular de cAMP ([cAMP]i). As alterações em [cAMP]i foram medidas utilizando a tecnologia de HTRF em células SK- N-MC de neuroepitelioma humano que expressam endogenamente o D1R. Em placa de 384 poços, 20.000 células por poço foram incubadas por 1 hora à temperatura ambiente em um volume final de 20 µL de solução de sal balanceada de Hank tamponada com HEPES 20 mM (tampão HBSS HEPES, pH 7,4) contendo isobutil metilxantina 0,1 mM e 10 concentrações crescentes de dopamina ou de composto de fórmula (I) (10 - 5M a 10 - 12M). A reação foi terminada por adições consecutivas de 10 µL de reagente de detecção de d2 e o reagente de criptografia diluído em tampão de lise. Após um período de 60 min à temperatura ambiente, as mudanças na razão de emissão de HTRF foram determinadas e transformadas em [cAMP]i usando uma curva padrão. Todas as incubações foram realizadas em duplicado e os resultados foram comparados a uma curva de concentração-efeito da dopamina. A potência de pEC50 de um composto é o –log10 da concentração do composto que produz 50% da ativação dos níveis de cAMP e o Erel é a eficácia relativa, definida como a porcentagem máxima de potencialização produzida pelo composto em comparação com a resposta máxima produzido por concentrações crescentes de dopamina (Erel de 1 = resposta máxima da dopamina).

[0337] Quando testado em células SK-N-MC de neuroblastoma humano, o composto (-)-I exibiu um efeito parcial de agonista D1 com um pEC50 de 8,3 e Erel de 53 % como em comparação com dopamina. Os resultados funcionais comparativos para o composto (-)-1 e dopamina estão resumidos na Tabela 1 e mais ilustrados na Figura 1. Tabela 1: valores DE pEC50 e Erel DE (-)-I composto e dopamina PARA hD1R em CÉLULAS SK-N-MC Composto de Teste pEC50 (-logM) Erel (%) Composto (-)-(I) 8,3 ± 0,1 53 ± 13 dopamina 5,8 ± 0,1 100 ± 13

[0338] Os valores de pEC50 e Erel foram obtidos de 2 a 4 experiências independentes (Média ± SD).

[0339] E.3. afinidade DO Composto (±)-I PARA D1R humanO e perfil DE seletividade

[0340] Afinidade (pKi) de Composto da fórmula (±)-(I) para D1R humano recombinante foi medida em CEREP (Celle l’Evescault, França) por experiências de ligação competitiva de radioligante [³H]SCH23390. Composto (±)-I exibiu um pKi de 9,2 para D1R humano.

[0341] A seletividade do composto para D1R humano foi avaliada a 10 µM no CEREP contra um painel de 80 alvos (n = 1 com dados em duplicado) incluindo receptores, transportadores, enzimas e canais de íons. Identificou-se afinidade potencialmente relevante para apenas três alvos: receptor de dopamina D5 (D5R), receptores de taquicinina NK1 e transportador de adenosina (ADET) com inibição > 60 % a 10 µM do composto (±)-(I). Afinidade (pKi) de composto da fórmula (±)-I para D5R humano, receptor NK1 e ADET foi então medida. O composto de fórmula (±)-I é um ligante seletivo do tipo D1 (D1R e D5R) (pKi de 9,4 para D5R humano), porque mais de 1000 vezes seletivo em relação aos outros 79 alvos testados (pKi ൑6,0).

[0342] E.4. ensaio DE Ligação de radioligante

[0343] A membrana das células de hD1R de HEK foi usada para medir a ligação de radioligante. 48 horas após a transfecção, as células foram sedimentadas por centrifugação a 1.500 g e a 4 °C por 10 min. A pelota foi lavada uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS) gelada e centrifugado como descrito logo acima. A pelota foi homogeneizada em um tampão contendo Tris-HCl 15 mM, ácido etileno diamina tetra-acético 0,3 mM, ácido tetraacético etileno glicol 1 mM, MgCl2 2 mM (pH 7,5) e complementado com um coquetel inibidor de protease. O homogenato foi descongelado por congelação duas vezes e equilibrado a 25 °C, seguido de um tratamento de 10 min de DNAse (10 U/ml). Posteriormente, a solução foi centrifugada a 40.000 g e 4 °C por 30 min. Finalmente, a pelota foi recolocada em suspensão em tampão Tris-HCl 20 mM (pH 7,4) contendo sacarose 250 mM e armazenada a -80 °C até ensaio de ligação de radioligante D1. A preparação de membrana de hD1R de HEK (5 µg proteínas por ensaio) foi incubada durante 120 min a 25 °C com (-)-(Ic) ou [³H]SCH23390 em tampão de ligação de 0,2 ml contendo DMSO a 1 %. No final do período de incubação, o radioligante ligado à proteína foi recuperado por filtração através de filtros de fibra de vidro GF/B pré-embebidos. Os filtros foram lavados com pelo menos 4 vezes o volume de ensaio de tampão Tris-HCl gelado 50 mM (pH 7,4). Toda a etapa de filtração não excedeu 10 segundos. Os filtros foram secos e a radioatividade determinada por cintilação líquida. Os ensaios de ligação à saturação foram realizados usando concentrações crescentes de (-)-(Ic) ou [³H]SCH23390 (0,5 a 50 nM) na ausência e na presença de PAMs de D1 10 µM, Composto a (CAS 1900706 - 51 - 5) e Composto b (CAS 1904661 - 53 - 5), também denominado como Composto B no parágrafo E.7 e nas Figuras 5 & 6.

[0344] As experiências de ligação de competição/potencialização foram realizadas a concentração constante (-)-(Ic) (1 - 4 nM) e 10 concentrações aumentadas de (-)- (Ic) ou composto b (10 - 10M a 10 - 5M). Em todas as experiências, a ligação não específica (NSB) foi definida como a ligação de radioligante residual observada na presença de 10 µM do respectivo composto não marcado.

[0345] O composto PAM de D1 não teve efeito na ligação de radioligante antagonista D1 [³H]SCH23390 (Figura 3A), mas melhorou significativamente as propriedades de radioligante agonista D1 (-)-(Ic) aumentando-se Bmax de 45 % e diminuindo KD de 20 % (Figura 3B).

[0346] A capacidade do composto PAM de D1 de potencializar a baixa concentração nanomolar (relevante para um marcador por PET) de ligação de radioligante agonista (-)-(Ic) para D1R foi demonstrada na Figura 3C (> 50 % potencialização de ligação (-)-(Ic)).

[0347] As curvas resultantes são apresentadas na Figura 3.

[0348] E.5. Autorradiografia

[0349] As fatias de cérebro de 12 µm foram preparadas a partir de hemisfério cerebral NHP congelado fresco e foram colocadas em lâmina de microscopia de vidro. A experiência de autorradiografia foi realizada à temperatura ambiente em tampão HBSS HEPES (pH 7,4). As seções do cérebro de NHP foram equilibradas primeiro por 30 minutos antes de serem incubadas por uma hora com o composto [³H] em DMSO a 1 %. As lâminas foram então lavadas em tampão Tris-HCl 50 mM gelado (pH 7,4) por 5 min seguido por duas lavagens em água destilada gelada. As seções foram secas sob pressão atmosférica à temperatura ambiente. A radioatividade na fatia foi medida indiretamente após a exposição das lâminas a uma tela de fósforo, usando um contador direto. Em todas as experiências de autoradiografia, um padrão [3H] foi incluído para quantificação e o NSB foi definido como a ligação residual do composto [³H] observada na presença de 10 µM de composto não marcado.

[0350] Quando testado em autorradiografia em fatias de cérebro do NHP, de maneira semelhante ao marcador tipo D1 conhecido (consultar, Cadet JL et al. Dopamine D1 receptors, regulation of gene expression in the brain, and neurodegeneration. CNS Neurol Disord Drug Targets. (2010) 9(5): 526-538), (-)-Ic demonstrou uma ligação significativa (ligação total) no putâmen caudado consistente com os níveis mais altos de expressão do receptor D1 encontrados nessas estruturas (Cadet et al.). Esta ligação é deslocável e 20 % foi avaliado como ligação não específica (medida na presença de 10 µM de composto (I)).

[0351] Na presença de 10 µM de Composto b de PAM de D1, a ligação específica (-)-Ic é significantemente aumentada (> 150 %) que mostra que existe uma potencialização significativa.

[0352] A Figura 4 exibe os resultados obtidos em ensaios de autorradiografia. Inserir mostra a região selecionada para quantificação de dados. Os dados são representados como a média de duplicatas ± desvio padrão.

[0353] E.6. estudos DE Imageamento por PET in vivo em MacacoS cinomolgos

[0354] A experiência foi realizada em um macaco cinomolgos (fêmea, peso corporal 6,02 kg). Os macacos foram sedados com injeção intramuscular de cetamina e mantidos anestesiados com uma mistura de sevoflurano, oxigênio e ar medicinal durante a experiência. Uma varredura de linha de base foi realizada após a administração intravenosa de 141 MBq de (-)-(Ia) a uma atividade específica de 795 GBq/µmol e as imagens PET do cérebro foram adquiridas usando o scanner PET Siemens HRRT (Siemens Preclinical Solutions, Knoxville, TN).

[0355] Os dados foram adquiridos por 123 min e agrupados em sinogramas com o seguinte tempo de quadro: 9 × 20 s; 3 × 1 min; 5 × 3 min; e 17 × 6 min. As regiões de interesse utilizadas neste estudo foram núcleo caudado, putâmen, cerebelo, córtex frontal, córtex occipital, globus pallidus, mesencéfalo, estriado ventral, tálamo e córtex temporal. Parâmetros de registro foram obtidos para aplicar as regiões de interesses à varredura por PET e curvas de tempo-atividade regional (TACs) foram geradas. As amostras de sangue venoso foram retiradas aos 4, 15, 30, 60, 90, 120 minutos após a administração de (-)-(Ia) para análise metabólita.

[0356] curvas de atividade de tempo de valor de captação padronizado (SUV) DE (-)-Ia

[0357] As curvas de atividade de tempo de valor de captação padronizado (SUV) de (-)-Ia foram adquiridas em várias regiões de interesse. O pico de captação de (-)- Ia atinge um SUV de cerca de 3,5 - 4 aos 5 a 10 minutos após a administração nas várias regiões do cérebro e é seguido por uma rápida lavagem do cerebelo para atingir um SUV de aproximadamente 1 a 60 minutos, conforme o esperado, de uma região de referência desprovida de receptor D1.

[0358] A lavagem das regiões de interesse caudado e putâmen é significativamente mais lenta para atingir um SUV de cerca de 2 a 60 minutos, o que seria esperado da distribuição relatada de D1 nessas regiões. Usando o cerebelo como região de referência e o modelo de tecido de referência Logan, o potencial de ligação (BPND) foi calculado, respectivamente, como 0,94 e 0,87 no caudado e putâmen, o que significa que o composto da fórmula (-)-(Ia) tem uma ligação específica que pode ser quantificado de forma confiável por imageamento por PET.

[0359] As imagens resumidas de SUV obtidas entre 33 - 63 minutos estão demonstrando um padrão de captação consistente com a autorradiografia nos tecidos cerebrais e a distribuição relatada de D1 com alta captação nas estruturas estriatais.

[0360] perfil DE Metabólitos DOS compostos da fórmula (I)

[0361] O perfil dos metabólitos de (-)-Ia foi determinado por análise por radio- HPLC das amostras de sangue venoso coletadas após a administração em vários momentos. A fração precursora no plasma é de 85 % em 15 minutos, 60 % em 30 minutos e ainda cerca de 45 % em 60 minutos. Em contraste com os marcadores agonistas D1 relatados anteriormente, apenas metabólitos hidrofílicos improváveis de atravessar a barreira hematoencefálica foram detectados.

[0362] E.7. Estudos de imageamento por PET DE potenCIALIZAÇÃO In vivo em MacacoS cinomolgos

[0363] Dois macacos cinomolgos (Macaca fascicularis) alojados no MPI Research (Mattawan, MI), foram usados como sujeitos de pesquisa para os estudos por PET potencialização in vivo.

[0364] E.7.1.Administração DE compostos e aQUISIÇÕES DE imageM

[0365] Cada animal foi anestesiado com bolo de iv de propofol (2,5 - 5,0 mg/kg) e mantido com infusão de taxa contínua de iv de propofol (CRI, 0,1-0,6 mg/kg/min) durante pelo menos 30 minutos antes do início da i.v. de administração da dose do Composto-B Vários níveis de dose foram administrados. Para o nível de dose de 20 mg/kg (dose total), o Composto B foi administrado como uma dose de infusão de carga de 8,54 mg/kg; administrado a um CRI de 34,2 mg/kg/h durante um período de aproximadamente 15 minutos, seguido por uma dose de manutenção de infusão de 11,45 mg/kg; administrado via CRI a uma taxa de 17,2 mg/kg/h durante um período de aproximadamente 40 minutos. A administração do composto B foi descontinuada após o tempo total de infusão de aproximadamente 55 minutos. Composto (-)-Ib foi administrado por iv por injeção em bolo, com a administração iniciada 10 minutos após o início da infusão do composto B. Os dados de imagem cerebral foram adquiridos imediatamente após o início da administração do radiomarcador no scanner microPET Focus 220 (Siemens Medical Systems, Knoxville, TN). Os dados de emissão dinâmica foram coletados no modo de lista por 120 minutos imediatamente após a injeção de Composto (-)-Ib, em seguida reconstruídos em uma imagem dinâmica de vários quadros (quadros de 6x0,5 min, 3x1 min, 2x2 min e 22x5 min). As imagens por PET foram corrigidas para normalização do detector, tempo morto, amostragem radial não uniforme, atenuação, dispersão e decaimento radioativo usando software e metodologias fornecidas pelo fabricante da câmera de PET.

[0366] E.7.2. Amostragem DE SANGUE Arterial

[0367] Após a administração do Composto (-)-Ib, foram colhidas amostras de sangue arterial da artéria ilíaca central antes da administração do Composto (-)-Ib e em 13 momentos até 120 minutos após a injeção do Composto (-)-Ib. Todas as amostras de sangue foram coletadas em tubos anticoagulantes e armazenadas em gelo úmido até quantificação para radioatividade por contador gama, medida da fração precursora do Composto (-)-Ib no plasma ao longo do tempo por HPLC e estabilidade ex vivo no sangue de Composto (-)-Ib.

[0368] E.7.3. processAMENTO e análise DE ImageM

[0369] As imagens por PET do cérebro dinâmicas reconstruídas foram transferidas e analisadas usando o pacote de software PMOD para processamento de imagens (PMOD Technologies, Zurique, Suíça). As imagens por PET obtidas na linha de base foram alinhadas às imagens de ressonância magnética estrutural (RM) do cérebro dos animais adquiridos anteriormente. A ressonância magnética do cérebro do animal foi espacialmente normalizada para um modelo comum de cérebro de macaco cinomolgos MR e a transformação de normalização resultante foi aplicada às imagens por PET. As imagens por PET subsequentes adquiridas durante os estudos com medicamentos foram alinhadas primeiro às imagens da linha de base e depois transformadas no espaço comum do modelo de RM usando a transformação já calculada a partir das imagens da linha de base.

[0370] As regiões de interesse (ROIs) definidas no espaço do modelo foram aplicadas às imagens por PET para calcular as curvas de atividade do tempo (TACs). A concentração média de atividade (kBq/cc) dentro de cada ROI foi determinada e TACs representando a concentração regional de atividade cerebral ao longo do tempo foram gerados. TACs e imagens cerebrais foram apresentadas em unidades de SUV (g/mL) normalizando pelo peso do animal e pela dose injetada.

[0371] A análise gráfica Logan (LGA) do método com base em plasma foi aplicada aos TACs regionais para determinar os volumes totais de distribuição (VT) para cada região do cérebro. A função de entrada arterial usada para modelagem foi gerada pela correção da atividade plasmática dos metabólitos, usando a fração precursora medida.

[0372] Um gráfico de potencialização, semelhante em conceito ao gráfico de ocupação global de Lassen, foi usado onde VTTratamento -VTLinha de base está no eixo y e VTTratamento está no eixo x. A potencialização, definida como o aumento do sinal específico, potencialização = VsTratamento/VTLinha de base onde VS é o volume específico de distribuição, pode então ser derivada do gráfico de potencialização como inclinação/(1 inclinação) do gráfico, enquanto o deslocamento não deslocável volume de distribuição (VND), é dado pela interceptação x do gráfico.

[0373] E.7.4. ResultADOs

[0374] As imagens por PET de SUV em média (ponderada no tempo) em 40 - 90 min obtidas na linha de base e após a dosagem com o Composto B a 20 mg/kg e as curvas de atividade de tempo associadas são mostradas na Figura 5. Ambas as imagens mostram o efeito do Composto B na captação do Composto B, onde é observado um aumento da captação devido à potencialização do Composto (-)-Ib pela ligação de Composto B ao sítio alostérico D1.

[0375] Para quantificar o efeito de potencialização, o volume de distribuição (VT) foi estimado a partir das curvas de atividade do tempo na linha de base e após a dosagem com o Composto B usando LGA. A 20 mg/kg, observou-se um aumento de aproximadamente 100 %, em média, no núcleo caudado e no putâmen em um macaco cinomolgos.

[0376] O gráfico de potencialização é mostrado na Figura 6 para o núcleo caudado, putâmen, estriado ventral, pálido, substância negra, ínsula, cingulado e cerebelo.

[0377] A partir do gráfico, a potencialização foi estimada em aproximadamente 136 % para uma dose total de Composto B de 20 mg/kg, administrada por infusão por 55 min.

Claims (14)

REIVINDICAÇÕES

1. Composto, caracterizado pelo fato de que a fórmula (I), que composto é radiomarcado, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

2. Composto da fórmula (I), de acordo com a Reivindicação 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que pelo menos um do hidrogênio é 3H; ou pelo menos um dos carbonos é um 11C; ou o átomo de flúor é um 18F.

3. Composto da fórmula (I), de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é representado pela fórmula (Ia), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que um do carbono é um 11C.

4. Composto da fórmula (I), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é representado pela fórmula (Ib), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que a flurorina é um 18F.

5. Composto da fórmula (I), de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é representado pela fórmula (Ic), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que um ou mais dos hidrogênios é 3H.

6. Composto da fórmula (I), de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que consiste essencialmente em atropisômero (-).

7. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade detectável de um composto da fórmula (I), tal como definido na reivindicação 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em combinação com um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

8. Composto da fórmula (I), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é para usar como um marcador radioativo.

9. Composto da fórmula (I), de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que é para usar em um método de quantificação da densidade de receptores tipo D1.

10. Composto da fórmula (Ia), de acordo com a reivindicação 3 ou composto da fórmula (Ib), de acordo com a reivindicação 4, ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que é para usar em um método de imageamento por PET in vivo.

11. Composto da fórmula (Ia), de acordo com a reivindicação 3 ou o composto da fórmula (Ib), de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que é para usar em um método de imageamento por PET in vivo e medir o engate alvo de um modulador agonista otostérico de receptores tipo D1.

12. Composto da fórmula (Ia), de acordo com a reivindicação 3 ou composto da fórmula (Ib), de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que é para usar na quantificação in vivo do efeito de moduladores alostéricos D1 no receptor D1.

13. Uso de um composto da fórmula (Ic), tal como definido na reivindicação 5, caracterizado pelo fato de ser para medir in vitro ou ex vivo o engate alvo de um modulador agonista otostérico de receptores tipo D1.

14. Uso de um composto da fórmula (Ic), tal como definido na reivindicação 5, caracterizado pelo fato de ser para quantificar in vitro ou ex vivo o efeito de moduladores alostéricos D1 no receptor D1.