BR112020005951A2 - compostos e seus usos como inibidores seletivos de caspase-2 - Google Patents

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Abstract

A presente invenção refere-se a um composto de fórmula (I), em que P1, P3, P4 e P5 são resíduos de aminoácidos ou estruturas similares a aminoácidos. A invenção também refere-se a um composto de fórmula (I) para seu uso como um inibidor de Caspase-2 e para seu uso terapêutico. Ela também diz respeito ao uso de um composto de fórmula (I) como sonda baseada em atividade para detectar seletivamente a atividade de Caspase2.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSTOS E SEUS USOS COMO INIBIDORES SELETIVOS DE CASPASE-2".
[001] A presente invenção refere-se a compostos que são úteis como inibidores seletivos da Caspase-2. Esta invenção também refere- se ao uso terapêutico desses compostos e ao seu uso como sondas baseadas na atividade (ABPs) para Caspase-2.
[002] Caspases são uma família de endoproteases intracelulares que usam um resíduo de cisteína no início da clivagem de substratos peptídicos. Elas são amplamente conhecidas por ter implicações importantes na regulação da inflamação, assim como um papel crucial no controle da morte celular programada por apoptose.
[003] As caspases são classificadas em dois grupos principais: aquelas envolvidas na regulação dos processos inflamatórios (-1, -4, - 5, -11, -12) e aquelas que são centrais para o início e a execução da apoptose. Existem dois grupos entre as Caspases apoptóticas, as "iniciadoras" que possuem um pró-domínio N-terminal longo (Caspase- 2, -8, -9, -10) e aquelas com um pró-domínio curto (resíduos 20-30) que são as "executoras" da apoptose (Caspase-3, -6, -7). As caspases envolvidas na inflamação e na iniciação da apoptose possuem unidades estruturais envolvidas na transdução do sinal apoptótico, tais como "Domínio Efetor da Morte" (DED) e "Domínio de Recrutamento da Caspase" (CARD). Cada um desses domínios permite a interação homotípica com outros parceiros proteicos.
[004] As propriedades enzimáticas das Caspases são governadas pela existência de uma díade catalítica (cisteína, histidina), na qual a cisteína atua como um nucleófilo para a iniciação da clivagem das ligações peptídicas. O sítio ativo das Caspases é altamente conservado, com a cisteína catalítica incluída na sequência peptídica QACXG (onde X é arginina (R), glutamina (Q) ou glicina (G)) e um sub-sítio básico S1,
que lhes dá especificidade para clivagem do substrato depois de um resíduo de aspartato, que é único entre as proteases de mamíferos, exceto a serina protease granzima B. Geralmente, as Caspases reconhecem um motivo tetrapeptídico, P1-P4 na terminação N da ligação clivável, respectivamente reconhecidos pelos sub-sítios S1-S4 da enzima. As posições a jusante do Aspartato (P'1 e P'2) também estão envolvidas no reconhecimento e especificidade em relação às Caspases.
[005] As Caspases foram classificadas em três grupos com base nas sequências peptídicas do substrato que elas preferivelmente reconhecem. As Caspases do grupo I (-1, -4 e -5) têm preferência por um resíduo hidrofóbico em P4. Enquanto que as enzimas do grupo II (- 2, -3, -7) têm uma forte preferência por um aspartato nessa posição, o grupo III (-6, -8, -9, -10) favorece pequenas cadeias alifáticas P4. No grupo II, a Caspase-2 possui uma modalidade de reconhecimento única; de fato, requer o reconhecimento de um resíduo na posição P5 (de preferência uma leucina, isoleucina, valina ou alanina) para exercer sua atividade catalítica. Caspase-3 e -7 também reconhecem um resíduo P5 de maneira não obrigatória.
[006] Originalmente chamada Nedd-2, "Neural precursor cell Expressed developmentally down-regulated 2" em camundongos e Ich- 1, "homóloga de ICE e CED3" em humanos, a Caspase-2, codificada pelo gene CASP2 (chr. 7q34-q35), é o membro mais conservado dessa família de enzimas. Sua atividade é finamente regulada durante o desenvolvimento neuronal em humanos. Existem duas isoformas de Caspase-2: uma pró-apoptótica (2L) e uma anti-apoptótica (2S). A isoforma 2L é a forma predominante na maioria dos tecidos, mas a isoforma 2S é expressa em níveis similares no cérebro, músculo esquelético e coração.
[007] A Caspase-2 atua como uma iniciadora da Caspase que cliva deficientemente outras Caspases, mas que pode iniciar a permeabilização da membrana externa mitocondrial e que regula diversas vias de sinalização induzidas por estresse, incluindo choque térmico, dano ao DNA, estresse oxidativo da mitocôndria e ruptura do citoesqueleto.
[008] Além da apoptose, a Caspase-2 participa da regulação do estresse oxidativo. Por exemplo, camundongos Casp-2-/- idosos apresentam atividades reduzidas de Superóxido Dismutase e Glutationa peroxidase. Em algumas circunstâncias específicas, a Caspase-2 pode atuar como um supressor de tumor. De fato, sob estresse oncogênico (como no modelo de camundongo transgênico Έµ-Myc), a deficiência de Caspase-2 potencializa a gênese do tumor. Alguns dados também sugerem que a Caspase-2 pode inibir a autofagia (Tiwari M et al., J Biol Chem 20 1 1; 286: 8493-8506; Tiwari M et al. Autofagia 20 14; 10: 1054 1070).
[009] A inibição genética da Caspase-2 mostrou ser neuroprotetora em camundongos recém-nascidos expostos a desafios hipóxico-isquêmicos ou excitotóxicos, sugerindo que a morte celular mediada pela Caspase-2 pode contribuir para a fisiopatologia da lesão cerebral perinatal (Carlsson et al, Annals of Neurology 2011 70 (5): 781- 9). Além disso, a inibição genética da Caspase-2 confere neuroproteção ocular (Amhed Z et al., Cell Death Dis. 2011 Jun 16; 2: e173) e foi recentemente demonstrado que a Caspase-2 medeia a morte específica para o sítio da célula do gânglio da retina após lesão ocular contundente (Thomas CN et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2018 4 de setembro; 59 (l): 4453-4462).
[0010] Em modelos celulares da doença de Alzheimer (Carol M. Troy et al. The Journal of Neuroscience, 15 de fevereiro de 2000, 20 (4): 1386-1392), a Caspase-2 é um efetor chave da morte neuronal induzida pelo peptídeo amiloide Aβ (Ribe EM et al., Biochem J. 2012 444 (3):
591-9).
[0011] Além disso, usando camundongos transgênicos com a proteína precursora de amiloide, Pozueta et al. (Nat. Comum. 2013; 4: 1939) mostraram que:
[0012] (i) Caspase-2 é necessária para o declínio cognitivo nesse modelo de Alzheimer em animal,
[0013] (ii) neurônios do hipocampo cultivados deficientes em Caspase-2 são imunes aos efeitos sinaptotóxicos de Aβ, e
[0014] (iii) Caspase-2 é uma mediadora crítica na ativação da via de sinalização de RhoA/ROCK-II, levando ao colapso das colunas dendríticas,
[0015] sugerindo assim que a Caspase-2 é a impulsionadora principal da disfunção sináptica na doença de Alzheimer.
[0016] Foi verificado também que a Caspase-2 cliva diretamente a proteína Tau e, portanto, parece estar implicada na geração de ∆tau314, que pode ter uma influência na disfunção sináptica observada na doença de Alzheimer e em outras taupatias (Zhao et al. Nat. Med. 2016).
[0017] A Caspase-2 também parece implicada em déficits comportamentais na doença de Huntington (Caroll et al., Mol. Neurodegener. 2011 19 de agosto; 6: 59).
[0018] A Caspase-2 também parece promover a obesidade, síndrome metabólica e doença hepática gordurosa não alcoólica. De fato, foi demonstrado que camundongos com deficiência de Caspase-2 foram protegidos dessas condições (Machado MV et al. Cell Death Dis. 18 de fevereiro de 2016; 7: e2096).
[0019] As primeiras gerações de inibidores de Caspases foram peptídeos de aldeído que inibem reversivelmente Caspases. Várias sequências supostamente conferem efeitos preferenciais vis-à-vis a alguns membros da família da Caspase que foram desenvolvidos, incluindo Ac-DEVD-CHO (um inibidor preferencial de Caspase-3 e
Caspase-7) e Ac-VDVAD-CHO (um inibidor preferencial de Caspase- 2, -3 e -7).
[0020] Na segunda geração de inibidores de Caspases, o grupo aldeído foi substituído por cetonas α-substituídas por um grupo fluorometil cetona (fmk). Este tipo de inibidor inativa a enzima, pela formação de um aduto com o sítio ativo de cisteína. Z (benziloxilcarbonil)-VAD-fmk é um inibidor de amplo espectro dessa geração. Essas moléculas são tóxicas in vivo, porque a liberação do grupo fluoroacetato, particularmente no fígado, leva à inibição da aconitase. Assim, o desenvolvimento de inibidores com um grupo fmk foi abandonado na fase pré-clínica devido à sua hepatotoxicidade. Então, vários inibidores da Caspase foram sintetizados na técnica (Poreba et al., Chem Rev. 25 de novembro de 2015; 115 (22): 12546- 629). Em particular, os compostos capazes de inibir a atividade da Caspase-2 foram relatados, por exemplo, em WO 2005/105829 e EP2670774. Entretanto, esses inibidores conhecidos da Caspase-2 também têm uma atividade muito alta em relação à Caspase-3. Portanto, eles não podem ser qualificados como inibidores seletivos da Caspase-2.
[0021] Mais recentemente, uma série de inibidores reversíveis da Caspase-2 foi relatada. Quando avaliados in vitro sobre Caspases recombinantes humanas, esses compostos foram encontrados inibir preferencialmente a Caspase-2, mas têm efeitos moderados em ensaios celulares e propriedades estruturais que são incompatíveis com o uso in vivo (Maillard et al., Biorganic & Medicinal Chemistry 19 (201 1 5833-5851).
[0022] Consequentemente, ainda são necessários inibidores potentes e seletivos da Caspase-2, mais particularmente com uma atividade significativamente reduzida contra a Caspase-3. Em particular, seria altamente vantajoso fornecer inibidores da Caspase-2 mais seletivos e eficientes para uso na prevenção e/ou tratamento de doenças e/ou lesões nas quais a atividade da Caspase-2 está implicada, como isquemia cerebral neonatal, isquemia cardíaca e doenças degenerativas crônicas como, por exemplo, a doença de Alzheimer.
[0023] Seria também muito vantajoso fornecer inibidores mais eficazes e seletivos da Caspase-2 para uso como uma sonda baseada em atividade para detectar especificamente a atividade da Caspase-2.
[0024] Os compostos da invenção visam atender a essas necessidades.
[0025] Assim, de acordo com um de seus aspectos, a presente invenção refere-se a um composto de fórmula (I):
[0026] em que:
[0027] ● Z1 e Z2, idênticos ou diferentes, são selecionados entre um átomo de hidrogênio, um grupo (C1-C6)alquila ou (C1-C6)alcoxila;
[0028] – P5 é selecionado entre os seguintes resíduos de aminoácidos ou estruturas similares a aminoácidos:
[0029] – P1 e P4, idênticos ou diferentes, são selecionados entre as seguintes estruturas similares a aminoácidos:
e
[0030] em que Z3 e Z4, idênticos ou diferentes, são selecionados entre um átomo de hidrogênio, um grupo (C1-C6)alquila;
[0031] – P3 é selecionado entre os seguintes resíduos de aminoácidos:
[0032] – R1 é selecionado entre:
[0033] em que:
[0034] ● m é 0, 1 ou 2;
[0035] ● p é 1, 2, 3 ou 4;
[0036] ● Z5 é um átomo de halogênio;
[0037] ● q é 0 ou 1;
[0038] ● Z6 é selecionado entre um grupo (C1-C6)alquila e um grupo fenila, o dito grupo fenila sendo opcionalmente substituído por um grupo amino;
[0039] ● Z7, Z8 e Z11, idênticos ou diferentes, são selecionados entre um átomo de hidrogênio, um grupo (C1-C4)alquila, uma tetraidroquinolinila e um grupo –(CH2)i-arila com i sendo 0, 1 ou 2, o dito grupo arila sendo opcionalmente substituído por um, dois, três ou quatro átomos de halogênio ou um grupo (C1-C4)alquila; e
[0040] ● Z9 e Z10, idênticos ou diferentes, são selecionados entre um átomo de hidrogênio e um grupo (C1-C4)alquila;
[0041] ou um dos seus sais; o dito composto de fórmula (I) estando em todas as formas de isômeros racêmicos, enantioméricos e diastereoisoméricos.
[0042] Após extensa pesquisa, o inventor descobriu que esses compostos de fórmula (I) atuam como inibidores seletivos e eficazes da atividade da Caspase-2, como demonstrado nos exemplos a seguir.
[0043] De fato, os compostos da presente invenção são muito mais eficientes para inibir a Caspase-2 do que para inibir a Caspase-3.
[0044] Em particular, como mostrado nos exemplos a seguir, alguns compostos da invenção exibem um efeito inibitório na Caspase-2 pelo menos duas vezes, preferencialmente pelo menos 5 vezes, mais preferencialmente pelo menos 10 vezes e ainda mais preferencialmente pelo menos 15 vezes maior do que seu efeito inibitório sobre a Caspase-
3.
[0045] O efeito inibidor dos compostos da invenção em relação à Caspase-2 e Caspase-3 pode ser avaliado por abordagens cinéticas usando Caspases recombinantes humanas. Para inibidores irreversíveis, a proporção entre kinact/Ki é determinada usando o método descrito no exemplo 2. Para inibidores reversíveis, são determinadas a IC50 e ki.
[0046] Além disso, o fato de que alguns desses inibidores são irreversíveis é muito vantajoso, já que esse tipo de inibidor pode ser usado na supressão prolongada da Caspase-2, limitada apenas pela taxa normal de re-sintetização de proteínas, também chamada "turnover".
[0047] No significado da presente invenção:
[0048] - Um "inibidor da Caspase" pretende significar um composto que reduz ou suprime a atividade da Caspase alvo, em comparação com a dita atividade determinada sem o dito inibidor.
[0049] - Um "inibidor seletivo da Caspase-2" significa um composto que diminui a atividade da Caspase-2 mais do que a atividade de outras Caspases, em particular da Caspase-3.
[0050] Assim, de acordo com um segundo aspecto, a invenção é direcionada a um composto da invenção para seu uso como inibidor seletivo da Caspase-2.
[0051] De acordo com uma modalidade, o radical R2 dos compostos da invenção é selecionado a partir de: e
[0052] em que m, p, q, Z5, Z6, Z7, Z8, Z9, Z10 e Z11 são como definidos acima.
[0053] Estes compostos podem ser introduzidos vantajosamente em uma composição farmacêutica. Estes compostos podem ser usados como um medicamento. Mais particularmente, eles podem ser usados na prevenção e/ou tratamento de doenças e/ou lesões nas quais a atividade da Caspase-2 está implicada.
[0054] Para os propósitos da presente invenção, a expressão "prevenção" significa pelo menos reduzir parcialmente o risco de manifestação de um determinado fenômeno, isto é, na presente invenção, uma doença e/ou lesão na qual a atividade da Caspase-2 está implicada. Uma redução parcial implica em que o risco permanece, mas em menor grau do que antes da implementação da invenção.
[0055] Para os propósitos da presente invenção, a expressão "tratamento" pretende significar a cura total ou parcial de um determinado fenômeno, isto é, na presente invenção, uma doença e/ou lesão na qual a atividade da Caspase-2 está implicada, incluindo diminuir, minimizar ou reduzir o dito fenômeno.
[0056] Assim, de acordo com um terceiro aspecto, a invenção é direcionada para uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um composto da invenção em que R2 é como definido acima e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0057] De acordo com um quarto aspecto, a invenção é direcionada a um composto da invenção em que R2 é como definido acima, para seu uso como medicamento.
[0058] De acordo com um quinto aspecto, a invenção é direcionada para um composto da invenção em que R2 é como definido acima, para seu uso na prevenção e/ou tratamento de doenças e/ou lesões nas quais a atividade da Caspase-2 está implicada.
[0059] De acordo com um sexto aspecto, a invenção é direcionada para um composto da invenção em que R2 é como definido acima, para seu uso na proteção de células neuronais contra a disfunção ou toxicidade induzida por Aβ, mais particularmente contra a morte celular induzida por Aβ, degeneração axonal induzida por Aβ, disfunção eletrofisiológica induzida por Aβ e/ou perda de sinapse induzida por Aβ.
[0060] De acordo com outra modalidade, o radical R2 dos compostos da invenção é selecionado a partir de: e
[0061] Estes compostos podem vantajosamente ser usados como uma sonda baseada em atividade para detectar seletivamente a atividade da Caspase-2.
[0062] Assim, de acordo com um sexto aspecto, a invenção é direcionada ao uso de um composto da invenção em que R2 é como definido acima, como uma sonda baseada em atividade para detectar seletivamente a atividade da Caspase-2.
[0063] No contexto da presente invenção, são usadas as seguintes abreviações e fórmulas empíricas: - Boc Terc-Butiloxicarbonila - °C Graus Celsius - Me Metila - Bn Benzila - AMC 7-amino-4-metilcumarina - PBS Salina tamponada com fosfato - Ac Acetila - RFU Unidades Relativas de Fluorescência - HEPES Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinisulfônico
- DTT Ditiotreitol - EDTA Ácido etilenodiaminotetraacético - CHAPS (3-((3-colamidopropil) dimetilamônio)-1- propanossulfonato) - DMSO Dimetilsulfóxido
[0064] Deverá ser observado ainda que em todas as sequências similares a aminoácido que são representadas na presente invenção, usando as abreviações acima mencionadas, a orientação à esquerda e à direita está na direção convencional da terminação amino para a terminação carboxila.
[0065] Consequentemente, parece claramente que, em uma fórmula que define uma estrutura similar a um peptídeo de acordo com a invenção, quando uma sequência como R1-P5P4P3- ou -P1-R2 é indicada:
[0066] - a parte do resíduo de aminoácido P5 ou do resíduo similar a um aminoácido está ligada a R1;
[0067] - um resíduo similar a aminoácido P4 está ligado ao resíduo de aminoácido P5 ou resíduo similar a um aminoácido;
[0068] - um resíduo de aminoácido P3 está ligado ao resíduo de aminoácido P4; e
[0069] - um resíduo similar a aminoácido P1 está ligado a em oposição a R2 como representado na fórmula (I); e
[0070] (ii) a parte do resíduo de aminoácido P5 ou do resíduo similar a um aminoácido está ligada ao resíduo similar a aminoácido P4;
[0071] - o resíduo similar a aminoácido P4 está ligado ao resíduo de aminoácido P3;
[0072] - o resíduo de aminoácido P3 está ligado ao em oposição ao resíduo similar a aminoácido P4 como representado na fórmula (I); e
[0073] - o resíduo de aminoácido P1 está ligado está ligado a R2.
[0074] Outras características e vantagens da invenção emergirão mais claramente a partir da descrição e dos exemplos que se seguem dados a título de ilustração não limitante.
FIGURA
[0075] Figura 1: Proteção da sinapse contra a toxicidade dos oligômeros do peptídeo Amiloide beta [1-42] com o composto 2. Co: controle; [Aβ]n: Neurônios intoxicados com os oligômeros do peptídeo Amiloide beta [1-42], 10 nM; Aβ: Neurônios incubados com Amiloide beta não oligomérico (não tóxico), 10 nM; 2a: Neurônios intoxicados com os oligômeros do peptídeo Amiloide beta [1-42], 10 nM, mas pré- tratados com o enantiômero do composto 2 em 0,1 µM ou 1 µM (** p<0,01 teste post hoc de Kruskall-Wallis Dunn)).
COMPOSTOS DA INVENÇÃO
[0076] Como mencionado acima, os compostos de acordo com a invenção correspondem a fórmula geral (I):
[0077] em que:
[0078] ● Z1 e Z2, idênticos ou diferentes, são selecionados entre um átomo de hidrogênio, um grupo (C1-C6)alquila ou (C1-C6)alcoxila;
[0079] – P5 é selecionado entre os seguintes resíduos de aminoácidos ou estruturas similares a aminoácidos:
[0080] – P1 e P4, idênticos ou diferentes, são selecionados entre as seguintes estruturas similares a aminoácidos: e
[0081] em que Z3 e Z4, idênticos ou diferentes, são selecionados entre um átomo de hidrogênio e um grupo (C1-C6)alquila;
[0082] – P3 é selecionado entre os seguintes resíduos de aminoácidos: e
[0083] – R1 é selecionado entre:
e
[0084] em que:
[0085] ● m é 0, 1 ou 2;
[0086] ● p é 1, 2, 3 ou 4;
[0087] ● Z5 é um átomo de halogênio;
[0088] ● q é 0 ou 1;
[0089] ● Z6 é selecionado entre um grupo (C1-C6)alquila e um grupo fenila, o dito grupo fenila sendo opcionalmente substituído por um grupo amino;
[0090] ● Z7, Z8 e Z11, idênticos ou diferentes, são selecionados entre um átomo de hidrogênio, um grupo (C1-C4)alquila, uma tetraidroquinolinila e um grupo –(CH2)i-arila com i sendo 0, 1 ou 2, o dito grupo arila sendo opcionalmente substituído por um, dois, três ou quatro átomos de halogênio ou um grupo (C1-C4)alquila; e
[0091] ● Z9 e Z10, idênticos ou diferentes, são selecionados entre um átomo de hidrogênio e um grupo (C1-C4)alquila;
[0092] ou um dos seus sais;
[0093] o dito composto de fórmula (I) estando em todas as formas de isômeros racêmicos, enantioméricos e diastereoisoméricos.
[0094] Em uma modalidade específica, o átomo de carbono assimétrico do anel de pirrolidina ligado a está na configuração (S) e os outros carbonos alfa assimétricos de P1, P3, P4 e P5 similares a aminoácido estão na configuração (S).
[0095] Em uma modalidade específica, o átomo de carbono assimétrico do anel de pirrolidina ligado a está na configuração (R) e os outros carbonos alfa assimétricos de P1, P3, P4 e P5 similares a aminoácido estão na configuração (S).
[0096] Consequentemente, os compostos da invenção compreendem vários átomos de carbono assimétrico. Assim, eles podem existir na forma de enantiômeros ou diastereoisômeros. Estes enantiômeros e diastereoisômeros, e também as suas misturas, incluindo misturas racémicas, fazem parte da invenção.
[0097] Os compostos da invenção também podem existir na forma de bases ou de sais de adição de ácido. Estes sais podem ser preparados com ácidos farmaceuticamente aceitáveis, mas os sais de outros ácidos que são úteis, por exemplo, para purificar ou isolar os compostos de fórmula (I) também fazem parte da invenção.
[0098] A expressão "farmaceuticamente aceitável" significa o que é útil na preparação de uma composição farmacêutica geralmente segura, não tóxica e nem biologicamente e nem de outro modo indesejável e inclui o que é aceitável para uso farmacêutico veterinário assim como humano.
[0099] Os compostos da invenção também podem existir na forma de hidratos ou solvatos, isto é, na forma de associações ou combinações com uma ou mais moléculas de água ou com um solvente. Tais hidratos e solvatos também fazem parte da invenção.
[00100] No contexto da presente invenção, são aplicadas as seguintes definições:
[00101] - um átomo de halogênio: um átomo de flúor, cloro, bromo ou iodo. Os átomos de halogênio podem ser mais particularmente átomos de flúor.
[00102] - Ct-Cz: cadeia à base de carbono que contém possivelmente de t a z átomos de carbono nos quais t e z podem assumir valores de 1 a 10; por exemplo, C1-C3 é uma cadeia baseada em carbono possivelmente contendo de 1 a 3 átomos de carbono.
[00103] - uma alquila: um grupo alifático saturado linear ou ramificado, que compreende em particular a forma 1 a 6 átomos de carbono. Exemplos que podem ser mencionados incluem metila, etila, n-propila, isopropila butila, isobutila, terc-butila, pentila, neopentila etc.
[00104] - uma alcoxila: um radical -O-alquila no qual o grupo alquila é como definido precedentemente.
[00105] - uma arila: um grupo aromático monocíclico ou bicíclico que contém entre 5 e 10 átomos de carbono, em particular entre 6 e 10 átomos de carbono. Como exemplos de um grupo arila, pode ser feita menção ao grupo fenila ou naftila. Preferivelmente, o grupo arila é fenila.
[00106] Entre os compostos da fórmula geral (I) de acordo com a invenção, um subgrupo de compostos é constituído pelos compostos da fórmula (II).
[00107] em que
[00108] R1 e R2 são como definidos na fórmula (I);
[00109] Z1 e Z2 são como definidos na fórmula (I);
[00110] R3 é selecionado entre um grupo –CH3, –CH(CH3)2, - CH2CH(CH3)2, –CH(CH3)CH2CH3 e 4-hidroxifenila;
[00111] A e B, idênticos ou diferentes, são selecionados entre um átomo de nitrogênio e um grupo -CH-;
[00112] R5 e R6, idênticos ou diferentes, são selecionados entre um átomo de hidrogênio e um grupo a (C1-C6)alquila; e
[00113] R4 é selecionado entre um grupo –CH3, –CH(CH3)2, – CH2CH(CH3)2, a–CH(CH3)CH2CH3 e –(CH2)2CO2H;
[00114] ou um dos seus sais;
[00115] o dito composto de formula (II) estando em todas as formas possíveis de isômero racêmico, enantiomérico e diastereoisomérico.
[00116] Em uma modalidade específica, o átomo de carbono assimétrico do anel de pirrolidina ligado a está na configuração (S) e os outros carbonos alfa assimétricos de P1, P3, P4 e P5 similares a aminoácido estão na configuração (S).
[00117] Em uma modalidade específica, o átomo de carbono assimétrico do anel de pirrolidina ligado a está na configuração (R) e os outros carbonos alfa assimétricos de P1, P3, P4 e P5 similares a aminoácido estão na configuração (S).
[00118] Preferivelmente na fórmula (II), pelo menos um de A e B é um grupo -CH, mais preferivelmente A e B são grupos -CH.
[00119] De acordo com um modo preferido da invenção, os compostos de acordo com a invenção podem ser da fórmula (III):
[00120] em que R1 e R2 são como definidos na fórmula (I);
[00121] ou um de seus sais; o dito composto de fórmula (III) estando em todas as formas de isômeros racêmicos, enantioméricos e diastereoisoméricos.
[00122] De acordo com outra modalidade preferida, na fórmula (I), (II) e/ou (III), R1 é:
[00123] De acordo com outra modalidade preferida, na fórmula (I), (II) e/ou (III), R1 é:
[00124] De acordo com outra modalidade preferida, na fórmula (I), (II) e/ou (III), R2 é selecionado entre: e
[00125] em que Z’ é um átomo de flúor e j é 0, 1 ou 2.
[00126] Preferivelmente, R2 é:
[00127] Em uma modalidade específica, quando R2 é uma metoxifenila como definida acima, o anel de fenila é substituído por 2, 3, 4 ou 5 átomos de halogênio, preferivelmente o dito halogêneo é selecionado entre átomos de flúor ou cloro.
[00128] De acordo com uma modalidade preferida, os compostos de acordo com a invenção têm pelo menos um, preferivelmente pelo menos três átomos de carbono assimétricos de configuração (S).
[00129] Em uma modalidade específica, o átomo de carbono assimétrico do anel de pirrolidina ligado a está na configuração (S) e os outros carbonos alfa assimétricos de aminoácidos como P1, P3, P4 e P5 estão na configuração (S).
[00130] Mais preferivelmente, todos os átomos de carbono assimétrico dos compostos de acordo com a invenção estão na configuração (S).
[00131] Ainda em uma modalidade particular, o átomo de carbono assimétrico do anel de pirrolidina ligado à está na configuração (R) e os outros carbonos alfa assimétricos de aminoácidos como P1, P3, P4 e P5 estão na configuração (S).
[00132] Entre os compostos da fórmula geral (I) de acordo com a invenção, pode ser feita menção especial aos seguintes compostos:
NOME ESTRUTURA / Composto No IUPAC ácido (S)-3-((S)-2-acetamido-3- metilbutanamido)-4-(((S)-1- ((2S,3S)-2-(((S)-3-carbóxi-1-((4- metil-2-oxo-2H-cromen-7- il)amino)-1-oxopropan-2- il)carbamoil)-3- neopentilpirrolidin-1-il)-3-metil- 1 1-oxobutan-2-il)amino)-4- oxobutanoico ácido (S)-4-(((S)-1-((2S,3S)-2- (2-(carboximetil)-2-(2-(2,6- difluorofenoxi)acetil)hidrazino carbonil)-3-neopentilpirrolidin-1- il)-3-metil-1-oxobutan-2- il)amino)-3-((S)-3-metil-2-
2 (quinolino-2- carboxamido)butanamido)-4- oxobutanoico ácido (S)-4-(((S)-1-((2S,3S)-2- (((S)-3-carbóxi-1-oxo-1-(tiazol- 5-ilmetoxi)propan-2- il)carbamoil)-3- neopentilpirrolidin-1-il)-3-metil- 1-oxobutan-2-il)amino)-3-((S)-3- metil-2-(quinolino-2- 3 carboxamido)butanamido)-4- oxobutanoico ácido (S)-4-(((S)-1-((2S,3S)-2- (2-(carboximetil)-2-(2-(2,6- difluorofenoxi)acetil)hidrazino carbonil)-3-neopentilpirrolidin-1- il)-3-metil-1-oxobutan-2- il)amino)-3-((S)-3-metil-2- (quinolino-2- 4 carboxamido)butanamido)-4- oxobutanoico
NOME ESTRUTURA / Composto No IUPAC ácido (S)-4-(((S)-1-((2S,3S)-2- (2-((E)-4-(benzil(metil)amino)-4- oxobut-2-enoil)-2- (carboximetil)hidrazinocarbonil)- 3-neopentilpirrolidin-1-il)-3- metil-1-oxobutan-2-il)amino)-3- 5 ((S)-3-metil-2-(quinolino-2- carboxamido)butanamido)-4- oxobutanoico ácido (S)-3-(2-((2-(tert- butil)fenil)amino)-2- oxoacetamido)-4-(((S)-1- ((2S,3S)-2-(2-(carboximetil)-2- (2-(2,6- difluorofenoxi)acetil)hidrazino carbonil)-3-neopentilpirrolidin-1- 6 il)-3-metil-1-oxobutan-2- il)amino)-4- oxobutanoico
[00133] Consequentemente, em uma modalidade particular, um composto de acordo com a invenção é selecionado entre os compostos 1 a 6 indicados acima.
PREPARAÇÃO DOS COMPOSTOS DE INVENÇÃO
[00134] Os compostos da invenção podem ser preparados por síntese orgânica e peptídica. A montagem da estrutura por síntese peptídica pertence ao conhecimento geral daquele versado na técnica e detalhes adicionais são descritos em Linton et al., J. Med. Chem. 2005, 48, 6779-6782 e em Chauvier et al. Cell Death Dis 2011, 2: e203. Os precursores de R1, R2, P1, X, P3, P4 e P5 que conduzem aos compostos da invenção são introduzidos nas diferentes etapas do processo.
[00135] O precursor pode ser um produto comercial ou um produto comercial que tenha sido funcionalizado de acordo com protocolos conhecidos para aquele versado na técnica. Mais detalhes e referências podem ser obtidas em "Design of Caspase inhibitors as potential clinical agents; CRC press; CRC Enzyme inhibitors series, Edited by Tom O'Brien & Steven D. Linton chapter 7 by BR Ullman".
[00136] Em particular, o exemplo 1 da presente invenção ilustra o protocolo de preparação do composto 2 de acordo com a invenção.
APLICAÇÕES
[00137] Como especificado precedentemente e claramente ilustrado pelos exemplos a seguir, os compostos de acordo com a presente invenção são úteis como inibidores seletivos da Caspase-2.
[00138] De fato, como apontado pelos exemplos, eles mostram um efeito inibitório muito melhor para a Caspase-2 do que para a Caspase- 3, apesar dessas duas terem o sítio ativo mais similar entre todas as caspases. Como consequência, são eficientes para inibir seletivamente a Caspase 2. a) Campo terapêutico
[00139] Em vista do exposto, os compostos da presente invenção e, mais particularmente, os compostos para os quais o radical R2 é selecionado entre: e
[00140] em que m, p, q, Z5, Z6, Z7, Z8, Z9, Z10 e Z11 são como definidos acima, podem ser usados no campo terapêutico.
[00141] De acordo com um de seus aspectos, a presente invenção refere-se portanto, a um composto da invenção em que R2 é como definido acima, para seu uso como medicamento, em particular um medicamento destinado a inibir seletivamente a atividade da Caspase-
2.
[00142] Em outros termos, a invenção refere-se ao uso de um composto de acordo com a invenção em que R2 é como definido acima para a preparação de um medicamento, em particular de um medicamento para inibir seletivamente a atividade da Caspase-2.
[00143] Em outras palavras, a presente invenção refere-se a um medicamento que compreende pelo menos um composto de acordo com a invenção em que R2 é como definido acima, em particular um medicamento para inibir seletivamente a atividade da Caspase-2.
[00144] Assim, de acordo com outro de seus aspectos, a invenção é direcionada a um composto da invenção em que R2 é como definido acima, para seu uso na prevenção e/ou tratamento de doenças e/ou lesões nas quais a atividade da Caspase-2 está implicada.
[00145] Em outros termos, a invenção refere-se ao uso de um composto de acordo com a invenção em que R2 é como definido acima para a preparação de um medicamento destinado a prevenir e/ou tratar doenças e/ou lesões nas quais a atividade da Caspase-2 está implicada.
[00146] Em particular, as ditas doenças e/ou lesões podem ser selecionadas entre patologias com morte celular, particularmente entre:
[00147] - doenças degenerativas crônicas, tais como doença de Alzheimer ou outras Taupatias, doença de Huntington e doença de Parkinson;
[00148] - dano cerebral neonatal, em particular isquemia cerebral neonatal;
[00149] – lesão traumática do crânio;
[00150] - isquemia renal;
[00151] - lesões por hipoxia-isquemia (H-I);
[00152] – lesões cerebrais similares a acidentes vasculares cerebrais;
[00153] - isquemia cardíaca;
[00154] - infarto do miocárdio;
[00155] - esclerose lateral amiotrófica (ELA);
[00156] - danos na retina;
[00157] - doenças oftálmicas, tais como lesão ocular contundente, neuropatia óptica isquêmica e glaucoma;
[00158] - danos à pele;
[00159] - doenças inflamatórias estéreis como diabetes, aterosclerose, isquemia cardíaca, gota, pseudogota, afrouxamento das articulações, aterosclerose, síndromes desencadeadas por sais de alumínio, neuropatia óptica isquêmica não arterítica (NAION), glaucoma e doenças metabólicas;
[00160] - doenças inflamatórias não estéreis, como infecção bacteriana, em particular por bactérias produtoras de toxinas formadoras de poros, infecção pelo vírus influenza e infecção por RNA de cadeia simples (ss) de Rhabdoviridae, tal como o vírus Maraba ou vírus da estomatite vesicular (VSV);
[00161] - doenças causadas por bactérias patogênicas, tais como Brucella, Staphylococcus aureus e Salmonella;
[00162] - dislipidemias;
[00163] - obesidade;
[00164] - síndrome metabólica; e
[00165] - doença hepática gordurosa não alcoólica.
[00166] Mais particularmente, as ditas doenças e/ou lesões são selecionadas a partir de doenças neurodegenerativas crônicas. Preferivelmente, elas são escolhidas entre a doença de Alzheimer, outras taupatias conhecidas (como taupatia primária relacionada à idade, encefalopatia traumática crônica, paralisia supranuclear progressiva, degeneração cortico-basal, demência fronto-temporal, parkinsonismo associado ao cromossomo 17, doença de Lytico-Bodig, ganglioglioma e gangliocitoma, meningeoangiomatose, parkinsonismo pós-encefalítico, pan-encefalite esclerosante subaguda, encefalopatia por chumbo, esclerose tuberosa, neurodegeneração associada a antotenato quinase, lipofuscinose), doença de Huntington e doença de Parkinson, mais especificamente a doença de Alzheimer.
[00167] De acordo com outro aspecto, a invenção é direcionada a um composto da invenção em que R2 é como definido acima, para uso em sinaptoproteção, mais particularmente na prevenção e/ou tratamento de doenças neurodegenerativas, ainda mais particularmente na doença de Alzheimer ou nas taupatias.
[00168] Em uma modalidade da invenção, a invenção é direcionada a um composto selecionado entre o composto 2, composto 3, composto 4, composto 5 e/ou composto 6, como definido acima para seu uso na prevenção e/ou tratamento da doença de Alzheimer ou outras Taupatias.
[00169] Em uma modalidade adicional, a invenção é direcionada ao composto 2 como definido acima para seu uso na prevenção e/ou tratamento da doença de Alzheimer ou outras Taupatias.
[00170] Em uma modalidade adicional, a invenção é direcionada ao composto 3 como definido acima para seu uso na prevenção e/ou tratamento da doença de Alzheimer ou outras Taupatias.
[00171] Em uma modalidade adicional, a invenção é direcionada ao composto 4, como definido acima, para seu uso na prevenção e/ou tratamento da doença de Alzheimer ou outras Taupatias.
[00172] Em uma modalidade adicional, a invenção é direcionada ao composto 5 como definido acima para a seu uso na prevenção e/ou tratamento da doença de Alzheimer ou outras Taupatias.
[00173] Em uma modalidade adicional, a invenção é direcionada ao composto 6 como definido acima para seu uso na prevenção e/ou tratamento da doença de Alzheimer ou outras Taupatias.
[00174] Em uma modalidade particular, a presente invenção refere- se a um composto como definido acima para seu uso na prevenção e/ou tratamento da doença de Alzheimer.
[00175] Em uma modalidade da invenção, a invenção é direcionada a um composto selecionado entre o composto 2, composto 3, composto 4, composto 5 e/ou composto 6 como definido acima para seu uso na prevenção e/ou tratamento da doença de Alzheimer.
[00176] Em uma modalidade adicional, a invenção é direcionada ao composto 2 como definido acima para seu uso na prevenção e/ou tratamento da doença de Alzheimer.
[00177] Em uma modalidade adicional, a invenção é direcionada ao composto 3 como definido acima para seu uso na prevenção e/ou tratamento da doença de Alzheimer.
[00178] Em uma modalidade adicional, a invenção é direcionada ao composto 4, como definido acima, para seu uso na prevenção e/ou tratamento da doença de Alzheimer.
[00179] Em uma modalidade adicional, a invenção é direcionada ao composto 5 como definido acima para seu uso na prevenção e/ou tratamento da doença de Alzheimer.
[00180] Em uma modalidade adicional, a invenção é direcionada ao composto 6 como definido acima para seu uso na prevenção e/ou tratamento da doença de Alzheimer.
[00181] Ainda mais particularmente, como mostrado na seção experimental, o composto da invenção em que R2 é como definido acima é eficaz na proteção de células neuronais da disfunção ou toxicidade induzida por oligômero de Aβ.
[00182] Consequentemente, de acordo com um aspecto adicional, a invenção é direcionada a um composto da invenção em que R2 é como definido acima, para seu uso na proteção de células neuronais da disfunção ou toxicidade induzida por Aβ, mais particularmente contra a morte celular induzida por Aβ, degeneração axonal induzida Aβ, disfunção eletrofisiológica induzida por Aβ e/ou perda de sinapse induzida por Aβ.
[00183] Em uma modalidade da invenção, a invenção é direcionada a um composto selecionado entre composto 2, composto 3, composto 4, composto 5 e/ou composto 6 como definido acima para seu uso na proteção de células neuronais da disfunção ou toxicidade induzida por Aβ, mais particularmente contra morte celular induzida por Aβ, degeneração axonal induzida por Aβ, disfunção eletrofisiológica induzida por Aβ e/ou perda de sinapse induzida por Aβ.
[00184] Em uma modalidade adicional, a invenção é direcionada ao composto 2 como definido acima para seu uso na proteção de células neuronais da disfunção ou toxicidade induzida por Aβ, mais particularmente contra a morte celular induzida por Aβ, degeneração axonal induzida por Aβ, degeneração axonal induzida por Aβ, eletrofisiológica induzida por Aβ disfunção e/ou perda de sinapse induzida por Aβ.
[00185] Em uma modalidade adicional, a invenção é direcionada ao composto 3 como definido acima para seu uso na proteção de células neuronais da disfunção ou toxicidade induzida por Aβ, mais particularmente contra a morte celular induzida por Aβ, degeneração axonal induzida por Aβ, degeneração axonal induzida por Aβ, eletrofisiológica induzida por Aβ disfunção e/ou perda de sinapse induzida por Aβ.
[00186] Em uma modalidade adicional, a invenção é direcionada ao composto 4 como definido acima para seu uso na proteção de células neuronais da disfunção ou toxicidade induzida por Aβ, mais particularmente contra a morte celular induzida por Aβ, degeneração axonal induzida por Aβ, degeneração axonal induzida por Aβ, eletrofisiológica induzida por Aβ disfunção e/ou perda de sinapse induzida por Aβ.
[00187] Em uma modalidade adicional, a invenção é direcionada ao composto 5 como definido acima para seu uso na proteção de células neuronais da disfunção ou toxicidade induzida por Aβ, mais particularmente contra a morte celular induzida por Aβ, degeneração axonal induzida por Aβ, degeneração axonal induzida por Aβ, eletrofisiológica induzida por Aβ disfunção e/ou perda de sinapse induzida por Aβ.
[00188] Em uma modalidade adicional, a invenção é direcionada ao composto 6 como definido acima para seu uso na proteção de células neuronais da disfunção ou toxicidade induzida por Aβ, mais particularmente contra a morte celular induzida por Aβ, degeneração axonal induzida por Aβ, degeneração axonal induzida por Aβ, eletrofisiológica induzida por Aβ disfunção e/ou perda de sinapse induzida por Aβ.
[00189] De acordo com ainda outro de seus aspectos, a invenção é direcionada a um método para prevenir e/ou tratar doenças e/ou lesões, nas quais a atividade da Caspase-2 está implicada, compreendendo pelo menos uma etapa de administração a um indivíduo necessitado de pelo menos uma quantidade eficaz de pelo menos um composto de acordo com a invenção, em que R2 é como definido acima.
[00190] De acordo com outro de seus aspectos, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um composto de acordo com a invenção em que R2 é como definido acima e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00191] As composições farmacêuticas da invenção podem conter mais particularmente uma dose eficaz de pelo menos um composto de acordo com a invenção em que R2 é como definido acima.
[00192] Uma "dose eficaz" significa uma quantidade suficiente para induzir uma modificação positiva na condição ou lesão a ser regulada ou tratada, mas baixa o suficiente para evitar efeitos colaterais graves. Uma dose eficaz pode variar com o efeito farmacêutico para obter ou com a condição particular que está sendo tratada, a idade e a condição física do usuário final, a gravidade da condição ou lesão que está sendo tratada/evitada, a duração do tratamento, a natureza da outros tratamentos, o composto ou composição específico usado, a via de administração e fatores similares.
[00193] Um composto de fórmula (I) de acordo com a invenção em que R2 é como definido acima pode ser administrado em uma dose eficaz por qualquer um dos modos de administração aceitos na técnica.
[00194] Em uma modalidade, este composto pode ser usado em uma composição destinada a ser administrada por via oral, nasal, sublingual, oftalmológica, tópica, retal, vaginal, uretral ou parenteral.
[00195] A via de administração e a formulação galênica serão adaptadas por aquele versado na técnica de acordo com o efeito farmacêutico desejado.
[00196] Aquele versado na técnica das formulações terapêuticas será capaz, sem experimentação indevida e com base no conhecimento pessoal, de determinar uma dose terapeuticamente eficaz de um composto da invenção para uma determinada indicação.
[00197] Uma composição farmacêutica da invenção pode ser formulada com qualquer excipiente farmaceuticamente aceitável conhecido de acordo com a dose, a forma galênica, a via de administração e similares.
[00198] Como usado aqui, "excipientes farmaceuticamente aceitáveis" incluem todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e agentes que retardam a absorção e similares. Exceto na medida em que qualquer excipiente convencional seja incompatível com os compostos ativos, está contemplada o seu uso em um medicamento ou composição farmacêutica da invenção.
[00199] Um medicamento ou composição farmacêutica da invenção pode estar na forma de comprimidos, pílulas, pós, pastilhas, sachês, elixires, suspensões, emulsões, soluções, xaropes, aerossóis, sprays, unguentos, géis, cremes, bastões, loções, pastas, cápsulas de gelatina mole e dura, supositórios, soluções injetáveis estéreis, pós em embalagens estéreis e similares.
[00200] De acordo com uma modalidade, uma composição farmacêutica da invenção pode ser pretendida para ser administrada separadamente, sequencialmente ou simultaneamente com um agente útil para a prevenção e/ou o tratamento de uma condição de doença, em particular a doença de Alzheimer, sendo o dito agente diferente do composto de fórmula (I) da invenção. b) Atividade baseada em sonda
[00201] Os compostos da presente invenção e, mais particularmente, os compostos para os quais o radical R2 é selecionado entre: e podem ser usados como sondas baseadas na atividade para detectar seletivamente a atividade de Caspase-2.
[00202] Assim, de acordo com um de seus aspectos, a presente invenção refere-se ao uso de um composto de acordo com a invenção em que R2 é como definido acima, como sonda baseada em atividade
(ABP) para detectar seletivamente a atividade da Caspase-2.
[00203] A presente invenção será melhor compreendida com referência aos exemplos a seguir, que são fornecidos apenas para fins ilustrativos e não devem ser interpretados como limitantes de qualquer maneira à presente invenção.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: preparação do composto 2 de acordo com a invenção
[00204] A síntese dos compostos de acordo com a invenção é inspirada no processo de preparação do composto TRP601 representado abaixo:
[00205] A síntese de TRP601 é descrita em D. Chauvier et al., Cell Death and Disease (2011) 2, e203.
[00206] Por exemplo, o Composto 2 da presente invenção difere de TRP601 pelo fato de que:
[00207] - P1 e P4 são representados por ao invés de em TRP01; e
[00208] – O resíduo similar à prolina é usado ao invés de em TRP601.
[00209] O composto 2 é assim obtido pela reprodução das etapas descritas no artigo mencionado acima para levar a TRP601, exceto que:
[00210] – o precursor foi usado ao invés de para introduzir os radicais P1 e P4; e
[00211] – o precursor foi usado ao invés de para introduzir o radical similar à prolina com a configuração (R ou S) do átomo de carbono assimétrico do anel de pirrolidina ligado a .
[00212] O precursor de P1 e P4 foi preparado a partir do ácido (S)- aspártico disponível comercialmente, no qual a função amina foi protegida por um grupo Boc, de acordo com um protocolo bem conhecido por aquele versado na técnica.
[00213] O precursor da prolina foi obtido de acordo com o descrito por Maillard et al, em Bioorganic & Medicinal Chemistry 19 (2011): 5833-
5851.
[00214] Os outros blocos de construção do composto 2 foram introduzidos da mesma maneira como para TRP601 nas publicações mencionadas acima, isto é, com os mesmos reagentes, nas mesmas condições e com as mesmas quantidades.
[00215] O composto 2 foi assim obtido com um rendimento superior a 90% e caracterizado por HPLC, com a configuração (R ou S) do átomo de carbono assimétrico do anel de pirrolidina ligado a . EXEMPLO 2: Ensaios de inibição da Caspase-2 e Caspase-3 (in vitro) para inibidores irreversíveis
[00216] A eficiência inibidora dos compostos da invenção que são inibidores irreversíveis da Caspase-2 e Caspase-3 pode ser avaliada usando o protocolo explicado abaixo. O composto 2, assim como os compostos 4, 5, 6 são inibidores irreversíveis e foram consequentemente avaliados.
[00217] A eficiência do composto comparativo ∆2Me-TRP601, que é um inibidor da Caspase do grupo II já conhecido (inibidor da Caspase- 2, Caspase-3 e Caspase-7), foi avaliada por um protocolo similar descrito em Chauvier et al, 2011 Cell Death Dis 2011, 2: e203.
[00218] Estes compostos testados estão representados abaixo: Composto 2
∆2Me-TRP601 (composto comparativo)
[00219] Neste exemplo, a Caspase-2 e Caspase-3 são enzimas ativas recombinantes humanas que são fornecidas respectivamente por Enzo Life® (ALX-201-057-U100) e R&D Systems® (707-C3 -010/CF).
[00220] A Caspase-2 é usada em uma concentração final de 0,1 nM em um "tampão de Caspase-2" que contém HEPES 20 mM (pH 7,4), DTT 5 mM, EDTA 2 mM, EDTA 2 mM, CHAPS 0,1% e succinato 800 mM. A Caspase-3 é usada em uma concentração final de 0,5 nM em um "tampão de Caspase-3" que contém HEPES 20 mM (pH 7,4), CHAPS 0,1%, DTT 5 mM e EDTA 2 mM.
[00221] Os substratos peptídicos usados para as medidas da atividade enzimática são Ac-DEVD-AMC e Ac-VDVAD-AMC comercializadas pela EnzoLife® (respectivamente referenciados como ALX-260-031 -M005 e ALX-260-060-M005). Eles são fluorogênicos devido à presença de seu grupo terminal AMC (7-amino-4- metilcumarina). A liberação de AMC permite acompanhar a atividade enzimática em unidades de fluorescência RFU ao longo do tempo em uma microplaca de 96 poços.
[00222] Os valores de fluorescência são medidos a 37°C com um espectrofluorômetro com um leitor de microplacas BMG FLUOstar OPTIMA. Este aparelho é orientado pelo programa Biolise® e é equipado com um dispositivo de resfriamento termoelétrico pelo efeito de Peltier. As análises matemáticas dos dados experimentais são feitas com o programa Kaleidagraph®.
[00223] As propriedades inibidoras dos compostos testados são avaliadas pela determinação da proporção entre kinact/KI em relação à Caspase-2 ou Caspase-3, em que:
[00224] - kinact é a constante da taxa de inativação máxima, e
[00225] - KI é a constante de dissociação de acordo com: complexo covalente inativo que reflete a afinidade do inibidor com relação à enzima.
[00226] Assim, quanto maior a proporção, mais eficiente é o inibidor.
[00227] A dita proporção é medida de acordo com o método contínuo (Allison RD. Curr Protoc Protein Sci. 2001 Maio; Capítulo 3: Unit 3.5.; Chauvier et al., 2011 Cell Death Dis 2: e203; Tan et al., J. Med. Chem. 2015, 58: 598-312).
[00228] Resumidamente, as atividades das Caspases foram determinadas pelo monitoramento da hidrólise de substratos fluorogênicos (λexc = 355 nm, λem = 460 nm) como uma função do tempo, na presença de Caspases não tratadas (controle) ou Caspases que foram incubadas com um composto de teste, por 30 min no mínimo a 37°C usando um leitor de microplacas BMG Fluostar (microplacas pretas de 96 poços) e a velocidade inicial (V0) foi determinada a partir da porção linear da curva de progresso.
[00229] Substratos e compostos foram previamente dissolvidos em DMSO a 10 mM, com a concentração final de solvente mantida abaixo de 4% (v/v). V0, velocidades relativas, KM e IC50 foram determinadas a partir de dados experimentais usando os programas Mars data Analysis
2.0 e Kaleidagraph.
[00230] Para inibidores irreversíveis como composto 2, a inativação pode ser representada pelo esquema cinético mínimo, onde E e I são as formas livres de enzima e inibidor, E*I uma quimera cinética do complexo de Michaelis e E-I o complexo covalente ou enzima inativada.
[00231] Os parâmetros de afinidade de ligação ao inibidor (constante de dissociação, KI) e constante de taxa de primeira ordem (k3) foram determinados para Caspase-2 e Caspase-3 usando o método da curva de progresso. A proporção k3/KI foi obtida ajustando os dados experimentais às equações (F.U., unidade de fluorescência): com e
[00232] Ajustes de regressão linear e não linear de dados experimentais às equações foram realizados com o programa Kaleidagraph.
[00233] Determinação da proporção entre kinact/KI para a atividade da Caspase-2 e Caspase-3
[00234] Um método contínuo de determinação da proporção entre kinact/KI foi usado para avaliar a atividade inibidora dos compostos testados contra Caspase-2 e Caspase-3.
[00235] A mistura de reação é preparada deixando a enzima e o tampão incubados a 37°C.
[00236] Os compostos inibitórios testados são preparados em diferentes concentrações (1/4 IC50; 1/2 C50; IC50; 2 C50; 4 C50) e colocados na microplaca.
[00237] Em seguida, a mistura de reação compreendendo a enzima, o tampão e o substrato é rapidamente adicionada aos poços.
[00238] As atividades da enzima são medidas entre 45 e 60 minutos.
[00239] As curvas de RFU (Unidades Relativas de Fluorescência = f(vezes) são traçadas para cada concentração da molécula testada, de acordo com a seguinte equação: ((((-V0)*(exp(-kobs*m0)))+V0)/kobs*)+RFU0
[00240] em que
[00241] – V0 corresponde à taxa inicial (RFU.s-1) na concentração de 0 do composto inibitório testado;
[00242] - kobs é a constante da taxa de inativação;
[00243] - RFU0 é o valor da fluorescência em t = 0 min; e
[00244] – m0 é a variável, isto é, a concentração do inibidor.
[00245] O ajuste da curva f([I]) = kobs em uma hipérbole usando o programa Kaleidagraph é então realizado a fim de obter a proporção entre kinact/KI com base na seguinte equação: Kobs = kinact x [I] / (KI x [I])
[00246] Para os compostos 2, 3, 5 e 6 e ∆2Me-TRP601, a comparação das proporções entre kinact/KI assim obtidas em relação à caspase 2 e 3 permite apreciar sua seletividade.
Inibidor Seletividade para Caspase 2 Composto 2 sim Composto 4 sim Composto 5 sim Composto 6 sim ∆2Me-TRP-601 não (composto comparativo) Tabela 1
[00247] Os compostos testados são eficientes para inibir a Caspase-2.
[00248] Entretanto, o composto 2 reage totalmente diferente de ∆2Me-TRP-601 com relação à Caspase-3 (veja a Tabela 2 abaixo). Tabela 2 k3/KI (M-1.s-1) Proporção de Casp2 Casp3 seletividade (C2/C3) ∆2Me-TRP-601 1 586 020 1 613 405 0,98 Composto 2 1 894 076 2 625 721 enantiômero a Composto 2 1 720 ND +++ enantiômero b ND: nenhuma atividade inibitória detectada. +++: como nenhuma atividade inibitória é detectável frente a casp3, a seletividade é muito importante (>>1000).
[00249] De fato, o composto 2 é muito mais eficiente para inativar a Caspase-2 do que para inativar a Caspase-3, enquanto que ∆2Me-TRP- 601 não exibe essa seletividade.
[00250] Como conclusão, o composto 2 não é apenas eficiente para inibir a Caspase-2, mas também é seletivo no que diz respeito à Caspase-2 em relação à Caspase-3. É interessante notar que é observado um nível muito diferente de inibição da caspase 2, dependendo da configuração (R ou S) do átomo de carbono assimétrico do anel de pirrolidina ligado a . Assim, os compostos da invenção fornecem inibidores moderados ou fortes, mas altamente específicos, da caspase 2 (Tabela 2), o que é de particular interesse.
EXEMPLO 3: Detecção da atividade da caspase-2 e caspase-3
[00251] Para determinar a eficiência de um substrato em relação a uma caspase individual, medimos a proporção entre kcat/KM que é responsável pela eficiência catalítica, onde kcat (s-1) é a constante catalítica ou o número de moléculas de substrato convertidas em produto por unidade de tempo por cada sítio ativo quando a enzima está saturada e KM é a constante de Michaelis-Menten, que é responsável pela afinidade enzima-substrato, ela representa a concentração de substrato para v = Vmax/2.
[00252] A caspase-2 (ou caspase-3) é incubada apenas com o inibidor ou apenas com tampão, adaptado à enzima e ao complexo de Michaelis-Menten, por 30 minutos a 37°C. A reação é desencadeada, em um volume total de 100 µl, quando a mistura tampão-substrato é adicionada; a atividade enzimática é então medida ao longo de 20 minutos. A liberação do grupo AMC fluorogênico é detectada usando os seguintes comprimentos de onda: λexc = 360 nm e λem = 460 nm. kcat/KM Enzimas Substratos AMC (índice) Casp-2 -AMC Ac-VDVAD- (0,1 nM) ++++ (25 µM) (62 kDa) Caspase-3 -AMC Ac-VDVAD- (0,5 nM) ++++ (10 µM) (60 kDa) Casp-2 Composto 1 (0,1 nM) ++++ (25 µM) (62 kDa) Caspase-3 Composto 1 (0,5 nM) +/- (10 µM) (60 kDa)
: sítio de clivagem da enzima Tabela 3
[00253] A atividade enzimática é caracterizada pelos valores de velocidade inicial (Vi) que são definidos na equação 1 (eq. 1), em que Vmax é a taxa na qual a enzima é saturada com o substrato, [S] é a concentração do substrato. A velocidade inicial, expressa aqui em RFU.min-1, é obtida experimentalmente a partir do valor da inclinação na parte linear da representação: f (tempo) = RFU, um valor calculado diretamente pelo programa Biolise®. Vi = Vmax x [S] / (Km + [S]) (eq.1)
[00254] A velocidade inicial obtida para o controle (V0) é considerada ser de 100% da atividade enzimática. Uma inibição é caracterizada por uma atividade, após tratamento com o inibidor, menor do que 100%. O percentual de inibição é calculado a partir da equação 2 (eq. 2), em que V0 é a taxa inicial do controle negativo, Vi é a taxa inicial na presença do inibidor. % inibição = (1 - (V0 / Vi)) x 100 (eq.2) EXEMPLO 4: Ensaios de inibição de Caspase-2 e Caspase-3 (in vitro) para inibidores reversíveis
[00255] A eficiência inibidora dos compostos da invenção que são inibidores reversíveis da Caspase-2 e Caspase-3 pode ser avaliada usando o protocolo explicado abaixo. O composto 3 é um inibidor reversível e foi avaliado adequadamente.
[00256] Uma etapa preliminar na caracterização de um inibidor é a determinação da sua IC50. A IC50 é a concentração necessária de um inibidor para diminuir a atividade enzimática em 50% do seu valor máximo e não inibido.
[00257] O composto, em diferentes concentrações, é incubado com a enzima e tampão por 30 minutos a 37°C para permit ir a formação do complexo Enzima-Inibidor. A reação é iniciada pela adição de tampão e substrato e a atividade é medida durante 15 minutos para a determinação das velocidades iniciais. O efeito inibitório do composto analisado (em %) como uma função de sua concentração geralmente segue a equação 3 (eq. 3) que traduz uma hipérbole. A equação é inserida no programa Kaleidagraph, para o ajuste da curva f ([I]) = % de inibição, onde [I] é a concentração do inibidor, a IC50 é então obtida. % Inibição = 100 x [I] / (IC50 + [I]) (eq.3) Avaliação de inibidores reversíveis
[00258] A reversibilidade da inibição é analisada pelo método de diluição para Ac-VDVAD-CHO, Ac-DEVD-CHO e composto 3. A enzima e o inibidor (ou DMSO como controle) são incubados por 30 minutos a 37°C. O complexo assim formado é diluído a 100° na mistura tampão/substrato e a medição da atividade é iniciada ao longo de 20 minutos. A taxa inicial obtida para o DMSO representa a atividade de 100% e servirá como referência para a quantificação da atividade residual da enzima na presença do inibidor.
[00259] A fim de caracterizar os inibidores reversíveis, a constante de dissociação Ki é determinada. Ela dá conta da afinidade do inibidor pela enzima. Para este propósito, o inibidor compete com o substrato em relação ao sítio ativo da enzima. Se, após a diluição, a atividade for restaurada em mais de 50%, o inibidor é dito ser "reversível".
[00260] O inibidor é incubado com a mistura de Caspase-tampão por 30 minutos a 37°C em diferentes concentrações (1/4 IC50, 1/2 IC50, IC50, 2 IC50, 4 IC50). A reação é iniciada ao longo de 20 minutos após adição da mistura tampão-substrato.
[00261] Os valores de velocidade inicial em RFU.min-1 são reduzidos para valores de Atividade Específica (SA) (pmol/min/µg de enzima) a partir de uma faixa padronizada de AMC (1 RFU → 0,02 pmol).
[00262] A evolução da proporção 1/SA como uma função de 1/[S] permite obter o chamado gráfico inverso duplo de Lineweaver-Burk a partir da equação 4 (eq.4) em que Vmaxapp e KMapp são os parâmetros que variam de acordo com a inibição do tipo e como uma função da concentração do inibidor. A interseção das linhas obtidas para aumentar as concentrações de inibidores torna possível distinguir diferentes tipos de inibidores.
[00263] Um gráfico secundário, obtido a partir dos valores das inclinações do gráfico de Lineweaver-Burk como uma função da concentração do inibidor, torna possível a obtenção do valor de Ki. Seu valor é dado pelo ponto de abcissa na origem.
[00264] Os poderes inibitórios dos compostos em relação a Casp-2 e -3 são quantificados pela determinação da IC50. Os resultados são apresentados na Tabela 3 (esquerda). Os valores de IC50 colocam o composto 3 no topo depois do composto de referência Ac-VDVAD-CHO (IC50 = 6,9 nM) em termos de eficácia sobre Casp-2. Além de atuar eficientemente sobre a Casp-2, o composto 3 parece ser consideravelmente menos potente sobre a Caspase-3 do que Ac- VDVAD-CHO (IC50 = 7,23 nM). Assim, o composto 3 é seletivo para Casp2.
[00265] O estudo aprofundado do mecanismo de inibição foi realizado como se segue.
[00266] A velocidade inicial V0 é expressa na equação 8 (eq.8), em que Vmax é a taxa máxima de reação (alcançada quando a enzima está saturada com substrato), [S] a concentração de substrato, KM é a constante de Michaelis-Menten (concentração de substrato correspondente para Vmax/2), Ki é a constante de dissociação que é responsável pela afinidade do inibidor pela enzima. Ki permite quantificar o poder inibitório, quanto menor o seu valor, mais forte o inibidor.
[00267] A traçado secundário obtido a partir dos dados do gráfico de Lineweaver-Burk permitiu determinar os valores de Ki. Os valores de Ki para os vários inibidores, assm como os índices de seletividade, são apresentados na Tabela 4 (à direita). IC50 (nM) Ki (nM) Caspase- Inibidores Casp-2 Caspase-3 Casp-2 3 Ac-VDVAD-CHO 6,9±0,6 7,23±0,66 6,31 7,68 Ac-DEVD-CHO 3907±189 0,7± 0,03 3 222 0,159 Tabela 4 Tabela 5 Índices de Seletividade Inibidores (KiCasp3/KiCasp2) Ac-VDVAD-CHO 1,3 Ac-DEVD-CHO 62 x 10-6 Composto 3 >> 1000
[00268] As eficiências de inibição são representadas pelos valores de IC50 para os inibidores de referência Ac-DEVD-CHO e Ac-VDVAD- CHO, assim como para os derivados da variante P2 de Ac-VDVAD-CHO (Tabela 4). A quantificação da inibição é dada pelos valores das constantes Ki que são responsáveis pela afinidade do inibidor pela enzima. Um valor baixo indica um inibidor potente em seu alvo. As proporções das constantes permitem quantificar a seletividade (Tabela 5), quanto maior a proporção, mais o inibidor será seletivo de Casp-2.
[00269] Os valores de Ki confirmam e complementam as informações fornecidas pelos dados de IC50. Assim, o composto 3 é um inibidor que ainda é poderoso sobre Casp-2 com uma seletividade em relação a este último acentuadamente aumentada em comparação com Ac-VDVAD-CHO (Tabela 5). EXEMPLO 5: Proteção contra ensaio de morte celular
[00270] Neste exemplo, o efeito protetor do composto 2 da invenção contra a morte celular induzida pela vincristina (um alcaloide da vinca) é testado usando um conhecido ensaio de morte celular por citometria de fluxo com base na coloração com iodeto de propídio. a. Modelo celular
[00271] Para avaliar o efeito protetor dos compostos 2 e 3, é usado um modelo celular dependente de Caspase.
[00272] As células HeLa humanas são usadas neste modelo. As células HeLa (linhagem celular de câncer do colo do útero) foram obtidas da American Type Cell Collection (ATCC) e foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, alta glicose, GlutaMAX™, piruvato) (Gibco, Life Technologies), suplementado com FCS 10% e antibióticos (Gibco, Life Technologies).
[00273] As células HeLa humanas são tratadas com uma solução de vincristina (Sigma Aldrich) (diluída em água a 5mM). A vincristina trabalha parcialmente pela ligação à proteína Tubulina, impedindo a célula de separar seus cromossomos durante a metáfase; a célula então sofre apoptose através de um processo dependente da caspase.
[00274] O iodeto de propídio (PI) (Sigma Aldrich) é usado para avaliar a permeabilização da membrana plasmática, um sinal de morte celular. b. Condições de tratamento e marcação
[00275] 24 horas antes do tratamento farmacológico, as células HeLa foram plaqueadas em placas de 24 poços. O meio de cultura foi então removido, as células foram lavadas com PBS e o meio fresco contendo o composto 2 ou 3 em diferentes concentrações foi adicionado 1 hora antes da adição da vincristina. As células foram expostas ou não (controle) a vincristina 20 nM por 48 horas.
[00276] O conteúdo de cada poço é coletado e adicionado a PBS e depois centrifugado (900 rpm; 5 min).
[00277] O pélete obtido é colocado em 300 µL de um meio que compreende iodeto de propídio e incubado (37°C, 5% de C02) no escuro por 5 minutos e depois submetido à análise por citometria de fluxo. c. Análise de células
[00278] As células são então analisadas por citometria de fluxo com uma excitação de 561 nm.
[00279] A Seleção de Célula Ativadas por Fluorescência foi realizada usando um citômetro FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA). Para cada amostra, os dados de 5.000 células foram registrados e analisados com o programa CellQuest Pro™ (Becton Dickinson). A análise incluiu parâmetros deFSC (Forward Scatter/relacionados ao tamanho das células) e SSC (Side Scatter/relacionados à granularidade das células) juntamente com o canal FL-1 e FL-3. Tabela 6 Composição Índice de morte celular Composto 2 e vincristina ++ Composto 3 e vincristina ++ Vincristina apenas ++++ O número de "+" é indicativo da mortalidade celular medida no ensaio. Quanto maior o número de "+" representado, maior a mortalidade celular medida no ensaio.
[00280] O percentual de células positivas para o iodeto de propídio dá uma estimativa da morte celular.
[00281] A composição de controle, que não contém vincristina nem inibidor, permite estimar a quantidade de células que morreram naturalmente.
[00282] A composição que contém vincristina, mas não inibidor, fornece o número total de células mortas que corresponde à soma de células mortas naturalmente e de células apoptóticas induzidas pela vincristina.
[00283] Os inventores observam claramente que os compostos 2 e 3 protegem as células contra a morte apoptótica induzida pela vincristina de uma maneira dependente da dose. EXEMPLO 6: Proteção contra a neurotoxicidade de Abeta a) Culturas neuronais primárias
[00284] O hipocampo é micro-dissecado de embriões E16de camundongos C57B16/J (Rene Janvier, França) em Solução Salina Equilibrada de Gey gelada (GBSS, Sigma) suplementada com 0,1% de glicose (Life technologies).
[00285] As estruturas dissecadas são digeridas com papaína (20U/ mL em DMEM, Sigma; St. Louis, MO, EUA) e mecanicamente dissociadas na presença de DNAse. As células do hipocampo são então enxaguadas e ressuspensas em DMEM (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD, EUA) até uma densidade final de 18 milhões de células/ml em Neurobasal (Life technologies) e Glutamax (0,1% LifeTechnologies) suplementado com B27 (1/50) e penicilina/asptreptomicina 1% (Gibco).
[00286] Essa suspensão celular é então usada para encher os reservatórios das câmaras microfluidizadas, como descrito (Peyrin et al., 2011 Lab Chips 11 (21): 3663; Deleglise et al., 2014 Acta Neuropathologica Comm. 2: 145). Os chips microfluidizados são colocados em placas de Petri de plástico contendo H20-EDTA para evitar a evaporação e incubados a 37°C em uma atmos fera úmida de C02 5%. O meio de cultura é renovado a cada sete dias. b) Preparação dos oligômeros do peptídeo de Aβ
[00287] A forma oligomérica de Aβ1-42 (Tocris Bioscience, MN, USA) é produzida de acordo com Stine WB et al (2003) em J Biol Chem 278, pp 11612-11622 e pode ser controlada por microscopia eletrônica como em Deleglise B et al. na Acta Neuropathol Commun. 2014;2: 145).
[00288] Resumidamente, os peptídeos liofilizados Aβ1-42 são solubilizados em 1 mM de 1, 1, 1, 3, 3, 3, - hexafluoro-2-propanol (HFIP, Sigma Aldrich). Após 30 min de incubação em RT, HFIP é evaporado por 12 h em uma capela de laboratório e os peptídeos são secos por 1 h (com um Speed Vac a 4°C). Em seguida, são obtidas soluções- estoque de peptídeos Aβ 5 mM pela solubilização em dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma Aldrich). Para obter os oligômeros, a solução estoque de peptídeo de Aβ é diluída em meio DMEM-F12 gelado sem fenol (Life Technologies) até uma concentração final de 100 µΜ. A solução é então incubada por 24 h a 4°C. A fração e oligômero de A β solúvel é coletada do sobrenadante após uma etapa de centrifugação a 20.000 g (10 min; 4°C) e armazenada a -80ºC até o uso. c) Ensaio de toxicidade
[00289] Após 18 dias de cultura em câmaras micro fluidizadas, as células do hipocampo são pré-incubadas por 1 h com os compostos da invenção previamente diluídos em meio DMEM-F12 gelado sem fenol ou em meio DMEM-F12 livre de fenol sozinho como solução de controle. As células são então intoxicadas por 3 h a 6 h ou 24 h com 10 ou 100 nm de oligômeros de Aβ1-42 (ou com o meio DMEM-F12 livre de fenol sozinho como uma solução de controle). Após a etapa de intoxicação, as células são fixadas em paraformaldeído 4% (PFA, Sigma; St. Louis, MO, USA) por 20 min de RT e marcadas como explicado abaixo para avaliar o estado das sinapses, morte celular ou degeneração axonal. d) Imunofluorescência
[00290] Resumidamente, após a etapa de fixação, as células das culturas são lavadas duas vezes com PBS + Azida 0,1% por 5 min e permeabilizadas por 10 min com Triton X-100 0,2% e BSA 0,1% (Albumina de Soro Bovino, Sigma) em PBS + Azida 0,1%. A etapa de saturação é então realizada pela incubação das células durante 30 min em PBS + Azida 0,1% + BSA1%. Anticorpos primários são então adicionados e as amostras incubadas a 4°C durante a noite em PBS. Posteriormente, as amostras são lavadas duas vezes por 5 min com PBS + Azida a 0,1% e incubadas com o anticorpo secundário correspondente juntamente com a faloidina conjugada com Alexa Fluor 555 por 2 h em RT. Os chips foram então lavados duas vezes com PBS + Azida 0,1%.
[00291] Os seguintes anticorpos são usados: anti-MAP-2 policlonal de coelho (AB5622; 1/400, MILLIPORE), Anti-Bassoon SAP7F407 monoclonal de camundongo; 1: 400, Enzo LifeSciences). São usados anticorpos secundários específicos para a espécie acoplados a Alexa 350, 488 ou 500 (1/500, Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD, EUA). A faloidina conjugada com Alexa Fluor 555 (1/500, EnzoLifeTechnologies) é usada para colorir a F-actina. e) Aquisição de imagens
[00292] As imagens são adquiridas com um Axio-observer Zl (Zeiss, Alemanha) equipado com uma câmera CCD resfriada (CoolsnapHQ2, Ropert Scientific). O microscópio é controlado com o programa Metamorph e Micro-manager. As imagens foram analisadas usando o programa ImageJ. f) Resultados
[00293] Nas células Aβ intoxicadas, mas não pré-tratadas com os compostos da invenção, é observada uma diminuição acentuada na marcação anti-Bassoon logo após 6 h de intoxicação quando comparadas com amostras não intoxicadas. Esta perda de colunas dendríticas em neurônios do hipocampo de camundongos fornece evidências de neurodegeneração devido à sinaptotoxicidade de Aβ e resulta na diminuição acentuada no número de sinapses (quase 50%, Figura 1). Além disso, 24 horas após o tratamento com Aβ, é observada a degeneração axonal para neurônios do hipocampo que não foram pré- tratados com os compostos da invenção. Os compostos da invenção são considerados eficientes na proteção de células do hipocampo da morte celular induzida por Aβ, degeneração axonal induzida por Aβ, disfunção eletrofisiológica induzida por Aβ e/ou perda de sinapse induzida por Aβ (Tabela 7 e Figura 1). Tabela 7 Efeito protetor contra a Composição toxicidade de Aβ Composto 2 + Composto 3 + Composto 4 + Composto 5 + Composto 6 + Aβ apenas - + : proteção significativa contra morte celular induzida por Aβ, degeneração axonal induzida por Aβ, disfunção eletrofisiológica induzida por Aβ e/ou perda de sinapse induzida por Aβ.
[00294] Esses experimentos fornecem evidências de que os compostos da invenção, que são capazes de modular a atividade da Caspase-2 (tabelas 1 e 5), são eficazes para tratar ou prevenir a ocorrência de um distúrbio associado com neurotoxicidade de Aβ. Conclusão
[00295] Os compostos da invenção são então compostos valiosos para o tratamento de doenças associadas à morte ou disfunção celular mediadas pela atividade da Caspase 2. Mais particularmente, eles são considerados eficazes no tratamento de distúrbios neurodegenerativos como doença de Alzheimer (AD), sendo conhecido que a sinaptotoxicidade por Aβ desempenha um papel importante na fisiopatologia desta doença.
Além disso, a Caspase 2 é conhecida na técnica por mediar a clivagem de tau que gera ∆tau314, implicada no déficit cognitivo na AD, tornando assim os compostos da invenção compostos valiosos para seu uso no tratamento ou prevenção de doenças que impliquem na toxicidade de tau e/ou Aβ.

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES
1. Composto de fórmula (I): caracterizado pelo fato de que: ● Z1 e Z2, idênticos ou diferentes, são selecionados entre um átomo de hidrogênio, um grupo (C1-C6)alquila ou (C1-C6)alcoxila; – P5 é selecionado entre os seguintes resíduos de aminoácidos ou estruturas similares a aminoácidos: – P1 e P4, idênticos ou diferentes, são selecionados entre as seguintes estruturas similares a aminoácidos: e em que Z3 e Z4, idênticos ou diferentes, são selecionados entre um átomo de hidrogênio, um grupo (C1-C6)alquila; – P3 é selecionado entre os seguintes resíduos de aminoácidos:
– R1 é selecionado entre:
em que: ● m é 0, 1 ou 2; ● p é 1, 2, 3 ou 4; ● Z5 é um átomo de halogênio; ● q é 0 ou 1; ● Z6 é selecionado entre um grupo (C1-C6)alquila e um grupo fenila, o dito grupo fenila sendo opcionalmente substituído por um grupo amino;
● Z7, Z8 e Z11, idênticos ou diferentes, são selecionados entre um átomo de hidrogênio, um grupo (C1-C4)alquila, uma tetraidroquinolinila e um grupo –(CH2)i-arila com i sendo 0, 1 ou 2, o dito grupo arila sendo opcionalmente substituído por um, dois, três ou quatro átomos de halogênio ou um grupo (C1-C4)alquila; e ● Z9 e Z10, idênticos ou diferentes, são selecionados entre um átomo de hidrogênio e um grupo (C1-C4)alquila; ou um dos seus sais; o dito composto de fórmula (I) estando em todas as formas de isômeros racêmicos, enantioméricos e diastereoisoméricos.
2. Composto de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por possuir a fórmula (II): em que - R1 e R2 são como definidos na fórmula (I); - Z1 e Z2 são como definidos na fórmula (I); - R3 é selecionado entre um grupo –CH3, –CH(CH3)2, - CH2CH(CH3)2, –CH(CH3)CH2CH3 e 4-hidroxifenila; - A e B, idênticos ou diferentes, são selecionados entre um átomo de nitrogênio e um grupo -CH-; - R5 e R6, idênticos ou diferentes, são selecionados entre um átomo de hidrogênio e um grupo a (C1-C6)alquila; e - R4 é selecionado entre um grupo –CH3, –CH(CH3)2, –
CH2CH(CH3)2, a–CH(CH3)CH2CH3 e –(CH2)2CO2H; ou um dos seus sais; o dito composto de formula (II) estando em todas as formas possíveis de isômero racêmico, enantiomérico e diastereoisomérico.
3. Composto de fórmula (II) acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos um de A e B é um grupo - CH, preferivelmente A e B são grupos -CH.
4. Composto de fórmula (III) de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes: caracterizado pelo fato de que R1 e R2 são como definidos na fórmula (I); ou um de seus sais; o dito composto de fórmula (III) estando em todas as formas de isômeros racêmicos, enantioméricos e diastereoisoméricos.
5. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que R1 é:
6. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que R2 é selecionado entre:
e em que Z’ é um átomo de flúor e j é 0, 1 ou 2; e preferivelmente R2 é:
7. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por possuir pelo menos um, preferivelmente pelo menos três átomos de carbono assimétrico na configuração (S) e mais preferivelmente todos os átomos de carbono assimétrico na configuração (S).
8. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ser selecionado entre:
e
9. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ser para uso como inibidor seletivo da Caspase-2.
10. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável, em que R2 é selecionado entre: e em que m, p, q, Z5, Z6, Z7, Z8, Z9, Z10 e Z11 são como definidos na fórmula (I) de acordo com a reivindicação 1.
11. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser para uso como um medicamento, em que R2 é selecionado entre: e em que m, p, q, Z5, Z6, Z7, Z8, Z9, Z10 e Z11 são como definidos na fórmula (I) de acordo com a reivindicação 1.
12. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser para uso na prevenção e/ou tratamento de doenças e/ou lesões nas quais a atividade da Caspase-2 está implicada, em que R2 é selecionado entre: e em que m, p, q, Z5, Z6, Z7, Z8, Z9, Z10 e Z11 são como definidos na fórmula (I) de acordo com a reivindicação 1.
13. Composto de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de ser para uso na prevenção e/ou tratamento de patologias com morte celular, particularmente doenças degenerativas crônicas, tais como doença de Alzheimer ou outras Taupatias, doença de Huntington e doença de Parkinson; dano cerebral neonatal, em particular isquemia cerebral neonatal; lesão traumática cerebral; isquemia renal; lesões por hipoxia-isquemia (H-I); lesões cerebrais similares a acidentes vasculares cerebrais; isquemia cardíaca; infarto do miocárdio; esclerose lateral amiotrófica (ELA); danos na retina; doenças oftálmicas, tais como lesão ocular contundente, neuropatia óptica isquêmica e glaucoma; danos à pele; doenças inflamatórias estéreis como diabetes, aterosclerose, isquemia cardíaca, gota, pseudogota, afrouxamento das articulações, aterosclerose, síndromes desencadeadas por sais de alumínio, neuropatia óptica isquêmica não arterítica (NAION), glaucoma e doenças metabólicas; doenças inflamatórias não estéreis, como infecção bacteriana, em particular por bactérias produtoras de toxinas formadoras de poros, infecção pelo vírus influenza e infecção por RNA de cadeia simples (ss) de Rhabdoviridae, tal como o vírus Maraba ou vírus da estomatite vesicular (VSV); doenças causadas por bactérias patogênicas, tais como Brucella, Staphylococcus aureus e Salmonella; dislipidemias;obesidade; síndrome metabólica; e doença hepática gordurosa não alcoólica.
14. Composto de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de ser para uso na prevenção e/ou tratamento da doença de Alzheimer.
15. Composto de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de ser para uso na proteção de células neuronais da disfunção ou toxicidade induzida por Aβ, mais particularmente contra a morte celular induzida por Aβ, degeneração axonal induzida por Aβ, disfunção eletrofisiológica induzida por Aβ e/ou perda de sinapse induzida por Aβ.
16. Uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser para uso como sonda baseada em atividade para detectar seletivamente a atividade de Caspase-2, em que R2 é selecionado entre:
e
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