BR112020005196A2 - anticorpos claudin6 e métodos para tratar câncer - Google Patents

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Mike Palazzolo
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Abstract

A presente invenção refere-se a proteínas de ligação a antígeno que se ligam a Claudin-6 (CLDN6). Em vários aspectos, as proteínas de ligação a antígeno se ligam à Alça Extracelular 2 (EL2) do domínio extracelular de CLDN6. Polipeptídeos, ácidos nucleicos, vetores, células hospedeiras e conjugados relacionados são adicionalmente fornecidos no presente documento. Kits e composições farmacêuticas compreendendo tais entidades são adicionalmente fornecidos. Também são fornecidos métodos para produzir uma proteína de ligação a antígeno e métodos para tratar um indivíduo que tem câncer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPOS CLAUDIN6 E MÉTODOS PARA TRATAR CÂNCER".
INCORPORAÇÃO A TÍTULO DE REFERÊNCIA DE MATERIAL ENVIADO ELETRONICAMENTE
[001] Uma listagem de sequências de nucleotídeos/aminoácidos legível por computador enviada juntamente com o presente documento e identificada conforme a seguir é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade: ASCII de 315.776 bytes (Texto) arquivo denominado "51836_SeqListing.txt"; criado em 18 de setembro de 2018.
ANTECEDENTES
[002] Os anticorpos constituem agentes terapêuticos potentes caracterizados por efeitos colaterais limitados devido à sua capacidade para alvejar especificamente um antígeno distinto numa célula, bactérias, vírus ou toxina. Em 1986, o primeiro anticorpo monoclonal terapêutico, OKT3 Ortoclone, foi introduzido no mercado. Desde então, esta classe de produtos biofarmarcêuticos tem crescido significativamente. No final de 2014, quarenta e sete produtos de anticorpo monoclonal receberam aprovação nos EUA ou Europa para o tratamento de uma variedade de doenças, incluindo câncer e doenças inflamatórias, cardiovasculares, respiratórias e infecciosas.
[003] Mais de uma dezena de anticorpos monoclonais são atualmente aprovados pela Administração Americana de Alimentos e Fármacos (U.S. Food and Drug Administration) para tratar cânceres. Dentre estes agentes estão alemtuzumab (Campath®), que é indicado para leucemia linfocítica crônica (CLL), e trastuzumab (Herceptin®), que é usado para tratar câncer de mama. Alguns anticorpos são identificados com fármacos quimioterapêuticos, incluindo, por exemplo, brentuximab vedotina (Adcetris®) e Ado-trastuzumab emtansina (Kadcyla®). Outros produtos de anticorpo, como blinatumomab
(Blincyto) são projetados para reconhecerem e se ligarem a dois antígenos diferentes. Apesar da disponibilidade comercial de tais produtos de anticorpo, a incidência atual de câncer e mortes por câncer permanecem altas. Foi relatado que a incidência de câncer é maior que 450 por 100000 homens e mulheres por ano, e a mortalidade de câncer é logo acima de 170 por 100000 homens e mulheres por ano.
SUMÁRIO
[004] São fornecidas no presente documento proteínas de ligação a antígeno que se ligam a Claudin-6 (CLDN6). Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno da presente invenção se liga a uma CLDN6 humana e opcionalmente se liga a uma CLDN6 de camundongo. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno se liga ao domínio extracelular (ECD) de CLDN6. Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno se liga à Alça Extracelular 2 (EL2) do ECD de CLDN6. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno se liga à EL2 e não se liga à Alça Extracelular 1 (EL1) do ECD de CLDN6. Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno se liga a membros adicionais da família de Claudina humana, incluindo, por exemplo, Claudin-3 (CLDN3), Claudin-4 (CLDN4) e Claudin-9 (CLDN9). Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno se liga à CLDN6 e pelo menos uma dentre CLDN4 e CLDN9. Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno se liga à CLDN6 e não se liga a nenhum outro membro da família de Claudina. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno se liga à CLDN6 expressa de modo endógeno por células de câncer de ovário humano, por exemplo, células OVCA429, e exibe uma IC50 menor que cerca de 1200 nM num ensaio de afinidade FACS com células OVCA429. Em vários casos, as proteínas de ligação a antígeno da presente invenção inibem o crescimento de tumor num indivíduo, por exemplo, um ser humano, sem qualquer outra porção química ligada à proteína de ligação a antígeno. Em vários casos, as proteínas de ligação a antígeno não conjugadas a uma porção química heteróloga (por exemplo, não conjugada a qualquer agente quimioterapêutico, fármaco ou porção química tóxica) inibem o crescimento de tumor num indivíduo, por exemplo, um ser humano.
[005] Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno se liga à CLDN6 expressa por células de câncer humanas. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno inibe uma interação de ligação entre CLDN6 humana e um anticorpo anti-CLDN6 de referência. Sem se ater a uma teoria particular, a ação de inibição das proteínas de ligação a antígeno fornecidas no presente documento permite que tais entidades sejam úteis em métodos para reduzir o crescimento de tumor e tratar um indivíduo com um tumor ou câncer. Como discutido adicionalmente no presente documento, em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno é um anticorpo, fragmento de anticorpo de ligação a antígeno do mesmo ou produto de proteína de anticorpo.
[006] A presente invenção também fornece proteínas de ligação a antígeno compreendendo pelo menos 3, 4, 5, ou todas as sequências de aminoácidos de um grupo especificado de sequências de aminoácidos. Em vários aspectos, as proteínas de ligação a antígeno compreendem pelo menos 3, 4, 5 ou 6 sequências de aminoácidos de região determinante de complementaridade (CDR) de anticorpos de CLDN6 divulgados no presente documento.
[007] A presente invenção fornece ainda proteínas de ligação a antígeno compreendendo sequências de aminoácidos como detalhado no presente documento. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de uma SEQ ID Nº: listada nas Tabelas A, A1, B, B1, C ou D, ou uma combinação das mesmas, como descrito adicionalmente no presente documento.
[008] Polipeptídeos, ácidos nucleicos, vetores, células hospedeiras e conjugados relacionados são adicionalmente fornecidos no presente documento. Kits e composições farmacêuticas compreendendo tais entidades são adicionalmente contemplados.
[009] Também são fornecidos métodos para produzir uma proteína de ligação a antígeno. Em várias modalidades, o método compreende cultivar uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico que codifica uma proteína de ligação a antígeno ou um polipeptídeo como descrito no presente documento, de modo a expressar a proteína de ligação a antígeno ou polipeptídeo.
[0010] Os métodos para tratar um indivíduo que tem câncer são adicionalmente fornecidos no presente documento. Em várias modalidades, o método compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica da presente invenção numa quantidade eficaz para tratar o câncer no indivíduo.
[0011] Também são fornecidos métodos para tratar um indivíduo com um câncer que expressa CLDN6 compreendendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica descrita no presente documento. É adicionalmente contemplado um método para inibir o crescimento de tumor num indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica descrita no presente documento.
[0012] Um método para reduzir o tamanho de tumor num indivíduo, ou prevenir a recorrência de câncer num indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica descrita no presente documento.
[0013] Também é fornecido no presente documento um método para tratar câncer num indivíduo diagnosticado para ser um superexpressador baixo de CLDN6, compreendendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica descrita no presente documento.
[0014] Em várias modalidades, a administração induz apoptose em células de tumor, por exemplo em células que expressam CLDN6. Em várias modalidades, a administração induz citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC), necrose tumoral e morte ou depleção de células e/ou perturbação de aderência de célula de tumor, cada um dos quais resulta em regressão de tumor ou retardamento de crescimento de tumor.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0015] A Figura 1 representa um gráfico de expressão de CLDN6 em tecidos normais (não cancerosos).
[0016] A Figura 2 representa um gráfico de expressão de CLDN6 em linhagens celulares de câncer como determinado por metodologia de Agilent44K.
[0017] A Figura 3 representa um gráfico de expressão de CLDN6 em linhagens celulares de câncer como determinado por RNASeq.
[0018] A Figura 4 representa um conjunto de imagens fluorescentes que representam a localização de CLDN6-GFP em diferentes modelos de célula.
[0019] A Figura 5 representa um alinhamento de sequência de CLDN6 humana, CLDN3 humana, CLDN4 humana, CLDN9 humana e CLDN6 de camundongo. As sequências da EL1 e EL2 são mostradas.
[0020] A Figura 6A representa um gráfico de volume de tumor (mm3) de tumores em camundongos portando tumores endometriais como uma função de tempo (dias) após o tratamento com anticorpo de IgG2 de controle, AB3, Ab1 de Referência, Ab2 de Referência, Ab3 de Referência, AB2 e AB3. A Figura 6B representa um gráfico da alteração média em volume de tumor (mm3) no Dia 14 de tumores em camundongos portando tumores endometriais tratados com anticorpo de IgG2 de controle, AB3, Ab1 de Referência, Ab2 de Referência, Ab3 de Referência, AB2 ou AB3.
[0021] A Figura 7A representa um gráfico de volume de tumor (mm3) de tumores em camundongos portando tumores de bexiga como uma função de tempo (dias) após o tratamento com anticorpo de IgG2 de controle, AB3, Ab1 de Referência, Ab2 de Referência e AB3. A Figura 7B representa um gráfico da alteração média no volume de tumor (mm3) no Dia 35 de tumores em camundongos portando tumores de bexiga tratados com anticorpo de IgG2 de controle, AB3, Ab1 de Referência, Ab2 de Referência ou AB3.
[0022] A Figura 8A representa um gráfico de volume de tumor (mm3) de tumores em camundongos portando tumores de ovário como uma função de tempo (dias) após o tratamento com anticorpo de IgG2 de controle, AB3, Ab1 de Referência, AB2 e AB3. A Figura 8B representa um gráfico da alteração média no volume de tumor (mm 3) no Dia 20 de tumores em camundongos portando tumores de ovário tratados com anticorpo de IgG2 de controle, AB3, Ab1 de Referência, AB2 ou AB3.
[0023] A Figura 9A representa um gráfico de volume de tumor (mm3) de tumores em camundongos portando tumores de melanoma como uma função de tempo (dias) após o tratamento com anticorpo de IgG2 de controle, AB3, Ab1 de Referência, Ab2 de Referência, Ab3 de Referência e AB3. A Figura 9B representa um gráfico da alteração média em volume de tumor (mm3) no Dia 21 de tumores em camundongos portando tumores de melanoma tratados com anticorpo de IgG2 de controle, AB3, Ab1 de Referência, Ab2 de Referência, Ab3 de Referência ou AB3.
[0024] A Figura 10A representa um gráfico da % de inibição de crescimento de tumor alcançada em camundongos portando tumor tratados com AB3, em relação a camundongos tratados com anticorpo de controle. A Figura 10B representa uma imagem de um Western blot demonstrando os diferentes níveis de CLDN6 em linhagens celulares de câncer endometrial (ARK2), linhagens celulares de câncer de bexiga
(UMUC4), linhagens celulares de câncer de ovário (OV90) e linhagens celulares de melanoma (M202) e células de controle. Os níveis de α- tubulina foram aproximadamente iguais, demonstrando carregamento de proteína igual.
[0025] A Figura 11 representa um gráfico da % de alteração no peso corporal de camundongos portando tumor tratados com controle de veículo, anticorpo de controle, Ab1 de Referência, Ab2 de Referência, Ab3 de Referência e AB3 como uma função de tempo (dias).
[0026] A Figura 12A representa um gráfico de volume de tumor (mm3) de tumores em camundongos portando tumores de ovário como uma função de tempo (dias) após o tratamento com controle de veículo, anticorpo de IgG2 de controle, AB3, Ab1 de Referência ou um dos anticorpos anti-CLDN6 indicados. A Figura 12B representa um gráfico da alteração média no volume de tumor (mm3) no Dia 28 de tumores em camundongos portando tumores de ovário tratados com controle de veículo, anticorpo de IgG2 de controle, AB3, Ab1 de Referência, ou um dos anticorpos anti-CLDN6 indicados.
[0027] A Figura 13 representa um gráfico da % de alteração no peso corporal de camundongos portando tumor tratados com controle de veículo, anticorpo de controle, Ab1 de Referência, e os anticorpos anti- CLDN6 indicados como uma função de tempo (dias).
[0028] A Figura 14 representa uma série de curvas de resposta à dose para vários anticorpos anti-CLDN6 da invenção e Ab1 de Referência e Referência 2. A IgG de camundongo foi usada como um controle.
[0029] A Figura 15A representa um gráfico da alteração média no volume de tumor (mm3) no Dia 35 de tumores nos camundongos portando tumores de bexiga tratados com controle de veículo, anticorpo de IgG de controle, uma forma de camundongo de AB3, uma primeira forma humanizada de AB3 e uma segunda forma humanizada de AB3.
A Figura 15B representa um gráfico das alterações no volume de tumor (mm3) para cada dos grupos na Figura 15A.
[0030] A Figura 16A representa um gráfico da alteração média no volume de tumor (mm3) no Dia 35 de tumores nos camundongos portando tumores de bexiga tratados com controle de veículo, anticorpo de IgG de controle, uma forma de camundongo de AB3, uma primeira forma humanizada de AB3 e uma segunda forma humanizada de AB3. Dois anticorpos de controle (um camundongo e um quimérico) também são testados neste experimento. A Figura 16B representa um gráfico das alterações no volume de tumor (mm3) para cada dos grupos na Figura 16A.
[0031] A Figura 17A representa um gráfico da alteração média no volume de tumor (mm3) no Dia 35 de tumores nos camundongos portando tumores de bexiga tratados com controle de veículo, anticorpo de IgG de controle, uma forma de camundongo de AB1, e uma forma humanizada de AB1. A Figura 17B representa um gráfico das alterações no volume de tumor (mm3) para cada dos grupos na Figura 17A.
[0032] A Figura 18A representa um gráfico da alteração média no volume de tumor (mm3) no Dia 35 de tumores nos camundongos portando tumores de bexiga tratados com controle de veículo, anticorpo de IgG de controle, uma forma de camundongo de AB4, e uma forma humanizada de AB4. A Figura 18B representa um gráfico das alterações no volume de tumor (mm3) para cada dos grupos na Figura 18A.
[0033] A Figura 19A representa um gráfico da alteração média no volume de tumor (mm3) no Dia 35 de tumores em camundongos portando tumores de bexiga tratados com controle de veículo, anticorpo de IgG de controle, uma forma de camundongo de AB3, uma forma quimérica de AB3, uma primeira forma humanizada de AB3, uma segunda forma humanizada de AB3, uma forma de camundongo de Ab1, uma forma humanizada de AB1, uma forma de camundongo de
AB4, uma forma humanizada de AB4 e quatro anticorpos de controle (um anticorpo tem uma forma de camundongo ou uma forma quimérica e um anticorpo que tem uma forma de camundongo ou humana) também são testados neste experimento. A Figura 19B representa um gráfico das alterações no volume de tumor (mm3) para cada dos grupos na Figura 19A.
[0034] A Figura 20 representa um gráfico da alteração média no volume de tumor (mm3) no Dia 55 de tumores em camundongos portando tumores de bexiga tratados como descrito na Figura 19A.
[0035] A Figura 21 representa um gráfico da % de alteração no peso corporal de camundongos portando tumor tratados no Dia 32 tratados como descrito na Figura 19A.
DESCRIÇÃO DETALHADA A FAMÍLIA DE CLAUDINA
[0036] As junções firmes, também conhecidas como junções de oclusão ou zonulae occludentes, são estruturas vertebradas localizadas entre duas células adjacentes que regulam a permeabilidade paracelular e mantém a polaridade celular em placas de célula epitelial e endotelial. A família de claudina (CLDN) de genes codifica proteínas de membrana que são importantes componentes de junções firmes. As proteínas CLDN compreendem quatro hélices transmembranares (TM) (TM1, TM2, TM3 e TM4) e duas alças extracelulares (EL1 e EL2). As alças extracelulares das proteínas CLDN de células adjacentes interagem uma com a outra para vedar a placa celular e regular o transporte paracelular entre os espaços luminais e basolaterais.
[0037] As proteínas CLDN desempenham um papel em várias doenças e patologias humanas. Por exemplo, as mutações no gene CLDN1 mostraram resultar em escamamento progressivo da pele junto com a obstrução de dutos biliares. Os mutantes do gene CLDN16 causam um distúrbio de espoliação de magnésio. As mutações de
CLDN19 levam a afecções oculares, como colobomata macular e miopia, enquanto as mutações de CLDN14 podem levar a surdez recessiva não sindrômica. A CLDN3 e CLDN4 são conhecidas por serem receptores de superfície para a enterotoxina Clostridium perfringens no intestino, a CLDN1, CLDN6 e CLDN9 são correceptores para a entrada de vírus de hepatite C (HCV). Várias proteínas CLDN mostraram ser expressas de modo anormal em cânceres. Por exemplo, a CLDN1 é regulada de modo decrescente em câncer de mama e de cólon, enquanto a CLDN3 e a CLDN4 são altamente reguladas de modo crescente em múltiplos cânceres.
[0038] A Claudin-6 (CLDN6) é um membro da família de CLDN. O gene que codifica a proteína CLDN6 humana é localizado no braço p do cromossomo 16 humano em 16p13.3 e é conservado em chimpanzé, macaco Rhesus, cachorro, vaca, camundongo, rato, peixe-zebra e sapo. A CLDN6 é geralmente expressa em seres humanos como uma proteína precursora de 220 aminoácidos; cujos primeiros 21 aminoácidos constituem o peptídeo de sinal. A sequência de aminoácidos da proteína precursora CLDN6 é publicamente disponível no sítio da web do Centro Nacional para Informações de Biotecnologia (National Center for Biotechnology Information) (NCBI) como NCBI Reference Sequence NP_067018.2 e é fornecida no presente documento como SEQ ID Nº: 1. O aminoácido na posição 143 de SEQ ID Nº: 1 é Ile. Em alguns casos, devido a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) na sequência de DNA que codifica CLDN6, o aminoácido na posição 143 é um Val. A sequência de aminoácidos de CLDN6 humana que tem um Val na posição 143 é fornecida no presente documento como SEQ ID Nº: 178.
PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO
[0039] São fornecidas no presente documento proteínas de ligação a antígeno que se ligam a Claudin-6 (CLDN6). As proteínas de ligação a antígeno da presente invenção podem assumir qualquer uma dentre muitas formas de proteínas de ligação a antígeno conhecidas na técnica. Em várias modalidades, as proteínas de ligação a antígeno da presente invenção assumem a forma de um anticorpo, ou fragmento de anticorpo de ligação a antígeno ou um produto de proteína de anticorpo.
[0040] Em várias modalidades da presente invenção, a proteína de ligação a antígeno compreende, consiste essencialmente em ou consiste num anticorpo. Como usado no presente documento, o termo "anticorpo" se refere a uma proteína que tem um formato de imunoglobulina convencional, compreendendo cadeias pesadas e leves, e compreendendo regiões variáveis e constantes. Por exemplo, um anticorpo pode ser uma IgG que é uma estrutura "em formato de Y" de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada par tendo uma cadeia "leve" (tipicamente tendo um peso molecular de cerca de 25 kDa) e uma "pesada" (tipicamente tendo um peso molecular de cerca de 50 a 70 kDa). Um anticorpo tem uma região variável e uma região constante. Em formatos de IgG, a região variável tem geralmente cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos, compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDRs), é primariamente responsável por reconhecimento de antígeno e varia substancialmente dentre outros anticorpos que se ligam a diferentes antígenos. A região constante permite o anticorpo a recrutar células e moléculas do sistema imunológico. A região variável é produzida a partir das regiões N terminais de cada cadeia leve e cadeia pesada, enquanto a região constante é produzida a partir das porções C terminais de cada uma das cadeias pesadas e leves. (Janeway et al., "Structure of the Antibody Molecule and the Immunoglobulin Genes", Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4a edição Elsevier Science Ltd./Garland Publishing, (1999)).
[0041] A estrutura e propriedades gerais de CDRs de anticorpos foram descritas na técnica. Brevemente, num arcabouço de anticorpo, as CDRs são embutidas dentro de uma framework na região variável de cadeia pesada e leve em que constituem as regiões amplamente responsáveis por ligação e reconhecimento de antígeno. Uma região variável tipicamente compreende pelo menos três CDRs de cadeia pesada ou leve (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, Md.; consultar ainda Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883), dentro de uma região de framework (regiões de framework designadas 1-4, FR1, FR2, FR3, e FR4, por Kabat et al., 1991; consultar ainda Chothia e Lesk, 1987, supra).
[0042] Os anticorpos podem compreender qualquer região constante conhecida na técnica. As cadeias leves humanas são classificadas como cadeias leves de kapa e lambda. As cadeias pesadas são classificadas como mu, delta, gama, alfa ou épsilon e definem o isótipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. A IgG tem várias subclasses, incluindo, mas sem limitações, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. A IgM tem subclasses, incluindo, mas sem limitações, IgM1 e IgM2. As modalidades da presente invenção incluem todas estas classes ou isótipos de anticorpos. A região constante de cadeia leve pode ser, por exemplo, uma região constante de cadeia leve tipo kapa ou lambda, por exemplo, uma região constante de cadeia leve tipo kapa ou lambda humana. A região constante de cadeia pesada pode ser, por exemplo, regiões constantes de cadeia pesada tipo alfa, delta, épsilon, gama ou mu, por exemplo, uma região constante de cadeia pesada tipo alfa, delta, épsilon, gama ou mu humana. Consequentemente, em várias modalidades, o anticorpo é um anticorpo de isótipo IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM, incluindo qualquer uma dentre IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em vários aspectos, o anticorpo compreende uma região constante compreendendo uma ou mais modificações de aminoácido, em relação à contraparte de ocorrência natural, para aprimorar a meia vida/estabilidade ou para tornar o anticorpo mais adequado para expressão/fabricabilidade. Em vários casos, o anticorpo compreende uma região constante, em que o resíduo de Lys C terminal que está presente na contraparte de ocorrência natural é removido ou aparado.
[0043] O anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência que é substancialmente similar a um anticorpo de ocorrência natural produzido por um mamífero, por exemplo, camundongo, coelho, cabra, cavalo, galinha, criceto, ser humano e similares. Neste sentido, o anticorpo pode ser considerado como um anticorpo de mamífero, por exemplo, um anticorpo de camundongo, anticorpo de coelho, anticorpo de cabra, anticorpo de cavalo, anticorpo de galinha, anticorpo de criceto, anticorpo humano e similares. Em certos aspectos, a proteína de ligação a antígeno é um anticorpo, como um anticorpo humano. Em certos aspectos, a proteína de ligação a antígeno é um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado. O termo "anticorpo quimérico" se refere a um anticorpo contendo domínios de dois ou mais anticorpos diferentes. Um anticorpo quimérico pode, por exemplo, conter os domínios constantes de uma espécie e os domínios variáveis de uma segunda ou, mais geralmente, pode conter trechos de sequência de aminoácidos de pelo menos duas espécies. Um anticorpo quimérico também pode conter domínios de dois ou mais anticorpos diferentes dentro da mesma espécie. O termo "humanizado", quando usado em relação a anticorpos, se refere a anticorpos que têm pelo menos regiões CDR de uma fonte não humana que são geneticamente modificados para terem uma estrutura e função imunológica mais similar a anticorpos humanos verdadeiros que os anticorpos de fonte original. Por exemplo, humanizar pode envolver enxertar uma CDR de um anticorpo não humano, como um anticorpo de camundongo, num anticorpo humano. Humanizar também pode envolver selecionar substituições de aminoácido para produzir uma sequência não humana mais similar a uma sequência humana. As informações, incluindo informações de sequência para regiões constantes de cadeia pesada e leve de anticorpo humano são publicamente disponíveis através do banco de dados Uniprot, assim como outros bancos de dados bem conhecidos por aqueles no campo de modificação genética e produção de anticorpo. Por exemplo, a região constante de IgG2 é disponível a partir do banco de dados Uniprot como número de Uniprot P01859, incorporado no presente documento a título de referência.
[0044] Um anticorpo pode ser clivado em fragmentos por enzimas, como, por exemplo, papaína e pepsina. A papaína cliva um anticorpo para produzir dois fragmentos Fab e um único fragmento Fc. A pepsina cliva um anticorpo para produzir um fragmento F(ab')2 e um fragmento pFc'. Em vários aspectos da presente invenção, a proteína de ligação a antígeno da presente invenção é um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo (também conhecido como fragmento de anticorpo de ligação a antígeno, fragmento de ligação a antígeno, porção de ligação a antígeno). Em vários casos, o fragmento de anticorpo de ligação a antígeno é um fragmento Fab ou um fragmento F(ab')2.
[0045] A arquitetura de anticorpos foi explorada para criar uma faixa crescente de formatos de anticorpo alternativos que abrange uma faixa de peso molecular de pelo menos cerca de 12 a 150 kDa e tem uma faixa de valência (n) de monomérica (n = 1), a dimérica (n = 2), a trimérica (n = 3), a tetramérica (n = 4) e potencialmente superior; tais formatos de anticorpo alternativos são chamados, no presente documento, de "produtos de proteína de anticorpo". Os produtos de proteína de anticorpo incluem aqueles baseados na estrutura completa de anticorpo e aqueles que simulam os fragmentos de anticorpo que retêm capacidade de ligação a antígeno total, por exemplo, scFvs, Fabs e VHH/VH (discutido abaixo). O menor fragmento de ligação a antígeno que retém seu sítio de ligação a antígeno completo é o fragmento Fv, que consiste inteiramente em regiões variáveis (V). um ligante de peptídeo de aminoácido flexível solúvel é usado para conectar as regiões V to um fragmento scFv (variável de fragmento de cadeia única) para estabilização da molécula, ou os domínios constantes (C) são adicionados às regiões V para gerar um fragmento Fab [fragmento, ligação a antígeno]. Ambos os fragmentos scFv e Fab podem ser facilmente produzidos em células hospedeiras, por exemplo, células hospedeiras procariotas. Outros produtos de proteína de anticorpo incluem scFv estabilizado por ligação de dissulfeto (ds-scFv), Fab de cadeia única (scFab), assim como formatos de anticorpo diméricos e multiméricos como diacorpos, triacorpos e tetracorpos, ou minicorpos (miniAbs) que compreendem diferentes formatos consistindo em scFvs ligados a domínios de oligomerização. Os menores fragmentos são VHH/VH de Abs de cadeia pesada de camelida assim como Abs de domínio único (sdAb). O bloco de construção que é mais frequentemente usado para criar formatos de anticorpo inovadores é o fragmento de anticorpo de domínio variável (V) de cadeia única (scFv), que compreende domínios V das cadeias pesada e leve (domínio VH e VL) ligados por um ligante de peptídeo de resíduos de ~15 aminoácidos. Um a fusão de Fc de pepticorpo ou peptídeo é ainda outro produto de proteína de anticorpo. A estrutura de um pepticorpo consiste num peptídeo biologicamente ativo enxertado num domínio de Fc. Os pepticorpos são bem descritos na técnica. Consultar, por exemplo, Shimamoto et al., mAbs 4(5): 586-591 (2012).
[0046] Outros produtos de proteína de anticorpo incluem um anticorpo de cadeia única (SCA); um diacorpo; um triacorpo; um tetracorpo; anticorpos biespecíficos ou triespecíficos e similares. Os anticorpos biespecíficos podem ser divididos em cinco classes principais: BsIgG, IgG anexa, fragmentos de anticorpo biespecífico (BsAb), proteínas de fusão biespecífica e conjugados de BsAb. Consultar, por exemplo, Spiess et al., Molecular Immunology 67(2) Parte A: 97-106 (2015).
[0047] Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno da presente invenção compreende, consiste essencialmente em ou consiste em qualquer um destes produtos de proteína de anticorpo. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno da presente invenção compreende, consiste essencialmente em ou consiste em qualquer um dentre um scFv, Fab VHH/VH, fragmento Fv, ds-scFv, scFab, anticorpo dimérico, anticorpo multimérico (por exemplo, um diacorpo,, triacorpo, tetracorpo), miniAb, pepticorpo VHH/VH de anticorpo de cadeia pesada de camelida, sdAb, diacorpo; um triacorpo; um tetracorpo; um anticorpo biespecífico ou triespecífico, BsIgG, IgG anexa, fragmento de BsAb, proteína de fusão biespecífica e conjugado de BsAb.
[0048] Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno da presente invenção é um produto de proteína de anticorpo em forma monomérica ou forma polimérica, oligomérica ou multimérica. Em certas modalidades nas quais o anticorpo compreende dois ou mais fragmentos de regiões de ligação ao antígeno distintas, o anticorpo é considerado como biespecífico, triespecífico, ou multiespecífico, ou bivalente, trivalente, ou multivalente, dependendo do número de epítopos distintos que são reconhecidos e ligados pelo anticorpo.
[0049] Em várias modalidades, um anticorpo anti-CLDN6 ou variante de anticorpo do mesmo é selecionado a partir do grupo consistindo num anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo monoclonal, um anticorpo recombinante, um fragmento de anticorpo de ligação um antígeno, um anticorpo de cadeia única, um anticorpo monomérico, um diacorpo, um triacorpo, um tetracorpo, um fragmento Fab, um anticorpo de IgG1, um anticorpo de IgG2, um anticorpo de IgG3 e um anticorpo de IgG4.
[0050] Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno da presente invenção é ligada a um agente terapêutico. Como descrito abaixo, o agente terapêutico pode ser qualquer um conhecido na técnica, incluindo, mas sem limitações, agentes quimioterapêuticos, citocinas e fatores de crescimento, agentes citotóxicos e similares. Consultar "Conjugates" abaixo. CLDN6 E EPÍTOPOS
[0051] As proteínas de ligação a antígeno da presente invenção se ligam a CLDN6. Em vários aspectos, a CLDN6 é uma CLDN6 humana que tem uma sequência de aminoácidos de:
[0052] MASAGMQILGVVLTLLGWVNGLVSCALPMWKVTAFIGNSI
VVAQVVWEGLWMSCVVQSTGQMQCKVYDSLLALPQDLQAARALCV IALLVALFGLLVYLAGAKCTTCVEEKDSKARLVLTSGIVFVISGVLTLIP
VCWTAHAXIRDFYNPLVAEAQKRELGASLYLGWAASGLLLLGGGLLC CTCPSGGSQGPSHYMARYSTSAPAISRGPSEYPTKNYV, em que X é Ile ou Val (SEQ ID Nº: 202).
[0053] Em vários aspectos, a CLDN6 humana compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 178 e 200 a 202.
[0054] Em vários aspectos, as proteínas de ligação a antígeno da presente invenção se ligam a um epítopo dentro de uma sequência de aminoácidos de CLDN6. Em vários aspectos, CLDN6 é uma CLDN6 humana e as proteínas de ligação a antígeno da presente invenção se ligam a um epítopo dentro de uma sequência de aminoácidos de CLDN6 humana, por exemplo, SEQ ID NOs: 1, 178 e 200 a 202. O termo "epítopo" significa a região de ou dentro da CLDN6 que é ligada pela proteína de ligação a antígeno. Em algumas modalidades, o epítopo é um epítopo linear. O "epítopo linear" se refere à região de ou dentro da CLDN6 que é ligada pela proteína de ligação a antígeno e a região que é composta por aminoácidos contíguos da sequência de aminoácidos da CLDN6. Os aminoácidos de um epítopo linear são adjacentes um ao outro na estrutura primária da CLDN6. Consequentemente, um epítopo linear é um fragmento ou porção da sequência de aminoácidos do antígeno, isto é, CLDN6. Em outras várias modalidades, o epítopo é um epítopo conformacional ou estrutural. O termo "epítopo conformacional" ou "epítopo estrutural" significa um epítopo que é composto por aminoácidos que são localizados em proximidade um com o outro apenas quando a CLDN6 está em seu estado dobrado apropriado. Diferente de epítopos lineares, os aminoácidos de um epítopo conformacional ou estrutural não são adjacentes um ao outro na estrutura primária (isto é, sequência de aminoácidos) da CLDN6. Um epítopo conformacional ou estrutural não é produzido a partir de aminoácidos contíguos da sequência de aminoácidos do antígeno (CLDN6).
[0055] Em vários aspectos, o epítopo é localizado dentro do domínio extracelular (ECD) de CLDN6, por exemplo, CLDN6 humana. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno se liga à Alça Extracelular 2 (EL2) do ECD de CLDN6 que tem a sequência de aminoácidos de WTAHAIIRDFYNPLVAEAQKREL (SEQ ID Nº: 2). Em vários aspectos, o epítopo ao qual a proteína de ligação a antígeno se liga está na SEQ ID Nº: 2. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno da presente invenção se liga a uma porção N-terminal de SEQ ID Nº: 2, por exemplo, TAHAIIRDFYNPL (SEQ ID Nº: 3). Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno da presente invenção se liga a uma porção C-terminal de SEQ ID Nº: 2, por exemplo, LVAEAQKREL (SEQ ID Nº: 4). Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno da presente invenção se liga a EL2, mas não à Alça Extracelular 1 (EL1)
de CLDN6. Em vários aspectos, o epítopo (ou epítopos) ao qual as proteínas de ligação a antígeno da presente invenção se ligam é diferente do epítopo ligado por um anticorpo anti-CLDN6 compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de SEQ ID Nº: 185 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de SEQ ID Nº: 186. Em vários aspectos, o epítopo (ou epítopos) ao qual as proteínas de ligação a antígeno da presente invenção se ligam é diferente do epítopo ligado por um anticorpo anti-CLDN6 compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de SEQ ID Nº: 181 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de SEQ ID Nº:
182.
[0056] Em vários aspectos, as proteínas de ligação a antígeno se ligam à CLDN6 humana e uma CLDN6 não humana. Em vários casos, a CLDN6 não humana é uma CLDN6 de chimpanzé, macaco Rhesus, cachorro, vaca, camundongo, rato, peixe-zebra ou sapo. Em vários casos, as proteínas de ligação a antígeno se ligam à CLDN6 humana e CLDN6 de camundongo.
AFINIDADE E AVIDEZ
[0057] As proteínas de ligação a antígeno fornecidas no presente documento se ligam à CLDN6 de uma maneira não covalente e reversível. Em várias modalidades, a força de ligação da proteína de ligação a antígeno à CLDN6 pode ser descrita em termos de sua afinidade, uma medida da força de interação entre o sítio de ligação da proteína de ligação a antígeno e o epítopo. Em vários aspectos, as proteínas de ligação a antígeno fornecidas no presente documento têm alta afinidade para CLDN6 e, assim, irão se ligar a uma quantidade maior de CLDN6 num período de tempo mais curto que as proteínas de ligação a antígeno de baixa afinidade. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno tem uma constante de associação de equilíbrio,
KA, que é pelo menos 105 mol-1, pelo menos 106 mol-1, pelo menos 107 mol-1, pelo menos 108 mol-1, pelo menos 109 mol-1 ou pelo menos 1010 mol-1 ou pelo menos 1010 mol-1 pelo menos 1010 mol-1. Como entendido pelo técnico de habilidade comum, KA pode ser influenciada por fatores incluindo pH, temperatura e composição tampão.
[0058] Em várias modalidades, a força de ligação da proteína de ligação a antígeno à CLDN6 pode ser descrita em termos de sua sensibilidade. KD é a constante de dissociação de equilíbrio, uma razão de koff/kon, entre a proteína de ligação a antígeno e CLDN6. KD e KA são inversamente relacionadas. O valor de KD se refere à concentração da proteína de ligação a antígeno (a quantidade de proteína de ligação a antígeno necessária para um experimento particular) e, portanto, quando menor o valor de KD (menor concentração) maior a afinidade da proteína de ligação a antígeno. Em vários aspectos, a força de ligação da proteína de ligação a antígeno à CLDN6 pode ser descrita em termos de KD. Em vários aspectos, a KD das proteínas de ligação a antígeno fornecidas no presente documento é cerca de 10-1, cerca de 10-2, cerca de 10-3, cerca de 10-4, cerca de 10-5, cerca de 10-6 ou menos. Em vários aspectos, a KD das proteínas de ligação a antígeno fornecidas no presente documento é micromolar, nanomolar, picomolar ou femtomolar. Em vários aspectos, a KD das proteínas de ligação a antígeno fornecidas no presente documento é dentro de uma faixa de cerca de 10-4 a 10-6 ou 10-7 a 10-9 ou 10-10 a 10-12 ou 10-13 a 10-15. Em vários aspectos, a KD das proteínas de ligação a antígeno fornecidas no presente documento está numa faixa de cerca de 1,0 x 10-12 M a cerca de 1,0 x 10-8 M. Em vários aspectos, a KD das proteínas de ligação a antígeno está numa faixa de cerca de 1,0 x 10-11 M a cerca de 1,0 x 10-9 M.
[0059] Em vários aspectos, a afinidade das proteínas de ligação a antígeno é medida ou classificada usando um ensaio à base de Classificação Celular Ativada (FACS) por citometria de fluxo ou
Fluorescência. Os ensaios de ligação à base de citometria de fluxo são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Cedeno-Arias et al., Sci Pharm 79(3): 569-581 (2011); Rathanaswami et al., Analytical Biochem 373: 52-60 (2008); e Geuijen et al., J Immunol Methods 302(1-2): 68-77 (2005). Em vários aspectos, a afinidade das proteínas de ligação a antígeno é medida ou classificada usando um ensaio de competição como descrito em Trikha et al., Int J Cancer 110: 326-335 (2004) e Tam et al., Circulation 98(11): 1085-1091 (1998), assim como abaixo. Consultar a seção intitulada "Competition Assays" abaixo. Em Trikh et al., as células que expressam o antígeno foram usadas num radioensaio. A ligação de proteína de ligação a antígeno identificada por 125 I (por exemplo, anticorpo) ao antígeno de superfície de célula é medido com as células em suspensão. Em vários aspectos, a afinidade relativa de um anticorpo de CLDN6 é determinada por meio de um ensaio à base de FACS, em que diferentes concentrações de um anticorpo de CLDN6 conjugada a um fluoróforo são incubadas com células que expressam CLDN6 e a fluorescência emitida (que é uma medida direta de ligação de anticorpo-antígeno) é determinada. Uma curva que plota a fluorescência para cada dose ou concentração é produzida. O valor máximo é a concentração mais baixa em que a fluorescência atinge o platô ou alcança um máximo, que é quando a saturação de ligação ocorre. A metade do valor máximo é considerada uma EC50 ou uma IC50 e o anticorpo com a EC50/IC50 mais baixa é considerado como tendo a afinidade mais alta em relação a outros anticorpos testados da mesma maneira. Tal ensaio é descrito no presente documento no Exemplo 5.
[0060] Em vários aspectos, o valor de IC50, como determinado num ensaio de inibição de ligação competitiva, aproxima a KD da proteína de ligação a antígeno. Em vários casos, como discutido abaixo, o ensaio de competição é um ensaio à base de FACS executado com um anticorpo de referência, anticorpo secundário conjugado a fluoróforo e células que expressam CLDN6. Em vários aspectos, as células são geneticamente modificadas para superexpressar CLDN6. Em alguns aspectos, as células são células HEK293T transduzidas com um vetor viral para expressar CLDN6. Em aspectos alternativos, as células de modo endógeno expressam CLDN6. Antes de o ensaio à base de FACS ser executado, em alguns aspectos, as células que expressam CLDN6 de modo endógeno são pré-determinadas como células que expressam CLDN6 baixas ou células que expressam CLDN6 altas.
Em alguns aspectos, as células são células de câncer ou de tumor.
Em vários aspectos, as células são células de uma linhagem celular, por exemplo, uma linhagem celular de ovário, linhagem celular endometrial, linhagem celular de bexiga, linhagem celular de pulmão, linhagem celular gastrointestinal (GI), linhagem celular de fígado, linhagem celular de pulmão e similares.
Em vários aspectos, as células que expressam CLDN6 de modo endógeno como selecionado a partir do grupo consistindo em células ovarianas OVCA429, células endometriais ARK2, células ovarianas OAW28, células de bexiga UMUC-4, células ovarianas PEO14, células ovarianas OV177, células de pulmão H1693, células GI superiores MKN7, células ovarianas OV-90, células de fígado HUH-7, células ovarianas JHOS-4, células de pulmão H1435 e células GI superiores NUGC3. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno inibe a interação de ligação entre CLDN6 humana expressa pelas células e o anticorpo de referência, anticorpo de referência o qual é conhecido por se ligar a CLDN6, porém, não é uma proteína de ligação a antígeno da presente invenção.
Em vários casos, as proteínas de ligação a antígeno da presente invenção competem com o anticorpo de referência pela ligação à CLDN6 humana e, assim, reduzem a quantidade de CLDN6 humana ligada ao anticorpo de referência como determinado por um ensaio de ligação competitiva in vitro.
Em vários aspectos, as proteínas de ligação a antígeno da presente invenção inibem a interação de ligação entre CLDN6 humana e o anticorpo de referência e a inibição é caracterizada por uma IC50. Em vários aspectos, as proteínas de ligação a antígeno exibem uma IC50 menor que cerca de 2500 nM para inibir a interação de ligação entre CLDN6 humana e o anticorpo de referência. Em vários aspectos, as proteínas de ligação a antígeno exibem uma IC50 menor que cerca de 2000 nM, menor que cerca de 1500 nM, menor que cerca de 1000 nM, menor que cerca de 900 nm, menor que cerca de 800 nm, menor que cerca de 700 nm, menor que cerca de 600 nm, menor que cerca de 500 nm, menor que cerca de 400 nm, menor que cerca de 300 nm, menor que cerca de 200 nm ou menor que cerca de 100 nm. Em vários aspectos, as proteínas de ligação a antígeno exibem uma IC50 menor que cerca de 90 nM, menor que cerca de 80 nM, menor que cerca de 70 nM, menor que cerca de 60 nM, menor que cerca de 50 nM, menor que cerca de 40 nM, menor que cerca de 30 nM, menor que cerca de 20 nM ou menor que cerca de 10 nM. Em vários casos, as proteínas de ligação a antígeno da presente invenção competem contra um anticorpo de referência conhecido por se ligar à CLDN6 (o anticorpo de referência que é diferente de qualquer uma das proteínas de ligação a antígeno da presente invenção) para ligação à CLDN6. Consultar descrição adicional sob Ensaios de competição.
[0061] A avidez fornece uma medida da força geral de um complexo de anticorpo-antígeno. A mesma é dependente de três parâmetros principais: afinidade da proteína de ligação a antígeno para o epítopo, valência tanto da proteína de ligação a antígeno quanto da CLDN6 e disposição estrutural das partes que interagem. Quanto maios a valência de uma proteína de ligação a antígeno (número de sítio de ligação a antígeno), maior a quantidade de antígenos (CLDN6) que a mesma pode ligar. Em vários aspectos, as proteínas de ligação a antígeno têm uma forte avidez para CLDN6. Em vários aspectos, as proteínas de ligação a antígeno são multivalentes. Em vários aspectos, as proteínas de ligação a antígeno são bivalentes. Em vários casos, as proteínas de ligação a antígeno são monovalentes.
REATIVIDADE CRUZADA
[0062] Em várias modalidades, as proteínas de ligação a antígeno da presente invenção se ligam à CLDN6 e não se ligam a qualquer outro membro da família de CLDN, por exemplo, não reagem de modo cruzado com nenhum outro membro da família de CLDN. Em vários casos, as proteínas de ligação a antígeno da presente invenção são específicas de CLDN-6. Em várias modalidades, as proteínas de ligação a antígeno da presente invenção têm uma seletividade para CLDN6 que é pelo menos 10 vezes, 5 vezes, 4 vezes, 3 vezes, duas vezes maior que a seletividade da proteína de ligação a antígeno para CLDN3, CLDN4, CLDN9 ou uma combinação das mesmas. Em várias modalidades, as proteínas de ligação a antígeno da presente invenção têm uma seletividade para CLDN6 que é pelo menos 10 vezes, 5 vezes, 4 vezes, 3 vezes, duas vezes maior que a seletividade da proteína de ligação a antígeno para cada uma dentre CLDN3, CLDN4 e CLDN9. A seletividade pode ser baseada na KD exibida pela proteína de ligação a antígeno para CLDN6, ou um membro da família de CLDN, em que a KD pode ser determinada por técnicas conhecidas na técnica, por exemplo, ressonância plasmônica de superfície, ensaios de afinidade à base de FACS.
[0063] Em vários aspectos, as proteínas de ligação a antígeno da presente invenção se ligam à CLDN6 e não se ligam a qualquer uma dentre Claudin3 (CLDN3), Claudin4 (CLDN4) e Claudin9 (CLDN9). Em vários aspectos, as proteínas de ligação a antígeno não se ligam a qualquer uma dentre CLDN3, CLDN4 e CLDN9 e exibem uma IC 50 menor que cerca de 1200 nM (por exemplo, menor que cerca de 1000 nM, menor que cerca de 750 nM, menor que cerca de 500 nM, menor que cerca de 250 nM) num ensaio à base de FACS com células OVCA429 que expressam CLDN6 de modo endógeno. Em vários aspectos, as proteínas de ligação a antígeno não se ligam a qualquer uma dentre CLDN3, CLDN4 e CLDN9 e a concentração em que 50% de saturação de ligação é alcançada com células OVCA429 que expressam CLDN6 de modo endógeno é menor que cerca de 1200 nM (por exemplo, menor que cerca de 1000 nM, menor que cerca de 750 nM, menor que cerca de 500 nM, menor que cerca de 250 nM). Em vários aspectos, as proteínas de ligação a antígeno exibem pelo menos uma seletividade para CLDN 6 5 vezes maior que aquela para CLDN3, CLDN4 e CLDN9 e a concentração em que 50% de saturação de ligação é alcançada com células OVCA429 que expressam CLDN6 de modo endógeno é menor que cerca de 1200 nM (por exemplo, menor que cerca de 1000 nM, menor que cerca de 750 nM, menor que cerca de 500 nM, menor que cerca de 250 nM). Em vários aspectos, as proteínas de ligação a antígeno exibem uma IC50 menor que cerca de 1200 nM (por exemplo, menor que cerca de 1000 nM, menor que cerca de 750 nM, menor que cerca de 500 nM, menor que cerca de 250 nM) para modelos artificiais e endógenos de CLDN6 e exibem uma razão de mais de cerca de 5 vezes separando IC50s de CLDN6 de CLDN3, CLDN4 e/ou CLDN9. Em vários casos, as proteínas de ligação a antígeno exibem uma IC50 menor que cerca de 1200 nM (por exemplo, menor que cerca de 1000 nM, menor que cerca de 750 nM, menor que cerca de 500 nM, menor que cerca de 250 nM) para CLDN6 e exibem uma IC50 para qualquer uma dentre CLDN3, CLDN4 e CLDN9 pelo menos 5 vezes maior que a IC50.
[0064] Em várias modalidades, as proteínas de ligação a antígeno da presente invenção se ligam a CLDN6 e reagem de modo cruzado com (por exemplo, se ligam a) pelo menos um outro membro da família de CLDN. Em vários aspectos, as proteínas de ligação a antígeno da presente invenção se ligam a CLDN6 e uma ou mais dentre CLDN3, CLDN4 e CLDN9. Em vários aspectos, as proteínas de ligação a antígeno da presente invenção se ligam a CLDN6 e CLDN4 ou CLDN9, mas, não se ligam à CLDN3. Em vários casos, as proteínas de ligação a antígeno da presente invenção se ligam à CLDN6 e CLDN4, mas, não se ligam à CLDN3 nem CLDN9. Em vários casos, as proteínas de ligação a antígeno da presente invenção se ligam à CLDN6 e CLDN9, mas, não se ligam à CLDN3 ou CLDN4.
ENSAIOS DE COMPETIÇÃO
[0065] Em várias modalidades, a proteína de ligação a antígeno inibe uma interação de ligação entre CLDN6 humana e um anticorpo de referência, o anticorpo de referência que é conhecido por se ligar à CLDN6, mas, não é uma proteína de ligação a antígeno da presente invenção. Em vários casos, as proteínas de ligação a antígeno da presente invenção competem com o anticorpo de referência pela ligação à CLDN6 humana e, assim, reduzem a quantidade de CLDN6 humana ligada ao anticorpo de referência como determinado por um ensaio de ligação competitiva in vitro. Em várias modalidades, o anticorpo de referência se liga a um epítopo dentro da sequência de aminoácidos do domínio extracelular de CLDN6 humana, opcionalmente, na EL2 ou EL1. Em vários aspectos, o anticorpo de referência compreende uma sequência variável de cadeia leve codificada por SEQ ID Nº: 179, e uma sequência variável de cadeia pesada codificada por SEQ ID Nº: 180. Em vários aspectos, o anticorpo de referência compreende uma sequência variável de cadeia leve de SEQ ID Nº: 181 e uma sequência variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº: 182. Em vários aspectos, as proteínas de ligação a antígeno da presente invenção inibem a interação de ligação entre CLDN6 humana e o anticorpo de referência e a inibição é caracterizada por uma IC50. Em vários aspectos, as proteínas de ligação a antígeno exibem uma IC50 menor que cerca de 2500 nM para inibir a interação de ligação entre CLDN6 humana e o anticorpo de referência. Em vários aspectos, as proteínas de ligação a antígeno exibem uma IC50 menor que cerca de 2000 nM, menor que cerca de 1500 nM, menor que cerca de 1000 nM, menor que cerca de 900 nm, menor que cerca de 800 nm, menor que cerca de 700 nm, menor que cerca de 600 nm, menor que cerca de 500 nm, menor que cerca de 400 nm, menor que cerca de 300 nm, menor que cerca de 200 nm ou menor que cerca de 100 nm. Em vários aspectos, as proteínas de ligação a antígeno exibem uma IC50 menor que cerca de 90 nM, menor que cerca de 80 nM, menor que cerca de 70 nM, menor que cerca de 60 nM, menor que cerca de 50 nM, menor que cerca de 40 nM, menor que cerca de 30 nM, menor que cerca de 20 nM ou menor que cerca de 10 nM.
[0066] Em vários casos, as proteínas de ligação a antígeno da presente invenção competem com o anticorpo de referência pela ligação à CLDN6 humana e, assim, reduzem a quantidade de CLDN6 humana ligada ao anticorpo de referência como determinado por um ensaio de ligação competitiva in vitro. Em vários aspectos, o ensaio de ligação competitiva in vitro é um ensaio à base de FACS, em que a fluorescência de um anticorpo secundário conjugado a fluoróforo que se liga ao Fc do anticorpo de referência é medida na ausência ou presença de uma quantidade particular da proteína de ligação a antígeno da presente invenção. Tal ensaio à base de FACS é descrito no presente documento nos EXEMPLOS. Em vários aspectos, o ensaio à base de FACS é executado com o anticorpo de referência, anticorpo secundário conjugado a fluoróforo e células que expressam CLDN6. Em vários aspectos, as células são geneticamente modificadas para superexpressar CLDN6. Em alguns aspectos, as células são células HEK293T transduzidas com um vetor viral para expressar CLDN6. Em aspectos alternativos, as células de modo endógeno expressam
CLDN6. Antes de o ensaio à base de FACS ser executado, em alguns aspectos, as células que expressam CLDN6 de modo endógeno são pré-determinadas como células que expressam CLDN6 baixas ou células que expressam CLDN6 altas.
Em alguns aspectos, as células são células de câncer ou de tumor.
Em vários aspectos, as células são células de uma linhagem celular, por exemplo, uma linhagem celular de ovário, linhagem celular endometrial, linhagem celular de bexiga, linhagem celular de pulmão, linhagem celular gastrointestinal (GI), linhagem celular de fígado, linhagem celular de pulmão e similares.
Em vários aspectos, as células que expressam CLDN6 de modo endógeno como selecionado a partir do grupo consistindo em células ovarianas OVCA429, células endometriais ARK2, células ovarianas OAW28, células de bexiga UMUC-4, células ovarianas PEO14, células ovarianas OV177, células de pulmão H1693, células GI superiores MKN7, células ovarianas OV-90, células de fígado HUH-7, células ovarianas JHOS-4, células de pulmão H1435 e células GI superiores NUGC3. Em vários casos, as proteínas de ligação a antígeno da presente invenção se ligam à CLDN6 expressa de modo endógeno por uma ou mais dentre as células ARK2, células OVCA429, células LS513 ou células MCF7 com alta afinidade.
Em vários aspectos, as proteínas de ligação a antígeno exibem uma IC50 menor que cerca de 3000 nM como determinado num ensaio de inibição de ligação competitiva à base de FACS usando uma ou mais dentre as células ARK2, células OVCA429, células LS513 ou células MCF7. Em vários aspectos, as proteínas de ligação a antígeno exibem uma IC50 menor que cerca de 2500 nM, menor que cerca de 2000 nM, menor que cerca de 1750 nM, menor que cerca de 1500 nM, menor que cerca de 1250 nM, menor que cerca de 1000 nM, menor que cerca de 750 nM ou menor que cerca de 500 nM, como determinado num ensaio de inibição de ligação competitiva à base de FACS usando uma ou mais dentre as células ARK2, células OVCA429, células LS513 ou células MCF7. Em vários aspectos, as proteínas de ligação a antígeno exibem uma IC50 menor que cerca de 400 nM, menor que cerca de 300 nM, menor que cerca de 200 nM, menor que cerca de 100 nM, menor que cerca de 75 nM, menor que cerca de 50 nM, menor que cerca de 25 nM ou menor que cerca de 10 nM, como determinado num ensaio de inibição de ligação competitiva à base de FACS usando uma ou mais dentre as células ARK2, células OVCA429, células LS513 ou células MCF7.
[0067] Outros ensaios de ligação, por exemplo, ensaios de ligação competitiva ou ensaios de competição, que testam a capacidade de um anticorpo para competir com um segundo anticorpo pela ligação a um antígeno, ou a um epítopo do mesmo, são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Trikha et al., Int J Cancer 110: 326-335 (2004); Tam et al., Circulation 98(11): 1085-1091 (1998). Publicação de Pedido de Patente Americana No US20140178905, Chand et al., Biologicals 46: 168-171 (2017); Liu et al., Anal Biochem 525: 89-91 (2017); e Goolia et al., J Vet Diagn Invest 29(2): 250-253 (2017). Além disto, outros métodos para comparar dois anticorpos são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, ressonância plasmônica de superfície (SPR). A SPR pode ser usada para determinar as constantes de ligação do anticorpo e segundo anticorpo e as duas constantes de ligação podem ser comparadas.
MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE ANTICORPO E MÉTODOS RELACIONADOS
[0068] Os métodos adequados para produzir proteínas de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpos, fragmentos de anticorpo de ligação a antígeno e produtos de proteína de anticorpo) são conhecidos na técnica. Por exemplo, os métodos de hibridoma padrão para produzir anticorpos são descritos, por exemplo, em Harlow e Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), e CA. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5a Edição, Garland Publishing, New York, NY (2001)). Um método diverso para preparar anticorpos monoclonais de CLDN6 ou da presente invenção é fornecido no presente documento em EXEMPLOS.
[0069] Dependendo da espécie hospedeira, vários adjuvantes podem ser usados para aumentar a resposta imunológica levando a uma maior produção de anticorpo pelo hospedeiro. Tais adjuvantes incluem, mas, sem limitações, Freund's, géis minerais como hidróxido de alumínio e substâncias ativas de superfície como lisolectina, poliois plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões de óleo, hemocianina de lapa californiana e dinitrofenol. BCG (bacilli Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum são adjuvantes humanos potencialmente úteis.
[0070] Outros métodos de produção de anticorpo são resumidos em Tabela 1. TABELA 1. i.Técnica ii.Várias referências iv.Haskard e Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361- iii.Os métodos de hibridoma de EBV e 67 (1984), Roder et al., Methods Enzymol., 121, 140- sistemas de expressão de vetor de 67 (1986), and Huse et al., Science, 246, 1275-81 bacteriófago (1989)).
vi.Patentes No U.S. 5.545.806, 5.569.825 e 5.714.352 e v.Os métodos para produzir anticorpos Publicação de Pedido de Patente No U.S. em animais não humanos 2002/0197266 vii.induzir produção in vivo na população de linfócitos por ou viii.Orlandi et al (Proc Natl Acad Sci 86: 3833-3837; examinação de bibliotecas de 1989), e Winter G e Milstein C (Nature 349: 293-299, imunoglobulina recombinante ou 1991). painéis e reagentes de ligação altamente específicos ix.Os métodos para produzir proteínasx.Produção e Purifiacação de Proteína" Nat Methods recombinantes 5(2): 135-146 (2008).
i.Técnica ii.Várias referências xii.Janeway et al., supra, Huse et al., supra e Patente No U.S. 6.265.150). Métodos relacionados também são descritos na Patente No U.S. 5.403.484; Patente No U.S. 5.571.698; Patente No U.S. 5.837.500; Patente No U.S. 5.702.892. As técnicas descritas na Patente xi.Apresentação em fago No U.S. 5.780.279; Patente No U.S. 5.821.047; Patente No U.S. 5.824.520; Patente No U.S.
5.855.885; Patente No U.S. 5.858.657; Patente No U.S. 5.871.907; Patente No U.S. 5.969.108; Patente No U.S. 6.057.098; e Patente No U.S. 6.225.447 xiv.Patentes Nos U.S. 5.545.806 e 5.569.825, e Janeway xiii.Os anticorpos podem ser produzidos por camundongos transgênicos et al., supra.
[0071] Os métodos para testar anticorpos quanto à capacidade para se ligarem ao epítopo de CLDN6, independentemente de como os anticorpos são produzidos são conhecidos na técnica e incluem qualquer ensaio de ligação de anticorpo-antígeno, como, por exemplo, radioimunoensaio (RIA), ELISA, Western blot, imunoprecipitação, SPR e ensaios de inibição competitiva (consultar, por exemplo, Janeway et al., infra, e a Publicação de Pedido de Patente No U.S. 2002/0197266, e a seção acima relacionada a ensaios de competição). SEQUÊNCIAS/ESTRUTURA
[0072] São fornecidas, no presente documento, proteínas de ligação a antígeno compreendendo (a) uma sequência de aminoácidos de região determinante de complementaridade (CDR) 1 de cadeia pesada (HC) apresentada na Tabela A ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 11, 17, 23, 29, 35, 41, 47, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125 e 131, ou uma sequência variante da mesma que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência; (b) uma sequência de aminoácidos de CDR2 de HC apresentada na Tabela A ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 86, 102, 108, 114, 120, 126 e 132, ou uma sequência variante das mesmas, que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência; (c) uma sequência de aminoácidos de CDR3 de HC apresentada na Tabela A ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 13, 19, 25, 31, 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127 e 133, ou uma sequência variante das mesmas que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência; (d) uma sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia leve (LC) apresentada na Tabela A ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 8, 14, 20, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122 e 128, ou uma sequência variante das mesmas que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência; (e) uma sequência de aminoácidos de CDR2 de LC apresentada na Tabela A ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123 e 129, ou uma sequência variante das mesmas que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência; (f) uma sequência de aminoácidos de CDR3 de LC apresentada na Tabela A ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 10, 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124 e 130, ou uma sequência variante das mesmas que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência; ou (g) uma combinação de quaisquer dois ou mais dentre (a) a (f).
TABELA A CDR1 de CDR2 de CDR3 de CDR1 de CDR2 de CDR3 de
LC LC LC HC HC HC AB1 8 9 10 11 12 13 AB2 14 15 16 17 18 19 AB3 20 21 22 23 24 25 AB4 26 27 28 29 30 31 AB5 32 33 34 35 36 37 AB6 38 39 40 41 42 43 AB7 44 45 46 47 48 49 AB8 50 51 52 53 54 55 AB9 56 57 58 59 60 61 AB10 62 63 64 65 66 67 AB11 68 69 70 71 72 73 AB12 74 75 76 77 78 79 AB13 80 81 82 83 84 85 AB14 86 87 88 89 90 91 AB15 92 93 94 95 96 97 AB16 98 99 100 101 102 103 AB17 104 105 106 107 108 109 AB18 110 111 112 113 114 115 AB19 116 117 118 119 120 121 AB20 122 123 124 125 126 127 AB21 128 129 130 131 132 133
[0073] Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de CDR1 de LC, uma sequência de aminoácidos de CDR2 de LC e uma sequência de aminoácidos de CDR3 de LC apresentada na Tabela A e pelo menos 1 ou 2 dentre as sequências de aminoácidos de CDR de HC apresentadas na Tabela A. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de CDR1 de HC, uma sequência de aminoácidos de CDR2 de HC e uma sequência de aminoácidos de CDR3 de HC apresentada na Tabela A e pelo menos 1 ou 2 dentre as sequências de aminoácidos de CDR de LC apresentadas na Tabela A.
[0074] Em várias modalidades, a proteína de ligação a antígeno compreende pelo menos 3, 4 ou 5 dentre as sequências de aminoácidos designadas pelas SEQ ID Nºs: numa única fileira da Tabela A. Em várias modalidades, a proteína de ligação a antígeno compreende cada uma das sequências de aminoácidos de CDR de LC designadas pelas SEQ ID Nºs: de uma única fileira da Tabela A e pelo menos 1 ou 2 das sequências de aminoácidos de CDR de HC designadas pelas SEQ ID Nºs: de uma única fileira da Tabela A. Em várias modalidades, a proteína de ligação a antígeno compreende cada uma das sequências de aminoácidos de CDR de HC designadas pelas SEQ ID Nºs: de uma única fileira da Tabela A e pelo menos 1 ou 2 das sequências de aminoácidos de CDR de LC designadas pelas SEQ ID Nºs: de uma única fileira da Tabela A. Em várias modalidades, a proteína de ligação a antígeno compreende todas as 6 dentre as sequências de aminoácidos de CDR designadas pelas SEQ ID Nºs: de uma única fileira da Tabela A. Em várias modalidades, a proteína de ligação a antígeno compreende seis sequências de aminoácidos de CDR selecionadas a partir do grupo consistindo em: (a) SEQ ID Nºs: 74 a 79; (b) SEQ ID Nºs: 50 a 55; (c) SEQ ID Nºs: 122 a 127; (d) SEQ ID Nºs: 26 a 31; (e) SEQ ID
Nºs: 128 a 133; (f) SEQ ID Nºs: 38 a 43; (g) SEQ ID Nºs: 62 a 67; (h) SEQ ID Nºs: 80 a 85; (i) SEQ ID Nºs: 44 a 49; (j) SEQ ID Nºs: 86 a 91; (k) SEQ ID Nºs: 104 a 109; (l) SEQ ID Nºs: 56 a 61; (m) SEQ ID Nºs: 32 a 37; (n) SEQ ID Nºs: 110 a 115; (o) SEQ ID Nºs: 98 a 103; (p) SEQ ID Nºs: 92 a 97; (q) SEQ ID Nºs: 116 a 121; (r) SEQ ID Nºs: 8 a 13; (s) SEQ ID Nºs: 68 a 73; (t) SEQ ID Nºs: 14 a 19; e (u) SEQ ID Nºs: 20 a 25.
[0075] Em vários casos, as sequências de aminoácidos da Tabela A são separadas por pelo menos um ou mais (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) aminoácido (ou aminoácidos) de intervenção. Em vários casos, há cerca de 10 a cerca de 20 aminoácidos entre as sequências da CDR1 de LC e a CDR2 de LC e cerca de 25 a cerca de 40 aminoácidos entre as sequências da CDR2 de LC e a CDR3 de LC. Em vários casos, há cerca de 14 a cerca de 16 aminoácidos entre as sequências da CDR1 de LC e a CDR2 de LC e cerca de 30 a cerca de 35 aminoácidos entre as sequências de CDR2 de LC e a CDR3 de LC. Em vários casos, há cerca de 10 a cerca de 20 aminoácidos entre as sequências da CDR1 de HC e CDR2 de HC e cerca de 25 a cerca de 40 aminoácidos entre as sequências da CDR2 de HC e a CDR3 de HC. Em vários casos, há cerca de 14 a cerca de 16 aminoácidos entre as sequências de CDR1 de HC e a CDR2 de HC e cerca de 30 a cerca de 35 aminoácidos entre as sequências de CDR2 de HC e a CDR3 de HC.
[0076] Em várias modalidades, a proteína de ligação a antígeno compreende (a) uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada apresentada na Tabela B ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173 e 175, ou uma sequência variante das mesmas que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de
85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência; ou (b) uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve apresentada na Tabela B ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174 e 176, ou uma sequência variante das mesmas que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência; ou (c) tanto (a) quanto (b).
TABELA B Região Variável de Cadeia Leve Região Variável de Cadeia Pesada AB1 134 135 AB2 136 137 AB3 138 139 AB4 140 141 AB5 142 143 AB6 144 145 AB7 146 147 AB8 148 149 AB9 150 151 AB10 152 153 AB11 154 155 AB12 156 157 AB13 158 159 AB14 160 161 AB15 162 163 AB16 164 165 AB17 166 167 AB18 168 169 AB19 170 171 AB20 172 173 AB21 174 175
[0077] Em várias modalidades, a proteína de ligação a antígeno compreende um par de sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo consistindo em: (a) SEQ ID Nºs: 156 e 157; (b) SEQ ID Nºs: 148 e 149; (c) SEQ ID Nºs: 172 e 173; (d) SEQ ID Nºs: 140 e 141; (e) SEQ ID Nºs: 174 e 175; (f) SEQ ID Nºs: 144 e 145; (g) SEQ ID Nºs: 152 e 153; (h) SEQ ID Nºs: 158 e 159; (i) SEQ ID Nºs: 146 e 147; (j) SEQ ID Nºs: 160 e 161; (k) SEQ ID Nºs: 166 e 167; (l) SEQ ID Nºs: 150 e 151; (m) SEQ ID Nºs: 142 e 143; (n) SEQ ID Nºs: 168 e 169; (o) SEQ ID Nºs: 164 e 165; (p) SEQ ID Nºs: 162 e 163; (q) SEQ ID Nºs: 170 e 171; (r) SEQ ID Nºs: 134 e 135; (s) SEQ ID Nºs: 154 e 155; (t) SEQ ID Nºs: 136 e 137; e (u) SEQ ID Nºs: 138 e 139.
[0078] Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno não compreende um par de sequências de aminoácidos codificado pelas sequências de SEQ ID Nºs: 179 e 180. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno não compreende um par de sequências de aminoácidos de SEQ ID Nºs: 181 e 182. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno não compreende um par de sequências de aminoácidos codificado pelas sequências de SEQ ID Nºs: 183 e 184. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno não compreende um par de sequências de aminoácidos de SEQ ID Nºs: 185 e 186.
[0079] Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é similar a uma sequência de aminoácidos mencionada acima, contudo, a proteína de ligação a antígeno retém substancialmente sua função biológica, por exemplo, sua capacidade de se ligar à CLDN6 humana, reduzir o crescimento de tumor, tratar câncer.
[0080] Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que difere por apenas 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais aminoácidos, em relação à sequência (ou sequências) de aminoácidos mencionada acima. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência variante da sequência mencionada, sequência variante a qual difere por apenas um ou dois aminoácidos, em relação à sequência mencionada.
Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreendendo uma ou mais substituições de aminoácido que ocorrem fora das CDRs, por exemplo, a uma ou mais substituições de aminoácido ocorrem dentro da região (ou regiões) de framework da cadeia pesada ou leve.
Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreendendo uma ou mais substituições de aminoácido, contudo, a proteína de ligação a antígeno retém as sequências de aminoácidos das seis CDRs.
Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que tem apenas 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais substituições de aminoácido conservativas, em relação à sequência (ou sequências) de aminoácidos mencionada acima.
Como usado no presente documento, o termo "substituição de aminoácido conservativa" se refere à substituição de um aminoácido por outro aminoácido que tem propriedades similares, por exemplo, tamanho, carga, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou aromaticidade e inclui trocas dentro de um dos seguintes cinco grupos: I.
Resíduos pequenos alifáticos não polares ou ligeiramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly II.
Os resíduos polares negativamente carregados e suas amidas e ésteres: Asp, Asn, Glu, Gln, ácido cisteico e ácido homocisteico; III.
Os resíduos polares positivamente carregados: His, Arg, Lys; Ornitina (Orn) IV.
Os resíduos grandes alifáticos não polares: Met, Leu, Ile, Val, Cys, Norleucina (Nle), homocisteína V.
Os resíduos aromáticos grandes:
Phe, Tyr, Trp, acetil fenilalanina
[0081] Em vários aspectos, a substituição de aminoácido conservativa é uma troca dentro de um dos seguintes grupos de aminoácidos: I. aminoácidos alifáticos: Gly, Ala, Val, Leu, Ile II. aminoácidos não aromáticos compreendendo uma hidroxila de cadeia lateral: Serc Thr III. aminoácidos compreendendo uma cadeia lateral de enxofre: Cys, Met IV: aminoácidos compreendendo um anel aromático de cadeia lateral: Phe, Tyr, Trp. V: aminoácido ácido: Glu; Asp VI: aminoácido básico: Arg; Lys VII: aminoácido compreendendo uma amida de cadeia lateral: Gln, Asn VIII: aminoácido compreendendo um imidazol de cadeia lateral: His, ácido alfa-dimetil imidiazol acético (DMIA) IX: ácido imino: Pro, 4-hidroxi-Pro, 4-amino-Pro
[0082] Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que tem mais de ou cerca de 30%, mais de ou cerca de 50% ou mais de ou cerca de 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos mencionada acima. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou tem mais de 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos mencionada acima. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou tem mais de 90% de identidade de sequência ao longo do comprimento total da sequência de aminoácidos mencionada acima. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência ao longo do comprimento total da sequência de aminoácidos mencionada acima.
[0083] Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência variante da sequência mencionada, sequência variante a qual tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequência, em relação à sequência mencionada acima. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência variante da sequência mencionada, sequência variante a qual tem pelo menos ou cerca de 80% de identidade de sequência, em relação à sequência mencionada acima. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência variante da sequência mencionada, sequência variante a qual tem pelo menos ou cerca de 90% de identidade de sequência, em relação à sequência mencionada acima. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência variante da sequência mencionada, sequência variante a qual tem pelo menos ou cerca de 95% de identidade de sequência, em relação à sequência mencionada acima.
[0084] Em várias modalidades, a proteína de ligação a antígeno compreende uma, duas, três, quatro ou cinco sequências das SEQ ID Nºs. numa única fileira da Tabela A e pelo menos uma sequência variante que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência com qualquer uma dentre SEQ ID Nºs: 8 a 133. Em várias modalidades, a proteína de ligação a antígeno compreende uma, duas, três, quatro ou cinco sequências de um conjunto de sequências selecionado a partir de: (a) SEQ ID Nºs: 74 a 79; (b) SEQ ID Nºs: 50 a 55; (c) SEQ ID Nºs: 122 a 127; (d) SEQ ID Nºs: 26 a 31; (e) SEQ ID Nºs: 128 a 133; (f) SEQ ID Nºs: 38 a 43; (g) SEQ ID Nºs: 62 a 67; (h) SEQ ID Nºs: 80 a 85; (i) SEQ ID Nºs: 44 a 49; (j) SEQ ID Nºs: 86 a 91; (k) SEQ ID Nºs: 104 a 109; (l) SEQ ID Nºs: 56 a 61; (m) SEQ ID Nºs: 32 a 37; (n) SEQ ID Nºs: 110 a 115; (o) SEQ ID Nºs: 98 a 103; (p) SEQ ID Nºs: 92 a 97; (q) SEQ ID Nºs: 116 a 121; (r) SEQ ID Nºs: 8 a 13; (s) SEQ ID Nºs: 68 a 73; (t) SEQ ID Nºs: 14 a 19; e (u) SEQ ID Nºs: 20 a 25, em que a proteína de ligação a antígeno compreende ainda pelo menos uma sequência variante que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência com pelo menos uma das sequências do conjunto. Por exemplo, em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreende quatro sequências de SEQ ID Nºs: 74 a 79, a saber, SEQ ID Nºs: 74 a 77, em que a proteína de ligação a antígeno compreende duas sequências variantes: uma sequência variante que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência com a SEQ ID Nº: 78 e outra sequência variante que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência com SEQ ID Nº: 79.
[0085] Em várias modalidades, a proteína de ligação a antígeno compreende um par de sequências variantes que têm pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência com qualquer uma dentre SEQ ID Nºs: 134 a
175. Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno compreende um par de sequências variantes que têm pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência com (a) SEQ ID Nºs: 156 e 157; (b) SEQ ID Nºs: 148 e 149; (c) SEQ ID Nºs: 172 e 173; (d) SEQ ID Nºs: 140 e 141; (e) SEQ ID Nºs: 174 e 175; (f) SEQ ID Nºs: 144 e 145; (g) SEQ ID Nºs: 152 e 153; (h) SEQ ID Nºs: 158 e 159; (i) SEQ ID Nºs: 146 e 147; (j) SEQ ID Nºs: 160 e 161; (k) SEQ ID Nºs: 166 e 167; (l) SEQ ID Nºs: 150 e 151; (m) SEQ ID Nºs: 142 e 143; (n) SEQ ID Nºs: 168 e 169; (o) SEQ ID Nºs: 164 e 165; (p) SEQ ID Nºs: 162 e 163; (q) SEQ ID Nºs: 170 e 171; (r) SEQ ID Nºs: 134 e 135; (s) SEQ ID Nºs: 154 e 155; (t) SEQ ID Nºs: 136 e 137; e (u) SEQ ID Nºs: 138 e 139. Em várias modalidades, a proteína de ligação a antígeno compreende um par de sequências: uma sequência da Tabela B e outra sequência que é uma sequência variante que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência com qualquer uma dentre SEQ ID Nºs: 134 a
175. Em várias modalidades, a proteína de ligação a antígeno compreende uma par de sequências: uma sequência selecionada a partir de (a) SEQ ID Nºs: 156 e 157; (b) SEQ ID Nºs: 148 e 149; (c) SEQ ID Nºs: 172 e 173; (d) SEQ ID Nºs: 140 e 141; (e) SEQ ID Nºs: 174 e 175; (f) SEQ ID Nºs: 144 e 145; (g) SEQ ID Nºs: 152 e 153; (h) SEQ ID Nºs: 158 e 159; (i) SEQ ID Nºs: 146 e 147; (j) SEQ ID Nºs: 160 e 161; (k) SEQ ID Nºs: 166 e 167; (l) SEQ ID Nºs: 150 e 151; (m) SEQ ID Nºs: 142 e 143; (n) SEQ ID Nºs: 168 e 169; (o) SEQ ID Nºs: 164 e 165; (p) SEQ ID Nºs: 162 e 163; (q) SEQ ID Nºs: 170 e 171; (r) SEQ ID Nºs: 134 e 135; (s) SEQ ID Nºs: 154 e 155; (t) SEQ ID Nºs: 136 e 137; e (u) SEQ ID Nºs: 138 e 139, e outra sequência que é uma sequência variante que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de
95%) de identidade de sequência com uma sequência de (a) a (u). Por exemplo, em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de SEQ ID Nº: 134 e a proteína de ligação a antígeno compreende ainda uma sequência variante que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência com SEQ ID Nº: 135.
[0086] Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de uma sequência de aminoácidos mencionada acima com uma ou mais substituições de aminoácido para reduzir ou eliminar aminoácidos reativos para diminuir ou impedir reações de cadeia lateral indesejadas. Por exemplo, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de uma sequência de aminoácidos mencionada acima com um ou mais (i) resíduos de Trp substituídos por His, Tyr ou Phe; (ii) resíduos de Asn substituídos por Gln, Ser, Ala ou Asp; (iii) resíduos de Asp que ocorrem imediatamente antes de um resíduo de Pro substituído por Ala, Ser ou Glu, (iv) resíduos de Asn substituídos por Gln, Ser ou Ala; e/ou (v) resíduos de Cys substituídos por Tyr, Ser ou Ala. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de uma sequência de aminoácidos mencionada acima com uma substituição de aminoácido prevista para ter maior afinidade de ligação, maior estabilidade ou outro atributo positivo, com base em eventos de SHM ou com base em análises estatísticas de múltiplas outras sequências de anticorpos similares. Em alguns aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreende (a) uma sequência de aminoácidos de CDR1 de HC apresentada na Tabela A1 ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 452, 455, 461, 465, 71 e 472, ou uma sequência variante das mesmas que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70 (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência; (b) uma sequência de aminoácidos de CDR2 de HC apresentada na Tabela A1 ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 475, 456, 462, 466, 468 e 473; ou uma sequência variante das mesmas, que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência; (c) uma sequência de aminoácidos de CDR3 de HC apresentada na Tabela A1 ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 453, 457, 463, 467, 469 e 474, ou uma sequência variante das mesmas que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência; (d) uma sequência de aminoácidos de CDR1 de LC apresentada na Tabela A1 ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 449, 476, 458, 464, 68 e 470; ou uma sequência variante das mesmas que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência; (e) uma sequência de aminoácidos de CDR2 de LC apresentada na Tabela A1 ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 450, 477, 459, 57, 69 e 471; ou uma sequência variante das mesmas, que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência; (f) uma sequência de aminoácidos de CDR3 de LC apresentada na Tabela A1 ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 451, 454, 460, 58, 70 e 112, ou uma sequência variante das mesmas que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência ou (g) uma combinação de quaisquer dois ou mais dentre (a) a (f). TABELA A1: CDR1 de LC CDR2 de LC CDR3 de LC CDR1 de HC CDR2 de HC CDR3 de HC AB1* 449 450 451 452 475 453 AB3* 476 477 454 455 456 457 AB4* 458 459 460 461 462 463 AB9* 464 57 58 465 466 467 AB11* 68 69 70 71 468 469 AB18* 470 471 112 472 473 474
[0087] Em alguns aspectos, a CDR1 de HC compreende Gly imediatamente N-terminal de SEQ ID Nº: 452 e, opcionalmente, em alguns aspectos, a CDR1 de HC compreende MX imediatamente C- terminal de SEQ 452, em que X é H, N ou S. Em vários aspectos, a CDR3 de HC compreende Ala imediatamente N-terminal de SEQ ID Nº:
453. Em vários aspectos, a CDR1 de LC compreende ainda TAS imediatamente N-terminal de SEQ ID Nº: 449 e opcionalmente XH imediatamente C-terminal de SEQ ID Nº: 449, em que X é H, S, Y ou Q. Em alguns aspectos, como descrito abaixo, o primeiro aminoácido de SEQ ID Nº: 449 é S ou Q. Em alguns aspectos, como descrito abaixo, o primeiro aminoácido de SEQ ID Nº: 451 é S ou Q.
[0088] Em vários aspectos, a CDR1 de HC compreende Gly imediatamente N-terminal de SEQ ID Nº: 455 e opcionalmente, em vários aspectos, a CDR1 de HC compreende MX imediatamente C- terminal de SEQ ID Nº: 455, em que X é N, S ou H. Em alguns aspectos,
CDR2 de HC compreende Gln imediatamente N-terminal de SEQ ID Nº: SEQ ID Nº: 456 e opcionalmente H imediatamente C-terminal de SEQ ID Nº: 456. Em vários aspectos, a CDR1 de LC compreende RIS imediatamente N-terminal de SEQ ID Nº: 476 e opcionalmente, compreende LA imediatamente C-terminal de SEQ ID Nº: 476. Em vários aspectos, a CDR2 de LC compreende XLVE imediatamente C- terminal de SEQ ID Nº: 477, em que X é I ou S.
[0089] Em vários aspectos, a CDR1 de HC compreende MH imediatamente C-terminal de SEQ ID Nº: 461. Em vários aspectos, a CDR2 de HC compreende Tyr imediatamente N-terminal de SEQ ID Nº: 462 e opcionalmente TH imediatamente C-terminal de SEQ ID Nº: 462. Em aspectos exemplificativos, a CDR3 de HC não inclui os primeiros dois aminoácidos de SEQ ID Nº: 463. Em vários aspectos, a CDR1 de LC compreende RSS imediatamente N-terminal de SEQ ID Nº: 458 e opcionalmente LN imediatamente C-terminal de SEQ ID Nº: 458. Em vários aspectos, a CDR2 de LC compreende XRFS imediatamente C- terminal de SEQ ID Nº: 459, em que X é Q, S, A ou D.
[0090] Em vários aspectos, a CDR1 de HC compreende MH imediatamente C-terminal de SEQ ID Nº: 465. Em vários aspectos, a CDR2 de HC compreende YI imediatamente N-terminal de SEQ ID Nº: 466 e opcionalmente Xaa imediatamente C-terminal de SEQ ID Nº: 466, em que Xaa é N, S, Q ou A. Em vários aspectos, a CDR1 de LC compreende LAS imediatamente N-terminal de SEQ ID Nº: 464 e opcionalmente LA imediatamente C-terminal de SEQ ID Nº: 464. Em vários aspectos, a CDR2 de LC compreende SLAD imediatamente C- terminal de SEQ ID Nº: 57.
[0091] Em vários aspectos, a CDR1 de HC compreende MH imediatamente C-terminal de SEQ ID Nº: 71. Em vários aspectos, a CDR2 de HC compreende Tyr imediatamente N-terminal de SEQ ID Nº: 468 e opcionalmente IY imediatamente C-terminal de SEQ ID Nº: 468.
Em vários aspectos, a CDR1 de LC compreende RAS imediatamente N-terminal de SEQ ID Nº: 68 e opcionalmente SYIH imediatamente C- terminal a SEQ 68. Em vários aspectos, a CDR2 de LC compreende XLES imediatamente C-terminal a SEQ ID Nº: 69, em que X é N, Q, S, A ou D.
[0092] Em vários aspectos, a CDR1 de LC compreende KSS imediatamente N-terminal de SEQ ID Nº: 470 e opcionalmente YLA imediatamente C-terminal a SEQ 470. Em vários aspectos, a CDR2 de LC compreende TRES imediatamente C-terminal de SEQ ID Nº: 471. Em vários aspectos, a CDR1 de HC compreende MN imediatamente C- terminal de SEQ ID Nº: 472. Em vários aspectos, a CDR2 de HC compreende Xaa imediatamente N-terminal de SEQ 473, em que Xaa é N, Q, S ou A e opcionalmente Thr imediatamente C-terminal de SEQ
473.
[0093] Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de CDR1 de LC, uma sequência de aminoácidos de CDR2 de LC e uma sequência de aminoácidos de CDR3 de LC apresentada na Tabela A1 e pelo menos 1 ou 2 das sequências de aminoácidos de CDR de HC apresentadas na Tabela A1. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de CDR1 de HC, uma sequência de aminoácidos de CDR2 de HC e uma sequência de aminoácidos de CDR3 de HC apresentada na Tabela A1 e pelo menos 1 ou 2 das sequências de aminoácidos de CDR de LC apresentadas na Tabela A1.
[0094] Em várias modalidades, a proteína de ligação a antígeno compreende pelo menos 3, 4 ou 5 das sequências de aminoácidos designadas pelo SEQ ID Nºs: numa única fileira da Tabela A1. Em várias modalidades, a proteína de ligação a antígeno compreende cada uma das sequências de aminoácidos de CDR de LC designadas pelas SEQ
ID Nºs: de uma única fileira da Tabela A1 e pelo menos 1 ou 2 das sequências de aminoácidos de CDR de HC designadas pelas SEQ ID Nºs: de uma única fileira da Tabela A1. Em várias modalidades, a proteína de ligação a antígeno compreende cada uma das sequências de aminoácidos de CDR de HC designadas pelas SEQ ID Nºs: de uma única fileira da Tabela A1 e pelo menos 1 ou 2 das sequências de aminoácidos de CDR de LC designadas pelas SEQ ID Nºs: de uma única fileira da Tabela A1. Em várias modalidades, a proteína de ligação a antígeno compreende todas as 6 das sequências de aminoácidos de CDR designadas pelas SEQ ID Nºs: de uma única fileira da Tabela A1. Em várias modalidades, a proteína de ligação a antígeno compreende seis sequências de aminoácidos de CDR selecionadas a partir do grupo consistindo em: (a) SEQ ID Nºs: 449 a 453 e 475; (b) SEQ ID Nºs: 476 a 477, 454 a 457; (c) SEQ ID Nºs: 458 a 463; (d) SEQ ID Nºs: 57, 58, 464 a 467; (e) SEQ ID Nºs: 68 a 71 e 468 a 469; e (f) SEQ ID Nºs: 112 e 470 a 474.
[0095] Em vários casos, as sequências de aminoácidos da Tabela A1 são separadas por pelo menos um ou mais (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) aminoácido (ou aminoácidos) de intervenção. Em vários casos, há cerca de 10 a cerca de 20 aminoácidos entre as sequências da CDR1 de LC e a CDR2 de LC e cerca de 25 a cerca de 40 aminoácidos entre as sequências da CDR2 de LC e a CDR3 de LC. Em vários casos, há cerca de 14 a cerca de 16 aminoácidos entre as sequências da CDR1 de LC e a CDR2 de LC e cerca de 30 a cerca de 35 aminoácidos entre as sequências de CDR2 de LC e a CDR3 de LC. Em vários casos, há cerca de 10 a cerca de 20 aminoácidos entre as sequências da CDR1 de HC e CDR2 de HC e cerca de 25 a cerca de 40 aminoácidos entre as sequências da CDR2 de HC e a CDR3 de HC. Em vários casos, há cerca de 14 a cerca de 16 aminoácidos entre as sequências de CDR1 de HC e a CDR2 de HC e cerca de 30 a cerca de 35 aminoácidos entre as sequências de CDR2 de HC e a CDR3 de HC.
[0096] Em várias modalidades, a proteína de ligação a antígeno compreende (a) uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada apresentada na Tabela B1 ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nº: 478, 480, 482, 484, 486 e 488, ou uma sequência variante das mesmas que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência; ou (b) uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve apresentada na Tabela B1 ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nº: 479, 481, 483, 485, 487 e 489, ou uma sequência variante das mesmas que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência; ou (c) tanto (a) quanto (b). TABELA B1 variável de HC variável de LC AB1* 478 479 AB3* 480 481 AB4* 482 483 AB9* 488 489 AB11* 486 487 AB18* 484 485
[0097] Em várias modalidades, a proteína de ligação a antígeno compreende um par de sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo consistindo em: (a) SEQ ID Nº: 478 e 479; (b) SEQ ID Nº: 480 e 481; (c) SEQ ID Nº: 482 e 483; (d) SEQ ID Nº: 484 e 485; (e) SEQ ID Nº: 486 e 487; e (f) SEQ ID Nº: 488 e 489. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência variante de uma sequência que tem uma SEQ ID Nº: listada na Tabela B1 que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência, em que o aminoácido (ou aminoácidos) diferente ocorre nas posições descritas abaixo em "anticorpos humanizados".
ANTICORPOS HUMANIZADOS
[0098] Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno é uma versão humanizada de uma proteína de ligação a antígeno descrita na Tabela A, na Tabela A1, na Tabela B ou na Tabela B1. AB1 HUMANIZADA
[0099] Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno é uma versão humanizada de AB1 como apresentado na Tabela B ou B1 com uma ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ou 35) substituições de aminoácido na região variável de cadeia pesada numa ou mais das seguintes posições: 5, 8, 11, 12, 13, 20, 31, 33, 35, 38, 40, 48, 50, 55, 57, 59, 61, 65, 66, 67, 68, 70, 72, 74, 76, 79, 80, 82, 87, 90, 91, 98, 101 e 116. Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº:
428. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno é uma versão humanizada de AB1 como apresentado na Tabela B ou B1 com uma ou mais substituições de aminoácido na região variável de cadeia pesada numa ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12) das seguintes posições: 20, 31, 35, 48, 50, 59, 67, 70, 74, 79, 98, 101. Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 429. Em vários aspectos, os aminoácidos nas posições mencionadas acima são selecionados a partir dos aminoácidos de acordo com a tabela abaixo: Posição Aminoácidos Posição Aminoácidos Posição Aminoácidos 5 Q, V 8 A, G 11 L,V 12 A, K 13 R, K 20 M, V 31 S, T, V, D 33 Y, T 35 H, N, S 38 K, R 40 R, A 48 I, M 50 F, V, T, Y, I 55 G, S 57 S, Y 59 D, E, N, S 61 N, A 65 K, Q 66 D, G 67 R, Q, N, K 68 T, V 70 L, M 72 R, A 74 K, T 79 V, D, S, A 82 Q, E 87 T, R 91 S, T 98 N, Q, H, D, R 101 Y 76 ST 116 A, S
[00100] Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno é uma versão humanizada de AB1 como apresentado na Tabela B ou B1 com uma ou mais substituições de aminoácido na região variável de cadeia leve numa ou mais, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 ou 41) das seguintes posições: 1, 3, 4, 9, 10, 11, 15, 17, 21, 24, 27, 29, 32, 34, 35, 43, 44, 48, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 61, 67, 71, 72, 73, 79, 80, 81, 84, 90, 92, 93, 94, 95, 96, 101, 107. Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 430. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno é uma versão humanizada de AB1 como apresentado na Tabela B ou B1 com uma ou mais substituições de aminoácido na região variável de cadeia leve numa ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13) das seguintes posições: 4, 21, 32, 34, 48, 51, 53, 61, 67, 79, 84, 91 e 93. Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 431. Em vários aspectos, os aminoácidos nas posições mencionadas acima são selecionados a partir dos aminoácidos de acordo com a tabela abaixo: Posição Aminoácidos Posição Aminoácidos Posição Aminoácidos 1 Q, D 3 V, Q 4 L, M 9 A, S 10 I, S 11 M, L 15 L, V 17 E, D 21 M, I 24 T, R 27 S, Q 32 T, V, F, D, S 34 F, L 35 H, S, Y, Q, N 43 S, K 44 S, A 48 W, L 51 S, T, Q, A 52 T, A 53 S, T, D, Q 54 N, S 56 A, Q 61 R, Q, S, D, 67 A, S, T, G 71 S, D 72 Y, F 73 S, T 79 M, L 80 E, Q 81 A, P 84 A, F 90 H, Q 91 Q, H, S 93 H, Q, S, Y 94 R, S 97 L, P 101 A, Q 107 L, I 29 V, I 92 Y, S 95 S, T AB3 HUMANIZADA
[00101] Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno é uma versão humanizada de AB3 como apresentado na Tabela B ou B1 com uma ou mais substituições de aminoácido na região variável de cadeia pesada numa ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,
32 ou 33) das seguintes posições: 3, 5, 18, 19, 23, 31, 33, 35, 40, 42, 49, 50, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 64, 76, 79, 80, 81, 87, 94, 95, 99, 106, 112, 114. Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 432. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno é uma versão humanizada de AB3 como apresentado na Tabela B ou B1 com uma ou mais substituições de aminoácido na região variável de cadeia pesada numa ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7) das seguintes posições: 31, 35, 50, 55, 79, 99, 106. Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº:
433. Em vários aspectos, os aminoácidos nas posições mencionadas acima são selecionados a partir dos aminoácidos de acordo com a tabela abaixo: Posição Aminoácidos Posição Aminoácidos Posição Aminoácidos 3 K, Q 5 E, L 18 M, L 19 K, R 23 V, A 31 N, S, R 33 W, A 35 N, S, H 40 S, A 42 E, G 49 A, S 50 Q, S, N, H, A 52 R, S 53 L, G 54 K, S 55 S, N, T, A, G 56 D, G 59 A, S 61 H, Y 64 E, D 76 D, N 79 R, N, Q, D, S 80 S, T 81 V, L 87 N, S 94 G, A 95 T, V, I 99 N, D, T, K, A 106 C, Y, A, S, T 112 T, L 114 I, T
[00102] Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno é uma versão humanizada de AB3 como apresentado na Tabela B ou B1 com uma ou mais substituições de aminoácido na região variável de cadeia leve numa ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ou 29) das seguintes posições: 9, 17, 18, 25, 27, 28, 30, 34, 40, 43, 45, 48, 50, 52, 53, 55, 56, 70, 72, 74, 76, 84, 85, 90, 91, 93, 94, 97 e 100. Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 434. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno é uma versão humanizada de AB3 como apresentado na Tabela B ou B1 com uma ou mais substituições de aminoácido na região variável de cadeia leve numa ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9) das seguintes posições: 25, 34, 48, 53, 55, 84, 85, 90 e 93. Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 435. Em vários aspectos, os aminoácidos nas posições mencionadas acima são selecionados a partir dos aminoácidos de acordo com a tabela abaixo: Posição Aminoácidos Posição Aminoácidos Posição Aminoácidos 9 A, S 17 E, D 18 T, R 25 I, V, L, T, A 34 A, S, N 40 Q, P 43 S, A 45 Q, K 48 V, I 53 I, V, L, T, S 55 V, T, L, A, Q 70 Q, D 72 S, T 74 K, T 76 N, S 84 G, A 85 N, Q, S, T 90 H, Q, S, T 93 T, S, N, G 100 G, Q 27 E, Q 28 N, S 30 Y, S 50 N, A 52 K, S 56 E, S 91 H, S 94 V, T 97 T, P AB4 HUMANIZADA
[00103] Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno é uma versão humanizada de AB4 como apresentado na Tabela B ou B1 com uma ou mais substituições de aminoácido na região variável de cadeia pesada numa ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36) das seguintes posições: 5, 11, 12, 13, 20, 29, 31, 33, 37, 38, 40, 45, 48, 50, 55, 56, 57, 59, 61, 62, 65, 66, 67, 68, 70, 72, 74, 76, 79, 82, 84, 87, 91, 97, 101, 117. Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 436. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno é uma versão humanizada de AB4 como apresentado na Tabela B ou B1 com uma ou mais substituições de aminoácido na região variável de cadeia pesada numa ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19) das seguintes posições: 20, 29, 31, 37, 45, 48, 56, 59, 61, 62, 65, 66, 68, 70, 74, 79, 84, 97 e 101. Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 437. Em vários aspectos, os aminoácidos nas posições mencionadas acima são selecionados a partir dos aminoácidos de acordo com a tabela abaixo: Posição Aminoácidos Posição Aminoácidos Posição Aminoácidos
5 Q, V 11 L, V 12 A, K
13 R, K 20 M, V 33 T, Y
37 I, V, F, Y 38 K, R 40 R, A
45 Q, L, V, T, N 48 I, M 50 Y, I
55 S, G 56 T, G, S, V, D 57 Y, S
59 H, K, S, Q, N 61 I, A, N, F, Y, V 62 K, Q
65 K, Q 66 D, G 67 K, R
68 A, V 70 L, M 72 A, R
74 T, K 76 S, T 79 A, V
82 Q, E 84 R, S, Q, D 87 T, R
91 S, T 97 S, A, T, V 101 L, V, F
117 A, S 29 F, Y, S, T 31 S, T, Y, D
[00104] Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno é uma versão humanizada de AB4 como apresentado na Tabela B ou B1 com uma ou mais substituições de aminoácido na região variável de cadeia leve numa ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24) das seguintes posições: 7, 14, 17, 18, 31, 33, 39, 41, 42, 44, 50, 51, 55, 57, 60, 81, 88, 92, 94, 95, 96, 99, 100, 105. Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 438. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno é uma versão humanizada de AB4 como apresentado na Tabela B ou B1 com uma ou mais substituições de aminoácido na região variável de cadeia leve numa ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7) das seguintes posições: 33, 39, 55, 57, 81, 95 e 96. Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº:
439. Em vários aspectos, os aminoácidos nas posições mencionadas acima são selecionados a partir dos aminoácidos de acordo com a tabela abaixo: Posição Aminoácidos Posição Aminoácidos Posição Aminoácidos 7 T, S 14 S, T 17 D, Q 18 Q, P 31 Y, H 33 D, N, E, Q 39 H, N, Q, D 41 F, Y 42 L, Q 44 K, R 50 K, R 51 R, L 55 K, R, Q 57 S, T, V 60 D, F 81 R, S, N, D 88 L, V 92 F, Y 94 M, S 95 Q, H, T 96 S, T, G, D 99 W, V 105 G, Q AB18 HUMANIZADA
[00105] Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno é uma versão humanizada de AB18 como apresentado na Tabela B ou B1 com uma ou mais substituições de aminoácido na região variável de cadeia pesada numa ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25) das seguintes posições: 5, 9, 11, 12, 20, 38, 40, 41, 43, 44, 48, 61, 65, 67, 68, 70, 72, 74, 76, 79, 82, 84, 87, 91 e 116 opcionalmente um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5) das seguintes posições: 20, 48, 68, 70, 79 Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 440 ou 441. Em vários aspectos, os aminoácidos nas posições mencionadas acima são selecionados a partir dos aminoácidos de acordo com a tabela abaixo: Posição Aminoácidos Posição Aminoácidos Posição Aminoácidos 5 K, V 9 P, A 11 L, V 12 E, K 20 I, V 38 K, R 40 S, A 41 N, P 43 K, Q 44 S, G 48 I, V, M 61 N, A 65 T, Q 67 K, R 68 A, V 70 L, M 72 V, R 74 K, T 76 S, T 79 A, V 82 Q, E 84 K, S 87 T, R 91 S, T 116 S, L
[00106] Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno é uma versão humanizada de AB18 como apresentado na Tabela B ou B1 com uma ou mais substituições de aminoácido na região variável de cadeia leve numa ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16) das seguintes posições: 1, 3, 9, 15, 18, 19, 21, 22, 49, 51, 69, 93, 84, 78, 105 e 111, opcionalmente, uma ou mais (por exemplo, 1, 2, ou 3) das seguintes posições: 19, 21 ou 84. Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 442 ou 443. Em vários aspectos, os aminoácidos nas posições mencionadas acima são selecionados a partir dos aminoácidos de acordo com a tabela abaixo:
Posição Aminoácidos Posição Aminoácidos Posição Aminoácidos 1 N, D 3 M, V 9 S, D 15 A, L 18 K, R 19 V, A 21 M, I 22 S, N 49 S, P 51 R, K 69 T, S 83 N, S 84 V, L 89 L, V 105 A, Q 111 L, I AB9 HUMANIZADA
[00107] Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno é uma versão humanizada de AB9 como apresentado na Tabela B ou B1 com uma ou mais substituições de aminoácido na região variável de cadeia pesada numa ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ou 29) das seguintes posições: 1, 5, 9, 11, 12, 20, 38, 40, 41, 43, 44, 48, 61, 63, 65, 67, 69, 70, 72, 73, 74, 76, 79, 84, 87, 91, 93, 112 e 113. Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 444. Em vários aspectos, os aminoácidos nas posições mencionadas acima são selecionados a partir dos aminoácidos de acordo com a tabela abaixo: Posição Aminoácidos Posição Aminoácidos Posição Aminoácidos 1 E, Q 5 Q, V 9 P, A 11 L, V 12 V, K 20 M, V 38 K R, 40 S, A 41 H, P 43 KQ 44 S, G 48 I, M 61 N, A 63 N, K 65 K, Q 67 K, R 69 A, V 70 L, M 72 V, R 73 N, D 74 K, T 76 S, T 79 A, V 84 R, S 87 T, R 91 S, T 93 A, V 112 T, L 113 L, V
[00108] Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno é uma versão humanizada de AB9 como apresentado na Tabela B ou B1 com uma ou mais substituições de aminoácido na região variável de cadeia leve numa ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15) das seguintes posições: 9, 11, 15, 17, 18, 43, 45, 70, 72, 73, 74, 80, 84, 85 e 100. Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 445. Em vários aspectos, os aminoácidos nas posições mencionadas acima são selecionados a partir dos aminoácidos de acordo com a tabela abaixo: Posição Aminoácidos Posição Aminoácidos Posição Aminoácidos 9 A, S 11 Q, L 15 L, V 17 E, D 18 S, R 43 S, A 45 Q, K 70 R, D 72 S, T 73 F, L 74 K, R 80 A, P 84 V, A 85 S, T 100 G, Q AB11 HUMANIZADA
[00109] Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno é uma versão humanizada de AB11 como apresentado na Tabela B ou B1 com uma ou mais substituições de aminoácido na região variável de cadeia leve numa ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15) das seguintes posições: 1, 15, 18, 19, 42, 49, 63, 75, 76, 78, 80, 84, 88 e 93. Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº:
446. Em vários aspectos, os aminoácidos nas posições mencionadas acima são selecionados a partir dos aminoácidos de acordo com a tabela abaixo:
Posição Aminoácidos Posição Aminoácidos Posição Aminoácidos 1 D, E 15 R, G 18 R, L 19 K, R 42 E, G 49 A, S 63 T, S 75 P, A 76 T, K 78 T, S 80 F, Y 84 T, N 88 S, A 93 M, V
[00110] Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno é uma versão humanizada de AB11 como apresentado na Tabela B ou B1 com uma ou mais substituições de aminoácido na região variável de cadeia leve numa ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15) das seguintes posições: 4, 9, 17, 22, 64, 78, 80, 81, 82, 83, 84, 87, 89, 104 e 110, opcionalmente, uma ou mais das seguintes posições: 4, 82, 110 Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 447 ou 448. Em vários aspectos, os aminoácidos nas posições mencionadas acima são selecionados a partir dos aminoácidos de acordo com a tabela abaixo: Posição Aminoácidos Posição Aminoácidos Posição Aminoácidos 4 L, M 9 A, D 17 Q, E 22 S, N 64 A, D 78 N, T 80 H, S 81 P, S 82 V, L 83 E, Q 84 E, A 87 A, V 89 T, V 104 A, Q 110 L, I
[00111] Em várias modalidades, a proteína de ligação a antígeno compreende (a) uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada apresentada na Tabela C ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: 376 a 379, 384 a 387, 391 a 396, 403 a 408, 412, 413, 416 a 419 e 422 a 427 ou uma sequência variante das mesmas que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70%, ou cerca de 80%, ou cerca de 85%, ou cerca de 90%, ou cerca de 95% de identidade de sequência; ou (b) uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve apresentada na Tabela C ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: 380 a 383, 388 a 390, 397 a 402, 409 a 411, 414, 415, 420 e 421 ou uma sequência variante das mesmas que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70%, ou cerca de 80%, ou cerca de 85%, ou cerca de 90%, ou cerca de 95% de identidade de sequência; ou (c) tanto (a) quanto (b).
TABELA C Região Variável de Cadeia Região Variável de Cadeia Pesada Leve Humanizada Humanizada AB1 380, 381, 382.383 376, 377, 378, 379 AB3 388, 389, 390 384, 385, 386, 387, 422 391, 392, 392, 394, 395, 396, 423, 424, AB4 397, 398, 399, 400, 401, 402 425, 426, 427 AB9 409, 410, 411 403, 404, 405, 406, 407, 408 AB11 414, 415 412, 413 AB18 420, 421 416, 417, 418, 419
[00112] Em várias modalidades, a proteína de ligação a antígeno humanizada compreende um par de sequências de aminoácidos como mostrado na Tabela D.
TABELA D
AB humanizada HC LC
1-1 376 380
1-2 377 380
1-3 377 381
1-4 377 382
1-5 377 383
1-6 378 381
1-7 378 382
1-8 378 383
1-9 379 381
1-10 379 382
1-11 379 383
3-1 384 388
3-2 385 388
3-3 385 389
3-4 386 388
3-5 386 389
3-6 387 388
3-7 387 389
3-9 422 389
4-1 391 397
4-2 392 397
4-3 392 398
4-4 393 398
4-5 394 398
4-6 395 398
4-7 396 398
AB humanizada HC LC 4-8 423 398 4-9 424 398 4-10 425 398 4-11 426 398 4-12 427 398 9-1 403 409 9-2 404 409 9-3 405 410 9-4 405 411 9-5 406 410 9-6 406 411 9-7 407 410 9-8 407 411 9-9 408 410 9-10 408 411 11-1 412 414 11-2 413 414 11-3 413 415 18-1 416 420 18-2 417 420 18-3 417 420 18-4 417 421 18-5 418 420 18-6 418 421 18-7 419 420 18-8 419 421
[00113] Em várias modalidades, a proteína de ligação a antígeno compreende um par de sequências variantes, cada uma tendo pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência com uma SEQ ID NO listada na Tabela C. Em várias modalidades, a proteína de ligação a antígeno compreende uma par de sequências: uma sequência selecionada a partir de uma SEQ ID Nº: listada na Tabela C e outra sequência que é uma sequência variante que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência com uma sequência que tem uma SEQ ID Nº: listada na Tabela D, uma sequência que tem uma SEQ ID Nº: listada na Tabela C.
[00114] Em várias modalidades, a proteína de ligação a antígeno compreende uma par de sequências: uma sequência selecionada a partir de uma SEQ ID Nº: listada na Tabela D, e outra sequência que é uma sequência variante que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência com uma sequência que tem uma SEQ ID Nº: listada na Tabela D. Por exemplo, em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de SEQ ID Nº: 419 e a proteína de ligação a antígeno compreende ainda uma sequência variante que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência com SEQ ID Nº: 421.
ÁCIDOS NUCLEICOS
[00115] A presente invenção fornece ainda ácidos nucleicos compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de ligação a antígeno da presente invenção. O termo "ácido nucleico" como usado no presente documento inclui "polinucleotídeo,"
"oligonucleotídeo", e "molécula de ácido nucleico" e geralmente significa um polímero de DNA ou RNA, ou formas modificadas do mesmo, que pode ser de filamento único ou de filamento duplo, sintetizado ou obtido (por exemplo, isolado e/ou purificado) a partir de fontes naturais, que podem conter nucleotídeos naturais, não naturais ou alterados, e que pode conter uma ligação entre nucleotídeos natural, não natural ou alterada, como uma ligação de fosforoamidato ou uma ligação de fosforotioato, em vez do fosforodiéster encontrado entre os nucleotídeos de um oligonucleotídeo não modificado.
O ácido nucleico pode compreender qualquer sequência de nucleotídeos que codifica qualquer uma das proteínas de ligação a antígeno da presente invenção.
Em vários aspectos, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de ligação a antígeno compreendendo (a) uma sequência de aminoácidos de região determinante de complementaridade (CDR) 1 de cadeia pesada (HC) apresentada na Tabela A ou A1 ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 11, 17, 23, 29, 35, 41, 47, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 452, 455, 461, 465 e 472, ou uma sequência variante da mesma, que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos ou cerca de 80%, pelo menos ou cerca de 85%, pelo menos ou cerca de 90%, pelo menos ou cerca de 95%) de identidade de sequência; (b) uma sequência de aminoácidos de CDR2 de HC apresentada na Tabela A ou A1 ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 86, 102, 108, 114, 120, 126, 132, 475, 456, 462, 466, 468 e 473; ou uma sequência variante da mesma que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos ou cerca de 80%, pelo menos ou cerca de 85%, pelo menos ou cerca de 90%, pelo menos ou cerca de
95%) de identidade de sequência; (c) uma sequência de aminoácidos de CDR3 de HC apresentada na Tabela A ou A1 ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 13, 19, 25, 31, 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 453, 457, 463, 467, 469 e 474; ou uma sequência variante da mesma que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos ou cerca de 80%, pelo menos ou cerca de 85%, pelo menos ou cerca de 90%, pelo menos ou cerca de 95%) de identidade de sequência; (d) uma sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia leve (LC) apresentada na Tabela A ou A1 ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 8, 14, 20, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 449, 476, 458, 464 e 470; ou uma sequência variante da mesma que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos ou cerca de 80%, pelo menos ou cerca de 85%, pelo menos ou cerca de 90%, pelo menos ou cerca de 95%) de identidade de sequência; (e) uma sequência de aminoácidos de CDR2 de LC apresentada na Tabela A ou A1 ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129, 450, 477, 459 e 471; ou uma sequência variante da mesma que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos ou cerca de 80%, pelo menos ou cerca de 85%, pelo menos ou cerca de 90%, pelo menos ou cerca de 95%) de identidade de sequência; (f) uma sequência de aminoácidos de CDR3 de LC apresentada na Tabela A ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 10, 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130, 451, 454 e 460 ou uma sequência variante da mesma que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos ou cerca de 80%, pelo menos ou cerca de 85%, pelo menos ou cerca de 90%, pelo menos ou cerca de 95%) de identidade de sequência; ou (g) uma combinação de quaisquer dois ou mais dentre (a) a (f). Em vários aspectos, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de ligação a antígeno compreendendo uma sequência de aminoácidos de CDR1 de LC, uma sequência de aminoácidos de CDR2 de LC e uma sequência de aminoácidos de CDR3 de LC apresentada na Tabela A ou A1 e pelo menos 1 ou 2 das sequências de aminoácidos de CDR de HC apresentadas na Tabela A ou A1. Em vários aspectos, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de ligação a antígeno compreendendo uma sequência de aminoácidos de CDR1 de HC, uma sequência de aminoácidos de CDR2 de HC e uma sequência de aminoácidos de CDR3 de HC apresentada na Tabela A ou A1 e pelo menos 1 ou 2 das sequências de aminoácidos de CDR de LC apresentadas na Tabela A ou A1. Em várias modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de ligação a antígeno compreendendo (a) pelo menos 3, 4, ou 5 das sequências de aminoácidos designadas pelas SEQ ID Nºs: numa única fileira da Tabela A ou A1, (b) cada uma das sequências de aminoácidos de CDR de LC designadas pelas SEQ ID Nºs: de uma única fileira da Tabela A ou A1 e pelo menos 1 ou 2 das sequências de aminoácidos de CDR de HC designadas pelas SEQ ID Nºs: de uma única fileira da Tabela A ou A1, (c) cada uma das sequências de aminoácidos de CDR de HC designadas pelas SEQ ID Nºs: de uma única fileira da Tabela A ou A1 e pelo menos 1 ou 2 das sequências de aminoácidos de CDR de LC designadas pelas SEQ ID Nºs: de uma única fileira da Tabela A ou A1, (d) todas as 6 dentre as sequências de aminoácidos de CDR designadas pelas SEQ ID Nºs: de uma única fileira da Tabela A, e/ou (e)
seis sequências de aminoácidos de CDR selecionadas a partir do grupo consistindo em: (a) SEQ ID Nºs: 74 a 79; (b) SEQ ID Nºs: 50 a 55; (c) SEQ ID Nºs: 122 a 127; (d) SEQ ID Nºs: 26 a 31; (e) SEQ ID Nºs: 128 a 133; (f) SEQ ID Nºs: 38 a 43; (g) SEQ ID Nºs: 62 a 67; (h) SEQ ID Nºs: 80 a 85; (i) SEQ ID Nºs: 44 a 49; (j) SEQ ID Nºs: 86 a 91; (k) SEQ ID Nºs: 104 a 109; (l) SEQ ID Nºs: 56 a 61; (m) SEQ ID Nºs: 32 a 37; (n) SEQ ID Nºs: 110 a 115; (o) SEQ ID Nºs: 98 a 103; (p) SEQ ID Nºs: 92 a 97; (q) SEQ ID Nºs: 116 a 121; (r) SEQ ID Nºs: 8 a 13; (s) SEQ ID Nºs: 68 a 73; (t) SEQ ID Nºs: 14 a 19; e (u) SEQ ID Nºs: 20 a 25, (v) SEQ ID Nºs: 449 a 453 e 475; (w) SEQ ID Nºs: 476 a 477, 454 a 457; (x) SEQ ID Nºs: 458 a 463; (y) SEQ ID Nºs: 57, 58, 464 a 467; (z) SEQ ID Nºs: 68 a 71 e 468 a 469; e (aa) SEQ ID Nºs: 112 e 470 a 474. Em várias modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de ligação a antígeno compreendendo (a) uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada apresentada na Tabela B ou B1 ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 478, 480, 482, 484, 486 e 488, ou uma sequência variante da mesma que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos ou cerca de 80%, pelo menos ou cerca de 85%, pelo menos ou cerca de 90%, pelo menos ou cerca de 95%) de identidade de sequência; ou (b) uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve apresentada na Tabela B ou B1 ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 479, 481, 483, 485, 487 e 489 ou uma sequência variante da mesma que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos ou cerca de 80%, pelo menos ou cerca de 85%,
pelo menos ou cerca de 90%, pelo menos ou cerca de 95%) de identidade de sequência; ou (c) tanto (a) quanto (b). Em várias modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de ligação a antígeno compreendendo uma par de sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo consistindo em: (a) SEQ ID Nºs: 156 e 157; (b) SEQ ID Nºs: 148 e 149; (c) SEQ ID Nºs: 172 e 173; (d) SEQ ID Nºs: 140 e 141; (e) SEQ ID Nºs: 174 e 175; (f) SEQ ID Nºs: 144 e 145; (g) SEQ ID Nºs: 152 e 153; (h) SEQ ID Nºs: 158 e 159; (i) SEQ ID Nºs: 146 e 147; (j) SEQ ID Nºs: 160 e 161; (k) SEQ ID Nºs: 166 e 167; (l) SEQ ID Nºs: 150 e 151; (m) SEQ ID Nºs: 142 e 143; (n) SEQ ID Nºs: 168 e 169; (o) SEQ ID Nºs: 164 e 165; (p) SEQ ID Nºs: 162 e 163; (q) SEQ ID Nºs: 170 e 171; (r) SEQ ID Nºs: 134 e 135; (s) SEQ ID Nºs: 154 e 155; (t) SEQ ID Nºs: 136 e 137; e (u) SEQ ID Nºs: 138 e 139. Em várias modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de ligação a antígeno compreendendo um par de sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo consistindo nos pares listados na Tabela D. Em vários aspectos, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos compreendendo uma sequência de qualquer uma ou mais de SEQ ID Nºs: 208 a 375. Em algumas modalidades, o ácido nucleico não compreende quaisquer inserções, deleções, inversões e/ou substituições. Noutras modalidades, o ácido nucleico compreende uma ou mais inserções, deleções, inversões e/ou substituições.
[00116] Em alguns aspectos, os ácidos nucleicos da presente invenção são recombinantes. Como usado no presente documento, o termo "recombinante" se refere a (i) moléculas que são construídas fora de células vivas através de junção de segmentos de ácido nucleico naturais ou sintéticos a moléculas de ácido nucleico que podem se replicar numa célula viva, ou (ii) moléculas que resultam da replicação daquelas descritas em (i) acima. Para propósitos no presente documento, a replicação pode ser replicação in vitro ou replicação in vivo.
[00117] Os ácidos nucleicos em alguns aspectos são construídos com base em reações de síntese química e/ou ligação enzimática usando procedimentos conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Sambrook et al., supra; e Ausubel et al., supra. Por exemplo, um ácido nucleico pode ser quimicamente sintetizado usando nucleotídeos de ocorrência natural ou nucleotídeos modificados diversamente projetados para aumentar a estabilidade biológica das moléculas ou para aumentar a estabilidade física do dúplex formado mediante a hibridização (por exemplo, derivados de fosforotioato e nucleotídeos substituídos por acridina). Os exemplos de nucleotídeos modificados que podem ser usados para gerar os ácidos nucleicos incluem, mas, sem limitações, 5-fluorouracila, 5-bromouracila, 5-clorouracila, 5- iodouracila, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carbóxi-hidroximetil) uracila, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridme, 5-carboximetilaminometil- uracila, di-hidrouracila, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N 6- isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, adenina N-substituída, 7-metilguanina, 5-metilamometiluracila, 5-metoxiami- nometil-2-tiouracila, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetilura- cila, 5-metoxiuracila, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5- oxiacético (v), vibutoxosina, pseudouratila, queosina, 2-tiocitosina, 5- metil-2-tiouracila, 2-tiouracila, 4-tiouracila, 5-metiluracila, metiléster de ácido uracil-5-oxiacético, 3- (3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracila e 2,6- diaminopurina. Alternativamente, um ou mais dos ácidos nucleicos da presente invenção podem ser adquiridos junto a companhias, como Macromolecular Resources (Fort Collins, CO) e Synthegen (Houston, TX).
VETOR
[00118] Os ácidos nucleicos da presente invenção em alguns aspectos são incorporados num vetor. Neste sentido, a presente invenção fornece vetores compreendendo qualquer um dos ácidos nucleicos aqui divulgados. Em vários aspectos, o vetor é um vetor de expressão recombinante. Para propósitos no presente documento, o termo "vetor de expressão recombinante" significa um oligonucleotídeo geneticamente modificado ou construto de polinucleotídeo que permite a expressão de um mRNA, proteína, polipeptídeo ou peptídeo por uma célula hospedeira, quando o construto compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o mRNA, proteína, polipeptídeo ou peptídeo, e o vetor é colocado em contato com a célula sob condições suficientes para ter o mRNA, proteína, polipeptídeo ou peptídeo expresso dentro da célula. Os vetores da presente invenção não são de ocorrência natural como um todo. Entretanto, as partes dos vetores podem ser de ocorrência natural. Os vetores aqui divulgados podem compreender qualquer tipo de nucleotídeos, incluindo, mas sem limitações DNA e RNA, que podem ser de filamento único ou de filamento duplo, sintetizados ou obtidos em parte a partir de fontes naturais, e que podem conter nucleotídeos naturais, não naturais ou alterados. Os vetores podem compreender ligações entre nucleotídeos de ocorrência natural ou de ocorrência não natural ou ambos os tipos de ligações. Em alguns aspectos, os nucleotídeos alterados ou ligações entre nucleotídeos de ocorrência não natural não impedem a transcrição ou replicação do vetor.
[00119] O vetor da presente invenção pode ser qualquer vetor adequado, e pode ser usado para transduzir, transformar ou transfectar qualquer hospedeiro adequado. Os vetores adequados incluem aqueles projetados para a propagação e expansão ou para expressão ou ambos, como plasmídeos e vírus. O vetor pode ser um vetor de expressão à base de plasmídeo. Em vários aspectos, o vetor é selecionado a partir do grupo consistindo na série de pUC (Fermentas Life Sciences), na série de pBluescript (Stratagene, LaJoIIa, CA), na série de pET (Novagen, Madison, WI), na série de pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia) e na série de pEX (Clontech, Palo Alto, CA). Os vetores de bacteriófago, como λGTIO, λGTl 1, λZapII (Stratagene), λEMBL4 e λNMl 149 também podem ser usados. Os exemplos de vetores de expressão vegetais incluem pBIOl, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 e pBIN19 (Clontech). Os exemplos de vetores de expressão animal incluem pEUK-Cl, pMAM e pMAMneo (Clontech). Em alguns aspectos, o vetor é um vetor viral, por exemplo, um vetor retroviral. Em vários aspectos, o vetor é um vetor de adenovírus, um vetor de vírus adenoassociado (AAV), um vetor de vetor de Vírus Herpes Simples (HSV), um vetor de vírus de estomatite vesicular (VSV), vetor de vírus de vacina ou vetor de lentivírus. Consultar, por exemplo, Howarth et al., Cell Biol. Toxicol. 26(1): 1-20 (2010). Em vários aspectos, o vetor é um vetor de baculovírus que infecta artrópodes, por exemplo, insetos. Em vários aspectos, o vetor de baculovírus é um múltiplos vírus nucleares Autographacalifornica (AcMNPV) ou um Bombyxmorinuclear poliedrose (BmNPV). Consultar, por exemplo, Khan, Adv Pharm Bull 3(2): 257-263 (2013); Miller, Bioessays 11(4): 91-96 (1989); Atkinson et al., Pestic Sci 28: 215-224 (1990).
[00120] Os vetores da presente invenção podem ser preparados usando técnicas de DNA recombinante padrão descritas, por exemplo, em Sambrook et al., supra, e Ausubel et al., supra. Os construtos de vetores de expressão, que são circulares ou lineares, podem ser preparados para conter um sistema de replicação funcional numa célula hospedeira procariota ou eucariota. Os sistemas de replicação podem ser derivados, por exemplo, de CoIEl, 2 μ de plasmídeo, λ, SV40, vírus do papiloma bovino e similares.
[00121] Em alguns aspectos, o vector compreende sequências reguladoras, como transcrição e códons de iniciação e terminação de tradução, que são específicos ao tipo de hospedeiro (por exemplo, bactéria, fungo, planta ou animal) em que o vector deve ser introduzido, conforme for apropriado e levando em consideração se o vector é à base de DNA ou de RNA.
[00122] O vetor pode incluir um ou mais genes marcadores, que permitem a seleção de hospedeiros transformados ou transfectados. Os genes marcadores incluem resistência a biocida, por exemplo, resistência a antibióticos, metais pesados, etc., complementação num hospedeiro auxotrófico para fornecer prototrofia e similares. Os genes marcadores adequados para os vetores de expressão aqui divulgados incluem, por exemplo, genes de resistência a neomicina/G418, genes de resistência a higromicina, genes de resistência a histidinol, genes de resistência a tetraciclina e genes de resistência a ampicilina.
[00123] O vetor pode compreender um promotor nativo ou normativo operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo (incluindo porções funcionais e variantes funcionais das mesmas), ou à sequência de nucleotídeo que é complementar a ou que hibridiza à sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo. A seleção de promotores, por exemplo, fortes, fracos, induzíveis, específicos de tecido e específicos desenvolvimentais, é abrangida pelo técnico de habilidade comum. De modo similar, a combinação de uma sequência de nucleotídeo com um promotor também é abrangida pelo técnico versado na técnica. O promotor pode ser um promotor não viral ou um promotor viral, por exemplo, um promotor de citomegalovírus (CMV), um promotor de SV40, um promotor de RSV e um promotor encontrado na repetição de terminal longo do vírus de célula-tronco murina.
CÉLULAS HOSPEDEIRAS
[00124] São fornecidas, no presente documento, células hospedeiras compreendendo um ácido nucleico ou vetor da presente invenção. Como usado no presente documento, o termo "célula hospedeira" se refere a qualquer tipo de célula que pode conter o vetor aqui divulgado e é capaz de produzir um produto de expressão codificado pelo ácido nucleico (por exemplo, mRNA, proteína). A célula hospedeira, em alguns aspectos, é uma célula aderente ou uma célula suspensa, isto é, uma célula que cresce em suspensão. A célula hospedeira, em vários aspectos, é uma célula cultivada ou uma célula primária, isto é, isolada diretamente de um organismo, por exemplo, um ser humano. A célula hospedeira pode ser de qualquer tipo de célula, pode se originar de qualquer tipo de tecido e pode ser de qualquer estágio de desenvolvimento.
[00125] Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno é uma proteína glicosilada e a célula hospedeira é uma célula competente para glicosilação. Em vários aspectos, a célula competente para glicosilação é uma célula eucariota, incluindo, mas sem limitações, uma célula de levedura, célula fúngica filamentosa, célula de protozoário, célula de algas, célula de inseto ou célula de mamífero. Tais células hospedeiras são descritas na técnica. Consultar, por exemplo, Frenzel, et al., Front Immunol 4: 217 (2013). Em vários aspectos, as células eucariotas são células de mamífero. Em vários aspectos, as células de mamífero são células de mamífero não humano. Em alguns aspectos, as células são células de Ovário de Criceto Chinês (CHO) e derivadas das mesmas (por exemplo, CHO-K1, CHO pro-3), células de mieloma de camundongo (por exemplo, NS0, GS-NS0, Sp2/0), células geneticamente modificadas para serem deficientes em atividade de di- hidrofolatereductase (DHFR) (por exemplo, DUKX-X11, DG44), células de rim embrionário humano 293 (HEK293) ou derivadas das mesmas
(por exemplo, HEK293T, HEK293-EBNA), células de rim de macaco africano verde (por exemplo, células COS, células VERO), células de câncer cervical humano (por exemplo, HeLa), células epiteliais de osteossarcoma ósseo humano U2-OS, células epiteliais basais alveolares humanas adenocarcinômicas A549, células de fibrossarcoma humano HT1080, células de tumor de cérebro de camundongo CAD, células de carcinoma embrionário P19, células de fibroblasto embrionário de camundongo NIH 3T3, células de fibroblasto de camundongo L929, células de neuroblastoma de camundongo N2a, células de câncer de mama humano MCF-7, células de retinoblastoma Y79, células de retinoblastoma humano SO-Rb50, células de câncer de fígado humano Hep G2, células de mieloma B de camundongo J558L, ou células de rim de criceto recém-nascido (BHK) (Gaillet et al. 2007; Khan, Adv Pharm Bull 3(2): 257-263 (2013)).
[00126] Para propósitos de ampliar ou replicar o vetor, a célula hospedeira é, em alguns aspectos, uma célula procariota, por exemplo, uma célula bacteriana.
[00127] Também é fornecida pela presente invenção uma população de células compreendendo pelo menos uma célula hospedeira descrita no presente documento. A população de células em alguns aspectos é uma população heterogênea compreendendo a célula hospedeira compreendendo vetores descritos, em adição a pelo menos uma outra célula, que não compreende qualquer um dos vetores. Alternativamente, em alguns aspectos, a população de células é uma população substancialmente homogênea, em que a população compreende principalmente células hospedeiras (por exemplo, consistindo essencialmente em) compreendendo o vetor. A população em alguns aspectos é uma população clonal de células, em que todas as células da população são clones de uma única célula hospedeira compreendendo um vetor, de modo que todas as células da população compreendam o vetor. Em várias modalidades da presente invenção, a população de células é uma população clonal compreendendo células hospedeiras compreendendo um vetor como descrito no presente documento.
MÉTODOS DE FABRICAÇÃO
[00128] Também são fornecidos, no presente documento, métodos para produzir uma proteína de ligação a antígeno que se liga à CLDN6. Em várias modalidades, o método compreende cultivar uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica a proteína de ligação a antígeno como descrito no presente documento num meio de cultura celular e coletar a proteína de ligação a antígeno do meio de cultura celular. A célula hospedeira pode ser qualquer uma das células hospedeiras descritas no presente documento. Em vários aspectos, a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo consistindo em: células CHO, células NS0, células COS, células VERO e células BHK. Em vários aspectos, a etapa de cultura de uma célula hospedeira compreende cultivar a célula hospedeira num meio de crescimento para suportar o crescimento e a expansão da célula hospedeira. Em vários aspectos, o meio de crescimento aumenta a densidade celular, a viabilidade de cultura e a produtividade de uma maneira adequada. Em vários aspectos, o meio de crescimento compreende aminoácidos, vitaminas, sais inorgânicos, glicose e soro como uma fonte de fatores de crescimento, hormônios e fatores de fixação. Em vários aspectos, o meio de crescimento consiste em meios definidos de modo totalmente químico consistindo em aminoácidos, vitaminas, elementos vestigiais, sais inorgânicos, lipídios e insulina ou fatores de crescimento tipo insulina. Além de nutrientes, o meio de crescimento também ajuda a manter o pH e a osmolalidade. Vários meios de crescimento são comercialmente disponíveis e são descritos na técnica. Consultar, por exemplo, Arora, "Cell Culture Media: A Review" MATER METHODS 3:175 (2013).
[00129] Em vários aspectos, o método compreende cultivar a célula hospedeira num meio de alimentação. Em vários aspectos, o método compreende a cultura num meio de alimentação num modo de batelada de alimentação. Os métodos de produção de proteína recombinante são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Li et al., "Cell culture processes for monoclonal antibody production" MAbs 2(5): 466-477 (2010).
[00130] O método para produzir a proteína de ligação a antígeno pode compreender uma ou mais etapas para purificar a proteína de uma cultura celular ou o sobrenadante da mesma e preferencialmente recuperar a proteína purificada. Em vários aspectos, o método compreende uma ou mais etapas de cromatografia, por exemplo, cromatografia de afinidade (por exemplo, cromatografia de afinidade de proteína A), cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica. Em vários aspectos, o método compreende purificar a proteína usando uma resina de cromatografia de afinidade de Proteína A.
[00131] Em várias modalidades, o método compreende ainda etapas para formular a proteína purificada, etc., obtendo assim uma formulação compreendendo a proteína purificada. Tais etapas são descritas em Formulation and Process Development Strategies for Manufacturing, eds. Jameel e Hershenson, John Wiley & Sons, Inc. (Hoboken, NJ),
2010.
[00132] Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno ligada a um polipeptídeo e a proteína de ligação a antígeno é parte de uma proteína de fusão. Portanto, a presente invenção fornece, ainda, métodos para produzir uma proteína de fusão compreendendo uma proteína de ligação a antígeno que se liga à CLDN6. Em várias modalidades, o método compreende cultivar uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica a proteína de fusão como descrito no presente documento num meio de cultura celular e coletar a proteína de fusão do meio de cultura celular.
CONJUGADOS
[00133] A presente invenção também fornece proteínas de ligação a antígeno fixada, ligada ou conjugada a uma segunda porção química (por exemplo, uma porção química heteróloga, uma porção química conjugada). Consequentemente, a presente invenção fornece um conjugado compreendendo uma proteína de ligação a antígeno e uma porção química heteróloga. Como usado no presente documento, o termo "porção química heteróloga" é sinônimo de "porção química conjugada" e se refere a qualquer molécula (química ou bioquímica, de ocorrência natural ou não codificada) que é diferente das proteínas de ligação a antígeno da presente invenção. Várias porções químicas heterólogas incluem, mas, sem limitações, um polímero, um carboidrato, um lipídio, um ácido nucleico, um oligonucleotídeo, um DNA ou RNA, um aminoácido, peptídeo, polipeptídeo, proteína, agente terapêutico, (por exemplo, um agente citotóxico, citocina) ou um agente de diagnóstico.
[00134] Em algumas modalidades, a porção química heteróloga é um polímero. O polímero pode ser ramificado ou não ramificado. O polímero pode ser de qualquer peso molecular. O polímero, em algumas modalidades, tem um peso molecular médio entre cerca de 2 kDa a cerca de 100 kDa (o termo "cerca de" indicando que, nas preparações de um polímero solúvel e água, algumas moléculas pesarão mais, algumas, menos que o peso molecular indicado). O peso molecular médio do polímero é, em algum aspecto, entre cerca de 5 kDa e cerca de 50 kDa, entre cerca de 12 kDa a cerca de 40 kDa ou entre cerca de 20 kDa a cerca de 35 kDa.
[00135] Em algumas modalidades, o polímero é modificado para ter um grupo reativo único, como um éster ativo para acilação ou um aldeído para alquilação, de modo que o grau de polimerização possa ser controlado. O polímero em algumas modalidades é solúvel em água, de modo que a proteína à qual o mesmo é fixado não precipite num ambiente aquoso, como um ambiente fisiológico. Em algumas modalidades, quando, por exemplo, a composição é usada para uso terapêutico, o polímero é farmaceuticamente aceitável. Adicionalmente, em alguns aspectos, o polímero é uma mistura de polímeros, por exemplo, um copolímero, um copolímero em bloco.
[00136] Em algumas modalidades, o polímero é selecionado a partir do grupo consistindo em: poliamidas, policarbonatos, polialquilenos e derivados dos mesmos incluindo, polialquileno glicóis, óxidos de polialquileno, tereftalatos de polialquileno, polímeros de ésteres acrílicos e metacrílicos, incluindo metacrilato de poli(metila), metacrilato de poli(etila), metacrilato de poli(butila), metacrilato de poli(isobutila), metacrilato de poli(hexila), metacrilato de poli(isodecila), metacrilato de poli(laurila), metacrilato de poli(fenila), acrilato de poli(metila), acrilato de poli(isopropila), acrilato de poli(isobutila) e acrilato de poli(octadecila), polímeros polivinílicos incluindo alcoóis polivinílicos, éteres polivinílicos, ésteres polivinílicos, hatelos polivinílivos, acetato de poli(vinila) e polivinilpirrolidona, poliglicolídeos, polissiloxanos, poliuretanos e copolímeros dos mesmos, celuloses incluindo alquilcelulose, hidroxialquilceluloses, éteres de celulose, ésteres de celulose, nitroceluloses, metilcelulose, etilcelulose, hidroxipropilcelulose, hidroxi- propilmetilcelulose, hidroxibutilmetilcelulose, acetato de celulose, propionato de celulose, butirato de acetato de celulose, ftalato de acetato de celulose, carboxiletilcelulose, triacetato de celulose e sal de sódio de sulfato de celulose, polipropileno, polietilenos incluindo poli(etileno glicol), óxido de poli(etileno) e tereftalato de poli(etileno) e poliestireno.
[00137] Um polímero solúvel em água particularmente preferencial para uso no presente documento é polietileno glicol (PEG). Como usado no presente documento, polietileno glicol se destina a englobar qualquer uma das formas de PEG que podem ser usadas para derivar outras proteínas, como mono-(C1-C10) alcóxi- ou arilóxi-polietileno glicol. PEG é um poliéter neutro linear ou ramificado, disponível numa ampla faixa de pesos moleculares, e é solúvel em água e na maioria dos solventes orgânicos.
[00138] Em algumas modalidades, a porção química heteróloga é um carboidrato. Em algumas modalidades, o carboidrato é um monossacarídeo (por exemplo, glicose, galactose, frutose), um dissacarídeo (por exemplo, sacarose, lactose, maltose), um oligossacarídeo (por exemplo, rafinose, estaquiose), um polissacarídeo (um amido, amilase, amilopectina, celulose, quitina, calose, laminarina, xilano, manano, fucoidano, galactomanano.
[00139] Em algumas modalidades, a porção química heteróloga é um lipídio. O lipídio, em algumas modalidades, é um ácido graxo, eicosanoide, prostaglandina, leucotrieno, tromboxano, N-acil etanolamina), glicerolipídeo (por exemplo, glicerois monossubstituídos, dissubstituídos, trissubstituídos), glicerofosfolipídeo (por exemplo, fosfatidilcolina, fosfatidilinositol, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina), esfingolipídeo (por exemplo, efingosina, ceramida), lipídio de esterol (por exemplo, esteroide, colesterol), lipídio de prenol, sacarolipídeo ou um policetídeo, óleo, cera, colesterol, esterol, vitamina solúvel em gordura, monoglicerídeo, diglicerídeo, triglicerídeo a fosfolipídeo.
[00140] Em algumas modalidades, a porção química heteróloga é um agente terapêutico. O agente terapêutico pode ser qualquer um daqueles conhecidos na técnica. Os exemplos de agentes terapêuticos que são contemplados no presente documento incluem, mas, sem limitações, enzimas naturais, proteínas derivadas de fontes naturais,
proteínas recombinantes, peptídeos naturais, peptídeos sintéticos, peptídeos cíclicos, anticorpos, agonistas receptores, agentes citotóxicos, imunogloinas, agentes de bloqueio beta-adrenérgicos, bloqueadores de canal de cálcio, vasodilatadores coronários, glicosídeos cardíacos, antiarrítmicos, simpatomeméticos cardíacos, inibidores de enzima de conversão de angiotensina (ACE), diuréticos, inótropos, redutores de colesterol e triglicerídeo, sequestrantes de ácido biliar, fibratos, inibidores de 3-hidroxi-3-metilgluterila (HMG)-CoA redutase, derivados de niacina, agentes antiadrenérgicos, agentes de bloqueio alfa-adrenérgico, agentes antiadrenérgicos de atuação central, vasodilatadores, agentes de regulação de potássio, tiazidas e agentes relacionados, antagonistas de receptor de angiotensina II, vasodilatadores periféricos, antiandrógenos, estrogênios, antibióticos, retinoides, insulinas e análogos, inibidores de alfa-glicosidase, biguanidas, meglitinidas, sulfonilureias, tizaolidinadionas, androgênios, progestogênios, reguladores de metabolismo ósseo, hormônios pituitários anteriores, hormônios hipotalâmicos, hormônios pituitários posteriores, gonadotropinas, antagonistas de hormônio de liberação de gonadotropina, estimulantes de ovulação, moduladores de receptor de estrogênio seletivos, agentes antitiroide, hormônios de tiroide, agentes de formação de volume, laxantes, antiperistálticos, modificadores de flora, adsorventes intestinais, anti-infectantes intestinais, antianoréxico, anticaquéxico, antibulímicos, supressores de apetite, agentes antiobesidade, antiácidos, agentes do trato gastrointestinal superior, agentes anticolinárgicos, derivados de ácido aminossalicílico, modificadores de resposta biológica, corticosteroides, antiespasmódicos, agonistas parciais de 5-HT4, anti-histaminas, canabinoides, antagonistas de dopamina, antagonistas de serotonina, citoprotetores, antagonistas de receptor de histamina H2, agente protetor mucosal, inibidores de bomba de prótons, terapia de erradicação de H. pilori, estimulante de eritropoiese, agentes hematopoiéticos, agentes de anemia, heparinas, antifibrinolíticos, hemostáticos, fatores de coagulação sanguínea, inibidores de difosfato de adenosina, inibidores de receptor de glicoproteína, inibidores de ligação de fibrinogênio-plaqueta, inibidores de tromboxano-A2, ativadores de plasminogênio, agentes antitrombóticos, glicocorticoides, mineralcorticoides, corticosteroides, agentes imunossupressores seletivos, antifúngicos, fármacos envolvidos em terapia profilática, infecções associadas à AIDS, citomegalovírus, inibidores de transcriptase reversa de não nucleosídeo, inibidores de transcriptase reversa análoga a nucleosídeo, inibidores de protease, anemia, sarcoma de Kaposi, aminoglicosídeos, carbapenemas, cefalosporinas, glicopoptídeos, lincosamidas, macrolídeos, oxazolidinonas, penicilinas, estreptograminas, sulfonamidas, trimetoprime e derivados, tetraciclinas, antelmínticos, amebicies, biguanidas, alcaloides de cincona, antagonistas de ácido fólico, derivados de quinolina, terapia de Pneumocystis carinii, hidrazidas, imidazóis, triazóis, nitroimidazóis, aminas cíclicas, inibidores de neuraminidase, nucleosídeos, aglutinantes de fosfato, inibidores de colinasterase, terapia adjuntiva, barbituratos e derivados, benzodiazepinas, derivados de ácido gama aminobutírico, derivados de hidantoina, derivados de iminostilbeno, derivados de succinimida, anticonvulsivos, alcaloides de ergot, preparações antienxaqueca, modificadores de resposta biológica, ésteres de ácido carbâmico, derivados tricíclicos, agentes de despolarização, agentes de não despolarização, agentes paralíticos neuromusculares, estimulantes de CNS, reagentes dopaminárgicos, inibidores de monoamina oxidase, inibidores de COMT, sulfonatos de alquila, etileniminas, imidazotetrazinas, análogos de mostarda de nitrogênio, nitrosoureias, compostos contendo platina, antimetabólitos, análogos de purina, análogos de pirimidina, derivados de ureia,
antraciclinas, actinomocinas, derivados de camptotecina, epipodofilotoxinas, taxanas, alcaloides de vinca e análogos, antiandrogênios, antiestrogênios, inibidores de aromatase não esteroidal, antineoplástico inibidor de proteína cinase, derivado de azaspirodecanodiona, ansiolíticos, estimulantes, inibidores de reabsorção de monoamina, inibidores de reabsorção de serotonina seletivos, antidepressivos, derivados de benziso-oxazol, derivados de butirofenona, derivados de dibenzodiazepina, derivados de dibenzotiazepina, derivados de difenilbutilpiperidina, fenotiazinas, derivados de tienobenzodiazepina, derivados de tioxanteno, extratos alergênicos, agentes não esteroidais, antagonistas de receptor leucotrieno, xantinas, antagonista de receptor de endotelina, prostaglandinas, tensoativos de pulmão, mucolíticos, antimitóticos, uricosúricos, inibidores de xantina oxidase, inibidores de fosfodiesterase, sais de meteamina, derivados de nitrofurano, quinolonas, relaxantes de músculo liso, agentes parassimpatomiméticos, hidrocarbonetos halogenados, ésteres de ácido amino benzoico, amidas (por exemplo, lidocaína, cloridrato de articaína, cloridrato de bupivacaína), antipiréticos, hipnóticos e sedativos, ciclopirrolonas, pirazolopirimidinas, fármacos anti- inflamatórios não esteroidais, opioides, derivados de para-aminofenol, inibidor de desidrogenase de álcool, antagonistas de heparina, adsorventes, eméticos, antagonistas de opoide, reativadores de colinasterase, terapia de substituição de nicotina, análogos e antagonistas de vitamina A, análogos e antagonistas de vitamina B, análogos e antagonistas de vitamina C, análogos e antagonistas de vitamina D, análogos e antagonistas de vitamina E, análogos e antagonistas de vitamina K.
[00141] As proteínas de ligação a antígeno da presente invenção podem ser conjugadas a uma ou mais citocinas e fatores de crescimento que são eficazes na inibição de metástase de tumor, e em que a citocina ou fator de crescimento mostrou ter um efeito antiproliferativo em pelo menos uma população celular.
Tais citocinas, linfocinas, fatores de crescimento ou outros fatores hematopoiéticos incluem, mas, sem limitações: M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFN, TNFα, TNF1, TNF2, G-CSF, Meg-CSF, GM-CSF, trombopoietina, fator de célula-tronco e eritropoietina.
Os fatores de crescimento adicionais para uso no presente documento incluem angiogenina, proteína morfogênica óssea-1, proteína morfogênica óssea-2, proteína morfogênica óssea-3, proteína morfogênica óssea-4, proteína morfogênica óssea-5, proteína morfogênica óssea-6, proteína morfogênica óssea-7, proteína morfogênica óssea-8, proteína morfogênica óssea-9, proteína morfogênica óssea-10, proteína morfogênica óssea-11, proteína morfogênica óssea-12, proteína morfogênica óssea-13, proteína morfogênica óssea-14, proteína morfogênica óssea-15, receptor de proteína morfogênica óssea IA, receptor de proteína morfogênica óssea IB, fator neurotrófico derivado do cérebro, fator neurotrófico ciliar, receptor de fator neurotrófico ciliar α, fator quimiotático de neutrofilia induzida por citocina 1, neutrofilia induzida por citocina, fator quimiotático 2 α, fator quimiotático de neutrofilia induzida por citocina 2 β, β fator de crescimento de célula endotelial, endotelina 1, atrativo de neutrofilia de derivação epitelial, receptor de fator neutrófico derivado de linhagem celular glial α 1, receptor de fator neutrófico derivado de linhagem celular glial α 2, proteína relacionada ao crescimento, proteína relacionada ao crescimento α, proteína relacionada ao crescimento β, proteína relacionada ao crescimento γ, fator de crescimento epidérmico de ligação de heparina, fator de crescimento hepatócito, receptor de fator de crescimento hepatócito, fator de crescimento tipo insulina I, receptor de fator de crescimento tipo insulina, fator de crescimento tipo insulina II, proteína de ligação de fator de crescimento tipo insulina, fator de crescimento queratinócito, fator inibidor de leucemia, fator inibidor de leucemia receptor α, fator de crescimento nervoso, receptor de fator de crescimento nervoso, neurotrofina-3, neurotrofina-4, fator estimulante de crescimento pré-célula B, fator de célula-tronco, receptor de fator de célula-tronco, fator de crescimento de transformação α, fator de crescimento de transformação β, fator de crescimento de transformação β1, fator de crescimento de transformação β1.2, fator de crescimento de transformação β2, fator de crescimento de transformação β3, fator de crescimento de transformação β5, fator de crescimento de transformação β1 latente, fator de crescimento de transformação β ligação proteína I, fator de crescimento de transformação β ligação proteína II, proteína de ligação III de fator de crescimento de transformação β, receptor de fator de necrose tumoral tipo I, receptor de fator de necrose tumoral tipo II, receptor de ativador de plasminogênio tipo urocinase e proteínas quiméricas e fragmentos ativos biológica ou imunologicamente dos mesmos.
[00142] Em algumas modalidades, o conjugado compreende uma proteína de ligação a antígeno como descrito no presente documento e um agente citotóxico. O agente citotóxico é qualquer molécula (química ou bioquímica) que é tóxica a uma célula. Em alguns aspectos, quando um agente citotóxico é conjugado a uma proteína de ligação a antígeno da presente invenção, os resultados obtidos são sinérgicos. Isto significa que a eficácia da terapia de combinação de uma proteína de ligação a antígeno e o agente citotóxico é sinérgica, isto é, a eficácia é maior que a eficácia esperada dos efeitos individuais aditivos de cada um. Portanto, a dosagem do agente citotóxico pode ser reduzida e, assim, o risco dos problemas de toxicidade e outros efeitos colaterais é simultaneamente reduzido. Em algumas modalidades, o agente citotóxico é um agente quimioterapêutico. Os agentes quimioterapêuticos são conhecidos na técnica e incluem, mas sem limitações, compostos de coordenação de platina, inibidores de topoisomerase, antibióticos, alcaloides antimitóticos e difluoronucleosídeos, como descrito na Patente No U.S. 6.630.124.
[00143] Em algumas modalidades, o agente quimioterapêutico é um composto de coordenação de platina. O termo "composto de coordenação de platina" se refere a qualquer composto de coordenação de platina de inibição de crescimento de célula de tumor que fornece a platina na forma de um íon. Em algumas modalidades, a cisplatina é o composto de coordenação de platina empregado nas composições e métodos da presente invenção. Em algumas modalidades, o agente quimioterapêutico é um inibidor de topoisomerase. Em alguns aspectos, o inibidor de topoisomerase é campototecina ou um análogo de campototecina. Ainda em outras modalidades da presente invenção, o agente quimioterapêutico é um composto antibiótico. O antibiótico adequado inclui, mas, sem limitações, doxorrubicina, mitomicina, bleomicina, daunorrubicina e estreptozocina. Em algumas modalidades, o agente quimioterapêutico é um alcaloide antimitótico. Em geral, alcaloides antimitóticos podem ser extraídos de Cantharanthus roseus, e mostraram ser eficazes como agntes de quimioterapia anticâncer. Noutras modalidades da presente invenção, o agente quimioterapêutico é um difluoronuleosídeo. 2'-deóxi-2',2'-difluoronucleosídeos são conhecidos na técnica como tendo atividade antiviral. Tais compostos são divulgados e ensinados nas Patentes Nos 4.526.988 e 4.808.614. A Publicação de Pedido de Patente Europeia 184.365 revela que estes mesmos difluoronucleosídeos têm atividade oncolítica.
[00144] A presente invenção também fornece conjugados compreendendo uma proteína de ligação a antígeno da presente invenção ligada a um polipeptídeo, de modo que o conjugado seja uma proteína de fusão. Portanto, a presente invenção fornece proteínas de fusão compreendendo uma proteína de ligação a antígeno da presente invenção ligada a um polipeptídeo. Em várias modalidades, o polipeptídeo é uma identificação de diagnóstico, por exemplo, uma proteína fluorescente, como proteína fluorescente verde ou outra etiqueta, por exemplo, etiqueta Myc. Em vários aspectos, o polipeptídeo é uma das citocinas, linfocinas, fatores de crescimento ou outros fatores hematopoiéticos listados acima.
LIGANTES
[00145] Em algumas modalidades, o conjugado é ligado diretamente à porção química heteróloga. Em modalidades alternativas, o conjugado compreende um ligante que une o composto da presente invenção à porção química heteróloga. Em alguns aspectos, o ligante compreende uma cadeia de átomos de 1 a cerca de 60, ou 1 a 30 átomos ou maior, 2 a 5 átomos, 2 a 10 átomos, 5 a 10 átomos ou 10 a 20 átomos de comprimento. Em algumas modalidades, os átomos da cadeia são todos átomos de carbono. Em algumas modalidades, os átomos da cadeia na cadeia principal do ligante são selecionados a partir do grupo consistindo em C, O, N e S. Os átomos da cadeia e ligantes podem ser selecionados de acordo com sua solubilidade esperada (hidrofilicidade), de modo a fornecer um conjugado mais solúvel. Em algumas modalidades, o ligante fornece um grupo funcional que é submetido à clivagem por uma enzima ou outro catalisador ou condições hidrolíticas encontradas no tecido ou órgão ou célula-alvo. Em algumas modalidades, o comprimento do ligante é suficientemente longo para reduzir o potencial para impedimento estérico. Em algumas modalidades, o ligante é um aminoácido ou um ligante peptidílico. Tais ligantes peptidílicos podem ter qualquer comprimento. Vários ligantes têm de cerca de 1 a 50 aminoácidos de comprimento, 5 a 50, 3 a 5, 5 a 10, 5 a 15 ou 10 a 30 aminoácidos de comprimento.
COMPOSIÇÕES, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E FORMULAÇÕES
[00146] As composições compreendendo uma proteína de ligação a antígeno, um ácido nucleico, um vetor, uma célula hospedeira ou um conjugado como aqui divulgado são fornecidas no presente documento. As composições, em alguns aspectos, compreendem as proteínas de ligação a antígeno em forma isolada e/ou purificada. Em alguns aspectos, a composição compreende um único tipo (por exemplo, estrutura) de uma proteína de ligação a antígeno da presente invenção ou compreende uma combinação de duas ou mais proteínas de ligação a antígeno da presente invenção, em que a combinação compreende duas ou mais proteínas de ligação a antígeno de tipos diferentes (por exemplo, estruturas).
[00147] Em alguns aspectos, a composição compreende agentes que intensificam os recursos químico-físicos da proteína de ligação a antígeno, por exemplo, por meio da estabilização da proteína de ligação a antígeno em certas temperaturas, por exemplo, temperatura ambiente, aumentando a vida-de-prateleira, reduzindo a degradação, por exemplo, degradação mediada por protease de oxidação, aumentando a meia vida da proteína de ligação a antígeno, etc. Em alguns aspectos, a composição compreende qualquer um dos agentes divulgados no presente documento como uma porção química heteróloga ou porção química conjugada, opcionalmente em mistura por adição com as proteínas de ligação a antígeno da presente invenção ou conjugada às proteínas de ligação a antígeno.
[00148] Em vários aspectos da presente invenção, a composição adicionalmente compreende um carreador, diluentes ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a proteína de ligação a antígeno, um ácido nucleico, um vetor, uma célula hospedeira ou um conjugado como aqui divulgado (doravante chamados de
"agentes ativos") é formulado numa composição farmacêutica compreendendo o agente ativo, juntamente com um carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Neste sentido, a presente invenção fornece ainda composições farmacêuticas compreendendo um agente ativo que se destina à administração a um indivíduo, por exemplo, um mamífero.
[00149] Em algumas modalidades, o agente ativo está presente na composição farmacêutica a um nível de pureza adequado para a administração a um paciente. Em algumas modalidades, o agente ativo tem um nível de pureza de pelo menos cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% e um diluente, carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composições contém um agente ativo a uma concentração de cerca de 0,001 a cerca de 30,0 mg/ml.
[00150] Em vários aspectos, as composições farmacêuticas compreendem um carreador farmaceuticamente aceitável. Como usado no presente documento, o termo "carreador farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer um dos carreadores farmacêuticos-padrão, como uma solução salina tamponada de fosfato, água, emulsões como uma emulsão de óleo/água ou água/óleo e vários tipos de agentes umectantes. O termo também engloba qualquer um dos agentes aprovados por uma agência reguladora do Governo federal Americano ou listados na Farmacopeia Americana (U.S. Pharmacopeia) para uso em animais, incluindo seres humanos.
[00151] A composição farmacêutica pode compreender quaisquer ingredientes farmaceuticamente aceitáveis, incluindo, por exemplo, agentes acidificantes, aditivos, adsorventes, propulsores de aerossol, agentes de deslocamento de ar, agentes alcalizantes, agentes antiformação de bolo, anticoagulantes, conservantes antimicrobianos,
antioxidantes, antissépticos, bases, aglutinantes, agentes de tamponamento, agentes quelantes, agentes de revestimento, agentes colorantes, dissecantes, detergentes, diluentes, desinfetantes, desintegrantes, agentes dispersantes, agentes de intensificação de dissolução, corantes, emolientes, agentes emulsificantes, estabilizadores de emulsão, cargas, agentes de formação de filme, intensificadores de aroma, agentes aromatizantes, intensificadores de fluxo, agentes gelificantes, agentes granuladores, umectantes, lubrificantes, mucoadesivos, bases de pomada, pomadas, veículos oleaginosos, bases orgânicas, bases de pastilha, pigmentos, plastificantes, agentes de polimento, conservantes, agentes sequestrantes, penetrantes na pele, agentes solubilizantes, solventes, agentes estabilizantes, bases de supositório, agentes ativos de superfície, tensoativos, agentes de suspensão, agentes adoçantes, agentes terapêuticos, agentes espessantes, agentes de tonicidade, agentes de toxicidade, agentes de aumento de viscosidade, agentes de absorção de água, cossolventes miscíveis em água, amaciantes de água ou agentes umidificantes. Consultar, por exemplo, the Handbook of Pharmaceutical Excipients, Terceira Edição, A. H. Kibbe (Pharmaceutical Press, Londres, Reino Unido, 2000), que é incorporado a título de referência em sua totalidade. Remington's Pharmaceutical Sciences, décima sexta Edição, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980), que é incorporado a título de referência em sua totalidade.
[00152] Em vários aspectos, a composição farmacêutica compreende materiais de formulação que são não tóxicos a recipientes nas dosagens e concentrações empregadas. Em modalidades específicas, as composições farmacêuticas compreendendo um agente ativo e um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis; poliois; tensoativos; agentes de equilíbrio osmótico; agentes de tonicidade;
antioxidantes; antibióticos; antimicóticos; agentes de volume; lioprotetores; agentes antiespumantes; agentes quelantes; conservantes; colorantes; analgésicos; ou agentes farmacêuticos adicionais. Em vários aspectos, a composição farmacêutica compreende um ou mais poliois e/ou um ou mais tensoativos, opcionalmente, além de um ou mais excipientes, incluindo, mas sem limitações, sais farmaceuticamente aceitáveis; agentes de equilíbrio osmótico (agentes de tonicidade); antioxidantes; antibióticos; antimicóticos; agentes de volume; lioprotetores; agentes antiespumantes; agentes quelantes; conservantes; colorantes; e analgésicos.
[00153] Em certas modalidades, a composição farmacêutica pode conter materiais de formulação para modificar, manter ou preservar, por exemplo, o pH, a osmolaridade, a viscosidade, clareza, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou liberação, adsorção ou penetração da composição. Em tais modalidades, os materiais de formulação adequados incluem, mas, sem limitações, aminoácidos (como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina); antimicrobianos; antioxidantes (como ácido ascórbico, sulfito de sódio ou hidrogênio-sulfito de sódio); tampões (como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos ou outros ácidos orgânicos); agentes de volume (como manitol ou glicina); agentes quelantes (como ácido etilenodiamina tetra-acético (EDTA)); agentes complexantes (como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina ou hidroxipropil- beta-ciclodextrina); cargas; monossacarídeos; dissacarídeos; e outros carboidratos (como glicose, manose ou dextrinas); proteínas (como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas); agentes colorantes, aromatizantes e diluentes; agentes emulsificantes; polímeros hidrofílicos (como polivinilpirrolidona); polipeptídeos de baixo peso molecular; contraíons de formação de sal (como sódio); conservantes
(como cloreto de benzoalcônio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrgênio); solventes (como glicerina, propileno glicol ou polietileno glicol); alcoóis de açúcar (como manitol ou sorbitol); agentes de suspensão; tensoativos ou agentes umidificantes (como plurônicos, PEG, ésteres de sorbitano, polissorbatos como polissorbato 20, polissorbato, tritona, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes de intensificação de estabilidade (como sacarose ou sorbitol); agentes de intensificação de tonicidade (como haletos de metal alcalino, preferencialmente cloreto de potássio ou sódio, manitol sorbitol); veículos de distribuição; diluentes; excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos. Consultar, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a Edição, (A. R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company.
[00154] As composições farmacêuticas podem ser formuladas para alcançar um pH fisiologicamente compatível. Em algumas modalidades, o pH da composição farmacêutica pode ser, por exemplo, entre cerca de 4 ou cerca de 5 e cerca de 8,0 ou cerca de 4,5 e cerca de 7,5 ou cerca de 5,0 a cerca de 7,5. Em várias modalidades, o pH da composição farmacêutica é entre 5,5 e 7,5.
[00155] A presente invenção fornece métodos para produzir uma composição farmacêutica. Em vários aspectos, o método compreende combinar a proteína de ligação a antígeno, conjugado, proteína de fusão, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira ou uma combinação dos mesmos, com um carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
VIAS DE ADMINISTRAÇÃO
[00156] Em relação à presente invenção, o agente ativo, ou a composição farmacêutica compreendendo o mesmo, pode ser administrado ao indivíduo por meio de qualquer via de administração adequada. Por exemplo, o agente ativo pode ser administrado a um indivíduo por meio de administração parenteral, nasal, oral, pulmonar, tópica, vaginal ou retal. A seguinte discussão sobre vias de administração é meramente fornecida para ilustrar várias modalidades e não deve ser considerada como limitante do escopo de nenhuma forma.
[00157] As formulações adequadas para administração parenteral incluem soluções de injeção aquosas e não aquosas estéreis isotônicas, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do recipiente pretendido, e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizantes e conservantes. O termo, "parenteral" significa que não é através do canal alimentar, mas, por alguma outra via como subcutânea, intramuscular, intraspinal ou intravenosa. O agente ativo da presente invenção pode ser administrado com um diluente fisiologicamente aceitável num carreador farmacêutico, como um líquido ou mistura de líquidos estéril, incluindo água, solução salina, dextrose aquosa e soluções de açúcar relacionadas, um álcool, como etanol ou álcool hexadecílico, um glicol, como propileno glicol ou polietileno glicol, dimetilsulfóxido, glicerol, cetais como 2,2-dimetil-l53-dioxolano-4- metanol, éteres, poli(etilenoglicol) 400, óleos, ácidos graxos, ésteres de ácido graxo ou glicerídeos ou glicerídeos de ácido graxo acetilados com ou sem a adição de um tensoativo farmaceuticamente aceitável, como um sabão ou um detergente, agente de suspensão, como pectina, carbômeros, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose ou carboximetilcelulose ou agentes emulsificantes e outros adjuvantes farmacêuticos.
[00158] Os óleos, que podem ser usados em formulações parenterais incluem óleos de petróleo, animal, vegetal ou sintético. Os exemplos específicos de óleos incluem amendoim, soja, gergelim, semente de algodão, milho, oliva, petrolato e mineral. Os ácidos graxos adequados para uso em formulações parenterais incluem ácido oleico, ácido esteárico e ácido isoesteárico. O oleato de etila e miristato de isopropila são exemplos de ésteres de ácido graxo adequados.
[00159] Os sabões adequados para uso em formulações parenterais incluem metal alcalino graxo, amônio e sais de trietanolamina e detergentes adequados incluem (a) detergentes catiônicos como, por exemplo, haletos de amônio de dimetil dialquila e haletos de piridínio alquila, (b) detergentes aniônicos como, por exemplo, sulfonatos de alquila, arila e olefina, sulfatos de alquila, olefina, éter e monoglicerídeo, e sulfosuccinatos, (c) detergentes não iônicos como, por exemplo, óxidos de amina graxa, alcanolamidas de ácido graxo e copolímeros de polioxietilenopolipropileno, (d) detergentes anfotéricos como, por exemplo, alquil-β-aminopropionatos, e sais de amônio quaternário de 2- alquil-imidazolina e (e) misturas dos mesmos.
[00160] As formulações parenterais em algumas modalidades contêm de cerca de 0,5% a cerca de 25% em peso do agente ativo da presente invenção em solução. Os conservantes e tampões podem ser usados. Para minimizar ou eliminar a irritação no sítio de injeção, tais composições podem conter um ou mais tensoativos não iônicos que têm um equilíbrio hidrofílico-lipofílico (HLB) de cerca de 12 a cerca de 17. A quantidade de tensoativo em tais formulações tipicamente irá variar de cerca de 5% a cerca de 15% em peso. Os tensoativos adequados incluem ésteres de ácido graxo de polietileno glicol sorbitano, como mono-oleato de sorbitano e os adutos de alto peso molecular de óxido de etileno com uma base hidrofóbica, formada pela condensação de óxido de propileno com propileno glicol. As formulações parenterais em alguns aspectos são apresentadas em recipientes vedados de dose unitária ou múltiplas doses, como ampolas e frascos, e podem ser armazenadas numa condição de secagem por congelamento (liofilizada) exigindo apenas a adição do excipiente líquido estéril, por exemplo, água, para injeções, imediatamente antes do uso. As suspensões e solução de injeção extemporâneas, em alguns aspectos, são preparadas a partir de pós, grânulos e tabletes estéreis do tipo descrito anteriormente.
[00161] As formulações injetáveis estão em conformidade com a presente invenção. As exigências para carreadores farmacêuticos eficazes para composições injetáveis são bem conhecidas por aqueles de habilidade comum na técnica (consultar, por exemplo, Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker e Chalmers, eds., páginas 238-250 (1982), e ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4a edição, páginas 622- 630 (1986)).
DOSAGENS
[00162] Acredita-se que os agentes ativos da descrição sejam úteis nos métodos para inibir o crescimento de tumor, assim como outros métodos, como descrito adicionalmente no presente documento, incluindo métodos para tratar ou prevenir câncer. Para propósitos da descrição, a quantidade ou dose do agente ativo administrado deve ser suficiente para efetuar, por exemplo, uma resposta terapêutica ou profilática no indivíduo ou animal ao longo de um intervalo de tempo razoável. Por exemplo, a dose do agente ativo da presente invenção deve ser suficiente para tratar câncer como descrito no presente documento num período de cerca de 1 a 4 minutos, 1 a 4 horas ou 1 a 4 semanas ou mais, por exemplo, 5 a 20 ou mais semanas, a partir do momento da administração. Em certas modalidades, o período de tempo pode ser ainda mais longo. A dose será determinada pela eficácia do agente ativo particular e a afecção do animal (por exemplo, ser humano), assim como o peso corporal do animal (por exemplo, ser humano) a ser tratado.
[00163] Muitos ensaios para determinar uma dose administrada são conhecidos na técnica. Para propósitos do presente documento, um ensaio, que compreende comparar a extensão à qual o câncer é tratado mediante a administração de uma dada dose do agente ativo da presente invenção a um mamífero dentre um conjunto de mamíferos, cada conjunto dos quais recebe uma dose diferente do agente ativo, pode ser usada para determine uma dose inicial a ser administrada a um mamífero. A extensão à qual o câncer é tratado mediante a administração de uma certa dose pode ser representada, por exemplo, pela extensão de regressão de tumor alcançada com o agente ativo num modelo de xenoenxerto de camundongo. Os métodos para avaliar a regressão de tumor são conhecidos na técnica e descritos no presente documento nos EXEMPLOS.
[00164] A dose do agente ativo da presente invenção também será determinada pela existência, natureza e extensão de quaisquer efeitos colaterais adversos que possam acompanhar a administração de um agente ativo particular da presente invenção. Tipicamente, o médico responsável decidirá a dosagem do agente ativo da presente invenção com a qual tratar cada paciente individual, levando em consideração uma variedade de fatores, como idade, peso corporal, saúde geral, dieta, sexo, agente ativo da presente invenção a ser administrado, via de administração e a gravidade da afecção sendo tratada. A título de exemplo, e sem pretender limitar a presente invenção, a dose do agente ativo da presente invenção pode ser cerca de 0,0001 a cerca de 1 g/kg de peso corporal do indivíduo sendo tratado/dia, de cerca de 0,0001 a cerca de 0,001 g/kg de peso corporal/dia, ou cerca de 0,01 mg a cerca de 1 g/kg de peso corporal/dia.
FORMULAÇÕES DE LIBERAÇÃO CONTROLADA
[00165] Em algumas modalidades, os agentes ativos descritos no presente documento podem ser modificados para uma forma de depósito, de modo que a maneira em que o agente ativo da presente invenção for liberado para o corpo ao qual é administrado seja controlada em relação ao tempo e localização no corpo (consultar, por exemplo, Patente No U.S. 4.450.150). As formas de depósito de agentes ativos da presente invenção podem ser, por exemplo, uma composição implantável compreendendo os agentes ativos e um material poroso ou não poroso, como um polímero, em que o agente ativo é encapsulado por ou difundido ao longo do material e/ou degradação do material não poroso. O depósito é, então, implantado na localização desejada dentro do corpo do indivíduo e o agente ativo é liberado do implante a uma taxa predeterminada.
[00166] A composição farmacêutica compreendendo o agente ativo em certos aspectos é modificada para ter qualquer tipo de perfil de liberação in vivo. Em alguns aspectos, a composição farmacêutica é uma formulação de liberação imediata, liberação controlada, liberação sustentada, liberação estendida, liberação retardada ou liberação bifásica. Os métodos para formular peptídeos para a liberação controlada são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Qian et al., J Pharm 374: 46-52 (2009) e Publicação de Pedido de Patente Internacional nos WO 2008/130158, WO2004/033036; WO2000/032218; e WO 1999/040942.
[00167] As presentes composições podem compreender adicionalmente, por exemplo, micelas ou lipossomos ou alguma outra forma encapsulada, ou podem ser administradas numa forma de liberação estendida para fornecer um armazenamento e/ou efeito de distribuição prolongado.
USO
[00168] As proteínas de ligação a antígeno da presente invenção são úteis para inibir o crescimento de tumor. Sem se ater a uma teoria particular, a ação de inibição das proteínas de ligação a antígeno fornecidas no presente documento permite que tais entidades sejam úteis em métodos para tratar câncer.
[00169] Consequentemente, são fornecidos, no presente documento, métodos para inibir o crescimento de tumor num indivíduo e métodos para reduzir o tamanho de tumor num indivíduo. Em várias modalidades, os métodos compreendem administrar ao indivíduo a composição farmacêutica da presente invenção numa quantidade eficaz para inibir o crescimento de tumor ou reduzir o tamanho de tumor no indivíduo. Em vários aspectos, o crescimento de um tumor ovariano, tumor de melanoma, tumor de bexiga ou tumor endometrial é inibido. Em vários aspectos, o tamanho de um tumor ovariano, tumor de melanoma, tumor de bexiga ou tumor endometrial é reduzido.
[00170] Como usado no presente documento, o termo "inibir" ou "reduzir" e palavras provenientes dos mesmos podem não ser uma inibição ou redução 100% ou completa. Em vez disto, há graus variáveis de inibição ou redução que uma pessoa de habilidade comum na técnica reconhece como tendo um benefício potencial ou efeito terapêutico. Neste sentido, as proteínas de ligação a antígeno da presente invenção podem inibir o crescimento de tumor ou reduzir o tamanho de tumor a qualquer quantidade ou nível. Em várias modalidades, a inibição fornecida pelos métodos da presente invenção é uma inibição de pelo menos ou cerca de 10% (por exemplo, uma inibição de pelo menos ou cerca de 20%, uma inibição de pelo menos ou cerca de 30%, uma inibição de pelo menos ou cerca de 40%, uma inibição de pelo menos ou cerca de 50%, uma inibição de pelo menos ou cerca de 60%, uma inibição de pelo menos ou cerca de 70%, uma inibição de pelo menos ou cerca de 80%, uma inibição de pelo menos ou cerca de 90%, uma inibição de pelo menos ou cerca de 95%, uma inibição de pelo menos ou cerca de 98%). Em várias modalidades, a redução fornecida pelos métodos da presente invenção é uma redução de pelo menos ou cerca de 10% (por exemplo, uma redução de pelo menos ou cerca de 20%, uma redução de pelo menos ou cerca de 30%, uma redução de pelo menos ou cerca de 40%, uma redução de pelo menos ou cerca de 50%, uma redução de pelo menos ou cerca de 60%, uma redução de pelo menos ou cerca de 70%, uma redução de pelo menos ou cerca de 80%, uma redução de pelo menos ou cerca de 90%, uma redução de pelo menos ou cerca de 95%, uma redução de pelo menos ou cerca de 98%).
[00171] São adicionalmente fornecidos no presente documento métodos para tratar um indivíduo com câncer, por exemplo, câncer que expressa CLDN6. Em várias modalidades, o método compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica da presente invenção numa quantidade eficaz para tratar o câncer no indivíduo.
[00172] Para propósitos do presente documento, o câncer dos métodos divulgados no presente documento podem ser qualquer câncer, por exemplo, qualquer crescimento maligno ou tumor causado por divisão celular anormal ou não controlada que possa difundir para outras partes do corpo através do sistema linfático ou a corrente sanguínea. O câncer, em alguns aspectos, é um selecionado a partir do grupo consistindo em câncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiossarcoma alveolar, câncer ósseo, câncer cerebral, câncer de mama, câncer do anus, canal anal, ou anorreto, câncer do olho, câncer do duto biliar intra-hepático, câncer das articulações, câncer do pescoço, vesícula biliar ou pleura, câncer do nariz, cavidade nasal ou ouvido intermediário, câncer da cavidade oral, câncer da vulva, leucemia linfocítica crônica, câncer mieloide crônico, câncer de cólon, câncer do esôfago, câncer cervical, tumor carcinoide gastrointestinal, linfoma de Hodgkin, câncer de hipofaringe, câncer de rim, câncer de laringe, câncer de fígado, câncer de pulmão, mesotelioma maligno, melanoma, mieloma múltiplo, câncer de nasofaringe, linfoma não Hodgkin, câncer ovariano, câncer pancreático, peritôneo, omento e câncer mesentério, câncer de faringe, câncer de próstata, câncer retal, câncer renal (por exemplo, carcinoma de célula renal (RCC)), câncer de intestino delgado, câncer de tecido macio, câncer de estômago, câncer testicular, câncer de tiróide, câncer de ureter e câncer de bexiga urinária. Em aspectos particulares, o câncer é selecionado a partir do grupo consistindo em: cânceres de cabeça e pescoço, ovariano, cervical, bexiga e esôfago, câncer pancreático, gastrointestinal, cânceres gástrico, de mama, endometrial e colorretal, carcinoma hepatocelular, glioblastoma, câncer de bexiga, pulmão, por exemplo, câncer de pulmão de célula não pequena (NSCLC), carcinoma de brônquioloalveolar. Em vários aspectos, o câncer é câncer ovariano, melanoma, câncer de bexiga, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer endometrial. Em vários aspectos, o câncer é qualquer câncer caracterizado por expressão moderada a alta de CLDN6. Consultar, por exemplo, as Figuras 1 a 3. Em vários aspectos, o câncer é leucemia mieloide aguda, linfoma de célula B grande, câncer de estômago, câncer de próstata, melanoma, câncer de cólon, câncer retal, câncer de bexiga, câncer cervical, câncer de fígado, câncer de mama, carcinoma de célula clara de rim, câncer de cabeça e pescoço, sarcoma, câncer cromófobo de rim, glioma de grau inferior, câncer adrenocortical, glioblastoma, carcinoma de célula papilar de rim, carcinoma de célula escamosa de pulmão, câncer de tiróide, adenocarcinoma de pulmão, câncer pancreático, câncer endometroide, carcinsarcoma uterino ou câncer ovariano. Em vários aspectos, o câncer é selecionado a partir de câncer ovariano, câncer endometrioide, câncer uterino, câncer de pulmão, câncer gástrico, câncer de mama câncer de Carcinoma de Células Escamosas de Cabeça e Pescoço (HNSCC), câncer cervical e bexiga.
[00173] Como usado no presente documento, o termo "tratar", assim como palavras relacionadas ao mesmo, não implica necessariamente tratamento de 100% ou completo. Em vez disto, há graus variáveis tratamento que uma pessoa de habilidade comum na técnica reconhece como tendo um benefício potencial ou efeito terapêutico. Neste sentido, os métodos para tratar câncer da presente invenção podem fornecer qualquer quantidade ou qualquer nível de tratamento. Ademais, o tratamento fornecido pelo método da presente invenção pode incluir o tratamento de uma ou mais afecções ou sintomas ou sinais do câncer sendo tratado. Além disto, o tratamento fornecido pelos métodos da presente invenção pode englobar o retardamento da progressão do câncer. Por exemplo, os métodos podem tratar câncer em virtude de intensificar a atividade de T célula ou uma resposta imune contra o câncer, reduzindo o tumor ou crescimento de câncer, reduzindo a metástase de células de tumor, aumentando a morte celular de células de tumor ou câncer e similares. Em vários aspectos, os métodos tratados por meio de retardamento do início ou recorrência do câncer por pelo menos 1 dia, 2 dias, 4 dias, 6 dias, 8 dias, 10 dias, 15 dias, 30 dias, dois meses, 3 meses, 4 meses, 6 meses, 1 ano, 2 anos, 3 anos, 4 anos ou mais. Em vários aspectos, os métodos tratam por meio do aumento da sobrevivência do indivíduo.
[00174] As proteínas de ligação a antígeno da presente invenção também podem ser usadas para detectar CLDN6 numa amostra ou diagnosticar um câncer positivo para CLDN6. Portanto, a presente invenção fornece métodos para detectar Claudin6 (CLDN6) numa amostra. Em várias modalidades, o método compreende colocar a amostra em contato com uma proteína de ligação a antígeno, um conjugado ou uma proteína de fusão, como descrito no presente documento, e realizar um ensaio para um imunocomplexo compreendendo a proteína de ligação a antígeno, o conjugado ou a proteína de fusão ligada à CLDN6. A presente invenção também fornece métodos para diagnosticar um câncer positivo para Claudin6 (CLDN6)
num indivíduo. Em várias modalidades, o método compreende colocar uma amostra biológica compreendendo células ou tecido obtido do indivíduo com uma proteína de ligação a antígeno, um conjugado ou uma proteína de fusão, como descrito no presente documento, e realizar um ensaio para um imunocomplexo compreendendo a proteína de ligação a antígeno, o conjugado ou a proteína de fusão ligada a CLDN6.
INDIVÍDUOS
[00175] Em algumas modalidades da presente invenção, o indivíduo é um mamífero, incluindo, mas sem limitações, mamíferos da ordem Rodentia, como camundongos e cricetos, e mamíferos da ordem Logomorpha, como coelhos, mamíferos da ordem Carnivora, incluindo Felinos (gatos) e Caninos (cachorros), mamíferos da ordem Artiodactyla, incluindo Bocinos (vacas) e Suínos (porcos) ou da ordem Perssodactyla, incluindo Equinos (cavalos). Em alguns aspectos, os mamíferos são das ordens Primatas, Ceboids ou Simoids (macacos) ou da ordem Anthropoids (seres humanos e símios). Em alguns aspectos, o mamífero é um ser humano.
KITS
[00176] Em algumas modalidades, as proteínas de ligação a antígeno da presente invenção são fornecidas num kit. Em vários aspectos, o kit compreende a proteína (ou proteínas) de ligação a antígeno como uma dose unitária. Para propósitos do presente documento, "dose unitária" se refere a uma quantidade discreta dispersa num carreador adequado. Em vários aspectos, a dose unitária é a quantidade suficiente para fornecer a um indivíduo um efeito desejado, por exemplo, a inibição de crescimento de tumor, redução de tamanho de tumor, tratamento de câncer. Consequentemente, são fornecidos, no presente documento, kits compreendendo uma proteína de ligação a antígeno da presente invenção opcionalmente fornecida em doses unitárias. Em vários aspectos, o kit compreende várias doses unitárias, por exemplo, suprimento de uma semana ou mês de doses unitárias, opcionalmente, cada uma das quais é individualmente embalada ou, de outro modo, separada de outras doses unitárias. Em algumas modalidades, os componentes do kit/dose unitária são embalados com instruções para administração a um paciente. Em algumas modalidades, o kit compreende um ou mais dispositivos para administração a um paciente, por exemplo, uma agulha e seringa e similares. Em alguns aspectos, a proteína de ligação a antígeno da presente invenção, um sal farmaceuticamente aceitável da mesma, um conjugado compreendendo a proteína de ligação a antígeno, ou um multímero ou dímero compreendendo a proteína de ligação a antígeno, é pré-embalado numa forma pronta para uso, por exemplo, uma seringa, uma bolsa intravenosa, etc. Em alguns aspectos, o kit compreende ainda outros agentes terapêuticos ou de diagnóstico ou carreadores farmaceuticamente aceitáveis (por exemplo, solventes, tampões, diluentes, etc.), incluindo qualquer um destes descritos no presente documento. Em aspectos particulares, o kit compreende uma proteína de ligação a antígeno da presente invenção, juntamente com um agente, por exemplo, um agente terapêutico, usado em quimioterapia ou terapia de radiação.
VÁRIAS MODALIDADES
[00177] Em várias modalidades da presente invenção, a proteína de ligação a antígeno se liga a uma proteína Claudin6 (CLDN6) humana (SEQ ID Nº: 200), em que (a) a proteína de ligação a antígeno se liga à Alça Extracelular 2 (EL2) de um domínio extracelular (ECD) de CLDN6 e não se liga à Alça Extracelular 1 (EL1) do ECD de CLDN6; ou (b) não se liga a qualquer uma dentre Claudin3 (CLDN3), Claudin4 (CLDN4) e Claudin9 (CLDN9) e inibe a ligação de um anticorpo de referência à CLDN6 expressa de modo endógeno por células OVCA429 com menos que cerca de 1200 nM; ou (c) uma combinação destes. Em vários casos,
a proteína de ligação a antígeno se liga a um epítopo dentro da sequência de aminoácidos de WTAHAIIRDFYNPLVAEAQKREL (SEQ ID Nº: 2), ou se liga à sequência de aminoácidos de TAHAIIRDFYNPL (SEQ ID Nº: 3) ou LVAEAQKREL (SEQ ID Nº: 4) de CLDN 6. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno não se liga a qualquer uma ou mais dentre Claudin3 (CLDN3), Claudin4 (CLDN4) e Claudin9 (CLDN9). Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno não se liga à CLDN3. Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno se liga à CLDN6, CLDN4 e CLDN9, porém, não se liga à CLDN3. Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno se liga a CLDN6 e CLDN4, porém, não se liga à CLDN3 ou CLDN9. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno se liga à CLDN6 e CLDN9, porém, não se liga à CLDN3 ou CLDN4.
[00178] Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno da presente invenção inibe a ligação de um anticorpo de referência à CLDN6 expressa de modo endógeno por células OVCA429 com menos que cerca de 1200 nM e o anticorpo de referência compreende uma sequência variável de cadeia leve de SEQ ID Nº: 181 e uma sequência variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº: 182 ou uma sequência variável de cadeia leve de SEQ ID Nº: 185 e uma sequência variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº: 186. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno da presente invenção inibe a ligação de um anticorpo de referência à CLDN6 expressa de modo endógeno por células OVCA429 com menos que cerca de 1000 nM ou menos que 750 nM (por exemplo, menos que cerca de 500 nM, menos que cerca de 250 nM, menos que cerca de 100 nM) e o anticorpo de referência compreende uma sequência variável de cadeia leve de SEQ ID Nº: 181 e uma sequência variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº: 182 ou uma sequência variável de cadeia leve de SEQ ID Nº: 185 e uma sequência variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº: 186.
[00179] Em várias modalidades, a proteína de ligação a antígeno compreende (a) uma sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia pesada apresentada na Tabela A ou A1 ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 11, 17, 23, 29, 35, 41, 47, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 452, 455, 461, 465 e 472, ou uma sequência variante da mesma, que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos ou cerca de 85%, pelo menos ou cerca de 90%) identidade de sequência; (b) uma sequência de aminoácidos de CDR2 de cadeia pesada apresentada na Tabela A ou A1 ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 86, 102, 108, 114, 120, 126, 132, 475, 456, 462, 466, 468 e 473, ou uma sequência variante da mesma que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos ou cerca de 85%, pelo menos ou cerca de 90%) de identidade de sequência; (c) uma sequência de aminoácidos de CDR3 de cadeia pesada apresentada na Tabela A ou A1 ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 13, 19, 25, 31, 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 453, 457, 463, 467, 469 e 474, ou uma sequência variante da mesma que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos ou cerca de 85%, pelo menos ou cerca de 90%) de identidade de sequência; (d) uma sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia leve apresentada na Tabela A ou A1 ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 8, 14, 20, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 449, 476, 458, 464 e 470, ou uma sequência variante da mesma, que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos ou cerca de 85%,
pelo menos ou cerca de 90%) identidade de sequência; (e) uma sequência de aminoácidos de CDR2 de cadeia leve apresentada na Tabela A ou A1 ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129, 450, 477, 459 e 471, ou uma sequência variante da mesma, que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos ou cerca de 85%, pelo menos ou cerca de 90%) identidade de sequência; (f) uma sequência de aminoácidos de CDR3 de cadeia leve apresentada na Tabela A ou A1 ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 10, 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130, 451, 454 e 460 ou uma sequência variante da mesma que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos ou cerca de 85%, pelo menos ou cerca de 90%) de identidade de sequência; (g) uma combinação de quaisquer dois ou mais dentre (a) a (f).
[00180] Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia leve, uma sequência de aminoácidos de CDR2 de cadeia leve e uma cadeia leve CDR3 sequência de aminoácidos apresentada na Tabela A ou A1 e 1 ou 2 das sequências de aminoácidos de CDR de cadeia pesada apresentadas na Tabela A ou A1. Em alguns casos, a proteína de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia pesada, a sequência de aminoácidos de CDR2 de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de CDR3 de cadeia pesada apresentada na Tabela A ou A1 e 1 ou 2 das sequências de aminoácidos de CDR de cadeia leve apresentadas na Tabela A ou A1. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreende seis sequências de aminoácidos de CDR selecionadas a partir do grupo consistindo em: (a) SEQ ID Nºs: 74 a 79; (b) SEQ ID Nºs: 50 a 55; (c) SEQ ID Nºs: 122 a 127; (d) SEQ ID Nºs: 26 a 31; (e) SEQ ID Nºs: 128 a 133; (f) SEQ ID Nºs: 38 a 43; (g) SEQ ID Nºs: 62 a 67; (h) SEQ ID Nºs: 80 a 85; (i) SEQ ID Nºs: 44 a 49; (j) SEQ ID Nºs: 86 a 91; (k) SEQ ID Nºs: 104 a 109; (l) SEQ ID Nºs: 56 a 61; (m) SEQ ID Nºs: 32 a 37; (n) SEQ ID Nºs: 110 a 115; (o) SEQ ID Nºs: 98 a 103; (p) SEQ ID Nºs: 92 a 97; (q) SEQ ID Nºs: 116 a 121; (r) SEQ ID Nºs: 8 a 13; (t) SEQ ID Nºs: 68 a 73; (u) SEQ ID Nºs: 14 a 19; (v) SEQ ID Nºs: 20 a 25, (v) SEQ I D Nºs: 449 a 453 e 475; (w) SEQ ID Nºs: 476 a 477, 454 a 457, (x) SEQ ID Nºs: 458 a 463; (y) SEQ ID Nºs: 57, 58, 464 a 467; (z) SEQ ID Nºs: 68 a 71 e 468 a 469; e (aa) SEQ ID Nºs: 112 e 470 a 474. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreende (a) uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada apresentada na Tabela B ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173 e 175, ou uma sequência variante das mesmas que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos ou cerca de 85%, pelo menos ou cerca de 90%) de identidade de sequência; ou (b) uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve apresentada na Tabela B ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174 e 176, ou uma sequência variante das mesmas que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% (por exemplo, pelo menos ou cerca de 85%, pelo menos ou cerca de 90%) de identidade de sequência; ou tanto (a) quanto (b). Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreende um par de sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo consistindo em: (a) SEQ ID Nºs: 156 e 157; (b) SEQ ID Nºs: 148 e 149; (c) SEQ ID Nºs: 172 e 173;
(d) SEQ ID Nºs: 140 e 141; (e) SEQ ID Nºs: 174 e 175; (f) SEQ ID Nºs: 144 e 145; (g) SEQ ID Nºs: 152 e 153; (h) SEQ ID Nºs: 158 e 159; (i) SEQ ID Nºs: 146 e 147; (j) SEQ ID Nºs: 160 e 161; (k) SEQ ID Nºs: 166 e 167; (l) SEQ ID Nºs: 150 e 151; (m) SEQ ID Nºs: 142 e 143; (n) SEQ ID Nºs: 168 e 169; (o) SEQ ID Nºs: 164 e 165; (p) SEQ ID Nºs: 162 e 163; (q) SEQ ID Nºs: 170 e 171; (r) SEQ ID Nºs: 134 e 135; (s) SEQ ID Nºs: 154 e 155; (t) SEQ ID Nºs: 136 e 137; e (u) SEQ ID Nºs: 138 e 139.
[00181] Em várias modalidades, a proteína de ligação a antígeno compreende (a) uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada apresentada na Tabela B1 ou C ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 376 a 379, 384 a 387, 391 a 396, 403 a 408, 412, 413, 416 a 419, 422 a 427, 478, 480, 482, 484, 486 e 488 ou uma sequência variante da mesma, que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70%, ou cerca de 80%, ou cerca de 90%, ou cerca de 95% de identidade de sequência; ou (b) uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve apresentada na Tabela B1 ou C ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs:: 380 a 383, 388 a 390, 397 a 402, 409 a 411, 414, 415, 420, 421 e 479, 481, 483, 485, 487 e 489 ou uma sequência variante da mesma, que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70%, ou cerca de 80%, ou cerca de 90% ou cerca de 95% de identidade de sequência; ou (c) tanto (a) quanto (b). Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno compreende um par de sequências de aminoácidos como listado na Tabela D.
[00182] A presente invenção fornece uma proteína de ligação a antígeno compreendendo: (A) uma CDR1 de HC que compreende a sequência de aminoácidos de YTFTXYT, em que X é T, V, D ou S (SEQ ID Nº: 452), opcionalmente, compreendendo a sequência de aminoácidos de YTFTTYT (SEQ ID Nº: 11); (B) uma CDR2 de HC que compreende a sequência de aminoácidos de IXPSSGYT, em que X é Q, S, A ou N (SEQ ID Nº: 475), opcionalmente, que compreende a sequência de aminoácidos de INPSSGYT (SEQ ID Nº: 12); (C) uma CDR3 de HC que compreende a sequência de aminoácidos de AXGDYYVAY, em que X é N, Q, H ou D (SEQ ID Nº: 453), opcionalmente, compreendendo a sequência de aminoácidos de ANGDYYVAY (SEQ ID Nº:13); (D) uma CDR1 de LC compreendendo a sequência de aminoácidos de SSVSSXY, em que X é T, V, F ou D (SEQ ID Nº: 449), opcionalmente, que compreende a sequência de aminoácidos de SSVSSTY (SEQ ID Nº:8); (E) uma CDR2 de LC compreendo a sequência de aminoácidos de XTX, em que X na posição 1 é S, T, Q ou A e X na posição 3 é S, T, D ou Q (SEQ ID Nº: 450), opcionalmente, que compreende a sequência de aminoácidos de STS (SEQ ID Nº:9); (F) uma CDR3 de LC compreendendo a sequência de aminoácidos de HXYXRSPLT, em que X na posição 2 é Q, H ou S e X na posição 4 é H, Y, Q ou S (SEQ ID Nº: 451), opcionalmente, que compreende a sequência de aminoácidos de HQYHRSPLT (SEQ ID Nº: 10).
[00183] Uma proteína de ligação a antígeno que compreende: (A) uma CDR1 de HC compreendendo a sequência de aminoácidos de FTFSXYX, em que X na posição 5 é N, S, R, Q ou A e X na posição 7 é W, H, Y, F (SEQ ID Nº: 455), opcionalmente, compreendendo a sequência de aminoácidos de FTFSNYW (SEQ ID Nº: 23); (B) uma CDR2 de HC compreendendo a sequência de aminoácidos de IRLKXDXYAT, em que X na posição 5 é S, N, A ou T e X na posição 7 é Q, S, A, N (SEQ ID Nº: 456), opcionalmente, compreendendo a sequência de aminoácidos de IRLKSDNYAT (SEQ ID Nº: 24); (C) uma CDR3 de HC compreendendo a sequência de aminoácidos de XDGPPSGX, em que X na posição 1 é N, D ou T e X na posição 8 é S, T, A, C ou Y (SEQ ID Nº: 457), opcionalmente, compreendendo a sequência de aminoácidos de NDGPPSGC (SEQ ID Nº: 25); (D) uma CDR1 de LC compreendendo a sequência de aminoácidos de EXIYSY, em que X é Q, S, A, D ou N (SEQ ID Nº: 476), opcionalmente, compreendendo a sequência de aminoácidos de ENIYSY (SEQ ID Nº: 20); (E) uma CDR2 de LC compreendendo a sequência de aminoácidos de XAK, em que X na posição 1 é Q, S, A, D ou N (SEQ ID Nº: 477), opcionalmente, compreendendo a sequência de aminoácidos de NAK (SEQ ID Nº: 21); e (F) uma CDR3 de LC compreendendo a sequência de aminoácidos de QXHYXVPWT, em que X na posição 2 é H, Q, S ou T e X na posição 5 é T, S, N ou G (SEQ ID Nº: 454), opcionalmente, compreendendo a sequência de aminoácidos de QHHYTVPWT (SEQ ID Nº: 22).
[00184] Uma proteína de ligação a antígeno que compreende: (A) uma CDR1 de HC compreendendo a sequência de aminoácidos de YTXTXYT, em que X na posição 3 é F, Y, S ou T e X na posição 5 é S, T, Y ou D (SEQ ID Nº: 461), opcionalmente, compreendendo a sequência de aminoácidos de YTFTSYT (SEQ ID Nº: 29); (B) uma CDR2 de HC compreendendo a sequência de aminoácidos de IXPSSXYT, em que X na posição 2 é Q, S, A ou N e X na posição 6 é T, S, V, D ou G (SEQ ID Nº: 462), opcionalmente, compreendendo a sequência de aminoácidos de INPSSTYT (SEQ ID Nº: 30); (C) uma CDR3 de HC compreendendo a sequência de aminoácidos de XRGEXGGFAY, em que X na posição 1 é S, A, T ou V e X na posição 5 é L, V ou F (SEQ ID Nº: 463), opcionalmente, compreendendo a sequência de aminoácidos de SRGELGGFAY (SEQ ID Nº: 31); (D) uma CDR1 de LC compreendendo a sequência de aminoácidos de QSLVHSXGXTY, em que X na posição 7 é D, N, E, Q, S ou A e X na posição 9 é Q, S, A, D ou N (SEQ ID Nº: 458), opcionalmente, compreendendo a sequência de aminoácidos de QSLVHSDGNTY (SEQ ID Nº: 26); (E) uma CDR2 de LC compreendendo a sequência de aminoácidos de XVX, em que X na posição 1 é K, Q ou R e X na posição 3 é S, T ou V (SEQ ID Nº: 459), opcionalmente, compreendendo a sequência de aminoácidos de KVS (SEQ ID Nº: 27); e (F) uma CDR3 de LC compreendendo a sequência de aminoácidos de SXXTHVPYT, em que X na posição 2 é Q, H ou T e X na posição 3 é S, G, T ou D (SEQ ID Nº: 460), opcionalmente, compreendendo a sequência de aminoácidos de SQSTHVPYT (SEQ ID Nº: 28).
[00185] Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno da presente invenção é um anticorpo, por exemplo, um anticorpo monoclonal. Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno é uma IgG. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno inibe pelo menos cerca de 50% de crescimento de colônia em ensaios de proliferação de 3D de ágar macio ou inibe o crescimento de tumor em camundongos de xenoenxerto injetados com células de câncer humanas. Em vários aspectos, a proteína de ligação a antígeno inibe crescimento de tumor em camundongos de xenoenxerto injetados com células de câncer ovariano, células de câncer de melanoma, células de câncer de bexiga ou células de câncer endometrial. Em vários casos, a proteína de ligação a antígeno inibe pelo menos 50% de crescimento de tumor em camundongos de xenoenxerto injetados com células de câncer ovariano, células de câncer de bexiga ou células de câncer endometrial.
[00186] A presente invenção fornece um conjugado compreendendo uma proteína de ligação a antígeno descrita aqui e uma porção química heteróloga. A presente invenção também fornece uma proteína de fusão compreendendo uma proteína de ligação a antígeno descrita no presente documento. A presente invenção fornece ainda um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína de ligação a antígeno, um conjugado ou uma proteína de fusão da presente invenção. A presente invenção fornece um vetor compreendendo o ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína de ligação a antígeno, um conjugado ou uma proteína de fusão da presente invenção. A presente invenção adicionalmente fornece uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico ou o vetor da presente invenção.
[00187] A presente invenção fornece um método para produzir uma proteína de ligação a antígeno que se liga a uma proteína Claudin6 (CLDN6), compreendendo (i) cultivar a célula hospedeira da presente invenção num meio de cultura celular, em que a célula hospedeira compreende um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína de ligação a antígeno de qualquer uma das reivindicações anteriores, e (ii) coletar a proteína de ligação a antígeno a partir do meio de cultura celular. Além disto, é fornecido um método para produzir uma proteína de fusão compreendendo uma proteína de ligação a antígeno que se liga a uma proteína Claudin6 (CLDN6), compreendendo (i) cultivar a célula hospedeira da presente invenção num meio de cultura celular, em que a célula hospedeira compreende um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão da presente invenção e (ii) coletar a proteína de fusão do meio de cultura celular.
[00188] A presente invenção fornece ainda um método para produzir uma composição farmacêutica compreendendo combinar uma proteína de ligação a antígeno, um conjugado, uma proteína de fusão, um ácido nucleico, um vetor, uma célula hospedeira da presente invenção ou uma combinação dos mesmos e um carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Também são fornecidas composições farmacêuticas compreendendo proteína de ligação a antígeno, um conjugado, uma proteína de fusão, um ácido nucleico, um vetor, uma célula hospedeira, da presente invenção ou uma combinação dos mesmos, e um carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00189] É fornecido, no presente documento, um método para tratar um indivíduo com um câncer que expressa CLDN6, compreendendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica descrita no presente documento numa quantidade eficaz para tratar o câncer. Também é fornecido um método para inibir crescimento de tumor num indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica descrita no presente documento numa quantidade eficaz para inibir o crescimento de tumor. A presente invenção fornece um método para reduzir o tamanho de tumor num indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica descrita no presente documento numa quantidade eficaz para reduzir o tamanho de tumor. É adicionalmente fornecido um método para prevenir a recorrência de câncer num indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica descrita no presente documento numa quantidade eficaz para prevenir a recorrência de câncer.
[00190] A presente invenção fornece um método para detectar Claudin6 (CLDN6) numa amostra, compreendendo colocar a amostra em contato com uma proteína de ligação a antígeno, um conjugado ou a proteína de fusão, da presente invenção e realizar um ensaio para um imunocomplexo compreendendo a proteína de ligação a antígeno, conjugado ou proteína de fusão ligada à CLDN6. Também é fornecido, no presente documento, um método para diagnosticar um câncer positivo para Claudin6 (CLDN6) num indivíduo, compreendendo colocar uma amostra biológica compreendendo células ou tecido obtido do indivíduo com uma proteína de ligação a antígeno, um conjugado ou uma proteína de fusão da presente invenção, e realizar um ensaio para um imunocomplexo compreendendo a proteína de ligação a antígeno, conjugado ou proteína de fusão ligada à CLDN6.
[00191] A presente invenção também fornece um método para tratar câncer num indivíduo diagnosticado como sendo um superexpressador baixo de CLDN6. Em várias modalidades, o método compreende administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica aqui divulgada numa quantidade eficaz para prevenir a recorrência de câncer. Em alguns aspectos, a administração induz apoptose em células de tumor, opcionalmente, a administração induz apoptose em células que expressam CLDN6. Em vários aspectos, o indivíduo tem um tumor, e o tumor é categorizado de modo semiquantitativo num de quatro grupos: altos expressadores, expressadores moderados, expressadores baixos e não expressadores. Em vários casos, os altos expressadores são definidos como RNA de CLDN6 maior que 12 log de Fragmentos Por Milhão de Quilobase (FPKM), em que o RNA de CLDN6 é medido por RNASeq, ou níveis de proteína de CLDN6 são mais de 3+ como medido por imunohistoquímica (IHC). Em vários casos, os expressadores moderados são definidos como RNA de CLDN6 maior que 10 log de FPKM, em que o RNA de CLDN6 é medido por RNASeq, ou níveis de proteína de CLDN6 são mais de 2+ como medido por IHC. Em vários casos, os baixos expressadores são definidos como RNA de CLDN6 maior que 6 log de FPKM, em que o RNA de CLDN6 é medido por RNASeq, ou níveis de proteína de CLDN6 são mais de 1+ como medido por IHC. Em vários casos, não expressadores são definidos como RNA de CLDN6 menor que 6 log de FPKM, em que o RNA de CLDN6 é medido por RNASeq, ou níveis de proteína de CLDN6 são abaixo dos limites de detecção de IHC. Em vários aspectos, o indivíduo que tem o referido tumor é igualmente descrito como um alto expressador, expressador moderado, expressador baixo ou não expressador de CLDN6.
[00192] Os seguintes exemplos são fornecidos meramente para ilustrar a presente invenção e não, de forma alguma, para limitar seu escopo.
EXEMPLOS EXEMPLO 1
[00193] Este exemplo demonstra uma análise de níveis de RNA de CLDN6 em diferentes fontes de célula e tecido.
[00194] Para estabelecer uma linha de base para expressão de CLDN6 em materiais de fonte diferente, os níveis de expressão de expressão de CLDN6 em amostras de paciente, tecido normal e linhagens celulares criadas pelo laboratório Translational Oncology Research (TORL) foram submetidos a ensaio.
[00195] Os níveis de RNA de CLDN6 em amostras de paciente foram medidos usando informações contidas no banco de dados The Cancer Genome Atlas (TCGA) gerenciado pelo National Cancer Institute (NCI). Os níveis de CLDN6 no tecido de normal foram medidos usando informações no banco de dados Genotype-Tissue Expression (GTEX) mantido pela Common Fund. A análise de tecidos do banco de dados de GTEX mostrou que CLDN6 é detectável em vários sítios, incluindo o cérebro, pituitária, pâncreas, rim, pulmão, tiróide e colo do útero, dentre outros tecidos (Figura 1).
[00196] A expressão de níveis de CLDN6 foi medida em linhagens celulares de câncer de TORL usando microarranjos de Agilent 44K (chip de arranjo 4x44K, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) e ensaios de sequenciamento de RNA (RNA-Seq). O RNASeq foi realizado por BGI Americas (Cambridge, MA) usando seu serviço "RNASeq para quantificação". Como mostrado nas Figuras 2 e 3, as células de câncer ovariano, de cabeça e pescoço, pulmão e câncer de bexiga expressaram os níveis mais altos de CLDN6, embora a expressão de níveis de CLDN6 fosse detectável em células de câncer de mama, rim, cólon, sarcoma e fígado.
EXEMPLO 2
[00197] Este exemplo demonstra a produção de células geneticamente modificadas para superexpressar CLDN6.
[00198] Os modelos geneticamente modificados para superexpressar CLDN6 foram gerados. Estes modelos foram usados para determinar a eficácia de anticorpos de CLDN6 descritos no Exemplo 5. Brevemente, uma sequência de nucleotídeo que codifica CLDN6 foi geneticamente modificada num vetor bicistrônico que tem um promotor de CMV e um Sítio de entrada de ribossomo interno atenuado (IRES) de vírus de encefalomiocardite (EMCV). O IRES foi localizado entre o cDNA de Gene de Interesse (GOI) (CLDN6) e cDNA de puromicina. Um elemento regulador pós-transcricional de Woodchuck (WPRE) foi localizado a jusante da cDNA de puromicina. O vetor também expressou uma sequência marcadora de GFP ou uma etiqueta de MycDDK. A sequência do vetor de expressão contendo GFP é fornecido no presente documento como SEQ ID Nº: 189.
[00199] O vetor de expressão foi viralmente transduzido em células HEK293T (para propósitos de examinação) e células NIH3T3 (para imunizações). As células positivamente transduzidas foram selecionadas com base em sobrevivência em meio contendo puromicina (1 µg/ml). As células positivas foram subclonadas para obter uma população clonal estável uniforme de células de superexpressão de CLDN6.
[00200] A expressão de CLDN6 de subclone foi confirmada por citometria de fluxo usando um anticorpo de referência de CLDN6 monoclonal (mAb) numa citometria de fluxo BD Biosciences Accuri™ (San Jose, CA). Anticorpo secundário e conjugado: Anticorpo de IgG anti-camundongo de cabra Alexa Fluor® 647 (reatividade x mínima) (Biolegend, San Diego, CA; No de cat 405322) foi usado para detectar a atividade de ligação entre o mAb de CLDN6 de referência e a CLDN6 expressa por subclone.
[00201] A localização celular de CLDN6 foi determinada por microscopia de fluorescência usando o sistema de imaginologia Cellavista® (Synentec (Mountain View, CA) com células que expressam uma proteína de fusão de CLDN6-proteína de fluorescência verde (GFP). Como mostrado na Figura 4, a fluorescência da GFP foi detectada na membrana celular, evidenciando que CLDN6 se localiza na membrana celular. EXEMPLO 3
[00202] Este exemplo demonstra a produção de referência e anticorpos de controle.
[00203] Anticorpos específicos de CLDN6 d Benchmark (referência) e anticorpos de controle foram produzidos clonando as regiões variáveis de cadeias pesada e leve de anticorpo no sistema de expressão ExpiCHO™ (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) para produzir anticorpos quiméricos de IgG2A de camundongo recombinante. Estes anticorpos foram testados juntamente com anticorpos específicos de CLDN6 recém-gerados descritos no Exemplo 5.
[00204] Brevemente, os plasmídeos contendo o as sequências de anticorpo de controle e benchmark foram transfectados usando o Sistema de Expressão ExpiCHO™ (Número de Catálogo: A29133, ThermoFisher Scientific, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram cultivadas a 37°C e 8% de CO2 no dia 1 e, então, a 32°C e 5% de CO2 pós-transfecção em meios fornecidos no kit. Os anticorpos foram purificados através do clareamento do meio de cultura de ExpiCHO™ por centrifugação a 1.000 g por 10 min seguidos por
5.000 g por 30 min. O sobrenadante foi, então, filtrado usando um filtro de 0,45 µm seguido por um filtro de 0,22 µm. Subsequentemente, o sobrenadante foi submetido à purificação por afinidade usando resinas de proteína A/G (Life Technologies, Carlsbad, CA; No de Catálogo 20424) de acordo com o protocolo do fabricante. Antes da purificação por ELISA, a titulação de anticorpo no meio de cultura foi aproximadamente determinada para assegurar a quantidade de meio carregado ocupou menos que 80% da capacidade de ligação de resina. Após a incubação, as resinas foram lavadas com PBS e eluído com Tampão de Eluição (Life Technologies, No de catálogo 21004). As frações de eluição foram imediatamente ajustadas para pH fisiológico através da adição de Tampão Tris, pH 8,0. Os anticorpos purificados foram subsequentemente submetidos à troca de tampão e concentração de proteína usando Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit (Life Technologies, No de catálogo UFC900324) em tampão PBS. A concentração de anticorpo foi determinada por Ensaio de Proteína de BCA. SDS-PAGE e manchamento de Coomassie foram executados para testar a pureza de anticorpo. A proteína purificada foi tomada em alíquota e armazenada a - 80°C para armazenamento de longo prazo ou mantido a 4°C para uso imediato.
[00205] A integridade do anticorpo foi validada por SDS-PAGE, seguido por manchamento de Coomassie sob condições de não redução versus redução; sob condição de não redução, uma banda dominante em cerca de 150 kDa, enquanto sob condições de redução, duas bandas foram observadas, 50 kDa e 25 kDa.
[00206] Os anticorpos específicos para outros membros de família de CLDN que têm similaridade de sequência (Figura 5), a saber, CLDN3, CLDN4 e CLDN9 foram produzidas essencialmente da mesma maneira, exceto que as sequências de anticorpo contidas nos plasmídeos foram sequências de anticorpo específicas a CLDN3, CLDN4 ou CLDN9. EXEMPLO 4
[00207] Este exemplo demonstra a caracterização de linhagens celulares com alta expressão de CLDN6 endógena.
[00208] Um painel de linhagens celulares de câncer foi analisado quanto à sua expressão endógena de CLDN6 por FACS e Western blot. Brevemente, a ligação de anticorpos aos alvos foi validada por FACS usando células que superexpressam CLDN6 (por exemplo, células HEK293T que superexpressam CLDN6, descrito no Exemplo 2), e linhagens celulares que expressam CLDN6 de modo endógeno em níveis altos ou baixos, como determinado no Exemplo 1. As células que expressam CLDN6 foram incubadas com anticorpos de referência ou de controle (descrito no Exemplo 3) por 30 minutos em gelo, e, após a lavagem, incubadas com anticorpo de IgG anticamundongo de cabra conjugado Alexa Fluor® 647 (reatividade x mínima), Biolegend No de catálogo 405322 por 30 minutos em gelo. A fluorescência foi lida por um citômetro de fluxo BD Biosciences Accuri™ (San Jose, CA).
[00209] Western blots foram executadas em nitrocelulose com anticorpos de referência e de controle. Brevemente, as amostras de lisados celulares foram fervidas para desnaturar o teor de proteína. SDS-PAGE (eletroforese de gel de poliacrilamida de SDS) foi usado para separar as proteínas desnaturadas pelo comprimento do polipeptídeo. As proteínas separadas foram, então, transferidas do gel de acrilamida para uma membrana de nitrocelulose. Uma solução a 2% de Albumina de Soro Bovino (BSA) foi usada para bloquear a membrana, minimizando a ligação de anticorpo não específica. A membrana foi incubada com anticorpos de referência ou de controle. A membrana foi manchada com um anticorpo secundário conjugado a peroxidase de raiz-forte (HRP) que reconhece os anticorpos de controle ou referência e a detecção de anticorpo secundário foi por meio de quimioluminescência.
[00210] As linhagens superexpressas foram usadas para validar os anticorpos de controle e de referência e, uma vez validados, os anticorpos de controle e de referência foram usados para caracterizar as linhagens celulares endógenas. As células que superexpressam
CLDN6 foram incluídas como controles positivos nestes ensaios.
[00211] Os ensaios de FACS mostraram que quatro linhagens celulares de câncer de ovário, em adição a uma linhagem celular de câncer endometrial, linhagem celular de câncer de bexiga, linhagem celular de câncer de pulmão e linhagem celular de câncer de GI superior, expressam CLDN6 na superfície em altos níveis. Os altos níveis de expressão de CLDN6 também foram detectados por Western blot. Duas linhagens celulares de câncer de ovário adicionais, uma linhagem celular de câncer de fígado adicional, linhagem celular de câncer de pulmão adicional e linhagem celular de câncer de GI superior adicional mostraram expressar CLDN6 a um nível moderado na superfície, como detectado por Western blot. As células de tumor endometriais e células de tumor de bexiga também expressaram altos níveis de CLDN6 como xenoenxertos in vivo. Os níveis de expressão endógenos de CLDN6 pelas linhagens celulares de câncer testadas são resumidos na Tabela 2.
TABELA 2. Expressão Expressão de Expressão de Nome de Sub Q Tumori- Tumori- Histologia RNASeq em Proteína por WB Proteína por Linhagem Grupo tumori- gênico IP gênico IP Primária de CLDN6 Superfície (Linhagens WB Celular gênico (Nude) (SCID) por FACS Celulares) (xenoenxerto)
OVCA429 Ovário 393.99 Con Pos ++++ ++++ No Lento TBD
ARK2 Endométrio 335,06 Con Pos ++++ ++++ +++ Sim
OAW28 Ovário 273,78 Con Pos ++++ ++++ No TBD TBD
UMUC-4 Bexiga 242,93 Con Pos ++++ ++++ ++ Sim Lento TBD
PEO14 Ovário 196,63 Con Pos ++++ +++ No TBD TBD
OV177 Ovário 195,53 Con Pos ++++ + No TBD TBD
H1693 Pulmão 184,12 Con Pos ++++ +++ TBD
MKN7 GI Superior 118,6 Con Pos +++ ++ TBD
OV-90 Ovário 108,23 Con Pos ++ ++ + Sim
HUH-7 Fígado 93,52 Con Pos ++ + Sim
JHOS-4 Ovário 69,3 Con Pos ++ + No TBD TBD
H1435 Pulmão 42,8 Con Pos ++ +/- TBD
NUGC 3 GI Superior 41,11 Con Pos ++ ++ + Sim
RMG-1 Ovário 0,63 Con Neg - - - Sim TBD TBD
COLO704 Ovário 0,44 Con Neg - - - Sim TBD TBD
MCF-7 Mama 0 Con Neg - - - Sim
LS513 Cólon 0 Con Neg - - - Sim
M202 Melanoma 0 Con Neg - - - Sim
M275 Melanoma 0 Con Neg - - Sim
KOC-7C Ovário 0 Con Neg - - - Sim Sim TBD
EXEMPLO 5
[00212] Este exemplo demonstra a imunização de camundongos para a produção de anticorpos específicos de CLDN6.
[00213] Os anticorpos específicos de CLDN6 foram produzidos através da imunização de camundongos Balb/c e CD1 com uma mistura de três imunogênios de peptídeo diferentes seguindo as técnicas do Centro de Pesquisa de Câncer Fred Hutchinson (Fred Hutchinson Cancer Research Center). Os três peptídeos abrangiram a segunda alça no domínio extracelular de CLDN6 (isto é, EL2). Os peptídeos incluem o comprimento total de EL2, um peptídeo que abrange a primeira metade (N-terminal) de EL2 e um peptídeo que abrange a segunda metade (C-terminal) de EL2. A Tabela 3 fornece as sequências dos três peptídeos. TABELA 3 Imunogênio de Peptídeo EL2 SEQ ID Nº: Ac-CWTAHAIIRDFYNPLVAEAQKREL-amida EL2 de comprimento total 2 Ac-CTAHAIIRDFYNPL-amida metade N-terminal 3 Ac-LVAEAQKRELGC-amida metade C-terminal 4
[00214] Os camundongos também foram imunizados com células 3T3 que superexpressam CLDN6 de comprimento total usando um plasmídeo compreendendo um vetor de expressão myc-DDK de CLDN6 humana.
[00215] Os esplenócitos foram coletados dos camundongos imunizados e fundidos com linhagens de mieloma por Eletrofusão de BTX (BTX, Holliston, MA) para gerar hidridomas. 7680 culturas de hibridoma primárias foram geradas e cultivadas em placas de 384 poços. A capacidade dos anticorpos para se ligarem a peptídeo foi avaliada por arranjo de microesfera usando microesferas que expressam os três alvos de peptídeos diferentes. 1920 anticorpos positivos potenciais foram redispostos em placas de 96 poços adicionalmente examinadas por citometria de fluxo contra modelos de linhagem celular endógenos e artificiais.
[00216] Os sobrenadantes de hibridoma positivo foram, então, contraexaminados por citometria de fluxo contra modelos endógenos e artificiais de proteínas que têm similaridade de sequência com a região alvo (por exemplo, outras proteínas CLDN). A partir do exame secundário e contraexame, ~20 anticorpos específicos de CLDN6 foram escolhidos para estudo adicional. Estes anticorpos foram subclonados e as sequências de cadeias pesada e leve variáveis foram determinadas. Consultar a Tabela B e listagem de sequências.
[00217] Os anticorpos de CLDN6 foram formatados como anticorpos de IgG de comprimento total usando expressão de ExpiCHO™. As regiões variáveis de cadeias pesada e leve dos anticorpos foram clonadas num vetor de expressão de anticorpo que foi geneticamente modificado no laboratório com base num vetor pcDNA™3.4-TOPO® (Número de Catálogo: A14697, ThermoFisher Scientific, EUA) e transfectadas em células CHO por (De acordo com o protocolo fornecido no kit (Sistema de Expressão ExpiCHO™, Número de Catálogo: A29133, ThermoFisher Scientific, EUA)). Os anticorpos foram purificados e a ligação de superfície celular dos anticorpos à CLDN6 e a IC50 de anticorpo foram determinadas por FACS em que os anticorpos de CLDN6 foram diretamente conjugados com Éster de NHS Alexa Fluor® 647 (Éster Succinimidílico), no de cat A20106 (ThermoFisher Scientific) seguindo o protocolo do fabricante. Os anticorpos de CLDN6 foram testados de 0,32 nM a 1000 nM (diluição serial 1:5, 6 pontos) num volume de 50 µl com sistema de 150000 células.
[00218] As células que expressam CLDN6 foram usadas em ensaios de FACS para determinar a capacidade do anticorpo de CLDN6 para se ligar à CLDN6 na superfície de células e para reagir cruzadamente com outros membros de família de CLDN. As células T HEK293 geneticamente modificadas para expressar CLDN6 humana fundida à GFP, CLDN6 de camundongo fundida à GFP, CLDN9-GFP, CLDN4- GFP ou CLDN3-GFP ou GFP sozinha (sem CLDN6) foram usadas como modelos artificiais de expressão de CLDN6. As células ARK2, OVCA429, LS513 e MCF7 foram usadas como modelos endógenos de expressão de CLDN6, assim como modelos para expressão de CLDN3/4.
[00219] Para cada tipo de célula testado e para cada mAb, as células foram destacadas da superfície dos frascos de cultura por EDTA (em vez de tripsina) para proteger as proteínas de superfície celular. As células destacadas foram, então, incubadas com mAbs de CLDN6 identificados com Alexa Fluor® por 30 min no escuro em gelo a uma concentração predeterminada. Os mAbs de CLDN6 foram diretamente identificados com Éster de NHS Alexa Fluor® 647 (Éster Succinimidílico). Após a lavagem, as células foram lidas por um C6 de Citometria de Fluxo BD Accuri™ para detectar ligação de proteína de antígeno-anticorpo no canal FL4H. Cada anticorpo foi testado em concentrações variadas para estabelecer uma curva de fluorescência de dose. A EC50/IC50 dos anticorpos (a concentração do anticorpo em que a metade do valor máximo foi calculado com base nos valores de FL4H (chaveado em células de singleto viáveis) usando o Kit de ferramentas de IC50 Muito Simples (Very Simple IC50 Tool kit) disponível online, que permite que dados de resposta à dose biológica sejam plotados e preenchidos nos tipos de curva para fornecer a EC50/IC50. O valor máximo foi a concentração mais baixa do anticorpo em que a fluorescência atinge um máximo. Os anticorpos foram também examinados quanto à sua capacidade de reagir de modo cruzado com outras proteínas CLDN como CLDN9, CLDN3 e CLDN4. Estes valores foram usados para determinar a afinidade relativa de cada anticorpo dentre o conjunto de anticorpos testados. Os dados de reação cruzada foram obtidos usando uma metodologia similar, porém, com células que têm um perfil de expressão diferente para CLDN6, CLDN3, CLDN4 e CLDN9.
[00220] Os dados de afinidade relativa e dados de reatividade cruzada, como determinado desta maneira, são apresentados nas Tabelas 4 e 5. TABELA 4. HEK293T- HEK293T- HEK293T HEK293T HEK293T HEK293T- Classi- CLDN6-mGFP CLDN6-mGFP CLDN9-mGFP CLDN4-mGFP CLDN3-mGFP mGFP N°de AB ficação CLDN6+ CLDN6+ artificial CLDN9+ CLDN4+ CLDN3+ Parental artificial (camundongo) artificial artificial artificial 1 1 109 72 2765 5000 5000 5000 2 2 182 5000 5000 5000 5000 5000 3 3 604 2487 5000 5000 5000 5000 4 4 17 5000 1860 739 5000 5000 5 5 10 11 25 5000 5000 5000 6 6 1427 2222 2769 26 5000 5000 7 7 579 1548 1938 2088 5000 5000 8 8 1918 5000 2769 5000 5000 5000 9 9 2671 5000 5000 5000 5000 5000 10 10 2757 5000 246 5000 5000 5000 11 11 1696,29 2375 5000 2238 5000 5000 12 Neg 5000 5000 2468 2087 5000 5000 13 Neg 5000 5000 5000 5000 5000 5000 14 Neg 5000 5000 5000 5000 5000 5000 16 Neg 5000 5000 5000 5000 5000 5000 17 Neg 2645,95 5000 5000 5000 5000 5000 18 Neg 5000 5000 5000 5000 5000 5000 15 Neg 5000 5000 5000 5000 5000 5000 19 Neg 5000 5000 5000 5000 5000 5000 Ab2 de referência 0 122 46 5000 5000 5000 5000 Ab1 de referência 0 57 651 2943 5000 5000 5000 N° de AB corresponde ao n° de AB listado nas Tabelas A e B.
TABELA 5
N° de AB ARK2 OVCA429 LS513 MCF7
CLDN6+ endógena CLDN6+ endógena CLDN3/4+ CLDN3/4+ endógena endógena
1 105 84 5000 5000
2 1365 912 5000 5000
3 1653 1096 5000 5000
4 48 168 730 653
5 8 5 781 1485
6 765 394 133 1135
7 353 531 635 979
8 1136 1090 1126 1063
9 1140 1165 1040 5000
10 2143 2473 1947 5000
11 362,81 834,65 492,567 427,031
12 1297 2294 2266 5000
13 1147 2287 1594 5000
14 1304 1661 1161 546
16 5000 5000 5000 5000
17 5000 5000 5000 5000
18 1354,80 2435,18 5000 5000
15 5000 5000 5000 5000
19 5000 5000 5000 5000
Ab2 de referência 1115 1283 2222 5000
Ab1 de referência 162 62 5000 5000
N° de AB corresponde ao n°de AB listado nas Tabelas A e B.
EXEMPLO 6
[00221] Este exemplo demonstra a caracterização de mAbs de IgG de camundongo quiméricos.
[00222] Os ensaios de proliferação em 3D de ágar macio e ensaios de ligação de xenoenxerto foram executados para caracterizar adicionalmente mAbs descritos no Exemplo 5. Brevemente, uma mistura de camada superior de 250 µL contendo 10000 células em 0,6% de SeaPlaque agarose em meio de 1x RPMI foi disposta em placas no topo de uma camada de fundo de 250 uL solidificada de 0,6% de SeaPlaque agarose em meio de 1x RPMI para cada poço de uma placa de 48 poços. Uma camada alimentadora líquida de 250 uL contendo meio de 1x RPMI foi colocada acima da camada de topo solidificada. Todas as três camadas do ensaio de ágar macio foram preparadas com ou sem Trastuzumab, mAbs de Cldn6 ou controle de IgG2a de camundongo iniciando em 150 ng/mL (1uM) e terminando em 1,5 ng/mL, diluição 1:10. Cada condição de teste foi realizada em duplicatas. As células puderam formar colônias por 3 semanas antes do manchamento com 0,05% de vermelho natural, e foram submetidas à imaginologia no microscópio de luz invertida EVOS XL. As linhagens celulares com uma diminuição de ≥ 20% no número de colônia em tratadas versus controle foram consideradas sensíveis.
[00223] Como mostrado na Tabela 6, muitas das linhagens celulares exibiram uma diminuição no número de colônia quando tratadas com o anticorpo indicado.
TABELA 6 Atividade 3D in vitro
Ab1 de referência** 70%
Ab2 de referência** 50%
AB1 50%
AB2 50%
AB3 50%
AB4 70%
AB5 70%
AB6 70%
AB7 50%
AB8 0%
AB9 0%
AB10 50%
AB11 50%
AB12 0%
AB13 50%
AB14 0%
AB19 50%
AB16 25%
AB17 0%
AB18 0%
AB19 0%
[00224] Os estudos de ligação in vivo foram executados em camundongos de xenoenxerto injetados com linhagens celulares de câncer humanas.
Brevemente, os modelos de xenoenxerto de linhagens celulares de câncer humanas foram estabelecidos em camundongos nude atímicos CD-1 com seis semanas de idade (Charles River Laboratories). As seguintes condições foram seguidas para a injeção subcutânea de cada linhagem celular: ARK2 0,75 × 107, UMUC4 1,0 × 107, OV90 1,0 × 107 e M202 0,5 × 107 células, todas com 50% de matrigel (BD Biosciences). Números suficientes de camundongos foram injetados para alcançar 8 camundongos por braço de tratamento.
Quando os tumores alcançaram um tamanho médio de 150 a 300 mm3, os camundongos foram randomizados em grupos de tratamento.
Para o tratamento, cada anticorpo terapêutico (AB3, AB2, Ab1 de Referência, Ab2 de Referência, Ab3 de Referência (trastuzumab) e controle de IgG2 não alvejante foram diluídos em solução salina estéril a uma concentração funcional de 1 mg/ml para injeção na veia caudal intravenosa (IV). Para o estudo de M202, o trametinib (solvato de DMSO, MedChem Express) foi dosado a 1,0 mg/kg (10% de Cremaphor, 10% de PEG400) por PO num agendamento de 5 dias ligado, 2 dias desligado para o primeiro ciclo semanal, seguido pela redução a 0,5 mg/kg pelas duas semanas restantes de dosagem.
Os xenoenxertos tumorais foram medidos com calibradores três vezes por semana, e o volume de tumor em mm3 foi determinado multiplicando-se altura × largura × comprimento.
Os camundongos foram tratados por duas a 7 semanas.
Ao final do estudo, os animais foram submetidos à eutanásia e o tecido tumoral foi excisado e dividido para ser armazenado como tecido de congelamento instantâneo ou embutido com parafina fixa por formalina (FFPE) para a análise de biomarcador.
Todo trabalho animal foi executado sob um protocolo aprovado por IACUC e na Universidade da Califórnia (University of California) no
Comitê de Pesquisa Animal de Los Angeles (Los Angeles Animal Research Committee). Os dados foram analisados usando o software StudiLog de StudiDirector (San Francisco, CA). Os resultados são apresentados como volumes médios para cada grupo. As barras de erro representam o erro padrão (SE) da média.
[00225] Os resultados dos ensaios de xenoenxerto são mostrados nas Figuras 6 a 10. Como mostrado nas Figuras 6A e 6B, cada um dentre AB2 e AB3 causou uma alteração média substancial no volume de tumor no Dia 14, em relação ao anticorpo de IgG2 de controle, em camundongos portando tumores endometriais. Como mostrado nas Figuras 7A e 7B, AB3 causou uma alteração média substancial no volume de tumor no Dia 35, em relação ao anticorpo de IgG2 de controle, em camundongos portando tumores de bexiga. As Figuras 8A e 8B mostram que cada um dentre AB2 e AB3 causou uma alteração média substancial no volume de tumor no Dia 20, em relação ao anticorpo de IgG2 de controle, em camundongos portando tumores de ovário. As Figuras 9A e 9B demonstram que AB3 funciona de uma maneira específica de CLDN, visto que o modelo usado nas Figuras 9A e 9B não expressou nenhum dentre CLDN6, CLDN3, CLDN4 e CLDN9 e foi, portanto, usado como um controle negativo. Os dados das Figuras 9A e 9B também sugerem que AB3 tem menos atividade fora do alvo que Ab1 de Referência e Ab2 de Referência. A Figura 10A resume os resultados das Figuras 6 a 9. Como mostrado na Figura 10A, AB3 reduziu significativamente o crescimento de tumor em camundongos portando tumores endometrial, de bexiga e de ovário, cada um dos quais expressa CLDN6, porém, não reduziu o crescimento de tumor em camundongos portando tumores de melanoma, que não expressaram CLDN6 (Figura 10B). Como mostrado na Figura 11, a cadeia média no peso corporal de camundongo durante o tratamento não foi alterada substancialmente, sugerindo a segurança do tratamento.
[00226] Um segundo conjunto de experimentos foi executado em modelos de xenoenxerto de uma linhagem celular de câncer ovariano humano, OV90. Os camundongos foram injetados com um dentre 10 mAbs descritos no Exemplo 5 ou com um anticorpo de controle (anticorpo de IgG2a de camundongo, ab de CLDN6 de referência) ou com um controle de veículo de PBS. Há 8 camundongos por grupo e cada animal foi injetado intravenosamente com 10 mg/kg de anticorpo a cada 4 dias. Como mostrado nas Figuras 12A e 12B, vários anticorpos descritos no Exemplo 5 reduziram o volume de tumor em camundongos portando tumores de ovário. Dentre os melhores desempenhos, estavam AB3, AB4, AB7 e AB10, embora todos os anticorpos testados tenham reduzido o volume de tumor em relação ao controle de veículo. Como mostrado na Figura 13, o peso corporal dos animais tratados com AB3, AB4, AB7 ou AB10 não foi significativamente alterado, sugerindo sua segurança. EXEMPLO 7
[00227] Este exemplo demonstra a caracterização adicional de mAbs de IgG de camundongo quiméricos.
[00228] Ensaios de quantificação de internalização foram executados. Brevemente, o estudo de internalização de proteína CLDN6 desencadeado por ligação de Ab1 de Referência, AB3 ou AB4 foi realizado com um controle positivo, Receptor de Transferina expresso de modo ubíquo (TfR) que é um receptor de superfície celular conhecido que é internalizado após a ligação de anticorpo.
[00229] TfR e anticorpos de CLDN6 foram identificados com Texas Red™-X, Éster Succinimidílico, isômeros misturados, no de cat T6134 (ThermoFisher Scientific). As células foram semeadas numa câmara de 8 poços µ-Slide (no de cat 80826, ibidi Cells In Focus Inc.) um dia antes do tratamento de anticorpo para permitir que as células se fixem e cresçam. As células foram incubadas com anticorpos identificados por
30 min no escuro em gelo. Então, a câmara contendo CLDN6 ou células identificadas com TfR foram lidas por microscópio de fluorescência de Echo lab para coletar imagens antes da internalização. A câmara foi, então, incubada a 37 °C por 40 min para permitir o processo de internalização e imagens foram coletadas novamente pelo microscópio de fluorescência de Echo lab. AB3 e AB4 causaram um grau maior de internalização de CLDN6 em comparação com aquela causada por Ab1 de Referência (dados não mostrados). EXEMPLO 8
[00230] Este exemplo demonstra a caracterização adicional de mAbs de IgG de camundongo quiméricos.
[00231] Os ensaios de proliferação bidimensional (2D) foram executados com anticorpos seletos descritos no Exemplo 5 conforme a seguir: As células foram semeadas em duplicata a 5000 a 20000 células por poço numa placa de 24 poços. No dia seguinte, as células foram tratadas com seis diluições de 1 para 5 de mAb (iniciando a 100 nM de Trastuzumab, mAbs de Cldn6 ou controle de IgG2A de camundongo) e uma concentração fixa de 1 ng/µL anticamundongo secundário conjugado a Monometil auristatina E (MMAE) (Moradec, LLC) para gerar curvas de resposta à dose. Os poços não tratados das células foram quantificados no Dia 1, o dia de tratamento de anticorpo, e posteriormente, no Dia 6, para determinar a faixa de crescimento celular. Os poços tratados com mAbs foram quantificados no Dia 6 e um crescimento em cada condição de tratamento foi determinado como uma razão de porcentagem normalizada contra o crescimento de células não tratadas. A quantificação foi realizada no Contador de Partículas Z1 (Beckman Coulter, Inc).
[00232] Os resultados são mostrados na Figura 14. AB2, AB3, AB4 e AB5 demonstraram a maior eficácia em inibir a proliferação. A IC50 para cada um destes anticorpos foi entre 0,1 nM e 1 nM. Cada um dentre
AB7, AB10, AB11 e AB15 também demonstrou a capacidade para inibir a proliferação neste ensaio, embora a uma menor extensão que AB2, AB3, AB4 e AB5. EXEMPLO 9
[00233] Este exemplo demonstra a humanização de anticorpos das presentes divulgações.
[00234] Um subconjunto de anticorpos listados na Tabela A foi selecionado para análise de humanização. As sequências variáveis de cadeia pesada (VH) e variáveis de cadeia leve (VL) de anticorpos AB1, AB3, AB4, AB9, AB11 e AB18 foram comparadas com uma biblioteca de sequências de linha germinativa humana conhecidas de genes de VH humanos e genes kapa VL humanos (IMGT ® as informações internacionais de ImMunoGeneTics system® www.imgt.org; fundador e diretor: Marie-Paule Lefranc, Montpellier, França); os bancos de dados usados foram genes de VH humanos de IMGT (F+ORF, 273 sequências de linha germinativa) e genes kapa VL humanos de IMGT (F+ORF, 74 sequências de linha germinativa). A linha germinativa humana aceitante foi escolhida a partir daquelas mais próximas, na sequência, a um anticorpo parental.
[00235] A Tabela 7 fornece, para cada VH e VL de cada anticorpo, informações sobre as sequências de linha germinativa humanas escolhidas como a sequência aceitante e a região de junção de cadeia pesada humana (gene J) escolhida. A região de junção (gene J) foi escolhida a partir das sequências de região de junção humanas compiladas em IMGT® o informações internacionais ImMunoGeneTics system® www.imgt.org (fundador e diretor: Marie-Paule Lefranc, Montpellier, França).
TABELA 7 Linha germinativa HC humana Linha germinativa LC humana de HC humana LC humana região de junção região de junção (gene J) (gene J) AB1 IGHV1-46(alelo 1) IGHJ4(alelo 1) IGLV1-39(alelo 1) IGKJ2(alelo 1) AB3 IGHV3-23(alelo 1) IGHJ4(alelo 1) IGLV1-39(alelo 1) IGKJ2(alelo 1) AB4 IGHV1-46(alelo 1) IGHJ4(alelo 1) IGLV2-30(alelo 1) IGKJ2(alelo 1) AB9 IGHV1-46(alelo 1) IGHJ4(alelo 1) IGLV1-39(alelo 1) IGKJ2(alelo 1) AB11 IGHV3-48(alelo 1) IGHJ4(alelo 1) IGLV4-1(alelo 1) IGKJ2(alelo 1) AB18 IGHV1-46(alelo 1) IGHJ4(alelo 1) IGLV4-1(alelo 1) IGKJ2(alelo 1)
[00236] CDRs foram definidas de acordo com a definição de AbM (consultar o sítio da web de Dr. Andrew C. R. Martin www.bioinf.org.uk/abs/ para uma tabela que compara definições de CDR).
[00237] Alteração de posições de framework de linha germinativa humana (isto é, resíduos não CDR em VH e VL) para sequência murina parental correspondente pode ser necessária para otimizar a ligação do anticorpo humanizado. As sequências para versões de anticorpos humanizados são fornecidas como SEQ ID NOs: 376 a 421.
[00238] Para AB1, cada um dentre Asn52 (numeração sequencial) de CDR2 do HC e Asn54 de CDR2 na LC foi determinado como tendo um baixo potencial para desamidação com base na sequência e conformação.
[00239] Para AB3, cada um de Asn31 (numeração sequencial) de CDR1 da HC, Asn57 de CDR2 do HC, Asn 28 de CDR1 de LC e Asn50 de CDR2 da LC foi determinado como tendo um baixo potencial para desamidação com base na sequência e conformação. Trp33 de CDR1 da HC foi determinado como propenso à exposição ao solvente e a ter potencial para oxidação, especialmente sob condições de estresse. Em CDR3 da HC, foi determinado que há um Cys106 livre na CDR que pode ser problemático ao produzir o anticorpo, visto que é propenso à exposição ao solvente. Este resíduo de Cys foi recomendado para alteração para Tyr, Ser ou Ala. A manutenção de ligação destes anticorpos alterados é testada. Ile53 de CDR2 da LC foi determinado como sendo exposto ao solvente e pode levar à ligação não específica. Foi sugerido que este resíduo de Ile seja alterado para Ser. A manutenção de ligação deste anticorpo alterado é testada.
[00240] Para AB4, cada um dentre Asn52 (numeração sequencial) da CDR2 de HC e Asn58 de CDR2 da LC foi determinado como tendo um baixo potencial para desamidação com base em sequência e conformação. A sequência DGNT na CDR1 da LC foi determinada como problemática, visto que foi determinado que tem um alto potencial para formação de isoaspartato (na sequência DG), assim como um potencial para desamidação (na sequência NT). Esta sequência foi recomendada para alteração.
[00241] Para AB9, Asn33 (numeração sequencial) em CDR1 de HC e Asn52 e Asn59 em CDR2 de HC foram determinados como tendo um baixo potencial para desamidação com base em sequência e conformação. Asn54 foi determinado como tendo um potencial médio para desamidação com base na sequência e conformação. A sequência de NGG em CDR2 da HC foi determinada como tendo um potencial alto/médio para desamidação seguida por formação de isoaspartato. Portanto, foi recomendado que esta sequência de aminoácidos seja alterada. Um Cys106 livre em CDR3 da HC pode ser problemático ao produzir o anticorpo, visto que é determinado como propenso à exposição ao solvente. Este resíduo de Cys é sugerido para alteração para Tyr, Ser ou Ala. A manutenção de ligação destes anticorpos alterados é testada. Arg28 em CDR1 de HC não é frequentemente encontrado em anticorpos humanos. Este resíduo é alterado para Thr e a manutenção de ligação testada. Para AB 9, Trp32 (numeração sequencial) em CDR1 da LC foi determinado como propenso à exposição ao solvente e pode ser submetido à oxidação, especialmente sob condições de estresse. Leu24 da mesma CDR não é frequentemente encontrado em anticorpos humanos. Este resíduo é alterado para Arg e a manutenção de ligação é testada.
[00242] Para AB11, Asp54-Ser55 (numeração sequencial) em CDR2 da HC foi determinada como tendo um baixo potencial para formação de isoaspartato. Asn57 em CDR2 da LC foi determinado como tendo um baixo potencial para desamidação com base em sequência e conformação.
[00243] Para AB18, Asn33 e Asn50 de CDR-H2 (numeração sequencial) em CDR1 da HC foi determinado como tendo um baixo potencial para desamidação com base em sequência e conformação. Em CDR2 da HC, a sequência de Asp-Pro (DP) foi determinada como tendo um potencial para ser submetido à fragmentação sob condições ácidas. No domínio de VL, Asn34 e Asn37 no CDR1 da LC foi determinado como tendo um baixo potencial para desamidação com base em sequência e conformação. Em CDR3 da LC, Trp56 foi determinado como propenso à exposição ao solvente e pode ser submetido à oxidação, especialmente sob condições de estresse.
[00244] A Tabela 8 mostra um esquema para combinar a VH e VL humanizadas. Se nenhuma das versões humanizadas for equivalente ao mAb quimérico. Os pares preferidos são mostrados em texto sublinhado em negrito.
TABELA 8
Parental N° de Ab humanizado VH(SEQ ID Nº:) VL(SEQ ID Nº:)
AB1 AB1-1 376 380
AB1-2 377 380
AB1-3 377 381
AB1-4 377 382
AB1-5 377 383
AB1-6 378 381
AB3 AB3-1 384 h21G5-L1 (opcional)
AB3-2 385 388
AB3-3 385 389
AB3-4 386 388
AB3-5 386 389
AB3-6 387 388
AB3-7 387 389
AB4 AB4-1 391 397
AB4-2 392 397
AB4-3 392 398
AB4-4 393 398
AB4-5 394 398
AB4-6 395 398
AB4-7 396 398
AB9 AB9-1 403 409
Parental N° de Ab humanizado VH(SEQ ID Nº:) VL(SEQ ID Nº:) AB9-2 404 409 AB9-3 405 410 AB9-4 405 411 AB9-5 406 410 AB9-6 406 411 AB9-7 407 410 AB9-8 407 411 AB9-9 408 410 AB9-10 408 411 AB11 AB11-1 412 414 AB11-2 413 414 AB11-3 413 415 AB18 AB18-1 416 420 AB18-2 417 420 AB18-3 417 420 AB18-4 417 421 AB18-5 418 420 AB18-6 418 421 AB18-7 419 420
[00245] Os anticorpos humanizados descritos na Tabela 8 foram construídos e expressos como essencialmente descrito no Exemplo 5. Os ensaios de FACS foram executados como essencialmente descrito no Exemplo 5 para determinar forças de ligação de antígeno relativas dos anticorpos humanizados.
Duas doses (1,5 µg ou 0,3 µg) dos anticorpos humanizados foram testados para ligação à CLDN6 humana ou CLDN6 murina, proteínas as quais foram expressas por clones de 293T geneticamente modificados.
Os resultados dos ensaios são fornecidos na Tabela 9. TABELA 9
Designação de Ab CLDN6 humana CLDN6 humana CLDN6 de humanizado (1,5 µg de Ab) (0,3 µg de Ab) camundongo
2o Ab apenas 768,07 768,07 1061,72
64A-chim 224297,77 124463,44 170906,13 h64A 233932,53 93415,06 188577,77
SC27-108-chim 320381,33 150854,98 284326,77
AB1-Chim 364416,49 311923,02 513665,18
AB1-3 142182,2 141773,57 89292,21
AB1-4 197142,08 101763,71 75860,6
AB1-5 213233,57 137828,05 128498,45
AB1-6 227152,34 119699,97 77561,34
AB1-7 207009,91 79207,94 99740,72
AB1-8 209971,67 98785,97 121717,49
AB1-11 112923,25 64892,04 101386,62
AB3-chim 459373,03 267327,83 67927,47
AB3-2 395813,97 309318,89 31741,02
AB3-3 339510,79 250519,45 23038,44
AB3-4 55845,14 11641,7 1521,79
AB3-5 48550,83 13335,93 783,28
AB3-7 169209,42 105881,93 56071,82
Designação de Ab CLDN6 humana CLDN6 humana CLDN6 de humanizado (1,5 µg de Ab) (0,3 µg de Ab) camundongo
AB3-8 151519,51 108419,64 21509,63
AB4-chim 326603,58 176289,63 3639,29
AB4-3 47760,08 14309,78 671,08
AB4-4 48975,26 14081,47 741,03
AB4-5 43385,34 16765,44 2003,95
AB4-6 29243,78 10841,68 14205,6
AB4-7 33342,17 19215,28 6635,91
AB4-8 77642,77 49310,15 4703,98
AB4-9 56854,11 37231,13 1778,41
AB4-10 77159,9 50809,2 2647,29
AB4-11 61204,92 37798,69 1227,86
AB4-12 86189,87 71121,12 1133,16
AB18-chim 135142,76 73775,39 57373,94
AB18-3 58948,59 30357,27 2512,77
AB18-4 54378,24 32424,7 4294,94
AB18-5 51871,17 29448,66 8191,13
AB18-6 58464,54 26883,47 3680,42
AB9-chim 72036,29 46694,71 6745,58
AB9-3 24649,43 9504,6 3175,17
AB9-4 34309,83 15331,51 1709,25
AB11-chim 3491,4 1671,35 5490,52
AB11-2 2557,3 1289,17 7160,15
AB11-3 2364,44 1009,7 5521,52
[00246] Os ensaios de FACS também forma executados para determinar forças de ligação de antígeno relativas dos anticorpos humanizados (1,5 µg ou 0,3 µg) para ligação a CLDN6 como expresso pelas linhagens celulares de câncer indicadas.
Os resultados dos ensaios são fornecidos na Tabela 10. 2o Ab apenas foi usado como um controle negativo. 64A-chim, h64A, e SC27-108-chim foram usados como anticorpos de referência, Anticorpos Parentais Correspondentes (anticorpos antes da humanização) foram usados como controles e designados com "chim". TABELA 10
Designação de OVCA429 ARK2 ARK2 M202 M202 Ab humanizado 1,5 µg 1,5 µg 0,3 µg 1,5 µg 0,3 µg
2o Ab apenas 885,77 1351,21 1351,21 638,83 638,83
64A-chim 140378,55 80449,93 66518,52 1456,2 628,72 h64A 161168,87 69118,48 90346,66 3093,69 2467,63
SC27-108-chim 54987,78 25522,86 62410,85 2293,1 742,74
AB1-Chim 176836,16 51913,52 58762,01 23377,33 9426,64
AB1-3 27535,69 10776,6 2829,25 1225,78 694,08
AB1-4 34551,99 10039,46 3641,11 970,7 697,98
AB1-5 54331,07 22353,67 7494,86 869,06 684,3
AB1-6 29949,91 7743,19 2816,15 880,4 1423,53
AB1-7 44711,89 11224,28 4443,54 876,24 611,15
AB1-8 65974,83 17642,9 5805,35 583,54 1886,84
AB1-11 não testado 97659,62 53926,71 5079,26 978,76
AB3-chim 138190,1 29114,68 17055,33 1120,39 843,5
AB3-2 85941,69 33618,84 14656,49 1483,17 727,98
AB3-3 88679,61 54901,39 1156,25 801,56 749,95
AB3-4 2955,8 1459,46 1315,36 839,75 563,41
AB3-5 2951,18 2909,74 1275,51 713,46 611,66
Designação de OVCA429 ARK2 ARK2 M202 M202 Ab humanizado 1,5 µg 1,5 µg 0,3 µg 1,5 µg 0,3 µg
AB3-7 não testado 90420,04 35995,73 7841 1742,34
AB3-8 não testado 23259,52 11856,48 1903,05 952,71
AB4-chim 64796,15 38447,83 19142,38 1343,31 1007,71
AB4-3 1155,95 1522,98 1192,96 708,25 984,95
AB4-4 1203,16 1398,82 1048,05 899,25 618,43
AB4-5 1351,27 1198,66 966,62 1203,98 653,41
AB4-6 não testado 9842,52 3303,34 2520,88 1281,68
AB4-7 não testado 7563,59 2765,93 3322,65 1444,19
AB4-8 não testado 7313,46 3118,74 1495,74 974,83
AB4-9 não testado 7787,35 3058,96 1179,5 825,33
AB4-10 não testado 20227,28 7212,1 1392,45 546,63
AB4-11 não testado 9167,61 6392,04 895,77 549,19
AB4-12 não testado 24221,65 9690,02 2015,4 1506,93
AB18-chim 25521,37 9149,19 3442,7 1048,6 895,4
AB18-3 2703,41 1210,4 1079,32 684,33 592,8
AB18-4 3220,08 1379,11 1134,22 1231,31 762,51
AB18-5 4273,83 1330,44 1313,83 1001,99 594,43
AB18-6 6753,92 1936,48 1393,53 914,2 865,43
AB9-chim 3569,69 4487,55 3508,75 1331,44 680,03
AB9-3 1257,3 1471,97 1139,54 1659,76 1111,31
AB9-4 1110,93 1553,6 1116,78 1149,55 625,38
AB11-chim 2440,63 1260,97 1315,28 973,48 610,05
AB11-2 2694,81 1937,51 1400,43 1766,07 872,68
AB11-3 2201,32 1541,47 1320,38 1134,3 940,92
"chim" é a forma pré-humanizada de anticorpo.
[00247] Com base nos dados de ligação de antígeno in vitro, três anticorpos humanizados foram selecionados para testes e desenvolvimento adicionais. Os anticorpos foram derivados de AB1, AB3 e AB4.
[00248] Os estudos de ligação in vivo das versões humanizadas de AB1, AB3 e AB4 foram executados em camundongos de xenoenxerto injetados com linhagens celulares de câncer de bexiga UMUC4, como essencialmente descrito no Exemplo 6. Brevemente, os modelos de xenoenxerto de UMUC4 foram estabelecidos em camundongos nude atímicos CD-1 com seis semanas de idade (Charles River Laboratories). Após os tumores alcançarem um tamanho médio de 150 a 300 mm3, os camundongos foram randomizados em grupos de tratamento. Os anticorpos humanizados foram diluídos em solução salina estéril a uma concentração funcional de 1 mg/ml para injeção de veia caudal intravenosa (IV). Os xenoenxertos tumorais foram medidos com calibradores três vezes por semana, e o volume de tumor em mm3 foi determinado multiplicando-se altura × largura × comprimento. Os camundongos foram tratados por 2 a 7 semanas. Ao final do estudo, os animais foram submetidos à eutanásia e o tecido tumoral foi excisado e dividido para ser armazenado como tecido de congelamento instantâneo ou embutido com parafina fixa por formalina (FFPE) para a análise de biomarcador.
[00249] Os resultados dos ensaios de xenoenxerto são mostrados nas Figuras 15 a 21. A Figura 15 mostra os resultados de ensaio de xenoenxerto para duas versões de AB3 humanizado (AB3-2 e AB3-4), em que o tratamento envolveu 10 mg/kg administrado Q4D. Os controles incluíram controle de veículo (PBS), IgG humana (10 mg/kg Q4D) e a versão murina de AB3 (10 mg/kg Q4D). Como mostrado nesta Figura, AB3-4 humanizado demonstrou uma diminuição no volume de tumor ao longo do período de tratamento de 35 dias. A Figura 16 mostra os resultados de ensaio de xenoenxerto para os mesmos tratamentos que os experimentos mostrados na Figura 15, exceto pelo fato de que dois controles adicionais (64A MSE e uma versão quimérica do mesmo (64A-CHIM)) foram executados. Como na Figura 15, a Figura 16 mostra uma diminuição marcada no volume de tumor mediante o tratamento com AB3-4 humanizado.
[00250] A Figura 17 mostra os resultados de ensaio de xenoenxerto para AB1-5 humanizado. Os controles incluíram controle de veículo (PBS), IgG humana (10 mg/kg Q4D) e a versão murina de AB1 (10 mg/kg Q4D). Como mostrado na Figura 17, os camundongos tratados com AB1-5 humanizado demonstraram uma diminuição marcada no volume de tumor.
[00251] A Figura 18 mostra os resultados de ensaio de xenoenxerto para AB4-3 humanizado. Os controles incluíram controle de veículo (PBS), IgG humana (10 mg/kg Q4D) e a versão murina de AB4 (10 mg/kg Q4D). Os camundongos tratados com AB4-3 humanizada não demonstraram uma diminuição marcada no volume de tumor.
[00252] As Figuras 19 a 21 demonstram os resultados de um ensaio de xenoenxerto em que todos os 4 anticorpos humanizados das Figuras 15 a 18 foram testados. As versões de camundongo e quimérica de anticorpos de referência de CLDN6 foram usadas como controles. Como mostrado na Figura 19, os camundongos tratados com AB3-4 humanizado e AB1-5 demonstraram diminuições no volume de tumor. A Figura 20 demonstra o volume de tumor ao longo curso de tempo ao Dia 55. Os pesos de corpo de camundongos no ensaio são mostrados na Figura 21. EXEMPLO 10
[00253] Uma análise in silico foi executada com sequências diferentes de AB1, AB3 e AB4. Em particular, as sequências para (a) o clone parental original, (b) a sequência de linha germinativa de camundongo mais próxima, (c) a sequência de linha germinativa humana mais próxima e (d) a sequência humanizada, para cada anticorpo, foram alinhadas. Os aminoácidos que se acreditam que tenham sido submetidos à maturação de afinidade são marcados com um asterisco enquanto os aminoácidos que diferem de aminoácidos em tal posição de acordo com informações de banco de dados de anticorpos são marcados com um símbolo de "jogo-da-velha". CDRs para cada sequência são dispostos em caixa. Com base nesta análise, vários anticorpos humanizados serão produzidos tendo uma sequência listada na TABELA 10. TABELA 10 Clone Parental HC de Sequência de LC de Sequência de Consenso Consenso AB1 422 423 AB3 424 425 AB4 426 427
[00254] Múltiplos anticorpos tendo uma sequência como definido por estas sequências de consenso são produzidos como essencialmente descrito no Exemplo 5 e testados in vitro para ligação de antígeno por meio de FACS (como essencialmente descrito no Exemplo 5) e in vivo quanto à capacidade para diminuir o volume de tumor em camundongos (como essencialmente descrito no Exemplo 6).
[00255] Todas as referências, incluindo publicações, pedidos de patente e patentes mencionados no presente documento são aqui incorporados a título de referência à mesma extensão que se cada referência fosse individual e especificamente indicada como sendo incorporada a título de referência e fosse apresentada em sua totalidade no presente documento.
[00256] O uso dos termos "um/uma" e "um/uma" e "o/a" e referentes similares no contexto da descrição da descrição (especialmente no contexto das seguintes reivindicações) deve ser interpretado como cobrindo o singular e o plural, exceto onde indicado em contrário no presente documento ou evidentemente contrariado pelo contexto. Os termos "compreendendo", "tendo", "incluindo" e "contendo" devem ser interpretados como termos abertos (isto é, que significam "incluindo, mas sem limitações"), exceto se indicado de outro modo.
[00257] A menção de faixas de valores no presente documento é meramente destinada para servir como um método para fazer referência individualmente a cada valor separado abrangido pela faixa e cada ponto de extremidade, exceto se indicado de outro modo no presente documento, e cada valor separado e ponto de extremidade é incorporado no relatório descritivo como se fosse individualmente mencionado no presente documento.
[00258] Todos os métodos descritos no presente documento podem ser realizados em qualquer ordem adequada, exceto se indicado de outro modo no presente documento ou de claramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer um e todos os exemplos, ou linguagem diversa (por exemplo, "como") fornecida no presente documento, se destina meramente a mais bem iluminar a descrição e não apresenta uma limitação do escopo da descrição, exceto se reivindicado de outro modo. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada de modo a indicar qualquer elemento não reivindicado como essencial à prática da descrição.
[00259] As modalidades preferenciais desta descrição são descritas no presente documento, incluindo o melhor modo conhecido pelos inventores para executar a descrição. As variações destas modalidades preferenciais podem se tornar evidentes àqueles de habilidade comum na técnica mediante a leitura da descrição supracitada. Os inventores esperam que técnicos versados empreguem tais variações conforme for apropriado, e os inventores pretendem que a descrição seja praticada de outro modo além daqueles especificamente descritos no presente documento.
Consequentemente, esta descrição inclui todas as modificações e equivalentes da matéria mencionada nas reivindicações anexas ao presente documento conforme for permitido pela lei aplicável.
Ademais, qualquer combinação dos elementos descritos acima em todas as variações possíveis das mesmas é englobada pela descrição exceto se indicado de outro modo no presente documento ou claramente contradito pelo contexto.

Claims (58)

REIVINDICAÇÕES
1. Proteína de ligação a antígeno caracterizada pelo fato de que se liga a uma proteína Claudin6 (CLDN6) humana (SEQ ID Nº: 200), em que: a. a proteína de ligação a antígeno se liga à Alça Extracelular 2 (EL2) de um domínio extracelular (ECD) de CLDN6 e não se liga à Alça Extracelular 1 (EL1) do ECD de CLDN6; ou b. não se liga a qualquer um dentre Claudin3 (CLDN3), Claudin4 (CLDN4) e Claudin9 (CLDN9) e inibe a ligação de um anticorpo de referência a CLDN6 endogenamente expressado por células OVCA429 com menos que cerca de 1200 nM; ou c. uma combinação dos mesmos.
2. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que se liga a um epítopo dentro da sequência de aminoácidos de WTAHAIIRDFYNPLVAEAQKREL (SEQ ID Nº: 2).
3. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que se liga à sequência de aminoácidos de TAHAIIRDFYNPL (SEQ ID Nº: 3) ou LVAEAQKREL (SEQ ID Nº: 4) de CLDN 6.
4. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que não se liga a qualquer um ou mais dentre Claudin3 (CLDN3), Claudin4 (CLDN4) e Claudin9 (CLDN9).
5. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que não se liga a CLDN3.
6. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que se liga a CLDN6, CLDN4 e CLDN9.
7. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que não se liga a CLDN9.
8. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que se liga a CLDN6 e CLDN4.
9. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que não se liga a CLDN4.
10. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que se liga a CLDN6 e CLDN9.
11. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o anticorpo de referência compreende uma sequência variável de cadeia leve de SEQ ID Nº: 181 e uma sequência variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº: 182 ou uma sequência variável de cadeia leve de SEQ ID Nº: 185 e uma sequência variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº:
186.
12. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que compreende: a. uma sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia pesada apresentada na Tabela A ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 11, 17, 23, 29, 35, 41, 47, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125 e 131 ou uma sequência variante das mesmas que difere apenas por um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequência; b. uma sequência de aminoácidos de CDR2 de cadeia pesada apresentada na Tabela A ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 86, 102, 108, 114, 120, 126 e 132 ou uma sequência variante das mesmas que difere apenas por um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequência; c. uma sequência de aminoácidos de CDR3 de cadeia pesada apresentada na Tabela A ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 13, 19, 25, 31, 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127 e 133 ou uma sequência variante das mesmas que difere apenas por um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequência; d. uma sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia leve apresentada na Tabela A ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 8, 14, 20, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122 e 128 ou uma sequência variante das mesmas que difere apenas por um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequência; e. uma sequência de aminoácidos de CDR2 de cadeia leve apresentada na Tabela A ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123 e 129 ou uma sequência variante das mesmas que difere apenas por um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequência; f. uma sequência de aminoácidos de CDR3 de cadeia leve apresentada na Tabela A ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 10, 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124 e 130 ou uma sequência variante das mesmas que difere apenas por um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequência; g. uma combinação de quaisquer dois ou mais dentre (a) a (f).
13. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a sequência variante tem pelo menos cerca de 80% ou pelo menos ou cerca de 85% de identidade de sequência.
14. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a sequência variante tem pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência ou pelo menos ou cerca de 95% de identidade de sequência.
15. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia leve, uma sequência de aminoácidos de CDR2 de cadeia leve e uma sequência de aminoácidos de CDR3 de cadeia leve apresentada na Tabela A e 1 ou 2 das sequências de aminoácidos de CDR de cadeia pesada apresentadas na Tabela A.
16. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia pesada, uma sequência de aminoácidos de CDR2 de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de CDR3 de cadeia pesada apresentada na Tabela A e 1 ou 2 das sequências de aminoácidos de CDR de cadeia leve apresentadas na Tabela A.
17. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 16, caracterizada pelo fato de que compreende seis sequências de aminoácidos de CDR selecionadas a partir do grupo consistindo em: a. SEQ ID Nºs: 74 a 79; b. SEQ ID Nºs: 50 a 55; c. SEQ ID Nºs: 122 a 127; d. SEQ ID Nºs: 26 a 31; e. SEQ ID Nºs: 128 a 133; f. SEQ ID Nºs: 38 a 43;
g. SEQ ID Nºs: 62 a 67; h. SEQ ID Nºs: 80 a 85; i. SEQ ID Nºs: 44 a 49; j. SEQ ID Nºs: 86 a 91; k. SEQ ID Nºs:: 104 a 109; l. SEQ ID Nºs: 56 a 61; m. SEQ ID Nºs: 32 a 37; n. SEQ ID Nºs: 110 a 115; o. SEQ ID Nºs: 98 a 103; p. SEQ ID Nºs: 92 a 97; q. SEQ ID Nºs: 116 a 121; r. SEQ ID Nºs: 8 a 13; s. SEQ ID Nºs: 68 a 73; t. SEQ ID Nºs:: 14 a 19; e u. SEQ ID Nºs: 20 a 25.
18. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 19, caracterizada pelo fato de que compreende: a. uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada apresentada na Tabela B ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173 e 175 ou uma sequência variante das mesmas que difere apenas por um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequência; ou b. uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve apresentada na Tabela B ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174 e 176 ou uma sequência variante das mesmas que difere apenas por um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequência; ou c. tanto (a) quanto (b).
19. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a sequência variante tem pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 85% de identidade de sequência.
20. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que a sequência variante tem pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência.
21. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que compreende um par de sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo consistindo em: a. SEQ ID Nºs: 156 e 157; b. SEQ ID Nºs: 148 e 149; c. SEQ ID Nºs: 172 e 173; d. SEQ ID Nºs: 140 e 141; e. SEQ ID Nºs: 174 e 175; f. SEQ ID Nºs: 144 e 145; g. SEQ ID Nºs: 152 e 153; h. SEQ ID Nºs: 158 e 159; i. SEQ ID Nºs: 146 e 147; j. SEQ ID Nºs: 160 e 161; k. SEQ ID Nºs: 166 e 167; l. SEQ ID Nºs: 150 e 151; m. SEQ ID Nºs: 142 e 143; n. SEQ ID Nºs: 168 e 169; o. SEQ ID Nºs: 164 e 165;
p. SEQ ID Nºs: 162 e 163; q. SEQ ID Nºs: 170 e 171; r. SEQ ID Nºs: 134 e 135; s. SEQ ID Nºs: 154 e 155; t. SEQ ID Nºs: 136 e 137; e u. SEQ ID Nºs: 138 e 139.
22. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que é um anticorpo.
23. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que é um anticorpo monoclonal.
24. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizada pelo fato de que é uma IgG.
25. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que inibe pelo menos cerca de 50% de crescimento de colônia em ensaios de proliferação de 3D de ágar macio.
26. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que inibe crescimento de tumor em camundongos de xenoenxerto injetados com células de câncer humanas.
27. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que inibe crescimento de tumor de camundongos de xenoenxerto injetados com células de câncer ovariano, células de câncer de melanoma, células de câncer de bexiga ou células de câncer endometrial.
28. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que inibe pelo menos 50% de crescimento de tumor em camundongos de xenoenxerto injetados com células de câncer ovariano, células de câncer de bexiga ou células de câncer endometrial.
29. Proteína de ligação a antígeno caracterizada pelo fato de que compreende (a) uma sequência de aminoácidos de CDR1 de HC apresentada na Tabela A ou A1 ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 11, 17, 23, 29, 35, 41, 47, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 452, 455, 461, 465, e 472 ou uma sequência variante das mesmas que difere apenas por um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequência; (b) uma sequência de aminoácidos de CDR2 de HC apresentada na Tabela A ou A1 ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 86, 102, 108, 114, 120, 126, 132, 475, 456, 462, 466, 468, e 473; ou uma sequência variante das mesmas que difere apenas por um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequência; (c) uma sequência de aminoácidos de CDR3 de HC apresentada na Tabela A ou A1 ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 13, 19, 25, 31, 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 453, 457, 463, 467, 469, e 474; ou uma sequência variante das mesmas que difere por apenas um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequência; (d) uma sequência de aminoácidos de CDR1 de LC apresentada na Tabela A ou A1 ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 8, 14, 20, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 449, 476, 458, 464 e 470 ou uma sequência variante das mesmas que difere apenas por um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequência; (e) uma sequência de aminoácidos de CDR2 de LC apresentada na Tabela A ou A1 ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 9,
15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129, 450, 477, 459 e 471 ou uma sequência variante das mesmas que difere apenas por um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequência; (f) uma sequência de aminoácidos de CDR3 de LC apresentada na Tabela A ou A1 ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 10, 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130, 451, 454, e 460 ou uma sequência variante das mesmas que difere apenas por um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequência; ou (g) uma combinação de quaisquer dois ou mais dentre (a) a (f).
30. Proteína de ligação a antígeno caracterizada pelo fato de que compreende seis sequências de aminoácidos de CDR selecionadas a partir do grupo consistindo em: a. SEQ ID Nºs: 74 a 79; b. SEQ ID Nºs: 50 a 55; c. SEQ ID Nºs: 122 a 127; d. SEQ ID Nºs: 26 a 31; e. SEQ ID Nºs: 128 a 133; f. SEQ ID Nºs: 38 a 43; g. SEQ ID Nºs: 62 a 67; h. SEQ ID Nºs: 80 a 85; i. SEQ ID Nºs: 44 a 49; j. SEQ ID Nºs: 86 a 91; k. SEQ ID Nºs: 104 a 109; l. SEQ ID Nºs: 56 a 61; m. SEQ ID Nºs: 32 a 37; n. SEQ ID Nºs: 110 a 115; o. SEQ ID Nºs: 98 a 103; p. SEQ ID Nºs: 92 a 97;
q. SEQ ID Nºs: 116 a 121; r. SEQ ID Nºs: 8 a 13; s. SEQ ID Nºs: 68 a 73; t. SEQ ID Nºs: 14 a 19; u. SEQ ID Nºs: 20 a 25; v. SEQ ID Nºs: 449 a 453 e 475; w. SEQ ID Nºs: 476 a 477, 454 a 457; x. SEQ ID Nºs: 458 a 463; y. SEQ ID Nºs: 57, 58, 464 a 467; z. SEQ ID Nºs: 68 a 71 e 468 a 469; e aa. SEQ ID Nºs: 112 e 470 a 474.
31. Proteína de ligação a antígeno caracterizada pelo fato de que compreende: a. uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada apresentada na Tabela B ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173 e 175 ou uma sequência variante das mesmas que difere apenas por um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequência; ou b. uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve apresentada na Tabela B ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174 e 176 ou uma sequência variante das mesmas que difere apenas por um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequência; ou c. tanto (a) quanto (b).
32. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que a sequência variante tem pelo menos cerca de 85% de identidade de sequência ou cerca de 90% ou cerca de 95% de identidade de sequência.
33. Proteína de ligação a antígeno caracterizada pelo fato de que compreende um par de sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo consistindo em: a. SEQ ID Nºs: 156 e 157; b. SEQ ID Nºs: 148 e 149; c. SEQ ID Nºs: 172 e 173; d. SEQ ID Nºs: 140 e 141; e. SEQ ID Nºs: 174 e 175; f. SEQ ID Nºs: 144 e 145; g. SEQ ID Nºs: 152 e 153; h. SEQ ID Nºs: 158 e 159; i. SEQ ID Nºs: 146 e 147; j. SEQ ID Nºs: 160 e 161; k. SEQ ID Nºs: 166 e 167; l. SEQ ID Nºs: 150 e 151; m. SEQ ID Nºs: 142 e 143; n. SEQ ID Nºs: 168 e 169; o. SEQ ID Nºs: 164 e 165; p. SEQ ID Nºs: 162 e 163; q. SEQ ID Nºs: 170 e 171; r. SEQ ID Nºs: 134 e 135; s. SEQ ID Nºs: 154 e 155; t. SEQ ID Nºs: 136 e 137; e u. SEQ ID Nºs: 138 e 139.
34. Proteína de ligação a antígeno caracterizada pelo fato de que compreende: a. uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada apresentada na Tabela C ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 376 a 379, 384 a 387, 391 a 396, 403 a 408, 412 a 413, 416 a 419, e 422 a 427 ou uma sequência variante das mesmas que difere apenas por um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequência; ou b. uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve apresentada na Tabela C ou uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Nºs: 380 a 383, 388 a 390, 397 a 402, 409 a 411, 414 a 415 e 420 a 421 ou uma sequência variante das mesmas que difere apenas por um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequência; ou c. tanto (a) quanto (b).
35. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a sequência variante tem pelo menos cerca de 85% de identidade de sequência.
36. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a sequência variante tem pelo menos cerca de 90% ou cerca de 95% de identidade de sequência.
37. Proteína de ligação a antígeno caracterizada pelo fato de que compreende um par de sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo consistindo em: a. SEQ ID Nºs: 376 e 380; b. SEQ ID Nºs: 377 e 380; c. SEQ ID Nºs: 377 e 381; d. SEQ ID Nºs: 377 e 382; e. SEQ ID Nºs: 377 e 383; f. SEQ ID Nºs: 378 e 381; g. SEQ ID Nºs: 378 e 382; h. SEQ ID Nºs: 378 e 383; i. SEQ ID Nºs: 379 e 381; j. SEQ ID Nºs: 379 e 382;
k.
SEQ ID Nºs: 379 e 383; l.
SEQ ID Nºs: 384 e 388; m.
SEQ ID Nºs: 385 e 388; n.
SEQ ID Nºs: 385 e 389; o.
SEQ ID Nºs: 386 e 388; p.
SEQ ID Nºs: 386 e 389; q.
SEQ ID Nºs: 387 e 389; r.
SEQ ID Nºs: 422 e 389; s.
SEQ ID Nºs: 391 e 397; t.
SEQ ID Nºs: 392 e 397; u.
SEQ ID Nº: 393 e 398; v.
SEQ ID Nº: 394 e 398; w.
SEQ ID Nº: 395 e 398; x.
SEQ ID Nº: 396 e 398; y.
SEQ ID Nº: 423 e 398; z.
SEQ ID Nº: 424 e 398; aa.
SEQ ID Nº: 425 e 398; bb.
SEQ ID Nº: 426 e 398 cc.
SEQ ID Nº: 427 e 398; dd.
SEQ ID Nº: 403 e 409; ee.
SEQ ID Nº: 404 e 409; ff.
SEQ ID Nº: 405 e 410; gg.
SEQ ID Nº: 405 e 411; hh.
SEQ ID Nº: 406 e 410; ii.
SEQ ID Nº: 406 e 411; jj.
SEQ ID Nº: 407 e 410; kk.
SEQ ID Nº: 407 e 411; ll.
SEQ ID Nº: 408 e 410; mm.
SEQ ID Nº: 408 e 411; nn.
SEQ ID Nº: 412 e 414;
oo. SEQ ID Nº: 413 e 414; pp. SEQ ID Nº: 416 e 420; qq. SEQ ID Nº: 417 e 420; rr. SEQ ID Nº: 417 e 421; ss. SEQ ID Nº: 418 e 420; tt. SEQ ID Nº: 418 e 421; uu. SEQ ID Nº: 419 e 420; e vv. SEQ ID Nº: 419 e 421;
38. Proteína de ligação a antígeno caracterizada pelo fato de que compreende: (A) um CDR1 de HC que compreende a sequência de aminoácidos de YTFTXYT, em que X é T, V, D ou S (SEQ ID Nº: 452), opcionalmente, compreendendo a sequência de aminoácidos de YTFTTYT (SEQ ID Nº: 11); (B) um CDR2 de HC que compreende a sequência de aminoácidos de IXPSSGYT, em que X é Q, S, A ou N (SEQ ID Nº: 475), opcionalmente, que compreende a sequência de aminoácidos de INPSSGYT (SEQ ID Nº: 12); (C) um CDR3 de HC que compreende a sequência de aminoácidos de AXGDYYVAY, em que X é N, Q, H ou D (SEQ ID Nº: 453), opcionalmente, compreendendo a sequência de aminoácidos de ANGDYYVAY (SEQ ID Nº:13) (D) um CDR1 de LC compreendendo a sequência de aminoácidos de SSVSSXY, em que X é T, V, F ou D (SEQ ID Nº: 449), opcionalmente, que compreende a sequência de aminoácidos de SSVSSTY (SEQ ID Nº: 8); (E) um CDR2 de LC compreendo a sequência de aminoácidos de XTX, em que X na posição 1 é S, T, Q ou A e X na posição 3 é S, T, D ou Q (SEQ ID Nº: 450), opcionalmente, que compreende a sequência de aminoácidos de STS (SEQ ID Nº: 9); e
(F) um CDR3 de LC compreendendo a sequência de aminoácidos de HXYXRSPLT, em que X na posição 2 é Q, H ou S e X na posição 4 é H, Y, Q ou S (SEQ ID Nº: 451), opcionalmente, que compreende a sequência de aminoácidos de HQYHRSPLT (SEQ ID Nº: 10).
39. Proteína de ligação a antígeno caracterizada pelo fato de que compreende: (A) um CDR1 de HC compreendendo a sequência de aminoácidos de FTFSXYX, em que X na posição 5 é N, S, R, Q ou A e X na posição 7 é W, H, Y, F (SEQ ID Nº: 455), opcionalmente, compreendendo a sequência de aminoácidos de FTFSNYW (SEQ ID Nº: 23); (B) um CDR2 de HC compreendendo a sequência de aminoácidos de IRLKXDXYAT, em que X na posição 5 é S, N, A ou T e X na posição 7 é Q, S, A, N (SEQ ID Nº: 456), opcionalmente, compreendendo a sequência de aminoácidos de IRLKSDNYAT (SEQ ID Nº: 24); (C) um CDR3 de HC compreendendo a sequência de aminoácidos de XDGPPSGX, em que X na posição 1 é N, D ou T e X na posição 8 é S, T, A, C ou Y (SEQ ID Nº: 457), opcionalmente, compreendendo a sequência de aminoácidos de NDGPPSGC (SEQ ID Nº: 25); (D) um CDR1 de LC compreendendo a sequência de aminoácidos de EXIYSY, em que X é Q, S, A, D ou N (SEQ ID Nº: 476), opcionalmente, compreendendo a sequência de aminoácidos de ENIYSY (SEQ ID Nº: 20); (E) um CDR2 de LC compreendendo a sequência de aminoácidos de XAK, em que X na posição 1 é Q, S, A, D ou N (SEQ ID Nº: 477), opcionalmente, compreendendo a sequência de aminoácidos de NAK (SEQ ID Nº: 21); e
(F) um CDR3 de LC compreendendo a sequência de aminoácidos de QXHYXVPWT, em que X na posição 2 é H, Q, S ou T e X na posição 5 é T, S, N ou G (SEQ ID Nº: 454), opcionalmente, compreendendo a sequência de aminoácidos de QHHYTVPWT (SEQ ID Nº: 22).
40. Proteína de ligação a antígeno caracterizada pelo fato de que compreende: (A) um CDR1 de HC compreendendo a sequência de aminoácidos de YTXTXYT, em que X na posição 3 é F, Y, S ou T e X na posição 5 é S, T, Y ou D (SEQ ID Nº: 461), opcionalmente, compreendendo a sequência de aminoácidos de YTFTSYT (SEQ ID Nº: 29); (B) um CDR2 de HC compreendendo a sequência de aminoácidos de IXPSSXYT, em que X na posição 2 é Q, S, A ou N e X na posição 6 é T, S, V, D ou G (SEQ ID Nº: 462), opcionalmente, compreendendo a sequência de aminoácidos de INPSSTYT (SEQ ID Nº: 30); (C) um CDR3 de HC compreendendo a sequência de aminoácidos de XRGEXGGFAY, em que X na posição 1 é S, A, T ou V e X na posição 5 é L, V ou F (SEQ ID Nº: 463), opcionalmente, compreendendo a sequência de aminoácidos de SRGELGGFAY (SEQ ID Nº: 31); (D) um CDR1 de LC compreendendo a sequência de aminoácidos de QSLVHSXGXTY, em que X na posição 7 é D, N, E, Q, S ou A e X na posição 9 é Q, S, A, D ou N (SEQ ID Nº: 458), opcionalmente, compreendendo a sequência de aminoácidos de QSLVHSDGNTY (SEQ ID Nº: 26); (E) um CDR2 de LC compreendendo a sequência de aminoácidos de XVX, em que X na posição 1 é K, Q ou R e X na posição 3 é S, T ou V (SEQ ID Nº: 459), opcionalmente, compreendendo a sequência de aminoácidos de KVS (SEQ ID Nº: 27); e (F) um CDR3 de LC compreendendo a sequência de aminoácidos de SXXTHVPYT, em que X na posição 2 é Q, H ou T e X na posição 3 é S, G, T ou D (SEQ ID Nº: 460), opcionalmente, compreendendo a sequência de aminoácidos de SQSTHVPYT (SEQ ID Nº: 28).
41. Conjugado caracterizado pelo fato de que compreende uma proteína de ligação a antígeno, como definida em qualquer uma das reivindicações anteriores.
42. Proteína de fusão caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína de ligação a antígeno, como definida em qualquer uma das reivindicações anteriores.
43. Ácido nucleico caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de ligação a antígeno, como definida em qualquer uma das reivindicações anteriores, um conjugado, como definido na reivindicação 41, ou uma proteína de fusão, como definida na reivindicação 42.
44. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico, como definido na reivindicação 43.
45. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico, como definido na reivindicação 43, ou o vetor, como definido na reivindicação 44.
46. Método para produzir uma proteína de ligação a antígeno que se liga a uma proteína Claudin6 (CLDN6) caracterizado pelo fato de que compreende (i) cultivar a célula hospedeira, como definida na reivindicação 45, num meio de cultura celular, em que a célula hospedeira compreende um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de ligação a antígeno, como definida em qualquer uma das reivindicações anteriores, e (ii) coletar a proteína de ligação a antígeno do meio de cultura celular.
47. Método para produzir uma proteína de fusão que compreende uma proteína de ligação a antígeno que se liga a uma proteína Claudin6 (CLDN6) caracterizado pelo fato de que compreende (i) cultivar a célula hospedeira, como definida na reivindicação 45, num meio de cultura celular, em que a célula hospedeira compreende um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão, como definida na reivindicação 30, e (ii) coletar a proteína de fusão do meio de cultura celular.
48. Método para produzir uma composição farmacêutica caracterizado pelo fato de que compreende combinar uma proteína de ligação a antígeno, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 40, um conjugado, como definido na reivindicação 41, uma proteína de fusão, como definida na reivindicação 42, um ácido nucleico, como definido na reivindicação 43, um vetor, como definido na reivindicação 44, uma célula hospedeira, como definida na reivindicação 45, ou uma combinação dos mesmos, e um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável
49. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína de ligação a antígeno, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 40, um conjugado, como definido na reivindicação 41, uma proteína de fusão, como definida na reivindicação 42, um ácido nucleico, como definido na reivindicação 43, um vetor, como definido na reivindicação 44, uma célula hospedeira, como definida na reivindicação 45, ou uma combinação dos mesmos, e um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.
50. Método para tratar um indivíduo com um câncer que expressa CLDN6 caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica, como definida na reivindicação 49, numa quantidade eficaz para tratar o câncer.
51. Método para inibir o crescimento de tumor num indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica, como definida na reivindicação 49, numa quantidade eficaz para inibir o crescimento de tumor.
52. Método para reduzir o tamanho de tumor num indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica, como definida na reivindicação 49, numa quantidade eficaz para reduzir o tamanho de tumor.
53. Método para prevenir a recorrência de câncer num indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica, como definida na reivindicação 49, numa quantidade eficaz para prevenir a recorrência de câncer.
54. Método para tratar câncer num indivíduo diagnosticado com um superexpressor baixo de CLDN6 caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica, como definida na reivindicação 49, numa quantidade eficaz para prevenir a recorrência de câncer
55. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 54, caracterizado pelo fato de que a administração induz apoptose em células de tumor.
56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 55, caracterizado pelo fato de que a administração induz apoptose em células que expressam CLDN6
57. Método para detectar Claudin6 (CLDN6) numa amostra caracterizado pelo fato de que compreende colocar a amostra em contato com uma proteína de ligação a antígeno, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 40, um conjugado, como definido na reivindicação 41, ou uma proteína de fusão, como definida na reivindicação 42, e realizar um ensaio para um imunocomplexo compreendendo a proteína de ligação a antígeno, o conjugado ou a proteína de fusão ligada a CLDN6.
58. Método para diagnosticar um câncer positivo para Claudin6 (CLDN6) num a indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende colocar uma amostra biológica compreendendo células ou tecido obtida a partir do indivíduo em contato com uma proteína de ligação a antígeno, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 40, um conjugado, como definido na reivindicação 41, ou uma proteína de fusão, como definida na reivindicação 42, e realizar um ensaio para um imunocomplexo compreendendo a proteína de ligação a antígeno, o conjugado ou a proteína de fusão ligada a CLDN6.
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