BR112020001000A2

BR112020001000A2 - método para detectar um anticorpo em uma amostra de paciente, e, aparelho.

Info

Publication number: BR112020001000A2
Application number: BR112020001000-6A
Authority: BR
Inventors: James Matthew SIMMONS; Jeffrey Allen SPENCER; Charles David Kelley; Gaston Andres Del Pino
Original assignee: Helena Laboratories Corporation
Priority date: 2017-07-21
Filing date: 2018-07-13
Publication date: 2020-07-21
Also published as: JP2020528145A; WO2019018222A1; EP3655768A1; CA3070762A1; CN111051873A; US11802871B2; US20200217818A1; AU2018304083A1; JP7366000B2

Abstract

Um sistema e método aplicador de eletroforese de imunofixação deposita antissoro em locais espaçados em um substrato, onde o antissoro é depositado como um grânulo alongado em uma primeira direção e retido contra migração em uma direção transversal à dita primeira direção por pelo menos tensão superficial.

Description

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MÉTODO PARA DETECTAR UM ANTICORPO EM UMA AMOSTRA DE PACIENTE, E, APARELHO

[001] Essa descrição refere-se ao campo de eletroforese. A eletroforese é o movimento de moléculas carregadas eletricamente que são colocadas sobre ou em um meio de suporte e, posteriormente, submetidas a um campo elétrico. As moléculas carregadas migram através ou ao longo do meio de suporte e através do campo elétrico, pelo que a separação de moléculas de vários tamanhos depende, pelo menos em parte, do seu respectivo tamanho.

[002] A eletroforese é usada para prover informações analíticas sobre várias moléculas biológicas. É amplamente usada por laboratórios médicos para a análise de uma variedade de amostras, como, por exemplo, proteínas do sangue, DNA, RNA, imunoglobulina, hemoglobina, colesterol, lipoproteínas, isoenzimas e proteínas do líquido cefalorraquidiano (LCR). Essas amostras tipicamente incluem moléculas ou componentes largos que têm uma carga elétrica. A eletroforese permite o movimento das moléculas ou componentes eletricamente carregados quando submetidos a um campo elétrico. Durante a eletroforese, as amostras a serem testadas, analisadas ou avaliadas são colocadas sobre ou dentro de um meio de suporte conectado a uma fonte elétrica. O meio de suporte, como um gel, provê uma camada ou malha sólida ou semissólida, através da qual as moléculas eletricamente carregadas migram através do campo elétrico. Uma solução tampão é tipicamente usada para submergir as amostras e meio de suporte e manter o nível de pH. O meio de suporte é tipicamente uma camada de apoio tratada com uma substância em gel. Um exemplo de um gel comumente usado em eletroforese é agarose.

[003] Sistemas de eletroforese incluem um eletrodo positivo e um eletrodo negativo, que são colocados em um circuito elétrico para criar um campo eletroforético entre os eletrodos. As moléculas carregadas fluirão sob a

2 / 12 influência do campo eletroforético dentro da estrutura porosa do gel com base na atração da carga na molécula em direção ao eletrodo que possui uma carga oposta.

[004] Em um exemplo não limitativo de um sistema de eletroforese, as amostras são colocadas em uma ou mais áreas de amostra, como poços que podem ser intermediários ou próximos a um dos dois eletrodos, como, por exemplo, intermediário aos eletrodos ou mais próximo do eletrodo negativo ou cátodo. O termo “intermediário” não se refere ao centro geográfico entre os dois eletrodos. Quando o campo elétrico é ativado, as moléculas ou componentes eletricamente carregados se moverão através do campo elétrico com base em sua atração pelo eletrodo de carga oposta. A distância que cada molécula ou componente se desloca através do campo elétrico dependerá de fatores como o tamanho ou massa respectiva ou relativa do componente ou molécula. Os componentes ou moléculas separados formam, assim, uma série de bandas no meio de suporte que podem se estender de uma extremidade do meio à outra. A visualização das bandas pode ser auxiliada por várias técnicas de secagem e/ou coloração e/ou lavagem ou remoção da solução tampão. Cada banda representa tipicamente uma quantidade de uma molécula ou componente com um determinado tamanho e pode ser mais ou menos distinta de outras bandas, dependendo da concentração de tal molécula ou componente. Este procedimento às vezes é chamado de resolução da fração proteica. As bandas podem ser adicionalmente examinadas, analisadas e avaliadas por várias técnicas, como densitometria e/ou outros métodos.

[005] A eletroforese de imunofixação ou IFE é um procedimento em duas etapas bem conhecido para detectar a presença de certas proteínas, tal como as do soro humano, urina ou LCR. O procedimento envolve, como uma primeira etapa, a resolução da fração proteica por eletroforese, como geralmente descrito acima. Como uma segunda etapa, o antígeno solúvel na proteína é permitido reagir com seu anticorpo (antissoro). Os complexos

3 / 12 antígeno-anticorpo resultantes precipitarão, a uma taxa dependente da proporção dos reagentes, temperatura, concentração de sal e pH. Os complexos antígeno-anticorpo são então visualizados por coloração.

[006] O processo IFE referido em termos gerais no parágrafo anterior é descrito em mais detalhes na Patente norte-americana nº 5.185.066, emitida em 9 de fevereiro de 1993, e atribuído à Helena Laboratories Corporation de Beaumont, Texas, EUA, cuja totalidade é incorporada por referência neste documento, incluindo as referências e bibliografia listadas. Aparelhos e produtos químicos para a realização de IFE foram comercializados há algum tempo pela Helena Laboratories Corporation de Beaumont, Texas, EUA, o cessionário da patente acima mencionada. Exemplos não limitativos de tais aparelhos comercializados pela Helena Laboratories Corporation de Beaumont, Texas, EUA, incluem o SPIFE TOUCH e o SPIFE 4000. Os manuais de instruções (D6500140C de novembro de 2016 e D6500141B de julho de 2017, respectivamente) estão disponíveis ao público na Helena Laboratories Corporation de Beaumont, Texas, EUA, on-line em www.Helena.com e são incorporados aqui por referência em sua totalidade.

[007] Tipicamente, no uso da IFE para analisar proteínas para diagnóstico, monitoramento e avaliação do paciente, um espécime de um único paciente é diluído e depois colocado em várias amostras ou áreas de aplicação em uma única placa de gel eletroforética. O objetivo de utilizar várias áreas de amostra é possibilitar a detecção, separadamente, da proteína sérica total e de várias proteínas, como as cadeias pesadas de imunoglobulina IgG, IgM, IgA e cadeias leves Kappa e Lambda, ou outras proteínas cuja presença ou ausência pode ser de importância no diagnóstico médico.

[008] Anteriormente, um molde com canais ou fendas separadas foi colocado na placa de gel preferencialmente após a etapa da eletroforese. Em seguida, vários antissoros, tipicamente os antissoros das proteínas IgG, IgM,

4 / 12 IgA, Kappa e Lambda, foram colocados em seus respectivos canais ou fendas no molde. Se a proteína específica estivesse presente na amostra submetida a eletroforese, a proteína (anticorpo) reagiria com os antissoros para causar uma reação de precipitação anticorpo-antissoro no respectivo canal.

[009] O molde, em contato com o gel, manteve cada antissoro em seu canal ou fenda pretendida e impediu a migração indesejável de antissoro de um canal ou fenda para um canal ou fenda adjacente. Assim, o uso do molde era comum e desejável no processo de IFE.

[0010] Portanto, era comum preencher os canais ou fendas no molde com excesso de antissoros, ou seja, mais antissoros do que a quantidade real necessária para a reação antissoro-anticorpo. Isso aumentava os custos. Em adição, o molde, se descartável, aumentava o custo de cada teste de IFE. O molde, se reutilizável, aumentava o custo e esforço de limpeza entre testes sucessivos, já que limpar um molde reutilizável era necessário além de limpar o aparelho ou sistema ou equipamento.

[0011] Assim, um sistema, método e aparelho eram necessários para prover os benefícios do molde, mas sem a necessidade do molde.

[0012] De acordo com um aspecto, o presente sistema, método e aparelho para aplicar antissoro sobre o gel submetido a eletroforese no procedimento de IFE evita a necessidade do molde convencional. O sistema, método e aparelho também podem ser usados em outros ambientes de eletroforese para aplicar os reagentes desejados nos locais desejados sobre o gel.

[0013] Modalidades da invenção serão agora descritas apenas a título de exemplo, com referência aos desenhos anexos, nos quais: a Figura 1 é uma ilustração de uma pipeta ou sonda nas proximidades de uma placa ou substrato de eletroforese antes da formação de um grânulo de reagente; a Figura 2 é uma ilustração do uso da pipeta ou sonda para

5 / 12 aplicar um grânulo de reagente; a Figura 3 é uma ilustração diagramática de uma porção de uma placa de eletroforese mostrando o início da colocação de um reagente na placa; a Figura 4 é uma ilustração diagramática de uma placa de eletroforese mostrando a colocação de um reagente na placa; e a Figura 5 é uma ilustração diagramática de uma modificação da pipeta ou da sonda.

[0014] Com referência aos desenhos, uma placa de eletroforese 10 é ilustrada na forma diagramática nas Figuras 1, 2 e 3 e inclui um apoio ou substrato que pode ser uma película ou chapa de plástico 12, tal como Mylar® (uma marca registrada de Dupont para polietileno tereftalato). A chapa inclui uma séria de aberturas 14 para alinhamento com pinos em um aparelho de eletroforese, tal como o SPIFE TOUCH, fabricado e vendido por Helena Laboratories Corporation de Beaumont, Texas, EUA. Como um exemplo não limitante, a placa 10 pode incluir um gel eletroforético 16, tal como um gel agarose, com tampas de extremidade 18, 20 alargadas em extremidades opostas do gel. As tampas de extremidade alargadas também são formadas de material de agarose e são providas para manter fluidez suficiente durante a etapa de eletroforese.

[0015] Apenas para os fins de explicação e em um sentido não limitante, os desenhos ilustram como o sistema pode ser usado para testar nove amostras de paciente simultaneamente. Além disso, apenas para fins de explicação e em um sentido não limitante, os “resultados” da reações de imunofixação são ilustrados como se os testes tivessem sido finalizados. Assim, as áreas de teste 22 para nove pacientes, designados como 22a, 22b, ... 22i, são ilustradas em um arranjo três por três na Figura 4. As áreas de teste 22a, 22b e 22c são arranjadas em uma primeira coluna (vistas na direção a partir da tampa de extremidade de gel 18 para a tampa de extremidade de gel

6 / 12 20), uma segunda coluna à direita da primeira coluna com as áreas de teste 22d, 22e e 22f, e uma terceira coluna à direita da segunda coluna. Novamente, o número e localização e designação de áreas de teste são apenas para fins ilustrativos e explicativos não limitantes.

[0016] Além disso, para cada área de teste de paciente, existe seis canais ou vias identificadas como SPx, G, A, M, Κ, e λ, referindo-se respectivamente aos canais para medir proteína sérica total, IgG, IgM, IgA, Kappa e Lambda. O “x” subscrito após SP (como visto na Figura 3), nesta ilustração não limitativa, varia de um a nove, uma vez que existem áreas de teste para nove pacientes. O uso do subscrito é para auxiliar na identificação e diferenciação entre os vários pacientes.

[0017] São providos meios para depositar amostras de pacientes na placa de eletroforese, de preferência intermediar as extremidades dos seis canais para cada paciente. Como pode ser apreciado, portanto, seis amostras ou alíquotas para cada paciente serão depositadas na placa de eletroforese e, se as amostras de nove pacientes forem avaliadas simultaneamente, serão depositadas 54 alíquotas.

[0018] Como um exemplo não limitativo, amostras de pacientes podem ser coletadas, inicialmente em tubos de ensaio. As amostras são então retiradas dos tubos de ensaio, tal como em um laboratório, e depositadas em recipientes ou copos de amostra associados com o sistema de eletroforese. As amostras são subsequentemente transferidas dos copos de amostra para a placa de eletroforese usando um aplicador do tipo ilustrado na Patente norte- americana 6.544.395, concedida em 8 de abril de 2003 e atribuída a Helena Laboratories Corporation de Beaumont, Texas, EUA, cuja totalidade é aqui incorporada por referência.

[0019] Alternativamente, uma pipeta ou sonda pode ser usada para retirar amostras de pacientes de recipientes e depositar as amostras de pacientes na placa de eletroforese. Como ainda outra alternativa, uma pipeta

7 / 12 ou sonda pode ser usada para retirar amostras de pacientes de um tubo de ensaio e aplicar as amostras diretamente na placa de eletroforese. Outras variações no usado da pipeta ou sonda serão aparentes ao trabalhador versado.

[0020] Referindo-se às Figuras, uma pipeta ou sonda 26 é ilustrada diagramaticamente. A pipeta ou sonda é convencionalmente usada para retirar amostras de paciente, tal como a partir de um tubo de ensaio. Se um teste de IFE for realizado, a sonda aplicará seis amostras do primeiro paciente nos seis canais ou vias apropriadas em uma primeira área de teste 22a. A sonda será limpa e, em seguida, retirará amostras de um tubo de ensaio diferente e aplicará seis amostras na área de teste 22b para um segundo paciente. Esse processo é repetido com base no número de áreas de teste 22 na placa de eletroforese. Alternativamente, um pluralidade de pipetas ou sondas podem ser usadas simultaneamente, tal como uma pipeta ou sonda para cada paciente.

[0021] Após a etapa de eletroforese ser finalizada, a pipeta ou sonda é então usada para aplicar o antissoro ou reagentes sobre a placa. O reagente é formado como um grânulo 28 e é aplicado preferencialmente ao longo do comprimento da placa 10, começando em uma extremidade 30 da placa de eletroforese, adjacente a uma tampa de extremidade de gel 18 e terminando na extremidade oposta 32 da placa de eletroforese, adjacente à outra tampa de extremidade de gel 20.

[0022] Como uma ilustração não limitante com base no parágrafo anterior, um grânulo 28 é aplicado pelo movimento da sonda 26 na direção da seta 34, de uma extremidade 30 para a outra extremidade 32, e o grânulo 28 aparece como uma tira estreita e alongada.

[0023] Na Figura 4, o grânulo 28 é ilustrado como aplicado sobre o canal SP para três áreas de teste 22a, 22b e 22c. Em seguida, a sonda é removida do contato com a placa 10, como por elevação da sonda verticalmente. A sonda é então movida em uma direção perpendicular à

8 / 12 direção da seta 34, isto é, perpendicular à direção de aplicação do grânulo 28. Em seguida, a sonda é colocada em contato com a placa, abaixando a sonda verticalmente, e um segundo grânulo seria aplicado sobre a área SP para as próximas três áreas de teste 22d, 22e e 22f, tal como por movimento da sonda entre as extremidades 30 e 32 da placa. O trabalhador versado entende que para a aplicação do segundo grânulo, pode ser vantajoso reverter a direção do movimento da sonda, como da extremidade 32 até a extremidade 30, embora a sonda possa ser movida para a extremidade 30 e depois abaixada para contato com a placa para a aplicação do segundo grânulo.

[0024] O procedimento descrito acima seria então repetido para o exemplo não limitativo ilustrado na Figura 4, onde existem três colunas de áreas de teste do paciente, ou seja, um arranjo 3 x 3 de amostras de teste de paciente. Na modalidade ilustrada na Figura 4, existem nove áreas de teste de paciente; portanto, a sonda ou a pipeta atravessaria a placa três vezes apenas para aplicar o grânulo (reagente) na área de SP.

[0025] Então, a sonda é lavada e limpa. Um reagente para o próximo canal ou via ou região da área de teste é aplicada como um grânulo discreto. No exemplo não limitativo ilustrado, o próximo canal ou área receberá o antissoro para IgG e isso será aplicado nas áreas de teste 22a, 22b e 22c., por movimento da sonda entre as extremidades 30 e 32 da placa. Isso é repetido para a próxima coluna das áreas de teste, 22d, 22e e 22f e, em seguida, para a terceira coluna das áreas de teste 22g, 22h e 22i. Novamente, três grânulos são aplicados. Em seguida, a sonda é lavada e limpa e ainda é aplicada um outro grânulo, esse grânulo seria o antissoro para IgM, e isso também é repetido três vezes, uma para cada uma das colunas das áreas de teste.

[0026] O procedimento descrito acima é repetido para os antissoros para as áreas de teste de IgA e Kappa e Lambda. Para o exemplo ilustrado, mas não limitativo, de um teste de IFE, são necessários seis grânulos ou depósitos de reagente para cada área de teste 22, um reagente para cada canal,

9 / 12 com os seis reagentes sendo correlacionados para reagir com o anticorpo na amostra do paciente a ser detectado por uma reação antígeno-anticorpo. Existem seis canais por paciente, portanto, são necessários seis grânulos para cada paciente, um grânulo para cada canal. Além disso, como o arranjo de áreas de teste do paciente é ilustrado como 3 x 3, cada área de teste inclui seis canais. Assim, na ilustração não limitativa em uma direção perpendicular à seta 34, existem 18 canais - seis canais para a primeira coluna de áreas de teste de paciente, seis canais para a segunda coluna de áreas de teste de paciente e seis canais para a terceira coluna de áreas de teste.

[0027] Portanto, no exemplo ilustrado e descrito, mas não limitativo, podem ser depositados 18 grânulos, três grânulos dos antissoros de SP, três grânulos para os antissoros de IgG, três grânulos para os antissoros de IgM, etc. Cada grânulo se estende entre a extremidades 30 e 32 da placa.

[0028] Também é contemplado que múltiplas sondas possam ser usadas simultaneamente. Como um exemplo não limitativo, se três sondas forem usadas, todas as três sondas podem depositar simultaneamente o antissoro ou reagente para o canal SP, uma para as áreas de teste 22a, 22b e 22c, uma segunda para as áreas de teste 22d, 22e, e 22f, e a terceira para as áreas de teste 22g, 22h e 22i. Como um outro exemplo não limitativo, se seis sondas forem usadas, as sondas poderão ter reagentes para canais diferentes, isto é, uma sonda com o reagente para o canal SP, uma segunda sonda com o reagente para o canal IgG, uma terceira sonda com o reagente para o canal IgM, etc. Então, seis sondas podem depositar simultaneamente os reagentes nos seis canais das placas 22a, 22b e 22c enquanto se deslocam entre as extremidades 30 e 32, e isso é repetido para a segunda coluna de área de teste 22d, 22e, 22f e depois para a terceira coluna de áreas de teste 22g, 22h, 22i.

[0029] Outros tamanhos e arranjos de áreas de teste de paciente são de competência do trabalhador técnico no assunto. A placa de eletroforese pode incluir mais ou menos canais ou vias do que as seis listadas (SP, IgG, IgM,

10 / 12 IgA, Kappa e Lambda) para um paciente. A placa de eletroforese pode incluir uma única área de teste de paciente 22. A placa de eletroforese pode incluir uma única coluna com uma ou mais área de teste, por exemplo, 22a, 22b, etc., e não é limitada a três áreas de teste. A placa de eletroforese pode incluir uma única fileira com uma ou mais área de teste, por exemplo, 22a, 22d, etc., e não é limitada a três áreas de teste. A placa de eletroforese geral pode incluir um arranjo de áreas de teste de paciente e não é limitada a um arranjo 3 x 3.

[0030] Em um procedimento de IFE padrão, as reações são visualizadas após o antissoro ter sido aplicado e aplicação de coloração. No entanto, para ilustrar a localização relativa da aplicação dos grânulos de antissoros nas áreas de teste, a Figura 3 também ilustra as reações visíveis típicas nas várias colunas nas várias áreas de teste dos pacientes, entendendo- se que, na prática, as reações não ocorrem até depois dos antissoros terem sido depositados.

[0031] A quantidade ou volume de reagente ou antissoro que é depositado como um grânulo é controlado. De preferência, mas em um sentido não limitativo, o volume é controlado por pelo menos uma das três técnicas. Em primeiro lugar, a velocidade de movimento da sonda na direção da aplicação dos antissoros pode ser ajustada e controlada. Em uma modalidade ilustrativa, a direção de aplicação está na direção da seta 34 de uma extremidade do gel 30 para a outra extremidade do gel 32. Em segundo lugar, a vazão do reagente ou antissoro fornecida à pipeta ou sonda a partir de uma bomba que é usada para fornecer o reagente pode ser ajustada e controlada. Em terceiro lugar, a área da seção transversal da abertura da pipeta ou sonda pode ser controlada, tal como pelo uso de sondas com aberturas de tamanhos diferentes, se desejado.

[0032] Nesse último aspecto, pode ser apreciado que uma sonda pode incluir uma ponta ou extremidade afiada para perfurar uma tampa protetora que cobre a amostra do paciente. A sonda, depois de perfurar a tampa, se

11 / 12 estende para a amostra e retira a amostra para posterior deposição no gel. Tipicamente, uma sonda que perfura a tampa protetora e aplica a amostra de paciente possui uma área de seção transversal pequena demais para aplicar a quantidade desejada de antissoros. Portanto, uma luva 38 pode ser afixada à extremidade da sonda antes da aplicação dos grânulos de antissoro. A luva pode ser encaixada à força na sonda e pode ter uma extremidade inferior aberta de diâmetro maior e, portanto, uma seção transversal maior do que a área da seção transversal da sonda que é usada para perfurar a tampa protetora e/ou aplicar a amostra de paciente. Assim, o diâmetro interno da luva pode ser maior que o diâmetro externo da sonda. A luva ajuda a limitar ou controlar o diâmetro do grânulo, conforme aplicado na placa de gel. O uso da luva é opcional, se desejado, para auxiliar no controle da quantidade de antissoros a serem depositados.

[0033] Independentemente de uma manga ser utilizada, os antissoros depositados podem se espalhar transversalmente na direção do movimento da sonda/luva, ou seja, os antissoros podem se espalhar transversalmente na direção da seta 34. Em uma modalidade, o grânulo de antissoro conforme aplicado terá uma largura perpendicular à direção da seta 34 de aproximadamente 0,432 cm. O grânulo de antissoro conforme aplicado terá uma altura acima da placa de gel geralmente menor que a largura.

[0034] O sistema, método e aparelho, conforme descritos, permitem que os vários antissoros sejam depositados em vias, canais ou áreas espaçadas na placa de gel em quantidade suficientemente grande para prover uma reação se o anticorpo apropriado estiver presente na amostra, mas sem a necessidade de um barreira física externa, como um molde, para manter a separação entre os antissoros dos canais adjacentes. O sistema, método e aparelho utilizam menos antissoro do que usado anteriormente com um molde enquanto provê a mesma sensibilidade. A viscosidade dos antissoros e reagentes pode ser a mesma usada anteriormente com um molde e, como menos antissoro é

12 / 12 utilizado quando comparado aos sistemas anteriores, pelo menos em certa medida a tensão superficial mantém, ou ajuda a manter, o grânulo de antissoro no local adequado, livre de migração indesejável para canais adjacentes.

[0035] Uma bomba de seringa adequada é a Cavro Centris Pump, conforme descrita no Manual de Instruções 30038165, Revisão B, março de 2012, disponível publicamente na Tecan Systems de San Jose, Califórnia, EUA, cuja totalidade é aqui incorporada por referência. O movimento da sonda nas direções X, Y e Z per se é tradicional como é usado em vários produtos da Helena Laboratories Corporation de Beaumont, Texas, EUA.

[0036] Muitas mudanças e modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito e do escopo da presente descrição. A descrição deve ser limitada apenas pelas seguintes reivindicações.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para detectar pelo menos um anticorpo em uma amostra de paciente, a amostra de paciente sendo colocada em um substrato em uma primeira área de teste de amostra de paciente, o substrato tendo pelo menos primeira e segunda áreas de teste de paciente adjacentes, o método caracterizado pelo fato de que inclui depositar pelo menos um antissoro ao pelo menos um anticorpo em pelo menos na dita primeira área de teste de amostra de paciente para colocar a primeira área de teste de amostra de paciente em contato e para reagir com o pelo menos um anticorpo, se o dito anticorpo estiver presente na primeira área de teste de amostra de paciente, o aperfeiçoamento compreendendo: a dita primeira área de teste de amostra de paciente sendo isenta de limites físicos não líquidos que, se presentes, restringiriam o movimento da amostra de paciente, e depositar o pelo menos um antissoro em uma primeira direção como um grânulo alongado na primeira área de teste de amostra de paciente do substrato, o grânulo de antissoro sendo retido no substrato por tensão superficial para evitar migração do antissoro em uma direção transversal à dita primeira direção.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o grânulo de antissoro é retido no substrato por tensão superficial para evitar migração do antissoro para a dita segunda área de teste de paciente adjacente.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a segunda área de teste de amostra de paciente é isenta de limites físicos não líquidos que, se presentes, restringiriam o movimento da amostra de paciente, e depositar o pelo menos um antissoro como um grânulo alongado na segunda área de teste de amostra de paciente do substrato, o grânulo de antissoro sendo retido no substrato por tensão superficial para evitar migração do antissoro em direção à primeira área de teste de amostra de paciente.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um antissoro é depositado como um grânulo alongado na segunda área de teste de amostra de paciente em uma segunda direção oposta à dita primeira direção.

5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um antissoro é depositado como dois grânulos alongados, um primeiro grânulo alongado na primeira área de teste de amostra de paciente e um segundo grânulo alongado na segunda área de teste de amostra de paciente.

6. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o antissoro depositado como um grânulo alongado na segunda área de teste de amostra de paciente é diferente do antissoro depositado como um grânulo alongado na primeira área de teste de amostra de paciente.

7. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que múltiplos grânulos alongados são depositados, sequencialmente.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma amostra de paciente é depositada na primeira área de teste de amostra de paciente antes de depositar o pelo menos um antissoro em uma primeira direção como um grânulo alongada, e realizar eletroforese da pelo menos uma amostra de paciente antes de depositar o pelo menos um antissoro em uma primeira direção como um grânulo alongado.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o grânulo alongado tem uma largura maior do que a largura da primeira amostra de teste de paciente medida em uma direção perpendicular à dita primeira direção.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o volume do antissoro depositado como um grânulo alongado é controlado por pelo menos um dentre (a) a velocidade de movimento da deposição de antissoro, (b) a vazão do antissoro, e (c) a área de seção transversal do antissoro sendo depositado como um grânulo alongado.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a largura do grânulo alongado medido em uma direção perpendicular à primeira direção alongada é aproximadamente 0,432 cm.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a largura do grânulo alongado medido em uma direção perpendicular à primeira direção alongada é maior do que a altura do antissoro medido do substrato.

13. Aparelho, caracterizado pelo fato de ser para depositar antissoro como um grânulo alongado em um substrato conforme o método como definido na reivindicação 1.

14. Aparelho de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que inclui adicionalmente uma sonda (26) com uma extremidade aberta para obter pelo menos uma amostra de teste de paciente através da dita extremidade aberta, para depositar a pelo menos uma amostra de teste de paciente através da dita extremidade aberta, para obter antissoro através da dita extremidade aberta, e para depositar o antissoro através da dita extremidade aberta como um grânulo alongado.

15. Aparelho de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que inclui adicionalmente uma sonda (26) com uma extremidade aberta para obtenção, através da dita extremidade aberta, e uma luva (38) na dita sonda, a dita luva com uma extremidade aberta com uma área de seção transversal maior que a área de seção transversal da extremidade aberta da sonda, a dita sonda e luva para depositar o antissoro através das mesmas como um grânulo alongado, a área de seção transversal da extremidade aberta da luva para controlar a largura do dito grânulo alongado.