BR112020000638A2

BR112020000638A2 - methods of associating a tag with a nucleic acid, to detect a nucleic acid and to capture a nucleic acid.

Info

Publication number: BR112020000638A2
Application number: BR112020000638-6A
Authority: BR
Inventors: John Katz
Original assignee: John Katz
Priority date: 2017-07-12
Filing date: 2018-07-12
Publication date: 2020-07-14
Also published as: WO2019012481A2; WO2019012481A3

Abstract

Métodos de utilização de G-quadruplexos divididos associados a etiquetas funcionais para associação das referidas etiquetas a ácidos nucleicos alvo. Métodos incluem uso de G-quadruplexos divididos associados a etiquetas de detecção para a detecção de ácidos nucleicos alvo, e uso de G-quadruplexos divididos associados a etiquetas de captura para detecção ou captura de ácidos nucleicos alvo.Methods of using divided G-quadruplexes associated with functional tags for associating said tags with target nucleic acids. Methods include use of divided G-quadruplexes associated with detection tags for the detection of target nucleic acids, and use of divided G-quadruplexes associated with capture tags for detection or capture of target nucleic acids.

Description

METHODS OF ASSOCIATING A LABEL TO A NUCLEIC ACID, TO DETECT A NUCLEIC ACID AND TO CAPTURE A NUCLEIC ACID FIELD OF THE INVENTION

[001] A invenção refere-se a métodos de associação de etiquetas funcionais a ácidos nucleicos alvo, e uso dos mesmos, incluindo a detecção de ácidos nucleicos alvo, e a captura de ácidos nucleicos alvo.[001] The invention relates to methods of associating functional tags with target nucleic acids, and their use, including the detection of target nucleic acids, and the capture of target nucleic acids.

BACKGROUND OF THE INVENTION

[002] G-quadruplexos são estruturas formadas em ácidos nucléicos por sequências que são ricas em guanina. Quatro bases de guanina podem associar-se através da ligação de hidrogênio Hoogsteen para formar uma estrutura plana quadrada denominada tétrade de guanina, e dois ou mais tétrades de guanina podem se empilhar entre si para formar um G- quadruplexo. A estrutura quadruplexo é estabilizada ainda mais pela presença de um cátion, que fica em um canal central entre cada par de tétrades. Eles podem ser formados por DNA ou RNA (ou outros ácidos nucleicos); e eles tipicamente se formam a partir de uma cadeia (intramolecular), duas cadeias (bimolecular), três cadeias (trimolecular) ou quatro cadeias (tetramolecular) de ácido nucleico. G-quadruplexos com 4 sequências ricas em G alinhados na mesma direção 5'-a-3' são denominados paralelos; G-quadruplexos com 2 sequências ricas em G alinhadas 5'-a-3' e 2 sequências ricas em G alinhadas na direção 3º-a-5* são denominadas anti-paralelas; e G quadruplexos com 3 sequências ricas em G alinhadas 5'-a-3* e 1 sequência rica em G alinhada 3'- a-5', ou 1 sequência rica em G alinhada em 5º-a-3'e 3 sequências ricas em G alinhadas de 3'-a-5', são denominadas mistas ou híbridas.[002] G-quadruplexes are structures formed in nucleic acids by sequences that are rich in guanine. Four guanine bases can join together through the Hoogsteen hydrogen bond to form a flat square structure called a guanine tetrad, and two or more guanine tetrads can stack together to form a quadruple G-. The quadruplex structure is further stabilized by the presence of a cation, which is in a central channel between each pair of tetrads. They can be formed by DNA or RNA (or other nucleic acids); and they typically form from one chain (intramolecular), two chains (bimolecular), three chains (trimolecular) or four chains (tetramolecular) of nucleic acid. G-quadruplexes with 4 G-rich sequences aligned in the same 5'-to-3 'direction are called parallels; G-quadruplexes with 2 G-rich sequences aligned 5'-to-3 'and 2 G-rich sequences aligned in the 3rd-to-5 * direction are called anti-parallel; and G quadruplexes with 3 G-rich sequences aligned 5'-to-3 * and 1 G-rich sequence aligned 3'- to-5 ', or 1 G-rich sequence aligned to 5º-a-3'and 3 rich sequences in G aligned from 3'-to-5 ', they are called mixed or hybrid.

[003] Bases que intervêm nas sequências ricas em G são necessárias para o dobramento adequado do Gr-quadruplexo, especialmente para estruturas bimoleculares e intramoleculares. Após a formação do G- quadruplexo, essas bases residem em regiões de alça, e G-quadruplexos de diferentes topologias possuem alças em diferentes configurações. Por exemplo, quadruplexos em uma topologia paralela terão alças em uma configuração de hélice (posicionados lateralmente ao quadruplexo), enquanto quadruplexos em uma topologia anti-paralela terão alças em uma configuração lateral (unindo sequências adjacentes ricas em G), ou em ambas configuração lateral e configuração diagonal (unindo sequências ricas em G diagonalmente opostas). Além disso, estudos desenvolveram a sequência consenso G34N1.7+4G3+N1-7+4G34N1-7G3 (onde N é qualquer base incluindo guanina) para identificar G-quadruplexos putativos, com G; representando as sequências ricas em G e Ni; representando as bases intervenientes nas regiões de alça. Exemplos de G-quadruplexos publicados e teóricos são encontrados no banco de dados G4RNA (http://scottgroup.med.usherbrooke.ca) e GregList (Lista de Genes Regulados por G-quadruplexo) (http://tubic.tju.edu.cn/ greglist), respectivamente.[003] Bases that intervene in G-rich sequences are necessary for the proper folding of the Gr-quadruplex, especially for bimolecular and intramolecular structures. After the formation of the G-quadruplex, these bases reside in loop regions, and G-quadruplexes of different topologies have loops in different configurations. For example, quadruplexes in a parallel topology will have handles in a helix configuration (positioned laterally to the quadruplex), while quadruplexes in an anti-parallel topology will have handles in a lateral configuration (joining adjacent G-rich sequences), or both in lateral configuration. and diagonal configuration (joining diagonally opposed G-rich sequences). In addition, studies have developed the consensus sequence G34N1.7 + 4G3 + N1-7 + 4G34N1-7G3 (where N is any base including guanine) to identify putative G-quadruplets, with G; representing sequences rich in G and Ni; representing the intervening bases in the loop regions. Examples of published and theoretical G-quadruplexes are found in the G4RNA database (http://scottgroup.med.usherbrooke.ca) and GregList (List of Genes Regulated by G-quadruplex) (http://tubic.tju.edu .cn / greglist), respectively.

[004] Sequência G-quadruplexo está presente nos genomas de uma variedade de organismos. Em humanos, pesquisas em todo o genoma identificaram >376.000 Sequências Quadruplexo Putativas, embora nem todas provavelmente se formem “in vivo”. Algumas seqiências são encontradas em telômeros humanos com o “DNA repeat” d(GGTTAG),. Foi demonstrado que a formação de quadruplexos nos telômeros diminui a atividade da enzima telomerase, que é responsável pela manutenção do comprimento dos telômeros, e está envolvida em cerca de 85% de todos os cânceres. Outras sequências são encontradas nas regiões promotoras dos genes, incluindo os proto-oncogenes c-myc, k-ras, c-kit, Bcl-2 e VEGF.[004] G-quadruplex sequence is present in the genomes of a variety of organisms. In humans, research across the genome has identified> 376,000 Putative Quadruplex Sequences, although not all are likely to form "in vivo". Some sequences are found in human telomeres with the “DNA repeat” d (GGTTAG) ,. The formation of quadruplexes in the telomeres has been shown to decrease the activity of the telomerase enzyme, which is responsible for maintaining telomere length, and is involved in about 85% of all cancers. Other sequences are found in the promoter regions of the genes, including the proto-oncogenes c-myc, k-ras, c-kit, Bcl-2 and VEGF.

[005] Além dos cátions, foram identificadas outras moléculas que influenciam a formação ou se ligam aos G-quadruplexos. Algumas moléculas induzem a formação de G-quadruplexos, incluindo a proteína de ligação ao DNA RAP], o agente de aglomeração polietileno glicol e o líquido iônico tris (pentafluoroetil) trifluorofosfato de guanidínio (Gua-IL). Outras moléculas são capazes de se ligar aos G-quadruplexos, incluindo a helicase BLM, a proteína de ligação ao DNA RAPI, a proteína dedo de zinco engenheirada Gql, o anticorpo específico para G-quadruplexo 1H6 e as pequenas moléculas hemina, NMM, TMPyP4 e telomestatina. Interessantemente, um subconjunto dessas moléculas também estabiliza a formação de G-quadruplexos (ex. Gua- IL, TMPyP4 e telomestatina). O banco de dados de ligantes de G-quadruplexo (http://www.g4ldb.org) lista centenas de moléculas que influenciam ou ligam G-quadruplexos. G-Quadruplexos Catalíticos[005] In addition to cations, other molecules have been identified that influence formation or bind to G-quadruplexes. Some molecules induce the formation of G-quadruplexes, including the DNA-binding protein RAP], the agglomeration agent polyethylene glycol and the ionic liquid tris (pentafluoroethyl) trifluorophosphate guanidinium (Gua-IL). Other molecules are able to bind to the G-quadruplexes, including the BLM helicase, the DNA-binding protein RAPI, the engineered zinc finger protein Gql, the specific antibody to the G-quadruple 1H6 and the small hemine molecules, NMM, TMPyP4 and telomestatin. Interestingly, a subset of these molecules also stabilizes the formation of G-quadruplexes (eg, Gua-IL, TMPyP4 and telomestatin). The G-quadruplex ligand database (http://www.g4ldb.org) lists hundreds of molecules that influence or bind G-quadruplexes. G-Catalytic Quadruplexes

[006] G-quadruplexos foram isolados de bibliotecas aleatórias de DNA usando metodologia de seleção de aptâmeros SELEX e a molécula NMM - um análogo do estado de transição do heme, um cofator enzimático encontrado nas peroxidases e outras enzimas. G-quadruplexos ligam NMM com afinidade micromolar (via “end-stacking”) e, interessantemente, ligam a hemina (uma forma oxidada de heme) com afinidade micromolar também. Com a adição do agente oxidante H2O;, o complexo G-quadruplexo-hemina é capaz de oxidar uma variedade de substratos, incluindo substratos colorimétricos e cromogênicos (por exemplo, DAB, ABTS) - e substratos quimioluminescentes (por exemplo, luminol) - usados em ensaios de peroxidase. O complexo G-quadruplexo-hemina é aproximadamente duas ordens de magnitude mais reativo que a hemina somente na catalisação de reações de peroxidase.[006] G-quadruplexes were isolated from random DNA libraries using SELEX aptamer selection methodology and the NMM molecule - an analogue of the heme transition state, an enzyme cofactor found in peroxidases and other enzymes. G-quadruplexes bind NMM with micromolar affinity (via “end-stacking”) and, interestingly, bind hemin (an oxidized form of heme) with micromolar affinity as well. With the addition of the oxidizing agent H2O ;, the G-quadruplex-hemin complex is able to oxidize a variety of substrates, including colorimetric and chromogenic substrates (eg, DAB, ABTS) - and chemiluminescent substrates (eg, luminol) - used in peroxidase assays. The G-quadruplex-hemine complex is approximately two orders of magnitude more reactive than hemine only in catalyzing peroxidase reactions.

[007] Portanto, os G-quadruplexos são considerados enzimas de DNA. Estudos demonstraram que complexos G-quaduplexo-hemina são menos ativos que a peroxidase de rábano silvestre (HRP), mas mais ativos que a enzima catalase. Interessantemente, o complexo G-quadruplexo-hemina exibe uma faixa mais ampla de especificidade de substrato que a HRP, e uma maior taxa de auto-inativação do que a HRP - provavelmente devido a um sítio ativo mais exposto. Alguns estudos mostraram a atividade do G-[007] Therefore, G-quadruplexes are considered DNA enzymes. Studies have shown that G-quaduplexo-hemin complexes are less active than horseradish peroxidase (HRP), but more active than the enzyme catalase. Interestingly, the G-quadruplex-hemin complex exhibits a broader range of substrate specificity than HRP, and a higher rate of self-inactivation than HRP - probably due to a more exposed active site. Some studies have shown the activity of G-

quadruplexo dependente de fons, tampões, pH e surfactantes - bem como agentes de melhoria da atividade, como adenosina trifosfato e espermidina. Outros estudos mostraram a atividade do G-quadruplexo dependente do tamanho da alça, sequência flanqueadora e topologia. Complexos G- quadruplexo-hemina têm muitas vantagens em comparação ao HRP; no entanto, menor atividade da peroxidase e maior taxa de inativação dificultaram o uso do G-quadruplexo como substitutos do HRP. G-Quadruplexos divididosquadruplex dependent on fons, buffers, pH and surfactants - as well as agents for improving activity, such as adenosine triphosphate and spermidine. Other studies have shown G-quadruplex activity dependent on loop size, flanking sequence and topology. G-quadruplex-hemin complexes have many advantages over HRP; however, less peroxidase activity and a higher rate of inactivation made it difficult to use G-quadruplex as substitutes for HRP. G-Quadruplexes divided

[008] G-quadruplexos divididos são G-quadruplexos engenheirados que são usados para detectar ácidos nucleicos por meio de sua atividade catalítica inerente. Essas moléculas foram primeiramente projetadas dividindo a sequência G-quadruplexo em uma sequência a montante e uma sequência a jusante, e anexando braços de ligação ao alvo nas sequências a montante e a jusante. Assim, G- quadruplexos divididos compreendem duas cadeias oligonucleotídicas - cada uma com uma sequência parcial do G-quadruplexo e um braço de ligação ao alvo. Os braços de ligação ao alvo são de cadeia simples, e projetados para ligar ácido nucleico alvo de cadeia única, por exemplo, projetado com uma sequência complementar ao ácido nucleico alvo e, portanto, capaz de se ligar ao referido ácido nucleico. Por conseguinte, na presença do alvo, o G-quadruplexo dividido se liga e seu G-quadruplexo se reúne e se torna competente para catalisar sua reação à peroxidase.[008] Divided G-quads are engineered G-quads that are used to detect nucleic acids through their inherent catalytic activity. These molecules were first designed by dividing the G-quadruplex sequence into an upstream and a downstream sequence, and attaching link arms to the target in the upstream and downstream sequences. Thus, divided G-quadruplexes comprise two oligonucleotide chains - each with a partial G-quadruplex sequence and a target binding arm. The target binding arms are single-stranded, and designed to bind single-stranded target nucleic acid, for example, designed with a sequence complementary to the target nucleic acid and, therefore, capable of binding to said nucleic acid. Therefore, in the presence of the target, the divided G-quadruplex binds and its G-quadruplex gathers and becomes competent to catalyze its reaction to peroxidase.

[009] O uso de G-quadruplexos divididos com atividade peroxidase para detectar ácidos nucleicos é interessante, especialmente com moléculas que demonstram alta especificidade de ligação (usando braços curtos de ligação ao alvo). No entanto, estudos observaram baixa sensibilidade ao alvo (por exemplo, IOnM-a-ImMM usando substratos colorimétricos) em comparação com ensaios de HRP (por exemplo, 0,1pM-a-100pM). A baixa sensibilidade ao alvo provavelmente reflete as limitações acima mencionadas de (1) atividade mais fraca da peroxidase e (11) maior taxa de inativação em comparação com a HRP. Tal como acontece com G-quadruplexos, essas limitações impediram o uso de G-quadruplexos divididos como agentes de detecção de ácido nucleico.[009] The use of divided G-quadruplexes with peroxidase activity to detect nucleic acids is interesting, especially with molecules that demonstrate high binding specificity (using short target binding arms). However, studies have observed low sensitivity to the target (for example, IOnM-a-ImMM using colorimetric substrates) compared to HRP assays (for example, 0.1pM-to-100pM). The low sensitivity to the target probably reflects the aforementioned limitations of (1) weaker peroxidase activity and (11) higher rate of inactivation compared to HRP. As with G-quadruplexes, these limitations prevented the use of divided G-quadruplexes as nucleic acid detection agents.

BRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0010] A presente invenção descreve métodos e reagentes para associar etiquetas a ácidos nucleicos, o método compreendendo a associação de uma etiqueta a um G-quadruplexo dividido, e a ligação de um G- quadruplexo dividido a um ácido nucleico. Em alguns aspectos, a etiqueta é uma etiqueta de captura, que pode ser usada para capturar um G-quadruplexo dividido e, consequentemente, capturar um ácido nucleico ligado pelo G- quadruplexo dividido. Em outros aspectos, a etiqueta é uma etiqueta de detecção, que pode ser usada para detectar um G-quadruplexo dividido e, consequentemente, detectar um ácido nucleico ligado pelo G-quadruplexo dividido.[0010] The present invention describes methods and reagents for associating tags with nucleic acids, the method comprising associating a tag with a divided G-quadruplex, and the attachment of a divided G-quadruplex to a nucleic acid. In some respects, the tag is a capture tag, which can be used to capture a divided G-quadruplex and, consequently, capture a nucleic acid bound by the divided G-quadruplex. In other respects, the tag is a detection tag, which can be used to detect a divided G-quadruplex and, consequently, detect a nucleic acid bound by the divided G-quadruplex.

[0011] Etiquetas são modificações de ácido nucleico que conferem caráter característicos ao ácido nucleico, como a capacidade de ser capturado, detectado, marcado ou reticulado. As etiquetas são conhecidos no estado da técnica, comumente vendidos pelos fabricantes de oligonucleotídeos, e podem ser ligados ou incorporados em ácidos nucleicos, como químicas de fixação, fluoróforos, enzimas detectáveis, partículas detectáveis e análogos de nucleotídeos.[0011] Tags are modifications of nucleic acid that give character to the nucleic acid, such as the ability to be captured, detected, marked or cross-linked. The tags are known in the state of the art, commonly sold by oligonucleotide manufacturers, and can be linked or incorporated into nucleic acids, such as fixation chemicals, fluorophores, detectable enzymes, detectable particles and nucleotide analogs.

[0012] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um kit para capturar ou detectar ácidos nucleicos compreendendo um G-quadruplexo dividido e uma etiqueta associada usada para capturar ou detectar o referido G- quadruplexo dividido. Em outros aspectos, a divulgação fornece um aparato para capturar ou detectar ácidos nucleicos compreendendo um G-quadruplexo dividido e uma etiqueta associada usada para capturar ou detectar o referido G-quadruplexo dividido.[0012] In some respects, the disclosure provides a kit for capturing or detecting nucleic acids comprising a divided G-quadruplex and an associated tag used to capture or detect said divided G-quadruplex. In other aspects, the disclosure provides an apparatus for capturing or detecting nucleic acids comprising a divided G-quadruplex and an associated tag used to capture or detect said divided G-quadruplex.

BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0013] A Figura | é uma ilustração de seis modalidades da divulgada invenção para a captura ou detecção de ácidos nucleicos alvo (linha tracejada) utilizando G-quadruplexos divididos associados a etiquetas de captura (C) ou etiquetas de detecção (D). Na caixa superior, um anticorpo (Ab), um G- quadruplexo dividido (SQ) e um G-quadruplexo dividido com braços de captura (SQB) são ilustrados. Algumas modalidades apresentam um ácido nucleico de captura (linha sólida). A etiqueta de captura do ácido nucleico usado para ligar a superfície sólida (grande retângulo preto) não está ilustrada.[0013] The Figure | is an illustration of six modalities of the disclosed invention for the capture or detection of target nucleic acids (dashed line) using divided G-quadruplexes associated with capture tags (C) or detection tags (D). In the upper box, an antibody (Ab), a divided G-quadruplex (SQ) and a divided G-quadruplex with capture arms (SQB) are illustrated. Some modalities have a capture nucleic acid (solid line). The capture label for the nucleic acid used to bind the solid surface (large black rectangle) is not shown.

DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0014] A presente invenção descreve — uma interação surpreendentemente estável entre G-quadruplexos divididos e ácidos nucleicos alvo. A alta afinidade de ligação dos G-quadruplexos divididos (para ácidos nucleicos alvo) não requer atividade da peroxidase - e provavelmente reflete a formação do G-quadruplexo após a ligação ao alvo, que liga fisicamente os dois braços de ligação ao alvo do G-quadruplexo dividido. A combinação de alta afinidade de ligação e alta especificidade de ligação são características compartilhadas com anticorpos, que são usados para associar (ou unir) etiquetas a antígenos. Por conseguinte, a presente invenção divulga o uso de G-quadruplexos divididos para associar etiquetas a ácidos nucleicos, por exemplo, em metodologias para capturar ácidos nucleicos e metodologias para detectar ácidos nucleicos. A presente invenção também divulga o uso de G-quadruplexos divididos (no lugar de anticorpos) em várias metodologias de anticorpos adaptadas para ácidos nucléicos, incluindo purificação, precipitação, marcação, reticulação e modificação de ácidos nucléicos - bem como kits e aparatos baseados nas referidas metodologias. G-Quadruplexos divididos[0014] The present invention describes - a surprisingly stable interaction between divided G-quadruplexes and target nucleic acids. The high binding affinity of the divided G-quadruplexes (for target nucleic acids) does not require peroxidase activity - and probably reflects the formation of the G-quadruplex after binding to the target, which physically connects the two binding arms to the G- divided quadruplex. The combination of high binding affinity and high binding specificity are characteristics shared with antibodies, which are used to associate (or join) tags with antigens. Accordingly, the present invention discloses the use of divided G-quadruplexes to associate tags with nucleic acids, for example, in methodologies for capturing nucleic acids and methodologies for detecting nucleic acids. The present invention also discloses the use of divided G-quadruplexes (in place of antibodies) in various antibody methodologies adapted for nucleic acids, including purification, precipitation, labeling, cross-linking and modification of nucleic acids - as well as kits and apparatus based on said methodologies. G-Quadruplexes divided

[0015] Os — G-quadruplexos divididos são G-quadruplexos engenheirados projetados para ligar sequências alvo em ácidos nucleicos alvo e, após a ligação, reúnem-se em G-quadruplexos. Essas moléculas podem compreender duas, três ou quatro cadeias de ácido nucleico, com (i) cada cadeia contendo uma sequência parcial de um G-quadruplexo e (11) duas ou mais cadeias com braços de ligação ao alvo de cadeia simples, cada uma capaz de ligar parte de uma sequência alvo de cadeia simples do ácido nucleico alvo. Numa modalidade, os braços de ligação ao alvo são projetados com sequência capaz de ligar a sequência alvo, por exemplo, por hibridação. Noutra modalidade, os braços de ligação ao alvo são projetados com uma sequência complementar à sequência alvo e, portanto, são capazes de ligar a sequência alvo por hibridação. Numa concretização preferida, a soma das sequências parciais do G-quadruplexo dividido é um G-quadruplexo e a soma das sequências do braço de ligação ao alvo é uma sequência complementar à sequência alvo.[0015] The - divided G-quadruplexes are engineered G-quadruplexes designed to bind target sequences to target nucleic acids and, after binding, come together in G-quadruplexes. Such molecules may comprise two, three or four nucleic acid chains, with (i) each chain containing a partial sequence of a G-quadruplex and (11) two or more chains with single-stranded target binding arms, each capable of to link part of a single-stranded target sequence of the target nucleic acid. In one embodiment, the target binding arms are designed with a sequence capable of binding the target sequence, for example, by hybridization. In another embodiment, the target binding arms are designed with a sequence complementary to the target sequence and, therefore, are able to link the target sequence by hybridization. In a preferred embodiment, the sum of the partial sequences of the divided G-quadruplex is a G-quadruplex and the sum of the sequences of the target binding arm is a sequence complementary to the target sequence.

[0016] Um G-quadruplexo dividido de x cadeias (onde x=2, 3 ou 4) pode ser projetado por (1) dividir a sequência do G-quadruplexo em x sequências parciais (por exemplo, para x=2, divididas em uma sequência a um montante e uma a jusante), ex. contendo 1, 2 ou 3 sequências ricas em G); (11) determinar a sequência complementar da sequência alvo, dividindo a sequência complementar em y sequências parciais (onde y=2, 3 ou 4); e (ii) colocar uma sequência alvo complementar parcial em cada cadeia do G- quadruplexo dividido. As sequências alvo complementares parciais (aqui denominadas braços de ligação ao alvo) podem ser colocadas na extremidade 5', na extremidade 3', ou em uma posição interna da sequência G-quadruplexo parcial. Por exemplo, um G-quadruplexo dividido de duas cadeias pode ter uma primeira cadeia com (i) a extremidade 5' do braço de ligação ao alvo (com a sequência alvo complementar a montante) anexada à extremidade 3' da sequência a montante do G-quadruplexo, ou preferencialmente (11) a extremidade 3' do braço de ligação ao alvo (com sequência alvo complementar a montante) ligada à extremidade 5' da sequência a montante do G-quadruplexo; e uma segunda cadeia com (iii) a extremidade 5' da sequência a jusante do G-quadruplexo anexada à extremidade 3' do braço de ligação ao alvo (com a sequência alvo complementar a jusante), ou preferencialmente (iv) a extremidade 3' da sequência a jusante do G- quadruplexo anexada à extremidade 5S'do braço de ligação ao alvo (com a sequência alvo complementar a jusante). Em outra modalidade, uma cadeia do G-quadruplexo dividido é conectada a dois ou mais braços de ligação ao alvo. Numa modalidade preferida, os braços de ligação ao alvo são ligados às sequências parciais do G-quadruplexo por meio de um ligador ou espaçador — tal como fosforamidito C3, hexanodiol, e 1',2'-didesoxirribose e preferencialmente pelos espaçadores trietileno glicol ou hexa-etilenoglicol.[0016] A G-quadruplex divided by x chains (where x = 2, 3 or 4) can be designed by (1) dividing the sequence of the G-quadruplex into x partial sequences (for example, for x = 2, divided into one upstream and one downstream), eg containing 1, 2 or 3 sequences rich in G); (11) determine the complementary sequence of the target sequence, dividing the complementary sequence into y partial sequences (where y = 2, 3 or 4); and (ii) placing a partial complementary target sequence in each split G-quadruplex chain. The partial complementary target sequences (here called target binding arms) can be placed at the 5 'end, at the 3' end, or at an internal position of the partial G-quadruplex sequence. For example, a two-chain split G-quadruplex may have a first chain with (i) the 5 'end of the target connecting arm (with the complementary target sequence upstream) attached to the 3' end of the upstream G sequence - quadruplex, or preferably (11) the 3 'end of the target connecting arm (with complementary target sequence upstream) connected to the 5' end of the upstream sequence of the G-quadruplex; and a second chain with (iii) the 5 'end of the downstream G-quadruplex sequence attached to the 3' end of the target binding arm (with the complementary downstream target sequence), or preferably (iv) the 3 'end of the downstream G-quadruplex sequence attached to the 5S 'end of the target connecting arm (with the complementary downstream target sequence). In another embodiment, a split G-quadruplex chain is connected to two or more link arms to the target. In a preferred embodiment, the target binding arms are linked to the partial sequences of the G-quadruplex by means of a linker or spacer - such as C3 phosphoramidite, hexanediol, and 1 ', 2'-dideoxyribose and preferably by the triethylene glycol or hexa spacers -ethylene glycol.

[0017] As cadeias do G-quadruplexo dividido podem ser projetadas com diferentes combinações de sequências parciais do G-quadruplexo. Por exemplo, um G-quadruplexo dividido de duas cadeias pode ter uma primeira cadeia com 3 seqiiências ricas em G e 2 alças de um G-quadruplexo, e uma segunda cadeia com 1 sequência rica em G de um G-quadruplexo. Numa modalidade preferida, a primeira e segunda cadeia compreendem cada 2 sequências ricas em G e | alça de um G-quadruplexo. Em outra modalidade, a primeira cadeia compreende a sequência G-quadruplexo G34N1-7+G34N1-7+G3, e a segunda cadeia compreende a sequência G-quadruplexo G;3, em que N é qualquer base incluindo guanina. Numa modalidade preferida, a primeira e a segunda sequências da cadeia compreendem cada a sequência G-quadruplexo G34N1-7+G3, em que N é qualquer base incluindo guanina. Noutra modalidade preferida, a primeira cadeia compreende a sequência G-quadruplexo GGGTAGGG, e a segunda cadeia compreende a sequência G-quadruplexo GGGTTGGG. E os G-quadruplexos divididos de três e quatro cadeias podem ser projetados separando (dividindo) as sequências ricas em G acima, tal como uma cadeia 2 ricas em G e duas cadeias 1 rica em G para um G- quadruplexo de três cadeias, e quatro cadeias | rico em G para um quadruplexo de quatro cadeias.[0017] The chains of the divided G-quadruplex can be designed with different combinations of partial sequences of the G-quadruplex. For example, a two-chain split G-quadruplex can have a first chain with 3 G-rich sequences and 2 loops of a G-quadruplex, and a second chain with 1 G-rich sequence from a G-quadruplex. In a preferred embodiment, the first and second strands each comprise 2 sequences rich in G and | handle of a G-quadruplex. In another embodiment, the first strand comprises the G-quadruplex sequence G34N1-7 + G34N1-7 + G3, and the second strand comprises the sequence G-quadruplex G; 3, where N is any base including guanine. In a preferred embodiment, the first and second strands of the chain each comprise the G-quadruplex sequence G34N1-7 + G3, where N is any base including guanine. In another preferred embodiment, the first strand comprises the G-quadruplex sequence GGGTAGGG, and the second strand comprises the G-quadruple sequence GGGTTGGG. And the three- and four-strand divided G-quadruplexes can be designed by separating (dividing) the above G-rich sequences, such as a G-rich 2 strand and two G-rich 1 strands for a three-strand G-quadruplex, and four chains | rich in G for a four-chain quadruplex.

[0018] Uma sequência alvo pode ser uma única sequência contínua no ácido nucleico alvo. Por conseguinte, em uma modalidade, os braços de ligação ao alvo do G-quadruplexo dividido são projetados para ligar duas regiões flanqueadoras (partes) da referida sequência alvo contínua. Uma sequência alvo também pode ser duas ou mais sequências fisicamente separadas (por exemplo, partes, separadas por sequência não alvo) no ácido nucleico alvo. Por conseguinte, em outra modalidade, os braços de ligação ao alvo do G-quadruplexo dividido são projetados para ligar duas ou mais sequências fisicamente separadas da sequência alvo. Em outra modalidade, um ou mais braços de ligação ao alvo são encurtados em comprimento, de modo que nas condições e temperatura escolhidas para ligação, o G- quadruplexo dividido hibridiza a sequências alvo perfeitas e não a sequências alternativas, incluindo sequências com substituições de nucleotídeos, tal como os polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs). Por exemplo, o comprimento curto pode ser selecionado por (1) escolher uma temperatura para operação do G-quadruplexo dividido (ex. 25ºC), e (2) projetar um par de braços de ligação ao alvo, com um braço tendo uma temperatura de fusão (Tm) igual ou superior à temperatura de operação (ex. 40ºC), e um braço com Tm igual a menos que a temperatura de operação (ex. 20ºC), em que uma substituição de nucleotídeo no alvo reduz significativamente a Tm (ex. <0ºC). Esse projeto permite o uso dos G-quadruplexos divididos para capturar ou detectar sequências alvo perfeitas ou, alternativamente, capturar ou detectar sequências com substituições de nucleotídeo, incluindo SNPs.[0018] A target sequence can be a single continuous sequence in the target nucleic acid. Therefore, in one embodiment, the target connecting arms of the divided G-quadruplex are designed to connect two flanking regions (parts) of said continuous target sequence. A target sequence can also be two or more physically separate sequences (e.g., parts, separated by non-target sequence) in the target nucleic acid. Therefore, in another embodiment, the target binding arms of the divided G-quadruplex are designed to link two or more sequences physically separate from the target sequence. In another embodiment, one or more binding arms to the target are shortened in length, so that under the conditions and temperature chosen for binding, the divided quadruplex G hybridizes to perfect target sequences and not to alternative sequences, including sequences with nucleotide substitutions. , such as single nucleotide polymorphisms (SNPs). For example, the short length can be selected by (1) choosing a temperature for operation of the divided G-quadruplex (eg 25ºC), and (2) designing a pair of target connecting arms, with one arm having a temperature of fusion (Tm) equal to or greater than the operating temperature (eg 40 ° C), and an arm with Tm equal to less than the operating temperature (eg 20 ° C), in which a nucleotide substitution in the target significantly reduces Tm (eg <0ºC). This design allows the use of split G-quadruplexes to capture or detect perfect target sequences or, alternatively, to capture or detect sequences with nucleotide substitutions, including SNPs.

[0019] Em uma modalidade, G-quadruplexos divididos são usados com moléculas que influenciam a formação de G-quadruplexos, ou se ligam a G-quadruplexos. Em uma modalidade preferida, os G-quadruplexos divididos são usados com moléculas que induzem a formação de G-quadruplexos, como cátions (por exemplo, Na*, K*, NH,y”), a proteína de ligação ao DNA RAP1I, o agente de aglomeração polietileno glicol, e o líquido iônico tris (pentafluoroetil) trifluorofosfato de guanidínio (Gua-IL). Em outra modalidade preferida, os G-quadruplexos divididos são usados com moléculas que estabilizam a formação de G-quadruplexos, como Gua-lIL, TMPyP4 e telomestatina. E em outra modalidade preferida, G-quadruplexos divididos são usados com moléculas que promovem a atividade catalítica de G-quadruplexos, como ATP.[0019] In one embodiment, divided G-quads are used with molecules that influence the formation of G-quads, or bind to G-quads. In a preferred embodiment, the divided G-quadruplexes are used with molecules that induce the formation of G-quadruplexes, such as cations (for example, Na *, K *, NH, y ”), the DNA binding protein RAP1I, the agglomeration agent polyethylene glycol, and the ionic liquid tris (pentafluoroethyl) guanidinium trifluorophosphate (Gua-IL). In another preferred embodiment, divided G-quadruplexes are used with molecules that stabilize the formation of G-quadruplexes, such as Gua-lIL, TMPyP4 and telomestatin. And in another preferred embodiment, divided G-quadruplexes are used with molecules that promote the catalytic activity of G-quadruplexes, such as ATP.

[0020] Estudos de temperatura de fusão descobriram que os G- quadruplexos com topologias paralelas são mais estáveis do que os G- quadruplexos com topologias anti-paralelas. Na presente invenção, G- quadruplexos divididos com maior estabilidade - ex. com topologia paralela - espera-se que ligue alvos de maneira mais estável e pode ser usado em métodos que requerem uma melhor ligação de alvos. Da mesma forma, G- quadruplexos divididos com estabilidade mais fraca - ex. com topologia anti- paralela - espera-se que ligue alvos de maneira mais fraca, e podem ser usados em métodos que requerem uma ligação reduzida ao alvo (por exemplo, para reduzir o background ou melhorar a especificidade). Os G- quadruplexos podem ser projetados ou tratados (por exemplo, com químicos) para assumir diferentes topologias, como uma topologia paralela, uma topologia anti-paralela ou uma topologia híbrida. Por exemplo, G- quadruplexos projetados com alças curtas favorecem topologias paralelas, e G-quadruplexos com alças longas favorecem topologias anti-paralelas. Por exemplo, G-quadruplexos tratados com K* favorecem topologias paralelas, e G-quadruplexos tratados com Na* favorecem topologias anti-paralelas. Na presente invenção, os G-quadruplexos divididos podem ser concebidos ou tratados de forma semelhante para favorecer topologias paralelas ou favorecer topologias anti-paralelas. Etiquetas[0020] Fusion temperature studies have found that G-quads with parallel topologies are more stable than G-quads with anti-parallel topologies. In the present invention, G- quadruplexes divided with greater stability - ex. with parallel topology - it is expected to connect targets more stably and can be used in methods that require better target binding. Likewise, G- quadruplexes divided with weaker stability - ex. with anti-parallel topology - it is expected to bind targets weakly, and can be used in methods that require reduced binding to the target (for example, to reduce the background or improve specificity). G-quadruplexes can be designed or treated (for example, with chemicals) to assume different topologies, such as a parallel topology, an anti-parallel topology or a hybrid topology. For example, G-quadruplexes designed with short handles favor parallel topologies, and G-quadruplexes with long handles favor anti-parallel topologies. For example, G * quadruplexes treated with K * favor parallel topologies, and G-quadruplexes treated with Na * favor anti-parallel topologies. In the present invention, divided G-quadruplexes can be designed or treated in a similar way to favor parallel topologies or favor anti-parallel topologies. Hang tags

[0021] Etiquetas são modificações de ácidos nucleicos que podem ser associadas - ex. ligada ou incorporada - a ácidos nucleicos, e da mesma forma, pode ser associada - ex. ligada ou incorporada - a G-quadruplexos divididos. Etiquetas são funcionais, e sua associação a um ácido nucleico confere sua função ao ácido nucleico. Por exemplo, uma etiqueta que pode ser detectada (por exemplo, uma etiqueta de detecção), ligada ou incorporada a um ácido nucleico, permite que o referido ácido nucleico seja detectado. Por exemplo, uma etiqueta que pode ser capturada (por exemplo, uma etiqueta de captura), ligada ou incorporada a um ácido nucleico, permite que o referido ácido nucleico seja capturado. Por exemplo, uma etiqueta que pode ser marcada (por exemplo, uma etiqueta alvo), ligada ou incorporada a um ácido nucleico, permite que o referido ácido nucleico seja marcado. Por exemplo, uma etiqueta que pode ser reticulada (por exemplo, uma etiqueta reticulada), ligada ou incorporada a um ácido nucleico, permite que o referido ácido nucleico seja reticulado.[0021] Tags are modifications of nucleic acids that can be associated - eg. linked or incorporated - to nucleic acids, and likewise, can be associated - ex. connected or incorporated - to divided G-quadruplexes. Labels are functional, and their association with a nucleic acid confers its function to the nucleic acid. For example, a tag that can be detected (for example, a detection tag), attached to or incorporated into a nucleic acid, allows said nucleic acid to be detected. For example, a tag that can be captured (e.g., a capture tag), attached to or incorporated into a nucleic acid, allows said nucleic acid to be captured. For example, a tag that can be tagged (e.g., a target tag), attached to or incorporated into a nucleic acid, allows said nucleic acid to be tagged. For example, a label that can be cross-linked (e.g., a cross-linked label), attached to or incorporated into a nucleic acid, allows said nucleic acid to be cross-linked.

[0022] Etiquetas são geralmente associadas a ácidos nucleicos por ligação ou incorporação ao ácido nucleico (por exemplo, durante a síntese de ácidos nucleicos). Etiquetas e modificações de ácidos nucleicos são conhecidos na técnica, e muitos estão disponíveis nos fabricantes de oligonucleotídeos. Exemplos de etiquetas de detecção incluem fluoróforos, “quenchers”, fosfoilação, enzimas detectáveis (peroxidase de rábano silvestre), corantes, reagentes (por exemplo, acridito), partículas detectáveis e análogos de nucleotídeos (por exemplo, fluorescentes, radiomarcados); e incluem acridito, corantes de cianina, 6-FAM, Fluoresceína-dT, HEX, JOE, Lightcycler 640, ROX, SYBR Green, TAMRA, TET, Texas Red-X, corantes Alexa Fluor, corantes rodamina, corantes WellRED, “Black Hole quenchers”, DABCYL e 2-aminopurina. Exemplos de etiquetas de captura incluem químicas de fixação, químicas de ligação, fosforilação, antígenos de anticorpos, anticorpos, análogos de nucleotídeos (por exemplo, que são antígenos de anticorpos) e sequências de nucleotídeos (por exemplo, que hibridizam com outros ácidos mnucleicos); e incluem adenilação, modificadores de alcino (por exemplo, reação “click”), modificadores de amino, avidina, azida, biotina, colesterol, digoxigenina (DIG), 2,4- dinitrofenol (DNP) e modificadores de tiol. Exemplos de etiquetas alvo incluem colesterol e fosforilação. Exemplos de etiquetas de reticulação incluem 5-bromo-desoxiuridina. Outras etiquetas como análogos de nucleotídeos (que incluem nucleotídeos modificados, por exemplo, nucleotídeos com nucleobases modificadas), têm membros com funções semelhantes às etiquetas acima mencionadas, como 2-aminopurina (detecção) e 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) (reticulação).[0022] Tags are generally associated with nucleic acids by binding to or incorporating the nucleic acid (for example, during nucleic acid synthesis). Nucleic acid labels and modifications are known in the art, and many are available from oligonucleotide manufacturers. Examples of detection tags include fluorophores, quenchers, phosphoylation, detectable enzymes (horseradish peroxidase), dyes, reagents (for example, acridite), detectable particles and nucleotide analogs (for example, fluorescent, radiolabeled); and include acridite, cyanine dyes, 6-FAM, Fluorescein-dT, HEX, JOE, Lightcycler 640, ROX, SYBR Green, TAMRA, TET, Texas Red-X, Alexa Fluor dyes, rhodamine dyes, WellRED dyes, “Black Hole quenchers ”, DABCYL and 2-aminopurine. Examples of capture tags include fixation chemicals, binding chemicals, phosphorylation, antibody antigens, antibodies, nucleotide analogues (for example, which are antibody antigens) and nucleotide sequences (for example, which hybridize with other mnucleic acids) ; and include adenylation, alkaline modifiers (eg, "click" reaction), amino modifiers, avidin, azide, biotin, cholesterol, digoxigenin (DIG), 2,4-dinitrophenol (DNP) and thiol modifiers. Examples of target labels include cholesterol and phosphorylation. Examples of cross-linking labels include 5-bromo-deoxyuridine. Other tags such as nucleotide analogs (which include modified nucleotides, for example, nucleotides with modified nucleobases), have members with functions similar to the above mentioned tags, such as 2-aminopurine (detection) and 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) (halftone).

[0023] Etiquetas de detecção são modificações de ácidos nucleicos que podem ser detectadas, por exemplo, por sensores (por exemplo, visualmente) ou pelo uso de ensaios ou equipamentos (por exemplo, medindo a presença, quantidade ou atividade funcional da etiqueta de detecção). As etiquetas de detecção comumente usados são fluoróforos e “quenchers”, que podem ser detectados por fluorômetro ou microscópio. Outras etiquetas de detecção que podem ser usadas incluem análogos de fosforilação e nucleotídeos (por exemplo, radiomarcados e detectados por contador de cintilação ou auto-radioagrafia (por exemplo, filme)), enzimas detectáveis (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre), partículas detectáveis (por exemplo, ouro coloidal e látex colorido) e BrdU (por exemplo, reticulação do ácido nucleico marcado (por exemplo, o G-quadruplexo dividido) com o ácido nucleico alvo, e então medindo a presença dos dois ácidos nucleicos reticulados por eletroforese ou cromatografia).[0023] Detection tags are modifications of nucleic acids that can be detected, for example, by sensors (for example, visually) or by the use of tests or equipment (for example, measuring the presence, quantity or functional activity of the detection tag ). The commonly used detection tags are fluorophores and "quenchers", which can be detected by fluorometer or microscope. Other detection tags that can be used include phosphorylation analogs and nucleotides (for example, radiolabeled and detected by scintillation counter or auto-radiography (for example, film)), detectable enzymes (for example, horseradish peroxidase), particles detectable (for example, colloidal gold and colored latex) and BrdU (for example, cross-linking of the labeled nucleic acid (for example, the divided G-quadruplex) with the target nucleic acid, and then measuring the presence of the two cross-linked nucleic acids by electrophoresis or chromatography).

[0024] Etiquetas de captura são modificações de ácidos nucleicos que se ligam, ou são capazes de se ligar, a moléculas específicas - aqui denominadas alvos de captura. Algumas etiquetas de captura dependem de ligações não covalentes de alta afinidade para a ligação ao alvo de captura, como biotina (ligação à avidina) e digoxigenina e 2,4-dinitrofenol (ligação a anticorpos anti-DIG e anti-DNP, respectivamente). Outras etiquetas de captura dependem de ligações covalentes para a ligação do alvo de captura, que geralmente requerem tratamento químico para ativar grupos reativos na etiqueta de captura (ou alvo de captura), como modificadores de amino, modificadores de alcinos e modificadores de tiol. Exemplos de alvos de captura incluem ácidos nucleicos (incluindo aqui os ácidos nucléicos de captura), moléculas que podem ser detectadas (por exemplo, corantes e enzimas), moléculas capazes de se ligar a outras moléculas (por exemplo, antígenos e anticorpos), e superfícies sólidas.[0024] Capture tags are modifications of nucleic acids that bind, or are able to bind, to specific molecules - here called capture targets. Some capture tags rely on high affinity non-covalent bonds for binding to the capture target, such as biotin (binding to avidin) and digoxigenin and 2,4-dinitrophenol (binding to anti-DIG and anti-DNP antibodies, respectively). Other capture tags rely on covalent bonds to bind the capture target, which usually require chemical treatment to activate reactive groups on the capture tag (or capture target), such as amino modifiers, alkyd modifiers and thiol modifiers. Examples of capture targets include nucleic acids (including capture nucleic acids here), molecules that can be detected (for example, dyes and enzymes), molecules capable of binding to other molecules (for example, antigens and antibodies), and solid surfaces.

[0025] Etiquetas alvo como colesterol e fosforilação podem ser usados para facilitar a captação de ácido nucleico nas células. As etiquetas alvo podem ser incorporadas de forma semelhante em um G-quadruplexo dividido, por exemplo, para facilitar sua captação nas células e para facilitar a captação de ácidos nucleicos alvo ligados pelo G-quadruplexo dividido. Tais G-quadruplexos divididos também podem ser associados a moléculas reguladoras de DNA - ex. enzimas, nucleases, fatores de transcrição, inibidores de enzimas, subtratos de enzimas, catalisadores de enzimas etc - para direcionar as referidas moléculas para ácidos nucleicos alvo específicos dentro das células, por exemplo, para uso na regulação de genes, expressão de proteínas via regulação de RNA ou terapia antiviral ou antibacteriana. As etiquetas de reticulação, como BrdU, são usadas para reticular os ácidos nucleicos alvo a outros ácidos nucleicos ou proteínas. Etiquetas de reticulação podem igualmente ser incorporadas em um G-quadruplexo dividido, a fim de reticulá-lo com outros ácidos nucleicos, ou com outras proteínas, que podem assim ser associadas a um ácido nucleico alvo pela ligação do referido G- quadruplexo dividido ao ácido nucleico alvo.[0025] Target tags such as cholesterol and phosphorylation can be used to facilitate the uptake of nucleic acid in cells. Target tags can be similarly incorporated into a divided G-quadruplex, for example, to facilitate their uptake in cells and to facilitate uptake of target nucleic acids linked by the divided G-quadruplex. Such divided G-quadruplexes can also be associated with regulatory DNA molecules - ex. enzymes, nucleases, transcription factors, enzyme inhibitors, enzyme subtracts, enzyme catalysts etc. - to target said molecules to specific target nucleic acids within cells, for example, for use in gene regulation, protein expression via regulation of RNA or antiviral or antibacterial therapy. Cross-linking tags, such as BrdU, are used to cross-link target nucleic acids to other nucleic acids or proteins. Cross-linking tags can also be incorporated into a divided G-quadruplex in order to cross-link it with other nucleic acids, or with other proteins, which can thus be associated with a target nucleic acid by binding said divided G-quadruplex to the acid target nucleic acid.

[0026] Os quadruplexos G divididos podem conter uma ou mais etiquetas - ligadas ou incorporadas em um, dois, três ou quatro de suas cadeias. As etiquetas podem ser colocadas nas extremidades 5', 3', ou no meio de uma cadeia, e diferentes etiquetas podem ser colocadas em uma cadeia ou em diferentes cadeias do G-quadruplex dividido. Em uma modalidade, as etiquetas são colocadas distantes do G-quadruplexo dividido parcial, por exemplo, uma cadeia pode ter uma etiqueta ligada ou incorporada na extremidade 5' de um braço de ligação ao alvo e na extremidade 3' do braço de ligação ao alvo ligado à extremidade 5S'da sequência parcial do G- quadruplexo. Tal configuração pode ser desejada se a etiqueta de captura - ou o alvo de captura (ex. Superfície sólida) anexado a etiqueta de captura - puder interferir na montagem do G-quadruplexo dividido. Em outra modalidade, as etiquetas são colocadas proximal ao G-quadruplexo parcial, por exemplo, uma cadeia pode ter a extremidade 3' do braço de ligação ao alvo anexada à extremidade 5' da sequência parcial do G-quadruplexo e a extremidade 3' da sequência parcial G-quadruplexo ligada ou incorporada à etiqueta. Tal configuração pode ser desejada se múltiplas etiquetas de captura (por exemplo, biotinas) puderem ligar uma única molécula alvo (por exemplo, avidina), o que pode resultar em múltiplas cadeias G-quadruplexo sendo capturadas próximas umas das outras, e montadas artificialmente em um G- quadruplexo (sem a ligação do braço de ligação ao alvo ao ácido nucleico alvo). Colocar a etiqueta de captura próximo ao G-quadruplexo parcial localiza efetivamente a referida sequência G-quadruplexo em um único sítio de ligação no alvo de captura, e reduz a probabilidade de que a referida sequência possa interagir com outros G-quadruplexos ligados a outros sítios de ligação no mesmo ou alvos de captura vizinhos. Sítios de ligação adicionais podem ser bloqueados usando etiquetas de captura que podem ligar múltiplos sítios de ligação no mesmo alvo de captura, ou vizinhos, por exemplo, etiquetas de captura disponíveis comercialmente com duas biotinas (anexadas por ligantes longos).[0026] The divided G quadruplexes can contain one or more tags - linked or incorporated in one, two, three or four of their chains. The tags can be placed at the 5 ', 3' ends, or in the middle of a chain, and different tags can be placed on a chain or on different chains of the divided G-quadruplex. In one embodiment, the tags are placed away from the partial split G-quadruplex, for example, a chain may have a tag attached or embedded at the 5 'end of a target link arm and at the 3' end of the target link arm connected to the 5S'-end of the partial G-quadruplex sequence. Such a configuration can be desired if the capture tag - or the capture target (eg solid surface) attached to the capture tag - can interfere with the assembly of the split G-quadruplex. In another embodiment, the tags are placed proximal to the partial G-quadruplex, for example, a chain may have the 3 'end of the target binding arm attached to the 5' end of the G-quadruplex partial sequence and the 3 'end of the partial G-quadruplex sequence connected or incorporated into the label. Such a configuration can be desired if multiple capture tags (eg, biotins) can bind a single target molecule (eg, avidin), which can result in multiple G-quadruplex chains being captured close together, and artificially assembled in a quadruplex G- (without binding the target binding arm to the target nucleic acid). Placing the capture tag next to the partial G-quadruplex effectively locates said G-quadruplex sequence at a single binding site on the capture target, and reduces the likelihood that said sequence can interact with other G-quadruplexes linked to other sites connection points or neighboring capture targets. Additional binding sites can be blocked using capture tags that can link multiple binding sites on the same capture target, or neighbors, for example, commercially available capture tags with two biotins (attached by long linkers).

Braços de CapturaCapture Arms

[0027] Braços adicionais de ligação ao alvo - capazes de se ligar a outras sequências de ácidos nucleicos - podem ser adicionados a G- quadruplexos divididos para capturar outros ácidos nucleicos alvo. Esses braços adicionais funcionam como etiquetas de captura dependentes de sequência, capazes de se ligar ácidos nucleicos como seus alvos de captura, e podem ser projetados de maneira semelhante ou diferente dos braços de ligação ao alvo, acima mencionados. Por conseguinte, neste documento, é utilizada nomenclatura diferente, onde esses braços adicionais de ligação ao alvo são chamados de braços de captura, que ligam sequências alvo chamadas sequências de captura, que estão presentes nos ácidos nucleicos alvo chamados ácidos nucleicos de captura. Em uma modalidade, os braços de captura são projetados de maneira semelhante aos braços de ligação ao alvo, em que cada cadeia do G-quadruplexo dividido contém um braço de captura de cadeia simples, que é capaz de se ligar a parte da sequência de captura de cadeia simples do ácido nucleico de captura. Em uma modalidade preferida, um ou mais braços de captura são curtos em comprimento, portanto, nas condições e temperatura escolhidas para ligação, o G-quadruplexo dividido hibridiza para capturar perfeitamente sequências e não sequências alternativas, incluindo sequências com substituições de nucleotídeos, como SNPs. Em outra modalidade, os braços de captura são projetados de maneira diferente dos braços de ligação ao alvo, em que uma cadeia do G-quadruplexo dividido contém um braço de captura, que é capaz de ligar toda a sequência de captura do ácido nucleico de captura. E em outra modalidade, a soma das sequências do braço de captura é uma sequência complementar à sequência de captura.[0027] Additional target binding arms - capable of binding to other nucleic acid sequences - can be added to divided G-quadruplexes to capture other target nucleic acids. These additional arms function as sequence-dependent capture tags, capable of binding nucleic acids as their capture targets, and can be designed similarly or differently to the above-mentioned target binding arms. Therefore, in this document, different nomenclature is used, where these additional target binding arms are called capture arms, which link target sequences called capture sequences, which are present in the target nucleic acids called capture nucleic acids. In one embodiment, the capture arms are designed similarly to the target binding arms, where each split G-quadruplex chain contains a single chain capture arm, which is capable of attaching part of the capture sequence single-stranded capture nucleic acid. In a preferred embodiment, one or more capture arms are short in length, therefore, under the conditions and temperature chosen for attachment, the split G-quadruplex hybridizes to perfectly capture sequences and non-alternate sequences, including sequences with nucleotide substitutions, such as SNPs . In another embodiment, the capture arms are designed differently from the target binding arms, in which a split G-quadruplex chain contains a capture arm, which is able to link the entire capture nucleic acid capture sequence . And in another mode, the sum of the sequences of the capture arm is a complementary sequence to the capture sequence.

[0028] Um G-quadruplexo dividido de n cadeias (onde n=2, 3 ou 4) e x braços de captura (onde x=1, 2, 3 ou 4 e x <n) pode ser projetado por (1) dividindo a sequência G-quadruplexo em n sequências parciais (por exemplo, n=2, divididas em uma sequência a montante e a jusante, por exemplo, contendo 1, 2 ou 3 sequências ricas em G), e colocando uma sequência parcial em cada cadeia do G-quadruplexo dividido; (11) determinando a sequência complementar da sequência alvo, dividindo a sequência complementar em n sequências parciais (por exemplo, para n=2, divididas em uma sequência a montante e a jusante) e colocando uma sequência alvo complementar parcial em cada cadeia do G-quadruplexo dividido; e (11) determinar a sequência complementar da sequência alvo, dividindo a sequência complementar em n sequências parciais (por exemplo, para n=2, divididas em uma sequência a montante e a jusante), e colocando uma sequência alvo complementar parcial em cada cadeia do G -quadruplexo dividido; e (111) determinando a sequência complementar da sequência de captura, dividindo a sequência complementar em x sequências parciais (por exemplo, para x=2, divididas em uma sequência a montante e a jusante), e colocando uma sequência de captura complementar parcial em uma ou mais cadeias do G-quadruplexo dividido.[0028] A G-quadruplex divided from n chains (where n = 2, 3 or 4) ex capture arms (where x = 1, 2, 3 or 4 ex <n) can be designed by (1) dividing the sequence G-quadruplex in n partial sequences (for example, n = 2, divided into an upstream and downstream sequence, for example, containing 1, 2 or 3 G-rich sequences), and placing a partial sequence in each G chain - divided quadruplex; (11) determining the complementary sequence of the target sequence, dividing the complementary sequence into n partial sequences (for example, for n = 2, divided into an upstream and downstream sequence) and placing a partial complementary target sequence in each G chain - divided quadruplex; and (11) determining the complementary sequence of the target sequence, dividing the complementary sequence into n partial sequences (for example, for n = 2, divided into an upstream and downstream sequence), and placing a partial complementary target sequence in each chain the G-divided quadruplex; and (111) determining the complementary sequence of the capture sequence, dividing the complementary sequence into x partial sequences (for example, for x = 2, divided into an upstream and downstream sequence), and placing a partial complementary capture sequence in one or more strands of the divided G-quadruplex.

Por exemplo, um G-quadruplexo dividido de duas cadeias pode ter uma primeira cadeia com a extremidade 3' do braço de ligação ao alvo (com sequência alvo complementar a montante) anexada à extremidade 5' da sequência G-quadruplexo a montante, e a extremidade 3' da sequência G- quadruplexo anexada à extremidade 5' do braço de captura (com sequência de captura complementar a jusante); e a extremidade 3' do braço de captura (com sequência de captura complementar a montante) anexada à extremidade 5' da sequência G-quadruplexo a jusante, e a extremidade 3' da sequência G- quadruplexo a jusante anexada à extremidade 5' do braço de ligação ao alvo (com a sequência alvo complementar a jusante), e a extremidade 3' do braço de captura (com sequência de captura complementar a montante) anexada à extremidade 5' da sequência G-quadruplexo a jusante, e a extremidade 3' da sequência G-quadruplexo a jusante anexada à extremidade 5' do braço de ligação ao alvo (com sequência alvo complementar a jusante). Em uma modalidade preferencial, os braços de ligação ao alvo e os braços de captura são anexados às sequências parciais do G-quadruplexo através de um ligante ou espaçador - como fosforamidito C3, hexanodiol e 1',2'-didesoxirribose e preferencialmente através dos espaçadores trietileno glicol ou hexa- etilenoglicol.For example, a two-strand split G-quadruplex may have a first strand with the 3 'end of the target binding arm (with complementary target sequence upstream) attached to the 5' end of the upstream G-quadruplex sequence, and the 3 'end of the G-quadruplex sequence attached to the 5' end of the capture arm (with complementary capture sequence downstream); and the 3 'end of the capture arm (with complementary capture sequence upstream) attached to the 5' end of the downstream G-quadruple sequence, and the 3 'end of the downstream G-quadruple sequence attached to the 5' end of the arm to the target (with the complementary target sequence downstream), and the 3 'end of the capture arm (with complementary capture sequence upstream) attached to the 5' end of the downstream G-quadruple sequence, and the 3 'end of the downstream G-quadruplex sequence attached to the 5 'end of the target connecting arm (with complementary downstream target sequence). In a preferred embodiment, the target binding arms and the capture arms are attached to the partial sequences of the G-quadruplex through a ligand or spacer - such as phosphoramidite C3, hexanediol and 1 ', 2'-dideoxyribose and preferably through the spacers triethylene glycol or hexa-ethylene glycol.

[0029] Os ácidos nucleicos de captura podem ser ligados ou incorporados com etiquetas funcionais; por exemplo, etiquetas de detecção, etiquetas de captura, etiquetas de marcação ou etiquetas de reticulação. Por conseguinte, os ácidos nucleicos de captura podem ser utilizados para associar etiquetas funcionais aos ácidos nucleicos alvo; por exemplo (i) uma etiqueta funcional está associada a um ácido nucleico de captura, (11) o referido ácido nucleico de captura está ligado aos braços de captura de um G-quadruplexo dividido e (il) os braços de ligação ao alvo do referido G-quadruplexo são ligado a um ácido nucleico alvo. Tais métodos permitem o uso de ácidos nucleicos de captura com G-quadruplexos divididos para detectar, capturar, marcar ou reticular os ácidos nucleicos alvo. Por exemplo, os métodos são descritos abaixo para a detecção de ácidos nucleicos alvo usando um ácido nucleico de captura com uma etiqueta de detecção, e G-quadruplexos divididos. Por exemplo, os métodos são descritos abaixo para a captura de ácidos nucleicos alvo em uma superfície sólida usando ácidos nucléicos de captura com etiquetas de captura, e G-quadruplexos divididos. Métodos para detectar ácidos nucleicos[0029] The capture nucleic acids can be linked or incorporated with functional tags; for example, detection tags, capture tags, marking tags or cross-linking tags. Therefore, capture nucleic acids can be used to associate functional tags with the target nucleic acids; for example (i) a functional tag is associated with a capture nucleic acid, (11) said capture nucleic acid is attached to the capture arms of a divided G-quadruplex and (il) the binding arms to the target of said G-quadruplexes are linked to a target nucleic acid. Such methods allow the use of capture nucleic acids with divided G-quadruplexes to detect, capture, tag or cross-link target nucleic acids. For example, the methods are described below for the detection of target nucleic acids using a capture nucleic acid with a detection tag, and divided G-quadruplexes. For example, the methods are described below for capturing target nucleic acids on a solid surface using capture nucleic acids with capture tags, and split G-quadruples. Methods for detecting nucleic acids

[0030] Em uma modalidade, os ácidos nucleicos alvo são detectados por (1) associar uma etiqueta de detecção a um G-quadruplexo dividido, (ii) ligar o referido G-quadruplexo dividido ao ácido nucleico alvo, e (ii) detectar a etiqueta de detecção com um método conhecido na arte. Exemplos de etiquetas de detecção que podem ser utilizados incluem fluoróforos, “quenchers”, fosfoilação e análogos de nucleotídeos. Em outra modalidade, os ácidos nucleicos alvo são detectados por (1) ligar um G-quadruplexo dividido a um ácido nucleico alvo, (11) associar uma etiqueta de detecção ao G-quadruplexo dividido, e (iii) detectar a etiqueta de detecção com um método conhecido na arte. Exemplos de etiquetas de detecção que podem ser usados incluem fosforilação e análogos de nucleotídeos. Numa concretização preferida, o ácido nucleico alvo está ligado a uma superfície sólida — qualquer (1) antes de o ácido nucleico alvo estar ligado ao G-quadruplex dividido; ou (11) depois que o ácido nucleico alvo é ligado ao G-quadruplexo dividido, mas antes da detecção da etiqueta de detecção - permitindo a lavagem do referido ácido nucleico alvo e a remoção dos marcadores de detecção não ligados antes da detecção (das etiquetas de detecção ligados). Uma ilustração de um ácido nucleico alvo associado a uma etiqueta de detecção usando os referidos métodos e uma superfície sólida (isto é, modalidade preferida) é mostrada na Figura 1 Modalidade |.[0030] In one embodiment, target nucleic acids are detected by (1) associating a detection tag with a divided G-quadruplex, (ii) attaching said divided G-quadruplex to the target nucleic acid, and (ii) detecting the detection tag with a method known in the art. Examples of detection tags that can be used include fluorophores, quenchers, phosphorylation and nucleotide analogs. In another embodiment, target nucleic acids are detected by (1) attaching a divided G-quadruplex to a target nucleic acid, (11) associating a detection tag with the divided G-quadruplex, and (iii) detecting the detection tag with a method known in the art. Examples of detection tags that can be used include phosphorylation and nucleotide analogs. In a preferred embodiment, the target nucleic acid is attached to a solid surface - any (1) before the target nucleic acid is attached to the divided G-quadruplex; or (11) after the target nucleic acid is attached to the divided G-quadruplex, but before detection of the detection tag - allowing the washing of said target nucleic acid and removal of unbound detection markers prior to detection (of the tags detection sensors). An illustration of a target nucleic acid associated with a detection tag using said methods and a solid surface (i.e., preferred embodiment) is shown in Figure 1.

[0031] Uma segunda abordagem para detectar ácidos nucleicos alvo usa etiquetas de captura para ligar alvos de captura que podem ser detectados ou capturar alvos que podem ligar moléculas detectáveis. Exemplos de alvos de captura detectáveis (e moléculas detectáveis) incluem etiquetas de detecção e marcadores de imunoensaios e enzimas detectáveis, fluoróforos, partículas detectáveis e moléculas radiomarcadas. Exemplos de enzimas detectáveis incluem enzimas que catalisam reações cromogênicas ou quimioluminescentes, como fosfatase alcalina (AP), peroxidase de rábano silvestre (HRP), beta-galactosidase (b-gal), e luciferase (LUC), e enzimas de DNA tal como G-Quadruplexos catalíticos. Exemplos de fluoróforos detectáveis incluem isotiocianato de fluoresceína (FITC) e tetrametil- rodamina (TRITC). Exemplos de partículas detectáveis incluem ouro coloidal, látex colorido ou fluorescente, e partículas de látex paramagnético. E exemplos de moléculas radiomarcadas detectáveis incluem anticorpos e antígenos marcados com 125-I ou 3-H.[0031] A second approach to detecting target nucleic acids uses capture tags to bind capture targets that can be detected or to capture targets that can bind detectable molecules. Examples of detectable capture targets (and detectable molecules) include detection tags and immunoassay markers and detectable enzymes, fluorophores, detectable particles and radiolabeled molecules. Examples of detectable enzymes include enzymes that catalyze chromogenic or chemiluminescent reactions, such as alkaline phosphatase (AP), horseradish peroxidase (HRP), beta-galactosidase (b-gal), and luciferase (LUC), and DNA enzymes such as G -Catalytic quadruplexes. Examples of detectable fluorophores include fluorescein isothiocyanate (FITC) and tetramethyl rhodamine (TRITC). Examples of detectable particles include colloidal gold, colored or fluorescent latex, and paramagnetic latex particles. And examples of detectable radiolabeled molecules include antibodies and antigens labeled with 125-I or 3-H.

[0032] Em uma modalidade, os ácidos nucleicos alvo são detectados usando etiquetas de captura e alvos de captura por (1) associar um etiqueta de captura a um G-quadruplexo dividido, (11) ligar o referido G-quadruplexo a um ácido nucleico alvo, (111) ligar um alvo de captura detectável para a referida etiqueta de captura, e (iv) detectar o alvo de captura detectável com um método conhecido na arte. Em outra modalidade, os ácidos nucleicos alvo são detectados usando etiquetas de captura e alvos de captura por (1) associar uma etiqueta de captura a um G-quadruplexo dividido, (11) ligar um alvo de captura detectável a referida etiqueta de captura, (111) ligar o referido G- quadruplexo dividido a um ácido nucleico alvo, e (iv) detectar o alvo de captura detectável com um método conhecido na arte. E em outra modalidade, os ácidos nucleicos alvo são detectados usando etiquetas de captura e alvos de captura por (1) ligar um G-quadruplexo dividido a um ácido nucleico alvo, (11) associar uma etiqueta de captura ao referido G-quadruplexo dividido, (111) ligar um alvo de captura detectável a referida etiqueta de captura, e (iv) detectar o alvo de captura com um método conhecido na técnica. Nestes métodos, os alvos de captura que podem ser detectados podem ser utilizados, ou os alvos de captura capazes de ligar moléculas detectáveis podem ser utilizados. Os métodos de ligação de etiquetas de captura a alvos de captura, e ligação de alvos de captura a moléculas detectáveis, são conhecidos no estado da técnica. Numa concretização preferida, o ácido nucleico alvo está ligado a uma superfície sólida — qualquer (1) antes de o ácido nucleico alvo estar ligado ao G-quadruplexo dividido; ou (11) após o ácido nucleico alvo ser ligado ao G-quadruplexo dividido, mas antes da detecção - permitindo a lavagem do referido ácido nucleico alvo e a remoção dos alvos ou moléculas de captura detectáveis não ligados antes da detecção. Uma ilustração de um ácido nucleico alvo associado a um alvo de captura detectável usando os referidos métodos e uma molécula detectável e uma superfície sólida (isto é, modalidade preferida) - é mostrada na Figura 1 Modalidade 2.[0032] In one embodiment, target nucleic acids are detected using capture tags and capture targets by (1) associating a capture tag with a divided G-quadruplex, (11) linking said G-quadruplex to a nucleic acid target, (111) attaching a detectable capture target to said capture tag, and (iv) detecting the detectable capture target with a method known in the art. In another embodiment, target nucleic acids are detected using capture tags and capture targets by (1) associating a capture tag with a divided G-quadruplex, (11) attaching a detectable capture target to said capture tag, ( 111) attaching said divided G-quadruplex to a target nucleic acid, and (iv) detecting the detectable capture target with a method known in the art. And in another embodiment, target nucleic acids are detected using capture tags and capture targets by (1) attaching a divided G-quadruplex to a target nucleic acid, (11) associating a capture tag with said divided G-quadruplex, (111) attaching a detectable capture target to said capture tag, and (iv) detecting the capture target with a method known in the art. In these methods, capture targets that can be detected can be used, or capture targets capable of binding detectable molecules can be used. Methods of attaching capture tags to capture targets, and attaching capture targets to detectable molecules, are known in the art. In a preferred embodiment, the target nucleic acid is attached to a solid surface - any (1) before the target nucleic acid is attached to the divided G-quadruplex; or (11) after the target nucleic acid is bound to the divided G-quadruplex, but prior to detection - allowing washing of said target nucleic acid and the removal of unbound detectable targets or capture molecules prior to detection. An illustration of a target nucleic acid associated with a detectable capture target using said methods and a detectable molecule and a solid surface (i.e., preferred embodiment) - is shown in Figure 1 Mode 2.

[0033] Em outra modalidade, os métodos de detecção podem ser aprimorados se combinados com métodos secundários que (1) amplificam o sinal de etiquetas de detecção, alvos de captura detectáveis, ou moléculas detectáveis; ou (11) capturam etiquetas de detecção adicionais, alvos de captura detectáveis, ou moléculas detectáveis. Por exemplo, métodos para amplificar sinais incluem métodos para melhorar a estabilidade de etiquetas de detecção, alvos de captura detectáveis ou moléculas detectáveis (por exemplo, adição de dextrano ao HRP); e métodos para melhorar a atividade catalítica de etiquetas de detecção, alvos de captura detectáveis, ou moléculas detectáveis (por exemplo, adição de PEG para impedir a inativação de HRP). Por exemplo, métodos para capturar (ou cascatear) etiquetas de detecção adicionais, alvos de captura detectáveis, ou moléculas detectáveis incluem (i) amplificação de sinal de tiramida (TSA), (11) complexos enzimáticos avidin- biotinilados (ABC), e (ii) ensaios “branched- DNA” (bDNA). Em uma modalidade, os braços de captura de um G-quadruplexo dividido são usados para capturar (ou cascatear) etiquetas de detecção adicionais, alvos de captura detectáveis, ou moléculas detectáveis - por exemplo, ligando ácidos nucleicos de captura que (1) estão associados a etiquetas de detecção ou etiquetas de captura detectáveis, ou (11) são capazes de ligar moléculas que podem se ligar ou cascatear com moléculas detectáveis. Em outra modalidade, os braços de captura de um G-quadruplexo dividido são usados para capturar (ou cascata) G-quadruplexos divididos adicionais, que opcionalmente possuem etiquetas de detecção ou etiquetas de captura detectáveis (por exemplo, braços de captura adicionais capazes de ligar ácidos nucleicos de captura adicionais ou G-quadruplexos divididos).[0033] In another embodiment, detection methods can be improved if combined with secondary methods that (1) amplify the signal from detection tags, detectable capture targets, or detectable molecules; or (11) capture additional detection tags, detectable capture targets, or detectable molecules. For example, methods for amplifying signals include methods for improving the stability of detection tags, detectable capture targets or detectable molecules (for example, adding dextran to HRP); and methods for improving the catalytic activity of detection tags, detectable capture targets, or detectable molecules (for example, addition of PEG to prevent HRP inactivation). For example, methods to capture (or cascade) additional detection tags, detectable capture targets, or detectable molecules include (i) tyramide signal amplification (TSA), (11) avidin-biotinylated (ABC) enzyme complexes, and ( ii) “branched-DNA” (bDNA) assays. In one embodiment, the capture arms of a split G-quadruplex are used to capture (or cascade) additional detection tags, detectable capture targets, or detectable molecules - for example, by binding capture nucleic acids that (1) are associated with detection tags or detectable capture tags, or (11) are able to bind molecules that can bind or cascade with detectable molecules. In another embodiment, the capture arms of a split G-quadruplex are used to capture (or cascade) additional split G-quadruples, which optionally have detection tags or detectable capture tags (for example, additional capture arms capable of connecting additional capture nucleic acids or divided G-quadruplexes).

Métodos para Capturar Ácidos NucleicosMethods for Capturing Nucleic Acids

[0034] Os métodos de utilização de etiquetas de captura para ligar alvos de captura são conhecidos no estado da técnica, e são usados para ligar ácidos nucleicos - associados a etiquetas de captura - para capturar alvos, incluindo superfícies sólidas. Os ácidos nucleicos ligados a superfícies sólidas são usados em várias metodologias, incluindo precipitação de ácidos nucleicos, purificação de ácidos nucleicos, ensaios de “branched-DNA”,[0034] Methods of using capture tags to bind capture targets are known in the art, and are used to bind nucleic acids - associated with capture tags - to capture targets, including solid surfaces. Nucleic acids bound to solid surfaces are used in a variety of methodologies, including nucleic acid precipitation, nucleic acid purification, branched-DNA assays,

amplificação por PCR em fase sólida e amplificação de ponte em fase sólida (para sequenciamento NGS). Essas metodologias podem ser agrupadas em dois métodos de captura, em que o primeiro grupo de métodos de captura - precipitação de ácidos nucléicos e purificação de ácidos nucléicos - geralmente utiliza um ácido nucleico alvo associado a uma etiqueta de captura, que é capaz de ligar uma superfície sólida; e o segundo grupo de métodos de captura - “branched-DNA”, PCR de fase sólida, e amplificação de ponte de fase sólida - geralmente usam um ácido nucleico não alvo (que é capaz de hibridar com o ácido nucleico alvo, por exemplo, um iniciador), que está associado a uma etiqueta de captura e, portanto, capaz de ligar uma superfície sólida. Em uma modalidade da presente invenção, os G- quadruplexos divididos associados às etiquetas de captura, que são capazes de ligar ambos ácido nucleico alvo (através dos braços de ligação ao alvo) e uma superfície sólida (através de uma etiqueta de captura), podem ser usados para ligar ácidos nucleicos alvo a superfícies sólidas. Por conseguinte, nas metodologias mencionadas acima, usando ácidos nucleicos ligados a superfícies sólidas, um G-quadruplexo dividido associado a uma etiqueta de captura mais um ácido nucleico pode substituir o ácido nucleico alvo associado a uma etiqueta de captura (no primeiro grupo) e o ácido nucleico não alvo associado a uma etiqueta de captura mais um ácido nucleico (no segundo grupo) das metodologias mencionadas acima.solid phase PCR amplification and solid phase bridge amplification (for NGS sequencing). These methodologies can be grouped into two capture methods, in which the first group of capture methods - nucleic acid precipitation and nucleic acid purification - generally uses a target nucleic acid associated with a capture tag, which is capable of binding a solid surface; and the second group of capture methods - “branched-DNA”, solid-phase PCR, and solid-phase bridge amplification - generally use a non-target nucleic acid (which is capable of hybridizing to the target nucleic acid, for example, a primer), which is associated with a capture tag and therefore capable of attaching a solid surface. In one embodiment of the present invention, the split G-quadruplexes associated with the capture tags, which are capable of binding both target nucleic acid (via the target binding arms) and a solid surface (via a capture tag), can be used to bind target nucleic acids to solid surfaces. Therefore, in the methodologies mentioned above, using nucleic acids attached to solid surfaces, a divided G-quadruplex associated with a capture tag plus a nucleic acid can replace the target nucleic acid associated with a capture tag (in the first group) and the non-target nucleic acid associated with a capture tag plus a nucleic acid (in the second group) of the methodologies mentioned above.

[0035] Em uma modalidade, um G-quadruplexo dividido associado a uma etiqueta de captura pode ser usado para ligar um ácido nucleico alvo a uma superfície sólida (1) associando uma etiqueta de captura à primeira cadeia de um G-quadruplexo dividido, (ii) ligando a referida primeira cadeia e a segunda cadeia do G-quadruplexo dividido a um ácido nucleico alvo, e (iii) ligando a referida etiqueta de captura a uma superfície sólida. Em uma segunda modalidade, um G-quadruplexo dividido associado a uma etiqueta de captura pode ser usado para ligar um ácido nucleico alvo a uma superfície sólida (1) associando uma etiqueta de captura à primeira cadeia de um G- quadruplexo dividido, (11) ligando a referida etiqueta de captura a uma superfície sólida, e (111) ligando a segunda cadeia do G-quadruplexo dividido e o ácido nucleico alvo à superfície ligada à primeira cadeia do G- quadruplexo dividido. Uma ilustração de um ácido nucleico alvo associado a uma etiqueta de captura e superfície sólida usando os referidos métodos - é mostrada na Figura 1 Modalidade 4. A ilustração também mostra uma etiqueta de detecção opcional (D) na segunda cadeia do G-quadruplexo dividido, que permite a detecção do ácido nucleico alvo capturado, preferencialmente usando uma etapa adicional de lavagem antes da etapa de detecção para remover etiquetas de detecção não acopladas. Em outra modalidade, um G-quadruplexo dividido associado a uma etiqueta de captura pode ser usado para ligar ácidos nucleicos alvo a uma superfície sólida, (1) associando etiquetas de captura às primeira e segunda cadeias de um G- quadruplexo dividido, (ii) ligando as ditas primeira e segunda cadeias do G- quadruplexo dividido a um ácido nucleico alvo, e (111) ligando a dita etiqueta de captura a uma superfície sólida.[0035] In one embodiment, a divided G-quadruplex associated with a capture tag can be used to attach a target nucleic acid to a solid surface (1) by associating a capture tag with the first strand of a divided G-quadruplex, ( ii) attaching said first strand and the second strand of the divided G-quadruplex to a target nucleic acid, and (iii) attaching said capture tag to a solid surface. In a second embodiment, a divided G-quadruplex associated with a capture tag can be used to attach a target nucleic acid to a solid surface (1) by associating a capture tag with the first strand of a divided G-quadruplex, (11) attaching said capture tag to a solid surface, and (111) attaching the second strand of the divided G-quadruplex and the target nucleic acid to the surface attached to the first strand of the divided G-quadruplex. An illustration of a target nucleic acid associated with a capture tag and solid surface using the aforementioned methods - is shown in Figure 1 Mode 4. The illustration also shows an optional detection tag (D) on the second strand of the divided G-quadruplex, which allows the detection of the captured target nucleic acid, preferably using an additional washing step before the detection step to remove unbound detection tags. In another embodiment, a divided G-quadruplex associated with a capture tag can be used to attach target nucleic acids to a solid surface, (1) associating capture tags with the first and second strands of a divided G-quadruplex, (ii) attaching said first and second strands of the divided G-quadruplex to a target nucleic acid, and (111) attaching said capture tag to a solid surface.

[0036] Modalidades para ligar ácidos nucleicos a superfícies sólidas são úteis para o primeiro grupo de metodologias de captura (incluindo precipitação e purificação de ácidos nucleicos), e são úteis para o segundo grupo de metodologias de captura (incluindo PCR em fase sólida e amplificação de ponte) quando combinadas com síntese de ácidos nucleicos dirigida por molde - como métodos enzimáticos para síntese de DNA, amplificação de DNA, transcrição de DNA e síntese de RNA. Os métodos de síntese de ácidos nucleicos dirigida por molde são conhecidos no estado da técnica, e podem ser classificados em três grupos, exigindo (1) um iniciador (ou extremidade 3'-OH) para iniciação, (11) uma sequência promotora para iniciação, ou (111) nem iniciador ou promotor para iniciação. Esses requisitos para iniciadores ou promotores podem ser acomodados pelo G-quadruplexo dividido - com ou sem associação a uma etiqueta de captura - por exemplo, usando a extremidade 3-OH da segunda cadeia para iniciação, ou incorporando uma sequência promotora (por exemplo, flanqueando o braço de ligação ao alvo).[0036] Modalities for binding nucleic acids to solid surfaces are useful for the first group of capture methodologies (including precipitation and purification of nucleic acids), and are useful for the second group of capture methodologies (including solid-phase PCR and amplification bridging) when combined with template-directed nucleic acid synthesis - as enzymatic methods for DNA synthesis, DNA amplification, DNA transcription and RNA synthesis. Mold-directed nucleic acid synthesis methods are known in the art, and can be classified into three groups, requiring (1) a primer (or 3'-OH end) for initiation, (11) a promoter sequence for initiation , or (111) neither initiator nor promoter for initiation. These requirements for initiators or promoters can be accommodated by the split G-quadruplex - with or without association to a capture tag - for example, using the 3-OH end of the second chain for initiation, or incorporating a promoter sequence (for example, flanking connecting arm to the target).

[0037] Em uma modalidade, um método de síntese de ácido nucleico direcionado por molde que requer um iniciador é realizado por (1) ligar um ácido nucleico alvo a um G-quadruplexo dividido associado a uma etiqueta de captura, e ligação da etiqueta de captura a uma superfície sólida; e (11) iniciar a síntese de ácido nucleico usando a extremidade 3'-OH da segunda cadeia do G-quadruplexo dividido. Numa modalidade preferida, a extremidade 3'-OH da primeira cadeia do G-quadruplexo dividido é modificado (por exemplo, aminado) para impedir a síntese a partir da primeira cadeia. Numa segunda concretização preferida, as temperaturas para hibridação com ácido nucleico alvo e extensão enzimática estão abaixo da temperatura de fusão do G- quadruplexo. Em uma segunda modalidade, um método de síntese de ácido nucleico direcionado por molde que requer um promotor é realizado (1) ligando um ácido nucleico alvo a um G-quadruplexo dividido associado a uma etiqueta de captura e uma sequência do promotor e ligando a etiqueta de captura a uma superfície sólida; e (11) iniciando a síntese de ácido nucleico utilizando a sequência promotora associada ao Gr-quadruplexo dividido. Numa modalidade preferida, a sequência do promotor é incorporada em uma região que flanqueia o braço de ligação ao alvo. Em outra modalidade preferida, a sequência do promotor é ácido nucleico de cadeia dupla, por exemplo, formado pela hibridação de uma sequência complementar incorporada na mesma ou em uma cadeia diferente do G-quadruplexo dividido, ou pela hibridação de uma sequência complementar incorporada em um fragmento de ácido nucleico.[0037] In one embodiment, a template-directed nucleic acid synthesis method that requires a primer is performed by (1) attaching a target nucleic acid to a divided G-quadruplex associated with a capture tag, and attaching the capture to a solid surface; and (11) initiate nucleic acid synthesis using the 3'-OH end of the second strand of the divided G-quadruplex. In a preferred embodiment, the 3'-OH end of the first strand of the divided G-quadruplex is modified (e.g., amino) to prevent synthesis from the first strand. In a second preferred embodiment, the temperatures for hybridization with target nucleic acid and enzymatic extent are below the melting temperature of the G-quadruplex. In a second embodiment, a template-directed nucleic acid synthesis method that requires a promoter is performed (1) by attaching a target nucleic acid to a divided G-quadruplex associated with a capture tag and a promoter sequence and attaching the tag capture to a solid surface; and (11) initiating nucleic acid synthesis using the promoter sequence associated with the divided Gr-quadruplex. In a preferred embodiment, the promoter sequence is incorporated into a region that flanks the target binding arm. In another preferred embodiment, the promoter sequence is double-stranded nucleic acid, for example, formed by hybridizing a complementary sequence incorporated into the same or a different strand from the divided G-quadruplex, or by hybridizing a complementary sequence incorporated into a nucleic acid fragment.

[0038] A síntese de ácido nucleico dirigida por molde do ácido nucleico alvo pode ser usada para fortalecer a ligação entre o G-quadruplexo dividido e o ácido nucleico alvo. Por exemplo, se a síntese de ácido nucleico for iniciada na extremidade 3'-OH do G-quadruplexo dividido e for estendida ao longo do comprimento do ácido nucleico alvo (a jusante do G-quadruplexo dividido), ele cria um ácido nucleico complementar que está conectado ao G- quadruplexo dividido e ligado ao ácido nucleico alvo. Dependendo do comprimento do ácido nucleico alvo que está a jusante do G-quadruplexo dividido, o fragmento complementar recém-sintetizado pode ser grande e pode ser usado para fortalecer a ligação do G-quadruplexo dividido e do ácido nucleico alvo. Em uma modalidade, a ligação de um G-quadruplexo dividido a um ácido nucleico alvo é fortalecida (1) ligando o G-quadruplexo dividido a um ácido nucleico alvo e (ii) realizando a síntese de ácido nucleico direcionada por molde no ácido nucleico alvo. Em outra modalidade, uma etiqueta funcional pode ser associada a um G-quadruplexo dividido por (i) ligação do G-quadruplexo dividido a um ácido nucleico alvo e (11) execução da síntese de ácido nucleico direcionada por molde em ácido nucleico alvo utilizando nucleotídeos vinculados a etiquetas funcionais.[0038] Template-directed nucleic acid synthesis of the target nucleic acid can be used to strengthen the link between the divided G-quadruplex and the target nucleic acid. For example, if nucleic acid synthesis is initiated at the 3'-OH end of the divided G-quadruplex and is extended along the length of the target nucleic acid (downstream of the divided G-quadruplex), it creates a complementary nucleic acid that it is connected to the divided G-quadruplex and linked to the target nucleic acid. Depending on the length of the target nucleic acid that is downstream of the divided G-quadruplex, the newly synthesized complementary fragment can be large and can be used to strengthen the binding of the divided G-quadruplex and the target nucleic acid. In one embodiment, the binding of a divided G-quadruplex to a target nucleic acid is strengthened (1) by linking the divided G-quadruplex to a target nucleic acid and (ii) performing template-directed nucleic acid synthesis on the target nucleic acid . In another embodiment, a functional tag can be associated with a G-quadruplex divided by (i) binding the divided G-quadruplex to a target nucleic acid and (11) performing template-directed nucleic acid synthesis on target nucleic acid using nucleotides linked to functional tags.

[0039] O uso de G-quadruplexos divididos para a síntese de ácido nucleico direcionada por moldes possui duas vantagens principais sobre os iniciadores de cadeia simples (com sequência igual aos braços de ligação ao alvo): (1) os G-quadruplexos divididos podem ser projetados para hibridizar em temperaturas muito diferentes em comparação com os iniciadores de cadeia simples, por exemplo, diminuindo o comprimento de um braço e aumentando o comprimento do outro braço, mantendo a mesma sequência geral; e (11) G-quadruplexos divididos são mais específicos do que os iniciadores de cadeia simples porque os braços de ligação ao alvo individuais podem ser mais curtos que os iniciadores e, portanto, mais sensíveis às substituições de nucleotídeos, especialmente se um braço tiver comprimento curto.[0039] The use of split G-quadruplexes for template-directed nucleic acid synthesis has two main advantages over single-stranded primers (with the same sequence as the target binding arms): (1) the split G-quadruplexes can be designed to hybridize at very different temperatures compared to single-stranded initiators, for example, by decreasing the length of one arm and increasing the length of the other arm, maintaining the same general sequence; and (11) Divided G-quadruplexes are more specific than single-stranded primers because the individual target binding arms can be shorter than the primers and therefore more sensitive to nucleotide substitutions, especially if an arm is long I enjoy.

[0040] Exemplos de superfícies sólidas comumente usadas para ligação de ácidos nucleicos incluem lâminas de vidro, chips de silício, micro pérolas, micro esferas e substâncias sedimentáveis e ferromagnéticas, como resina de agarose e esferas de ferro. Exemplos de etiquetas (e grupos reativos correspondentes ou revestimentos em superfícies sólidas) incluem modificações de aminoácidos (e superfícies revestidas com epóxi silano ou isotiocinanato), modificações de tiol (e superfícies mercaptosilanizadas), modificações de hidrazida (e aldeído ou epóxido), biotina (e estreptavidina imobilizada), colesterol-TEG (e anticorpos anti-colesterol imobilizados) e digoxigenina NHS Ester (e anticorpos anti-digoxigenina imobilizados). Algumas etiquetas se ligam diretamente aos grupos reativos na superfície sólida (por exemplo, biotina e estreptavidina), e outras etiquetas requerem uma reação química com produtos químicos secundários para fixação. Exemplos de microesferas incluem microesferas de poliestireno, microesferas magnéticas e microesferas de sílica.[0040] Examples of solid surfaces commonly used for nucleic acid binding include glass slides, silicon chips, micro beads, micro spheres and sedimentable and ferromagnetic substances, such as agarose resin and iron spheres. Examples of labels (and corresponding reactive groups or coatings on solid surfaces) include amino acid modifications (and surfaces coated with epoxy silane or isothiocinanate), thiol modifications (and mercaptosilanized surfaces), hydrazide modifications (and aldehyde or epoxide), biotin ( and immobilized streptavidin), cholesterol-TEG (and immobilized anti-cholesterol antibodies) and digoxigenin NHS Ester (and immobilized anti-digoxigenin antibodies). Some tags bind directly to reactive groups on the solid surface (for example, biotin and streptavidin), and other tags require a chemical reaction with secondary chemicals for fixation. Examples of microspheres include polystyrene microspheres, magnetic microspheres and silica microspheres.

[0041] Os G-quadruplexos divididos são vantajosos para a captura de ácidos nucleicos alvo, incluindo (1) os G-quadruplexos divididos podem capturar seletivamente um ácido nucleico alvo com base na sequência, com especificidade de SNP; (2) G-quadruplexos divididos podem ser facilmente utilizados para a síntese de ácido nucleico direcionada por molde do ácido nucleico alvo que foi capturado; (3) o G-quadruplexo dividido pode ser facilmente desnaturado (por exemplo, termicamente, quimicamente) ou digerido (ex. em um sítio de restrição engenheirado para uma enzima de restrição) para liberar o ácido nucleico alvo que foi capturado, e (4) os G- quadruplexos divididos podem ser mais simples de modificar do que os ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos sintéticos longos e especialmente ácidos nucleicos isolado de fontes biológicas). Além disso, a eficiência da captura pode ser facilmente monitorada, por exemplo, (1) capturando um ácido nucleico alvo em uma superfície sólida com um G- quadruplexo dividido associado a uma etiqueta de detecção (ou etiqueta de captura detectável) em uma cadeia e uma etiqueta de captura na outra cadeia (Figura 1 Modalidade 4), (11) removendo (ex. lavando) a cadeia não ligada com a etiqueta de detecção, e (111) monitorando a etiqueta de detecção da segunda cadeia ligada por métodos conhecidos no estado da técnica. Alternativamente, pode-se (1) capturar um ácido nucleico alvo em uma superfície sólida com um Gr-quadruplexo dividido com uma etiqueta de detecção em uma cadeia (ou em ambas cadeias), e (11) monitorar os G- quadruplexos divididos montados por monitorar sua atividade atividade catalítica.[0041] Divided G-quadruplexes are advantageous for capturing target nucleic acids, including (1) divided G-quadruplexes can selectively capture a target nucleic acid based on the sequence, with SNP specificity; (2) Divided G-quadruplexes can be easily used for template-directed nucleic acid synthesis of the captured nucleic acid; (3) the divided G-quadruplex can be easily denatured (for example, thermally, chemically) or digested (eg at a restriction site engineered for a restriction enzyme) to release the target nucleic acid that has been captured, and (4 ) divided G-quadruplexes may be simpler to modify than nucleic acids (for example, long synthetic nucleic acids and especially nucleic acids isolated from biological sources). In addition, capture efficiency can be easily monitored, for example, (1) by capturing a target nucleic acid on a solid surface with a divided G-quadruplex associated with a detection tag (or detectable capture tag) in a chain and a capture tag on the other chain (Figure 1 Mode 4), (11) removing (eg washing) the unbound chain with the detection tag, and (111) monitoring the detection tag of the second linked chain by methods known in the state of the art. Alternatively, one can (1) capture a target nucleic acid on a solid surface with a split Gr-quadruplex with a detection tag in one strand (or both strands), and (11) monitor the split G-quadruplexes assembled by monitor your catalytic activity activity.

[0042] Em uma modalidade, a etiqueta de captura está associada a uma cadeia do G-quadruplexo por meio de um ligante ou espaçador - por exemplo, Fosforamidito C3, Hexanodiol e 1',2'-didesoxirribose e preferencialmente Trietileno-glicol ou Hexa-etilenoglicol. Nos casos em que há pouca ligação entre a etiqueta de captura e a superfície sólida - ex. devido a impedimentos estéricos, carga superficial incompatível, hidrofobicidade/hidrofilicidade incompatíveis a superfície - o ligante da etiqueta de captura pode ser mais longo. Por exemplo, o ligante pode ser mais longo adicionando moléculas ligantes adicionais ao primeiro ligante (ex. (HEG)s, que são 5 ligantes de hexa-etilenoglicol). Ou, alternativamente, o ligante pode ser feito mais longo adicionando nucleotídeos adicionais (por exemplo, dTio, que são 10 desoxitiminas) entre a etiqueta de captura e as outras partes do G-quadruplexo dividido (por exemplo, o braço de ligação ao alvo e a sequência parcial do G-quadruplexo).[0042] In one embodiment, the capture tag is associated with a chain of the G-quadruplex by means of a ligand or spacer - for example, Phosphoramidite C3, Hexanediol and 1 ', 2'-dideoxyribose and preferably Triethylene glycol or Hexa -ethylene glycol. In cases where there is little connection between the capture tag and the solid surface - ex. due to steric impediments, incompatible surface charge, hydrophobicity / hydrophilicity incompatible with the surface - the binder on the capture tag may be longer. For example, the linker can be longer by adding additional linker molecules to the first linker (eg (HEG) s, which are 5 hexa-ethylene glycol linkers). Or, alternatively, the linker can be made longer by adding additional nucleotides (eg, dTio, which are 10 deoxythymines) between the capture tag and the other parts of the split G-quadruplex (eg, the target binding arm and the partial G-quadruplex sequence).

[0043] Na presente invenção, os G-quadruplexos divididos e os ácidos nucleicos de captura podem ser utilizados em conjunto para a captura dos ácidos nucleicos alvo em superfícies sólidas. Numa concretização preferida, o G-quadruplexo dividido possui braços de captura capazes de se ligar ao ácido nucleico de captura e o ácido nucleico de captura tem uma etiqueta de captura capaz de se ligar à superfície sólida. Numa modalidade,[0043] In the present invention, divided G-quadruplexes and capture nucleic acids can be used together to capture target nucleic acids on solid surfaces. In a preferred embodiment, the split G-quadruplex has capture arms capable of binding to the capture nucleic acid and the capture nucleic acid has a capture tag capable of binding to the solid surface. In one modality,

um G-quadruplexo dividido associado a uma etiqueta de captura pode ser usado para ligar um ácido nucleico alvo a uma superfície sólida (1) associando uma etiqueta de captura a um ácido nucleico de captura, (ii) ligando a referida etiqueta de captura a um superfície sólida, (111) ligando o(s) braço(s) de captura de um G-quadruplexo dividido ao referido ácido nucleico de captura, e (iv) ligação de um ácido nucleico alvo aos braços de ligação ao alvo do referido G-quadruplexo dividido. Em uma segunda modalidade, um G- quadruplexo dividido associado a uma etiqueta de captura pode ser usado para ligar um ácido nucleico alvo a uma superfície sólida (1) associando uma etiqueta de captura a um ácido nucleico de captura, (11) ligando a referida etiqueta de captura a uma superfície sólida, (111) ligando os braços de ligação ao alvo de um G-quadruplexo dividido a um ácido nucleico alvo, e (iv) ligando os braços de captura do referido G-quadruplexo dividido ao referido ácido nucleico de captura. Uma ilustração de um ácido nucleico alvo associado a um etiqueta de captura - isto é, os braços de captura de um G- quadruplexo dividido - e uma superfície sólida usando os referidos métodos, é mostrada na Figura 1 Modalidade 5. O referido ácido nucleico alvo pode ser detectado usando um segundo G-quadruplexo associado a uma etiqueta de detecção (ou uma etiqueta de captura capaz de ligar alvos de captura detectáveis) - como mostrado na Figura | Modalidade 6.a split G-quadruplex associated with a capture tag can be used to attach a target nucleic acid to a solid surface (1) by associating a capture tag with a capture nucleic acid, (ii) attaching said capture tag to a solid surface, (111) linking the capture arm (s) of a split G-quadruplex to said capture nucleic acid, and (iv) attaching a target nucleic acid to the target binding arms of said G- divided quadruplex. In a second embodiment, a split G-quadruplex associated with a capture tag can be used to attach a target nucleic acid to a solid surface (1) by associating a capture tag with a capture nucleic acid, (11) linking said capture nucleic acid. capture tag to a solid surface, (111) attaching the target binding arms of a divided G-quadruplex to a target nucleic acid, and (iv) attaching the capture arms of said divided G-quadruplex to said nucleic acid of catch. An illustration of a target nucleic acid associated with a capture tag - that is, the capture arms of a split quadruplex G- and a solid surface using said methods, is shown in Figure 1 Mode 5. That target nucleic acid can be detected using a second G-quadruplex associated with a detection tag (or a capture tag capable of linking detectable capture targets) - as shown in Figure | Mode 6.

[0044] A presente invenção apresenta um kit e um aparato para usar G-quadruplexos divididos com, etiquetas funcionais, por exemplo, para detectar ou capturar ou direcionar ou reticular ácidos nucleicos alvo. O kit ou aparato pode ser um "point-of-care” (POC). Numa modalidade, o kit ou aparato inclui um G-quadruplexo dividido associado a uma etiqueta funcional. Em outra modalidade, o kit ou aparato inclui um G-quadruplexo dividido associado a uma etiqueta de captura, e uma superfície sólida (capaz de ligar a referida etiqueta de captura). E em outra modalidade, o kit ou aparato inclui um G-quadruplexo dividido associado a uma etiqueta de captura (capaz de ligar um ácido nucleico de captura), um ácido nucleico de captura com uma etiqueta de captura (capaz de ligar uma superfície sólida) e uma superfície sólida.[0044] The present invention features a kit and apparatus for using G-quadruplexes divided with, functional tags, for example, to detect or capture or target or cross-link target nucleic acids. The kit or apparatus may be a "point-of-care" (POC). In one embodiment, the kit or apparatus includes a divided G-quadruplex associated with a functional label. In another embodiment, the kit or apparatus includes a G-quadruplex split associated with a capture tag, and a solid surface (capable of attaching said capture tag) .And in another embodiment, the kit or apparatus includes a divided G-quadruplex associated with a capture tag (capable of attaching an acid capture nucleic acid), a capture nucleic acid with a capture tag (capable of binding a solid surface) and a solid surface.

EXAMPLES

[0045] Outras características e vantagens da invenção serão evidentes a partir dos seguintes exemplos das modalidades e das reivindicações. Exemplo 1 Forte Ligação por G-Quadruplexos divididos[0045] Other features and advantages of the invention will be evident from the following examples of the modalities and the claims. Example 1 Strong connection by split G-quadruplexes

[0046] Para observar a ligação de G-quadruplexos divididos em ácidos nucleicos alvo (na ausência de atividade catalítica do G-quadruplexo), um ácido nucleico alvo com uma etiqueta de captura foi ligado a uma superfície sólida, lavado, ligado a um G-quadruplexo dividido, lavado repetidamente e, em seguida, o G-quadruplexo dividido foi detectado. O ácido nucleico alvo utilizado tinha uma etiqueta de captura e sequência 5'- /SBiosg/NN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NAÃA CCA TTT GGG TGT CCT GAT-3' (SEQ ID NO: 1). O G-quadruplexo dividido utilizado, específico para o referido ácido nucleico alvo, compreendeu duas cadeias oligonucleotídicas, com a primeira cadeia da sequência S-AT CAG GAC AC/ISp9/GGG TTG GG-3'(SEQ ID NO: 2) e a segunda cadeia da sequência 5-GGG ETIQUETA GG/ISp9/CCA AAT GG-3'(SEQ ID NO: 3). Os oligonucleotídeos foram feitos sob encomenda pela IDT (Coralville, Iowa). Outros reagentes, salvo indicação em contrário, foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).[0046] To observe the binding of G-quadruplexes divided into target nucleic acids (in the absence of catalytic activity of the G-quadruplex), a target nucleic acid with a capture tag was attached to a solid, washed surface, attached to a G -divided quadruplex, washed repeatedly and then the divided G-quadruplex was detected. The target nucleic acid used had a capture tag and sequence 5'- / SBiosg / NN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NAÃA CCA TTT GGG TGT CCT GAT-3 '(SEQ ID NO: 1). The split G-quadruplex used, specific for said target nucleic acid, comprised two oligonucleotide chains, with the first chain of the S-AT CAG GAC AC / ISp9 / GGG TTG GG-3 'sequence (SEQ ID NO: 2) and the second strand of sequence 5-GGG LABEL GG / ISp9 / CCA AAT GG-3 '(SEQ ID NO: 3). The oligonucleotides were made to order by IDT (Coralville, Iowa). Other reagents, unless otherwise indicated, were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

[0047] O ácido nucleico alvo (100pm) foi primeiro ligado a uma superfície sólida - placas de alta capacidade revestidas com estreptavidina Pierce (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA) - por 1 hora a 37º Cem tampão de ligação (HEPES SOmMM (pH 7,4), KCl 20OmM , NaCl SOmMM, Triton X-100 a 0,02% (0,02% v/v), MgCl, SOMM). As placas foram lavadas em Tampão de Lavagem (TBS, BSA a 0,1%, Tween-20 a 0,05%) e, em seguida,[0047] The target nucleic acid (100pm) was first bound to a solid surface - high capacity plates coated with streptavidin Pierce (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA) - for 1 hour at 37º One hundred binding buffer (HEPES SOmMM (pH 7.4), 20OmM KCl, SOmMM NaCl, 0.02% (0.02% v / v) Triton X-100, MgCl, SOMM). The plates were washed in Wash Buffer (TBS, 0.1% BSA, 0.05% Tween-20) and then

ligadas com G-quadruplexo dividido 100pm por 30 minutos a 25º C em Tampão de Ligação. As placas foram (1) lavadas uma vez ou (11) lavadas uma vez, descansadas por 30 minutos e lavadas novamente uma vez. Para observar a ligação, a atividade catalítica do G-quadruplexo dividido foi desencadeada em Tampão de Ligação suplementado com 125mM de hemina, IMM de H2O2, IMM de ABTS; e a absorvância de 420nm do produto resultante foi medida em um espectrofotômetro SpectraMax Plus 384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Os resultados são apresentados na Tabela 1 e demonstram que os G-quadruplexos divididos ligam os ácidos nucleicos alvo na ausência de atividade catalítica - e a ligação é estável após uma lavagem ou duas lavagens com uma etapa de descanso adicionada. TABELA | Efeito das lavagens na ligação do G-quadruplexo dividido aos ácidos nucleicos alvo Lo = = a | Ligação Cooperativa por G-Quadruplexos divididosconnected with G-quadruplex divided 100pm for 30 minutes at 25º C in Connection Buffer. The plates were (1) washed once or (11) washed once, rested for 30 minutes and washed again once. To observe the binding, the catalytic activity of the divided G-quadruplex was triggered in Binding Buffer supplemented with 125mM hemin, IMO H2O2, IMM ABTS; and the 420nm absorbance of the resulting product was measured on a SpectraMax Plus 384 spectrophotometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). The results are shown in Table 1 and demonstrate that the divided G-quadruplexes bind target nucleic acids in the absence of catalytic activity - and the binding is stable after one wash or two washes with an added rest step. TABLE | Effect of washes on binding of divided G-quadruplex to target nucleic acids Lo = = a | Cooperative Liaison via Divided G-Quadruplexes

[0048] A forte ligação sugere que as duas cadeias do G-quadruplexo dividido (na ligação do ácido nucleico alvo) se ligam através da formação do G-quadruplexo, e essa ligação estabiliza ainda mais cada cadeia no ácido nucleico alvo. Para determinar se a ligação das duas cadeias do G- quadruplexo dividido no alvo é cooperativa, um ácido nucleico alvo com uma etiqueta de captura (SEQ ID NO: 1) (100pm) foi ligado a uma superfície sólida por 30 minutos a 25ºC, lavado e depois ligado por 30 minutos a 25ºC com (1) 100pm da primeira cadeia de um G-quadruplexo dividido (SEQ ID NO: 2) (aqui denominada poço 1) ou (11) 100pm da segunda cadeia de um G- quadruplexo dividido (SEQ ID NO: 3) (aqui denominado poço 2) ou (iii) ambas as cadeias de um G-quadruplexo dividido (SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3) (aqui chamado poço 3). Posteriormente, o sobrenadante do poço 1[0048] The strong link suggests that the two strands of the divided G-quadruplex (at the target nucleic acid link) link through the formation of the G-quadruplex, and that link further stabilizes each strand in the target nucleic acid. To determine whether the binding of the two strands of the divided G-quadruplex on the target is cooperative, a target nucleic acid with a capture tag (SEQ ID NO: 1) (100pm) was attached to a solid surface for 30 minutes at 25 ° C, washed and then switched on for 30 minutes at 25ºC with (1) 100pm of the first strand of a split G-quadruplex (SEQ ID NO: 2) (hereinafter well 1) or (11) 100pm of the second strand of a split G-quadruplex ( SEQ ID NO: 3) (here called well 2) or (iii) both strands of a divided G-quadruplex (SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3) (here called well 3). Subsequently, the supernatant from well 1

(contendo SEQ ID NO: 2) e do poço 2 (contendo SEQ ID NO: 3) foi transferido para o poço A, contendo 100pm de ácido nucleico alvo da sequência S-AA CCA TTT GGG TGT CCT GAT-3'(SEQ ID NO: 4); e o sobrenadante do poço 3 (contendo SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3) foi transferido para o poço b contendo 100pm de ácido nucleico alvo da sequência SED ID NO: 4. Para observar a ligação, a atividade catalítica dos G-quadruplexos divididos não ligados foram acionados e a absorvância de 420 nm do produto resultante foi medida em um espectrofotômetro. Os resultados são apresentados na Tabela 2 e indicam ligação cooperativa - ou seja, mais cadeias são retidas nos ácidos nucleicos alvo quando as cadeias são ligadas em conjunto (por causa da ligação cooperativa) (ex. Poço 3) e não separadamente (ex. Poço | e poço 2). TABELA 2 Mais retenção de cadeias G-quadruplexo divididos ligados em conjunto do que em separado Exemplo 2 Detecção de ácido nucleico alvo por G-Quadruplexo dividido com etiqueta de captura(containing SEQ ID NO: 2) and from well 2 (containing SEQ ID NO: 3) was transferred to well A, containing 100pm of target nucleic acid from the sequence S-AA CCA TTT GGG TGT CCT GAT-3 '(SEQ ID NO: 4); and the supernatant from well 3 (containing SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3) was transferred to well b containing 100pm of target nucleic acid from the sequence SED ID NO: 4. To observe the binding, the catalytic activity of G - unbound split quadruplexes were activated and the absorbance of 420 nm of the resulting product was measured on a spectrophotometer. The results are shown in Table 2 and indicate cooperative linkage - that is, more strands are retained in the target nucleic acids when the strands are linked together (because of cooperative linkage) (eg Well 3) and not separately (eg Well | and well 2). TABLE 2 More retention of split G-quadruplex chains linked together than separately Example 2 Detection of target nucleic acid by split G-Quadruplex with capture tag

[0049] A ligação forte e a ligação cooperativa observadas no Exemplo 1 - na ausência de atividade catalítica do G-quadruplexo - indicam que os G- quadruplexos divididos se ligam de maneira estável aos ácidos nucleicos alvo e, portanto, eles também podem ser usados para associar outras moléculas, como etiquetas funcionais (ligado ou incorporado no G-quadruplexo dividido) para ácidos nucleicos alvo. Para demonstrar que uma etiqueta de captura de um G-quadruplexo dividido pode ser associada a um ácido nucleico alvo - e além disso, um alvo de captura detectável pode ser ligado à etiqueta de captura para detecção do ácido nucleico alvo - um ácido nucleico alvo com uma etiqueta de captura (SEQ ID NO: 1) foi ligada a uma superfície sólida, lavada, ligada com um G-quadruplexo dividido com uma etiqueta de captura DIG (SEQ ID NO: 2 e sequência 5-GGG ETIQUETA GG/iSp9/ CCA AAT GG/3DiG N/-3'(SEQ ID NO: 5)), lavado, ligado por 30 minutos a 25º C com anticorpo anti-DIG de coelho (Thermo Fischer Scientific), lavado, ligado por minutos a 25º*C com anticorpo anti-coelho conjugado com HRP (Sigma- Aldrich), lavado e, em seguida, a atividade catalítica do HRP foi desencadeada em Tampão de Ligação suplementado com ImMM de H2O; e ImMM ABTS, e a absorvância de 420 nm do produto resultante foi medida em um espectrofotômetro. (O método se parece muito com a Figura 1 da Modalidade 2, exceto que ele usa dois anticorpos em vez de um para detecção). Outras soluções e métodos são os mesmos do Exemplo 1, salvo indicação em contrário. Os resultados são apresentados na Tabela 3 e demonstram o uso de G-quadruplexos divididos para (1) associar etiquetas funcionais e, em particular, etiquetas de captura, para marcar ácidos nucleicos, (11) associar alvos de captura para marcar ácidos nucleicos e (111) associar moléculas detectáveis para marcar os ácidos nucleicos através da ligação a etiquetas de captura G-quadruplexo dividido. TABELA 3 Detecção de ácido nucleico alvo usando G-Quadruplexo dividido com etiqueta de captura Exemplo 3 Detecção de ácido nucléico alvo por G-quadruplexo dividido com braços de captura[0049] The strong bond and cooperative bond observed in Example 1 - in the absence of catalytic activity of the G-quadruplex - indicate that the divided G-quadruplexes bind stably to the target nucleic acids and therefore they can also be used to associate other molecules, such as functional tags (attached or embedded in the divided G-quadruplex) to target nucleic acids. To demonstrate that a capture tag from a divided G-quadruplex can be associated with a target nucleic acid - and in addition, a detectable capture target can be attached to the capture tag for detection of the target nucleic acid - a target nucleic acid with a capture tag (SEQ ID NO: 1) was attached to a solid, washed surface, linked with a divided G-quadruplex with a DIG capture tag (SEQ ID NO: 2 and 5-GGG sequence LABEL GG / iSp9 / CCA AAT GG / 3DiG N / -3 '(SEQ ID NO: 5)), washed, bound for 30 minutes at 25º C with rabbit anti-DIG antibody (Thermo Fischer Scientific), washed, bound for minutes at 25º * C with anti-rabbit antibody conjugated with HRP (Sigma-Aldrich), washed and then the catalytic activity of HRP was triggered in Binding Buffer supplemented with ImMM H2O; and ImMM ABTS, and the absorbance of 420 nm of the resulting product was measured on a spectrophotometer. (The method looks a lot like Figure 1 of Mode 2, except that it uses two antibodies instead of one for detection). Other solutions and methods are the same as in Example 1, unless otherwise specified. The results are shown in Table 3 and demonstrate the use of divided G-quadruplexes to (1) associate functional tags and, in particular, capture tags, to target nucleic acids, (11) associate capture targets to target nucleic acids and ( 111) associating detectable molecules to label nucleic acids by binding to split G-quadruplex capture tags. TABLE 3 Detection of target nucleic acid using split G-quadruplex with capture tag Example 3 Detection of target nucleic acid by split G-quadruplex with capture arms

[0050] Os Gr-quadruplexos divididos podem ser projetados com braços adicionais de ligação ao alvo (aqui chamados braços de captura), que são capazes de se ligar a ácidos nucleicos alvo adicionais (aqui chamados ácidos nucleicos de captura). No exemplo a seguir, um G-quadruplexo dividido com dois braços alvo e dois braços de captura foi projetado [5-AT CAG GAC AC /iSp9/ GGG TTG GG /iSp9/ ATT AAG TGT-3' (SEQ ID NO: 6) e S-GGC CAG TTT CAT TTG AGC /iSp9/ GGG ETIQUETA GG /iSp9/ CCA AAT GG-3 '(SEQ ID NO:7)], que foi capaz de ligar dois ácidos nucleicos de captura, ou seja, duas cadeias de um segundo G-quadruplexo dividido de sequência [5-ACA CTT AAT /iSp9/ GGG TTG GG-3'(SEQ ID NO: 8) e 5- GGG ETIQUETA GG /iSp9/ GCT CAA ATG AAA CTG CCC- 3' (SEQ ID NO: 9)]. Para demonstrar a metodologia, um ácido nucleico alvo com uma etiqueta de captura (SEQ ID NO: 1) foi ligado a uma superfície sólida, lavado, ligado com um G-quadruplex dividido com dois braços-alvo e dois braços de captura (SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7), lavada e ligada com dois ácidos nucleicos de captura que também eram cadeias de um segundo G- quadruplexo dividido (SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9), que é capaz de se montar em um G-quadruplexo funcional (veja a Figura 1 Modalidade 2). TABELA 4 Detecção de um Ácido Nucleico de Captura - um 2º G-Quadruplexo dividido Lo — | a ||[0050] Divided Gr-quadruplexes can be designed with additional target binding arms (here called capture arms), which are capable of binding additional target nucleic acids (here called capture nucleic acids). In the following example, a split G-quadruplex with two target arms and two capture arms was designed [5-AT CAG GAC AC / iSp9 / GGG TTG GG / iSp9 / ATT AAG TGT-3 '(SEQ ID NO: 6) and S-GGC CAG TTT CAT TTG AGC / iSp9 / GGG LABEL GG / iSp9 / CCA AAT GG-3 '(SEQ ID NO: 7)], which was able to link two capture nucleic acids, that is, two strands of a second split sequence G-quadruplex [5-ACA CTT AAT / iSp9 / GGG TTG GG-3 '(SEQ ID NO: 8) and 5- GGG LABEL GG / iSp9 / GCT CAA ATG AAA CTG CCC-3' (SEQ ID NO: 9)]. To demonstrate the methodology, a target nucleic acid with a capture tag (SEQ ID NO: 1) was attached to a solid, washed surface, attached with a split G-quadruplex with two target arms and two capture arms (SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7), washed and ligated with two capture nucleic acids that were also strands of a second split quadruplex G (SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9), which is capable of mount on a functional G-quadruplex (see Figure 1 Mode 2). TABLE 4 Detection of a Capture Nucleic Acid - a 2nd G-Quadruplex divided Lo - | a ||

[0051] Para observar a ligação dos ácidos nucleicos capturados, foi desencadeada a atividade catalítica de ambos os G-quadruplexos divididos e a absorbância de 420nm do produto resultante foi medida em um espectrofotômetro. Outras soluções e métodos são os mesmos do Exemplo 1, salvo indicação em contrário. Os resultados são apresentados na Tabela 4 acima e demonstram o uso de braços de captura em G-quadruplexos divididos para capturar outros ácidos nucleicos (isto é, ácidos nucléicos de captura) e o uso dos referidos ácidos nucleicos de captura para a detecção de ácidos nucleicos alvo. Esta abordagem pode ser usada com outros tipos de ácidos nucleicos detectáveis no lugar do segundo G-quadruplexo, por exemplo,[0051] To observe the binding of the captured nucleic acids, the catalytic activity of both divided G-quadruplexes was triggered and the absorbance of 420nm of the resulting product was measured in a spectrophotometer. Other solutions and methods are the same as in Example 1, unless otherwise specified. The results are presented in Table 4 above and demonstrate the use of capture arms in divided G-quadruplexes to capture other nucleic acids (ie, capture nucleic acids) and the use of said capture nucleic acids for the detection of nucleic acids target. This approach can be used with other types of detectable nucleic acids in place of the second G-quadruplex, for example,

ácidos nucleicos com etiquetas de detecção e ácidos nucleicos com etiquetas de captura capazes de ligar moléculas detectáveis. A abordagem também pode ser usada com ácidos nucleicos de captura associados a outros tipos de etiquetas funcionais (por exemplo, etiquetas de captura, etiquetas alvo, etiquetas reticuladas etc.), que podem ser usados para a captura, marcação ou reticulação de ácidos nucleicos alvo. Exemplo 4 Captura de ácido nucleico alvo por G-Quadruplexo dividido com etiqueta de capturanucleic acids with detection tags and nucleic acids with capture tags capable of binding detectable molecules. The approach can also be used with capture nucleic acids associated with other types of functional tags (for example, capture tags, target tags, cross-linked tags, etc.), which can be used for the capture, tagging or cross-linking of target nucleic acids . Example 4 Capture of target nucleic acid by split G-Quadruplex with capture tag

[0052] Vários tipos de etiquetas de captura são capazes de ligar superfícies sólidas. Essas etiquetas de captura, associadas aos G-quadruplexos divididos, podem ser usadas para ligar G-quadruplexes divididos a superfícies sólidas. Além disso, estes G-quadruplexos divididos, capazes de ligar ácidos nucleicos alvo, podem ser utilizados para ligar (capturar) ácidos nucleicos alvo a superfícies sólidas. Para demonstrar que os G-quadruplexos divididos podem ser usados para capturar ácidos nucleicos alvo em superfícies sólidas, uma cadeia de um G-quadrúplexo dividido com uma etiqueta de captura de biotina [5'-/SBiosG/ AT CAG GAC AC /iSp9/ GGG TTG GG- 3'(SEQ ID NO: 10)] foi ligada a uma superfície sólida, lavada, ligada com um ácido nucleico alvo (SEQ ID NO: 4) e a segunda cadeia do G-quadruplexo com uma etiqueta de captura DIG (SEQ ID NO : 5), lavado, ligado ao anticorpo anti-DIG de coelho, lavado, ligado ao anticorpo anti-coelho conjugado ao HRFP, lavado e, em seguida, a atividade catalítica do HRP foi desencadeada no Tampão de Ligação suplementado com IMM de H202 e ImMM ABTS, e à absorvância de 420nm do produto resultante foi medida em um espectrofotômetro. O método é semelhante à Figura 1 da Modalidade 4, com a etiqueta de detecção desenhada substituída por uma etiqueta de captura, capaz de se ligar a um anticorpo (que é capaz de se ligar a um 2º anticorpo). Outras soluções e métodos são os mesmos do Exemplo 2, salvo indicação em contrário. Os resultados são apresentados na Tabela 5 e demonstram o uso de G-quadruplexos divididos para capturar ácidos nucleicos alvo em superfícies sólidas. TABELA 5 Captura de um ácido nucleico alvo por G-Quadruplexo dividido com etiqueta de captura Exemplo 5 Captura de ácido nucleico alvo montado + G-quadruplexo dividido[0052] Various types of capture tags are capable of bonding solid surfaces. These capture tags, associated with the divided G-quadruplexes, can be used to link divided G-quadruplexes to solid surfaces. In addition, these divided G-quadruplexes, capable of binding target nucleic acids, can be used to bind (capture) target nucleic acids to solid surfaces. To demonstrate that divided G-quadruplexes can be used to capture target nucleic acids on solid surfaces, a split G-quadruplex chain with a biotin capture tag [5 '- / SBiosG / AT CAG GAC AC / iSp9 / GGG TTG GG-3 '(SEQ ID NO: 10)] was attached to a washed, solid surface, ligated with a target nucleic acid (SEQ ID NO: 4) and the second G-quadruplex strand with a DIG capture tag ( SEQ ID NO: 5), washed, bound to the rabbit anti-DIG antibody, washed, bound to the HRFP-conjugated anti-rabbit antibody, washed, and then the catalytic activity of the HRP was triggered in the Link Buffer supplemented with IMM H202 and ImMM ABTS, and the absorbance of 420nm of the resulting product was measured on a spectrophotometer. The method is similar to Figure 1 of Mode 4, with the drawn detection tag replaced by a capture tag, capable of binding an antibody (which is capable of binding a 2nd antibody). Other solutions and methods are the same as in Example 2, unless otherwise specified. The results are shown in Table 5 and demonstrate the use of divided G-quadruplexes to capture target nucleic acids on solid surfaces. TABLE 5 Capture of a target nucleic acid by split G-Quadruplex with capture tag Example 5 Capture of assembled target nucleic acid + split G-quadruplex

[0053] Uma segunda abordagem para capturar ácidos nucleicos alvo em superfícies sólidas liga G-quadruplexos divididos (com etiquetas de captura) aos ácidos nucleicos alvo e, em seguida, liga o (etiqueta de captura com o) complexo montado a uma superfície sólida. Essa abordagem pode ser otimizada usando uma quantidade menor da cadeia de G-quadruplexo dividido com a etiqueta de captura em relação a sua outra cadeia. Para demonstrar essa abordagem, um G-quadruplex dividido com etiquetas de captura de biotina e DIG (25pm da SEQ ID NO: 10 e 100pm da SEQ ID NO: 5) foi misturado por 60 minutos com 100pm do ácido nucleico alvo e depois ligado a um superfície sólida (revestida com avidina). Os complexos montados ligados foram então lavados, ligados com anticorpo anti-DIG de coelho, lavados, ligados com anticorpo anti-coelho conjugado com HRP, lavados e, em seguida, a atividade catalítica do HRP foi desencadeada em Tampão de Ligação suplementado com IMM de H;yO; e INM ABTS e a absorvância de 420nm do produto resultante foram medidos em um espectrofotômetro. Outras soluções e métodos são os mesmos do Exemplo 4, salvo indicação em contrário. Os resultados são apresentados na Tabela 6 e demonstram uma segunda abordagem para capturar ácidos nucleicos alvo em superfícies sólidas usando G-quadruplexos divididos.[0053] A second approach to capture target nucleic acids on solid surfaces binds divided G-quadruplexes (with capture tags) to the target nucleic acids and then binds the (capture tag with) complex mounted to a solid surface. This approach can be optimized by using a smaller amount of the G-quadruplex chain divided with the capture tag in relation to its other chain. To demonstrate this approach, a split G-quadruplex with biotin and DIG capture tags (25pm SEQ ID NO: 10 and 100pm SEQ ID NO: 5) was mixed for 60 minutes with 100pm of the target nucleic acid and then bound to a solid surface (coated with avidin). The bound assembled complexes were then washed, ligated with rabbit anti-DIG antibody, washed, ligated with HRP-conjugated anti-rabbit antibody, washed and then the HRP catalytic activity was triggered in Binding Buffer supplemented with IMM H; yO; and INM ABTS and the absorbance of 420nm of the resulting product were measured on a spectrophotometer. Other solutions and methods are the same as in Example 4, unless otherwise specified. The results are shown in Table 6 and demonstrate a second approach to capture target nucleic acids on solid surfaces using divided G-quadruplexes.

TABELA 6 Captura de Ácido Nucleico Alvo Montado/ G-Quadruplexo dividido com Etiqueta de Captura O |TABLE 6 Capture of Targeted Nucleic Acid / G-Quadruplex divided with Capture Label O |

Claims

1. Method of associating a tag with a nucleic acid, characterized by the fact that it comprises associating the tag with a divided G-quadruplex, and binding of the divided G-quadruplex to the nucleic acid.

Method according to claim 1, characterized in that it additionally comprises carrying out nucleic acid synthesis directed by the nucleic acid template.

3. Method according to claim 1, characterized by the fact that the association step is carried out by bonding or embedding the label on a split G-quadruplex tape.

4. Method according to claim 1, characterized by the fact that the association step is carried out by connecting or incorporating the label into two strips of the divided G-quadruplex.

Method according to claim 1, characterized in that the label is a binding chemical, a fluorophore, a detectable enzyme, a detectable particle, or a nucleotide analog.

6. Method according to claim 1, characterized in that the tag is a detection tag, a capture tag, a target tag or a cross-linking tag.

7. Method according to claim 6, characterized by the fact that the capture tag is a capture arm.

8. Method according to claim 1, characterized by the fact that the tag is associated with the G-quadruplex divided by the template-directed nucleic acid synthesis.

9. Method for detecting a nucleic acid, characterized by the fact that it comprises associating a detection tag or capture tag with a divided G-quadruplex, binding the divided G-quadruplex to the nucleic acid, and detecting the detection tag or tag capture.

10. Method according to claim 9, characterized in that the capture tag is detected by connecting a detectable capture target to the capture tag, and detection of the detectable capture target.

Method according to claim 9, characterized in that it additionally comprises the attachment of the nucleic acid to a solid surface.

12. Method according to claim 11, characterized by the fact that it comprises association of a detection tag or capture tag with a divided G-quadruplex, connection of the capture tag if present to a detectable capture target, connection of the G - quadruplex divided to a nucleic acid, binding of the nucleic acid to a solid surface, washing the solid surface to remove unbound molecules, and detecting the attached detection tag or the detectable capture target.

13. Method according to claim 9, characterized by the fact that the detection tag or capture tag is associated with the G-quadruplex divided by the template-directed nucleic acid synthesis.

14. Method for capturing a nucleic acid, characterized by the fact that it comprises associating a capture tag with a divided G-quadruplex, attaching the divided G-quadruplex to the nucleic acid and attaching the capture tag to a capture target.

15. Method according to claim 14, characterized in that the capture target is a nucleic acid, a molecule that can be detected, a molecule that can bind to other molecules or a solid surface.

16. Method according to claim 15, characterized by the fact that the capture target is a solid surface.

17. Method according to claim 15, characterized in that the capture tag is a capture arm, and the capture target is a capture nucleic acid.

Method according to claim 17, characterized in that it additionally comprises the attachment of the capture nucleic acid to a solid surface.

19. Method according to claim 14, characterized in that the divided G-quadruplex has a detection tag or a second capture tag capable of binding a detectable capture target.

20. Method according to claim 14, characterized in that the capture tag is associated with the G-quadruplex divided by the template-directed nucleic acid synthesis.

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