BR112019027679A2

BR112019027679A2 - método para a obtenção de um produto de levedura com alta concentração de nucleotídeos

Info

Publication number: BR112019027679A2
Application number: BR112019027679-3A
Authority: BR
Inventors: Sergio Atares Real; Joaquin Romero Lopez; Ignasi Salaet Madorran; María Ferrer Gines; Miguel Angel Naranjo Olivero; Tula Del Carmen Yance Chavez; Rosa Aligue Alemany
Original assignee: Fertinagro Biotech, S.L.
Priority date: 2017-06-27
Filing date: 2017-06-27
Publication date: 2020-09-15
Also published as: EP3647431A1; EP3647431A4; WO2019002634A1

Abstract

A presente invenção fornece um método para a obtenção de um produto de levedura com uma alta concentração de nucleotídeos, em particular com uma riqueza em nucleotídeos superior a 80% em peso. O método se baseia essencialmente em realizar, a partir de um produto de partida rico em nucleotídeos, tal como uma levedura, uma primeira digestão enzimática com pepsina na presença de íons ferro e uma segunda digestão enzimática com um agente quelante de ferro, de maneira a se obter um produto final de levedura com uma alta concentração de nucleotídeos, em particular superior a 80% em peso.

Description

MÉTODO PARA A OBTENÇÃO DE UM PRODUTO DE LEVEDURA COM ALTA CONCENTRAÇÃO DE NUCLEOTÍDEOS CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção se refere a um método para a obtenção de um produto de levedura com uma alta concentração de nucleotídeos, em particular com uma riqueza em nucleotídeos superior a 80% em peso.

[0002] O método da invenção se baseia essencialmente em realizar, a partir de um produto de partida rico em nucleotídeos, tal como uma levedura, uma primeira digestão enzimática com pepsina na presença de íons ferro e uma segunda digestão enzimática com um agente quelante de ferro, de maneira a se obter um produto final de levedura com uma alta concentração de nucleotídeos, em particular superior a 80% em peso.

DESCRIÇÃO DO ESTADO DA TÉCNICA

[0003] As técnicas de agricultura intensiva têm como finalidade aumentar o rendimento dos cultivos e nelas são empregados insumos, tais como fertilizantes químicos, pesticidas e herbicidas que são conhecidos por serem prejudiciais ao meio ambiente e por representarem risco à saúde humana. Com o objetivo de reduzir o uso de fertilizantes químicos, há no mercado, por exemplo, os produtos denominados “orgânicos”, devido à sua origem biológica, tais como produtos de compostagem, “microrganismos fixadores de nitrogênio, microrganismos solubilizadores de nutrientes, como fósforo e potássio etc.

[0004] Por outro lado, a elaboração e a aplicação de inoculantes baseados em diversas espécies microbianas (biofertilizantes) é uma prática bem conhecida na agricultura. Assim, o emprego de leveduras como biofertiizantes é muito interessante, já que são uma fonte rica em vitaminas, especialmente vitaminas do complexo B, constituem uma fonte natural de aminoácidos e proteínas e também, são uma fonte muito rica em ferro (vide, por exemplo, “Vegetative growth, chemical composition, and flavonoids content of Azadirachta indica plants as affected by application of yeast natural extract”, Lobna S. Taha et al., Journal of Applied Pharmaceutical Science Vol. 6 (04), pp. 093-097, abril, 2016; Mady, M.A,, “Effect of foliar application with yeast extract and zinc on fruit setting and yield of faba bean” (Vicia faba L), J. Biol. Chem. Environ. Sci., 2009, Vol. 4(2): 109-127).

[0005] Além disso, certas leveduras sintetizam sustâncias antimicrobianas, fatores de crescimento vegetal e citocinas estimulantes da divisão celular (Barnet et al. 1990; El-Desouky et al. 1998; Ahmad et al. 2014). As leveduras representam uma fonte abundante e confiável de compostos bioativos, os quais conferem propriedades como a promoção do crescimento vegetal e/ou a proteção contra diversos tipos de estresse, tanto bióticos como abióticos (Hanafy et al., “Effect of Some Natural Extracts on Growth and Chemical Constituents of Schefflera arboricola Plants”, Journal of Horticultural Science & Ornamental Plants 4 (1): 26- 33, 2012; Hammad & Ali 2014; Abdelhamid et al. 2014; Kowalczy K & Zielony T 2008; Mohamed 2006; Shalaby & El-Ramady 2014), no campo da agricultura sustentável.

[0006] O uso de extratos de leveduras e de leveduras já é conhecido na indústria de fertilizantes. Nesse sentido, vide, por exemplo, o documento CN 1966663 (“Composite microorganism foliage fertilizer bacteria agent and its producing method and use”) que descreve um agente microbiano que é composto por Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus plantarum, Mucor racemosus e Aspergillus oryzae, e que é usado como fertilizante foliar para promover o crescimento das plantas de raiz e folhas ao melhorar os solos cultivados e ao aumentar o rendimento dos cultivos.

[0007] As células de levedura têm uma composição química de aproximadamente 40% de proteínas, 15% de ácidos nucleicos, 25% de polissacarídeos, 15% de lipídios e 5% de compostos hidrossolúveis, como nucleotídeos, aminoácidos, açúcares, fatores de rendimento e enzimas, entre outras (PÉREZ, M., (2000), "Obtención de un hidrolizado de crema de levadura de destileria y evaluación de su actividad prebiótica”, Universidad Agraria de la Habana, Cuba, 2000).

[0008] Um dos componentes celulares das leveduras de interesse especial são os nucleotídeos. Dada a importância desses componentes na agricultura, seria desejável, e constitui um objetivo da presente invenção, fornecer um método que permitiria a obtenção de um produto riquíssimo em nucleotídeos a partir de matérias-primas ricas nesses componentes e de fácil disponibilidade, especialmente a partir de leveduras.

[0009] No documento ES 2 004 241, por exemplo, descreve-se um método para preparar um extrato de levedura Candida utiis CS 7529 (FERM BP-1656) ou Candida utiis CSB 6316 (FERM BP-1657) que contém 5'-IMP (inosina 5'- monofosfato), 5'GMP (guanosina 5'-monofosfato) naturais ou similares, em uma alta concentração, a partir de um extrato que contém RNA obtido a partir de células de levedura viáveis ricas em RNA, em temperaturas de 80 a 120ºC, obtendo-se um extrato contendo RNA e tratando-se posteriormente o extrato com 5"- fosfodiesterase. O extrato de levedura assim obtido tem um sabor melhorado.

OBJETIVOS DA INVENÇÃO

[0010] De acordo com o objetivo descrito anteriormente, a invenção fornece um método para a obtenção de um produto riquíssimo em nucleotídeos a partir de leveduras. O método se baseia essencialmente em realizar, a partir de um produto de partida rico em nucleotídeos, corpos celulares de uma levedura, uma primeira digestão enzimática com pepsina na presença de íons ferro e uma segunda digestão enzimática com um agente quelante de Fe, de maneira a se obter um produto final de levedura com uma alta concentração de nucleotídeos, em particular superior a 80% em peso.

[0011] Na presente descrição, os conceitos “levedura” e “corpos celulares de levedura” são empregados como sinônimos, salvo se especificado de outra maneira.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0012] A Figura | apresenta o resultado de uma eletroforese em gel de agarose a 0,8%, validando a digestão de diversos DNA e RNA por uma pepsina suína comercial. Pistas 1, 2: DNA de esperma de salmão; Pistas 3, 4: ADNA; Pistas 5, 6: pET-28a; Pistas 7, 8: M13mp18; Pistas 9, 10: escada de RNA. Outras condições: 4,0 mg/ml de pepsina, tampão de NaHszPO, (25 mM, pH 3,8, incluindo NaCl 200 mM), 37ºC, 5h. Para o RNA, o tempo de digestão foi de 1 hora (Fonte: Liu, Y., et al.

(2015), "Digestion of Nucleic Acids Starts in the Stomach”. Scientific Reports, 5, 11936);

[0013] A Figura 2 apresenta o resultado da eletroforese de um DNA plasmídico (DNAp) empregando diferentes concentrações de íons ferro e de cloreto de sódio e de cálcio (controle) como comparação, a fim de validar as diferentes concentrações de íons de ferro (Fe?) capazes de inibir a atividade de DNAse da pepsina comparativamente. Solução tampão, pH 2,5, 5h, a 37ºC.

[0014] A Figura 3 apresenta o resultado da eletroforese de corpos de leveduras, sem DNA plasmídico empregando diferentes concentrações de íons ferro e de cloreto de sódio e de cálcio (controle) como comparação, demostrando a maior inibição por parte dos íons ferro a) e conservando sua atividade de protease b).

[0015] A Figura 4 ilustra o efeito quelante sobre os íons ferro do EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) em DNAp.

[0016] A Figura 5 ilustra o efeito quelante sobre os íons ferro do EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) em corpos de leveduras.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0017] Especificamente, o método da presente invenção inclui as seguintes etapas: a. uma primeira digestão enzimática de corpos celulares de levedura realizada por pepsina na presença de íons Fe?'/Fe*', como agente inibidor da atividade de DNAse da pepsina, para realizar uma digestão seletiva das proteínas, mantendo- se o DNA dos ditos corpos celulares sem digestão; b. separação das partes solúveis das insolúveis, onde se encontra o DNA, mediante filtração ou centrifugação; c. uma segunda digestão enzimática realizada mediante a incorporação de um agente quelante de Fe com o objetivo de impedir que o íon Fe?*/Fe** possa inibir a ação da pepsina sobre o DNA; e d. separação das partes insolúveis das solúveis, onde se encontram os nucleotídeos.

[0018] Ousode pepsinana primeira digestão enzimática do método é decorrente de sua capacidade de digerir tanto proteínas quanto DNA (Liu, Y., et al. (2015), "Digestion of Nucleic Acids Starts in the Stomach”. Scientific Reports, 5, 11936; Zhang Y, et al. (2016), "The effects of food components on the digestion of DNA by pepsin”, International Journal of Food Sciences and Nutrition 7, 67, 2016, vide a Figura 1). Essa capacidade da pepsina sobre o DNA é inibida pela adição ao meio de determinados sais como NaCl, KCl, MgCl; e CaCl; em concentrações que variam entre 100 e 500 mM.

[0019] Conforme mencionado acima, na etapa a) do método da invenção são primeiramente digeridos os corpos celulares de levedura na presença de uma concentração de íon Fe?'/Fe?*' com o objetivo de inibir a capacidade da pepsina de digerir o DNA (capacidade de DNAse).

[0020] Na presente invenção, o uso do íon Fe?/Fe?** como inibidor da capacidade de digestão que a pepsina tem sobre o DNA se justifica por sua capacidade até 100 vezes mais potente do que qualquer sal descrito até o momento (NaCl, CaCl, vide a Figura 3).

[0021] Em seguida, separam-se os insolúveis que contêm o DNA, o qual permanece intacto nos insolúveis, na etapa b).

[0022] A próxima etapa c) é a incorporação de um agente quelante de Fe?'/Fe?'; dessa forma, os íons Fe?'/Fe?' já não estão disponíveis e a ação inibidora sobre a pepsina não pode ser realizada, com a qual pode-se iniciar a digestão do DNA.

[0023] Na etapa d), os solúveis são novamente separados dos insolúveis, sendo que nessa etapa os nucleotídeos são encontrados nos solúveis.

[0024] O método permite a obtenção de um produto rico em nucleotídeos que, em uma etapa de método adicional e), são secos mediante atomização ou liofilização para resultar em um produto seco com uma riqueza mínima de 80% em nucleotídeos.

[0025] Em uma modalidade do método da invenção, a primeira digestão enzimática da etapa a) é realizada em uma solução tampão em pH 2,5, a 37ºC, durante aproximadamente 16 horas. A solução tampão a ser empregada pode ser,

por exemplo, um tampão de glicina a 25 mM.

[0026] Embora a levedura a ser empregada na presente invenção não seja particularmente limitada, em uma modalidade preferencial são utilizados corpos celulares de Saccharomyces cerevisiae.

[0027] A fonte de íons Fe?'/Fe” não é particularmente limitada, podendo-se empregar sais inorgânicos ou orgânicos de ferro como fonte de íons Fe?*/Fe*”, tais como sulfato de ferro (II), cloreto de ferro (III), citrato férrico de amônio ou gluconato ferroso. Preferivelmente, no processo da invenção, em particular na primeira digestão enzimática da etapa a), Fe?' é utilizado como íon ferro na forma de sulfato ferroso. Preferivelmente, a concentração de sulfato ferroso ou de íons Fe?' varia entre 2,5 e 50 MM.

[0028] Em uma modalidade, a segunda digestão enzimática da etapa c) é realizada em uma solução tampão em pH 2,5, a 37ºC, durante aproximadamente 24 horas, com o objetivo de se alcançar a máxima digestão até se obter nucleotídeos.

[0029] Embora a presente invenção possa empregar qualquer agente quelante de ferro, o agente quelante é preferivelmente selecionado entre ácido etilenodiaminotetracético — (EDTA), ácido hidroxietiletilenodiaminotriacético (HEDTA), ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA), ácido etilenodiamino-N,N'- di[(orto-hidroxifenilacético)] (o0,0-EDDHA), ácido etilenodiamino-di-(o- hidroximetilfenilacético) (o,o-EDDHMA), ácido etilenodiamino-di-2-hidroxi-4- carboxifenilacético (EDDCHA) e ácido etilenodiamino-N N-bis(2-hidroxi-5-sulfo) fenilacético (EDDHSA). Com especial preferência, emprega-se EDTA como agente quelante na etapa c).

[0030] Preferivelmente, o agente quelante citado na etapa c) é empregado em uma proporção de agente quelante: íons Fe?'/Fe?** de 0,1:5.

[0031] Com relação à etapa adicional d), a secagem do produto rico em nucleotídeos (riqueza superior a 80%) é preferivelmente realizada por atomização ou liofilização.

[0032] A invenção será agora explicada com base nos seguintes exemplos, os quais são ilustrativos e não limitativos da mesma, e em referência às figuras.

EXEMPLO 1: Determinação da dose inibidora de Fe sobre a atividade de DNAse da pepsina

[0033] Com o objetivo de determinar a concentração mínima capaz de inibir a atividade de DNAse da pepsina, foram testadas diferentes concentrações de Fe?*/Fe** em um DNA plasmídico (DNAp). Para tanto, realizou-se um estudo com 1ug de DNAp purificado com diferentes concentrações de FeSO,, nas concentrações de 25, 20, 15, 10, 5,0 e 2,5 MM, em uma solução tampão em pH 2,5, durante 5h, a 37ºC.

[0034] Como controle, foram empregados os sais NaCl e CaCl; acima mencionados. Os resultados da eletroforese são mostrados na Figura 2, onde se observa que o ferro é capaz de inibir a capacidade de DNAse da pepsina, mesmo em concentrações de 2,5 MM. EXEMPLO 2: Efeito da presença de Fe sobre as atividades de protease e DNAse da pepsina utilizando extrato de levedura como fonte de matéria-prima a digerir

[0035] Foram testadas as mesmas condições de digestão que no Exemplo 1, mas utilizando corpos de leveduras e nenhum DNAp puro como material a digerir. Os resultados da eletroforese são mostrados na Figura 3, onde se observa a inibição da capacidade de DNAse da pepsina, mas mantendo sua atividade de protease. Como é mostrado na figura, em uma concentração de íons ferro de 2,5 mM existe uma inibição parcial da atividade de DNAse, a 5,0 mM essa inibição aumenta, embora não seja total. Obtém-se uma inibição completa da digestão do DNA celular em uma concentração de íons ferro de 25 mM, sendo esses resultados de inibição melhores do que nos sais anteriormente descritos.

EXEMPLO 3: A incorporação de um agente quelante de Fe restabelece a atividade de DNAse da pepsina

[0036] Com o objetivo de demostrar que o sequestro de ferro solúvel com a incorporação de um agente quelante restabelece a atividade de DNAse da pepsina, realizou-se um teste com 1 ug de DNAp purificado com concentrações de FeSO,.

de 2,5 MM e 25 mM em uma solução tampão em pH 2,5, empregando-se um agente quelante, nesse caso EDTA, em uma concentração de 3 vezes a concentração de íons ferro. A reação foi realizada durante 5h a 37ºC. Foram utilizados como controle os sais anteriormente descritos. Os resultados são mostrados na Figura 4. De acordo com os resultados, observa-se que a concentração do agente quelante EDTA não é suficiente para sequestrar o Na+ ou o Ca?', provavelmente devido às suas altas concentrações. No entanto, esse agente quelante é sim capaz de sequestrar o Fe, permitindo a máxima digestão do DNAp, tanto em concentrações de 2,5 mM quanto de 25 mM.

EXEMPLO 4: A incorporação de um agente quelante de Fe restabelece a atividade de DNAse da pepsina utilizando extrato de levedura como fonte de matéria-prima a digerir

[0037] É realizado o mesmo protocolo do Exemplo 3, mas utilizando corpos de levedura e nenhum DNAp como fonte de matéria-prima a digerir. Os resultados são mostrados na Figura 5. Como pode ser observado, na concentração mais alta de Fe/quelato, há uma máxima digestão de ácidos nucleicos.

EXEMPLO 5: Realização do método da invenção utilizando uma concentração de 25 mM de Fel(ll!), utilizando sulfato de ferro (Il) como sal e 50 MM de EDTA como agente quelante

[0038] Foi realizada uma digestão proteica de uma quantidade de 500 g de leveduras Saccharomyces cerevisiae nas seguintes condições: solução tampão em pH 2,5, FeESO, 25 mM, durante 16 horas a 37ºC e 4 pg/ml de pepsina. A mistura foi centrifugada a 8.000 g para se obter a parte insolúvel onde se encontra o DNA. Essa fração é utilizada na sequência para a segunda digestão.

[0039] Na segunda digestão, adicionou-se uma solução tampão em pH 2,5, o agente quelante EDTA (50 mM) em uma concentração de 2 vezes e suplementou- se com pepsina até se obter uma concentração final de 4 ug/ml, sendo que a digestão foi realizada durante 24 horas a 37ºC.

[0040] Uma vez terminada a digestão, foi realizada uma filtração tangencial com um tamanho de poro de 1 KDa para se obter a parte solúvel onde se encontram os nucleotídeos. Por fim, o permeado da etapa anterior foi atomizado.

[0041] Rendimento do processo: 41,23 gramas de produto.

[0042] Pureza em nucleotídeos: 91,1% EXEMPLO 6: Realização do método da invenção utilizando uma concentração de 5 mM de Fe (III) utilizando cloreto de ferro (III) como sal e 15 mM de EDTA como agente quelante

[0043] Realizou-se uma digestão proteica de uma quantidade de 500 g de leveduras Saccharomyces cerevisiae nas seguintes condições: solução tampão em pH 2,5, FeESOs 5 mM, durante 16 horas a 37ºC e 4 ug/ml de pepsina. A mistura foi centrifugada a 8.000 g para se obter a parte insolúvel onde se encontra o DNA. Essa fração é utilizada na sequência para a segunda digestão.

[0044] Na segunda digestão, adicionou-se uma solução tampão em pH 2,5, o agente quelante EDTA (50 mM) em uma concentração de 3 vezes e suplementou- se com pepsina até se obter uma concentração final de 4 ug/ml, sendo que a digestão foi realizada durante 24 horas a 37ºC.

[0045] Uma vez terminada a digestão, foi realizada uma filtração tangencial com um tamanho de poro de 1 KDa para se obter a parte solúvel onde se encontram os nucleotídeos. Por fim, o permeado da etapa anterior foi atomizado.

[0046] Rendimento do processo: 52,23 gramas de produto.

[0047] Pureza em nucleotídeos: 84,1%.

EXEMPLO 7: Realização do método da invenção utilizando uma concentração de 25 mM de Fe (II), utilizando sulfato de ferro (II) como sal e 5 mM de 0,0-EDDHA como agente quelante

[0048] Realizou-se uma digestão proteica de uma quantidade de 500 g de leveduras Saccharomyces cerevisiae nas seguintes condições: solução tampão em pH 2,5, FeESO., 5 mM, durante 16 horas a 37ºC e 4 pg/ml de pepsina. A mistura foi centrifugada a 8.000 g para se obter a parte insolúvel onde se encontra o DNA. Essa fração é utilizada na sequência para a segunda digestão.

[0049] Na segunda digestão, adicionou-se uma solução tampão em pH 2,5, o agente quelante 0,0-EDDHA (5 mM) em uma concentração de 0,2 vez e suplementou-se com pepsina até se obter uma concentração final de 4 ug/ml, sendo que a digestão foi realizada durante 24 horas a 37ºC.

[0050] Uma vez terminada a digestão, foi realizada uma filtração tangencial com um tamanho de poro de 1 KDa para se obter a parte solúvel onde se encontram os nucleotídeos. Por fim, o permeado da etapa anterior foi atomizado.

[0051] Rendimento do processo: 53,23 gramas de produto.

[0052] Pureza em nucleotídeos: 92,02%.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. MÉTODO PARA A OBTENÇÃO DE UM PRODUTO COM UMA ALTA CONCENTRAÇÃO DE NUCLEOTÍDEOS, em particular com uma riqueza em nucleotídeos superior a 80% em peso, a partir de uma levedura, caracterizado por compreender as etapas de: a. uma primeira digestão enzimática de corpos celulares de levedura realizada por pepsina na presença de íons Fe?'/Fe?', como agente inibidor da atividade de DNAse da pepsina, para realizar uma digestão seletiva das proteínas, mantendo-se o DNA dos ditos corpos celulares sem digestão; b. separação das partes solúveis das insolúveis, onde se encontra o DNA, mediante filtração ou centrifugação; c. uma segunda digestão enzimática realizada mediante a incorporação de um agente quelante de Fe com o objetivo de impedir que o íon Fe?*/Fe** possa inibir a ação da pepsina sobre o DNA; e d. separação das partes insolúveis das solúveis, onde se encontram os nucleotídeos.

2. MÉTODO PARA A OBTENÇÃO DE UM PRODUTO COM UMA ALTA CONCENTRAÇÃO DE NUCLEOTÍDEOS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por incluir ainda uma etapa adicional e) de secagem mediante atomização ou liofilização para a obtenção de um produto seco com uma riqueza mínima de 80% em nucleotídeos.

3. MÉTODO PARA A OBTENÇÃO DE UM PRODUTO COM UMA ALTA CONCENTRAÇÃO DE NUCLEOTÍDEOS, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por os íons Fe?'/Fe*' serem provenientes de um sal de ferro orgânico ou inorgânico selecionado a partir do grupo que consiste em sulfato de ferro (Il), cloreto de ferro (Ill), citrato férrico de amônio ou gluconato ferroso.

4. MÉTODO PARA A OBTENÇÃO DE UM PRODUTO COM UMA ALTA CONCENTRAÇÃO DE NUCLEOTÍDEOS, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por os íons Fe?*/Fe** serem provenientes de sulfato de ferro (1).

5. MÉTODO PARA A OBTENÇÃO DE UM PRODUTO COM UMA ALTA

CONCENTRAÇÃO DE NUCLEOTÍDEOS, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a concentração de sulfato de ferro (Il) variar entre 2,5 e 50 mM.

6. MÉTODO PARA A OBTENÇÃO DE UM PRODUTO COM UMA ALTA CONCENTRAÇÃO DE NUCLEOTÍDEOS, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o agente quelante de Fe?'/Fe** ser empregado em uma proporção de agente quelante: íons Fe?'/Fe** de 0,1:5.

7. MÉTODO PARA A OBTENÇÃO DE UM PRODUTO COM UMA ALTA CONCENTRAÇÃO DE NUCLEOTÍDEOS, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o agente quelante de Fe?'//Fe*' ser selecionado entre ácido etilenodiaminotetracético — (EDTA), ácido —hidroxietiletilenodiaminotriacético (HEDTA), ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA), ácido etilenodiamino-N,N'- di[(orto-hidroxifenilacético)] (o0,0-EDDHA), ácido etilenodiamino-di-(o- hidroximetilfenilacético) (o,o0-EDDHMA), ácido etilenodiamino-di-2-hidroxi-4- carboxifenilacético (EDDCHA) e ácido etilenodiamino-N,N-bis (2-hidroxi-5-sulfo) fenilacético (EDDHSA).

8. MÉTODO PARA A OBTENÇÃO DE UM PRODUTO COM UMA ALTA CONCENTRAÇÃO DE NUCLEOTÍDEOS, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o agente quelante ser EDTA.

9. MÉTODO PARA A OBTENÇÃO DE UM PRODUTO COM UMA ALTA CONCENTRAÇÃO DE NUCLEOTÍDEOS, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a primeira digestão enzimática da etapa a) ser realizada em uma solução tampão em pH 2,5, a 37ºC, durante aproximadamente 16 horas.

10. MÉTODO PARA A OBTENÇÃO DE UM PRODUTO COM UMA ALTA CONCENTRAÇÃO DE NUCLEOTÍDEOS, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a segunda digestão enzimática da etapa c) ser realizada em uma solução tampão em pH 2,5, a 37ºC, durante aproximadamente 24 horas.

11. MÉTODO PARA A OBTENÇÃO DE UM PRODUTO COM UMA ALTA CONCENTRAÇÃO DE NUCLEOTÍDEOS, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a levedura a ser empregada consistir em corpos celulares de Saccharomyces cerevisiae.

12. USO DE SAIS DE FERRO (II) OU DE FERRO (Ill) SOLÚVEIS PARA A INIBIÇÃO DA ATIVIDADE DE DNAse DA PEPSINA, caracterizado por ser em um método de obtenção de nucleotídeos a partir de uma levedura com o objetivo de se obter um produto rico em nucleotídeos, com uma riqueza superior a 80%.