BR112019025180B1 - Produto alimentício ou de bebida com agregação de laticínios e proteína vegetal com cátions divalentes livres, e seu método de produção - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a um método para produzir um produto alimentício ou de bebida que compreende as etapas de: fornecer uma composição de ingredientes que compreende caseínas micelares, proteína do soro do leite e proteína vegetal que tem um pH de 5,9 a 7,1, de preferência 6,2 a 6,8, e tem uma concentração de 1 a 15% em peso de proteínas totais, e sendo que a composição tem uma razão entre a caseína micelar e a proteína do soro do leite de 90/10 a 60/40 e uma razão entre caseínas micelares e proteína do soro do leite e a proteína vegetal de 80/20 a 20/80, adicionar cátions divalentes para fornecer uma concentração de 2,0 a 10 mM de cátions divalentes livres na composição de ingredientes e, subsequentemente, tratar termicamente a composição de ingredientes para formar proteínas aglomeradas que compreendem caseína micelar, proteína do soro do leite e proteínas vegetais, sendo que os aglomerados têm um tamanho de 5 a 50 mícrons como medido por diâmetro médio D(4,3), como medido por difração de laser. A presente invenção refere-se, também, a um produto obtido por meio desse método.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a um método de produção de um produto alimentício ou de bebida, em particular, a um método para formação de proteínas aglomeradas em uma composição de ingredientes. A invenção também se refere a um produto alimentício ou de bebida que compreende proteínas agregadas que compreendem caseínas micelares e agregados de proteína vegetal e proteínas de soro de leite.

ANTECEDENTES

[002] É conhecido o fornecimento de textura e sensação bucal para produtos alimentícios e de bebidas mediante a agregação de proteínas, havendo uma necessidade contínua de produtos alimentícios e de bebidas que apresentem equilíbrio nutricional de macronutrientes, ao mesmo tempo que proporcionam sabor e textura satisfatórios.

[003] O documento CN104489097A descreve um processo para obter preparações protetoras de secagem por convecção térmica para bactérias lácticas ou probióticos. Esse processo consiste no tratamento térmico a 60°C de uma preparação de leite enriquecida com cálcio a fim de induzir a agregação de proteínas e subsequentemente submeter a preparação a um tratamento de homogeneização mecânica.

[004] O documento WO07040113A descreve a produção de um ingrediente que apresenta teor elevado de lipídios complexos derivados de leite. Ele é obtido por meio da precipitação das frações de proteína do soro de manteiga em pH 4,0 a 5,0 na presença de cálcio e da filtração do sobrenadante a fim de concentrar os lipídios complexos.

[005] O documento WO 06065135 A2 revela a produção de um produto alimentício líquido rico em cátions divalentes livres no qual 20% dos resíduos de lisina conduzidos pelas proteínas foram glicosados para aumentar sua resistência à agregação na presença de cálcio. Portanto, o documento WO 06065135 A2 está relacionado à prevenção da agregação de proteínas na presença de cátions divalentes, cálcio, entre outros.

[006] O documento US20130011515 A1 descreve um processo para a produção de um concentrado de proteína do leite que é enriquecido com proteínas de soro de leite. O leite desnatado é aquecido em um pH na faixa de 6,5 a 7,0 a fim de promover a agregação de proteínas de soro de leite juntamente com caseínas. O produto aquecido é subsequentemente submetido à filtração para concentrar agregados de proteína e para remover a lactose.

[007] D. L. Van Hekken et al. [Rheology and Microestructure of Chemically Superphosphorilated Whole Casein, 1997, J; Dairy Sci. 80 2740-2750] descrevem o efeito da adição de cálcio livre sobre a viscosidade das caseínas superfosforiladas. Foi mostrado que a viscosidade de 4%, em peso, de caseínas superfosforiladas (190% de fosforilação) aumentou mediante a adição de 30 mM de cálcio em pH 8,4. Esse estudo não se refere a misturas de proteínas vegetais e lácteas. Adicionalmente, para misturas de proteínas vegetais e lácteas, as caseínas superfosforiladas não são desejáveis como ingrediente dispendioso e quimicamente modificado.

[008] C. Holt descreveu em seu artigo [An equilibrium thermodynamic model of the sequestration of calcium phosphate by casein micelles and its application to the calculation of the partition of salts in milk, 2004, Eur. J. Phys., 33, 421-434] que a quantidade de íons de cálcio livres no leite bovino a um pH de 6,70 era de 10,2 mM e que este valor diminuiu para 8 mM quando o pH do leite foi reduzido para 6,0. Esse artigo não se refere a proteínas vegetais.

[009] I.R. McKinon et al. [Diffusing-wave spectroscopy investigation of heated reconstituted skim milks containing calcium chloride, 2009, Food Hydrocolloids, 1127-1133] investigaram o efeito da adição de cloreto de cálcio ao leite desnatado reconstituído a 10%, em peso, em uma faixa de pH de 6,0 a 7,2 e o efeito subsequente sobre a viscosidade quando o leite foi aquecido por 10 minutos a 60, 75 e 90°C. Eles relataram uma instabilidade crítica nos leites a um pH de 5,9 mediante aquecimento a 90°C com um teor de cloreto de cálcio de até 10 mM. Esse artigo não se refere a proteínas vegetais.

[0010] L. Ramasubramanian et al. [The rheological properties of calcium-induced milk gels, 2014, J. Food Engineering, 45-51] determinaram o impacto da adição de cloreto de cálcio ao leite integral (3,5% de gordura) mediante aquecimento a 70°C. Foi relatado que a adição de cloreto de cálcio abaixo de 12,5 mM produzia dispersões viscosas, enquanto concentrações mais altas de cloreto de cálcio induziam à formação de géis mais fortes. Curiosamente, o pré- tratamento do leite a 90°C durante 10 minutos antes da adição de cloreto de cálcio e o subsequente aquecimento a 70°C estava produzindo géis mais fortes. A formação de gel não é desejável em muitos produtos alimentícios e de bebidas semissólidos. Esse artigo não se refere a proteínas vegetais.

[0011] T. Phan-Xuan et al. [Tuning the structure of protein particles and gels with calcium or sodium ions. 2013, Biomacromolecules, 14, 6, 1980-1989] relataram que o tratamento de proteína de soro de leite a 100% (β-lactoglobulina) com uma adição de cloreto de cálcio a β- lactoglobulina em pH 7,0 estava levando à formação de gel ou microgéis mediante o aquecimento a 68 ou 85°C quando o teor de cálcio era de 5 a 6 mM para uma concentração de proteína de 4%, em peso. Novamente, a formação de gel não é desejável em muitos produtos alimentícios e de bebidas semissólidos.

[0012] N. Chen et al. [Thermal aggregation and gelation of soy globulin at neutral pH. 2016, Food Hydrocolloids, 61, 740-746] relataram que o isolado de proteína de soja estava formando agregados fractais mediante o aquecimento em pH neutro a temperaturas na faixa entre 50 e 90°C para concentrações de proteína na faixa entre 5 e 9%, em peso. Nenhum impacto de cálcio sobre a agregação de proteínas é descrito.

[0013] J.M. Franco et al. [Influence of pH and protein thermal treatment on the rheology of pea protein-stabilized oil-in-water emulsions. 2000, JAOCS, 77, 9, 975-984] relataram que uma emulsão de girassol a 65%, em peso, concentrada estabilizada por 6%, em peso, de proteína de ervilha exibia um aumento de viscosidade mediante o aquecimento a uma temperatura acima de 70°C por até 60 minutos, e que o maior aumento de viscosidade foi obtido a um pH em torno do ponto isoelétrico das proteínas de ervilha, isto é, pH 5,3.

[0014] A interação entre caseína micelar e proteínas de ervilha foi descrita por J.-L. Mession et al. [Interactions on casein micelle-pea system (part 1): heat-induced denaturation and aggregation. 2017, Food Hydrocolloids, 67, 229-242.] Mediante aquecimento, as dispersões de caseínas micelares e proteína de ervilha isolam entre 40 e 85°C em pH 7,1 para uma razão de mistura em peso de 1:1 e um teor de proteína de 1,8%, em peso. Concluiu-se que as caseínas não estavam envolvidas na agregação de proteína de ervilha enquanto contribuíam para a dissociação de subunidades de proteína de ervilha. Esse documento não revela o efeito do cálcio livre.

[0015] C.M. Beliciu e C.I. Moraru [The effect of protein concentration and heat treatment temperature on micellar casein-soy protein mixtures. 2011, Food Hydrocolloids, 25, 1448-1460] estudaram o efeito do aquecimento de isolado de proteína de soja e caseínas micelares 1:1 a temperaturas na faixa de 40 a 90°C por 15 minutos em pH 7,0 para um teor de proteína na faixa de 2 a 15%, em peso. Eles constataram que as propriedades de fluxo das misturas eram inferiores às do isolado de proteína de soja na mesma concentração de proteína. Além disso, os autores reivindicaram que o cálcio estava precipitando da solução e não contribuiu para a carga geral dos agregados, nem para a textura/viscosidade.

[0016] O ensinamento da técnica anterior mostra que, embora o aumento de viscosidade possa ser obtido com a adição de cálcio a produtos lácteos, não é revelado que um aumento de viscosidade de misturas de proteínas lácteas/vegetais possa ser obtido. Também é bem conhecido a partir da técnica anterior que o efeito gelificante pode ser indesejável na produção de alimentos. Adicionalmente, o pH do produto pode variar e influenciar o processo, mas pode levar à instabilidade do produto. A técnica anterior não mostra como fornecer produtos alimentícios e de bebidas que proporcionem sabor e textura desejáveis.

[0017] Dessa forma, existe uma necessidade de produtos alimentícios e de bebidas que exibam equilíbrio nutricional de macronutrientes, enquanto proporcionam sabor e textura satisfatórios.

OBJETIVO DA INVENÇÃO

[0018] É o objetivo da presente invenção fornecer um produto de proteína vegetal/lácteo ou alimentício com textura e sensação bucal aprimoradas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0019] A presente invenção fornece o aprimoramento mediante o uso de agregados à base de proteína de leite/vegetal por meio do tratamento térmico específico na presença de uma concentração específica de cátions divalentes adicionados.

[0020] Em um primeiro aspecto, a invenção se refere a um método de produção de um produto alimentício ou de bebida que compreende as etapas de: fornecer uma composição de ingredientes que compreende caseínas micelares, proteína do soro do leite e proteína vegetal que tem um pH de 5,9 a 7,1, de preferência 6,2 a 6,8, e tem uma concentração de 1 a 15% em peso de proteínas totais, e sendo que a composição tem uma razão entre a caseína micelar e a proteína do soro do leite de 90/10 a 60/40 e uma razão entre caseínas micelares e proteína do soro do leite e a proteína vegetal de 80/20 a 20/80, adicionar cátions divalentes para fornecer uma concentração de 2 a 10 mM de cátions divalentes livres na composição de ingredientes, e, subsequentemente, tratar termicamente a composição de ingredientes para formar proteínas aglomeradas que compreendem caseína micelar, proteína do soro do leite e proteínas vegetais, sendo que os aglomerados têm tamanho de 5 a 50 mícrons conforme medido por diâmetro médio D(4,3), conforme medido por difração a laser.

[0021] A presente invenção usa agregados à base de proteína de leite/vegetal que são gerados mediante o tratamento térmico na presença de cátions divalentes livres adicionados para fornecer propriedades sensoriais ideais, enquanto permitem uma redução do teor de gordura total no produto. Além disso, a invenção descrita possibilita a formulação de produtos texturizados à base de laticínios sem o uso de estabilizantes ou hidrocoloides adicionais.

[0022] No método preferencial da invenção, nos tratamentos térmicos, a composição de ingredientes é submetida a uma temperatura de 80 a 125°C durante um período de 30 a 900 segundos ou a uma temperatura de 126°C ou maior por 3 a 45 segundos. Em uma modalidade mais preferencial da invenção, a composição de ingredientes é submetida a uma temperatura de 80 a 100°C durante um período de 0,5 a 4 minutos ou a um tratamento térmico por UHT (temperatura ultra-alta) acima de 135°C por 3 a 45 segundos.

[0023] Um método de acordo com a reivindicação 1, em que a composição de ingredientes é tratada termicamente a uma temperatura de 80 a 125°C durante um período de 30 a 900 segundos ou a uma temperatura de 126°C ou maior por 3 a 45 segundos.

[0024] Em um segundo aspecto, a invenção se refere a um produto alimentício ou de bebida obtido por um método descrito acima.

[0025] Em um aspecto, a invenção se refere a um produto alimentício ou de bebida que compreende proteínas agregadas que compreendem caseína micelar, soro do leite e agregados de proteína vegetal, sendo que o produto tem um pH de 5,9 a 7,1, de preferência, 6,2 a 6,8, e tem uma concentração de 1 a 15%, em peso, de proteínas totais, e sendo que a composição tem uma razão entre caseína micelar e proteína do soro do leite de 90/10 a 60/40 e uma razão entre caseínas micelares e proteína do soro do leite e proteína vegetal de 80/20 a 20/80, uma concentração de 2,0 a 10 mM de cátions divalentes livres na composição de ingredientes, sendo que as proteínas aglomeradas compreendem caseína, proteína do soro do leite e proteínas vegetais, sendo que os aglomerados têm um tamanho de 5 a 50 mícrons conforme medido por diâmetro médio D(4,3), conforme medido por difração a laser.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0026] A Figura 1 mostra distribuições de tamanho de partícula de emulsões à base de girassol com alto teor oleico estabilizadas por concentrado de proteína do leite (CPL)/isolado de proteína da soja (IPS) com um teor de proteína total de 3%, em peso, e uma razão de mistura de 75/25 após o aquecimento (95°C, 15 minutos) e cisalhamento em pH 7,0 na presença ou ausência de 5 mM de CaCl2. (A) 2,5%, em peso, de óleo de girassol, (B) 5%, em peso, de óleo de girassol, (C) 10%, em peso, de óleo de girassol. Linha contínua: pH 7,0 sem CaCl2 adicionado; linha tracejada: pH 7,0 com 5 mM de CaCl2 adicionados.

[0027] A Figura 2 mostra distribuições de tamanho de partícula de emulsões à base de girassol com alto teor oleico estabilizadas por concentrado de proteína do leite/isolado de proteína da soja com um teor de proteína total de 3%, em peso, e uma razão de mistura de 50/50 após o aquecimento (95°C, 15 minutos) e cisalhamento em pH 7,0 na presença ou ausência de 10 mM de CaCl2. (A) 2,5%, em peso, de óleo de girassol, (B) 5%, em peso, de óleo de girassol, (C) 10%, em peso, de óleo de girassol. Linha contínua: pH 7,0 sem CaCl2 adicionado; linha tracejada: pH 7,0 com 10 mM de CaCl2 adicionados.

[0028] A Figura 3 mostra micrografias obtidas por microscopia confocal de varredura a laser de emulsão de girassol com alto teor oleico a 5%, em peso, estabilizada com 3%, em peso, de concentrado de proteína de leite/isolado de proteína de soja na razão de mistura 75/25 após tratamento térmico e cisalhamento a 95°C por 15 minutos. (A) pH 7,0 sem CaCl2 adicionado; (B) pH 7,0 com 5 mM de CaCl2 adicionados. A barra de escala é de 10 mícrons. "mc" significa caseínas micelares, "sp" significa proteínas da soja e "o" significa gotículas de óleo próximas às setas.

[0029] A Figura 4 mostra micrografias obtidas por microscopia confocal de varredura a laser de emulsão de girassol com alto teor oleico a 3%, em peso, estabilizada com 5%, em peso, de concentrado de proteína do leite/isolado de proteína da soja na razão de mistura 50/50 após tratamento térmico e cisalhamento a 95°C por 15 minutos. (A) pH 7,0 sem CaCl2; (B) pH 7,0 com 10 mM de CaCl2 adicionados. A barra de escala é de 10 mícrons. "mc" significa caseínas micelares, "sp" significa proteínas da soja e "o" significa gotículas de óleo próximas às setas.

[0030] A Figura 5 mostra curvas de fluxo a 20°C para a emulsão de girassol com alto teor oleico estabilizada com 3%, em peso, de concentrado de proteína de leite/isolado de proteína de soja na razão de mistura 75/25 após o tratamento térmico e cisalhamento a 95°C por 15 minutos em pH 7,0 na presença ou ausência de 5 mM de CaCl2. (A) 2,5%, em peso, de óleo de girassol, (B) 5%, em peso, de óleo de girassol, (C) 10%, em peso, de óleo de girassol. Círculos: pH 7,0 sem CaCl2 adicionado; Cruzes: pH 7,0 com 5 mM de CaCl2 adicionados.

[0031] A Figura 6 mostra curvas de fluxo a 20°C para a emulsão de girassol com alto teor oleico estabilizada com 3%, em peso, de concentrado de proteína de leite/isolado de proteína de soja na razão de mistura 75/25 após o tratamento térmico e cisalhamento a 95°C por 15 minutos em pH 7,0 na presença ou ausência de CaCl2 5 mM. (A) 2,5%, em peso, de óleo de girassol, (B) 5%, em peso, de óleo de girassol, (C) 10%, em peso, de óleo de girassol. Círculos: pH 7,0 sem CaCl2 adicionado; Cruzes: pH 7,0 com 10 mM de CaCl2 adicionados.

[0032] A Figura 7 mostra viscosidade a uma taxa de cisalhamento de 10 1/segundo para emulsões de girassol com alto teor oleico estabilizada com 3%, em peso, de concentrado de proteína de leite/isolado de proteína de soja após o tratamento térmico e cisalhamento a 95°C por 15 minutos em pH 7,0 na presença ou ausência de CaCl2. (A) razão de mistura de CPL/IPS 75/25 com 5 mM de CaCl2 adicionados, (B) razão de mistura de CPL/IPS 50/50 com 10 mM de CaCl2 adicionados.

[0033] A Figura 8 mostra micrografias obtidas por microscopia confocal de varredura a laser de emulsão de girassol com alto teor oleico a 5%, em peso, estabilizada com 3%, em peso, de concentrado de proteína de leite/isolado de proteína de soja na razão de mistura 75/25 após tratamento térmico e cisalhamento a 95°C por 3 minutos na planta piloto. (A) pH 7,0 sem CaCl2 adicionado; (B) pH 7,0 com 10 mM de CaCl2 adicionados. A barra de escala é de 10 mícrons. "p" significa proteínas e "o" significa gotículas de óleo próximas às setas.

[0034] A Figura 9 mostra micrografias obtidas por microscopia confocal de varredura a laser de emulsão de girassol com alto teor oleico a 5%, em peso, estabilizada com 3%, em peso, de concentrado de proteína do leite/isolado de proteína da soja na razão de mistura 50/50 após tratamento térmico e cisalhamento a 95°C por 3 minutos na planta piloto. (A) pH 7,0 sem CaCl2 adicionado; (B) pH 7,0 com 20 mM de CaCl2 adicionados. A barra de escala é de 10 mícrons. "p" significa proteínas e "o" significa gotículas de óleo próximas às setas.

[0035] A Figura 10 mostra o processo usado para formular os sistemas de leite-ervilha ou leite-soja.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0036] Mediante a realização de experimentos sobre o efeito da adição de cátions divalentes, em particular, cálcio, a misturas de proteínas lácteas/vegetais na agregação de proteína e aumento de viscosidade, constatou-se, surpreendentemente, que há uma faixa crítica de adição de cátions divalentes que leva à agregação ideal de proteínas sem precipitação ou gelificação dos agregados formados mediante aquecimento. Quando esta concentração ideal de cálcio é ultrapassada, o sistema exibiu uma superagregação com precipitação ou uma redução no tamanho do agregado.

[0037] Sem se ater à teoria, é provável que a adição de cloreto de cálcio a proteínas leve a uma troca entre os prótons adsorvidos na superfície das proteínas e os íons de cálcio que têm uma maior afinidade. Este fenômeno resultou em uma redução do pH da dispersão e, assim, em uma redução de repulsões eletrostáticas entre as proteínas. Nessas condições, o tratamento térmico subsequente de emulsões e dispersões à base de proteína láctea/vegetal leva a uma agregação controlada das proteínas que demonstrou afetar positivamente as propriedades sensoriais e de textura dos produtos acabados.

[0038] Uma grande vantagem desta invenção é que ela permite texturizar sistemas à base de proteína láctea/vegetal com teor de gordura reduzido e possibilita uma redução do uso de hidrocoloides adicionais.

[0039] No presente contexto, os aglomerados criados com o método de acordo com a invenção e presentes no produto da invenção têm um tamanho de 5 a 50 mícrons, conforme medido por diâmetro médio D(4,3). A distribuição de tamanho de partícula (DTP) de aglomerado é medida com o uso do Mastersizer 2000 (Malvern Intruments, Reino Unido) ou um sistema de medição equivalente. Para as medições, uma amostra pode, por exemplo, ser dispersa na célula de medição Hydro SM até que uma taxa de obscurecimento de 9 a 10% seja obtida e, então, analisada no Mastersizer.

[0040] Adicionalmente no presente contexto, os cátions divalentes livres podem ser medidos por meio de um eletrodo seletivo. Por exemplo, a concentração de cálcio livre (iônico) é determinada através de meias-células de eletrodo de cálcio seletivo da série Perfection™ DX da Mettler-Toledo com um conector BNC P/N 51344703 conectado a um medidor de pH/íons 692 (Metrohm, Suíça).

[0041] Adicionalmente no presente contexto, exceto onde indicado em contrário, a porcentagem de um componente significa a porcentagem em peso com base no peso da composição, isto é, peso / porcentagem em peso.

[0042] De preferência, a concentração de proteína na composição de ingredientes é de 1 a 10%, em peso, com mais preferência, de 2 a 9% em peso.

[0043] Em uma modalidade preferencial da invenção, os agregados são de 10 a 40 mícrons, de preferência, 10 a 30 mícrons, medidos por diâmetro médio D(4,3). Isso confere uma sensação bucal desejável ao produto sem que os agregados provoquem uma sensação arenosa.

[0044] No presente contexto, a proteína vegetal pode ser selecionada do grupo que consiste em soja, ervilha, aveia, batata, canola, amendoim ou arroz.

[0045] Em uma modalidade preferencial da invenção, a proteína vegetal é selecionada do grupo que consiste em proteína de ervilha, proteína de soja ou uma combinação das mesmas. Constatou-se que essas proteínas vegetais fornecem uma boa textura aos produtos da invenção.

[0046] Vantajosamente, no método de acordo com a invenção, a solubilidade da proteína vegetal foi aprimorada com tratamento físico (por exemplo, aquecimento, homogeneização).

[0047] É preferencial que, com o método de acordo com a invenção, a composição de ingredientes seja submetida à homogeneização. Entretanto, constatou-se que os aglomerados criados no método de acordo com a invenção podem ser destruídos se os forem submetidos a cisalhamento muito alto. Vantajosamente, a homogeneização é acontece antes do tratamento térmico da composição de ingredientes.

[0048] De acordo com a invenção, é preferencial que os cátions divalentes sejam selecionados do grupo que consiste em cátions de Ca ou Mg, ou uma combinação dos mesmos. Esses cátions divalentes são de grau alimentício e não contribuem para a oxidação fácil de óleos ou gorduras.

[0049] Em uma modalidade preferencial da invenção, os cátions divalentes são cátions de cálcio.

[0050] Vantajosamente, os cátions divalentes, de preferência, sal de cálcio, são adicionados até que a concentração de cátions divalentes de cálcio livres seja de 2,0 a 6,0 mM, de preferência, 2,0 a 4,0 mM, com mais preferência, 2,0 a 3,0 mM.

[0051] Em uma modalidade preferencial da invenção, a proteína vegetal é proteína de ervilha, e o sal de cálcio é adicionado até que a concentração de cátions divalentes de cálcio livres seja de 2,0 a 3,0 mM, de preferência, 2,0 a 2,5 mM. Essa modalidade da invenção tem a vantagem de não levar a alguns defeitos sensoriais (sabor metálico, de sabão) induzidos pelo sal adicionado.

[0052] A proteína vegetal é proteína de ervilha, e o sal de cálcio é adicionado até que a concentração de cátions divalentes de cálcio livres seja de 2,0 a 3,0 mM, de preferência, 2,0 a 2,5 mM.

[0053] Em uma outra modalidade preferencial da invenção, a proteína vegetal é proteína de soja, e o sal de cálcio é adicionado até que a concentração de cátions divalentes de cálcio livres seja de 2,0 a 3,0 mM, de preferência, 2,0 a 3,0 mM. Essa modalidade da invenção tem a vantagem de não levar a alguns defeitos sensoriais (sabor metálico, de sabão) induzidos pelo sal adicionado.

[0054] O pH da composição de ingredientes pode ser ajustado para 5,9 a 6,8 após a adição dos cátions.

[0055] Além disso, é preferencial que os cátions divalentes sejam adicionados sob a forma de um sal mineral. De preferência, o sal mineral é sal de cálcio e é selecionado do grupo que consiste em cloreto de cálcio, hidróxido de cálcio, carbonato de cálcio, citrato de cálcio, fosfato de cálcio, estearato-malato, glicerofosfato de cálcio, lactato de cálcio e gluconato de cálcio. Em uma modalidade preferencial específica da invenção, o sal de cálcio é cloreto de cálcio ou lactato de cálcio. Em uma modalidade natural da invenção, o cálcio é obtido de minerais de concentração do leite após a separação da proteína, gordura e lactose, por exemplo, através de fracionamento por membrana.

[0056] O pH da composição de ingredientes é, de preferência, de 6,2 a 7,1 antes da adição dos cátions de cálcio.

[0057] O teor de proteína solúvel após a reação de agregação na composição de ingredientes é, de preferência, igual ou inferior a 30%, de preferência, igual ou inferior a 20% em relação ao teor de proteína total, mostrando que a maior parte das proteínas está embutida nas estruturas agregadas.

[0058] Em uma modalidade da invenção, a composição de ingredientes compreende de 0 a 36%, em peso, de gordura, de preferência, de 1,0 a 20%, em peso, com mais preferência, de 3,0 a 15%, em peso, com a máxima preferência, de 5 a 10%, em peso, de gordura. Constatou-se que mesmo com baixas quantidades de gordura, a textura do produto é cremosa devido à aglomeração criada dentro do produto.

[0059] As caseínas e a proteína de soro de leite na composição de ingredientes são, de preferência, fornecidas sob a forma selecionada do grupo que consiste em leite cru, leite pasteurizado, leite concentrado obtido por tratamento em baixa temperatura, leite em pó obtido por tratamento em baixa temperatura, concentrado de proteína de leite, isolado de leite sob a forma líquida ou em pó, ou uma combinação dos mesmos, ao passo que as proteínas de soro de leite adicionais são fornecidas sob uma forma selecionada do grupo que consiste em soro de leite doce, concentrados de proteína de soro de leite, isolados de proteína de soro de leite sob a forma líquida, concentrada ou em pó, ou uma combinação dos mesmos.

[0060] De preferência, a fonte de proteína do soro do leite é não desnaturada.

[0061] As proteínas vegetais são, de preferência, selecionadas a partir de concentrados ou isolados de proteína vegetal em pó.

[0062] A caseína micelar pode ser obtida do grupo que consiste em leite, concentrado e isolado de proteína de leite e sob uma forma líquida ou em pó, ou uma combinação dos mesmos.

[0063] A invenção também se refere a um concentrado lácteo obtido pelo método descrito acima.

[0064] Em uma modalidade preferencial específica da invenção, o concentrado é submetido a secagem para se tornar um pó por meio de secagem por congelamento, secagem por atomização ou secagem por cilindro.

[0065] Os produtos de acordo com a invenção podem ser produtos à base de laticínios, como sorvete ou doces congelados, concentrados ou sobremesas lácteas, molhos, etc. O formato de produto inclui congelado, em temperatura ambiente, aquecido, líquido e em pó.

Exemplos

[0066] A título de exemplo e não de limitação, os exemplos a seguir são ilustrativos de várias modalidades da presente invenção.

Exemplo 1: Agregados de proteína do leite e proteína de ervilha obtidos mediante a adição de lactato de cálcio em isolados de proteína de ervilha e leite integral recombinados, em que 75% do teor de proteína total é proteína do leite e 25% é proteína de ervilha. Material e métodos

[0067] O leite desnatado em pó (LDP) a baixa temperatura foi fornecido por Hochdorf (Suíça) e o isolado de proteína de ervilha Nutralys XF foi fornecido por Roquette (França).

[0068] Uma vez que a concentração de proteína do isolado de proteína de ervilha é maior que o leite desnatado em pó, os sólidos totais (ST) foram ajustados mediante a adição de maltodextrina DE 38-41 (Roquette, França), a fim de se alcançar 13% de ST, como um leite integral médio. O óleo de girassol com alto teor oleico (Oleificio Sabo, Suíça) foi usado para substituir a gordura do leite.

[0069] Em um ST de 13%, o sistema foi formulado com 3,3% de proteína total (2,5% de proteína do leite, 0,8% de proteína de ervilha) e 3,5% de óleo.

[0070] A Tabela 1 mostra a composição do sistema de leite-ervilha. Tabela 1: Ingredientes principais e formulação exemplificadora de um sistema de LDP-proteína de ervilha 75:25 misturado com 13% de ST.

[0071] Para adição de cálcio, o lactato de cálcio (Purac Biochem, Países Baixos) foi misturado a seco e adicionado juntamente com a maltodextrina durante o processo.

[0072] A Figura 10 mostra o processo usado para formular os sistemas de leite-ervilha.

[0073] Para aumentar a solubilidade da proteína de ervilha, a proteína de ervilha foi adicionada à água submetida a osmose reversa a 55°C e agitada por 30 minutos. A dispersão de proteína foi aquecida a 95°C com o uso de um tubo espiralado (raio interno de 4 mm, 7 enrolamentos de 94 mm de diâmetro, 2.100 cm de comprimento) imerso em um banho de óleo a 110°C (HBR4 IKA, Alemanha). A vazão era de 425 mL/minuto a fim de garantir que, na saída da bobina, a temperatura- alvo fosse alcançada. A dispersão aquecida foi coletada em uma garrafa Schott colocada em banho-maria a 95°C (HBR4 IKA, Alemanha) e dotada de um agitador magnético. A dispersão de proteína de ervilha foi agitada a 95°C por 10 minutos antes de ser resfriada em banho de água frio até 50°C e subsequentemente homogeneizada a 200 + 50 bar em um homogeneizador de bancada Panda PLUS (GEA Niro Soavi, Itália).

[0074] Os outros ingredientes (LDP, óleo, se presente, maltodextrina e sal de cálcio) foram adicionados à dispersão de proteína de ervilha homogeneizada a 50°C, e a mistura foi agitada durante 40 minutos a 50°C. Uma pré-emulsão foi obtida por meio de um Ultra Turrax (T25 IKA, Alemanha) a 14.000 rpm por 1 minuto.

[0075] A mistura pré-homogeneizada foi subsequentemente homogeneizada a 200 + 50 bar a 50°C e, então, resfriada em um banho de gelo a 4°C. A mistura foi dividida em alíquotas diferentes e mantida abaixo de 10°C, enquanto o pH de cada uma delas foi ajustado para o valor-alvo com uma solução de hidróxido de potássio a 5% p/p (Merck, Alemanha) ou solução de ácido cítrico a 10% p/p (Jungbunzlauer, Áustria).

[0076] Após o equilíbrio do pH, cada emulsão foi pré-aquecida em uma garrafa Schott em um aquecedor de placas (rtc basic IKA, Alemanha) sob agitação contínua. A emulsão pré-aquecida foi bombeada a 115 mL/minuto através de uma bobina de aquecimento (raio interno de 4 mm, 7 enrolamentos, 94 mm de diâmetro, 210 cm de comprimento) que foi imersa em banho de óleo a 110°C (HBR4 IKA, Alemanha) para garantir que, na saída da bobina, a temperatura-alvo fosse alcançada. A bobina foi conectada ao tubo de retenção (raio interno de 7 mm, 3.400 mm de comprimento), que foi imerso em banho- maria a 96°C (HBR4 IKA, Alemanha). A conexão entre a bobina e o banho-maria, juntamente com o tubo de retenção, forneceu um tempo de aquecimento total de 60 segundos a 96°C.

[0077] Após o aquecimento, a amostra foi bombeada através de um tubo espiralado adicional (raio interno de 4 mm, 4 enrolamentos, 94 mm de diâmetro, 120 cm de comprimento), imerso em água gelada para ser resfriado até < 50°C em menos de 30 segundos.

Propriedades de fluxo

[0078] Com as emulsões aquecidas e não aquecidas, foram realizados experimentos de fluxo com o uso de um reômetro de tensão controlada Haake Rheostress 6000 acoplado a um UMTC (Thermo Scientific, Alemanha) equipado com uma geometria de placa/placa (60 mm de diâmetro) e vão de 1 mm.

[0079] As curvas de fluxo de cisalhamento constantes foram determinadas a taxas de cisalhamento que se situam na faixa de 0 a 300 1/s (aumento linear) a uma temperatura constante de 25°C +/- 0,1. A viscosidade aparente foi registrada como uma função da taxa de cisalhamento.

Distribuição de Tamanho de Partícula

[0080] A fim de avaliar a distribuição de tamanho de partícula, as emulsões aquecidas e não aquecidas foram analisadas por dispersão dinâmica de luz com o uso de um granulômetro Malvern Mastersizer 2000 (Malvern Instruments, Ltd., Reino Unido). A água ultrapura e isenta de gás usada para dispersar a amostra líquida foi preparada com o uso do redutor de pressão de água Honeywell (pressão máxima da água deionizada: 1 bar) e um desgaseificador de água ERMA (para reduzir o ar dissolvido na água desionizada).

[0081] As configurações de medição usadas são um índice de refração de 1, 46 para gotículas de gordura e 1,33 para água a uma absorção de 0,01. Todas as amostras foram medidas a uma taxa de obscurecimento de 2,0 a 2,5%. Os resultados da medição são calculados no software Malvern, com base na teoria de Mie. O valor D(4,3) de diâmetro médio à base de volume é relatado.

Determinação iônica (cálcio livre)

[0082] A concentração de cálcio iônico foi medida com o uso de um eletrodo sensível a íon de cálcio Orion Ion Analyzer EA940 e um medidor pH/mV em modo mV (Thermo Orion, EUA). A concentração de íons cálcio foi calculada a partir das leituras de milivolts, com base em uma equação de regressão a partir de uma curva padrão de leituras de mV para soluções padrão de 1, 5 e 10 mM de cálcio contendo 80 mM de KCl, a fim de padronizar a força iônica. Esses padrões foram preparados a partir de uma solução padrão de cloreto de 0,1 M de cálcio fornecida pela Thermo Fisher Scientific (EUA) e uma solução de 4 M de cloreto de potássio (Ionic Strength Adjustor Calcium, Thermo Orion, EUA).

Resultados

[0083] A Tabela 2 mostra os resultados obtidos a partir da análise das amostras preparadas com proteínas de leite-ervilha (75:25 - formulação na Tabela 1) com a adição de 2,5 mM de lactato de cálcio e ajustadas para um pH diferente.

[0084] A Tabela 2 mostra que, mediante a diminuição do pH, o cálcio no sistema foi liberado progressivamente até 2,8 mM em pH 6,06. É possível observar que tanto o tamanho de partícula como a viscosidade aumentaram após o aquecimento das emulsões na presença de lactato de cálcio. O efeito no aumento de viscosidade é maior em pH mais baixo.

[0085] Quando o pH foi diminuído ainda mais para 5,84, o cálcio livre aumentou para 3,6, levando à formação de agregados muito grandes (239,541 μm), perdendo qualquer efeito de viscosidade (3 mPa.s em 100 1/s). Entretanto, o sistema não gelificou.

Exemplo 2: Agregados de proteína do leite e proteína de ervilha obtidos mediante a adição de lactato de cálcio em leite integral recombinado duplamente concentrado, em que 25% da proteína do leite foram substituídos por proteínas de ervilha.

[0086] O leite desnatado em pó (LDP) a baixa temperatura foi fornecido por Hochdorf (Suíça) e o isolado de proteína de ervilha Nutralys XF foi fornecido por Roquette (França).

[0087] Uma vez que a concentração de proteína do isolado de proteína de ervilha é maior que o leite desnatado em pó, os sólidos totais (ST) foram ajustados mediante a adição de maltodextrina DE 38-41 (Roquette, França), a fim de se alcançar 13% de ST, como um leite integral médio. O óleo de girassol com alto teor oleico (Oleificio Sabo, Suíça) tem sido usado para substituir a gordura do leite.

[0088] Em um ST de 26%, o sistema foi formulado com 6,6% de proteína total (4,95% de proteína do leite, 1,65% de proteína de ervilha) e 7% de óleo.

[0089] A Tabela 1 mostra a composição do sistema de leite-ervilha. Tabela 3: Ingredientes principais e formulação exemplificadora de um sistema de LDP-proteína de ervilha 75:25 misturado com 26% de ST.

[0090] Para adição de cálcio, o lactato de cálcio (Purac Biochem, Países Baixos) foi misturado a seco e adicionado juntamente com a maltodextrina durante o processo.

[0091] A Figura 10 mostra o processo usado para formular os sistemas de leite-ervilha.

[0092] A proteína de ervilha foi pré-tratada, e o sistema de leite- ervilha foi formulado e processado conforme indicado no Exemplo 1.

Propriedades de Fluxo

[0093] Com as emulsões aquecidas e não aquecidas, os experimentos de fluxo foram realizados conforme no Exemplo 1.

Distribuição de Tamanho de Partícula

[0094] A distribuição de tamanho de partícula foi analisada conforme no Exemplo 1.

Determinação lônica (cálcio livre)

[0095] A concentração de cálcio iônico foi medida conforme indicado no Exemplo 1. Resultados Tabela 4:

[0096] A Tabela 4 mostra que a emulsão com 2,5 mM de lactato de cálcio adicionados foi caracterizada por um valor de cálcio livre de 1,4 mM em pH 6,7, o que não induz uma agregação de proteína significativa durante o tratamento térmico. Com a diminuição do pH, o cálcio no sistema foi liberado progressivamente até 3,0 mM em pH 6,11. É possível observar que tanto o tamanho de partícula como a viscosidade aumentaram após o aquecimento das emulsões na presença de lactato de cálcio e a uma concentração de cálcio livre de 2,0 mM ou mais. O efeito no aumento da viscosidade é maior em pH mais baixo, e, dessa forma, em concentração de cálcio livre maior.

Exemplo 3: Agregados de proteína do leite e proteína de ervilha obtidos mediante a adição de lactato de cálcio em leite com teor de gordura reduzido recombinado duplamente concentrado, em que 25% da proteína do leite foram substituídos por proteínas de ervilha.

[0097] O leite desnatado em pó (LDP) a baixa temperatura foi fornecido por Hochdorf (Suíça) e o isolado de proteína de ervilha Nutralys XF foi fornecido por Roquette (França).

[0098] Uma vez que a concentração de proteína do isolado de proteína de ervilha é maior que o leite desnatado em pó, os sólidos totais (ST) foram ajustados mediante a adição de maltodextrina DE 38-41 (Roquette, França), a fim de se alcançar 13% de ST, como um leite integral médio. O óleo de girassol com alto teor oleico (Oleificio Sabo, Suíça) tem sido usado para substituir a gordura do leite. Em um ST de 26%, o sistema foi formulado com 6,6% de proteína total (4,95% de proteína do leite, 1,65% de proteína de ervilha) e 1% de óleo.

[0099] A Tabela 5 mostra a composição do sistema de leite-ervilha. Tabela 5: Ingredientes principais e formulação exemplificadora de um sistema de LDP-proteína de ervilha 75:25 misturado com 26% de ST.

[00100] Para adição de cálcio, o lactato de cálcio (Purac Biochem, Países Baixos) foi misturado a seco e adicionado juntamente com a maltodextrina durante o processo.

[00101] A Figura 10 mostra o processo usado para formular os sistemas de leite-ervilha.

[00102] A proteína de ervilha foi pré-tratada e o sistema de leite- ervilha foi formulado e processado conforme indicado no Exemplo 1.

Propriedades de Fluxo

[00103] Com as emulsões aquecidas e não aquecidas, os experimentos de fluxo foram realizados conforme no Exemplo 1.

Distribuição de tamanho de partícula

[00104] A distribuição de tamanho de partícula foi analisada conforme no Exemplo 1.

Determinação iônica (cálcio livre)

[00105] A concentração de cálcio iônico foi medida conforme indicado no Exemplo 1. Resultados Tabela 6:

[00106] A Tabela 6 mostra que a emulsão com lactato de cálcio teve um valor de cálcio iônico livre de 1,5 mM em pH 6,59, que é comparável ao valor observado no sistema de gordura total. Sob essas condições (pH 6,59, concentração de cálcio livre de 1,5 mM), não foi induzida uma agregação de proteína significativa durante o tratamento térmico. Com a diminuição do pH, o cálcio livre aumentou até 2,4 mM em pH 6,20, e tanto o tamanho de partícula como a viscosidade aumentaram após o aquecimento das emulsões. O efeito no aumento da viscosidade é maior em pH mais baixo. Mediante a adição de lactato de cálcio e a diminuição do pH, em um sistema de gordura reduzida foi possível obter viscosidades similares ou até mais altas do que aquelas do sistema de gordura total (16 mPa.s a 100 1/s) sem cálcio adicionado.

Exemplo 4: Agregados de proteína do leite e proteína de ervilha obtidos mediante a adição de lactato de cálcio em leite desnatado recombinado duplamente concentrado, em que 25% da proteína do leite foram substituídos por proteínas de ervilha.

[00107] O leite desnatado em pó (LDP) a baixa temperatura foi fornecido por Hochdorf (Suíça) e o isolado de proteína de ervilha Nutralys XF foi fornecido por Roquette (França). Uma vez que a concentração de proteína do isolado de proteína de ervilha é maior que o leite desnatado em pó, os sólidos totais (ST) foram ajustados mediante a adição de maltodextrina DE 38-41 (Roquette, França), a fim de se alcançar 13% de ST, como um leite integral médio. O óleo de girassol com alto teor oleico (Oleificio Sabo, Suíça) tem sido usado para substituir a gordura do leite. Em um ST de 26%, o sistema foi formulado com 6,6% de proteína total (4,95% de proteína do leite, 1,65% de proteína de ervilha) e sem qualquer adição de gordura.

[00108] A Tabela 5 mostra a composição do sistema de leite-ervilha. Tabela 7: Ingredientes principais e formulação exemplificadora de um sistema de LDP-proteína de ervilha 75:25 misturado com 26% de ST.

[00109] Para adição de cálcio, o lactato de cálcio (Purac Biochem, Países Baixos) foi misturado a seco e adicionado juntamente com a maltodextrina durante o processo.

[00110] A Figura 10 mostra o processo usado para formular os sistemas de leite-ervilha.

[00111] A proteína de ervilha foi pré-tratada e o sistema de leite- ervilha foi formulado e processado conforme indicado no Exemplo 1.

Propriedades de fluxo

[00112] Com as emulsões aquecidas e não aquecidas, os experimentos de fluxo foram realizados conforme no Exemplo 1.

Distribuição de tamanho de partícula

[00113] A distribuição de tamanho de partícula foi analisada conforme no Exemplo 1, mas com uma configuração de medição em que o índice de refração usado era de 1,52 para proteínas.

Determinação iônica (cálcio livre)

[00114] A concentração de cálcio iônico foi medida conforme indicado no Exemplo 1. Resultados: Tabela 8:

[00115] A Tabela 8 mostra que a dispersão de proteína com lactato de cálcio adicionado teve um valor de cálcio iônico livre de 1,5 mM em pH 6,69, que é comparável ao valor observado no sistema de gordura total e com gordura reduzida. Sob essas condições (pH 6,69, concentração de cálcio livre de 1,5 mM), não foi induzida uma agregação de proteína significativa durante o tratamento térmico. Na dispersão de proteína com pH menor, o cálcio livre aumentou até 2,8 mM em pH 6,03, e tanto o tamanho de partícula como a viscosidade aumentaram após o aquecimento das dispersões de proteína. O efeito no aumento da viscosidade é maior em pH mais baixo. Mediante a adição de lactato de cálcio e a diminuição do pH, em um sistema sem gordura, foi possível obter viscosidades similares ou até mais altas do que aquelas do sistema de gordura total (16 mPa.s a 100 1/s) sem cálcio adicionado.

Exemplo 5: Adição de cloreto de cálcio em emulsões estabilizadas com concentrado de proteína do leite (CPL)/isolado de proteína de soja (IPS) em escala de laboratório Material e Métodos Preparação da Dispersão de CPL

[00116] A solução de estoque de dispersão de caseínas micelares foi preparada a uma concentração de proteína de 10%, em peso. O concentrado de proteína do leite enriquecido em caseínas micelares Promilk852B foi adquirido junto à Ingredia (Arras, França). A composição em pó continha (g/100 g de pó úmido): proteína (Nx6,38) 82,3, Ca 2,6, Mg 0,1, Na 0,07, K 0,29, Cl 0,05, P 1,56. A massa de pó necessária para preparar a dispersão foi calculada como uma função do teor de proteína no pó.

[00117] O pó de CPL foi hidratado em água MilliQ durante 3 horas sob misturação à temperatura ambiente. Após 3 horas, a dispersão de proteína foi homogeneizada com um homogeneizador EmulsiFlex C-5 de alta pressão e estágio único (Avestin®, Canadá). Esse tratamento diminuiu o tamanho médio de partícula das caseínas micelares, o que permite estabilizar a dispersão e evita a sedimentação do CPL.

[00118] O raio hidrodinâmico médio z das micelas de caseína foi determinado após a homogeneização com o uso de um aparelho Nanosizer ZS (Malvern Instruments®, Reino Unido) e ficou em torno de 200 a 250 nm. O índice de polidispersividade correspondente ficou abaixo de 0,2, indicando que a amostra exibia uma distribuição de tamanho de partícula monodispersa.

Preparação da Dispersão de IPS

[00119] Para aprimorar a solubilidade da proteína de soja, as proteínas de soja foram extraídas da farinha de soja não OGM (Soy Flour 7B IP, disponível junto à ADM, Decatur, Il, EUA; lote 413936) com o uso do processo de precipitação isoelétrica branda para minimizar a desnaturação de proteína. Com esse objetivo, a farinha de soja foi dispersa em água MilliQ por 90 minutos sob agitação à temperatura ambiente. A razão entre farinha e água era de 1:8 (100 g de farinha para 800 g de água ao pH: 6,7). Após a dispersão, o pH foi ajustado para 7,5 com o uso de 1 M de NaOH, e a dispersão foi centrifugada em garrafa de 1 litro por 30 minutos a 9.000 g à temperatura ambiente. O sobrenadante foi depois coletado, e o pH foi ajustado para 4,8 com o uso de 1 M de HCL a fim de precipitar as proteínas. Então, a dispersão foi centrifugada novamente nas mesmas condições de antes. Após a centrifugação, o precipitado foi extraído e triturado com um pilão a fim de reduzir o tamanho de partícula e aprimorar a capacidade de hidratação. Depois disso, o precipitado foi solubilizado na menor quantidade de água possível (razão de massa de precipitado/água de 1:4) sob misturação por pelo menos 10 minutos, e o pH foi ajustado para 7,0 mediante a adição de 1 M de NaOH. Após a solubilização completa, a dispersão de isolado de proteína de soja foi congelada e liofilizada para se obter um pó. A composição do pó era (g/100 g de pó úmido): proteína (Nx6,25) 91,3, Ca 0,057, Mg 0,073, Na 1,59, K 0,37, Cl 0,62, P 0,63. Pode ser observado que a quantidade de Na e Cl mineral era bastante alta devido às etapas de ajuste de pH necessárias para a extração da proteína. As frações diferentes de proteínas de soja foram identificadas por meio de eletroforese em SDS-PAGE, o que revelou a presença de ambas as frações principais de proteínas da soja: 7S e 11S.

[00120] A dispersão de estoque de IPS foi preparada em uma concentração de proteína de 10%, em peso. Os IPS foram dispersos em água MilliQ durante 4 horas à temperatura ambiente sob misturação. As dispersões foram, então, armazenadas de um dia para o outro a 4°C para permitir a hidratação completa e diminuir a camada de espuma que se formou durante a misturação.

Preparação das Misturas de MCI/IPS

[00121] As dispersões de MCI e IPS preparadas conforme descrito abaixo foram misturadas em peso na razão de CPL:IPS de 75:25 e 50:50 após a misturação à temperatura ambiente por pelo menos 10 minutos com o uso de um agitador magnético.

Preparo da Emulsão

[00122] As emulsões O/A foram preparadas mediante a adição de óleo de girassol com alto teor oleico (Oleificio Sabo, Manno, Suíça) às dispersões de proteínas, de modo que a amostra total resultou em um conteúdo de óleo de 2,5, 5 e 10%, em peso, e um teor de proteína constante de 3%, em peso, por meio da diluição das dispersões de estoque preparadas em 10%, em peso. Os sistemas de óleo/água foram subsequentemente pré-homogeneizados com o uso de um Ultra-Turrax T25 básico (IKA®, Suíça) a 11.000 rpm/min durante 1 minuto para um volume de 500 mL. As emulsões pré-homogeneizadas foram posteriormente homogeneizadas sob alta pressão com um PandaPLUS HomoGenius 2000 (GEA®, Alemanha) ajustado a 50 bares para a primeira válvula e a 250 bares para a segunda, a fim de se obter uma pressão total de 300 bares.

[00123] As emulsões foram homogeneizadas duas vezes por este método. Após a homogeneização, o pH foi ajustado para 7,0 mediante a adição de 1 M de NaOH. Para amostras que contêm cálcio, a quantidade necessária de CaCl2,2(H2O) foi adicionada à amostra com pH 7,0, e a emulsão foi agitada por uma hora à temperatura ambiente. As amostras foram, então, aquecidas até 95°C durante 15 minutos em um banho de água quente ajustado a 97°C. As emulsões foram posteriormente resfriadas em água gelada durante 20 minutos e armazenadas a 4°C durante uma hora.

[00124] Após o resfriamento, as emulsões tratadas termicamente foram submetidas em seguida ao cisalhamento a 16.000 rpm durante 2 minutos com o uso de um Ultra-Turrax T25 básico (IKA®, Suíça) em um béquer com um volume de 60 mL. As emulsões foram posteriormente armazenadas a 4°C até que as análises fossem realizadas.

Distribuição de tamanho de partícula

[00125] Para avaliar a distribuição de tamanho de partícula, as emulsões foram analisadas após o cisalhamento por dispersão dinâmica de luz com o uso de um MasterSizer 3000 (Malvern Instruments Ltd®, Reino Unido). A amostra de emulsão foi dispersa na célula de medição Hydro SM até que uma taxa de obscurecimento de 9 a 10% fosse obtida. Amostras não aquecidas e aquecidas foram analisadas. As medições foram realizadas três vezes e a média das três replicações foi registrada.

Microestrutura de Agregados de Proteína Criosseccionamento de Amostras

[00126] Cortes criogênicos foram feitos para analisar as amostras por CLSM. Com essa finalidade, a sacarose e o formaldeído foram adicionados às amostras para conservá-las. As porcentagens são: para a sacarose, 30%, em peso, do volume total, e 3,7%, em peso, para o formaldeído. As amostras foram homogeneizadas com o uso de um vórtice e armazenadas de um dia para o outro a 4°C e antes de se iniciar as análises.

[00127] Depois, as amostras foram fixadas. Esta etapa consistia em adicionar 0,5 g da amostra em 1 g de composto de Optimum Cutting Temperature (OCT) para seccionamento em criostato, Tissue-Tek®. A composição foi homogeneizada e 0,1 g foi adicionado ao suporte de amostra do criostato, ele próprio já contendo composto de OCT para seccionamento em criostato, Tissue-Tek®.

[00128] O suporte de amostra de criostato foi imerso em um frasco plástico que contém 80 mL de 2-metilbutano (99%, disponível junto à Sigma Aldrich®, EUA), ele próprio imerso em uma caixa isolada contendo nitrogênio líquido. A solução de 2-metilbutano assegura um bom congelamento da amostra, protegendo-a contra a secagem.

[00129] As amostras foram, então, colocadas em um criostato CM 3050 (Leica®, Suíça). Foram realizados cortes em um micrótomo com 7 μm de espessura a -21°C. As lâminas para microscópio foram conservadas em um congelador a -20°C até que as análises fossem realizadas.

[00130] As lâminas para microscópio foram previamente tratadas com HistoGrip (50x concentrado, disponível junto à ThermoFisher Scientific®, EUA) para aderir o tecido às lâminas de vidro e evitar a remoção dos tecidos durante processos adversos.

Microscopia Confocal de Varredura a Laser

[00131] As emulsões de proteínas mistas foram analisadas com o uso de uma imunomarcação de proteína específica para fazer a distinção entre as proteínas do leite e as de soja. De acordo com Auty (2013), a imunomarcação é mais comumente usada para proteínas e exige um anticorpo específico para atingir as proteínas de interesse, isto é, CPL e IPS. Os resultados da imunomarcação dependem fortemente da especificidade do anticorpo primário em relação ao epítopo-alvo. A desnaturação térmica pode ter um impacto na imunorreatividade da proteína-alvo, especialmente à medida que as proteínas se submetem a um tratamento térmico severo no presente experimento. Esse tratamento pode afetar a especificidade dos anticorpos e diminuir a eficácia da marcação.

[00132] Foi realizada uma imunomarcação em duas etapas, com o uso de um anticorpo secundário marcado de maneira fluorescente para se ligar ao anticorpo primário, uma vez que isso aumenta a relação sinal/ruído.

[00133] Antes de usar anticorpos para detectar proteínas, a superfície de ligação restante precisa ser bloqueada para impedir a ligação não específica de anticorpos. O soro de cabra normal, Invitrogen PCN 5000 (ThermoFisher Scientific®, EUA), foi usado como um bloqueador. Foram adicionados 25 μl de soro de cabra normal a 1 mL de tampão de diluição de anticorpos {Tris 50 mM-NaCl 150 mM - PEG 0,1% - BSA 2,5% a pH 8,6}. A preparação foi posteriormente centrifugada a 4.000 g por 10 minutos com o uso da centrífuga Eppendorf® 5702 (Vaudaux-Eppendorf AG®, Suíça). As lâminas de microscópio foram, durante esse momento, enxaguadas com o uso de água milliQ para eliminar o Tissus Tek®. O soro de cabra normal foi aplicado nas lâminas de microscópio durante 20 minutos e enxaguado em três pratos de coloração, dois deles sendo preenchidos com água milliQ e o último, com tampão de enxágue {Tris 50 mM-NaCl 1,50 MPEG 1% a pH 8,6}. Os anticorpos primários foram preparados na diluição de 1:200 para o anticorpo da soja e na diluição de 1:50 para o anticorpo da caseína K. Diluições diferentes foram realizadas anteriormente a fim de se escolher a mais eficaz. Vinte (20) μl de anticaseína k de coelho (Antibodies.Online, EUA) foram adicionados a 1 mL de solução para diluições de anticorpos e homogeneizados com o uso de um vórtice. O mesmo trabalho prático foi feito para preparar o anticorpo da proteína de soja com o uso de anticorpo antiproteína de soja de galinha (Antibodies.Online, EUA), ajustando-se à diluição escolhida. Os dois anticorpos foram misturados em conjunto, 1 mL de cada um sendo colocado em um tubo Eppendorf®. O tubo Eppendorf® foi posteriormente centrifugado a 4.000 g por 10 minutos com o uso da centrífuga Eppendorf® 5702 (Vaudaux-Eppendorf AG®, Suíça). Os anticorpos primários foram, então, colocados nas lâminas para microscópio de um dia para o outro a 4°C em condições úmidas. Após a incubação, as lâminas de microscópio são enxaguadas em três placas de coloração preenchidas com tampão enxaguado, e as amostras foram deixadas 10 minutos nas últimas. Durante esse momento, os anticorpos secundários foram preparados seguindo a mesma manipulação dos anticorpos primários. Os anticorpos de cabra anti-IgY de galinha (H&L), Dylight 488 (Agrisera®, Suécia) e de cabra anti-IgY de coelho (H&L), Dylight 405 (Agrisera®, Suécia) foram usados como anticorpos secundários. Os anticorpos secundários foram colocados nas lâminas para microscópio por 1 hora e enxaguados em três placas de coloração preenchidas com água MilliQ.

[00134] Para visualizar as gotículas de óleo, as lâminas de microscópio foram também tingidas com o Nile Red solubilizado em etanol, por 10 minutos e enxaguadas em água MilliQ. As lâminas foram, então, montadas com um conjunto de meio de montagem Vectashield Hard Set Mounting Medium (Vector Laboratories®, EUA).

[00135] As lâminas para microscópio foram depois analisadas com o uso de um microscópio de varredura confocal Zeiss® LSM 710 (Zeiss®, Alemanha). Uma objetiva PL APO de 10x/0,45 ~/0,17/PL APO e 63x/ 1,4 de óleo/DIC 420782-9900 foi usada em todas as imagens.

[00136] O controle de saturação permite verificar a especificidade do anticorpo primário para a proteína e assegurar que o anticorpo secundário seja específico para o primeiro. Para esse propósito, foram adicionadas proteínas na quantidade de 2,5 μl/mL à preparação de anticorpos primários. Se o anticorpo primário e o secundário forem específicos, um não deve ter um sinal e um fundo em CLSM. O controle da emissão espectral de Nile Red foi também realizado para assegurar que cada emissão espectral seja suficientemente separada para evitar superposição.

Propriedades de fluxo

[00137] Um dia após o cisalhamento, foram realizados experimentos de fluxo com o uso de um reômetro de tensão controlada Physica MCR501 (Anton Paar®, Áustria) com geometria de cilindros concêntricos CC27-SS/S (diâmetro = 27 mm, vão = 1,14 mm, disponível junto à Anton Paar®, Áustria).

[00138] As medições de fluxo em estado estacionário foram conduzidas em uma temperatura constante de 25°C, sendo que uma tensão de cisalhamento de 100 1/s foi aplicada às amostras durante 5 minutos, seguido de quatro taxas de cisalhamento, uma de 0,1 a 500 1/s e outra de 500 a 0,1 1/s, as mesmas foram feitas duas vezes; foram feitas 15 medições a cada 30 segundos. A viscosidade aparente foi registrada como uma função da taxa de cisalhamento.

[00139] Para cada medição, uma alíquota (19 mL) da amostra de emulsão foi despejada no recipiente. As medições foram realizadas três vezes e a média das três replicações foi registrada.

Teor de Proteína Solúvel

[00140] A fim de caracterizar o teor de proteínas solúveis nos produtos da invenção, as emulsões foram centrifugadas a 16.000 g à temperatura ambiente durante 20 minutos com o uso de uma centrífuga 5418 Eppendorf® (Vaudaux-Eppendorf AG®, Suíça) um dia após a produção. O sobrenadante foi cuidadosamente retirado e armazenado a 4°C para ser analisado por cromatografia líquida de fase reversa de ultraeficiência (RP-UPLC).

[00141] O sistema de UPLC (Waters Corp Milford Ma, EUA) consistia em uma bomba binária, um autoamostrador de temperatura controlada (gerenciador de amostra - UPSMPM6R) e um detector de matriz de fotodiodo (UPPDA-E). O equipamento foi controlado pelo software Empower® 3, versão Pro.

[00142] As separações foram realizadas em uma coluna analítica de fase reversa Acquity UPLC® BEH300 C4 1,7 μm de 2,1 x 150 mm (Waters Corp Milford Ma, EUA) e em uma pré-coluna VANGUARDTM BEH300 C4 1,7 μm de 2,1 x 5 mm (Waters Corp Milford Ma, EUA). Os frascos de UPLC foram mantidos em temperatura constante entre 8°C ± 2°C e injetados pelo sistema de gerenciamento de amostras. Foram usadas uma seringa de injeção de 500 μl e uma alça de injeção de 250 μl.

[00143] Os padrões de caseínas e proteínas de soja foram preparados em concentrações de 0,1, 0,3, 1, 3, e 5%, em peso, por diluição em água MilliQ a partir de uma solução de referência de 10%, em peso. Em um microtubo Eppendorf® de 1,5 mL, 200 μl da amostra e 800 μl de tampão {Guanidina-HCl 7,5 M, citrato trissódico 6,25 mM, DTT 23 mM} foram adicionados. As massas da amostra e do tampão foram pesadas com precisão. A composição foi, então, homogeneizada com o uso de um vórtice e incubada em um misturador Eppendorf® Thermomixer Compact (Vaudaux-Eppendorf AG®, Suíça) a 60°C durante 10 minutos a 650 rpm.

[00144] Após a incubação, as amostras foram homogeneizadas e centrifugadas a 16.000 g durante 10 minutos à temperatura ambiente com o uso da centrífuga Eppendorf® 5418 (Vaudaux Eppendorf AG®, Suíça). O sobrenadante foi, então, cuidadosamente retirado e introduzido em um frasco de UPLC, com atenção voltada para a camada de gordura e também para não suspender os péletes, caso estivessem presentes. O volume de injeção foi variável de 30 μl a 150 μl, adaptado ao teor de proteína da amostra (determinado pelo método Kjeldahl, Nx6,38) para ter sinal suficiente. Os padrões também foram injetados com volumes ajustados levando em conta a variabilidade.

[00145] Uma eluição gradiente foi executada com dois solventes misturados durante a eluição. O solvente A consistia em 0,1% de TFA em água e o solvente B, em 0,1% de TFA em acetonitrila/água (90/10) (v:v). As separações foram realizadas com um gradiente linear de 15 a 35% de B em 4 minutos (5% de B.min-1), 35 a 47% de B em 24 minutos (0,5% de B.min-1) e de 47% de B a 80% de B em 4 minutos (8,25% de B.min-1). Seguiu-se uma eluição isocrática a 80% B durante 1 minuto. Então, retornou-se linearmente à condição inicial em 2 minutos, seguido do reequilíbrio da coluna por 5 minutos.

[00146] A vazão foi de 0,6 mL.min-1, e a temperatura da coluna foi mantida constante a 40 ± 1°C. A captura foi obtida a À = 214 nm (resolução 2,4 nm - 20 pontos/s - tempo de exposição automático).

[00147] Cada cromatograma foi integrado manualmente. Para as curvas de calibração, a área total foi plotada como uma função da quantidade de proteínas injetadas. O teor de proteína solúvel foi calculado a partir da razão entre quantidade de proteína presente no sobrenadante após centrifugação e a quantidade total de proteína presente na emulsão sem centrifugação, sendo expresso em percentagem.

Resultados Distribuição de Tamanho de Partícula

[00148] As Figuras 1A, B e C mostram que mediante o tratamento térmico e cisalhamento em razão de CPL:IPS de 75:25, a distribuição de tamanho das emulsões em pH 7,0 exibe um pico em torno de 400 a 600 nm para os 3 teores de óleo de girassol testados (2,5, 5 e 10%, em peso). Ao invés disso, as partículas maiores são formadas quando o tratamento térmico é realizado na presença de 5 mM de cálcio livre adicionado. Por conseguinte, há um desvio claro do pico da distribuição de tamanho para cerca de 10 a 25 mícrons, indicando que as gotículas de óleo iniciais foram agregadas a partículas maiores à base de proteína.

[00149] As Figuras 2A, B e C mostram que mediante o tratamento térmico e cisalhamento em razão de CPL:IPS de 50:50, a distribuição de tamanho das emulsões em pH 7,0 exibe um pico em torno de 400 a 600 nm para os 3 teores de óleo de girassol testados (2,5, 5 e 10% em peso). Ao invés disso, as partículas maiores são formadas quando o tratamento térmico é realizado na presença de 10 mM de cálcio livre adicionado. Por conseguinte, há um desvio claro do pico da distribuição de tamanho para cerca de 10 a 25 mícrons, indicando que as gotículas de óleo iniciais foram agregadas a partículas maiores à base de proteína.

Microestrutura e Teor de Proteína Solúvel

[00150] A microestrutura dos agregados à base de proteína desta invenção é claramente mostrada nas Figuras 3 (razão de 75:25) e 4 (50:50) para emulsões que contêm 5%, em peso, de óleo de girassol com alto teor oleico. A Figura 3A mostra, para a razão de CPL/IPS de 75/25, que pequenos agregados conectados foram obtidos em torno de gotículas de óleo bem definidas. A marcação tanto de CPL como de IPS mostra que as proteínas não estavam localizadas em posição próxima nos agregados, uma vez que ambas as marcações específicas poderiam ser facilmente discriminadas. A quantidade de proteínas solúveis era de cerca de 97%, indicando que apenas uma pequena fração de ambas as fontes de proteínas estava participando da formação de agregado. Ao invés disso, as partículas maiores e mais compactas foram obtidas na presença de 5 mM de cálcio (Figura 3B). As gotículas de óleo eram menos visíveis e estavam fortemente embutidas na estrutura de agregado. A marcação de CPL e IPS estava situada dentro das partículas, indicando que elas eram espacialmente muito próximas. A quantidade de proteínas solúveis nessa amostra foi menor que 4%, mostrando que a maior parte do CPL e do IPS estava envolvida na estrutura agregada. A Figura 4 apresenta micrografias de misturas de CPL/IPS na razão de peso de 50/50 na presença de 10 mM de CaCl2. Na ausência de cálcio livre adicionado (Figura 4A), foram vistos agregados pequenos que exibem numerosas gotículas de óleo discretas embutidas. Com CaCl2 adicionado, as gotículas de óleo foram muito mais embutidas em agregados de proteína maiores, em que tanto CPL como IPS estavam envolvidos, conforme pode ser visto com a comarcação das duas fontes de proteína (Figura 4B). Verificou-se que a quantidade de proteína solúvel a um pH 7,0 era de cerca de 85,9%, conforme medido por UPLC. Isso indica que a maioria das proteínas não estava participando das estruturas agregadas. Na presença de cloreto de cálcio, a quantidade de proteínas solúveis caiu drasticamente para alcançar 13,4%, indicando que a maioria das proteínas fazia parte dos agregados, contribuindo, portanto, para formar partículas maiores.

Propriedades de Fluxo e Viscosidade de Cisalhamento

[00151] As curvas de fluxo de misturas de CPL/IPS com teor de óleo de girassol com alto teor oleico diferente são mostradas nas Figuras 5 e 6. A Figura 5 mostra que, para a razão de mistura de 75/25, a adição de cloreto de cálcio promoveu um comportamento de diminuição de viscosidade sob cisalhamento, e que esse efeito foi aumentado com o teor de óleo na mistura inicial (Figuras 5A, B e C). Curiosamente, o sistema em pH 7,0 na ausência de cloreto de cálcio sempre exibiu um comportamento de diminuição de viscosidade sob cisalhamento inferior e foi muito menos afetado pelo teor de fato, indicando que as estruturas de proteínas formadas não foram capazes de afetar fortemente a viscosidade de volume dos sistemas. Isso foi muito diferente no caso das amostras da presente invenção, em que claramente a adição de cloreto de cálcio promoveu a agregação de proteína, levando a partículas que afetam muito a viscosidade, e, portanto, permitem a redução de gordura.

[00152] Os dados de fluxo relacionados à mistura de CPL/IPS na razão de mistura em peso de 50/50 são apresentados na Figura 6. Pode ser visto, para a razão de 75/25, que na presença de CaCl2 10 mM, as curvas exibiram um comportamento de diminuição de viscosidade sob cisalhamento forte que foi intensificado pela presença de teores crescentes em óleo de girassol com alto teor oleico (Figuras 6A, B e C). Isto confirma que os agregados de proteína da invenção foram capazes de ocupar mais espaço e estavam afetando a viscosidade de volume, que não é o caso do sistema de controle em pH 7,0 na ausência de cálcio. A emulsão produzida em pH 7,0 exibiu um comportamento de fluxo newtoniano com uma independência da viscosidade como uma função da taxa de cisalhamento. Isso é explicado pelo fato de que a viscosidade é principalmente induzida pela fração de volume de óleo e pelo fato de que as gotículas de óleo não estão interagindo.

[00153] A Figura 7 resume a viscosidade de cisalhamento extraída das curvas de fluxo a uma taxa de cisalhamento de 10 1/s, que é relevante para condições fisiológicas na boca. Para ambos os sistemas CPL/IPS, é óbvio que a adição de óleo aumenta a viscosidade de cisalhamento, mas curiosamente, os valores obtidos nas amostras da presente invenção foram, para ambas as razões de CPL/IPS, maiores que os respectivos controles em pH 7,0 na ausência de CaCl2 adicionado. Isso mostra novamente o potencial da presente invenção de diminuir o teor de gordura, mantendo, ao mesmo tempo, a viscosidade e a sensação bucal.

Exemplo 6: Adição de cloreto de cálcio em emulsões estabilizadas com concentrado de proteína do leite/isolado de proteína de soja em escala piloto

[00154] Os sistemas testados no Exemplo 6 foram reproduzidos em escala piloto para testar a sensibilidade da presente invenção às condições industriais. O CPL usado foi similar ao do Exemplo 5, isto é, o Promilk852B foi adquirido junto à Ingredia (Arras, França). O isolado de proteína de soja era um Profam 974 - IP comercial da ADM (Decatur, IL, EUA). Ele é obtido por precipitação isoelétrica de proteínas a partir da farinha de soja desengordurada. O teor de proteína no pó seco era de 95,4%, em peso, enquanto o teor de gordura era de 0,6%, em peso.

Preparação das Amostras

[00155] As dispersões de MCP e IPS com teor de proteína a 3%, em peso, foram preparadas em água de osmose reversa (OR). Um lote de 180 kg de CPL foi preparado por meio da dispersão, sob misturação mecânica por 30 minutos, de 6,6 kg de CPL em pó em 173,4 kg em água de OR a 50°C em um tanque de aço inoxidável. Para IPS, 2,1 kg de IPS em pó foram dispersos em 57,9 kg de água de OR a 20°C. Após 30 minutos, a dispersão de CPL foi homogeneizada a 250/50 bar com o uso de um homogeneizador de alta pressão. O pH do CPL e do IPS foi ajustado a 20°C para pH 7,0 com o uso de ácido clorídrico a 10%. As dispersões de CPL e de IPS ajustadas para pH 7,0 foram misturadas em peso em lotes de 40 kg para alcançar a razão de mistura de CPL/IPS de 75/25 e 50/50, e foram agitadas a 20°C por 30 minutos. O óleo de girassol com alto teor oleico (Oleificio Sabo, Suíça) foi, então, adicionado à dispersão de proteína, produzindo 5%, em peso, de emulsões sob alto cisalhamento. A pré-emulsão foi, então, homogeneizada a 250/50 bar com o uso de um homogeneizador de alta pressão, e as amostras foram resfriadas até 10°C. O pH foi verificado novamente e, nas amostras da presente invenção, a quantidade necessária de CaCl2,2 (H2O) foi adicionada para aumentar o teor de 10 mM de cálcio livre para a razão de 75 de CPL/25 de IPS e 20 mM para a razão de 50 de CPL/50 de IPS. As amostras foram, então, tratadas termicamente a 95°C por 3 minutos com o uso de uma linha de injeção direta de vapor operando a 180 l/h. As amostras foram pré-aquecidas a 60°C para o tratamento de DSI e foram, então, resfriadas até 10°C com o uso de um trocador de calor tubular. As amostras foram, então, preenchidas em garrafas de 500 mL de polipropileno e armazenadas a 4°C para análise.

Distribuição de Tamanho de Partícula

[00156] A distribuição de tamanho de partícula das amostras foi determinada conforme descrito no Exemplo 1. O diâmetro médio ponderado D(4,3) foi relatado para as diferentes amostras.

Propriedades de Fluxo

[00157] As curvas de fluxo das amostras foram determinadas conforme descrito no Exemplo 1. A viscosidade de cisalhamento em 10 s-1 foi relatada para as amostras.

Microscopia Confocal de Varredura a Laser

[00158] As amostras foram preparadas e caracterizadas conforme descrito no Exemplo 5, exceto pelo fato de que as amostras não foram criosseccionadas, mas foram imageadas em formato líquido e que nenhuma imunomarcação específica foi usada para diferenciar CPL e IPS. Com esse objetivo, as amostras foram depositadas dentro de uma câmara plástica de 1 mm de profundidade, fechada por uma lamela de vidro para impedir artefatos de compressão e secagem. Para a marcação, o corante verde Fast (1%, em peso, em solução aquosa diluída 100 vezes para uso) foi usado para proteínas, enquanto o Nile Red (0,25%, em peso, em etanol, diluído 100 vezes para uso) foi usado para gotículas de óleo.

Proteínas Solúveis

[00159] As proteínas solúveis presentes na amostra foram determinadas por UPLC conforme descrito no Exemplo 5.

Resultados Tamanho de Partícula, Viscosidade e Proteínas Solúveis

[00160] O tamanho de partícula das amostras da presente invenção foi aumentado em comparação com as amostras que não continham CaCl2 adicionado para ambas as razões de misturação de CPL/IPS (Tabela 9). Isso indica que as gotículas de óleo iniciais se agregaram juntamente com a proteína para formar agregados maiores. A viscosidade a 10 1/s foi similar ou maior que a amostra de controle correspondente, mostrando que os agregados de proteína estavam impactando a viscosidade de volume das amostras para um teor de óleo similar nas amostras. Deve-se notar que as curvas de fluxo para as amostras da presente invenção exibiram um comportamento de diminuição de viscosidade sob cisalhamento, enquanto que para os controles, foram newtonianas, conforme descrito no Exemplo 5. O teor de proteína solúvel era muito baixo nas amostras da presente invenção (menor que 3%), enquanto era maior para os controles (até 62,2% para a razão de 50/50). Isso mostra que, conforme descrito no exemplo anterior, a presente invenção está fazendo com que a maior parte das proteínas se agregue com as gotículas de óleo para formar agregados maiores que afetam a viscosidade de volume. Tabela 9: Propriedades físico-químicas das amostras produzidas em escala piloto.

Microestrutura dos Agregados

[00161] A estrutura das amostras foi investigada por CSLM (Figuras 8 e 9). As amostras de controle exibiram uma distribuição homogênea de gotículas de óleo sem sinal de agregação marcado para ambas as razões de mistura de CPL/IPS (Figuras 8A e 9A). Isso explica por que a maioria das proteínas permaneceu solúvel, à medida que apenas uma fração limitada estava envolvida na estabilização da interface das gotículas de óleo. Na presença de CaCl2 adicionado para as amostras da presente invenção, as gotículas de óleo se agregaram para formar agregados maiores que eram gotículas de óleo embutidas para ambas as razões (Figuras 8B e 9B).

Exemplo 7: Agregados de proteína do leite e proteína de soja obtidos mediante a adição de lactato de cálcio em leite integral recombinado duplamente concentrado, em que 50% da proteína do leite foram substituídos por proteínas de soja.

[00162] O leite desnatado em pó (LDP) à baixa temperatura foi fornecido por Hochdorf (Suíça), e o isolado proteico da soja Clarisoy 170 foi fornecido por ADM (Illinois).

[00163] Uma vez que a concentração de proteína do isolado proteico da soja é maior que o leite desnatado em pó, os sólidos totais (ST) foram ajustados mediante a adição de maltodextrina DE 38-41 (Roquette, França), a fim de se alcançar 26% de ST. O óleo de girassol com alto teor oleico (Oleificio Sabo, Suíça) tem sido usado para substituir a gordura do leite.

[00164] Em um ST de 26%, o sistema foi formulado com 6,6% de proteína total (3% de proteína do leite, 3% de proteína de soja) e 7% de óleo.

[00165] A Tabela 10 mostra a composição do sistema de leite-soja. Tabela 10: Ingredientes principais e formulação exemplificadora de um sistema de LDP-proteína de soja 50:50 misturado com 26% de ST.

[00166] Para adição de cálcio, o lactato de cálcio (Merck, Alemanha) foi misturado a seco e adicionado juntamente com a maltodextrina durante o processo.

[00167] A Figura 10 mostra o processo usado para formular os sistemas de leite-ervilha.

[00168] A proteína de soja foi tratada para aprimorar a solubilidade, e o sistema de leite-soja foi formulado e processado conforme explicado no Exemplo 1. Resultados: Tabela 11:

[00169] A Tabela 11 mostra que a emulsão sem adição de lactato de cálcio continha 1,8 mM de cálcio iônico livre na forma de cálcio solúvel, o que não é suficiente para induzir uma agregação de proteína significativa durante o tratamento térmico. A adição de lactato de cálcio ao sistema levou a um aumento em cálcio iônico livre. Com a diminuição do pH, o cálcio no sistema foi liberado progressivamente até 2,9 mM em pH 6,39, e tanto o tamanho de partícula como a viscosidade aumentaram após o aquecimento das emulsões. O efeito no aumento de viscosidade é maior em pH mais baixo.

[00170] Quando o pH diminui ainda mais para 6,25, o cálcio livre aumentou para 3,1, levando à formação de agregados de tamanho médio (49,733 μm), mas, entretanto, perdendo parte do efeito da viscosidade em comparação com o pH 6,39. Isso indica que, para esse sistema específico, um cálcio livre de 3,1 a um pH de 6,25 já é muito alto. A fim de maximizar o aumento da viscosidade, é necessário usar menos cálcio livre e/ou um pH mais alto (por exemplo, pH 6,39 e 3,1 mM de cálcio livre).

Claims (19)

1. Método para produzir um produto alimentício ou de bebida, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: fornecer uma composição de ingredientes, que compreende caseínas micelares, proteína do soro do leite e proteína vegetal, que apresenta um pH de 6,2 a 6,8, e que apresenta uma concentração de 1 a 15% em peso de proteínas totais, sendo que a composição apresenta uma razão entre a caseína micelar e a proteína do soro do leite de 90/10 a 60/40, e uma razão entre caseínas micelares e proteína do soro do leite e a proteína vegetal de 80/20 a 20/80, adicionar cátions divalentes para fornecer uma concentração de 2 a 10 mM de cátions divalentes livres na composição de ingredientes para formar uma mistura, e, subsequentemente, tratar termicamente ingredientes mistura para formar proteínas aglomeradas que compreendem caseína micelar, proteína do soro do leite e proteínas vegetais para produzir o produto alimentício ou de bebida, sendo que os aglomerados apresentam um tamanho de 5 a 50 mícrons, como medido por diâmetro médio D(4,3), como medido por difração a laser.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tratamento térmico da mistura compreende tratar termicamente a uma temperatura de 80 a 125°C durante um período de 30 a 900 s ou a uma temperatura de 126°C ou maior por 3 a 45 s.

3. Método, de acordo com reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a proteína vegetal é selecionada do grupo que consiste em proteína de ervilha, proteína de soja ou uma combinação destas.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende homogeneizar a mistura.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a solubilidade da proteína vegetal foi melhorada pelo tratamento térmico da mistura.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que as protéinas aglomeradas apresentam de 10 a 40 mícrons, como medido por diâmetro médio D(4,3).

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que os cátions divalentes serem selecionados do grupo que consiste em cátions de Ca2+,Mg2+, e uma combinação destes.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o sal é um sal de cálcio, e os cátions divalentes são Ca2+.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o sal de cálcio é adicionado à composição de ingrediente até que a concentração de cátions divalentes de Ca2+ seja de 2,0 a 6,0 mM.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a proteína vegetal é proteína de ervilha, e o sal de cálcio é adicionado à composição de ingredientes até que a concentração de cátions divalentes de Ca2+ seja de 2,0 a 3,0 mM.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a proteína vegetal é proteína de soja, e o sal de cálcio é adicionado à composição de ingredientes até que a concentração de cátions divalentes de Ca2+ seja de 2,0 a 3,0 mM.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que um teor de proteína solúvel no produto final é menor ou igual a 30% em relação ao teor total de proteína.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a composição de ingredientes compreende de 0 a 36% em peso de gordura.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que compreende adicionar proteínas do soro do leite adicionais à composição de ingredientes, sendo que as caseínas micelar e a proteína do soro do leite, na composição de ingredientes, são fornecidas sob uma forma selecionada do grupo que consiste em leite cru, leite pasteurizado, leite concentrado obtido por tratamento em baixa temperatura, leite em pó obtido por tratamento em baixa temperatura, concentrado de proteína do leite, isolado de proteína de leite sob a forma líquida ou em pó, ou uma combinação destes, ao passo que as proteínas do soro do leite adicionais são fornecidas sob uma forma selecionada do grupo que consiste em soro do leite doce, concentrados de proteína do soro do leite, isolados de proteína do soro do leite sob a forma líquida, concentrada ou em pó, ou uma combinação desses.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição de ingredientes compreende de 2 a 9 % em peso do total de proteínas.

16. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a solubilidade da proteína vegetal foi melhorada pelo tratamento térmico e a homogeneização da mistura.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição de ingredientes compreende de 5 a 10 % em peso de gordura.

18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tratamento térmico da mistura compreende o tratamento térmico a uma temperatura de 80° a 100° C por um período de 0,5 a 4 minutos ou a uma temperatura ultra-elevada (UHT) de pelo menos 135° C por 3 a 45 segundos.

19. Produto alimentício ou de bebida, caracterizado pelo fato de que é obtido por meio do método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, e que compreende proteínas agregadas, que compreendem caseína micelar, soro do leite e agregados de proteína vegetal, sendo que o produto apresenta um pH de 6,2 a 6,8, e apresenta uma concentração de 1 a 15% em peso de proteínas totais, sendo que a composição apresenta uma razão entre a caseína micelar e a proteína do soro do leite de 90/10 a 60/40, uma razão entre caseínas micelares e proteína do soro do leite e a proteína vegetal de 80/20 a 20/80, e uma concentração de 2,0 a 10 mM de cátions divalentes livres na composição de ingredientes, sendo que as proteínas aglomeradas compreendem caseína, proteína do soro do leite e proteínas vegetais, e sendo que os aglomerados apresentam tamanho de 5 a 50 mícrons, como medido por diâmetro médio D(4,3), como medido por difração a laser.