BR112019022595B1 - Método para produção de uma ração animal e produto de milho floculado a vapor - Google Patents

Abstract

A invenção proporciona uma composição de ração animal compreendendo material vegetal de uma planta ou parte de planta transgênica expressando uma a-amilase termotolerante recombinante. A invenção proporciona adicionalmente métodos de melhoria da utilização de ração e diminuição de abscessos hepáticos. São também proporcionados métodos de produção de um produto de milho floculado a vapor e o produto de milho floculado a vapor assim produzido.

Description

INFORMAÇÃO DE PEDIDO RELACIONADO

[0001] Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório de patente Número de Série US 62/492,609, depositado em 1 de maio de 2017, a divulgação do qual é incorporada por referência aqui na sua totalidade.

DECLARAÇÃO DIZENDO RESPEITO À SUBMISSÃO ELETRÔNICA DE UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] Uma Listagem de Sequências no formato de texto ASCII, submetida sob 37 CFR § 1.821, intitulada "81324_ST25.txt", 15.179 bytes em tamanho, gerada em 26 de abril, 2018 e depositada através de EFS-WEB é proporcionada em vez de uma cópia em papel. Esta Listagem de Sequências é deste modo incorporada por referência na especificação quanto às suas divulgações.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] A presente invenção se relaciona com composições de ração animal e métodos de preparação e uso das mesmas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] As rações animais podem ser classificadas em dois grupos: (1) concentrados ou rações compostas e (2) forragens. Os concentrados ou rações compostas são ricos em valor energético, incluindo gordura, grãos de cereais e seus subprodutos (cevada, milho, aveia, centeio, trigo), farinhas ou bolos oleosos ricos em proteína (soja, canola, semente de algodão, amendoim e similares), e subprodutos do processamento de beterrabas-sacarinas, cana-de-açúcar, animais, e peixe, que podem ser produzidos na forma de péletes ou migalhas. Os concentrados ou rações compostas podem ser completos na medida em que conseguem proporcionar todas as necessidades alimentares requeridas diárias ou podem proporcionar uma parte da ração, suplementando qualquer outra coisa que possa ser proporcionado como uma ração alimentar. A forragem inclui pastagens, fenos, silagens, culturas de raízes, palheta e palha (hastes de milho).

[0005] A ração constitui o maior custo da criação de animais para produção alimentar. Assim, a presente invenção está dirigida a composições e métodos para melhoria da eficácia de utilização de ração animal, reduzindo deste modo o custo de produção.

[0006] Adicionalmente, em gado em parques de engorda, são comuns abscessos hepáticos causados por bactérias piogênicas. A prevalência de abscessos hepáticos aumenta com dietas com pouca forage/ricas em concentrado. A redução de abscessos hepáticos em gado em parques de engorda resulta em peso vivo, peso da carcaça, percentagem de curativo e corte da carcaça aumentados. O gado com abscessos hepáticos graves pode requerer corte adicional da carcaça e, em alguns casos, condenação de vísceras inteiras. A ruptura de um abscesso pode levar à contaminação da carcaça resultando em fluxo interrompido da carcaça, perda de tempo, custos aumentados e trabalho aumentado.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0007] Um aspecto da presente invenção proporciona uma composição de ração animal compreendendo α-amilase microbiana e métodos de uso da composição de ração animal para diminuir os abscessos hepáticos em gado. Em alguns aspectos, a α-amilase microbiana compreende um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 80% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1 ou um polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos cerca de 80% de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 e/ou SEQ ID NO:5. Em alguns aspectos, a composição de ração animal compreende milho floculado a vapor expressando uma α-amilase microbiana. São também proporcionados métodos de produção de um produto de milho floculado a vapor por floculação a vapor de grãos de milho de uma planta de milho transgênica expressando uma α-amilase microbiana, e o produto de milho floculado a vapor produzido a partir deles.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0008] A não ser que o contexto indique de outro modo é especificamente pretendido que as várias características da invenção descrita aqui possam ser usadas em qualquer combinação.

[0009] Além do mais, a presente invenção contempla também que, em algumas modalidades da invenção, qualquer característica ou combinação de características apresentada aqui possa ser excluída ou omitida. Para ilustrar, se a especificação afirma que uma composição compreende os componentes A, B e C, se pretende especificamente que qualquer um de A, B ou C, ou uma sua combinação, possa ser omitido e negado singularmente ou em qualquer combinação.

[0010] A não ser que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por um perito na técnica à qual esta invenção pertence. A terminologia usada na descrição da invenção aqui é para o propósito somente de descrição de modalidades particulares e não se destina a ser limitante da invenção.

[0011] Como usado na descrição da invenção e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" se destinam a incluir as formas singulares e plurais, a não ser que o contexto claramente indique de outro modo.

[0012] Como usado aqui, "e/ou" se refere a e engloba todas e quaisquer combinações possíveis de um ou mais dos itens listados associados, bem como a falta de combinações quando interpretados na alternativa ("ou").

[0013] O termo "cerca de", como usado aqui quando se refere a um valor mensurável tal como uma dosagem, uma quantidade ou período de tempo e similares, se destina a englobar variações de ± 20%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0,5%, ou mesmo ± 0,1% da quantidade especificada (p.ex., uma quantidade de peso ganho ou ração proporcionada).

[0014] Como usadas aqui, frases tais como "entre X e Y" e "entre cerca de X e Y" devem ser interpretadas como incluindo X e Y. Como usadas aqui, frases tais como "entre cerca de X e Y" significam "entre cerca de X e cerca de Y". Como usadas aqui, frases tais como "de cerca de X a Y" significam "de cerca de X a cerca de Y".

[0015] Os termos "compreendem", "compreende" e "compreendendo", como usados aqui, especificam a presença de características, números inteiros, etapas, operações, elementos, e/ou componentes apresentados, mas não excluem a presença ou adição de uma ou mais de outras suas características, números inteiros, etapas, operações, elementos, componentes, e/ou seus grupos.

[0016] Como usada aqui, a frase transicional "consistindo essencialmente em" significa que o escopo de uma reivindicação é para ser interpretado como englobando os materiais ou etapas especificados recitados na reivindicação e aqueles que não afetam materialmente a(s) caraterística(s) básica(s) e nova(s) da invenção reivindicada. Assim sendo, o termo "consistindo essencialmente em" quando usado em uma reivindicação desta invenção não se destina a ser interpretado como sendo equivalente a "compreendendo".

[0017] A presente invenção está dirigida a composições e métodos para melhoria da eficácia de utilização de ração animal, reduzindo deste modo o custo de produção. Os presentes inventores fizeram a constatação surpreendente de que os animais alimentados com uma composição de ração animal compreendendo α-amilase microbiana podem ter um aumento no ganho de peso diário médio ou taxa de crescimento, um aumento da eficácia de utilização de ração ou requerer um número reduzido de dias para alcançar um peso desejado em comparação com animais não alimentados com a referida composição de ração.

[0018] Conformemente, em um aspecto da invenção, é proporcionada uma composição de ração animal compreendendo α- amilase microbiana. Em aspectos adicionais da invenção, a α-amilase microbiana compreende um polipeptídeo tendo pelo menos 80% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1 ou um polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 e/ou SEQ ID NO:5. Em algumas modalidades, a α-amilase é um líquido. Assim, em algumas modalidades da invenção, uma composição de ração animal da invenção pode ser um suplemento que compreende uma α-amilase microbiana líquida que pode ser adicionada à ração proporcionada a um animal.

[0019] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição de ração animal compreendendo material vegetal, em que o material vegetal compreende uma α-amilase recombinante expressa. Em algumas modalidades particulares, a α-amilase recombinante expressa é codificada por uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos cerca de 80% de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 e/ou SEQ ID NO:5 ou compreende um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 80% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1. Assim, em modalidades adicionais, a invenção proporciona adicionalmente uma composição de ração animal compreendendo material vegetal de uma planta ou parte de planta transgênica compreendendo uma α- amilase recombinante codificada por uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos cerca de 80% de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 e/ou SEQ ID NO:5 ou compreendendo um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 80% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1.

[0020] Em modalidades particulares, a planta ou parte de planta transgênica pode compreender cerca de 1% a cerca de 100% em peso do material vegetal. Assim, por exemplo, a planta ou parte de planta transgênica pode compreender cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% em peso do material vegetal, e similares, ou qualquer gama intermédia. Assim, em algumas modalidades, o material vegetal pode compreender um ou mais tipos diferentes de plantas. Assim, por exemplo, o material vegetal pode ser de uma planta na qual α-amilase recombinante ou heteróloga (p.ex., microbiana) é expressa. Em outras modalidades, o material vegetal compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em material de uma planta na qual α-amilase recombinante ou heteróloga (p.ex., microbiana) é expressa e material de uma planta não expressando a referida α-amilase recombinante ou heteróloga (p.ex., uma planta de commodity). Assim, em algumas modalidades, quando o material vegetal compreende material de uma planta na qual α-amilase recombinante ou heteróloga (p.ex., microbiana) é expressa e material de uma planta não expressando a referida α-amilase recombinante ou heteróloga (p.ex., uma planta de commodity), o material de uma planta na qual α-amilase recombinante ou heteróloga (p.ex., microbiana) é expressa pode compreender de cerca de 1% a cerca de 99% em peso do material vegetal e o material de uma planta não expressando a referida α-amilase recombinante ou heteróloga pode compreender de cerca de 99% a cerca de 1% por peso do material vegetal.

[0021] Em modalidades adicionais, o material vegetal pode compreender de cerca de 5% a cerca de 100% em peso da composição de ração animal. Assim, por exemplo, o material vegetal pode compreender cerca de 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% em peso da composição de ração animal, e similares, e/ou qualquer gama intermédia.

[0022] A ração animal da invenção pode estar em qualquer forma que seja útil com esta invenção. Assim, em algumas modalidades, a forma da ração animal pode ser, mas não está limitada a, péletes, grão incluindo um ou mais tipos de grão misturado (i.e., grão misto), uma mistura de grãos e péletes, silagem, miolo inteiro, floculado a vapor, laminado a seco, grãos grosseiramente rachados (p.ex., milho grosseiramente rachado), milho com elevada umidade e/ou qualquer sua combinação. Em algumas modalidades, a ração animal pode compreender outros componentes, incluindo mas não se limitando a grãos grosseiramente rachados, grãos úmidos destilados, grãos secos destilados, silagem de milho, suplementos/suplementos líquidos, ração de glúten de milho, e/ou feno triturado.

[0023] Como usado aqui, o termo "material vegetal" inclui qualquer parte de planta, incluindo mas não se limitando a endosperma, embriões (gérmen), pericárpio (revestimento de farelo), pedículo (tampa da ponta), pólen, óvulos, sementes (grão), folhas, flores, ramos, caules, fruto, grãos, espigas, sabugos, cascas, hastes, raízes, pontas de raízes, anteras, células vegetais incluindo células vegetais que estão intactas em plantas e/ou partes de plantas, protoplastos vegetais, tecidos vegetais, culturas de células de tecidos vegetais, calos vegetais, tufos vegetais, e similares. Ainda, conforme usado no presente documento, "célula vegetal" se refere a uma unidade fisiológica e estrutural da planta, que compreende uma parede celular e também pode se referir a um protoplasto. Uma célula vegetal da invenção pode estar na forma de uma única célula isolada ou pode ser uma célula cultivada ou pode ser uma parte de uma unidade de organização superior tal como, por exemplo, um tecido vegetal ou um órgão vegetal. Um "protoplasto" é uma célula vegetal isolada sem uma parede celular ou com somente partes da parede celular. Assim, em algumas modalidades da invenção, uma planta ou parte de planta transgênica compreendendo uma α- amilase recombinante codificada por uma sequência de nucleotídeos da invenção compreende uma célula compreendendo a referida α-amilase recombinante codificada por uma sequência de nucleotídeos da invenção, em que a célula é uma célula de qualquer planta ou parte de planta incluindo, mas não se limitando a, uma célula da raiz, uma célula da folha, uma célula da cultura de tecidos, uma célula da semente, uma célula da flor, uma célula do fruto, uma célula do pólen e similares. Em modalidades representativas, o material vegetal pode ser uma semente ou grão.

[0024] O material vegetal pode ser de qualquer planta. Em algumas modalidades, o material vegetal é de uma planta na qual α-amilase recombinante ou heteróloga (p.ex., microbiana) pode ser expressa. Adicionalmente, como discutido aqui, em outras modalidades, o material vegetal pode ser uma mistura de material vegetal de uma planta na qual α-amilase recombinante ou heteróloga (p.ex., microbiana) é expressa e de uma planta não expressando a referida α-amilase recombinante ou heteróloga (p.ex., uma planta de commodity). Assim, em modalidades representativas, o material vegetal pode ser uma mistura de material vegetal “de commodity” normal (p.ex., milho de commodity) e material vegetal de uma planta transgênica da presente invenção expressando α-amilase recombinante ou heteróloga.

[0025] Assim, em algumas modalidades, o material vegetal pode ser de uma planta de milho, uma planta de sorgo, uma planta de trigo, uma planta de cevada, uma planta de centeio, uma planta de aveia, uma planta de arroz, e/ou uma planta de milheto. Em modalidades representativas, o material vegetal pode ser de uma planta de milho. Em outras modalidades, o material vegetal pode ser uma semente ou grão de uma planta de milho. Em modalidades particulares, o material vegetal pode ser uma planta de milho compreendendo o evento 3272 de milho (ver, Documento de Patente No. de Série 8,093,453 B2).

[0026] Em alguma modalidade, a invenção proporciona uma “ração mista total” compreendendo material vegetal de uma planta ou parte de planta de milho transgênica estavelmente transformada com uma α- amilase recombinante codificada por uma sequência de nucleotídeos tendo cerca de 80% de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 e/ou SEQ ID NO:5 ou compreendendo um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 80% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1. Como usada aqui, “ração mista total” pode significar a tolerância de ração de 24 horas para um animal individual que inclui, por exemplo, material vegetal de uma planta ou parte de planta de milho transgênica (p.ex., grãos de milho, milho grosseiramente rachado, e similares), suplementos e aditivos (p.ex., vitaminas e minerais), e/ou “forragens” (p.ex., pastagens, fenos, silagem, culturas de raízes, palheta, palha (hastes de milho)).

[0027] Em algumas modalidades, o material vegetal da planta ou parte de planta de milho transgênica compreende de cerca de 1% a cerca de 100% em peso da ração mista total. Assim, por exemplo, a planta ou parte de planta transgênica pode compreender cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% em peso do material vegetal, e similares, e/ou qualquer gama intermédia.

[0028] Em outras modalidades é proporcionada uma composição de ração animal que compreende uma ração mista total da invenção. Em algumas modalidades, a ração mista total pode compreender cerca de 5% a cerca de 100% em peso da composição de ração animal. Assim, por exemplo, a ração mista total pode compreender cerca de 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% em peso da composição de ração animal, e similares, e/ou qualquer gama intermédia. Em modalidades representativas, a ração mista total compreende cerca de 50% da composição de ração animal.

[0029] Em modalidades ainda adicionais, a invenção proporciona uma ração de milho compreendendo material vegetal de uma planta ou parte de planta de milho transgênica estavelmente transformada com uma α-amilase recombinante codificada por uma sequência de nucleotídeos tendo cerca de 80% de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 e/ou SEQ ID NO:5 ou compreendendo um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 80% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1. Como usada aqui, “ração de milho” significa a tolerância de milho de 24 horas para um animal individual.

[0030] Em algumas modalidades, o material vegetal da planta ou parte de planta de milho transgênica compreende de cerca de 1% a cerca de 100% em peso da ração de milho. Assim, por exemplo, a planta ou parte de planta transgênica pode compreender cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% em peso do material vegetal, e similares, e/ou qualquer gama intermédia.

[0031] Em outras modalidades é proporcionada uma composição de ração animal que compreende uma ração de milho da invenção. Em algumas modalidades, a ração de milho pode compreender cerca de 5% a cerca de 100% em peso da composição de ração animal. Assim, por exemplo, a ração de milho pode compreender cerca de 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% em peso da composição de ração animal, e similares, e/ou qualquer gama intermédia. Em modalidades representativas, a ração de milho compreende cerca de 50% da composição de ração animal.

[0032] Em algumas modalidades, a ração mista total pode compreender ração de glúten de milho úmida que pode ser cerca de 10% a cerca de 40% em peso da composição de ração animal. Em modalidades adicionais, a ração mista total pode compreender ração de glúten de milho úmida que pode ser cerca de 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, em peso da composição de ração animal.

[0033] Em outras modalidades, a ração mista total pode compreender grãos destilados modificados com solúveis que podem ser cerca de 5% a cerca de 25% em peso da composição de ração animal. Em modalidades adicionais, a ração mista total pode compreender grãos destilados modificados com solúveis que podem ser cerca de 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, em peso da composição de ração animal.

[0034] Em outras modalidades, a ração mista total pode compreender grãos destilados modificados com solúveis que podem ser cerca de 5% a cerca de 25% em peso da composição de ração animal. Em modalidades adicionais, a ração mista total pode compreender grãos destilados secos que podem ser cerca de 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, em peso da composição de ração animal.

[0035] Em modalidades adicionais, a ração mista total pode compreender grãos úmidos destilados com solúveis que podem ser cerca de 5% a cerca de 25% em peso da composição de ração animal. Em modalidades adicionais, a ração mista total pode compreender grãos destilados úmidos com solúveis que podem ser cerca de 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, em peso da composição de ração animal.

[0036] Ácidos nucleicos ou proteínas diferentes tendo homologia são referidos aqui como "homólogos". O termo homólogo inclui sequências homólogas da mesma e outras espécies e sequências ortólogas da mesma e outras espécies. "Homologia" se refere ao nível de similaridade entre duas ou mais sequências de ácidos nucleicos e/ou de aminoácidos em termos de porcentagem de identidade posicional (isto é, similaridade ou identidade de sequências). Homologia se refere também ao conceito de propriedades funcionais similares entre ácidos nucleicos ou proteínas diferentes. Assim, as composições e métodos da invenção compreendem adicionalmente homólogos das sequências de nucleotídeos e sequências de polipeptídeos desta invenção (p.ex., SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5). "Ortólogo", como usado aqui, se refere a sequências de nucleotídeos e/ou aminoácidos homólogas em diferentes espécies que têm origem a partir de um gene ancestral comum durante a especiação. Um homólogo desta invenção tem uma identidade de sequências significativa (p.ex., 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, e/ou 100%) com SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 ou SEQ ID NO:5.

[0037] Um homólogo de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 e/ou SEQ ID NO:5 pode ser utilizado com qualquer composição de ração ou método da invenção, sozinho ou em combinação com um outro e/ou com SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 e/ou SEQ ID NO:5.

[0038] Como usado aqui, "identidade de sequências" se refere à extensão na qual duas sequências de polinucleotídeos ou peptídeos otimamente alinhadas são invariantes ao longo de uma janela de alinhamento de componentes, p.ex., nucleotídeos ou aminoácidos. "Identidade" pode ser prontamente calculada por métodos conhecidos incluindo aqueles, mas não se limitando àqueles, descritos em: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, Nova Iorque (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, Nova Jérsia (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); e Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, Nova Iorque (1991).

[0039] Como usado aqui, o termo "percentagem de identidade de sequências" ou "percentagem de identidades" se refere à percentagem de nucleotídeos idênticos em uma sequência de polinucleotídeos linear de uma molécula de polinucleotídeo de referência ("consulta") (ou sua cadeia complementar) em comparação com uma molécula de polinucleotídeo de teste ("objeto") (ou sua cadeia complementar) quando as duas sequências estão otimamente alinhadas. Em algumas modalidades, "percentagem de identidade" pode se referir à percentagem de aminoácidos idênticos em uma sequência de aminoácidos.

[0040] A frase "substancialmente idêntica", no contexto de duas moléculas de ácido nucleico, sequências de nucleotídeos ou sequências de proteína, se refere a duas ou mais sequências ou subsequências que têm pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos, quando comparadas e alinhadas quanto a correspondência máxima, como medida usando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequências, descritos aqui e como conhecidos na técnica, ou por inspeção visual. Em algumas modalidades da invenção, a identidade substancial existe ao longo de uma região das sequências que tem pelo menos cerca de 50 resíduos a cerca de 200 resíduos, cerca de 50 resíduos a cerca de 150 resíduos e similares, em comprimento. Assim, em algumas modalidades da invenção, a identidade substancial existe ao longo de uma região das sequências que tem pelo menos cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 110, cerca de 120, cerca de 130, cerca de 140, cerca de 150, cerca de 160, cerca de 170, cerca de 180, cerca de 190, cerca de 200, ou mais resíduos em comprimento. Em uma modalidade adicional, as sequências são substancialmente idênticas ao longo do comprimento inteiro das regiões codificantes. Além do mais, em modalidades representativas, sequências de nucleotídeos ou proteínas substancialmente idênticas desempenham substancialmente a mesma função (p.ex., atividade de α-amilase). Assim, em algumas modalidades particulares, as sequências são substancialmente idênticas ao longo de pelo menos cerca de 150 resíduos e têm atividade de α-amilase.

[0041] Para comparação de sequências, tipicamente uma sequência atua como uma sequência de referência com a qual as sequências de teste são comparadas. Quando se usa um algoritmo de comparação de sequências, as sequências de referência e de teste são inseridas em um computador, as coordenadas de subsequência são designadas se necessário e os parâmetros do programa de algoritmo de sequências são designados. O algoritmo de comparação de sequências calcula depois a percentagem de identidade de sequências para a(s) sequência(s) de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa designados.

[0042] O alinhamento ótimo de sequências para alinhamento de uma janela de comparação é bem conhecido por aqueles peritos na técnica e pode ser conduzido por ferramentas tais como o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, o algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, o método de busca de similaridade de Pearson e Lipman, e opcionalmente por implementações computadorizadas destes algoritmos tais como GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA disponíveis como parte do pacote GCG® Wisconsin Package® (Accelrys Inc., San Diego, CA). Uma "fração de identidade" para segmentos alinhados de uma sequência de teste e uma sequência de referência é o número de componentes idênticos que são partilhados pelas duas sequências alinhadas dividido pelo número total de componentes no segmento da sequência de referência, i.e., a sequência de referência inteira ou uma parte definida mais pequena da sequência de referência. A percentagem de identidade de sequências é representada como a fração de identidade multiplicada por 100. A comparação de uma ou mais sequências de polinucleotídeos pode ser com uma sequência de polinucleotídeos de comprimento total ou uma sua porção ou com uma sequência de polinucleotídeos mais longa. Para propósitos desta invenção, a "percentagem de identidade" pode ser também determinada usando BLASTX versão 2.0 para sequências de nucleotídeos traduzidas e BLASTN versão 2.0 para sequências de polinucleotídeos.

[0043] O software para realizar análises BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo envolve identificação em primeiro lugar de pares de sequência de pontuação elevada (HSPs) por identificação de palavras curtas de comprimento W na sequência de consulta, que corresponde ou satisfaz alguma pontuação T limiar de valor positivo-quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de base de dados. T é referido como uma pontuação limiar de palavra de proximidade (Altschul et al., 1990). J. Mol. Biol. 215: 403). Estes acertos de palavra de proximidade iniciais atuam como sementes para iniciação de buscas para encontrar HSPs mais longos contendo os mesmos. Os acertos de palavras são depois estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência tanto quanto a pontuação de alinhamento cumulativa possa ser aumentada. As pontuações cumulativas são calculadas usando, para sequências de nucleotídeos, os parâmetros M (pontuação de recompensa para um par de resíduos correspondentes; sempre > 0) e N (pontuação de penalidade para resíduos não correspondentes; sempre < 0). Para sequências de aminoácidos é usada uma matriz de pontuação para calcular a pontuação cumulativa. A extensão dos acessos de palavra em cada direção é parada quando a pontuação de alinhamento cumulativa cai pela quantidade X a partir de seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa vai para zero ou abaixo devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de pontuação negativa-ou a extremidade de cada uma das sequências é alcançada. Os parâmetros W, T e X do algoritmo BLAST determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) usa como padrões um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, um corte de 100, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as fitas. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)).

[0044] Adicionalmente a calcular a percentagem de identidade de sequências, o algoritmo BLAST realiza também uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (ver, p.ex., Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Uma medida da similaridade proporcionada pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), que proporciona uma indicação da probabilidade pela qual uma correspondência entre duas sequências de nucleotídeos ou de aminoácidos ocorreria por acaso. Por exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos de teste é considerada similar a uma sequência de referência se a menor probabilidade de soma em uma comparação da sequência de nucleotídeos de teste com a sequência de nucleotídeos de referência for menor do que cerca de 0,1 a menor do que cerca de 0,001. Assim, em algumas modalidades da invenção, a menor probabilidade de soma em uma comparação da sequência de nucleotídeos de teste com a sequência de nucleotídeos de referência é menor do que cerca de 0,001.

[0045] Duas sequências de nucleotídeos podem ser também consideradas como sendo substancialmente idênticas quando as duas sequências hibridizam uma com a outra sob condições estringentes. Em algumas modalidades representativas, duas sequências de nucleotídeos consideradas como sendo substancialmente idênticas hibridizam uma com a outra sob condições altamente estringentes.

[0046] "Condições de hibridização estringentes" e "condições de lavagem de hibridização estringentes" no contexto das experiências de hibridização de ácido nucleico tais como hibridizações de Southern e Northern são dependentes da sequência, e são diferentes sob diferentes parâmetros ambientais. Um guia extenso para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes parte I capítulo 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, Nova Iorque (1993). Geralmente, condições de hibridização e lavagem altamente estringentes são selecionadas para serem cerca de 5 °C mais baixas do que o ponto térmico de fusão (Tm) para a sequência específica a uma força iônica e pH definidos.

[0047] A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) à qual 50% da sequência alvo hibridiza com uma sonda perfeitamente correspondente. Condições muito estringentes são selecionadas para serem iguais à Tm para uma sonda particular. Um exemplo de condições de hibridização estringentes para hibridização de sequências de nucleotídeos complementares que têm mais do que 100 resíduos complementares em um filtro em uma transferência de Southern ou Northern é formamida a 50% com 1 mg de heparina a 42 °C, com a hibridização sendo levada a cabo durante a noite. Um exemplo de condições de lavagem altamente estringentes é NaCl a 0,15 M a 72 °C durante cerca de 15 minutos. Um exemplo de condições de lavagem estringentes é uma lavagem com 0,2x SSC a 65 °C durante 15 minutos (ver, Sambrook, infra, para uma descrição de tampão SSC). Frequentemente, uma lavagem de estringência elevada é precedida por uma lavagem de baixa estringência para remover o sinal da sonda de fundo. Um exemplo de uma lavagem de estringência média para um dúplex de, p.ex., mais do que 100 nucleotídeos, é 1x SSC a 45 °C durante 15 minutos. Um exemplo de uma lavagem de estringência baixa para um dúplex de, p.ex., mais do que 100 nucleotídeos, é 4-6x SSC a 40 °C durante 15 minutos. Para sondas curtas (p.ex., cerca de 10 a 50 nucleotídeos), as condições estringentes envolvem tipicamente concentrações de sais de menos do que cerca de 1,0 M de íon Na, tipicamente concentração de cerca de 0,01 a 1,0 M de íon Na (ou outros sais) a pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é tipicamente pelo menos cerca de 30 °C. Condições estringentes podem ser também alcançadas com a adição de agentes desestabilizantes tais como formamida. Em geral, uma razão de sinal em relação a ruído de 2x ou mais elevada do que aquela observada para uma sonda não relacionada no ensaio de hibridização particular indica detecção de uma hibridização específica. Sequências de nucleotídeos que não hibridizam umas com as outras sob condições estringentes são ainda substancialmente idênticas se as proteínas que elas codificam forem substancialmente idênticas. Isto pode ocorrer, por exemplo, quando uma cópia de uma sequência de nucleotídeos é criada usando a degeneração de códons máxima permitida pelo código genético.

[0048] Os seguintes são exemplos de conjuntos de condições de hibridização/lavagem que podem ser usados para clonar sequências de nucleotídeos homólogas que são substancialmente idênticas a sequências de nucleotídeos de referência (p.ex., SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5). Em uma modalidade, uma sequência de nucleotídeos de referência hibridiza com a sequência de nucleotídeos “teste” em dodecil sulfato de sódio (SDS) a 7%, NaPO4 a 0,5 M, EDTA a 1 mM a 50 °C com lavagem em 2X SSC, SDS a 0,1% a 50 °C. Em outra modalidade, a sequência de nucleotídeos de referência hibridiza com a sequência de nucleotídeos “teste” em dodecil sulfato de sódio (SDS) a 7%, NaPO4 a 0,5 M, EDTA a 1 mM a 50 °C com lavagem em 1X SSC, SDS a 0,1% a 50 °C ou em dodecil sulfato de sódio (SDS) a 7%, NaPO4 a 0,5 M, EDTA a 1 mM a 50 °C com lavagem em 0,5X SSC, SDS a 0,1% a 50 °C. Em modalidades ainda adicionais, a sequência de nucleotídeos de referência hibridiza com a sequência de nucleotídeos "teste" em dodecil sulfato de sódio (SDS) a 7%, NaPO4 a 0,5 M, EDTA a 1 mM a 50 °C com lavagem em 0,1X SSC, SDS a 0,1% a 50 °C, ou em dodecil sulfato de sódio (SDS) a 7%, NaPO4 a 0,5 M, EDTA a 1 mM a 50 °C com lavagem em 0,1X SSC, SDS a 0,1% a 65 °C.

[0049] Em modalidades particulares, uma indicação adicional de que duas sequências de nucleotídeos ou duas sequências de polipeptídeos são substancialmente idênticas pode ser que a proteína codificada pelo primeiro ácido nucleico é imunologicamente reativa de modo cruzado com a, ou se liga especificamente à, proteína codificada pelo segundo ácido nucleico. Assim, em algumas modalidades, um polipeptídeo pode ser substancialmente idêntico com um segundo polipeptídeo, por exemplo, onde os dois polipeptídeos diferem somente por substituições conservativas.

[0050] Conformemente, em algumas modalidades da invenção, são proporcionadas sequências de nucleotídeos tendo identidade de sequências significativa com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 e/ou SEQ ID NO:5. “Identidade de sequências significativa” ou “similaridade de sequências significativa” significa pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, e/ou 100% de identidade ou similaridade com outra sequência de nucleotídeos. Assim, em modalidades adicionais, "identidade de sequências significativa" ou "similaridade de sequências significativa" significa uma gama de cerca de 70% a cerca de 100%, cerca de 75% a cerca de 100%, cerca de 80% a cerca de 100%, cerca de 81% a cerca de 100%, cerca de 82% a cerca de 100%, cerca de 83% a cerca de 100%, cerca de 84% a cerca de 100%, cerca de 85% a cerca de 100%, cerca de 86% a cerca de 100%, cerca de 87% a cerca de 100%, cerca de 88% a cerca de 100%, cerca de 89% a cerca de 100%, cerca de 90% a cerca de 100%, cerca de 91% a cerca de 100%, cerca de 92% a cerca de 100%, cerca de 93% a cerca de 100%, cerca de 94% a cerca de 100%, cerca de 95% a cerca de 100%, cerca de 96% a cerca de 100%, cerca de 97% a cerca de 100%, cerca de 98% a cerca de 100%, e/ou cerca de 99% a cerca de 100% de identidade ou similaridade com outra sequência de nucleotídeos. Portanto, em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeos da invenção é uma sequência de nucleotídeos que tem identidade de sequências significativa com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 ou SEQ ID NO:5 e codifica um polipeptídeo tendo atividade de α-amilase. Em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeos da invenção é uma sequência de nucleotídeos que tem 80% a 100% de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 ou SEQ ID NO:5 e codifica um polipeptídeo tendo atividade de α-amilase. Em modalidades representativas, uma sequência de nucleotídeos da invenção é uma sequência de nucleotídeos que tem 95% de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 ou SEQ ID NO:5 e codifica um polipeptídeo tendo atividade de α-amilase.

[0051] Em algumas modalidades, um polipeptídeo da invenção compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica, p.ex., pelo menos 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, e/ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1 e tem atividade de α-amilase.

[0052] Em algumas modalidades, uma sequência de polipeptídeos ou nucleotídeos pode ser uma variante conservativamente modificada. Como usada aqui, "variante conservativamente modificada" se refere a sequências de polipeptídeos e nucleotídeos contendo substituições, deleções ou adições individuais que alteram, adicionam ou eliminam um único aminoácido ou nucleotídeo ou uma pequena percentagem de aminoácidos ou nucleotídeos na sequência, onde a alteração resulta na substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente similar. Tabelas de substituições conservativas proporcionando aminoácidos similares são bem conhecidas na técnica.

[0053] Como usada aqui, uma variante conservativamente modificada de um polipeptídeo é biologicamente ativa e portanto possui a atividade desejada do polipeptídeo de referência (p.ex., atividade de α-amilase) como descrito aqui. A variante pode resultar de, por exemplo, um polimorfismo genético ou manipulação humana. Uma variante biologicamente ativa do polipeptídeo de referência pode ter pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais de identidade ou similaridade de sequências (p.ex., cerca de 40% a cerca de 99% ou mais identidade ou similaridade de sequências e qualquer gama intermédia) com a sequência de aminoácidos para o polipeptídeo de referência como determinado por programas e parâmetros de alinhamento de sequências descritos em outro lado aqui. Uma variante ativa pode diferir da sequência do polipeptídeo de referência por tão poucos quantos 1-15 resíduos de aminoácidos, tão poucos quantos 110, tal como 6-10, tão poucos quantos 5, tão poucos quantos 4, 3, 2, ou mesmo 1 resíduo de aminoácidos.

[0054] Variantes ocorrendo naturalmente podem existir dentro de uma população. Tais variantes podem ser identificadas por uso de técnicas de biologia molecular bem conhecidas, tais como reação em cadeia da polimerase (PCR), e hibridização como descrito em baixo. Sequências de nucleotídeos sinteticamente derivadas, por exemplo, sequências geradas por mutagênese sítio-dirigida oi mutagênese mediada por PCR que codificam um polipeptídeo da invenção, estão também incluídas como variantes. Uma ou mais substituições, adições, ou deleções de nucleotídeos ou aminoácidos podem ser introduzidas em uma sequência de nucleotídeos ou aminoácidos divulgadas aqui, tal que as substituições, adições, ou deleções sejam introduzidas na proteína codificada. As adições (inserções) ou deleções (truncações) podem ser feitas na extremidade N-terminal ou C-terminal da proteína nativa, ou em um ou mais locais na proteína nativa. Similarmente, uma substituição de um ou mais nucleotídeos ou aminoácidos pode ser feita em um ou mais locais na proteína nativa.

[0055] Por exemplo podem ser feitas substituições de aminoácidos conservativas em um ou mais resíduos de aminoácidos previstos preferencialmente não essenciais. Um resíduo de aminoácido "não essencial" é um resíduo que pode ser alterado a partir da sequência de tipo selvagem de uma proteína sem alterar a atividade biológica, enquanto um aminoácido "essencial" é requerido para a atividade biológica. Uma "substituição de aminoácido conservativa" é uma na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares são conhecidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (p.ex., lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (p.ex., ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (p.ex., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (p.ex., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais com ramificação beta (p.ex., treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (p.ex., tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Tais substituições não seriam feitas para resíduos de aminoácidos conservados, ou para resíduos de aminoácidos residindo dentro de um motivo conservado, onde tais resíduos são essenciais para a atividade da proteína.

[0056] Por exemplo, variantes da sequência de aminoácidos do polipeptídeo de referência podem ser preparadas por mutação da sequência de nucleotídeos codificando a enzima. Os mutantes resultantes podem ser expressos recombinantemente em plantas, e rastreados quanto àqueles que retêm atividade biológica por avaliação da atividade de α-amilase usando métodos bem conhecidos na técnica. Métodos para mutagênese e alterações na sequência de nucleotídeos são conhecidos na técnica. Ver, p. ex., Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154: 367-382; e Techniques in Molecular Biology (Walker & Gaastra eds., MacMillan Publishing Co. 1983) e as referências citadas aí; bem como a Patente dos EUA No. 4,873,192. Evidentemente, as mutações feitas no DNA codificando a variante não podem perturbar a grelha de leitura e preferencialmente não criarão regiões complementares que poderiam produzir estrutura de mRNA secundária. Ver, Publicação de Pedido de Patente EP No. 75,444. Orientação quanto às substituições de aminoácidos apropriadas que não afetam a atividade biológica da proteína de interesse pode ser encontrada no modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.), aqui incorporado por referência.

[0057] Não é expectável que as deleções, inserções e substituições nos polipeptídeos descritas aqui produzam mudanças radicais nas características do polipeptídeo (p.ex., a atividade do polipeptídeo). No entanto, quando é difícil prever o efeito exato da substituição, deleção ou inserção antes de a fazer, um perito na técnica apreciará que o efeito pode ser avaliado por ensaios de rastreio padrão que podem rastrear quanto às atividades de interesse do polipeptídeo particular (p.ex., atividade de α-amilase).

[0058] Em algumas modalidades, as composições da invenção podem compreender fragmentos ativos do polipeptídeo. Como usado aqui, “fragmento” significa uma porção do polipeptídeo de referência que retêm a atividade de polipeptídeo de α-amilase. Um fragmento significa também uma porção de uma molécula de ácido nucleico codificando o polipeptídeo de referência. Um fragmento ativo do polipeptídeo pode ser preparado, por exemplo, por isolamento de uma porção de uma molécula de ácido nucleico codificando o polipeptídeo que expressa o fragmento codificado do polipeptídeo (p.ex., por expressão recombinante in vitro), e avaliação da atividade do fragmento. As moléculas de ácido nucleico codificando tais fragmentos podem ter pelo menos cerca de 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, ou 2200 nucleotídeos contíguos, ou qualquer gama intermédia, ou até ao número de nucleotídeos presentes em uma molécula de ácido nucleico codificando polipeptídeo de comprimento total. Como tal, os fragmentos de polipeptídeos podem ter pelo menos cerca de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 525, 550, 600, 625, 650, 675, ou 700 resíduos de aminoácidos contíguos, ou qualquer gama intermédia, ou até ao número total de resíduos de aminoácidos presentes no polipeptídeo de comprimento total. Assim, em algumas modalidades, a invenção proporciona um polipeptídeo compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em pelo menos cerca de 150 resíduos de aminoácidos contíguos de um polipeptídeo da invenção (p.ex., SEQ ID NO:1) e tendo atividade de α-amilase.

[0059] Como usados aqui, os termos "expressam", "expressa", "expresso" ou "expressão", e similares, no que diz respeito a uma molécula de ácido nucleico e/ou sequência de nucleotídeos (p.ex., RNA ou DNA) indicam que a molécula de ácido nucleico e/ou sequência de nucleotídeos é transcrita e opcionalmente, traduzida. Assim, uma molécula de ácido nucleico e/ou sequência de nucleotídeos pode expressar ou produzir um polipeptídeo de interesse ou um RNA não traduzido funcional.

[0060] Uma sequência de nucleotídeos "heteróloga" ou "recombinante" é uma sequência de nucleotídeos não naturalmente associada a uma célula hospedeira na qual é introduzida, incluindo múltiplas cópias não ocorrendo naturalmente de uma sequência de nucleotídeos ocorrendo naturalmente.

[0061] Um ácido nucleico, sequência de nucleotídeos, polipeptídeo ou sequência de aminoácidos "nativo" ou de "tipo selvagem" se refere a um ácido nucleico, sequência de nucleotídeos, polipeptídeo ou sequência de aminoácidos que ocorre naturalmente ou endógeno. Assim, por exemplo, um "mRNA de tipo selvagem" é um mRNA que ocorre naturalmente no ou é endógeno ao organismo. Uma sequência de ácidos nucleicos "homóloga" é uma sequência de nucleotídeos naturalmente associada a uma célula hospedeira na qual é introduzida.

[0062] Também como usados aqui, os termos "ácido nucleico","molécula de ácido nucleico", "sequência de ácidos nucleicos", e "polinucleotídeo" podem ser usados indistintamente e englobam ambos RNA e DNA, incluindo cDNA, DNA genômico, mRNA, DNA ou RNA sintético (p.ex., quimicamente sintetizado) e quimeras de RNA e DNA. O termo polinucleotídeo, sequência de nucleotídeos, ou ácido nucleico se refere a uma cadeia de nucleotídeos sem ter em conta o comprimento da cadeia. O ácido nucleico pode ser de fita dupla ou fita simples. Onde de fita simples, o ácido nucleico pode ser uma fita senso ou uma fita antissenso. O ácido nucleico pode ser sintetizado usando análogos ou derivados de oligonucleotídeos (p. ex., nucleotídeos de inosina ou fosforotioato). Tais oligonucleotídeos podem ser usados, por exemplo, para preparar ácidos nucleicos que têm capacidades de emparelhamento de bases alteradas ou resistência aumentada a nucleases. A presente invenção proporciona adicionalmente um ácido nucleico que é o complemento (que pode ser ou um complemento completo ou um complemento parcial) de um ácido nucleico, sequência de nucleotídeos, ou polinucleotídeo desta invenção. As moléculas de ácido nucleico e/ou sequências de nucleotídeos proporcionadas aqui são apresentadas aqui na direção 5’ a 3’, da esquerda para a direita e são representadas usando o código padrão para representação dos caracteres de nucleotídeos como estabelecido nas regras para sequências dos E.U.A., 37 CFR §§1.821 - 1.825 e na World Intellectual Property Organization (WIPO) Padrão ST.25.

[0063] Em algumas formas de realização, as moléculas de ácido nucleico recombinantes, sequências de nucleotídeos e polipeptídeos da invenção são "isolados". Uma molécula de ácido nucleico "isolada", uma sequência de nucleotídeos "isolada" ou um polipeptídeo "isolado" é uma molécula de ácido nucleico, sequência de nucleotídeos ou polipeptídeo que, pela mão do homem, existe separadamente do seu ambiente nativo e não é portanto um produto da natureza. Uma molécula de ácido nucleico, sequência de nucleotídeos ou polipeptídeo isolado pode existir em uma forma purificada que é pelo menos parcialmente separada de pelo menos alguns dos outros componentes do organismo ou vírus ocorrendo naturalmente, por exemplo, a célula ou componentes estruturais virais ou outros polipeptídeos ou ácidos nucleicos comumente encontrados associados ao polinucleotídeo. Em modalidades representativas, a molécula de ácido nucleico isolada, a sequência de nucleotídeos isolada e/ou o polipeptídeo isolado é pelo menos cerca de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou mais puro.

[0064] Em outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico, sequência de nucleotídeos ou polipeptídeo isolado pode existir em um ambiente não nativo tal como, por exemplo, uma célula hospedeira recombinante. Assim sendo, por exemplo, no que diz respeito a sequências de nucleotídeos, o termo "isolada" significa que está separada do cromossomo e/ou célula no qual ocorre naturalmente. Um polinucleotídeo está também isolado se estiver separado do cromossomo e/ou célula no qual ocorre naturalmente e for depois inserido em um contexto genético, um cromossomo e/ou uma célula no qual não ocorre naturalmente (p.ex., uma célula hospedeira diferente, sequências reguladoras diferentes, e/ou posição diferente no genoma do que como encontrado na natureza). Conformemente, as moléculas de ácido nucleico, sequências de nucleotídeos e seus polipeptídeos codificados recombinantes são "isolados" na medida em que, pela mão do homem, existem separados do seu ambiente nativo e não são portanto produtos da natureza, no entanto, em algumas modalidades, podem ser introduzidos em e existir em uma célula hospedeira recombinante.

[0065] Em algumas modalidades, as sequências de nucleotídeos e/ou moléculas de ácido nucleico da invenção podem estar operacionalmente associadas a uma variedade de promotores para expressão em células hospedeiras (p.ex., células vegetais). Como usado aqui, "operacionalmente associada a", quando se refere a uma primeira sequência de ácido nucleico que está operacionalmente ligada a uma segunda sequência de ácido nucleico, significa uma situação quando a primeira sequência de ácido nucleico está colocada em uma relação funcional com a segunda sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor está operacionalmente associado a uma sequência codificante se o promotor efetuar a transcrição ou expressão da sequência codificante.

[0066] Um "promotor" de DNA é uma sequência de DNA não traduzida a montante de uma região codificante que contém o local de ligação para RNA polimerase e inicia a transcrição do DNA. Uma "região promotora" pode também incluir outros elementos que atuam como reguladores da expressão de genes. Os promotores podem incluir, por exemplo, promotores constitutivos, induzíveis, temporalmente regulados, regulados pelo desenvolvimento, quimicamente regulados, preferenciais quanto a tecidos e específicos quanto a tecidos para uso na preparação de moléculas de ácido nucleico recombinantes, i.e., genes quiméricos. Em aspetos particulares, um "promotor" útil da invenção é um promotor capaz de iniciar a transcrição de uma sequência de nucleotídeos em uma célula de uma planta.

[0067] Um “gene quimérico” é uma molécula de ácido nucleico recombinante na qual um promotor ou outra sequência de nucleotídeos reguladora está operacionalmente associado a uma sequência de nucleotídeos que codifica um mRNA ou que é expresso como uma proteína, tal que a sequência de nucleotídeos reguladora seja capaz de regular a transcrição ou expressão da sequência de nucleotídeos associada. A sequência de nucleotídeos reguladora do gene quimérico não está normalmente operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos associada como encontrada na natureza.

[0068] A escolha do promotor irá variar dependendo dos requisites temporais e espaciais para expressão, e também dependendo da célula hospedeira a ser transformada. Assim, por exemplo, a expressão de uma sequência de nucleotídeos pode ser em qualquer planta e/ou parte de planta (p.ex., em folhas, em hastes ou caules, em espigas, em inflorescências (p.ex. espigões, panículas, sabugos, etc.), em raízes, sementes e/ou plântulas, e similares). Embora tenha sido mostrado que muitos promotores de dicotiledôneas são operacionais em monocotiledôneas e vice-versa, idealmente são selecionados promotores de dicotiledôneas para expressão em dicotiledôneas, e promotores de monocotiledôneas para expressão em monocotiledôneas. No entanto, não há restrição quanto à proveniência de promotores selecionados; é suficiente que eles sejam operacionais no direcionamento da expressão das sequências de nucleotídeos na célula desejada.

[0069] Promotores úteis com a invenção incluem aqueles, mas não estão limitados àqueles que dirigem a expressão de uma sequência de nucleotídeos constitutivamente, aqueles que dirigem a expressão quando induzidos, e aqueles que dirigem a expressão de um modo específico quanto aos tecidos ou ao desenvolvimento. Estes vários tipos de promotores são conhecidos na técnica.

[0070] Exemplos de promotores constitutivos incluem, mas não estão limitados ao promotor do vírus Cestrum (cmp) (Patente dos E.U.A. No. 7,166,770), promotor 1 da actina do arroz (Wang et al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12: 3399-3406; bem como Patente dos E.U.A. No. 5,641,876), promotor de 35S de CaMV (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812), promotor de 19S de CaMV (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9: 315324), promotor nos (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 5745-5749), promotor de Adh (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6624-6629), promotor da sacarose sintase (Yang & Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 4144-4148), e o promotor da ubiquitina. O promotor constitutivo derivado da ubiquitina se acumula em muitos tipos de células. Promotores da ubiquitina foram clonados de várias espécies de plantas para uso em plantas transgênicas, por exemplo, girassol (Binet et al., 1991. Plant Science 79: 87-94), maís (Christensen et al., 1989. Plant Molec. Biol. 12: 619-632) e Arabidopsis (Norris et al. 1993. Plant Molec. Biol. 21: 895-906). O promotor da ubiquitina (UbiP) do maís foi desenvolvido em sistemas de monocotiledôneas transgênicas e a sua sequência e vetores construídos para transformação de monocotiledôneas são divulgados na publicação de patente EP 0 342 926. Adicionalmente, os cassetes de expressão de promotor descritos por McElroy et al. (Mol. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991)) podem ser facilmente modificados para a expressão de sequências de nucleotídeos e são particularmente adequados para uso em hospedeiras monocotiledôneas.

[0071] Em algumas modalidades podem ser usados promotores específicos quanto a tecidos/preferenciais quanto a tecidos. Padrões de expressão específicos ou preferenciais quanto aos tecidos incluem, mas não estão limitados a, específicos ou preferenciais quanto aos tecidos verdes, específicos ou preferenciais quanto às raízes, específicos ou preferenciais quanto aos caules, e específicos e preferenciais quanto às flores. Promotores adequados para expressão em tecido verde incluem muitos que regulam genes envolvidos na fotossíntese e muitos destes foram clonados a partir de monocotiledôneas e dicotiledôneas. Em uma modalidade, um promotor útil com a invenção é o promotor PEPC do maís do gene da fosfoenol carboxilase (Hudspeth & Grula, Plant Molec. Biol. 12: 579-589 (1989)). Exemplos não limitantes de promotores específicos quanto aos tecidos incluem aqueles associados a genes codificando as proteínas de armazenamento de sementes (tais como β- conglicinina, cruciferina, napina e faseolina), zeína (p.ex., gama zeína) ou proteínas de corpos oleosos (tais como oleosina), ou proteínas envolvidas na biossíntese de ácidos graxos (incluindo a proteína transportadora de acila, estearoíl-ACP dessaturase e ácido graxo dessaturases (fad 2-1)), e outros ácidos nucleicos expressos durante o desenvolvimento do embrião (tais como Bce4, ver, p.ex., Kridl et al. (1991) Seed Sci. Res. 1:209-219; bem como Patente EP No. 255378). Promotores específicos quanto aos tecidos ou preferenciais quanto aos tecidos úteis para a expressão de sequências de nucleotídeos em plantas, particularmente maís, incluem aqueles mas não estão limitados àqueles que dirigem a expressão na raiz, medula, folha ou pólen. Tais promotores são divulgados, por exemplo, na Publicação PCT WO 93/07278, aqui incorporada por referência na sua totalidade. Outros exemplos não limitantes de promotores específicos quanto aos tecidos ou preferenciais quanto a tecidos úteis incluem o promotor de rubisco do algodão divulgado na Patente dos EUA 6,040,504; o promotor de sacarose sintase do arroz divulgado na Patente dos EUA 5,604,121; o promotor específico quanto às raízes descrito por de Framond (FEBS 290: 103-106 (1991); EP 0 452 269 em nome de Ciba-Geigy); o promotor específico quanto aos caules descrito na Patente dos E.U.A. 5,625,136 (em nome de Ciba-Geigy) e que dirige a expressão do gene trpA do maís; e o promotor do vírus de enrolamento das folhas amarelas Cestrum divulgado na Publicação PCT WO 01/73087, todos incorporados por referência aqui.

[0072] Exemplos adicionais de promotores específicos quanto aos tecidos/preferenciais quanto aos tecidos incluem os, mas não estão limitados aos promotores específicos quanto às raízes RCc3 (Jeong et al. Plant Physiol. 153: 185-197 (2010)) e RB7 (Patente dos E.U.A. No. 5459252), o promotor da lectina (Lindstrom et al. (1990) Der. Genet. 11: 160-167; e Vodkin (1983) Prog. Clin. Biol. Res. 138: 87-98), promotor 1 da álcool desidrogenase do milho (Dennis et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 3983-4000), S-adenosil-L-metionina sintetase (SAMS) (Vander Mijnsbrugge et al. (1996) Plant and Cell Physiology, 37 (8): 1108-1115), promotor do complexo de coleta leve do milho (Bansal et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3654-3658), promotor da proteína de choque térmico do milho (O'Dell et al. (1985) EMBO J. 5: 451-458; e Rochester et al. (1986) EMBO J. 5: 451-458), promotor de RuBP carboxilase de pequena subunidade da ervilha (Cashmore, “Nuclear genes encoding the small subunit of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase” pp. 29-39 Em: Genetic Engineering of Plants (Hollaender ed., Plenum Press 1983; e Poulsen et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 205: 193-200), promotor de manopina sintase do plasmídeo Ti (Langridge et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3219-3223), promotor de nopalina sintase do plasmídeo Ti (Langridge et al. (1989), supra), promotor de chalcona isomerase da petúnia (van Tunen et al. (1988) EMBO J. 7: 1257-1263), promotor da proteína 1 rica em glicinas do arroz (Keller et al. (1989) Genes Dev. 3: 1639-1646), promotor truncado de 35S de CaMV (O'Dell et al. (1985) Nature 313: 810-812), promotor da patatina da batata (Wenzler et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13: 347-354), promotor das células das raízes (Yamamoto et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 7449), promotor da zeína do maís (Kriz et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 207: 9098; Langridge et al. (1983) Cell 34: 1015-1022; Reina et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 6425; Reina et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 7449; e Wandelt et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 2354), promotor da globulina-1 (Belanger et al. (1991) Genetics 129: 863-872), promotor cab da α-tubulina (Sullivan et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215: 431-440), promotor da PEPCase (Hudspeth & Grula (1989) Plant Mol. Biol. 12: 579-589), promotores associados ao complexo do gene R (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1: 1175-1183), e promotores da chalcona sintase (Franken et al. (1991) EMBO J. 10: 2605-2612).

[0073] Particularmente útil para expressão específica quanto às sementes é o promotor da vicilina da ervilha (Czako et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 235: 33-40); bem como os promotores específicos quanto às sementes divulgados na Patente dos E.U.A. No. 5,625,136. Em algumas modalidades, o promotor pode ser um promotor específico quanto ao endosperma incluindo mas não se limitando a um promotor da gama-zeína do maís ou um promotor de ADP-gpp do maís.

[0074] Promotores úteis para expressão em folhas maduras são aqueles que são ativados aquando do início da senescência, tais como o promotor de SAG de Arabidopsis (Gan et al. (1995) Science 270: 1986-1988).

[0075] Adicionalmente podem ser usados promotores funcionais em plastídeos. Exemplos não limitantes de tais promotores incluem a 5' UTR do gene 9 do bacteriófago T3 e outros promotores divulgados na Patente dos E.U.A. No. 7,579,516. Outros promotores úteis com a invenção incluem o, mas não estão limitados ao promotor da carboxilase de RuBP de pequena subunidade S-E9 e o promotor do gene do inibidor de tripsina Kunitz (Kti3).

[0076] Em algumas modalidades da invenção podem ser usados promotores induzíveis. Assim, por exemplo, podem ser usados promotores regulados por químicos para modular a expressão de um gene em uma planta através da aplicação de um regulador químico exógeno. A regulação da expressão de sequências de nucleotídeos através de promotores que são quimicamente regulados permite que os polipeptídeos da invenção sejam sintetizados somente quando as plantas de cultura são tratadas com os químicos indutores. Dependendo do objetivo, o promotor pode ser um promotor induzível por químicos, onde a aplicação de um químico induz a expressão de genes, ou um promotor repressível por químicos, onde a aplicação do químico reprime a expressão de genes.

[0077] Promotores induzíveis químicos são conhecidos na técnica e incluem o, mas não limitados ao, promotor In2-2 do maís, que é ativado por fitoprotetores herbicidas de benzenossulfonamida, o promotor GST do maís, que é ativado por compostos eletrofílicos hidrofóbicos que são usados como herbicidas de pré-emergência, e o promotor PR-1 a do tabaco, que é ativado por ácido salicílico (p.ex., o sistema PR1a), promotores responsivos a esteroides (ver, p.ex., o promotor induzível por glicocorticoides em Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10421-10425 e McNellis et al. (1998) Plant J. 14, 247-257) e promotores induzíveis por tetraciclina e repressíveis por tetraciclina (ver, p.ex., Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227, 229-237, e Patentes dos E.U.A. Números 5,814,618 e 5,789,156), promotores do sistema repressor Lac, promotores do sistema induzível por cobre, promotores do sistema induzível por salicilato (p.ex., o sistema PR1a), promotores induzíveis por glicocorticoides (Aoyama et al. (1997) Plant J. 11: 605-612), e promotores do sistema induzível por ecdisona.

[0078] Outros exemplos não limitantes de promotores induzíveis incluem promotores induzíveis por ABA e turgor, o promotor do gene da proteína de ligação à auxina (Schwob et al. (1993) Plant J. 4: 423-432), o promotor da glicosil-transferase do flavonoide de UDP glucose (Ralston et al. (1988) Genetics 119: 185-197), o promotor do inibidor da MPI proteinase (Cordero et al. (1994) Plant J. 6: 141-150), e o promotor da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (Kohler et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29: 1293-1298; Martinez et al. (1989) J. Mol. Biol. 208: 551-565; e Quigley et al. (1989) J. Mol. Evol. 29: 412-421). Estão também incluídos os sistemas induzíveis por benzenossulfonamida (Patente dos E.U.A. No. 5,364,780) e induzível por álcool (Pedidos de Patentes Internacionais Nos. de Publicação WO 97/06269 e WO 97/06268) e promotores da glutationa-S-transferase. Da mesma forma, se pode usar qualquer um dos promotores induzíveis descritos em Gatz (1996) Current Opinion Biotechnol. 7: 168-172 e Gatz (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 89-108. Outros promotores quimicamente induzíveis úteis para direcionamento da expressão das sequências de nucleotídeos desta invenção em plantas são divulgados na Patente dos E.U.A. 5,614,395 aqui incorporada por referência na sua totalidade. A indução química da expressão de genes está também detalhada no pedido publicado EP 0 332 104 (em nome de Ciba-Geigy) e Patente dos E.U.A. 5,614,395. Em algumas modalidades, um promotor para indução química pode ser o promotor PR-1a do tabaco.

[0079] Um polipeptídeo desta invenção pode ou não ser dirigido para um compartimento dentro da planta através do uso de uma sequência sinal. Numerosas sequências sinal são conhecidas por influenciarem a expressão ou direcionamento de um polinucleotídeo para um compartimento/tecido particular ou fora de um compartimento/tecido particular. Sequências sinal e promotores do direcionamento adequados são conhecidos na técnica e incluem aqueles, mas não estão limitados àqueles, proporcionados aqui (ver, p.ex., Patente dos E.U.A. No. 7,919,681). Exemplos de alvos incluem o, mas não estão limitados ao, vacúolo, retículo endoplasmático (ER), cloroplasto, amiloplasto, grânulo de amido, parede celular, semente, ou a um tecido particular, p.ex., endosperma. Assim, uma sequência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo da invenção (p.ex., SEQ ID NO:1) pode estar operacionalmente ligada a uma sequência sinal para direcionamento e/ou retenção do polipeptídeo para um compartimento dentro de uma planta. Em algumas modalidades, a sequência sinal pode ser uma sequência sinal N-terminal de cera, uma sequência sinal N- terminal de gama-zeína, um domínio de ligação ao amido, ou um domínio de ligação ao amido C-terminal. Em modalidades adicionais, a sequência sinal pode ser uma sequência sinal do ER, uma sequência de retenção do ER, uma sequência sinal do ER e uma sequência de retenção do ER adicional. Assim, em algumas modalidades da invenção, os polipeptídeos de α-amilase podem ser fundidos com uma ou mais sequências sinal (e/ou as sequências de nucleotídeos codificando os referidos polipeptídeos podem estar operacionalmente ligadas a sequências de nucleotídeos codificando as referidas sequências sinal).

[0080] Como usado aqui, "cassete de expressão" significa uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos de interesse (p.ex., as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 e/ou SEQ ID NO:5), em que a referida sequência de nucleotídeos está operacionalmente associada a pelo menos uma sequência de controle (p.ex., um promotor). Assim, algumas modalidades da invenção proporcionam cassetes de expressão concebidos para expressar a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 e/ou SEQ ID NO:5. Deste modo, por exemplo, um ou mais promotores de plantas operacionalmente associados à sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 e/ou SEQ ID NO:5 ou uma sequência de nucleotídeos tendo identidade substancial com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 e/ou SEQ ID NO:5 podem ser proporcionados em um cassete de expressão para expressão em um organismo ou sua célula (p.ex., uma planta, parte de planta e/ou célula vegetal).

[0081] Um cassete de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeos de interesse pode ser quimérico, significando que pelo menos um dos seus componentes é heterólogo no que diz respeito a pelo menos um dos seus outros componentes. Um cassete de expressão pode ser também um que ocorra naturalmente mas que tenha sido obtido em uma forma recombinante útil para expressão heteróloga. Tipicamente, no entanto, o cassete de expressão é heterólogo no que diz respeito ao hospedeiro, i.e., a sequência de ácidos nucleicos particular do cassete de expressão não ocorre naturalmente na célula hospedeira e tem de ser introduzida na célula hospedeira ou um antepassado da célula hospedeira por um evento de transformação.

[0082] Adicionalmente aos promotores operacionalmente ligados a uma sequência de nucleotídeos a ser expressa, um cassete de expressão pode também incluir outras sequências reguladoras. Como usada aqui, uma “sequência reguladora” significa uma sequência de nucleotídeos localizada a montante (sequências não codificantes 5'), dentro e/ou a jusante (sequências não codificantes 3’) de uma sequência codificante, e/ou que influencia a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA, ou tradução da sequência codificante associada. As sequências reguladoras incluem, mas não estão limitadas a, promotores, intensificadores, íntrons, sequências líder de tradução, sinais de terminação, e sequências sinal de poliadenilação. Em algumas modalidades, um cassete de expressão pode também incluir sequências de nucleotídeos codificando sequências sinal operacionalmente ligadas a uma sequência de polinucleotídeos da invenção.

[0083] Para propósitos da invenção, as sequências ou regiões reguladoras podem ser nativas/análogas em relação à planta, parte da planta e/ou célula vegetal e/ou as sequências reguladoras podem ser nativas/análogas em relação às outras sequências reguladoras. Alternativamente, as sequências reguladoras podem ser heterólogas em relação à planta (e/ou parte da planta e/ou célula vegetal) e/ou uma em relação à outra (i.e., sequências reguladoras). Assim, por exemplo, um promotor pode ser heterólogo quando está operacionalmente ligado a um polinucleotídeo de uma espécie diferente da espécie da qual o polinucleotídeo foi derivado. Alternativamente, um promotor pode ser também heterólogo em relação a uma sequência de nucleotídeos selecionada se o promotor for da mesma/análoga espécie da qual o polinucleotídeo é derivado, mas um ou ambos (i.e., promotor e/ou polinucleotídeo) são substancialmente modificados em relação à sua forma original e/ou lócus genômico, e/ou o promotor não é o promotor nativo do polinucleotídeo operacionalmente ligado.

[0084] Um número de sequências líder não traduzidas derivadas de vírus é conhecido como intensificando a expressão de genes. Especificamente foi mostrado que sequências líder do Vírus do Mosaico do Tabaco (TMV, a "sequência w"), Vírus do Mosqueado Clorótico do Maís (MCMV) e Vírus do Mosaico da Alfalfa (AMV) são eficazes na intensificação da expressão (Gallie et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 8693-8711; e Skuzeski et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15: 65-79). Outras sequências líder conhecidas na técnica incluem, mas não estão limitadas a, líderes de picornavírus tais como um líder da região não codificante 5’ (EMCV) da encefalomiocardite (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6126-6130); líderes de potivírus tais como um líder do Vírus Etch do Tabaco (TEV) (Allison et al. (1986) Virology 154: 9-20); líder do Vírus do Mosaico Anão (MDMV) do Maís (Allison et al. (1986), supra); líder da proteína de ligação (BiP) à cadeia pesada da imunoglobulina humana (Macejak & Samow (1991) Nature 353: 90-94); líder não traduzido do mRNA da proteína de revestimento de AMV (AMV RNA 4; Jobling & Gehrke (1987) Nature 325: 622-625); líder de TMV de mosaico do tabaco (Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA 237-256); e líder de MCMV (Lommel et al. (1991) Virology 81: 382-385). Ver também, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968.

[0085] Um cassete de expressão pode também incluir opcionalmente uma região de terminação transcricional e/ou translacional (i.e., região de terminação) que é funcional em plantas. Uma variedade de terminadores transcricionais está disponível para uso em cassetes de expressão e é responsável pela terminação da transcrição para além da sequência de nucleotídeos heteróloga de interesse e poliadenilação correta de mRNA. A região de terminação pode ser nativa em relação à região de iniciação transcricional, pode ser nativa em relação à sequência de nucleotídeos de interesse operacionalmente ligada, pode ser nativa em relação à planta hospedeira, ou pode ser derivada de outra fonte (i.e., estranha ou heteróloga em relação ao promotor, à sequência de nucleotídeos de interesse, à hospedeira de planta, ou qualquer sua combinação). Terminadores transcricionais apropriados incluem o, mas não estão limitados ao, terminador de 35S do CAMV, o terminador de tml, o terminador da nopalina sintase e/ou o terminador de rbcs E9 da ervilha. Estes podem ser usados tanto em monocotiledôneas como em dicotiledôneas. Adicionalmente pode ser usado um terminador da transcrição nativo de uma sequência codificante.

[0086] Um cassete de expressão da invenção pode também incluir uma sequência de nucleotídeos para um marcador selecionável, que pode ser usado para selecionar uma planta, parte de planta e/ou célula de planta transformadas. Como usado aqui, “marcador selecionável” significa uma sequência de nucleotídeos que quando expressa fornece um fenótipo distinto à planta, parte de planta e/ou célula de planta expressando o marcador e permite assim que tais plantas, partes de planta e/ou células de planta transformadas sejam distinguidas daquelas que não têm o marcador. Uma tal sequência de nucleotídeos pode codificar tanto um marcador selecionável como marcador rastreável, dependendo de se o marcador confere um traço que pode ser selecionado por meios químicos, tal como por uso de um agente seletivo (p.ex., um antibiótico, herbicida, ou similares), ou se o marcador é simplesmente um traço que se pode identificar através de observação ou teste, tal como por rastreamento (p.ex., o traço do lócus R). Obviamente, muitos exemplos de marcadores selecionáveis adequados são conhecidos na técnica e podem ser usados nos cassetes de expressão descritos no presente documento.

[0087] Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados a uma sequência de nucleotídeos codificando neo ou nptII, que confere resistência à canamicina, G418, e similares (Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199: 183-188); uma sequência de nucleotídeos codificando bar, que confere resistência à fosfinotricina; uma sequência de nucleotídeos codificando uma 5- enolpiruvilchiquimato-3-fosfato (EPSP) sintase alterada, que confere resistência ao glifosato (Hinchee et al. (1988) Biotech. 6: 915-922); uma sequência de nucleotídeos codificando uma nitrilase tal como bxn de Klebsiella ozaenae que confere resistência ao bromoxinil (Stalker et al. (1988) Science 242: 419-423); uma sequência de nucleotídeos codificando uma acetolactato sintase (ALS) alterada que confere resistência à imidazolinona, sulfonilureia ou outros químicos inibindo ALS (Pedido de Patente EP No. 154204); uma sequência de nucleotídeos codificando uma di-idrofolato reductase (DHFR) resistente ao metotrexato (Thillet et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 12500-12508); uma sequência de nucleotídeos codificando uma dalapon dehalogenase que confere resistência ao dalapon; uma sequência de nucleotídeos codificando uma manose-6-fosfato isomerase (também referida como fosfomanose isomerase (PMI)) que confere uma capacidade de metabolizar a manose (Patentes dos E.U.A. Nos. 5,767,378 e 5,994,629); uma sequência de nucleotídeos codificando uma antranilato sintase alterada que confere resistência ao triptofano de 5-metila; e/ou uma sequência de nucleotídeos codificando hph que confere resistência à higromicina. Um perito na técnica é capaz de escolher um marcador selecionável adequado para uso em um cassete de expressão da invenção.

[0088] Marcadores selecionáveis adicionais incluem, mas não estão limitados a, uma sequência de nucleotídeos codificando β- glucuronidase ou uidA (GUS) que codifica uma enzima para a qual são conhecidos vários substratos cromogênicos; uma sequência de nucleotídeos do lócus R que codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) em tecidos vegetais (Dellaporta et al., "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon-tagging with Ac" páginas 263-282 Em: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium (Gustafson & Appels eds., Plenum Press 1988)); uma sequência de nucleotídeos codificando β-lactamase, uma enzima para a qual são conhecidos vários substratos cromogênicos (p.ex., PADAC, uma cefalosporina cromogênica) (Sutcliffe (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3737-3741); uma sequência de nucleotídeos codificando xylE que codifica uma catechol dioxigenase (Zukowsky et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1101-1105); uma sequência de nucleotídeos codificando tirosinase, uma enzima capaz de oxidar tirosina até DOPA e dopaquinona, que por seu turno condensa para formar melanina (Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-2714); uma sequência de nucleotídeos codificando β-galactosidase, uma enzima para a qual existem substratos cromogênicos; uma sequência de nucleotídeos codificando luciferase (lux) que permite detecção de bioluminescência (Ow et al. (1986) Science 234: 856-859); uma sequência de nucleotídeos codificando aquorina, que pode ser empregue na detecção da bioluminescência sensível ao cálcio (Prasher et al. (1985) Biochem. Biophys. Res. Comm. 126: 1259-1268); ou uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína verde fluorescente (Niedz et al. (1995) Plant Cell Reports 14: 403-406). Um perito na técnica é capaz de escolher um marcador selecionável adequado para uso em um cassete de expressão da invenção.

[0089] Em outros aspectos da invenção é proporcionado um método de aumento da taxa de crescimento (ganho de peso) ou do ganho de peso diário médio de um animal, compreendendo o método alimentação ao referido animal de uma composição de ração animal da presente invenção, em que a taxa de crescimento do animal ou o ganho de peso diário médio do animal é aumentado em cerca de 0,05 lb/dia a cerca de 10 lbs/dia em comparação com a taxa de crescimento de um animal de controle ao qual não é proporcionada a composição de ração animal da invenção. Assim, em algumas modalidades, o aumento na taxa de crescimento ou ganho de peso diário médio pode ser cerca de 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,1, 0,125, 0,15, 0,175, 0,2, 0,225, 0,25, 0,275, 0,3, 0,325, 0,35, 0,375, 0,4, 0,425, 0,45, 0,475, 0,5, 0,525, 0,55, 0,575, 0,6, 0,625, 0,65, 0,675, 0,7, 0,725, 0,75, 0,775, 0,8, 0,825, 0,85, 0,875, 0,9, 0,925, 0,95, 0,975, 1, 1,25, 1,5, 1,75, 2, 2,25, 2,5, 2,75, 3, 3,25, 3,5, 3,75, 4, 4,1, 4,2, 4,21, 4,22, 4,23, 4,24, 4,25, 4,26, 4,27, 4,28, 4,29, 4,3, 4,31, 4,32, 4,33, 4,34, 4,35, 4,36, 4,37, 4,38, 4,39, 4,4, 4,41, 4,42, 4,43, 4,44, 4,45, 4,46, 4,47, 4,48, 4,49, 4,5, 4,75, 5, 5,25, 5,5, 5,75, 6, 6,25, 6,5, 6,75, 7, 7,25, 7,5, 7,75, 8, 8,25, 8,5, 8,75, 9, 9,25, 9,5, 9,75, 10 lbs/dia e similares e/ou qualquer gama intermédia. Em algumas modalidades particulares, o aumento na taxa de crescimento ou ganho de peso diário médio pode ser de cerca de 0,05 lb/dia a cerca de 0,5 lb/por dia. Em modalidades adicionais, o aumento na taxa de crescimento ou ganho de peso diário médio pode ser cerca de 0,1 lb/dia em comparação com o crescimento de um animal de controle ao qual não é proporcionada a referida composição de ração animal.

[0090] Em aspectos ainda adicionais da invenção é proporcionado um método para redução do número de dias necessários para alcançar um peso desejado em um animal, compreendendo o método alimentação ao referido animal de uma composição de ração animal da invenção, reduzindo deste modo o número de dias necessários para alcançar um peso desejado em comparação com o número de dias necessários para alcançar o mesmo peso desejado em um animal de controle que não é alimentado com a referida composição de ração animal.

[0091] Como usado, um “peso desejado” ou “peso acabado desejado” pode significar um peso vivo ou um peso de carcaça quente. Assim, por exemplo, para gado, um peso vivo desejado pode ser entre cerca de 950 a cerca de 1.600 lbs e um peso de carcaça quente desejado pode ser entre cerca de 700 a cerca e 1.000 lbs.

[0092] Antes de entrar no parque de engorda, o gado passa a maioria da sua vida a pastorear em campo ou pastagem e depois é transportado para um parque de engorda para acabamento onde é alimentado com grão e outros concentrados de ração. Geralmente, o gado entra em um parque de engorda a um peso de cerca de 600 a cerca de 750 lbs. Dependendo do peso aquando da colocação, das condições de alimentação, e do peso acabado desejado, o período em um parque de engorda pode estar em uma gama de cerca de 90 dias a cerca de 300 dias. O ganho médio pode ser de cerca de 2,5 a cerca de 5 libras por dia.

[0093] Conformemente, em outro aspecto da invenção, o número de dias necessários para alcançar um peso desejado em um animal alimentado com as composições de ração animal da invenção pode ser reduzido em cerca de 1 dia a cerca de 30 dias em comparação com um animal de controle que não é alimentado com a referida composição de ração animal. Em algumas modalidades, o número de dias necessários para alcançar um peso desejado em um animal alimentado com as composições de ração animal da invenção pode ser reduzido em cerca de 1 dia a cerca de 25 dias, cerca de 1 dia a cerca de 20 dias, cerca de 5 dias a cerca de 20 dias, cerca de 5 dias a cerca de 15 dias, e similares, em comparação com um animal de controle que não é alimentado com a referida composição de ração animal. Assim, em algumas modalidades, o número de dias necessários para alcançar um peso desejado em um animal alimentado com uma composição de ração animal da invenção pode ser reduzido em cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,28, 29, 30 dias e similares e/ou qualquer gama intermédia.

[0094] Em outros aspectos da invenção é proporcionado um método de aumento da eficácia de utilização de ração por um animal, compreendendo o método alimentação ao referido animal de uma composição de ração animal da invenção em uma quantidade eficaz para aumentar a eficácia de utilização de ração pelo referido animal em comparação com um animal de controle que não é alimentado com a referida composição de ração animal.

[0095] A eficácia de utilização de ração pode ser calculada como o ganho no peso corporal do animal pela quantidade de ração proporcionada. Em algumas modalidades, o peso corporal é o peso corporal acabado antes do abate. Em modalidades adicionais, a ração proporcionada é a quantidade de ração que é proporcionada ao longo de um período de cerca de 90 dias a cerca de 300 dias. Assim, em algumas modalidades, a ração proporcionada é a quantidade de ração que é proporcionada ao longo de um período de cerca de 100 dias a cerca de 275 dias, cerca de 125 dias a cerca de 250 dias, cerca de 150 dias a cerca de 225 dias, cerca de 180 dias a cerca de 200 dias e similares.

[0096] Conformemente, em algumas modalidades, o período de tempo (número de dias) ao longo do qual o ganho de peso é medido é 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300 dias, e similares, e/ou qualquer gama intermédia.

[0097] Em aspectos adicionais da invenção, o valor de ração do milho pelo animal é aumentado em cerca de 1% a cerca de 25% em comparação com um animal de controle que não é alimentado com a referida composição de ração animal. O valor de ração do milho iguala a diferença na eficácia de ração da composição de ração da presente invenção e a eficácia de ração de um animal de controle que não é alimentado com a referida composição de ração, dividida pela eficácia de ração do referido animal de controle que não é alimentado com a referida composição de ração, toda a qual é dividida pela percentagem de inclusão de milho da referida composição de ração. Conformemente, em algumas modalidades, o aumento no valor de ração do milho pode ser cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, e similares e/ou qualquer gama intermédia. Em modalidades particulares, o aumento no valor de ração do milho é cerca de 1% a cerca de 10% em comparação com um controle. Em uma modalidade representativa, o aumento no valor de ração é cerca de 5% em comparação com um controle.

[0098] Em aspectos adicionais da invenção, a eficácia de utilização de pelo animal é aumentada em cerca de 0,005 a cerca de 0,1 em comparação com um animal de controle que não é alimentado com a referida composição de ração animal. Conformemente, em algumas modalidades, o aumento na eficiência de utilização de ração pode ser cerca de 0,005, 0,006, 0,007, 0,008, 0,009,0,01, 0,011, 0,012, 0,013, 0,014, 0,015, 0,016, 0,017, 0,018, 0,019, 0,02, 0,021, 0,022, 0,023, 0,024, 0,025, 0,026, 0,027, 0,028, 0,029, 0,03, e similares e/ou qualquer gama intermédia. Em modalidades particulares, o aumento na eficácia de utilização de ração é cerca de 0,005 a cerca de 0,01 em comparação com um controle. Em uma modalidade representativa, o aumento na eficácia de utilização de ração é cerca de 0,06 em comparação com um controle. A eficácia de utilização de ração, também conhecida como “G:F”, é o ganho de peso diário médio pela ingestão de matéria seca por dia do animal.

[0099] Em algumas modalidades, o animal é alimentado com cerca de 1 lb a cerca de 30 lb de uma composição de ração animal da invenção por animal por dia. Conformemente, em algumas modalidades, o animal é alimentado com cerca de 1 lb, 2 lbs, 3 lbs, 4 lbs, 5 lbs, 6 lbs, 7 lbs, 8 lbs, 9 lbs, 10 lbs, 11 lbs, 12 lbs, 13 lbs, 14 lbs, 15 lbs, 16 lbs, 17 lbs, 18 lbs, 19 lbs, 20 lbs, 21 lbs, 22 lbs, 23 lbs, 24 lbs, 25 lbs, 26 lbs, 27 lbs, 28 lbs, 29 lbs, 30 lbs da composição de ração animal da invenção por animal por dia, e similares, e/ou qualquer gama intermédia. Em algumas modalidades, o animal é alimentado com cerca de 9 lbs a cerca de 21 lb da composição de ração animal da invenção por animal por dia. Em algumas modalidades, um animal pode ser alimentado com a composição de ração animal da invenção ad libitum, ou cerca de uma vez a cerca de três vezes por dia (p.ex., 1, 2, 3) ou qualquer sua combinação.

[0100] A invenção contempla também um método de redução de abscessos hepáticos em gado coletado (p.ex., abatido), compreendendo o método as etapas de: a) alimentação de uma composição de ração animal ao gado, em que a composição de ração animal compreende material vegetal de uma planta ou parte de planta transgênica (p.ex., uma planta ou parte de planta de milho transgênica) expressando uma α-amilase termotolerante recombinante (opcionalmente, microbiana); e b) coleta do gado. A α-amilase da invenção é como descrita aqui. Em modalidades, a planta ou parte de planta transgênica é uma planta ou parte de planta de milho transgênica (p.ex., grãos de milho floculados a vapor), compreendendo opcionalmente o evento 3272 de milho. Em modalidades representativas, a planta ou parte de planta transgênica compreende cerca de 1% a cerca de 100% em peso do material vegetal. O método pode ser praticado com qualquer gado, p.ex., gado de corte (novilhos e/ou novilhas) e/ou vacas leiteiras. Em modalidades, o gado é gado em parques de engorda.

[0101] É conhecido na técnica que a frequência de formação de abscessos hepáticos aumenta com dietas que são ricas em concentrados de ração e pobres em forage (i.e., forragem). Em modalidades representativas, o método de redução de abscessos hepáticos é praticado com gado que é alimentado com uma dieta rica em concentrado/pobre em forage. Em modalidades, a dieta compreende forage em uma quantidade menor do que ou igual a cerca de 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% (base de matéria seca). Em modalidades, a dieta inclui forage nula ou essencialmente nula. Em modalidades, a dieta compreende pelo menos cerca de 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais concentrado de ração (base de matéria seca).

[0102] Em modalidades, a frequência global de formação de abscessos hepáticos é reduzida (p.ex., em pelo menos cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60% ou mais). Em modalidades representativas, a frequência de abscessos hepáticos moderados e/ou graves é reduzida (p.ex., em pelo menos cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60% ou mais).

[0103] É também proporcionada pela invenção uma carcaça de gado coletado (i.e., abatido) (ou uma pluralidade de carcaças de gado coletado) produzida por um método de alimentação como descrito aqui, em que a(s) carcaça(s) de gado coletado compreende(m) o fígado do animal coletado, e em que existe uma incidência reduzida de abscessos hepáticos no fígado da(s) referida(s) carcaça(s) de gado coletado em comparação com carcaças de gado de controle que não é alimentado com material vegetal de uma planta ou parte de planta transgênica expressando uma α-amilase termotolerante recombinante (p.ex., microbiana). Em modalidades, a frequência global de formação de abscessos hepáticos é reduzida (p.ex., em pelo menos cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60% ou mais). Em modalidades representativas, a frequência de abscessos hepáticos moderados e/ou graves é reduzida (p.ex., em pelo menos cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60% ou mais).

[0104] Os inventores constataram que material vegetal (p.ex., grãos de milho) floculado a vapor expressando uma α-amilase termotolerante recombinante (p.ex., microbiana) (como descrito aqui) tem vantagens surpreendentes e inesperadas em comparação com um material vegetal de controle adequado que não expressa uma α-amilase termotolerante recombinante. Para ilustrar, os inventores constataram que a taxa de produtividade de material vegetal (p.ex., grãos de milho) expressando a α-amilase termotolerante recombinante pode ser aumentada em comparação com material vegetal que não expressa a α-amilase, p.ex., sob condições similares ou mesmo idênticas (tais como umidade, temperatura e similares). Em modalidades, o método resulta em um produto floculado a vapor com substancialmente a mesma espessura de flocos (por exemplo, dentro de cerca de 5% ou 10%) ou mesmo espessura de flocos melhorada (reduzida), substancialmente o mesmo tamanho médio geométrico de partículas (por exemplo, dentro de cerca de 5% ou 10%) ou mesmo tamanho médio geométrico de partículas melhorado (reduzido) e/ou substancialmente a mesma densidade de flocos (por exemplo, dentro de 5% ou 10%) ou densidade de flocos melhorada (aumentada). Uma taxa de produtividade aumentada tem vantagens pois pode apoiar a alimentação de um número aumentado de animais e/ou pode se traduzir em poupanças em termos de mão-de- obra, água, energia (tal como eletricidade e/ou gás natural) e/ou custos de maquinaria.

[0105] Conformemente, a invenção proporciona também métodos de produção de uma ração animal por floculação a vapor de um material vegetal compreendendo uma α-amilase termotolerante recombinante (p.ex., microbiana). Em modalidades representativas, o método compreende: a) fornecimento de grãos de milho transgênicos (como descrito aqui, p.ex., grãos de milho com casca inteiros) compreendendo uma α-amilase termotolerante recombinante (p.ex., microbiana); e b) floculação a vapor dos grãos de milho para produzir um produto de milho floculado a vapor; opcionalmente, em que a taxa de produtividade é aumentada em comparação com grãos de milho controle adequados que não compreendem uma α-amilase termotolerante recombinante (p.ex., microbiana), p.ex., sob condições similares ou mesmo idênticas (tais como umidade, temperatura e similares). Em modalidades, a taxa de produtividade é aumentada em pelo menos cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% ou 50% ou mais. A taxa de “produtividade” se refere geralmente à taxa à qual o material vegetal é processado através do processo e dispositivos inteiros de floculação a vapor, que pode incluir opcionalmente uma câmara/etapa de limpeza preliminar, uma câmara/etapa de imersão preliminar, uma câmara/etapa de resfriamento de seguimento, uma câmara/etapa de secagem de seguimento e similares. Em modalidades, a taxa de produtividade se refere especificamente à taxa à qual o material vegetal é processado através da câmara de vapor e moinho de floculação (p.ex., rolos).

[0106] Um material vegetal, grão de milho ou similar de “controle”, como usado aqui, se refere a um material vegetal ou grão de milho que não expressa uma α-amilase termotolerante recombinante (como descrito aqui), p.ex., o material vegetal ou grão de milho controle tem de outro modo propriedades similares ao material vegetal ou grãos de milhos transgênicos. Um produto de planta floculado a vapor de “controle” ou produto de milho floculado a vapor de “controle”, como usado aqui, é produzido a partir de um material vegetal ou grão de milho de “controle”, respectivamente.

[0107] Em modalidades representativas, os grãos de milhos transgênicos usados nos métodos de floculação a vapor da invenção compreendem o evento 3272 de milho.

[0108] Em modalidades, o tempo para flocular a vapor do material vegetal (p.ex., grãos de milho) transgênico expressando a α-amilase termotolerante recombinante (p.ex., microbiana) pode ser reduzido (p.ex., em pelo menos cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% ou mais) em comparação com o material vegetal de controle sob condições de outro modo similares.

[0109] Em modalidades representativas, a digestibilidade de amido no produto vegetal (p.ex., produto de milho) floculado a vapor é aumentada (p.ex., em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 15%, 20% ou mais) em comparação com a digestibilidade de amido em um produto de milho floculado a vapor controle produzido a partir dos grãos de milho controle. A digestibilidade de amido é uma medida de quanto do amido na ração é convertido em energia e usado pelo animal e pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica, incluindo animal inteiro (p.ex., amido fecal) e métodos laboratoriais (p.ex., como descrito nos Exemplos acompanhantes).

[0110] Em modalidades, o produto vegetal floculado a vapor (p.ex., produto de milho floculado a vapor) produzido pelos métodos de floculação a vapor da invenção tem uma diminuição no tamanho médio geométrico de partículas (p.ex., pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 15%, 20% ou mais) em comparação com um produto vegeta floculado a vapor controle produzido a partir de um produto vegetal de controle. Métodos de determinação do tamanho médio geométrico de partículas são conhecidos na técnica (ver, p.ex., os Exemplos).

[0111] Em modalidades, os métodos de floculação a vapor da invenção podem resultar em um aumento no acastanhamento do produto vegetal (p.ex., grãos de milho) floculado a vapor preparado a partir de material vegetal expressando uma α-amilase termotolerante recombinante (p.ex., microbiana) em comparação com um produto vegetal floculado a vapor controle. Em modalidades, o aumento no acastanhamento no produto floculado a vapor é observado durante o e/ou após o processo de resfriamento. Em modalidades existe um aumento (p.ex., em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% ou mais) no acastanhamento (p.ex., acastanhamento não enzimático). Sem estar limitado por qualquer teoria da invenção parece que a α- amilase termotolerante recombinante (p.ex., microbiana) produz uma concentração aumentada de açúcares solúveis, tais como maltose e outros açúcares redutores, no material vegetal. Os açúcares redutores podem participar da reação de Maillard (uma reação química entre aminoácidos e açúcares redutores produzindo uma cor marrom), que pode resultar em acastanhamento aumentado em material vegetal (p.ex., grãos de milho) floculado a vapor expressando uma α-amilase termotolerante recombinante (p.ex., microbiano) em comparação com um produto vegetal floculado a vapor controle produzido a partir de um material vegetal de controle (p.ex., como determinado por inspeção visual ou por análise laboratorial).

[0112] A invenção proporciona também um produto vegetal (p.ex., produto de milho) floculado a vapor produzido por um método de floculação a vapor como descrito aqui. Em modalidades, o produto vegetal floculado a vapor pode compreender uma ou mais das vantagens discutidas acima (p.ex., digestibilidade de amido aumentada, tamanho médio geométrico de partículas diminuído, espessura de flocos diminuída e/ou densidade de flocos aumentada). Em modalidades representativas, o produto vegetal floculado a vapor é utilizado mais eficientemente quando alimentado a animais (p.ex., gado) em comparação com a utilização de um produto vegetal floculado a vapor controle. Por exemplo, a eficiência da ração como medida por razão entre ganho e ração pode ser aumentada. Métodos de determinação de um aumento na eficiência da ração e razão entre ganho e ração são descritos aqui. Por exemplo, em modalidades, a razão entre ganho e ração é aumentada em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 15% ou mais em comparação com uma ração compreendendo um produto vegetal floculado a vapor controle. Em modalidades representativas, um aumento na eficiência da ração é observado quando se alimenta o produto vegetal floculado a vapor da invenção, mesmo em comparação com um produto vegetal floculado a vapor controle que tem um nível substancialmente similar (p.ex., dentro de cerca de 5% ou 10%) de disponibilidade de amido. Em modalidades, a disponibilidade de amido está na gama de igual a ou mais do que cerca de 48%, 49%, 50% e/ou igual a ou menos do que cerca de 51%, 52%, 53%, 54% ou 55% (incluindo qualquer sua combinação, desde que a extremidade inferior da gama seja menor do que a extremidade superior da gama). Em modalidades, a disponibilidade de amido está na gama de cerca de 48% a 55%, cerca de 48% a 54%, cerca de 48% a 53%, cerca de 48% a 52%, cerca de 49% a 55%, cerca de 49% a 54 %, cerca de 49% a 53%, cerca de 49% a 52%, cerca de 50% a 55%, cerca de 50% a 54%, cerca de 50% a 53%, cerca de 50% a 52%, cerca de 51% a 55%, cerca de 51% a 54%, cerca de 51% a 53% ou cerca de 51% a 52%.

[0113] A disponibilidade de amido reflete quanto do amido é gelatinizado (p.ex., durante o processo de floculação a vapor) e/ou de outro modo rompido a partir da matriz de proteínas que encapsula tipicamente os grânulos de amido (p.ex., no grão de milho) e está, portanto, disponível para digestão enzimática (p.ex., no rúmen). A disponibilidade de amido pode ser medida por qualquer método conhecido na técnica (p.ex., Sindt et al., (2000) “Refractive Index: a rapid method for determination of starch availability in grains,” Kansas Agricultural Experiment Station Research Reports, Artigo 398: Vol. 0: Ed. 1, encontrado na internet em doi.org/10.4148/2378-5977.1801). Na floculação a vapor, a disponibilidade de amido está altamente correlacionada com a densidade de flocos, que é frequentemente usada na prática como uma medida indireta da disponibilidade de amido.

[0114] A composição de ração animal da presente invenção pode ser alimentada a qualquer animal, por exemplo, um animal de quinta, um animal de zoo, um animal de laboratório e/ou um animal de companhia. Em algumas modalidades, o animal pode ser, mas não está limitado a, um bovino (p.ex., gado doméstico (vacas (p.ex., leiteiras e/ou de corte), bisonte, búfalo), um equino (p.ex., cavalo, burro, zebra, e similares), uma ave (p.ex., uma galinha, uma codorniz, um peru, um pato, e similares; p.ex., aves de capoeira), uma ovelha, uma cabra, um antílope, um porco (p.ex., suíno), um canino, um felino, um roedor (p.ex., camundongo, rato, porquinho-da-índia); um coelho, um peixe, e similares. Em algumas modalidades, o animal pode ser uma vaca. Em algumas modalidades, o animal pode ser aves de capoeira. Em outras modalidades, o animal pode ser uma galinha. Em modalidades adicionais, o animal pode ser suíno. Em modalidades ainda adicionais, o animal pode ser um porco.

[0115] Em modalidades adicionais, a presente invenção proporciona um método para aumento do volume de leite produzido por um animal leiteiro (p.ex., uma vaca, uma cabra, e similares), compreendendo alimentação ao referido animal leiteiro de uma composição de ração animal da presente invenção, em que o volume de leite produzido pelo referido animal é aumentado em cerca de 5% a cerca de 200% em comparação com o volume de leite produzido por um animal de controle ao qual não é proporcionada a referida composição de ração animal da invenção. Em algumas modalidades, o aumento no volume de leite é ao longo de um período de tempo de cerca de 1 a cerca de 72 horas. Em outras modalidades, o volume de leite produzido pelo referido animal é aumentado em cerca de 25% a cerca de 175%, cerca de 50% a cerca de 150%, e similares. Em modalidades adicionais, o volume de leite produzido pelo referido animal é aumentado em cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 155%, 160%, 165%, 170%, 175%, 180%, 185%, 190%, 195% e/ou 200% em comparação com um animal de controle que não foi alimentado com a composição de ração animal da invenção.

[0116] Os termos “aumento”, “aumentando”, “aumentado”, “intensificar”, “intensificado”, “intensificando” e “intensificação” (e suas variações gramaticais), como usados aqui, descrevem um aumento no parâmetro especificado, p.ex., o ganho de peso diário médio de um animal ou a taxa de crescimento (ganho de peso) de um animal por alimentação ao referido animal de uma composição de ração animal da invenção, em que o ganho de peso diário médio ou taxa de crescimento do animal é aumentado em cerca de 0,05 lbs/dia a cerca de 10 lbs/dia ou um aumento na eficiência de utilização de ração por um animal por alimentação ao referido animal da composição de ração animal da invenção em uma quantidade eficaz para aumentar a eficiência de utilização de ração pelo referido animal. Este aumento no ganho de peso diário médio, na taxa de crescimento (ganho de peso), ou na eficácia de utilização de ração por um animal, pode ser observado por comparação do ganho de peso diário médio, da taxa de crescimento (ganho de peso) ou aumento na eficácia de utilização de ração pelo animal com um animal não alimentado com uma composição de ração animal da invenção (i.e., um controle).

[0117] Como usados aqui, os termos “reduzem”, “reduzido”, “reduzindo”, “redução”, “diminuir”, “suprimir” e “diminuir” (e suas variações gramaticais) descrevem, por exemplo, uma redução do ou diminuição no parâmetro especificado, p.ex., número e/ou gravidade de formação de abscessos hepáticos ou o número de dias necessários para alcançar um peso desejado em um animal em comparação com um controle (p.ex., um animal de controle que não é alimentado com a composição de ração animal).

[0118] A presente invenção é mais particularmente descrita nos seguintes exemplos que se destinam a ser ilustrativos somente, uma vez que numerosas modificações e variações neles serão aparentes àqueles peritos na técnica.

EXEMPLOS Exemplo 1 - Efeitos de milho de ração rico em amilase no desempenho de parques de engorda e qualidade da carcaça de novilhas de corte de acabamento

[0119] Milho de Ração Enogen® (EFC; Syngenta Seeds, LLC) é caracterizado por elevada expressão de amilase no endosperma de grãos. Foi originalmente concebido, e tem sido extensivamente usado, para a produção de etanol. O milho está bem estabelecido como o ingrediente mais dominante alimentado ao gado de acabamento, pois o amido proporciona uma maioria da energia da dieta. Os ruminantes têm capacidade limitada para secreção de amilase pancreática e, consequentemente, são limitados na digestão pós-ruminal de amido (Harmon et al., 2004. Can. J. Anim. Sci. 84: 309). É plausível que qualquer amido não digerido ruminalmente poderia ser adicionalmente degradado no intestino delgado por α-amilase produzida pelo grão. Isto seria uma vantagem energética.

[0120] Muitos consideram a floculação a vapor de milho como sendo o método de processamento ótimo para maximizar a energia utilizada a partir do grão, e melhorias por esta técnica de processamento são extensivamente documentadas (Owens et al., 1997. J. Anim. Sci. 75: 868; Zinn et al., 2002. J. Anim. Sci. 80: 1145). Tanto quanto os inventores estão cientes, os estudos descritos aqui são os primeiros a avaliar o EFC floculado a vapor. Nossos resultados indicam que as ações de EFC intensificam o processo de floculação, resultando em maior produtividade, possivelmente devido à amilase aumentando a taxa de gelatinização de amido.

[0121] Nosso objetivo em este estudo foi examinar as características de floculação a vapor de EFC quando alimentado a novilhas de corte de acabamento e os efeitos no desempenho de parques de engorda, características da carcaça e prevalência e gravidade de abscessos hepáticos.

Materiais e métodos

[0122] O Kansas State University Institutional Animal Care and Use Committee aprovou todos os protocolos e procedimentos utilizados em este estudo. O ensaio foi iniciado em dezembro, e terminou em abril, tendo lugar no Kansas State University Beef Cattle Research Center, Manhattan, KS.

Desenho Experimental

[0123] Um desenho de bloco completo randomizado com 2 tratamentos foi levado a cabo usando 700 novilhas mestiças (BW inicial de 394 kg ± 8,5). Dois lotes de gado, bloqueados separadamente, foram utilizados no ensaio. Trezentas e cinquenta novilhas recebidas em junho foram usadas previamente em um ensaio de recepção examinando suplementação com minerais vestigiais. O segundo lote de gado foi recebido em novembro, visando peso corporal (BW) inicial similar entre lotes no início do estudo. As novilhas foram bloqueadas por lote, depois BW, estratificadas, depois aleatoriamente atribuídas a 1 de 28 compartimentos com superfície suja (25 animais/compartimento). Os tratamentos aleatoriamente atribuídos dentro de bloco consistiram em milho moído (CON) como controle, floculado a vapor até 360 g/L; e Milho para Ração Enogen (EFC), floculado a vapor até 390 g/L. Os tratamentos de grãos foram concebidos para visar disponibilidade diária de amido similar; com base em trabalho preliminar foi tomada uma decisão de flocular o EFC até uma densidade a granel maior e de flocular com maior produtividade do moinho para se alcançar isto. O milho moído foi floculado a aproximadamente 6 toneladas/h; o EFC foi floculado a aproximadamente 9 toneladas/h (produtividade do moinho 50% aumentada), diminuindo o tempo de retenção da câmara de vapor.

Processamento, Alojamento e Manuseamento de Animais

[0124] Após chegada ao Kansas State University Beef Cattle Research Center foi dado às novilhas acesso ad libitum a feno de alfafa e água. O gado foi recebido em múltiplas datas para cada lote e foi processado 24 a 48 horas após chegada. O processamento do lote 1 incluiu vacinação usando vacina viral de 5 vias (Bovishield Gold-5; Zoetis, Parsippany, NJ), um clostrídio de 7 vias (Ultrabac 7/Somubac; Zoetis) e um antibiótico (Micotil; Elanco Animal Health, Greenfield, IN) para visar doença respiratória, pois as novilhas deste lote tinham idade mais jovem. A vacinação do lote 2 foi idêntica, exceto que as novilhas deste lote não foram tratadas com Micotil e um parasiticida tópico (Dectomax; Zoetis) foi aplicado. Durante o processamento inicial para ambos os grupos, os animais foram marcados nas orelhas com um número único para identificação, e o BE foi registrado. No d 1 de início do ensaio, o BW inicial foi registrado à medida que os animais eram separados em compartimentos e recebiam um implante de trenbolona/estradiol (Componente TE-IH com Tylan; Elanco Animal Health). No dia 84, as novilhas foram reimplantadas (Componente TE- 200 com Tylan; Elanco Animal Health) e tratadas com um inseticida de espalhamento (Standguard; Elanco Animal Health).

[0125] Os animais foram alojados em compartimentos com superfície suja que proporcionavam aproximadamente 13 m2 de área superficial/animal; as cercas e portões eram feitos de tubo de aço e divididos em 2 por uma cerca elétrica adicional. Bebedouros automáticos permitindo acesso ad libitum eram partilhados entre compartimentos adjacentes. Os pesos corporais foram determinados usando uma balança e calculando a média do peso dos compartimentos para se determinar o BW médio para cada compartimento.

Preparação de Dieta

[0126] As novilhas foram mudadas para dietas de acabamento no início do ensaio ao longo de 21 d usando 3 dietas intermediárias, com razões concentrado: forragem de:60:40, 71:29 e 92:8 (7 d/etapa) para adaptação gradual. Ambos os tipos de grãos foram floculados a vapor diariamente, usando um floculador a vapor (R & R Machine Works; Dalhart, TX) com rolos corrugados de 46 x 91 cm e uma câmara de vapor capaz de armazenar aproximadamente 4,25 toneladas de milho. As características dos grãos permitem que o milho moído em este sistema seja floculado a aproximadamente 6 toneladas/h sem acúmulo de grãos nos rolos; o EFC, no entanto, poderia ser floculado à capacidade máxima do moinho sem acúmulo de grãos (~ 9 toneladas/h). Um sistema para aplicar umidade aos grãos antes do vapor (SarTec; Anoka, MN) nos permitiu ajustar o condicionamento dos grãos tal que a matéria seca (DM) dos grãos fosse equivalente entre tratamentos. A composição de dietas experimentais é mostrada na Tabela 1. As dietas foram reformuladas durante 39 dias finais para incluir 300 mg/d de Optaflexx (Elanco Animal Health). O gado foi alimentado com rações ad libitum que foram misturadas e administradas uma vez diariamente, começando aproximadamente às 8:00 h. As entradas de ração foram visualmente monitorizadas e ajustadas diariamente como necessário, tal que somente quantidades vestigiais de ração residual estivessem nas manjedouras todas as manhãs. Os resíduos foram coletados como necessário para contabilizar ração não consumida e secos a 55 °C durante 48 h para ajuste preciso da ingestão de matéria seca (DMI). Subamostras de cada ingrediente de ração foram coletadas semanalmente ou após chegada, secas a 55 °C durante 48 h e compostas em amostras mensais que foram posteriormente analisadas quanto à composição de nutrientes (SDK Labs; Hutchinson, KS).Tabela 1. Composição de dietas de acabamento alimentadas a novilhas de corte1

[0127] 1Optaflexx (Elanco Animal Health) foi formulado na dieta durante 39 dias finais na ração, a uma taxa de 300 mg/d.

[0128] 2Formulado para proporcionar 1,76 mg/kg de acetato de melengestrol na DM de dieta total, combinados com milho triturado e sebo a 1% como transportador.

[0129] 3Contém ureia, sal, calcário, pré-mistura de minerais vestigiais/vitaminas, KCl para proporcionar (com base na DM de dieta total) 0,15 mg/kg de cobalto, 10 mg/kg de cobre, 0,50 mg/kg de iodo, 20 mg/kg de manganês, 0,10 mg/kg de selênio, 30 mg/kg de zinco, 2205 IU/kg de vitamina A, 22 IU/kg de vitamina E e 36,4 mg/kg de monensina (Rumensin, Elanco Animal Health).

[0130] 4Composição de nutrientes analisada de ingredientes na dieta total (SDK Labs).

[0131] 5CP, proteína em bruto

[0132] 6ADF, fibra em detergente ácido

[0133] 7EE, extrato de éter

Coleta

[0134] No d 136, todos os animais foram pesados em uma balança imediatamente antes do transporte para abate. O BW final foi calculado por multiplicação da BW média para cada compartimento por 0,96 para contabilizar encolhimento de 4% durante a viagem. As novilhas foram carregadas em caminhões e transportadas aproximadamente 440 km até um matadouro comercial em Lexington, NE. Os registros coletados no dia do abate por pessoal treinado da Kansas State University foram: identificação do animal dentro da ordem de morte, peso da carcaça quente (HCW) e prevalência e gravidade de abscessos hepáticos usando o sistema de pontuação da Elanco (Liver Abscess Technical Information AI 6288; Elanco Animal Health). A pontuação hepática dá graus de: 0 (sem abscesso) ou A-, A ou A+ para abscessos hepáticos ligeiros, moderados e graves, respectivamente. Após um período de resfriamento ao longo de 24 h, dados de área LM, gordura subcutânea da 12a costela, pontuação de marmoreio, Grau de Rendimento USDA e Grau de Qualidade USDA foram coletados. A percentagem de curativo foi determinada pelo cálculo da média de HCW dentro de compartimento de engorda e divisão desse valor pelo BW final encolhido.

Características dos Grãos

[0135] Observações diárias sobre DM, disponibilidade de amido e tamanho de partículas foram medidas para ambos os tipos de grãos. A DM dos grãos foi determinada por secagem em forno de ar forçado ajustado até 105 °C durante 24 h. Se ocorressem mudanças na DM ajustaríamos a quantidade de umidade aplicada pelo sistema SarTec conformemente para se alcançar um conteúdo de umidade equivalente entre tipos de milho. A disponibilidade de amido foi determinada pela infusão de 25 g de flocos de milho em 100 mL de solução de amiloglucosidase a 2,5% aquecida até 55 °C durante 15 min (Sindt et al., 2006. J. Anim. Sci. 84: 424). A fração líquida é depois filtrada, e a percentagem de açúcares solúveis é visualizada em um refratômetro manual. A percentagem de solúveis e DM é depois colocada em equações de regressão determinando a disponibilidade de amido. O tamanho de partículas foi determinado por pesagem de aproximadamente 200 g de milho floculado espalhado em um conjunto de peneiras, com tamanhos de peneira decrescentes na ordem: 4750, 3350, 2360, 1700, 1180, 850, 600 μm e uma panela sólida. A pilha é colocada em um agitador orbital Ro-Tap, com um ciclo de rosqueamento rotativo durante 5 min. Cada peneira individual é limpa, e as partículas pesadas. O tamanho geométrico de partículas é calculado em uma planilha (Scott e Herrman, 2002. Evaluating Particle Size. Kansas State University Department of Grain Science and Industry. MF-2051, 1-6) usando equações descritas por Pfost e Headley (Methods of determining and expressing particle size. Em: H. Pfost (ed), Feed Manufacturing Technology II - Apêndice C. Am. Feed Manufacturers Assoc. 1976: 512-520).

Análises Estatísticas

[0136] As análises de BW, DMI, ganho diário médio (ADG) e eficiência de ração usaram o procedimento MIXED do Statistical Analysis System (SAS versão 9.4; SAS Inst. Inc., Cary, NC), com compartimento como unidade experimental, tratamento como efeito fixo e bloqueio como um efeito aleatório. As características categóricas da carcaça (Grau de Qualidade USDA, Grau de Rendimento USDA e prevalência e gravidade de abscessos hepáticos) foram analisadas com o procedimento GLIMMIX de SAS, com os mesmos parâmetros como acima.

Resultados -

[0137] Quatro animais foram removidos do grupo com CON por razões não relacionadas com o tratamento; 3 devido a parto e 1 foi encontrado falecido devido a doença respiratória. Quatro animais foram também removidos do grupo com EFC por razões diferente do tratamento; 1 devido a uma infecção bacteriana, 1 devido a doença respiratória, 1 devido a um abomaso deslocado e 1 devido a uma lesão no quadril, todos os quais causaram grave perda de peso.

Características dos Grãos

[0138] As análises laboratoriais (SDK labs) da composição de nutrientes entre CON e EFC são mostradas na Tabela 2. O Milho para Ração Enogen teve maior componentes de ADF (P < 0,01) e potássio (P = 0,03). O Milho para Ração Enogen teve também uma tendência (P = 0,06) para conteúdo de gordura maior (extrato de éter [EE] como indicador). Não foram evidentes diferenças entre grãos entre grãos floculados para proteína, cálcio ou fósforo.Tabela 2. Análises de nutrientes de Milho moído e para Ração Enogen

[0139] As características de grãos são apresentadas na Tabela 3. Por desenho, o conteúdo de umidade de ambos os tipos de milho não teve diferença após floculação a vapor (P = 0,55), e a disponibilidade de amido foi similar, embora tivesse existindo uma tendência (P = 0,08) para EFC originar um maior valor de disponibilidade de amido. Embora EFC tenha floculado até uma maior densidade aparente (390 vs. 360 g/L) resultou ainda em um tamanho médio de partículas mais pequeno (P < 0,01).Tabela 3. Características de grãos floculados

Desempenho de Parques de Engorda

[0140] Os efeitos de EFC no ganho e eficiência de novilhas em parques de engorda são encontrados na Tabela 4. Não existiu diferença no BW no início do ensaio (P = 0,52), mas o gado alimentado com EFC era mais pesado no dia final (P < 0,01). Assim, ao longo do período de 136 d, o gado com Enogen teve ADG melhorado (P < 0,01). Não existiu diferença na DMI entre tratamentos (P = 0,78), o que resulta em eficiência de ração 5% maior (Ganho:Ração, G:F) para gado alimentado com EFC (P < 0,01).Tabela 4. Desempenho de parques de engorda de novilhas acabadas usando milho moído ou EFC

Características das Carcaças

[0141] Os efeitos de EFC no mérito das carcaças são exibidos na Tabela 5. Ganho diário melhorado no parque de engorda para gado alimentado com EFC se transferiu para o peso das carcaças, pois as novilhas produziram carcaças aproximadamente 6 kg mais pesadas (P < 0,01). Não ocorreram diferenças na área do músculo longuíssimo (LM) ou gordura da 12a costela. A dieta com CON originou carcaças com uma pontuação de marmoreio numérica mais elevada (P = 0,04), no entanto, isto não resultou em um impacto nos Graus de Qualidade USDA (P > 0,33). Existiu também uma tendência (P = 0,09) para novilhas alimentadas com EFC de resultar em mais carcaças com Grau de Rendimento USDA 3. Tabela 5. Características de carcaças de novilhas de corte acabadas usando milho moído ou EFC

[0142] ’500 - 599 = grau de marmoreio pequeno; 600 - 699 = grau de marmoreio modesto.

[0143] A prevalência e gravidade de abscessos hepáticos são mostradas na Tabela 6. Se note que nenhuma tilosina para impedir a formação de abscessos hepáticos foi incluída nas dietas experimentais (Tabela 1). Novilhas de corte acabadas alimentadas com EFC tiveram menos abscessos hepáticos totais no abate do que suas contrapartes com CON (P = 0,03). Esta diferença ocorre devido a menos abscessos hepáticos moderados (P = 0,03) e graves (P = 0,11) no grupo com EFC. Efeitos prejudiciais de abscessos hepáticos no ganho de gado (Potter et al., 1985. J. Anim. Sci. 61: 1058) resultando em carcaças mais leves, de qualidade mais fraca (Brown e Lawrence, 2010. J. Anim. Sci. 88: 4037) foram bem estabelecidos. A relação entre gravidade de abscessos hepáticos e HCW para cada tratamento é mostrada na Figura 1. Existiram efeitos pela dieta (P < 0,01), gravidade de abscessos hepáticos (P < 0,01) e tendência para uma interação tratamento x abscesso hepático (P = 0,09). O grupo com EFC manteve carcaças mais pesadas e não exibiu a mesma diminuição em HCW quando a gravidade de abscessos aumentou que foi observada para gado com CON. Embora o modo de ação para o efeito que EFC floculado a vapor teve na formação de abscessos hepáticos não seja claro em este momento, as implicações poderiam ser substanciais, pois novos métodos para a prevenção de abscessos hepáticos são necessários pois o uso de antibióticos é crescentemente desencorajado.Tabela 6. Prevalência e gravidade de abscessos hepáticos em novilhas alimentadas com milho moído ou EFC

[0144] Mais investigação será necessária com o traço de expressão de amilase de EFC para mais bem entender modos de ação para descrever o desempenho animal intensificado que observamos. Em esta etapa, não é claro se a vantagem digestiva ocorre ruminalmente ou pós-ruminalmente. Acreditamos que a elevada expressão de amilase em EFC é provavelmente a razão por detrás de um processo de floculação mais produtivo, onde o amido gelatiniza mais rapidamente e é capaz de ser floculado com produtividade muito maior e nível de processamento reduzido (maior densidade aparente).

Implicações

[0145] O Milho para Ração Enogen poderia ser usado vantajosamente pelos produtores para reduzir os custos de produção associados à floculação a vapor. Uso de vapor reduzido, processamento de grãos reduzido, produtividade do moinho aumentada (50% em este estudo) e, portanto, custos e mão-de-obra reduzidos são todos benefícios que ocorrem antes de a ração ser administrada às manjedouras. Melhorias na produtividade do moinho, ADG, eficiência de ração, HCW e mitigação de abscessos hepáticos parecem ser benefícios substanciais do uso de EFC floculado a vapor.

Exemplo 2 - Características de digestão de combinações de milho amilase sendo submetidas a tratamentos de umidade e vapor variáveis seguidos por floculação. Tratamento de Grãos

[0146] Misturas de grãos em estudo foram preparadas usando milho inteiro com casca de amilase e uma única fonte de milho inteiro com casca, moído como um controle. O grão de amilase foi combinado com grão moído em proporções de 0:100, 25:75, 50:50, 75:25, e 100:0. Amostras (1,8 kg) foram colocadas em frascos de vidro com tampa de rosca de 3,8 L. Foi adicionada água a 0%, 3% ou 6% (p/p), os frascos foram selados e, subsequentemente, colocados horizontalmente em um dispositivo mecânico de rolos, que rodou lentamente os frascos para dispersar a água durante o período de temperamento. Os frascos cheios de grãos permaneceram no rolo durante 1 hora, assegurando mistura uniforme de grãos e exposição máxima aos tratamentos de umidade. Após 60 minutos, as misturas de grãos foram removidas dos frascos e colocadas em cestos perfurados de aço inoxidável, que depois foram colocados em uma mesa de vapor equipada com 12 câmaras individuais. As amostras foram condicionadas com vapor durante 15, 30 ou 45 minutos, completando assim um arranjo de tratamento fatorial de 5 x 3 x 3 (5 misturas de grãos, 3 níveis de umidade e 3 tempos de condicionamento). Cada um dos 45 tratamentos foi preparado em duplicado, perfazendo 90 amostras totais. Imediatamente após condicionamento a vapor, as amostras foram floculadas usando um moinho de rolos de acionamento duplo (R&R Machine), tendo os rolos ajustados para uma densidade alvo de 360 g/L (28 lb/bu). As amostras foram colocadas no floculador através de um sistema de transporte acima dos rolos, coletando o produto floculado por debaixo dos rolos imediatamente a seguir. A densidade aparente foi determinada imediatamente usando um copo Winchester, e a amostra foi depois congelada para análise futura do tamanho de partículas. A disponibilidade de amido foi determinada usando um ensaio enzimático imediatamente a seguir. Outra porção do grão foi colocada em um forno de ar forçado a 105 °C durante 24 horas para determinação do conteúdo de umidade. A amostra restante (aproximadamente 700 g) foi congelada e retida para futuras análises in vitro e in situ.

Análise do Tamanho de Partículas

[0147] Aproximadamente 200 g de cada grão foram usados para caracterização da distribuição dos tamanhos de partículas usando um dispositivo RoTap equipado com um conjunto de oito peneiras e uma panela de fundo. As peneiras foram empilhadas, de cima para baixo, com tamanhos de peneira progressivamente mais pequenas de 9,50, 6,70, 4,75, 3,35, 2,36, 1,70 e 1,18 mm e colocadas sobre uma panela para coleta de partículas finas. Uma amostra de milho floculado foi adicionada à peneira de topo, e a pilha foi depois colocada no leito de um agitador orbital Ro-Tap durante 5 minutos. Após agitação, o conteúdo de cada peneira foi removido e pesado, e o diâmetro geométrico médio (Dgw) e desvio padrão (Sgw) foram calculados para cada grão como descrito por Scott e Herrman. (Scott, B., T. Herrman. 2002. Evaluating Particle Size. Kansas State University Department of Grain Science and Industry. MF-2051, 1-6.).

Disponibilidade de Amido

[0148] Um procedimento enzimático por Sindt (Sindt, J.J. 2004. Factors influencing utilization of steam-flaked corn. Dissertação de Doutoramento, Kansas State University, Manhattan) foi usado para determinação da disponibilidade de amido para cada amostra. Amiloglucosidase (Sigma Chemical Company, St. Louis Mo) em tampão de acetato foi pré-aquecida em um banho de água até 55°C. Amostras de grão floculado (25 g) foram combinadas com 100 mL de tampão pré- aquecido e incubadas em um banho de água durante 15 min a 55°C. Após incubação, os conteúdos foram esticados através de papel de filtro, e várias gotas do filtrado isento de partículas foram colocadas no prisma de um refratômetro manual. O índice refratário proporciona uma medida de componentes solúveis em água e, assim, é um indicador útil da extensão da hidrólise enzimática. O valor resultante (percentagem de solúveis) é expresso em uma base de matéria seca para originar estimativas da disponibilidade de amido.

Desaparecimento de Matéria Seca In situ

[0149] Aproximadamente 2 g (base de matéria seca) de cada amostra floculada foram pesados e selados em sacos Dacron, preparados em triplicado. As medições foram realizadas ao longo de 3 dias na mesma semana. As amostras foram atribuídas a 6 novilhos de Jersey canulados em blocos, contabilizando assim os efeitos dos animais nos valores de desaparecimento resultantes. Os sacos foram suspensos dentro dos rúmens de novilhos fistulados durante 14 horas, após o que foram removidos, extensivamente enxaguados e secos a 105 °C em um forno de ar forçado durante 24 horas. Os sacos foram depois pesados, o peso do saco foi subtraído, e o resíduo seco foi expresso como uma percentagem do peso seco pré-incubação. A percentagem do desaparecimento de matéria seca in situ (ISDMD) foi calculada como:peso de amostra secs peso de reslduo seco 1 θθ peso de amostra seca

Produção de Gás e Perfis de VFA In vitro

[0150] Um procedimento in vitro com fluido ruminal como inóculo foi usado para avaliar a suscetibilidade dos grãos à digestão, com cada amostra preparada em duplicado (total de 180 observações). Duas garrafas sem substrato (brancos) foram usadas em cada operação para contabilizar as contribuições do fluido ruminal para o conteúdo de ácidos graxos voláteis (VFA) das culturas. O sistema de monitorização da Produção de Gás RF a Ankom (Ankom Technologies, Macedon, NY) foi usado para monitorizar os perfis de fermentação. Três gramas de grãos processados foram colocados em um frasco com tampa de rosca de 250 mL, 10 mL de fluido ruminal esticado e 140 mL de tampão de McDougall foram adicionados, as garrafas foram equipadas com um módulo sensor de pressão por radiofrequência da Ankom, as culturas foram colocadas em uma incubadora de agitação a 39°C durante 24 horas, e a pressão de gás dentro das garrafas foi registrada em intervalos de 15 minutos ao longo da incubação. Após 24 horas, o pH das culturas foi determinado, e 4 mL de sobrenadante foram combinados com 1 mL de solução de ácido metafosfórico a 25% em frascos de cintilação, que foram subsequentemente congelados para uso futuro. As amostras foram posteriormente descongeladas, homogeneizadas com um misturador de vórtice, o sobrenadante foi transferido para tubos de microcentrífuga, os conteúdos foram centrifugados a 15.000 x g durante 15 minutos, e o sobrenadante isento de particulados foi transferido para frascos de cromatografia para medição de VFA por cromatografia gasosa. Os ácidos graxos voláteis foram medidos usando um cromatógrafo gasoso 7890 da Aglient (Aglient Technologies, Santa Clara, CA) equipado com uma coluna capilar Nukol (15 m x 0,35 mm, df 0,50 μm), originando concentrações de acetato, propionato, isobutirato, butirato, isovalerato, valerato, isocaproato, caproato e heptanoato.

Análise Estatística

[0151] O procedimento dos modelos MIXED do Statistical Analysis System (SAS versão 9.4) foi usado para analisar os dados. Os efeitos fixos incluíram percentagem de amilase de milho, percentagem de umidade adicionada, tempo de condicionamento a vapor e todas as interações de 2 e 3 vias. O bloqueio foi usado como o efeito aleatório. Contrastes ortogonais adicionais permitiram o exame de efeitos lineares e quadráticos entre tratamentos. Os efeitos de tratamento foram considerados significativos com um valor P menor do que 0,05.

[0152] Não existiram efeitos de duas ou três vias significativos entre tratamentos para qualquer análise

Análise do Tamanho de Partículas

[0153] O tamanho de partículas desempenha um papel importante na digestibilidade e propriedades fermentativas dos grãos quando alimentados a ruminantes. Existiu uma resposta linear (P < 0,01) à percentagem de inclusão de milho amilase nas misturas de grãos. Quanto mais elevada a percentagem de milho amilase, mais pequeno o tamanho médio de partículas. Os tratamentos de umidade não tiveram efeitos no tamanho de partículas (P > 0,10). O tempo de condicionamento a vapor dos grãos induziu um efeito quadrático (P < 0,01), por meio do que 30 min de exposição a vapor resultaram no tamanho médio de partículas menor. Este efeito quadrático de vapor reflete aquilo que é visto em ensaios subsequentes.

Disponibilidade de Amido

[0154] O ensaio de disponibilidade de amido é comumente usado para caracterizar a suscetibilidade de grãos floculados à digestão. O grão de amilase puro resultou na maior disponibilidade de amido (52,7%), e a disponibilidade de amido diminuiu linearmente (P < 0,01) em resposta à diluição de milho amilase com milho moído, sugerindo que a amilase dentro da fração de milho amilase de misturas teve impacto relativamente pequeno no milho diferente de amilase, componente de grão moído de misturas.

[0155] A disponibilidade de amido aumentou linearmente em resposta a quantidades crescentes de umidade (P < 0,01). O tempo de condicionamento a vapor, por outro lado, resultou em um efeito quadrático (P < 0,01), com o tratamento de condicionamento de 30 minutos originando a maior disponibilidade de amido.

Desaparecimento de Matéria Seca In situ

[0156] O conteúdo de milho amilase de misturas de grãos teve um impacto notável (efeito linear do conteúdo de milho amilase; P < 0,01) na digestibilidade in situ das misturas de grãos floculados. A ausência de efeitos não lineares sugere que os efeitos da amilase derivada de milho amilase estão essencialmente confinados ao próprio grão e que não existe migração apreciável para grãos de milho diferentes amilase dentro da mistura.

[0157] Em comparação com efeitos do conteúdo de milho da amilase, a adição de umidade durante a fase de temperamento e tempo de condicionamento a vapor tiveram impacto relativamente pequeno no desaparecimento de grãos de matéria seca in situ. Existiu uma tendência para o tempo de condicionamento impactar o desaparecimento de matéria seca in situ de uma maneira quadrática (P = 0,12); e a relação é notavelmente similar àquela observada para a disponibilidade de amido, com 30 minutos de condicionamento a vapor produzindo o maior grão com o maior desaparecimento in situ.

Produção de Gás e Perfis de VFA In Vitro

[0158] O pH do substrato terminal é um indicador útil da atividade fermentativa global pela cultura in vitro, com medições mais baixas indicando maior produção de ácidos orgânicos e, portanto, digestão microbiana dos grãos aumentada. O pH terminal das culturas diminui em proporção direta à quantidade de grão de milho amilase incorporada nas misturas (efeito linear P < 0,01). Um efeito quadrático significativo (P < 0,01) é observado para o tempo de condicionamento a vapor, com 30 minutos originando o menor pH da cultura. A adição de umidade durante a fase de temperamento teve aparentemente pouco efeito no pH final de culturas in vitro.

[0159] Como esperado, as mudanças na produção de VFA são consistentes com as diferenças no pH terminal das culturas. As amostras foram analisadas quanto a caproato, isocaproato e heptanoato; no entanto, nenhum destes VFAs menores foi detectado. A Tabela 7 resume os perfis de VFA para grãos floculados compreendidos em proporções variáveis de milho amilase e milho moído.Tabela 7. Efeito do conteúdo de milho Amilase na produção de VFA por culturas in vitro de micróbios ruminais mistos alimentados com grãos floculados a vapor misturados como substrato.

[0160] A produção de VFA (acetato, propionato, valerato, isovalerato e VFA total) aumentou linearmente em resposta à proporção crescente de grãos de milho amilase (P < 0,01). Isto indica digestão microbiana mais extensa do grão de milho amilase em comparação com o milho moído. Os VFA contribuem com a vasta maioria da energia para propósitos de manutenção e produtivos em ruminantes, e a digestão microbiana aumentada é geralmente consistente com digestão total de amido no trato aumentada. Os grãos que são mais suscetíveis à digestão por micróbios ruminais são assim mais propensos a maior digestão total no trato e, assim, podem originar melhorias no desempenho ou eficiência. O aumento da proporção de grão de milho amilase diminuiu também a razão acetato:propionato (P < 0,01). Este é um efeito desejável, pois desvios descendentes em acetato:propionato estão frequentemente associados a diminuições na metanogênese, o que é energeticamente mais favorável.

[0161] A produção de gás in vitro é um bom indicador da atividade fermentativa total, com o dióxido de carbono e metano sendo os principais subprodutos gasosos da fermentação ruminal. As diferenças estatísticas entre tratamentos foram analisadas em intervalos de 6 horas. À hora 6, o grão de milho amilase a 0% começou a se separar, sendo significativamente menor do que os tratamentos a 50, 75 e 100%. Às 12 horas, os níveis de milho amilase de 0% e 25% diferiram de todos os outros tratamentos; 50% diferiu de 100%, enquanto a diferença entre 75% e 100% não era significativa. A hora 18 espelhou as diferenças de tratamento exatamente à hora 12. Às 24 horas de fermentação, o tratamento com milho amilase a 50% fechou a lacuna e não pôde mais ser estatisticamente distinguível entre 75% e 100%.

[0162] O grão de milho amilase parece ser muito mais suscetível à digestão em comparação com o milho moído usado como controle, originando melhorias substanciais na disponibilidade de amido, digestão in vitro e in situ e formação de produto final. A resposta ao grão de milho amilase nas misturas foi em proporção direta ao conteúdo de milho amilase, sugerindo que a amilase derivada de milho amilase tem pouco ou nenhum impacto no outro grão dentro de misturas. O milho amilase confere vantagens significativas para processamento de grãos por floculação a vapor.

[0163] O acima mencionado é ilustrativo da presente invenção, e não é para ser interpretado como limitando a mesma. A invenção é definida pelas seguintes reivindicações, com equivalentes das reivindicações a serem incluídos nas mesmas.

[0164] Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências citados aqui são incorporados por referência nas suas totalidades quanto aos ensinamentos relevantes para a frase e/ou parágrafo no qual a referência é apresentada.

Claims (7)

1. Método para produção de uma ração animal, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer grãos de milho transgênicos compreendendo o evento 3272 de milho expressando uma α-amilase termotolerante recombinante, sendo que o evento 3272 de milho está presente na American Type Culture Collection (ATCC) sob o No. de Acesso PTA- 9972; e (b) flocular a vapor os grãos de milho para produzir um produto de milho floculado a vapor, sendo que taxa de produtividade é aumentada em pelo menos 20% em comparação com grãos de milho controle que não compreendem uma α-amilase microbiana termotolerante recombinante.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tempo para flocular a vapor os grãos de milho transgênicos é reduzido em pelo menos 20% em comparação com os grãos de milho controle.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a digestibilidade de amido no produto de milho floculado a vapor é aumentada em comparação com a digestibilidade de amido em um produto de milho floculado a vapor controle produzido a partir dos grãos de milho controle.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o produto de milho floculado a vapor apresenta uma diminuição no tamanho médio geométrico de partículas em comparação com um produto de milho floculado a vapor controle produzido a partir dos grãos de milho controle.

5. Produto de milho floculado a vapor, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

6. Produto de milho floculado a vapor, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que é utilizado mais eficientemente quando alimentado ao gado em comparação com a utilização de um produto de milho floculado a vapor controle.

7. Produto de milho floculado a vapor, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é utilizado mais eficientemente quando alimentado ao gado em comparação com a utilização de um produto de milho floculado a vapor controle que apresenta uma disponibilidade de amido substancialmente similar.