BR112019014335A2

BR112019014335A2 - Sinérgicos para pesticidas melhorados

Info

Publication number: BR112019014335A2
Application number: BR112019014335-1A
Authority: BR
Inventors: Jackson Colin; London Nir; Correy Galen; San Juan Janelle
Original assignee: The Australian National University; Yeda Research And Development Co. Ltd.; The Regents Of The University Of California, Us
Priority date: 2017-01-09
Filing date: 2018-01-09
Publication date: 2020-02-27
Also published as: WO2018127928A1; US20190327974A1; CN110312424A

Abstract

sinérgicos para pesticidas melhorados esta invenção refere-se a agentes sinérgicos para pesticidas de organofosfato (op), carbamato (cm) e/ou piretroide sintético (sp). esta invenção se refere, adicionalmente, a uma composição que compreende organofosfato, carbamato e/ou piretroide/piretroide sintético, e pelo menos um derivado de ácido borônico. esta invenção fornece, adicionalmente, métodos para eliminar pragas de inseto.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: SINÉRGICOS PARA PESTICIDAS MELHORADOS

CAMPO DA INVENÇÃO [001] Esta invenção refere-se a agentes sinérgicos para pesticidas de organofosfato (OP), carbamato (CM) e/ou piretroide/sintético (SP) . Esta invenção se refere, adicionalmente, a uma composição que compreende organofosfato, carbamato e/ou piretroide/piretroide sintético, e pelo menos um derivado de ácido borônico. Esta invenção fornece, adicionalmente, métodos para eliminar pragas de inseto.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] Conforme a população mundial aumenta, a produtividade agrícola é essencial para manter a segurança alimentar. Inseticidas têm uma importância fundamental na proteção de culturas e rebanho, assim como no controle de doenças carregadas por inseto. Os mesmos permitem o controle de pragas agrícolas e vetores de doença e são vitais para a segurança alimentar e saúde global. Os mesmos são especialmente importantes em países em desenvolvimento, onde vetores de inseto são responsáveis por quase 20% de todas as doenças infecciosas. Líquidos injetados com inseticida e pulverização residual de habitações estão entre os meios mais eficazes para controlar a disseminação dessas doenças. No entanto, o uso amplamente difundido de inseticidas impôs

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2/136 uma pressão de seleção evolucionária sobre populações de inseto e foi selecionado de maneira eficaz para indivíduos que são resistentes aos efeitos tóxicos de inseticidas. A resistência a inseticida é difundida e é um problema global urgente. Desde os anos 40 o número de espécies de inseto com resistência a inseticida relatada tem aumentado rapidamente, e passou, recentemente, de 580 espécies. Tal resistência gera inseticidas ineficazes, e resulta em consumo aumentado com consequências significativas às espécies não alvo e prejuízo aos trabalhadores agrícolas.

[003] Organofosfatos (OPs), carbamatos (CMs) e piretroides sintéticos (SPs) são algumas das classes amplamente usadas de pesticidas, porém, sua eficácia caiu devido à evolução de resistência a inseticida. A resistência é frequentemente mediada por enzimas carboxilesterase (CBEs) que sequestram ou hidrolisam os pesticidas antes que os mesmos possam inibir seu alvo. OPs e CMs inibem a enzima acetilcolinasterase (AChE) em junções neuromusculares colinérgicas, fosforilando/carbamilando-se o nucleófilo de serina de sítio ativo. Isso resulta em transdução de sinal nervoso interminável e morte. SPs rompem a função nervosa evitando-se o fechamento de canais de sódio sensíveis a tensão, o que resulta em paralisia do organismo. Resistência mediada por CBE aos OPs, CMs e SPs foi documentada em diversas espécies de inseto, com o mecanismo mais comum de

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3/136 resistência envolvendo carboxilesterases (CBEs). CBEs podem ser superexpressas em pesticidas de sequestro, ou mutadas para ganhar uma nova função de hidrolase de pesticida; ambos os mecanismos permitem que CBEs intercepte pesticidas antes que cheguem em seu alvo, AChE. Inibição de CBEs podería, portanto, restaurar a eficácia de OPs para os quais a resistência evoluiu, e inibidores de CBEs de inseto podem ser usados como agentes sinérgicos para pesticidas de OP/CM ou SP. Agentes sinérgicos superariam o mecanismo de resistência, desse modo, se recupera os efeitos tóxicos desses pesticidas.

[004] Carboxilesterases de inseto a partir do conjunto de gene aEsterase, tal como aE7 (também conhecido como E3) da mosca-varejeira de ovelha australiana Lucilia cuprina (LcaEl), têm um papel fisiológico importante em metabolismo de lipídio e são implicados na desintoxicação de inseticidas de organofosfato (OP) . A mosca-varejeira de ovelha Lucilia cuprina é um ectoparasite que custa mais de $280 milhões à indústria australiana ao ano. A mesma se tornou um sistema modelo para o estudo de resistência a inseticida: resistência foi primeiro documentada em 1966, que resultou predominantemente de uma mutação Glyl37Asp no gene que codifica a carboxilesterase de aE7. Esse alelo de resistência domina agora as populações de moscas-varejeiras contemporâneas, e a mutação equivalente foi observada em uma

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4/136 gama de outras espécies de mosca resistente a OP. 0 surgimento de resistência a inseticidas de OP mediada por CBE reduziu muito a eficácia de controle químico. Trabalho recente mostrou que a proteína aE7 de tipo selvagem (WT) também tem algum efeito protetor contra OPs através de sua capacidade em sequestrar os pesticidas. A estrutura cristalina de raio x da CBE responsável por resistência a OP, aE7, colocou uma luz sobre o mecanismo molecular de resistência. A homologia estrutural com AChE fundamenta o OP de alta afinidade que se liga por aE7 (Ca desvio de raiz quadrada média de 1,2 Â). Ambas as enzimas adotam a dobra de a/β-hidrolase e compartilham a tríade catalítica de Ser-HisGlu típica e o buraco de oxiânion no sítio ativo. De maneira interessante, embora aE7 de tipo selvagem tenha algum efeito protetor sobre moscas expostas a OPs por sequestro, uma mutação (Glyl37Asp) foi identificada conferindo desintoxicação de OP catalítica. Essa mutação introduz uma nova base geral no sítio ativo da enzima, o que permite que a mesma ative uma molécula de água para desfosforilação da serina catalítica. 0 sucesso da mutação Glyl37Asp significa que a mesma domina agora as populações de mosca-varejeira contemporâneas.

[005] Tentativas recentes em superar resistência a inseticida focaram no desenvolvimento de novos inseticidas com modos de ação inovadores. Embora muitos desses novos

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5/136 alvos se mostrem promissores, há um número finito de alvos bioquímicos e novos alvos não estão imunes dos problemas de falta de sensibilidade de sítio alvo e resistência metabólica. Agentes sinérgicos foram usados no passado, para intensificar a eficácia de inseticidas por inibição de enzimas envolvidas em desintoxicação de inseticida; um exemplo proeminente de um dos poucos agentes sinérgicos de inseticida estabelecidos é butóxido de piperonila, um inibidor não específico de citocromo P450s, que é usado para intensificar a atividade de carbamatos e piretroides. A ideia de agentes sinérgicos pode ser levada adiante, para especificamente enzimas alvo que evoluíram para conferir resistência metabólica, desse modo, se recupera a eficácia do inseticida para níveis pré-resistência. Assim, CBEs, tal como aE7, que são um sistema de desintoxicação relativamente bem entendidos, são alvos ideais para o projeto de inibidores abolir resistência a inseticida (Figuras IA a 1C). CBEs de inseto, tal como aE7, são, portanto, potenciais alvos para o projeto de inibidores que trabalharão sinergicamente com inseticidas para abolir resistência e aumentar potência, desse modo, se reduz a quantidade de pesticidas tóxicos necessários para controle de praga de inseto eficaz (Figuras IA a 1C) . Embora abordagens tradicionais combatam resistência por meio de desenvolvimento de novos inseticidas, que alvejam, frequentemente, novas proteínas,

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CBEs de alvejamento permitirão o uso contínuo (e reduzido) de inseticidas econômicos e já aprovados. Inibidores covalentes específicos e potentes de aE7 podem atuar como agentes sinérgicos para inseticidas de OP, auxiliando os esforços para controlar essa importante praga agrícola.

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SUMÁRIO DA INVENÇÃO [006] Em várias modalidades, esta invenção fornece uma composição pesticida para eliminar pragas de inseto que compreende uma combinação sinergicamente eficaz de pelo menos um dentre: organofosfato (OP), carbamato (CM) e piretroide sintético (SP); e pelo menos um derivado de ácido borônico ou sal do mesmo.

[007] Em outras modalidades, o derivado de ácido borônico é representado pela estrutura de Fórmula I:

I em que

Ri, R2, R3, R4 e Rs são, cada um, independentemente, H,

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F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada (por exemplo, metila), C1-C5 haloalquila linear ou ramificada, C1-C5 alcoxi linear ou ramificado (por exemplo, -OiPr, -OtBu, -OCHg-Ph), ariloxi (por exemplo, OPh) , RgR?, -C(O)NHg, -C(O)N(R)g, C1-C5 tioalcoxi linear ou ramificado, C1-C5 haloalcoxi linear ou ramificado (por exemplo, OCF3) , arila, C3-C8 cicloalquila, C3-C8 anel heterociclico (por exemplo, pirrolidina, morfolina, piperidina, piperazina, 4-Me-piperazina); em que cada um pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcoxi, N(R)₂, CF3, CN ou NO2; CF3, CN, NO2, -CH2CN, NH₂, N(R)₂, alquilN(R)₂, hidroxila, -OC(O)CF₃, -NHCO-alquila, COCH, C(0)0alquila, C(0)H;

ou dois substituintes adjacentes (isto é, R2 e Ri, ou R3 e Ri, ou R4 e R3, ou R5 e R4) se juntam para formar um anel carbocíclico (por exemplo, benzeno, furano) ou heterociclico com 5 ou 6 membros, que pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcoxi, N(R)₂, CF3, CN ou NO2;

R₆ é 0, (CH₂)n, C(0), C(0)0, 0C(0), C(O)NH, C(O)N(R),

NHC(O), N(R)CO, NHSO2, N(R)SO₂, SO2NH, SO₂N(R), S, SO, S0₂, NH, N(R), OCH₂ ou CH₂O;

R e R7 são, cada um, independentemente, C1-C5 alquila linear ou ramificada (por exemplo, t-Bu, i-Pr), C1-C5 haloalquila linear ou ramificada (por exemplo, CF3),Ci-Cs

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12/136 alcóxi linear ou ramificado, Cs-Cs cicloalquila, Cs-Cs anel heterociclico (por exemplo, morfolina), fenila, arila (por exemplo, 2-clorofenila, 2-fluorofenila), naftila, benzila ou heteroarila, em que cada um pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcóxi, N(R)2, CF3, CN ou NO2; ou dois subst ituintes de gem R se juntam para formar um anel heterociclico com 5 ou 6 membros; e n é um número inteiro entre 1 e 6.

[008] Em várias modalidades, esta invenção se refere a um método para eliminar pragas de inseto, sendo que o método compreende colocar uma população de pragas de inseto em contato com uma quantidade eficaz da composição desta invenção.

[009] Em várias modalidades, esta invenção fornece um método para eliminar pragas de inseto em uma planta ou animal, sendo que o método compreende colocar a planta ou animal em contato com a composição desta invenção, em que a composição tem um efeito sinérgico sobre atividade inseticida.

[010] Em várias modalidades, esta invenção fornece um método para eliminar pragas que compreende inibir resistência ao organofosfato (OP), carbamato (CM) e/ou piretroide/piretroide sintético (SP) mediado pela carboxilesterase (CBE) em uma praga, sendo que o dito método

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13/136 compreende colocar um derivado de ácido borônico ou sal do mesmo em contato com a dita praga em combinação com pesticida de OP, CM e/ou SP. Em outras modalidades a CBE é uma CBE de tipo selvagem, um homólogo de CBE ou CBE mutante. Em outras modalidades, a CBE é de tipo selvagem ou versões mutantes de CBE de aE7 ou homólogo da mesma. Em outras modalidades, a CBE é .LcaEV, .LcaEV de tipo selvagem, JLcaE7 mutante, um homólogo da mesma, ou qualquer combinação dos mesmos.

[011] Em várias modalidades, esta invenção fornece um método para potencialização de um pesticida de um OP, um CM e/ou um SP que compreende colocar um derivado de ácido borônico ou um sal do mesmo, em contato com uma praga, antes, após ou simultaneamente ao contato do dito pesticida de OP, CM e/ou SP com a dita praga.

[012] Em outras modalidades, a praga é moscavarejeira (por exemplo, Calliphora stygia, Lucilia cuprina), mosca-da-bicheira (por exemplo, Cochliomyia hominivorax), baratas, carrapatos, mosquitos (por exemplo, Aedes aegypti, Anopheles gambiae, Culex guinguefasciatus), grilos, moscas domésticas (por exemplo, Musca domestica), moscas de areia, moscas-dos-estábulos (por exemplo, Stomoxys calcitrans), formigas, cupins, pulgas, pulgões (por exemplo, pulgão verde do pêssego), brocas (por exemplo, Ostrinia nubilalis (broca europeia do milho)), besouros (por exemplo, Leptinotarsa decemlineata (besouro do Colorado)), mariposas ou qualquer

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14/136 combinação dos mesmos.

[013] Em outras modalidades, o derivado de ácido borônico é ácido aril-borônico ou sal do mesmo, em que a dita arila é opcionalmente substituída por entre 1 e 5 substituintes, em que cada substituinte é independentemente: H, F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada (por exemplo, metila), C1-C5 haloalquila linear ou ramificada, CiC5 alcóxi linear ou ramificado (por exemplo, -OiPr, -OtBu, OCH2-Ph), ariloxi (por exemplo, OPh), O-CfpPh, -C(O)NH2, C(O)N(R)2, -C(O)NHR, -NHC(O)R, C1-C5 tioalcoxi linear ou ramificado, C1-C5 haloalcoxi linear ou ramificado (por exemplo, OCF3) , C1-C5 alcoxialquila linear ou ramificada, arila, C3-C8 cicloalquila, C3-C8 anel heterocíclico (por exemplo, pirrolidina, morfolina, piperidina, piperazina, 4Me-piperazina) ; em que cada um pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcóxi, N(R)2, CF3, CN ou NO2; CF3, CN, NO₂, -CH2CN, NH₂, NHR, N(R)₂, alquil-N (R) 2, hidroxila, OC(O)CF₃, -O-CH₂-arila (por exemplo, -OCH₂Ph, OCH₂-2fluorofenila), -NHCO-alquila, COCH, -C(O)Ph, C(O)O-alquila, C(O)H, ou -C(O)NH2, -C(O)N(R)2, -C (O)-morfolina, ou dois substituintes adjacentes (isto é, R2 e Ri, ou R3 e Ri, ou R4 e R3, ou R5 e R4) se juntam para formar um anel carbocíclico (por exemplo, benzeno, furano) ou heterocíclico com 5 ou 6 membros, que pode ser adicionalmente substituído por F, Cl,

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Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcóxi, N(R)₂, CF3, CN ou NO2; e em que

R é C1-C5 alquila linear ou ramificada, C1-C5 alcóxi linear ou ramificado, fenila, arila ou heteroarila, que pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcóxi, N(R)₂, CF3, CN ou N0₂, ou dois substituintes de gem R se juntam para formar um anel heterocíclico com 5 ou 6 membros (por exemplo, morfolina).

[014] Em outras modalidades, o derivado de ácido borônico é representado pela estrutura de Fórmula I:

I em que

Ri, R2, R3, R4 e Rs são, cada um, independentemente, H, F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada (por exemplo, metila), C1-C5 haloalquila linear ou ramificada, C1-C5 alcóxi linear ou ramificado (por exemplo, -OiPr, -OtBu, -OCH₂-Ph), ariloxi (por exemplo, OPh) , RgR?, -C(O)NH₂, -C(O)N(R)₂, C1-C5 tioalcoxi linear ou ramificado, C1-C5 haloalcoxi linear ou

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16/136 ramificado (por exemplo, OCF3) , arila, C3-C8 cicloalquila, C3-C8 anel heterociclico (por exemplo, pirrolidina, morfolina, piperidina, piperazina, 4-Me-piperazina); em que cada um pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcóxi, N(R)₂, CF3, CN ou NO2; CF3, CN, NO2, -CH2CN, NH₂, N(R)₂, alquilN(R)₂, hidroxila, -OC(O)CF₃, -NHCO-alquila, COOH, C(0)0alquila, C(0)H;

ou dois substituintes adjacentes (isto é, R2 e Ri, ou R3 e Ri, ou R4 e R3, ou R5 e R4) se juntam para formar um anel carbocíclico (por exemplo, benzeno, furano) ou heterociclico com 5 ou 6 membros, que pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcóxi, N(R)₂, CF3, CN ou NO2;

R₆ é 0, (CH₂)n, C(0), C(0)0, 0C(0), C(O)NH, C(0)N(R), NHC(O), N(R)C0, NHSO2, N(R)SO₂, SO2NH, SO₂N(R), S, SO, S0₂, NH, N(R), OCH₂ ou CH₂O;

R e R7 são, cada um, independentemente, C1-C5 alquila linear ou ramificada (por exemplo, t-Bu, i-Pr), C1-C5 haloalquila linear ou ramificada (por exemplo, CF3),Ci-Cs alcóxi linear ou ramificado, Cs-Cs cicloalquila, Cs-Cs anel heterociclico (por exemplo, morfolina), fenila, arila (por exemplo, 2-clorofenila, 2-fluorofenila), naftila, benzila ou heteroarila, em que cada um pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou

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17/136 ramificada, hidroxila, alcoxi, N(R)2, CF3, CN ou NO2; ou dois subst ituintes de gem R se juntam para formar um anel heterociclico com 5 ou 6 membros; e n é um número inteiro entre 1 e 6.

[015] Em outras modalidades, o derivado de ácido borônico é selecionado a partir de:

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OH

[016] Em outras modalidades, o método não é tóxico aos animais e/ou seres humanos. Em outras modalidades, a praga é resistente a pesticida de OP, CM e/ou SP. Em outras modalidades, o OP é acetato, aspon, azinfos-metila, azametifos, carbofurano carbofenotion, clorfenvinfos, clorpirifos, Clorpirifos-etila (CPE), coumafos crotoxifos, crufomato, demeton, diazinon, diclorvos, dicrotofos, dimetoato, dioxation, disulfoton, fosfato de dietil-4metilumbeliferila, fenilfosfonotioato de etil-4nitrofenila, etio, etoprop, fanfur, fenamifos, fenitrotion, fensulfotion, fention, fonofos, isofenfos, malation, metamidofos, metidation, paration de metila, mevinfos, monocrotofos, naled, oxidometon-metila, paration, forato, fosalona, fosmet, fosfamidon, temefos, pirofosfato de tetraetila, terbufos, tetraclorvinfos, triclorfon ou qualquer combinação dos mesmos. Em outras modalidades, o OP é diazinon, malation ou Clorpirifos-etila (CPE).

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [017] A matéria, considerada como a invenção, é particularmente apontada e reivindicada de modo distinto na

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21/136 parte de conclusão do relatório descritivo. A invenção, no entanto, tanto como para organização quanto para método de operação, juntamente com objetos, recursos e vantagens da mesma, pode ser entendida melhor em referência à seguinte descrição detalhada quando lida com os desenhos anexos nos quais:

[018] As Figuras IA a 1C apresentam uma visão geral de agentes sinérgicos para inseticidas de organofosfato. (Figura IA) Inseticidas de organofosfato inibem acetilcolinasterase e evitam a hidrólise de acetilcolina. (Figura 1B) CBEs como aE7 recuperam atividade de acetilcolinasterase ligando e hidrolisando-se inseticidas de organofosfato. (Figura 1C) Um inibidor que compete com organofosfatos para ligação à CBE podería atuar como um agente sinérgico para recuperar atividade inseticida.

[019] As Figuras 2A a 2J apresentam as previsões de acoplagem covalente de inibidores de ácido borônico 1 a 5 ligados a LcaEl de tipo selvagem contra sua estrutura cristalina. As Figuras 2A, 2B, 2C, 2D, 2E se referem aos compostos 1 a 5, respectivamente, (barras escuras) que formam adutos covalentes com a serina catalítica de LcaEl (Ser218). A densidade de elétron de diferença de mFo-DFc omitida é mostrada (malha contornada em 3o) . As previsões de encaixe sobrepostas nas estruturas cocristalinas correspondentes. Resíduos de sítio ativo são mostrados como barras claras. As

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Figuras 2F, 2G, 2H, 21, 2J se referem à representação de superfície do bolso de ligação de LcaEl com compostos 1 a 5, respectivamente, mostrados com uma representação de preenchimento de espaço (esferas brancas).

[020] A Figura 3 representa que inibidores de ácido borônico têm sinergia com os inseticidas de organofosfato diazinon e malation. O tratamento consistiu em diazinon (Dz) ou malation (Mal) apenas, ou Dz/Mal complementado com composto de ácido borônico em uma concentração definida de 1 mg/ml. Dados são apresentados como intervalo de confiança médio de ± 95% para três (Dz) ou dois (Mal) experimentos replicados, em que cada experimento utiliza 50 larvas em cada concentração de Dz/Mal.

[021] A Figura 4 mostra como compostos de ácido borônico podem adotar duas configurações quando coordenados em um nucleófilo de serina. O aduto plano trigonal tem uma única hidroxila coordenada, enquanto a coordenação de uma segunda hidroxila resulta em um aduto tetraédrico negativamente carregado.

[022] A Figura 5 apresenta que compostos de ácido borônico não tiveram efeito sobre pupação de Lucilia cuprina na ausência dos organofosfatos diazinon ou malation. O número de pupas recuperadas na ausência de ácidos borônicos foi comparado com o número recuperado na presença de ácidos borônicos em 1 mg por ensaio para ambas cepas laboratorial

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23/136 e selvagem. Dados são apresentados como erro ± médio para 3 experimentos replicados.

[023] A Figura 6 apresenta o sequenciamento do gene aE7 em isolados suscetíveis (laboratoriais) e resistentes (selvagens). A cepa suscetível carrega apenas o gene aE7 de tipo selvagem, enquanto a cepa resistente carrega um número equivalente de cópias do aE7 de tipo selvagem (Glyl37) e da variante de Glyl37Asp de aE7. Cromatogramas e nucleotídeos correspondentes são mostrados para a região relevante do gene aE7.

[024] A Figura 7 apresenta curvas de resposta à dose para a inibição de aE7 de tipo selvagem. Inibição da hidrólise de 4-nitrofenila foi determinada para ácido fenilborônico (PBA) e compostos 1 a 5 e 3,1 a 3,12. Três medições replicadas (da técnica) de atividade enzimática foram realizadas para cada concentração de ácido borônico. A concentração de ácido borônico necessária para inibir 50% da atividade (IC50) foi determinada encaixando-se uma curva de resposta à dose sigmoidal dupla em plotagens de inibição percentual. A curva foi restrita à inibição de 0 (inferior) e 100% (superior) com uma inclinação de Hill variável. Valores de IC50 são citados com o intervalo de confiança de 95%.

[025] A Figura 8 apresenta curvas de resposta à dose para a inibição de aE7 Glyl37Asp. Inibição da hidrólise de

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4-nitrofenila foi determinada para ácido fenil-borônico (PBA) e compostos 1 a 5 e 3,1 a 3,12 . Três medições replicadas (da técnica) de atividade enzimática foram realizadas para cada concentração de ácido borônico. A concentração de ácido borônico necessária para inibir 50% da atividade (IC50) foi determinada encaixando-se uma curva de resposta à dose sigmoidal em plotagens de inibição percentual. A curva foi restrita à inibição de 0 (inferior) e 100% (superior) com uma inclinação de Hill variável. Valores de IC50 são citados com o intervalo de confiança de 95%.

[026] A Figura 9 apresenta curvas de resposta à dose para a inibição de acetilcolinasterase de Electrophorus electricus. Inibição da hidrólise de acetiltiocolina foi determinada para ácido fenil-borônico (PBA) e compostos 1 a

5. Três medições replicadas (da técnica) de atividade enzimática foram realizadas para cada concentração de ácido borônico. Compostos foram testados para seus limites de solubilidade, apenas 3 mostram > 50% de inibição. O valor de IC50 foi determinado como antes, e é citado com o intervalo de confiança de 95%.

[027] A Figura 10 apresenta parâmetros cinéticos para ensaios de atividade. aE7 de tipo selvagem e Glyl37Asp foram testados com butirato de 4-nitrofenol (4-NPB), e acetilcolinasterase de Electrophorus electricus (Ee AChE) foi testada com acetiltiocolina (ATCh). Parâmetros foram

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25/136 determinados encaixando-se a equação de Michaelis-Menton em plotagens de velocidade enzimática em oito concentrações de substrato com o uso de regressão não linear. Seis medições replicadas (da técnica) de atividade enzimática foram realizadas para cada concentração de substrato. A constante de Michalis (Km) é apresentada como erro ± padrão.

[028] As Figuras 11A a 11D apresentam que os ácidos borônicos de segunda geração são inibidores potentes de LcaEl Glyl37Asp. A Figura 11A: Estruturas químicas de análogos de composto 3. A Figura 11B: Estrutura cocristalina de composto 3,10 (bar ras cinza escuro) com LcaEl Glyl37Asp (código de PDB 5TYM). A densidade de elétron de diferença de mFo-DFc omitida é mostrada (malha contornada em 3 o). Resíduos de sítio ativo são mostrados como barras cinza claro. A Figura 11C: Representação de superfície de bolso de ligação de LcaEl Glyl37Asp com composto 3,10 mostrada com uma representação de preenchimento de espaço (esferas cinza claro). A Figura 11D: Reorganização do sítio ativo após ligação de inibidor com LcaEl Glyl37Asp. Alinhamento da estrutura cocristalina de composto 3,10 (barras cinza escuro/claro) com a estrutura cristalina de LcaEl apo Glyl37Asp (barras cinza claro, código de PDB 5C8V) . Ligações de hidrogênio são mostradas como linhas pretas tracejadas. Todas as ligações de hidrogênio são 2,8 Â, exceto por Glyl36 N com ácido borônico OH que é 3,4 Â. A molécula de água que media uma ligação de hidrogênio

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26/136 entre a cadeia lateral Aspl37 e o ácido borônico é mostrada como uma esfera preta com densidade de elétron 2mFo-DFc (malha contornada em 1 o) .

[029] A Figura 12 apresenta que ácidos borônicos adotam ambas geometrias tetraédrica e plana trigonal quando coordenados na serina catalítica de LcaEl. A geometria foi atribuída com referência aos picos positivos (malha verde) e negativos (malha vermelha) nos mapas de densidade de elétron de diferença mFo-DFc (mostrados contornados em ± 3 o) com as espécies tetraédrica ou plana trigonal modeladas. Os resíduos de sítio ativo selecionado e ligante são mostrados como barras brancas, com densidade de elétron 2mFoDFc (malha azul) contornada em 1 σ ao redor do ligante e Ser218. 3* denota a estrutura de LcaEl que contém as duas mutações de superfície (Asp83Ala, Lys530Glu) necessárias para cristalização.

[030] A Figura 13 representa que ácidos borônicos mostram pouca toxicidade celular. Compostos 1 a 5 assim como 3, 9 e 3,10 f oram incubados por 48 h com duas linhas celulares humanas diferentes HB-2 e MDA-MB-231 em 7 concentrações de até 100 μΜ. A viabilidade celular foi medida após 48 h com o uso do ensaio Cell Titer Glo. Exceto para os compostos 2 e 5 que mostraram baixa toxicidade contra HB-2, nenhum dos compostos eliminou significativamente células mesmo na concentração mais elevada.

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27/136 [031] As Figuras 14A a 14B apresentam a base estrutural para seletividade contra AChE. A Figura 14A. Sobreposição das estruturas de AChE humana (cinza; PDB 4PQE) e AChE de Ee (branco; PDB 1EEA) na estrutura cocristalina de LcoCEl (cinza claro) com o composto 3 (cinza escuro) . Phe288 de AChE colide significativamente com o átomo de bromo de 3. A Figura 14B. Uma representação de superfície de LcaEl (branco) e hAChE (cinza) demonstra a colisão mencionada acima .

[032] A Figura 15 apresenta que mutações de estabilização internas presentes em AcaE7-4a não têm efeito sobre ligação de ácido borônico. AcaE7-4a é uma variante de LcoCEl que contém 8 mutações para aumentar termoestabilidade e permitir cristalização. Para determinar se as mutações internas presentes em AcaE7-4a afetaram a ligação de inibidor, as mutações de superfície de AcaE7-4a foram introduzidas no antecedente de WT e testadas para cristalização. Duas mutações (Lys530Glu e Asp83Ala) foram suficientes para permitir cristalização, provavelmente através da introdução de uma ponte salina intermolecular (Lys530Glu) entre moléculas na estrutura cristalina, e remoção de uma carga em uma interface de embalagem cristalina (Asp83Ala). A comparação entre a estrutura cocristalina de ácido borônico 3 com AcaE7-4a (barras brancas) e LcaEl de Asp83Ala + Lys530Glu (barras cinza escuro) mostra que as

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28/136 mutações Ile419Phe e Ala472Thr tiveram pouco efeito sobre a postura de inibidor ou topologia de bolso de ligação. A Ile419Phe comuta o ângulo diédrico χ2 de Tyr420 adjacente em aproximadamente 30°. Para maior clareza, apenas a estrutura principal de LcaE7-4a é mostrada (desenho branco). Isso confirma que as posturas de ligação capturadas nas estruturas cocristalinas correspondem às posturas de ligação em LcaEl de WT.

[033] Será verificado que para simplicidade e clareza de ilustração, elementos mostrados nas Figuras não foram necessariamente desenhados em escala. Por exemplo, as dimensões de alguns dos elementos podem ser exageradas em relação a outros elementos para fins de maior clareza. Ademais, quando se considera apropriado, numerais de referência podem ser repetidos dentre as Figuras para indicar elementos correspondentes ou análogos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA PRESENTE INVENÇÃO [034] Na seguinte descrição detalhada, diversos detalhes específicos são apresentados de modo a fornecer um entendimento completo da invenção. No entanto, será entendido por aqueles versados na técnica que a presente invenção pode ser praticada sem esses detalhes específicos. Em outros exemplos, métodos, procedimentos e componentes bastante conhecidos não foram descritos em detalhes de modo a não ocultar a presente invenção.

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DEFINIÇÕES :

[035] O termo organofosfatos ou OPs se refere a um grupo de inseticidas ou agentes nervosos que atuam, na enzima acetilcolinasterase. O termo é usado frequentemente para descrever virtualmente qualquer composto que contém fósforo(V) orgânico, especialmente ao lidar com compostos neurotóxicos. Além disso, diversos compostos que são derivados de ácido fosfinico são usados como organofosfatos neurotóxicos. Exemplos de organofosfatos usados como pesticidas incluem acefato, aspon, azinfos-metila, azametifos, carbofurano carbofenotion, clorfenvinfos, clorpirifos, Clorpirifos-etila (CPE), coumafos crotoxifos, crufomato, demeton, diazinon, diclorvos, dicrotofos, dimetoato, dioxation, disulfoton, fosfato de dietil-4metilumbeliferila, fenilfosfonotioato de etil-4nitrofenila, etio, etoprop, fanfur, fenamifos, f enitrot. ion, fensulfotion, fention, fonofos, isofenfos, malation, metamidofos, metidation, paration de metila, mevinfos, monocrotofos, naled, oxidometon-metila, paration, forato, fosalona, fosmet, fosfamidon, temefos, pirofosfato de tetraetila, terbufos, tetraclorvinfos, triclorfon.

[036] O termo carbamatos ou CMs se refere a um grupo de inseticidas que atuam na enzima acetilcolinasterase. O termo é usado frequentemente para descrever virtualmente qualquer composto de carbamato-éster,

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30/136 especialmente ao lidar com compostos neurotóxicos. Exemplos de carbamatos usados como pesticidas incluem Aldicarb, Aminocarb, Bendiocarb, Carbarila, Carbofuran, Carbosulfan, Dimetilan, Etiofencarb, Fenobucarb, Fenoxicarb, Formetanato,

Formparanato, Metiocarb, Metomil, Metolcarb, Oxamil,

Pirimicarb, Propoxur e Tiofanox.

[037] O termo piretroide/piretroide sintético ou

SPs se refere a um grupo de inseticidas que atuam nos canais de sódio mediados por tensão em membranas axonais. O termo é usado frequentemente para descrever virtualmente quaisquer estruturas químicas de composto éster carboxílico que sejam adaptadas das estruturas químicas da piretrinas e atuem de uma maneira similar às piretrinas. Exemplos de SPs usados como pesticidas incluem Aletrina, Bifentrina, Bioaletrina, Ciflutrina, Cipermetrina, Cifenotrina, Cialotrina, Deltametrina, Esfenvalerato, Etofenprox, Fenpropatrina, Fenvalerato, Flucitrinato, Flumetrina, Imiprotrina, lambda-Cialotrina, Metoflutrina, Permetrina, Praletrina, Piretro, Resmetrina, Silafluofeno, Sumitrina, tau-Fluvalinato, Teflutrina, Tetrametrina, Tralometrina e

Transflutrina.

[038] O termo ácido borônico se refere, em várias modalidades, a um composto químico que contém uma porção química de -B(OH)2. Ácidos borônicos atuam como ácidos de Lewis. Seu recurso único é que podem formar complexos

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31/136 covalent.es reversíveis com açúcares, aminoácidos, ácidos hidroxâmicos, etc. A pK_a de um ácido borônico é de ~9, porém, podem formar complexos de boronato tetraédricos com pK_a ~7. Em algumas modalidades, o termo derivado de ácido borônico se refere a um ácido borônico de alquila ou arila substituída que contém, uma ligação carbono-boro. Um recurso proeminente de ácidos borônicos é sua formação reversível de ésteres com dióis em solução aquosa. Portanto, em algumas modalidades, o termo derivado de ácido borônico inclui ésteres de boronato (também denominados ésteres borônicos), que incluem ésteres cíclico, lineares, mono e/ou di-ésteres. Tais ésteres borônicos contêm uma porção química de B(Zi) (Z2), em que pelo menos um dentre Zi ou Z2 é alcoxi, aralcoxi, ou ariloxi; ou Zi e Z2 formam, juntos, um anel. Exemplos de ésteres de boronato incluem, porém, sem limitação a: monoéster cíclico de ácido 2-(hidroximetil)fenilborônico, éster de 1,3-propanodiol de ácido 3-piridinaborônico, éster de 1,3-propanodiol de ácido 5-formil-4-metiltiofeno-2borônico, éster de pinacol de ácido 4-isoxazolborônico, éster de pinacol de ácido lH-pirazol-5-borônico, éster de 1,3-propanodiol de ácido 2-cianofenilborônico, 5-(5,5dimetil-1,3,2-dioxaborinan-2-il)-1-etil-lH-pirazol, éster neopentilglicólico de ácido 4-cianopiridina-3-borônico, éster de pinacol de ácido 5-bromo-2-fluoro-3piridinaborônico, éster de pinacol de ácido 5-cianotiofenoPetição 870190064986, de 10/07/2019, pág. 39/193

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2-borônico, 5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2il)furan-2-carbonitrila, éster de pinacol de ácido [1,2,5]oxadiazol[3,4-b]piridin-6-ilborônico, 2,4-dimetil-5(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)-1,3-tiazol, ácido (3-cianofenil)borônico, éster neopentilglicólico, ácido 2,4-diclorofenilborônico, éster de pinacol, éster de pinacol de ácido benzo[c][1,2,5]tiadiazol-5-ilborônico, 1metil-5-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-1Hpiridin-2-ona e seus semelhantes. Em algumas modalidades, compostos de ácido borônico podem formar anidridos oligoméricos por desidratação da porção química de ácido borônico. Por exemplo, Snyder et al . , J. Am. Chem. Soc. 80:3.611 (1958), relata ácidos arilborônicos oligoméricos. Consequentemente, conforme usado no presente documento, o termo derivado de ácido borônico se refere, em algumas modalidades, a anidrido de ácido borônico, formado pela combinação de duas ou mais moléculas de um composto de ácido borônico, com perda de uma ou mais moléculas de água. Quando misturado com água, o composto de anidrido de ácido borônico é hidratado para liberar o ácido borônico ou derivado de ácido borônico livre. Em várias modalidades, o anidrido de ácido borônico pode compreender duas, três, quatro ou mais unidades de ácido borônico, e pode ter uma configuração cíclica ou linear.

[039] O termo carboxietilesterase (CBE), se

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33/136 refere a carboxilesterases de inseto a partir dos grupos de gene alfa e beta e não microssomal, conforme definido em Oakeshott, Claudianos, Campbell, Newcomb e Russell, Biochemical Genetic and Genomics of Insect Esterases, páginas 309 a 381, capitulo 10, volume 5, 2005, edições publicadas por Gilbert, latrou, Gill - Elsevier que está incorporada no presente documento a titulo de referência. A CBE de DE7 is um exemplo de uma alfa-esterase, e se encontra na mosca-varejeira de ovelha, Lucilia cuprina, sendo que genes homólogos estão presentes em outras pragas de inseto. A sequência de CBE de AcDE7 de tipo selvagem foi depositada no banco de dados de sequência da GenBank com o número de acesso GenBank: AAB67728.1 que é incorporado no presente documento a titulo de referência. A mutação Glyl37Asp em CBE de AcDE7 a partir de Lucilia cuprina demonstrou conferir resistência a inseticidas de OP em: Newcomb, Campbell, Ollis, Cheah, Russell e Oakeshott, A single amino acid substitution converts a carboxylesterase to an organophosphorus hydrolase and confers insecticide resistance on a blowfly páginas 7.464 a 7.468, volume 94, 1997, Proceedings of the National Academy of Sciences, E.U.A., que está incorporado no presente documento a titulo de referência. A mesma mutação na mesma posição em homólogos de CBE de AcDE7 a partir de Lucilia cuprina também resulta em resistência a OP. As CBEs têm um papel fisiológico importante em diversos aspectos do

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34/136 metabolismo de inseto e estão implicadas na desintoxicação de inseticidas de organofosfato (OP), carbamato (CM) e piretroide/piretroide sintético (SP). Em outras modalidades, a CBE desta invenção é um homólogo de CBE ou CBE mutante.

[040] Em várias modalidades, esta invenção fornece um inibidor seletivo de carboxietilesterase (CBE), em que o inibidor compreende um derivado de ácido borônico ou sal do mesmo. Em outras modalidades, a CBE desta invenção é CBE de tipo selvagem, um homólogo de CBE ou CBE mutante. Em outras modalidades, a CBE desta invenção é de tipo selvagem ou versões mutantes de CBE de aE7 ou homólogo da mesma. Em outras modalidades, a CBE desta invenção é lLcaE7, JLcaE7 de tipo selvagem, JLcaE7 mutante, um homólogo da mesma, ou qualquer combinação das mesmas.

[041] Em várias modalidades, o derivado de ácido borônico desta invenção, e usos do mesmo, é um derivado de ácido aril-borônico ou sal do mesmo, em que a dita arila (por exemplo, fenila, naftila, indolila) é opcionalmente substituída por entre 1 a 5 subst ituintes, em que cada substituinte é independentemente: H, F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada (por exemplo, metila), C1-C5 haloalquila linear ou ramificada, C1-C5 alcóxi linear ou ramificado (por exemplo, -OiPr, -OtBu, -OCH₂-Ph), ariloxi (por exemplo, OPh), O-CH₂Ph, O-CH₂-arila, CH₂-O-arila, C(O)NH₂, -C(O)N(R)₂, -C(O)NHR, -NHC(O)R, C1-C5 tioalcoxi

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35/136 linear ou ramificado, C1-C5 haloalcoxi linear ou ramificado (por exemplo, OCF3) , C1-C5 alcoxialquila linear ou ramificada, arila, C3-C8 cicloalquila, C3-C8 anel heterocíclico (por exemplo, pirrolidina, morfolina, piperidina, piperazina, 4-Me-piperazina); em que cada urn pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcoxi, N(R)2, CF3, CN ou N0₂; CF₃, CN, NO2, -CH2CN, NH₂, NHR, N(R)₂, alquil-N (R) 2, hidroxila, -OC(O)CF3, -0-CH2-arila (por exemplo, -OCfpPh, OCH₂-2-fluorofenila), -NHCO-alquila, COCH, -C(O)Ph, C(0)0alquila, C(O)H, ou -C(O)NH2, -C(O)N(R)2, -C(0)-morfolina, ou dois substituintes adjacentes (isto é, R2 e Ri, ou R3 e Ri, ou R4 e R3, ou R5 e R4) se juntam para formar urn anel carbociclico (por exemplo, benzeno, furano) ou heterocíclico com 5 ou 6 membros, que pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcoxi, N(R)₂, CF3, CN ou NO2; e em que

R é C1-C5 alquila linear ou ramificada, C1-C5 alcoxi linear ou ramificado, fenila, arila ou heteroarila, que pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcoxi, N(R)2, CF3, CN ou NO2, ou dois substituintes de gem R se juntam para formar urn anel heterocíclico com 5 ou 6 membros (por exemplo, morfolina).

[042] Em várias modalidades, a dita arila do dito

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36/136 ácido aril-borônico é fenila. é fenila substituída. Em naftila substituída ou modalidades, a arila é substituída. Em várias substituída por um ou mais partir de: F, Cl, Br, C1-C5 metila, C1-C5 alcoxi linear

Em outras modalidades, a arila outras modalidades, a arila é não substituída. Em outras indolila substituída ou não modalidades, a dita arila é substituintes selecionados a alquila linear ou ramificada, ou ramificado, O-iPr, O-tBu, ariloxi, Ο-Ph, O-CH₂Ph, O-CH₂-arila, CH₂-O-arila, -C(O)N(R)₂,

-C(O)NHR, C1-C5 haloalcoxi linear ou ramificado, OCF3, C3-C8 anel heterocíclico, pirrolidina, morfolina, piperidina, 4Me-piperazina; em que cada substituinte é uma modalidade separada, de acordo com esta invenção. Em outras modalidades, o dito ácido aril-borônico é selecionado a partir de compostos 1 a 5, PBA, 3,12 a 3,12, C2, CIO e C21 descritos abaixo no presente documento.

[043] Em várias modalidades, o derivado de ácido borônico desta invenção é representado pela estrutura de Fórmula I:

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37/136 em que

Ri, R2, R3, R4 e R.5 são, cada um, independentemente, H, F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada (por exemplo, metila), C1-C5 haloalquila linear ou ramificada, C1-C5 alcóxi linear ou ramificado (por exemplo, -OiPr, -OtBu, -OCtp-Ph), ariloxi (por exemplo, OPh) , R.gR.7, -C(O)NH2, -C(O)N(R)2, C1-C5 tioalcoxi linear ou ramificado, C1-C5 haloalcóxi linear ou ramificado (por exemplo, OCF3) , arila, Cs-Cs cicloalquila, Cs-Cs anel heterocíclico (por exemplo, pirrolidina, morfolina, piperidina, piperazina, 4-Me-piperazina); em que cada um pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcóxi, N(R)₂, CF3, CN ou NO2; CF3, CN, NO2, -CH2CN, NH₂, N(R)₂, alquilN(R)₂, hidroxila, -OC(O)CF₃, -NHCO-alquila, COOH, C(0)0alquila, C(0)H;

ou dois substituintes adjacentes (isto é, R2 e Ri, ou R3 e Ri, ou R4 e R3, ou R5 e R4) se juntam para formar um anel carbocíclico (por exemplo, benzeno, furano) ou heterocíclico com 5 ou 6 membros, que pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcóxi, N(R)₂, CF3, CN ou NO2;

R₆ é 0, (CH₂)n, C(0), C(0)0, 0C(0), C(O)NH, C(O)N(R), NHC(O), N(R)CO, NHSO2, N(R)SO₂, SO2NH, SO₂N(R), S, SO, S0₂, NH, N(R), OCH₂ ou CH₂O;

R e R7 são, cada um, independentemente, C1-C5 alquila

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38/136 linear ou ramificada (por exemplo, t-Bu, i-Pr), C1-C5 haloalquila linear ou ramificada (por exemplo, CF3),Ci-Cs alcoxi linear ou ramificado, C3-C8 cicloalquila, C3-C8 anel heterociclico (por exemplo, morfolina), fenila, arila (por exemplo, 2-clorofenila, 2-fluorofenila), naftila, benzila ou heteroarila, em que cada um pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcoxi, N(R)2, CF3, CN ou NO2; ou dois subst ituintes de gem R se juntam para formar um anel heterociclico com 5 ou 6 membros; e n é um número inteiro entre 1 e 6.

[044] Em várias modalidades, o derivado de ácido borônico é representado pela estrutura de Fórmula II:

II em que

Anel A é um sistema de anel aromático (por exemplo, fenila, naftila) ou heteroaromático (por exemplo, indol, 2,3-di-hidrobenzofurano) único ou fundido, ou uma C3-C10 cicloalquila única ou fundida, ou um C3-C10 anel heterociclico único ou fundido;

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39/136

Ri, R2, R3, R4 e Rs são, cada um, independentemente, Η, F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada (por exemplo, metila), C1-C5 haloalquila linear ou ramificada, C1-C5 alcoxi linear ou ramificado (por exemplo, -OiPr, -OtBu, -OCH2-Ph), ariloxi (por exemplo, OPh) , RgR?, -C(O)NH2, -C(O)N(R)2, C1-C5 tioalcoxi linear ou ramificado, C1-C5 haloalcoxi linear ou ramificado (por exemplo, OCF3) , arila, C3-C8 cicloalquila, C3-C8 anel heterociclico (por exemplo, pirrolidina, morfolina, piperidina, piperazina, 4-Me-piperazina); em que cada um pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcoxi, N(R)₂, CF3, CN ou NO2; CF3, CN, NO2, -CH2CN, NH₂, N(R)₂, alquilN(R)₂, hidroxila, -OC(O)CF₃, -NHCO-alquila, COOH, C(0)0alquila, C(0)H;

ou dois substituintes adjacentes (isto é, R2 e Ri, ou R3 e Ri, ou R4 e R3, ou R5 e R4) se juntam para formar um anel carbocíclico (por exemplo, benzeno, furano) ou heterociclico com 5 ou 6 membros, que pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcoxi, N(R)2, CF3, CN ou NO2;

R e R7 são, cada um, independentemente, C1-C5 alquila linear ou ramificada (por exemplo, t-Bu, i-Pr), C1-C5

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40/136 haloalquila linear ou ramificada (por exemplo, CF3),Ci-Cs alcoxi linear ou ramificado, Cs-Cs cicloalquila, C3-C8 anel heterociclico (por exemplo, morfolina), fenila, arila (por exemplo, 2-clorofenila, 2-fluorofenila), naftila, benzila ou heteroarila, em que cada um pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou

ramificada, hidroxila,	alcoxi, N(R)2,	cf₃,	CN ou N0₂	; ou	dois
substituintes de gem	R se juntam	para	formar	um	anel
heterociclico com 5 ou	6 membros; e
n é um número inteiro entre 1 e	6 .
[045] Em várias modalidades,	A de	Fórmula	II é	uma

fenila. Em outras modalidades, A é piridinila. Em outras modalidades, A é naftila. Em outras modalidades, A é indolila. Em outra modalidade, A é 2,3-dihidrobenzofuranila. Em várias modalidades, o anel A é piridinila. Em várias modalidades, o anel A é pirimidinila. Em várias modalidades, o anel A é piridazinila. Em várias modalidades, A é pirazinila. Em várias modalidades, o anel A é triazinila. Em várias modalidades, o anel A é tetrazinila. Em várias modalidades, o anel A é tiazolila. Em várias modalidades, o anel A é isotiazolila. Em várias modalidades, o anel A é oxazolila. Em várias modalidades, o anel A é isoxazolila. Em várias modalidades, o anel A é imidazolila. Em várias modalidades, o anel A é pirazolila. Em várias modalidades, o anel A é pirrolila. Em várias

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41/136 modalidades, o anel A é furanila. Em várias modalidades, o anel A é tiofenoila. Em várias modalidades, o anel A é indenila. Em várias modalidades, o anel A é 2,3-dihidroindenila. Em várias modalidades, o anel A é tetrahidronaftila. Em várias modalidades, o anel A é isoindolila. Em várias modalidades, o anel A é naftila. Em várias modalidades, o anel A é antracenila. Em várias modalidades, o anel A é benzimidazolila. Em várias modalidades, o anel A é indazolila. Em várias modalidades, o anel A é purinila. Em várias modalidades, o anel A é benzoxazolila. Em várias modalidades, o anel A é benzisoxazolila. Em várias modalidades, o anel A é benzotiazolila. Em várias modalidades, o anel A é quinazolinila. Em várias modalidades, o anel A é quinoxalinila. Em várias modalidades, o anel A é cinolinila. Em várias modalidades, o anel A é ftalazinila. Em várias modalidades, o anel A é quinolinila. Em várias modalidades, o anel A é isoquinolinila. Em várias modalidades, o anel A é 3,4-di-hidro-2Hbenzo[b] [ 1,4]dioxepina. Em várias modalidades, o anel A é benzo[d] [l,3]dioxol. Em várias modalidades, o anel A é acridinila. Em várias modalidades, o anel A é benzofuranila. Em várias modalidades, o anel A é isobenzofuranila. Em várias

modalidades,	o	anel	A	é	benzotiofenila.	Em	várias
modalidades,	o	anel	A	é	benzo[c]tiofenila.	Em	várias
modalidades,	o	anel	A	é	benzodioxolila.	Em	várias

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42/136 modalidades, o anel A é tiadiazolila. Em várias modalidades, o anel A é oxadiaziolila. Em várias modalidades, o anel A é

7-OXO-6H,7H-[1,3]tiazol[4,5-d]pirimidina. Em várias modalidades, o anel A é [ 1,3]tiazol[5,4-b]piridina. Em várias modalidades, o anel A é tieno[3,2-d]pirimidin-4(3H)ona. Em várias modalidades, o anel A é 4-oxo-4H-tieno[3,2d][1,3]tiazina. Em várias modalidades, o anel A é pirido[2,3b]pirazina ou pirido[2,3-b]pirazin-3(4H)-ona. Em várias modalidades, o anel A é quinoxalin-2(1H)-ona. Em várias modalidades, o anel A é IH-indol. Em várias modalidades, o anel A é 2H-indazol. Em várias modalidades, o anel A é 4,5,6,7-tetra-hidro-2H-indazol. Em várias modalidades, o anel A é 3H-indol-3-ona. Em várias modalidades, o anel A é 1,3-benzoxazolila. Em várias modalidades, o anel A é 1,3benzotiazol. Em várias modalidades, o anel A é 4,5,6,7-tetrahidro-1,3-benzotiazol. Em várias modalidades, o anel A é 1benzofurano. Em várias modalidades, o anel A é [ 1,3]oxazol[4,5-b]piridina. Em várias modalidades, o anel A é imidazo[2,1-b][l,3]tiazol. Em várias modalidades, o anel A é 4H,5H,6H-ciclopenta[d][l,3]tiazol. Em várias modalidades, o anel A é 5H,6H,7H,8H-imidazo[1,2-a]piridina. Em várias modalidades, o anel A é 2H,3H-imidazo[2,1b][l,3]tiazol. Em várias modalidades, o anel A é imidazo[l,2a]piridina. Em várias modalidades, o anel A é pirazol[l,5a]piridina. Em várias modalidades, o anel A é imidazo[1,2

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43/136

a]pirazina. Em várias modalidades, o anel A é imidazo[l,2-

a] pirimidina. Em várias modalidades, o anel A é 4H-tieno[3,2-

b] pirrol. Em várias modalidades, o anel A é IH-pirrol[2,3b]piridina. Em várias modalidades, o anel A é IH-pirrol[3,2b]piridina. Em várias modalidades, o anel A é 7H-pirrol[2,3d]pirimidina. Em várias modalidades, o anel A é oxazol[5,4b]piridina. Em várias modalidades, o anel A é tiazol[5,4b]piridina. Em várias modalidades, o anel A é triazolila. Em várias modalidades, o anel A é benzoxadiazol. Em várias modalidades, o anel A é benzo[c][1,2,5]oxadiazolila. Em várias modalidades, o anel A é IH-imidazo[4,5-b]piridina. Em várias modalidades, o anel A é 3H-imidazo[4,5-c]piridina. Em várias modalidades, o anel A é Cs-Cs cicloalquila. Em várias modalidades, o anel A é Cs-Cs anel heterociclico. Em várias modalidades, o anel A é tetra-hidropirano. Em várias modalidades, o anel A é piperidina. Em várias modalidades, o anel A é 1-(piperidin-l-il)etanona. Em várias modalidades, o anel A é morfolina. Em várias modalidades, o anel A é tieno[3,2-c]piridina.

[046] Em várias modalidades, Ri de Fórmula I ou II é H. Em outras modalidades, Ri é F. Em outras modalidades, Ri é Cl. Em outras modalidades, Ri é Br. Em outras modalidades, Ri é I. Em outras modalidades, Ri é C1-C5 alquila linear ou ramificada. Em outras modalidades, Ri é metila. Em outras modalidades, Ri é C1-C5 haloalquila linear ou

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44/136 ramificada. Em outras modalidades, Ri é C1-C5 alcóxi linear ou ramificado. Em outras modalidades, Ri é -OiPr. Em outras modalidades, Ri é -OtBu. Em outras modalidades, Ri é -OCH2Ph. Em outras modalidades, Ri é ariloxi. Em outras modalidades, Ri é OPh. Em outras modalidades, Ri é RgR?. Em outras modalidades, Ri é -0(0)NH2. Em outras modalidades, Ri é -C(0)N(R)2. Em outras modalidades, Ri é C1-C5 tioalcoxi linear ou ramificado. Em outras modalidades, Ri é C1-C5 haloalcoxi linear ou ramificado. Em outras modalidades, Ri é OCF3. Em outras modalidades, Ri é arila. Em outras modalidades, Ri é C3-C8 cicloalquila. Em outras modalidades, Ri é C3-C8 anel heterociclico. Em outras modalidades, Ri é pirrolidina. Em outras modalidades, Ri é morfolina. Em outras modalidades, Ri é piperidina. Em outras modalidades, Ri é piperazina. Em outras modalidades, Ri é 4-Me-piperazina; em que cada um pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcóxi, N(R)₂, CF3, CN ou NO2. Em outras modalidades, Ri é CF3. Em outras modalidades, Ri é CN. Em outras modalidades, Ri é NO2. Em outras modalidades, Ri é -CH2CN. Em outras modalidades, Ri é NH2. Em outras modalidades, Ri é N(R)2. Em outras modalidades, Ri é alquil-N(R)2. Em outras modalidades, Ri é hidroxila. Em outras modalidades, Ri é -0C(0)CF3. Em outras modalidades, Ri é COOH. Em outras modalidades, Ri é C(0)0alquila. Em outras modalidades, Ri é C(O)H.

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45/136 [047] Em várias modalidades, R2 de Fórmula I ou II é H. Em outras modalidades, R2 é F. Em outras modalidades, R2 é Cl. Em outras modalidades, R2 é Br. Em outras modalidades, R2 é I. Em outras modalidades, R2 é C1-C5 alquila linear ou ramificada. Em outras modalidades, R2 é metila. Em outras modalidades, R2 é C1-C5 haloalquila linear ou ramificada. Em outras modalidades, R2 é C1-C5 alcoxi linear ou ramificado. Em outras modalidades, R2 é -OiPr. Em outras modalidades, R2 é -OtBu. Em outras modalidades, R2 é -OCH2Ph. Em outras modalidades, R2 é ariloxi. Em outras modalidades, R2 é OPh. Em outras modalidades, R2 é RgR?. Em outras modalidades, R2 é -C(O)NH2. Em outras modalidades, R2 é -C(O)N(R)2. Em outras modalidades, R2 é C1-C5 tioalcoxi linear ou ramificado. Em outras modalidades, R2 é C1-C5 haloalcoxi linear ou ramificado. Em outras modalidades, R2 é OCF3. Em outras modalidades, R2 é arila. Em outras modalidades, R2 é C3-C8 cicloalquila. Em outras modalidades, R2 é C3-C8 anel heterocíclico. Em outras modalidades, R2 é pirrolidina. Em outras modalidades, R2 é morfolina. Em outras modalidades, R2 é piperidina. Em outras modalidades, R2 é piperazina. Em outras modalidades, R2 é 4-Me-piperazina; em que cada um pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcoxi, N(R)₂, CF3, CN ou NO2. Em outras modalidades, R2 é CF3. Em outras modalidades, R2 é CN. Em outras modalidades, R2 é NO2.

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46/136

Em outras modalidades, R2 é -CH2CN. Em outras modalidades, R2 é NH2. Em outras modalidades, R2 é N(R)2. Em outras modalidades, R2 é alquil-N(R)2. Em outras modalidades, R2 é hidroxila. Em outras modalidades, R2 é -OC(O)CF3. Em outras modalidades, R2 é COOH. Em outras modalidades, R2 é C(0)0alquila. Em outras modalidades, R2 é C(O)H.

[048] Em várias modalidades, R3 de Fórmula I ou II é H. Em outras modalidades, R3 é F. Em outras modalidades, R3 é Cl. Em outras modalidades, R3 é Br. Em outras modalidades, R3 é I. Em outras modalidades, R3 é C1-C5 alquila linear ou ramificada. Em outras modalidades, R3 é metila. Em outras modalidades, R3 é C1-C5 haloalquila linear ou ramificada. Em outras modalidades, R3 é C1-C5 alcóxi linear ou ramificado. Em outras modalidades, R3 é -OiPr. Em outras modalidades, R3 é -OtBu. Em outras modalidades, R3 é -OCH2Ph. Em outras modalidades, R3 é ariloxi. Em outras modalidades, R3 é OPh. Em outras modalidades, R3 é RgR?. Em outras modalidades, R3 é -C(O)NH2. Em outras modalidades, R3 é -C(O)N(R)2. Em outras modalidades, R3 é C1-C5 tioalcoxi linear ou ramificado. Em outras modalidades, R3 é C1-C5 haloalcóxi linear ou ramificado. Em outras modalidades, Ri é OCF3. Em outras modalidades, R3 é arila. Em outras modalidades, R3 é C3-C8 cicloalquila. Em outras modalidades, R3 é C3-C8 anel heterociclico. Em outras modalidades, R.3 é pirrolidina. Em outras modalidades, R.3 é morfolina. Em outras

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47/136 modalidades, R3 é piperidina. Em outras modalidades, R3 é piperazina. Em outras modalidades, R3 é 4-Me-piperazina; em que cada um pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcoxi, N(R)₂, CF3, CN ou NO2. Em outras modalidades, R3 é CF3. Em outras modalidades, R3 é CN. Em outras modalidades, R3 é NO2. Em outras modalidades, R3 é -CH2CN. Em outras modalidades, R3 é NH₂. Em outras modalidades, R3 é N(R)₂. Em outras modalidades, Ri é alquil-N(R)2. Em outras modalidades, R3 é hidroxila. Em outras modalidades, R3 é -OC(O)CF3. Em outras modalidades, R3 é COOH. Em outras modalidades, R3 é C(0)0alquila. Em outras modalidades, R3 é C(O)H.

[049] Em várias modalidades, R4 de Fórmula I ou II é H. Em outras modalidades, R4 é F. Em outras modalidades, R₄ é Cl. Em outras modalidades, R4 é Br. Em outras modalidades, R4 é I. Em outras modalidades, R4 é C1-C5 alquila linear ou ramificada. Em outras modalidades, R4 é metila. Em outras modalidades, R4 é C1-C5 haloalquila linear ou ramificada. Em outras modalidades, R4 é C1-C5 alcoxi linear ou ramificado. Em outras modalidades, R4 é -OiPr. Em outras modalidades, R4 é -OtBu. Em outras modalidades, R4 é -OCH2Ph. Em outras modalidades, R4 é ariloxi. Em outras modalidades, R4 é OPh. Em outras modalidades, R4 é RgR?. Em outras modalidades, R4 é -C(O)NH2. Em outras modalidades, R4 é -C(O)N(R)2. Em outras modalidades, R4 é C1-C5 tioalcoxi

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48/136 linear ou ramificado. Em outras modalidades, R4 é C1-C5 haloalcoxi linear ou ramificado. Em outras modalidades, R4 é OCF3. Em outras modalidades, R4 é arila. Em outras modalidades, R4 é C3-C8 cicloalquila. Em outras modalidades, R₄ é C3-C8 anel heterocíclico. Em outras modalidades, R4 é pirrolidina. Em outras modalidades, R4 é morfolina. Em outras modalidades, R4 é piperidina. Em outras modalidades, R4 é piperazina. Em outras modalidades, R4 é 4-Me-piperazina; em que cada um pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcóxi, N(R)₂, CF3, CN ou N0₂. Em outras modalidades, R4 é CF3. Em outras modalidades, R4 é CN. Em outras modalidades, R4 é N0₂. Em outras modalidades, R4 é -CH₂CN. Em outras modalidades, R4 é NH₂. Em outras modalidades, R4 é N(R)₂. Em outras modalidades, R4 é alquil-N(R)₂. Em outras modalidades, R4 é hidroxila. Em outras modalidades, R4 é -OC(O)CF3. Em outras modalidades, R4 é COOH. Em outras modalidades, R4 é C(0)0alquila. Em outras modalidades, R4 é C(O)H.

[050] Em várias modalidades, R5 de Fórmula I ou II é H. Em outras modalidades, Rs é F. Em outras modalidades, Rs é Cl. Em outras modalidades, Rs é Br. Em outras modalidades, Rs é I . Em outras modalidades, Rs é C1-C5 alquila linear ou ramificada. Em outras modalidades, Rs é metila. Em outras modalidades, Rs é C1-C5 haloalquila linear ou ramificada. Em outras modalidades, Rs é C1-C5 alcóxi linear

Petição 870190064986, de 10/07/2019, pág. 56/193

49/136 ou ramificado. Em outras modalidades, Rs é -OiPr. Em outras modalidades, Rs é -OtBu. Em outras modalidades, Rs é -OCH2Ph. Em outras modalidades, Rs é ariloxi. Em outras modalidades, Rs é OPh. Em outras modalidades, Rs é RgR?. Em outras modalidades, Rs é -C(O)NH2. Em outras modalidades, Rs é -C(0)N(R)2. Em outras modalidades, Rs é C1-C5 tioalcoxi linear ou ramificado. Em outras modalidades, Rs é C1-C5 haloalcoxi linear ou ramificado. Em outras modalidades, Rs é OCF3. Em outras modalidades, Rs é arila. Em outras modalidades, Rs é Cs-Cs cicloalquila. Em outras modalidades, Rs é Cs-Cs anel heterocíclico. Em outras modalidades, Rs é pirrolidina. Em outras modalidades, Rs é morfolina. Em outras modalidades, Rs é piperidina. Em outras modalidades, Rs é piperazina. Em outras modalidades, Rs é 4-Me-piperazina; em que cada um pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcoxi, N(R)₂, CF3, CN ou NO2. Em outras modalidades, Rs é CF3. Em outras modalidades, Rs é CN. Em outras modalidades, Rs é NO2. Em outras modalidades, Rs é -CH2CN. Em outras modalidades, Rs é NH2. Em outras modalidades, Rs é N(R)2. Em outras modalidades, Rs é alquil-N(R)2. Em outras modalidades, Rs é hidroxila. Em outras modalidades, Rs é -OC(O)CF3. Em outras modalidades, Rs é COOH. Em outras modalidades, Rs é C(0)0alquila. Em outras modalidades, Rs é C(O)H.

[051] Em várias modalidades, R2 e Ri ou R3 e Ri, ou

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50/136

R.4 e R.3, ou Rs e R4 de Fórmula I ou II (cada par é uma modalidade separada) se juntam para formar um anel carbocíclico ou heterocíclico com 5 ou 6 membros, que pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcoxi, N(R)₂, CF3, CN e/ou NO₂. Em outras modalidades, R2 e Ri ou R3 e Ri, ou R4 e R3, ou Rs e R4 (cada par é uma modalidade separada) se juntam para formar benzeno. R2 e Ri ou R3 e Ri, ou R4 e R3, ou Rs e R4 se juntam para formar furano.

[052] Em várias modalidades, Rg de Fórmula I ou II é O. Em outras modalidades, Rg é (CH₂)_n, em que n é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 (cada um é uma modalidade separada) . Em outras modalidades, Rg é C(O). Em outras modalidades, Rg é C(O)O. Em outras modalidades, Rg é OC(O). Em outras modalidades, Rg é C(O)NH. Em outras modalidades, Rg é C(O)N(R). Em outras modalidades, Rg é NHC(O). Em outras modalidades, Rg é N(R)CO. Em outras modalidades, Rg é NHSO₂. Em outras modalidades, Rg é N(R)SO₂. Em outras modalidades, Rg é SO₂NH. Em outras modalidades, Rg é SO₂N(R). Em outras modalidades, Rg é S. Em outras modalidades, Rg é SO. Em outras modalidades, Rg é SO₂. Em outras modalidades, Rg é NH. Em outras modalidades, Rg é N(R) . Em outras modalidades, Rg é OCH₂. Em outras modalidades, Rg é CH₂O.

[053] Em várias modalidades, R7 de Fórmula I ou II é C1-C5 alquila linear ou ramificada. Em outras modalidades,

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51/136

R7 é t-Bu. Em outras modalidades, R7 é i-Pr. Em outras modalidades, R7 é C1-C5 haloalquila linear ou ramificada. Em outras modalidades, R7 é CF3. Em outras modalidades, R7 é CiC5 alcoxi linear ou ramificado. Em outras modalidades, R7 é C3-C8 cicloalquila. Em outras modalidades, R7 é Cs-Cs anel heterociclico. Em outras modalidades, R7 é morfolina. Em outras modalidades, R7 é fenila. Em outras modalidades, R7 é arila. Em outras modalidades, R7 é 2-clorofenila. Em outras modalidades, R7 é 2-fluorofenila. Em outras modalidades, R7 é naftila. Em outras modalidades, R7 é benzila. Em outras modalidades, R7 é heteroarila. Em outras modalidades, a arila, benzila, heteroarila ou naftila podem ser adicionalmente substituídas por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcoxi, N(R)2, CF3, CN e/ou NO2 (cada um é uma modalidade separada).

[054] Em várias modalidades, R de Fórmula I ou II é C1-C5 alquila linear ou ramificada. Em outras modalidades, R é t-Bu. Em outras modalidades, R é i-Pr. Em outras modalidades, R é C1-C5 haloalquila linear ou ramificada. Em outras modalidades, R é CF3. Em outras modalidades, R é CiC5 alcoxi linear ou ramificado. Em outras modalidades, R é C3-C8 cicloalquila. Em outras modalidades, R é Cs-Cs anel heterociclico. Em outras modalidades, R é morfolina. Em outras modalidades, R é fenila. Em outras modalidades, R é arila. Em outras modalidades, R é 2-clorofenila. Em outras

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52/136 modalidades, R é 2-fluorofenila. Em outras modalidades, R é naftila. Em outras modalidades, R é benzila. Em outras modalidades, R é heteroarila. Em outras modalidades, a benzila, heteroarila ou naftila podem ser adicionalmente substituídas por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcoxi, N(R)2, CF3, CN e/ou NO2 (cada um é uma modalidade separada). Em outras modalidades, dois subst ituintes de gem R se juntam para formar um anel heterocíclico com 5 ou 6 membros.

[055] Em várias modalidades, n de Fórmula I ou II é

1.	Em	outras	modalidades,	n	é	2 .	Em	outras	modalidades,	n é
3 .	Em	outras	modalidades,	n	é	4 .	Em	outras	modalidades,	n é
5 .	Em	outras	modalidades,	n	é	6 .

[056] Em várias modalidades, o derivado de ácido borônico é selecionado a partir de:

4

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53/136

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54/136

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55/136

OH

[057] Em várias modalidades, os sais de derivado de ácido borônico incluem quaisquer sais de ácido. Exemplos sem limitação de sais inorgânicos de ácidos carboxilicos incluem amônia, metais alcalinos que incluem litio, sódio, potássio, césio; metais alcalinos terrosos que incluem cálcio, magnésio, alumínio; zinco, bário, cloros ou amônias quaternárias. Exemplos sem limitação de sais orgânicos incluem aminas orgânicas que incluem aminas orgânicas alifáticas, aminas orgânicas alicíclicas, aminas orgânicas aromáticas, benzatinas, t-butilaminas, benetaminas (Nbenzilfenetilamina), diciclo-hexilaminas, dimetilaminas, dietanolaminas, etanolaminas, etilenodiaminas, hidrabaminas, imidazóis, lisinas, metilaminas, meglaminas, N-metil-D-glucaminas, N, N'-dibenziletilenodiaminas, nicotinamidas, aminas orgânicas, ornitinas, piridinas, picolies, piperazinas, procaína, tris(hidroximetil)metilaminas, trietilaminas, trietanolaminas, trimetilaminas, trometaminas ou ureias.

[058] Conforme usado no presente documento, o termo alquila pode ser qualquer grupo alquila de cadeia linear

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56/136 ou ramificada que contém até cerca de 30 carbonos, a menos que seja especificado de outra forma. Em várias modalidades, uma alquila inclui carbonos C1-C5. Em outras modalidades, uma

alquila	inclui	carbonos	Ci-Cg.	Em	outras	modalidades,	uma
alquila	inclui	carbonos	Ci-Cs.	Em	outras	modalidades,	uma
alquila	inclui	carbonos	Ci-Cio.	Em	outras	modalidades,	uma
alquila	é um	C1-C12 carbonos.	Em	outras	modalidades,	uma

alquila é um C1-C20 carbonos. Em outras modalidades, alquila ramificada é uma alquila substituída por cadeias laterais de alquila de 1 a 5 carbonos. Em várias modalidades, o grupo alquila pode ser não substituído. Em outras modalidades, o grupo alquila pode ser substituído por um halogênio, haloalquila, hidroxila, alcóxi, carbonila, amido, alquilamido, dialquilamido, ciano, nitro, CO2H, amino, alquilamino, dialquilamino, carboxila, tio e/ou tioalquila.

[059] O grupo alquila pode ser um único substituinte ou pode ser um componente de um substituinte maior, tal como em um alcóxi, alcoxialquila, haloalquila, arilalquila, alquilamino, dialquilamino, alquilamido, alquilureia, etc. Grupos alquila preferenciais são metila, etila e propila e, assim, halometila, di-halometila, tri-halometila, haloetila, di-haloetila, tri-haloetila, halopropila, di-halopropila, tri-halopropila, metoxi, etoxi, propoxi, arilmetila, ariletila, arilpropila, metilamino, etilamino, propilamino, dimetilamino, dietilamino, metilamido, acetamido,

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57/136 propilamido, halometilamido, haloetilamido, halopropilamido, metil-ureia, etil-ureia, propil-ureia, etc.

[060] Conforme usado no presente documento, o termo arila se refere a qualquer anel único ou fundido aromático ou heteroaromático que esteja diretamente ligado a outro grupo e possa ser substituído ou não substituído. O grupo arila pode ser um único substituinte, ou o grupo arila pode ser um componente de um substituinte maior, tal como em uma arilalquila, arilamino, arilamido, etc. Grupos arila exemplificativos incluem, sem limitação, fenila, tolila, xilila, furanila, naftila, piridinila, pirimidinila, piridazinila, pirazinila, triazinila, tiazolila, oxazolila, isooxazolila, pirazolila, indolila, imidazolila, tiofenoila, pirrolila, fenilmetila, feniletila, fenilamino, fenilamido, etc. Substituições incluem, porém, sem limitação a: F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, C1-C5 haloalquila linear ou ramificada, C1-C5 alcoxi linear ou ramificado, CiC5 haloalcoxi linear ou ramificado, CF3, CN, NO2, -CH2CN, NH2, NH-alquila, N(alquil)₂, hidroxila, -OC(O)CF₃, -OCH₂Ph, -NHCOalquila, COCH, -C(O)Ph, C(O)O-alquila, C(O)H, ou -C(O)NH₂.

[061] Conforme usado no presente documento, o termo alcoxi se refere a um grupo éter substituído por um grupo alquila, conforme definido acima. Alcoxi se refere a ambos grupos alcoxi linear e ramificado. Exemplos sem limitação de grupos alcoxi são metoxi, etoxi, propoxi, iso-propoxi, terc

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58/136 butoxi, -OCH2-Ph.

[062] Conforme usado no presente documento, o termo tioalcoxi se refere a um grupo tio substituído por um grupo alquila, conforme definido acima. Tioalcoxi se refere a ambos os grupos tioalcoxi linear e ramificado. Exemplos sem limitação de grupos tioalcoxi são S-metila, S-etila, Spropila, S-iso-propila, S-terc-butila, -SCfp-Ph.

[063] Conforme usado no presente documento, o termo ariloxi se refere a um grupo éter substituído por um grupo arila, conforme definido acima. Exemplos sem limitação de grupos ariloxi são OPh.

[064] Um grupo haloalquila se refere, em outras modalidades, a um grupo alquila, conforme definido acima, que é substituído por um ou mais átomos de halogênio, por exemplo, por F, Cl, Br ou I. Exemplos sem limitação de grupos haloalquila são CF3, CF2CF3, CH2CF3.

[065] Um grupo haloalcoxi se refere, em outras modalidades, a um grupo alcóxi, conforme definido acima, que é substituído por um ou mais átomos de halogênio, por exemplo, por F, Cl, Br ou I. Exemplos sem limitação de grupos haloalcoxi são OCF₃, OCF2CF3, OCH2CF3.

[066] Um grupo alcoxialquila se refere, em outras modalidades, a um grupo alquila, conforme definido acima, que é substituído por grupo alcóxi, conforme definido acima, por exemplo, por metoxi, etoxi, propoxi, i-propoxi, t

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59/136 butoxi, etc. Exemplos sem limitaçao de grupos alcoxialquila são -CH2-O-CH3, -CH2-O-CH (CH₃) 2, -CH2-O-C (CH₃) 3, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-O-CH (CH₃) 2, -CH2-CH2-O-C (CH₃) 3 .

[067] Um grupo cicloalquila ou carbocíclico se refere, em várias modalidades, a uma estrutura de anel que compreende átomos de carbono como átomos de anel, que podem ser saturados ou insaturados, substituídos ou não substituídos. Em outras modalidades, a cicloalquila é um anel com 3 a 12 membros. Em outras modalidades, a cicloalquila é um anel com 6 membros. Em outras modalidades, a cicloalquila é um anel com 5 a 7 membros. Em outras modalidades, a cicloalquila é um anel com 3 a 8 membros. Em outras modalidades, o grupo cicloalquila pode ser não substituído ou substituído por um halogênio, haloalquila, hidroxila, alcóxi, carbonila, amido, alquilamido, dialquilamido, ciano, nitro, CO2H, amino, alquilamino, dialquilamino, carboxila, tio e/ou tioalquila. Em outras modalidades, o anel de cicloalquila pode ser fundido com outro anel de cicloalquila ou heterocíclico saturado ou insaturado com 3 a 8 membros. Em outras modalidades, o anel de cicloalquila é um anel saturado. Em outras modalidades, o anel de cicloalquila é um anel insaturado. Exemplos sem limitação de um grupo cicloalquila compreendem ciclo-hexila, ciclo-hexenila, ciclopropila, ciclopropenila, ciclopentila, ciclopentenila, ciclobutila, ciclobutenila, cicloctila,

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60/136 cicloctadienila (COD), cicloctano (COE) etc.

[068] Um grupo heterociclo ou heterociclico se refere, em várias modalidades, a uma estrutura de anel que compreende adicionalmente aos átomos de carbono, enxofre, oxigênio, nitrogênio ou qualquer combinação dos mesmos, como parte do anel. Em outras modalidades, o heterociclo é um anel com 3 a 12 membros. Em outras modalidades, o heterociclo é um anel com 6 membros. Em outras modalidades, o heterociclo é um anel com 5 a 7 membros. Em outras modalidades, o heterociclo é um anel com 3 a 8 membros. Em outras modalidades, o grupo heterociclo pode ser não substituído ou substituído por um halogênio, haloalquila, hidroxila, alcóxi, carbonila, amido, alquilamido, dialquilamido, ciano, nitro, CO2H, amino, alquilamino, dialquilamino, carboxila, tio e/ou tioalquila. Em outras modalidades, o anel de heterociclo pode ser fundido com outro anel de cicloalquila ou heterociclico saturado ou insaturado com 3 a 8 membros. Em outras modalidades, o anel de heterociclo é um anel saturado. Em outras modalidades, o anel de heterociclo é um anel insaturado. Exemplos sem limitação de um anel heterociclico compreendem piridina, pirrolidina, piperidina,

morfolina,	piperazina,	tiofeno, pirrol,	benzodioxol ou
indol.
[069]	Em várias	modalidades, esta	invenção fornece

um inibidor seletivo de carboxietilesterase (CBE) que

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61/136 compreende um derivado de ácido borônico e sal do mesmo. Em outras modalidades, a CBE desta invenção é CBE de tipo selvagem, um homólogo de CBE ou CBE mutante. Em outras modalidades, a CBE desta invenção é de tipo selvagem ou versões mutantes de CBE de aE7 ou homólogo da mesma. Em outras modalidades, a CBE desta invenção é JLcaE7, JLcaE7 de tipo selvagem, JLcaE7 mutante, um homólogo da mesma, ou qualquer combinação das mesmas. Em outras modalidades, o derivado de ácido borônico é um derivado de ácido arilborônico e sal do mesmo, conforme descrito acima no presente documento.

[070] Em várias modalidades, esta invenção fornece um inibidor seletivo de carboxietilesterase (CBE) que compreende um derivado de ácido borônico ou sal do mesmo representado pela estrutura de Fórmula I:

em que

Ri, R2, R3, R4 e R.5 são, cada um, independentemente, H,

F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada (por exemplo, metila), C1-C5 haloalquila linear ou ramificada, C1-C5 alcoxi

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62/136 linear ou ramificado (por exemplo, -OiPr, -OtBu, -OCfR-Ph), ariloxi (por exemplo, OPh) , RgR?, -C(O)NH2, -C(O)N(R)2, C1-C5 tioalcoxi linear ou ramificado, C1-C5 haloalcoxi linear ou ramificado (por exemplo, OCF3) , arila, C3-C8 cicloalquila, C3-C8 anel heterociclico (por exemplo, pirrolidina, morfolina, piperidina, piperazina, 4-Me-piperazina); em que cada um pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcoxi, N(R)₂, CF3, CN ou NO2; CF3, CN, NO2, -CH2CN, NH₂, N(R)₂, alquilN(R)₂, hidroxila, -OC(O)CF₃, -NHCO-alquila, COOH, C(0)0alquila, C(0)H;

ou dois substituintes adjacentes (isto é, R2 e Ri, ou R3 e Ri, ou R4 e R3, ou R5 e R4) se juntam para formar um anel carbocíclico (por exemplo, benzeno, furano) ou heterociclico com 5 ou 6 membros, que pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcoxi, N(R)2, CF3, CN ou NO2; e

R₆ é 0, (CH₂)n, C(0), C(0)0, 0C(0), C(O)NH, C(0)N(R), NHC(O), N(R)CO, NHSO2, N(R)SO₂, SO2NH, SO₂N(R), S, SO, S0₂, NH, N(R), OCH₂ ou CH₂O;

R e R7 são, cada um, independentemente, C1-C5 alquila linear ou ramificada (por exemplo, t-Bu, i-Pr), C1-C5 haloalquila linear ou ramificada (por exemplo, CF3),Ci-Cs alcoxi linear ou ramificado, Cs-Cs cicloalquila, Cs-Cs anel heterociclico (por exemplo, morfolina), fenila, arila (por

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63/136 exemplo, 2-clorofenila, 2-fluorofenila), naftila, benzila ou heteroarila, em que cada um pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcóxi, N(R)2, CF3, CN ou NO2; ou dois subst ituintes de gem R se juntam para formar um anel heterocíclico com 5 ou 6 membros; e n é um número inteiro entre 1 e 6.

[071] Em outras modalidades, a CBE desta invenção é uma CBE de tipo selvagem, um homólogo de CBE ou CBE mutante. Em outras modalidades, a CBE é LcaEl.

[072] Em várias modalidades, esta invenção fornece um inibidor seletivo de carboxietilesterase (CBE) que compreende um derivado de ácido borônico selecionado a partir de:

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OH

[073] Em outras modalidades, o inibidor é covalentemente ligado à CBE, ao homólogo de CBE ou à CBE mutante. Em outras modalidades, a CBE é uma «E7 de tipo selvagem. Em outras modalidades, a CBE é um homólogo de «E7. Em outras modalidades, a CBE é uma «E7 mutante. Em outras modalidades, a «E7 é LcaEl. Em outras modalidades, a CBE é uma CBE de tipo selvagem ou uma CBE mutante ou combinação das mesmas. Em outras modalidades, a mutação na dita CBE mutante é «E7 Glyl37Asp. Em outras modalidades, a CBE é a mutação equivalente em um homólogo de CBE de «E7. Em outras modalidades, o inibidor é um inibidor nanomolar. Em outras modalidades, o inibidor é um inibidor picomolar.

[074] Apesar do surgimento da resistência, e problemas com relação à contaminação humana e do ambiente, inseticidas são a principal medida para controle de moscavarejeira. A recente detecção de resistência contra os principais meios de controle químico da mosca-varejeira, diciclanila e ciromazina (Levot, G. et al., Survival advantage of cyromazine-resistant sheep blowfly larvae on dicyclanil- and cyromazine-treated Merinos. Aust. Vet. J.

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92, 421 a 426 (2014) e Levot, G. Cyromazine resistance detected in Australian sheep blowfly. Aust. Vet. J. 90, 433437 (2012).), destaca a necessidade para inovação continua em medidas de controle de mosca-varejeira. Embora nos alvos de inseticida estejam sob investigação (Kotze, A. C. et al. Histone deacetylase enzymes as drug targets for the control of the sheep blowfly, Lucilia cuprina. Int. J. Parasitol. Drugs Drug Resist. 5, 201 a 208 (2015).), auxiliada pela recente publicação do genoma de L. cuprina (Anstead, C. a. et al. Lucilia cuprina genome unlocks parasitic fly biology to underpin future interventions. Nat. Commun. 6, 7344 (2015)), o uso de agentes sinérgicos para ressuscitar a eficácia de inseticidas de OP pode ser uma estratégia viável para controle de mosca-varejeira, particularmente se os métodos de controle atuais falharem.

[075] Em várias modalidades, esta invenção fornece uma composição pesticida para eliminar pragas que compreende uma combinação sinergicamente eficaz de pelo menos um: organofosfato (OP), carbamato (CM) e/ou piretroide/piretroide sintético (SP); e pelo menos um derivado de ácido borônico ou sal do mesmo. Em outras modalidades, as pragas são resistentes a pesticida de organofosfato (OP), carbamato (CM) e/ou piretroide/piretroide sintético (SP). Em várias modalidades, esta invenção fornece uma composição pesticida para eliminar

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68/136 pragas que compreende uma combinação sinergicamente eficaz de organof osf ato (OP) e pelo menos um derivado de ácido borônico ou sal do mesmo. Em outras modalidades, as pragas são resistentes a pesticida de organofosfato (OP).

[076] Em outras modalidades, a composição é para uso na eliminação de pragas. Em outras modalidades, a composição é para uso na eliminação de insetos. Em outras modalidades, o derivado de ácido borônico é um derivado de ácido aril-borônico ou sal do mesmo, conforme descrito acima no presente documento. Em outras modalidades, o derivado de ácido borônico é representado pela Fórmula I ou II descrita acima no presente documento. Em outras modalidades, o derivado de ácido borônico é selecionado a partir de compostos 1 a 8, PBA, 3,1 a 3,12, C2, CIO e C21 descritos acima no presente documento; em que cada um é uma modalidade separada, de acordo com esta invenção. Em outras modalidades, a composição é útil para eliminar pragas de culturas agrícolas que incluem, plantas de culturas vegetais, floricultura, culturas ornamentais, medicinais e econômicas. Em outras modalidades, a cultura agrícola são pequenas favas {Vicia faba). Em outras modalidades, a cultura agrícola é milho (por exemplo, Zea may) . Em outras modalidades, a cultura agrícola é batata.

[077] Uma grande exigência para tal composição sinergicamente eficaz ser possível é um perfil ambiental e

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69/136 de segurança benigno. A principal preocupação em termos de toxicidade é a seletividade contra AChE. Embora a estrutura geral de LcocEl lembre aquela de AChE humana (PDB 4PQE; 1.05Â RMSD sobre 309 resíduos), as enzimas são bastante diferentes na região do sítio ativo, o que resulta na seletividade >10⁶vezes do, por exemplo, composto 3 para LcaEl (Tabela 1) . Como resultado das diferenças conformacionais nos sítios ativos, o substituinte de bromo, que é altamente complementar ao sítio ativo de LcaEl, é estericamente ocluído do sítio ativo de AChE devido a uma colisão com Phe295 na (Figura 14) . Além disso, é demonstrado no presente documento que compostos não inibem significativamente outras proteínas não alvo, tais como proteases serina e treonina humanas, nem são geralmente tóxicas às células. Isso também é consistente com outra literatura que sugere que ácidos borônicos são relativamente benignos.

[078] Consequentemente, em várias modalidades, a composição, conforme descrita acima no presente documento, não é tóxica às plantas. Em outras modalidades, a composição não é tóxica a mamíferos. Em outras modalidades, a composição não é tóxica, a pássaros. Em outras modalidades, a composição não é tóxicas a animais. Em outras modalidades, a composição não é tóxica a seres humanos.

[079] Em outras modalidades, a composição elimina pragas, que incluem, porém., sem limitação a mosca-varejeira

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70/136 (por exemplo, Calliphora stygia), mosca-da-bicheira (por exemplo, Cochliomyia hominivorax), baratas, carrapatos, mosquitos (por exemplo, Aedes aegypti, Anopheles gambiae, Culex quinquefasciatus), grilos, moscas domésticas (por exemplo, Musca domestica), moscas de areia, moscas-dosestábulos (por exemplo, Stomoxys calcitrans), formigas, cupins, pulgas, pulgões (por exemplo, pulgão verde do pêssego), brocas (por exemplo, Ostrinia nubilalis (broca europeia do milho)), besouros (por exemplo, Leptinotarsa decemlineata (besouro do Colorado)), mariposas ou qualquer combinação dos mesmos. Exemplos de pragas incluem, porém, sem limitação a: mosca-varejeira (por exemplo, Calliphora stygia), mosca-da-bicheira (por exemplo, Cochliomyia hominivorax) , mosquitos (por exemplo, Aedes aegypti, Anopheles gambiae, Culex quinquefasciatus) , moscas domésticas (por exemplo, Musca domestica), moscas-dosestábulos (por exemplo, Stomoxys calcitrans), pulgões (por exemplo, pulgão verde do pêssego), brocas (por exemplo, Ostrinia nubilalis (broca europeia do milho)), besouros (por exemplo, Leptinotarsa decemlineata (besouro do Colorado)), mariposas, ninfas e adultos da ordem Blattodea que incluem baratas das famílias Blattellidae e Blattidae (por exemplo, barata oriental (Blatta orientalis Linnaeus), barata asiática (Blatella asahinai Mizukubo), barata alemã (Blattella germanica Linnaeus), barata de listras castanhas

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71/136 (Supella longipalpa Fabricius), barata americana (Periplaneta americana Linnaeus), barata marrom (Periplaneta brunnea Burmeister), barata-da-madeira (Leucophaea maderae Fiabricius), barata marrom fuligem(Periplaneta fuliginosa Service), barata australiana (Periplaneta australasiae Fabr.), barata cinérea (Nauphoeta cinerea Olivier) e barata suave (Symploce pallens Stefens)); adultos e larvas da ordem Dermaptera que incluem lacraias da família Forficulidae (por exemplo, lacraia europeia (Forficula auricularia Linnaeus), e lacraia preta (Chelisoches morio Fabricius)) . Outros exemplos são adultos e larvas da ordem Acari (ácaros), tais como ácaros aranhiços e ácaros vermelhos na família Tetranychidae (por exemplo, ácaro vermelho europeu (Panonychus ulmi Koch), ácaro aranhiço rajado (Tetranychus urticae Koch), e ácaro McDaniel (Tetranychus mcdanieli McGregor)); ácaros importantes para saúde humana e animal (por exemplo, ácaros domésticos na família Epidermoptidae, ácaros foliculares na família Demodicidae, e ácaros granulares na família Glycyphagidae); carrapatos na ordem Ixodidae (por exemplo, carrapato de cervo (Ixodes scapularis Say) , carrapato da paralisia australiana (Ixodes holociclus Neumann), carrapato do cachorro americano (Dermacentor variabilis Say), e carrapato lone star (Amblyomma americanum Linnaeus)); ácaros de coceira e sarna nas famílias Psoroptidae, Pyemotidae e Sarcoptidae; grilos tais como

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72/136 grilo doméstico (Acheta domesticus Linnaeus), grilos toupeiras (por exemplo, grilo toupeira leonado (Scapteriscus vicinus Scudder), e grilo toupeira do sul (Scapteriscus borellii Giglio-Tos)); moscas que incluem moscas domésticas (por exemplo, Musca domestica Linnaeus), moscas domésticas menores (por exemplo, Fannia canicularis Linnaeus, F. femoralis Stein), moscas-dos-estábulos (por exemplo, Stomoxys calcitrans Linnaeus), moscas de rosto, moscas-doschifres, moscas-varejeiras (por exemplo, Chrysomya spp., Phormia spp. Lucilia cuprina), e outras pragas de mosca muscoide, moscas de cavalo (por exemplo, Tabanus spp.), moscas-berneiras (por exemplo, Gastrophilus spp., Oestrus spp.), larvas de gado (por exemplo, Hypoderma spp.), moscas de cervo (por exemplo, Chrysops spp.), moscas de ovinos (por exemplo, Melophagus ovinus Linnaeus) e outros Brachycera; mosquitos (por exemplo, Aedes spp., Anopheles spp., Culex spp.), Aedes aegypti (mosquito da febre amarela); Anopheles albimanus; Culex pipiens complex; Culex tarsalis; Culex tritaenorhynchus; moscas pretas (por exemplo, Prosimulium spp., Simulium spp.), Simulium damnosum; Simulium sanctipauli (moscas pretas); maruins, moscas de areia, sciarideos e outros Nematocera; pragas de inseto da ordem Hymenoptera que incluem formigas (por exemplo, formiga carpinteira vermelha (Camponotus ferrugineus Fabricius), formiga carpinteira preta (Camponotus pennsylvanicus De

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Geer), formiga-faraó (Monomorium pharaonis Linnaeus), formiga pequena de fogo (Wasmannia auropunctata Roger), formiga de fogo (Solenopsis geminata Fabricius), formiga de fogo vermelha importada (Solenopsis invicta Buren), formiga argentina (Iridomyrmex humilis Mayr), formiga maluca (Paratrechina longicomis Latreille), formiga dos pavimentos (Tetramorium caespitum Linnaeus), formiga do campo de milho (Lasius alienus Forster), formiga invasora (Tapinoma sessile Say)); pragas de inseto da família Formicidae que incluem a formiga carpinteira da Flórida (Camponotus floridanus Buckley), formiga de pé branco (Technomyrmex albipes fr. Smith), formigas cabeçudas (Pheidole spp.), e formiga fantasma (Tapinoma melanocephalum Fabricius); abelhas (que incluem abelhas carpinteiras), vespões, vespas yellowjackets, vespas e marimbondos (Neodiprion spp.; Cephus spp.); pragas de inseto da ordem Isoptera que incluem cupins na Termitidae (por exemplo, Macrotermes sp.), Kalotermitidae (por exemplo, Cryptotermes sp.) e Rhinotermitidae (por exemplo, Reticulitermes spp., Coptotermes spp.), famílias da térmita subterrânea oriental (Reticulitermes flavipes Kollar), térmita subterrânea ocidental (Reticulitermes hesperus Banks), térmita subterrânea de Formosa (Coptotermes formosanus Shiraki), térmita-da-madeira-seca do oeste Índico (Incisitermes immigrans Snyder), térmita pós-pó (Cryptotermes brevis Walker), térmita-da-madeira-seca

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74/136 (Incisitermes snyderi Light), térmita subterrânea do sudeste (Reticulitermes virginicus Banks), térmita-da-madeira-seca ocidental (Incisitermes minor Hagen), cupins arbóreos, tais como Nasutitermes sp. e outros cupins de importância econômica; pragas de inseto da ordem Thysanura, tais como traça (Lepisma saccharine Linnaeus) e tesourinha (Thermobia domestica Packard); pragas de inseto da ordem Mallophaga e que incluem o piolho de cabeça (Pediculus humanus capitis De Geer), piolho de corpo (Pediculus humanus humanus Linnaeus), piolho-do-corpo-da-galinha (Menacanthus straminaus Nitszch), piolho-do-cão (Trichodectes canis De Geer), piolho-da-galinha (Goniocotes gallinae De Geer), piolho-daovelha (Bovicola ovis Schrank), piolho-do-gado-de-fucinhocurto (Haematopinus eurysternus Nitzsch); piolho-do-gado-defucinho-longo (Linognathus vituli Linnaeus) e outros piolhos parasiticos que sugam e mastigam que atacam seres humanos e animais; exemplos para pragas de inseto da ordem Siphonoptera que incluem a pulga de rato oriental (Xenopsylla cheopis Rothschild), pulga de gato (Ctenocephalides felis Bouche), pulga de cão (Ctenocephalides canis Curtis), pulga de galinha (Ceratophyllus gallinae Schrank), pulga das aves (Echidnophaga gallinacea Westwood), pulga do ser humano (Pulex irritans Linnaeus) e outras pulgas que afetam mamíferos e pássaros. Exemplos para pragas de artrópode também incluem aranhas na ordem Araneae, tais como a aranha

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75/136 marrom (Loxosceles reclusa Gertsch e Mulaik) e a viúva-negra (Latrodectus mactans Fabricius), e centopeias na ordem Scutigeromorpha, tal como a centopeia caseira (Scutigera coleoptrata Linnaeus); Frankliniella Occidentalis; Scirtothrips citri; Acyrthosiphon pisum; Aphis gossypii; Bemisia tabaci; Brevicoryne brassicae (pulgão-da-couve); Lygus Hesperus; Myzus persicae (pulgão-verde-dopessegueiro); Myzus nicotianaea (pulgão-do-fumo); Nasonovia ribisnigri (pulgão-da-alface); Nephotettix cincticeps; Nilaparvata lugens (cigarrinha-marrom-do-arroz) ; Phorodon humuli (pulgão-do-lúpulo); Schizaphis graminum (pulgãoverde-dos-cereais); Diabrotica virgifera; Leptinotarsa decemlineata; Oryzaephilus surinamensis (caruncho-desuriname); Leptinotarsa decemlineata (besouro do Colorado); mariposas, tais como: Cydia pomonella (mariposa-das-maçãs); Epiphyas postvittana (mariposa-das-maçãs marrom clara); Heliothis virescens; Platynota idaeusalis (mariposa-dobroto-das-maçãs); Haematobia irritans (mosca de Buffalo); Lucilia sericata (mosca verde); Amblyseius pontentillae; Boophilus microplus; Calliphora stygia, Cochliomyia hominivorax, Aedes aegypti, Anopheles gambiae, Culex quinquefasciatus e Tetranychus kanzawai. Em outras modalidades, a composição elimina pragas como as listadas acima, no presente documento, porém, não é prejudicial aos animais. Em outras modalidades, a composição não é

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76/136 prejudicial a mamíferos. Em outras modalidades, a composição não é prejudicial a pássaros. Em outras modalidades, a composição não é prejudicial ao ser humano. Em outras modalidades, a composição não é prejudicial a plantas.

[080] Em várias modalidades, a composição é aplicada na cultura agrícola por pulverização, filme, injetada em líquidos ou administrada por via tópica a um rebanho.

[081] Em várias modalidades, esta invenção fornece um método para eliminar população de insetos que carregam o agente causador de malária que compreende administrar uma combinação de pelo menos um organofosfato (OP), carbamato (CM) e/ou piretroide/piretroide sintético (SP); e pelo menos um derivado de ácido borônico ou sal do mesmo. Em outras modalidades, a composição de combinação de pelo menos um organofosfato (OP), carbamato (CM) e/ou piretroide/piretroide sintético (SP); e pelo menos um derivado de ácido borônico ou sal do mesmo é injetada em um líquido.

[082] Em outras modalidades, a população de insetos que carregam o agente causador de malária inclui mosquitos (por exemplo, Aedes spp., Anopheles spp., Culex spp.), Aedes aegypti (mosquito da febre amarela); Anopheles albimanus; Culex pipiens complex; Culex tarsalis; Culex tritaenorhynchu ou qualquer combinação dos mesmos.

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77/136 [083] Em várias modalidades, esta invenção fornece um método para eliminar pragas, sendo que o método compreende colocar uma população de pragas em contato com uma quantidade eficaz da composição desta invenção. Em outras modalidades, as pragas são insetos. Em outras modalidades, o inseto é mosca-varejeira (por exemplo, Calliphora stygia), mosca-dabicheira (por exemplo, Cochliomyia hominivorax), baratas, carrapatos, mosquitos (por exemplo, Aedes aegypti, Anopheles gambiae, Culex quinquefasciatus), grilos, moscas domésticas (por exemplo, Musca domestica), moscas de areia, moscas-dosestábulos (por exemplo, Stomoxys calcitrans), formigas, cupins, pulgas, pulgões (por exemplo, pulgão verde do pêssego), brocas (por exemplo, Ostrinia nubilalis (broca europeia do milho)), besouros (por exemplo, Leptinotarsa decemlineata (besouro do Colorado)), mariposas ou qualquer combinação dos mesmos. Em outras modalidades, o inseto é mosca-varejeira. Em outras modalidades, o inseto é pulgão. Em outras modalidades, o inseto é uma broca. Em outras modalidades, o inseto é um besouro. Em outras modalidades, o inseto é uma mariposa. Em outras modalidades, o contato da população compreende expor a população ao pesticida, de modo que a composição seja ingerida pelas pragas de maneira suficiente para eliminar pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% , 60%, 70%, 80%, 90%, 100% da população de pragas, em que cada valor é uma modalidade separada de acordo com esta

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78/136 invenção. Em outras modalidades, o contato da população compreende expor a população ao inseticida, de modo que a composição seja ingerida pelos insetos de maneira suficiente para eliminar pelo menos 50% da população. Em outras modalidades, o método não é tóxico a animais. Em outras modalidades, o método não é tóxico a seres humanos. Em outras modalidades, o método não é tóxico a plantas. Em outras modalidades, o método é ecologicamente seguro.

[084] Em várias modalidades, esta invenção fornece um método para eliminar pragas de inseto em uma planta, sendo que o método compreende colocar a planta em contato com a composição desta invenção, em que a composição tem um efeito sinérgico sobre atividade inseticida. Em outras modalidades, esta invenção fornece um método para eliminar pragas de inseto em um animal, sendo que o método compreende colocar o animal em contato com a composição desta invenção. Em outras modalidades, o inseto é mosca-varejeira (por exemplo, Calliphora stygia), mosca-da-bicheira (por exemplo, Cochliomyia hominivorax), baratas, carrapatos, mosquitos (por exemplo, Aedes aegypti, Anopheles gambiae, Culex guinguefasciatus), grilos, moscas domésticas (por exemplo, Musca domestica), moscas de areia, moscas-dos-estábulos (por exemplo, Stomoxys calcitrans), formigas, cupins, pulgas, pulgões (por exemplo, pulgão verde do pêssego), brocas (por exemplo, Ostrinia nubilalis (broca europeia do milho)),

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79/136 besouros (por exemplo, Leptinotarsa decemlineata (besouro do Colorado)), mariposas ou qualquer combinação dos mesmos, ou qualquer uma das outras espécies de inseto descritas no presente documento. Em outras modalidades, o inseto é moscavarejeira. Em outras modalidades, o inseto é pulgão. Em outras modalidades, o inseto é uma broca. Em outras modalidades, o inseto é um besouro. Em outras modalidades, o inseto é uma mariposa. Em outras modalidades, o método compreende aplicação direta da composição no inseto. Em outras modalidades, a composição é útil para eliminar pragas de animais agrícolas que incluem pragas de ovelha, gado, cabras, animais domésticos, tais como gatos, cães, pássaros, porcos e peixe. Em outras modalidades, a praga é resistente a pesticida de organofosfato (OP), carbamato (CM) e/ou piretroide/piretroide sintético (SP). Em outras modalidades,

o método par		eliminar pr	agas de inse	to conforn	te 1	..1st ado
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modalidades, o método é ecologicamente seguro.

[085] Em várias modalidades, esta invenção fornece um método para eliminar pragas que compreende inibir resistência ao organofosfato (OP), carbamato (CM) e/ou

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80/136 piretroide/piretroide sintético (SP) mediado pela carboxilesterase (CBE) em uma praga, sendo que o dito método compreende colocar um derivado de ácido borônico de acordo com esta invenção com a dita praga em combinação com um OP, CM e/ou SP. Em outras modalidades, a CBE é qualquer CBE dentro dos grupos de gene alfa, beta ou não microsomal, conforme descrito em Oakeshott, Claudianos, Campbell, Newcomb e Russell, Biochemical Genetic and Genomics of Insect Esterases, páginas 309 a 381, capítulo 10, volume 5, 2005, edições publicadas por Gilbert, latrou, Gill - Elsevier que está incorporada no presente documento a título de referência. Em outras modalidades, a CBE é homólogo de aE7. Em outras modalidades, a CBE é uma CBE de tipo selvagem ou uma CBE mutante ou combinação das mesmas. Em outras modalidades, a mutação na dita CBE mutante é aE7 Glyl37Asp. Em outras modalidades, a aE7 é LcaEl. Em outras modalidades, a CBE é a mutação equivalente em um homólogo de CBE. Em outras modalidades, o derivado de ácido borônico é um derivado de ácido aril-borônico, conforme descrito acima no presente documento. Em outras modalidades, o ácido borônico é um derivado de ácido fenil-borônico representado pela Fórmula I ou II descrita acima no presente documento. Em outras modalidades, o derivado de ácido borônico é selecionado a partir de compostos 1 a 8, PBA, 3,1 a 3,12, C2, CIO e C21 de scritos acima no presente documento; em que

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81/136 cada um é uma modalidade separada de acordo com esta invenção.

[086] Em várias modalidades, esta invenção fornece um método de potencialização de um pesticida de OP, CM e/ou SP que compreende colocar um derivado de ácido borônico, de acordo com esta invenção, em contato com uma praga: antes, após ou simultaneamente ao contato do pesticida de OP, CM e/ou SP com a praga.

[087] O recurso mais importante de resistência mediada por CBE é a alta afinidade de ligação ao OP. Os derivados de ácido borônico, de acordo com esta invenção, têm afinidade -100 vezes maior em comparação com OPs, desse modo, se permite superar a resistência de insetos ao OP.

[088] Em várias modalidades, esta invenção fornece um método para eliminar praga de resistência ao pesticida de organofosfato (OP), carbamato (CM) e/ou piretroide sintético (SP), que compreende inibir CBE na dita praga, colocando-se um derivado de ácido borônico desta invenção em contato com o inseto, antes, após ou simultaneamente ao contato do pesticida de OP, CM e/ou SP com a praga. Em outras modalidades, o derivado de ácido borônico é covalentemente ligado à CBE. Em outras modalidades, o derivado de ácido borônico é selecionado a partir de compostos 1 a 8, PBA, 3,1 a 3,12, C2, CIO e C21 descritos acima no presente documento; em que cada um é uma modalidade separada de acordo com esta

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82/136 invenção. Em outras modalidades, a CBE é aE7. Em outras modalidades, a CBE é homólogo de aE7. Em outras modalidades, a aE7 é aE7 de tipo selvagem (ou homólogo da mesma), aE7 mutante (ou homólogo da mesma) ou combinação das mesmas. Em outras modalidades, a mutação na dita aE7 mutante é Glyl37Asp ou mutação equivalente em um homólogo de aE7. Em outras modalidades, a aE7 é icaE7.

[089] Em outras modalidades, os métodos descritos acima no presente documento (em que cada método é uma modalidade separada), não são tóxicos a plantas. Em outras modalidades, os métodos não são tóxicos a mamíferos. Em outras modalidades, os métodos não são tóxicos a roedores. Em outras modalidades, os métodos não são tóxicos a pássaros. Em outras modalidades, os métodos não são tóxicos a animais. Em outras modalidades, os métodos não são tóxicos a. seres humanos. Em outras modalidades, os métodos são ecologicamente seguros.

[090] De acordo com a invenção descrita no presente documento, inibidores de ácido borônico picomolares de LcaEl foram rapidamente identificados, as relações de estrutura e atividade que auxiliaram a otimização de inibidor foram obtidas, e foi considerado que os compostos eliminaram resistência a inseticida de OP em uma praga agrícola importante. Talvez o recurso mais importante de resistência mediada por CBE seja a alta afinidade de ligação ao OP.

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Resistência foi superada desenvolvendo-se inibidores que têm afinidade -100 vezes maior em comparação com OPs, com o uso de arcabouços de ácido borônico seletivos e relativamente leves.

[091] Inseticidas permanecem como a primeira medida para controle de pragas agrícolas, tal como a mosca-varejeira de ovelha, assim como vetores de doença, tais como mosquitos. A constante evolução de resistência a pesticida em quase todas as espécies torna o desenvolvimento de novas abordagens para prevenir ou abolir resistência de grande importância. Embora haja esperança para o desenvolvimento de novos pesticidas, há um número finito de alvos bioquímicos e o uso de agentes sinérgicos para knockout dos mecanismos de resistência e restaurar a eficácia de inseticidas de OP é uma estratégia alternativa viável. Nesse trabalho, CBEs, que foram associadas a mais de 50 casos de resistência a pesticida durante os últimos 50 anos, foram alvejadas. A observação de que uma mutação de Gly>Asp em uma posição equivalente para 137 em outras pragas de inseto, e a conservação de sequência relativamente alta de CBEs de inseto metabólicas, sugere que os agentes sinérgicos, tais como aqueles desenvolvidos no presente documento poderíam ter atividade de espectro amplo contra uma faixa de espécies de inseto. Um benefício adicional de agentes sinérgicos de derivados de ácido borônico é a potencial proteção da

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84/136 evolução de resistência. Visto que derivados de ácido borônico são análogos de estado de transição para a fosforilação da serina catalítica por inseticidas de OP, mutações que prejudicam a ligação de derivados de ácido borônico provavelmente também perturbarão sequestro e/ou hidrólise de OP.

[092] Os inibidores de CBE potentes e seletivos relatados no presente documento representam um marco no uso de exame virtual para constatação de inibidor no contexto de combate à resistência a pesticida. Inibidores à base de ácido borônico de alta afinidade de uma enzima de resistência chave foram identificados, e o entendimento das relações de estrutura e atividade gerais que fundamentam a eficácia de derivados de ácido borônico com hidrolases de serina foi desenvolvido, o que facilita a otimização de inibidor. A demonstração de que os compostos abolem de maneira eficaz a resistência a inseticida de OP em L. cuprina, sem toxicidade significativa por si só ou inibição significativa de enzimas humanas, estabelece a viabilidade dessa abordagem focada em agente sinérgico para combater resistência a pesticida e restaurar a eficácia de classes de pesticida existentes. O aumento substancial na eficácia de inseticida permitiría o uso de pesticida mais sustentável e reduz efeitos de pesticida relacionados a saúde e ambiente fora do alvo.

[093] Os exemplos a seguir são apresentados em ordem

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85/136 para ilustrar completamente as modalidades preferenciais da invenção. Os mesmos não devem ser de forma alguma interpretados, contudo, como limitação ao escopo amplo da invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Exame Virtual de Compostos de Ácido Borônico [094] Um projeto computacional de inibidores covalentes potentes e seletivos de aE7 foi conduzido com o uso de DOCKovalent. DOCKovalent é um método geral para testar grandes bibliotecas virtuais para a constatação de inibidores covalentes específicos (London, N. et al. Covalent docking of large libraries for the discovery of chemical probes. Nat. Chem. Biol. 10, 1.066 a 72 (2014) e London, N. et al. Covalent docking predicts substrates for haloalkanoate dehalogenase superfamily phosphatases. Biochemistry 54, 528 a 537 (2015).). DOCKovalent foi usado para testar uma biblioteca de 23.000 ácidos borônicos contra a estrutura cristalina de LcaE7 (coordenadas correspondem ao código do banco de dados de proteína (www.rcsb.org; PDB) 4FNG) . Dado como entrada, um modelo estrutural do alvo proteico com um resíduo nucleofílico, e uma biblioteca de ligantes eletrofílicos de pequena molécula, esse protocolo amostra exaustivamente todas as conformações de ligante com relação a uma ligação covalente para o nucleófilo alvo.

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Conformações de ligante são pontuadas com o uso de uma função de pontuação à base de física, que avalia as interações de van der Waals e eletrostát icas do ligante com o alvo proteico, e corrige o dissolvimento de ligante (Mysinger, M. M. e Shoichet, B. K. Rapid context-dependent ligand desolvation in molecular docking. J. Chem. Inf. Model. 50, 1.561 a 73 (2010).). DOCKovalent foi aplicado na estrutura cristalina de LcaEl para buscar novos inibidores covalentes de alvo inseticida.

[095] LcaEl cataliza a hidrólise de substratos de ácido graxo por meio do mecanismo de hidrolase de serina canônica. Ácidos borônicos são conhecidos por formar adutos covalentes reversíveis na serina catalítica de hidrolases de serina, que imitam a geometria do estado de transição para hidrólise de carboxiléster e, portanto, se ligam com alta afinidade. DOCKovalent, um algoritmo para testar inibidores covalentes, foi usado para testar uma biblioteca de 23.000 ácidos borônicos contra a estrutura cristalina de LcaEl (código de PDB 4FNG).

[096] O aduto tetraédrico formado quando uma coordenada de ácido borônico para a serina catalítica é um análogo de estado de transição putativa para hidrólise de éster. Cada ácido borônico foi modelado como uma espécie tetraédrica covalentemente ligada à serina catalítica (Ser218). Após aplicar o protocolo de acoplagem covalente,

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87/136 os 2% superiores da biblioteca classificada foram manualmente examinados, e cinco compostos classificados entre 8 e 478 (Figura 2A a J) foram selecionados para teste com base em pontuação de encaixe, eficiência de ligante, diversidade molecular, representação correta da molécula e cepa interna (energia interna de ligante não é parte da função de pontuação) (Compostos 1 a 5) . Adicionalmente, posturas foram selecionadas nas quais hidroxila do ácido borônico foi previsto por ocupar o buraco de oxiânion).

Detalhes Experimentais:

[097] DOCKovalent é uma adaptação covalente de DOCK3.6. Dado um conjunto pré-gerado de conformação de ligante e um ponto de ligação covalente, o mesmo amostra exaustivamente posturas de ligante ao redor da ligação covalente e seleciona a postura de energia mais baixa com o uso de uma função de energia à base de física que avalia interações de Van der Waals e eletrostáticas, assim como penaliza para dissolvimento de ligante. Para o encaixe realizado nesse trabalho, uma biblioteca de ácidos borônicos de 23.000 compostos comercialmente disponíveis, foi usada.

[098] Preparação de receptor: Código de PDB 4FNG foi usado para o encaixe. Ser218 foi desprotonado para acomodar o aduto covalente e a carga parcial Ογ foi ajustada para representar uma forma ligada. His471 foi representada em sua forma duplamente protonada.

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88/136 [099] Postura encaixada de ácidos borônicos usada para exame virtual: O ácido borônico foi covalentemente ligado à serina catalítica (Ser218). A histidina catalítica (His471) foi representada em sua forma duplamente protonada. A ligação Β-Ογ foi definida em 1,5 ± 0,1 Â e o ângulo de ligação Οβ-Ογ-Β foi definido em 116,0 ± 5^o e o ângulo de ligação Ογ-Β-R foi definido em 109,5 ± 5^o. Na seleção manual de composto para teste, preferência foi dada aos compostos em que nenhuma das hidroxilas de ácido borônico ocupou o buraco de oxiânion (formado pelos nitrogênios de estrutura principal de Glyl36, Glyl37 e Ala219).

[100] Seleção de candidato: as 500 moléculas superiores da lista de encaixe classificadas, ordenadas pela eficiência de ligante calculada (pontuação de encaixe dividida pelo número de átomos pesados) foram manualmente inspecionadas por critérios de exclusão com base em considerações que são ortogonais na função de pontuação de encaixe, tal como inovação dos compostos, diversidade, disponibilidade comercial, representação correta da molécula, cepa interna (energia interna de ligante não é parte da função de pontuação). Adicionalmente, posturas nas quais qualquer uma das hidroxilas de ácido borônico é prevista para ocupar o buraco de oxiânion foram selecionadas.

Exemplo 2

Inibidores Potentes e Seletivos de aE7 de tipo selvagem

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89/136 [101] LcaEl de tipo selvagem foi heterologamente expressa em Escherichia coli e purificada com o uso de afinidade de ion de metal e cromatografia por exclusão de tamanho. A potência dos ácidos borônicos foi determinada por ensaios enzimáticos de LcaEl recombinante com o modelo butirato de 4-nitrofenol de substrato de carboxiléster. Todos os cinco compostos de ácido borônico 1 a 5 exibiram valores de Kí inferiores a 12 nM (Tabela 1), em que o composto mais potente (3) exibe um valor de Kí de 250 pM. Embora os cinco compostos sejam diversos, todos compartilham uma subestrutura de ácido fenilborônico (PBA), que inibe LcaEl com um valor de Kí aproximadamente 2 a 3 ordens de magnitude menor que os compostos projetados (210 nM) . Em comparação com a inibição nanomolar de LcaEl, PBA exibe inibição micromolar a milimolar de outras hidrolases de serina.

(Por exemplo, protease α-lítica, (Kettner, C. a, et al. Kinetic properties of the binding of a-lytic protease to peptide boronic acids. Biochemistry 27, 7.682 a 7688 (1988).). Os valores de 10 a 1.000 vezes menores de K± dos compostos encaixados (e a maior eficiência de ligante), indicam que os substituintes fenilborônicos identificados pelo exame virtual são importantes para ligação de alta afinidade. Embora aE7 seja conhecida por ser uma enzima promíscua (Correy, G. J. et al. Mapping the Accessible Conformational Landscape of an Insect Carboxylesterase Using

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Conformational Ensemble Analysis and Kinetic Crystallography. Structure 24, 1 a 11 (2016)), a potência de todos os compostos selecionados a partir do exame virtual sugere que o sítio de ligação de aE7 tem capacidade para acomodar um conjunto estruturalmente diverso de compostos com pouca similaridade com o substrato nativo da enzima.

Tabela 1: Classificaçao de encaixe, inibição de LcaEl in vitro e seletividade de compostos 1 a 5 e ácido fenilborônico (PBA).

		Kí (nM)	Viabilidade IC50 (μΜ)
Comp.	Class if ica ção de encai xe	LcaEl de tipo selvag em	LcaEl Glyl37As P	Ee AChE^b	Trips ina^b	AmpC	MDA-MB231^c	HB2^C
PBA	-	210 (270 a 260)	450 (370 a 550)	> 10 mM	-	-	-	-
1	8	12 (9 a 16)	49 (42 a 56)	> 1 mM	>0,1 mM	216	> 100	100
2	169	2,9 (2,2 a 3,8)	29 (27 a 32)	> 0,3 mM	>0,1 mM	380	> 100	20,5
3	202	0,25 (0,22 a 0,28)	110 (97 a 130)	0,27 mM	>0,1 mM	60	> 100	100
4^a	210	7, 2 (6,0 a 8, 7)	190 (160 a 230)	> 1 mM	> 10 μΜ	104	> 100	100
5	478	11 (9 a 13)	170 (140 a 190)	>0,1 mM	>0,1 mM	220	> 100	77, 8

^a Valores nos parênteses representam o intervalo de

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91/136 confiança de 95% no K±. 0 K± foi calculado de acordo com a equação de Cheng-Prusoff a partir de uma curva de resposta à dose com três medições de repetição (da técnica) de atividade enzimática em cada concentração de composto.

^b Compostos foram testados para seu limite de solubilidade.

^c Viabilidade celular após incubação de 48 h com os compostos foi avaliada com o uso de Cell Titer Glo. Consultar a Figura 13 para curvas de resposta à dose completas.

[102] Para caracterizar a seletividade de ácidos borônicos 1 a 5, os mesmos foram testados contra AChE, o alvo de inseticidas de OP e carbamato (Tabela 1), assim como tripsina e β-lactamase de AmpC bacteriana. Nenhum dos cinco compostos mostrou inibição significativa de AChE quando testados até seus limites de solubilidade (Tabela 1), com o composto mais potente 3 que exibe seletividade >10⁶ vezes para LcaEl sobre AChE. Composto 3 foi adicionalmente testado contra um painel de 26 proteases serina ou treonina humanas (Tabela 2 e 3). A uma concentração de composto de 100 μΜ (10⁴vezes maior que o Kí para LcaEl), apenas 3 das 26 proteases foram inibidas em mais que 50% e mesmo essas tiveram atividade residual de pelo menos 30%. A toxicidade dos ataques contra duas linhas celulares humanas foi adicionalmente avaliada. Nenhum dos cinco compostos foi tóxico para células de MDA-MB-231 até 100 μΜ, e apenas os

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92/136 compostos 2 e 5 mostraram toxicidade limitada contra células HB-2 em concentrações relativamente altas (IC50 = 20,5 μΜ e 77,8 μΜ respectivamente; Tabela 1 e Figura 13) . Em geral, esses dados estabelecem que os compostos são altamente seletivos para seu alvo com efeitos fora do alvo mínimos.

Tabela 2. Agentes sinérgicos sao seletivos sobre proteases humanas.

Protease	3 ^a	3, 9 ^a	3,10 ^a
DPP 4	6	2	-3
DPP 8	42	53	37
DPP 9	45	75	71
Fator VII	15	26	53
Fator-Xa	53	26	35
Furina	1	-2	-5
Granzima A	12	23	12
Granzima B	3	17	11
Granzima K	5	14	3
HTRA2	23	28	2
Kallikreinll	-71	-148	-43
Kallikreinl3	3	-1	0
Matriptase	-1	5	4
Plasma-Calicreina	6	41	64
Plasmina	13	16	-2
Oligopeptidase de Prolila	61	48	30
PSMB5	3	34	2
PSMB6	16	54	27
PSMB7	39	70	48
PSMB8	19	52	49

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PSMB9	12	50	15
PSMB10	43	78	45
Espinesina	26	13	34
Trombina	32	54	58
tPA	26	40	19
uPA	67	40	32

^a Inibição % média de protease a 100 μΜ do composto de ácido borônico indicado (η = 2). Inibição > 50% é marcada em vermelho.

[103] Para caracterizar a seletividade de ácidos borônicos 1 a 5, os mesmos foram testados contra o alvo de inseticidas de OP, AChE, assim como tripsina e β-lactamase de AmpC bacteriana (Tabela 1) . AChE e aE7 são homólogos, compartilham a dobra de a/β-hidrolase e a mesma maquinaria catalítica, no entanto, a topologia de seus bolsos de ligação

é diferente	(Jackson, C. J. et	al. Structure and	function of
an insect a	-carboxylesterase	(aEsterase7) associated with
insecticide	resistance. Proc.	Natl. Acad. Sci.	E.U.A. 110,
10.177 a 82	(2013) e Correy,	_r G. J. et al.	Mapping the
Accessible	Conformational	Landscape of	an Insect

Carboxylesterase Using Conformational Ensemble Analysis and Kinetic Crystallography. Structure 24, 1 a 11 (2016) .) . Tanto tripsina quanto β-lactamase de AmpC contêm um buraco de oxiânion e nucleófilo de serina ativada, no entanto tripsina contém um ácido serina-histidina-aspártico (Hedstrom, L. Serine protease mechanism and specificity. Chem. Rev. 102,

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4501-4523 (2002). ) enquanto β-lactamase de AmpC contém uma tríade de serina-tirosina-lisina catalítica (Dubus, A., et al. The roles of residues Tyrl50, Glu272, and His314 in class C β- lactamases. Proteins Struct. Funct. Genet. 25, 473 a 485 (1996).). Embora os ácidos borônicos fossem inibidores fracos de AChE e tripsina, os mesmos exibem inibição nanomolar de β-lactamase de AmpC (Tabela 1). Essa ligação de afinidade relativamente alta pode refletir a natureza exposta da tríade catalítica de β-lactamase de AmpC em comparação com AChE e tripsina, e a inibição geralmente potente de nucleófilos de serina ativada por ácidos borônicos. Apesar dessa reatividade cruzada, o composto 3 exibiu seletividade de 240 vezes para aE7 sobre β-lactamase de AmpC, e seletividade de mais de 10⁶ vezes sobre AChE ou tripsina.

Detalhes Experimentais:

Expressão e Purificação Enzimática [104] Proteínas marcadas com Hise foram expressas em BL21(DE3) E. coli (Invitrogen) a 26 °C por 18 horas. Células foram coletadas por centrifugação, ressuspensas em tampão de lise (300 mM de NaCl, 10 mM de imidazol, 50 mM de HEPES, pH 7,5) e lisadas por sonicação. Resíduos celulares foram pelorizados por centrifugação e a fração solúvel foi carregada em uma coluna de Ni-Sefarose HisTrap-HP (GE Healthcare). Proteína ligada foi eluída com tampão de lise

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95/136 complementado com 300 mM de imidazol. As frações que contêm a proteína eluída foram concentradas com um concentrador de centrifugação de corte de massa molecular de 30 kDa (Amicon) e carregadas em uma coluna de exclusão por tamanho HiLoad 26/60 Superdex-200 (GE Healthcare) pré-equilibrada com 150 mM de NaCl, 20 mM de HEPES, pH 7,5. As frações eluídas que contêm a proteína monomérica foram agrupadas para ensaios de inibição enzimática ou cristalização. A concentração de proteína foi determinada medindo-se a absorção a 280 nm com um coeficiente de extinção calculado com o uso do servidor online Protparam (Gasteiger, E. et al . Protein Identification and analysis tools on the ExPASy server. Proteomics Protoc. Handb. 571 a 607 (2005). doi:10.1385/1 59259-890-0:571) .

Ensaios de Inibição Enzimática [105] Inibição de αΕ7 de tipo selvagem e da variante de aE7 Glyl37Asp foi determinada por um ensaio de competição entre o análogo de substrato nativo butirato de 4-nitrofenol (Sigma) e os compostos de ácido borônico. Inicialmente, a constante de Michalis (Km) com butirato de 4-nitrofenol foi medida para ambas as enzimas para determinar uma concentração apropriada de substrato para uso nos ensaios de competição. A formação do produto de 4-nitrofenolato de hidrólise foi monitorada em 405 nm na presença de enzima e oito diferentes concentrações de substrato. O butirato de 4-nitrofenol foi

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96/136 preparado em metanol para 100 mM e diluído em série de 1 em 2 para atingir concentrações de 100 mM a 0,8 mM. Estoques de enzima foram preparados em 4 mg/ml de albumina sérica bovina (Sigma) para manter a estabilidade enzimática. Reações foram preparadas pipetando-se 178 μΐ de tampão de ensaio (100 mM de NaCl, 20 mM de HEPES, pH 7,5) e 2 μΐ de substrato (concentrações finais de 1.000 a 8 μΜ) em 300 μΐ de poços de uma placa de 96 poços. A reação foi iniciada pela adição de 20 μΐ de enzima (concentração final de 2,5 nM para aE7 de tipo selvagem e 4 nM para aE7 Glyl37Asp) . A formação de produto foi monitorada por quatro minutos em temperatura ambiente com o uso de um espectrofotômetro de microplaca Epoch (BioTek) e as taxas iniciais de hidrólise de éster foram determinadas por regressão linear com o uso de GraphPad Prism. A constante de Michalis foi determinada encaixandose as taxas iniciais na equação de Michalis-Menton (Figura 10) .

[106] A inibição enzimática com os compostos de ácido borônico foi determinada avaliando-se a taxa inicial de hidrólise de butirato de 4-nitrofenol na presença de DMSO liquido ou dos compostos de ácido borônico em DMSO. Compostos foram preparados diluindo-se em série de 1 em 3 um estoque de 10 mM inicial para alcançar concentrações de 10 mM a 2 nM. Reações foram preparadas pipetando-se 178 μΐ de tampão de ensaio complementado com substrato em uma concentração

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97/136 final igual à Km da enzima (15 μΜ para aE7 de tipo selvagem e 250 μΜ para aE7 Glyl37Asp) em poços de uma placa de 96 poços. 2 μΐ de DMSO líquido ou 2 μΐ de inibidor diluído em série (concentrações finais de 100 μΜ a 20 pM) foram adicionados aos poços. A reação foi iniciada pela adição de 20 μΐ de enzima (concentração final de 0,5 nM para aE7 de tipo selvagem e 10 nM para aE7 Glyl37Asp) . A formação de produto foi monitorada por quatro minutos em temperatura ambiente e as taxas iniciais de hidrólise de éster foram determinadas por regressão linear. Para determinar a concentração de compostos de ácido borônico necessária para inibir 50% de atividade de esterase (IC50), uma curva de resposta à dose sigmoidal de quatro parâmetros foi encaixada em inibição percentual com o uso de GraphPad Prism (Figuras 7 e 8) . Valores de Ka foram determinados com o uso da equação de Cheng-Prusoff que assume a inibição competitiva (YungChi, C. e Prusoff, W. H. Relationship between the inhibition constant (KI) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (150) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 22, 3.099 a 3.108 (1973)).

Seletividade de AChE [107] Inibição de AChE de Electrophorus electricus (Tipo V-S, Sigma) por ácido fenilborônico e compostos 1 a 5 foi determinada com 0 uso do método descrito por Ellman et. al. (A new and rapid colorimetric determination of

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98/136 acetylcholinesterase activity. Biochem. Pharmacol. 1, 88 a 95 (1961)) . Inicialmente, a Km para AChE com o substrato acetiltiocolina foi determinada monitorando-se produção de tiocolina com ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico) (DTNB) a 412 nm. Acetiltiocolina foi preparada em tampão de ensaio (100 mM de NatbPCq, pH 7,4) em 10 mM e diluída em série de 1 em 2 para alcançar concentrações de 10 mM a 0,08 mM, enquanto AChE foi preparada em 20 mM de NaH2PO4, pH 7,0, complementada com 4 mg/ml de BSA para 0,4 nM. Reações foram preparadas pipetando-se 160 μΐ de tampão de ensaio (complementado com DTNB para uma concentração final de 300 μΜ) e 20 μΐ de acetiltiocolina (1.000 para 7,8 μΜ de concentração final) em poços de uma placa de 96 poços. A reação foi iniciada pela adição de 20 μΐ de AChE (40 pM de concentração final) . A formação de produto foi monitorada por seis minutos em temperatura ambiente e as taxas iniciais de hidrólise de tioéster foram determinadas por regressão linear com o uso de GraphPad Prism. A constante de Michalis foi determinada como antes (Figura 10).

[108] Inibição de AChE foi determinada avaliandose a taxa inicial de hidrólise de acetiltiocolina na presença de DMSO liquido ou dos compostos de ácido borônico em DMSO. Compostos foram preparados preparando-se diluições em série de 1 em 3 de 1 M de estoques para alcançar concentrações de 1 M a 627 nM. Reações foram preparadas pipetando-se 178 μΐ

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99/136 de tampão de ensaio complementado com acetiltiocolina (para uma concentração final de 100 μΜ) e DTBN (para uma concentração final de 300 μΜ) em poços de uma placa de 96 poços. 2 μΐ de DMSO liquido ou 2 μΐ de inibidor diluído em série (concentrações finais de 100 mM a 6,27 nM) foram adicionados aos poços. A reação foi iniciada pela adição de 20 μΐ de enzima (concentração final de 40 pM). A formação de produto foi monitorada por seis minutos em temperatura ambiente e as taxas iniciais de hidrólise de tioéster foram determinadas por regressão linear. Valores de IC50 e Kí foram determinados conforme descrito anteriormente (Figura 9).

Painel de Seletividade de Protease [109] Compostos foram testados para inibição de um painel de 26 proteases de Ser/Thr em uma concentração de ponto único de 100 μΜ em duplicatas por NanoSyn (Santa Clara, CA) . Consultar a Tabela 3 para condições de ensaio. Compostos de teste foram dissolvidos em 100% de DMSO para produzir 10 mM de estoque. A concentração final de composto em ensaio é de 100 mM. Compostos foram testados em poços duplicados em concentração única e a concentração final de DMSO em todos os ensaios foi mantida em 1%. Cinco compostos de referência, AEBSF, Carfilzomibe, Inibidor II de Granzima B, Dec-RVKR-CMK e bromidrato de teneligliptina, foram testados de uma maneira idêntica com 8 pontos de concentração em diluições de 5x.

Tabela 3. Painel de Seletividade de Protease

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Alvo	Forneced or	N^a de Lote	[Enzima] , nM	Substrato	Tempo de Incuba ção (h)
DPP4	ENZO	2021206	0,369	RPAGARK	1,5
DPP8	ENZO	2281220	0,5	RPAGARK	1,5
DPP9	ENZO	7221432	0,3125	RPAGARK	1,5
Fator VII^a	ReD Systems	NJX0716 031	38,6	BOC-VPA-AMC	0,3
Fator Xa	Calbioch em	B76791	20	VMIAALPRTMFIQRR	5
Furina	ReD Systems	INK0250 61	16	LRRVKRSLDDA	6
Granz im a A	ENZO	1106141 1	30	PRTLTAKK	5
Granz im a B	ENZO	9161556	0,493	IEPDSGGKRK	5
Granz im a K	ENZO	L27095	40	RPAGARK	5
HTRA2	ReD Systems	HVL1015 111	76, 1	Fluorosceina de Caseina	3
Calicre ina ll^b	ReD Systems	MZV0116 081	0,032	BOC-VPA-AMC	3
Calicre ina 13^c	ReD Systems	NXS0117 021	8,9	BOC-VPA-AMC	0,2
Matript ase	ReD Systems	PZZ0916 101	0,3134	BOC-QAR-AMC	0,5
Plasma- Calicre ina	ReD Systems	NVH0111 081	1,5	ARDIYAASFFRK	1
Plasmin a^d	ReD Systems	MQB0411 091	2	KHPFHLVIHTKR	2
Oligope ptidase de Prolila	ReD Systems	QBQ0212 Oil	0,1	VMIAALPRTMFIQRR	2

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Alvo	Forneced or	N^a de Lote	[Enzima] , nM	Substrato	Tempo de Incuba ção (h)
PSMB5	BOSTON- BIOCHEM	2111851 5B	0,8	TYETFKSIMKKSPF	1, 75
PSMB6	BOSTON- BIOCHEM	2111851 5B	1	GLTNIKTEEISEVNL DAEFRKKRR	3,75
PSMB7	BOSTON- BIOCHEM	2111851 5B	0,24	GRSRSRSRSR	2
PSMB8	BOSTON- BIOCHEM	0472001 7A	0,8	TYETFKSIMKKSPF	4,5
PSMB9	BOSTON- BIOCHEM	0472001 7A	1	GLTNIKTEEISEVNL DAEFRKKRR	3,75
PSMB10	BOSTON- BIOCHEM	0472001 7A	2	GRSRSRSRSR	2
Espines ina^b	ReD Systems	NOS0317 01A	8, 721	BOC-QAR-AMC	0,5
Trombin a	ReD Systems	HWO0413 121	1	PRTLTAKK	1,5
tPA	ReD Systems	DATN021 2041	9	VMIAALPRTMFIQRR	6
uPA	ReD Systems	HKY0112 041	6,5	ADFVRAARR	3

^a Ensaio	em cascata onde a	enzima foi	ativada primeiro
por Termolisina e depois por Fator III. ^b Ensaio em cascata onde a enzima	foi ativada por
Termolisina. ^c Ensaio	em cascata onde	a enzima	foi ativada por
Endopeptidase ^d Ensaio	de Lisila. em cascata onde a	enzima foi	ativada por 0,04x

de uPA.

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Ensaios de Toxicidade Celular [110] Uma série de respostas à dose dupla de sete pontos com 100 uM como o limite superior e um ponto de controle de DMSO apenas foi gerada com o uso de um manipulador de líquido Echo 550 (Labcyte Inc.) em placas de 384 poços. Subsequentemente, as linhas de célula da mama humana MDA-MB-231 (tumorigênicas) e HB2 (não tumorigênicas) foram semeadas (1.000 células/poço) com o uso de uma combinação de múltiplas gotas (Thermo Fisher Scientific) sobre os compostos. Placas foram, então, incubadas a 37 °C e 5% de CO2 por 48 horas, após isso a viabilidade celular foi avaliada adicionando-se CellTiter-Glo® (Promega) à reação. O sinal de luminescência foi medido em um leitor de placa de múltiplos modos Pherastar FS (BMG Labtech).

Exemplo 3

Validação de Postura de Encaixe [111] As estruturas cocristalinas de ácidos borônicos 1 a 5 com LcaEl foram solucionadas de modo a avaliar as posturas de ligação previstas por DOCKovalent (Figura 2). As estruturas cocristalinas foram solucionadas com aE7-4a, uma variante de aE7 que cristaliza (Jackson, C. J. et al. Structure and function of an insect αcarboxylesterase (aEsterase7) associated with insecticide resistance. Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 110, 10.177 a 2 (2013) e Fraser, N. J. et al. Evolution of Protein Quaternary

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Structure in Response to Selective Pressure for Increased Thermostability. J. Mol. Biol. 428, 2.359 a 2.371 (2015).). Mapas de densidade de elétron de diferença do sitio ativo calculados antes de colocação de ligante mostram os compostos de ácido borônico covalentemente ligados à serina catalítica (Figura 2) . A orientação do anel aromático proximal é conservada através de todos os cinco compostos, o que indica que a topologia de bolso de ligação implica um modo de ligação conservada apesar da diversidade estrutural dos compostos. Todos os ácidos borônicos ocupam o maior dos dois subsítios de bolso de ligação LcaEl, que accomoda uma cadeia de ácido graxo do substrato de lipídio nativo previsto²⁷. Os anéis distais de compostos 2, 3 e 5 são projetados em direção ao funil que leva ao sítio ativo. Tanto o bolso de ligação quanto o funil são revestidos por resíduos hidrofóbicos; a topologia do subsítio maior é definida por Trp251, Phe355, Tyr420, Phe421, Met308 e Phe309. O encaixe dos ácidos borônicos no bolso de ligação varia com o modelo de substituição; a 3,5-dissubstituição de composto 3 é altamente complementar enquanto a disposição 3,4dissubstituída dos compostos restantes resulta em disposição subideal dependende do tamanho de substituinte relativo (Figura 2) .

[112] O alinhamento das estruturas cocristalinas com a estrutura de apo LcaEl mostra menor redisposição

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104/136 estrutural nos complexos inibidores de enzima. A geometria do buraco de oxiânion, e ligação de hidrogênio interna na tríade catalítica, é retida. As diferenças estruturais incluem uma comutação na orientação da cadeia lateral de Tyr457, que oclui o menor subsítio do bolso de ligação de LcoCEl, e foi anteriormente notado por ocorrer após ligação de OP. (Correy, G. J. et al. Mapping the Accessible Conformational Landscape of an Insect Carboxylesterase Using Conformational Ensemble Analysis and Kinetic Crystallography. Structure 24, 1 a 11 (2016)) . A orientação da cadeia lateral de Met308 é heterogênea, com conformações alternativas modeladas nas estruturas cocristalinas de 2, 3, 4 e 5. De maneira interessante, a geometria de coordenação dos ácidos borônicos nos vários complexos cristalinos variou entre ser tetraédrica ou plana trigonal (Figura 4 e Figura 12). Compostos 2 e 5 parecem ser planos trigonais, enquanto 1 e 4 foram melhor modelados como adutos tetraédricos. A diferença em geometria reflete os dois estados de coordenação possíveis de ácidos borônicos; seja tetraédrica com hidróxidos ou plana trigonal com um hidroxido (Figura 4). A geometria plana trigonal permitiu ligação de hidrogênio mais favorável com o buraco de oxiânion; em média, a distância de ligação de hidrogênio foi de 2,7 Â para espécies planas trigonais contra 3,0 Â para as espécies tetraédricas.

Exemplo 4

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105/136

Cristalização de AcaE7-4a Com Mutações de Superfície [113] Para determinar se as mutações internas presentes na variante de aE7 usada para cristalização tiveram um efeito sobre a ligação de inibidor, as mutações de superfície de LcaE7-4a foram introduzidas no gene de tipo selvagem e testadas para cristalização. Duas mutações (Lys530Glu e Asp83Ala) foram suficientes para permitir cristalização, provavelmente através da introdução de uma ponte salina intermolecular (Lys530Glu), e remoção de uma carga em uma interface de embalagem cristalina (Asp83Ala). A comparação das duas estruturas indica que as mutações internas não tiveram efeito observável sobre a ligação do composto 3, com alterações estruturais limitadas a uma pequena alteração na embalagem de Tyr420 e Phe421 como resultado da mutação de Ile419Phe. Isso confirma que as posturas de ligação capturadas nas estruturas cocristalinas correspondem às posturas de ligação em aE7 de tipo selvagem. Mapas de densidade de elétron de diferença calculados com as espécies de boro trigonais ou tetraédricas confirmam que o composto 3 coordena como uma espécie plana trigonal (Figura 12) .

Detalhes Experimentais:

Determinação de Cristalização e Estrutura [114] Cocristais de compostos 1 a 5 com a variante de LcaEl termoestável {Jackson, C. J. et al. Structure and

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106/136 function of an insect α-carboxylesterase (aEsterasel) associated with insecticide resistance. Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 110, 10.177 a 2 (2013) e Fraser, N. J. et al. Evolution of Protein Quaternary Structure in Response to Selective Pressure for Increased Thermostability. J. Mol. Biol. 428, 2.359 a 2.371 (2015).) (LcaEl-4a) (código de PDB 5TYP, 5TYO, 5TYN, 5TYL e 5TLK) e composto 3,10 com icaE7-4a Glyl37Asp (código de PDB 5TYM) foram cultivados com o uso do método de difusão a vapor de gota suspensa. Soluções em reservatório contiveram 100 mM de acetato de sódio (pH 4,6 a 5,1) e 15 a 26% de éter monometílico (MME) de PEG 2000 ou MME de PEG 550. Inibidores preparados em DMSO foram incubados com proteína (7 mg/ml in 75 mM NaCl e 10 mM HEPES pH 7,5) para alcançar uma razão estequiométrica de inibidor para composto de 5:1. Gotas suspensas foram definidas com 2 μΐ de reservatório e 1 μΐ de proteína com cristais de formação de um dia para o outro a 19°C. Para crioproteção, os cristais foram brevemente imersos em uma solução que contém a solução de reservatório de gota suspensa com a concentração de PEG aumentada em 35% e, então, vitrificados a 100 K em uma corrente gasosa de nitrogênio.

[115] Dados de difração foram coletados a 100 K na linha de feixe MX1 ou MX2 no Síncotron Australiano com o uso de um comprimento de onda de 0,954 Â. Dados foram indexados, integrados e escalonados com o uso de XDS (Kabsch, W. XDS.

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Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 66, 125 a 132 (2010).). Dados de alta resolução foram excluídos quando ο coeficiente de correlação entre conjuntos de metade de dados aleatórios (CC1/2) (Karplus, P. A. e Diederichs, K. Linking crystallographic model and data quality. Science 336, 1.030 a 3 (2012) e Diederichs, K. e Karplus, P. A. Better models by discarding data? Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 69, 1.215 a 22 (2013).) diminuíram abaixo de 0,3 no invólucro de resolução mais alta. Fases foram obtidas por substituição molecular pelo programa Phaser (McCoy, A. J. et al. Phaser crystallographic software. J. Appl. Crystallogr. 40, 658 a 674 (2007)) com o uso das coordenadas de apo-ic(XE7-4a (código de PDB 5CH3) como o modelo de busca. O modelo inicial foi melhorado através de construção de modelo interativo com COOT (Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G. e Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 66, 486 a 501 (2010)) e refinamento com fenix.refine (Afonine, P. A. et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix. refine . Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 68, 352 a 367 (2012)). Coordenadas de inibidor e restrições foram geradas com eLBOW (Adams, P. D. et al. PHENIX: A comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 66, 213 a 221 (2010) .

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108/136 [116] Para determinar se as mutações presentes no LcaE7-4a termoestável influenciaram a orientação ou modo de ligação de inibidor, as mutações de superfície presentes em AcaE7-4a (Asp83Ala e Lys530Glu) foram introduzidas no antecedente de tipo selvagem e a proteína foi testada para cristalização. Duas mutações (Lys530Glu e Asp83Ala) foram suficientes para permitir cristalização nas mesmas condições, conforme descrito anteriormente (código de PDB 5TYM) (Figura 12 e Figura 15).

Exemplo 5

Inibidores potentes de aE7 Glyl37Asp [117] Os dois mecanismos de resistência a inseticida mediados por CBE mais comuns envolvem expressão de proteína aumentada, ou mutação para ganhar novas funções catalíticas (hidrolase de OP) . Compostos 1 a 5 foram testados contra a variante de ΑσαΕ7¹⁷'²? Glyl37Asp associada a resistência (Tabela 1). A mutação Glyl37Asp está localizada no buraco de oxiânion e posiciona uma nova base geral no sítio ativo para catalizar defosforilação da serina catalítica. Assim, compostos que inibem LcaEl de WT, assim como essa variante de Glyl37Asp associada a resistência aumentaria a eficácia de OPs alvejando-se ambas as rotas de desintoxicação. Encorajados pela atividade dos ácidos borônicos 1 a 5, os compostos foram testados contra a variante de Glyl37Asp de LcaEl (Tabela 1).

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109/136 [118] O composto mais potente foi 2, que exibe Kí de 29 nM. A razão do valor de Kí de tipo selvagem para Glyl37Asp, normalizada pela diferença em potência de PBA, indica recursos estruturais que são tolerados pela cadeia lateral de Aspl37 (Tabela 1). A afinidade diminuída de todos os compostos para LcaEl Glyl37Asp sugere que a cadeia lateral de Aspl37 seja impeditiva de ligação. Isso é consistente com a afinidade superior de ambos os substratos de OP e carboxiléster para aE7 de tipo selvagem com relação a AcaE7²⁷Glyl37Asp. A tolerância de compostos 1 e 4 por aE7 Glyl37Asp pode refletir sua natureza relativamente compacta, enquanto o ligante flexível que conecta os anéis proximal e distai de compostos 2 e 5 pode permitir que esses compostos evitem interações desfavoráveis com a cadeia lateral de Aspl37. A rigidez do substituinte de pirridinila do composto 3 pode explicar o motivo desse composto ser um fraco inibidor de LcaEl Glyl37Asp.

Exemplo 6

Inibição de aE7 Glyl37Asp otimizada [119] Para melhorar inibição de Glyl37Asp enqaunto se mantém boa potência de WT, o foco foi elaborar o composto 3, o inibidor de WT mais potente. Foi previsto que a combinação dos recursos estruturais tolerada pela mutação Glyl37Asp (substituintes pequenos ou flexíveis) com o modelo de 3,5-dissubstituição de composto 3 pode melhorar a inibição

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110/136 de LcaE7 Glyl37Asp. Para testar isso, 12 análogos de ácido 3-bromo-fenilborônico com o modelo de 3,5-dissubstituição de composto 3 foram adquiridos (Figura 11) e os valores de K± foram determinados para LcaEl Glyl37Asp e de tipo selvagem (Tabela 4).

Tabela 4. Atividade in vitro de ácidos borônicos 3,1 a 3,12 otimizada para inibição de LcaEl Glyl37Asp.

	Kí (nM)
Composto	LcaEl de tipo selvagem	LcaEl Glyl37Asp
3,1	0,70 (0,62 a 0, 79)	430 (380 a 500)
3,2	0,35 (0,31 a 0, 40)	210 (180 a 230)
3,3	0,47 (0,36 a 0,59)	150 (130 a 170)
3,4	3,8 (2,9 a 4,9)	1000 (900 a 1200)
3,5	3,4 (2,6 a 4,5)	440 (350 a 550)
3,6	6 (5 a 9)	71 (60 a 85)
3,7	0,30 (0,26 a 0,35)	76 (69 a 85)
3,8	2,0 (1,7 a 2,4)	110 (100 a 120)
3,9	0,44 (0,39 a 0,50)	25 (22 a 27)
3,10	0,44 (0,33 a 0,56)	18 (16 a 20)
3,11	5,8 (4,1 a 8,0)	1000 (800 a 1200)
3,12	12 (9,2 a 15)	990 (870 a 1100)

^a Valores nos parênteses representam o intervalo de confiança de 95% na Kl. O Kl foi calculado de acordo com a equação de Cheng-Prusoff a partir de uma curva de resposta

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111/136 à dose com três medições de replicação (da técnica) de atividade enzimática em cada concentração de composto.

[120] Embora um inibidor mais potente de LcaEl de tipo selvagem não seja encontrado, seis dos 12 análogos exibiram valores Kí picomolares (Tabela 2). Isso estabelece uma relação de estrutura e atividade estável entre o ácido fenilborônico 3,5-disubstituido e ligação de LcoCEl de tipo selvagem de alta afinidade. De maneira importante, análogos 3, 9 e 3,10, que têm o modelo de 3,5-dissubstituiçao e ligantes flexíveis, exibiram uma melhora de 4,4 e 6,1 vezes na inibição de LcaEl Glyl37Asp, respectivamente, em comparação com o composto 3. Os resultados indicam que um grupo fenila ligado por meio de um ligante flexível confere a ligação de maior afinidade com aE7 Glyl37Asp, enquanto ainda retém ligação de alta afinidade com LcaEl de tipo selvagem. Ambos compostos otimizados 3,9 e 3,10 não exibem qualquer toxicidade celular até 100 μΜ (Figura 13), nem inibição potente através do painel de 26 proteases humanas (Tabela 2).

[121] Para investigar a ligação do inibidor mais potente de LcaEl Glyl37Asp, o composto 3,10, a estrutura cocristalina foi solucionada em 1,75 Â. A densidade de diferença mFo-DFc antes da colicação de ligante mostra o ácido borônico covalentemente ligado à serina catalítica (Figura 11). A orientação de 3,10 é conservada em comparação

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112/136 com 3, com o substituinte 3-bromo localizado no maior subsitio de bolso de ligação, e o 5-metoxi-fenol orientado em direção ao funil de bolso de ligação (Figura 11) . Para acomodar o inibidor covalentemente ligado, as cadeias laterais de Aspl37 e Met308 adotam novas conformações alternativas. Embora a nova conformação de Aspl37 permita que o composto 3,10 se ligue, a colisão esférica resultante com Phe309 adjacente força essa cadeia lateral a adotar uma nova conformação coberta (Figura 11). As posições relativas das cadeias laterais de Aspl37 e Phe309 sugerem que a cadeia lateral de Phe309 deve alcançar a conformação coberta antes da cadeia lateral de Aspl37 adotar o novo rotâmero. Portanto, a ligação de ácido borônico 3,10 explora uma rede préexistente de resíduos acoplados dinâmicos dentro do sítio ativo de aE7.

[122] Embora ambas as cadeias laterais de Phe309 e Met308 girem na direção oposta do buraco de oxiânion, o efeito geral é que a estrutura principal de 308 a 309 comute mais próximo ao buraco de oxiânion (Figura 11). Uma ligação de hidrogênio é formada entre o carboxilato de Aspl37 e o oxigênio de estrutura principal Met308 (Figura 11), e uma rede de ligações de hidrogênio liga uma das hidroxilas de ácido borônico ao carboxilato de Aspl37 por meio de uma molécula de água. A densidade de diferença no sítio ativo (Figura 12) indica que a geometria ao redor do boro é

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113/136 tetraédrica, no entanto, diferente dos compostos 1 e 4, cuja hidroxila está posicionada quase equidistante dos três nitrogênios de estrutura principal do buraco de oxiânion, a hidroxila do composto 3,10 não está no alcance de ligação de hidrogênio do nitrogênio de estrutura principal Glyl36 (3,4 Â) ·

Exemplo 7

Exame in vivo [123] Foi investigado se os compostos de ácido borônico poderíam inibir a atividade de DcaE7 in vivo, desse modo, atuando como agentes sinérgicos para restaurar a eficácia de inseticidas de OP. Compostos foram inicialmente testados contra cepas de L. cuprina tanto suscetíveis quanto resistentes ao inseticida de OP diazinon (Figura 3 e Tabela 5) .

Tabela 5. Efeitos de inibidores de ácido borônico sobre sensibilidade de larvas de mosca-varejeira a diazinon.

Cepa de moscavare jeira	Tratamento com fármaco^a	Resposta à dose de diazinon
	ECso^b(pg/ensaio )	Cl de 95%	SR^C	RR^d
Laboratór io (LS)	Dz apenas	0,80	0,61 a 1, 04	-	-
	Dz mais 2	0,86	0,68 a 1, 08	0,9	-
	Dz mais 3	0,33 *	0,29 a 0,38	2, 4	-
	Dz mais 3,9	0,32 *	0,23 a	2,5	-

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114/136

Cepa de moscavare jeira	Tratamento com fármaco^a	Resposta à dose de diazinon
	ECso^b(pg/ensaio )	Cl de 95%	SR^C	RR^d
			0, 44
	Dz mais 3,10	0,14 *	0, 09 a 0,22	5, 7
	Dz mais 5	0,70	0,62 a 0, 78	1, 1	-
Campo (Tara)	Dz apenas	2,29	1, 89 a 2, 77		2,86 #
	Dz mais 2	1,09 *	0,99 a 1, 19	2, 1	1,36
	Dz mais 3	0,43 *	0,39 a 0, 47	5, 3	0,54#
	Dz mais 3,9	0,59 *	0,52 a 0,67	3,9	0, 74
	Dz mais 3,10	0,20 *	0, 13 a 0,30	11,5	0,25 #
	Dz mais 5	0,95 *	0, 84 a 1, 08	2, 4	1, 19
Laboratór io (LS)	Mal apenas	2,06	1,75 a 2, 42	-	-
	Mal mais 3	0, 48*	0, 43 a 0,53	4, 3	-
	Mal mais 3,9	0,23*	014 a 0,37	9, 0	-
	Mal mais 3,10	0, 13*	0, 11 a 0, 16	16	-

^a· Diazinon (Dz) e malation (Mal) examinados a uma faixa de concentrações na presença ou ausência de ácido borônico em concentração constante de 1 mg/ensaio ^b· * indica que, dentro de uma cepa de mosca-varejeira,

EC50 para Dz/Mal mais ácido borônico é significativamente diferente de EC50 para Dz/Mal apenas (com base na

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115/136 sobreposição de Cis de 95%) ^c· SR = razão de sinergismo = EC50 para Dz/Mal apenas/ECso para Dz/Mal mais ácido borônico, dentro de uma cepa de moscavarejeira ^d· RR = razão de resistência = EC50 para Dz apenas ou Dz mais ácido borônico com a cepa de campo/ECso para Dz apenas para a cepa de laboratório; ^# indica que o valor de cepa de laboratório é significativamente diferente do valor de cepa de laboratório (com base na sobreposição de CIs de 95%).

[124] Eficácia de inibidor foi determinada tratando-se larvas com diazinon sobre uma faixa de concentrações, na presença ou ausência dos compostos em concentrações constantes, e comparando-se taxas de pupação. Compostos 2, 3, 3,9, 3,10 e 5 foram selecionados para teste com base na alta potência contra LcaEl de tipo selvagem e/ou Glyl37Asp, e sua diversidade estrutural. Em ensaios da cepa suscetível, sinergismo foi observado para compostos 3, 3,9 e 3,10. Composto 3,1 f oi o mais potente, o que diminui a quantidade de diazinon necessária para alcançar uma redução de 50% na pupação (valor de EC50) reduzida por 5,7 vezes em comparação com um controle de diazinon apenas (Figura 3) . Esses inibidores picomolares tiveram capacidade para competir com diazinon para ligação de LcaEl, desse modo, se recupera atividade anti-colinasterase de OP. Isso destaca o efeito protetor de LcaEl de tipo selvagem contra inseticidas

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116/136 de OP. Nenhum sinergismo foi observado para os compostos 2 e 5, o que sugere que, apesar de baixa inibição nanomolar, esses compostos não tiveram capacidade para competir com diazinon para ligação de «E7. As diferenças observadas nos níveis de sinergismo para os compostos 3, 3,9 e 3,10 poderíam estar relacionadas com as diferenças na biodisponibilidade dos compostos, visto que sua potência in vitro é muito similar.

[125] Para confirmar que o sinergismo observado ocorreu devido à inibição de LcaEl, e nenhum efeito colateral tóxico dos compostos de ácido borônico ocorreu, os compostos foram testados na ausência de diazinon (Figura 5). Não houve diferença significativa entre as taxas de pupação de mosca na presença ou ausência dos compostos de ácidos borônicos. Isso é consistente com testes in vitro que mostram que esses compostos têm baixa (mM) afinidade para AChE (Tabela 1), os dados de baixa toxicidade celular apresentados abaixo no presente documento, e a baixa toxicidade conhecida de ácidos borônicos (Hall, D. G. in Boronic Acids (2005).).

[126] Ao demostrar sinergismo entre os ácidos borônicos e um inseticida de OP, os compostos foram testados contra uma cepa de campo de L. cuprina resistente a diazinon. Resistência a dizinon está tipicamente associada ao alelo de mutação/resistência Glyl37Asp. 0 genótipo da cepa de campo usado nos bioensaios foi determinado, e constatou-se que,

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117/136 embora a cepa de laboratório tenha carregado apenas alelos suscetíveis de WT (Glyl37), a cepa de campo carregou ambos os alelos suscetível (Glyl37) e de resistência (Aspl37) (Figura 6) . Isso é consistente com os resultados anteriores que mostram que duplicações da região cromossômica que contêm aE7 ocorreram, o que significa que cepas resistentes agora carregam cópias tanto de LcaEl Glyl37Asp quanto de WT. Na ausência dos ácidos borônicos, o EC50 de diazinon para a cepa de campo foi 2,9 vezes maior em comparação com a cepa de laboratório (Figura 3). 0 sinergismo foi observado para todos os ácidos borônicos testados, em que o composto mais eficaz (3,10) reduz o EC50 em 12 vezes em comparação com um controle de diazinon apenas (Tabela 5) . Composto 3,10, portanto, aboliu resistência a OP na cepa de campo de L. cuprina e rendeu a cepa de campo 4 vezes mais sensível a diazinon em comparação com a cepa de laboratório (quando trarada com diazinon apenas) .

[127] Com base no perfil de inibição de enzima in vitro (Tabela 1), o nível superior de sinergismo de diazinon na cepa de campo com o composto 3 contra o composto 2 foi surpreendente. Para investigar essa discrepância, múltiplas cópias de cada uma das cepas de L. cuprina foram sequenciadas, e constatou-se que, embora a cepa suscetível tenha contido apenas aE7 de tipo selvagem, a cepa resistente carregou um número igual de genes de tipo selvagem e

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118/136 glyl37asp (Figura 6). Essa discrepância é consistente com a observação de que cepas resistentes contemporâneas contêm ambos alelos de tipo selvagem e Glyl37Asp AcaE7²⁹; especificamente, um composto, tal como 3,10, que inibe de maneira eficaz ambas as variantes de AcaE7 seria o melhor agente sinérgico contra uma cepa resistente. 0 sinergismo exibido pelo composto 3,10 é, portanto, uma função da inibição otimizada de AcaE7 Glyl37Asp e retenção de inibição de AcaE7 de WT. Isso destaca a importância tanto de sequestro (por meio de WT) quanto de desintoxicação catalítica (por meio de Glyl37Asp) por AcaE7 em resistência a OP.

[128] Os efeitos de compostos 3, 3,9 e 3,10 sobre a sensibilidade da cepa de laboratório no inseticida de OP malation foram testados. A sensibilidade a malation e diazinon é qualitativamente diferente; AcaE7 de WT confere um baixo nível de resistência a diazinon por meio de ligação de alta afinidade e lenta hidrólise, no entanto AcaE7 de WT exibe atividade de hidrólise de malation significativa. Essa diferença é evidente nos valores de ECso similares para a cepa de L. cuprina de laboratório tratada com malation em comparação com a cepa de campo (resistente) tratada com diazinon (Figura 6). 0 sinergismo com malation foi observado para todos os compostos de ácido borônico testados. 0 Composto 3,10 foi o mais eficaz, o que reduz o ECso em 16 vezes em comparação com um controle de malation apenas

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119/136 (Figura 3 e Tabela 5).

[129] A associação entre resistência a OP e homólogos de LcaEl de outras pragas de inseto sugere que os agentes sinérgicos desenvolvidos aqui tenham potencial para atividade de espectro amplo contra resistência a OP mediada por CBE.

[130] Inseticidas de organofosfato são usados em todo o mundo; uma estimativa de 9 milhões de quilos são aplicados anualmente apenas nos Estados Unidos. Os resultados in vivo apresentados no presente documento indicam que a administração em combinação com esses agentes sinérgicos ou similares, pode reduzir uso de OP em mais que uma ordem de magnitude. Tal redução, sem comprometer a eficácia, podería ter enormes consequências ambientais e econômicas.

[131] Em suma, um teste inicial de 23.000 ácidos borônicos contra a estrutura cristalina de aE7 foi implantado para identificar inibidores de LcaEl, que identificaram inibidores picomolares a nanomolares de aE7 de WT. O que melhora o entendimento das relações de estrutura e atividade subjacentes à interação habilitaram a otimização de inibidor, que resulta em um inibidor potente e seletivo de ambas as enzimas de WT e Glyl37Asp associadas a resistência. Bioensaios de sobrevivência de mosca-varejeira confirmaram que o inibidor otimizado sinergizou com inseticidas de OP e

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120/136 aboliu resistência. Esses compostos não mostram toxicidade intrinsica significativa em linhas celulares de moscas ou humanas, assim como seletividade muito alta contra um painel de 26 proteases de serina/treonina humanas. Os mesmos podem superar a resistência a inseticidas baratos e disponíveis, enquanto diminuem a quantidade geral de inseticida necessária em mais que uma ordem de magnitude. Tais agentes sinérgicos poderíam ter maiores benefícios econômicos e ambientais. A abordagem geral demonstrada nesse trabalho deve ser aplicável em CBEs adicionais como uma rota para combater a resistência a inseticida.

Detalhes Experimentais:

Bioensaios de Lucilia Cuprina [132] Duas cepas de L. cuprina foram usadas: 1) uma cepa suscetível a fármaco de referência laboratorial, LS, derivada de coletas no território da Capital da Austrália durante 40 anos, sem histórico de exposição a inseticidas; e 2) uma cepa coletada no campo, Tara, resistente a diazinon e diflubenzuron (Levot, G. W. e Sales, N. New high level resistance to diflubenzuron detected in the Australian sheep blowfly, Lucilia cuprina (Wiedemann) (Diptera: Calliphoridae) . Gen. Appl. Entomol. 31, 43 a 46 (2002)). 0 gene AcaE7 foi sequenciado em cada uma das cepas. Brevemente, DNA genômico foi preparado a partir de 20 moscas adultas fêmeas de cada cepa com o uso do kit DNeasy Blood and Tissue

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121/136 (Qiagen). PCR foi realizada com iniciadores específicos para o gene LcaEl e o produto foi clonado em um vetor pGEM-T EASY (Promega) . Oito clones da cepa suscetível e 10 clones da cepa resistente foram sequenciados com o uso de iniciadores dianteiros e reversos M13.

[133] O efeito de compostos 2, 3, 5, 3,9 e 3,10 sobre o desenvolvimento de larvas de mosca-varejeira na presença de diazinon/malation foi avaliado com o uso de um sistema de bioensaio no qual as larvas foram deixadas para se desenvolver a partir do primeiro estágio instar até a pupação em algodão impregnado com diazinon/malation sobre uma faixa de concentrações, na presença ou ausência dos compostos em concentrações constantes(Kotze, A. C. et al . Histone deacetylase enzymes as drug targets for the control of the sheep blowfly, Lucilia cuprina. Int. J. Parasitol. Drugs Drug Resist. 5, 201 a 208 (2015)). Cada experimento utilizou 50 larvas em cada concentração de diazinon/malation. Experimentos foram replicados três vezes para diazinon, e duas vezes para malation. Os efeitos inseticidas foram definidos medindo-se a taxa de pupação. Os dados de resposta à dose de taxa de pupação foram analisados por regressão não linear (GraphPad Prism) de modo a calcular valores de ECso (com intervalos de confiança de 95%) que representam a concentração de diazinon/malation (sozinhos ou em combinação com compostos 2, 3, 5, 3,9 ou 3,10) necessária

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122/136 para reduzir a taxa de pupação em 50% daquela medida em ensaios de controle. Os efeitos de compostos 2, 3, 5, 3,9 e 3,10 foram definidos de duas maneiras: 1) razão de sinergismo dentro de cada isolato = o ECso para diazinon/maltion apenas/ECso para diazinon/maltion em combinação com os compostos; e 2) razão de resistência = o ECso para diazinon apenas ou em combinação com os compostos para a cepa de Tara/ECso para diazinon apenas com a cepa de LS. Diferenças significativas entre valores de ECso foram avaliadas com base em sobreposição de intervalos confiança de 95%. Compostos também estiveram sem diazinon ou malation em 1 mg por ensaio.

[134] A associação entre resistência a OP e homólogos de LcaEl de outras pragas²⁰ de inseto sugere que os agentes sinérgicos descritos no presente documento tenham potencial para atividade de espectro amplo contra resistência a OP mediada por CBE.

Exemplo 8

Avaliação biológica de Clorpirifos-etila(CPE) combinada com derivados de ácido borônico (BA) com relação a Myzus persicae (pulgão-verde-do-pessegueiro) em pequenas favas (Vicia faba) [135] A capacidade de derivados de ácido borônico (BA) em aumentar a eficácia de organofosfato de clorpirifosetila (CPE) com relação a Myzus persicae (pulgão-verde-dopessegueiro) em pequenas favas (Vicia faba) foi investigada.

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Resultados :

	Tabela	6. Porcentagem de	eficácia	de	condiçoes	de
clorpirifos	-etila.
		CPE 0,7 CPE 1,4	CPE 2,8		CPE 5,6
1	DAT	38% 41%	32%		36%
3	DAT	20% 27%	26%		48%
7	DAT	25% 25%	23%		67%
		CPE 0,7 + CPE 1, 4	+ CPE 2,	8	+ CPE 5,6	+
		3,10 3,10	3,10		3,10
1	DAT	38% 24%	59%		71%
3	DAT	56% 8%	77%		92%
7	DAT	66% 24%	94%		100%
		CPE 0,7+5 CPE 1,4 +	5 CPE 2,8	+	5 CPE 5,6 +	5
1	DAT	45% 41%	59%		74%
3	DAT	34% 38%	84%		98%
7	DAT	18% 30%	95%		100%
		CPE 0,7 + CPE 1, 4	+ CPE 2,	8	+ CPE 5,6	+
		3,7 3,7	3, 7		3, 7
1	DAT	34% 39%	48%		79%
3	DAT	24% 46%	39%		92%
7	DAT	27% 38%	63%		100%

Tabela 7. Resultados de calibragem.

	CPE 1,4	CPE 2,8	CPE 5,6
1 DAT	33%	31%	67%
3 DAT	51%	79%	98%
7 DAT	51%	99%	100%

[136] CPE: Clorpirifos-etila (Pyrinex 480 EC; 480 g de a.i./l); Composto 3,10: Ácido 3-bromo-5fenoxifenilborônico 98%; Composto 5: Ácido 3-cloro-4(2 '

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124/136 fluorobenziloxi)fenilborônico 95%; Composto 3,7: Ácido 3bromo-5-isopropoxifenilborônico 95% [137] Floculação é observada com o Composto 5 apenas e em mistura com CPE em todas as doses.

[138] Nenhuma toxicidade significativa de DMSO ou de Compostos derivados 3,10, 5 ou 3,7 foi observada. (Testes ANOVAs seguidos por Newman-Keuls com um limite de 5%).

[139] Conforme mostrado na Tabela 6, a eficácia inseticida de CPE usada em 2,8 g de a.i./ha (gram de ingrediente ativo por hectare) e 5,6 g de a.i./ha foi aumentada pela adição de todos os Compostos 3,10, 5 e 3,7.

Detalhes Experimentais:

[140] Experimentações foram conduzidas em BlOtransfer, France sob condições controladas.

[141] Folhas de fava foram tratadas com clorpirifos 480 EC (480 g de a.i./l) em 4 taxas de aplicação (360, 180, 90, 45 g de a.i./ha), usado sozinho ou em combinação com 3 derivados de ácido borônico (BA) (3,10, 5 e 3,7) cada um a 0,2 mg/ml. 0 tratamento foi realizado com um bocal agrícola (300 1 por hectare) após infestação. Uma condição de controle não tratado também foi avaliada em paralelo. A análise estatística dos dados foi então realizada. Quando as folhas estavam totalmente secas, 3 folhas foram amostradas e infestadas com 3 adultos sem asas de M. persicae por fragmento de folha.

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Temporização de avaliação:

• T+l (DAT 1) - Um dia depois o número de adultos que permaneceram nas folhas foi contado.

• T+3 (DAT 3) - 3 dias após tratamento a população de pulgão foi estimada;

• T + 7 (DAT 7) - 7 dias após tratamento o desenvolvimento da população de pulgão foi estimado.

Procedimento de operação:

[142] 3 fragmentos de folhas de favas por microcaixa *4 microcaixa por condição (1 condição é 1 Formulação em 1 dose) *9 pulgões adultos por microcaixa * 4 inseticidas (3 derivados de clorpirifos + clorpirifos apenas) *4 taxas + 2 controles (1 Formulação de inseticida de referência em uma dose e não tratada) *3 temporizações de avaliações (DAT+1, DAT+3 e DAT+7).

Exemplo 9

Avaliação biológica de Clorpirifos-etila(CPE) combinada com derivados de ácido borônico (BA) com relação a Ostrinia nubilalis (broca europeia do milho) em seleção se folhas de filho (Zea may) [143] A capacidade de derivados de ácido borônico (BA) em aumentar a eficácia de organofosfato de Clorpirifosetila (CPE) com relação a Ostrinia nubilalis (broca europeia do milho) em seleção de folhas de milho (Zea may) foi investigada.

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126/136

Detalhes Experimentais:

[144] Tratamentos foram realizados pulverizando-se um volume de mistura que corresponde a 200 1/ha. 4 caixas/condição.

[145] Condições (doses testadas): CPE: clorpirifosetila (Pyrinex 480 EC; 480 g de a.i./l); Composto 3,10: Ácido 3-bromo-5-fenoxifenilborônico 98%; Composto 5: Ácido 3cloro-4(2'-fluorobenziloxi)fenilborônico 95%; Composto 3,7: Ácido 3-bromo-5-isopropoxifenilborônico 95%; todos os derivados de ácido borônico foram dissolvidos em DMSO antes da diluição que resulta em 1% de DMSO final.

[146] Secar 1 h a 20 °C; Depósito de três fragmentos de folha por caixa em ágar de água (4 caixa/condição) ; Infecção de cada fragmento de folha com 4 Ostrinia nubilalis (12 larvas/caixa); Incubação 18 °C/28 °C fotoperiodo de 16 h; Larvas vivas foram contadas 1, 2 e 6 dias após tratamento (DAT). A porcentagem de mortalidade foi calculada para cada tempo de avaliação. Análise estatística dos dados foi realizada com software XLSTAT® (ANOVAs seguido por testes de Newman-Keuls com um limite de 5%, consultar a Tabela abaixo).

Tabela 8. Resumo de Condições Experimentais.

Tratamento Dose (g de a.i./ha)

Controle Água

DMSO 1%

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Tratamento	Dose (g de	a.i./ha)
3,10 (mg/ml)	0,2	0,2	0,2	0,2
5 (mg/ml)	0,2	0,2	0,2	0,2
3,7 (mg/ml)	0,2	0,2	0,2	0,2
CPE	2,5	6,24	15,6	39
CPE	2,5	6,24	15,6	39
+ 3,10 (mg/ml)	0,2	0,2	0,2	0,2
CPE	2,5	6,24	15,6	39
+ 5 (mg/ml)	0,2	0,2	0,2	0,2
CPE	2,5	6,24	15,6	39
+ 3,7 (mg/ml)	0,2	0,2	0,2	0,2

Resultados :

Tabela 9. Resumo de resultados de eficácia para tratamento com BA+clorpirifos-etila.

Tratam ento	Dose	Avaliação de número de larvas
1 DAT	3 DAT	6 DAT
Méd ia	s d	N-K	Médi a	s-d	N-K	Médi a	s-d	N-K
Contro le		12	0	A	11,5	0, 6	A	10,8	1,3	A
DMSO	1%	12	0	A	11, 8	0, 5	A	10,8	0, 5	A
3,1	0,2 mg/ml	12	0	A	12	0	A	8,3	1,2	ABC
5	0,2 mg/ml	12	0	A	12	0	A	10,3	1,2	AB
3, 7	0,2 mg/ml	11, 7	0 r	A	11	1	A	8	1	ABCD

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Tratam ento	Dose	Avaliação de número de larvas
1 DAT	3 DAT	6 DAT
Méd ia	s d	N-K	Médi a	s-d	N-K	Médi a	s-d	N-K
			6
CPE 2,5	2,5 g de a. i . /ha	12	0	A	12	0	A	8	1	ABCD
CPE 2,5 + 3,10	2,5 g de a. i . /ha + 0,2 mg/ml	11, 8	0 r 6	A	11	0, 6	A	5, 3	1,5	CDEF
CPE 2,5 + 5	2,5 g de a. i . /ha + 0,2 mg/ml	11, 7	0 r 6	A	11,3	1,2	A	6,3	Mo	BCDE
CPE 2,5 + 3, 7	2,5 g de a. i . /ha + 0,2 mg/ml	11, 8	0 r 5	A	10,3	0, 5	AB	6	0, 8	ABCDE
CPE 6,24	6,24 g de a. i . /ha	10, 7	1 r 5	A	9, 7	Mo	ABC	4	3, 5	CDEFGH
CPE 6,24 + 3,10	6,24 g de a. i . /ha + 0,2 mg/ml	12	0	A	11, 7	0, 6	A	3	3	DEFGH
CPE 6,24 + 5	6,24 g de a. i . /ha + 0,2 mg/ml	11	2	A	9,3	2, 5	ABC	7	2, 2	ABCD
CPE 6,24 + 3, 7	6,24 g de a. i . /ha + 0,2 mg/ml	12	0	A	11	1,2	A	6,5	1, 9	ABCD

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Tratam ento	Dose	Avaliação de número de larvas
1 DAT	3 DAT	6 DAT
Méd ia	s d	N-K	Médi a	s-d	N-K	Médi a	s-d	N-K
CPE 15, 6	15,6 g de a. i . /ha	7,3	3 r 1	B	7	3,2	C	3,5	2, 4	DEFGH
CPE 15,6 + 5	15,6 g de a. i . /ha + 0,2 mg/ml	8	0 r 8	B	8	0, 8	BC	4, 8	3,2	CDEFG
CPE 15,6 + 3,10	15,6 g de a. i . /ha + 0,2 mg/ml	4	1	C	4	1	D	4	1	CDEFGH
CPE 15,6 + 3, 7	15,6 g de a. i . /ha + 0,2 mg/ml	2,3	0 r 5	C	1, 8	1,3	DE	1	1,2	GH
CPE 39	39 g de a. i . /ha	3,3	2 r 5	C	2	1, 7	DE	1,3	1,2	FGH
CPE 39 + 3,10	39 g de a. i . /ha + 0,2 mg/ml	2, 7	2 r 5	C	2	2	DE	1, 7	1,5	EFGH
CPE 39 + 5	39 g de a. i . /ha + 0,2 mg/ml	2,3	1 r 7	C	0, 8	1	E	0,5	1	H
CPE 39 + 3,7	39 g de a. i . /ha + 0,2 mg/ml	1,3	1	C	0,3	0, 5	E	0,3	0, 5	H

N-K: Resultados de teste Newman-Keuls. Duas condiçoes com a mesma letra nao sao significativamente diferentes umas das outras .

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130/136

Tabela 10. Resumo de porcentagem de resultados de eficácia para tratamento com BA+CPE

Porcentagem de eficácia	DMSO	3,10	5	3, 7
1	DAT	0%	0%	0%	3%
3	DAT	0%	0%	0%	4%
6	DAT	0%	22%	4%	26%

Porcentagem de eficácia	CPE 2,5	CPE 6,24	CPE 15,6	CPE 39
1 DAT	0%	11%	40%	72%
3 DAT	0%	16%	39%	83%
6 DAT	26%	63%	67%	88%

Porcentagem de eficácia	CPE 2,5 + 3,10	CPE 6,24 + 3,10	CPE 15,6 + 3,10	CPE 39 + 3,10
1 DAT	2%	0%	67%	78%
3 DAT	4%	0%	65%	83%
6 DAT	51%	72%	63%	84%

Porcentagem de eficácia	CPE 2,5 + 5	CPE 6,24 + 5	CPE 15,6 + 5	CPE 39 + 5
1 DAT	3%	8%	33%	81%

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131/136

DAT

1%

41%

20%

35%

30%

56%

93%

95%

Porcentagem de eficácia	CPE 2,5 + 3,7	CPE 6,24 + 3,7	CPE 15,6 + 3,7	CPE 39 + 3,7
1 DAT	2%	0%	81%	90%
3 DAT	11%	4%	85%	98%
6 DAT	44%	40%	91%	98%

Conclusoes:

[147] Ausência de toxicidade de 1% de DMSO. Ausência de toxicidade significativa de Compostos 3,10, 5 e 3,7 apesar de algumas mortes de larvas com os Compostos 3,10 e 3,7 em 6 DAT. CPE com ou sem compostos BA são dependentes de dose e são significativamente mais eficientes em 6 DAT em comparação com condições de controle na exceção de:

[148] CPE usada sozinha em 2,5 g de a.i./ha.

[149] CPE + composto 5 em 6,24 g de a.i./ha.

[150] CPE + composto 3,7 em 2,5 e 6,24 g de a.i./ha.

[151] A adição de Composto 3,10 aumentou significativamente a eficácia em comparação com CPE usada sozinha em:

DAT e 3 DAT na dose de 15,6 g de a.i./ha.

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132/136 [152] A adição de Composto 3,7 aumentou significativamente a eficácia em comparação com CPE usada sozinha em:

DAT e 3 DAT na dose de 15,6 g de a.i./ha

Exemplo 10

Avaliação biológica de Clorpirifos-etila(CPE) combinada com derivados de ácido borônico (BA) com relação a Leptinotarsa decemlineata (besouro do Colorado) em folhas de batata [153] A capacidade de derivados de ácido borônico (BA) em aumentar a eficácia de organofosfato de Clorpirifosetila (CPE) com relação a Leptinotarsa decemlineata (besouro do Colorado) em folhas de batata é investigada.

Detalhes Experimentais:

[154] Experimentações são conduzidas em BlOtransfer, France sob condições controladas.

[155] Folhas de batata são tratadas com clorpirifos 480 EC (480 g de a.i./l) em 4 taxas de aplicação (360, 180, 90, 45 g de a.i./ha), usado sozinho ou em combinação com 3 derivados de ácido borônico (BA) (3,10, 5 e 3,7) cada um a 0,2 mg/ml. O tratamento é realizado com um bocal agrícola (300 1 por hectare) após infestação. Uma condição de controle não tratado e um inseticida de referência também são avaliados em paralelo. A análise estatística dos dados é então realizada. Quando as folhas estão totalmente secas, as

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133/136 mesmas são infestadas por seis (6) larvas de besouro do Colorado. 0 Karate Zeon em 1 dose (1 a 2 g/ha) é justificado pela alta sensibilidade dos besouros em condições de laboratório. Essa dose é então comparada com a dose de campo registrada (7,5 g/ha).

Temporização de avaliação:

[156] Três temporizações de observação, 1 dia, 2 dias e 3 dias após tratamento permitem a avaliação do número de insetos vivos.

Procedimento de operação:

[157] Folhas de batata *6 larvas por teste * 3 repetições (1 repetição é 1 Formulação em 1 dose) * 4 inseticidas (3 derivados de clorpirifos + clorpirifos apenas) *4 taxas + 2 controles (1 inseticida: Karate Zeon * 1 taxa + condição não tratada) *3 temporizações de avaliações (T + l, T + 2 e T + 3) .

[158] Após secagem completa da folha, as mesmas são infestadas por seis (6) larvas de besouro do Colorado. Três temporizações de observação (1 dia, 2 dias e 3 dias) permitem a avaliação do número de insetos vivos.

[159] 0 Karate Zeon em 1 dose (1 a 2 g/ha) é justificado pela alta sensibilidade dos besouros em condições de laboratório. Essa dose é então comparada com a dose de campo registrada (7,5 g/ha).

Exemplo 11

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134/136

Inibição de várias CBEs por compostos da invenção [16 0] Para provar a geralidade da abordagem e de vários compostos da invenção (3,7, 3, 5 e 2, C21, CIO e C2), suas constants de inibição contra um painel de CBEs a partir de várias pragas foram determinadas.

[161] Compostos 3,7, 3, 5 e 2 foram projetados para inibir aE7 de Lucilia cuprina. Compostos C21, CIO e C2 foram projetados para inibir Culix quinquefasciatus B2.

Resultados:

Tabela 11. Valores de Ki (em nanomolar) para inibidores de ácido borônico contra várias CBEs de inseto.

	Composto
	2	3	3, 7	5	C2	CIO	C21
Stomoxys calcitrans	8	3	14	20	270	3	2
Musca domestica	50	<1	<1	13	700	5	130
Calliphora stygia	<1	<1	<1	2	210	40	9
Cochliomyia hominivorax	<1	<1	<1	2	110	3	2
Aedes aegypti	3100	9900	2600	4000 0	37000	10	10000
Anopheles gambiae	170	790	330	30	420	80	200
Culex quinquefasciatus	2400	4700	900	420	3600	190	140

[162] Ensaios foram realizados com 4-NPB como o substrato. Valores de Ki são apresentados como média ±SD, n = 3; valores inferiores a 1 nM são relatados como <1 como esses estão no limite de detecção.

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135/136 [163] Alguns compostos, tais como 5, mostraram um espectro muito amplo que inibe de maneira eficiente seis diferentes CBEs. Outros ácidos borônicos foram mais específicos para um subconjunto menor de CBEs.

Exemplo 12

Painel de Seletividade para Compostos da Invenção [164] Para estabelecer adicionalmente a segurança e toxicidade celular de compostos de acordo com esta invenção, seu IC50 na eliminação de um painel amplo de linhas celulares humanas (que incluem tanto cancerígenas e não cancerígenas) linhas celulares foram determinadas, e sua toxicidade celular foi testada.

Resultados:

Tabela 12. Dados de toxicidade celular para sete derivados de ácido borônico da invenção contra sete linhas celulares.

	6543 IC50 Viabilidade Células: IC50 (pM) (Mostrador: Luminescência)
Compos to	Linha Célula r: Colo20 5	Linha Celular : H23	Linha Celular : 293T	Linha Celular HCT116	Linha Celul ar: Hela	Linha Celul ar: HT29	Linha Celul ar: PC3
2	91,5	> 99,8	42,9	62,8	4	34, 1	49, 1
5	79, 4	92, 7	90,3	88,5	4, 8	62, 4	83,7
3, 9	> 99,8	99,3	> 99,8	> 99,8	2, 1	72, 8	99,8
3	> 99,8	> 99,8	> 99,8	> 99,8	8, 1	99,8	99,8
1	> 99,8	> 99,8	> 99,8	> 99,8	37,9	>	>

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136/136

						99,8	99,8
3,1	> 99,8	> 99,8	N. A.	> 99,8	99,8	99,8	99,8
4	> 99,8	N. A.	> 99,8	> 99,8	32,7	99,8	99,8

[165] Exceto células HeLa que mostraram alguma sensibilidade a alguns dos ácidos borônicos, todas as outras linhas celulares mostraram quase nenhuma reação a qualquer um dos compostos de até 100 μΜ.

[166] Embora determinados recursos da invenção tenham sido ilustrados e descritos no presente documento, muitas modificações, substituições, alterações e equivalentes ocorrerão agora àqueles de habilidade comum na técnica. Portanto, deve ser entendido que as reivindicações anexas se destinam a cobrir todas essas modificações e mudanças como estando dentro do espirito verdadeiro da invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição pesticida para eliminar pragas de inseto caracterizada pelo fato de que compreende uma combinação sinergicamente eficaz de pelo menos um dentre: organofosfato (OP), carbamato (CM) e piretroide sintético (SP) ; e pelo menos um derivado de ácido borônico ou sal do mesmo.

2/18 hidroxila, -OC(O)CF3, -O-CH₂-arila (por exemplo, -OCHgPh, OCH₂-2-fluorofenila), -NHCO-alquila, COOH, -C(O)Ph, C(0)0alquila, C(O)H, ou -C(O)NH₂, -C(O)N(R)₂, -C(0)-morfolina, ou dois substituintes adjacentes (isto é, R₂ e Ri, ou Rg e Ri, ou R4 e Rg, ou R5 e R4) se juntam para formar um anel carbociclico (por exemplo, benzeno, furano) ou heterociclico com 5 ou 6 membros, que pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcoxi, N(R)₂, CFg, CN ou N0₂; e em que

R é C1-C5 alquila linear ou ramificada, C1-C5 alcoxi linear ou ramificado, fenila, arila ou heteroarila, que pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcoxi, N(R)₂, CFg, CN ou N0₂, ou dois substituintes de gem R se juntam para formar um anel heterociclico com 5 ou 6 membros.

2. Composição pesticida, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo em insetos. fato de que é para uso 3. Composição pesticida, de acordo com a

reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o derivado de ácido borônico é ácido aril-borônico ou sal do mesmo, em que a dita arila é opcionalmente substituída por entre 1 e 5 subst ituintes, em que cada substituinte é independentemente: H, F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, C1-C5 haloalquila linear ou ramificada, C1-C5 alcoxi linear ou ramificado, ariloxi, O-CH₂Ph, O-CH₂-arila, CH₂-O-arila, -C(O)NH₂, -C(O)N(R)₂, -C(O)NHR, -NHC(O)R, C1-C5 tioalcoxi linear ou ramificado, C1-C5 haloalcoxi linear ou ramificado, C1-C5 alcoxialquila linear ou ramificada, arila, C3-C8 cicloalquila, Cs-Cs anel heterociclico; em que cada um pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcoxi, N(R)₂, CF3, CN ou N0₂; CF3, CN, N0₂, -CH2CN, NH₂, NHR, N(R)₂, alquil-N (R) 2,

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3/18 em que

Ri, R2, R3, R4 e Rs são, cada um, independentemente, Η, F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada (por exemplo, metila), C1-C5 haloalquila linear ou ramificada, C1-C5 alcóxi linear ou ramificado (por exemplo, -OiPr, -OtBu, -OCfp-Ph), ariloxi (por exemplo, OPh) , RgR?, -C(O)NH2, -C(O)N(R)2, C1-C5 tioalcoxi linear ou ramificado, C1-C5 haloalcoxi linear ou ramificado (por exemplo, OCF3) , arila, C3-C8 cicloalquila, C3-C8 anel heterocíclico (por exemplo, pirrolidina, morfolina, piperidina, piperazina, 4-Me-piperazina); em que cada um pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcóxi, N(R)₂, CF3, CN ou N0₂; CF3, CN, N0₂, -CH₂CN, NH₂, N(R)₂, alquilN(R)₂, hidroxila, -OC(O)CF₃, -NHCO-alquila, COOH, C(0)0alquila, C(0)H;

ou dois substituintes adjacentes (isto é, R2 e Ri, ou R3 e Ri, ou R4 e R3, ou R5 e R4) se juntam para formar um anel carbocíclico (por exemplo, benzeno, furano) ou heterocíclico com 5 ou 6 membros, que pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcóxi, N(R)2, CF3, CN ou NO2; e

R e R7 são, cada um, independentemente, C1-C5 alquila

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4/18 linear ou ramificada (por exemplo, t-Bu, i-Pr), C1-C5 haloalquila linear ou ramificada (por exemplo, CF3),Ci-Cs alcoxi linear ou ramificado, C3-C8 cicloalquila, Cs-Cs anel heterocíclico (por exemplo, morfolina), fenila, arila (por exemplo, 2-clorofenila, 2-fluorofenila), naftila, benzila ou heteroarila, em que cada um pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcoxi, N(R)2, CF3, CN ou NO2; ou dois subst ituintes de gem R se juntam para formar um anel heterocíclico com 5 ou 6 membros; e n é um número inteiro entre 1 e 6.

4. Composição pesticida, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o derivado de ácido borônico é representado pela estrutura de Fórmula I :

I

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5/18

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5. Composição pesticida, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o derivado de ácido borônico é selecionado a partir de:

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6/18

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7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a composição é caracterizada pelo fato de que é útil para eliminar pragas de animais agrícolas que incluem pragas em ovelha, gado, cabras, animais domésticos, tais como gatos, cães e pássaros, porcos, peixe.

7/18

caracterizada pelo fato de que é útil para eliminar pragas de culturas agrícolas que incluem plantas de culturas vegetais, floricultura, culturas ornamentais, medicinais e

8/18 mosca-varejeira (por exemplo, Calliphora stygia, Lucilia cuprina), mosca-da-bicheira (por exemplo, Cochliomyia hominivorax), baratas, carrapatos, mosquitos (por exemplo, Aedes aegypti, Anopheles gamblae, Culex guinguefasciatus), grilos, moscas domésticas (por exemplo, Musca domestica), moscas de areia, moscas-dos-estábulos (por exemplo, Stomoxys calcitrans), formigas, cupins, pulgas, pulgões (por exemplo, pulgão verde do pêssego), brocas (por exemplo, Ostrinia nubilalis (broca europeia do milho)), besouros (por exemplo, Leptinotarsa decemlineata (besouro do Colorado)), mariposas ou qualquer combinação dos mesmos.

8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a dita composição é caracterizada pelo fato de que elimina pragas que incluem

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9/18

9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o OP é acefato, aspon, azinfos-metila, azametifos, carbofurano c a r b o f e η o t i o n, c1o r f e nv i n f o s, c1o rp i r i f o s, Clorpirifosetila (CPE), coumafos crotoxifos, crufomato, demeton, diazinon, diclorvos, dicrotofos, dimetoato, dioxation, disulfoton, fosfato de dietil-4-metilumbeliferila, fenilfosfonotioato de etil-4-nitrofenila, etio, etoprop, fanfur, fenamifos, fenitrotion, fensulfotion, fention, fonofos, isofenfos, malation, metamidofos, metidation, paration de metila, mevinfos, monocrotofos, naled, oxidometon-metila, paration, forato, fosalona, fosmet, fosfamidon, temefos, pirofosfato de tetraetila, terbufos, tetraclorvinfos, triclorfon ou qualquer combinação dos

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10/18 a 12, em que a composição tem um efeito sinérgico sobre atividade inseticida.

10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o OP é diazinon, malation ou Clorpirifos-etila (CPE).

11/18 compreende colocar um derivado de ácido borônico ou um sal do mesmo, em contato com uma praga, antes, após ou simultaneamente ao contato do dito pesticida de OP, CM e/ou SP com a dita praga.

11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que a composição é caracterizada pelo fato de que não é tóxica aos animais e/ou ser humano.

12/18 exemplo, -OiPr, -OtBu, -OCH₂-Ph), ariloxi (por exemplo, OPh),

O-CH₂Ph, O-CH₂-arila, CH₂-O-arila, -C(O)NH₂, -C(O)N(R)₂, C(O)NHR, -NHC(O)R, C1-C5 tioalcoxi linear ou ramificado, CiC5 haloalcóxi linear ou ramificado (por exemplo, OCF3) , CiC5 alcoxialquila linear ou ramificada, arila, C3-C8 cicloalquila, C3-C8 anel heterociclico (por exemplo, pirrolidina, morfolina, piperidina, piperazina, 4-Mepiperazina); em que cada um pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcóxi, N(R)₂, CF3, CN ou N0₂; CF3, CN, N0₂, -CH₂CN, NH₂, NHR, N(R)₂, alquil-N (R) ₂, hidroxila, OC(O)CF₃, -O-CH₂-arila (por exemplo, -OCH₂Ph, OCH₂-2fluorofenila), -NHCO-alquila, COCH, -C(O)Ph, C(0)O-alquila, C(O)H, ou -C(O)NH₂, -C(O)N(R)₂, -C (0)-morfolina, ou dois substituintes adjacentes (isto é, R₂ e Ri, ou R3 e Ri, ou R4 e R3, ou R5 e R4) se juntam para formar um anel carbocíclico (por exemplo, benzeno, furano) ou heterociclico com 5 ou 6 membros, que pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcóxi, N(R)₂, CF3, CN ou N0₂; e em que

R é C1-C5 alquila linear ou ramificada, C1-C5 alcóxi linear ou ramificado, fenila, arila ou heteroarila, que pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcóxi, N(R)₂, CF3, CN ou N0₂, ou dois substituintes de gem R se juntam para

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12. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que o derivado de ácido borônico é um inibidor covalente seletivo de carboxietilesterase (CBE).

13/18 formar um anel heterocíclico com 5 ou 6 membros (por exemplo, morfolina).

13. Método para eliminar pragas de inseto, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que compreende colocar uma população de pragas de inseto em contato com uma quantidade eficaz da composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

14/18

N(R)₂, CF₃, CN ou N0₂; CF₃, CN, NO₂, -CH₂CN, NH₂, N(R)₂, alquilN(R)₂, hidroxila, -OC(O)CF₃, -NHCO-alquila, COOH, C(0)0alquila, C(0)H;

ou dois substituintes adjacentes (isto é, R₂ e Ri, ou R₃e Ri, ou R4 e R₃, ou R5 e R4) se juntam para formar um anel carbociclico (por exemplo, benzeno, furano) ou heterociclico com 5 ou 6 membros, que pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcoxi, N(R)₂, CF₃, CN ou N0₂;

R₆ é 0, (CH₂)_n, C(0), C(0)0, 0C(0), C(O)NH, C(O)N(R), NHC(O), N(R)CO, NHSO₂, N(R)SO₂, SO₂NH, SO₂N(R), S, SO, S0₂, NH, N(R), OCH₂ ou CH₂O;

R e R7 são, cada um, independentemente, C1-C5 alquila linear ou ramificada (por exemplo, t-Bu, i-Pr), C1-C5 haloalquila linear ou ramificada (por exemplo, CF₃),Ci-Cs alcoxi linear ou ramificado, C₃-Cg cicloalquila, C₃-Cg anel heterociclico (por exemplo, morfolina), fenila, arila (por exemplo, 2-clorofenila, 2-fluorofenila), naftila, benzila ou heteroarila, em que cada um pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcoxi, N(R)₂, CF₃, CN ou N0₂; ou dois subst ituintes de gem R se juntam para formar um anel heterociclico com 5 ou 6 membros; e n é um número inteiro entre 1 e 6.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o contato da população compreende expor a população ao inseticida, de modo que a composição seja ingerida pelas pragas de inseto de maneira suficiente para eliminar pelo menos 50% da população.

15/18 reivindicações 16 a 24, caracterizado pelo fato de que o derivado de ácido borônico é selecionado a partir de:

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15. Método para eliminar pragas de inseto em uma planta ou animal, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que compreende colocar a planta ou animal em contato com a composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1

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16. Método para eliminar pragas caracterizado pelo fato de que compreende inibir resistência ao organofosfato (OP), carbamato (CM) e/ou piretroide/piretroide sintético (SP) mediado pela carboxilesterase (CBE) em uma praga, sendo que o dito método compreende colocar um derivado de ácido borônico ou sal do mesmo em contato com a dita praga em combinação com pesticida de OP, CM e/ou SP.

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17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a dita CBE é uma CBE de tipo selvagem, um homólogo de CBE ou CBE mutante.

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18. Método, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que a dita CBE é de tipo selvagem ou versões mutantes de CBE de aE7 ou homólogo da mesma.

19. Método, de acordo com a reivindicação 16, 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que a dita CBE é AcaE7, AcaE7 de tipo selvagem, AcaE7 mutante, um homólogo da mesma, ou qualquer combinação dos mesmos.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a mutação na dita AcaE7 mutante (ou homólogo da mesma) é Glyl37Asp (ou mutação equivalente em homólogo).

21. Método para potencialização de um pesticida de um OP, um CM e/ou um SP caracterizado pelo fato de que

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22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 21, caracterizado pelo fato de que a praga é mosca-varejeira (por exemplo, Calliphora stygia, Lucilia cuprina), mosca-da-bicheira (por exemplo, Cochliomyia hominivorax) , baratas, carrapatos, mosquitos (por exemplo, Aedes aegypti, Anopheles gambiae, Culex quinquefasciatus) , grilos, moscas domésticas (por exemplo, Musca domestica), moscas de areia, moscas-dos-estábulos (por exemplo, Stomoxys calcitrans) , formigas, cupins, pulgas, pulgões (por exemplo, pulgão verde do pêssego), brocas (por exemplo, Ostrinia nubilalis (broca europeia do milho)), besouros (por exemplo, Leptinotarsa decemlineata (besouro do Colorado)), mariposas ou qualquer combinação dos mesmos.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 22, caracterizado pelo fato de que o derivado de ácido borônico é um ácido aril-borônico ou sal do mesmo, em que a dita arila é opcionalmente substituída por entre 1 e 5 substituintes, em que cada substituinte é independentemente: H, F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada (por exemplo, metila), C1-C5 haloalquila linear ou ramificada, C1-C5 alcóxi linear ou ramificado (por

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24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 23, caracterizado pelo fato de que o dito derivado de ácido borônico é representado pela estrutura de Fórmula I :

em que

Ri, R2, R3, R4 e Rs são, cada um, independentemente, H, F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada (por exemplo, metila), C1-C5 haloalquila linear ou ramificada, C1-C5 alcoxi linear ou ramificado (por exemplo, -OiPr, -OtBu, -OCfp-Ph), ariloxi (por exemplo, OPh) , RgR?, -C(O)NH2, -C(0)N(R)2, C1-C5 tioalcoxi linear ou ramificado, C1-C5 haloalcoxi linear ou ramificado (por exemplo, OCF3) , arila, C3-C8 cicloalquila, C3-C8 anel heterocíclico (por exemplo, pirrolidina, morfolina, piperidina, piperazina, 4-Me-piperazina); em que cada um pode ser adicionalmente substituído por F, Cl, Br, I, C1-C5 alquila linear ou ramificada, hidroxila, alcoxi,

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25. Método, de acordo com qualquer uma das

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26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 25, em que o método é caracterizado pelo fato de que nao é tóxico aos animais e/ou seres humanos • 2 7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 26 , caracterizado pelo fato de que a dita praga é resistente a pesticida de OP, CM e/ou SP. 28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 27, caracterizado pelo fato de que ο OP é ac efato, aspon, ci Z 1. Π fos-meti1 ..a, azametifos, carbof urano

carbofenotion, clorfenvinfos, clorpirifos, Clorpirifosetila (CPE), coumafos crotoxifos, crufomato, demeton, diazinon, diclorvos, dicrotofos, dimetoato, dioxation, disulfoton, fosfato de dietil-4-metilumbeliferila, fenilfosfonotioato de etil-4-nitrofenila, etio, etoprop, fanfur, fenamifos, fenitrotion, fensulfotion, fention, fonofos, isofenfos, malation, metamidofos, metidation, paration de metila, mevinfos, monocrotofos, naled,

o x i d orne t o n - me t i 1 a, p ci T c t* * o n or at o , f o s a 1 o n a, f o s met, fosfamidon, temef O S _Λ p -Ί. rofosfate ') de tetraetila, terbu t os, tetraclorvinfos, triclc :>rfon ou qualquer combinação dos mesmos. 29 . Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 28, caracterizado pelo fato de que o OP

é diazinon, malation ou Clorpirifos-etila (CPE).