BR112019009888B1

BR112019009888B1 - Composições sinérgicas de suplementos dietéticos de sphaeranthus indicus e terminalia chebula para saúde do fígado

Info

Publication number: BR112019009888B1
Application number: BR112019009888-7A
Authority: BR
Inventors: Alluri Venkata Krishna Raju; Bhupathiraju Kiran; Golakoti Trimurtulu; Gokaraju Ganga Raju; Gokaraju Rama Raju; Gokaraju Venkata Kanaka Ranga Raju
Original assignee: Laila Nutraceuticals
Priority date: 2016-11-20
Filing date: 2017-11-20
Publication date: 2023-03-28
Also published as: WO2018092159A1; US11071764B2; US20190365839A1; BR112019009888A2; CA3044507A1

Abstract

COMPOSIÇÕES SINÉRGICAS DE SUPLEMENTOS DIETÉTICOS DE SPHAERANTHUS INDICUS E TERMINALIA CHEBULA PARA SAÚDE DO FÍGADO A invenção divulga composições sinérgicas que compreendem, pelo menos, um componente selecionado a partir de extrato(s) e fração(ões) ou misturas respectivas derivados da Sphaeranthus indicus em combinação com, pelo menos, um componente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) ou misturas respectivas derivados da Terminalia chebula para melhoria da saúde do fígado. A invenção também divulga um método de melhoria da saúde do fígado em seres humanos e animais ao administrar as composições compreendendo, pelo menos, um componente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões) ou misturas respectivas derivados da Sphaeranthus indicus em combinação com, pelo menos, um componente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) ou misturas respectivas derivados da Terminalia chebula.

Description

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

[001] A invenção refere-se a composições sinérgicas que compreendem, pelo menos, um componente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões) ou misturas respectivas derivados da Sphaeranthus indicus em combinação com, pelo menos, um componente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) ou misturas respectivas derivados da Terminalia chebula para melhoria da saúde do fígado. A invenção refere-se, ainda, a um método de melhoria da saúde do fígado em seres humanos e animais ao administrar as composições, compreendendo, pelo menos, um componente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões) ou misturas respectivas derivados da Sphaeranthus indicus em combinação com, pelo menos, um componente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões) ou misturas respectivas derivados da Terminalia chebula.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

[002] O fígado é um órgão vital no corpo humano e executa uma série de funções, incluindo o metabolismo dos compostos endógenos e exógenos para sua fácil eliminação do corpo. O fígado também desempenha um papel importante em inúmeras outras funções, que incluem a desintoxicação, armazenamento de glicogênio, síntese da proteína plasmática e produção de hormônios. Seu tecido altamente especializado consiste principalmente de hepatócitos que regulam uma variedade de reações bioquímicas, incluindo a síntese e quebra de moléculas pequenas e complexas. No entanto, a exposição contínua a xenobióticos, por vezes, resulta em uma lesão hepática. Exemplos de vários fatores que causam danos ao fígado incluem a hepatite viral (mais comumente a hepatite B), cirrose e consumo excessivo de álcool ou medicamentos, como o acetaminofeno. A lesão hepática aguda causada por hepatotoxinas é mais uma causa de doença hepática progressiva. Assim, grande ênfase está sendo dada nos últimos anos ao desenvolvimento de novos tratamentos para doenças do fígado e suplementos dietéticos à base de plantas e nutracêuticos para melhoria da saúde e das funções do fígado.

[003] A Sphaeranthus indicus é uma importante espécie de planta da família das Asteraceae. Também é conhecida como Gorakhmundi, uma erva anual altamente ramificada e fortemente perfumada com caule alado, folhas obovadas-oblongas e capítulos compostos como flores. As partes medicinalmente úteis são a raiz, casca, folhas, flores e sementes. Os capítulos florais e frutíferos da Sphaeranthus indicus contêm 7-a-hidróxi-4,11(13)-eudesmadien-12,6-olida ou 7-hidroxifrullanolídeo como um composto principal. A S. indicus é usada na medicina ayurvédica para o tratamento de doenças associadas ao fígado, indigestão, bronquite, convulsões epilépticas, etc.

[004] A Terminalia chebula é uma árvore de folhas secas de tamanho médio a grande, nativa do sul da Ásia. É uma erva amplamente usada no sistema indiano tradicional da medicina chamado Ayurveda. É um suave purgativo, adstringente, estomacal, antibilioso e alterativo. É usada para o tratamento de flatulência, obstipação, diarreia, distúrbios digestivos, vômitos, aumento do fígado e do baço, tosse e asma brônquica e para a harmonia metabólica. Os frutos da T. chebula são usados em combinação com a Emblica officinalis e a T. bellerica (sob o nome Triphala) como ajuda digestiva e alívio da constipação. Ácido chebulágico, ácido chebulínico, ácido elágico e ácido gálico são os principais fitoquímicos do fruto da Chebula.

[005] Foi relatado um potencial hepatoprotetor e antioxidante dos extratos da Sphaeranthus indicus contra danos hepáticos induzidos pelo tetracloreto de carbono (CCL4) e danos hepáticos induzidos pelo acetaminofeno.

[006] Uma formulação fitoterápica contendo Cichorium inlybus, Sphaeranthus indicus, Rosa gallica, Swertia chirala, Coriandrum sativum, Smilax chinensis, Rheum e Emodi foi investigada para atividade hepatoprotetora sobre o dano hepático induzido por (CCL4) (Int. J. Chem. Sci.: 7(2), 2009, 617-624).

[007] A publicação de patente PCT WO2011074001A2 divulga uma formulação fitoterápica hepatoprotetora, compreendendo Andrographis paniculata, Curcuma longa, Glycyrrhiza glabra e Terminalia chebula.

[008] A sustentabilidade e o desenvolvimento das culturas animais (aquicultura, incluindo camarão, peixe, etc.), aves, suínos, bovinos e outros estão em grande parte em risco, uma vez que problemas ecológicos e patológicos significativos vêm aumentando na maioria dos países produtores. A prevenção e controle de doenças são agora a prioridade para a durabilidade desta indústria. Questões como resíduos de antibióticos, resistência bacteriana e restrições internacionais ao uso de antibióticos estão aumentando. A questão mais crítica que afeta a aquicultura é o fígado comprometido/danificado nos animais afetados. O uso de composições naturais à base de plantas para prevenção de doenças, proteção do fígado contra danos, melhoria da saúde do fígado e redução ou até mesmo eliminação do uso de antibióticos levará a uma melhor saúde e crescimento dos animais aquáticos.

[009] Há uma necessidade contínua na técnica para fornecer uma composição sinérgica alternativa que compreenda extratos à base de plantas altamente eficazes que protejam e desintoxiquem o fígado. Além disso, há uma necessidade na técnica por melhores opções de tratamento que forneçam efeitos colaterais mínimos, tornando, assim, a opção segura para o consumo humano e animal.

OBJETO DA INVENÇÃO

[010] Portanto, o principal objeto da presente invenção é fornecer uma composição sinérgica, compreendendo, pelo menos, um componente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões) ou misturas respectivas derivados da Sphaeranthus indicus em combinação com, pelo menos, um componente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões) ou misturas respectivas derivados da Terminalia chebula para melhoria da saúde do fígado em seres humanos e animais.

[011] Outro objeto da invenção é fornecer métodos de uso de tais composições sinérgicas, compreendendo, pelo menos, um componente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões) ou misturas respectivas derivados da Sphaeranthus indicus em combinação com, pelo menos, um componente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões) ou misturas respectivas derivados da Terminalia chebula para melhoria da saúde do fígado em seres humanos e animais.

[012] Ainda outro objeto da invenção é fornecer composições sinérgicas que compreendam extratos ou frações da Sphaeranthus indicus em combinação com, pelo menos, um extrato ou fração derivado(a) de ervas selecionadas a partir da Terminalia chebula e da Curcuma longa para a prevenção ou tratamento de danos no fígado causados por vários fatores, como hepatite viral, cirrose e danos ao fígado causados pelo álcool ou fármacos, como o acetaminofeno.

[013] Em outro objeto, a invenção fornece um método para melhoria da saúde do fígado em seres humanos ou animais, caracterizado pelo método compreender a suplementação dos animais com uma dose eficaz de uma composição sinérgica, compreendendo, pelo menos, um componente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões) ou misturas respectivas derivados da Sphaeranthus indicus em combinação com, pelo menos, um componente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões) ou misturas respectivas derivados da Terminalia chebula.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[014] A presente invenção fornece novas composições sinérgicas, compreendendo, pelo menos, um componente selecionado a partir de extratos ou frações derivados da Sphaeranthus indicus em combinação com, pelo menos, um componente selecionado a partir de extratos ou frações derivados da Terminalia chebula para melhoria da saúde do fígado. Estas composições sinérgicas contêm, ainda, opcionalmente, pelo menos, um componente biologicamente ativo adicional derivado de plantas, animais e microrganismos em associação com ativos, excipientes, transportadores ou diluentes farmacêutica ou nutraceuticamente aceitáveis.

[015] Em outro aspecto, a invenção fornece métodos de uso das composições sinérgicas, compreendendo, pelo menos, um componente selecionado a partir de extratos ou frações derivados da Sphaeranthus indicus em combinação com, pelo menos, um componente selecionado a partir de extratos ou frações derivados da Terminalia chebula ou misturas respectivas para melhoria da saúde do fígado.

[016] Em outro aspecto, a invenção fornece composições sinérgicas, compreendendo, pelo menos, um componente selecionado a partir de extratos ou frações derivados da Sphaeranthus indicus em combinação com, pelo menos, um componente selecionado a partir de extratos ou frações derivados da Terminalia chebula para a prevenção ou tratamento de danos no fígado causados por vários fatores, como hepatite viral, cirrose e danos ao fígado causados pelo álcool ou fármacos, como o acetaminofeno.

[017] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para melhoraria da saúde do fígado ou tratamento de danos no fígado em seres humanos e animais causados por vários fatores, tais como hepatite viral, cirrose e danos no fígado causados pelo álcool ou fármacos, tais como o acetaminofeno, caracterizado pelo método compreender a suplementação dos seres humanos ou animais com uma dose eficaz da composição sinérgica, compreendendo, pelo menos, um componente selecionado a partir de extratos ou frações derivados da Sphaeranthus indicus em combinação com, pelo menos, um componente selecionado a partir de extratos ou fracções derivados da Terminalia chebula ou Curcuma longa.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[018] Figura 1: Efeito da composição LN16025F1 (G3), composição LN16013F2 (G4) e composição LN16049F1 (G5) sobre a ALT, AST e TB no 15° dia. Os valores são representados como a média ± S.E.M; n = 6 animais por grupo, onde ###P<0,001 e ##P<0,01, em comparação com o grupo de controle de veículo (G1), onde ***p<0,001 e **P<0,01, em comparação com o grupo de controle de doenças (G2), usando teste ANOVA unidirecional, seguido por pós-teste de Dunnett.

[019] Figura 2: (A) Diagrama de barras que mostra uma redução na melhoria do período de cultivo no tamanho da colheita e contagem de camarões em tanque de cultivo suplementado com a composição 34 a 2 g por kg de ração/dia em comparação com um tanque de controle. (B) Diagrama de barras que mostra o efeito da composição 34 na FCR (feed conversion ratio | proporção de conversão alimentar). A suplementação da composição 34 a 2 g por kg de ração/dia mostrou melhoria na FCR em comparação com o tanque de controle.

[020] Figura 3: (A) Fotomicrografia do hepatopâncreas de um camarão infectado com doença do intestino branco, mostrando extensa vacuolização/degeneração do epitélio interno dos túbulos e obstrução do lúmen. H&E x 200. (B) Maior ampliação de A, mostrando extensa vacuolização/degeneração/necrose do epitélio interno dos túbulos hepatopancreáticos. Observe a descamação das microvilosidades no lúmen (seta), causando obstrução e infiltração de células mononucleares (ponta da seta) nos espaços intertubulares. H&E x 400. (C) Fotomicrografia de um camarão tratado com a composição 34, mostrando numerosas seções transversais de túbulos com epitélio interno intacto normal (seta) e lúmen (L) H&E 200.

[021] Figura 4: Seção transversal do fígado de um peixe Rohu; As Figuras A e B mostram a seção do fígado do peixe Rohu infectado com numerosos depósitos de pigmento biliar (estagnação biliar), grau moderado de inflamação (infiltração linfocitária) e congestão grave (seta). A Figura C mostra o pós-tratamento com a composição 34, a seção do fígado do peixe mostra uma ausência completa de grânulos de pigmento biliar dentro dos hepatócitos com inflamação mínima (seta) na periferia.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[022] O fígado é uma parte vital da anatomia humana/animal e suporta quase todos os outros órgãos do corpo. Devido à sua localização estratégica e funções multidimensionais como o principal órgão desintoxicante e como órgão que mantém a homeostase metabólica, o fígado é propenso a muitos distúrbios. Espécies Reativas do Oxigênio (ROS | Reactive Oxygen Species) são consideradas como a origem de numerosos distúrbios hepáticos, cujos níveis são conhecidos por serem aumentados pela exposição a certos medicamentos ou produtos químicos, infecções, condições externas, lesão tecidual, etc. As Espécies Reativas do Oxigênio (ROS) desempenham um papel crucial na defesa do hospedeiro contra infecções bacterianas e na ativação controlada de muitas vias de sinalização intracelular. Vários sistemas enzimáticos localizados e expressos diferentemente contribuem para a formação das ROS no fígado, incluindo NO-sintases endoteliais, citocromos P450 monooxigenases e NADPH oxidase. O aumento da geração de ROS pode causar uma estimulação aberrante de vias, levando a um comportamento celular anormal. Sistemas antioxidantes como a Glutationa, Superóxido dismutase e Catalase removem o excesso de ROS para manter a homeostase celular normal. Nas doenças crônicas do fígado, há um aumento da produção das ROS, enquanto a atividade dos sistemas antioxidantes é diminuída, resultando em estresse oxidativo, um estado comumente observado em pessoas com abuso de álcool, infecção por hepatite C, colestase crônica e fibrogênese hepática. As células estreladas hepáticas, o principal tipo de célula fibrogênica no fígado, produzem uma forma não fagocítica de NADPH, que modula a função fibrogênica dessas células e, portanto, a NADPH oxidase evoluiu como um alvo potencial na patogênese da fibrose hepática. Assim, os inventores têm exibido um vasto número de extratos à base de ervas para a modulação da atividade da NADPH oxidase em um modelo celular e descobriram que os extratos de capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17131) e dos frutos da Terminalia chebula (LN17129) demonstraram potente atividade de inibição da NADPH oxidase, conforme resumido na Tabela 1.

[023] Os inventores prepararam aleatoriamente várias composições, compreendendo frações ou extratos derivados da Sphaeranthus indicus, em combinação com extratos ou frações derivados da Terminalia chebula e testaram sua eficácia na inibição da NADPH oxidase para identificação de composições que demonstrassem uma inibição sinérgica. Verificou-se surpreendentemente que composições compreendendo, pelo menos, um componente selecionado a partir de extratos ou frações derivados da Sphaeranthus indicus em combinação com, pelo menos, um componente selecionado a partir de extratos ou frações derivados da Terminalia chebula, demonstraram uma inibição mais potente da NADPH oxidase quando comparado com a eficácia apresentada pelos extratos individuais correspondentes derivados da Sphaeranthus indicus e da Terminalia chebula. O extrato enriquecido com capítulos florais da S. indicus (LN17131) e o extrato aquoso do fruto da Terminalia chebula (LN17129), por exemplo, demonstraram 43,24% e 13,79% de inibição, respectivamente, a uma concentração de 125 ng/ml em células HL-60. A composição 2 (LN16013F2) contendo esses extratos na proporção de 1:1, juntamente com os excipientes, mostrou 71,62% de inibição na concentração de 250 ng/ml, o que é significativamente melhor do que o efeito aditivo (43,24% + 13,79% = 57,03%) destes dois ingredientes, sugerindo a inibição sinérgica da NADPH pelo extrato enriquecido dos capítulos florais da S. indicus (LN17131) e o extrato do fruto da Terminalia chebula (LN17129). Estes dois ingredientes também demonstraram sinergismo quando combinados em outras proporções, 1:2, 1:3 e 3:1, conforme mostrado pelos efeitos inibidores melhorados da NADPH oxidase exibidos pelas composições 1, 3 e 4, (LN16013F1, LN16013F3 e LN16013F4), respectivamente. Os resultados são resumidos na Tabela 1.

[024] Os efeitos sinérgicos apresentados por estes ingredientes foram testados em modelos in vivo. Por exemplo, o extrato enriquecido com capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17131), a composição (LN16013F2) compreendendo o extrato enriquecido com capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17131) + extrato aquoso da Terminalia chebula (LN17129) e o extrato aquoso da Terminalia chebula (LN17129) foram suplementados aos grupos G3, G4 e G5, respectivamente. O tratamento oral dos animais do grupo G4 com a composição LN16013F2 na dose de 200 mg/kg resultou em níveis séricos de Alanina Aminotransferase (ALT | Alanine Aminotransferase) significativamente menores (129,17 ± 20,18) quando comparados aos níveis da ALT que foram observados nos animais do grupo G3 (255,83 ± 41,12) tratados com LN17131 e nos animais do grupo G5 (275 ± 133,9) tratados com LN17129 nos mesmos níveis de dose. Da mesma forma, o tratamento oral com a composição LN16013F2 (G4) a 200 mg/kg resultou em melhor redução dos níveis séricos de Aspartato Aminotransferase (AST | Aspartate Aminotransferase) (334,17 ± 57,34), quando comparado aos níveis de AST observados no grupo tratado com LN17131 (G3; 548,33 ± 128,6) e no grupo tratado com LN17129 (G5; 390,83 ± 40,77). Estes resultados, conforme resumidos na Tabela 7, confirmam, ainda, a eficácia sinérgica da composição LN16013F2 no controle da hepatotoxicidade, controlando os níveis de enzimas hepáticas induzidas pela CCL4. O nível reduzido da AST e ALT sérica é uma indicação clara da melhoria do estado funcional do fígado.

[025] O extrato aquoso de capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17133) também apresentou eficácia sinérgica similar quando combinado com os extratos derivados da Terminalia chebula. Por exemplo, o extrato aquoso de capítulos florais da S. indicus (LN17133) e o extrato aquoso do fruto da Terminalia chebula (LN17129) mostraram uma NADPH oxidase com 21,47% e 45,29% de inibição, respectivamente, a uma concentração de 312,5 ng/ml em células HL-60. A composição 6 (LN16049F2) contendo estes extratos na proporção de 1:1 mostrou 81,9% de inibição na concentração de 625 ng/ml, que é significativamente melhor do que o efeito aditivo (21,47% + 45,29% = 66,76%) destes dois ingredientes, sugerindo uma inibição sinérgica da NADPH entre os extratos aquosos de capítulos florais da S. indicus (LN17133) e do fruto da Terminalia chebula (LN17129). As outras composições 5, 7, 8 e 9, contendo os extratos de capítulos florais da S. indicus (LN17133) e o extrato do fruto da Terminalia chebula (LN17129) em outras proporções, como 1:2 (LN16049F1), 2:1 (LN16049F3), 3:1 (LN16049F4) e 1:3 (LN16049F5) também mostraram sinergismo, conforme demonstrado por seus efeitos inibidores da NADPH oxidase melhorados, quando comparados ao ingrediente individual, conforme resumido na Tabela 2.

[026] A glutationa é um importante antioxidante em seres humanos e animais. A forma reduzida da glutationa (GSH) é muito eficaz na prevenção e melhoria dos danos aos componentes celulares causados por ROS, peróxidos, peróxidos lipídicos e, portanto, a glutationa (GSH) beneficia a saúde do fígado combatendo o estresse oxidativo causado ao tecido hepático após exposição ao excesso de produtos químicos, poluentes, toxinas, álcool, etc. Assim, os extratos e frações derivados da Sphaeranthus indicus e da Terminalia chebula e suas composições foram avaliados quanto à sua eficácia em aumentar os níveis da GSH nas células hepáticas Hep G2 induzidos por Hidroperóxido de terc -butila e os resultados são resumidos na Tabela 4.

[027] A geração de Espécies Reativas do Oxigênio (ROS) leva ao estresse oxidativo e desempenha um papel importante na patogênese de muitas doenças do fígado. O ataque de radicais livres em lipídios de membrana poliinsaturada produz hidroperóxido (peroxidação lipídica), o que leva à produção de um malondialdeído (MDA). Sabe-se que o aumento da produção de MDA está correlacionado a enzimas hepáticas elevadas (AST e ALT) e, como tal, o MDA é um marcador para a saúde do fígado. Assim, os inventores avaliaram algumas das composições quanto à sua inibição sinérgica contra o MDA induzido por Hidroperóxido de terc-butila em células hepáticas Hep G2 e os resultados são resumidos nas Tabelas 5 e 6.

[028] Além dos dados acima revelados, diferentes composições contendo acetona, acetato de etila ou extratos etanólicos de capítulos florais da Sphaeranthus indicus em combinação com água, hidroálcool e extratos de acetona da Terminalia chebula, e composições contendo etanol, acetona, acetato de etila ou extratos aquosos de partes aéreas da Sphaeranthus indicus, em combinação com extratos aquosos, hidroálcool ou acetona da Terminalia chebula, também demonstraram uma inibição sinérgica da atividade da NADPH oxidase e/ou MDA, aumentando os níveis de glutationa reduzida (GSH), conforme resumido nas Tabelas 3A, 3B 4, 5 e 6. Os resultados sugerem, assim, que o sinergismo observado entre estas duas ervas é independente do solvente usado para a extração.

[029] A eficácia mostrada pela composição 5 (LN16049F1), juntamente com a composição 2 (LN16013F2) e a composição 10 (LN16025F1) in vitro foi, ainda, validada in vivo em modelo de dano hepático induzido por acetaminofeno em ratos. O estudo mostrou que o Acetaminofeno aumentou acentuadamente as atividades dos níveis séricos da ALT e AST no grupo de controle da doença (G2) em comparação com o grupo controle do veículo (G1). No entanto, a suplementação dos compostos LN16025F1, LN160I3F2, LN16049FI e Silimarina nos animais dos grupos de tratamento G3, G4, G5 e G6 reduziu significativamente o nível sérico da AST e ALT nos dias 12 e 15. Os dados para o 15° dia são resumidos na Tabela 8 e na Figura 1. Além disso, um grau acentuado de degeneração/vacuolização centrolobular de hepatócitos e um grau mínimo a acentuado de proliferação de tecido conjuntivo fibroso pericapsular misturado com adipócitos foram evidentes em fígados de ratos intoxicados com Acetaminofeno do grupo de controle de doença (G2), indicando indução de hepatotoxicidade ou dano hepático. O exame microscópico dos fígados dos animais dos grupos G3, G4, G5 e G6, tratados com LN16025F1, LN16013F2, LN16049F1 e Silimarina, respectivamente, não revelou vacuolização/degeneração dos hepatócitos, o que indica potenciais efeitos de melhoria destes itens do teste contra o dano hepático induzido pelo Acetaminofeno em ratos. O grau de proliferação de tecido conjuntivo fibroso pericapsular/adipócitos reduziu significativamente nos fígados dos animais dos grupos G3, G4 e G6, enquanto tais lesões foram completamente ausentes nos fígados de animais suplementados com a composição LN16049F1 (G5).

[030] Assim como o fígado humano (hepático), o hepatopâncreas em muitos animais aquáticos é o órgão central responsável pelo metabolismo dos alimentos/rações consumidos pelos animais. Ele exerce as funções do fígado e do pâncreas em animais aquáticos, como o camarão, peixe, caranguejo, etc. A saúde do fígado pode ser comprometida por conta de diversas doenças, o que leva à absorção inadequada da nutrição, crescimento atrofiado e deterioração na saúde geral ou até morte em casos severos. Em animais aquáticos, o fígado pode ser danificado devido a infecções ou uso regular de antibióticos ou pesticidas durante a aquicultura. Os agricultores costumam usar grandes doses de antibióticos e pesticidas desde os primeiros estágios durante a aquicultura, de forma a melhorar a taxa de sobrevivência e prevenir infeções. Os agricultores também usam substâncias químicas nocivas para controle das condições do tanque. Isso leva ao enfraquecimento da função hepática e afeta ainda mais o intestino do animal.

[031] Assim, os inventores testaram algumas composições da presente invenção em tanques de camarão e descobriram surpreendentemente que a composição contendo extrato ou frações derivadas de capítulos florais da Sphaeranthus indicus em combinação com um extrato derivado da Terminalia chebula, contendo opcionalmente um ou mais dos extratos vegetais derivados da Allium sativum, Andrographis paniculata e Ocimum sanctum, Curcuma longa, Phyllanthus amarus, Silybum marianum (cardo de leite), Tephrosia purpúrea e Tinospora sinensis melhorou a saúde hepatopancreática e aumentou a taxa de sobrevivência, fornecendo uma redução do tempo de cultura, melhor absorção nutricional da ração e melhoria da Proporção de Conversão Alimentar (FCR | Feed Conversion Ratio), do crescimento e da saúde geral. Por exemplo, a suplementação da composição 34 a 2 g por kg de ração/dia demonstrou redução no período de cultura em 5 dias. Uma melhoria no tamanho da colheita e na contagem (número de camarões/kg) também foi observada conforme mostrado na Figura 2A e 2B. De forma semelhante, a suplementação da composição 34 a 2 g por kg de ração/dia para camarões infectados com a doença do intestino branco demonstrou recuperação completa da vacuolização/degeneração do epitélio interno dos túbulos e obstrução da luz, conforme mostrado nas Figuras 3A, 3B e 3C.

[032] Além disso, a composição também demonstrou prevenir várias doenças associadas a danos no fígado, tais como Doença de necrose hepatopancreática aguda (AHPND | Acute hepatopancreatic necrosis disease), Doença do intestino branco (WGD | white gut disease), Síndrome das fezes brancas, Síndrome da mancha branca, Doença devido ao parasita Enterocytozoon hepatopenaei (EHP | Enterocytozoon hepatopenaei), síndrome da mortalidade precoce (EMS | Early mortality syndrome), Síndrome da mortalidade por condução (RMS | Running mortality syndrome), Vibriose, Doença das guelras negras, Necrose muscular, Doença do músculo branco, Síndrome da cãibra muscular, Síndrome da concha solta, Vírus da síndrome de Taura (TSV | Taura Syndrome Virus), Vírus da cabeça amarela (YHV | Yellow Head Virus), Vírus da necrose infecciosa hipodérmica e hematopoiética (IHHNV | Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus), etc., em camarões e columnaris, doença das guelras, íctio, hidropisia, cauda e barbatana vermelhas, infecções fúngicas, doença da mancha branca, olho saltado, olho nublado, doença da bexiga natatória, infestação de piolhos e nematódeos, doenças induzidas pela qualidade da água, constipação, anorexia, chilodonella, ergasilus, tuberculose, glugea, henneguya, hexamita, doença do furo na cabeça, ferimentos, sanguessugas em aquários, linfócitos, veludo marinho, doença do neon tetra, Anemia Infecciosa do Salmão (ISA | Infectious Salmon Anaemia), Necrose Hematopoiética Infecciosa (IHN | Infectious Hematopoietic Necrosis), Furunculose, Doença Renal Bacteriana e infecção por helmintos, etc., em peixes. Além disso, a suplementação da Composição 34 na alimentação de peixes reduziu completamente os grânulos de pigmentos biliares dentro dos hepatócitos e a inflamação na periferia do peixe Rohu, conforme resumido nas Figuras 4A, 4B e 4C. Os resultados anteriores manifestam que as composições da presente invenção são eficazes na proteção do hepatopâncreas, na melhoria da saúde hepatopancreática ou no tratamento de doenças associadas ao hepatopâncreas em animais aquáticos.

[033] Por conseguinte, em uma aplicação preferencial, a invenção fornece composições sinérgicas que compreendem, pelo menos, um componente selecionado a partir de extratos, frações ou misturas respectivas derivados da Sphaeranthus indicus em combinação com, pelo menos, um componente selecionado a partir de extratos, frações, composto(s) ativo(s) ou misturas respectivas derivados da Terminalia chebula para proteção do fígado, melhoria da saúde do fígado ou tratamento de doenças associadas ao fígado em seres humanos e animais.

[034] Em outra aplicação, a invenção fornece composição(ões) sinérgica(s), compreendendo, pelo menos, um componente selecionado a partir de extratos, frações ou misturas respectivas derivados da Sphaeranthus indicus em combinação com, pelo menos, um componente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) ou misturas respectivas derivados da Terminalia chebula para proteção do fígado, melhoraria da saúde do fígado ou tratamento de doença associadas ao fígado em seres humanos e animais, caracterizado pelas composições sinérgicas poderem conter, opcionalmente, excipientes, transportadores ou diluentes farmacêutica, nutracêutica ou dieteticamente aceitáveis, em que os excipientes, transportadores ou diluentes farmacêutica, nutracêutica ou dieteticamente aceitáveis podem ser selecionados a partir da glicose, frutose, sacarose, maltose, dextrina amarela, dextrina branca, aerosil, celulose microcristalina, estearato de cálcio, estearato de magnésio, sorbitol, esteviosídeos, xarope de milho, lactose, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido málico, ácido succínico, ácido láctico, ácido L-ascórbico, dl-alfa- tocoferol, glicerina, propilenoglicol, éster graxo de glicerina, éster graxo de poliglicerina, éster graxo de sacarose, éster graxo de sorbitano, éster graxo de propilenoglicol, acácia, carragenina, caseína, gelatina, pectina, ágar, grupo das vitaminas B, nicotinamida, pantotenato de cálcio, aminoácidos, proteínas, sais de cálcio, pigmentos, sabores, conservantes, água destilada, solução salina, solução aquosa de glicose, álcool, propilenoglicol e polietilenoglicol, diversos óleos animais e vegetais, parafina branca macia, parafina, aromatizantes, corantes e cera.

[035] Em outra aplicação, a invenção fornece composição(ões) sinérgica(s), compreendendo, pelo menos, um componente selecionado a partir de extratos, frações ou misturas respectivas derivados da Sphaeranthus indicus em combinação com, pelo menos, um componente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões), componente(s) ativo(s) ou misturas respectivas derivados da Terminalia chebula para proteção do fígado, melhoria da saúde do fígado ou tratamento de doenças associadas ao fígado em seres humanos e animais, caracterizado pelas composições sinérgicas também conterem, opcionalmente, pelo menos, um componente adicional selecionado do grupo que consiste em ingredientes naturais biologicamente ativos selecionados dentre os conhecidos antioxidantes, agentes anti-inflamatórios, agentes imunomoduladores e dos agentes conhecidos para proteção do fígado, melhoria da saúde do fígado e tratamento de doenças do fígado; ingredientes ativos farmaceuticamente aceitáveis, vitaminas, minerais, em que os agentes conhecidos para proteção do fígado, melhoria da saúde do fígado e tratamento de doenças associadas ao fígado são selecionados a partir de extratos, frações, fitoquímicos puros ou misturas respectivas derivadas das matérias-primas vegetais da Aegle marmelos, Allium sativum, Andrographis paniculata, Curcuma longa, Oscimum sanctum, Phyllanthus amarus, Silybum marianum (cardo de leite), Tephrosia purpúrea e Tinospora sinensis.

[036] Em outra aplicação, a invenção fornece composição(ões) sinérgica(s), compreendendo, pelo menos, um componente selecionado a partir de extratos, frações ou misturas derivados da Sphaeranthus indicus em combinação com, pelo menos, um componente selecionado de extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) ou misturas respectivas derivados da Terminalia chebula para proteção do fígado, melhoria da saúde do fígado ou tratamento de doenças associadas ao fígado em seres humanos e animais, caracterizado pelas partes da planta usadas na presente invenção para preparação das composições sinérgicas serem selecionadas a partir de frutos, capítulos florais, flores, cascas, sementes, folhas, caules, caules macios, lascas de árvores, toda a planta, partes aéreas ou misturas respectivas.

[037] Em outra aplicação, a invenção fornece composição(ões) sinérgica(s), compreendendo, pelo menos, um componente selecionado a partir de extratos, frações ou misturas respectivas derivados da Sphaeranthus indicus em combinação com, pelo menos, um componente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) ou misturas respectivas derivados da Terminalia chebula para proteção do fígado, melhoria da saúde do fígado ou tratamento de doença associadas ao fígado em seres humanos e animais, caracterizado pelos solventes usados para preparação dos extratos e frações poderem ser selecionados a partir de, entre outros, álcoois C1-C5, como o etanol, metanol, n-propanol, álcool isopropílico; cetonas como a acetona, metilisobutilcetona; solventes clorados como o diclorometano e o clorofórmio; água; hidrocarbonetos C1-C7, tais como o hexano; ésteres como acetato de etila e misturas respectivas.

[038] Em outra aplicação, a invenção fornece composição(ões) sinérgica(s), compreendendo, pelo menos, um componente selecionado a partir de extratos, frações ou misturas respectivas derivados da Sphaeranthus indicus em combinação com, pelo menos, um componente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões), componente(s) ativo(s) ou misturas respectivas derivados da Terminalia chebula para proteção do fígado, melhoria da saúde do fígado ou tratamento de doenças associadas ao fígado em seres humanos e animais, caracterizado pelas composições poderem ser formuladas em uma forma de dosagem selecionada a partir de uma forma em pó seco, forma líquida, bebida, alimento, suplemento dietético ou qualquer outras forma adequada, como um comprimido, uma cápsula, um ursinho de goma ou mastigável macio.

[039] Em outra aplicação, a invenção fornece composição(ões) sinérgica(s), compreendendo, pelo menos, um componente selecionado a partir de extratos, frações ou misturas respectivas derivados da Sphaeranthus indicus em combinação com, pelo menos, um componente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões), componente(s) ativo(s) ou misturas respectivas derivados da Terminalia chebula para proteção do fígado, melhoria da saúde do fígado ou tratamento de doenças associadas ao fígado em seres humanos e animais, caracterizado por composição(ões) poder(em) ser feita(s) na forma de dosagem de alimentos saudáveis ou alimentos para usos específicos da saúde, alimentos sólidos como chocolate ou barras nutricionais, alimentos semissólidos como cremes, geleias ou géis e também bebidas e similares, como refrescos, bebidas com bactérias do ácido láctico, pastilhas, doces, gomas de mascar, doces de goma, iogurtes, sorvetes, pudins, jujubas moles adzuki, gelatinas, cookies, chás, refrigerantes, sucos, leites, cafés, cereais, salgadinhos e afins.

[040] Em outra aplicação, a invenção fornece composição(ões) sinérgica(s), compreendendo, pelo menos, um componente selecionado a partir de extratos, frações ou misturas respectivas derivados da Sphaeranthus indicus em combinação com, pelo menos, um componente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões), componente(s) ativo(s) ou misturas respectivas derivados da Terminalia chebula para proteção do fígado, melhoria da saúde do fígado ou tratamento de doenças associadas ao fígado em seres humanos e animais, caracterizado pelo peso do componente derivado da Sphaeranthus indicus variar na faixa de 10% a 90% da composição e pelo peso do componente derivado da Terminalia chebula variar na faixa de 90% a 10%.

[041] Em outra aplicação, a invenção fornece composição(ões) sinérgica(s), compreendendo, pelo menos, um componente selecionado a partir de extratos, frações ou misturas respectivas derivados da Sphaeranthus indicus em combinação com, pelo menos, um componente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões), componente(s) ativo(s) ou misturas respectivas derivados da Terminalia chebula para proteção do fígado, melhoria da saúde do fígado ou tratamento de doenças associadas ao fígado em seres humanos e animais, caracterizado pelo extrato e fração da Sphaeranthus indicus conter 7-hidroxifrullanolídeo na faixa de 12% a 30% no caso de extratos de solventes e de 1% a 10% de ácidos clorogênicos totais no caso de extratos aquosos conforme método HPLC de análise, e pelo extrato e fração derivados da Terminalia chebula conterem polifenóis totais na faixa de 20% a 80% conforme método espectrométrico de análise, de 1% a 6% de ácidos chebulágicos totais, de 1% a 12% de ácidos chebulínicos totais, de 1% a 10% de ácidos elágicos e/ou de 1% a 10% de ácidos gálicos conforme o método HPLC de análise.

[042] Em outra aplicação, a invenção fornece o uso de uma composição(s) sinérgica(s), compreendendo, pelo menos, um componente selecionado a partir de extratos, frações ou misturas respectivas derivados da Sphaeranthus indicus em combinação com, pelo menos, um componente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) ou misturas respectivas derivados da Terminalia chebula para proteção do fígado, melhoria da saúde do fígado ou tratamento de doença associada ao fígado em seres humanos e animais.

[043] Ainda em outra aplicação, a invenção fornece método(s) de proteção do fígado, melhoria da saúde do fígado ou tratamento de, pelo menos, uma doença associada ao fígado em seres humanos e animais, incluindo a hepatite viral, cirrose, doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD| non-alcoholic fatty liver disease) e danos no fígado causados pelo álcool ou fármacos, tais como o acetaminofeno, níveis elevados de alanina transaminase (ALT), aspartato transaminase (AST), fosfatase alcalina (ALP | alkaline phosphatase), bilirrubina, triglicerídeos (TG | triglycerides), gamaglutamiltransferase, caracterizado pelo método compreender a suplementação de seres humanos e animais com uma dose eficaz da composição sinérgica, compreendendo, pelo menos, um componente selecionado a partir de extratos, frações ou misturas respectivas derivados da Sphaeranthus indicus em combinação com, pelo menos, um componente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) ou misturas respectivas derivados da Terminalia chebula.

[044] Em outra aplicação, a invenção fornece método(s) de proteção do fígado, melhoria da saúde do fígado ou tratamento de, pelo menos, uma doença associada ao fígado em seres humanos e animais, incluindo a hepatite viral, cirrose, doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD) e danos no fígado causados pelo álcool ou fármacos, tais como o acetaminofeno, níveis elevados de alanina transaminase (ALT), aspartato transaminase (AST), fosfatase alcalina (ALP), bilirrubina, triglicerídeos (TG), gamaglutamiltransferase, caracterizado pelo método compreender a suplementação dos seres humanos ou animais com uma dose eficaz da composição sinérgica, compreendendo, pelo menos, um componente selecionado a partir de extratos, frações ou misturas respectivas derivados da Sphaeranthus indicus em combinação com, pelo menos, um componente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) ou misturas respectivas derivados da Terminalia chebula, o que contêm, opcionalmente, pelo menos, um componente adicional selecionado do grupo que consiste em ingredientes naturais biologicamente ativos selecionados dentre os conhecidos antioxidantes, agentes anti-inflamatórios, agentes imunomoduladores e dos agentes conhecidos para proteção do fígado, melhoria da saúde do fígado e tratamento de doenças do fígado; ingredientes ativos farmaceuticamente aceitáveis, vitaminas, minerais; ativo, excipientes, transportadores ou diluentes farmacêutica, nutracêutica ou dieteticamente aceitáveis ou misturas respectivas, em que os agentes conhecidos para proteção do fígado, melhoria da saúde do fígado e tratamento de doenças associadas ao fígado são selecionados a partir de extratos, frações, fitoquímicos puros ou misturas respectivas derivadas das matérias-primas vegetais da Aegle marmelos, Allium sativum, Andrographis paniculata, Curcuma longa, Oscimum sanctum, Phyllanthus amarus, Silybum marianum (cardo de leite), Tephrosia purpurea e Tinospora sinensis.

[045] Em outra aplicação, a invenção fornece método(s) de proteção do fígado, melhoria da saúde do fígado ou tratamento de, pelo menos, uma doença associada ao fígado em seres humanos e animais, caracterizado pelos animais serem selecionados a partir de espécies terrestres e aquáticas, em que o método compreende a suplementação do animal com uma dose eficaz do composto sinérgico, compreendendo, pelo menos, um componente selecionado a partir de extratos, frações ou misturas respectivas derivados da Sphaeranthus indicus em combinação com, pelo menos, um componente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) ou misturas respectivas derivados da Terminalia chebula, contendo, opcionalmente, pelo menos, um componente adicional selecionado do grupo que consiste em ingredientes naturais biologicamente ativos selecionados dentre os conhecidos antioxidantes, agentes anti-inflamatórios, agentes imunomoduladores e dos agentes conhecidos para proteção do fígado, melhoria da saúde do fígado e tratamento de doenças do fígado; ingredientes ativos farmaceuticamente aceitáveis, vitaminas, minerais; ativo, excipientes, transportadores ou diluentes farmacêutica, nutracêutica ou dieteticamente aceitáveis ou misturas respectivas, em que os agentes conhecidos para proteção do fígado, melhoria da saúde do fígado e tratamento de doenças associadas ao fígado são selecionados a partir de extratos, frações, fitoquímicos puros ou misturas respectivas derivadas das matérias-primas vegetais da Aegle marmelos, Allium sativum, Andrographis paniculata, Curcuma longa, Oscimum sanctum, Phyllanthus amarus, Silybum marianum (cardo de leite), Tephrosia purpurea e Tinospora sinensis.

[046] Em outra aplicação, a invenção fornece método(s) de proteção do fígado, melhoria da saúde do fígado ou tratamento de, pelo menos, uma doença associada ao fígado em animais, caracterizado pelas doenças associadas ao fígado de espécies aquáticas serem selecionadas dentre: Doença da necrose hepatopancreática aguda (AHPND), Doença do intestino branco, Síndrome das fezes brancas, Síndrome da mancha branca, Doença devido ao parasita Enterocytozoon hepatopenaei (EHP), síndrome da mortalidade precoce (EMS), Síndrome da mortalidade por condução (RMS), Vibriose, Doença das guelras negras, Necrose muscular, Doença do músculo branco, Síndrome da cãibra muscular, Síndrome da concha solta, Vírus da síndrome de Taura (TSV), Vírus da cabeça amarela (YHV), Vírus da necrose infecciosa hipodérmica e hematopoiética (IHHNV), etc., em camarões e columnaris, doença das guelras, íctio, hidropisia, cauda e barbatana vermelhas, infecções fúngicas, doença da mancha branca, olho saltado, olho nublado, doença da bexiga natatória, infestação de piolhos e nematódeos, doenças induzidas pela qualidade da água, constipação, anorexia, chilodonella, ergasilus, tuberculose, glugea, henneguya, hexamita, doença do furo na cabeça, ferimentos, sanguessugas em aquários, linfócitos, veludo marinho, doença do neon tetra, Anemia Infecciosa do Salmão (ISA), Necrose Hematopoiética Infecciosa (NHI), Furunculose, Doença Renal Bacteriana e infecção por helmintos, em que o método compreende a suplementação do mamífero com uma dose eficaz da composição sinérgica, compreendendo, pelo menos, um componente selecionado a partir de extratos, frações ou misturas respectivas derivados da Sphaeranthus indicus em combinação com, pelo menos, um componente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) ou misturas respectivas derivados da Terminalia chebula, contendo, opcionalmente, pelo menos, um componente adicional selecionado do grupo que consiste em ingredientes naturais biologicamente ativos, selecionados dentre conhecidos antioxidantes, agentes anti-inflamatórios, agentes imunomoduladores e dos agentes conhecidos para proteção do fígado, melhoria da saúde do fígado e tratamento de doenças do fígado; ingredientes ativos farmaceuticamente aceitáveis, vitaminas, minerais; ativo, excipientes, transportadores ou diluentes farmacêutica, nutracêutica ou dieteticamente aceitáveis ou misturas respectivas, em que os agentes conhecidos para proteção do fígado, melhoria da saúde do fígado e tratamento de doenças associadas ao fígado são selecionados a partir de extratos, frações, fitoquímicos puros ou misturas respectivas derivadas das matérias-primas vegetais da Aegle marmelos, Allium sativum, Andrographis paniculata, Curcuma longa, Oscimum sanctum, Phyllanthus amarus, Silybum marianum (cardo de leite), Tephrosia purpurea e Tinospora sinensis.

[047] Os exemplos a seguir, que incluem aplicações preferenciais, servirão para ilustrar a prática desta invenção, sendo entendido que as particularidades mostradas são apenas a título de exemplo e para fins de discussão ilustrativa das aplicações preferenciais da invenção.

EXEMPLO 1

[048] A) Preparação do extrato enriquecido de capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17131): Capítulos florais secos da Sphaeranthus indicus (l Kg) foram pulverizados até se tornarem um pó granulado e extraídos com álcool etílico (5L) durante 2h à temperatura ambiente. A extração foi repetida três vezes (3 x 3L) sob condições de temperatura semelhantes. Os extratos foram combinados, o extrato combinado foi filtrado com precisão e a solução límpida foi evaporada sob pressão reduzida para obtenção de um líquido em forma de xarope. Em seguida, foi adicionada água (500 mL) ao concentrado e o conteúdo foi bem misturado. A mistura foi extraída com EtOAc (4 x 500 ml). Os extratos de EtOAc combinados foram concentrados sob vácuo para dar origem à fração do extrato de acetato de etila (50 g), contendo 20,6% de 7-hidroxifrullanolídeo. A camada aquosa foi concentrada separadamente sob pressão reduzida para fornecer uma fração de extrato aquoso do resíduo (80 g). A fração do extrato de acetato de etila e as frações do extrato aquoso foram combinadas em uma proporção de 3:1 para obtenção do extrato enriquecido de capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17131) contendo 15,2% de 7-hidroxifrullanolídeo. Alternativamente, estes dois extratos podem ser combinados em qualquer proporção desejada, de modo a manter uma concentração necessária de um marcador ativo ou fitoquímico.

[049] B) Preparação de extratos aquosos de capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17133).

[050] Os capítulos florais secos da Sphaeranthus indicus (100 g) foram pulverizados e o pó foi extraído com água (700 ml) usando o processo de percolação contínua à temperatura ambiente durante 1,5h em um aparelho Soxhlet. O extrato foi removido do Soxhlet e a matéria-prima usada foi re-extraída duas vezes com água (2 x 500 ml) sob condições similares. Os extratos foram combinados, filtrados com precisão e concentrados em um evaporador rotativo sob vácuo a 40-50°C para obtenção do extrato aquoso dos capítulos florais da Sphaeranthus indicus como um resíduo marrom (LN17133, 17,2g), que contém 3,35% do total de ácidos orogênicos chi (ácido dicafeoilquínico e ácido 5-O-cafeoilquínico) conforme o método de análise por HPLC.

[051] C) Preparação de extratos de acetona de capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17122) e extratos de acetato de etila (LN17123): A matéria-prima de 100 g de capítulos florais da Sphaeranthus indicus foi pulverizada e o pó extraído com acetona (600 ml) usando percolação contínua à temperatura ambiente por 1,5h em aparelho Soxhlet. O extrato foi removido do Soxhlet e a matéria-prima usada foi re- extraída duas vezes com acetona (2 x 300 ml) sob condições similares. O extrato combinado foi filtrado com precisão e concentrado em um evaporador rotatório para obtenção do extrato de acetona dos capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LNLN17122; 8g) contendo 7,7% de 7-hidroxifrullanolídeo. Repetiu-se o mesmo procedimento de extração com acetato de etila como solvente de extração em 100 g de capítulos florais da Sphaeranthus indicus para obtenção do extrato de acetato de etila (LN17123; 9,3 g, 30,2% 7-hidroxifrullanolídeo) de capítulos florais da Sphaeranthus indicus.

[052] D) Preparação de extratos etanólicos de capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17121).

[053] Os capítulos florais secos da Sphaeranthus indicus (1 Kg) foram pulverizados até se tornarem um pó granulado e extraídos com álcool etílico (6 L) durante 2h a 40-45°C. O extrato foi filtrado e o resíduo foi submetido a um processo de extração três vezes (3 x 4 L) sob condições de temperatura similares. Os extratos foram combinados, o resultado foi filtrado com precisão e o extrato límpido foi evaporado sob pressão reduzida para remoção completa do álcool e obtenção do extrato etanólico de capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17121; 120 g, 12% de 7- hidroxifrullanolídeo).

EXEMPLO 2

[054] A) Preparação de extratos etanólicos de partes aéreas da Sphaeranthus indicus (LN17124). Partes aéreas secas da Sphaeranthus indicus (1 Kg) foram pulverizadas até se tornarem um pó granulado e extraídas com álcool etílico comercial (6 L) por 2h a 55-60°C. O extrato foi filtrado e o resíduo foi submetido a um processo de extração três vezes (3 x 4L) sob condições de temperatura similares. Os extratos foram combinados, o extrato combinado foi filtrado com precisão e o extrato límpido foi evaporado sob pressão reduzida para remoção completa do álcool para obtenção do extrato de partes aéreas da Sphaeranthus indicus (LN17124; 95 g).

[055] B) Preparação de extratos de acetona (LN17125) e acetato de etila (LN17126) de partes aéreas da Sphaeranthus indicus: A matéria-prima de 100 g de Sphaeranthus indicus foi pulverizada e o pó extraído com acetona (600 ml) usando percolação contínua à temperatura ambiente por 1,5h em aparelho Soxhlet. O extrato foi removido do Soxhlet e a matéria-prima usada foi re-extraída duas vezes com acetona (2 x 300 ml) sob condições similares. O extrato combinado foi filtrado com precisão e concentrado em um evaporador rotativo para obtenção do extrato de acetona das partes aéreas da Sphaeranthus indicus (LN17125; 12 g, 13,4% de 7- hidroxifrullanolídeo). O mesmo procedimento de extração foi repetido com acetato de etila como solvente de extração em 100 g de partes aéreas da Sphaeranthus indicus para obtenção do extrato de acetato de etila (LN17126; 8g, 14,9% de 7- hidroxifrullanolídeo) de partes aéreas da Sphaeranthus indicus.

[056] C) Preparação de extratos aquosos de partes aéreas da Sphaeranthus indicus (LN17134). Capítulos florais secos da Sphaeranthus indicus (100 g) foram pulverizados e o pó foi extraído com água (700 mL) usando um processo contínuo de percolação à temperatura ambiente por 1,5h em um equipamento Soxhlet. O extrato foi removido do Soxhlet e a matéria-prima usada foi re-extraída duas vezes com etanol (2 x 500 mL) sob condições similares. Os extratos foram combinados, filtrados com precisão e concentrados em um evaporador rotativo sob vácuo à temperatura ambiente para obtenção do extrato aquoso (LN17134) das partes aéreas da Sphaeranthus indicus como um resíduo marrom (17,54 g).

[057] D) Preparação de um extrato a partir do extrato (LN17132) enriquecido de partes aéreas da Sphaeranthus indicus: As partes aéreas secas da Sphaeranthus indicus (1 Kg) foram pulverizadas até se tornarem um pó granulado e extraídas com álcool etílico (5 L) durante 2h à temperatura ambiente. A extração foi repetida três vezes (3 x 3L) sob condições de temperatura similares. Os extratos foram combinados, o extrato combinado foi filtrado com precisão e a solução límpida foi evaporada sob pressão reduzida para remoção da maior parte do álcool. Em seguida, foi adicionada água (500 ml) ao concentrado e o conteúdo foi bem misturado. A mistura foi extraída com EtOAc (4 x 500 ml). Os extratos de EtOAc combinados foram concentrados sob vácuo para dar origem à fração do extrato de acetato de etila (65 g). A camada aquosa foi concentrada sob pressão reduzida para dar origem a uma fração de extrato aquoso do resíduo (70 g). A fração do extrato de acetato de etila e as frações de extrato aquoso foram combinadas na proporção de 3:1 para obtenção do extrato de partes aéreas da Sphaeranthus indicus (LN 17132).

EXEMPLO 3

[058] A) Preparação de extratos aquosos da Terminalia chebula (LN17129).

[059] Frutos secos do material vegetal da Terminalia chebula (l Kg) foram pulverizados até se tornarem um pó granulado e extraídos com água (6 L) a 65-70°C durante 2 horas. O extrato foi separado da matéria-prima por filtração. O processo de extração foi repetido três vezes no resíduo usando 4,5 litros de água cada vez, sob condições de extração similares. Todos os extratos foram combinados, o extrato combinado foi filtrado com precisão e o extrato límpido foi evaporado em um evaporador de película ascendente a 50-60°C. O concentrado foi, então, seco em um secador a vácuo para obtenção de um extrato aquoso da Terminalia chebula (LN17129) como um resíduo em pó (370 g).

[060] B) Preparação de extratos de acetona da Terminalia chebula (LN17127).

[061] Frutos secos do material vegetal da Terminallia chebula (250 g) foram pulverizados até se tornarem um pó granulado, extraídos com acetona (4 L) à temperatura ambiente durante 2 horas. A extração foi repetida três vezes (3 x 3L) sob condições de extração similares. Os extratos foram combinados, os extratos combinados foram filtrados com precisão e o extrato límpido foi evaporado sob pressão reduzida para remoção completa da acetona, sendo seco sob pressão reduzida para obtenção do extrato de acetona da Terminalia chebula (LN17127) como um resíduo em pó seco (50,0 g)).

[062] C) Preparação do extrato hidroalcoólico da Terminalia chebula (LN17128).

[063] Os frutos secos do material vegetal da Terminallia chebula (250 g) foram pulverizados até se tornarem um pó granulado e extraídos com etanol a 50% (4 L) à temperatura ambiente durante 2 horas. O processo de extração foi repetido três vezes (3 X 3 L) sob condições de extração similares. Os extratos foram combinados, os resultados foram filtrados com precisão e o extrato límpido foi evaporado até à secura em um evaporador rotativo para remoção completa do solvente e seco sob vácuo para obtenção do extrato hidroalcoólico da Terminalia chebula (LN17128) como um pó seco (65,0 g).

[064] O extrato aquoso da Allium sativum e o extrato aquoso da Ocimum sanctum usados nos estudos foram obtidos pela Chemiloids Life Sciences, Pvt. Ltd., Vijayawada.

EXEMPLO 4

[065] Composições contendo extratos da Sphaeranthus indicus e extratos da Terminalia chebula.

[066] Composição 1 (LN16013F1): A composição 1 (LN16013F1) é preparada pela mistura do extrato enriquecido com capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17131) e o extrato aquoso da Terminalia chebula (LN17129) na proporção de 1:2 junto com os excipientes, conforme mostrado abaixo: LN17131 20% LN17129 40% MCCP 33% Neusilin® 5% Syloid® 244FP 2%

[067] Composição 2 (LN16013F2): A composição 2 (LN16013F2) é preparada pela mistura do extrato enriquecido com capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17131) e o extrato aquoso da Terminalia chebula (LN17129) na proporção de 1:1 junto com os excipientes, conforme mostrado abaixo: LN17131 30% LN17129 30% MCCP 33% Neusilin® 5% Syloid® 244FP 2%

[068] Composição 3 (LN16013F3): A composição 3 (LN16013F3) é preparada pela mistura do extrato enriquecido com capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17131) e o extrato aquoso da Terminalia chebula (LN17129) na proporção de 1:3.

[069] Composição 4 (LN16013F4): A composição 4 (LN16013F4) é preparada pela mistura do extrato enriquecido com capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17131) e o extrato aquoso da Terminalia chebula (LN17129) na proporção de 3:1.

[070] Composição 5 (LN16049F1): A composição 5 (LN16049F1) é preparada pela mistura do extrato aquoso de capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17133) e o extrato aquoso da Terminalia chebula (LN17129) na proporção de 1:2.

[071] Composição 6 (LN16049F2): A composição 6 (LN16049F2) é preparada pela mistura do extrato aquoso de capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17133) e o extrato aquoso da Terminalia chebula (LN17129) na proporção de 1:1.

[072] Composição 7 (LN16049F3): A composição 7 (LN16049F3) é preparada pela mistura do extrato aquoso de capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17133) e o extrato aquoso da Terminalia chebula (LN17129) na proporção de 2:1.

[073] Composição 8 (LN16049F4): A composição 8 (LN16049F4) é preparada pela mistura do extrato aquoso de capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17133) e o extrato aquoso da Terminalia chebula (LN17129) na proporção de 3:1.

[074] Composição 9 (LN16049F5): A composição 9 (LN16049F5) é preparada pela mistura do extrato aquoso de capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17133) e o extrato aquoso da Terminalia chebula (LN17129) na proporção de 1:3.

[075] Composição 10 (LN16025F1): A composição 10 (LN16025F1) é preparada pela mistura do extrato aquoso de partes aéreas da Sphaeranthus indicus (LN17134) e o extrato aquoso da Terminalia chebula (LN 17129) na proporção de 2:1.

[076] Composição 11 (LN16025F2): A composição 11 (LN16025F2) é preparada pela mistura do extrato aquoso de partes aéreas da Sphaeranthus indicus (LN17134) e o extrato aquoso da Terminalia chebula (LN 17129) na proporção de 1:1.

[077] Composição 12 (LN16014F1): A composição 12 (LN16014F1) é preparada pela mistura do extrato enriquecido de partes aéreas da Sphaeranthus indicus (LN17132) e o extrato aquoso da Terminalia chebula (LN17129) na proporção de 1:2.

[078] Composição 13 (LN16014F2): A composição 13 (LN16014F2) é preparada pela mistura do extrato enriquecido de partes aéreas da Sphaeranthus indicus (LN17132) e o extrato aquoso da Terminalia chebula (LN17129) na proporção de 1:1.

[079] Composição 14 (LN16014F3): A composição 14 (LN16014F3) é preparada pela mistura do extrato enriquecido de partes aéreas da Sphaeranthus indicus (LN17132) e o extrato aquoso da Terminalia chebula (LN17129) na proporção de 1:3.

[080] Composição 15: A composição 15 é preparada pela mistura do extrato etanólico direto de capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17121) e o extrato aquoso da Terminalia chebula (LN17129) na proporção de 1:2.

[081] Composição 16: A composição 16 é preparada pela mistura do extrato etanólico direto de capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17121) e o extrato aquoso da Terminalia chebula (LN 17129) na proporção de 1:1.

[082] Composição 17: A composição 17 é preparada pela mistura do extrato etanólico direto de capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17121) e o extrato aquoso da Terminalia chebula (LN17129) na proporção de 2:1.

[083] Composição 18: A composição 18 é preparada pela mistura do extrato etanólico direto de capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17121) e o extrato hidroalcoólico do fruto da Terminalia chebula (LN17128) na proporção de 1:1.

[084] Composição 19: A composição 19 é preparada pela mistura do extrato de acetona de capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17122) e o extrato aquoso do fruto da Terminalia chebula (LN 17129) na proporção de 1:1.

[085] Composição 20: A composição 20 é preparada pela mistura do extrato de acetona de capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17122) e o extrato de acetona do fruto da Terminalia chebula (LN 17127) na proporção de 1:1.

[086] Composição 21: A composição 21 é preparada pela mistura do extrato de acetona de capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17122) e o extrato hidroalcoólico do fruto da Terminalia chebula (LN17128) na proporção de 1:1.

[087] Composição 22: A composição 22 é preparada pela mistura do extrato de acetato de etila de capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17123) e o extrato aquoso da Terminalia chebula (LN17129) na proporção de 1:2.

[088] Composição 23: A composição 23 é preparada pela mistura do extrato de acetato de etila de capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17123) e o extrato aquoso da Terminalia chebula (LN 17129) na proporção de 1:1.

[089] Composição 24: A composição 24 é preparada pela mistura do extrato de acetato de etila de capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17123) e o extrato aquoso da Terminalia chebula (LN17129) na proporção de 2:1.

[090] Composição 25: A composição 25 é preparada pela mistura do extrato de acetato de etila de capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17123) e o extrato hidroalcoólico da Terminalia chebula (LN17128) na proporção de 1:1.

[091] Composição 26: A composição 26 é preparada pela mistura do extrato de partes aéreas da Sphaeranthus indicus (LN17132) e o extrato de acetona da Terminalia chebula (LN17127) na proporção de 1:1.

[092] Composição 27: A composição 27 é preparada pela mistura do extrato enriquecido de partes aéreas da Sphaeranthus indicus (LN17132) e o extrato hidroalcoólico da Terminalia chebula (LN 17128) na proporção de 1:1.

[093] Composição 28: A composição 28 é preparada pela mistura do extrato etanólico direto de partes aéreas da Sphaeranthus indicus (LN17124) e o extrato aquoso da Terminalia chebula (LN17129) na proporção de 1:2.

[094] Composição 29: A composição 29 é preparada pela mistura do extrato etanólico direto de partes aéreas da Sphaeranthus indicus (LN17124) e o extrato aquoso da Terminalia chebula (LN 17129) na proporção de 1:1.

[095] Composição 30: A composição 30 é preparada pela mistura do extrato etanólico direto de partes aéreas da Sphaeranthus indicus (LN17124) e o extrato aquoso da Terminalia chebula (LN17129) na proporção de 2:1.

[096] Composição 31: A composição 31 é preparada pela mistura do extrato etanólico de partes aéreas da Sphaeranthus indicus (LN17124) e o extrato hidroalcoolólico da Terminalia chebula (LN 17128) na proporção de 1:1.

[097] Composição 32: A composição 32 é preparada pela mistura do extrato de acetona de partes aéreas da Sphaeranthus indicus (LN17125) e o extrato aquoso da Terminalia chebula (LN 17129) na proporção de 1:1.

[098] Composição 33: A composição 33 é preparada pela mistura do extrato de acetato de etila de partes aéreas da Sphaeranthus indicus (LN17126) e o extrato aquoso da Terminalia chebula (LN 17129) na proporção de 1:1.

[099] Composição 34: A Composição 34 é preparada pela mistura do extrato enriquecido com capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17131), extrato aquoso da Terminalia chebula (LN17129) e extrato aquoso da Allium sativum (alho) na proporção de 1:4:5.

[100] Composição 35: A Composição 35 é preparada pela mistura do extrato enriquecido com capítulos florais da Sphaeranthus indicus (LN17131), extrato aquoso da Terminalia chebula (LN17129) e extrato aquoso da Ocimum sanctum na proporção de 1:4:5.

EXEMPLO 5

[101] Eficácia do extrato enriquecido da Sphaeranthus indicus (LN17131), do extrato aquoso da Terminalia chebula (LN17129) e suas composições de 1 a 4 (LN16013F1 a F4) na inibição da atividade da NADPH Oxidase no modelo celular HL-60. As células HL- 60 foram suspensas em HBSS a 1 milhão/ml (5 ml de suspensão celular preparada para uma placa de 96 poços) na presença de 20 mm de L-012 (uma sonda quimioluminescente à base de luminol). Foram preparadas amostras necessárias e estoques de controle com DMSO a 0,8% em Tampão de Reação. Adicionou-se 50 μl de uma suspensão celular por poço em uma placa branca opaca de 96 poços. Também foram adicionadas 25 μl de amostras de teste (conc. final de DMSO a 0,2%) por poço. Imediatamente foi iniciada leitura da placa em modo de luminescência, a 37°C por 20 minutos com dois minutos de intervalo. Após 20 minutos adicionou-se 25 μl de PMA a uma concentração de 400nM (forbol-12-miristato-13-acetato) (concentração final de 100 nM) a todos os poços, exceto poços sem indução ou vazios. Foi feita leitura da placa no modo de luminescência, a 37°C por 20 minutos com dois minutos de intervalo. Foi obtida a área calculada sob a curva (AUC | Calculated Area Under Curve) para cada tratamento e determinado a porcentagem de inibição da NADPH oxidase usando a fórmula. Porcentagem de inibição = (AUC de indução normalizada - AUC em tratamentos normalizados) x100/AUC de indução normalizada. Os resultados são resumidos na Tabela 1. TABELA 1

[102] Usando o mesmo procedimento, os dados obtidos para o extrato aquoso da Sphaeranthus indicus (LN17133), o extrato aquoso da Terminalia chebula (LN17129) e suas composições de 5 a 9 (LN16049F1 a F5) são resumidos na Tabela 2. TABELA 2

[103] Usando o mesmo procedimento, os dados obtidos para diferentes extratos da Sphaeranthus indicus e Terminalia chebula e suas composições são resumidos abaixo nas Tabelas 3 A e 3B. TABELA 3A

TABELA 3B

EXEMPLO 6

[104] Eficácia de extratos da Sphaeranthus indicus, extratos da Terminalia chebula e suas composições para aumento na forma reduzida de glutationa: Células HepG2 (0,5x106 células/poço) foram semeadas em uma placa de cultura celular de 24 poços contendo 500μL de um meio α-MEM+FBS a 10% e incubadas durante a noite a 37°C em uma incubadora de CO2. No dia seguinte, as células foram privadas de soro durante 24 horas, substituindo o meio por 400 μL do meio RPMI. No dia seguinte, foi adicionado meio RPMI+FBS a 10% fresco e pré-tratado com 50 μL das respectivas concentrações de amostras de teste durante 1 hora. As células que receberam 0,2% de DMSO foram consideradas como controles de veículo. Com exceção dos controles de veículo, todos os poços foram induzidos com 50 μL de hidroperóxido de terc-butila (t- BHP) para atingir concentração final de 500 μm e incubados por 4 horas a 37°C em uma incubadora de CO2. Os sobrenadantes foram descartados e as células foram raspadas com 100 μL de ácido sulfosalicílico (SSA | sulfosalicylic acid) a 5%. As amostras foram congeladas e descongeladas por 3 vezes e centrifugadas a 8000xg por 5 minutos a 4°C. Em seguida, 20 μL de amostras/padrões foram adicionados aos respectivos poços de uma placa de 96 poços e subsequentemente foram adicionados 50 μL de reagente DTNB e a absorbância foi medida a 412 nm no espectrofotômetro SpectramaxM2e. Os resultados são resumidos abaixo na Tabela 4.

[105] A glutationa (%) foi calculada usando a seguinte fórmula:

Tabela 4

EXEMPLO 7

[106] Eficácia de extratos da Sphaeranthus indicus, extratos da Terminalia chebula e suas composições para inibição de um Malondialdeído (MDA).

[107] Em uma placa de cultura celular de seis poços, foram semeadas 2 milhões de células HepG2 em cada poço, contendo 2 mL do meio MEM (com 10% de soro bovino fetal, FBS) e incubados durante a noite a 37 °C, em uma incubadora de CO2. Após lavagem com 2 mL de meio RPMI (sem soro), as células foram substituídas por 1,3 mL de RPMI+FBS a 10% e pré-tratadas com as respectivas concentrações de amostras de teste durante uma hora. As células que receberam 0,2% de DMSO foram consideradas como controles de veículo. Com exceção dos controles do veículo, todos os poços foram induzidos com 500 μL de hidroperóxido de terc-butila (t-BHP) para atingir a concentração final de 300 μM. Após 4 horas de incubação a 37°C em uma incubadora de CO2, os sobrenadantes foram recolhidos em tubos contendo hidroxitolueno butilado (BHT; 20 μL) a uma concentração final de 5 mM. Cada 200μL da amostra foi misturado com 400μL de ácido tricloroacético (TCA | trichloroacetic acid) a 10% e centrifugado a 12000xg durante 5 minutos a 4 °C. Em seguida, 300 μL de amostras ou padrões na concentração necessária foram adicionados aos respectivos frascos com tampa de rosca e incubados a 90 °C por 1 hora. Finalmente, 200 de padrões/amostras, cada, foram adicionados a uma placa de fundo transparente preta e a fluorescência foi medida a Ex/Em: 530/550nm sob o modo de leitura inferior no espectrofotômetro SpectramaxM2e. Os resultados dos estudos de inibição de MDA são resumidos na Tabela 5 e 6.

[108] A (%) de inibição de MDA foi calculada usando a seguinte fórmula:

Tabela 5

Tabela 6

EXEMPLO 8

[109] Eficácia sinérgica in vivo da LN16013F2 na redução dos níveis séricos elevados da AST e ALT no dano hepático induzido por CCL4 em modelos de ratos:

[110] Ratos machos da linhagem Sprague Dawley com 8 semanas de idade foram adquiridos e 36 ratos saudáveis foram randomizados em 6 grupos (G1 a G6). Os grupos são os seguintes: G1 Controle Neutro, G2 Controle de Doença, G3 Composição LN17131 (200 mpk), G4 Composição LN16013F2 (200 mpk), G5 Composição LN17129 (200 mpk) e G6 Silimarina (200 mpk).

[111] Indução: Todos os animais, exceto os do grupo de controle de veículo (G1), foram administrados com CCL4 em azeite (1:nível/v, 0,5 mL/kg em peso corporal) nos dias 12, 18 e 25 usando uma seringa descartável por via intraperitoneal. Os animais do grupo G1 receberam apenas o veículo (0,5 mL/kg de azeite) por via IP nos mesmos dias (dias 12, 18 e 25). Todos os ratos tiveram livre acesso a alimentos e água potável durante o estudo.

[112] Tratamento: Os animais receberam os respectivos tratamentos designados diariamente por via oral do dia 5 ao 25. As substâncias de teste das composições LN17131, LN16013F2 e LN17129 foram, cada uma, suspensas em solução de CMC de sódio a 0,5% e administradas a animais dos grupos G3, G4 e G5, respectivamente, a uma dose de 200 mg/kg.

[113] Coleta de sangue e análise dos níveis de AST e ALT: Os animais foram submetidos a jejum durante a noite (aproximadamente de 16 a 18 horas) antes da coleta de sangue. A água foi fornecida ad libitum durante o período de jejum. Amostras de sangue foram coletadas no dia 26 do plexo retro-orbital sob anestesia leve com isoflurano com a ajuda de um tubo capilar fino. As amostras de soro foram separadas por centrifugação das amostras de sangue a 7000 rpm durante 10 minutos em ± 4 a 2°C. Os níveis de AST e ALT (U/L) foram testados usando o analisador para química clínica da ILAB, modelo ARIES, Itália.

[114] Resultados: Houve um aumento estatisticamente significante nos níveis da ALT e AST (471,67 ± 131,4; 830 ± 117,8) no grupo de controle da doença tratada com CCL4 (G2) quando comparado ao grupo de controle (G1) do veículo (85,83 ± 2,01; 238,33 ± 14,64). No entanto, uma redução significativa nos níveis da AST e ALT foi observada nos grupos G3, G4 e G5 tratados respectivamente com LN17131, LN16013F2 e LN17129 quando comparados ao grupo de controle da doença (G2). Os dados são resumidos abaixo na Tabela 7. Tabela 7

EXEMPLO 9

[115] Avaliação da atividade hepatoprotetora das composições LN16025F1, LN16013F2 e LN16049F1 na hepatotoxicidade induzida por Acetaminofeno em ratos Sprague Dawley: Um grupo de 53 ratos Sprague Dawley foi examinado quanto à saúde, 48 foram selecionados para o experimento e distribuídos aleatoriamente em 6 grupos, G1, G2, G3, G4, G5 e G6, com base no peso corporal. A lesão hepática/toxicidade foi induzida em todos os animais, exceto aqueles do grupo de controle de veículo (G1) pela administração de Acetaminofeno em PBS (900 mg/kg em peso corporal) do 8° ao 14° dia, usando seringa descartável por via intraperitoneal, 1 hora após administração do item de referência ou teste. O volume da dose administrada foi de 5 mL/kg em peso corporal. Os animais no grupo de controle de veículo (G1) receberam injeção intraperitoneal de PBS no mesmo dia da injeção de Acetaminofeno, também 1 hora após a administração do veículo. Os ratos tiveram livre acesso a alimentos e água potável durante o estudo. Os animais de controle de veículo (G1) e controle de doença (G2) receberam 0,5% de CMC-Na uma vez ao dia por via oral durante 14 dias. Os animais dos grupos G3, G4, G5 e G6 receberam por via oral 200 mpk de LN16025F1, LN16013F2, LN16049F1 ou Silimarina, respectivamente, uma vez ao dia por 14 dias. O volume da dose administrada foi de 10 ml/kg de peso corporal.

[116] Os animais foram submetidos a jejum durante a noite anterior, antes da recolha de 1,5 ml de amostras de sangue de todos os animais nos dias 9, 12 e 15, e as amostras de soro foram separadas por centrifugação a 7000 rpm durante 10 minutos a ± 4 a 2°C. As amostras de soro foram analisadas quanto à aspartato transaminase (AST), alanina transaminase (ALT) e bilirrubina total (TB), com métodos de conjuntos convencionais usando um ILab Aries, um analisador bioquímico automático (Milano, Itália).

[117] ALT e AST são as importantes enzimas metabólicas hepáticas. Essas enzimas serão liberadas do fígado ao soro, quando o fígado estiver danificado. Assim, as atividades dessas enzimas no soro podem refletir o grau de lesão hepática. Os experimentos mostraram que o Acetaminofeno aumentou significativamente os níveis séricos de ALT e AST no grupo controle da doença (G2) em comparação com o grupo de controle de veículo (G1). No entanto, a suplementação de LN16025Fl, LN16013F2, LN16049F1 e Silimarina nos animais dos grupos de tratamento G3, G4, G5 e G6, respectivamente, reduziram significativamente a ALT e a AST nos dias 12 e/ou 15. Essas composições também reduziram significativamente os níveis séricos de bilirrubina nos dias 12 e 15. Os resultados obtidos no dia 15 são resumidos na Tabela 8 e na Figura 1.

[118] Um grau acentuado de vacuolização centrolobular/degeneração de hepatócitos (Pontuação: 3,50) e um grau de mínimo a acentuado de proliferação fibrosa do tecido conjuntivo pericapsular misturada com adipócitos (Pontuação: 1,67) foram evidentes em fígados de ratos intoxicados com Acetaminofeno no grupo de controle de doença (G2), indicando indução de hepatotoxicidade ou dano hepático. O exame microscópico dos fígados dos animais do grupo G3, G4, G5 e G6, tratados com LN16025F1, LN16013F2, LN16049F1 e Silimarina, respectivamente, juntamente com Acetaminofeno, não revelou vacuolização/degeneração dos hepatócitos (Pontuação 0), indicando possíveis efeitos benéficos desses itens contra o dano hepático induzido pelo Acetaminofeno em ratos. Apenas um grau muito pequeno de adipócitos/proliferação de tecido conjuntivo fibroso pericapsular (Pontuação: 0,50, 0,33, 0,17 e 0,17) foi observado nos fígados dos animais do grupo G3, G4 e G6. Tais lesões não foram observadas no fígado dos animais do grupo G5, indicando eficácia superior da composição LN16049F1. Tabela 8

EXEMPLO 10

[119] Avaliação da atividade protetora hepatopancreática da composição 34 em camarões.

[120] Este experimento foi conduzido em dois tanques no mesmo local e condições com dimensões semelhantes de 2 acres cada (8093,71 m2). A água do riacho foi tratada por cloração e 15 larvas saudáveis de camarões foram usadas para estocagem com uma densidade de 50/m2. A salinidade variou de 5 a 8 ppt com uma faixa de temperatura de 28°C a 35°C. Os camarões foram alimentados com ração artificial conforme a exigência. Todos os parâmetros de qualidade da água foram medidos de tempos em tempos. A composição 34 foi usada diariamente na última ração, desde o 15° DOC até a colheita, junto com grânulos de ração de 2-5 gramas. A composição 34 foi misturada com um aglutinante e grânulos de ração revestidos uniformemente. Os grânulos revestidos foram secados à sombra por 30 minutos antes do uso.

[121] Resultado: após estoque, taxas de sobrevivência de 81% e 83% foram observadas para os tanques de controle e de teste. Os tanques foram coletados em 120 e 115 dias de cultivo (DOC | days of culture) com um tamanho de colheita de 20 e 22,5 gramas nos respectivos tanques de controle e de teste. A Proporção de Conversão Alimentar (FCR) final e o Crescimento Médio Diário (ADG | Average Daily Growth) foram de (1,4 e 1,3) e (0,17 e 0,2), respectivamente, para os tanques de controle e de teste. Estes e outros parâmetros de teste são resumidos abaixo na Tabela 9 e na Figura 2. Tabela 9

EXEMPLO 11

[122] Experiência de Campo com Camarões:

[123] Este experimento foi realizado em dois tanques no mesmo local e nas mesmas condições com dimensões semelhantes a 2 acres cada (8093.71 m2). A água do riacho foi tratada por cloração e 15 larvas de camarões saudáveis do tipo Litopenaeus vannamei foram usadas para estocagem com uma densidade de 50/m2.

[124] Os camarões foram alimentados com ração padrão de acordo com o requerimento. Todos os parâmetros de qualidade da água foram medidos de tempos em tempos. A composição 34™ foi misturada com grânulos de ração usando um aglutinante adequado. O tanque de teste e o tanque de controle foram inoculados com a bactéria (Vibrio Spp) Vibrio parahaemolyticus no dia 40. Os camarões no tanque de teste foram alimentados com a Composição 34, conforme mencionado acima. Não foi observada qualquer doença no tanque de teste por 5-7 dias após o tratamento com o medicamento. A doença se agravou no tanque de controle 5 dias após a inoculação. O exame histopatológico demonstrou melhora significativa na redução da inflamação, descamação e vacúolos, conforme resumido na Figura 3.

EXEMPLO 12

[125] Experiência de Campo com Peixes:

[126] Este experimento foi realizado em duas lagoas no mesmo local e condições com dimensões semelhantes de 5 acres cada (20234.3 m2). A água do riacho foi tratada por cloração e peixes Labeo rohita saudáveis com 6 meses de idade foram usados para estoque com uma densidade de 3000 por acre.

[127] Os peixes foram alimentados com ração padrão de acordo com a exigência. Todos os parâmetros de qualidade da água foram medidos de tempos em tempos. A composição 34 foi misturada com grânulos de ração usando um aglutinante adequado.

[128] A água em ambos os tanques experimentais revelou-se poluída com pesticidas agrícolas, antibióticos e produtos químicos. A mortalidade dos peixes foi observada em ambos os tanques, juntamente com o hepatopâncreas danificado. Os peixes no tanque de teste foram tratados com a Composição 34 diariamente por um período de 7 dias e foram alimentados por este período com a ração, conforme mencionado acima. Não foi observada mortalidade no tanque de teste após o tratamento.

[129] O exame histopatológico mostrou melhoria significativa na redução da inflamação, acúmulo de pigmentos biliares, vacúolos e linfócitos, conforme resumido na Figura IV.

Claims

1. “COMPOSIÇÃO SINÉRGICA”, compreendendo: pelo menos, um componente selecionado a partir de extratos, frações ou misturas respectivas derivados da Sphaeranthus indicus em combinação com, pelo menos, um componente selecionado a partir de extratos, frações, componente(s) ativo(s) ou misturas respectivas derivados da Terminalia chebula caracterizado pelo extrato de Sphaeranthus indicus e o extrato de Terminalia chebula estarem presentes em uma proporção variando de 1:3 a 3:1.

2. “COMPOSIÇÃO SINÉRGICA”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelas composições sinérgicas conterem, opcionalmente, pelo menos, um componente adicional selecionado do grupo consistindo em ingredientes naturais biologicamente ativos selecionados entre os antioxidantes, agentes antiinflamatórios e agentes imunomoduladores conhecidos; ingredientes ativos farmaceuticamente aceitáveis, vitaminas, minerais e excipientes, transportadores ou diluentes farmacêutica, nutracêutica ou dieteticamente aceitáveis.

3. “COMPOSIÇÕES SINÉRGICAS” de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por excipientes, transportadores ou diluentes farmacêutica, nutracêutica ou dieteticamente aceitáveis serem selecionados a partir de glicose, frutose, sacarose, maltose, dextrina amarela, dextrina branca, aerosil, celulose microcristalina, estearato de cálcio, estearato de magnésio, sorbitol, esteviosídeos, xarope de milho, lactose, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido málico, ácido succínico, ácido láctico, ácido Lascórbico, dl-alfa-tocoferol, glicerina, propilenoglicol, éster graxo de glicerina, éster graxo de poliglicerina, éster graxo de sacarose, éster graxo de sorbitano, éster graxo de propilenoglicol, acácia, carragenina, caseína, gelatina, pectina, ágar, grupo das vitaminas B, nicotinamida, pantotenato de cálcio, aminoácidos, proteínas, sais de cálcio, pigmentos, sabores, conservantes, água destilada, solução salina, solução aquosa de glicose, álcool, propilenoglicol e polietilenoglicol, diversos óleos animais e vegetais, parafina branca macia, parafina, aromatizantes, corantes e cera.

4. “COMPOSIÇÕES SINÉRGICAS” de acordo com a reivindicação 1 compreendendo, ainda, um agente conhecido para proteção do fígado, melhoria da saúde do fígado e tratamento de doenças associadas ao fígado caracterizado por o agente conhecido para proteção do fígado ser selecionados a partir de extratos, frações, fitoquímicos puros ou misturas respectivas derivados das matérias-primas vegetais da Aegle marmelos, Allium sativum, Andrographis paniculata, Curcuma longa, Oscimum sanctum, Phyllanthus amarus, Silybum marianum (cardo de leite), Tephrosiapurpurea e Tinospora sinensis.

5. “COMPOSIÇÕES SINÉRGICAS” de acordo com, reivindicação 1, caracterizado por partes da planta Sphaeranthus indicus, serem selecionadas a partir de frutos, capítulos florais, flores, cascas, sementes, folhas, caules, caules macios, lascas de árvores, toda a planta, partes aéreas ou misturas respectivas.

6. “COMPOSIÇÕES SINÉRGICAS”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo extrato de Terminalia chebula ser preparado de uma parte da planta Terminalia chebula, a parte da planta Terminalia chebula sendo selecionada do grupo consistindo em uma fruta, capítulo, flor, crosta, semente, folhas, caules, casca, uma planta inteira, partes aéreas da planta e misturas respectivas.

7. “COMPOSIÇÕES SINÉRGICAS” de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por solventes utilizados para preparação dos extratos e frações de Sphaeranthus indicus ser preparado pela extração de parte da planta Sphaeranthus indicus serem selecionados a partir de, entre outros, álcoois C1-C5, como cetonas solventes clorados; água; hidrocarbonetos C1-C7, como ésteres e misturas respectivas.

8. “COMPOSIÇÕES SINÉRGICAS”, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo extrato de Terminalia chebula ser preparado pela extração de parte da planta Terminalia chebula com um solvente selecionado do grupo consistindo em álcoois C1-C5, cetonas, solventes clorados, água, hidrocarbonetos C1-C7, ésteres e misturas respectivas.

9. “COMPOSIÇÕES SINÉRGICAS”, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo extrato de Sphaeranthus indicus ser preparado pela extração de parte da planta Sphaeranthus indicus com um solvente selecionado do grupo consistindo em etanol, metanol, n-propanol, álcool isopropílico, acetona, metilisobutilcetona, dicloreto de metileno, clorofórmio, água, hexano, acetato de etila e misturas respectivas.

10. “COMPOSIÇÕES SINÉRGICAS”, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo extrato de Terminalia chebula ser preparado pela extração de parte da planta Terminalia chebula com um solvente selecionado do grupo consistindo em etanol, metanol, n-propanol, álcool isopropílico, acetona, metilisobutilcetona, dicloreto de metileno, clorofórmio, água, hexano, acetato de etila e misturas respectivas.

11. “COMPOSIÇÕES SINÉRGICAS” de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por composições serem formuladas em uma forma de dosagem selecionada a partir de uma forma em pó seco, forma líquida, bebida, alimento, suplemento dietético ou qualquer outra forma adequada, como um comprimido, uma cápsula ou um ursinho de goma ou mastigável macio.

12. “COMPOSIÇÕES SINÉRGICAS” de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por composição(ões) ser(em) feita(s) na forma de dosagem de alimentos saudáveis ou alimentos para usos específicos da saúde, em alimentos sólidos, como chocolate ou barras nutricionais, alimentos semissólidos, como creme, geleia ou gel e bebidas e similares, como refrescos, bebidas com bactérias do ácido láctico, pastilhas, doces, gomas de mascar, doces de goma, iogurtes, sorvetes, pudins, jujubas moles adzuki, gelatinas, cookies, chás, refrigerantes, sucos, leites, cafés, cereais, salgadinhos e afins.

13. “COMPOSIÇÕES SINÉRGICAS” de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por extrato e fração da Sphaeranthus indicus conter hidroxifrullanolídeo na faixa de 12% a 30%, no caso de extratos de solventes, e de 1% a 10% de ácidos clorogênicos totais, no caso de extratos de água, conforme o método HPLC de análise.

14. “COMPOSIÇÕES SINÉRGICAS”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos extrato e fração derivados da Terminalia chebula conterem polifenóis totais na faixa de 20% a 80%, conforme o método espectrométrico de análise, de 1% a 6% de ácidos chebulágicos totais, de 1% a 12% de ácidos chebulínicos totais, de 1% a 10% de ácidos elágicos e/ou de 1% a 10% de ácidos gálicos, conforme o método HPLC de análise.