BR112019004953B1 - Método para prevenir ou tratar infecção de espécie hospediera de planta, composição, método para aumentar o rendimento de uma espécie hospedeira de planta de importância agrícola ou hortícula e método para aumentar a capacidade de uma espécie hospedeira de planta de resistir aos danos causados por fungos, bactérias ou patógenos virais - Google Patents

Abstract

A presente invenção é dirigida a um método para prevenir e/ou tratar infecção de planta ou espécie hospedeira animal causada por fungo, bactéria e/ou patógenos virais, sendo que dito método compreende as etapas de prover uma mistura de um ou mais bactéria não-patogênica e um ou mais agentes de ativação, e administrar dita mistura à referida espécie hospedeira. A invenção também abrange composições compreendendo uma mistura de bactéria não-patogênica e um ou mais agentes de ativação.

Description

Campo da invenção

[0001] A presente invenção refere-se ao uso de espécies de bactérias não-patogênicas junto com um ou mais agentes de ativação na prevenção e/ou tratamento de doenças microbianas em uma faixa de hospedeiros biológicos diferentes. Antecedentes da invenção

[0002] O uso de bactéria não-patogênica originária do solo para proteção de plantas e outras espécies hospedeiras de interesse agrícola ou hortícula contra o ataque de bactérias e fungos é bem conhecido do estado da técnica. Um exemplo de uma espécie bactéria não-patogênica usado em tal sistema é o Bacillus subtilis.

[0003] Existem várias publicações do estado da técnica descrevendo produtos fungicidas e bactérias compreendendo o Bacillus subtilis, bem como o uso de tais produtos na proteção de plantas importantes na agricultura contra doenças microbianas. Entretanto, estes produtos principalmente tiveram baixos níveis de atividade, e coo resultado foram usados primariamente coo adjuntos para aumentar a atividade de agentes químicos convencionais. Em adição, a literatura também descreve o uso de tais produtos coo o agente sozinho para a proteção das plantas organicamente cultivadas (ou seja, em situações na quais o uso de agentes químicos mais fortes não seria permitido).

[0004] Assim, embora o uso de controle biológico de pragas microbiológicas usando Bacillus subtilis é altamente vantajoso devido a sua baixa toxicidade em células hospedeiras, sua atividade relativamente de baixo nível tem prevenido esta abordagem de ser mais amplamente adotada na agricultura e na horticultura em grande escala e em escala comercial.

[0005] Existe, portanto, uma necessidade insatisfeita para composições e métodos para proteção de plantas importantes comercialmente e espécies de animais que combinam a baixa toxicidade do hospedeiro de sistemas baseados no uso de bactéria não-patogênica tal como Bacillus subtilis com eficácia grandemente aumentada na melhoria da capacidade de espécies hospedeiras em resistir ao ataque microbiano.

[0006] A presente invenção atente esta necessidade.

Sumário da invenção

[0007] A presente invenção é primariamente dirigida a um método para aumentar a capacidade de uma espécie hospedeira de planta ou animal em resistir aos danos causados por fungos, bactérias e/ou patógenos virais. Em sua forma mais geral, este método compreende as etapas de: (a) prover uma mistura de bactéria não-patogênica e um ou mais agentes de ativação; e (b) administração da mistura da etapa (a) em uma planta ou espécie de planta ou animal.

[0008] Em certos casos, os dois componentes mencionados na etapa (a), acima (ou seja, a bactéria não-patogênica e o agente de ativação) pode ser administrado separadamente. Consequentemente, em tais casos, o método para aumentar a capacidade de espécies hospedeiras de plantas ou animais para resistir aos danos causados por fungos, bactérias e/ou patógenos virais compreende a etapa de: (a) prover separadamente: (i) uma composição compreendendo um ou mais bactérias não- patogênicas; e (ii) uma composição compreendendo um ou mais dos agentes de ativação; e (b) administrar, separadamente, cada uma das composições (i) e (ii) à dita espécie hospedeira.

[0009] Sem desejar estar ligado pela teoria, deve ser observado que o efeito protetor visto com o método e composição da presente invenção pode ser devido a uma atividade antimicrobiana, melhora da resistência das espécies hospedeiras à infecção microbiana (por exemplo, pela melhora da resposta imune do hospedeiro) ou para uma combinação de ambos os mecanismos. Consequentemente, a frase acima mencionada “capacidade em resistir aos danos causados por fungos, bactérias e/ou patógenos virais” deve ser entendida em termos de um ou mais sobreviventes melhorados, tamanho e saúde da espécie hospedeira (e quando relevante, rendimento aumentado de um produto agrícola ou hortícola) na presença de patógenos microbianos, com relação ao mecanismo atual envolvido na melhora destes parâmetros. Similarmente, o termo “danos causados por fungos, bactérias e/ou patógenos virais” deve ser entendido como qualquer efeito prejudicial sobre as espécies hospedeiras que são diretamente ou indiretamente relacionados à presença de patógenos microbianos dentro das células ou tecidos da referida espécie hospedeira, ou nas proximidades da referida espécie hospedeira. Estes efeitos prejudiciais incluem (mas não estão limitados a) interferência com o crescimento, tamanho ou capacidade reprodutiva da espécie hospedeira, lesão fatal e não fatal sobre um ou mais órgãos da espécie hospedeira, rendimento diminuído dos produtos de importância agrícola (por exemplo, frutas, vegetais, leguminosas, leite, mel, etc.) produzido pela espécie hospedeira.

[0010] No contexto da presente invenção, o termo “agente de ativação” é usado para denotar uma substância que quando presente em uma mistura junto com a bactéria não-patogênica ou quando liberada separadamente da mesma, é capaz de melhorar os efeitos benéficos das referidas células bacterianas não-patogênicas sobre a espécie hospedeira de planta ou animal. Esta melhora pode, em alguns casos, ser o resultado de uma interação sinergística entre a bactéria não patogênica e os agentes de ativação. Em uma alternativa, os agentes de ativação e a bactéria não-patogênica pode cada um ser desprovido de qualquer efeito benéfico significante sobre o hospedeiro quando usado sozinho, mas podem causar significante efeito antimicrobiano, imunoestimulante e/ou outros efeitos benéficos na espécie hospedeira quando as duas classes de substância são administradas juntas ou consecutivamente.

[0011] Os inventores da presente invenção encontraram inesperadamente que muitos dos agentes de ativação apropriados para uso no método da presente invenção dividem uma característica comum, denominada sua capacidade de inibir os mediadores inflamatórios que são mais geralmente associados com espécies de animais superiores (tais como fator alfa de necrose tumoral (TNF-α)) em vez de com espécies de plantas. Assim, em uma configuração preferida da presente invenção, um ou mais dos agentes de ativação são substâncias tendo atividade anti-inflamatória.

[0012] Em um aspecto, a presente invenção é dirigida a um método para prevenir e/ou tratar a infecção de uma espécie hospedeira de planta ou animal causada por fungos, bactérias e/ou patógenos virais, sendo que dito método compreende as etapas de: (a) prover uma mistura de bactéria não-patogênica e um ou mais agentes de ativação; e (b) administrar a mistura da etapa (a) para a referida espécie hospedeira.

[0013] Em uma concretização alternativa desse aspecto da invenção, a bactéria não patogênica e o agente de ativação podem ser administrados separadamente, como explicado adiante.

[0014] Em um aspecto adicional, a presente invenção também é dirigida a um método para aumentar tanto o rendimento de uma planta de importância agrícola ou hortícula ou o rendimento de um produto (por exemplo, leite ou mel) a partir de um animal ou planta agrícola de importância, por meio de: (a) prover uma mistura de bactéria não-patogênica e um ou mais agentes de ativação; e (b) administrar a mistura da etapa (a) para a referida espécie hospedeira.

[0015] Em uma concretização alternativa deste aspecto da invenção, a bactéria não-patogênica e os agentes de ativação podem ser administrados separadamente, como explicado adiante.

[0016] Foi descrito adiante que em algumas implementações dos vários métodos da presente invenção, a bactéria não- patogênica e o agente de ativação podem ser administrados separadamente, ou seja, um após o outro. Em tais implementações, a primeira composição a ser administrada pode ser tanto a composição compreendendo a bactéria não- patogênica ou a composição compreendendo um ou mais agentes de ativação. Em certas outras concretizações do tipo no qual a bactéria não-patogênica e o agente de ativação são administradas separadamente, ambos são administrado à espécie hospedeira em aproximadamente o mesmo tempo.

[0017] Em um outro aspecto, a presente invenção também prove uma composição compreendendo uma mistura de bactéria não-patogênica e um ou mais agentes de ativação, sendo que dito um ou mais agentes de ativação são substâncias tendo atividade anti-inflamatória, como será discutido em detalhes adicionais adiante.

[0018] Muitas espécies diferentes e cepas de bactéria não- patogênica podem ser usadas em combinação com os agentes de ativação descritos aqui (ou alternativamente, podem ser administradas separadamente e sequencialmente). O termo “não- patogênico é usado neste contexto para indicar que as espécies selecionadas não têm, ou tem muito pouca, toxicidade ou outro efeito prejudicial sobre a espécie hospedeira a qual a composição da invenção contendo a bactéria estão sendo administradas.

[0019] Em uma concretização preferida dos métodos e composições definidas aqui, as bactérias não-patogênicas são selecionadas a partir do grupo consistindo dos Bacillus subtilis e bactéria probiótica.

[0020] Em uma concretização preferida, a espécie de bactéria não-patogênica é Bacillus subtilis. Várias cepas diferentes desta espécie podem ser usadas. Entretanto, em uma concretização altamente preferida, a cepa usada é QST713.

[0021] Em uma outra concretização preferida, as bactérias não-patogênicas são selecionadas a partir de um ou mais espécies de bactéria probiótica. Deve ser observado, neste sentido, que o termo “bactéria probiótica” para o presente propósito deve ser entendido como se referindo ao micro-organismo vivo que são acreditados proverem benefícios de saúde quando consumidos ou de outra forma administrados para o hospedeiro de interesse. Muitas de tais bactérias probiótica são conhecidas, com muitas delas sendo espécies do gênero Bifidobacterium (por exemplo, B. longum e B. breve). Ou do gênero Lactobacillus (por exemplo, L. rhamnosus, L. casei, L. helveticus e assim por diante). Em uma concretização preferida, a bactéria probiótica usada nas composições e métodos da presente invenção são selecionadas a partir do grupo consistido de L. rhamnosus, L. casei, L. plantarum, L. helveticus (acidophilus), B. longun, B. breve, Pediococcus acidilactici, Lacotoccus lactis e combinações das mesmas.

[0022] Concretizações adicionais e vantagens da invenção se tornarão aparentes quando da descrição a seguir.

Breve descrição dos desenhos

[0023] A figura 1 mostra graficamente os resultados de uma classificação inicial de fito-químicos quanto ao seu potencial uso como agentes de ativação para B. subtilis para melhora dos efeitos antifúngicos e antibacterianos;

[0024] A figura 2 apresenta os resultados para ativação de B. subtilis da combinação de 3 ou 4 agentes de ativação diferentes e para a atividade fúngica e bactericida das composições contendo aquelas combinações junto com B. subtilis;

[0025] A figura 3 apresenta os resultados da investigação similar para aquelas apresentadas na figura 2, exceto que os agentes de ativação são usados em uma concentração diferente;

[0026] A figura 4 apresenta os resultados para a atividade fúngica e bactericida usando composições similares àquelas usadas para gerar os resultados mostrados na figura 1, exceto que uma formulação diferente de B. subtilis foi usado;

[0027] A figura 5 apresenta resultados fungicidas e bactericidas obtidos usando a composição similar àquela suada para gerar os resultados da figura 4, exceto que os agentes se ativação foram usados em uma concentração diferente;

[0028] A figura 6 apresenta resultados mostrando os efeitos fungicidas e bactericidas das combinações dos extratos de duas plantas - Aster tataricus e Cyperus rotundus com B. subtilis;

[0029] A figura 7 apresenta os resultados dos estudos similares àqueles que geraram os resultados da figura 6, exceto que os dois extratos de plantas foram suados em uma concentração diferente;

[0030] A figura 8 demonstra que a inoculação de sementes de pepino com diferentes combinações de agentes de ativação e B. subtilis é capaz de proteger as plantas de pepino de ambas as infecções por bactérias e fungos;

[0031] A figura 9 apresenta os resultados mostrando que a inoculação de sementes de tomates com diferentes combinações de agentes de ativação e B. subtilis é capaz de proteger as plantas de tomate contra a infecção microbiana;

[0032] A figura 10 apresenta os resultados mostrando a sobrevivência aumentada das plantas de tomate infectadas com o vírus do mosaico do tomate, após o tratamento com composições da presente invenção;

[0033] A figura 11 demonstra o efeito protetor das composições da presente invenção contra a infecção microbiana em plantas de pimenta, após inoculação das sementes da planta de pimenta com a referida composição;

[0034] A figura 12 demonstra o efeito protetor das composições da presente invenção contra a infecção microbiana em milho, após inoculação com a referida composição;

[0035] A figura 13 apresenta os resultados mostrando o efeito protetor das composições da presente invenção contra a infecção microbiana em trigo, após a inoculação de sementes com a referida composição;

[0036] A figura 14 demonstra o efeito protetor das composições da presente invenção contra infecção microbiana em plantas de arroz, após inoculação de sementes de arroz com a referida composição;

[0037] A figura 15 apresenta os resultados de um campo de estudo que demonstra a proteção contra infecção antimicrobiana em plantas de grão de bico, após o tratamento com composições da presente invenção;

[0038] A figura 16 apresenta in vitro resultados mostrando a eliminação quase completa de Streptococcus sobrinus (uma espécie bacteriana de significância para o desenvolvimento de cáries dentárias em humanos) após o tratamento com a composição da presente invenção;

[0039] A figura 17 apresenta in vitro resultados mostrando a eliminação quase completa de Lactobacilli (uma espécie bacteriana de significância para o desenvolvimento de cáries dentárias em humanos) após o tratamento com a composição da presente invenção;

[0040] A figura 18 é um mapa da triagem mostrando a divisão de um campo em grupos de tratamento diferentes usados em um estudo de campo do efeito das composições da presente invenção sobre o crescimento de cenouras e das folhagens de plantas de cenouras após infecção com Candidatus liberibacter;

[0041] A figura 19 representa graficamente os efeitos benéficos de uma composição da presente invenção na redução da porcentagem de plantas de cenouras tendo lesões foliares causadas por Candidatus liberibacter;

[0042] A figura 20 representa graficamente os efeitos benéficos de uma composição da presente invenção na redução do número médio de cenouras tendo lesões causadas por Candidatus liberibacter;

[0043] A figura 21 apresenta dados mostrando o número aumentado de larvas de abelha presentes em colmeias, após o tratamento de abelhas com uma composição da presente invenção, quando comparado com o controle não tratado; e

[0044] A figura 22 apresenta dados mostrado o número aumentado de abelhas adultas presentes nas colmeias, após o tratamento das abelhas com uma composição da presente invenção, quando comparado com o controle não tratado.

Descrição detalhada da invenção

[0045] Como explicado acima, os inventores da presente invenção descobriram de forma inesperada que muitos dos agentes de ativação apropriados para uso no método da presente invenção (em combinação com a bactéria não- patogênica tal como B. subtilis ou espécie probiótica) dividem a capacidade de inibir os mediadores inflamatórios que são mais geralmente associados com espécies animal superiores (tais como fator alfa de necrose tumoral [TNF- α]). Assim, em uma concretização preferida da presente invenção, um ou mais agentes de ativação são substâncias tendo atividade inflamatória.

[0046] Como mencionado, foi observado que a presente invenção que a atividade anti-inflamatória acima mencionada que está associada com os agentes de ativação da presente invenção é mediada, pelo menos em parte, pela inibição de um ou mais mediadores inflamatórios chaves, tais como TNF-α e/ou óxido nítrico (NO). Consequentemente, em uma concretização preferida da presente invenção, um ou mais agentes de ativação usados no método acima mencionado são substâncias capazes de inibição a produção de NO e/ou TNF-α.

[0047] Em uma concretização preferida ainda da presente invenção, os agentes de ativação têm cada um IC50 para a inibição da produção de NO de menos que 1,5 mg/ml e/ou um IC50 para a inibição da produção de TNF-α de menos que 2,5 mg/ml.

[0048] Em uma concretização preferida ainda, cada agente de ativação individual (se usado sozinho ou em combinação com outros tipos de agentes) tem um IC50 para inibição da produção de NO de menos que 0,05 mg/ml e/ou um IC50 para a inibição da produção de TNF-α de menos que 0,1 mg/ml.

[0049] Deve ser observado que o uso do valor IC50 (ou seja, a concentração de um agente que causa 50% da inibição máxima de um mediador, agonista ou outra molécula biologicamente ativa) como um meio para comparação da potência do agonista e outras moléculas farmacologicamente ativas e biologicamente ativas, é bem conhecido por todos os técnicos no assunto neste campo. Resumidamente, os valores IC50 podem ser obtidos pela delineação da curva de resposta a dose para um parâmetro tal como inibição de um mediador inflamatório particular, e extração das referidas curvas a partir da citada curva.

[0050] Em outra concretização preferida, os agentes de ativação são selecionados a partir do grupo consistindo de Sclareol, Naringin, Nootkatone, glicosídeo de Steviol e canabidiol e combinações dos mesmos.

[0051] Ainda em outras concretizações preferidas, os agentes de ativação (incluindo aqueles tendo as propriedades anti-inflamatórias qualitativas e quantitativas descritas acima) são derivadas a partir do material de planta (tal como extratos de planta bruta, tal como, extratos aquosos de toda a planta, extratos parcialmente purificados ou fracionados, extratos purificados e análogos sintéticos de moléculas ativas presentes em citados extratos).

[0052] Em uma concretização preferida deste aspecto da invenção, os agentes de ativação derivado da planta são extratos herbários selecionados a partir do grupo consistindo de Aster totaricus, Cyperus rotundus e combinações dos mesmos.

[0053] Em uma concretização preferida, as espécies hospedeiras é uma espécie de planta, incluindo (mas não limitado a) vegetais, leguminosas, grãos, espécies tropicais (tais como bananas), espécies subtropicais (tais como frutas cítricas), outras árvores e arbustos, plantas de flores de horticultura de interesse, e assim por diante.

[0054] Em outras concretizações preferidas, as espécies são uma espécie animal, em particular uma espécie de inseto de importância agrícola, tal como várias espécies de abelhas incluindo, mas não limitado a abelhas (Apis melífera L). Em outra concretização preferida, a espécie animal tratada são mamíferos, incluindo ambos os indivíduos humano e espécies não humanas. Com relação ao último, muitos animais domesticados, ou animais de importância agrícola podem ser tratados com as composições e métodos da presente invenção. Em uma concretização preferida, o indivíduo de mamífero a ser tratado é uma vaca ou ovelha.

[0055] Em uma concretização preferida, as espécies de bactérias não-patogênicas é Bacillus subtilis.

[0056] Apesar de muitas cepas diferentes de Bacillus subtilis podem ser usados para realizar o método da presente invenção, em uma concretização preferida, a cepa usada é a cepa QST 713. Esta cepa pode ser obtida comercialmente em várias formulações diferentes, incluindo Serenade® ASO e Cease®.

[0057] Em outra concretização preferida, a bactéria não- patogênica são selecionadas a partir de um ou mais espécies de bactéria probiótica. Como explicado daqui em diante, muitas espécies diferentes de bactéria probiótica (incluindo, mas não limitado a espécies de Lactobacillus e Bifidobacterium genii podem ser usadas para realizar o método da presente invenção).

[0058] Em algumas concretizações, entre um e cincopo dos agentes de ativação acima mencionados é usado para preparar a mistura usada na etapa (a) do método. Em uma concretização preferida, todos os cinco dos referidos agentes de ativação é usado.

[0059] Em outra concretização particularmente preferida, os cinco agentes de ativação são presentes na mistura nas faixas de porcentagem a seguir:

[0060] Preferivelmente, a composição da porcentagem das células de Bacillus subtilis e os agentes de ativação na mistura são como a seguir: Bacillus subtilis (Serenade) 0,1% - 10% (mais preferivelmente 0,5% - 5%) Agentes de ativação 0,01% - 10% (mais preferivelmente, 0,05% - 5%)

[0061] Em concretizações dos métodos descritos e reivindicados aqui nos quais as espécies hospedeiras são plantas, muitos meios diferentes de colocar a mistura da etapa (a) em contato com o organismo hospedeiro pode ser empregada na etapa (b) do referido método. Estes significam incluir (mas não estão limitados a): fertilização, pulverização, emulsão, membranas de liberação controlada ou substratos e combinações dos mesmos.

[0062] Em algumas concretizações preferida, um ou mais das bactérias não-patogênicas, um ou mais agentes de ativação e/ou combinações dos mesmos são administrados à planta por meio de administração foliar. Isto pode ser conseguido, por exemplo, por meio de pulverização destas substâncias usando meios convencionais.

[0063] Em outras concretizações preferidas, um ou mais bactéria não-patogênica, um ou mais agentes de ativação e/ou combinações dos mesmos são administrados à planta por meio da adição destas substâncias ao meio no qual dita planta é crescida. Isto pode ser conseguido por meio do preparo dos grânulos ou outros substratos (tais como fibras absorventes, pelotas, contas, etc.) que foram revestidos com a bactéria não-patogênica e/ou agentes de ativação, ou alternativamente foi causado em absorver estas substâncias em sua estrutura interna por imersão aqui ou por quaisquer outros meios. Em uma concretização particularmente preferida, a forma de liberação usada compreende uma pluralidade de grânulos (por exemplo, grânulos de perlita) que foram revestidos com as substancias a serem liberadas. Geralmente (mas não sempre), estes grânulos podem ainda compreender um polímero controle de liberação, que é usualmente presente como um revestimento externo sobre a superfície do grânulo.

[0064] Em uma concretização preferida adicional, a bactéria não-patogênica, um ou mais agentes de ativação e/ou combinações dos mesmos são administrados por meio de sementes revestidas das espécies plantas com estas substâncias anteriormente à semeadura das referidas sementes. Tais sementes revestidas podem ainda compreender um ou mais polímeros de controle de liberação, geralmente (mas não exclusivamente) na forma de um revestimento externo.

[0065] Em algumas concretizações, o método da presente invenção compreende a administração separada da bactéria não- patogênica e os agentes de ativação. Tal administração separada pode também ser acompanhado por qualquer uma das rotas de administração usadas para as misturas da referida bactéria não-patogênica e agentes de ativação descrito aqui.

[0066] Em algumas concretizações, a mistura da etapa (a) é administrada aos organismos hospedeiros a serem tratados de uma maneira contínua, por períodos entre umas poucas horas e cerca de 180 dias.

[0067] Quando o método de emulsão é usado, o período de tratamento é geralmente umas poucas horas e um segundo tratamento pode ser administrado após cerca d 10 dias.

[0068] Quando uma membrana ou substrato de liberação controlada é usado, o tratamento será tomado em cerca de 180 dias. O substrato deliberação controlada pode ser de vários tipos diferentes. Em uma concretização preferida, este substrato é formado em grânulos, tais como grânulos de Perlita, como são bem conhecidos pelos técnicos no assunto deste campo. Outras opções para substratos de liberação controlada incluem várias pelotas, contas, micro-contas, fibras tendo uma capacidade de absorção de água de cerca de 1:15 em relação ao seu peso seco. De modo a conseguir as características de liberação controlada desejada, os substratos podem ser revestidos com cera, etocel, outros polímeros de controle de liberação (bem conhecidos na agricultura, no campo de pesticida e farmacêutico) e óleos de plantas.

[0069] No caso em que o método da invenção é usado para tratar os animais, a composição da presente invenção pode ser formulada para uso tópico na forma de géis e cremes. Alternativamente, a composição pode ser formulada de modo que ela possa ser adicionada a um alimento animal sólido ou líquido que já está sendo administrado ao animal em uma base diária. Finalmente, outras formas de dosagens pretendidas para administração oral ou parenteral dentro da espécie hospedeira animal será bem conhecido pelos técnicos do assunto neste campo, e são todos incluídos dentro do escopo da presente invenção.

[0070] A presente invenção também provê uma composição compreendendo uma mistura de bactéria não-patogênica e um ou mais agentes de ativação, sendo que dito um ou mais agentes de ativação são substâncias tendo atividade anti- inflamatória. Preferivelmente, tais agentes anti-inflamatório são capazes de inibir a produção ou liberação de mediadores anti-inflamatórios de óxido nítrico (NO) e/ou TNF-α.

[0071] Em uma concretização preferida deste aspecto, ditos agentes de ativação cada um tem um IC50 para a inibição da produção NO menor que 1,5 mg/ml e/ou um IC50 para a inibição da produção de TNF-α menor que 2,5 mg/ml.

[0072] Em uma outra concretização preferida, dito agente de ativação têm cada uma um IC50 para a inibição da produção de NO menor que 0,1 mg/ml e/ou um IC50 para a inibição da produção de TNF-α menor que 0,2 mg/ml.

[0073] Em uma outra concretização preferida ainda, dito agente de ativação têm cada uma um IC50 para a inibição da produção de NO menor que 0,05 mg/ml e/ou um IC50 para a inibição da produção de TNF-α menor que 0,1 mg/ml.

[0074] Em uma concretização preferida deste aspecto, a presente invenção é dirigida a uma composição de proteção de planta ou proteção animal compreendendo uma mistura de Bacillus subtilis e um ou mais agentes de ativação selecionados a partir do grupo consistindo de Sclareol, Naringin, Nootkatona, glicosídeo de Steviol e canabidiol.

[0075] Em uma concretização preferida, qualquer uma das composições acima descrita podem ainda compreender um ou mais componentes adicionais, incluindo agentes de penetração, estabilizantes, solventes, sequestradores, emulsificantes e agentes de controle de liberação (por exemplo, liberação lenta).

[0076] Exemplos de agentes de penetração apropriados, solventes apróticos polares DMSO, DMSO-d6, dimetilformamida (DUF).

[0077] Exemplos de surfactante não-iônico apropriado incluem Triton X-100, Tergitol 15-S-3, 15-S-5, 15-S-7.

[0078] Exemplos de sequestradores apropriados incluem fosfatos de sódio, gluconato de sódio, cloreto de cálcio, gluconato de potássio.

[0079] Exemplos de emulsificantes incluem polialdo 10-6-O, E-471, E-475, e E-476.

[0080] Exemplos de agentes de liberação controlada incluem revestimentos compreendendo diciclopentadieno e óleo de linhaça ou um alquida de óleo de soja (por exemplo, composição de revestimento comercialmente disponível e vendido sob a marca registrada “Osmocote®”, e distribuído por ICL Specialty Fertilizers, Israel, e descrito na US 4,657,576), e o polímero E603 obtida na Sekisui Specialty Chemicals, Japão.

[0081] É claro que, os componentes adicionais listados acima são dados apenas a título de ilustração, e muitos outros aditivos diferentes e excipientes podem também ser incluídos nas composições descritas aqui.

[0082] Deve ser observado que em algumas das concretizações preferidas da presente invenção, a mistura dos agentes de ativação inclui ambas, as substâncias hidrofílicas e hidrofóbicas. Como resultado, é necessário em muitos casos preparar a composição como uma mistura emulsificada de dois componentes separados, uma porção aquosa contendo mais agentes solúveis em água dissolvidos em água e uma porção hidrofóbica contendo menos agentes solúveis em água dissolvidos em ácidos graxos, triglicérides de cadeia média, etanol, outros solventes e combinações dos mesmos.

[0083] Em uma concretização preferida da composição acima descrita da presente invenção, a bactéria não-patogênica são selecionadas a partir do grupo consistindo de Bacillus subtilis e bactéria probiótica.

[0084] Em uma concretização altamente preferida, a bactéria não-patogênica são bactérias das espécies Bacillus subtilis. Apesar de muitas cepas diferentes desta espécie pode ser usada, em uma concretização preferida, a composição compreende a cepa QST 713.

[0085] Em outra concretização altamente preferida, a bactéria não-patogênica na composição são um ou mais espécies de bactéria probiótica. Em uma implementação desta concretização, a bactéria probiótica são selecionadas a partir do grupo consistindo de L. rhamnosus, L. Casei, L. plantarum, L. helveticus (acidophilus), B. longum, B. breve, pediococcus acidilactici, Lactococcus lactis e combinações dos mesmos.

[0086] Em um aspecto adicional, a presente invenção também provê uma mistura de agentes capazes de causar a ativação de Bacillus subtilis, selecionado a partir do grupo consistindo de: Sclareol, Naringin, Nootkatona, glicosídeo Steviol e canabidiol, e combinações dos mesmos.

[0087] Uma vantagem adicional do método e composição da presente invenção é a influência positiva que a mistura de bactéria não-patogênica (tal como, por exemplo, B. subtilis e bactéria probiótica) e agentes de ativação pode ter um vigor de plantas tratadas com ela, particularmente durante os estágios anteriores do desenvolvimento da muda. Consequentemente, em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um método para aumentar o rendimento de uma planta de importância agrícola ou hortícola por meio de: (a) prover uma mistura de um ou mais bactérias não-patogênica e um ou mais agentes de ativação; e (b) administrar a mistura da etapa (a) para a referida espécie hospedeira.

[0088] Em outra concretização deste aspecto, a invenção também provê um método para aumentar o rendimento de uma planta de importância agrícola ou hortícula por meio de: (a) prover, separadamente: (i) uma composição compreendendo uma ou mais bactéria não- patogênica; e (ii) uma composição compreendendo um ou mais agentes de ativação; e (b) administrar, separadamente cada uma das composições (i) e (ii) à referida espécie hospedeira.

[0089] Similarmente, a presente invenção também abrange um método para aumentar o rendimento de um produto (por exemplo, leite, mel, etc.) a partir de um animal de importância agrícola por meio de: (a) prover, separadamente: (i) uma composição compreendendo uma ou mais bactéria não- patogênica; e (ii) uma composição compreendendo um ou mais agentes de ativação; e (b) administrar, separadamente, cada uma das composições (i) e (ii) à referida espécie hospedeira.

[0090] Em uma variante deste método (como descrito adiante, em relação a outros métodos da presente invenção), a bactéria não-patogênica e composição compreendendo um ou mais dos agentes de ativação podem ser administrados separadamente à espécie hospedeira.

[0091] Os métodos acima definidos para aumentar o rendimento dos produtos agrícolas e para aumentar a capacidade de uma espécie de planta ou hospedeiro para resistir aos danos induzidos por micróbios, podem cada um compreender qualquer uma das características técnicas que foram descritas e descritas a seguir em conjunto com o método para prevenir e/ou tratar infecção da espécie hospedeira de planta ou animal por patógenos microbianos.

[0092] Em um outro aspecto, a presente invenção é dirigida a uma mistura de um ou mais bactéria não-patogênica e um ou mais agentes de ativação para uso na prevenção ou tratamento da infecção causada pelo fungo, bactéria e/ou patógenos virais em espécie animal.

[0093] Em outro aspecto, a presente invenção é também dirigida ao uso de uma mistura de um ou mais bactéria não- patogênica e um ou mais agentes de ativação para o tratamento e/ou prevenção de infecção causada por fungos, bactérias e/ou patógenos virais em espécies hospedeiras de plantas ou animais.

[0094] Todas as características técnicas descritas e definidas a seguir em conjunto com os vários métodos de tratamento, aplicam-se igualmente ao uso da mistura de bactéria não-patogênica e agentes de ativação descritos imediatamente a seguir.

[0095] A presente invenção será agora ainda ilustrada com referência aos exemplos de trabalho não limitativos a seguir e as figuras que acompanham o pedido. Exemplos Materiais e Métodos: 1. Bactéria não-patogênica (a) Bacillus subtilis

[0096] Para o propósito dos estudos reportados aqui, como Exemplos 1 a 18, a cepa QST 713 comercialmente disponível foi usada. Esta cepa foi obtida da Bayer Corporation em duas diferentes formulações: (1) Serenade® ASO; e (2) Cease®. Em muitos dos exemplos de trabalho abresentados abaixo, Serenade® ASO foi usado como a fonte de Bacillus subtilis. Entretanto, nos Exemplos 3 e 11, Cease® foi usado no lugar de Serenade®. (b) Bactéria probiótica

[0097] Para o propósito dos estudos reportados aqui, como Exemplos 19 e 20, a mistura probiótica comercialmente disponível conhecida como “Jarro Dophilus” foi usada para preparar a composição da presente invenção. Detalhes adicionais desta mistura probiótica são encontrados no Exemplo 19, definido a seguir. 2. Agentes de ativação:

[0098] A classificação inicial a seguir de um número grande de moléculas candidatos, os fito-químicos a seguir foram selecionados para uso como agentes de ativação na primeira parte do presente estudo. 1. Sclareol - álcool di-terpeno extraído da Salvia sclarea. 2. Naringin - flavanona-7-O-glicosídeo extraído da casca da toranja. 3. Nootkatona – sesquiterpeno – extraído da casca da laranja. 4. Glicosídeo de Steviol - extraído da Stevia rebaudiana. 5. CBD - canabidiol - extraído de cânhamo

[0099] Os testes iniciais a seguir das combinações de cinco ou menos destas substâncias como agentes de ativação para B. subtilis, a eficácia dos materiais herbários adicionais foi também investigada, como descrito nos Exemplos 4 e 5, a seguir.

Exemplo 1 Classificação inicial de fito-químicos para seu uso potencial como agentes de ativação para Bacillus subtilis Introdução:

[0100] As mudas de pepino (Cucumis sativus L) são altamente suscetíveis ao ataque dos patógenos fúngico e bacterianos nas mudas durante o processo de germinação, e foram, portanto, selecionados como uma planta modelo para classificar e calibrar o Bacillus subtilis e os fito-químicos que podem causar ativação dos mesmos.

Materiais e métodos: 1. Classificação fito-química

[0101] Os fito-químicos potenciais foram adicionados em uma mistura de 30 cc de glicose 50% V/V do substrato, 10 cc do coquetel ou patógeno fúngico e 10 cc do coquetel do patógeno bacteriano em uma placa de Petri. O coquetel fúngico continha: Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Pythium spp e fungos não patogênicos usados para a fermentação de tomates. O coquetel bacteriano continha: Clavibacter michiganensis, Xanthomonas campestres, Pseudomonas syringae e bactéria não- patogênica usada para a fermentação dos tomates.

[0102] Aproximadamente 1000 fito-químicos potenciais foram classificados quanto a sua capacidade de ativar Bacillus subtilis por meio de cálculo de um índice de formação de colônia para cada teste (0 = sem colônia; 5 = tamanho máximo da colônia). Os cinco fito-químicos listados acima na introdução da seção de Exemplos foram selecionados a partir de aproximadamente 1000 fito-químicos testados sobre a base de seu desempenho superior como agentes de ativação para Bacillus subtilis.

[0103] A combinação ótima e concentrações de cinco agentes de ativação selecionadas listados acima foram determinadas para cada um dos organismos hospedeiros usados nos estudos reportados abaixo. As combinações selecionadas foram àqueles encontrados em estudos preliminares tem o concentrado possivelmente menor que foi capaz de produzir o efeito protetor desejado. Neste caminho, os efeitos colaterais possíveis e o meio de poluição durante a administração destes agentes aos organismos hospedeiros foram evitados.

[0104] Ao mesmo tempo, os fito-químicos foram classificados quanto a sua capacidade de eliminar um coquetel de bactéria e patógenos fúngicos. Para o propósito de comparação entre os vários tratamentos, o índice de eliminação bacteriana e fúngico foram calculados (0 = eliminação máxima, 5 = sem eliminação).

[0105] As misturas de testes, contendo o substrato de glicose e coquetel de fungos e bactérias mencionados acima, junto com todos os cinco dos fito-químicos de ativação e um penetrador (DMSO) e solvente (Triton) foram usados em quatro concentrações diferentes: concentração 1, 2, 3 e 4. Em cada caso, a mesma quantidade de substrato de glicose e coquetel de fungo e bactéria - 30 ml - foi adicionada à mistura. Similarmente, a concentração de DMSO (0,5% v/v) e Triton (0,02% v/v) foram os mesmo em todas as misturas. Entretanto, as concentrações de Bacillus subtilis e cada um dos cinco agentes de ativação (dado em v/v%) foram diferentes em cada uma das misturas de teste, como descrito na tabela 1:

[0106] Várias misturas de teste diferentes contendo combinações diferentes de alguns ou todos os cinco agentes de ativação foram usados neste estudo, de acordo com a lista de tratamentos dados na Tabela II, abaixo. Em cada caso, os agentes de ativação, Bacillus subtilis e substratos foram usados em concentrações indicados na Tabela I. Por exemplo, quando testado em concentração 1, a concentração de Sclareol nas misturas de teste contendo aquele agente de ativação foi 0,1% enquanto quando testado em concentração 2, Sclareol foi presente em uma concentração de 0,2%, e assim por diante. Resultados:

[0107] Os resultados preliminares indicaram que a atividade antifúngica e antibacteriana ótima foi obtida usando as misturas de teste com concentração 2 e concentração 3 (ver tabela I, acima). Uma vez que o desenvolvimento da colônia de Bacillus subtilis foi ótimo usando a concentração 3, esta foi a concentração selecionada para uso no remanescente do estudo. Os resultados obtidos para a eliminação fúngica, eliminação bacteriana e ativação de Bacillus subtilis (tamanho da colônia) para os testes de concentração 3 são resumidos graficamente na figura 1 nas setas frontais, intermediárias e posterior do gráfico, respectivamente. Os onze tratamentos diferentes resumidos na Tabela II, acima são rotulados como T1 a T11 junto com o eixo X do gráfico.

[0108] Como explicado acima, os três índices semi- quantitativo usados para avaliar as propriedades de anti- fúngicos, anti-bacterianos e propriedades de ativação são como a seguir: Índice fúngico: 0 (sem desenvolvimento) a 5 (desenvolvimento máximo); Índice bacteriano: 0 (sem desenvolvimento) a 5 (desenvolvimento máximo); Índice B.s (índice de formação de colônias): 0 (sem desenvolvimento) a 5 (desenvolvimento máximo).

[0109] Pode ser observado a partir da figura 1 que os melhores resultados - ambos para a ativação de Bacillus subtilis e para eliminação do patógeno foram obtidos usando o tratamento 11, que (como mostrado na Tabela II, acima) usada uma combinação de todos os cinco agentes de ativação.

[0110] Os resultados de um experimento adicional (no qual 16 misturas de agentes diferentes foram testadas) são mostrados na Tabela a seguir:

[0111] Os resultados obtidos com as misturas 12-16 são de particular interesse: estas misturas não contêm B. subtilis, e sua perda completa da atividade contra a bactéria patogênica neste sistema de teste indicam claramente que os agentes de ativação sozinhos (incluindo mesmo uma mistura de todos os cinco agentes de ativação - mistura de teste 12 na Tabela II a) são inativos. Assim, a presença de ambos os agentes de ativação e B. subtilis (ou uma outra espécie bacteriana não-patogênica) são requeridos de modo a obter o efeito antimicrobiano desejado. Deve ser ainda observado que este efeito particular - a perda da atividade dos agentes de ativação sozinha, ou seja, na ausência de B. subtilis ou outra bactéria não-patogênica foi visto em todos os estudos reportados abaixo (dados não mostrados).

Exemplo 2 Efeito da alteração da composição de agente de ativação sobre a ativação de Bacillus subtilis e as atividades fungicida e bactericida da referida composição:

[0112] Um segundo grupo de estudos teve por objetivo investigar o efeito tanto de eliminar um fito-químico a partir de toda a combinação de 5 componentes ou de alterar seletivamente a concentração de um ou dois componentes na mistura.

Materiais e métodos - Como para o Exemplo 1:

[0113] As várias misturas de teste foram usadas tanto na concentração 3 ou concentração 4 (como definido no Exemplo, acima). A composição de cada uma destas misturas de teste é resumida nas duas tabelas a seguir: Tabela III Concentração 3 * No teste 8, o Nootkatona e Stevia estavam cada um presente em concentração elevada – 0,4% v/v Nootkatona (ao invés de 0,3%) e 1,0% de Stevia (ao invés de 0,75%). Tabela IV Concentração 4 ** No teste 7, o Naringin estava presente em uma concentração reduzida – 0,3% v/v (ao invés de 0,4%).

Resultados:

[0114] Como pode ser visto na figura 2, todas as misturas de teste contendo 3 ou 4 agentes de ativação usados na concentração 3 causando uma redução significante nos índices fúngicos e bacterianos (gráficos superior e intermediário, respectivamente) e um aumento significante no índice de ativação do Bacillus subtilis (gráfico inferior), quando comparado com o meio apenas e o meio mais Bacillus subtilis controles (misturas 1 e 2, respectivamente).

[0115] Similarmente, como mostrado na figura 3, todas as misturas de teste contendo 3 ou 4 agentes de ativação usadas na concentração 4 causou redução significante nos índices fúngicos e bacterianos (gráficos superior e intermediário, respectivamente) e um aumento significante no índice de ativação de Bacillus subtilis (gráfico inferior), quando comparado com meio apenas e meio mais Bacillus subtilis controles (misturas 1 e 2, respectivamente).

[0116] Pode ser também observado na figura 2 que a mistura de agente de ativação de cinco componentes no qual os componentes Nootkatona e Stevia são ambos em uma concentração elevada (ou seja, concentração 4, enquanto todos os outros componentes estão na concentração 3; ou seja, mistura de teste 8) tem a maior atividade sobre todos os índices tr~es.

[0117] Além disso, a figura 3 mostra que a mistura do agente de ativação de quatro componentes (número 7) na qual a concentração Naringin é reduzido à concentração 3, com todos os componentes na concentração 4, tem a atividade maior neste conjunto de dados, como medido por todos os três índices.

[0118] Estes dados indicam que as misturas contendo menos que o máximo de cinco agentes de ativação podem ser usados para proteger os organismos hospedeiros a partir do ataque fúngico ou bacteriano. Em adição, estes resultados também indicam que a otimização das misturas pode ser obtido pela manipulação da concentração de um ou mais agentes de ativação individual na mistura.

Exemplo 3 As atividades fungicidas e bactericidas de várias composições de agentes de ativação em conjunto com uma formulação diferente de Bacillus subtilis:

[0119] Neste estudo, os experimentos realizados no Exemplo 2 acima foram repetidos usando uma preparação diferente de B. subtilis.

Material e Métodos - como para o Exemplo 1:

[0120] As várias misturas de testes foram usadas tanto na concentração 3 ou concentração 4 (como definido no Exemplo 1, acima). A composição de cada uma destas misturas de teste é como resumido nas Tabelas II e IV, no Exemplo 2, aqui estabelecido.

Resultados:

[0121] Este estudo confirma os resultados obtidos no Exemplo 2. Assim, como visto na figura 4 (concentração 3) e Figura 5 (concentração 4), todas as misturas de teste contendo 3, 4, ou 5 agentes de ativação na concentração 3, causaram uma redução marcada nos índices de fungos e bactérias (gráficos superior e intermediário, respectivamente). Além disso, eles também causaram um aumento significante no índice de ativação do Bacillus subtilis (gráfico inferior).

[0122] Uma observação particular é o fato de que (como no caso do estudo reportado no Exemplo 2 usando a preparação Serenade*), na concentração 3, a mistura de agente de ativação de 5 componentes na qual os componentes de Nootkatona e Stevia são ambos, em uma concentração elevada (ou seja, concentração 4, enquanto todos os outros componentes estão na concentração 3; ou seja, a mistura de teste 8) tem atividade maior em todos os três índices (figura 4). Similarmente, como mostrado na figura 5, a mistura do agente de ativação de quatro componentes (número 7) na qual a concentração Naringin é reduzida na concentração 3, com todos os outros componentes na concentração 4, tem a maior atividade neste conjunto de dados, como medido em todos os três índices.

[0123] Estes resultados, obtidos com a formulação Cease® Bacillus subtilis confirma a descoberta obtida com a formulação Serenade® (Exemplo 2, daqui em diante), indicando que os efeitos observados não são específicos para qualquer uma das preparações particulares de Bacillus subtilis. Exemplo 4:

Atividade anti-inflamatória dos agentes usados na presente invenção:

[0124] A seguir os resultados obtidos com combinações de Bacillus subtilis e alguns ou todos dos cinco agentes de ativação reportados nos Exemplos 1 -3, daqui em diante, os referidos agentes foram investigados de modo a observar as propriedades funcionais comuns, em adição às suas capacidades bactericidas, fungicidas e habilidades de ativação de B. subtilis.

[0125] A seguir uma série de investigações preliminares, os inventores da presente invenção descobriram inesperadamente que cada um dos cinco agentes de ativação testados nos estudos apresentados acima, também divide uma atividade anti- inflamatória altamente potente.

[0126] De modo a investigar isto adicionalmente, três dos agentes de ativação usados nos Exemplos anteriores - ambos separadamente, em combinação com cada um dos outros e em combinação com o Bacillus subtilis, foram testados quanto a sua capacidade de inibir a produção in vitro em uma linha de macrófago cultivado de dois inibidores inflamatórias chaves: óxido nítrico (NO) e TNF-α. Em adição, a viabilidade dos macrófagos foi medida em valores IC50 apropriados correspondente à inibição de NO e TNF-α, no mesmo tempo que os ensaios anti-inflamatórios foram realizados.

Métodos: Linhas de células de macrófagos RAW 264,7:

[0127] Os macrófagos RW 264,7 foram crescidos em frascos de fundo plano usando um meio de crescimento padrão (DMEM suplementado com 5% FBS, antibióticos e glutamina). As células foram mantidas de acordo com os procedimentos padrões bem conhecidos na técnica. Após as células alcançarem a confluência, eles foram removidos a partir dos frascos usando meios mecânicos e então concentrados por centrifugação e re- suspensos em um volume menor de meio de cultura fresca. A concentração celular foi ajustada com meio de crescimento de modo que cerca de 75.000 células poderia ser adicionada em cada poço de uma placa de 96-poços. Uma combinação de 25 μg/mL LPS e 10 U/ml IFN-y DMEM, foi usado para ativação dos macrófagos. Os vários agentes de teste foram adicionados aos poços uma hora antes de ativação. As células foram então incubadas por 24 horas adicionais, antes de avaliação da produção mediadora inflamatória e viabilidade celular.

Determinação de viabilidade celular:

[0128] O ensaio em Alamar Blue da viabilidade foi realizado pela adição de 100 μ L de uma solução a 10% de Alamar Blue para cada poço e incubação a 37°C por 1-2 horas. A fluorescência foi medida (excitação a 545 nm e emissão a 595 nm) e expressas como uma porcentagem dos valores nas células controle não tratadas.

Determinação da produção de óxido nítrico pelo ensaio Griess:

[0129] A produção de NO pelos macrófagos submetidos aos vários tratamentos foi avaliado usando o reagente Griess (volumes iguais de 1% de sulfanilamida e 0,1% de naftietileno-diamina em 5% em HCl). 70 μ L de sobrenadante a partir de cada poço de teste foram transferidos para uma placa de 96-poços fresca e misturados com 70 μ L de reagente Greiss e a cor violeta produzida foi medida em 540 nm.

Determinação TNF-α por ELISA:

[0130] Um ELISA sanduíche foi usado para determinar a concentração de TNF-α. O anticorpo primário foi usado em uma concentração de 0,5 μ g/mL em PBS. As diluições seriais de TNF-α padrão de 0 a 1000 pg/mL no diluente (0,05% de Tween- 20, 0,1% de BSA em PBS) foram usados como padrão interno. O TNF-α foi detectado com um segundo anticorpo biotinilada e um conjugado de peroxidase avidina com TMB como reagente de detecção. O desenvolvimento de cor foi monitorado em 655 n, tomando as leituras a cada 5 minutos. Após 25 minutos, a reação foi interrompida usando 0,5 M de ácido sulfúrico e a absorbância foi medida em 450 nm.

Agentes testados:

[0131] Os métodos descritos acima foram usados para determinar os efeitos de Sclareol, Naringin e Steviol, e suas combinações uns com os outros e com Bacillus subtilis, sobre a produção de NO e TNF-α, e sobre a viabilidade celular. Os resultados para a atividade anti-inflamatória estão presentes como valores IC50 para a inibição da produção de NO e TNF-α na Tabela V, abaixo, junto com os resultados da viabilidade celular. Em adição, os resultados comparáveis obtidos a partir da literatura científica (A.S. Ravipati et al., (2012) BMC Complementary and Alternative Medicine, 12:173 - “Antioxidant and anti-inflammatory activities of selected Chinese medicinal plantas and their relation with antioxidante contente”) para duas espécies de plantas adicionais - extratos aquosos de Aster trataricus and Cyperus rotundus - são apresentados no final da tabela. Os extratos destas duas espécies foram investigados pelos inventores da presente invenção com relação aos seus efeitos fungicidas e bactericidas em combinação com B. subtilis. Os resultados destas investigações estão apresentados no Exemplo 5, em seguida.

Resultados:

[0132] Os resultados obtidos para os ensaios anti- inflamatórios e de viabilidade dos macrófagos cultivados tratados com os vários agentes estão apresentados na Tabela V, abaixo.

[0133] Pode ser observado que nenhum dos agentes de tratamento testados teve qualquer efeito colateral significante sobre a viabilidade dos macrófagos. Consequentemente, qualquer inibição da produção dos dois mediadores inflamatórios causados por estes agentes não foi resultado de um efeito citotóxico geral.

[0134] Deve ser observado a partir da tabela que quando tomado separadamente, o IC50 para a inibição de NO dos três agentes, Sclareol, Naringin e Steviol são 0,04; 0,04 e 0,02, respectivamente. Além disso, quando usado em combinação um com ou outro, dita combinação é ainda mais potente, com um IC50 para a inibição NO de 0,004 na ausência de B. subtilis, e 0,001 na presença de B. subtilis. Se estes resultados são comparados com os valores IC50 comparáveis para a inibição NO publicado para 44 extratos de plantas selecionados no artigo acima mencionado e A.S. Ravipati et al. (2012), pode ser visto que os valores para Sclareol, Naringin e Steviol estão na extremidade inferior da faixa de valores no referido artigo (0, 03 - 1, 49) e em um caso (Steviol) mesmo além da extensão inferior daquela faixa. Similarmente, se o valor médio para Sclareol, Naringin e Steviol for comparado com aqueles das 44 plantas reportadas no artigo, pode ser observado que o último (0,03) é muito menor que o extrato médio a partir dos valores publicados (0,26).

[0135] Uma conclusão similar pode também ser direcionada com relação à inibição de TNF-α por Sclareol, Naringin e Steviol quando testados separadamente, com valores IC50 de 0,08, 0,09 e 0,08, respectivamente (faixa = 0,08-0,09; média = 0,083), comparado com os resultados publicados para os 44 extratos de plantas em A.S. Ravipati et. al. (2012) (faixa = 0,07 — 2,5; média - 1,04).

[0136] Pode assim ser concluído que os três agentes selecionados e testados nos Exemplos 1-3, adiante, todas têm atividade anti-inflamatória, e são mais potentes (ou seja, tem um IC50 menor) do que um conjunto de 44 extratos de ervas, comumente usados na medicina Chinese (A.S. Ravipati et al., (2012)), com relação à inibição de NO e TNF-α.

[0137] Além disso, é de interesse observar a partir da tabela V que mesmo no caso de extratos de planta anti- inflamatórias menos potentes (por exemplo, Aster tataricus, Cyperus rotundus, Platycodon grandiflorus e Pleione bulbocadioides), ditos extratos são também efetivos como agentes de ativação para Bacillus subtilis com relação à atividade antifúngico e antibacteriano (como será mostrado no Exemplo 5, adiante).

Exemplo 5 As atividades fungicidas e bactericidas das combinações de dois extratos de plantas diferentes com Bacillus subtilis:

[0138] O potencial para extratos de duas plantas com propriedades anti-inflamatórias - Aster tataricus e Cyperus rotundus - ter um efeito potencial sobre as atividades fungicidas e bactericidas do Bacillus subtilis foi investigado. Método:

[0139] O mesmo método para avaliar as propriedades antifúngicas e antibacterianas como usado no Exemplo 1 dado aqui, foram aplicados neste estudo para as combinações de Bacillus subtilis com extratos aquosos de Aster tataricus e Cyperus rotundus. Duas concentrações diferentes dos extratos e da suspensão de B. subtilis foram usadas, como resumidos na Tabela V iram, abaixo.

[0140] Várias combinações dos extratos e a suspensão B. subtilis foram preparadas e testadas de acordo com o esquema provido na Tabela VII. Todas estas combinações foram testadas em ambas, na concentração 3 e na concentração 4. Resultados:

[0141] A figura 6 apresenta graficamente os resultados obtidos usando as combinações da Tabela VII na concentração 3. Será visto a partir do gráfico superior que todas as combinações testadas mostram atividade fungicida, e que a combinação mais efetiva neste sentido foi a combinação 5, denominada B. subtilis junto com o extrato de Cyperus rotundus. Os resultados similares são obtidos na concentração 4, como mostrado no gráfico superior na figura 7. Neste caso, entretanto, a combinação de WB. Subtilis e Aster tataricus também produziu um resultado similar.

[0142] Com relação à atividade bactericida, o gráfico intermediário da figura 6 indica que na concentração 3, a combinação de B. subtilis e Cyperus rotundus causa a maior redução no número de células bacterianas de todas as combinações testadas. Com relação aos dados da concentração 4, entretanto, o resultado do estudo bactericida mostrado no gráfico intermediário da figura 7 demonstra que quando nos caso da concentração 4, os dados fungicidas discutidos acima - ambas as combinações binárias do extrato de planta com B. subtilis produziram o maior efeito bactericida.

[0143] Finalmente, com relação à ativação de B. subtilis, fica claro a partir dos gráficos inferiores de ambas as figuras, figuras 6 e 7, que cada uma das combinações binárias do extrato de planta com B. subtilis mostrou o efeito máximo.

[0144] Pode ser concluído a partir deste estudo preliminar que os extratos aquosos de duas plantas tendo propriedades anti-inflamatórias agem como agentes de ativação para o Bacillus subtilis, aumentado sua atividade antibacteriana e antifúngica.

Exemplo 6 - Inoculação de sementes de pepino: Método:

[0145] 10cc de cada mistura de agentes de ativação, Bacillus subtilis e componentes adicionais (incluindo a coquetéis bacterianos e/ou fúngicos como descritos nas tabelas I e II do Exemplo 1, daqui em diante) foi amostrado a partir da placa de petri relevante e injetados em 4 replicações para germinação das sementes de pepino 10 horas após a semeadura.

[0146] A saúde de cada planta foi avaliada 5 dias, após o tratamento, usando um índice de inoculação semi-quantitativo (0 = saudável, 5 = morta).

Resultados:

[0147] Os resultados deste estudo estão mostrados graficamente na figura 8, na qual os quatro gráficos separados resumem os dados obtidos usando os agentes de ativação em concentrações 1, 2, 3, e 4 (a partir de cima para baixo).

[0148] Como pode ser visto a partir d primeiro (superior) gráfico na figura 8, nenhum dos protocolos de tratamento, quando usados na concentração mais baixa (concentração 10 foi capaz de proteger as plantas a partir da infecção microbiana (índice de inoculação de 5 para todos os tratamentos).

[0149] O segundo gráfico na figura 8 indicou que na próxima concentração mais alta nas séries (concentração 2), as misturas do agente de ativação 6 a 11 proveram todas a proteção total para as plantas de pepino contra a infecção fúngica e bacteriana. Um resultado similar foi também visto quando os agentes foram usados na concentração 3, como mostrado no terceiro gráfico na figura 8.

[0150] Nas concentrações mais altas (concentração 4; último gráfico na figura 8), o efeito protetor é visto com as misturas de ativação 5 a 11.

[0151] Em resumo, todas as misturas de agente de ativação de múltiplos-componentes, bem como algumas das misturas contendo apenas um agente de ativação, foram efetivas na proteção das plantas de pepino in vivo, quando usadas nas concentrações 2 a 4. Os dados semi-quantitativos obtidos neste estudo correlacionam muito bem a aparência das plantas que foram submetidas aos vários tratamentos.

Exemplo 7: Inoculação das mudas de tomates Método:

[0152] As mudas de tomate foram inoculadas com misturas de teste contendo Bacillus subtilis e várias combinações de fito-químicos de ativação, da mesma maneira que no Exemplo 6, dado acima. Entretanto, a composição e a concentração das várias misturas de testes usadas foram diferentes a partira daquela do Exemplo 5, e estão resumidas nas duas tabelas a seguir (todas as concentrações foram dadas como % v/v).

[0153] Em adição, todas as misturas continham um penetrador (DMSO) em uma concentração de 0,5% v/v e um solvente (Triton) em uma concentração de 0,02% v/v. *** Mistura de teste 7 foi omitida nos conjuntos realizados na concentração 2. Na concentração 3, esta mistura continha Nootkatona e Stevia em uma concentração elevada (0,4% e 1,0%, ao invés de 0,3% e 0,75%, respectivamente). Na concentração 4, Sclaerol foi omitido e Naringin foi usado em uma concentração menor (0,3% ao invés de 0,4%).

Resultados:

[0154] Os resultados deste estudo de inoculação estão resumidos graficamente na figura 9. Pode ser visto a partir desta figura que na concentração 2 (gráfico superior), apenas a mistura de teste 6 causou proteção próxima da máxima das plantas de tomate. Em concentrações 3 e 4 (gráficos intermediários e inferior, respectivamente), entretanto, ambos os tratamentos 6 e 7 resultaram na proteção máxima.

Exemplo 8: Plantas de tomate - estudo de campo Introdução:

[0155] A região de crescimento principal para os tomates em Israel é o sudoeste do país.

[0156] Dois anos atrás, a área foi infectada profundamente por uma nova cepa agressiva do vírus do mosaico do tomate (ToMV). Este vírus infectou as plantas e o campo comercial foi reduzido a menos do que a metade do nível de rendimento normal. Infelizmente, nenhuma variedade genética resistente existia ainda. Um estudo de campo usando o método descrito atualmente foi realizado de modo a avaliar se dito método poderia aumentar a sobrevivência das plantas de tomate infectadas ToMV.

Método:

[0157] Uma triagem de Bacilus subtilis e fito-químicos de ativação foi realizada em uma estufa de tomate que foi infectada fortemente com o vírus na estação de crescimento anterior.

[0158] As misturas de tratamento usada foram as mesmas daquelas descritas acima no Exemplo 1, usando a concentração 2.

[0159] O método de implementação usado foi: a) pulverização; b) pulverização e fertilização; c) fertilização d) controle não tratado

[0160] As plantas de tomate foram localizadas tanto na face sul quanto na face norte, e cada uma delas foi tratada 6, 5 e 4 vezes a cada 14 dias.

Resultados:

[0161] Os resultados deste estudo estão apresentados graficamente na figura 10. Os primeiros três gráficos desta figura relatam que as plantas cresceram nos pontos da face norte, enquanto o segundo conjunto de três gráficos apresentam os resultados para as plantas que cresceram nos pontos da face sul.

[0162] Como pode ser visto a partir desta figura, os regimes de 6-tratamentos e 5-tratamentos (primeiro e segundo gráficos, acima) ambos resultaram em bons resultados (como evidenciado por um índice de inoculação reduzido) quando a composição foi administrada tanto por fertilização (barras 5 e 6 em cada conjunto) quanto pela combinação de fertilização e pulverização (barras 3 e 4).

[0163] Também parece a partir destes resultados que as plantas de tomate na linha da face sul responderam mais a estes tratamentos e métodos de implementação do que aquelas nos pontos da fade norte.

Exemplo 9: mudas de plantas de pimenta Método:

[0164] O mesmo método para inoculação das mudas de tomate, como descrito acima no Exemplo 7, foi empregado para testar a atividade da composição da presente invenção sobre as mudas de plantas de pimenta. O protocolo de tratamento também foi o mesmo que o usado no Exemplo 7, como representado nas Tabelas V e VI, acima.

Resultados:

[0165] Os resultados para o tratamento das mudas de plantas de pimenta estão resumidos na Figura 11. O gráfico superior apresenta os resultados para as misturas de ativação usadas na concentração 2, o gráfico intermediário relata as misturas usadas na concentração 3, e o gráfico inferior apresenta os resultados para a mistura de concentração 4.

[0166] Pode ser visto que estes gráficos que na concentração 2, as misturas de ativação 5 e 6 proveram proteção completa para as mudas. Nas concentrações 3 e 4, entretanto, a mistura de ativação 4 proveu proteção mais próxima da completa, em adição á proteção completa provida pelas misturas de ativação 5 e 6.

Exemplo 10 - Inoculação das mudas de milho: Método:

[0167] O mesmo método para inoculação das mudas de tomate e pimenta, como descrito adiante nos Exemplos 7 e 9, foi usado para inocular milho (Zea mays ssp, Mays) com as misturas do agente de ativação (em quatro concentrações diferentes) definidas nas tabelas I e II do Exemplo 1. A única diferença entre o protocolo de tratamento usado neste estudo e aquele descrito nos exemplos anteriores refere-se a composição de coquetel usado bacteriano e fúngico. Assim, este estudo, o coquetel fúngico compreende Pythium spp, Rizoctonia spp, e Peniciliium oxalicum, enquanto o coquetel bacteriano continha Erwinia chrysanthemi, Erwinia dissolvens e Enterobacter dissolvens.

Resultados:

[0168] Os resultados deste estudo de inoculação são resumidos graficamente na figura 12, com os quatro gráficos apresentando os resultados para as onze misturas de ativação usadas nas concentrações 1, 2, 3, e 4 (na ordem descendente).

[0169] Pode ser observado a partir destes gráficos que a melhor proteção contra infecção bacteriana e fúngica foi provida pela mistura de ativação 11, quando usada nas concentrações 2, 3 e 4.

Exemplo 11: Mudas de trigo Método:

[0170] O mesmo método para inoculação das mudas de tomate e de pimenta, como descrito acima nos Exemplos 7 e 9, foi usado para inocular as mudas de planta (Triticum aestivum) com as misturas de agentes e ativação (nas quatro diferentes concentrações) definidas nas Tabelas I e II do Exemplo 1. A única diferença entre o protocolo de tratamento usado neste estudo e aquele descrito nos exemplos anteriores refere-se à composição do coquetel fungicida e bactericida usado. Assim, neste estudo, o coquetel fungicida compreende Rizoctonia solani, Pythium graminicola, e Pythilum myriotylum, enquanto o coquetel bactericida continha Pseudomonas syrigae, Xanthomonas campestres, e Erwinia rhapontici.

Resultados:

[0171] Os resultados deste estudo de inoculação estão graficamente resumidos na figura 13, com os quatro gráficos apresentando os resultados das onze misturas de ativação usadas nas concentrações 1, 2, 3 e 4 (na ordem descendente).

[0172] Pode ser visto que estes gráficos que a melhor proteção contra infecção bacteriana e fúngica foi provida pela mistura de ativação 11, quando usada nas concentrações 2, 3 e 4 e a mistura de ativação 10, quando usada nas concentrações 3 e 4.

Exemplo 12: Mudas de arroz Método:

[0173] O mesmo método para inoculação das mudas de tomate e pimenta, como descrito acima nos Exemplos 7 e 9, foi usado para inocular as mudas de arroz (oryza sativa) com as misturas de agente de ativação (nas quatro concentrações diferentes) definidas nas tabelas I e II do Exemplo 1. A única diferença entre o protocolo de tratamento usado neste estudo e aquele descrito nos exemplos anteriores refere-se á composição do coquetel bactericida e fungicida usado. Assim, neste estudo, o coquetel fungicida compreendeu Pythium spinosum, Rizoctonia salani, Pythium dissotocum, enquanto o coquetel bacteriano continha Xanthomonas compestris pv Oryzae e Erwinia chrisantemi.

Resultados:

[0174] Os resultados deste estudo de inoculação estão graficamente resumidos na figura 14, com os quatro gráficos apresentando os resultados para as onze misturas de ativação usadas nas concentrações 1, 2, 3 e 4 (na ordem descendente).

[0175] Pode ser visto a partir destes gráficos que a melhor proteção contra a infecção bacteriana e fúngica foi provida pela mistura de ativação 11, em todas as quatro concentrações testadas, a mistura 10 quando usada em concentrações 3 e 4, mistura 9 em concentrações 3 e 4 e a mistura de ativação 8, quando usada na concentração 4 apenas.

Exemplo 13: Campo de estudo - grãos-de-bico Método:

[0176] O experimento em campo foi plantado em 10.09.2015 em solo pesado em Nahalal, Israel.

[0177] O período de plantação normal para grão-de-bico (cicer arietinum L) em Israel é no início de Fevereiro, principalmente devido a dois patógenos principais - Ascochyta rabiei e Fusarium oxysporum f. sp. Cicero.

[0178] As variedades existentes têm tolerância intermediária a estes patógenos e não pode cruzar o inverno em Israel.

[0179] O campo escolhido para este experimento teve uma elevada carga de Fusarium no pasto.

[0180] Antes de Fevereiro 16, 2016, o campo não foi tratado e sintomas pesados de ambos patógenos foram observados por todo o campo.

[0181] Em Fevereiro 16, 2016, o primeiro tratamento foi aplicado.

[0182] 4 variedades de grão-de-bico foram incluídas no experimento -1, 11, 12, e 13- e plantas de cada variedade foram submetidas a um dos três protocolos diferentes: dois protocolos de tratamento diferentes (protocolos vermelho e azul; ver Tabela X, abaixo) e um protocolo controle não- tratado:

[0183] Os procedimentos de aplicações a seguir foram usados para tratar as plantas com os protocolos de tratamento e controle: 1. 1 pulverização em Fevereiro 16, 2016. 2. 1 fertilização em Fevereiro 16, 2016. 3. 1 pulverização + fertilização em Fevereiro 16, 2016. 4. 2 pulverizações + fertilização em Fevereiro 16,2016 e em Março 1, 2016.

[0184] O sucesso ou outro resultado dos vários tratamentos foi determinado pela medida do rendimento de cada área de tratamento, e então extrapolar que o peso do Kg por Dunam (1000 m2).

Resultados:

[0185] Os resultados de vários tratamentos estão resumidos graficamente na Figura 15. Será observado a partir deste estudo que a variedade 13 do grão-de-bico respondeu a ambos os tratamentos da mistura de ativação (protocolos azul e vermelho) para uma extensão muito maior do que as outras variedades testadas, com relação à maneira na qual o tratamento foi administrado. Assim, a rendimento extrapolou a variedade 13 com o protocolo azul e a melhor rota de aplicação é 684 kg.

[0186] Deve ser observado que este rendimento é 4,2 vezes maior que o controle e mais do que duas vezes o melhor nível de rendimento comercial esperado em Israel.

[0187] O tratamento com o protocolo azul torna possível fazer plantio 4 meses antes e obter este resultado de rendimento.

[0188] Deve ser observado que a frequência dos tratamentos com os protocolos foi checada e tornou-se claro que o melhor resultado foi obtido quando a frequência de tratamento foi muito intensiva. Isto sugere que ele pode ser vantajoso para administrar as composições da presente invenção via uma membrana deliberação controlada e/ou lenta expondo as espécies de hospedeiros para níveis constantes da dita composição. Esta possibilidade foi ainda investigada, e os resultados apresentados abaixo (Exemplo 18).

Exemplos 14: Estudo in vitro de patógenos bacterianos de relevância para cáries dentaria em indivíduos humanos Introdução:

[0189] Neste estudo preliminar, os efeitos da composição da presente invenção foram testados in vitro sobre duas espécies bacterianas que foram implicadas no desenvolvimento de cáries dentárias em indivíduos humanos: 1. Streptococcus sobrinus 2. lactobacilli.

[0190] Quando residentes na cavidade oral estas bactérias derivam sua nutrição primária ao açúcar ingerido. Consequentemente, para o propósito do presente estudo in vitro, a sacarose foi também usada como o substrato de crescimento.

Método:

[0191] Para o propósito de comparação entre os vários tratamentos, um índice de inoculação foi calculado (0 = eliminação máxima, 5 = sem eliminação).

[0192] As misturas de teste, contendo 30 ml de bactéria sendo testadas suspensas em 50% v/v de sacarose, junto com todos os cinco fito-químicos de ativação e um penetrador (DMSO) e solvente (Triton) foram usados em quatro concentrações diferentes: concentrações 1, 2, 3 e 4. Em cada caso, a mesma quantidade de suspensão bacteriana - 30 ml foram adicionadas à mistura. Similarmente, a concentração de DMSO (0,5% v/v) e Triton (0,02% v/v) foi à mesma em todas as misturas. Entretanto, a concentração de Bacillus subtilis e cada um dos cinco agentes de ativação (dado em v/v%) foram diferentes em cada uma das misturas de teste, como descrito na Tabela I, no Exemplo 1, acima.

[0193] Várias misturas de teste contendo diferentes combinações de algumas ou todos os cinco agentes de ativação foram suados neste estudo, de acordo com a lista de tratamentos dada na Tabela XI, abaixo:

Resultados:

[0194] Os resultados obtidos com a melhor bactéria de este Streptococcus sobrinus estão mostrados na figura 16, embora os resultados correspondentes obtidos com os Lactobacilli estão apresentados na figura 17.

[0195] Quase a eliminação completa da bactéria (no caso de ambos Streptococcus sobrinus e Lactobacilli) foi visto quando as misturas de ativação 6 foi usada - com relação à concentração usada. Em adição, a eliminação quase máxima foi observada quando a mistura 5 foi usada nas concentrações 2, 3, ou 4. Este resultado posterior sugeriria que o fito- químico não presente nas misturas 5 - CBC - pode não ser essencial para obter o efeito protetor observado quando desafiado tanto com as duas espécies de bactérias testadas neste estudo. É possível, entretanto que a mistura 6, contendo todos os cinco fito-químicos (ou seja, incluindo CBD) irá garantir resultados mais consistentes.

Exemplo 15: Experimento de triagem preliminar usando composições da presente invenção para proteção de cenouras contra infecções com Candidatus liberibacter. Introdução:

[0196] Candidatus liberibacter é um gênero de bactéria gram-negativa na família Rhizobiaceae. Não foi ainda possível manter esta bactéria na cultura e sua detecção e quantificação é geralmente acompanhada pelo uso de amplificação pro PCR dos seus 165 genes de rRNA com primers específicos. Os membros do gênero são patógenos de plantas mais comumente transmitidos pelo psyllidis.

[0197] Estas bactérias podem infectar cenouras e cítricos (doenças verdes), e assim por diante, podem causar significante perda comercial.

[0198] O objetivo deste estudo foi investigar se composições da presente invenção, compreendendo uma combinação de B. subtilis e agentes de ativação são capazes de proteger as plantas de cenoura durante a estação toda de crescimento.

Materiais e métodos:

[0199] Os grânulos de perlita foram embebidos nas preparações contendo combinações de B. subtilis e agentes de ativação, e então revestidos com um polímero de liberação lenta.

[0200] Os grânulos foram colocados sob as valas de semeadura, e após o plantio, as plantas e as cenouras foram monitoradas quanto ao desenvolvimento de sintomas de infecções com Candidatus liberibacter.

[0201] Os detalhes do protocolo de experimento são como a seguir: 1. o plantio foi feito no dia 8 de fevereiro 2017 - 3 linhas por leito de 193 cm. 2. a área de experimento foi coberta com uma malha Agrinet até completar a germinação. 3. a irrigação foi realizada com mini-aspersores provendo 4 qm/d. a) durante a germinação 70% de penman a cada dia. b) após germinação 90% de penman a cada 4 dias. 4. Fertilizantes - durante os meses 2 e 3 do experimento: 10 unidades de nitrogênio 5. fungicidas: a cada 10 dias, tratamento contra mofo/bolor Oidium e Oidiopsis usando Polar (Amiran K. Ltd, nairobi, Kneya) e Shavit (Adama Ltd. Israel), e Ami-oz). 6. Herbicidas: a) pré-germinação; b) antes da folhagem fechar 7. Sem tratamentos foram dados ás colheitas contra o vetor da mosca da cenoura, Psila rosae.

[0202] O mapa do experimento usado está mostrado na figura 18. Como indicado neste mapa do campo, dois tratamentos diferentes (T1 e T2) e um grupo controle foram usados. Cada tratamento de teste consistiu da administração de dois tipos diferentes de grânulo perlita: a) grânulos embebidos em uma mistura de emulsificante dos agentes de ativação, dita mistura compreendendo os agentes de ativação mostrados na Tabela XII:

[0203] Os grânulos embebidos são então secos e revestidos (por pulverização) com um polímero de liberação controlada (HPMC) de hidroxipropil metilcelulose. Os dois tratamentos diferentes (T1 e T2) diferem com relação à concentração do polímero dos grânulos preparados: T1 : 10% (p/p) T2 : 20% (p/p) b) os grânulos embebidos em B. subtilis (1,25g de pó de Serenade® misturado em 50 ml de água). Após a secagem, os grânulos são então revestidos por pulverização com o mesmo polímero de liberação controlada como os grânulos contendo os agentes de ativação descritos acima. Para cada um dos dois regimes de tratamento usados, os grânulos de B. subtilis tiveram as concentrações de polímero a seguir: T1: 5% (p/p) T2: 10% (p/p)

[0204] Em cada linha de tratamento, 20 grânulos dos grânulos contendo os agentes de ativação, e 20 grânulos contendo B. subtilis (a) e (b), acima, respectivamente foram adicionados em cada linha de 1 m, em triplicata (ou seja, 20 x 3 = 60 de cada tipo de grânulo).

[0205] Os vários tratamentos usados no estudo de campo foram resumidos na Tabela XIII:

[0206] As linhas de controle foram tratadas com grânulos de perlita que não continham nem as substâncias de tratamento (agentes de ativação ou B. subtilis) ou o revestimento de liberação controlada. Resultados:

[0207] A condição de ambas as folhagens das plantas e o desenvolvimento das cenouras foram monitorados através do período de experimento. Folhagem:

[0208] A porcentagem de plantas em cada um dos três grupos (controle, tratamento T1, tratamento T2) que foram afetados colateralmente pela presença de Candidatus Liberibacter foram avaliados cinco meses após o plantio, e os resultados médios calculados e mostrados na figura 19. Pode ser visto a partir desta figura que o regime de tratamento T2 causou uma diminuição notável na porcentagem das plantas com folhagem afetada colateralmente (a partir de 40,6% nas plantas controle para 26,1% no grupo T2). Esta diferença foi observada como sendo estatisticamente significante (p<0,05). Cenouras:

[0209] O número médio de cenouras que foram afetadas pela presença da infecção por Candidatus Liberibacter foi calculado para cada um dos três grupos. Como pode ser visto a partir da figura 20, o número médio de cenouras afetadas foi significantemente reduzido em ambos os regimes T1 e T2, quando comparados com o grupo controle. Conclusão:

[0210] Este estudo preliminar demonstra que o tratamento das plantas de cenoura em crescimento com a formulação granulada contendo uma composição da presente invenção reduziu significativamente o número de ambos, plantas e cenouras que continham lesões causadas pela infecção da Candidatus Liberribacter. Exemplo 16: Estudo preliminar do efeito de uma composição da presente invenção sobre as abelhas sobreviventes Introdução:

[0211] Em anos recentes, um declínio drástico no número de abelhas (principalmente das espécies Apis mallifera) tem sido observado. Em vista da importância da abelha para a agricultura e horticultura, este fenômeno (conhecido como distúrbio do colapso de colônia) tem tido várias consequências para aqueles campos de atividade. O distúrbio do colapso de colônias é caracterizado pelo desaparecimento de grandes números de abelhas trabalhadoras em uma colônia, usualmente deixando para traz a rainha junto apenas com um pequeno número de amas-secas e abelhas para cuidar da rainha e das abelhas imaturas remanescentes. Embora a causa precisa do distúrbio do colapso de colônia não seja conhecido ainda, é provável que a invenção com vírus e/ou fungos, possivelmente em conjunto com infestação de ácaros, tais como ácaro Varroa (agindo como um vetor para a infecção viral), participe de uma regra importante. É sabido, por exemplo, que o carrapato destruidor Varroa é altamente destrutivo de colônias de abelhas, e que isto é devido a pelo menos em parte o vírus que pode carregar, incluindo um vírus da asa deformada e vírus da paralisia aguda da abelha. Outros vírus também têm sido implicados neste fenômeno, incluindo o vírus da paralisia aguda de Israel. Ademais, existe evidência de que certas espécies de fungos, tais como Nosema apis e Nosema ceranea podem ser implicados no processo patogênico conduzindo ao distúrbio do colapso de colônia. Finalmente, pelo menos um estudo maior foi encontrado que a combinação viral (6 tipos de vírus iridescente) e gentes fúngicos (N. ceranae) estão igualmente envolvidos na patogênese deste fenômeno.

[0212] No presente estudo, os inventores postularam que as composições antimicrobianas da presente invenção, com seu amplo espectro de atividade antimicrobiana, podem ser capazes de deter ou prevenir a perda das abelhas. Métodos:

[0213] Este estudo foi realizado usando 7 pares de colmeias localizadas em Caminomorisco na região Extremadura na Espanha. Uma colmeia de cada parte (marcada como “Colméia No. -A”) foi tratada com uma composição da presente invenção. A outra colmeia (marcada como “colmeia No. - B” serviu como controle), uma vez que não foi tratada com a referida composição, mas continuou igualmente recebendo os tratamentos de manutenção convencionais de rotina que foram administrados rotineiramente para as colmeias.

[0214] A composição usada para tratar a colmeia de teste (A’) compreende os seguintes componentes: a) fase oleosa: Sclareol 98% 8,00 g Nootkatona 98% 16,00g CBD 3% 16,00g ALDO MO,HLB=2 30,61g MCT 68,00g Etanol 12,25 g b) fase aquosa: Tween 80 170,10g Naringin 98% 8,00 g Stevia 6% 14,00g Água 657,04 g (peso total das duas fases: 1000g)

[0215] As duas fases fora misturadas juntas, para formar uma emulsão.

[0216] 300 g da emulsão foram então misturadas junto com 20g da preparação de B. subtilis Serenade® suspensa em 20 ml de água. Um adicional de 80 ml de água foi então adicionado, rendendo 400 ml de uma solução de tratamento. Esta solução de tratamento foi então dividida em dois lotes: 300 ml para tratamento das abelhas, e 100 ml para tratamento das larvas.

[0217] A solução de tratamento foi administrada as abelhas adultas na colmeia “A” pela adição de 300 ml de dita solução á preparação de alimentação das abelhas (300 ml de água destilada misturado com 850 ml de mel).

[0218] A solução de tratamento foi administrada às larvas das abelhas na colmeia “A” pela adição de 100 ml da referida solução para a preparação de alimentação das larvas (480g de polem misturado com 80 g de mel).

[0219] Cada colmeia continha 10 bandejas, cada bandeja sendo ajustados com a linha de poços, alguns dos quais continham abelhas adultas e outros continham as larvas de abelhas. No início do experimento e então nos dias 14, 28, 42 e 62 em seguida, o número de abelhas adultas e larvas nestas bandejas foram avaliados, resultando em um índice de população de modo a averiguar o efeito do tratamento sobre a população de abelhas nas colmeias. Resultados:

[0220] Excluindo um par de colmeias (5A e 5B, na qual toda a colônia morreu por outras razões), os dados no número de abelhas adultas e larvas foram obtidos a partir de 7 pares de colmeias. Os resultados estão resumidos na figura 21 (larva) e na figura 22 (abelhas adultas). Pode ser observado nestas figuras que o tratamento com a composição da presente invenção (“colmeia A”) resultou na sobrevivência de um número maior de ambos, larvas e abelhas adultas do que nas colmeias controle não tratadas (“colmeia B”).

[0221] Pode assim ser incluído que a mistura de B. subtilis e os agentes de ativação da presente invenção é efetiva na prevenção ou reversão da redução de população de abelhas nas colmeias. Exemplo 17: Efeito de uma composição da presente invenção sobre a contagem de célula somática no leite de vacas Introdução:

[0222] Uma contagem elevada de célula somática no leite de vacas é usada pela indústria de laticínios como um indicador para infecção potencial e pode desqualificar o leite para consumo e uso na fabricação de alimentos. Uma elevada contagem de células somáticas pode, portanto, conduzir a perdas financeiras diretas para o produtor de leite como resultado da necessidade de descartar as bateladas de leite. Em adição, as perdas financeiras podem haver também pagamentos de multos pelos produtores. Além disso, em algumas regiões, dois relatórios de contagem elevada de células somáticas podem conduzir a recusa dos distribuidores em receber suprimentos adicionais de leites daquele produtor afetado. Método:

[0223] Seis vacas identificadas com níveis elevados pré- existentes de células somáticas no leite foram cada uma tratada com uma das seguintes preparações em gel tópicas: 1. um gel contendo 5% de emulsão óleo-água em uma fórmula de creme comercialmente disponível (Bio Spa enriquecida com óleo de creme de trigo, fabricado pela Sea of Spa, Arad, Israel) (2 vacas). 2. Um gel contendo 5% de emulsão óleo-água em um creve Aloe- vera comercialmente disponível (2 vacas). 3. apenas creme controle para a preparação (1). (Uma vaca). 4. apenas creme controle para a preparação (2). (uma vaca).

[0224] A emulsão contendo a composição da presente invenção foi preparada como óleo separado e fases aquosas, que foram então combinados. A composição da emulsão é dada na tabela a seguir:

[0225] 0,5g de pó Serenade® foram adicionados a 99,5 g da emulsão acima para criar a emulsão de tratamento, que foi então adicionada em uma concentração de 5% em cada uma das duas preparações de creme descritas acima.

[0226] O tratamento foi feito pela cobertura das tetas das vacas com 5 ml do gel imediatamente após a retirada do leite.

[0227] As vacas foram ordenhadas e tratadas com a preparação de creme duas vezes ao dia.

[0228] As vacas foram ordenhadas e tratadas com as preparações de creme duas vezes ao dia.

[0229] As amostras de células somáticas foram colhidas para análise antes do início do experimento e após 15 dias e 21 dias. Resultados:

[0230] Os números de células somáticas no leite de cada uma das seis vacas incluídas no experimento foram mostrados na Tabela XV:

[0231] Estes resultados mostram claramente uma redução drástica no número de células somáticas nas amostras de leite tomadas a partir de três das quatro vacas tratadas com a composição da presente invenção. Esta redução foi particularmente clara em 21 dias a partir do início do experimento. Em uma das vacas tratadas com a composição da presente invenção, (vaca número 989), enquanto o resultado não mostrou tal mudança drástica nas outras três amostras de teste, existe, contudo, uma diminuição significante na contagem de células somáticas (em cerca de 25% do valor de partida).

[0232] Estes resultados indicaram que o número de células somáticas no leite pode ser controlado usando a composição da presente invenção como tratamento profilático tópico no gado e outros animais produtores de leite usados na agricultura. Exemplo 18: Estudo de campo: revestimento direto de sementes de grão-de-bico com uma composição da presente invenção Introdução:

[0233] O período de cultivo normal para grão-de-bico (Cicer arietinum L) em Israel é o início de Fevereiro, principalmente devido aos problemas encontrados com dois patógenos fúngicos no solo - Ascochyta rabiei e Fusarium oxysporum f. sp. cícer. As variedades de grão-de-bico existentes são incapazes de sobreviver ao inverto de Israel como resultado da presença destes patógenos.

[0234] O propósito deste estudo foi investigar o efeito do revestimento direto das sementes de grão-de-bico com uma composição da presente invenção, sobre a sobrevivência das plantas de grão-de-bico. Método:

[0235] Os grãos de bico foram revestidos com a emulsão A (uma composição de acordo com a presente invenção - ver abaixo) e subsequentemente, revestidos com um polímero de liberação controlada (E603 da Sekisui specialty Chemicals, Japão).

[0236] A emulsão a foi preparada a partir dos componentes a seguir: Serenade® 0,021 gramas Sclareol 0,034 gramas Naringin 0,034 gramas Nootkatone 0,034 gramas Stevia 0,003 gramas CBD 0,001 gramas Tween 80 0,723 gramas Polyaldo 0,130 gramas NCT 0,289 gramas ETOH 0,052 gramas Água 2,929 gramas

[0237] Três diferentes lotes de sementes de grão de bico (variedade 13, peso médio 0,5 g/semente) foram então preparados: Lote A: 7000 grãos-de-bico foram revestidos com 1,25 g da emulsão (diluída em 40 ml com água), usando um revestidor de leito fluidizada. Subsequentemente, as sementes revestidas com a emulsão foram revestidas com 425 g do polímero E603. Lote B: 7000 grãos-de-bico foram tratados como no lote A, exceto que o número de emulsão A usada (antes da diluição em 40 ml com água) foi de 2,5g. As sementes revestidas na emulsão foram revestidas com o polímero de liberação controle exatamente como no Lote A. Controle: 3000 grãos-de-bico foram deixados sem revestimento e não foram tratados de qualquer outra forma.

[0238] O experimento de campo (área total de 1000 seq. Metros) que continham solo pesado e estava situado na Nahalal, Israel, foi semeado em Setembro 15, 2016 com um total de 17000 sementes da variedade 13 (média de peso por semente de 0,5 g) alocados aos três lotes diferentes descritos acima. Este campo foi mostrado, a partir dos experimentos anteriores, como tendo uma elevada carga de Fusarium. Resultados:

[0239] O sucesso ou outra forma dos vários tratamentos foi determinado pela medida do rendimento dos grãos-de-bico de cada área de tratamento, e então extrapolando que o peso em Kg por Dunam (1000 m2). Os resultados de vários tratamentos estão resumidos na tabela a seguir:

[0240] Pode ser visto a partir destes resultados ambos os lotes contendo as sementes revestidas com a composição da presente invenção e o revestimento de controle de liberação (ou seja, Lotes A e B) resultaram em um rendimento aumentado de grãos-de-bico quando comparado com o controle não tratado. O maior aumento no rendimento foi visto com as sementes do Lote B, que foram revestidas com duas vezes a quantidade da composição da presente invenção, em comparação com as sementes do lote A.

[0241] Estes resultados indicaram que o revestimento direto das sementes agrícolas, com uma composição da presente invenção pode capacitar o desenvolvimento de mudas resistentes á infecção pelo patógeno/micro-organismo de origem no solo. Este efeito aparece como sendo dependente da dose. Exemplo 19: Atividade fungicida e bactericida de vários agentes de ativação em conjunto com uma mistura de bactéria probiótica

[0242] Neste estudo, uma mistura de espécies antibacterianas probiótica foi usada em combinação com um ou mais agentes de ativação, de modo a investigar se tal espécie tem o mesmo efeito na combinação com o referido agente de ativação que foi visto pelos presentes inventores quando a espécie bacteriana é B. subtilis, como reportado acima. Método:

[0243] Neste estudo, a mistura bacteriana usada em combinação com os agentes de ativação é “Jarro Dophilus”, que é um produto probiótico comercial distribuído em Israel pela Altman Health Ltd.

[0244] O conteúdo de bactéria neste produto é como mostrado na Tabela XVII:

[0245] Uma concentração de 0,5% p/p deste produto probiótico foi usado em lugar da preparação de B. subtilis usada em outros Exemplos dados acima. As combinações desta mistura probiótica com até cinco agentes de ativação foram testadas como descrito no Exemplo 1, acima, nas mesmas concentrações descritas no exemplo (concentrações 3 e 4). Assim, a única diferença entre este estudo e aquele reportado no Exemplo 1, acima foi o fato de que B. subtilis foi substituído pela mistura de bactéria probiótica. Resultados:

[0246] Como pode ser visto na Tabela XVIII A - C abaixo, os resultados obtidos usando esta mistura de bactéria probiótica como o elemento bacteriano da composição foram essencialmente os mesmos que aqueles obtidos com as misturas contendo B. subtilis, que foram reportadas para o Exemplo 1, acima. Os resultados mostrados nestas tabelas são para combinações contendo o agente de ativação usado na concentração 4. (Índice JG = índice Jarro Dophilus, equivalente ao índice B. subtilis do Exemplo 1).

[0247] Em conclusão: a mistura de bactéria probiótica usada neste estudo parece funcionar da mesma forma que B. subtilis nos estudos de atividade antibacteriana reportado acima, e assim, podem substituir B. subtilis nas composições e métodos da presente invenção. Exemplo 20: Inoculação de mudas de milho usando vários agentes de ativação em conjunto com uma mistura de bactéria probiótica

[0248] Neste estudo, as sementes de milho foram inoculadas da mesma forma que a descrita para o Exemplo 10, acima, exceto que a mistura de inoculação (ou seja, a composição da presente invenção) compreendeu a mistura probiótica, “Jarro Dophilus” descrita no Exemplo 19, ao invés de B. subtilis. Resultados:

[0249] A tabela a seguir apresenta os resultados para a inoculação realizada com a mistura de ativação na concentração 4: (índice de inoculação: escala semi-quantitativa; 0 saudável; 5 = morta)

[0250] Será visto a partir destes resultados que a mistura probiótica usada neste estudo, quando administrado ás sementes de milho em combinação com os agentes de ativação indicados na tabela XIX, foi capaz de proteger o desenvolvimento de mudas de milho em muitos dos caminhos, e na mesma extensão, como a composição na qual espécie bacteriana não-patogênica foi B. subtilis (Exemplo 10).

Claims (9)

1. Método para prevenir ou tratar infecção de espécie hospedeira de planta, causada por fungos, bactérias e/ou patógenos virais, sendo dito método caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) prover uma mistura de uma composição compreendendo uma ou mais bactérias não-patogênicas; b) prover uma composição compreendendo um ou mais agentes de ativação; e c) administrar cada um da composição da etapa (a) e da etapa (b) à referida espécie hospedeira sendo que tanto a referida bactéria não patogênico quanto os referidos agentes de ativação são tanto administrados à referida espécie hospedeira como uma mistura, ou à referida bactéria não patogênica e ditos agentes de ativação são administrados separadamente à referida espécie hospedeira; sendo que a referida bactéria não patogênica é selecionada a partir do grupo consistindo de Bacillus subtilis e bactéria probiótica; e sendo que o referido um ou mais agentes de ativação são selecionados a partir do grupo consistindo de Sclareol, Naringin, Nootkatona, glicosídeo Steviol, canabidiol extrato de Aster tataricus e extrato de Cyperus rotundus.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo de as bactérias não patogênicas serem a cepa de Bacillus subtilis.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de uma ou mais bactéria não-patogênica, um ou mais agentes de ativação e/ou combinações dos mesmos serem administrados à espécie hospedeira de planta por meio da adição destas substâncias ao meio no qual dita planta é crescida.

4. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de a bactéria não-patogênica, um ou mais agentes de ativação e/ou combinações dos mesmos serem administrados na forma de grânulos revestidos com estas substâncias.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a bactéria não-patogênica, um ou mais agentes de ativação e/ou combinações dos mesmos serem administrados por meio de revestimento de sementes da espécie hospedeira de planta com estas substâncias antes da semeadura das referidas sementes.

6. Composição, caracterizada pelo fato de compreender uma mistura de (a) bactéria Bacillus subtilis e (b) um ou mais agentes de ativação, sendo que referido o um ou mais agentes de ativação são selecionados a partir do grupo consistindo de Sclareol, Naringin, Nootkatona, glicosídeo de Steviol, canabidiol, extrato de Aster tataricus e extrato de Cyperus rotundus.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de a cepa de Bacillus subtilis ser a cepa QST 713.

8. Método para aumentar o rendimento de uma espécie hospedeira de planta de importância agrícola ou hortícula, sendo o método caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) prover uma composição compreendendo um ou mais bactérias não-patogênicas; b) prover uma composição compreendendo o um ou mais agentes de ativação; c) administrar cada uma das composições da etapa (a) e etapa (b) à referida espécie de planta; sendo que tanto a referida bactéria não patogênica quanto os referidos agentes de ativação são tanto administrados à referida espécie de planta como uma mistura, ou dita bactéria não patogênica e ditos agentes de ativação são administrados separadamente à ditas espécies; sendo que a referida bactéria não patogênica é selecionada a partir do grupo consistindo de Bacillus subtilis e bactéria probiótica; e sendo que o referido um ou mais agentes de ativação são selecionados a partir do grupo consistindo de Sclareol, Naringin, Nootkatona, glicosídeo Steviol, canabidiol, extrato de Aster tataricus, e estrato de Cyperus rotundus.

9. Método para aumentar a capacidade de uma espécie de planta de resistir aos danos causados por fungos, bactérias ou patógenos virais, sendo o método caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) prover uma composição compreendendo uma ou mais bactérias não-patogênicas; b) prover uma composição compreendendo um ou mais agentes de ativação; e c) administrar a mistura da etapa (a) para uma planta; sendo que tanto a referida bactéria não patogênica quanto os referidos agentes de ativação são tanto administrados à referida espécie de planta como uma mistura, ou dita bactéria não patogênica e ditos agentes de ativação são administrados separadamente às referidas espécies; sendo que a referida bactéria não patogênica é selecionada a partir do grupo consistindo de Bacillus subtilis e bactéria probiótica; e sendo que o referido um ou mais agentes de ativação são selecionados a partir do grupo consistindo de Sclareol, Naringin, Nootkatona, glicosídeo Steviol, canabidiol, extrato de Aster tataricus, e extrato de Cyperus rotundus.