BR112018017088B1

BR112018017088B1 - Sistema de expressão para organismos eucarióticos

Info

Publication number: BR112018017088B1
Application number: BR112018017088-7A
Authority: BR
Inventors: Dominik Mojzita; Anssi RANTASALO; Jussi JÄNTTI; Christopher Landowski; Joosu Kuivanen
Original assignee: Teknologian Tutkimuskeskus Vtt Oy
Priority date: 2016-02-22
Filing date: 2017-02-21
Publication date: 2024-10-08

Abstract

A presente invenção proporciona um sistema de expressão para um hospedeiro eucariótico, que compreende 1) um cassete de expressão compreendendo um promotor de núcleo, o referido promotor de núcleo controlando a expressão de uma sequência de DNA que codifica um fator de transcrição sintético (sTF) e 2) um ou mais cassetes de expressão compreendendo, cada um, uma sequência de DNA que codifica um produto desejado operavelmente ligado a um promotor sintético, o referido promotor sintético compreendendo um promotor de núcleo, e sítios de ligação específicos para o sTF a montante do promotor de núcleo. A presente invenção também proporciona um método para identificar promotores de núcleo universais para hospedeiros eucarióticos, sistemas de expressão utilizando promotores de núcleo universais, hospedeiros compreendendo os referidos sistemas, e métodos para produzir produtos proteicos em hospedeiros eucarióticos.

Description

Campo técnico

[0001] A presente invenção refere-se a um sistema de expressão para um hospedeiro eucariótico (tal como um hospedeiro de micro-organismo), um hospedeiro compreendendo o referido sistema de expressão, e um método para a produção de um produto proteico desejado usando o referido hospedeiro. Além disso, a presente invenção refere-se a um método para identificar um promotor de núcleo universal, um promotor de núcleo universal obtenível pelo referido método e um sistema de expressão, um hospedeiro de organismo eucariótico (tal como um hospedeiro de micro-organismo) e um método para produzir um produto proteico utilizando um promotor de núcleo universal.

Antecedentes

[0002] A expressão gênica controlada e previsível é muito difícil de conseguir, mesmo em hospedeiros bem estabelecidos, especialmente em termos de expressão estável em condições de cultivo ou estágios de crescimento diversos. Além disso, para muitos hospedeiros industriais potencialmente interessantes, existe um espectro muito limitado (ou mesmo ausente) de ferramentas e/ou métodos para realizar a expressão de genes heterólogos. Em muitos casos, isso impede o uso desses (hospedeiros frequentemente muito promissores) em aplicações industriais. Em alguns hospedeiros, condições indutoras específicas precisam estar funcionando para alcançar a expressão desejável dos genes-alvo. Isso resulta em exigências específicas para os meios de cultura ou o processamento a jusante que, no final, aumentam os custos de produção. Outro problema em hospedeiros industriais é o estabelecimento de programas de expressão complexos nos quais se deseja ter simultaneamente níveis de expressão específicos de múltiplos genes. Isto é importante, por exemplo, para a engenharia da via metabólica, onde os genes individuais que codificam as enzimas nas vias de produção precisam ser expressos (e as enzimas correspondentes produzidas) em uma razão equilibrada, para garantir o fluxo metabólico ideal para os produtos desejados.

[0003] Para atingir padrões de expressão previsíveis e/ou estáveis dos genes-alvo em um organismo hospedeiro (em condições variáveis) é importante que a expressão destes genes seja minimamente afetada pelos mecanismos reguladores intrínsecos do hospedeiro. Isto pode ser realizado através da utilização de componentes não nativos (heterólogos) (promotores, fatores de transcrição e agentes indutores) nos sistemas de expressão de genes-alvo engenheirados. Estes sistemas de expressão são chamados ortogonais, se não forem influenciados pelo hospedeiro e senão estiverem influenciando o hospedeiro de outras maneiras que não as pretendidas. Os sistemas de expressão ortogonaisainda dependem, no entanto, das funções celulares endógenas do hospedeiro, tais como a transcrição e a tradução, de modo que eles têm que satisfazer certos critérios que permitam a sua funcionalidade no hospedeiro. Estes critérios são, até certo ponto, específicos para a espécie (hospedeiro), o que torna difícil projetar um sistema ortogonal funcional através de uma ampla variedade de espécies muito diferentes.

[0004] Tipicamente, as estratégias atuais para a expressão de genes heterólogos empregam o uso de promotores endógenos (específicos do hospedeiro) em hospedeiros específicos (Hubmann et al. 2014 e Blumhoff et al. 2012). Estes promotores podem ser induzíveis, ou os assim chamados constitutivos, porém, em nenhum caso, são ortogonais, porque a sua função é dependente de fatores específicos existentes no organismo hospedeiro. Também, o uso de promotores específicos do hospedeiro impede a transferência interespécies desses sistemas de expressão, o que resulta na necessidade de desenvolver sistemas de expressão customizados para cada hospedeiro. Os exemplos existentes de sistemas de expressão transferíveis interespécies, baseados nos promotores do hospedeiro nativo, estão limitados a um espectro estreito de organismos intimamente relacionados, nos quais os promotores funcionam. Estes incluem alguns promotores de levedura, tais como os promotores de Kluyveromyces lactis URA3 e LEU2 ou Schizosaccharomyces pombe HIS5 funcionais em Saccharomyces cerevisiae. Em fungos filamentosos, por exemplo, o promotor gpdA de Aspergillus nidulans tem sido utilizado com sucesso em Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus e Trichoderma reesei. Estes promotores são, no entanto, principalmente utilizados para a expressão de genes marcadores de seleção nestes organismos. Eles não são adequados para a expressão do gene-alvo (codificando uma proteína desejada) e especialmente para a expressão simultânea de múltiplos genes (codificando uma via metabólica), porque a sua atividade é fortemente influenciada pelas condições de crescimento ou eles conferem um espectro insuficiente de atividades transcricionais.

[0005] Vários estudos têm relatado acaracterização e a engenharia de sistemas de expressão gênica que empregam fatores de transcrição sintéticos (ortogonais) (sTFs) e promotores dependentes de sTF engenheirados para controlar a expressão de genes-alvo. Os promotores dependentes de sTF são compostos de um número variável de sítios de ligação ao sTF ligados a um promotorde núcleo. O número de sítios de ligação em combinação comum promotor de núcleo específico define o nível de expressão do gene-alvo e representa uma melhora significativa no controle do nível de expressão em comparação com os sistemas que utilizam promotores específicos do hospedeiro para a expressão do gene-alvo. Os sTFs utilizados nestes sistemas de expressão são, no entanto, expressos a partir de promotores nativos (específicos do hospedeiro) ou promotores nativosmodificados, o que torna estes sistemas apenas parcialmente ortogonais e o que impede a sua utilização em diversas espécies. Os exemplos dos sistemas de expressão parcialmente ortogonais incluem:1) O sistema de expressão desenvolvido para S. cerevisiae, onde o sTF é expresso a partir do promotor TDH3 de S. cerevisiae ou a partir do promotor que combina a UAS deTDH3 e o promotor de núcleo CYC1 de S. cerevisiae, e osgenes-alvo são expressos a partir de promotores sintéticos contendo um número diverso de sítios de ligação ao sTF e promotores de núcleo TDH3 ou CYC1 (Ito et al., 2015).2) O sistema de expressão desenvolvido para A. nidulans e A. niger, onde o sTF é expresso a partir do promotor gpdA de A. nidulans, e o gene-alvo é expresso a partir de um promotor sintético contendo três sítios de ligação para o sTF, do promotor de núcleo URA3 de S. cerevisiae e de uma sequência aleatória de 94 pb derivada de E. coli (Pachlinger et al., 2005).3) O sistema de expressão desenvolvido para Arabidopsis thaliana, onde o sTF é expresso a partir do promotor 35S de A. thaliana, ou outro promotor de A. thaliana, ou a partir de um promotor sintético contendo quatro sítios de ligação para o sTF e um promotor mínimo 35S de A. thaliana. O promotor mínimo refere-seprovavelmente a um promotor de núcleo na referida publicação. O gene-alvo é expresso a partir do promotor sintético contendo quatro sítios de ligação para o sTF e do promotor mínimo 35S de A. thaliana (US2002081667).

[0006] Embora vários sistemas de expressão gênica tenham sido divulgados na técnica anterior, ainda há uma necessidade de sistemas de expressão gênica para hospedeiros de organismos eucarióticos (e.g., hospedeiros de micro-organismos eucarióticos) que possam proporcionar uma expressão forte e estável, um amplo espectro de níveis de expressão e possam ser usados em diversas espécies e gêneros de organismos eucarióticos diferentes, tal como em diversas espécies e gêneros diferentes de micro-organismos eucarióticos. Isso possibilitaria, e.g., a transferência eficiente para, e o teste de vias metabólicas engenheiradas simultaneamente em, vários hospedeiros de produção potenciais para avaliação da funcionalidade. Além disso, um verdadeiro sistema de expressão ortogonal proporcionaria benefícios à comunidade científica que estuda organismos eucarióticos.

Resumo

[0007] Um objetivo da presente invenção é proporcionar sistemas de expressão ortogonais que sejam funcionais (transferíveis) em um grande espectro de organismos eucarióticos, tais como micro-organismos eucarióticos. Tais sistemas de expressão superariam a necessidade de utilizar sequências de DNA nativas do hospedeiro na construção dos sistemas de expressão e, portanto, o estabelecimento de sistemas de expressão não dependentes da regulação transcricional intrínseca do hospedeiro de expressão.

[0008] Um objetivo adicional da invenção é proporcionar sistemas de expressão, os quais permitam níveis de expressão fortes, estáveis e previsíveis de genes-alvo, e os quais não sejam influenciados pelas condições de cultivo ou pelos estágios de desenvolvimento ou crescimento do organismo hospedeiro.

[0009] A motivação para a presente invenção baseia-se na constatação que 1) a utilização dos promotores específicos do hospedeiro, ou das suas partes, para expressar os sTFs, e 2) a utilização de promotores de núcleo específicos da espécie nos promotores dependentes de sTF que controlam a expressão dos genes-alvo são as principais razões pelas quais os sistemas de expressão atuais baseados em sTFs não podem ser transferidos entre as diversas espécies sem perda de sua função.

[0010] A presente invenção mostra que é vantajoso utilizar um promotor de núcleo sozinho para a expressão de um sTF. Isto permite uma expressão constitutiva baixa do sTF no hospedeiro (e.g., hospedeiro de micro-organismo).

[0011] Além disso, a presente invenção mostra que é possível desenvolver um método para identificar promotores de núcleo que são funcionais em espécies distantes.

[0012] Além disso, a presente invenção mostra que é possível construir sistemas de expressão baseados nestes promotores de núcleo funcionais em diversas espécies, que permitem níveis ajustáveis de expressão de genes-alvo através de um grande espectro de organismos eucarióticos (e.g., micro-organismos eucarióticos).

[0013] Assim, a presente invenção proporciona um sistema de expressão para um hospedeiro eucariótico (e.g., hospedeiro de micro-organismo), que compreende:(a) um cassete de expressão compreendendo um promotor de núcleo,o referido promotor de núcleo sendo o único "promotor" que controla a expressão de uma sequência de DNA que codifica o fator de transcrição sintético (sTF) e(b) um ou mais cassetes de expressão compreendendo, cada um, uma sequência de DNA que codifica um produto proteico desejado operavelmente ligado a um promotor sintético, o referido promotor sintético compreendendo um promotor denúcleo idêntico a (a) ou outro promotor de núcleo, e sítios de ligação específicos para o sTF a montante do promotor denúcleo.

[0014] A presente invenção proporciona também um hospedeiro eucariótico, tal como um hospedeiro de micro-organismo eucariótico, compreendendo o sistema de expressão.

[0015] Além disso, a presente invençãoproporciona um método para produzir um produto proteico desejado (ou múltiplos produtos proteicos desejados simultaneamente) em um hospedeiro eucariótico,compreendendo cultivar o hospedeiro eucariótico sob condições de cultivo adequadas.

[0016] Além disso, a presente invençãoproporciona um método para produzir um produto proteico desejado (ou múltiplos produtos proteicos desejados simultaneamente) em um hospedeiro de micro-organismo eucariótico, compreendendo cultivar o hospedeiro de microorganismo eucariótico sob condições de cultivo adequadas.

[0017] A presente invenção também proporciona um método para identificar promotores de núcleo universais para hospedeiros eucarióticos.

[0018] O método de identificação compreende as seguintes etapas:- expressar constitutivamente um fator de transcrição sintético, sTF, em Saccharomyces cerevisiae,- no mesmo hospedeiro, coexpressar um gene relator operavelmente ligado a um promotor de teste dependente de sTF, o referido promotor de teste dependente de sTF compreendendo um promotor de núcleo a ser testado, e sítiosde ligação ao sTF a montante desse,- permitir que o referido gene relator seja expresso sob o promotor de teste na presença de ativação pelo sTF,- avaliar o nível de expressão do gene relator, e- selecionar, a partir dos promotores de núcleo testados, os promotores de núcleo que mostrem uma expressão do gene relator pelo menos 40% tão alta quanto a obtida com o promotor de núcleo PGK1 de S. cerevisiae testado no mesmo sistema de relator;- em casos específicos, também selecionar os promotores de núcleo que mostrem menos do que 40% de expressão do gene relator em comparação com a expressão do gene relator obtida com o promotor de núcleo PGK1 de S. cerevisiae testado no mesmo sistema de relator.

[0019] Além disso, a presente invençãoproporciona um promotor de núcleo universal (UCP). O promotor de núcleo universal é obtenível pelo método de identificação divulgado.

[0020] Um promotor de núcleo universal (UCP) compreende tipicamente uma sequência de DNA contendo a região 5’ a montante de um gene eucariótico, começando 10 -50 pb a montante de uma sequência TATA e terminando 9 pb amontante do códon de iniciação ATG. A distância entre a sequência TATA e o códon de iniciação é de preferência nãomaior do que 180 pb e não menor do que 80 pb. O UCP compreende tipicamente também uma sequência de DNA compreendendo 1-20 pb aleatórios na sua extremidade 3’. Em uma modalidade, um UCP compreende tipicamente uma sequência de DNA tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a referida região 5’ a montante de um gene eucariótico, e uma sequência de DNA compreendendo 1-20 pb aleatórios na sua extremidade 3'.

[0021] Além disso, a presente invençãoproporciona um sistema de expressão para um hospedeiro eucariótico, que compreende(a) um cassete de expressão que compreende um UCP, o referido UCP controlando a expressão de uma sequência de DNA que codifica o fator de transcrição sintético (sTF), e(b) um ou mais cassetes de expressão, cada um compreendendo uma sequência de DNA que codifica um produto proteico desejado operavelmente ligado a um promotor sintético, o referido promotor sintético compreendendo um UCP idêntico a (a) ou outro UCP, e sítios de ligação específicos para o sTF a montante do UCP.

[0022] Além disso, a presente invençãoproporciona um hospedeiro eucariótico (e.g., um hospedeiro de micro-organismo eucariótico) que compreende um sistema de expressão utilizando promotores de núcleo essenciais.

[0023] A presente invenção também proporciona um método para produzir um produto proteico desejado (ou múltiplos produtos proteicos desejados simultaneamente) em um hospedeiro eucariótico (e.g., um hospedeiro de microorganismo eucariótico) usando um sistema de expressão com promotores de núcleo universais.

[0024] A presente invenção proporciona assim um sistema de expressão ortogonal que é funcional (transferível) em um grande espectro de organismos eucarióticos ou micro-organismos eucarióticos, que permite níveis de expressão fortes, estáveis e previsíveis de genes-alvo, e não é influenciado por condições de cultivo ou estágios de desenvolvimento ou crescimento do organismo hospedeiro.

[0025] O sistema de expressão proporcionado pela presente invenção simplifica e concentra as ferramentas genéticas necessárias para construir novos hospedeiros de expressão. Atualmente, existe um amplo conjunto de sistemas de expressão que são altamente específicos para os organismos e as espécies. Com a presente invenção, a indústria e a comunidade científica mais ampla, que trabalham em organismos eucarióticos, podem adotar um conjunto menor e comum de ferramentas de expressão ortogonais. Isso beneficiaria a comunidade e levaria a novas inovações no campo.Breve descrição das Figuras

[0026] A Figura 1 representa um esquema de um sistema de expressão para a expressão de um único gene em um organismo eucariótico (e.g., um micro-organismo eucariótico).

[0027] As Figuras 2A, 2B e 2C representam um esquema do método de exame para selecionar UCPs a partir dos promotores de núcleo candidatos.

[0028] A Figura 3 representa um esquema de um sistema de expressão utilizando os UCPs para regular simultaneamente a expressão de múltiplos genes em um organismo eucariótico, tal como um micro-organismo eucariótico.

[0029] A Figura 4 representa exemplos dos sistemas de expressão funcionais/transferíveis em diversos organismos ou micro-organismos.

[0030] As Figuras 5A e 5B representam o teste de diferentes versões dos sTFs e a avaliação da modulação do desempenho do sistema de expressão em Saccharomyces cerevisiae por fluorometria.

[0031] As Figuras 6A e 6B representam a análise dos sistemas de expressão em diversos hospedeiros fúngicos. Análise quantitativa da expressão do gene relator determinada por citometria de fluxo da fluorescência (6A) e por fluorometria (6B).

[0032] As Figuras 7A, 7B, 7C e 7D representam a análise dos níveis de expressão ajustáveis em diferentes hospedeiros (Pichia kudriavzevii, Aspergillus niger e Trichoderma reesei) por citometria de fluxo da fluorescência e western blotting.

[0033] As Figuras 8A e 8B representam o esquema do sistema de expressão (8A) e a análise da expressão de um gene relator em Kazachstania exigua (8B) por PCR quantitativa em tempo real (qPCR).

[0034] As Figuras 9A, 9B, 9C e 9D representam a análise da produção de proteínas em diversos hospedeiros de expressão (Trichoderma reesei e Pichia pastoris) contendo o sistema de expressão.Descrição detalhadaDefinições

[0035] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos utilizados neste documento têm o mesmo significado que o normalmente entendido por alguém de habilidade na técnica à qual pertence esta invenção.

[0036] O DNA refere-se ao ácido desoxirribonucleico.

[0037] O códon é uma unidade de três nucleotídeos que está codificando para um único aminoácido nos genes que codificam para proteínas. Os códons que codificam um aminoácido podem diferir em quaisquer dos seus três nucleotídeos. Diferentes organismos têm diferentes frequências dos códons em seus genomas, o que tem implicações para a eficiência da tradução de mRNA e produção de proteínas.

[0038] A sequência de codificação refere-se a uma sequência de DNA que codifica um RNA ou polipeptídeo específico (i.e., uma sequência de amino ácidos específica). A sequência de codificação pode, em alguns casos, conter íntrons (i.e., sequências adicionais que interrompem o quadro de leitura, que são removidas durante a maturação da molécula de RNA em um processo denominado remoção de RNA). Se a sequência de codificação codificar um polipeptídeo, esta sequência contém um quadro de leitura.

[0039] O quadro de leitura é definido por um códon de iniciação (AUG no RNA; correspondendo a ATG na sequência de DNA) e é uma sequência de códons consecutivos codificando um polipeptídeo (proteína). O quadro de leitura está terminando por um códon de interrupção (um dos três: UAG, UGA e UAA no RNA; correspondendo a TAG, TGA e TAA na sequência de DNA). Uma pessoa versada na técnica pode predizer a localização dos quadros de leitura abertos utilizando programas de computador e banco de dados em geral disponíveis.

[0040] O Promotor eucariótico é uma região de DNA necessária para a iniciação da transcrição de um gene. Ele está a montante de uma sequência de DNA que codifica um RNA ou polipeptídeo específico (sequência de codificação). Ele contém uma sequência de ativação a montante (UAS) e um promotor de núcleo. Uma pessoa versada na técnica pode predizer a localização de um promotor utilizando programas de computador e banco de dados em geral disponíveis.

[0041] O promotor de núcleo (CP) é uma parte de um promotor eucariótico e é uma região de DNA imediatamente a montante (região 5’ a montante) de uma sequência de codificação que codifica um polipeptídeo, como definido pelo códon de iniciação. O promotor de núcleo compreende todos os motivos reguladores da transcrição gerais, necessários para a iniciação da transcrição, tais como uma sequência TATA, porém não compreende quaisquer motivos reguladores específicos, tais como as sequências UAS (sítios de ligação para ativadores e repressores nativos).

[0042] O promotor de núcleo é definido para o propósito da presente invenção como uma sequência de DNA contendo: 1) uma região 5’ a montante de um gene altamenteexpresso começando 10-50 pb a montante da sequência TATA e terminando 9 pb a montante do códon de iniciação, onde a distância entre a sequência TATA e o códon de iniciação não é maior do que 180 pb e não é menor do que 80 pb, 2) 1-20pb aleatórios, tipicamente 5 a 15 ou 6 a 10, que estão localizados no lugar dos 9 pb da região de DNA (1) imediatamente a montante do códon de iniciação; ou como uma sequência de DNA contendo: 1) uma sequência de DNA tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou99% de identidade de sequência com a referida região 5’ a montante e 2) 1-20 pb aleatórios, tipicamente 5 a 15 ou 6 a10, que estão localizados no lugar dos 9 pb da região de DNA (1) imediatamente a montante do códon de iniciação.

[0043] Um gene altamente expresso em um organismo, no contexto desta invenção, é um gene que tenha sido mostrado nesse organismo ser expresso entre os top 3% ou 5% de todos os genes em qualquer condição estudada, como determinado através de análise por transcriptômica, ou um gene, em um organismo onde a análise por transcriptômica não tenha sido realizada, que é o homólogo de sequência mais próximo ao gene altamente expresso.

[0044] A sequência TATA é definida para o propósito da presente invenção como uma sequência de DNA (TATA) a montante do códon de iniciação, onde a distância da sequência TATA e o códon de iniciação não é maior do que 180 pb e não é menor do que 80 pb. No caso de múltiplas sequências que satisfaçam a descrição, a sequência TATA é definida como a sequência TATA com menor distância do códon de iniciação.

[0045] O fator de transcrição refere-se a uma proteína que se liga a sequências de DNA específicas presentes na UAS, controlando com isso a taxa de transcrição, que é realizada pela RNA II polimerase. Os fatores de transcrição executam essa função sozinhos ou com outras proteínas em um complexo, promovendo (como um ativador) ou bloqueando (como um repressor) o recrutamento da RNA polimerase para os promotores de núcleo dos genes.

[0046] O fator de transcrição sintético (sTF) refere-se a uma proteína que funciona como um fator de transcrição, porém não é uma proteína nativa de um organismo hospedeiro. No contexto desta invenção, o sTF é uma proteína artificial que compreende tipicamente uma proteína de ligação ao DNA de origem procariótica, um sinal de localização nuclear e um domínio de ativação da transcrição de origem viral.

[0047] O promotor sintético refere-se a uma região de DNA que funciona como um promotor eucariótico, porém não é um promotor de ocorrência natural de um organismo hospedeiro. Ele contém uma sequência de ativação a montante (UAS) e um promotor de núcleo, em que a UAS, ou o promotor de núcleo, ou ambos os elementos, não são nativos no organismo hospedeiro. No contexto desta invenção, o promotor sintético compreende (normalmente 110, tipicamente 1, 2, 4 ou 8) sítios de ligação específicospara o sTF (UAS sintética - sUAS) ligados a um promotor de núcleo.

[0048] O domínio de ligação ao DNA ou DBD refere-se à região de uma proteína, tipicamente um domínio de proteína específico, que é responsável pela interação (ligação) da proteína com uma sequência de DNA específica.

[0049] O promotor de núcleo universal (UCP) é um promotor de núcleo que confere nível de expressão ou atividade de relator suficiente (normalmente, porém não necessariamente, pelo menos 40%), tal como nível de fluorescência, obtido com o promotor de núcleo PKG1 de Saccharomyces cerevisiae testado em um sistema de exame de CP como divulgado na presente invenção. Um promotor de núcleo selecionado utilizando este sistema proporciona tipicamente expressão suficiente de um fator de transcrição em várias espécies e gêneros de organismos eucarióticos.

[0050] Um sistema de expressão ortogonal significa aqui um sistema de expressão consistindo em promotores de núcleo heterólogos (não nativos), fator(es) de transcrição e sítios de ligação específicos para o fator de transcrição. Tipicamente, o sistema de expressão ortogonal é funcional (transferível) em diversos organismos eucarióticos, tais como os micro-organismos eucarióticos.

[0051] O sistema de exame de CP é construído em Saccharomyces cerevisiae e compreende uma cepa de Saccharomyces cerevisiae que expressa constitutivamente um sTF e de preferência um plasmídio relator do tipo centromérico construído com o promotor de núcleo a ser testado. O plasmídio relator tipicamente contém sítios de ligação específicos para o sTF, um gene relator, tal como o gene mCherry, e um terminador, tal como o terminador ADH1 para o gene mCherry. O promotor de núcleo testado é inserido entre os sítios de ligação ao sTF e o gene relator. O promotor de núcleo testado compreende tipicamente na sua extremidade 3’ uma sequência compreendendo 1-20 nucleotídeos aleatórios, tal como a sequência TTAATTAAA, e tipicamente incluindo sítios de restrição. A função do promotor de núcleo é avaliada por uma medição do relator, tal como a medição de fluorescência da cepa resultante e comparada com uma cepa de controle onde o promotor de núcleo é o promotor de núcleo PKG1 de Saccharomyces cerevisiae.

[0052] Um plasmídio centromérico refere-se aqui a um plasmídio de número de cópias único ou baixo usado em S. cerevisiae. Este plasmídio contém regiões de DNA funcionais como um centrômero (sequência CEN) e como uma sequência que se replica autonomamente (ARS) em S. cerevisiae. A sequência ARS proporciona uma origem de replicação e a sequência CEN regula a replicação e a distribuição dos plasmídios durante a divisão celular, o que torna o plasmídio centromérico análogo a um cromossoma.

[0053] A expressão suficiente de um fator de transcrição é definida como um nível de expressão de um fator de transcrição que leva à ativação da transcrição de um gene ou genes que estão sob o controle do(s) promotor(es) dependente(s) do fator de transcrição.

[0054] O organismo eucariótico é definido no contexto desta invenção como um organismo pertencente ao: 1) Reino fúngico, incluindo a levedura, tal como as classes Saccharomycetales, incluindo, porém não se limitando às, espécies Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Candida krusei (Pichia kudriavzevii), Pichia pastoris (Komagataella pastoris), Eremothecium gossypii,Kazachstania exigua, Yarrowia lipolytica e outras; ou Schizosaccharomycetes, tais como Schizosaccharomyces pombe; fungos filamentosos, tais como as classes Eurotiomycetes, incluindo, porém não se limitando às, espécies Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Penicillium chrysogenum, e outras; Sordariomycetes, incluindo, porém não se limitando às, espécies Trichoderma reesei, Myceliophthora thermophile e outras; ou Mucorales, tais como Mucor indicus e outros. 2) Reino vegetal, incluindo as angiospermas, tais como as ordens Solanales, incluindo, porém não se limitando ao, gênero Nicotiana (N. benthamiana), Solanum (S. tuberosum), Lycopersicon (L. esculentum), Capsicum (C. anuum) e outros; Brassicales, incluindo, porém não se limitando ao, gênero Arabidopsis (A. thaliana), Brassica (B. napus) e outros; Poales, incluindo, porém não se limitando às, espécies Avena sativa, Secale cereale, Zea mays, Triticum spp., Oryza sativa, Hordeum vulgare, Sorghum bicolor, Saccharum officinarum e outras; Fabales, incluindo, porém não se limitando às, espécies Phaseolus spp., Vigna spp., Glycine max, Pisum sativum, Lens culinaris, Cicer arietinum e outras; Malpighiales, incluindo, porém não se limitando ao, gênero Populus e outros; Pinales, incluindo, porém não se limitando ao, gênero Pinus, e outros; ou Arecales, incluindo, porém não se limitando às, espécies Elaeis guineensis, Cocos nucifera, e outras; e algas verdes, tais como as classes Chlorophyceae, incluindo, porém não se limitando ao, gênero Chlamydomonas (C. reinhardtii); ou Trebouxiophyceae, incluindo, porém não se limitando às, espécies Chlorella spp., e outras. 3) Reino animal, incluindo os mamíferos (Mammalia), incluindo, porém não se limitando às, espécies Mus musculus (camundongo), Cricetulus griseus (hamster), Homo sapiens (ser humano) e outros; insetos, incluindo, porém não se limitando às, espécies Mamestra brassicae, Spodoptera Frugiperda, Trichoplusia ni, Drosophila melanogaster e outras.

[0055] O micro-organismo eucariótico é definido no contexto da invenção como um micro-organismo incluindo a levedura, tal como as classes Saccharomycetales, incluindo, porém não se limitando às, espécies Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Candida krusei (Pichia kudriavzevii), Pichia pastoris (Komagataella pastoris), Eremotecium gossypii, Kazachstania exigua, Yarrowia lipolytica e outras; Schizosaccharomycetes, tais como Schizosaccharomyces pombe; e fungos filamentosos, tais como as classes Eurotiomycetes, incluindo, porém não se limitando às, espécies Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Penicillium chrysogenum, e outras; Sordariomycetes, incluindo, porém não se limitando às, espécies Trichoderma reesei, Myceliophthora thermophile e outras; Mucorales, tais como Mucor indicus e outras.

[0056] A presente invenção proporciona um sistema de expressão para um hospedeiro eucariótico, que compreende(a) um cassete de expressão compreendendo um promotor de núcleo;o promotor de núcleo sendo o único promotor para controlar a expressão de uma sequência de DNA que codifica o fator de transcrição sintético (sTF), e(b) um ou mais cassetes de expressão compreendendo, cada um, uma sequência de DNA que codifica um produto proteico desejado operavelmente ligado a um promotor sintético;o promotor sintético compreende um promotor de núcleo, que é idêntico ao promotor de núcleo em (a) ou outro promotor de núcleo, e um ou mais sítios de ligação específicos para o sTF a montante do promotor de núcleo.

[0057] O promotor de núcleo compreendetipicamente uma sequência de DNA contendo a região 5’ a montante de um gene eucariótico, começando 10 - 50 pb amontante de uma sequência TATA e terminando 9 pb a montante do códon de iniciação ATG. A distância entre a sequência TATA e o códon de iniciação não é maior do que 180 pb e não é menor do que 80 pb. O promotor de núcleo compreende tipicamente também uma sequência de DNA compreendendo 1-20 pb aleatórios em sua extremidade 3’. Em uma modalidade, o promotor de núcleo compreende tipicamente uma sequência de DNA tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com areferida região 5’ a montante de um gene eucariótico, e umasequência de DNA compreendendo 1-20 pb aleatórios em sua extremidade 3'.

[0058] A sequência de DNA que codifica o fator de transcrição sintético (sTF) compreende tipicamente um regulador de transcrição procariótico, um sinal de localização nuclear e um domínio de ativação da transcrição.

[0059] Os CPs usados no sistema de expressão podem ser diferentes, ou o primeiro, CP1, pode ser idêntico ao segundo, CP2 (ou ao terceiro, CP3, ou ao quarto, CP4). Isto é ilustrado nas Figuras 1 e 3.

[0060] Os dois cassetes de expressão ((a) e (b)) podem ser introduzidos em um hospedeiro eucariótico (tipicamente integrados em um genoma) como duas moléculas de DNA individuais, ou como uma molécula de DNA na qual os dois (ou mais) cassetes de expressão estão ligados (fundidos) para formar um único DNA.

[0061] Em aplicações específicas, onde o gene- alvo for um gene nativo (homólogo) de um organismo hospedeiro, o promotor sintético também pode ser inserido imediatamente a montante da região de codificação do gene- alvo no genoma do organismo hospedeiro, possivelmente substituindo o promotor original (nativo) do gene-alvo.

[0062] Mais especificamente, o sistema de expressão compreende, assim, duas partes de DNA, que são construídas no sistema de expressão compreendendo pelo menos dois cassetes de expressão individuais:(a) um cassete para sTF - fator de transcrição sintético, o qual compreende um CP que controla a expressão de um gene que codifica uma proteína de fusão (sTF), o próprio sTF e um terminador. O sTF compreende uma proteína de ligação ao DNA derivada de origem procariótica, tipicamentereguladores da transcrição bacterianos, tais como da família TetR; um sinal de localização nuclear, tal como o NLS de SV40; e um domínio de ativação da transcrição, tal como o domínio de ativação VP16 ou VP64; e (b) um cassete de expressão para gene-alvo, o qual compreende um promotor sintético, que compreende um número variável de sítios de ligação ao sTF, normalmente 1 a 10, tipicamente 1, 2, 4 ou 8, separados por 0-20, tipicamente 5-15 nucleotídeos aleatórios, um CP, um gene-alvo e um terminador.

[0063] A composição do sistema de expressão de exemplo é ilustrada na Figura 1.

[0064] A presente invenção baseia-se na ideia de utilizar um promotor de núcleo (CP), em vez de um promotor completo, para a expressão de um fator de transcrição sintético (sTF). Alguns CPs podem suportar um baixo nível de transcrição quando colocados na frente de um gene. Devido à ausência de sequências reguladoras específicas, necessárias para o controle da transcrição condicional, que estão presentes em promotores completos (tipicamente na sequência de ativação a montante - UAS), esta transcrição é constitutiva - ou seja, constante em todas as condições de crescimento ou metabólicas. Porque o mecanismo geral de transcrição é evolutivamente conservado, alguns dos CPs podem funcionar em espécies muito diversas. Estas características são utilizadas na invenção para a construção de sistemas de expressão transferíveis entre espécies.

[0065] A baixa expressão constitutiva do gene de sTF facilitada por um CP proporciona uma quantidade suficiente de um fator de transcrição sintético, que se liga aos seus sítios de ligação específicos sobre o promotor sintético do gene-alvo e ativa a sua expressão. O número de sítios de ligação é proporcional ao nível de expressão do(s) gene(s)-alvo, onde mais sítios de ligação resultam em maior expressão. O promotor sintético compreende, além dos sítios de ligação ao sTF, também um CP. A escolha do CP no promotor sintético que controla a expressão do(s) gene(s)-alvo é também importante para o nível de expressão do(s) gene(s)-alvo. A combinação dos sítios de ligação ao sTF e o CP pode resultar em uma gama de níveis de expressão que podem ser modulados desde muito baixos até muito altos. Na extremidade superior, a expressão atingida por este sistema excede os níveis de expressão dos genes nativos mais altamente expressos em um organismo hospedeiro.

[0066] A Figura 1 ilustra um exemplo de um esquema de um sistema de expressão para a expressão de um único gene em um organismo ou micro-organismo eucariótico. O cassete de expressão para fator de transcrição sintético (sTF) contém um CP (CP1), uma sequência de codificação de sTF e um terminador. O CP1 proporciona uma baixa expressão constitutiva do sTF. Portanto, o sTF está presente em uma célula hospedeira em um nível constante o tempo todo, em todas as condições de crescimento e em todos os estágios de desenvolvimento e crescimento. O cassete de expressão para gene-alvo contém um promotor sintético, uma sequência de codificação de um gene-alvo e um terminador. O promotor sintético compreende múltiplos sítios de ligação específicos para o sTF (normalmente 1-10, tipicamente 1, 2,4 ou 8; formando uma sequência de ativação a montante sintética - sUAS) e um CP (CP2). O gene-alvo codifica um produto proteico de interesse.

[0067] A atividade de transcrição do CP1, o “sinal”, é “amplificada” pelo sTF ligado à sUAS. Isto resulta na ativação da transcrição sobre o CP2, resultando na expressão do gene-alvo. Como discutido acima, os dois cassetes de expressão podem ser introduzidos em um hospedeiro eucariótico (tipicamente integrados em um genoma) como duas moléculas de DNA individuais, ou como uma molécula de DNA na qual os dois cassetes estão ligados (fundidos) em um único DNA. Em aplicações específicas, onde o gene-alvo for um gene nativo (homólogo) de um organismo hospedeiro, o promotor sintético também pode ser inserido imediatamente a montante da região de codificação do gene- alvo no genoma do organismo hospedeiro. Os CPs usados no sistema de expressão podem ser diferentes, ou o CP1 pode ser idêntico ao CP2.

[0068] A presente invenção também proporciona um hospedeiro eucariótico (e.g., um hospedeiro de micro-organismo eucariótico) que compreende o sistema de expressão como divulgado neste documento.

[0069] Um organismo eucariótico refere-se aqui, em particular, às 1) espécies fúngicas, incluindo a levedura, tais como as espécies das classesSaccharomycetales, incluindo, porém não se limitando à, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Candida krusei (Pichia kudriavzevii), Pichia pastoris (Komagataella pastoris), Eremothecium gossypii, Kazachstania exigua, Yarrowia lipolytica, e outras; Schizosaccharomycetes, tais como Schizosaccharomyces pombe; e espécies de fungos filamentosos, tais como as das classes Eurotiomycetes, incluindo, porém não se limitando a, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Penicillium chrysogenum, e outras; Sordariomycetes, incluindo, porém não se limitando a, Trichoderma reesei, Myceliophthora thermophile e outras; Mucorales, tais como Mucor indicus e outras; 2) espécies de plantas, incluindo as angiospermas, tais como as espécies das ordens Solanales, incluindo, porém não se limitando a, Nicotiana benthamiana, Solanum tuberosum, Lycopersicon esculentum, Capsicum anuum e outras; Brassicales,incluindo, porém não se limitando a, Arabidopsis thaliana, Brassica napus e outras; Poales, incluindo, porém não se limitando a, Avena sativa, Secale cereale, Zea mays, Triticum spp. Oryza sativa, Hordeum vulgare, Sorghum bicolor, Saccharum officinarum e outras; Fabales, incluindo, porém não se limitando a, Phaseolus spp., Vigna spp., Glycine max, Pisum sativum, Lens culinaris, Cicer arietinum e outras; Malpighiales, incluindo, porém não se limitando a, Populus sp., e outras; Pinales, incluindo, porém não se limitando a, Pinus sp., e outras; ou Arecales incluindo, porém não se limitando a, Elaeis guineensis, Cocos nucifera, e outras; e as espécies de algas verdes, incluindo, porém não se limitando a, Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella spp. e outras; 3) Espécies de animais, incluindo, porém não se limitando aos, mamíferos (Mammalia), incluindo, porém não se limitando às, espécies Mus musculus (camundongo), Cricetulus griseus (hamster), Homo sapiens (ser humano), e outras; espécies de insetos, incluindo, porém não se limitando às, espécies Mamestra brassicae, Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Drosophila melanogaster e outras.

[0070] A presente invenção também proporciona um método para produzir um produto proteico desejado em um hospedeiro eucariótico (e.g., hospedeiro de micro-organismo,) compreendendo cultivar o hospedeiro sob condições de cultivo adequadas.

[0071] Por condições de cultivo adequadas entende-se quaisquer condições que permitam a sobrevivência ou o crescimento do organismo hospedeiro e/ou a produção do produto desejado no organismo hospedeiro. O produto desejado pode ser um produto do gene ou genes-alvo (proteína ou proteínas), ou um composto produzido por uma proteína (enzima) ou por uma via metabólica. No presente contexto, o produto desejado é tipicamente um produto proteico (enzima).

[0072] A presente invenção também proporciona um sistema de expressão gênica que é funcional em várias espécies e gêneros eucarióticos diferentes. O elemento- chave no sistema é um promotor de núcleo que facilita a expressão em várias espécies. Tal promotor de núcleo é aqui denominado promotor de núcleo universal - UCP.

[0073] Esta propriedade, assim chamada atividade de transcrição basal, baseia-se no recrutamento eficiente do complexo de RNA polimerase II para o promotor de núcleo; e resulta em nível de expressão baixo, porém estável, em todas as condições de cultivo e crescimento (desenvolvimento). Este sinal constitutivo baixo é amplificado por um fator de transcrição sintético (sTF), cuja expressão é controlada pelo UCP, para um nível de expressão ajustável dos genes-alvo (nativos ouheterólogos). Cada gene-alvo está sob o controle de um promotor engenheirado e compreende um número selecionado de sítios de ligação específicos para o sTF e um UCP. A combinação dos sítios de ligação específicos para o sTF e o UCP define o nível de expressão do gene-alvo.

[0074] Isso proporciona meios para controlar a expressão em diversos hospedeiros, incluindo aqueles com tecnologia não desenvolvida. As aplicações do uso dos UCPs são a produção de proteínas, a engenharia metabólica e as redes reguladoras genéticas artificiais.

[0075] Além disso, o sistema pode ser usado como uma plataforma para identificar novos UCPs com novas propriedades.

[0076] A presente invenção proporciona um método para identificar um promotor de núcleo universal para hospedeiros eucarióticos. O método compreende- expressar constitutivamente um fator de transcrição sintético, sTF, em Saccharomyces cerevisiae,- coexpressar no mesmo hospedeiro um gene relator operavelmente ligado a um promotor de teste dependente de sTF, o referido promotor de teste dependente de sTF compreendendo um promotor de núcleo a ser testado, e sítios de ligação ao sTF a montante desse,- permitir que o referido gene relator seja expresso sob o promotor de teste na presença de ativação pelo sTF,- avaliar o nível de expressão do gene relator, e- selecionar, a partir dos promotores de núcleo testados, os promotores de núcleo que mostrem uma expressão do gene relator pelo menos 40% tão alta quanto a obtida com o promotor de núcleo PGK1 de S. cerevisiae testado no mesmo sistema de relator;- em casos específicos, também selecionar os promotores de núcleo que mostrem um nível de expressão do relator menor do que 40%.

[0077] Mais especificamente, o método compreende otimamente o uso de um plasmídio centromérico circular compreendendo sítios de ligação específicos para o sTF operavelmente ligados ao promotor de núcleo testado, e um gene relator.

[0078] A sequência de DNA que codifica o fator de transcrição sintético (sTF) compreende tipicamente uma sequência de DNA que codifica uma proteína de ligação ao DNA de origem procariótica, um sinal de localização nuclear e um domínio de ativação da transcrição. O sTF compreende uma proteína de ligação ao DNA derivada de origem procariótica, tipicamente bacteriana, reguladores da transcrição, tais como uma proteína da família TetR; um sinal de localização nuclear, tal como o NLS de SV40; e um domínio de ativação da transcrição, tal como o domínio de ativação VP16 ou VP64.

[0079] O promotor a ser testado é selecionado a partir dos promotores de genes eucarióticos expressos ao nível dos mais elevados 3% ou 5% de todos os genes em qualquer condição no organismo eucariótico dado.

[0080] A presente invenção proporciona um promotor de núcleo universal (UCP), em que o promotor de núcleo é obtenível pelo método de identificação como divulgado neste documento.

[0081] Tipicamente, um promotor de núcleo universal compreende uma sequência de DNA contendo 1) a região 5’ a montante de um gene eucariótico, começando 10 - 50 pb a montante de uma sequência TATA e terminando 9 pb a montante do códon de iniciação ATG; e 2) uma sequência de DNA aleatória de 1-20 pb que está localizada no lugar dos 9 pb da região de DNA (1) imediatamente a montante do códon de iniciação. A distância entre a sequência TATA e o códon de iniciação do gene eucariótico original não é maior do que 180 pb e não é menor do que 80 pb. Em uma modalidade, o promotor de núcleo compreende uma sequência de DNA tendo pelo menos 90% de identidade de sequências com a referida região 5’ a montante e uma sequência de DNA aleatória de 120 pb que está localizada no lugar dos 9 pb da região de DNA (1) imediatamente a montante do códon de iniciação.

[0082] A seleção dos CPs funcionais em organismos distantes é realizada em Saccharomyces cerevisiae, e as fontes dos CPs candidatos são preferivelmente (mas não necessariamente) organismos industrialmente relevantes, preferivelmente (mas não necessariamente) distantes em termos de divergência evolutiva ou em outras características, tais como a arquitetura do genoma ou o teor de GC.

[0083] A seleção dos CPs candidatos é baseada no nível de expressão dos genes nos organismos-fonte selecionados, contendo o CP candidato em seus promotores. Outro critério de seleção é a presença de uma sequência TATA no CP candidato (Figura 2A).

[0084] Em uma modalidade, o exame quanto aos CPs funcionais é vantajosamente realizado por construção in vivo do CP candidato com o cassete de relator dependente de sTF expresso em uma cepa de S. cerevisiae que expressa constitutivamente o sTF (Figura 2B). As cepas resultantes são testadas quanto a um nível de um relator, preferivelmente a fluorescência, e estes níveis são comparados com uma cepa de controle, onde o promotor de núcleo PGK1 de S. cerevisiae é utilizado na construção do relator. Os CPs candidatos, que facilitam os níveis suficientes de relator, preferivelmente de fluorescência (normalmente, porém não necessariamente, maiores do que 40%), da cepa de controle (Figura 2C), e, portanto, satisfazem os critérios do exame, são chamados promotores de núcleo universais, UCPs. Os CPs e os UCPs selecionados são usados para a construção de sistemas de expressão.

[0085] Os sistemas de expressão resultantes são funcionais em hospedeiros eucarióticos. Estes hospedeiros incluem todos os organismos eucarióticos, em particular: 1) Micro-organismos fúngicos, incluindo os fungos filamentosos e as leveduras, em particular os organismos das seguintes taxionomias: A) Saccharomycetales, incluindo, porém não se limitando à, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Candida krusei (Pichia kudriavzevii), Pichia pastoris (Komagataella pastoris), Eremothecium gossypii, Kazachstania exigua, Yarrowia lipolytica, e outras; Schizosaccharomycetes, tal como Schizosaccharomyces pombe; B) Eurotiomycetes, incluindo, porém não se limitando às, espécies Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Penicillium chrysogenum e outras; C) Sordariomycetes, incluindo, porém não se limitando às, espécie Trichoderma reesei, Myceliophthora thermophile e outras; D) Mucorales, tais como Mucor indicus e outras. 2) Organismos de plantas,incluindo as angiospermas e as algas verdes, em particular,os organismos a partir das seguintes taxionomias: E)Solanales, incluindo, porém não se limitando às, espécies Nicotiana benthamiana, Solanum tuberosum, Lycopersicon esculentum, Capsicum anuum, e outras; F) Brassicales, incluindo, porém não se limitando às, espécies Arabidopsis thaliana, Brassica napus e outras; G) Poales, incluindo, porém não se limitando às, espécies Avena sativa, Secale cereale, Zea mays, Triticum spp., Oryza sativa, Hordeum vulgare, Sorghum bicolor, Saccharum officinarum e outras; H) Fabales incluindo, porém não se limitando às, espécies Phaseolus spp., Vigna spp., Glycine max, Pisum sativum, Lens culinaris, Cicer arietinum e outras; I) Malpighiales, incluindo, porém não se limitando às, espécies Populus sp., e outras; J) Pinales, incluindo, porém não se limitando às,espécies Pinus sp., e outras; K) Arecales, incluindo, porémnão se limitando às, espécies Elaeis guineensis, Cocos nucifera, e outras; L) Chlorophyceae, incluindo, porém não se limitando às, espécies Chlamydomonas reinhardtii e outras; M) Trebouxiophyceae, incluindo, porém não se limitando às, espécies Chlorella spp., e outras. 3) Organismos de animais, em particular organismos das seguintes taxionomias: N) mamíferos (Mammalia), incluindo, porém não se limitando às, espécies Mus musculus (camundongo), Cricetulus griseus (hamster), Homo sapiens (ser humano) e outras; O) insetos (Insecta), incluindo, porém não se limitando às, espécies Mamestra brassicae, Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Drosophilamelanogaster e outras.

[0086] As Figuras 2A, B e C ilustram um exemplo de um esquema do método de exame utilizado para a seleção de UCPs a partir dos promotores de núcleo candidatos.

[0087] A Figura 2A ilustra um esquema de seleção de um promotor de núcleo candidato em um organismo eucariótico. A região de DNA imediatamente a montante de um gene de qualquer organismo eucariótico, que pertence a um grupo dos top 3% ou 5% dos genes mais altamente expressos em qualquer condição, é analisada quanto à presença da sequência TATA (sequência TATA) dentro de -180 pb e -80 pb a montante de um códon de iniciação (ATG). Se mais do que uma sequência TATA aparecer nessa região, então a mais próxima ao ATG (códon de iniciação) é escolhida como uma sequência TATA. A sequência que começa 10-50 pb a montante da sequência TATA e termina 9 pb a montante do ATG (códon de iniciação) é selecionada para o exame do promotor de núcleo.

[0088] A Figura 2B ilustra uma cepa de Saccharomyces cerevisiae que expressa constitutivamente um sTF. Ela é cotransformada tipicamente com um plasmídio centromérico linearizado (número de cópias único ou baixo) e uma biblioteca, ou versões individuais, dos promotores de núcleo a serem testados. O plasmídio centromérico contém tipicamente, por exemplo, 4 sítios de ligação ao sTF, o gene relator, tal como o gene mCherry, e é linearizado entre essas duas características, como mostrado na figura. Cada fragmento de DNA do promotor de núcleo compreende a sequência de DNA selecionada (Figura 2A), seguida por uma sequência compreendendo nucleotídeos aleatórios, tipicamente contendo sítios de restrição, aqui uma sequência útil é, por exemplo, TTAATTAAA, e flanqueada por sequências de DNA com 20-50 pb de comprimento sobre cada extremidade. Estas sequências de flanco são homólogas à cada extremidade do plasmídio linearizado, a sequência de flanco a 5’ é homóloga a uma região que cobre parcialmente os sítios de ligação ao sTF no plasmídio linearizado, e a sequência de flanco a 3' é homóloga à extremidade 5’ do quadro de leitura aberto do gene relator, tal como o gene mCherry. Após a transformação, o plasmídio é construído in vivo por um mecanismo de recombinação homólogo intrínseco da levedura Saccharomyces cerevisiae, resultando no plasmídio centromérico circular compreendendo os sítios de ligação ao sTF, seguidos por um promotor de núcleo incluindo uma sequência, tal como TTAATTAAA, e o gene relator, tal como o gene mCherry. As cepas resultantes são analisadas quanto ao relator, tal como uma fluorescência vermelha causada pela proteína mCherry produzida. O nível de intensidade do relator, tal como a fluorescência, corresponde ao nível de expressão do gene relator, tal como o gene mCherry, que corresponde à função do promotor de núcleo testado.

[0089] Figura 2C) As cepas transformadas, que conferem um nível suficiente de relator, tal como a fluorescência, que é tipicamente 40% ou maior do que o relator, tal como a fluorescência da cepa contendo o promotor de núcleo PGK1 construído no mesmo plasmídio centromérico (destacado pela seta na figura), são selecionadas. Os plasmídios centroméricos são isolados das cepas selecionadas, o DNA de plasmídio é purificado e sequenciado e os promotores de núcleo selecionados são utilizados para construções subsequentes de cassetes de expressão para o teste em outros organismos eucarióticos. Em casos específicos, também os promotores de núcleo que não conferem um nível de 40% ou maior de expressão do relator são usados para construções de cassetes de expressão para organismos eucarióticos. Se o promotor de núcleo for funcional no hospedeiro doador de promotor de núcleo e também em pelo menos um outro hospedeiro que seja uma espécie diferente do hospedeiro doador de promotor de núcleo, então o promotor de núcleo é designado como promotor de núcleo universal, UCP.

[0090] A presente invenção proporciona um promotor de núcleo universal (UCP), que é obtenível pelo método divulgado. Tipicamente, o UCP compreende uma sequência de DNA contendo: 1) a região 5’ a montante de um gene eucariótico, começando 10 - 50 pb a montante de uma sequência TATA e terminando 9 pb a montante do códon de iniciação ATG, e em que a distância entre a sequência TATA e o códon de iniciação não é maior do que 180 pb e não é menor do que 80 pb, 2) e uma sequência de DNA compreendendo 1-20 pb aleatórios que está localizada na extremidade 3’ da sequência de DNA (1). Em uma modalidade, o promotor de núcleo universal compreende 1) uma sequência de DNA tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a referida região 5’ a montante e 2) uma sequência de DNA compreendendo 1-20 pb aleatórios que está localizada na extremidade 3' da sequência de DNA.

[0091] A presente invenção também proporciona um sistema de expressão para um hospedeiro eucariótico, que compreende (a) um cassete de expressão compreendendo um UCP,o referido UCP controlando a expressão de uma sequência de DNA que codifica o fator de transcrição sintético (sTF), e(b) um ou mais cassetes de expressão compreendendo, cada um, uma sequência de DNA que codifica um produto proteico desejado operavelmente ligado a um promotor sintético,o referido promotor sintético compreendendo o UCP de (a) ououtro UCP, e sítios de ligação específicos para o sTF a montante do UCP.

[0092] É possível construir múltiplos promotores sintéticos com diferentes números de sítios de ligação (normalmente 1-10, tipicamente 1, 2, 4 ou 8, separados por0-20, tipicamente 5 -15 nucleotídeos aleatórios)controlando diferentes genes-alvo simultaneamente por um sTF. Isto resultaria, por exemplo, em um conjunto de genes expressos diferentemente, formando uma via metabólica.

[0093] A Figura 3 ilustra um exemplo de um esquema de um sistema de expressão utilizando os UCPs para uma regulação simultânea da expressão de múltiplos genes em um organismo eucariótico (e.g., micro-organismo). O esquema representa uma via metabólica hipotética, porém a abordagem também poderia ser usada para outros sistemas de expressão de múltiplos genes (vias de sinalização, transporte ou glicosilação, produção simultânea de proteínas, etc.) ou suas combinações.

[0094] O cassete de expressão para fator de transcrição sintético (sTF) (A) na Figura 3 é análogo ao mostrado na Figura 1, satisfazendo o mesmo propósito. Os cassetes de expressão de genes-alvo podem estar presentesem um número variável, variando de 1 a 20. Cada cassete de expressão para gene-alvo contém um promotor sintético, que pode ter uma arquitetura clássica (monodirecional) (B) ou um desenho bidirecional (C). O promotor sintético (mono- ou bidirecional) consiste em múltiplos sítios de ligação específicos para o sTF (normalmente 1-10, tipicamente 1, 2, 4 ou 8), e um UCP. Os genes-alvo (Genes A, B, C, D) codificam as proteínas de interesse que podem formar uma via metabólica ou sua parte, ou codificam qualquer combinação de proteínas, dependendo da aplicação.

[0095] A função do sistema de expressão ilustrado na Figura 3 é análoga à apresentada na Figura 1, a atividade de transcrição do UCP1 é “modulada” pelo sTF ligado às sUASs dos genes-alvo. A ocupação de cada sUAS em combinação com os UCPs leva a níveis de expressão específicos de cada gene individual, resultando em níveis específicos das proteínas-alvo. Os cassetes de expressão podem ser introduzidos em um hospedeiro eucariótico (tipicamente integrados em um genoma) como moléculas de DNA individuais ou como moléculas de DNA maiores onde os cassetes de expressão individuais são fundidos em conjunto. Em aplicações específicas, onde os genes-alvo forem genes nativos (homólogos) de um organismo hospedeiro - os promotores sintéticos também podem ser inseridos imediatamente a montante de cada região de codificação do gene-alvo no genoma do organismo hospedeiro. Os UCPs usados no sistema de expressão podem ser diferentes, ou alguns ou todos os UCPs também podem ser idênticos.

[0096] A presente invenção proporciona um hospedeiro eucariótico compreendendo o sistema de expressão divulgado. Estes hospedeiros incluem todos os organismos eucarióticos, em particular os micro-organismos fúngicos, incluindo os fungos filamentosos e as leveduras, os hospedeiros de plantas, incluindo as angiospermas e as algas, e hospedeiros animais, incluindo os mamíferos e os insetos.

[0097] A presente invenção proporciona também um método para produzir um produto proteico desejado em um hospedeiro eucariótico (e.g., hospedeiro de micro-organismo), compreendendo cultivar o hospedeiro sob condições de cultivo adequadas.

[0098] O ajuste do sistema de expressão para diferentes níveis de expressão pode ser realizado em S. cerevisiae, onde múltiplas opções, incluindo escolhas de UCPs, sTFs, diferentes números de BSs e genes-alvo, podem ser testadas rapidamente. O conjunto ideal estabelecido de genes diferentemente expressos pode ser transferido diretamente para o hospedeiro de destino, onde ele conserva a sua função. O alto nível de expressão atingido por este sistema também pode ser utilizado nos hospedeiros de produção de proteína (enzima). A vantagem de utilizar S. cerevisiae é a disponibilidade de métodos bem estabelecidos e rápidos para modificações genéticas, transformação de DNA, exame, análises, cultivos e modelagem in silico. Isso acelerará o processo de desenvolvimento de hospedeiro industrial e possibilitará o uso de novos hospedeiros que tenham alto potencial para propósitos específicos, porém um espectro muito limitado de ferramentas para a engenharia genética.

[0099] A Figura 4 ilustra exemplos dos sistemas de expressão funcionais/transferíveis em diversos organismos eucarióticos. Os sistemas de expressão construídos em uma única molécula de DNA compreendem doiscassetes de expressão: 1) cassete de expressão para sTF, que compreende diferentes UCPs, exemplificadas aqui com o533cp ou 008cp (ver as Tabelas 1 e 2), a versão de sTF coma proteína de ligação ao DNA, exemplificada aqui por BM3R1, e um terminador, exemplificado aqui pelo terminador TEF1 de Trichoderma reesei. E 2) o cassete de expressão para gene- alvo compreende diversos sítios de ligação específicos parao sTF, exemplificados aqui por oito sítios de ligação específicos para BM3R1, diferentes UCPs, exemplificados aqui por 114cp ou 201cp (ver as Tabelas 1 e 2), a região decodificação do gene relator, exemplificada aqui pela regiãode codificação de mCherry (proteína fluorescente vermelha,)e um terminador, exemplificado aqui pelo terminador ADH1 deS. cerevisiae. A região de codificação da proteína de ligação ao DNA, aqui BM3R1, foi optimizada nos códons para se adequar ao uso de códons de Aspergillus niger. No Exemplo 3, a versão do sistema de expressão contendo 201cp e 008cp é referida como “versão A”, e a versão do sistema de expressão contendo 114cp e 533cp é referida como “versão B”.

[0100] As Figuras 5A e 5B ilustram um exemplo de um teste de diferentes versões dos sTFs e a avaliação da modulação do desempenho dos sistemas de expressão em Saccharomyces cerevisiae.

[0101] Figura 5A) Os sistemas de expressão análogos ao apresentado na Figura 4 foram construídos com as seguintes modificações no sistema acima descrito: 1)diferentes proteínas de ligação ao DNA foram utilizadas como partes dos sTFs (LexA, SrpR, PhlF, TetR, BM3R1, e TarA, ver o Exemplo 1); 2) diferentes números dos sítios de ligação específicos para o sTF foram utilizados nos promotores sintéticos dos cassetes de expressão para genesalvo (a versão com 8 sítios de ligação mostrados na figura); 3) os cassetes individuais (o cassete de expressão para sTF e o cassete para relator) foram integrados, cada um em uma única cópia, no genoma de Saccharomyces cerevisiae em dois loci genômicos separados (exemplificados aqui por URA3 e LEU2); 4) os sTFs foram expressos a partir do promotor de núcleo de S. cerevisiae, aqui exemplificado pelo promotor de núcleo TDH3; 5) o promotor de núcleo utilizado no cassete de expressão do relator foi aqui exemplificado por ENO1cp de S. cerevisiae.

[0102] Figura 5B) As cepas com ambos os cassetes de expressão integrados foram testadas quanto ao nível de fluorescência. Foram testados sistemas de expressão de controle que possuem oito sítios de ligação específicos para o sTF e que não possuem os cassetes de expressão para sTF (mostrados como "wo sTF" na figura). As proteínas de ligação ao DNA, SrpR, PhlF, TetR, BM3R1 e TarA, foram optimizadas nos códons para a utilização de códon de Saccharomyces cerevisiae. Na maioria dos casos, é demonstrada uma clara modulação do nível de expressão do gene-alvo, que reflete o número de sítios de ligação específicos para o sTF (0-8, conforme especificado na figura) nos promotores sintéticos dos cassetes de expressão para gene-alvo.

[0103] As Figuras 6A e 6B representam exemplos da análise dos sistemas de expressão em diversos hospedeiros fúngicos. Análise quantitativa da expressão do gene relator detectada por citometria de fluxo da fluorescência (6A) e por fluorometria (6B). Os sistemas de expressão construídos (Tabela 2) foram integrados em uma única cópia nos genomas de: Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger, Trichoderma reesei, Yarrowia lipolytica, Candida krusei (Pichia kudriavzevii), e Pichia pastoris (Komagataella pastoris). A funcionalidade do sistema em todos estes organismos foi confirmada por análise fluorescente das cepas transformadas. Os sistemas de expressão usados para cada organismo são idênticos aos apresentados na Figura 4. Os identificadores das cepas nas figuras (6A e 6B) significam o que segue: “WT” representa uma cepa de base de cada hospedeiro de expressão no qual os sistemas de expressão não foram transformados; “A” representa cepas com uma versão do sistema de expressão (integrado no genoma em cópia única) mostrado na Figura 4 contendo 201cp e 008cp; “A*” representa as cepas com a versão do sistema de expressão A, onde a parte de ligação ao DNA do sTF foi otimizada no códon para combinar com os códons frequentes em Saccharomyces cerevisiae; “B” representa cepas com uma versão do sistema de expressão (integrado no genoma em cópia única) mostrado na Figura 4 contendo 114cp e 533cp; “B*” representa as cepas com a versão do sistema de expressão B, onde a parte de ligação ao DNA do sTF foi otimizada no códon para combinar com os códons frequentes em Saccharomyces cerevisiae; “A_NC” e “B_NC” representam cepas com as versões de controle negativo dos sistemas de expressão (A ou B) (integrados no genoma em cópia única), onde o cassete de expressão para sTF estava ausente (removido), deixando apenas o cassete de expressão para gene-alvo (exemplificado aqui com 8 BS + 201/114cp + mCherry + terminador Sc-ADH1).

[0104] A Figura 6A representa a análise por citometria de fluxo (instrumento DB FACSAria III) da expressão de mCherry nos hospedeiros. Ela foi realizada sobre as células (para os fungos unicelulares - Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, Pichia kudriavzevii, Pichia pastoris) ou os esporos (para os fungos filamentosos - Aspergillus niger, Trichoderma reesei). Os gráficos mostram a intensidade da fluorescência (mCherry) normalizada pelo tamanho da partícula (célula/esporo) (FSC - dispersão direta) para 10000 células/esporos de cada cepa. A linha horizontal (dentro da caixa cinza) representa o valor mediano, a caixa cinza representa o intervalo interquartil (intervalo IQ), a parte inferior da caixa cinza representa o valor do percentil de 25%, a parte superior da caixa cinza representa o valor do percentil de 75% e os bigodes no gráficos de caixas representam valores que se estendem a partir dos valores dos percentis de 25%/75% até os valores mais altos e mais baixos que não são maiores do que 1,5 vez o intervalo IQ, que, juntamente com o intervalo IQ, representam cerca de 99% de todos os casos medidos (células/esporos) nesses experimentos.

[0105] A Figura 6B representa um exemplo da análise da expressão de mCherry nos hospedeiros. Ela foi realizada por medição da fluorometria utilizando o instrumento Varioskan (Thermo Electron Corporation), sobre suspensões de células/micélios após crescimento 18 horas em meio SCD. Os gráficos mostram a intensidade da fluorescência (mCherry) normalizada pela densidade óptica das suspensões de células/micélios usadas para a análise fluorimétrica. As colunas representam os valores médios e as barras de erro os desvios-padrão a partir de pelo menos 3 réplicas experimentais.

[0106] As Figuras 7A, 7B, 7C e 7D representamexemplos da análise dos níveis de expressão ajustáveis em diferentes hospedeiros (Pichia kudriavzevii, Aspergillus niger e Trichoderma reesei).

[0107] A Figura 7A representa um exemplo (mostrado como um esquema) do sistema de expressão com um número variável de sítios de ligação ao sTF utilizados para a modulação da expressão do gene relator em Pichia kudriavzevii e Aspergillus niger. O sistema de expressão construído em uma única molécula de DNA compreende dois cassetes de expressão (análogos àqueles na Figura 4): 1)cassete de expressão para sTF, que compreende um UCP, exemplificado aqui com o 008cp (ver a Tabela 1), a versão de sTF com a proteína de ligação ao DNA, exemplificada aqui por BM3R1, e o domínio de ativação, exemplificado aqui por VP16, e um terminador, exemplificado aqui por terminador TEF1 de Trichoderma reesei. E 2) os cassetes de expressão para genes-alvo, que compreendem diferentes números de sítios de ligação específicos para o sTF, exemplificados aqui por 0, 1, 2, 4 e 8 sítios de ligação específicos paraBM3R1, diferentes UCPs, exemplificados aqui por 201cp (ver a Tabela 1), a região de codificação do gene relator, exemplificada aqui pela região de codificação de mCherry (proteína fluorescente vermelha), e um terminador, exemplificado aqui pelo terminador ADH1 de S. cerevisiae. A região de codificação da proteína de ligação ao DNA, aqui BM3R1, foi optimizada nos códons para se adequar ao uso de códons de Aspergillus niger.

[0108] A Figura 7B representa a análise por citometria de fluxo (instrumento DB FACSAria III) da expressão de mCherry em Pichia kudriavzevii e Aspergillus niger contendo os sistemas de expressão com número variável de sítios de ligação ao sTF (0, 1, 2, 4 e 8). Ela foi realizada sobre células obtidas a partir de 18 horas de cultivo em meio SCD (para Pichia kudriavzevii), ou sobre esporos obtidos após 4 dias de cultivo em placas de ágar PDA (Aspergillus niger). Os gráficos mostram a intensidade da fluorescência (mCherry) normalizada pelo tamanho da partícula (célula/esporo) (FSC - dispersão direta) para 10000 células de cada cepa. A linha horizontal (dentro da caixa cinza) representa o valor mediano, a caixa cinza representa o intervalo interquartil (intervalo IQ), a parte inferior da caixa cinza representa o valor do percentil de 25%, a parte superior da caixa cinza representa o valor do percentil de 75% e os bigodes no gráfico de caixas representam valores que se estendem a partir dos valores dos percentis de 25%/75% até os valores mais altos e mais baixos que não são maiores do que 1,5 vez o intervalo IQ, que, juntamente com o intervalo IQ, representam cerca de 99% de todos os casos medidos (células/esporos) nesses experimentos.

[0109] A Figura 7C representa um exemplo (mostrado como um esquema) do sistema de expressão com um número variável de sítios de ligação ao sTF utilizados para a modulação da produção de proteína CBH1 em Trichoderma reesei. O sistema de expressão construído em uma única molécula de DNA compreende dois cassetes de expressão (análogos àqueles nas Figuras 4 e 7A): 1) cassete deexpressão para sTF, que compreende um UCP, exemplificado aqui com o 533cp (ver a Tabela 1), a versão de sTF com a proteína de ligação ao DNA, exemplificada aqui por BM3R1, e o domínio de ativação, exemplificado aqui por VP16, e um terminador, exemplificado aqui pelo terminador TEF1 de Trichoderma reesei. E 2) os cassetes de expressão para genes-alvo, que compreendem diferentes números de sítios de ligação específicos para o sTF, exemplificados aqui por 0, 1, 2, 4 e 8 sítios de ligação específicos para BM3R1,diferentes UCPs, exemplificados aqui por 201cp (ver a Tabela 1), a região de codificação do gene-alvo, exemplificada aqui pela região de codificação de CBH1 de Trichoderma reesei (incluindo os íntrons que ocorrem no gene CBH1 de Trichoderma reesei nativo), e um terminador, exemplificado aqui pelo terminador ADH1 de S. cerevisiae. A região de codificação da proteína de ligação ao DNA, aquiBM3R1, foi optimizada nos códons para se adequar ao uso decódons de Aspergillus niger.

[0110] A Figura 7D representa as análises por western blot da proteína CBH1 produzida por Trichoderma reesei para diferentes níveis com a utilização dos sistemas de expressão com um número variável de sítios de ligação ao sTF (0, 1, 2, 4 e 8). Duas condições diferentes de culturaforam usadas, 1) um meio com extrato de grão consumido e lactose (“SGE-lactose” na Figura), o que resulta na forte suprarregulação da expressão do gene CBH1 nativo (na cepa de base - WT), e 2) SCD (“SCD” na figura), que tem um forteefeito inibitório sobre a expressão do gene CBH1 nativo (nacepa de base - WT). O equivalente de 15 μl do sobrenadante da cultura de 3 dias de cada cultura foi carregado sobre umgel (gradiente de 4-20%). O gel foi transferido para uma membrana de nitrocelulose e a proteína CBH1 foi detectada com o anticorpo primário anti-CBH1 específico (camundongo) (e o anticorpo secundário conjugado ao anti-IR680 de camundongo), e a visualização do sinal foi realizada no instrumento Odyssey CLx Imaging System (LI-CORBiosciences).

[0111] As Figuras 8A e 8B representam o esquema do sistema de expressão (8A) e a análise da expressão de um gene relator em Kazachstania exigua (8B).

[0112] A Figura 8A representa um exemplo (mostrado como um esquema) do sistema de expressão usado para Kazachstania exigua. O sistema de expressão construído em uma única molécula de DNA compreende dois cassetes de expressão (Tabela 3): 1) cassete de expressão para sTF, quecompreende um UCP, exemplificado aqui com o Sc-TDH3cp (ver a Tabela 1), a versão de sTF com a proteína de ligação ao DNA, exemplificada aqui por TetR, e o domínio de ativação, exemplificado aqui por VP16, e um terminador, exemplificado aqui pelo terminador g706 de Kazachstania exigua. E 2) o cassete de expressão para gene-alvo compreende diferentes sítios de ligação específicos para o sTF, exemplificados aqui por oito sítios de ligação específicos para TetR, diferentes UCPs, exemplificados aqui por Sc-ENO1cp (ver a Tabela 1), a região de codificação do gene relator, exemplificada aqui pela região de codificação de Venus (proteína fluorescente amarela), e um terminador, exemplificado aqui pelo terminador PDC1 de S. cerevisiae. A região de codificação da proteína de ligação ao DNA, aqui TetR, e a região de codificação do gene-alvo, aqui relator Venus, foram optimizadas nos códons para se adequarem ao uso de códons de Saccharomyces cerevisiae.

[0113] A Figura 8B representa um exemplo de uma análise da expressão de Venus em Kazachstania exigua contendo o sistema de expressão (descrito na Figura 8A, Tabela 3). O cassete de expressão foi integrado no genoma da cepa de base de Kazachstania exigua (“WT” na Figura), substituindo a região de codificação nativa de g706, para obter a cepa testada (“SES” na Figura). As duas cepas (WT e SES) foram cultivadas no meio SCD por 10 horas, e a cepa SES por 22 para atingir a fase estacionária (“SES_stat” na Figura). A transcrição de Venus e os genes ADH1 foram analisados por qPCR, com o gene ALG9 sendo o controle de normalização para a quantificação da expressão. As colunas apresentam os valores médios e as barras de erros os desvios-padrão de 3 réplicas experimentais.

[0114] As Figuras 9A, 9B, 9C e 9D representam a análise da produção de proteína em diversos hospedeiros de expressão (Trichoderma reesei e Pichia pastoris) contendo o sistema de expressão.

[0115] A Figura 9A representa um exemplo (mostrado como um esquema) do sistema de expressão para a produção de proteína CBH1 em Trichoderma reesei. O sistema de expressão construído em uma única molécula de DNA compreende dois cassetes de expressão (análogos àqueles nas Figuras 4 e 7C): 1) cassete de expressão para sTF, que compreende um UCP, exemplificado aqui com o 533cp (ver a Tabela 1), a versão de sTF com a proteína de ligação ao DNA, exemplificada aqui por BM3R1, e o domínio de ativação, exemplificado aqui por VP16, e um terminador, exemplificado aqui pelo terminador TEF1 de Trichoderma reesei. E 2) os cassetes de expressão para genes-alvo, que compreendem diversos sítios de ligação específicos para o sTF, exemplificados aqui por oito sítios de ligação específicos para BM3R1, diferentes UCPs, exemplificados aqui por 114cp (ver a Tabela 1), a região de codificação do gene-alvo, exemplificada aqui pela região de codificação de CBH1 de Trichoderma reesei (incluindo os íntrons que ocorrem na região de codificação de CBH1 de Trichoderma reesei nativa), e um terminador, exemplificado aqui pelo terminador PDC1 de Trichoderma reesei. A região de codificação da proteína de ligação ao DNA, aqui BM3R1, foi optimizada nos códons para se adequar ao uso de códons de Aspergillus niger.

[0116] A Figura 9B representa um exemplo de uma análise da produção de CBH1 em Trichoderma reesei contendo o sistema de expressão (descrito na Figura 9A). A cepa de base de Trichoderma reesei ("WT" na Figura) era uma cepa mutante abrigando múltiplas remoções dos genes que codificam 8 proteases diversas. O cassete de expressão foi integrado no genoma da cepa de base para obter a cepa testada (“SES” na Figura). As duas cepas (WT e SES) foram cultivadas no biorreactor (fermentador) em duas condições diferentes: 1) em um meio contendo grão consumido, extrato de grão consumido e lactose (“SGM” na Figura), o que resulta em uma forte suprarregulação da expressão do gene CBH1 nativo (na cepa de base - WT) e da expressão de outros genes celulolíticos (em ambas as cepas), e 2) em um meio contendo extrato de levedura e glicose (“glicose” na Figura) que tem um forte efeito inibitório sobre a expressão do gene CBH1 nativo (na cepa de base - WT) e a expressão de outros genes celulolíticos (em ambas as cepas). Os sobrenadantes destas culturas foram analisados através de análise por SDS-PAGE (SDS-eletroforese em gel de poliacrilamida) quanto ao teor de proteína total (Coomassie) e quanto ao teor de CBH1 específico ("western blot"). Para a análise do teor de proteína total, o equivalente de 1,5 μl de sobrenadantes da cultura em pontos de tempo diferentes, e a faixa de proteína CBH1 purificada (controle de carga), foram carregados sobre um gel (4-20% de gradiente), e o gel foi colorido com coomassie coloidal (PageBlue Protein Staining Solution; Thermo Fisher Scientific). Para a análise de CBH1 específico, o equivalente de 0,075 μl de sobrenadantes da cultura de diferentes pontos de tempo, e a faixa de proteína CBH1 purificada (controle de carga), foram carregados sobre um gel (gradiente de4-20%) e a proteína CBH1 (após transferência para uma membrana de nitrocelulose) foi detectada com o anticorpo primário anti-CBH1 específico (camundongo) (e o anticorpo secundário conjugado ao anti- IR680 de camundongo). Para ambas as análises, a visualização do sinal foi realizada no instrumento Odyssey CLx Imaging System (LI-COR Biosciences). A concentração de proteína (nos sobrenadantes da cultura) foi estimada a partir da faixa de CBH1 purificada carregada sobre cada gel, e os valores são mostrados na Figura.

[0117] A Figura 9C representa um exemplo (mostrado como um esquema) do sistema de expressão utilizado para Pichia pastoris para a produção de um produto proteico. O sistema de expressão construído em uma única molécula de DNA compreende dois cassetes de expressão (análogos àqueles na Figura 4): 1) cassete de expressão para sTF, que compreende um UCP, exemplificado aqui com o 008cp (ver a Tabela 1), a versão de sTF com a proteína de ligação ao DNA, exemplificada aqui por BM3R1, e o domínio de ativação, exemplificado aqui por VP16, e um terminador, exemplificado aqui pelo terminador TEF1 de Trichoderma reesei. E 2) o cassete de expressão para gene-alvo compreende diversos sítios de ligação específicos para o sTF, exemplificados aqui por oito sítios de ligação específicos para BM3R1, diferentes UCPs, exemplificados aqui por 201cp (ver a Tabela 1), a região de codificação do gene-alvo, exemplificada aqui pela região de codificação da proteína de fusão compreendendo o sinal de secreção de S. cerevisiae (fator α), o sítio de clivagem de protease KEX/spe13, o módulo de ligação ao carboidrato (CBM), a proteína elastina-like (ELP5), e outro CBM, e um terminador exemplificada aqui pelo terminador ADH1 de S. cerevisiae. A região de codificação da proteína de ligação ao DNA, aqui BM3R1, foi optimizada nos códons para se adequar ao uso de códons de Saccharomyces cerevisiae.

[0118] A Figura 9D representa uma análise da produção de CBM-ELP5-CBM em Pichia pastoris contendo o sistema de expressão (descrito na Figura 9C). A cepa foi cultivada em diversas condições, e os sobrenadantes dessas culturas foram analisados pelo western blot. O equivalente a 22,5 μl dos sobrenadantes da cultura foram carregadassobre um gel (gradiente de 4-20%), e a proteína CBM-ELP5- CBM (após transferência para uma membrana de nitrocelulose) foi detectada com o anticorpo primário anti-CBM específico (camundongo) (e o anticorpo secundário conjugado ao anti- IR680 de camundongo). A visualização do sinal foi realizada no instrumento Odyssey CLx Imaging System (LI-COR Biosciences).Tabela 1:Seleção dos promotores de núcleo testados em Saccharomyces cerevisiae e outros organismos. As sequências sombreadas são as regiões de flanco a 3’ adicionadas às sequências promotoras do núcleo para propósitos de exame ou clonagem. O ATG (códon de iniciação) está sublinhado. Sc - origem de Saccharomyces cerevisiae; An - origem de Aspergillus niger; Tr - origem de Trichoderma reesei; At - origem de Arabidopsis thaliana; Cr - origem de Chlamydomonas reinhardtii; Mm - origem de Mus musculus Tabela 2:Sequências de DNA de alguns dos sistemas de expressãotransferíveis interespécies. As partes de DNA funcionaissão indicadas: 8 × sítio de ligação ao BM3R1 (texto branco,destaque preto); promotores de núcleo (sublinhados); regiãode codificação de mCherry (texto branco, destaque cinza);terminadores (itálico, destaque cinza); BM3R1-sTF (destaquecinza). Tabela 3:Sequência de DNA do sistema de expressão testado emKazachstania exígua e Saccharomyces cerevisiae. As partesde DNA funcionais são indicadas: 8 × sítio de ligação aoTetR (texto branco, destaque preto); promotores de núcleo(sublinhados); região de codificação de Venus (textobranco, destaque cinza); terminadores (itálico, destaquecinza); TetR-sTF (destaque cinza). Tabela 4:Sequências de DNA dos sistemas de expressão testados emNicotiana benthamiana. As partes de DNA funcionais sãoindicadas: 8 × sítio de ligação ao sTF (texto branco,destaque preto); promotores de núcleo (sublinhados); regiãode codificação de mCherry (texto branco, destaque cinza);terminadores (itálico, destaque cinza); sTFs (destaquecinza). Tabela 5:Sequências de DNA dos sistemas de expressão testados emChlamydomonas reinhardtii. As partes de DNA funcionais sãoindicadas: 8 × sítio de ligação ao sTF (texto branco,destaque preto); promotores de núcleo (sublinhados); regiãode codificação de mCherry (texto branco, destaque cinza);terminadores (itálico, destaque cinza); sTFs (destaquecinza). Tabela 6:Sequência de DNA dos sistemas de expressão testados nascélulas de ovário de hamster chinês (células CHO -Cricetulus griseus). As partes de DNA funcionais sãoindicadas: 8 × sítio de ligação ao sTF (texto branco,destaque preto); promotores de núcleo (sublinhados); regiãode codificação de mCherry (texto branco, destaque cinza);terminadores (itálico, destaque cinza); sTF (destaquecinza). ExemplosExemplo 1As proteínas de ligação ao DNA bacterianas e os seus sítiosde ligação utilizados nos sistemas de expressão:- LexA (repressor de transcrição de Escherichia coli;GenBank: EDV67321.1)Sítios de ligação ao LexA (independentemente dafita de DNA):CTGTATATAAACACAG (SEQ ID NO: 76);CTGTATATATACCCAG (SEQ ID NO: 77);CTGTATATAAAACCAG (SEQ ID NO: 78);GTGGTTATATATACAG (SEQ ID NO: 79)- SrpR (regulador transcricional de Pseudomonasputida; Sequência de Referência NCBI: WP_019437727.1)Sítios de ligação ao SrpR (independentemente dafita de DNA):ATATACATACATGCTTGTTTGTTTGTAAAC (SEQ ID NO: 80);ATTTACATACATTCTTGTTTGTTTGTAAAC (SEQ ID NO: 81)- PhlF (regulador transcricional de Pseudomonasprotegens; GenBank: AAF20928.1)Sítios de ligação ao PhlF (independentemente dafita de DNA):ATGATACGAAACGTACCGTATCGTTAAGGT (SEQ ID NO: 82);ATGATACGGAACGTTACGTATCGTTAAGCT (SEQ ID NO: 83);ATGATACGGAAGCTACCGTATCGTAAAGGT (SEQ ID NO: 84);ATGATACGTAACGTACCGTATCGTAAAGGT (SEQ ID NO: 85)- TetR (regulador transcricional de Escherichia coli,GenBank: EFK45326.1)Sítio de ligação ao TetR (independentemente dafita de DNA):ACTCCCTATCAGTGATAGAGA (SEQ ID NO: 86)- BM3R1 (regulador transcricional de Bacillusmegaterium; Sequência de Referência NCBI: WP_013083972.1)Sítios de ligação ao BM3R1 (independentemente dafita de DNA):CGGAATGAAGGTTCATTCCG (SEQ ID NO: 87);CGGAATGAACTTTCATTCCG (SEQ ID NO: 88);CGGAATGAACATTCATTCCG (SEQ ID NO: 89);CGGAATGAACGTTCATTCCG (SEQ ID NO: 90)- TarA (regulador transcricional de Streptomyceslavenduligriseus; Sequência de Referência NCBI:WP_030788560.1)Sítios de ligação ao TarA (independentemente dafita de DNA):AACATACCGTGTGGTATGTT (SEQ ID NO: 91);AACATACCGAGTGGTATGTT (SEQ ID NO: 92);AACATACCGTGAGGTATGTT (SEQ ID NO: 93);AAACATACCGTGTGGTATGTTC (SEQ ID NO: 94)- LacI (repressor de lac de Escherichia coli;Sequência de Referência NCBI: WP_048339836.1)Sítio de ligação ao LacI (independentemente dafita de DNA):AATTGTGAGCGGCTCACAATT (SEQ ID NO: 95)Exemplo 2Teste de diferentes versões dos sTFs e avaliação damodulação do desempenho do sistema de expressão emSaccharomyces cerevisiae. (Figura 5)

[0119] Os sistemas de expressão (cassetes deexpressão individuais para os sTFs e para os relatores) foram construídos como duas moléculas de DNA separadas (plasmídios) (Figura 5A). Os plasmídios com os cassetes de expressão para cada sTF continham: 1) a região decodificação optimizada nos códons de Saccharomyces cerevisiae da proteína de ligação ao DNA (LexA, PhlF, SrpR, TetR, BM3R1 e TarA; Exemplo 1) em cada região de codificação de sTF, 2) NLS e o domínio de ativação VP16 em cada região de codificação de sTF, 3) o Sc-TDH3cp (Tabela 1) controlando a expressão de cada sTF, 4) o gene marcador de seleção URA3 (de origem de Kluyveromyces lactis), 5) osflancos para integração no genoma por recombinação homóloga no lócus ura3-52 (para substituir a região de codificação mutada do lócus), 6) regiões necessárias para a propagaçãodo plasmídio em E. coli. Os plasmídios com os cassetes para o relator continham 1) a região de codificação optimizada nos códons de Saccharomyces cerevisiae da proteína Venus (fluorescente amarela), 2) o Sc-ENO1cp (Tabela 1) que controla a expressão de Venus em conjunto com 3) sítios de ligação específicos para sTF posicionados a montante (0, 1, 2, 4 ou 8) (Exemplo 1), 4) o gene marcador de seleçãoLEU2 (de origem de Kluyveromyces lactis), 5) os flancospara integração no genoma por recombinação homóloga no lócus leu2-3_112 (substituindo a região de codificação mutada do lócus) e 6) regiões necessárias para a propagação do plasmídio em E. coli.

[0120] O Saccharomyces cerevisiae CEN.PK (MATα, ura3-52 leu2-3_112 his3Δ 1 MAL2-8C SUC2) foi usada como acepa parental. Os cassetes de expressão (Figura 5A) foram introduzidos nas células através da transformação dos plasmídios integrativos linearizados, o sTF e os cassetes de expressão para relator correspondentes foramtransformados em uma única cepa. Cada cassete de integração foi librado pela endonuclease de restrição NotI do plasmídio antes da transformação. As transformações foram realizadas usando o protocolo padrão de acetato de lítio.As integrações de cópia única foram confirmadas por qPCR,onde o sinal da qPCR do gene Venus foi comparado a um sinal da qPCR de uma sequência nativa única em cada cepa.

[0121] Para todos os cultivos, 6,7 g/L de base de nitrogênio de levedura (YNB, Becton, Dickinson and Company), mistura sintética de aminoácidos completa sem uracil e leucina suplementada com 20 g/L de D-glicose (SCD- LU) foram utilizados. No caso de cultivos em placa de ágar,20 g/L de ágar foram utilizados além dos componentes acimamencionados.

[0122] As pré-culturas das cepas testadas foram desenvolvidas durante 24-48 horas sobre as placas de ágar com SCD-LU antes da inoculação de 4 ml de SCD-LU em placasde cultivo de 24 poços até DO600 = 0,2. As culturas foramdesenvolvidas durante 18 horas a 800 rpm (Infors HT Microtron) e 28°C em triplicata, centrifugadas, lavadas e ressuspensas em 0,2 ml de água estéril. Duzentos μl da suspensão celular foram analisados em 96 poços pretos (Black Cliniplate; Thermo Scientific) utilizando o fluorímetro Varioskan (Thermo Electron Corporation). As configurações para Venus foram 510 nm (excitação) e 530 nm (emissão), respectivamente. Para a normalização dos resultados de fluorescência, as suspensões celulares analisadas foram diluídas 100x e a DO600 foi medida em placas de microtítulo de 96 poços transparentes (NUNC) usando Varioskan (Thermo Electron Corporation).

[0123] Os resultados da análise fluorescente são mostrados na Figura 5B.Exemplo 3Análise quantitativa do desempenho do sistema de expressão em diversos hospedeiros fúngicos (Figura 6)

[0124] Os sistemas de expressão (Tabela 2, Figura 4) e as suas versões de controle negativo (os sistemas de expressão com regiões removidas abrangendo o promotor de núcleo controlando o sTF e o próprio sTF) foramclonados em plasmídios introduzindo marcadores de seleção eflancos para integração no genoma para 6 espécies diferentes. 1) A cepa CEN.PK de Saccharomyces cerevisiae foi utilizada como a cepa parental. Os sistemas de expressão (incluindo as versões com a região de codificação optimizada nos códons de Saccharomyces cerevisiae da proteína de ligação ao DNA, BM3R1), incluindo o gene marcador de seleção LEU2 (de origem de Kluyveromyces lactis), foram integrados no lócus leu2-3_112 (substituindo a região de codificação mutada do lócus) usando as regiões de flanco correspondentes para recombinação homóloga. As transformações foram feitas pelo protocolo padrão de acetato de lítio. 2) A cepa ATCC1015 de Aspergillus niger foi utilizada como a cepa parental. Os sistemas de expressão, incluindo um gene marcador de seleção de resistência à higromicina com um promotor e terminador adequados, foram integrados no lócus gaaC (substituindo a região de codificação nativa) utilizando as regiões de flanco correspondentes para recombinação homóloga. As transformações foram realizadas usando o protocolo de transformação CRISPR (ver abaixo), incluindo: protoplastos da cepa de A. niger, DNA doador linear (cassete de expressão com o marcador de seleção e os flancos para integração), proteína Cas9 (IDT) e mistura de crRNA sintético e tracrRNA (IDT). A Cas9, o crRNA e o tracrRNA formam um complexo de ribonucleoproteína (RNP) que gera uma quebra da fita dupla no lócus genômico alvo que é então reparado com o DNA doador linear por recombinação homóloga. 3) A cepa M124 de Trichoderma reesei (coleta de cultura VTT) foi usada como a cepa parental. Os sistemas de expressão, incluindo um gene marcador de seleção de resistência à higromicina com um promotor e terminador adequados, foram integrados no lócus pep4 (substituindo a região de codificação nativa) usando as regiões de flanco correspondentes para recombinação homóloga. As transformações foram feitas usando o protocolo de transformação CRISPR (ver abaixo), incluindo: protoplastos da cepa de T. reesei, DNA doador linear (cassete de expressão com o marcador de seleção e regiões de flanco) e complexo de RNP que gera uma quebra da fita dupla no lócus genômico alvo que é então reparado com o DNA doador linear. 4) A cepa ATCC 32196 de Pichia kudriavzevii foi utilizada como a cepa parental. Os sistemas de expressão, incluindo um gene marcador de seleção de resistência à higromicina com um promotor e terminador adequados, foram integrados no lócus PDC1 (substituindo a região de codificação nativa) usando regiões de flanco correspondentes para recombinação homóloga. As transformações foram feitas usando o protocolo padrão de acetato de lítio. 5) A cepa X-33 de Pichia pastoris (Invitrogen) foi usada como a cepa parental. Os sistemas de expressão (com a região de codificação da proteína de ligação ao DNA, BM3R1, que foi optimizada no códon para se adequar ao uso do códon de Saccharomyces cerevisiae), incluindo um gene marcador de seleção de resistênciaà zeocina com promotor e terminador adequados, foram integrados no lócus AOX1 (integração na região promotora AOX1) utilizando as regiões de flanco correspondentes para recombinação homóloga. As transformações foram feitas usando o protocolo padrão de acetato de lítio. 6) A Yarrowia lipolytica C-00365 (coleta de cultura VTT) foi usada como a cepa parental. Os sistemas de expressão, incluindo um gene marcador de seleção de resistência a nourseotricina com um promotor e terminador adequados, foram integrados no lócus ANT1 (substituindo a região de codificação nativa) utilizando as regiões de flanco correspondentes para recombinação homóloga. Astransformações foram feitas usando o protocolo padrão de acetato de lítio.

[0125] O protocolo de transformação CRISPR: Os protoplastos isolados foram suspensos em 200 μl de solução STC (1,33 M de sorbitol, 10 mM de Tris-HCl, 50 mM de CaCl2, pH 8,0). Cem μl de suspensão de protoplastos foram misturados com 3,5 μg de DNA doador e 20 μl de solução de RNP (1 μM de proteína Cas9 (IDT), 1 μM de crRNA sintético(IDT), e 1 μM de tracrRNA (IDT)) e 100 μl da solução detransformação (25% de PEG 6000, 50 mM de CaCl2, 10 mM deTris-HCl, pH 7,5). A mistura foi incubada em gelo durante 20 min. Dois ml de solução de transformação foram adicionados e a mistura foi incubada 5 min na temperaturaambiente. Quatro ml de STC foram adicionados, seguidos pela adição de 7 ml do ágar de superfície fundido (50°C) (200g/L de D-sorbitol, 6,7 g/L de base de nitrogênio de levedura (YNB, Becton, Dickinson and Company), aminoácido sintético completo, 20 g/l de D-glicose, 400 mg/L (para A. niger) ou 100 mg/L (para T. reesei) de higromicina B e 20 g/L de ágar). A mistura foi vertida em uma placa de seleção de higromicina (200 g/L de D-sorbitol, 6,7 g/L de base de nitrogênio de levedura (YNB, Becton, Dickinson and Company), aminoácido sintético completo, 20 g/L de D- glicose, 400 mg/L (para A. niger) ou 100 mg/L (para T. reesei) de higromicina B, 20 g/L de ágar). O cultivo foi realizado a +28 °C durante cinco ou sete dias, as colônias foram colhidas e cultivadas novamente sobre as placas YPD contendo 400 mg/L (para A. niger) ou 100 mg/L (para T. reesei) de higromicina B.

[0126] As integrações corretas foram confirmadas por PCR do DNA genômico de cada cepa transformada, onde o amplicon (região amplificada de DNA) estendeu a construção integrada e o DNA genômico para fora dos flancos para integração. As integrações de cópia única foram confirmadas por qPCR, onde o sinal de qPCR do gene mCherry foi comparado a um sinal de qPCR de uma sequência nativa única em cada hospedeiro.

[0127] Para os cultivos líquidos, foram usados 6,7 g/L de base de nitrogênio de levedura (YNB, Becton, Dickinson and Company), aminoácido completo sintético suplementado com 20 g/L de D-glicose (SCD). No caso de cultivos em placa de ágar, meio solidificado contendo 20 g/L de ágar, 20 g/L de bacto peptona (Becton Dickinson), 10 g/L de extrato de levedura e 20 g/L de D-glicose (placas YPD). Para obter os esporos dos fungos filamentosos, foram utilizadas placas de ágar PDA para a esporulação (39 g/L de Batata dextrose ágar da BD-Difco).

[0128] Para a análise por citometria de fluxo da produção de mCherry nas cepas testadas (Figura 6A), as pré- culturas das cepas de leveduras testadas foram desenvolvidas por 24-48 horas em placas de ágar YPD e os fungos filamentosos (cepas de A. niger e T. reesei) foram esporulados em placas PDA (7 dias), os esporos coletados e diluídos em 1x PBS antes da análise. No caso das cepas de leveduras, 4 ml de meio SCD em placas de cultivo de 24 poços foram inoculados a partir de pré-culturas para DO600 = 0,2 por cada cepa de levedura testada. As culturas foram desenvolvidas durante 18 horas a 800 rpm (Infors HT Microtron) e 28°C. Cem μL da cultura foram combinados com 1,5 mL de 1x PBS antes da análise. As medições foram feitas com o FACSAria III (BD), onde 10000 eventos foram registrados e os resultados foram normalizados dividindo-se os valores de fluorescência de mCherry pelo tamanho da célula (dispersão direta, FSC-A). Os resultados da análise fluorescente por citometria de fluxo são mostrados na Figura 6A.

[0129] Para a análise da fluorometria quantitativa (Figura 6B), as pré-culturas das cepas de leveduras testadas foram desenvolvidas por 24-48 horas em placas de ágar YPD e as pré-culturas (inoculadas por esporos) das cepas de Trichoderma reesei foram desenvolvidas por 24 horas em meio YPG (20 g/L de bacto peptona, 10 g/L de extrato de levedura e 30 g/L de gelatina). Quatro ml do meio SCD em placas de cultivo de 24 poços foram inoculados a DO600 = 0,2 por cada cepa delevedura testada (DO600 = 0,5 no caso de T. reesei). Asculturas foram desenvolvidas durante 18 horas a 800 rpm (Infors HT Microtron) e 28°C em triplicata, centrifugadas, lavadas e ressuspensas em 0,2 ml de água estéril. Duzentos μl de cada suspensão celular foram analisados em placas de 96 poços pretas (Black Cliniplate; Thermo Scientific) usando o fluorímetro Varioskan (Thermo ElectronCorporation). As configurações para mCherry foram 587 nm (excitação) e 610 nm (emissão), respectivamente. Para a normalização dos resultados de fluorescência, as suspensões celulares analisadas foram diluídas 100x e a DO600 foi medida em placas de microtítulo de 96 poços transparentes(NUNC) utilizando o Varioskan (Thermo ElectronCorporation). Os resultados da análise são mostrados na Figura 6B.Exemplo 4Análise dos níveis de expressão ajustáveis em diferentes hospedeiros (Pichia kudriavzevii, Aspergillus niger e Trichoderma reesei) (Figura 7)

[0130] Os sistemas de expressão para Pichia kudriavzevii e Aspergillus niger com diversos números dos sítios de ligação específicos para o sTF (0, 1, 2, 4 ou 8)(Figura 7A) foram construídos de forma análoga ao Exemplo 3 (a versão do sistema de expressão A - mostrada na Figura 4 - foi usada). No caso de Pichia kudriavzevii, a cepa ATCC 32196 foi usada como a cepa parental. Os sistemas de expressão, incluindo o gene marcador de seleção de resistência à higromicina com um promotor e terminador adequados, foram integrados no lócus PDC1 (substituindo a região de codificação nativa) utilizando as regiões de flanco correspondentes para recombinação homóloga. As transformações foram feitas usando o protocolo padrão de acetato de lítio. No caso de Aspergillus niger, a cepa ATCC1015 foi usada como a cepa parental. Os sistemas de expressão, incluindo um gene marcador de seleção de resistência à higromicina com um promotor e terminador adequados, foram integrados no lócus gaaC (substituindo a região de codificação nativa) utilizando as regiões de flanco correspondentes para recombinação homóloga. As transformações foram feitas utilizando o protocolo de transformação CRISPR, incluindo: protoplastos da cepa de A. niger, DNA doador linear (cassete de expressão com o marcador de seleção e os flancos para integração) e complexo de RNP que gera uma quebra da fita dupla no lócus genômico alvo que é então reparado com o DNA doador linear.

[0131] A molécula de DNA, contendo os sistemas de expressão para Trichoderma reesei para a expressão ajustável do gene CBH1 (Figura 7C), continha o 201cp (Tabela 1), juntamente com os sítios de ligação específicospara BM3R1 posicionados a montante (0, 1, 2, 4, ou 8)controlando a expressão da região de codificação de CBH1, oterminador PDC1 de T. reesei, 533cp (Tabela 1) controlandoa expressão da região de codificação de sTF, a região de codificação de sTF, o terminador TEF1 de Trichoderma reesei, o gene marcador de seleção de resistência à higromicina com promotor e terminador adequados, e os flancos para integração no genoma por recombinação homóloga no lócus CBH1 (substituindo a região de codificação nativa). A cepa M124 de T. reesei (coleta de cultura VTT) foi usada como a cepa parental. As transformações foram feitas pelo protocolo de transformação de protoplastos (ver abaixo), incluindo: protoplastos da cepa de T. reesei e DNA doador linear (cassete de expressão com o marcador de seleção e os flancos para integração).

[0132] O protocolo de transformação deprotoplastos: Os protoplastos isolados foram suspensos em200 μl de solução STC (1,33 M de sorbitol, 10 mM de Tris- HCl, 50 mM de CaCl2, pH 8,0). Cem μl de suspensão de protoplastos foram misturados com 10 μg do DNA doador e 100μl da solução de transformação (25% de PEG 6000, 50 mM deCaCl2, 10 mM de Tris-HCl, pH 7,5)). A mistura foi incubadaem gelo durante 20 min. Dois ml de solução de transformação foram adicionados e a mistura foi incubada 5 min na temperatura ambiente. Quatro ml de STC foram adicionados,seguidos pela adição de 7 ml do ágar de superfície fundido(200 g/L de D-sorbitol, 6,7 g/L de base de nitrogênio de levedura (YNB, Becton, Dickinson and Company), aminoácido sintético completo, 20 g/l de D-glicose, 100 mg/L de higromicina B, 20 g/L de ágar). A mistura foi vertida em uma placa de seleção (200 g/L de D-sorbitol, 6,7 g/L de base de nitrogênio de levedura (YNB, Becton, Dickinson and Company), aminoácido sintético completo, 20 g/L de D- glicose, 100 mg/L de higromicina B, e 20 g/L de ágar). O cultivo foi realizado a +28 °C durante cinco dia; as colônias foram colhidas e cultivadas novamente sobre as placas YPD contendo 100 mg/L de higromicina B.

[0133] As integrações corretas foram confirmadas por PCR do DNA genômico de cada cepa transformada, onde o amplicon (região amplificada de DNA) estendeu a construção integrada e o DNA genômico para fora dos flancos para integração. As integrações de cópia única foram confirmadas por qPCR, onde o sinal de qPCR do gene mCherry (para as cepas de Pichia kudriavzevii e Aspergillus niger) ou a região de codificação de BM3R1 (para as cepas de Trichoderma reesei) foi comparado a um sinal de qPCR de uma sequência nativa única em cada hospedeiro.

[0134] Para os cultivos líquidos, foram usados 6,7 g/L de base de nitrogênio de levedura (YNB, Becton, Dickinson and Company), aminoácido completo sintético suplementado com 20 g/L de D-glicose (SCD). No caso de cultivos em placa de ágar, foi usado meio solidificado contendo 20 g/L de ágar, 20 g/L de bacto peptona (Becton Dickinson), 10 g/L de extrato de levedura e 20 g/L de D- glicose (placas YPD). Para obter os esporos dos fungos filamentosos, foram utilizadas placas de ágar PDA para a esporulação (39 g/L de Batata dextrose ágar da BD-Difco).

[0135] Para a análise por citometria de fluxo da produção de mCherry nas cepas testadas (Figura 7B), as pré-culturas das cepas de Pichia kudriavzevii foram desenvolvidas por 24-48 horas em placas de ágar YPD e as cepas de Aspergillus niger foram esporuladas em placas PDA (por 7 dias), os esporos coletados e diluídos em 1x PBS antes da análise. No caso das cepas de Pichia kudriavzevii, 4 ml de meio SCD em placas de cultivo de 24 poços foram inoculados a partir da pré-cultura para DO600 = 0,2. As culturas foram desenvolvidas durante 18 horas a 800 rpm (Infors HT Microtron) e 28°C. Cem μL da cultura foram combinados com 1,5 mL de 1x PBS antes da análise. As medições foram feitas com o FACSAria III (BD), onde 10000 eventos foram registrados e os resultados foram normalizados dividindo-se os valores de fluorescência de mCherry pelo tamanho da célula (dispersão direta, FSC-A). Os resultados da análise fluorescente por

[0136] Para a análise por western blot da produção de CBH1 nas cepas de Trichoderma reesei, as pré- culturas (inoculadas por esporos) foram desenvolvidas por 24 horas em meio YPG (20 g/L de bacto peptona, 10 g/L de extrato de levedura e 30 g/L L gelatina). Quatro ml de SGE- lactose (15 g/L de KH2PO4, 5,4 g/L de Na2SO4, 1 mL/L deelementos residuais (3,7 mg/L de CoCl2, 5 mg/L deFeSO4.7H2O, 1,4 mg/L de ZnSO4.7H2O, 1,6 mg/L de MnSO4.7H2O),40 g/L de lactose, 333,25 g/L de extrato de grão consumido, 8,6 g/L de (NH4)2-citrato, 100 mM de Pipps, 2,4 mM de MgSO4, e 4,1 mM de CaCl2, pH ajustado para 4,8 com KOH) ou o meio SCD em placas de cultivo de 24 poços foi inoculado para DO600 = 0,5 para cada cepa testada. As culturas foramdesenvolvidas durante 3 dias a 800 rpm (Infors HT Microtron) e 28°C, centrifugadas e o sobrenadante transferido para um tubo limpo. Quinze μL de cadasobrenadante foram misturados com 4 μL de 4x tampão decarga de SDS (400 ml/L de glicerol, 100 mL/L de β-mercaptoetanol, 2 g/L de corante OrangeG (Sigma), 40 g/L de SDS, e 125 mM de Tris-HCl, pH 6,8), fervidos e carregados em gel de gradiente de 4-20% de SDS-PAGE. O gel foi transferido para uma membrana de nitrocelulose e a proteína CBH1 foi detectada com o anticorpo primário anti-CBH1 específico (camundongo) (e o anticorpo secundário conjugado ao anti-IR680 de camundongo) e a visualização do sinal foi realizada no instrumento Odyssey CLx Imaging System (LI-COR Biosciences). Os resultados da análise são mostrados na Figura 7D.Exemplo 5Teste do sistema de expressão em Kazachstania exigua (Figura 8)

[0137] O sistema de expressão usado para Kazachstania exigua (Tabela 3, Figura 8A) foi clonado em um plasmídio contendo regiões de flanco para o gene g706 de K. exigua que codifica um homólogo de ALD2 de S. cerevisiae. Na construção resultante, a região de flanco 3'-UTR para g706 de K. exigua formou uma sequência terminadora para o sTF no sistema de expressão. O sistema de expressão, incluindo as regiões de flanco para recombinação homóloga, foi integrado no lócus g706 (substituindo a região de codificação nativa).

[0138] A cepa C-02458 de Kazachstania exigua (coleta de cultura VTT) foi modificada pela substituição de ambos os locos KU70 pelo cassete de expressão de Cas9 (contendo promotor e terminador adequados). A cepa resultante (MAT a/α ura3Δ/ura3Δ ku70Δ::Cas9/ku70::Cas9) foi usada como a cepa parental (WT na Figura 8B). A transformação do sistema de expressão (DNA doador) na cepa de base foi realizada em conjunto com um plasmídio centromérico contendo o marcador de seleção URA3 e um cassete de expressão para um sgRNA que alveja Cas9 no lócus g706 (o sgRNA foi expresso sob o controle do promotor de RNA polimerase III de S. cerevisiae SNR52 e do terminador SUP4). A cepa resultante é mostrada como “SES” na Figura 8B.

[0139] A transformação foi feita pelo protocolo de eletroporação: As células foram inoculadas em meio YPD e cultivadas durante a noite a 250 rpm e 30 °C. A culturanoturna foi diluída para uma DO600 = 0,2 e desenvolvida até uma DO600 = 1,3. As células coletadas e lavadas foramressuspensas em 10 mL de Tris-EDTA (pH 7,5) contendo 10 mM de ditiotreitol e incubadas a 30 °C durante 30 minutos. Quarenta mL de água gelada foram adicionados às células, seguidos por centrifugação. Esta foi seguida com duas etapas de lavagem, primeiro com 50 mL de água estéril gelada, depois com 10 mL de sorbitol a 1 M gelado. Finalmente, as células foram ressuspensas em 125 μL de sorbitol a 1 M gelado. Cinquenta μL de suspensão celular foram combinados com 15 μL de uma mistura de DNA (contendo 5 μg do DNA doador e 5 μg do plasmídio de gRNA). A eletroporação foi realizada em cubetas de 2 mm a 1,25 kV, 200 Q e 25 μF. Novecentos e cinquenta μL de solução de recuperação (10 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de Bacto peptona, 20 g/L de glicose, 1 M de sorbitol) foram adicionados imediatamente após a eletroporação. As células foram recuperadas durante 30 minutos a 250 rpm e 30 °C antes da preparação em meio SCD sem uracil.

[0140] Para a análise da expressão, as duas cepas (WT e SES) foram cultivadas em triplicatas em meio SCD por 10 horas, e a cepa SES também por 22 horas para atingir a fase estacionária, quando toda a glicose foi consumida (“SES_stat” na Figura 8B). O RNA total foi isolado das cepas (Kit RNeasy - QIAGEN), o cDNA foi produzido (Kit Transcriptor First Strand cDNA Synthesis - Roche) e a transcrição dos genes Venus e ADH1 (um gene glicolítico altamente expresso na fase exponencial de crescimento e infrarregulado na ausência de glicose) foi analisada por qPCR com primers específicos para cada gene. O gene ALG9 foi usado como o controle de normalização para a quantificação da expressão. Os resultados da análise são mostrados na Figura 8B.Exemplo 6O sistema de expressão utilizado para a produção de uma proteína secretada em fungos (Trichoderma reesei e Pichia pastoris) (Figura 9)

[0141] A molécula de DNA, contendo o sistema de expressão para Trichoderma reesei (Figura 9A), continha 114cp (Tabela 1) juntamente com oito sítios de ligação específicos para BM3R1 posicionados a montante controlando a expressão da região de codificação de CBH1, a região de codificação para o gene CBH1, o terminador PDC1 de Trichoderma reesei, 533cp (Tabela 1) controlando a expressão da região de codificação de sTF, a região de codificação de sTF, o terminador TEF1 de Trichoderma reesei, o gene marcador de seleção de resistência à higromicina com um promotor e terminador adequados e regiões de flanco para a integração genômica no lócus CBH1 (substituindo a região de codificação nativa) por recombinação homóloga. A cepa M1763 de T. reesei (coleta de cultura VTT) foi usada como a cepa parental (“WT” na Figura 9B). As transformações foram feitas pelo protocolo de transformação de protoplastos (Exemplo 4), usandoprotoplastos da cepa de T. reesei e DNA doador linear (cassete de expressão com o marcador de seleção e flancos para integração).

[0142] As integrações corretas foram confirmadas usando PCR a partir do DNA genômico, onde o amplicon (amplificada região de DNA) estendeu a construção integrada e o DNA genômico para fora dos flancos para integração. A integração de cópia única foi testada usando qPCR, onde o sinal de qPCR da região de codificação de BM3R1 foi comparado com o sinal de uma sequência nativa única no hospedeiro. A cepa contendo o cassete de expressão (“SES” na Figura 9B) foi analisada quanto à produção de CBH1 e comparada com a cepa de base nas condições de indução e repressão de celulase.

[0143] A produção de CBH1 nas cepas deTrichoderma reesei foi realizada em biorreatores de 1 L. As pré-culturas (inoculadas com esporos) para os cultivos nas condições de indução de celulase foram desenvolvidas durante 24 horas em meio SGE-lactose (Exemplo 4) para produzir uma quantidade suficiente de micélio para as inoculações no biorreator. As pré-culturas (inoculadas com esporos) para os cultivos nas condições de repressão de celulase foram desenvolvidas durante 24 horas em um meio YE-glicose-A (20 g/L de glicose, 10 g/L de extrato de levedura, 15 g/L de KH2PO4, 5 g/L de (NH4)2SO4, 1 mL/L deelementos residuais (3,7 mg/L de CoCl2, 5 mg/L deFeSO4.7H2O, 1,4 mg/L de ZnSO4.7H2O, 1,6 mg/L de MnSO4.7H2O), 2,4 mM de MgSO4, e 4,1 mM de CaCl2, pH ajustado para 4,8). Os cultivos dos biorreatores de indução de celulase foram inoculados em meio SGM (“SGM” na Figura 9B) (20 g/L deextrato de grão consumido, 20 g/L de grão consumido vendido, 60 g/L de lactose, 5 g/L de KH2PO4, 5 g/l deNH4SO4, 1 mL/L de elementos residuais, 2,4 mM de MgSO4, e4,1 mM de CaCl2, 1 mL/L de Antiespuma J647, pH 4,8), fluxode ar a 0,5 slpm (0,4-0,6 vvm) e agitação a 600 rpm. Os cultivos dos biorreatores de repressão de celulase foram inoculados no meio de YE-glicose-B (“glicose” na Figura 9B) (10 g/L de glicose, 20 g/L de extrato de levedura, 5 g/l KH2PO4, 5 g/L de NH4SO4, 1 mL/L de elementos residuais, 2,4mM de MgSO4, e 4,1 mM de CaCl2, 1 mL/L de Antiespuma J647,pH 4,8), e estas culturas foram continuamente alimentadas com glicose (300 g/L de glicose com vazão a 4,4 g/h), fluxode ar a 0,5 slpm (0,4-0,6 vvm) e agitação a 900 rpm. O cultivo foi realizado por 150 horas, amostras obtidas em vários momentos, subconjunto mostrado na Figura 9B.

[0144] Para a análise por corante coomassie (Figura 9B - painel superior esquerdo), 1,5 μL de cadasobrenadante da cultura (ponto no tempo) foi misturado com 15 μL de 1x tampão de carga de SDS (100 ml/L de glicerol, 25 ml/L de β-mercaptoetanol, 0,5 g/L de corante OrangeG (Sigma), 10 g/L de SDS e 31,2 mM de Tris-HCl, pH 6,8), fervido e carregado em gel de gradiente de SDS-PAGE de 4-20% em conjunto com diluições de proteína CBH1 purificadacomo um padrão. O gel foi colorido com corante coomassie coloidal (PageBlue Protein Staining Solution; Thermo Fisher Scientific) de acordo com o protocolo do fabricante. A visualização do gel colorido foi realizada no instrumento Odyssey CLx Imaging System (LI-COR Biosciences). A concentração de proteína no sobrenadante da cultura foi estimada a partir do padrão de CBH1 no mesmo gel (Figura 9B - tabela superior à direita). Para a análise por western (Figura 9B - painel inferior esquerdo), 0,075 μL de cadasobrenadante de cultura (ponto no tempo) foi misturado com 15 μL de 1x tampão de carga de SDS, fervido e carregado nogel de gradiente de SDS-PAGE de 4-20% em conjunto com diluições de proteína CBH1 purificada. O gel foi transferido para uma membrana de nitrocelulose, e a proteína CBH1 foi detectada com o anticorpo primário anti- CBH1 específico (camundongo) (e o anticorpo secundário conjugado ao anti-IR680 de camundongo) e a visualização do sinal foi realizada no instrumento Odyssey CLx Imaging System (LI-COR Biosciences). A concentração de CBH1 no sobrenadante da cultura foi estimada (Figura 9B - tabela inferior à direita).

[0145] A molécula de DNA, contendo o sistema de expressão para Pichia pastoris (Figura 9C), consistiu no 201cp (Tabela 1) juntamente com oito sítios de ligação específicos para BM3R1 posicionados a montante controlando a expressão da região de codificação da proteína de fusão, na região de codificação para a proteína de fusão (consistindo no sinal de secreção N terminal de Saccharomyces cerevisiae (fator α), sítio de clivagem de protease KEX/spe13, módulo de ligação ao carboidrato (CBM), proteína elastina-like (ELP5) e outro CBM), seguida pelo terminador ADH1 de S. cerevisiae, 008cp (Tabela 1)controlando a expressão da região de codificação de sTF, a região de codificação de sTF (a região de codificação da proteína de ligação ao DNA, BM3R1, do sTF foi optimizada no códon para se adequar ao uso de códons de Saccharomyces cerevisiae), o terminador TEF1 de Trichoderma reesei, o gene marcador de seleção de resistência à zeocina com promotor e terminador adequados e os flancos para integração no genoma por recombinação homóloga no lócus de AOX1 (integração na região do promotor AOX1). As transformações foram feitas usando o protocolo padrão de acetato de lítio. A cepa contendo uma cópia única docassete de expressão foi testada quanto à produção da proteína em diversas condições (Figura 9D).

[0146] A produção de CBM-ELP5-CBM em Pichia pastoris foi realizada em frascos Erlenmeyer. A pré-cultura foi realizada por 24 horas no meio YPP (10 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de peptona, 13,4 g/L de base de nitrogênio de levedura, 0,4 mg/L de biotina, 20 g/L de glicerol, 13,2 mM de K2HPO4, e 86,8 mM de KH2PO4, pH = 6,0)com 20 g/L de glicerol (YPP-Gly). Para testar o efeito de diferentes fontes de carbono, o glicerol foi substituído por 20 g/L de glicose (“YPP-Glc” na Figura 9D) ou por 20 g/L de etanol (“YPP-EtOH” na Figura 9D). As células da pré- cultura foram inoculadas (para DO600 = 1,0) em YPP-Gly,YPP-Glc, ou YPP-EtOH e cultivadas durante 2 dias, também foi testada a adição de inibidores de proteinase (quimostatina e pepstatina). A pré-cultura também foi cultivada por dois dias adicionais (três dias no total).

[0147] Para a análise por western (Figura 9D), 22,5 μL de cada sobrenadante da cultura foram misturados com 7,5 μL de 4x tampão de carga de SDS, fervidos ecarregados no gel de gradiente de SDS-PAGE de 4-20%. O gel foi transferido para uma membrana de nitrocelulose e a proteína CBM-ELP5-CBM foi detectada com o anticorpo primário anti-CBM específico (camundongo) (e o anticorpo secundário conjugado ao anti-IR680 de camundongo) e a visualização do sinal foi realizada no instrumento Odyssey CLx Imaging System (LI-COR Biosciences) (Figura 9D).Exemplo 7Teste do desempenho do sistema de expressão em organismo de planta (Nicotiana benthamiana)

[0148] Dois sistemas de expressão são testadosem Nicotiana benthamiana (Tabela 4): Os sistemas deexpressão construídos em moléculas de DNA individuais compreendem dois cassetes de expressão: 1) cassete deexpressão para sTF, que compreende um promotor de núcleo utilizado para o controle da expressão de sTF, exemplificado aqui com o At-RPL41D_cp (Tabela 1); a versão de sTF com a proteína de ligação ao DNA, exemplificada aqui por BM3R1 ou TetR, e com o domínio de ativação, exemplificado aqui por VP16AD ou VP64AD; e um terminador, exemplificado aqui pelo terminador MT3 de Arabidopsis thaliana. E 2) o cassete de expressão para gene-alvo, que compreende diversos sítios de ligação específicos para o sTF, exemplificados aqui por oito sítios de ligação específicos para BM3R1 ou por oito sítios de ligação específicos para TetR; outro promotor de núcleo, exemplificado aqui por At-ATTI7_cp (ver Tabela 1), a região de codificação do gene-alvo, exemplificada aqui pela região de codificação de mCherry (relator de proteína fluorescente vermelha); e um terminador, exemplificado aqui pelo terminador PSBX de Arabidopsis thaliana. As regiões de codificação dos sTFs e do mCherry são otimizadas nos códons para adequarem-se ao uso de códons de Nicotiana benthamiana. Também, as versões de controle negativo (os sistemas de expressão com regiões removidas abrangendo o At-RPL41D_cp, o sTF e o terminador MT3) são construídas.

[0149] Os sistemas de expressão (e as versões de controle negativo) são clonados em um plasmídio contendo a região de codificação do marcador selecionável de planta (NptII) com promotor e terminador adequados, e as sequências para propagação em Agrobacterium tumefaciens, incluindo o marcador de seleção de canamicina. Os plasmídios são transformados em Agrobacterium tumefaciens (cepa EHA105) por eletroporação (cubetas de 2 mm; com configurações: 1,25 kV, 200 Q e 25 μF), e os transformantes são desenvolvidos na presença de canamicina e rifampicina antes da infecção das folhas de Nicotiana benthamiana. As folhas de plantas com 6 semanas de idade são infiltradas com a mistura 1:1 das culturas de Agrobacterium tumefaciens, uma com a cepa carregando o sistema de expressão e outra com uma cepa carregando um vetor de expressão para o inibidor de silenciamento de gene pós- transcricional p19 (Silhavy et al., 2002) (ambas as culturas diluídas para DO600 = 0,7 com 10 mM de MgCl2 + 10mM de MES - pH = 5,8). Os discos foliares infiltrados(correspondendo à área infiltrada) são coletados após 6 dias de incubação em uma estufa, triturados em 1xPBS, e os extratos brutos são analisados quanto à fluorescência de mCherry usando o instrumento Varioskan (Thermo Electron Corporation).Exemplo 8Teste do desempenho do sistema de expressão em algas verdes (Chlamydomonas reinhardtii)

[0150] Dois sistemas de expressão são testados em Chlamydomonas reinhardtii (Tabela 5): Os sistemas de expressão construídos em moléculas de DNA individuais compreendem dois cassetes de expressão: 1) cassete de expressão para sTF, que compreende um promotor de núcleo utilizado para o controle da expressão de sTF, exemplificado aqui com o Cr-eIF-5A_cp (Tabela 1); a versão de sTF com a proteína de ligação ao DNA, exemplificada aqui por BM3R1 ou TetR, e com o domínio de ativação, exemplificado aqui por VP16AD ou VP64AD; e um terminador, exemplificado aqui pelo terminador RPS27A de Chlamydomonas reinhardtii. E 2) o cassete de expressão para o gene-alvo, que compreende diversos sítios de ligação específicos para o sTF, exemplificados aqui por oito sítios de ligação específicos para BM3R1 ou por oito sítios de ligação específicos para TetR; outro promotor de núcleo, exemplificado aqui por Cr-RPS3A_cp (Tabela 1), a região de codificação do gene-alvo, exemplificada aqui pela região de codificação de mCherry (relator de proteína fluorescente vermelha); e um terminador, exemplificado aqui pelo terminador RBCS2 de Chlamydomonas reinhardtii. As regiões de codificação dos sTFs e do mCherry são otimizadas nos códons para se adequarem ao uso de códons de Chlamydomonas reinhardtii. Também, as versões de controle negativo (os sistemas de expressão com regiões removidas abrangendo o Cr-eIF-5A_cp, o sTF e o terminador RPS27A) são construídas.

[0151] Os sistemas de expressão (e as versões de controle negativo) são clonados no sítio Ncol do plasmídio pChlamy_4 (Invitrogen). Os plasmídios resultantes (incluindo o plasmídio pChlamy_4 não modificado), após a linearização, são transformados em Chlamydomonasreinhardtii (cepa 137c; Invitrogen). As transformações são realizadas de acordo com o protocolo no manual do Kit GeneArt Chlamydomonas Protein Expression (Invitrogen). Os transformantes são desenvolvidos no meio Gibco Tap Growth, na presença de Zeocina, e analisados quanto à fluorescência de mCherry usando o instrumento Varioskan (Thermo Electron Corporation).Exemplo 9Teste do desempenho do sistema de expressão em células CHO (Cricetulus griseus)

[0152] O sistema de expressão para Cricetulus griseus (Tabela 6) construídos em moléculas de DNA individuais compreende dois cassetes de expressão: 1)cassete de expressão para sTF, que compreende um promotor de núcleo utilizado para o controle da expressão de sTF, exemplificado aqui com o Mm-Atp5b_cp (Tabela 1); a versão de sTF com a proteína de ligação ao DNA, exemplificada aqui por BM3R1, e com o domínio de ativação, exemplificado aqui por VP64AD; e um terminador, exemplificado aqui pelo terminador INHA de Mus musculus. E 2) o cassete de expressão para o gene-alvo, que compreende diversos sítios de ligação específicos para o sTF, exemplificados aqui por oito sítios de ligação específicos para BM3R1; outro promotor de núcleo, exemplificado aqui por Mm-Eef2_cp (Tabela 1), a região de codificação do gene-alvo, exemplificada aqui pela região de codificação de mCherry (relator de proteína fluorescente vermelha); e um terminador, exemplificado aqui pelo terminador FTH1 de Mus musculus. As regiões de codificação de sTF e mCherry são otimizadas nos códons para se adequarem ao uso de códons de Cricetulus griseus. Também, as versões de controle negativo (os sistemas de expressão com regiões removidas abrangendo o Mm-Atp5b_cp, o sTF e o terminador INHA) são construídas.

[0153] O sistema de expressão (e a versão de controle negativo) é clonado entre os sítios MluI e XbaI do plasmídio pcDNA3.1 (Invitrogen). Os plasmídios resultantes são transfectados nas células de ovário de hamster chinês (CHO-K1; American Type Culture Collection (Rockville, MD)).Antes da transformação, as células CHO-K1 são cultivadas em Meio de Ham F-12K (de Kaighn) (Gibco) contendo 2 mM de L- glutamina e 1500 mg/L de bicarbonato de sódio, suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 100 U/ml de penicilina e 100 mg/ml de estreptomicina. As células são mantidas em uma atmosfera de 5% de CO2 e 90% de umidade relativa a 37 °C. Em um frasco, as células são cultivadas, divididas e 3x105 células são semeadas em placas de cultura de 6 poços e desenvolvidas em 2 ml de meio até 70% de confluência. A transfecção é feita com FuGene 6 (Roche) de acordo com as instruções do fabricante, com aproximadamente 1 μg de DNA de plasmídio adicionado por poço. As células transfectadas são deixadas continuarem a crescer por até 5 dias. A expressão de mCherry é monitorizada diariamente após a transfecção por microscopia de fluorescência.Referências da literatura:1. Hubmann G, Thevelein J, Nevoigt E (2014) Natural and Modified Promoters for Tailored Metabolic Engineering of the Yeast Saccharomyces cerevisiae. Em: Mapelli V, editor. Yeast Metabolic Engineering: Springer New York. pp. 17-42.2. Blumhoff M, Steiger MG, Marx H, Mattanovich D, Sauer M (2013) Six novel constitutive promoters for metabolic engineering of Aspergillus niger. Appl Microbiol Biotechnol 97(1):259-67.3. Ito Y, Yamanishi M, Ikeuchi A, Matsuyama T (2015) A highly tunable system for the simultaneous expression of multiple enzymes in Saccharomyces cerevisiae. ACS Synth Biol 4: 12-16.4. Pachlinger R, Mitterbauer R, Adam G, Strauss J (2005) Metabolically independent and accurately adjustable Aspergillus sp. expression system. Appl Environ Microbiol 71: 672-678.5. Silhavy D, Molnar A, Lucioli A, Szittya G, Hornyik C, Tavazza M, Burgyan J. (2002) A viral protein suppresses RNA silencing and binds silencing-generated, 21- to 25-nucleotide double-stranded RNAs. EMBO J. 21(12):3070-80. Referências de patentesUS2002081667

Claims

1. Sistema de expressão para um hospedeiro eucariótico caracterizado por compreender(a) um cassete de expressão compreendendoum promotor de núcleo, o referido promotor de núcleo sendo a única sequência reguladora para controlar a expressão de uma sequência de DNA que codifica o fator de transcrição sintético (sTF), euma sequência de DNA que codifica o fator de transcrição sintético (sTF), e(b) um ou mais cassetes de expressão compreendendo, cada um, uma sequência de DNA que codifica um produto desejado operacionalmente ligado a um promotor sintético,o referido promotor sintético compreendendo um promotor de núcleo idêntico ao promotor de núcleo de (a) ou outro promotor de núcleo, e sítios de ligação específicos para o sTF a montante do promotor de núcleo.

2. Sistema de expressão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o promotor de núcleo compreende uma sequência de DNA contendo a região 5’ a montante de um gene eucariótico, iniciando 10 - 50 pb a montante de uma sequência TATA e terminando 9 pb a montante do códon de iniciação ATG, e em que a distância entre a sequência TATA e o códon de iniciação não é maior do que 180 pb e não é menor do que 80 pb, e uma sequência de DNA na sua extremidade 3’ compreendendo 1-20 pb aleatórios.

3. Sistema de expressão, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o promotor de núcleo é um promotor de núcleo universal (UCP) funcional em diversos organismos eucarióticos.

4. Sistema de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o referido fator de transcrição sintético (sTF) compreende um regulador de transcrição procariótico, um sinal de localização nuclear, e um domínio de ativação da transcrição.

5. Sistema de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o hospedeiro eucariótico é selecionado a partir do grupo que consiste em espécies fúngicas, incluindo levedura e fungos filamentosos, espécies de plantas, incluindo angiospermas e espécies de algas verdes, e espécies animais.

6. Método para produzir um produto proteico desejado em um hospedeiro eucariótico caracterizado por compreender cultivar um hospedeiro eucariótico não-humano compreendendo o sistema de expressão, conforme definido na reivindicação 1 a 5, sob condições de cultivo adequadas.