BR112018013007B1

BR112018013007B1 - METHOD FOR EXPRESSING A PROTEIN, AND COMPOSITION FOR PREVENTING INFECTION BY PORcine CIRCOVIRUS TYPE 2 (PCV2)

Info

Publication number: BR112018013007B1
Application number: BR112018013007-9A
Authority: BR
Inventors: Jiunn-Horng Lin; Zeng-Weng CHEN; Jyh-Perng WANG; Tzu-Ting Peng; Weng-Zeng Huang; Shih-Rong WANG; Cheng-Yao YANG; Huei-Yu LEE
Original assignee: Agricultural Technology Research Institute
Filing date: 2015-12-28
Publication date: 2023-08-01

Abstract

MÉTODO PARA EXPRESSAR UMA PROTEÍNA, E COMPOSIÇÃO PARA PREVENIR INFECÇÃO POR CIRCOVÍRUS SUÍNO TIPO 2 (PCV2). A presente invenção refere-se a um método de preparação de uma proteína do capsídeo do PCV2 e uma composição farmacêutica contendo referida proteína do capsídeo. O método da presente invenção usa um novo vetor de expressão induzido por arabinose e, assim, melhora a eficácia da síntese de referida proteína do capsídeo do PCV2. Por outro lado, a presente composição farmacêutica combina referida proteína do capsídeo e outros componentes favoráveis em uma razão apropriada de modo a alcançar excelentes efeitos indutores de imunidade.METHOD FOR EXPRESSING A PROTEIN, AND COMPOSITION FOR PREVENTING INFECTION BY PORcine CIRCOVIRUS TYPE 2 (PCV2). The present invention relates to a method of preparing a PCV2 capsid protein and a pharmaceutical composition containing said capsid protein. The method of the present invention uses a new expression vector induced by arabinose and thus improves the efficiency of the synthesis of said PCV2 capsid protein. On the other hand, the present pharmaceutical composition combines said capsid protein and other favorable components in an appropriate ratio so as to achieve excellent immunity-inducing effects.

Description

BASICS OF THE INVENTION FIELD OF INVENTION

[0001] A presente invenção refere-se a um método de preparação de proteína do capsídeo do PCV2, particularmente a um método de preparação de proteína do capsídeo do PCV2 usando um sistema de expressão de célula procariótica.[0001] The present invention relates to a method of preparing PCV2 capsid protein, particularly to a method of preparing PCV2 capsid protein using a prokaryotic cell expression system.

DESCRIPTION OF THE PRIOR ART

[0002] Circovírus suíno tipo 2 (PCV2) é um patógeno viral que afeta amplamente a indústria mundial de criação de suínos. PCV2 causa principalmente síndrome definhante multissistêmica dos suínos desmamados (PMWS), cujos sintomas são febre, linfadenopatia, perda de peso ou fraqueza, dificuldade respiratória, diarreia, palidez corporal, ocasionalmente icterícia, etc. Ele também pode causar, nos suínos, dermatite e síndrome de nefropatia (PDNS), tremor congênito infeccioso (ICT) e distúrbios de reprodução. Além disso, infecção por PCV2 em combinação com outros patógenos virais ou bacterianos provoca o complexo de doença respiratória suína (PRDC). A doença causada por infecção por PCV2 em suínos resulta em uma diminuição na taxa de sobrevivência e na taxa de conversão de alimentos, levando a graves perdas econômicas para os produtores de suínos.[0002] Porcine circovirus type 2 (PCV2) is a viral pathogen that widely affects the global pig farming industry. PCV2 mainly causes multisystemic wasting syndrome of weaned pigs (PMWS), whose symptoms are fever, lymphadenopathy, weight loss or weakness, respiratory distress, diarrhea, body pallor, occasionally jaundice, etc. It can also cause, in pigs, dermatitis and nephropathy syndrome (PDNS), infectious congenital tremor (ICT) and reproductive disorders. Furthermore, PCV2 infection in combination with other viral or bacterial pathogens causes porcine respiratory disease complex (PRDC). Disease caused by PCV2 infection in pigs results in a decrease in survival rate and feed conversion rate, leading to serious economic losses for pig producers.

[0003] Vinte pontos de alimentação e manejo para prevenção e controle de PCV2 no campo são propostos, como a estratégia ‘todos dentro-todos fora’ (AIAO), boa gestão de higiene, eliminação ou segregação de porcos com doença grave e vacinação. Entre estes, a vacinação pode efetivamente reduzir a taxa de infecção por PCV2 e ainda aumentar a taxa de sobrevivência. Vacinas atuais para PCV2 no campo são divididas em três categorias, incluindo vacinas inativadas para PCV2, vacinas de subunidade inativadas de baculovírus, e vacinas inativadas de vírus quimérico PCV1-PCV2 (Beach e Meng, 2012; Chanhee, 2012).[0003] Twenty feeding and management points for prevention and control of PCV2 in the field are proposed, such as the 'all in-all out' (AIAO) strategy, good hygiene management, elimination or segregation of pigs with serious disease and vaccination. Among these, vaccination can effectively reduce the PCV2 infection rate and even increase the survival rate. Current PCV2 vaccines in the field are divided into three categories, including inactivated PCV2 vaccines, inactivated baculovirus subunit vaccines, and inactivated PCV1-PCV2 chimeric virus vaccines (Beach and Meng, 2012; Chanhee, 2012).

[0004] Vacina inativada de PCV2 é produzida infectando a linhagem de células de rim suíno PK-15 com PCV2, coletando o vírus, inativando o vírus e misturando o vírus com adjuvante. Para vacinas de subunidade inativadas de baculovírus, células de inseto são transfectadas com baculovírus carreando gene ORF2 codificando a proteína do capsídeo do PCV2 para expressar antígeno ORF2. Se o antígeno for expressado em uma célula, a vacina é preparada esmagando ultrassonicamente o meio de cultura contendo as células, inativando o vírus e misturando o vírus com o adjuvante. Se o antígeno for secretado no meio extracelular, a vacina é preparada coletando o sobrenadante de cultura de células, inativando o vírus e misturando o vírus com adjuvante. As vacinas inativadas de vírus quimérico PCV1-PCV2 são preparadas substituindo ORF2 de PCV1 por ORF2 de PCV2, infectando células, coletando o vírus, inativando o vírus e misturando o vírus com adjuvante.[0004] Inactivated PCV2 vaccine is produced by infecting the PK-15 porcine kidney cell line with PCV2, harvesting the virus, inactivating the virus and mixing the virus with adjuvant. For inactivated baculovirus subunit vaccines, insect cells are transfected with baculovirus carrying the ORF2 gene encoding the PCV2 capsid protein to express ORF2 antigen. If the antigen is expressed in a cell, the vaccine is prepared by ultrasonically crushing the culture medium containing the cells, inactivating the virus, and mixing the virus with the adjuvant. If the antigen is secreted into the extracellular medium, the vaccine is prepared by collecting cell culture supernatant, inactivating the virus, and mixing the virus with adjuvant. Inactivated PCV1-PCV2 chimeric virus vaccines are prepared by replacing PCV1 ORF2 with PCV2 ORF2, infecting cells, harvesting the virus, inactivating the virus, and mixing the virus with adjuvant.

[0005] Em vista do fato de que os métodos atuais de produção de vacinas de PCV2 são, todos, baseados no método de cultura de vírus, esses métodos apresentam as desvantagens de um longo tempo de preparação e custo elevado de produção. Para reduzir o custo de vacinas de PCV2, pesquisadores no campo tentaram usar E. coli recombinante com menor custo de cultura para a produção de um antígeno de vacina ORF2. No entanto, o método apresenta questões de baixa produção de ORF2, incapacidade de formar partículas tipo vírus do ORF2 recombinante, processos complicados, ou baixa imunidade.[0005] In view of the fact that current PCV2 vaccine production methods are all based on the virus culture method, these methods have the disadvantages of a long preparation time and high production cost. To reduce the cost of PCV2 vaccines, researchers in the field have attempted to use recombinant E. coli with lower culture costs for the production of an ORF2 vaccine antigen. However, the method presents issues of low ORF2 production, inability to form recombinant ORF2 virus-like particles, complicated processes, or low immunity.

SUMMARY OF THE INVENTION

[0006] Assim, é um objeto da presente invenção fornecer um método de preparação de proteína do capsídeo do PCV2 para reduzir o tempo de produção e custo da vacina de PCV2.[0006] Therefore, it is an object of the present invention to provide a method of preparing PCV2 capsid protein to reduce the production time and cost of the PCV2 vaccine.

[0007] Outro objeto da presente invenção consiste em fornecer uma composição para prevenir infecção por PCV2. A composição usa proteína do capsídeo do PCV2 como um componente ativo e contém um adjuvante apropriado para fornecer uma ferramenta para a prevenção de infecção por PCV2 para a indústria.[0007] Another object of the present invention is to provide a composition for preventing PCV2 infection. The composition uses PCV2 capsid protein as an active component and contains an appropriate adjuvant to provide a tool for the prevention of PCV2 infection for industry.

[0008] Outro objeto da presente invenção é fornecer um método de preparação de interferon suíno para reduzir o tempo de produção e custo de interferon suíno e para facilitar a aplicação de interferon suíno em uma composição para prevenir infecção por PCV2.[0008] Another object of the present invention is to provide a method of preparing porcine interferon to reduce the production time and cost of porcine interferon and to facilitate the application of porcine interferon in a composition for preventing PCV2 infection.

[0009] Para alcançar os objetos acima, a presente invenção fornece um método para expressar uma proteína, compreendendo: (a) obter um vetor de expressão induzido por arabinose, em que o vetor de expressão induzido por arabinose compreende um elemento de expressão e uma sequência de nucleotídeo codificando uma proteína alvo; em que o elemento de expressão compreende: um promotor; um elemento intensificador da tradução de fago T7 tendo SEQ ID NO: 01; e um sítio de ligação do ribossomo tendo SEQ ID NO: 02; (b) transformar o vetor de expressão induzido por arabinose em um hospedeiro de E. coli e induzir a expressão de uma proteína alvo; em que a proteína alvo é proteína do capsídeo do PCV2 ou interferon suíno.[0009] To achieve the above objects, the present invention provides a method for expressing a protein, comprising: (a) obtaining an arabinose-induced expression vector, wherein the arabinose-induced expression vector comprises an expression element and a nucleotide sequence encoding a target protein; wherein the expression element comprises: a promoter; a T7 phage translation enhancer element having SEQ ID NO: 01; and a ribosome binding site having SEQ ID NO: 02; (b) transforming the arabinose-induced expression vector into an E. coli host and inducing expression of a target protein; wherein the target protein is PCV2 capsid protein or porcine interferon.

[00010] Preferivelmente, o sítio -16 do promotor tem SEQ ID NO: 03.[00010] Preferably, the -16 site of the promoter has SEQ ID NO: 03.

[00011] Preferivelmente, o elemento de expressão tem SEQ ID NO: 04.[00011] Preferably, the expression element has SEQ ID NO: 04.

[00012] Preferivelmente, o vetor de expressão induzido por arabinose compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeo codificando um parceiro de fusão, e/ou uma sequência de nucleotídeo codificando uma molécula marcadora. Preferivelmente, o parceiro de fusão é MsyB de E. coli, YjgD de E. coli, proteína D de fago Lambda, proteína SUMO de fermento de padaria, ou uma combinação dos mesmos. Preferivelmente, a molécula marcadora é: etiqueta His, etiqueta Strep II, etiqueta FLAG, ou uma combinação das mesmas.[00012] Preferably, the arabinose-induced expression vector additionally comprises a nucleotide sequence encoding a fusion partner, and/or a nucleotide sequence encoding a marker molecule. Preferably, the fusion partner is E. coli MsyB, E. coli YjgD, Lambda phage D protein, baker's yeast SUMO protein, or a combination thereof. Preferably, the marker molecule is: His tag, Strep II tag, FLAG tag, or a combination thereof.

[00013] Preferivelmente, a proteína alvo é proteína do capsídeo do PCV2 codificada de SEQ ID NO: 09 ou SEQ ID NO: 24. Preferivelmente, o vetor de expressão induzido por arabinose tem SEQ ID NO: 46.[00013] Preferably, the target protein is PCV2 capsid protein encoded by SEQ ID NO: 09 or SEQ ID NO: 24. Preferably, the arabinose-induced expression vector has SEQ ID NO: 46.

[00014] Preferivelmente, o interferon suíno é interferon-α suíno ou interferon-Y suíno. Preferivelmente, a proteína alvo é interferon suíno, e o interferon suíno codificado de SEQ ID NO: 64 ou SEQ ID NO: 76. Preferivelmente, o vetor de expressão induzido por arabinose tem SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 87, ou SEQ ID NO: 95. Preferivelmente, o método não compreende uma etapa de re-enovelamento do interferon suíno.[00014] Preferably, the porcine interferon is porcine interferon-α or porcine interferon-Y. Preferably, the target protein is porcine interferon, and the porcine interferon encoded by SEQ ID NO: 64 or SEQ ID NO: 76. Preferably, the arabinose-inducible expression vector has SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 87, or SEQ ID NO: 95. Preferably, the method does not comprise a porcine interferon refolding step.

[00015] Preferivelmente, o método compreende adicionalmente uma etapa (c), após a etapa (b): purificar a proteína alvo. Preferivelmente, o método compreende adicionalmente uma etapa (d) após a etapa (c): tratar a proteína alvo com uma SUMO protease. Preferivelmente, na etapa (d), a razão em peso da proteína alvo para a SUMO protease é 4 a 20.[00015] Preferably, the method additionally comprises a step (c), after step (b): purifying the target protein. Preferably, the method further comprises a step (d) after step (c): treating the target protein with a SUMO protease. Preferably, in step (d), the weight ratio of the target protein to the SUMO protease is 4 to 20.

[00016] A presente invenção fornece adicionalmente uma composição para prevenir infecção por PCV2, compreendendo: 2,5 a 250 μg/mL de proteína do capsídeo do PCV2; 2,5 a 25 μg/mL de interferon-α suíno; 2,5 a 25 μg/mL de interferon-Y suíno; e um carreador farmaceuticamente aceitável.[00016] The present invention further provides a composition for preventing PCV2 infection, comprising: 2.5 to 250 μg/mL of PCV2 capsid protein; 2.5 to 25 μg/mL porcine interferon-α; 2.5 to 25 μg/mL of porcine interferon-Y; and a pharmaceutically acceptable carrier.

[00017] Preferivelmente, a composição compreende adicionalmente um adjuvante farmaceuticamente aceitável. Preferivelmente, o adjuvante farmaceuticamente aceitável é: adjuvante MONTANIDETM ISA 536 VG, adjuvante MONTANIDETM GEL 01, adjuvante completo ou incompleto de Freund, gel de alumínio, tensoativo, polímeros polianiônicos, peptídeos, emulsões de óleo, ou uma combinação dos mesmos.[00017] Preferably, the composition additionally comprises a pharmaceutically acceptable adjuvant. Preferably, the pharmaceutically acceptable adjuvant is: MONTANIDETM ISA 536 VG adjuvant, MONTANIDETM GEL 01 adjuvant, complete or incomplete Freund's adjuvant, aluminum gel, surfactant, polyanionic polymers, peptides, oil emulsions, or a combination thereof.

[00018] Preferivelmente, a composição compreende: 3,5 a 170 μg/mL de proteína do capsídeo do PCV2; 5 a 20 μg/mL de interferon-α suíno; 5 a 20 μg/mL de interferon-Y suíno; e um carreador farmaceuticamente aceitável.[00018] Preferably, the composition comprises: 3.5 to 170 μg/mL of PCV2 capsid protein; 5 to 20 μg/mL of porcine interferon-α; 5 to 20 μg/mL of porcine interferon-Y; and a pharmaceutically acceptable carrier.

[00019] Em resumo, a presente invenção fornece, principalmente, um método para expressar uma proteína usando um vetor de expressão induzido por arabinose. O método da presente invenção facilita, de modo eficaz, a síntese de proteína do capsídeo do PCV2 e interferon suíno usados como um adjuvante em vacina. Por outro lado, a composição farmacêutica da presente invenção combina a proteína do capsídeo e outros componentes vantajosos em uma razão apropriada para alcançar um excelente efeito indutor da imunogenicidade. Assim, a divulgação da presente invenção apresenta benefícios significantes para a prevenção e o tratamento de PCV2 no campo.[00019] In summary, the present invention mainly provides a method for expressing a protein using an arabinose-induced expression vector. The method of the present invention effectively facilitates the synthesis of PCV2 capsid protein and porcine interferon used as a vaccine adjuvant. On the other hand, the pharmaceutical composition of the present invention combines capsid protein and other advantageous components in an appropriate ratio to achieve an excellent immunogenicity-inducing effect. Thus, the disclosure of the present invention presents significant benefits for the prevention and treatment of PCV2 in the field.

BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[00020] Figura 1 é um diagrama esquemático de cinco vetores de expressão de proteínas do capsídeo do PCV2 preparadas no Exemplo 1.[00020] Figure 1 is a schematic diagram of five PCV2 capsid protein expression vectors prepared in Example 1.

[00021] Figura 2 mostra os resultados de expressão de proteína dos cinco vetores de expressão obtidos no Exemplo 1 em hospedeiros de E. coli após transformação dos mesmos usando eletroforese de proteína e western blot. (A) Resultados de eletroforese de proteína. (B) Resultados de western blot; trilha 1: BL21(DE3)/pET29a; trilha 2: BL21(DE3)/pET-SUMO-ORF2; trilha 3: BL21(DE3)/pET-OPTSUMO-ORF2; trilha 4: Rosetta2/pET-SUMO-ORF2; trilha 5: BL21(DE3)/pET-SUMO-OPTORF2; trilha 6: BL21(DE3)/pET-OPTSUMO-OPTORF2; trilha 7: BL21/pBA-OPTSUMO-OPTORF2.[00021] Figure 2 shows the protein expression results of the five expression vectors obtained in Example 1 in E. coli hosts after their transformation using protein electrophoresis and western blot. (A) Protein electrophoresis results. (B) Western blot results; track 1: BL21(DE3)/pET29a; track 2: BL21(DE3)/pET-SUMO-ORF2; track 3: BL21(DE3)/pET-OPTSUMO-ORF2; track 4: Rosetta2/pET-SUMO-ORF2; track 5: BL21(DE3)/pET-SUMO-OPTORF2; track 6: BL21(DE3)/pET-OPTSUMO-OPTORF2; track 7: BL21/pBA-OPTSUMO-OPTORF2.

[00022] Figura 3 mostra solubilidade das proteínas de fusão expressadas pelos quatro vetores de expressão obtidos em Exemplo 1 em hospedeiros de E. coli após transformação dos mesmos usando eletroforese de proteína. T: lisado de célula total; S: fração de proteína solúvel; IS: fração de proteína insolúvel. As setas indicam as proteínas alvo.[00022] Figure 3 shows solubility of the fusion proteins expressed by the four expression vectors obtained in Example 1 in E. coli hosts after transformation thereof using protein electrophoresis. T: whole cell lysate; S: soluble protein fraction; IS: insoluble protein fraction. Arrows indicate target proteins.

[00023] Figura 4 mostra um eletroforetograma de proteínas expressadas por BL21 (DE3) de E. coli abrigando plasmídeo pBA-OPTSUMO-OPTORF2 e purificação de proteína por cromatografia de afinidade de íon metálico imobilizado. Trilha 1: lisado de célula total de BL21de E. coli (pBA-OPTSUMO-OPTORF2); trilha 2: proteína de fusão purificada.[00023] Figure 4 shows an electrophoretogram of proteins expressed by BL21 (DE3) of E. coli harboring plasmid pBA-OPTSUMO-OPTORF2 and protein purification by immobilized metal ion affinity chromatography. Lane 1: E. coli BL21 whole cell lysate (pBA-OPTSUMO-OPTORF2); lane 2: purified fusion protein.

[00024] Figura 5 mostra os resultados de expressão de proteína da SUMO protease recombinante (SUMOPH) e da D-SUMO protease recombinante (DSUMOPH) em células hospedeiras [BL21 (DE3) de E. coli] em Exemplo 2 usando eletroforese de proteína e western blot. (A) Resultados de eletroforese de proteína. (B) Resultados de western blot. T: lisado de célula total; S: fração de proteína solúvel; IS: fração de proteína insolúvel. As setas indicam as proteínas alvo.[00024] Figure 5 shows the protein expression results of recombinant SUMO protease (SUMOPH) and recombinant D-SUMO protease (DSUMOPH) in host cells [E. coli BL21 (DE3)] in Example 2 using protein electrophoresis and western blot. (A) Protein electrophoresis results. (B) Western blot results. T: whole cell lysate; S: soluble protein fraction; IS: insoluble protein fraction. Arrows indicate target proteins.

[00025] Figura 6 mostra um eletroforetograma de proteínas expressadas por BL21 (DE3) de E. coli abrigando plasmídeos pET-SUMOPH e pET-D-SUMOPH e purificação de proteína por cromatografia de afinidade de íon metálico imobilizado. Trilha 1: SUMO protease purificada (SUMOPH); trilha 2: D-SUMO protease purificada (DSUMOPH).[00025] Figure 6 shows an electrophoretogram of proteins expressed by BL21 (DE3) of E. coli harboring pET-SUMOPH and pET-D-SUMOPH plasmids and protein purification by immobilized metal ion affinity chromatography. Track 1: purified SUMO protease (SUMOPH); lane 2: purified D-SUMO protease (DSUMOPH).

[00026] Figura 7 mostra um eletroforetograma de SUMO-ORF2 purificada, SUMO-ORF2 digerida e ORF2 purificada. Trilha 1: proteína de fusão SUMO-ORF2 purificada. Trilha 2: mistura de clivagem de SUMO-ORF2 com D-SUMO protease. Trilha 3: ORF2 purificada (mistura de clivagem filtrada com uma membrana de corte de peso molecular de 100 kDa).[00026] Figure 7 shows an electrophoretogram of purified SUMO-ORF2, digested SUMO-ORF2 and purified ORF2. Lane 1: Purified SUMO-ORF2 fusion protein. Lane 2: SUMO-ORF2 cleavage mixture with D-SUMO protease. Lane 3: Purified ORF2 (cleavage mixture filtered with a 100 kDa molecular weight cutoff membrane).

[00027] Figura 8 mostra imagens de microscópio eletrônico de transmissão de partículas tipo vírus de proteína de fusão SUMO-ORF2 (A), SUMO-ORF2 digerida (proteína de fusão SUMO-ORF2 clivada por protease) (B), ORF2 purificada (C).[00027] Figure 8 shows transmission electron microscope images of virus-like particles of SUMO-ORF2 fusion protein (A), digested SUMO-ORF2 (protease-cleaved SUMO-ORF2 fusion protein) (B), purified ORF2 (C ).

[00028] Figura 9 mostra eletroforetogramas de expressão de proteína de interferon recombinante suíno em Exemplo 3; T: lisado de célula total; S: fração de proteína solúvel. (A) pET-OPTPIFNAH / Shuffle de E. coli; (B) pBA-OPTPIFNAH / Shuffle de E. coli; (C) pET-SUMO-OPTPIFNAH / Shuffle de E. coli; (D) pET-OPTSUMO-OPTPIFNAH / Shuffle de E. coli; (E) pBA-OPTSUMO-OPTPIFNAH / Shuffle de E. coli; (F) pET-OPTPIFNRH / BL21 de E. coli (DE3); (G) pET-SUMO-OPTPIFNRH / BL21 (DE3) de E. coli; (H) pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH / BL21(DE3) de E. coli; (I) pBA-OPTSUMO-OPTPIFNRH / BL21(DE3) de E. coli. As setas indicam as proteínas alvo.[00028] Figure 9 shows electrophoretograms of porcine recombinant interferon protein expression in Example 3; T: whole cell lysate; S: soluble protein fraction. (A) pET-OPTPIFNAH/Shuffle from E. coli; (B) pBA-OPTPIFNAH/Shuffle from E. coli; (C) pET-SUMO-OPTPIFNAH/Shuffle from E. coli; (D) pET-OPTSUMO-OPTPIFNAH / E. coli Shuffle; (E) pBA-OPTSUMO-OPTPIFNAH / E. coli Shuffle; (F) pET-OPTPIFNRH/BL21 from E. coli (DE3); (G) pET-SUMO-OPTPIFNRH/BL21 (DE3) from E. coli; (H) pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH / BL21(DE3) from E. coli; (I) pBA-OPTSUMO-OPTPIFNRH / BL21(DE3) from E. coli. Arrows indicate target proteins.

[00029] Figura 10 mostra eletroforetogramas de interferon recombinante suíno purificado expressado em Exemplo 3. Trilha 1: proteína de fusão purificada expressada por Shuffle de E. coli (pET-OPTPIFNAH); trilha 2: proteína de fusão expressada por Shuffle de E. coli (pBA-OPTSUMO-OPTPIFNAH) após ser clivada por D-SUMO protease [pET- D-SUMOP / ruptura de células de BL21(DE3) de E. coli] e purificada; trilha 3: proteína de fusão expressada por E. coli BL21(DE3) (pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH) após ser clivada por D-SUMO protease [pET-D-SUMOP / ruptura de células de BL21(DE3) de E. coli] e purificada.[00029] Figure 10 shows electrophoretograms of purified porcine recombinant interferon expressed in Example 3. Track 1: purified fusion protein expressed by E. coli Shuffle (pET-OPTPIFNAH); lane 2: fusion protein expressed by E. coli Shuffle (pBA-OPTSUMO-OPTPIFNAH) after being cleaved by D-SUMO protease [pET- D-SUMOP / E. coli BL21(DE3) cell rupture] and purified ; lane 3: fusion protein expressed by E. coli BL21(DE3) (pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH) after being cleaved by D-SUMO protease [pET-D-SUMOP / E. coli BL21(DE3) cell rupture] and purified.

[00030] Figura 11 mostra os resultados de ELISA de títulos de anticorpo anti-PCV2 em porcos induzidos pelas amostras de Experimento 3 in Exemplo 4.[00030] Figure 11 shows the ELISA results of anti-PCV2 antibody titers in pigs induced by the samples from Experiment 3 in Example 4.

[00031] Figura 12 mostra o nível de viremia reduzido em porcos pelas amostras de Experimento 3 em Exemplo 4.[00031] Figure 12 shows the level of viremia reduced in pigs by samples from Experiment 3 in Example 4.

[00032] Figura 13 mostra os resultados de ELISA de títulos de anticorpo anti-PCV2 em porcos induzidos pelas amostras de Experimento 4 em Exemplo 4.[00032] Figure 13 shows the ELISA results of anti-PCV2 antibody titers in pigs induced by the samples from Experiment 4 in Example 4.

[00033] Figura 14 mostra o nível de viremia reduzido em porcos pelas amostras de Experimento 4 em Exemplo 4.[00033] Figure 14 shows the level of viremia reduced in pigs by samples from Experiment 4 in Example 4.

[00034] Figura 15 mostra os resultados de ELISA de títulos de anticorpo anti-PCV2 em porcos induzidos pelas amostras de Experimento 5 em Exemplo 4.[00034] Figure 15 shows the ELISA results of anti-PCV2 antibody titers in pigs induced by the samples from Experiment 5 in Example 4.

DETAILED DESCRIPTION OF MODALITIES

[00035] Como descrito acima, embora tenham sido realizadas tentativas no campo para produzir proteína do capsídeo do PCV2 através do sistema de expressão de E. coli, como na época da presente invenção, as desvantagens de baixos rendimentos ainda não foram superadas. Portanto, existem obstáculos ao progresso da prevenção da epidemia de PCV2.[00035] As described above, although attempts have been made in the field to produce PCV2 capsid protein through the E. coli expression system, as at the time of the present invention, the disadvantages of low yields have not yet been overcome. Therefore, there are obstacles to the progress of PCV2 epidemic prevention.

[00036] O método da presente invenção usa o elemento de expressão induzindo arabinose, divulgado pelos requerentes da presente invenção no pedido de patente de Taiwan No. 103146225 (data de depósito: 30 de dezembro de 2014) para preparar as proteínas do capsídeo do PCV2. O conteúdo completo do pedido de patente de Taiwan No. 103146225 é incorporado na presente invenção como referência.[00036] The method of the present invention uses the arabinose-inducing expression element disclosed by the applicants of the present invention in Taiwan patent application No. 103146225 (filing date: December 30, 2014) to prepare PCV2 capsid proteins . The entire contents of Taiwan patent application No. 103146225 are incorporated into the present invention by reference.

[00037] Como usado aqui, "uma proteína alvo" refere-se a uma proteína que se destina a ser expressada por um sistema de expressão procariótico. Na presente invenção, a proteína alvo acima mencionada é uma proteína do capsídeo do PCV2, interferon-α suíno, ou interferon-Y suíno.[00037] As used herein, "a target protein" refers to a protein that is intended to be expressed by a prokaryotic expression system. In the present invention, the aforementioned target protein is a PCV2 capsid protein, porcine interferon-α, or porcine interferon-Y.

[00038] Como usado aqui, "sequência de nucleotídeos codificando uma proteína alvo" ou outra descrição similar refere-se a uma sequência de nucleotídeo que pode formar a proteína alvo acima mencionada por um mecanismo de transcrição/tradução in vivo ou in vitro. Consequentemente, a "sequência de nucleotídeos codificando proteína do capsídeo do PCV2" ou "sequência de nucleotídeos codificando interferon suíno" da presente invenção é também definido como acima. Similarmente, a "sequência de nucleotídeos codificando o parceiro de fusão" ou a "sequência de nucleotídeos codificando a molécula marcadora" da presente invenção são também definidas como acima.[00038] As used herein, "nucleotide sequence encoding a target protein" or other similar description refers to a nucleotide sequence that can form the aforementioned target protein by an in vivo or in vitro transcription/translation mechanism. Accordingly, the "nucleotide sequence encoding PCV2 capsid protein" or "nucleotide sequence encoding porcine interferon" of the present invention is also defined as above. Similarly, the "nucleotide sequence encoding the fusion partner" or the "nucleotide sequence encoding the marker molecule" of the present invention are also defined as above.

[00039] Como usado aqui, "parceiro de fusão" refere-se a uma molécula que é usada para aumentar a solubilidade de uma proteína alvo sintetizada acima mencionada. Para os fins acima, a sequência de nucleotídeos codificando um parceiro de fusão e a sequência de nucleotídeos codificando uma proteína alvo acima mencionada são construídas no mesmo vetor de expressão por um método de engenharia genética, de modo que a proteína alvo acima mencionada é sintetizada com o parceiro de fusão acima mencionado como uma proteína de fusão. O parceiro de fusão acima mencionada é, por exemplo mas não limitado a, MsyB de E. coli, YjgD de E. coli, proteína D de fago Lambda, proteína SUMO de fermento de padaria, ou uma combinação dos mesmos.[00039] As used herein, "fusion partner" refers to a molecule that is used to increase the solubility of an aforementioned synthesized target protein. For the above purposes, the nucleotide sequence encoding a fusion partner and the nucleotide sequence encoding an above-mentioned target protein are constructed into the same expression vector by a genetic engineering method, so that the above-mentioned target protein is synthesized with the aforementioned fusion partner as a fusion protein. The aforementioned fusion partner is, for example but not limited to, E. coli MsyB, E. coli YjgD, Lambda phage D protein, baker's yeast SUMO protein, or a combination thereof.

[00040] Como usado aqui, "molécula marcadora" refere-se a uma molécula que facilita a observação da síntese da proteína alvo acima mencionada ou facilita a purificação da proteína alvo acima mencionada. Para os fins acima, a sequência de nucleotídeos de uma molécula marcadora e a sequência de nucleotídeos da proteína alvo acima mencionada são construídas no mesmo vetor de expressão em um método de engenharia genética, de modo que a proteína alvo acima mencionada é sintetizada com a molécula marcadora acima mencionada como uma proteína de fusão. A molécula marcadora acima mencionada é, por exemplo mas não limitada a, uma etiqueta His, uma etiqueta Strep II, uma etiqueta FLAG, ou uma combinação das mesmas.[00040] As used herein, "marker molecule" refers to a molecule that facilitates the observation of the synthesis of the aforementioned target protein or facilitates the purification of the aforementioned target protein. For the above purposes, the nucleotide sequence of a marker molecule and the nucleotide sequence of the above-mentioned target protein are constructed in the same expression vector in a genetic engineering method, so that the above-mentioned target protein is synthesized with the molecule aforementioned marker as a fusion protein. The aforementioned tag molecule is, for example but not limited to, a His tag, a Strep II tag, a FLAG tag, or a combination thereof.

[00041] O primeiro aspecto da presente invenção é relacionado com um método para preparar uma proteína do capsídeo do PCV2, interferon-α suíno, ou interferon—Y suíno. O método acima mencionado compreende (a) obter um vetor de expressão induzido por arabinose, em que o vetor de expressão induzido por arabinose compreende um elemento de expressão e uma sequência de nucleotídeo codificando uma proteína alvo; e (b) transformar o vetor de expressão induzido por arabinose em um hospedeiro de E. coli para induzir expressão da proteína alvo.[00041] The first aspect of the present invention relates to a method for preparing a PCV2 capsid protein, porcine interferon-α, or porcine interferon-Y. The above-mentioned method comprises (a) obtaining an arabinose-induced expression vector, wherein the arabinose-induced expression vector comprises an expression element and a nucleotide sequence encoding a target protein; and (b) transforming the arabinose-induced expression vector into an E. coli host to induce expression of the target protein.

[00042] Em uma modalidade alternativa, a proteína alvo acima mencionada é uma proteína do capsídeo do PCV2. Em uma modalidade alternativa, a proteína alvo acima mencionada é interferon-α suíno ou interferon-Y suíno.[00042] In an alternative embodiment, the aforementioned target protein is a PCV2 capsid protein. In an alternative embodiment, the aforementioned target protein is porcine interferon-α or porcine interferon-Y.

[00043] Em uma modalidade preferida, os elementos de expressão acima mencionados são descritos no pedido de patente de Taiwan No. 103146225 (data de depósito: 30 de dezembro de 2014) pelos requerentes da presente invenção. Especificamente, o elemento de expressão acima mencionado compreende: um promotor; um elemento intensificador da tradução de fago T7; e um sítio de ligação de ribossomo. Por exemplo, o elemento de desempenho acima mencionado é o elemento de expressão araB-M11 descrito no pedido de patente de Taiwan No. 103146225.[00043] In a preferred embodiment, the above-mentioned expression elements are described in Taiwan patent application No. 103146225 (filing date: December 30, 2014) by the applicants of the present invention. Specifically, the aforementioned expression element comprises: a promoter; a T7 phage translation enhancer element; and a ribosome binding site. For example, the above-mentioned performance element is the araB-M11 expression element described in Taiwan patent application No. 103146225.

[00044] Em uma modalidade preferida, o elemento intensificador da tradução de fago T7 acima mencionado tem SEQ ID NO: 01. Em uma modalidade preferida, o sítio de ligação de ribossomo acima mencionado tem SEQ ID NO: 02. Em uma modalidade preferida, o sítio -16 do promotor acima mencionado tem SEQ ID NO: 03. Em uma modalidade preferida, o elemento de expressão acima mencionado tem SEQ ID NO: 04.[00044] In a preferred embodiment, the above-mentioned T7 phage translation enhancer element has SEQ ID NO: 01. In a preferred embodiment, the above-mentioned ribosome binding site has SEQ ID NO: 02. In a preferred embodiment, the -16 site of the above-mentioned promoter has SEQ ID NO: 03. In a preferred embodiment, the above-mentioned expression element has SEQ ID NO: 04.

[00045] Em uma modalidade alternativa, a etapa acima mencionada (b) é seguida adicionalmente por uma etapa (c) de purificação da proteína alvo acima mencionada. Quando uma etiqueta His é usada como a molécula marcadora no método da presente invenção, a proteína alvo pode ser purificada por cromatografia de afinidade de íon metálico imobilizado.[00045] In an alternative embodiment, the aforementioned step (b) is additionally followed by a step (c) of purifying the aforementioned target protein. When a His tag is used as the tag molecule in the method of the present invention, the target protein can be purified by immobilized metal ion affinity chromatography.

[00046] Em uma modalidade alternativa, quando a proteína SUMO é usada como o parceiro de fusão acima mencionado no método da presente invenção, uma etapa (d) é incluída adicionalmente após a etapa acima mencionada (c): a proteína alvo é tratada com uma SUMO protease. O "tratado" acima mencionados refere-se a que o parceiro de fusão SUMO é cortado pela SUMO protease de modo que a proteína alvo é separada da proteína SUMO.[00046] In an alternative embodiment, when the SUMO protein is used as the above-mentioned fusion partner in the method of the present invention, a step (d) is additionally included after the above-mentioned step (c): the target protein is treated with a SUMO protease. The aforementioned "treaty" refers to that the SUMO fusion partner is cleaved by the SUMO protease so that the target protein is separated from the SUMO protein.

[00047] Em uma modalidade alternativa, a SUMO protease é produzida por um vetor de expressão T7. Em uma modalidade preferida, no tratamento acima mencionado, a razão em peso da proteína alvo para a SUMO protease é 4 a 20.[00047] In an alternative embodiment, the SUMO protease is produced by a T7 expression vector. In a preferred embodiment, in the above-mentioned treatment, the weight ratio of the target protein to the SUMO protease is 4 to 20.

[00048] Em uma modalidade preferida, o método acima mencionado não inclui uma etapa de re-enovelamento do interferon suíno. Uma pessoa versada na técnica pode entender que a “etapa de re-enovelamento” em um sistema de expressão de célula procariótica significa o processo de formar uma estrutura terciária ou uma estrutura quaternária de um polipeptídeo por dissolução do corpo de inclusão usando ureia ou cloridrato de guanidíneo e, então, re-enovelando o polipeptídeo resultante por diálise e outras etapas. Assim, os versados na técnica podem entender que “não inclui uma etapa de re-enovelamento do interferon suíno” da presente invenção significa que os polipeptídeos preparados no método da presente invenção podem se auto-enovelar na proteína desejada sem usar ureia ou cloridrato de guanidíneo e diálise[00048] In a preferred embodiment, the aforementioned method does not include a porcine interferon refolding step. A person skilled in the art can understand that the "refolding step" in a prokaryotic cell expression system means the process of forming a tertiary structure or a quaternary structure of a polypeptide by dissolving the inclusion body using urea or hydrochloride. guanidine and then refolding the resulting polypeptide by dialysis and other steps. Thus, those skilled in the art can understand that "does not include a porcine interferon refolding step" of the present invention to mean that the polypeptides prepared in the method of the present invention can self-fold into the desired protein without using urea or guanidine hydrochloride. and dialysis

[00049] Em uma modalidade alternativa, o hospedeiro é uma E. coli. Preferivelmente, a E. coli é de BL21, BL21 (DE3), Rosetta 2, ou Shuffle.[00049] In an alternative embodiment, the host is an E. coli. Preferably, the E. coli is BL21, BL21 (DE3), Rosetta 2, or Shuffle.

[00050] O segundo aspecto da presente invenção é uma composição para prevenir infecção por PCV2, compreendendo proteína do capsídeo do PCV2, interferon-α suíno, interferon—Y suíno, e um carreador farmacêutico aceitável.[00050] The second aspect of the present invention is a composition for preventing PCV2 infection, comprising PCV2 capsid protein, porcine interferon-α, porcine interferon-Y, and an acceptable pharmaceutical carrier.

[00051] Em uma modalidade preferida, a composição para prevenir infecção por PCV2 compreende 2,5 a 250 μg/mL de proteína do capsídeo do PCV2; 2,5 a 25 μg/mL de interferon-α suíno; 2,5 a 25 μg/mL de interferon-Y suíno; e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em ainda outra modalidade preferida, a composição para prevenir infecção por PCV2 compreende 3,5 a 170 μg/mL de proteína do capsídeo do PCV2; 5 a 20 μg/mL de interferon-α suíno; 5 a 20 μg/mL de interferon-Y suíno; e um carreador farmaceuticamente aceitável.[00051] In a preferred embodiment, the composition for preventing PCV2 infection comprises 2.5 to 250 μg/mL of PCV2 capsid protein; 2.5 to 25 μg/mL porcine interferon-α; 2.5 to 25 μg/mL of porcine interferon-Y; and a pharmaceutically acceptable carrier. In yet another preferred embodiment, the composition for preventing PCV2 infection comprises 3.5 to 170 μg/mL of PCV2 capsid protein; 5 to 20 μg/mL of porcine interferon-α; 5 to 20 μg/mL of porcine interferon-Y; and a pharmaceutically acceptable carrier.

[00052] Em uma modalidade preferida, a proteína do capsídeo do PCV2 é produzida pelo método da presente invenção. Em uma modalidade preferida, o interferon-α suíno e/ou o interferon-Y suíno são os produzidos pelo método da presente invenção.[00052] In a preferred embodiment, the PCV2 capsid protein is produced by the method of the present invention. In a preferred embodiment, porcine interferon-α and/or porcine interferon-Y are those produced by the method of the present invention.

[00053] O "carreador farmaceuticamente aceitável" da presente invenção refere-se a uma substância que não tem impacto negativo sobre a finalidade de prevenir infecção por PCV2 pela proteína do capsídeo do PCV2, por interferon-α suíno e/ou por interferon-Y suíno em uma composição a partir dos aspectos médicos/farmacêuticos. Em uma modalidade alternativa, o carreador farmaceuticamente aceitável é, por exemplo, mas não limitado a, água, solução salina tamponada com fosfato, álcool, glicerina, citina, alginato, condroitina, vitamina E, minerais ou combinações dos mesmos.[00053] The "pharmaceutically acceptable carrier" of the present invention refers to a substance that does not have a negative impact on the purpose of preventing PCV2 infection by PCV2 capsid protein, porcine interferon-α and/or interferon-Y pork in a composition from the medical/pharmaceutical aspects. In an alternative embodiment, the pharmaceutically acceptable carrier is, for example, but not limited to, water, phosphate buffered saline, alcohol, glycerin, cytin, alginate, chondroitin, vitamin E, minerals or combinations thereof.

[00054] Em uma modalidade preferida, a composição compreende adicionalmente um adjuvante farmaceuticamente aceitável. O "adjuvante farmaceuticamente aceitável" da presente invenção refere-se a uma substância que facilita o objetivo de prevenir infecção por PCV2 pela proteína do capsídeo do PCV2, pelo interferon-α suíno e/ou pelo interferon-Y suíno na composição e aumenta imunidade, de pontos de vista médicos/ farmacêuticos. Em uma modalidade alternativa, o adjuvante farmaceuticamente aceitável é, por exemplo, mas não limitado a, adjuvante MONTANIDETM ISA 536 VG, adjuvante MONTANIDETM GEL 01, adjuvante completo ou incompleto de Freund, gel de alumínio, tensoativo, polímeros polianiônicos, peptídeos, emulsões de óleo, ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o adjuvante farmaceuticamente aceitável é adjuvante MONTANIDETM ISA 536 VG, adjuvante MONTANIDETM GEL 01, ou uma combinação dos mesmos.[00054] In a preferred embodiment, the composition additionally comprises a pharmaceutically acceptable adjuvant. The "pharmaceutically acceptable adjuvant" of the present invention refers to a substance that facilitates the objective of preventing PCV2 infection by the PCV2 capsid protein, porcine interferon-α and/or porcine interferon-Y in the composition and enhances immunity, from medical/pharmaceutical points of view. In an alternative embodiment, the pharmaceutically acceptable adjuvant is, for example, but not limited to, MONTANIDETM ISA 536 VG adjuvant, MONTANIDETM GEL 01 adjuvant, complete or incomplete Freund's adjuvant, aluminum gel, surfactant, polyanionic polymers, peptides, emulsions of oil, or combinations thereof. In a preferred embodiment, the pharmaceutically acceptable adjuvant is MONTANIDETM ISA 536 VG adjuvant, MONTANIDETM GEL 01 adjuvant, or a combination thereof.

[00055] O processo de pesquisa da presente invenção será ainda detalhado nos seguintes exemplos. No entanto, o conteúdo abaixo apenas ilustra as características da presente invenção visando uma melhor compreensão. Os versados na técnica podem rever o conteúdo abaixo sem se afastar do espírito da presente invenção e modificar a mesma com base no conhecimento geral no campo, mas ainda estando dentro do escopo da presente invenção.[00055] The research process of the present invention will be further detailed in the following examples. However, the content below only illustrates the characteristics of the present invention for a better understanding. Those skilled in the art may review the content below without departing from the spirit of the present invention and modify the same based on general knowledge in the field, but still being within the scope of the present invention.

Example 1: Construction of PCV2 capsid protein expression vector (PCV2 ORF2). Isolation and sequencing of PCV2 viruses

[00056] Órgãos linfoides, como o baço e linfonodos, de porcos doentes, foram obtidos de fazendas de criação de suínos tendo infecção por PCV2 (Yunlin, Taiwan). Após serem cortados por uma tesoura esterilizada, os órgãos linfóides foram triturados com um pilão de moagem estéril e um bastão de moagem, e uma quantidade apropriada de solução estéril de tampão de fosfato foi adicionada e misturada para obter emulsão. A emulsão foi centrifugada (6.000 xg, 20 minutos) para coletar o sobrenadante e depois o sobrenadante foi filtrado através de uma peneira para remover resíduos de tecido. Extração de DNA foi realizada usando um kit de purificação de DNA (DNeasy Blood & Tissue kit; Qiagen, EUA). Cem (100) μL do sobrenadante da emulsão foram adicionados a 180 μL de tampão ATL e 20 μL de proteinase K (10 mg/mL) e incubados a 56°C durante 2 horas. Depois disso, adicionar 200 μL de álcool absoluto e misturar bem. Todas as soluções foram pipetadas para uma coluna giratória, que foi colocada em um tubo de coleta, e centrifugadas a 6.000 x g por 1 minuto. A coluna giratória foi colocada em um novo tubo de coleta, 500 μL de tampão AW1 foram adicionados ao tubo e o tubo foi centrifugado a 6.000 x g por 1 minuto. Colocar a coluna giratória em um novo tubo de coleta, adicionar 500 μL de tampão AW2 à coluna giratória, e a coluna giratória foi centrifugada a 20,630 x g durante 5 minutos. A coluna giratória foi colocada em um tubo eppendorf estéril e uma quantidade apropriada de água deionizada estéril foi adicionada para eluir o DNA.[00056] Lymphoid organs, such as the spleen and lymph nodes, from diseased pigs were obtained from pig farms having PCV2 infection (Yunlin, Taiwan). After being cut by sterilized scissors, the lymphoid organs were ground with a sterile grinding pestle and grinding stick, and an appropriate amount of sterile phosphate buffer solution was added and mixed to obtain emulsion. The emulsion was centrifuged (6,000 x g, 20 minutes) to collect the supernatant and then the supernatant was filtered through a sieve to remove tissue residue. DNA extraction was performed using a DNA purification kit (DNeasy Blood & Tissue kit; Qiagen, USA). One hundred (100) μL of emulsion supernatant was added to 180 μL of ATL buffer and 20 μL of proteinase K (10 mg/mL) and incubated at 56°C for 2 hours. After that, add 200 μL of absolute alcohol and mix well. All solutions were pipetted into a spin column, which was placed in a collection tube, and centrifuged at 6,000 x g for 1 minute. The spin column was placed in a new collection tube, 500 μL of buffer AW1 was added to the tube, and the tube was centrifuged at 6,000 x g for 1 minute. Place the spin column in a new collection tube, add 500 μL of buffer AW2 to the spin column, and the spin column was centrifuged at 20.630 x g for 5 minutes. The spin column was placed in a sterile eppendorf tube and an appropriate amount of sterile deionized water was added to elute the DNA.

[00057] Iniciadores de PCVF (5'-ACCAGCGCACTTCGGCAGC-3'; SEQ ID NO: 05) e PCVR (5'-AATACTTACAGCGCACTTCTTTCGTTTTC-3'; SEQ ID NO: 06) foram projetados, e DNA genômico de PCV2 foi amplificado por reação em cadeia polimerase (PCR). O volume da mistura de reação de PCR foi 100 μL, que incluía 10 μL de DNA extraído dos órgãos linfóides, 10 μL de 10x tampão Taq, 200 μM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 1 μM de iniciadores de amplificação, e 2,5 U de DreamTaq DNA polimerase. (Thermo, USA). Condições de reação de PCR foram 94°C durante 5 minutos (1 ciclo); 94°C durante 30 segundos, 59°C durante 30 segundos, 72°C durante 1 minuto e 30 segundos (35 ciclos); 72°C durante 7 minutos (1 ciclo). Eletroforese de DNA foi usada para confirmar a presença do fragmento de DNA com tamanho previsto.[00057] PCVF (5'-ACCAGCGCACTTCGGCAGC-3'; SEQ ID NO: 05) and PCVR (5'-AATACTTACAGCGCACTTCTTTCGTTTTC-3'; SEQ ID NO: 06) primers were designed, and PCV2 genomic DNA was amplified by reaction polymerase chain (PCR). The volume of the PCR reaction mixture was 100 μL, which included 10 μL of DNA extracted from lymphoid organs, 10 μL of 10x Taq buffer, 200 μM of dATP, dTTP, dGTP, and dCTP, 1 μM of amplification primers, and 2 .5 U of DreamTaq DNA polymerase. (Thermo, USA). PCR reaction conditions were 94°C for 5 minutes (1 cycle); 94°C for 30 seconds, 59°C for 30 seconds, 72°C for 1 minute and 30 seconds (35 cycles); 72°C for 7 minutes (1 cycle). DNA electrophoresis was used to confirm the presence of the predicted size DNA fragment.

[00058] O produto de PCR foi recuperado por kit PCR-MTM Clean Up kit (GMbiolab, Taiwan) e submetido à clonagem de TA usando o kit yT&A Cloning Vector kit (Yeastern, Taiwan). O procedimento experimental foi realizado com base em manual do fabricante para kit yT&A Cloning Vector kit. Cinco (5) μL do produto de PCR recuperado e purificado foram bem misturados com 2 μL de vetor yT&A, 1 μL de tampão de ligação A, 1 μL de tampão de ligação B, e 1 μL de DNA ligase de T4 (2 unidade/μL). A mistura foi incubada a 22°C durante 30 minutos. Um (1) μL da mistura de ligação foi transformado em ECOS 9-5 de E. coli (Yeastern, Taiwan). As células transformadas foram adicionadas a 1 mL de meio de recuperação SOC e agitadas a 37°C, 250 rpm durante 60 minutos. Após isto, uma quantidade apropriada da solução bacteriana foi aplicada a um meio sólido contendo ampicilina (uma concentração final de 100 μg/mL) e cultivada a 37°C durante 16 horas.[00058] The PCR product was recovered by PCR-MTM Clean Up kit (GMbiolab, Taiwan) and subjected to TA cloning using the yT&A Cloning Vector kit (Yeastern, Taiwan). The experimental procedure was carried out based on the manufacturer's manual for the yT&A Cloning Vector kit. Five (5) μL of the recovered and purified PCR product was mixed well with 2 μL of yT&A vector, 1 μL of ligation buffer A, 1 μL of ligation buffer B, and 1 μL of T4 DNA ligase (2 unit/ μL). The mixture was incubated at 22°C for 30 minutes. One (1) μL of the binding mixture was transformed into E. coli ECOS 9-5 (Yeastern, Taiwan). Transformed cells were added to 1 mL of SOC recovery medium and shaken at 37°C, 250 rpm for 60 minutes. After this, an appropriate amount of the bacterial solution was applied to a solid medium containing ampicillin (a final concentration of 100 μg/mL) and cultured at 37°C for 16 hours.

[00059] Depois, os transformantes foram selecionados por reação em cadeia polimerase da colônia. O procedimento de reação em cadeia polimerase da colônia é descrito como a seguir. Primeiro, 50 μL de 2x tampão de reação Premix (GMbiolab, Taiwan), 0,5 μL de 100 mM de iniciador de PCVF, 0,5 μL de 100 mM iniciador de PCVR e 49 μL de água estéril foram adicionados em um eppendorf e bem misturados. A solução de reação de PCR foi distribuída em tubos de PCR (10 μL/tubo). PCR foi realizada após a colônia ser colocada em um tubo de PCR com um palito. Condições de reação de PCR foram 95°C durante 5 minutos (1 ciclo); 95°C durante 30 segundos, 59°C durante 30 segundos, 72°C durante 1 minuto e 30 segundos (25 ciclos); 72°C durante 7 minutos (1 ciclo). Eletroforese de DNA foi usada para confirmar a presença dos fragmentos de DNA com tamanho previsto. Após confirmar que os plasmídeos recombinantes nos transformantes carregavam inserto de DNA, os plasmídeos nos transformantes foram extraídos e sequenciamento de DNA foi realizado (Tri-I Biotech, Inc.). O plasmídeo contendo DNA de PCV2 foi chamado pTA-PCV2.[00059] Then, the transformants were selected by colony polymerase chain reaction. The colony polymerase chain reaction procedure is described as follows. First, 50 μL of 2x Premix reaction buffer (GMbiolab, Taiwan), 0.5 μL of 100 mM PCVF primer, 0.5 μL of 100 mM PCVR primer, and 49 μL of sterile water were added into an eppendorf and well mixed. The PCR reaction solution was distributed into PCR tubes (10 μL/tube). PCR was performed after the colony was placed in a PCR tube with a toothpick. PCR reaction conditions were 95°C for 5 minutes (1 cycle); 95°C for 30 seconds, 59°C for 30 seconds, 72°C for 1 minute and 30 seconds (25 cycles); 72°C for 7 minutes (1 cycle). DNA electrophoresis was used to confirm the presence of DNA fragments of predicted size. After confirming that the recombinant plasmids in the transformants carried insert DNA, the plasmids in the transformants were extracted and DNA sequencing was performed (Tri-I Biotech, Inc.). The plasmid containing PCV2 DNA was called pTA-PCV2.

Amplification and codon optimization of ORF2 gene (i.e., the gene encoding capsid protein) (1) ORF2 gene amplification

[00060] Usando o pTA-PCV2 como um gabarito e realizando amplificação de gene ORF2 usando o conjunto de iniciadores ORF2F/ORF2R (ORF2F; 5'-CAATATGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCGTTTC-3'; SEQ ID NO: 07 e ORF2R; 5'-GATATAGTCGACTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTCTTTAAGATTAA-3'; SEQ ID NO: 08). Os 50 μL de mistura de reação de PCR continham 1x tampão de PCR GDP-HiFi B, 200 μM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 1 μM de iniciadores de amplificação, 100 ng de pTA-PCV2, e 1 U de GDP-HiFi DNA polimerase. A condição de reação de PCR foi 96°C durante 2 minutos (1 ciclo); 94°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos, 68°C durante 30 segundos (35 ciclos); 68°C durante 5 minutos (1 ciclo). Eletroforese de gel agarose foi usada para confirmar se o produto de PCR continha fragmentos de DNA com tamanho previsto. A seguir, o produto de PCR foi recuperado usando o kit PCR-MTM Clean Up kit. Com base nos resultados de sequenciamento, a sequência do gene ORF2 é mostrada como SEQ ID NO: 09.[00060] Using pTA-PCV2 as a template and performing ORF2 gene amplification using the ORF2F/ORF2R primer set (ORF2F; 5'-CAATATGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCGTTTC-3'; SEQ ID NO: 07 and ORF2R; 5'-GATATAGTCGACTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTCTTTAAGATTAA-3 '; SEQ ID NO: 08). The 50 μL of PCR reaction mixture contained 1x GDP-HiFi B PCR buffer, 200 μM of dATP, dTTP, dGTP, and dCTP, 1 μM of amplification primers, 100 ng of pTA-PCV2, and 1 U of GDP- HiFi DNA polymerase. The PCR reaction condition was 96°C for 2 minutes (1 cycle); 94°C for 30 seconds, 60°C for 30 seconds, 68°C for 30 seconds (35 cycles); 68°C for 5 minutes (1 cycle). Agarose gel electrophoresis was used to confirm that the PCR product contained DNA fragments of the predicted size. Next, the PCR product was recovered using the PCR-MTM Clean Up kit. Based on the sequencing results, the ORF2 gene sequence is shown as SEQ ID NO: 09.

(2) Synthesis of codon-optimized ORF2 gene (OPTORF2)

[00061] A sequência de aminoácidos de ORF2 foi revertida para a sequência de nucleotídeos com base nos códons preferidos de E. coli. Iniciadores foram projetados com base em nas sequências de nucleotídeos acima mencionadas: OPTORF2-T1, OPTORF2-T2, OPTORF2-T3, OPTORF2-T4, OPTORF2-T5, OPTORF2-T6, OPTORF2-T7, OPTORF2-T8, OPTORF2-T9, OPTORF2-T10, OPTORF2-T11, OPTORF2-T12, OPTORF2F, e OPTORF2R. As sequência de iniciadores são mostradas na Tabela 1. Tabela 1: Iniciadores usados para síntese do gene ORF2 otimizado no códon (OPTORF2) [00061] The amino acid sequence of ORF2 was reverted to the nucleotide sequence based on the preferred codons of E. coli. Primers were designed based on the above-mentioned nucleotide sequences: OPTORF2-T1, OPTORF2-T2, OPTORF2-T3, OPTORF2-T4, OPTORF2-T5, OPTORF2-T6, OPTORF2-T7, OPTORF2-T8, OPTORF2-T9, OPTORF2 -T10, OPTORF2-T11, OPTORF2-T12, OPTORF2F, and OPTORF2R. The primer sequences are shown in Table 1. Table 1: Primers used for synthesis of the codon-optimized ORF2 gene (OPTORF2)

[00062] OPTORF2-T1 a OPTORF2-T12 foram usados como iniciadores de gabarito, e OPTORF2 e OPTORF2R foram usados como iniciadores de amplificação. Reação em cadeia polimerase de sobreposição-extensão (OEPCR) foi usada para amplificar massivamente o gene ORF2 otimizado no códon. Os 50 μL da mistura de reação de PCR continham 1x tampão de PCR GDP-HiFi B, 200 μM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 1 μM de cada iniciador, e 1 U de GDP-HiFi DNA polimerase. A condição de reação de PCR foi 96°C durante 2 minutos (1 ciclo); 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 68°C durante 30 segundos (35 ciclos); 68°C durante 5 minutos (1 ciclo). Após a reação, eletroforese de gel agarose foi usada para confirmar se o produto de PCR continha fragmentos de DNA com tamanho previsto. A seguir, o produto de PCR foi recuperado usando o kit PCR-MTM Clean Up system kit. Com base nos resultados de sequenciamento, a sequência do gene ORF2 otimizado no códon é mostrada como SEQ ID NO: 24.[00062] OPTORF2-T1 to OPTORF2-T12 were used as template primers, and OPTORF2 and OPTORF2R were used as amplification primers. Overlap-extension polymerase chain reaction (OEPCR) was used to massively amplify the codon-optimized ORF2 gene. The 50 μL of PCR reaction mixture contained 1x GDP-HiFi B PCR buffer, 200 μM of dATP, dTTP, dGTP, and dCTP, 1 μM of each primer, and 1 U of GDP-HiFi DNA polymerase. The PCR reaction condition was 96°C for 2 minutes (1 cycle); 94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, 68°C for 30 seconds (35 cycles); 68°C for 5 minutes (1 cycle). After the reaction, agarose gel electrophoresis was used to confirm that the PCR product contained DNA fragments of the predicted size. Next, the PCR product was recovered using the PCR-MTM Clean Up system kit. Based on the sequencing results, the codon-optimized ORF2 gene sequence is shown as SEQ ID NO: 24.

Amplification and codon optimization of SUMO genes] (1) SUMO gene amplification

[00063] O fermento de padaria (Saccharomyces cerevisiae), isolado de levedura instantânea DIY de Sun Right Food Co., foi inoculado em um meio YPD (20% peptona, 10% extrato de levedura, 20% glicose; pH 6,5) e cultura agitada a 30°C, 200 rpm durante 16 horas. Após cultivo, extração do genoma de levedura foi realizada usando um kit YeaStarTM Genomic DNA kit (Zymo Research, USA). 1,5 mL de do caldo de cultura noturna foi adicionado a um frasco eppendorf, coletando as frações bacterianas por centrifugação (2.000xg, 5 minutos, temperatura ambiente), e 120 μL de tampão de digestão YD e 5 μL de R-Zymolase foram misturados completamente e incubados a 37°C durante 1 hora. Então, 120 μL de tampão de lise YD foram adicionados à mistura e misturados suavemente várias vezes. Duzentos e cinquenta (250) μL de clorofórmio foram adicionados à mistura e sacudidos por 1 minuto. Osobrenadante foi coletado por centrifugação (10.000xg, 2 minutos, temperatura ambiente). Uma coluna giratória foi colocada em um tubo de coleta, e o sobrenadante foi adicionado na coluna giratória. Após centrifugação (10.000xg, 1 minuto, temperatura ambiente), o filtrado foi descartado. 300 μL de tampão de lavagem de DNA foram adicionados à coluna giratória, a coluna giratória foi centrifugada (10.000xg, 1 minuto, temperatura ambiente), o filtrado foi descartado, e este procedimento foi repetido uma vez. A coluna giratória foi colocada em um tubo estéril eppendorf, uma quantidade apropriada de solução de eluição foi adicionada à coluna giratória, e a coluna giratória e o eppendorf foram centrifugados (10.000xg, 2 minutos, temperatura ambiente) para eluir o DNA genômico.[00063] Baker's yeast (Saccharomyces cerevisiae), isolated from DIY instant yeast from Sun Right Food Co., was inoculated into a YPD medium (20% peptone, 10% yeast extract, 20% glucose; pH 6.5) and culture stirred at 30°C, 200 rpm for 16 hours. After cultivation, yeast genome extraction was performed using a YeaStarTM Genomic DNA kit (Zymo Research, USA). 1.5 mL of overnight culture broth was added to an eppendorf flask, collecting the bacterial fractions by centrifugation (2,000xg, 5 minutes, room temperature), and 120 μL of YD digestion buffer and 5 μL of R-Zymolase were added. mixed thoroughly and incubated at 37°C for 1 hour. Then, 120 μL of YD lysis buffer was added to the mixture and gently mixed several times. Two hundred and fifty (250) μL of chloroform was added to the mixture and shaken for 1 minute. The supernatant was collected by centrifugation (10,000xg, 2 minutes, room temperature). A spin column was placed in a collection tube, and the supernatant was added to the spin column. After centrifugation (10,000xg, 1 minute, room temperature), the filtrate was discarded. 300 μL of DNA wash buffer was added to the spin column, the spin column was centrifuged (10,000xg, 1 minute, room temperature), the filtrate was discarded, and this procedure was repeated once. The spin column was placed in a sterile eppendorf tube, an appropriate amount of elution solution was added to the spin column, and the spin column and eppendorf were centrifuged (10,000xg, 2 minutes, room temperature) to elute the genomic DNA.

[00064] O gene SUMO foi amplificado usando o DNA genômico de Saccharomyces cerevisiae obtido no parágrafo anterior como gabarito e usando SUMOF (5'-GATATAGGTACCATGTCGGACTCAGAAGTCAATCAAG-3'; SEQ ID NO: 25)/ SUMOR (5'-CAATATGGATCCACCACCAATCTG TTCTCTGTGAGC-3; SEQ ID NO: 26) como o conjunto de iniciadores. Os 50 μL de mistura de reação de PCR continham 1x tampão de PCR GDP-HiFi B, 200 μM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 1 μM de iniciadores de amplificação, 200 ng de DNA genômico de Saccharomyces cerevisiae, e 1 U de GDP-HiFi DNA polimerase. A condição de reação de PCR foi 96°C durante 5 minutos (1 ciclo); 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 68°C durante 30 segundos (35 ciclos); 68°C durante 5 minutos (1 ciclo). Após a reação, eletroforese de gel agarose foi usada para confirmar se o produto de PCR continha fragmentos de DNA com tamanho previsto. A seguir, o produto de PCR foi recuperado usando o kit PCR-MTM Clean Up system kit.[00064] The SUMO gene was amplified using the Saccharomyces cerevisiae genomic DNA obtained in the previous paragraph as a template and using SUMOF (5'-GATATAGGTACCATGTCGGACTCAGAAGTCAATCAAG-3'; SEQ ID NO: 25)/ SUMOR (5'-CAATATGGATCCACCACCAATCTG TTCTCTGTGAGC-3; SEQ ID NO: 26) as the primer set. The 50 μL of PCR reaction mixture contained 1x GDP-HiFi B PCR buffer, 200 μM of dATP, dTTP, dGTP, and dCTP, 1 μM of amplification primers, 200 ng of Saccharomyces cerevisiae genomic DNA, and 1 U of GDP-HiFi DNA polymerase. The PCR reaction condition was 96°C for 5 minutes (1 cycle); 94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, 68°C for 30 seconds (35 cycles); 68°C for 5 minutes (1 cycle). After the reaction, agarose gel electrophoresis was used to confirm that the PCR product contained DNA fragments of the predicted size. Next, the PCR product was recovered using the PCR-MTM Clean Up system kit.

(2) Gene synthesis of codon-optimized SUMO gene (OPTSUMO)

[00065] A sequência de aminoácidos de SUMO foi revertida para a sequência de nucleotídeos com base nos códons preferidos de E. coli. Iniciadores foram projetados com base nas sequências de nucleotídeos acima mencionadas: OPTSUMO-T1, OPTSUMO-T2, OPTSUMO-T3, OPTSUMO-T4, OPTSUMO-T5, OPTSUMO-T6, OPTSUMO-T7, OPTSUMO-T8, OPTSUMOF, e OPTSUMOR. As sequências são mostrados na Tabela 2. Tabela 2: Iniciadores usados para síntese do gene SUMO otimizado no códon (OPTSUMO). [00065] The amino acid sequence of SUMO was reverted to the nucleotide sequence based on the preferred codons of E. coli. Primers were designed based on the above-mentioned nucleotide sequences: OPTSUMO-T1, OPTSUMO-T2, OPTSUMO-T3, OPTSUMO-T4, OPTSUMO-T5, OPTSUMO-T6, OPTSUMO-T7, OPTSUMO-T8, OPTSUMOF, and OPTSUMOR. The sequences are shown in Table 2. Table 2: Primers used for synthesis of the codon-optimized SUMO gene (OPTSUMO).

[00066] OPTSUMO-T1 a OPTSUMO-T8 foram usados como iniciadores de gabarito, e OPTSUMOF e OPTSUMOR foram usados como iniciadores de amplificação. Reação em cadeia polimerase de sobreposição-extensão foi usada para amplificar massivamente o gene SUMO otimizado no códon. Os 50 μL de mistura de reação de PCR continham 1X tampão de PCR GDP-HiFi B, 200 μM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 1 μM de cada iniciador, e 1 U de GDP-HiFi DNA polimerase. A condição de reação de PCR foi 96°C durante 2 minutos (1 ciclo); 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 68°C durante 30 segundos (35 ciclos); 68°C durante 5 minutos (1 ciclo). Após a reação, eletroforese de gel agarose foi usada para confirmar se o produto de PCR continha fragmentos de DNA com tamanho previsto. A seguir, o produto de PCR foi recuperado usando o kit PCR-MTM Clean Up kit. Com base nos resultados de sequenciamento, a sequência do gene SUMO otimizado no códon é mostrada como SEQ ID NO: 37.[00066] OPTSUMO-T1 to OPTSUMO-T8 were used as template primers, and OPTSUMOF and OPTSUMOR were used as amplification primers. Overlap-extension polymerase chain reaction was used to massively amplify the codon-optimized SUMO gene. The 50 μL of PCR reaction mixture contained 1X GDP-HiFi B PCR buffer, 200 μM of dATP, dTTP, dGTP, and dCTP, 1 μM of each primer, and 1 U of GDP-HiFi DNA polymerase. The PCR reaction condition was 96°C for 2 minutes (1 cycle); 94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, 68°C for 30 seconds (35 cycles); 68°C for 5 minutes (1 cycle). After the reaction, agarose gel electrophoresis was used to confirm that the PCR product contained DNA fragments of the predicted size. Next, the PCR product was recovered using the PCR-MTM Clean Up kit. Based on the sequencing results, the codon-optimized SUMO gene sequence is shown as SEQ ID NO: 37.

Construction of ORF2 fusion protein expression vector (1) Construction of pET-DRAHIS:

[00067] A reação de PCR foi realizada usando pET29a como o gabarito e DRAF (5'- GATATACATATGAAAAAAAAATTCGTATCGCATCACCATCACCATCACAGCGGTGGTGGTA CCCCAGATCTGGGTACCCTGG-3'; SEQ ID NO: 38)/terminador T7 (GCTAGTTATTGCTCAGCGG; SEQ ID NO: 39) como o conjunto de iniciadores. Os 50 μL da mistura de reação de PCR continham 1x tampão Ex TaqTM, 200 μM de dATP, dTTP, dGTP, e dCTP, 1 μM de iniciadores de amplificação, 100 ng de pET29a, e 1,25 U TakaRa Ex TaqTM DNA polimerase (Takara, Japão). A condição de reação de PCR foi 94°C durante 5 minutos (1 ciclo); 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 72°C durante 50 segundos (35 ciclos); 72°C durante 7 minutos (1 ciclo). Após a reação, eletroforese de gel agarose foi usada para confirmar se o produto de PCR continha fragmentos de DNA com tamanho previsto. A seguir, o produto de PCR foi recuperado usando o kit PCR-MTM Clean Up system kit.[00067] The PCR reaction was performed using pET29a as the template and DRAF (5'- GATATACATATGAAAAAAAAATTCGTATCGCATCACCATCACCATCACAGCGGTGGTGGTA CCCCAGATCTGGGTACCCTGG-3'; SEQ ID NO: 38)/T7 terminator (GCTAGTTATTGCTCAGCGG; SEQ ID NO: 39) as the primer set. The 50 μL of PCR reaction mixture contained 1x Ex TaqTM buffer, 200 μM of dATP, dTTP, dGTP, and dCTP, 1 μM amplification primers, 100 ng of pET29a, and 1.25 U TakaRa Ex TaqTM DNA polymerase ( Takara, Japan). The PCR reaction condition was 94°C for 5 minutes (1 cycle); 94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, 72°C for 50 seconds (35 cycles); 72°C for 7 minutes (1 cycle). After the reaction, agarose gel electrophoresis was used to confirm that the PCR product contained DNA fragments of the predicted size. Next, the PCR product was recovered using the PCR-MTM Clean Up system kit.

[00068] Após o produto de PCR ser cortado com NdeI e SalI, os fragmentos de DNA foram ligados em pET29a cortado com as mesmas enzimas de restrição usando DNA ligase de T4. Os produtos ligados foram transformados em XL1-blue de E. coli (Protech, Taiwan). Os transformantes foram aleatoriamente selecionados para confirmação de sequências de DNA. O plasmídeo com a sequência de DNA correta foi chamado pET-DRAHIS. Este plasmídeo tinha um códon de partida seguido com a sequência a jusante (DS) AAAAAAAAATTCGTATCG (SEQ ID NO: 40) e a sequência de DNA de etiqueta His CATCACCATCACCATCAC (SEQ ID NO: 41).[00068] After the PCR product was cut with NdeI and SalI, the DNA fragments were ligated into pET29a cut with the same restriction enzymes using T4 DNA ligase. The ligated products were transformed into E. coli XL1-blue (Protech, Taiwan). Transformants were randomly selected to confirm DNA sequences. The plasmid with the correct DNA sequence was called pET-DRAHIS. This plasmid had a start codon followed by the downstream sequence (DS) AAAAAAAAATTCGTATCG (SEQ ID NO: 40) and the His tag DNA sequence CATCACCATCACCATCAC (SEQ ID NO: 41).

(2) Construction of the pET-SUMO-ORF2 expression vector

[00069] Após o gene SUMO ser amplificado a partir do genoma de Saccharomyces cerevisiae e cortado com KpnI e BamHI, o fragmento de DNA foi ligado em pET-DRAHIS cortado com as mesmas enzimas de restrição usando DNA ligase de T4. O produto ligado foi transformado em ECOS 9-5 de E. coli. Transformantes foram selecionados por reação em cadeia polimerase da colônia. Após confirmar que os plasmídeos recombinantes nos transformantes carregaram o DNA inserido por eletroforese de DNA, os plasmídeos nos transformantes foram extraídos e o DNA foi sequenciado. O plasmídeo com a sequência de DNA correta foi chamado pET-SUMO.[00069] After the SUMO gene was amplified from the Saccharomyces cerevisiae genome and cut with KpnI and BamHI, the DNA fragment was ligated into pET-DRAHIS cut with the same restriction enzymes using T4 DNA ligase. The bound product was transformed into E. coli ECOS 9-5. Transformants were selected by colony polymerase chain reaction. After confirming that the recombinant plasmids in the transformants carried the inserted DNA by DNA electrophoresis, the plasmids in the transformants were extracted and the DNA was sequenced. The plasmid with the correct DNA sequence was called pET-SUMO.

[00070] Após o gene ORF2 amplificado a partir do genoma do vírus Yunlin PCV2 ser cortado com BamHI e SalI, o fragmento de DNA foi inserido em pET-SUMO cortado com as mesmas enzimas de restrição usando DNA ligase de T4. O produto ligado foi transformado em ECOS 9-5 de E. coli. Transformantes foram selecionados por reação em cadeia polimerase da colônia. Após confirmar que o plasmídeo recombinantes nos transformantes carregou o DNA inserido por eletroforese de DNA, os plasmídeos no transformante foram extraídos e o DNA foi sequenciado. O plasmídeo com a sequência de DNA correta é chamado pET-SUMO-ORF2, que tinha a sequência de SEQ ID NO: 42.[00070] After the ORF2 gene amplified from the Yunlin PCV2 virus genome was cut with BamHI and SalI, the DNA fragment was inserted into pET-SUMO cut with the same restriction enzymes using T4 DNA ligase. The bound product was transformed into E. coli ECOS 9-5. Transformants were selected by colony polymerase chain reaction. After confirming that the recombinant plasmids in the transformants carried the inserted DNA by DNA electrophoresis, the plasmids in the transformant were extracted and the DNA was sequenced. The plasmid with the correct DNA sequence is called pET-SUMO-ORF2, which had the sequence of SEQ ID NO: 42.

(3) Construction of the pET-OPTSUMO-ORF2 expression vector

[00071] Após o gene OPTSUMO sintético ser cortado com KpnI e BamHI, o fragmento de DNA foi ligado em pET-DRAHIS cortado com as mesmas enzimas de restrição usando DNA ligase de T4. O produto ligado foi transformado em ECOS 9-5 de E. Coli. Transformantes foram selecionados por reação em cadeia polimerase da colônia. Após confirmar que o plasmídeo recombinante nos transformantes carregou o DNA inserido por eletroforese de DNA, os plasmídeos nos transformantes foram extraídos e o DNA foi sequenciado. O plasmídeo com a sequência de DNA correta foi chamado pET-OPTSUMO.[00071] After the synthetic OPTSUMO gene was cut with KpnI and BamHI, the DNA fragment was ligated into pET-DRAHIS cut with the same restriction enzymes using T4 DNA ligase. The bound product was transformed into E. Coli ECOS 9-5. Transformants were selected by colony polymerase chain reaction. After confirming that the recombinant plasmid in the transformants carried the inserted DNA by DNA electrophoresis, the plasmids in the transformants were extracted and the DNA was sequenced. The plasmid with the correct DNA sequence was called pET-OPTSUMO.

[00072] Após o gene ORF2 amplificado a partir do genoma do vírus Yunlin PCV2 ser cortado com BamHI e SalI, o fragmento de DNA foi ligado em pET-OPTSUMO cortado com as mesmas enzimas de restrição usando DNA ligase de T4. O produto ligado foi transformado em ECOS 9-5 de E. coli. Transformantes foram selecionados por reação em cadeia polimerase da colônia. Após confirmar que o plasmídeo recombinante nos transformantes carregou o DNA inserido por eletroforese de DNA, os plasmídeos nos transformantes foram extraídos e o DNA foi sequenciado. O plasmídeo com a sequência de DNA correta é chamado pET-OPTSUMO-ORF2, que tem SEQ ID NO: 43.[00072] After the ORF2 gene amplified from the Yunlin PCV2 virus genome was cut with BamHI and SalI, the DNA fragment was ligated into pET-OPTSUMO cut with the same restriction enzymes using T4 DNA ligase. The bound product was transformed into E. coli ECOS 9-5. Transformants were selected by colony polymerase chain reaction. After confirming that the recombinant plasmid in the transformants carried the inserted DNA by DNA electrophoresis, the plasmids in the transformants were extracted and the DNA was sequenced. The plasmid with the correct DNA sequence is called pET-OPTSUMO-ORF2, which has SEQ ID NO: 43.

(4) Construction of the pET-SUMO-OPTORF2 expression vector

[00073] Após o gene sintético OPTORF2 ser cortado com BamHI e SalI, o fragmento de DNA foi ligado em pET-SUMO cortado com as mesmas enzimas de restrição usando DNA ligase de T4. O produto ligado foi transformado em ECOS 9-5 de E. coli. Transformantes foram selecionados por reação em cadeia polimerase da colônia. Após confirmar que o plasmídeo recombinante nos transformantes carregou o DNA inserido por eletroforese de DNA, os plasmídeos no transformante foram extraídos e o DNA foi sequenciado. O plasmídeo com a sequência de DNA correta é chamado pET-SUMO-OPTORF2, que tem SEQ ID NO: 44.[00073] After the synthetic OPTORF2 gene was cut with BamHI and SalI, the DNA fragment was ligated into pET-SUMO cut with the same restriction enzymes using T4 DNA ligase. The bound product was transformed into E. coli ECOS 9-5. Transformants were selected by colony polymerase chain reaction. After confirming that the recombinant plasmid in the transformants carried the inserted DNA by DNA electrophoresis, the plasmids in the transformant were extracted and the DNA was sequenced. The plasmid with the correct DNA sequence is called pET-SUMO-OPTORF2, which has SEQ ID NO: 44.

(5) Construction of pET-OPTSUMO-OPTORF2 expression vector

[00074] Após o gene sintético OPTORF2 ser cortado com BamHI e SalI, o fragmento de DNA foi inserido em pET-OPTSUMO cortado com as mesmas enzimas de restrição usando DNA ligase de T4. O produto ligado foi transformado em ECOS 9-5 de E. coli. Transformantes foram selecionados por reação em cadeia polimerase da colônia. Após confirmar que o plasmídeo recombinante no transformante carregou o DNA inserido por eletroforese de DNA, os plasmídeos nos transformantes foram extraídos e o DNA foi sequenciado. O plasmídeo com a sequência de DNA correta é chamado pET-OPTSUMO-OPTORF2, que tem SEQ ID NO: 45.[00074] After the synthetic OPTORF2 gene was cut with BamHI and SalI, the DNA fragment was inserted into pET-OPTSUMO cut with the same restriction enzymes using T4 DNA ligase. The bound product was transformed into E. coli ECOS 9-5. Transformants were selected by colony polymerase chain reaction. After confirming that the recombinant plasmid in the transformant carried the inserted DNA by DNA electrophoresis, the plasmids in the transformants were extracted and the DNA was sequenced. The plasmid with the correct DNA sequence is called pET-OPTSUMO-OPTORF2, which has SEQ ID NO: 45.

(6) Construction of the pBA-OPTSUMO-OPTORF2 expression vector

[00075] O pBA-OPTSUMO-OPTORF2 construído neste experimento foi obtido por inserção do fragmento de DNA de OPTSUMO-OPTORF2 em um novo vetor de expressão de indutor arabinose pBCM-araM11. pBCM-araM11 foi construído com o elemento de expressão induzindo arabinose e pBRCMMCS (SEQ ID NO: 100) divulgado em pedido de patente de Taiwan No. 103146225 (data de depósito: 30 de dezembro de 2014) e No. 103142753 (data de depósito: 9 de dezembro de 2014) pelos requerentes da presente invenção. O processo de construção do vetor de expressão é descrito como a seguir.[00075] The pBA-OPTSUMO-OPTORF2 constructed in this experiment was obtained by inserting the OPTSUMO-OPTORF2 DNA fragment into a new arabinose inducer expression vector pBCM-araM11. pBCM-araM11 was constructed with the arabinose-inducing expression element and pBRCMMCS (SEQ ID NO: 100) disclosed in Taiwan patent application No. 103146225 (filing date: December 30, 2014) and No. 103142753 (filing date : December 9, 2014) by the applicants of the present invention. The expression vector construction process is described as follows.

[00076] Após pARABM11-GFPT ser cortado com EcoRI e NdeI, o fragmento de DNA contendo elementos de expressão araC e araB-M11 foi recuperado usando um kit Gel-MTM gel extraction system kit (GMbiolab, Taiwan). Os elementos de expressão araC e araB-M11 foram ligados em pBRCMMCS cortado com as mesmas enzimas de restrição usando DNA ligase de T4. O produto ligado foi transformado em ECOS 9-5 de E. coli. Os transformantes foram selecionados por reação em cadeia polimerase da colônia e os plasmídeos foram extraídos para confirmação de sequência de DNA. O plasmídeo com a sequência correta é chamado pBCM-araM11, que tem SEQ ID NO: 98.[00076] After pARABM11-GFPT was cut with EcoRI and NdeI, the DNA fragment containing araC and araB-M11 expression elements was recovered using a Gel-MTM gel extraction system kit (GMbiolab, Taiwan). The araC and araB-M11 expression elements were ligated into cut pBRCMMCS with the same restriction enzymes using T4 DNA ligase. The bound product was transformed into E. coli ECOS 9-5. Transformants were selected by colony polymerase chain reaction and plasmids were extracted to confirm the DNA sequence. The plasmid with the correct sequence is called pBCM-araM11, which has SEQ ID NO: 98.

[00077] Após pET-OPTSUMO-OPTORF2 ser cortado com NdeI e SalI, o fragmento de DNA contendo OPTSUMO-OPTORF2 foi recuperado usando um kit Gel-MTM gel extraction system kit. OPTSUMO-OPTORF2 foi ligado em pBCM-araM11 cortado com as mesmas enzimas de restrição usando DNA ligase de T4. O produto ligado foi transformado em ECOS 9-5 de E. coli. Os transformantes foram selecionados por reação em cadeia polimerase da colônia e os plasmídeos foram extraídos para confirmação de sequenciamento de DNA. O plasmídeo com a sequência correta é chamado pBA-OPTSUMO-OPTORF2, que tem SEQ ID NO: 46.[00077] After pET-OPTSUMO-OPTORF2 was cut with NdeI and SalI, the DNA fragment containing OPTSUMO-OPTORF2 was recovered using a Gel-MTM gel extraction system kit. OPTSUMO-OPTORF2 was ligated into pBCM-araM11 cut with the same restriction enzymes using T4 DNA ligase. The bound product was transformed into E. coli ECOS 9-5. Transformants were selected by colony polymerase chain reaction and plasmids were extracted for DNA sequencing confirmation. The plasmid with the correct sequence is called pBA-OPTSUMO-OPTORF2, which has SEQ ID NO: 46.

[00078] O fragmento de DNA contendo o elemento de expressão araB-M11 é o elemento de expressão induzindo arabinose da presente invenção, que compreende um promotor (a parte -16 é mostrada como SEQ ID NO: 03) e um elemento de intensificação da tradução do fago T7 (SEQ ID NO: 01), e um sítio de ligação de ribossomo (SEQ ID NO: 02). O elemento de expressão induzindo arabinose é como mostrado no pedido de patente de Taiwan No. 103146225 (data de depósito: 30 de dezembro de 2014), que tem a SEQ ID NO: 04.[00078] The DNA fragment containing the araB-M11 expression element is the arabinose-inducing expression element of the present invention, which comprises a promoter (the -16 part is shown as SEQ ID NO: 03) and a protein enhancement element. translation of phage T7 (SEQ ID NO: 01), and a ribosome binding site (SEQ ID NO: 02). The expression element inducing arabinose is as shown in Taiwan patent application No. 103146225 (filing date: December 30, 2014), which has SEQ ID NO: 04.

Summary

[00079] Em resumo, cinco vetores de expressão da proteína do capsídeo do PCV2 foram preparados neste exemplo, ou seja: pET-SUMO-ORF2 (SEQ ID NO: 42) e pET-OPTSUMO-ORF2 (SEQ ID. NO: 43), pET-SUMO-OPTORF2 (SEQ ID NO: 44), pET-OPTSUMO-OPTORF2 (SEQ ID NO: 45), e pBA-OPTSUMO-OPTORF2 (SEQ ID NO: 46). Favor consultar Figura 1.[00079] In summary, five PCV2 capsid protein expression vectors were prepared in this example, namely: pET-SUMO-ORF2 (SEQ ID NO: 42) and pET-OPTSUMO-ORF2 (SEQ ID. NO: 43) , pET-SUMO-OPTORF2 (SEQ ID NO: 44), pET-OPTSUMO-OPTORF2 (SEQ ID NO: 45), and pBA-OPTSUMO-OPTORF2 (SEQ ID NO: 46). Please see Figure 1.

Example 2 Preparation of PCV2 capsid proteins of the present invention

[00080] Como descrito acima, cada um dos vetores obtidos em Exemplo 1 (SEQ ID NOs: 42 a 46) contém a proteína do capsídeo ORF2 e pode ser aplicado à produção de proteínas de capsídeo. Além disso, para a finalidade de purificação e desempenho de solubilidade, as proteínas alvos foram fundidas com a proteína SUMO e a etiqueta His. Esta proteína de fusão é mencionada aqui como a proteína de fusão SUMO-ORF2, e o fato de que a proteína de fusão contém etiqueta His não será mais mencionado. Este Exemplo usará o vetor de expressão descrito em Exemplo 1 para preparar a proteína de fusão SUMO-ORF2 da presente invenção.[00080] As described above, each of the vectors obtained in Example 1 (SEQ ID NOs: 42 to 46) contains the ORF2 capsid protein and can be applied to the production of capsid proteins. Furthermore, for the purpose of purification and solubility performance, the target proteins were fused with SUMO protein and His tag. This fusion protein is referred to here as the SUMO-ORF2 fusion protein, and the fact that the fusion protein contains His tag will not be mentioned further. This Example will use the expression vector described in Example 1 to prepare the SUMO-ORF2 fusion protein of the present invention.

Transformation of E. coli and induced expression of recombinant SUMO-ORF2 fusion protein (1) Experimental procedure

[00081] Vetores de expressão tais como pET-SUMO-ORF2, pET-OPTSUMO-ORF2, pET-SUMO-OPTORF2, e pET-OPTSUMO- OPTORF2 foram transformados em BL21 de E. coli (DE3) (Yeastern, Taiwan). pET-SUMO-ORF2 foi transformado em Rosetta2 de E. coli (EMD Millipore, USA). pBA-OPTSUMO-OPTORF2 foi transformado em BL21 de E. coli (New England Biolabs, USA). O método de transformação foi seguido pelos procedimentos de operação fornecidos pelos fabricantes.[00081] Expression vectors such as pET-SUMO-ORF2, pET-OPTSUMO-ORF2, pET-SUMO-OPTORF2, and pET-OPTSUMO-OPTORF2 were transformed into E. coli BL21 (DE3) (Yeastern, Taiwan). pET-SUMO-ORF2 was transformed into E. coli Rosetta2 (EMD Millipore, USA). pBA-OPTSUMO-OPTORF2 was transformed into E. coli BL21 (New England Biolabs, USA). The transformation method was followed by the operating procedures provided by the manufacturers.

[00082] O transformante BL21(DE3) de E. coli foi inoculado em um meio LB contendo canamicina (concentração final: 30 μg/mL) e foi cultivado agitado a 37°C e 180 rpm. Após incubação noturna, a solução bacteriana foi inoculada a uma razão de 1:100 em meio LB contendo canamicina (concentração final 30 μg/mL). Cultura agitada foi realizada a 37°C e 180 rpm. Bactérias foram cultivadas a uma concentração de aproximadamente 0,4 ato 0,6 OD600 medida por espectrofotômetro, e 0,1 mM isopropil-β-D-tiogalactosideo (IPTG) foi adicionado para indução de expressão de proteína. Após 4 horas de indução, as frações bacterianas foram coletadas por centrifugação (8.000xg, 30 minutos, 4°C) e a expressão da proteína de fusão SUMO-ORF2 foi observada por eletroforese de proteína e Western blot. Os anticorpos primários e secundários usados em métodos Western blot foram anticorpo policlonal anti-6*His de coelho (Protech, Taiwan) e IgG anti-coelho de cabra conjugado a fosfatase alcalina (H+L), respectivamente. O colorante usado foi NBT/BCIP (Thermo, USA). As proteínas solúveis e insolúveis das bactérias foram também diferenciadas, e a solubilidade da proteína de fusão SUMO-ORF2 foi observada por eletroforese de proteína.[00082] The E. coli BL21(DE3) transformant was inoculated into an LB medium containing kanamycin (final concentration: 30 μg/mL) and was cultivated shaking at 37°C and 180 rpm. After overnight incubation, the bacterial solution was inoculated at a ratio of 1:100 into LB medium containing kanamycin (final concentration 30 μg/mL). Shake culture was performed at 37°C and 180 rpm. Bacteria were grown to a concentration of approximately 0.4 to 0.6 OD600 measured by spectrophotometer, and 0.1 mM isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) was added for induction of protein expression. After 4 hours of induction, bacterial fractions were collected by centrifugation (8,000xg, 30 minutes, 4°C) and expression of the SUMO-ORF2 fusion protein was observed by protein electrophoresis and Western blot. The primary and secondary antibodies used in Western blot methods were rabbit anti-6*His polyclonal antibody (Protech, Taiwan) and goat anti-rabbit IgG conjugated to alkaline phosphatase (H+L), respectively. The colorant used was NBT/BCIP (Thermo, USA). The soluble and insoluble proteins of bacteria were also differentiated, and the solubility of the SUMO-ORF2 fusion protein was observed by protein electrophoresis.

[00083] O transformante Rosetta2 de E. coli foi inoculado em meio LB contendo cloranfenicol (concentração final de 34 μg/mL) e canamicina (concentração final de 30 μg/mL). A cultura agitada foi realizado a 37°C e 180 rpm. Após incubação noturna, a solução bacteriana foi inoculada a uma razão de 1:100 em meio LB contendo cloranfenicol (concentração final de 34 μg/mL) e canamicina (concentração final de 30 μg/mL). Cultura agitada foi realizada a 37°C e 180 rpm. Bactérias foram cultivadas a uma concentração de aproximadamente 0,4 a 0,6 OD600 medida por espectrofotômetro, e 0,1 mM de IPTG foi adicionado para indução de expressão de proteína. Após 4 horas de indução, as frações bacterianas foram coletadas por centrifugação (8.000xg, 30 minutos, 4°C) e a expressão da proteína de fusão SUMO-ORF2 foi observada por eletroforese de proteína e Western blot. As proteínas solúveis e insolúveis das bactérias foram também diferenciadas, e a solubilidade da proteína de fusão SUMO-ORF2 foi observada por eletroforese de proteína.[00083] The E. coli Rosetta2 transformant was inoculated into LB medium containing chloramphenicol (final concentration of 34 μg/mL) and kanamycin (final concentration of 30 μg/mL). Shake culture was carried out at 37°C and 180 rpm. After overnight incubation, the bacterial solution was inoculated at a ratio of 1:100 into LB medium containing chloramphenicol (final concentration of 34 μg/mL) and kanamycin (final concentration of 30 μg/mL). Shake culture was performed at 37°C and 180 rpm. Bacteria were grown to a concentration of approximately 0.4 to 0.6 OD600 measured by spectrophotometer, and 0.1 mM IPTG was added for induction of protein expression. After 4 hours of induction, bacterial fractions were collected by centrifugation (8,000xg, 30 minutes, 4°C) and expression of the SUMO-ORF2 fusion protein was observed by protein electrophoresis and Western blot. The soluble and insoluble proteins of bacteria were also differentiated, and the solubility of the SUMO-ORF2 fusion protein was observed by protein electrophoresis.

[00084] O transformante BL21 de E. coli foi inoculado em meio LB contendo cloranfenicol (25 μg/mL). A cultura agitada foi realizada a 37°C e 180 rpm. Após incubação noturna, a solução bacteriana foi inoculada a uma razão de 1:100 em meio LB contendo cloranfenicol (25 μg/mL). Cultura agitada foi realizada a 37°C e 180 rpm. Bactérias foram cultivadas a uma concentração de aproximadamente 0,4 a 0,6 OD600 medida por espectrofotômetro, e 0,2% arabinose foi adicionado para indução de expressão de proteína. Após 4 horas de indução, as frações bacterianas foram coletadas por centrifugação (8.000xg, 30 minutos, 4°C) e a expressão da proteína de fusão SUMO-ORF2 foi observada por eletroforese de proteína e Western blot. As proteínas solúveis e insolúveis das bactérias foram também diferenciadas, e a solubilidade da proteína de fusão SUMO-ORF2 foi observada por eletroforese de proteína.[00084] The E. coli BL21 transformant was inoculated into LB medium containing chloramphenicol (25 μg/mL). Shake culture was performed at 37°C and 180 rpm. After overnight incubation, the bacterial solution was inoculated at a ratio of 1:100 into LB medium containing chloramphenicol (25 μg/mL). Shake culture was performed at 37°C and 180 rpm. Bacteria were grown to a concentration of approximately 0.4 to 0.6 OD600 measured by spectrophotometer, and 0.2% arabinose was added for induction of protein expression. After 4 hours of induction, bacterial fractions were collected by centrifugation (8,000xg, 30 minutes, 4°C) and expression of the SUMO-ORF2 fusion protein was observed by protein electrophoresis and Western blot. The soluble and insoluble proteins of bacteria were also differentiated, and the solubility of the SUMO-ORF2 fusion protein was observed by protein electrophoresis.

[00085] Após o filme eletroforético da proteína ser escaneado, a porcentagem de expressão da proteína de fusão SUMO-ORF2 recombinante foi estimada usando software Image Quant TL 7.0 (GE Healthcare Life Sciences, USA) e o rendimento da proteína de fusão foi ainda calculado.[00085] After the electrophoretic film of the protein was scanned, the percentage of expression of the recombinant SUMO-ORF2 fusion protein was estimated using Image Quant TL 7.0 software (GE Healthcare Life Sciences, USA) and the yield of the fusion protein was further calculated .

(2) Experimental results

[00086] Os resultados mostraram que, no grupo de pET-SUMO-ORF2 e pET-OPTSUMO-ORF2 transformados e induzidos em BL21 (DE3) de E. Coli, a proteína de fusão SUMO-ORF2 recombinante estava completamente ausente (Figura 2). No grupo em que o pET-SUMO-ORF2 foi transformado e induzido em Rosetta2 de E. coli, que é capaz de produzir o tRNA de códon raro correspondente, a proteína de fusão SUMO-ORF2 recombinante pode ser expressada (Figura 2) e a maioria das mesmas eram solúvel (Figura 3) de acordo com os resultados. O rendimento de proteína de fusão SUMO-ORF2 recombinante solúvel é 46,81 mg/L. O fato de que o gene ORF2 acima não pode ser expressado em BL21 (DE3) de E. coli indica que os códons carregados por ORF2 severamente afetam o desempenho da proteína de fusão SUMO-ORF2 em E. coli.[00086] The results showed that, in the group of pET-SUMO-ORF2 and pET-OPTSUMO-ORF2 transformed and induced in E. Coli BL21 (DE3), the recombinant SUMO-ORF2 fusion protein was completely absent (Figure 2) . In the group in which pET-SUMO-ORF2 was transformed and induced into E. coli Rosetta2, which is capable of producing the corresponding rare codon tRNA, the recombinant SUMO-ORF2 fusion protein could be expressed (Figure 2) and the Most of them were soluble (Figure 3) according to the results. The yield of soluble recombinant SUMO-ORF2 fusion protein is 46.81 mg/L. The fact that the above ORF2 gene cannot be expressed in BL21 (DE3) of E. coli indicates that the codons carried by ORF2 severely affect the performance of the SUMO-ORF2 fusion protein in E. coli.

[00087] pET-SUMO-OPTORF2 com o gene ORF2 otimizado no códon foi transformado em BL21(DE3) de E. coli e induzido. Os resultados mostraram que a proteína de fusão SUMO-ORF2 recombinante foi expressada com sucesso (Figura 2) e era principalmente uma proteína solúvel (Figura 3); o rendimento de proteína de fusão SUMO-ORF2 recombinante solúvel foi 54,62 mg/L. Este resultado mostra que após otimizar o códon ORF2, o desempenho da proteína de fusão SUMO-ORF2 em de BL21 (DE3) E. coli pode ser aperfeiçoado.[00087] pET-SUMO-OPTORF2 with the codon-optimized ORF2 gene was transformed into BL21(DE3) from E. coli and induced. The results showed that the recombinant SUMO-ORF2 fusion protein was successfully expressed (Figure 2) and was mainly a soluble protein (Figure 3); the yield of soluble recombinant SUMO-ORF2 fusion protein was 54.62 mg/L. This result shows that after optimizing the ORF2 codon, the performance of the SUMO-ORF2 fusion protein in BL21 (DE3) E. coli can be improved.

[00088] O vetor de expressão pET-OPTSUMO-OPTORF2 carregando o gene ORF2 de comprimento completo otimizado no códon e o gene SUMO otimizado no códon foi transformado em BL21 (DE3) de E. coli e induzido. Os resultados mostraram que a proteína de fusão SUMO-ORF2 recombinante pode ser expressada com sucesso (Figura 2), e é principalmente uma proteína solúvel (Figura 3); o rendimento da proteína de fusão SUMO-ORF2 recombinante solúvel é 81,66 mg/L. Este resultado mostra que após o uso de códon do gene de parceiro de fusão ser otimizado, o desempenho da proteína de fusão ORF2 em E. coli pode ser ainda aperfeiçoado. Estudos anteriores nunca mostraram que a otimização dos códons do gene SUMO pode aumentar a expressão de proteína de fusão. Os inventores da presente invenção confirmaram que a optimização do códon do gene SUMO pode aumentar a produção de proteína de fusão SUMO-ORF2.[00088] The pET-OPTSUMO-OPTORF2 expression vector carrying the codon-optimized full-length ORF2 gene and the codon-optimized SUMO gene was transformed into E. coli BL21 (DE3) and induced. The results showed that the recombinant SUMO-ORF2 fusion protein can be successfully expressed (Figure 2), and it is mainly a soluble protein (Figure 3); the yield of soluble recombinant SUMO-ORF2 fusion protein is 81.66 mg/L. This result shows that after the codon usage of the fusion partner gene is optimized, the performance of the ORF2 fusion protein in E. coli can be further improved. Previous studies have never shown that SUMO gene codon optimization can increase fusion protein expression. The inventors of the present invention have confirmed that codon optimization of the SUMO gene can increase the production of SUMO-ORF2 fusion protein.

[00089] Um fragmento de DNA, carregando a sequência a jusante-DNA de etiqueta His-o gene SUMO otimizado no códon-o gene ORF2 otimizado no códon, foi inserido no vetor de expressão induzido por arabinose pBCM-araM11 e transformado em BL21 de E. coli para a produção de proteína de fusão SUMO-ORF2 recombinante. Os resultados mostram que a proteína de fusão SUMO-ORF2 recombinante (Figura 2) também pode ser produzida usando sistemas de expressão induzindo arabinose sendo principalmente uma proteína solúvel (Figura 3). Usando este vetor de expressão para a produção da proteína de fusão SUMO-ORF2, o maior rendimento (103,04 mg/L) pode ser obtido. Por comparação com o maior rendimento (81,66 mg/L) do sistema de expressão de T7, o rendimento poderia ser aumentado por aproximadamente 1,27 vezes. Cada vetor de expressão de Exemplo 1 da presente invenção exibe o rendimento da proteína de fusão SUMO-ORF2 solúvel neste experimento como resumido na Tabela 3 abaixo. Tabela 3: Rendimentos de proteína de fusão SUMO-ORF2 solúvel [00089] A DNA fragment, carrying the downstream sequence-His tag DNA-the codon-optimized SUMO gene-the codon-optimized ORF2 gene, was inserted into the arabinose-induced expression vector pBCM-araM11 and transformed into BL21 of E. coli for the production of recombinant SUMO-ORF2 fusion protein. The results show that the recombinant SUMO-ORF2 fusion protein (Figure 2) can also be produced using expression systems inducing arabinose being mainly a soluble protein (Figure 3). Using this expression vector for the production of SUMO-ORF2 fusion protein, the highest yield (103.04 mg/L) can be obtained. By comparison with the higher yield (81.66 mg/L) of the T7 expression system, the yield could be increased by approximately 1.27 times. Each Example 1 expression vector of the present invention exhibits the yield of soluble SUMO-ORF2 fusion protein in this experiment as summarized in Table 3 below. Table 3: Yields of soluble SUMO-ORF2 fusion protein

Purification of Recombinant SUMO-ORF2 Fusion Protein Using Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography

[00090] A proteína foi purificada por cromatografia de afinidade de íon de metal imobilizado tirando vantagem do aspecto característico da proteína de fusão SUMO-ORF2 recombinante de ter a etiqueta His no N término da mesma, que pode formar uma ligação covalente com um íon níquel ou cobalto. A purificação foi realizada usando uma sistema de cromatografia de proteína líquida AKTA prime plus (GE Healthcare, Suécia) com 5 mL de coluna HiTrapTM Ni excel (GE Healthcare, Suécia).[00090] The protein was purified by immobilized metal ion affinity chromatography taking advantage of the characteristic feature of the recombinant SUMO-ORF2 fusion protein of having the His tag at the N terminus thereof, which can form a covalent bond with a nickel ion or cobalt. Purification was performed using an AKTA prime plus liquid protein chromatography system (GE Healthcare, Sweden) with a 5 mL HiTrapTM Ni excel column (GE Healthcare, Sweden).

[00091] Os grânulos foram colocados em suspensão em tampão de lise (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 8,0) e rompidos em dispositivo ultrassônico. O sobrenadante foi coletado por centrifugação (8.000xg, 15 minutos). Após equilibrar a coluna com 2 5 mL de tampão de lise, o sobrenadante rompido foi injetado na coluna HiTrapTM Ni excel. Após a injeção da amostra estar completa, proteínas não especificamente ligadas foram lavadas com 100 mL de tampão de lavagem (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 30 mM imidazol, pH 8,0). Finalmente, a proteína recombinante na resina foi eluída com 150 mL de tampão de eluição (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8,0), que competiu com a proteína recombinante para ligação ao sítio de ligação de resina com a ajuda de uma elevada concentração de imidazol, resultando na eluição da proteína de fusão SUMO-ORF2 recombinante da resina. A eletroforese da proteína foi usada para observar a purificação da proteína de fusão SUMO-ORF2 recombinante. Os resultados experimentais são mostrados na Figura 4.[00091] The granules were suspended in lysis buffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 8.0) and disrupted in an ultrasonic device. The supernatant was collected by centrifugation (8,000xg, 15 minutes). After equilibrating the column with 25 mL of lysis buffer, the disrupted supernatant was injected onto the HiTrapTM Ni excel column. After sample injection was complete, nonspecifically bound proteins were washed with 100 mL of wash buffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 30 mM imidazole, pH 8.0). Finally, the recombinant protein on the resin was eluted with 150 mL of elution buffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0), which competed with the recombinant protein for binding to the protein binding site. resin with the help of a high concentration of imidazole, resulting in the elution of the recombinant SUMO-ORF2 fusion protein from the resin. Protein electrophoresis was used to observe the purification of the recombinant SUMO-ORF2 fusion protein. The experimental results are shown in Figure 4.

The SUMO-ORF2 fusion protein of the present invention is cleaved with SUMO protease.

[00092] Este experimento utilizou SUMO protease para cortar a proteína de fusão ORF2 preparada a partir do sistema de expressão de E. coli. Após corte, fragmentos do parceiro de fusão SUMO com a etiqueta His e fragmentos da proteína do capsídeo podem ser obtidos. Neste experimento, SUMO protease foi produzida através de um sistema de expressão de E. coli e aplicada nas aplicações mencionadas acima. Os versados na técnica também podem realizar esta etapa usando SUMO protease obtida de outros modos.[00092] This experiment used SUMO protease to cut the ORF2 fusion protein prepared from the E. coli expression system. After cutting, fragments of the His-tagged SUMO fusion partner and fragments of the capsid protein can be obtained. In this experiment, SUMO protease was produced through an E. coli expression system and applied in the applications mentioned above. Those skilled in the art can also perform this step using SUMO protease obtained in other ways.

(1) Construction of recombinant SUMO protease expression vector pET-SUMOPH

[00093] O gene de SUMO protease foi amplificado usando genoma de Saccharomyces cerevisiae como o gabarito e SUMOPF (5'-CAATATGGATCCCTTGTTCCTGAATTAAATGAAAAAGACG-3'; SEQ ID NO: 47) / SUMOPENZHISR (5'-GATATACTCGAGTTAGTGATGGTGATGGTGATGACCACTGCCGCTACCTTTTAAAGC GTCGGTTAAAATCAAATG-3; SEQ ID NO: 48) como o conjunto de iniciadores. Os 50 μL da mistura de reação de PCR continham 1x tampão de PCR GDP-HiFi B, 200 μM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 1 μM de iniciadores de amplificação, 200 ng de DNA genômico de Saccharomyces cerevisiae, e 1 U de GDP-HiFi DNA polimerase. A condição de reação de PCR foi 96°C durante 5 minutos (1 ciclo); 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 68°C durante 30 segundos (35 ciclos); 68°C durante 5 minutos (1 ciclo). Após a reação, eletroforese de gel agarose foi usada para confirmar se o produto de PCR continha fragmentos de DNA com tamanho previsto. A seguir, o produto de PCR foi recuperado usando o kit PCR-MTM Clean Up system kit.[00093] The SUMO protease gene was amplified using Saccharomyces cerevisiae genome as the template and SUMOPF (5'-CAATATGGATCCCTTGTTCCTGAATTAAATGAAAAAGACG-3'; SEQ ID NO: 47) / SUMOPENZHISR (5'-GATATACTCGAGTTAGTGATGGTGATGGTGATGACCACTGCCGCTACCTTTTAAAGC GTCGGTTAAAATCAAATG-3; SEQ ID NO: 48) as the primer set. The 50 μL of PCR reaction mixture contained 1x GDP-HiFi B PCR buffer, 200 μM of dATP, dTTP, dGTP, and dCTP, 1 μM of amplification primers, 200 ng of Saccharomyces cerevisiae genomic DNA, and 1 U of GDP-HiFi DNA polymerase. The PCR reaction condition was 96°C for 5 minutes (1 cycle); 94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, 68°C for 30 seconds (35 cycles); 68°C for 5 minutes (1 cycle). After the reaction, agarose gel electrophoresis was used to confirm that the PCR product contained DNA fragments of the predicted size. Next, the PCR product was recovered using the PCR-MTM Clean Up system kit.

[00094] Após o gene de SUMO protease amplificado a partir do genoma de levedura ser cortado com BamHI e XhoI, o fragmento de DNA foi ligado em pET29a cortado com BamHI e SalI usando DNA ligase de T4. O produto ligado foi transformado em ECOS 9-5 de E. coli. Transformantes foram selecionados por reação em cadeia polimerase da colônia. Após confirmar que o plasmídeo recombinante no transformante carregou o DNA inserido por eletroforese de DNA, os plasmídeos no transformante foram extraídos e o DNA foi sequenciado. O plasmídeo com a sequência de DNA correta é chamado pET-SUMOPH, que tem SEQ ID NO: 49.[00094] After the SUMO protease gene amplified from the yeast genome was cut with BamHI and XhoI, the DNA fragment was ligated into pET29a cut with BamHI and SalI using T4 DNA ligase. The bound product was transformed into E. coli ECOS 9-5. Transformants were selected by colony polymerase chain reaction. After confirming that the recombinant plasmid in the transformant carried the inserted DNA by DNA electrophoresis, the plasmids in the transformant were extracted and the DNA was sequenced. The plasmid with the correct DNA sequence is called pET-SUMOPH, which has SEQ ID NO: 49.

(2) Construction of the recombinant D-SUMO Protease expression vector pET-D-SUMOPH

[00095] O gene de proteína D foi amplificado usando DNA de fago Lambda (Promega, USA) como um gabarito e DF (5'-GATATAGGTACCATGACGAGCAAAGAAACCTTTACC-3'; SEQ ID NO: 50) e DR (5'-CAATATGGATCCAACGATGCTGATTGCCGTTC-3'; SEQ ID NO: 51) como o conjunto de iniciadores. Os 50 μL da mistura de reação de PCR continham 1x tampão de PCR GDP-HiFi B, 200 μM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 1 μM de iniciadores de amplificação, 100 ng de DNA de fago Lambda, e 1 U de GDP-HiFi DNA polimerase. A condição de reação de PCR foi 96°C durante 5 minutos (1 ciclo); 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 68°C durante 30 segundos (35 ciclos); 68°C durante 5 minutos (1 ciclo). Após a reação, eletroforese de gel agarose foi usada para confirmar se o produto de PCR continha fragmentos de DNA com tamanho previsto. A seguir, o produto de PCR foi recuperado usando o kit PCR-MTM Clean Up system kit.[00095] The protein D gene was amplified using Lambda phage DNA (Promega, USA) as a template and DF (5'-GATATAGGTACCATGACGAGCAAAGAAACCTTTACC-3'; SEQ ID NO: 50) and DR (5'-CAATATGGATCCAACGATGCTGATTGCCGTTC-3' ; SEQ ID NO: 51) as the primer set. The 50 μL of PCR reaction mixture contained 1x GDP-HiFi B PCR buffer, 200 μM of dATP, dTTP, dGTP, and dCTP, 1 μM of amplification primers, 100 ng of Lambda phage DNA, and 1 U of GDP -HiFi DNA polymerase. The PCR reaction condition was 96°C for 5 minutes (1 cycle); 94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, 68°C for 30 seconds (35 cycles); 68°C for 5 minutes (1 cycle). After the reaction, agarose gel electrophoresis was used to confirm that the PCR product contained DNA fragments of the predicted size. Next, the PCR product was recovered using the PCR-MTM Clean Up system kit.

[00096] Após o gene de proteína D amplificado a partir de DNA de fago Lambda ser cortado com KpnI e BamHI, o fragmento de DNA foi ligado em pET29a cortado com as mesmas enzimas de restrição usando DNA ligase de T4. O produto ligado foi transformado em ECOS 9-5 de E. coli. Transformantes foram selecionados por reação em cadeia polimerase da colônia. Após confirmar que o plasmídeo recombinante no transformante carregou o DNA inserido por eletroforese de DNA, os plasmídeos no transformante foram extraídos e o DNA foi sequenciado. O plasmídeo com a sequência de DNA correta é chamado pET-D, que tem SEQ ID NO: 99.[00096] After the protein D gene amplified from Lambda phage DNA was cut with KpnI and BamHI, the DNA fragment was ligated into pET29a cut with the same restriction enzymes using T4 DNA ligase. The bound product was transformed into E. coli ECOS 9-5. Transformants were selected by colony polymerase chain reaction. After confirming that the recombinant plasmid in the transformant carried the inserted DNA by DNA electrophoresis, the plasmids in the transformant were extracted and the DNA was sequenced. The plasmid with the correct DNA sequence is called pET-D, which has SEQ ID NO: 99.

[00097] Após o gene de SUMO protease amplificado a partir do genoma de levedura ser cortado com BamHI e XhoI, o fragmento de DNA foi ligado em pET-D cortado com BamHI e SalI usando DNA ligase de T4. O produto ligado foi transformado em ECOS 9-5 de E. coli. Transformantes foram selecionados por reação em cadeia polimerase da colônia. Após confirmar que o plasmídeo recombinante no transformante carregou o DNA inserido por eletroforese de DNA, os plasmídeos no transformante foram extraídos e o DNA foi sequenciado. O plasmídeo com o DNA correto é chamado pET-D-SUMOPH, que tem SEQ ID NO: 52.[00097] After the SUMO protease gene amplified from the yeast genome was cut with BamHI and XhoI, the DNA fragment was ligated into pET-D cut with BamHI and SalI using T4 DNA ligase. The bound product was transformed into E. coli ECOS 9-5. Transformants were selected by colony polymerase chain reaction. After confirming that the recombinant plasmid in the transformant carried the inserted DNA by DNA electrophoresis, the plasmids in the transformant were extracted and the DNA was sequenced. The plasmid with the correct DNA is called pET-D-SUMOPH, which has SEQ ID NO: 52.

(3) Induced expression and purification of recombinant proteases

[00098] Vetores de expressão de pET-SUMOPH e pET-D-SUMOPH foram transformados em BL21(DE3) de E. coli, respectivamente. O transformante BL21(DE3) de E. coli foi inoculado em um meio LB contendo canamicina (concentração final: 30 μg/mL) e a cultura agitada a 37°C e 180 rpm. Após incubação noturna, a solução bacteriana foi inoculada a uma razão de 1:100 em meio LB contendo canamicina (concentração final 30 μg/mL). Cultura agitada foi realizada a 37°C e 180 rpm. Bactérias foram cultivadas a uma concentração de aproximadamente 0,4 a 0,6 OD600 medida por espectrofotômetro, e 0,1 mM de IPTG foi adicionado para indução de expressão de proteína. Após 4 horas de indução, as frações bacterianas foram coletadas por centrifugação (8.000xg, 30 minutos, 4°C) para diferenciação de proteínas solúveis e insolúveis. A solubilidade da protease recombinante foi observada por eletroforese de proteína e Western blot. Os anticorpos primários e secundários usados em métodos de Western blot foram anticorpos policlonais de etiqueta anti-His de coelho e anticorpos anti-coelho de cabra conjugados a fosfatase alcalina, respectivamente. O agente colorante usado foi NBT/BCIP. O método de purificação da protease recombinante é igual ao método de purificação da proteína de fusão ORF2 recombinante.[00098] pET-SUMOPH and pET-D-SUMOPH expression vectors were transformed into E. coli BL21(DE3), respectively. The E. coli BL21(DE3) transformant was inoculated into LB medium containing kanamycin (final concentration: 30 μg/mL) and the culture was shaken at 37°C and 180 rpm. After overnight incubation, the bacterial solution was inoculated at a ratio of 1:100 into LB medium containing kanamycin (final concentration 30 μg/mL). Shake culture was performed at 37°C and 180 rpm. Bacteria were grown to a concentration of approximately 0.4 to 0.6 OD600 measured by spectrophotometer, and 0.1 mM IPTG was added for induction of protein expression. After 4 hours of induction, bacterial fractions were collected by centrifugation (8,000xg, 30 minutes, 4°C) to differentiate soluble and insoluble proteins. The solubility of the recombinant protease was observed by protein electrophoresis and Western blot. The primary and secondary antibodies used in Western blot methods were rabbit anti-His tag polyclonal antibodies and goat anti-rabbit antibodies conjugated to alkaline phosphatase, respectively. The coloring agent used was NBT/BCIP. The recombinant protease purification method is the same as the recombinant ORF2 fusion protein purification method.

[00099] Os resultados mostraram que ambas a SUMO protease e a D-SUMO protease podem ser expressadas em BL21 (DE3) de E. coli (Figura 5), com rendimentos de 20,55 mg/L e 46,94 mg/L, respectivamente, em que o rendimento de D-SUMO protease foi maior. O número molar foi cerca de 2,2 vezes o da SUMO protease. Este resultado mostra que a estratégia de expressão de fusão pode aumentar o nível de expressão de SUMO protease em E. coli.[00099] The results showed that both SUMO protease and D-SUMO protease can be expressed in BL21 (DE3) of E. coli (Figure 5), with yields of 20.55 mg/L and 46.94 mg/L , respectively, in which the yield of D-SUMO protease was higher. The molar number was about 2.2 times that of SUMO protease. This result shows that the fusion expression strategy can increase the expression level of SUMO protease in E. coli.

[000100] A proteína foi então purificada por cromatografia de afinidade de íon metálico imobilizado alcançando vantagem do aspecto característico da protease recombinante de ter a etiqueta His no C-término da mesma. Os resultados mostraram que a SUMO protease e a D-SUMO protease recombinantes solúveis podem ser purificadas usando a coluna de afinidade de íon metálico imobilizado (Figura 6), em que o rendimento purificado de D-SUMO protease foi maior. Vinte e um vírgula 5 (21,50) mg de proteína podem ser purificado do meio de 1 L, que é aproximadamente 1,4 vezes o rendimento purificado de SUMO protease (15,33 mg).[000100] The protein was then purified by immobilized metal ion affinity chromatography taking advantage of the characteristic aspect of the recombinant protease of having the His tag at its C-terminus. The results showed that soluble recombinant SUMO protease and D-SUMO protease could be purified using the immobilized metal ion affinity column (Figure 6), in which the purified yield of D-SUMO protease was higher. Twenty-one point 5 (21.50) mg of protein can be purified from the 1 L medium, which is approximately 1.4 times the purified yield of SUMO protease (15.33 mg).

(4) Cutting the recombinant SUMO-ORF2 fusion protein and observing the formation of virus-like particles

[000101] A proteína de fusão SUMO-ORF2 purificada recombinante foi misturada com uma protease recombinante (SUMO protease ou D-SUMO protease) a uma razão de 1:0.05 em peso (por exemplo, 1 mg de proteína de fusão ORF2 recombinante e 0,05 mg de protease recombinante), e a mistura foi incubada a 4°C durante 16 horas. A solução de proteína cortada foi colocada em uma coluna giratória Amicon ultra-15 ultracel-100K (Merck Millipore, USA) e centrifugada a 2, 600xg a 4°C em um volume apropriado. Após isto, a proteína cortada foi filtrada usando 100 kDa de filtro de celulose regenerada. Os resultados mostraram que o uso da membrana de 100 kDa pode remover, de modo eficaz, os parceiros de fusão, eliminando a necessidade de usar cromatografia de coluna para separar ORF2 de seu parceiro de fusão, o que abaixa, de modo eficaz, os custos para a produção de antígenos (Figura 7).[000101] The purified recombinant SUMO-ORF2 fusion protein was mixed with a recombinant protease (SUMO protease or D-SUMO protease) at a ratio of 1:0.05 by weight (e.g., 1 mg of recombinant ORF2 fusion protein and 0 .05 mg of recombinant protease), and the mixture was incubated at 4°C for 16 hours. The chopped protein solution was placed on an Amicon ultra-15 ultracel-100K spin column (Merck Millipore, USA) and centrifuged at 2, 600xg at 4°C in an appropriate volume. After this, the cut protein was filtered using 100 kDa regenerated cellulose filter. The results showed that the use of the 100 kDa membrane can effectively remove fusion partners, eliminating the need to use column chromatography to separate ORF2 from its fusion partner, which effectively lowers costs. for the production of antigens (Figure 7).

[000102] A seguir, a proteína de fusão SUMO-ORF2, a proteína de fusão SUMO-ORF2 cortada com protease, e a proteína de fusão ORF2 obtida por clivagem de protease e filtração foram respectivamente colocadas em uma grade de cobre e deixadas em temperatura ambiente durante 3 minutos. A água em excesso foi então removida com um papel de filtro, e corante de acetato de uranila foi adicionado para coloração negativa. O tempo de coloração foi cerca de 40 segundos a 1 minuto. O corante em excesso foi então removido com um papel de filtro, e as partículas tipo vírus foram observadas com um microscópio eletrônico de transmissão emissão no campo JEM-2100F (JEOL, Japão).[000102] Next, the SUMO-ORF2 fusion protein, the SUMO-ORF2 fusion protein cut with protease, and the ORF2 fusion protein obtained by protease cleavage and filtration were respectively placed on a copper grid and left at temperature environment for 3 minutes. Excess water was then removed with filter paper, and uranyl acetate dye was added for negative staining. The staining time was about 40 seconds to 1 minute. The excess dye was then removed with a filter paper, and the virus-like particles were observed with a JEM-2100F field emission transmission electron microscope (JEOL, Japan).

[000103] Os resultados mostraram que a proteína de fusão SUMO-ORF2 não pode formar partículas tipo vírus, mas a proteína de fusão SUMO-ORF2 recombinante cortada por protease, e a proteína de fusão ORF2 obtida por corte com protease e filtrada podem, ambas, formar partículas tipo vírus (Figura 8). O tamanho de partícula médio das partículas tipo vírus, calculado por micrografias eletrônicas de transmissão, foi aproximadamente 19 nm.[000103] The results showed that the SUMO-ORF2 fusion protein cannot form virus-like particles, but the protease-cut recombinant SUMO-ORF2 fusion protein, and the protease-cut and filtered ORF2 fusion protein can both , form virus-like particles (Figure 8). The average particle size of the virus-like particles, calculated from transmission electron micrographs, was approximately 19 nm.

Example 3: Preparation of porcine interferon

[000104] A presente invenção descreve que interferon suíno pode ser usado como um adjuvante que é particularmente apropriado para uma vacina de subunidade de PCV2. Assim, o interferon-α suíno e interferon-Y suíno requeridos para a vacina de subunidade da presente invenção são produzidos em células hospedeiras de E coli neste Exemplo.[000104] The present invention describes that porcine interferon can be used as an adjuvant that is particularly suitable for a PCV2 subunit vaccine. Thus, porcine interferon-α and porcine interferon-Y required for the subunit vaccine of the present invention are produced in E coli host cells in this Example.

Synthesis of recombinant porcine interferon-α (IFN-α) and Y (IFN-Y) genes (1) IFN-α gene synthesis

[000105] A sequência de aminoácidos do interferon-α-6 suíno maduro foi inversamente derivada como uma sequência de nucleotídeo com base em um códon preferido para E. coli. Iniciadores foram projetados com base na sequência de nucleotídeos: OPTIFNA-T1, OPTIFNA-T2, OPTIFNA-T3, OPTIFNA-T4, OPTIFNA-T5, OPTIFNA-T6, OPTIFNA-T7, OPTIFNA-T8, OPTIFNAF, e OPTIFNAR. As sequências são mostrados na Tabela 4. Tabela 4: Iniciadores para síntese do gene de interferon-α-6 suíno otimizado no codon [000105] The amino acid sequence of mature porcine interferon-α-6 was inversely derived as a nucleotide sequence based on a preferred codon for E. coli. Primers were designed based on the nucleotide sequence: OPTIFNA-T1, OPTIFNA-T2, OPTIFNA-T3, OPTIFNA-T4, OPTIFNA-T5, OPTIFNA-T6, OPTIFNA-T7, OPTIFNA-T8, OPTIFNAF, and OPTIFNAR. The sequences are shown in Table 4. Table 4: Primers for codon-optimized porcine interferon-α-6 gene synthesis

[000106] OPTIFNA-T1 a OPTIFNA-T8 foram usados como iniciadores de gabarito, e OPTIFNAF e OPTIFNAR foram usados como iniciadores de amplificação. Reação em cadeia polimerase de sobreposição-extensão foi usada para amplificar massivamente o gene de IFN-α otimizado no códon. Os 50 μL da mistura de reação de PCR continham 1X tampão de PCR GDP-HiFi B, 200 μM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 1 μM de cada iniciador, e 1 U de GDP-HiFi DNA polimerase. A condição de reação de PCR foi 96°C durante 2 minutos (1 ciclo); 94°C durante 30 segundos, 58°C durante 30 segundos, 68°C durante 30 segundos (35 ciclos); 68°C durante 5 minutos (1 ciclo). Após a reação, eletroforese de gel agarose foi usada para confirmar se o produto de PCR continha fragmentos de DNA com tamanho previsto. A seguir, o produto de PCR foi recuperado usando o kit PCR-MTM Clean Up system kit.[000106] OPTIFNA-T1 to OPTIFNA-T8 were used as template primers, and OPTIFNAF and OPTIFNAR were used as amplification primers. Overlap-extension polymerase chain reaction was used to massively amplify the codon-optimized IFN-α gene. The 50 μL of PCR reaction mixture contained 1X GDP-HiFi B PCR buffer, 200 μM of dATP, dTTP, dGTP, and dCTP, 1 μM of each primer, and 1 U of GDP-HiFi DNA polymerase. The PCR reaction condition was 96°C for 2 minutes (1 cycle); 94°C for 30 seconds, 58°C for 30 seconds, 68°C for 30 seconds (35 cycles); 68°C for 5 minutes (1 cycle). After the reaction, agarose gel electrophoresis was used to confirm that the PCR product contained DNA fragments of the predicted size. Next, the PCR product was recovered using the PCR-MTM Clean Up system kit.

[000107] Clonagem do gene foi realizada usando o kit CloneJET PCR Cloning kit (Thermo, USA), e a mistura de ligação foi transformada em ECOS 9-5 de E. coli. Transformantes foram selecionados por reação em cadeia polimerase da colônia. Após confirmar que o plasmídeo recombinante no transformante carregou o DNA inserido por eletroforese de DNA, os plasmídeos no transformante foram extraídos e o DNA foi sequenciado. O plasmídeo com a sequência de DNA correta é chamado pJET-IFNA-6, que tem SEQ ID NO: 63. Após verificação da sequência, o gene de IFN-α otimizado no códon tem SEQ ID NO: 64.[000107] Gene cloning was performed using the CloneJET PCR Cloning kit (Thermo, USA), and the ligation mixture was transformed into E. coli ECOS 9-5. Transformants were selected by colony polymerase chain reaction. After confirming that the recombinant plasmid in the transformant carried the inserted DNA by DNA electrophoresis, the plasmids in the transformant were extracted and the DNA was sequenced. The plasmid with the correct DNA sequence is called pJET-IFNA-6, which has SEQ ID NO: 63. After sequence verification, the codon-optimized IFN-α gene has SEQ ID NO: 64.

(2) IFN-γ synthesis

[000108] A sequência de aminoácidos do interferon-y suíno maduro foi revertida para uma sequência de nucleotídeo com base em um códon preferido para E. coli. Iniciadores foram projetados com base nas sequências de nucleotídeos acima mencionadas: OPTIFNR-T1, OPTIFNR-T2, OPTIFNR-T3, OPTIFNR-T4, OPTIFNR-T5, OPTIFNR-T6, OPTIFNR-T7, OPTIFNR-T8, OPTIFNRF, e OPTIFNRR. As sequências são mostrados na Tabela 5. Tabela 5: Iniciadores para a síntese do gene de interferon-y suíno otimizado no codon [000108] The amino acid sequence of mature porcine interferon-γ was reverted to a nucleotide sequence based on a preferred codon for E. coli. Primers were designed based on the above-mentioned nucleotide sequences: OPTIFNR-T1, OPTIFNR-T2, OPTIFNR-T3, OPTIFNR-T4, OPTIFNR-T5, OPTIFNR-T6, OPTIFNR-T7, OPTIFNR-T8, OPTIFNRF, and OPTIFNRR. The sequences are shown in Table 5. Table 5: Primers for codon-optimized porcine interferon-γ gene synthesis

[000109] OPTIFNR-T1 para OPTIFNR-T8 foram usados como iniciadores de gabarito, e OPTIFNRF e OPTIFNRR foram usados como iniciadores de amplificação. Reação em cadeia polimerase de sobreposição-extensão foi usada para amplificar massivamente o gene de IFN-y otimizado no códon. Os 50 μL da mistura de reação de PCR continham 1X tampão de PCR GDP-HiFi B, 200 μM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 1 μM de cada iniciador, e 1 U de GDP-HiFi DNA polimerase. A condição de reação de PCR foi 96°C durante 2 minutos (1 ciclo); 94°C durante 30 segundos, 57°C durante 30 segundos, 68°C durante 30 segundos (35 ciclos); 68°C durante 5 minutos (1 ciclo). Após a reação, eletroforese de gel agarose foi usada para confirmar se o produto de PCR continha fragmentos de DNA com tamanho previsto. A seguir, o produto de PCR foi recuperado usando o kit PCR-MTM Clean Up system kit.[000109] OPTIFNR-T1 to OPTIFNR-T8 were used as template primers, and OPTIFNRF and OPTIFNRR were used as amplification primers. Overlap-extension polymerase chain reaction was used to massively amplify the codon-optimized IFN-γ gene. The 50 μL of PCR reaction mixture contained 1X GDP-HiFi B PCR buffer, 200 μM of dATP, dTTP, dGTP, and dCTP, 1 μM of each primer, and 1 U of GDP-HiFi DNA polymerase. The PCR reaction condition was 96°C for 2 minutes (1 cycle); 94°C for 30 seconds, 57°C for 30 seconds, 68°C for 30 seconds (35 cycles); 68°C for 5 minutes (1 cycle). After the reaction, agarose gel electrophoresis was used to confirm that the PCR product contained DNA fragments of the predicted size. Next, the PCR product was recovered using the PCR-MTM Clean Up system kit.

[000110] Clonagem do gene foi realizada usando o kit CloneJET PCR Cloning Kit, e a mistura de ligação foi transformada em ECOS 9-5 de E. coli. Transformantes foram selecionados por reação em cadeia polimerase da colônia. Após confirmar que o plasmídeo recombinante no transformante carregou o DNA inserido por eletroforese de DNA, os plasmídeos no transformante foram extraídos e o DNA foi sequenciado. O plasmídeo com a sequência de DNA correta é chamado pJET-IFNR, que tem SEQ ID NO: 75. Após verificação da sequência, o gene de IFN-y otimizado no códon tem SEQ ID NO: 76.[000110] Gene cloning was performed using the CloneJET PCR Cloning Kit, and the ligation mixture was transformed into E. coli ECOS 9-5. Transformants were selected by colony polymerase chain reaction. After confirming that the recombinant plasmid in the transformant carried the inserted DNA by DNA electrophoresis, the plasmids in the transformant were extracted and the DNA was sequenced. The plasmid with the correct DNA sequence is called pJET-IFNR, which has SEQ ID NO: 75. After sequence verification, the codon-optimized IFN-γ gene has SEQ ID NO: 76.

Construction of porcine interferon-α and Y expression vectors (1) Construction of the pET-OPTPIFNAH expression vector

[000111] O gene de IFN-α foi amplificado usando o plasmídeo pJET-IFNA—6 como um gabarito e PIFNANDEIF (5‘- CAATATCATATGTGCGATCTGCCGCAAACC—3’; SEQ ID NO: 77)/PIFNAHISSALIR (5‘-GATATAGTCGACTTATTAGTGATGGTG ATGGTGATGTTCCTTTTTACGCAGGCGGTC—3’; SEQ ID NO: 78) como o conjunto de iniciadores. Os 50 μL da mistura de reação de PCR continham 1x tampão de PCR GDP-HiFi B, 200 μM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 1 μM de iniciadores de amplificação, 100 ng de pJET-IFNA-6, e 1 U de GDP-HiFi DNA polimerase. A condição de reação de PCR foi 96°C durante 2 minutos (1 ciclo); 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 68°C durante 30 segundos (35 ciclos); 68°C durante 5 minutos (1 ciclo). Após a reação, eletroforese de gel agarose foi usada para confirmar se o produto de PCR continha fragmentos de DNA com tamanho previsto. A seguir, o produto de PCR foi recuperado usando o kit PCR-MTM Clean Up system kit.[000111] The IFN-α gene was amplified using the plasmid pJET-IFNA—6 as a template and PIFNANDEIF (5'-CAATATCATATGTGCGATTCTGCCGCAAACC—3'; SEQ ID NO: 77)/PIFNAHISSALIR (5'-GATATAGTCGACTTATTAGTGATGGTG ATGGTGATGTTCCTTTTTACGCAGGCGGTC—3' ; SEQ ID NO: 78) as the primer set. The 50 μL of PCR reaction mixture contained 1x GDP-HiFi B PCR buffer, 200 μM of dATP, dTTP, dGTP, and dCTP, 1 μM of amplification primers, 100 ng of pJET-IFNA-6, and 1 U of GDP-HiFi DNA polymerase. The PCR reaction condition was 96°C for 2 minutes (1 cycle); 94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, 68°C for 30 seconds (35 cycles); 68°C for 5 minutes (1 cycle). After the reaction, agarose gel electrophoresis was used to confirm that the PCR product contained DNA fragments of the predicted size. Next, the PCR product was recovered using the PCR-MTM Clean Up system kit.

[000112] Após o produto de PCR ser cortado com NdeI e SalI, o fragmento de DNA foi ligado em pET29a cortado com as mesmas enzimas de restrição usando DNA ligase de T4. O produto ligado foi transformado em ECOS 9-5 de E. coli. Transformantes foram selecionados por reação em cadeia polimerase da colônia. Após confirmar que o plasmídeo recombinante no transformante carregou o DNA inserido por eletroforese de DNA, os plasmídeos no transformante foram extraídos e o DNA foi sequenciado. O plasmídeo com a sequência de DNA correta é chamado pET-OPTPIFNAH, que tem SEQ ID NO: 79.[000112] After the PCR product was cut with NdeI and SalI, the DNA fragment was ligated into pET29a cut with the same restriction enzymes using T4 DNA ligase. The bound product was transformed into E. coli ECOS 9-5. Transformants were selected by colony polymerase chain reaction. After confirming that the recombinant plasmid in the transformant carried the inserted DNA by DNA electrophoresis, the plasmids in the transformant were extracted and the DNA was sequenced. The plasmid with the correct DNA sequence is called pET-OPTPIFNAH, which has SEQ ID NO: 79.

(2) Construction of the pBA-OPTPIFNAH expression vector

[000113] Após o gene de IFN-α amplificado por PCR ser cortado com NdeI e SalI, os fragmentos de DNA foram respectivamente ligados em pBCM-araM11 cortado com as mesmas enzimas de restrição usando DNA ligase de T4. O produto ligado foi transformado em ECOS 9-5 de E. coli. Transformantes foram selecionados por reação em cadeia polimerase da colônia. Após confirmar que o plasmídeo recombinante no transformante carregou o DNA inserido por eletroforese de DNA, os plasmídeos no transformante foram extraídos e o DNA foi sequenciado. O plasmídeo com a sequência de DNA correta é chamado pBA-OPTPIFNAH, que tem SEQ ID NO: 80.[000113] After the PCR-amplified IFN-α gene was cut with NdeI and SalI, the DNA fragments were respectively ligated into pBCM-araM11 cut with the same restriction enzymes using T4 DNA ligase. The bound product was transformed into E. coli ECOS 9-5. Transformants were selected by colony polymerase chain reaction. After confirming that the recombinant plasmid in the transformant carried the inserted DNA by DNA electrophoresis, the plasmids in the transformant were extracted and the DNA was sequenced. The plasmid with the correct DNA sequence is called pBA-OPTPIFNAH, which has SEQ ID NO: 80.

(3) Construction of the pET-SUMO-OPTPIFNAH expression vector

[000114] O gene SUMO foi amplificado usando genoma de Saccharomyces cerevisiae como o gabarito e SUMOF (SEQ ID NO: 25)/SUMOR2 (5'-ACCACCAATCTGTTCTCTGTGAGC-3'; SEQ ID NO: 81) como o conjunto de iniciadores. Os 50 μL da mistura de reação de PCR continham 1x tampão de PCR GDP-HiFi B, 200 μM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 1 μM de iniciadores de amplificação, 200 ng do DNA genômico de Saccharomyces cerevisiae, e 1 U de GDP-HiFi DNA polimerase. A condição de reação de PCR foi 96°C durante 5 minutos (1 ciclo); 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 68°C durante 30 segundos (35 ciclos); 68°C durante 5 minutos (1 ciclo). Após a reação, eletroforese de gel agarose foi usada para confirmar se o produto de PCR continha fragmentos de DNA com tamanho previsto. A seguir, o produto de PCR foi recuperado usando o kit Gel-MTM gel extraction system kit.[000114] The SUMO gene was amplified using Saccharomyces cerevisiae genome as the template and SUMOF (SEQ ID NO: 25)/SUMOR2 (5'-ACCACCAATCTGTTCTCTGTGAGC-3'; SEQ ID NO: 81) as the primer set. The 50 μL of PCR reaction mixture contained 1x GDP-HiFi B PCR buffer, 200 μM of dATP, dTTP, dGTP, and dCTP, 1 μM amplification primers, 200 ng of Saccharomyces cerevisiae genomic DNA, and 1 U of GDP-HiFi DNA polymerase. The PCR reaction condition was 96°C for 5 minutes (1 cycle); 94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, 68°C for 30 seconds (35 cycles); 68°C for 5 minutes (1 cycle). After the reaction, agarose gel electrophoresis was used to confirm that the PCR product contained DNA fragments of the predicted size. Next, the PCR product was recovered using the Gel-MTM gel extraction system kit.

[000115] O gene de IFN- α foi amplificado usando plasmídeo pJET-IFNA-6 como o gabarito e SUMOIFNAF (5'-GCTCACAGAGAACAGATTGGTGGTTGCGATCTGCCGCAAACC-3'; SEQ ID NO: 82) / PIFNAHISSALIR (SEQ ID NO: 78) como o conjunto de iniciadores. Os 50 μL da mistura de reação de PCR continham 1xtampão de PCR GDP-HiFi B, 200 μM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 1 μM de iniciadores de amplificação, 100 ng de plasmídeo pJET-IFNA-6, e 1 U de GDP-HiFi DNA polimerase. A condição de reação de PCR foi 96°C durante 5 minutos (1 ciclo); 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 68°C durante 30 segundos (35 ciclos); 68°C durante 5 minutos (1 ciclo). Após a reação, eletroforese de gel agarose foi usada para confirmar se o produto de PCR continha fragmentos de DNA com tamanho previsto. A seguir, o produto de PCR foi recuperado usando o kit Gel-MTM gel extraction system kit.[000115] The IFN-α gene was amplified using plasmid pJET-IFNA-6 as the template and SUMOIFNAF (5'-GCTCACAGAGAACAGATTGGTGGTTGCGATCTGCCGCAAACC-3'; SEQ ID NO: 82) / PIFNAHISSALIR (SEQ ID NO: 78) as the set of initiators. The 50 μL of PCR reaction mixture contained 1x GDP-HiFi B PCR buffer, 200 μM of dATP, dTTP, dGTP, and dCTP, 1 μM of amplification primers, 100 ng of pJET-IFNA-6 plasmid, and 1 U of GDP-HiFi DNA polymerase. The PCR reaction condition was 96°C for 5 minutes (1 cycle); 94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, 68°C for 30 seconds (35 cycles); 68°C for 5 minutes (1 cycle). After the reaction, agarose gel electrophoresis was used to confirm that the PCR product contained DNA fragments of the predicted size. Next, the PCR product was recovered using the Gel-MTM gel extraction system kit.

[000116] O gene de fusão SUMO-IFN-α foi obtido por reação em cadeia polimerase usando os dois produtos de PCR obtidos acima como o gabarito e SUMOF (SEQ ID NO: 25)/PIFNAHISSALIR (SEQ ID NO: 78) como o conjunto de iniciadores. Os 50 μL da mistura de reação de PCR continham 1x tampão de PCR GDP-HiFi B, 200 μM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 1 μM de iniciadores de amplificação, 100 ng de SUMO produto PCR, 100 ng de produto PCR IFN-α, e 1 U de GDP-HiFi DNA polimerase. A condição de reação de PCR foi 96°C durante 2 minutos (1 ciclo); 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 68°C durante 1 minuto (35 ciclos); 68°C durante 5 minutos (1 ciclo). Após a reação, eletroforese de gel agarose foi usada para confirmar se o produto de PCR continha fragmentos de DNA com tamanho previsto. A seguir, o produto de PCR foi recuperado usando o kit PCR-MTM Clean Up system kit.[000116] The SUMO-IFN-α fusion gene was obtained by polymerase chain reaction using the two PCR products obtained above as the template and SUMOF (SEQ ID NO: 25)/PIFNAHISSALIR (SEQ ID NO: 78) as the starter set. The 50 μL of PCR reaction mixture contained 1x GDP-HiFi B PCR buffer, 200 μM dATP, dTTP, dGTP, and dCTP, 1 μM amplification primers, 100 ng SUMO PCR product, 100 ng IFN PCR product -α, and 1 U of GDP-HiFi DNA polymerase. The PCR reaction condition was 96°C for 2 minutes (1 cycle); 94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, 68°C for 1 minute (35 cycles); 68°C for 5 minutes (1 cycle). After the reaction, agarose gel electrophoresis was used to confirm that the PCR product contained DNA fragments of the predicted size. Next, the PCR product was recovered using the PCR-MTM Clean Up system kit.

[000117] Após o produto de PCR ser cortado com KpnI e SalI, o fragmento de DNA foi ligado em pET29a cortado com as mesmas enzimas de restrição usando DNA ligase de T4. O produto ligado foi transformado em ECOS 9-5 de E. coli. Transformantes foram selecionados por reação em cadeia polimerase da colônia. Após confirmar que o plasmídeo recombinante no transformante carregou o DNA inserido por eletroforese de DNA, os plasmídeos no transformante foram extraídos e o DNA foi sequenciado. O plasmídeo com a sequência de DNA correta é chamado pET-SUMO-OPTPIFNAH, que tem SEQ ID NO: 83.[000117] After the PCR product was cut with KpnI and SalI, the DNA fragment was ligated into pET29a cut with the same restriction enzymes using T4 DNA ligase. The bound product was transformed into E. coli ECOS 9-5. Transformants were selected by colony polymerase chain reaction. After confirming that the recombinant plasmid in the transformant carried the inserted DNA by DNA electrophoresis, the plasmids in the transformant were extracted and the DNA was sequenced. The plasmid with the correct DNA sequence is called pET-SUMO-OPTPIFNAH, which has SEQ ID NO: 83.

(4) Construction of the expression vector pET-OPTSUMO- OPTPIFNAH

[000118] O gene OPTSUMO foi amplificado usando pET-OPTSUMO-ORF2 (SEQ ID NO: 43) como o gabarito e OPTSUMOF (SEQ ID NO: 35)/ OPTSUMOR2 (5'-GCCGCCGATTTGTTCACGG-3'; SEQ ID NO: 84) como o conjunto de iniciadores.[000118] The OPTSUMO gene was amplified using pET-OPTSUMO-ORF2 (SEQ ID NO: 43) as the template and OPTSUMOF (SEQ ID NO: 35)/ OPTSUMOR2 (5'-GCCGCCGATTTGTTCACGG-3'; SEQ ID NO: 84) as the starter set.

[000119] Os 50 μL da mistura de reação de PCR continham 1x tampão de PCR GDP-HiFi B, 200 μM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 1 μM de iniciadores de amplificação, 100 ng de pET-OPTSUMO-ORF2, e 1 U de GDP-HiFi DNA polimerase. A condição de reação de PCR foi 96°C durante 2 minutos (1 ciclo); 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 68°C durante 30 segundos (35 ciclos); 68°C durante 5 minutos (1 ciclo). Após a reação, eletroforese de gel agarose foi usada para confirmar se o produto de PCR continha fragmentos de DNA com tamanho previsto. A seguir, o produto de PCR foi recuperado usando o kit Gel-MTM gel extraction system kit.[000119] The 50 μL of PCR reaction mixture contained 1x GDP-HiFi B PCR buffer, 200 μM of dATP, dTTP, dGTP and dCTP, 1 μM of amplification primers, 100 ng of pET-OPTSUMO-ORF2, and 1 U of GDP-HiFi DNA polymerase. The PCR reaction condition was 96°C for 2 minutes (1 cycle); 94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, 68°C for 30 seconds (35 cycles); 68°C for 5 minutes (1 cycle). After the reaction, agarose gel electrophoresis was used to confirm that the PCR product contained DNA fragments of the predicted size. Next, the PCR product was recovered using the Gel-MTM gel extraction system kit.

[000120] O gene de IFN-α foi amplificado usando pJET-IFNA-6 plasmídeo (SEQ ID NO: 63) como o gabarito e OPTSUMOIFNAF (CCGTGAACAAATCGGCGGCTGCGATCTGCCGCAAACC; SEQ ID NO: 85) / PIFNAHISSALIR (SEQ ID NO: 78) como o conjunto de iniciadores. Os 50 μL da mistura de reação de PCR continham 1x tampão de PCR GDP-HiFi B, 200 μM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 1 μM de iniciadores de amplificação, 100 ng de pJET-IFNA-6, e 1 U de GDP-HiFi DNA polimerase. A condição de reação de PCR foi 96°C durante 2 minutos (1 ciclo); 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 68°C durante 30 segundos (35 ciclos); 68°C durante 5 minutos (1 ciclo). Após a reação, eletroforese de gel agarose foi usada para confirmar se o produto de PCR continha fragmentos de DNA com tamanho previsto. A seguir, o produto de PCR foi recuperado usando o kit Gel-MTM gel extraction system kit.[000120] The IFN-α gene was amplified using pJET-IFNA-6 plasmid (SEQ ID NO: 63) as the template and OPTSUMOIFNAF (CCGTGAACAAATCGGCGGCTGCGATCTGCCGCAAACC; SEQ ID NO: 85) / PIFNAHISSALIR (SEQ ID NO: 78) as the starter set. The 50 μL of PCR reaction mixture contained 1x GDP-HiFi B PCR buffer, 200 μM of dATP, dTTP, dGTP, and dCTP, 1 μM of amplification primers, 100 ng of pJET-IFNA-6, and 1 U of GDP-HiFi DNA polymerase. The PCR reaction condition was 96°C for 2 minutes (1 cycle); 94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, 68°C for 30 seconds (35 cycles); 68°C for 5 minutes (1 cycle). After the reaction, agarose gel electrophoresis was used to confirm that the PCR product contained DNA fragments of the predicted size. Next, the PCR product was recovered using the Gel-MTM gel extraction system kit.

[000121] O gene de fusão OPTSUMO-IFN-α foi obtido por reação em cadeia polimerase usando os dois produtos acima de PCR como um gabarito e OPTSUMOF (SEQ ID NO: 35) / PIFNAHISSALIR (SEQ ID NO: 78) como o conjunto de iniciadores. Os 50 μL da mistura de reação de PCR continham 1x tampão de PCR GDP-HiFi B, 200 μM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 1 μM de iniciadores de amplificação, 100 ng de produto de PCR OPTSUMO, 100 ng de produto PCR de IFN-α e 1 U de GDP-HiFi DNA polimerase. A condição de reação de PCR foi 96°C durante 2 minutos (1 ciclo); 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 68°C durante 1 minuto (35 ciclos); 68°C durante 5 minutos (1 ciclo). Após a reação, eletroforese de gel agarose foi usada para confirmar se o produto de PCR continha fragmentos de DNA com tamanho previsto. A seguir, o produto de PCR foi recuperado usando o kit PCR-MTM Clean Up system kit.[000121] The OPTSUMO-IFN-α fusion gene was obtained by polymerase chain reaction using the above two PCR products as a template and OPTSUMOF (SEQ ID NO: 35) / PIFNAHISSALIR (SEQ ID NO: 78) as the set of initiators. The 50 μL of PCR reaction mixture contained 1x GDP-HiFi B PCR buffer, 200 μM dATP, dTTP, dGTP, and dCTP, 1 μM amplification primers, 100 ng OPTSUMO PCR product, 100 ng PCR product of IFN-α and 1 U of GDP-HiFi DNA polymerase. The PCR reaction condition was 96°C for 2 minutes (1 cycle); 94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, 68°C for 1 minute (35 cycles); 68°C for 5 minutes (1 cycle). After the reaction, agarose gel electrophoresis was used to confirm that the PCR product contained DNA fragments of the predicted size. Next, the PCR product was recovered using the PCR-MTM Clean Up system kit.

[000122] Após o produto de PCR ser cortado com KpnI e SalI, o fragmento de DNA foi ligado em pET29a cortado com as mesmas enzimas de restrição usando DNA ligase de T4. O produto ligado foi transformado em ECOS 9-5 de E. coli. Transformantes foram selecionados por reação em cadeia polimerase da colônia. Após confirmar que os plasmídeos recombinantes no transformante carregaram o DNA inserido por eletroforese de DNA, os plasmídeos no transformante foram extraídos e o DNA foi sequenciado. O plasmídeo com a sequência de DNA correta é chamado pET-OPTSUMO-OPTPIFNAH, que tem SEQ ID NO: 86.[000122] After the PCR product was cut with KpnI and SalI, the DNA fragment was ligated into pET29a cut with the same restriction enzymes using T4 DNA ligase. The bound product was transformed into E. coli ECOS 9-5. Transformants were selected by colony polymerase chain reaction. After confirming that the recombinant plasmids in the transformant carried the inserted DNA by DNA electrophoresis, the plasmids in the transformant were extracted and the DNA was sequenced. The plasmid with the correct DNA sequence is called pET-OPTSUMO-OPTPIFNAH, which has SEQ ID NO: 86.

(5) Construction of pBA-OPTSUMO-OPTPIFNAH expression vector

[000123] Após pET-OPTSUMO-OPTPIFNAH ser cortado com NdeI e SalI, o fragmento de DNA contendo o gene de fusão OPTSUMO-IFN-α foi recuperado usando um kit Gel-MTM gel extraction system kit. O fragmento de DNA foi ligado em pBCM-araM11 cortado com as mesmas enzimas de restrição usando DNA ligase de T4. O produto ligado foi transformado em ECOS 9-5 de E. coli. Transformantes foram selecionados por reação em cadeia polimerase da colônia. Após confirmar que os plasmídeos recombinantes no transformante carregaram o DNA inserido por Eletroforese de DNA, os plasmídeos no transformante foram extraídos e o DNA foi sequenciado. O plasmídeo com a sequência de DNA correta é chamado pBA-OPTSUMO-OPTPIFNAH, que tem SEQ ID NO: 87.[000123] After pET-OPTSUMO-OPTPIFNAH was cut with NdeI and SalI, the DNA fragment containing the OPTSUMO-IFN-α fusion gene was recovered using a Gel-MTM gel extraction system kit. The DNA fragment was ligated into pBCM-araM11 cut with the same restriction enzymes using T4 DNA ligase. The bound product was transformed into E. coli ECOS 9-5. Transformants were selected by colony polymerase chain reaction. After confirming that the recombinant plasmids in the transformant carried the inserted DNA by DNA Electrophoresis, the plasmids in the transformant were extracted and the DNA was sequenced. The plasmid with the correct DNA sequence is called pBA-OPTSUMO-OPTPIFNAH, which has SEQ ID NO: 87.

(6) Construction of the pET-OPTPIFNRH expression vector

[000124] O gene de IFN-y foi amplificado usando pJET-IFNR plasmídeo como o gabarito, PIFNRNDEIF (5'- CAATATCATATGCAAGCCCCGTTTTTCAAAGAA-3'; SEQ ID NO: 88) / PIFNRHISSALIR (5'- GATATAGTCGACTTATTAGTGATG GTGATGGTGATGTTTGCTGGCACGCTGACC-3'; SEQ ID NO: 89) como o conjunto de iniciadores. Os 50 μL da mistura de reação de PCR continham 1x tampão de PCR GDP-HiFi B, 200 μM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 1 μM de iniciadores de amplificação, 100 ng de plasmídeo pJET-IFNR, e 1 U de GDP-HiFi DNA polimerase. A condição de reação de PCR foi 96°C durante 2 minutos (1 ciclo); 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 68°C durante 30 segundos (35 ciclos); 68°C durante 5 minutos (1 ciclo). Após a reação, eletroforese de gel agarose foi usada para confirmar se o produto de PCR continha fragmentos de DNA com tamanho previsto. A seguir, o produto de PCR foi recuperado usando o kit PCR-MTM Clean Up system kit.[000124] The IFN-γ gene was amplified using pJET-IFNR plasmid as the template, PIFNRNDEIF (5'- CAATATCATATGCAAGCCCCGTTTTTCAAAGAA-3'; SEQ ID NO: 88) / PIFNRHISSALIR (5'- GATATAGTCGACTTATTAGTGATG GTGATGGTGATGTTTGCTGGCACGCTGACC-3'; SEQ ID NO: 89) as the primer set. The 50 μL of PCR reaction mixture contained 1x GDP-HiFi B PCR buffer, 200 μM of dATP, dTTP, dGTP, and dCTP, 1 μM of amplification primers, 100 ng of pJET-IFNR plasmid, and 1 U of GDP -HiFi DNA polymerase. The PCR reaction condition was 96°C for 2 minutes (1 cycle); 94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, 68°C for 30 seconds (35 cycles); 68°C for 5 minutes (1 cycle). After the reaction, agarose gel electrophoresis was used to confirm that the PCR product contained DNA fragments of the predicted size. Next, the PCR product was recovered using the PCR-MTM Clean Up system kit.

[000125] Após o produto de PCR ser cortado com NdeI e SalI, o fragmento de DNA foi ligado em pET29a cortado com as mesmas enzimas de restrição usando DNA ligase de T4. O produto ligado foi transformado em ECOS 9-5 de E. coli. Transformantes foram selecionados por reação em cadeia polimerase da colônia. Após confirmar que os plasmídeos recombinantes no transformante carregaram o DNA inserido por eletroforese de DNA, os plasmídeos no transformante foram extraídos e o DNA foi sequenciado. O plasmídeo com a sequência de DNA correta é chamado pET-OPTPIFNRH, que tem SEQ ID NO: 90.[000125] After the PCR product was cut with NdeI and SalI, the DNA fragment was ligated into pET29a cut with the same restriction enzymes using T4 DNA ligase. The bound product was transformed into E. coli ECOS 9-5. Transformants were selected by colony polymerase chain reaction. After confirming that the recombinant plasmids in the transformant carried the inserted DNA by DNA electrophoresis, the plasmids in the transformant were extracted and the DNA was sequenced. The plasmid with the correct DNA sequence is called pET-OPTPIFNRH, which has SEQ ID NO: 90.

(7) Construction of the pET-SUMO-OPTPIFNRH expression vector

[000126] O gene SUMO foi amplificado usando genoma de Saccharomyces cerevisiae como o gabarito e SUMOF (SEQ ID NO: 25) / SUMOR2 (SEQ ID NO: 81) como o conjunto de iniciadores. As condições de amplificação e métodos de recuperação de produto PCR são como descritos previamente.[000126] The SUMO gene was amplified using Saccharomyces cerevisiae genome as the template and SUMOF (SEQ ID NO: 25) / SUMOR2 (SEQ ID NO: 81) as the primer set. Amplification conditions and PCR product recovery methods are as previously described.

[000127] O gene de IFN-y foi amplificado usando plasmídeo pJET-IFNR (SEQ ID NO: 75) como o gabarito e SUMOIFNRF (5'- GCTCACAGAGAACAGATTGGTGGTCAAGCCCCGTTTTTCAAAGAA-3'; SEQ ID NO: 91) / PIFNRHISSALIR (SEQ ID NO: 89) como o conjunto de iniciadores. Os 50 μL da mistura de reação de PCR continham 1x tampão de PCR GDP-HiFi B, 200 μM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 1 μM de iniciadores de amplificação, 100 ng de plasmídeo pJET-IFNR, e 1 U de GDP-HiFi DNA polimerase. A condição de reação de PCR foi 96°C durante 2 minutos (1 ciclo); 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 68°C durante 30 segundos (35 ciclos); 68°C durante 5 minutos (1 ciclo). Após a reação, eletroforese de gel agarose foi usada para confirmar se o produto de PCR continha fragmentos de DNA com tamanho previsto. A seguir, o produto de PCR foi recuperado usando o kit Gel-MTM gel extraction system kit.[000127] The IFN-γ gene was amplified using plasmid pJET-IFNR (SEQ ID NO: 75) as the template and SUMOIFNRF (5'- GCTCACAGAGAACAGATTGGTGGTCAAGCCCCGTTTTTCAAAGAA-3'; SEQ ID NO: 91) / PIFNRHISSALIR (SEQ ID NO: 89) as the primer set. The 50 μL of PCR reaction mixture contained 1x GDP-HiFi B PCR buffer, 200 μM of dATP, dTTP, dGTP, and dCTP, 1 μM of amplification primers, 100 ng of pJET-IFNR plasmid, and 1 U of GDP -HiFi DNA polymerase. The PCR reaction condition was 96°C for 2 minutes (1 cycle); 94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, 68°C for 30 seconds (35 cycles); 68°C for 5 minutes (1 cycle). After the reaction, agarose gel electrophoresis was used to confirm that the PCR product contained DNA fragments of the predicted size. Next, the PCR product was recovered using the Gel-MTM gel extraction system kit.

[000128] O gene de fusão SUMO-IFN-Y foi obtido por reação em cadeia polimerase usando os dois produtos de PCR descritos acima como os gabaritos e usando SUMOF (SEQ ID NO: 25) / PIFNRHISSALIR (SEQ ID NO: 89) como o conjunto de iniciadores. Os 50 μL da mistura de reação de PCR continham 1x tampão de PCR GDP-HiFi B, 200 μM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 1 μM de iniciadores de amplificação, 100 ng de SUMO produto PCR, 100 ng de IFN-Y produto PCR, e 1 U de GDP-HiFi DNA polimerase. A condição de reação de PCR foi 96°C durante 2 minutos (1 ciclo); 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 68°C durante 1 minuto (35 ciclos); 68°C durante 5 minutos (1 ciclo). Após a reação, eletroforese de gel agarose foi usada para confirmar se o produto de PCR continha fragmentos de DNA com tamanho previsto. A seguir, o produto de PCR foi recuperado usando o kit PCR-MTM Clean Up system kit.[000128] The SUMO-IFN-Y fusion gene was obtained by polymerase chain reaction using the two PCR products described above as the templates and using SUMOF (SEQ ID NO: 25) / PIFNRHISSALIR (SEQ ID NO: 89) as the primer set. The 50 μL of PCR reaction mixture contained 1x GDP-HiFi B PCR buffer, 200 μM dATP, dTTP, dGTP and dCTP, 1 μM amplification primers, 100 ng SUMO PCR product, 100 ng IFN-Y PCR product, and 1 U of GDP-HiFi DNA polymerase. The PCR reaction condition was 96°C for 2 minutes (1 cycle); 94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, 68°C for 1 minute (35 cycles); 68°C for 5 minutes (1 cycle). After the reaction, agarose gel electrophoresis was used to confirm that the PCR product contained DNA fragments of the predicted size. Next, the PCR product was recovered using the PCR-MTM Clean Up system kit.

[000129] Após o produto de PCR ser cortado com KpnI e SalI, o fragmento de DNA foi ligado em pET29a cortado com a mesma enzima de restrição usando DNA ligase de T4. O produto ligado foi transformado em ECOS 9-5 de E. coli. Transformantes foram selecionados por reação em cadeia polimerase da colônia. Após confirmar que os plasmídeos recombinantes no transformante carregaram o DNA inserido por eletroforese de DNA, os plasmídeos no transformante foram extraídos e o DNA foi sequenciado. O plasmídeo com a sequência de DNA correta é chamado pET-SUMO-OPTPIFNRH, que tem SEQ ID NO: 92.[000129] After the PCR product was cut with KpnI and SalI, the DNA fragment was ligated into pET29a cut with the same restriction enzyme using T4 DNA ligase. The bound product was transformed into E. coli ECOS 9-5. Transformants were selected by colony polymerase chain reaction. After confirming that the recombinant plasmids in the transformant carried the inserted DNA by DNA electrophoresis, the plasmids in the transformant were extracted and the DNA was sequenced. The plasmid with the correct DNA sequence is called pET-SUMO-OPTPIFNRH, which has SEQ ID NO: 92.

(8) Construction of the expression vector pET-OPTSUMO- OPTPIFNRH

[000130] O gene OPTSUMO foi amplificado usando pET-OPTSUMO-ORF2 (SEQ ID NO: 43) como o gabarito e OPTSUMOF (SEQ ID NO: 35) / OPTSUMOR2 (SEQ ID NO: 84) como o conjunto de iniciadores. As condições de amplificação e métodos de recuperação de produto PCR são como descritos previamente.[000130] The OPTSUMO gene was amplified using pET-OPTSUMO-ORF2 (SEQ ID NO: 43) as the template and OPTSUMOF (SEQ ID NO: 35) / OPTSUMOR2 (SEQ ID NO: 84) as the primer set. Amplification conditions and PCR product recovery methods are as previously described.

[000131] O gene interferon-Y suíno foi amplificado usando plasmídeo pJET-IFNR (SEQ ID NO: 75) como o gabarito e OPTSUMOIFNRF (5'- CCGTGAACAAATCGGCGGCCAAGCCCCGTTTTTCAAAGAAATC-3'; SEQ ID NO: 93) / PIFNRHISSALIR (SEQ ID NO: 89) como o conjunto de iniciadores. Os 50 μL da mistura de reação de PCR continham 1x tampão de PCR GDP-HiFi B, 200 μM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 1 μM de iniciadores de amplificação, 100 ng de plasmídeo pJET-IFNR, e 1 U de GDP-HiFi DNA polimerase. A condição de reação de PCR foi 96°C durante 2 minutos (1 ciclo); 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 68°C durante 30 segundos (35 ciclos); 68°C durante 5 minutos (1 ciclo). Após a reação, eletroforese de gel agarose foi usada para confirmar se o produto de PCR continha fragmentos de DNA com tamanho previsto. A seguir, o produto de PCR foi recuperado usando o kit Gel-MTM gel extraction system kit.[000131] The porcine interferon-Y gene was amplified using plasmid pJET-IFNR (SEQ ID NO: 75) as the template and OPTSUMOIFNRF (5'-CCGTGAACAAATCGGCGGCCAAGCCCCGTTTTTCAAAGAAATC-3'; SEQ ID NO: 93) / PIFNRHISSALIR (SEQ ID NO: 89) as the primer set. The 50 μL of PCR reaction mixture contained 1x GDP-HiFi B PCR buffer, 200 μM of dATP, dTTP, dGTP, and dCTP, 1 μM of amplification primers, 100 ng of pJET-IFNR plasmid, and 1 U of GDP -HiFi DNA polymerase. The PCR reaction condition was 96°C for 2 minutes (1 cycle); 94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, 68°C for 30 seconds (35 cycles); 68°C for 5 minutes (1 cycle). After the reaction, agarose gel electrophoresis was used to confirm that the PCR product contained DNA fragments of the predicted size. Next, the PCR product was recovered using the Gel-MTM gel extraction system kit.

[000132] O gene de fusão OPTSUMO-IFN-Y foi obtido por reação em cadeia polimerase usando os dois produtos de PCR acima como os gabaritos e OPTSUMOF (SEQ ID NO: 35) / PIFNRHISSALIR (SEQ ID NO: 89) como o conjunto de iniciadores. Os 50 μL da mistura de reação de PCR continham 1x tampão de PCR GDP-HiFi B, 200 μM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 1 μM de iniciadores de amplificação, 100 ng de produto PCR OPTSUMO, 100 ng de produto de PCR suíno IFN-Y, e 1 U de GDP-HiFi DNA polimerase. A condição de reação de PCR foi 96°C durante 2 minutos (1 ciclo); 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 68°C durante 1 minuto (35 ciclos); 68°C durante 5 minutos (1 ciclo). Após a reação, eletroforese de gel agarose foi usada para confirmar se o produto de PCR continha fragmentos de DNA com tamanho previsto. A seguir, o produto de PCR foi recuperado usando o kit PCR-MTM Clean Up system kit.[000132] The OPTSUMO-IFN-Y fusion gene was obtained by polymerase chain reaction using the above two PCR products as the templates and OPTSUMOF (SEQ ID NO: 35) / PIFNRHISSALIR (SEQ ID NO: 89) as the set of initiators. The 50 μL of PCR reaction mixture contained 1x GDP-HiFi B PCR buffer, 200 μM dATP, dTTP, dGTP and dCTP, 1 μM amplification primers, 100 ng OPTSUMO PCR product, 100 ng PCR product porcine IFN-Y, and 1 U of GDP-HiFi DNA polymerase. The PCR reaction condition was 96°C for 2 minutes (1 cycle); 94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, 68°C for 1 minute (35 cycles); 68°C for 5 minutes (1 cycle). After the reaction, agarose gel electrophoresis was used to confirm that the PCR product contained DNA fragments of the predicted size. Next, the PCR product was recovered using the PCR-MTM Clean Up system kit.

[000133] Após o produto de PCR ser cortado com KpnI e SalI, o fragmento de DNA foi ligado em pET29a cortado com as mesmas enzima de restrição usando DNA ligase de T4. O produto ligado foi transformado em ECOS 9-5 de E. coli. Transformantes foram selecionados por reação em cadeia polimerase da colônia. Após confirmar que os plasmídeos recombinantes no transformante carregaram o DNA inserido por eletroforese de DNA, os plasmídeos no transformante foram extraídos e o DNA foi sequenciado. O plasmídeo com o plasmídeo de DNA correto é chamado pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH, que tem SEQ ID NO: 94.[000133] After the PCR product was cut with KpnI and SalI, the DNA fragment was ligated into pET29a cut with the same restriction enzymes using T4 DNA ligase. The bound product was transformed into E. coli ECOS 9-5. Transformants were selected by colony polymerase chain reaction. After confirming that the recombinant plasmids in the transformant carried the inserted DNA by DNA electrophoresis, the plasmids in the transformant were extracted and the DNA was sequenced. The plasmid with the correct DNA plasmid is called pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH, which has SEQ ID NO: 94.

(9) Construction of the pBA-OPTSUMO-OPTPIFNRH expression vector

[000134] Após pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH ser cortado com NdeI e SalI, um fragmento de DNA contendo o gene de fusão OPTSUMO-IFR-Y foi recuperado usando um kit Gel-MTM gel extraction system kit. O fragmento de DNA foi inserido em pBCM-araM11 cortado com as mesmas enzimas de restrição usando DNA ligase de T4. O produto ligado foi transformado em ECOS 9-5 de E. coli. Transformantes foram selecionados por reação em cadeia polimerase da colônia. Após confirmar que os plasmídeos recombinantes no transformante carregaram o DNA inserido por eletroforese de DNA, os plasmídeos no transformante foram extraídos e o DNA foi sequenciado. O plasmídeo com a sequência de DNA correta é chamado pBA-OPTSUMO-OPTPIFNRH, que tem SEQ ID NO: 95.[000134] After pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH was cut with NdeI and SalI, a DNA fragment containing the OPTSUMO-IFR-Y fusion gene was recovered using a Gel-MTM gel extraction system kit. The DNA fragment was inserted into pBCM-araM11 cut with the same restriction enzymes using T4 DNA ligase. The bound product was transformed into E. coli ECOS 9-5. Transformants were selected by colony polymerase chain reaction. After confirming that the recombinant plasmids in the transformant carried the inserted DNA by DNA electrophoresis, the plasmids in the transformant were extracted and the DNA was sequenced. The plasmid with the correct DNA sequence is called pBA-OPTSUMO-OPTPIFNRH, which has SEQ ID NO: 95.

Expression and purification of porcine recombinant interferon (1) Porcine recombinant interferon expression

[000135] pET-OPTPIFNAH (SEQ ID NO: 79), pBA-OPTPIFNAH (SEQ ID NO: 80), pET-SUMO-OPTPIFNAH (SEQ ID NO: 83), pET-OPTSUMO-OPTPIFNAH (SEQ ID NO: 86), e pBA-OPTSUMO-OPTPIFNAH (SEQ ID NO: 87) foram transformados em E. coli Shuffle (NEB, USA), respectivamente. pET-OPTPIFNRH (SEQ ID NO: 90), pET-SUMO-OPTPIFNHR (SEQ ID NO: 92), pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH (SEQ ID NO: 94) e pBA-OPTSUMO-OPTPIFNRH (SEQ ID NO: 95) foram transformados em E. coli BL21(DE3), respectivamente. Os transformantes foram inoculados em meio LB contendo canamicina (concentração final: 30 μg/mL), e cultura agitada foi realizada a 37°C e 180 rpm. Após incubação noturna, a solução bacteriana foi inoculada em uma razão de 1:100 para meio LB contendo uma final concentração de 30 μg/mL de canamicina. Cultura agitada foi realizada a 37°C e 180 rpm. Bactérias foram cultivadas a uma concentração de aproximadamente 0,4 a 0,6 OD600, medida por espectrofotômetro, e 0,1 mM de IPTG foi adicionado para indução de expressão de proteína a 25°C e 180 rpm. Após 4 horas de indução, as frações bacterianas foram coletadas por centrifugação (8.000xg, 30 minutos, 4°C) e a expressão de interferon recombinante suíno foi observada por eletroforese de proteína. Além disso, as proteínas solúveis e insolúveis das bactérias foram também diferenciadas, e a solubilidade de interferon recombinante suíno foi observada por eletroforese de proteína.[000135] pET-OPTPIFNAH (SEQ ID NO: 79), pBA-OPTPIFNAH (SEQ ID NO: 80), pET-SUMO-OPTPIFNAH (SEQ ID NO: 83), pET-OPTSUMO-OPTPIFNAH (SEQ ID NO: 86) , and pBA-OPTSUMO-OPTPIFNAH (SEQ ID NO: 87) were transformed into E. coli Shuffle (NEB, USA), respectively. pET-OPTPIFNRH (SEQ ID NO: 90), pET-SUMO-OPTPIFNHR (SEQ ID NO: 92), pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH (SEQ ID NO: 94) and pBA-OPTSUMO-OPTPIFNRH (SEQ ID NO: 95) were transformed into E. coli BL21(DE3), respectively. Transformants were inoculated into LB medium containing kanamycin (final concentration: 30 μg/mL), and shaken culture was performed at 37°C and 180 rpm. After overnight incubation, the bacterial solution was inoculated at a ratio of 1:100 into LB medium containing a final concentration of 30 μg/mL kanamycin. Shake culture was performed at 37°C and 180 rpm. Bacteria were grown to a concentration of approximately 0.4 to 0.6 OD600, measured by spectrophotometer, and 0.1 mM IPTG was added for induction of protein expression at 25°C and 180 rpm. After 4 hours of induction, bacterial fractions were collected by centrifugation (8,000xg, 30 minutes, 4°C) and expression of porcine recombinant interferon was observed by protein electrophoresis. Furthermore, the soluble and insoluble proteins of bacteria were also differentiated, and the solubility of recombinant porcine interferon was observed by protein electrophoresis.

[000136] Favor consultar os resultados experimentais em Figura 9 (A a E). Os resultados mostram que a presente invenção pode produzir, com sucesso, IFN-α solúvel recombinante suíno e proteína de fusão SUMO-IFN-α usando o hospedeiro de E. coli Shuffle, e a etapa de re-enovelamento pode ser omitida, de modo a evitar o problema de que a atividade biológica poderia ser afetada por uma baixa eficácia de re-enovelamento. Para a expressão da proteína de fusão SUMO-IFN-α, produção da proteína de fusão SUMO-IFN-α pode ser aumentada por otimização do códon do gene SUMO. O efeito de diferentes sistemas de expressão sobre a expressão da proteína de fusão SUMO-IFN-α mostraram que a produção de SUMO-IFN-α foi maior usando o sistema de expressão mutante induzindo arabinose (155,07 mg/L; Figura 9(E)). Favor consultar os resultados experimentais na Figura 9 (F a I). Os resultados mostram que a estratégia tendo proteína de fusão SUMO pode aumentar a solubilidade de IFN-y recombinante suíno. Após otimização dos códons do gene SUMO, a produção de proteínas de fusão SUMO-IFN-Y pode ser aumentada. O efeito de diferentes sistemas de expressão sobre a expressão de proteína de fusão SUMO-IFN-Y mostraram que a produção de SUMO-IFN-Y usando o sistema de expressão indutível por T7 e o sistema de expressão indutível por arabinose mutante foi muito satisfatória.[000136] Please consult the experimental results in Figure 9 (A to E). The results show that the present invention can successfully produce soluble porcine recombinant IFN-α and SUMO-IFN-α fusion protein using the E. coli Shuffle host, and the refolding step can be omitted, so to avoid the problem that biological activity could be affected by low refolding efficiency. For SUMO-IFN-α fusion protein expression, SUMO-IFN-α fusion protein production can be increased by codon optimization of the SUMO gene. The effect of different expression systems on the expression of the SUMO-IFN-α fusion protein showed that SUMO-IFN-α production was higher using the mutant expression system inducing arabinose (155.07 mg/L; Figure 9( AND)). Please refer to the experimental results in Figure 9 (F to I). The results show that the strategy having SUMO fusion protein can increase the solubility of porcine recombinant IFN-γ. After optimization of the SUMO gene codons, the production of SUMO-IFN-Y fusion proteins can be increased. The effect of different expression systems on the expression of SUMO-IFN-Y fusion protein showed that the production of SUMO-IFN-Y using the T7-inducible expression system and the mutant arabinose-inducible expression system was very satisfactory.

(2) Construction and expression of recombinant SUMO protease expression vector pET-D-SUMOP

[000137] Para clivar o interferon suíno expressado no sistema de expressão de E. coli descrito nos parágrafos anteriores para obter interferon suíno sem o fragmento de proteína SUMO, SUMO protease foi produzida através do Sistema de expressão de E. coli neste experimento. Os versados na técnica também pode realizar esta etapa usando SUMO protease obtida de outros modos.[000137] To cleave the porcine interferon expressed in the E. coli expression system described in the previous paragraphs to obtain porcine interferon without the SUMO protein fragment, SUMO protease was produced through the E. coli Expression System in this experiment. Those skilled in the art can also perform this step using SUMO protease obtained in other ways.

[000138] O gene de SUMO protease foi amplificado usando genoma de Saccharomyces cerevisiae como gabarito e SUMPOF (SEQ ID NO: 47) / SUMOPENZR (5'-GATATACTCGAGTTATTTTAAAGCGTCGGT TAAAATCAAATG-3; SEQ ID NO: 96) como o conjunto de iniciadores. Os 50 μL da mistura de reação de PCR continham Ixtampão de PCR GDP-HiFi B, 200 μM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 1 μM de iniciadores de amplificação, 200 ng de genoma de Saccharomyces cerevisiae, e 1 U de GDP-HiFi DNA polimerase. A condição de reação de PCR foi 96°C durante 5 minutos (1 ciclo); 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 68°C durante 30 segundos (35 ciclos); 68°C durante 5 minutos (1 ciclo). Após a reação, eletroforese de gel agarose foi usada para confirmar se o produto de PCR continha fragmentos de DNA com tamanho previsto. A seguir, o produto de PCR foi recuperado usando o kit PCR-MTM Clean Up system kit.[000138] The SUMO protease gene was amplified using Saccharomyces cerevisiae genome as a template and SUMPOF (SEQ ID NO: 47) / SUMOPENZR (5'-GATATACTCGAGTTATTTTAAAGCGTCGGT TAAAATCAAATG-3; SEQ ID NO: 96) as the primer set. The 50 μL of PCR reaction mixture contained IxGDP-HiFi B PCR buffer, 200 μM of dATP, dTTP, dGTP, and dCTP, 1 μM of amplification primers, 200 ng of Saccharomyces cerevisiae genome, and 1 U of GDP- HiFi DNA polymerase. The PCR reaction condition was 96°C for 5 minutes (1 cycle); 94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, 68°C for 30 seconds (35 cycles); 68°C for 5 minutes (1 cycle). After the reaction, agarose gel electrophoresis was used to confirm that the PCR product contained DNA fragments of the predicted size. Next, the PCR product was recovered using the PCR-MTM Clean Up system kit.

[000139] Após o gene de SUMO protease amplificado a partir do genoma de levedura ser cortado com BamHI e XhoI, o fragmento de DNA foi inserido em pET-D cortado com BamHI e SalI usando DNA ligase de T4. O produto ligado foi transformado em ECOS 9-5 de E. coli. Transformantes foram selecionados por reação em cadeia polimerase da colônia. Após confirmar que os plasmídeos recombinantes no transformante carregaram o DNA inserido por eletroforese de DNA, os plasmídeos no transformante foram extraídos e o DNA foi sequenciado. O plasmídeo com a sequência de DNA correta é chamado pET-D-SUMOP, que tem SEQ ID NO: 97.[000139] After the SUMO protease gene amplified from the yeast genome was cut with BamHI and XhoI, the DNA fragment was inserted into pET-D cut with BamHI and SalI using T4 DNA ligase. The bound product was transformed into E. coli ECOS 9-5. Transformants were selected by colony polymerase chain reaction. After confirming that the recombinant plasmids in the transformant carried the inserted DNA by DNA electrophoresis, the plasmids in the transformant were extracted and the DNA was sequenced. The plasmid with the correct DNA sequence is called pET-D-SUMOP, which has SEQ ID NO: 97.

[000140] pET-D-SUMOP (SEQ ID NO: 97) foi transformado em BL21 (DE3) de E. coli. BL21(DE3) de E. coli foi inoculado em meio LB contendo canamicina (concentração final: 30 μg/mL) e cultura agitada a 37°C e 180 rpm. Após incubação noturna, a solução bacteriana foi inoculada a uma razão de 1:100 em meio LB contendo canamicina (concentração final 30 μg/mL). Cultura agitada foi realizada a 37°C e 180 rpm. Bactérias foram cultivadas a uma concentração de aproximadamente 0,4 a 0,6 OD600 medida por espectrofotômetro, e 0,1 mM de IPTG foi adicionado para indução da expressão de proteína a 28°C e 180 rpm. Após 4 horas de indução, a fração bacteriana foi coletada por centrifugação (8.000xg, 30 minutos, 4°C).[000140] pET-D-SUMOP (SEQ ID NO: 97) was transformed into BL21 (DE3) from E. coli. E. coli BL21(DE3) was inoculated into LB medium containing kanamycin (final concentration: 30 μg/mL) and culture shaken at 37°C and 180 rpm. After overnight incubation, the bacterial solution was inoculated at a ratio of 1:100 into LB medium containing kanamycin (final concentration 30 μg/mL). Shake culture was performed at 37°C and 180 rpm. Bacteria were grown to a concentration of approximately 0.4 to 0.6 OD600 measured by spectrophotometer, and 0.1 mM IPTG was added for induction of protein expression at 28°C and 180 rpm. After 4 hours of induction, the bacterial fraction was collected by centrifugation (8,000xg, 30 minutes, 4°C).

(3) Cleavage and purification of porcine recombinant interferon

[000141] Após induzir expressão dos transformantes carregando o vetor de expressão da proteína de fusão de SUMO-interferon suíno e o vetor de expressão de SUMO protease, as frações bacterianas foram coletadas por centrifugação (8.000xg, 30 minutos, 4°C). As bactérias coletadas foram colocadas em suspensão em uma quantidade apropriada de tampão de lise (20 mM fosfato de sódio, 500 mM NaCl, pH 7,4) para ter uma absorbância de 50 a 600 nm. Após romper as bactérias usando um processador ultrassônico, o sobrenadante foi coletado por centrifugação (8.000xg, 15 minutos, 4°C). A proteína de fusão SUMO-interferon suíno recombinante, purificada, e protease recombinante (SUMO protease) foram misturadas em uma razão em peso de 4 e incubadas a 4°C durante 16 horas. Durante este período, a proteína de fusão SUMO-interferon suíno foi cortada por SUMO protease na proteína SUMO e interferon suíno com a etiqueta His no C-término.[000141] After inducing expression of the transformants carrying the porcine SUMO-interferon fusion protein expression vector and the SUMO protease expression vector, the bacterial fractions were collected by centrifugation (8,000xg, 30 minutes, 4°C). The collected bacteria were suspended in an appropriate amount of lysis buffer (20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, pH 7.4) to have an absorbance of 50 to 600 nm. After disrupting the bacteria using an ultrasonic processor, the supernatant was collected by centrifugation (8,000xg, 15 minutes, 4°C). Purified recombinant porcine SUMO-interferon fusion protein and recombinant protease (SUMO protease) were mixed in a weight ratio of 4 and incubated at 4°C for 16 hours. During this period, the SUMO-porcine interferon fusion protein was cleaved by SUMO protease into the SUMO protein and porcine interferon with the His tag at the C-terminus.

[000142] A proteína foi, então, purificada usando cromatografia de afinidade de íon metálico imobilizado. Purificação foi realizada usando um sistema de cromatografia líquida de proteína AKTA prime plus com 5 mL de coluna HiTrapTM Ni excel. Após equilibrar a coluna com 25 mL de tampão de lise, a solução de clivagem de proteína de fusão foi injetada na coluna HiTrapTM Ni. Após a injeção da amostra estar completa, as proteínas não especificamente ligadas foram lavadas com 100 mL de tampão de lavagem (20 mM fosfato de sódio, 500 mM NaCl, 30 mM imidazol, pH 7,4). Finalmente, o interferon recombinante suíno sobre a resina foi eluído com 150 mL de tampão de eluição (20 mM fosfato de sódio, 500 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 7,4) e a purificação foi observada por eletroforese de proteína (como mostrado na Figura 10).[000142] The protein was then purified using immobilized metal ion affinity chromatography. Purification was performed using an AKTA prime plus protein liquid chromatography system with 5 mL HiTrapTM Ni excel column. After equilibrating the column with 25 mL of lysis buffer, the fusion protein cleavage solution was injected into the HiTrapTM Ni column. After sample injection was complete, non-specifically bound proteins were washed with 100 mL of wash buffer (20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, 30 mM imidazole, pH 7.4). Finally, the recombinant porcine interferon on the resin was eluted with 150 mL of elution buffer (20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 7.4) and purification was observed by protein electrophoresis (as shown in Figure 10).

Example 4: Preparation and application of the present composition to prevent PCV2 infection

[000143] Neste exemplo, a proteína codificando ORF2, a proteína de fusão SUMO-ORF2, e o interferon suíno, preparados em Exemplo 2 e Exemplo 3 acima, foram usados para preparar uma composição para prevenir e tratar infecção por PCV2. Em muitas amostras aqui usadas, a composição compreende adicionalmente adjuvante MONTANIDETM ISA 563 VG (SEPPIC, França) e/ou adjuvante MONTANIDETM GEL 01 (SEPPIC, França). Os componentes são misturados com base no seguinte projeto experimental e, então, inoculados em leitões para observar a resposta imune induzida ou se ocorrem efeitos adversos (tal como vômitos, tremores, depressão, falta de ar e inchaço da área aplicada; se a taxa de incidência de, pelo menos, três dos efeitos adversos é maior do que 50%, a segurança da composição é baixa.)[000143] In this example, the protein encoding ORF2, the SUMO-ORF2 fusion protein, and porcine interferon, prepared in Example 2 and Example 3 above, were used to prepare a composition for preventing and treating PCV2 infection. In many samples used here, the composition additionally comprises adjuvant MONTANIDETM ISA 563 VG (SEPPIC, France) and/or adjuvant MONTANIDETM GEL 01 (SEPPIC, France). The components are mixed based on the following experimental design and then inoculated into piglets to observe the induced immune response or whether adverse effects occur (such as vomiting, tremors, depression, shortness of breath and swelling of the applied area; whether the rate of incidence of at least three of the adverse effects is greater than 50%, the safety of the composition is low.)

(1) Experiment 1: Effect of porcine interferon content on the safety of the present composition

[000144] Catorze leitões de campo com três semanas de idade foram selecionados e agrupados aleatoriamente. Eles foram divididos em 7 grupos A a G, e o número de leitões em cada grupo foi dois. Uma injeção intramuscular foi realizada em cada grupo e a dose de imunização foi de 2 mL. Componentes de cada vacina são mostrados na Tabela 6 abaixo. Observações foram feitas no dia da vacinação e no dia seguinte, e a proporção de efeitos clínicos adversos foi registrada. Tabela 6: Projeto experimental de Experimento 1 [000144] Fourteen three-week-old field piglets were selected and randomly grouped. They were divided into 7 groups A to G, and the number of piglets in each group was two. An intramuscular injection was performed in each group and the immunization dose was 2 mL. Components of each vaccine are shown in Table 6 below. Observations were made on the day of vaccination and the following day, and the proportion of adverse clinical effects was recorded. Table 6: Experimental design of Experiment 1

[000145] Os resultados do experimento (Tabela 7) mostraram que os suínos vacinados com V-001 apresentaram sintomas clínicos de depressão, mas nenhum outro efeito adverso. Porcos vacinados com V-002 apresentaram sintomas de vômito e tremor. Além disso, a segurança da amostra V-003 foi menos convincente, e os efeitos adversos das V-004, V-005 ou V-006 em porcos inoculados foram mais suaves. Com base nesses resultados, o teor de interferon suíno será mantido a 25 μg por dose (2 mL) nas seguintes experiências. Tabela 7: Resultados experimentais de experimento 1. [000145] The results of the experiment (Table 7) showed that pigs vaccinated with V-001 showed clinical symptoms of depression, but no other adverse effects. Pigs vaccinated with V-002 showed symptoms of vomiting and tremors. Furthermore, the safety of sample V-003 was less convincing, and the adverse effects of V-004, V-005, or V-006 on inoculated pigs were milder. Based on these results, the porcine interferon content will be maintained at 25 μg per dose (2 mL) in the following experiments. Table 7: Experimental results from experiment 1.

(2) Experiment 2: Effects of adjuvant content on the safety of the present composition

[000146] Setenta e três leitões de campo de três semanas de idade foram selecionados e divididos aleatoriamente nos grupos A e B. O número de leitões no grupo A foi de 38, e no grupo B foi de 35. Uma injeção intramuscular foi realizada em cada grupo e a dose de imunização foi de 2 mL. A composição de cada vacina é mostrada na Tabela 8 abaixo. Observações foram feitas no dia e no dia seguinte da vacinação, e a proporção de efeitos clínicos adversos foi registrada. Os resultados experimentais mostram (Tabela 9) que a segurança da amostra V-009 é elevada, mas a segurança da amostra V-008 também é aceitável. Tabela 8: Projeto experimental de experimento 2. Tabela 9: Resultados experimentais de experimento 2. [000146] Seventy-three three-week-old field piglets were selected and randomly divided into groups A and B. The number of piglets in group A was 38, and in group B was 35. An intramuscular injection was performed in each group and the immunization dose was 2 mL. The composition of each vaccine is shown in Table 8 below. Observations were made on the day and the day following vaccination, and the proportion of adverse clinical effects was recorded. The experimental results show (Table 9) that the safety of sample V-009 is high, but the safety of sample V-008 is also acceptable. Table 8: Experimental design of experiment 2. Table 9: Experimental results from experiment 2.

(3) Experiment 3: Effect of different adjuvants on immune induction of the present composition

[000147] Este experimento foi conduzido um local de criação animal de organismos geneticamente modificados (OGMs) na Seção de Inspeção de Fármacos para Animais do Animal Health Research Institute (AHRI). Onze leitões de 4 semanas de idade sem infecção por patógenos específicos foram agrupados aleatoriamente e divididos em 5 grupos A a E. Os grupos A a D eram grupos experimentais, em que o número de leitões de cada grupo era 2, e o grupo E o grupo de controle, tendo 3 leitões. Leitões em grupos A a D foram imunizados intramuscularmente nas 4 a e 6a semanas de idade, respectivamente, e a dose de imunização foi de 2 mL. Grupo E não foi imunizado. Componentes de cada vacina são dados na Tabela 10 abaixo. Tabela 10: Projeto experimental de experimento 3 [000147] This experiment was conducted at an animal breeding site for genetically modified organisms (GMOs) in the Animal Drug Inspection Section of the Animal Health Research Institute (AHRI). Eleven 4-week-old piglets without infection by specific pathogens were randomly grouped and divided into 5 groups A to E. Groups A to D were experimental groups, in which the number of piglets in each group was 2, and group E was control group, having 3 piglets. Piglets in groups A to D were immunized intramuscularly at 4 to 6 weeks of age, respectively, and the immunization dose was 2 mL. Group E was not immunized. Components of each vaccine are given in Table 10 below. Table 10: Experimental design of experiment 3

[000148] Os leitões em cada grupo foram desafiados com PCV2 na 8a. semana de idade e todos sofreram autópsias quatro semanas após o desafio. As amostras de soro e de plasma foram coletadas antes da imunização (4 semanas de idade), após imunização (6 e 8 semanas de idade) e após desafio (9, 10, 11 e 12 semanas de idade) dos porcos. O título de anticorpo anti-PCV2 no soro foi determinado usando um kit ELISA comercialmente disponível (BioCheck, Holanda). A quantidade de vírus no plasma foi determinada usando reação em cadeia polimerase quantitativa em tempo real.[000148] Piglets in each group were challenged with PCV2 on the 8th. week of age and all underwent autopsies four weeks after the challenge. Serum and plasma samples were collected before immunization (4 weeks of age), after immunization (6 and 8 weeks of age) and after challenge (9, 10, 11 and 12 weeks of age) from the pigs. Serum anti-PCV2 antibody titer was determined using a commercially available ELISA kit (BioCheck, Netherlands). The amount of virus in plasma was determined using real-time quantitative polymerase chain reaction.

[000149] Os resultados experimentais mostraram que V-009, V-010, V-011, e V-012 induziram, todos, anticorpo anti-ORF2 (Figura 11), e reduziram a viremia em porcos experimentais (Figura 12). Com base nos resultados experimentais, é também mostrado que cada dose (2 mL), que contém 67 μg de ORF2, pode produzir respostas imunes suficientes (V-011 e V-012).[000149] The experimental results showed that V-009, V-010, V-011, and V-012 all induced anti-ORF2 antibody (Figure 11), and reduced viremia in experimental pigs (Figure 12). Based on the experimental results, it is also shown that each dose (2 mL), which contains 67 μg of ORF2, can produce sufficient immune responses (V-011 and V-012).

(4) Experiment 4: Effects of SUMO-ORF2 and OFR2 fusion protein on immune induction of the present composition:

[000150] Este experimento foi conduzido um local de criação animal de organismos geneticamente modificados (OGMs) na Seção de Inspeção de Fármacos para Animais do Animal Health Research Institute (AHRI). Dezesseis leitões de 4 semanas de idade, sem infecção por patógenos específicos, foram agrupados aleatoriamente e divididos em 5 grupos A a E. Os grupos A a D eram grupos experimentais, em que o número de leitões de cada grupo era 3, e o grupo E o grupo de controle, tendo 4 leitões. Leitões em grupos A a D foram imunizados intramuscularmente nas 4 a e 6a semanas de idade, respectivamente, e a dose de imunização foi de 2 mL. Grupo E não foi imunizado. Componentes de cada vacina são dados na Tabela 11 abaixo. Tabela 11: Projeto experimental de experimento 4 [000150] This experiment was conducted at an animal breeding site for genetically modified organisms (GMOs) in the Animal Drug Inspection Section of the Animal Health Research Institute (AHRI). Sixteen 4-week-old piglets, without infection by specific pathogens, were randomly grouped and divided into 5 groups A to E. Groups A to D were experimental groups, in which the number of piglets in each group was 3, and the group And the control group, having 4 piglets. Piglets in groups A to D were immunized intramuscularly at 4 to 6 weeks of age, respectively, and the immunization dose was 2 mL. Group E was not immunized. Components of each vaccine are given in Table 11 below. Table 11: Experimental design of experiment 4

[000151] Os suínos em cada grupo foram desafiados com PCV2 na 8a. semana de idade, e todos sofreram autópsias 5 semanas após desafio. As amostras de soro e de plasma foram coletadas em pontos de tempo específicos. O título de anticorpo anti-PCV2 em soro foi determinado usando um kit ELISA comercialmente disponível. A quantidade de vírus em plasma foi determinada usando reação em cadeia polimerase quantitativa em tempo real.[000151] Pigs in each group were challenged with PCV2 on the 8th. week of age, and all underwent autopsies 5 weeks after challenge. Serum and plasma samples were collected at specific time points. Anti-PCV2 antibody titer in serum was determined using a commercially available ELISA kit. The amount of virus in plasma was determined using real-time quantitative polymerase chain reaction.

[000152] Os resultados mostraram que cada amostra poderia induzir os suínos a produzir anticorpos anti-PCV2, e os melhores resultados foram obtidos com amostras V-013 (contendo 27 μg de ORF2) (Figura 13). Além disso, todas as amostras reduziram viremia em porcos (Figura 14).[000152] The results showed that each sample could induce pigs to produce anti-PCV2 antibodies, and the best results were obtained with V-013 samples (containing 27 μg of ORF2) (Figure 13). Furthermore, all samples reduced viremia in pigs (Figure 14).

(5) Experiment 5: Effects of porcine Interferon-α and porcine Interferon-Y on the immune induction of the present composition

[000153] Este experimento foi conduzido em uma fazenda de criação de suínos com níveis baixos de contaminação por patógenos e sem infecção por PCV2. Vinte leitões SPF com 4 semanas de idade sem infecção por PCV2 foram selecionados e aleatoriamente divididos em 5 grupos A a E, em que cada grupo tinha 4 leitões. Grupos A a D foram os grupos experimentais, e grupo E foi o grupo de controle. Suínos em grupos A a D foram imunizados intramuscularmente na 4a. e 7a. semanas de idade respectivamente, e a dose de imunização foi 2 mL. Grupo E não foi imunizado. Os componentes de cada vacina são mostrados na Tabela 12 abaixo. Amostras de soro foram coletadas em pontos de tempo específicos. O título de anticorpo anti-PCV2 em soro foi determinado usando um kit ELISA comercialmente disponível. Tabela 12: Projeto experimental de Experimento 5 [000153] This experiment was conducted on a pig farm with low levels of pathogen contamination and no PCV2 infection. Twenty 4-week-old SPF piglets without PCV2 infection were selected and randomly divided into 5 groups A to E, where each group had 4 piglets. Groups A to D were the experimental groups, and group E was the control group. Pigs in groups A to D were immunized intramuscularly on the 4th. and 7a. weeks of age respectively, and the immunization dose was 2 mL. Group E was not immunized. The components of each vaccine are shown in Table 12 below. Serum samples were collected at specific time points. Anti-PCV2 antibody titer in serum was determined using a commercially available ELISA kit. Table 12: Experimental design of Experiment 5

[000154] Os resultados experimentais mostram que a adição de IFN-α (V-018) ou IFN-Y (V-019) sozinho na composição da presente invenção tem um efeito intensificador sobre a indução de resposta imune. O efeito de adicionarIFN-α émelhor do que adicionarIFN-Y. Por outro lado, a adição de tanto IFN-α como de IFN-y (V-020) na composição da presente invenção induziu uma melhor resposta imune. Os resultados indicam que, na composição da presente invenção, IFN-α e IFN-Y têm um efeito sinergístico sobre a indução imune (Figura 15).[000154] The experimental results show that the addition of IFN-α (V-018) or IFN-Y (V-019) alone in the composition of the present invention has an enhancing effect on the induction of immune response. The effect of addingIFN-α is better than addingIFN-Y. On the other hand, the addition of both IFN-α and IFN-γ (V-020) in the composition of the present invention induced a better immune response. The results indicate that, in the composition of the present invention, IFN-α and IFN-Y have a synergistic effect on immune induction (Figure 15).

Claims

1. COMPOSITION TO PREVENT INFECTION BY PORcine CIRCOVIRUS TYPE 2 (PCV2), characterized by comprising: 2.5 to 250 μg/mL of PCV2 capsid protein; 2.5 to 25 μg/mL porcine interferon-α; 2.5 to 25 μg/mL of porcine interferon-Y; and a pharmaceutically acceptable carrier.

2. Composition, according to claim 1, characterized by comprising: 3.5 to 170 μg/mL of PCV2 capsid protein; 2.5 to 20 μg/mL porcine interferon-α; 2.5 to 20 μg/mL of porcine interferon-Y; and a pharmaceutically acceptable carrier.

3. Composition, according to claim 2, characterized by comprising: 3.5 to 170 μg/mL of PCV2 capsid protein; 2.5 to 12.5 μg/mL porcine interferon-α; 2.5 to 12.5 μg/mL porcine interferon-Y; and a pharmaceutically acceptable carrier.

4. Composition, according to claim 1, characterized in that it additionally comprises a pharmaceutically acceptable adjuvant; wherein said pharmaceutically acceptable adjuvant is: MONTANIDETM ISA 563 VG adjuvant, MONTANIDETM GEL 01 adjuvant, complete or incomplete Freund's adjuvant, aluminum gel, surfactant, polyanionic polymers, peptides, oil emulsions, or a combination thereof.

5. Composition according to claim 1, characterized by the fact that said PCV2 capsid protein is encoded by SEQ ID NO: 09 or SEQ ID NO: 24.

6. Composition according to claim 1, characterized by the fact that said porcine interferon-α is encoded as SEQ ID NO: 64.

7. Composition according to claim 1, characterized by the fact that said porcine interferon-Y is encoded as SEQ ID NO: 76.