BR112017027079B1 - Uso de uma composição compreendendo desoxinucleosídeos para o tratamento de síndrome de depleção do dna mitocondrial relacionada a timidina quinase - Google Patents

Uso de uma composição compreendendo desoxinucleosídeos para o tratamento de síndrome de depleção do dna mitocondrial relacionada a timidina quinase Download PDF

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Abstract

terapia de desoxinucleosídeos para doenças causadas por pools de nucleotídeos em desequilíbrio, incluindo síndromes de depleção do dna mitocondrial. a invenção se refere geralmente a uma terapia farmacológica para doenças genéticas humanas, especificamente aquelas caracterizadas por pools de nucleotídeos em desequilíbrio, mais especificamente síndromes de depleção de dna mitocondrial e, mais especificamente, deficiência de timidina quinase 2 (tk2). a terapia farmacológica envolve a administração de pelo menos um desoxinucleosídeo ou misturas do mesmo. para o tratamento da deficiência de tk2, a terapia farmacológica envolve a administração de desoxitimidina (dt) ou desoxicitidina (dc) ou misturas das mesmas. essa administração de desoxinucleosídeos é aplicável a outros distúrbios de pools de nucleotídeos em desequilíbrio, especialmente aqueles encontrados na síndrome de depleção do dna mitocondrial.

Description

SUPORTE DO GOVERNO
[0001]Esta invenção foi feita com suporte do governo sob HD080642 concedido pelo NIH. O governo tem certos direitos sobre a invenção.
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0002]O presente pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório US No. de série 62/180. 194 depositado em 17 de junho de 2015, o qual é incorporado neste documento por referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0003]A invenção se refere, em geral, a uma terapia farmacológica para uma doença genética humana, especificamente doenças caracterizadas por pools de nucleotídeos em desequilíbrio, por exemplo, síndromes de depleção do DNA mitocondrial e, mais especificamente, deficiência de timidina quinase 2(TK2). A terapia farmacológica envolve a administração de pelo menos um desoxinucleosídeo ou misturas do mesmo. Para o tratamento da deficiência de TK2, a terapia farmacológica envolve a administração de desoxitimidina (dT) ou desoxicitidina (dC) ou misturas das mesmas. Essa administração de um ou mais desoxinucleosídeos é aplicável a outros distúrbios de pools de nucleosídeos em desequilíbrio, especialmente aqueles encontrados na síndrome de depleção do DNA mitocondrial.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0004]Doenças mitocondriais são doenças clinicamente heterogêneas devido a defeitos na cadeia respiratória mitocondrial (RC) e fosforilação oxidativa, as vias bioquímicas que convertem energia em elétrons em adenosina trifosfato (ATP). A cadeia respiratória compreende quatro enzimas de múltiplas subunidades (complexos I-IV) que transferem elétrons para gerar um gradiente de prótons através da membrana interna das mitocôndrias e o fluxo de prótons através do complexo V aciona a síntese de ATP (DiMauro e Schon 2003; DiMauro e Hirano 2005). A coenzima Q10 (CoQ10) é uma molécula essencial que transporta elétrons dos complexos I e II para o complexo III. A cadeia respiratória é única em eucariotos, por exemplo, células de mamíferos, em virtude de ser controlada por dois genomas, DNA mitocondrial (mtDNA) e DNA nuclear (nDNA). Consequentemente, mutações em qualquer um dos genomas podem causar doenças mitocondriais. A maioria das doenças mitocondriais afeta múltiplos órgãos do corpo e tipicamente são fatais na infância ou no início da vida adulta. Não há tratamentos eficazes comprovados para doenças mitocondriais, somente terapias de suporte, tais como a administração de CoQ10 e seus análogos para potencializar a atividade da cadeia respiratória e para desintoxicar espécies reativas de oxigênio (ROS) que são subprodutos tóxicos de enzimas da cadeia respiratória disfuncionais.
[0005] A síndrome de depleção do DNA mitocondrial (MDS), que é um subgrupo de doença mitocondrial, é uma causa frequente de encefalomiopatia grave da infância caracterizada molecularmente pela redução do número de cópias do DNA mitocondrial (mtDNA) nos tecidos e síntese insuficiente de complexos RC mitocondriais (Hirano, et al. 2001). Mutações em diversos genes nucleares foram identificadas como causas de MDS infantil, incluindo: TK2, DGUOK, POLG, POLG2, SCLA25A4, MPV17, RRM2B, SUCLA2, SUCLG1, TYMP, OPA1, e C10orf2 (PEO1). (Bourdon, et al. 2007; Copeland 2008; Elpeleg, et al. 2005; Mandel, et al. 2001; Naviaux and Nguyen 2004; Ostergaard, et al. 2007; Saada, et al. 2003; Sarzi, et al. 2007; Spinazzola, et al, 2006). Além disso, mutações nesses genes nucleares também podem causar múltiplas deleções de mtDNA com ou sem depleção de mtDNA (Béhin, et al. 2012; Garone, et al. 2012; Longley, et al. 2006; Nishino, et al. 1999; Paradas, et al. 2012; Ronchi, et al. 2012; Spelbrink, et al. 2001; Tyynismaa, et al. 2009; Tyynismaa, et al. 2012; Van Goethem, et al. 2001).
[0006] Um desses genes é TK2, que codifica a timidina quinase (TK2), uma enzima mitocondrial necessária para a fosforilação dos nucleosídeos de pirimidina (timidina e desoxicitidina) para gerar desoxitimidina monofosfato (dTMP) e desoxicitidina monofosfato (dCMP) (Saada, et al. 2001). Mutações em TK2 prejudicam as vias de recuperação de nucleosídeos/nucleotídeos mitocondriais necessárias para a síntese de desoxinucleotídeo trifosfato (dNTP), os blocos de construção para a replicação e reparo de mDNA.
[0007] A deficiência de TK2 foi descrita primeiramente em 2001 por Saada e colaboradores (Saada, et al. 2001), em quatro crianças afetadas provenientes de quatro famílias diferentes, que sofreram de miopatia grave e devastadora. Após um desenvolvimento inicial sem intercorrências, nas idades de 6-36 meses os pacientes desenvolveram hiperCKemia, hipotonia muscular grave com subsequente perda de atividade espontânea. A doença foi rapidamente progressiva e dois pacientes foram ventilados mecanicamente aos 3 anos, enquanto dois outros pacientes já estavam mortos à época do relatório.
[0008] Após a primeira descrição, sessenta pacientes adicionais foram relatados na literatura e pelo menos vinte e seis outros pacientes foram diagnosticados, mas não relatados (Alston, et al. 2013; Bartesaghi, et al. 2010; Béhin, et al. 2012; Blakely, et al. 2008; Carrozzo, et al. 2003; Chanprasert, et al. 2013; Collins, et al. 2009; Galbiati, et al. 2006; Gotz, et al. 2008; Leshinsky-Silver, et al. 2008; Lesko, et al. 2010; Mancuso, et al. 2002; Mancuso, et al. 2003; Marti, et al. 2010; Oskoui, et al. 2006; Paradas, et al. 2012; Roos, et al. 2014; Tulinius, et al. 2005; Tyynismaa, et al. 2012; Vilà, et al. 2003; Wang, et al. 2005), resultando em noventa pacientes, 53 homens e 37 mulheres.
[0009] Os vinte e seis pacientes recentemente diagnosticados foram identificados através do sequenciamento de DNA de última geração. Esse grande número de casos recém-identificados sugere que a deficiência de TK2 é um distúrbio pouco diagnosticado.
[0010] A deficiência de TK2 manifesta um amplo espectro genético clínico e molecular com a maioria dos pacientes apresentando manifestações no início da infância com um curso clínico devastador, enquanto outros apresentam fraqueza progressiva lenta ao longo de décadas.
[0011] O tratamento para a deficiência de TK2, como a maioria dos distúrbios de MDS e mitocondriais, tem sido limitado a terapias de suporte. Embora a administração de desoxitimidina monofosfato (dTMP) e desoxicitidina monofosfato (dCMP) tenha melhorado as condições tanto de camundongos mutantes com inserção (knock-in) de TK2 e pacientes humanos com deficiência de TK2 (Pedido US No. de série 15/082. 207, que é incorporado neste documento na sua totalidade), ainda há necessidade de intervenção terapêutica para a deficiência de TK2.
[0012] Adicionalmente, há a necessidade de tratamento para outras formas de MDS e outras doenças caracterizadas por pools de nucleotídeos em desequilíbrio. Por exemplo, diversos distúrbios mendelianos com depleção de mtDNA ou deleções múltiplas ou ambas são caracterizados por pools de desoxinucleotídeo trifosfato em desequilíbrio que levam a defeitos da replicação de mtDNA. Um desses distúrbios, mutações DGUOK, prejudicam a enzima intramitocondrial desoxiguanosina quinase, a qual normalmente fosforila os nucleosídeos desoxipurina desoxiguanosina e desoxicitidina para gerar desoxiguanosina monofosfato (dGMP) e desoxicitidina monofosfato (dCMP). Outros genes nucleares que perturbam os pools de dNTP mitocondriais incluem TYMP, RRM2B, SUCLA2, SUCLG1 e MPV17. As terapias que restauram o equilíbrio do pool de dNTP seriam úteis também para tratar esses distúrbios.
RESUMO DA INVENÇÃO
[0013] Em certas modalidades, a presente invenção se refere a um método de tratamento de uma doença ou distúrbio caracterizado por pools de nucleotídeos em desequilíbrio, compreendendo administrar a um sujeito que necessite do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo um ou mais desoxinucleosídeos.
[0014] Doenças ou distúrbios caracterizados por pools de nucleotídeos em desequilíbrio que podem ser tratados pelo método da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, aqueles caracterizados por mutações nos seguintes genes: TK2; DGUOK; TYMP; RRM2B; SUCLA2; SUCLG1; e MPV17.
[0015] Em uma modalidade preferencial, o distúrbio é uma síndrome de depleção do DNA mitocondrial (MDS). Em uma modalidade mais preferencial, a MDS inclui distúrbios de uma forma miopática caracterizada por mutações em TK2, uma forma encefalomiopática caracterizada por mutações em SUCLA2, uma forma encefalopática neurogastrointestinal caracterizada por mutações em TYMP, e uma forma hepatopática caracterizada por mutações em DGUOK, POLG e MPV17. Em uma modalidade mais preferencial, o distúrbio é uma deficiência de timidina quinase 2, caracterizada por mutação(ões) no gene deTK2.
[0016] Todas as síndromes de depleção do DNA mitocondrial podem ser tratadas com o método da presente invenção que compreende a administração de desoxinucleosídeos. Exemplos de MDS que podem ser tratados pelo método da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, deficiências no: gene DGUOK, que codifica a desoxiguanosina quinase, dGK; gene RRM2B, que codifica p53R2, a subunidade pequena induzível de p53 da ribonucleotídeo redutase, RNR; e gene TYMP, que codifica a timidina fosforilase, TP.
[0017] Em uma modalidade preferencial, o desoxinucleosídeo é desoxitimidina (dT) ou desoxicitidina (dC) ou misturas das mesmas. A desoxiadenosina (dA) e a desoxiguanosina (dG), isoladas ou em conjunto, também podem ser usadas no método da invenção. Um desoxinucleosídeo (isto é, dT, dC, dA ou dG) e misturas de dois ou mais de qualquer um dos quatro desoxinucleosídeos podem ser usadas no método da invenção.
[0018] Dosagens preferenciais do(s) desoxinucleosídeo(s) estão entre cerca de 100 e cerca de 1000 mg/kg/dia, mais preferencialmente entre cerca de 300 e cerca de 800 mg/kg/dia, e mais preferencialmente entre cerca de 250 e cerca de 600 mg/kg/dia. Se a composição compreender um único desoxinucleosídeo, então as dosagens serão do único desoxinucleosídeo. Se a composição compreender mais de um desoxinucleosídeo, as dosagens podem ser de cada desoxinucleosídeo ou dos desoxinucleosídeos totais da composição.
[0019] A administração do(s) desoxinucleosídeo(s) pode ser uma vez ao dia, duas vezes ao dia, três vezes ao dia, quatro vezes ao dia, cinco vezes ao dia, até seis vezes ao dia, preferencialmente em intervalos regulares.
[0020] Métodos preferenciais de administração são oral, intratecal, intravenoso e enteral.
[0021] A administração do(s) desoxinucleosídeo(s) deve começar assim que o distúrbio caracterizado por pools de nucleotídeos em desequilíbrio, por exemplo, MDS, estiver em suspeita e continuar ao longo da vida do paciente. Testes para o diagnóstico de tais distúrbios incluindo a deficiência de TK2 são conhecidos na técnica.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0022] Com a finalidade de ilustrar a invenção, certas modalidades da invenção estão representadas nas figuras. No entanto, a invenção não está limitada às disposições e instrumentalidades precisas das modalidades representadas nas figuras.
[0023] A Figura 1 representa uma curva de crescimento de camundongos (Tk2+/+ e Tk2+/-) tipo selvagem e Tk2-/- tratados com 260 mg/kg/dia ou 520 mg/kg/dia de desoxicitidina (dC) e desoxitimidina (dT) a partir do dia 4 pós-natal. Cada símbolo representa a média de peso em cada ponto de tempo. N de cada grupo é indicado na figura.
[0024] A Figura 2 representa a curva de sobrevivência de camundongos (Tk2+/+), e Tk2-/- do tipo selvagem com os seguintes tratamentos: Tk2-/-leite vs Tk2-/-200 mg/kg/dia de dCMP+dTMP, p=0,0013; Tk2-/-leite vs Tk2-/- 260 mg/kg/dia de dC+dT, p=0,0006; Tk2-/-leite vs Tk2-/- 520 mg/kg/dia de dC+dT, p<0,0001; Tk2-/- 260 mg/kg/dia de dC=dT vs Tk2-/-520mg/kg/dia de dCdT, p=0,0009, no dia 4 pós-natal. N de cada grupo indicado na figura. Valores de p determinados pelos testes de Mantel-Cox.
[0025] A Figura 3 representa gráficos das proporções relativas de dNTPs em mitocôndrias isoladas de tecido cerebral e hepático (Tk2+/+) do tipo selvagem, e Tk2-/-, não tratados ou tratados com 200 mg/kg/dia de dCMP e dAMP, ou 260 mg/kg/dia ou 520 mg/kg/dia de desoxicitidina (dC) e desoxitimidina (dT) nas idades dia 13 pós-natal (painéis superiores) e dia 29 pós-natal (painéis inferiores).
[0026] A Figura 4 representa gráficos que mostram a razão de mtDNA/nDNA no cérebro, fígado, intestino e músculo em camundongos Tk2 do tipo selvagem (Tk2+/+) (barra à esquerda) em comparação com camundongos Tk2-/-, não tratados ou tratados com 260 mg/kg/dia ou 520 mg/kg/dia de desoxicitidina (dC) e desoxitimidina (dT), nas idades dias 13 e 29 pós-natal. Os dados estão representados como média ± desvio padrão (SD) da porcentagem de cópias de mtDNA em relação a Tk2+. Os valores de p foram avaliados pelos testes de Mann-Whitney. (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001).
[0027] A Figura 5 representa gráficos que representam os resultados de HPLC que mediram dT e uracila no plasma camundongos do tipo selvagem não tratados (Tk2+/+), camundongos do tipo selvagem (Tk2+/+) tratados com 260 mg/kg/dia de desoxicitidina (dC) e desoxitimidina (dT), camundongos Tk2-/- tratados com 260 mg/kg/dia de desoxicitidina (dC) e desoxitimidina (dT) e camundongos Tk2-/- tratados com 200 mg/kg/dia de dCMP e dTMP, 30 minutos após o tratamento. Os dados estão expressos como média ± SD.
[0028] A Figura 6 representa gráficos de níveis de atividades de enzimas da cadeia respiratória em camundongos Tk2-/- tratados com 400 mg/kg/dia de dCMP e dTMP e THU aos 13 dias pós-natal, 260 mg/kg/dia de desoxicitidina (dC) e desoxitimidina (dT) aos 13 e 29 dias pós-natal, ou 520 mg/kg/dia de desoxicitidina (dC) e desoxitimidina (dT) 29 dias pós-natal. Os dados estão representados como a porcentagem das atividades de RCE em tecidos de camundongos Tk2-/- normalizados para níveis de proteínas e em relação a Tk2+ para cada tratamento. Valores de p determinados por testes de Mann-Whitney. *p<0,05.
[0029] A Figura 7A representa um imunoblot de proteínas da cadeia respiratória em camundongos do tipo selvagem tratados com 260 mg/kg/dia ou 520 mg/kg/dia de desoxicitidina (dC) e desoxitimidina (dT) e camundongos Tk2-/- tratados com 260 mg/kg/dia ou 520 mg/kg/dia de desoxicitidina (dC) e desoxitimidina (dT) aos 29 dias pós-natal. A Figura 7B representa gráficos que mostram os níveis de RCE normalizados para o complexo II, representados como porcentagem dos níveis de RCE em camundongos TK2+/+. Os valores de p foram avaliados por testes de Mann- Whitney.
[0030] Abreviações: CS = citrato sintase; CI = NADH- desidrogenase; CII = succinato desidrogenase; CIII = citocromo c redutase; CIV = citocromo c oxidase (COX); CI+III = NADH-citocromo c redutase; CII+III = succinato desidrogenase-citocromo c redutase. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0031] A presente invenção se baseia na verificação de que as síndromes de depleção do DNA mitocondrial, incluindo a deficiência de TK2, podem ser tratadas com desoxinucleosídeos. Como mostrado pelos resultados neste documento, a administração de desoxinucleosídeos melhorou significativamente a condição tanto em um modelo de camundongo de deficiência de TK2 quanto em pacientes humanos com deficiência de TK2.
Definições
[0032] Os termos usados neste relatório descritivo geralmente têm seus significados comuns na técnica, dentro do contexto desta invenção e do contexto específico em que cada termo é usado. Certos termos são discutidos abaixo ou em outros lugares no relatório descritivo para prover orientação adicional ao profissional na descrição dos métodos da invenção e como usá-los. Além disso, será apreciado que a mesma coisa pode ser dita de mais de uma forma. Consequentemente, linguagem alternativa e sinônimos podem ser usados para qualquer um ou mais dos termos discutidos neste documento, e nenhum significado especial deve ser atribuído à elaboração ou discussão ou não de um termo neste documento. Sinônimos para certos termos são providos. Um relato de um ou mais sinônimos não exclui o uso dos outros sinônimos. O uso de exemplos em qualquer parte do relatório descritivo, incluindo exemplos de quaisquer termos tratados neste documento, é somente ilustrativo e de modo algum limita o escopo e o significado da invenção ou qualquer termo exemplificado. Do mesmo modo, a invenção não está limitada às suas modalidades preferenciais.
[0033] O termo "sujeito" como usado neste pedido significa mamíferos. Os mamíferos incluem caninos, felinos, roedores, bovinos, equinos, suínos, ovinos e primatas. Assim, a invenção pode ser usada em medicina veterinária, por exemplo, para tratar animais domésticos, animais de fazenda, animais de laboratório, em parques zoológicos e animais selvagens. A invenção é particularmente desejável para aplicações médicas humanas.
[0034] O termo "paciente" como usado neste pedido significa um sujeito humano. Em algumas modalidades da presente invenção, sabe- se ou suspeita-se que o "paciente" tem uma doença ou distúrbio caracterizado por pools de nucleotídeos em desequilíbrio, doença mitocondrial, síndrome de depleção do DNA mitocondrial ou deficiência de TK2.
[0035] A frase "quantidade terapeuticamente eficaz" é usada neste documento para significar uma quantidade suficiente para causar uma melhoria em uma condição clinicamente significativa no sujeito, ou retarda ou minimiza ou diminui um ou mais sintomas associados à doença ou distúrbio, ou resulta em uma mudança benéfica desejada na fisiologia do sujeito.
[0036] Os termos "tratar", "tratamento" e semelhantes se referem a um meio para desacelerar, atenuar, melhorar ou aliviar pelo menos um dos sintomas da doença ou distúrbio, ou reverter a doença ou distúrbio após o seu início.
[0037] Os termos "prevenir", "prevenção" e semelhantes se referem à atuação antes da manifestação do início da doença ou distúrbio, a fim de evitar que a doença ou distúrbio se desenvolva ou minimizar o nível da doença ou distúrbio ou desacelerar seu curso de desenvolvimento.
[0038] O termo "em necessidade do mesmo" seria um sujeito que se sabe ou se suspeita que tenha ou esteja em risco de ter uma doença ou distúrbio caracterizado por pools de nucleotídeos em desequilíbrio, doença mitocondrial, síndrome de depleção do DNA mitocondrial ou deficiência de TK2.
[0039] O termo "agente", como usado neste documento, significa uma substância que produz ou é capaz de produzir um efeito e incluiria, mas não se limita a, produtos químicos, farmacêuticos, biológicos, pequenas moléculas orgânicas, anticorpos, ácidos nucleicos, peptídeos e proteínas.
[0040] O termo "desoxinucleosídeo", como usado neste documento, significa desoxitimidina ou dT, desoxicitidina ou dC, desoxiadenosina ou dA, e desoxiguanosina ou dG. O nome completo e abreviatura comum para cada um será usado de forma intercambiável. Tais desoxinucleosídeos também incluem derivados fisiologicamente funcionais dos desoxinucleosídeos.
[0041] Como usado neste documento, o termo "derivado fisiologicamente funcional" se refere a um composto (por exemplo, um precursor de fármaco) que é transformado in vivo para produzir um desoxinucleosídeo. A transformação pode ocorrer por vários mecanismos (por exemplo, por processos metabólicos ou químicos), tais como, por exemplo, por hidrólise no sangue. Pró-drogas são tais derivados e uma discussão sobre o uso de pró-drogas é provida por T. Higuchi e W. Stella, “Pro-drugs as Novel Delivery Systems,” Vol. 14 da A. C. S. Symposium Series, e em Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association e Pergamon Press, 1987.
[0042] Como usado neste documento, "um efeito adverso" é uma reação indesejada causada pela administração de um fármaco. Na maioria dos casos, a administração dos desoxinucleosídeos não causou nenhum efeito adverso. O efeito adverso mais esperado seria uma intolerância gastrointestinal sem importância.
[0043] O termo "cerca de" ou "aproximadamente" significa dentro de uma faixa de erro aceitável para o valor em particular determinado por alguém ordinariamente versado na técnica, o que dependerá em parte de como o valor é medido ou determinado, isto é, das limitações do sistema de medição, isto é, do grau de precisão necessário para uma finalidade em particular, tal como uma formulação farmacêutica. Por exemplo, "cerca de" pode significar dentro de 1 ou mais de 1 desvio padrão, pela prática no estado da técnica. Alternativamente, "cerca de" pode significar um intervalo de até 20%, preferencialmente até 10%, mais preferencialmente até 5%, e ainda mais preferencialmente até 1% de um dado valor. Alternativamente, particularmente a respeito dos sistemas ou processos biológicos, o termo pode significar dentro de uma ordem de magnitude, preferencialmente dentro de 5 vezes, e mais preferencialmente dentro de 2 vezes um valor. Onde valores específicos estiverem descritos no pedido e nas reivindicações, a menos que indicado de forma diferente, o termo "cerca de", significando dentro de uma faixa de erro aceitável para o valor em particular, deve ser presumido. Administração de desoxinucleosídeos para o tratamento da síndrome de depleção do DNA mitocondrial
[0044] A síndrome de depleção do DNA mitocondrial (mtDNA) (MDS) compreende diversas doenças autossômicas graves caracterizadas por uma redução do número de cópias de mtDNA nos tecidos afetados. A maioria dos genes nucleares causadores de MDS codificam proteínas que pertencem à maquinaria de replicação de mtDNA ou estão envolvidos no metabolismo de desoxirribonucleosídeo trifosfato (dNTP).
[0045] Uma forma de MDS é a deficiência de timidina quinase ou TK2. TK2 codificada pelo gene nuclear, TK2, é uma proteína de matriz mitocondrial que fosforila os nucleosídeos timidina e desoxicitidina para gerar desoxitimidina monofosfato (dTMP) e desoxicitidina monofosfato (dCMP), que, por sua vez, são convertidos em desoxinucleotídeos trifosfatos (dNTPs) necessários para a síntese de DNA mitocondrial. Como discutido na seção de fundamentos, mutações de TK2 autossômico recessivo causam fraqueza neuromuscular devastadora com depleção grave de DNA mitocondrial (mtDNA) em bebês e crianças, bem como oftalmoplegia externa progressiva com múltiplas deleções de mtDNA em adultos. Muitos pacientes não podem caminhar e necessitam de algum tipo de ventilação mecânica e tubo de alimentação. O sistema nervoso central está envolvido de forma variável nesses distúrbios, com sintomas que incluem convulsões, encefalopatia, comprometimento cognitivo e perda auditiva. Menos de 7% dos pacientes vivem mais de 42 anos.
[0046] Com base em descobertas genéticas clínicas e moleculares de pacientes assim diagnosticados, foram identificadas três apresentações da doença: i) miopatia com início na primeira infância (<1 ano de idade) com início de fraqueza no primeiro ano de vida com depleção de mtDNA grave e mortalidade precoce; ii) miopatia com início na infância (>1-11 anos de idade) com depleção grave de mtDNA; e iii) miopatia com início tardio (>12 anos de idade) com fraqueza leve no início e progressão lenta para a perda de ambulação, insuficiência respiratória ou ambas, muitas vezes com oftalmoparesis externa crônica progressiva na adolescência ou vida adulta em associação com múltiplas deleções do mtDNA, número de cópias de mtDNA reduzido, ou ambos. Vide geralmente Garone, et al. ,(2016) em preparação.
[0047] Tentativas de estudar a patogênese e terapias de teste para a deficiência de TK2 usando fibroblastos cultivados a partir de pacientes não tiveram êxito, pois as células replicantes não conseguiram manifestar a depleção do mtDNA. Em contraste, um modelo de camundongo mutante homozigótico com inserção (knock-in) de TK2 H126N (Tk2-/-) manifesta um fenótipo que é extremamente semelhante à encefalomiopatia infantil humana causada por mutações em TK2, caracterizado pelo início aos 10 dias de idade com diminuição da ambulação, marcha instável, tremor grosseiro, retardo de crescimento e depleção de DNA mitocondrial (mtDNA), progredindo rapidamente para a morte precoce aos 14 a 16 dias, que é um período de tempo análogo àquele da doença humana de início na primeira infância (Akman, et al. 2008; Dorado, et al. 2011).
[0048] Os estudos estabelecidos neste documento com camundongos com inserção de Tk2 mostraram que a administração oral de dC/dT retardou o início dos sintomas clínicos de deficiência de TK2 e prolongou as vidas dos camundongos em duas ou três vezes (Exemplo 2).
[0049] Experimentos adicionais mostraram efeitos específicos a tecidos. A medição dos níveis do pool de dNTP em extratos de mitocôndrias mostrou que o dCTP foi resgatado no cérebro e o dTTP foi resgatado no fígado (Exemplo 3). A medição da depleção de mtDNA mostrou que tanto a terapia dCMP+dTMP quanto dC+dT resgataram o número de cópias de mtDNA no fígado, músculo e tecido (Exemplo 4). Anteriormente, especulou-se que a formação da barreira hematoencefálica poderia comprometer a biodisponibilidade do tratamento no cérebro. No entanto, as medições por HPLC mostraram que os produtos catalíticos desses compostos foram encontrados em concentrações mais elevadas após tanto o tratamento com nucleotídeos monofosfatos quanto com desoxinucleosídeos, sugerindo que eles são capazes de atravessar a barreira hematoencefálica. As medidas de depleção do mtDNA também mostraram um resgate total do número de cópias de mtDNA no intestino.
[0050] Assim, os experimentos estabelecidos neste documento usando o modelo de camundongo de deficiência de Tk2 mostram que a administração de desoxinucleosídeos é eficaz e segura para o tratamento da doença. Adicionalmente, como mostrado no Exemplo 5, a administração de dT e dC melhorou muito os sintomas de deficiência de TK2 em pacientes.
[0051] Assim, a presente invenção inclui a administração de pelo menos um desoxinucleosídeo a um paciente em necessidade do mesmo. Em uma modalidade, a presente invenção inclui a administração de pelo menos uma desoxipirimidina. Em uma modalidade adicional, a desoxipirimidina é escolhida dentre dC, dT e misturas das mesmas. Em ainda outra modalidade, a presente invenção inclui a administração de pelo menos uma desoxipurina. Em uma modalidade adicional, a desoxipurina é escolhida dentre dA, dG e misturas das mesmas.
[0052] Os pacientes que se beneficiariam com a administração de desoxinucleosídeos seriam aqueles diagnosticados com deficiência de TK2. Nesses pacientes, pelo menos uma desoxipirimidina, dC ou dT, ou misturas das mesmas seria administrada.
[0053] Um defeito paralelo da desoxiguanosina quinase (dGK), devido a mutações autossômicas recessivas em DGUOK com deficiências de dGMP e dAMP causa depleção do mtDNA que tipicamente se manifesta como doença hepatocerebral com início no início da infância (Mandel, et al. 2001). Esses pacientes se beneficiariam com a administração de pelo menos uma desoxipurina, dG ou dA, ou misturas das mesmas.
[0054] Outras formas de MDS, bem como outros distúrbios relacionados a pools de nucleotídeos em desequilíbrios, podem ser tratadas através da administração de desoxinucleosídeos específicos, isto é, dA, dG, dC ou dT, ou misturas dos mesmos. Esses distúrbios incluiriam, mas não estão limitados a, deficiências relacionadas a RRM2B (que codifica p53R2, a subunidade pequena induzível p53 de ribonucleotídeo redutase, RNR) e mutações em TYMP (que codifica timidina fosforilase, TP) que causam encefalomiopatia neurogastrointestinal mitocondrial (MNGIE). Genes nucleares adicionais que perturbam os pools de dNTP mitocondriais incluem, mas não estão limitados a, SUCLA2, SUCLG1 e MPV17. Distúrbios relacionados a esses genes também podem ser tratados através da administração de um ou mais desoxinucleosídeos.
[0055] Adicionalmente, à medida que os mecanismos de outras formas de MDS e outros distúrbios se tornam elucidados, o(s) desoxinucleosídeo(s) apropriado(s) para o tratamento pode(m) ser determinado(s) pelo especialista qualificado.
[0056] Pacientes que exibem o fenótipo discutido acima para deficiência de TK2, incluindo a apresentação mais típica da doença muscular progressiva caracterizada por hipotonia generalizada, fraqueza muscular proximal, perda de habilidades motoras adquiridas anteriormente, má alimentação e dificuldades respiratórias, podem ser testados para diagnosticar definitivamente a doença.
[0057] Se a apresentação clínica for altamente suspeita para a síndrome de depleção do mtDNA, testes genéticos moleculares usando um painel de genes conhecidos por causar síndrome de depleção do mtDNA devem ser realizados (Chanprasert, et al. 2012). O gene TK2 é o único gene no qual se sabe que as mutações causam síndrome de depleção do DNA mitocondrial relacionada a TK2. Esse teste pode incluir uma análise de sequência de toda a codificação e regiões de junção de éxons/íntrons de TK2 para variantes de sequência e deleção/duplicação. Se as mutações deletérias heterozigóticas ou homozigóticas compostas forem identificadas na análise da sequência, o diagnóstico de deficiência de TK2 é confirmado e, assim, o sujeito se beneficiaria com a terapia de desoxinucleosídeos. Se a análise de sequência não identificar duas mutações deletérias heterozigóticas ou homozigóticas compostas, a análise de deleção/duplicação deverá ser considerada para determinar e/ou confirmar um diagnóstico de deficiência de TK2.
[0058] Testes adicionais para determinar e/ou confirmar um diagnóstico de deficiência de TK2 podem incluir teste de concentração de creatina quinase (CK) sérica, eletromiografia, histopatologia em músculo esquelético, teor de DNA mitocondrial (mtDNA) (número de cópias) e atividade da cadeia de transporte de elétrons (ETC) no músculo esquelético. Se for encontrado um ou mais dos seguintes nesses testes, a deficiência de TK2 é determinada e/ou confirmada. Concentração de CK elevada em comparação com controles saudáveis pode indicar deficiência de TK2. Uma biópsia do músculo esquelético pode ser desempenhada e então uma análise do conteúdo de mtDNA no músculo esquelético pode ser desempenhada. Se a biópsia do músculo esquelético mostrar variância proeminente no tamanho da fibra, vacúolos sarcoplásmicos variáveis, tecido conjuntivo aumentado variável e fibras vermelhas irregulares, bem como aumento da atividade da succinato desidrogenase (SDH) e atividade da citocromo c oxidase (COX) baixa a ausente, e número de cópias de mtDNA for severamente reduzido (tipicamente menos de 20% dos controles saudáveis compatíveis com idade e tecido), um diagnóstico de deficiência de TK2 pode ser determinado e/ou confirmado (Chanprasert, et al. 2012).
[0059] Adicionalmente, a deficiência de TK2 é herdada de maneira autossômica recessiva. Assim, um irmão de um paciente afetado pode ser testado o mais cedo possível após o nascimento para diagnosticar a doença.
[0060] Em todos esses exemplos, a terapia de desoxinucleosídeos deve ser iniciada o mais cedo possível após o diagnóstico de deficiência de TK2. Composições Farmacêuticas, Métodos de Administração e Dosagem
[0061] A presente invenção engloba a administração de desoxinucleosídeos, mais especificamente um ou mais desoxinucleosídeos.
[0062] Métodos mais preferenciais de administração são oral, intratecal, e parenteral, incluindo intravenoso. Os desoxinucleosídeos devem estar na forma apropriada para a administração de escolha.
[0063] Os desoxinucleosídeos são facilmente dissolvidos em líquidos são facilmente dissolvidos em líquidos (tais como água, fórmula ou leite), enquanto a forma de ácido livre não se dissolve prontamente em líquido.
[0064] Tais composições farmacêuticas compreendendo um dentre mais desoxinucleosídeos para administração podem compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz dos desoxinucleosídeos e um transportador farmaceuticamente aceitável. A frase "farmaceuticamente aceitável" se refere a entidades moleculares e composições que são fisiologicamente toleráveis e tipicamente não produzem uma reação alérgica ou desagradável semelhante, tal como, por exemplo, desconforto gástrico, tonturas e semelhantes, quando administradas a um humano e aprovadas por uma agência regulatória do governo federal ou estadual ou listadas nos EUA. A Farmacopeia dos EUA ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais e mais particularmente em humanos. O termo "transportador" se refere a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o terapêutico é administrado. Tais transportadores farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como soluções salinas em água e óleos, incluindo aqueles de petróleo, animais, vegetais ou de origem sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e semelhantes. Uma solução salina é um transportador preferencial quando a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa. Soluções salinas e soluções aquosas de glicerol e dextrose também podem ser empregadas como transportadores líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e semelhantes. A composição, se desejado, também pode conter quantidades menores de agentes umectantes ou emulsificantes, ou agentes tamponantes de pH.
[0065] A administração oral é um método preferencial de administração. Os desoxinucleosídeos podem ser adicionados a qualquer forma de líquido que um paciente consumiria, incluindo, mas não limitado a, leite, tanto de vaca quanto humano, fórmula infantil e água.
[0066] Adicionalmente, composições farmacêuticas adaptadas para administração oral podem ser cápsulas, comprimidos, pós, grânulos, soluções, xaropes, suspensões (em líquidos não aquosos ou aquosos) ou emulsões. Comprimidos ou cápsulas de gelatina dura podem compreender lactose, amido ou derivados dos mesmos, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, ácido esteárico ou sais dos mesmos. Cápsulas de gelatina mole podem compreender óleos vegetais, ceras, gorduras, polióis semissólidos ou líquidos. Soluções e xaropes podem compreender água, polióis e açúcares. Um agente ativo destinado para administração oral pode ser revestido ou misturado por adição com um material que retarda a desintegração e/ou a absorção do agente ativo no trato gastrointestinal. Assim, a liberação prolongada pode ser atingida ao longo de muitas horas e, se necessário, o agente ativo pode ser protegido da degradação dentro do estômago. Composições farmacêuticas para administração oral podem ser formuladas para facilitar a liberação de um agente ativo em um local gastrointestinal em particular devido a condições específicas de pH ou enzimáticas.
[0067] A fim de superar qualquer problema que os desoxinucleosídeos tenham em atravessar a barreira hematoencefálica, a administração intratecal é uma forma de administração adicionalmente preferencial (Galbiati, et al. 2006; Gotz, et al. 2008). A administração intratecal envolve a injeção do fármaco no canal espinhal, mais especificamente no espaço subaracnoide, de forma tal que ele alcance o fluido cefalorraquidiano. Esse método é comumente usado para anestesia espinhal, quimioterapia e medicação para dor. A administração intratecal pode ser desempenhada por punção lombar (injeção de bolus) ou por um sistema porta-cateter (bolus ou infusão). O cateter é mais comumente inserido entre as lâminas das vértebras lombares e a ponta é roscada no espaço tecal no nível desejado (geralmente L3-L4). As formulações intratecais mais comumente usam água e salina como excipientes, mas também foram usados EDTA e lipídios.
[0068] Uma forma de administração adicionalmente preferencial é parenteral, incluindo a administração intravenosa. Composições farmacêuticas adaptadas para administração parenteral, incluindo administração intravenosa, incluem soluções ou suspensões aquosas e não aquosas injetáveis estéreis, as quais podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam as composições substancialmente isotônicas ao sangue do sujeito. Outros componentes que podem estar presentes em tais composições incluem água, álcoois, polióis, glicerina e óleos vegetais. Composições adaptadas para administração parenteral podem ser apresentadas em recipientes de doses unitárias ou múltiplas, tais como ampolas e frascos vedados, e podem ser armazenadas em uma condição seca por congelamento (liofilizada) que requer somente a adição de um transportador estéril, imediatamente antes do uso. Soluções e suspensões de injeção extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis. Veículos adequados que podem ser usados para prover formas de dosagem parenterais da invenção são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Exemplos incluem: Água para Injeção USP; veículos aquosos, tais como Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Dextrose, Injeção de Dextrose e Cloreto de Sódio e Injeção Lática de Ringer; veículos miscíveis com água, tais como álcool etílico, polietilenoglicol e polipropilenoglicol; e veículos não aquosos, tais como óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de amendoim, óleo de gergelim, oleato de etila, miristato de isopropila e benzoato de benzila.
[0069] Adicionalmente, uma vez que alguns pacientes podem estar recebendo nutrição enteral no momento em que o tratamento com desoxinucleosídeos começa, os dNs podem ser administrados através de um tubo de alimentação gastronômica ou outros meios de nutrição enteral.
[0070] Métodos adicionais de administração incluem mucosa, tais como nasal, sublingual, vaginal, bucal ou retal; ou administração transdérmica a um sujeito.
[0071] As composições farmacêuticas adaptadas para administração nasal e pulmonar podem compreender transportadores sólidos, tais como pós, os quais podem ser administrados por inalação rápida através do nariz. As composições para administração nasal podem compreender transportadores líquidos, tais como pulverizadores ou gotas. Alternativamente, a inalação direta através dos pulmões pode ser realizada por inalação profunda ou instalação através de um bocal. Essas composições podem compreender soluções aquosas ou oleosas do ingrediente ativo. As composições para inalação podem ser fornecidas em dispositivos especialmente adaptados, incluindo, mas não limitados a, aerossóis, nebulizadores ou insufladores pressurizados, os quais podem ser construídos de forma a prover dosagens predeterminadas do ingrediente ativo.
[0072] As composições farmacêuticas adaptadas para administração retal podem ser providas como supositórios ou enemas. As composições farmacêuticas adaptadas para administração vaginal podem ser providas como pessários, tampões íntimos, cremes, géis, pastas, espumas ou formulações para pulverização.
[0073] As composições farmacêuticas adaptadas para administração transdérmica podem ser providas como adesivos discretos destinados a permanecerem em contato íntimo com a epiderme do receptor ao longo de um período prolongado de tempo.
[0074] A terapia de desoxinucleosídeos compreende a administração de um ou mais desoxinucleosídeos escolhidos dentre o grupo que consiste em desoxitimidina (dT), desoxicitidina (dC), desoxiadenosina (dA) e desoxiguanosina (dG).
[0075] Um especialista qualificado pode determinar quais desoxinucleosídeos são benéficos com base na deficiência. Também está dentro da técnica para que o profissional determine se misturas dos desoxinucleosídeos devem ser administradas e em que razão. Se dois desoxinucleosídeos forem administrados, eles podem estar em uma razão de 50/50 de cada desoxinucleosídeo, por exemplo, dC e dT, ou em razões de cerca de 5/95, 10/90, 15/85, 20/80, 25/75, 30/70, 35/65, 40/60, 45/55, 55/45 60/40, 65/35, 70/30, 75/25, 80/20, 85/15, 90/10 e 95/5.
[0076] A título de exemplo, dT e dC são administradas em mistura de quantidades iguais para deficiência de TK2.
[0077] A seleção de uma dose terapeuticamente eficaz será determinada pelo versado na técnica considerando diversos fatores, os quais serão conhecidos por alguém versado na técnica. Tais fatores incluem a forma particular do desoxinucleosídeo e seus parâmetros farmacocinéticos, tais como biodisponibilidade, metabolismo e meia-vida, os quais terão sido estabelecidos durante os procedimentos de desenvolvimento habituais tipicamente empregados na obtenção de aprovação regulatória para um composto farmacêutico. Outros fatores ao considerar a dose incluem a condição ou doença a ser tratada ou o benefício a ser atingido em um indivíduo normal, a massa corporal do paciente, a via de administração, se a administração é aguda ou crônica, medicamentos concomitantes e outros fatores bem conhecidos por afetar a eficácia de agentes farmacêuticos administrados. Assim, a dose precisa deve ser decidida de acordo com o julgamento da pessoa versada na técnica e as circunstâncias de cada paciente, e de acordo com técnicas clínicas padrão.
[0078] Uma dose preferencial varia de cerca de 100 mg/kg/dia a cerca de 1000 mg/kg/dia. Uma dose preferencial adicional varia de cerca de 200 mg/kg/dia a cerca de 800 mg/kg/dia. Uma dose preferencial adicional varia de cerca de 250 mg/kg/dia a cerca de 400 mg/kg/dia. Essas quantidades de dosagem são de desoxinucleosídeos individuais ou de uma composição com uma mistura de mais de um desoxinucleosídeo, por exemplo, dT e dC. Por exemplo, uma dose pode compreender 400 mg/kg/dia de dT isolada. Em um exemplo adicional, uma dose pode compreender uma mistura de 200 mg/kg/dia de dT e 200 mg/kg/dia de dC. Em um exemplo adicional, uma dose pode compreender 400 mg/kg/dia de uma mistura de dT e dC.
[0079] A administração dos desoxinucleosídeos pode ser uma vez ao dia, duas vezes ao dia, três vezes ao dia, quatro vezes ao dia, cinco vezes ao dia, até seis vezes ao dia, preferencialmente em intervalos regulares. Por exemplo, quando os desoxinucleosídeos forem administrados quatro vezes ao dia, as doses seriam às 8:00 AM, às 12:00 PM, às 4:00 PM e às 8:00 PM.
[0080] As doses também podem ser reduzidas se forem administradas por via intravenosa ou intratecal. Faixas de dosagem preferenciais para tal administração são de cerca de 50 mg/kg/dia a cerca de 500 mg/kg/dia.
[0081] Como mostrado no Exemplo 5, as doses podem ser ajustadas para otimizar os efeitos no sujeito. Por exemplo, os desoxinucleosídeos podem ser administrados a 100 mg/kg/dia no início e então aumentados ao longo do tempo para 200 mg/kg/dia, para 400 mg/kg/dia, para 800 mg/kg/dia, até 1000 mg/kg/dia, dependendo da resposta e tolerabilidade do sujeito.
[0082] Um sujeito pode ser monitorado para melhorar sua condição antes de aumentar a dosagem. A resposta de um sujeito à administração terapêutica dos desoxinucleosídeos pode ser monitorada através de observação da força muscular e controle do sujeito e mobilidade, bem como alterações da altura e do peso. Se um ou mais desses parâmetros aumentarem após a administração, o tratamento pode ser continuado. Se um ou mais desses parâmetros permanecerem iguais ou diminuírem, a dosagem dos desoxinucleosídeos pode ser aumentada.
[0083] Como mostrado nos Exemplos, os desoxinucleosídeos são bem tolerados. Todos os efeitos adversos observados foram sem importância e foram principalmente diarreia, inchaço abdominal e outras manifestações gastrointestinais. Um sujeito também pode ser monitorado quanto a quaisquer efeitos adversos, tais como intolerância gastrointestinal, por exemplo, diarreia. Se um ou mais efeitos adversos forem observados após a administração, então a dosagem poderá ser diminuída. Se não forem observados tais efeitos adversos, a dosagem poderá ser aumentada. Adicionalmente, uma vez que uma dosagem for diminuída devido à observação de um efeito adverso e o efeito adverso não for mais observado, a dosagem poderá ser aumentada.
[0084] Os desoxinucleosídeos também podem ser coadministrados com outros agentes. Tais agentes incluem agentes terapêuticos para tratar os sintomas da forma particular de MDS. Em particular, para a deficiência de TK2, dT e dC podem ser coadministradas com um inibidor de enzimas catabólicas de nucleosídeos ubíquas, incluindo, mas não limitadas a, inibidores enzimáticos, tais como tetra- hidrouridina (inibidora da citidina desaminase) e imucilina H (inibidora da purina nucleosídeo fosforilase) e tipiracil (inibidor da timidina fosforilase). Tais inibidores são conhecidos e usados no tratamento de alguns tipos de câncer.
EXEMPLOS
[0085] A presente invenção pode ser melhor entendida em referência aos seguintes exemplos não limitantes, os quais são apresentados a fim de ilustrar de forma mais completa as modalidades preferenciais da invenção. Eles não devem, de forma alguma, ser compreendidos como limitantes do amplo escopo da invenção. Exemplo 1 - Materiais e Métodos Modelo de Camundongo da Deficiência de TK2
[0086] Um camundongo mutante com inserção de Tk2 H126N homozigoto (Tk2-/-) que manifesta um fenótipo extremamente semelhante à encefalomiopatia infantil humana foi relatado anteriormente (Akman, et al. 2008). Entre o dia pós-natal 10 e 13, os camundongos Tk2-/- desenvolvem rapidamente encefalomiopatia fatal caracterizada por ambulação reduzida, marcha instável, tremor grosseiro, retardo de crescimento e progressão rápida até a morte precoce aos 14 a 16 dias. Análises moleculares e bioquímicas do modelo de camundongo demonstraram que a patogênese da doença é devida à perda de atividade enzimática e aos subsequentes desequilíbrios do pool de dNTP com níveis diminuídos de dTTP no cérebro e níveis diminuídos tanto de dTTP quanto de dCTP no fígado, o que, por sua vez, resulta em depleção de mtDNA e em defeitos nas enzimas da cadeia respiratória contendo subunidades codificadas por mtDNA, mais proeminentes no cérebro e na medula espinhal.
[0087] Todos os experimentos foram desempenhados de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal (Institutional Animal Care and Use Committee) do Centro Médico da Universidade de Columbia (Columbia University Medical Center), e foram consistentes com os Institutos Nacionais de Guia de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals). Os camundongos foram alojados e criados de acordo com condições padrão internacionais, com um ciclo de 12 horas de luz, 12 horas de escuridão e sacrificados aos 4, 13 e 29 dias de idade.
[0088] Os órgãos (cérebro, medula espinhal, fígado, coração, rim, músculo quadríceps, pulmão e trato gastrointestinal) foram removidos e congelados na fase líquida do isopentano, pré-resfriados próximo ao seu ponto de congelamento (-160 °C) com gelo seco ou fixados em 10% de formalina tamponada neutra e embebidos em parafina usando procedimentos padrão. Os tecidos embebidos em parafina foram então corados com hematoxilina e eosina (H&E) para estudo morfológico ou processados para estudos de imunocoloração com GFAP, COX I ou subunidade do complexo I como descrito detalhadamente nos procedimentos suplementares. Tanto os camundongos do tipo selvagem heterozigotos quanto os homozigotos foram considerados como grupo controle (Tk2+), uma vez que nenhuma diferença clínica e bioquímica foi descrita anteriormente (Akman, et al. 2008; Dorado, et al. 2011). Administração do tratamento e plano experimental
[0089] Desoxicitidina (dC) e desoxitimidina (dT) foram administradas em 50 μL de fórmula infantil de leite Esbilac para animais pequenos (Pet-Ag) por gavagem oral diária para camundongos com inserção de Tk2 H126N (Tk2-/-) e controle do tipo selvagem com a mesma idade (Tk2+) usando 2 doses, 260 mg/kg/dia e 520 mg/kg/dia, de 4 a 29 dias a partir do dia pós-natal. Aos 21 dias de idade, os camundongos foram separados da mãe e o tratamento foi continuado através de administração de dC e dT na água potável usando doses equimolares respectivamente de 1,6 mM e 3,2 mM. Um grupo controle negativo de mutantes Tk2 não tratados e camundongos controle do tipo selvagem foram pesados e observados atentamente para comparação. Avaliação do fenótipo
[0090] O peso corporal foi avaliado diariamente, uma vez que já foi observado anteriormente que a incapacidade de ganhar peso é o primeiro sinal de doença (Akman, et al. 2008).
[0091] Para definir o grau de segurança e eficácia de dT/dC, tempo de sobrevivência, idade no início da doença, tipo e gravidade dos sintomas, ocorrência de efeitos colaterais e proporção do término do tratamento devido a eventos adversos em camundongos Tk2 tratados e não tratados foram comparados. O comportamento geral, tempo de sobrevivência e pesos corporais dos camundongos foram avaliados diariamente a partir do dia 4 pós-natal. Pool de dNTP por ensaio de extensão da polimerase
[0092] Os tecidos foram homogeneizados em gelo em 10 volumes (p/v) de tampão MTSE frio (manitol a 210 mM, sacarose a 70 mM, Tris-HCl a 10 mM, pH 7,5, EGTA a 0,2 mM, BSA a 0,5%) e centrifugados a 1000 g por 5 minutos a 4 °C, seguido de três centrifugações a 13. 000 g por 2 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi precipitado com metanol a 60%, mantido por 2 horas a -80 °C, fervido por 3 minutos, armazenado a -80 °C (de 1 hora a durante a noite) e centrifugado a 20. 800 g por 10 minutos a 4 °C. Os sobrenadantes foram evaporados até secos e o pellet foi ressuspenso em 65 μL de água e armazenado a -80 °C até ser analisado. Para minimizar a interferência de ribonucleotídeos, os pools de dNTP totais foram determinados como relatado (Ferraro, et al. 2010; Marti, et al. 2012a). Resumidamente, foram geradas reações em volume de 20 μL através da mistura de 5 μL de amostra ou dNTP padrão com 15 μL de tampão de reação a 0,025 U/mL, DNA polimerase ThermoSequenase (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA) ou Taq polymerase (Life Technologies, NY, EUA), 3H-dTTP ou 3H-dATP a 0,75 μM (Moravek Biochemicals), oligonucleotídeo específico a 0,25 μM, Tris-HCl a 40 mM, pH 7,5, MgCl2 a 10 mM, DTT a 5 mM. Após 60 minutos a 48 °C, 18 mL de reação foram colocados em filtros Whatman DE81, secados ao ar e lavados três vezes por 10 minutos com Na2HPO4 a 5%, uma vez em água destilada e uma vez em etanol absoluto. A radioatividade retida foi determinada por contagem de cintilação. Medições de nucleosídeos por HPLC
[0093] Os níveis de desoxitimidina (dT), desoxiuridina (dU), uracila (U) e timina (T) foram avaliados por um método de HPLC com eluição por gradiente como descrito anteriormente (Lopez, et al. 2009; Marti, et al. 2012b), com pequenas modificações. Resumidamente, amostras desproteinizadas foram injetadas em um sistema de HPLC Alliance (Waters Corporation) com uma coluna de fase reversa Alltima C18NUC (Alltech) a uma taxa de fluxo constante de 1,5 mL/min (exceto onde indicado) usando quatro tampões: eluente A (fosfato de potássio a 20 mM, pH 5,6), eluente B (água) e eluente C (metanol). As amostras foram eluídas por 60 minutos com um gradiente como segue: 0-5 min, 100% de eluente A; 5-25 min, 100-71% de eluente A, 29% de eluente B; 25-26 min, 0-100% de eluente C; 26-30 min, 100% de eluente C; 30-31 min, 0-100% de eluente B; 31-35 min, 100% de eluente B (1,5-2 mL/min); 35-45 min, 100% de eluente B (2 mL/min); 45-46 min, 100% de eluente B (2-1,5 mL/min); 46-47 min, 0-100% de eluente C; 47-50 min, 100% de eluente C; 50-51 min, 0-100% de eluente A; e 51-60 min, 100% de eluente A.
[0094] A absorbância dos eluatos foi monitorada a 267 nm e os picos de dThd e dUrd foram quantificados através da comparação de suas áreas de pico com uma curva de calibração obtida com padrões aquosos. Para a identificação definitiva de picos de desoxitimidina, desoxiuridina, uracila e timina para cada amostra, uma segunda alíquota foi tratada com excesso de TP de E. coli purificada (Sigma) para eliminar especificamente dT e dU. O limite de detecção desse método é de 0,05 mmol/L para todos os nucleosídeos. Os resultados foram expressos em nmol/mg de proteína. RT-qPCR: Quantificação de DNA mitocondrial
[0095] PCR em tempo real foi realizado com os primers e sondas para o gene COX I murino (mtDNA) e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de camundongo (GAPDH, nDNA) (Applied Biosystems, Invitrogen, Foster City, CA, EUA) como descrito usando o método ddCt em um sistema de PCR em tempo real Step One Plus (Applied Biosystems) (Dorado, et al. 2011). Os valores de mtDNA foram normalizados para valores de nDNA e expressos em porcentagem em relação ao tipo selvagem (100%). Níveis de proteínas da cadeia respiratória mitocondrial
[0096] Trinta microgramas de extratos integrais de cérebro ou cerebelo foram submetidos a eletroforese em um gel SDS-PAGE 12%, transferidos para membranas PVDF Immun-BlotTM (Biorad, Hercules, CA, EUA) e inoculados com MitoProfile® Total OXPHOS Rodent WB Antibody Cocktail de anticorpos (MitoSciences, Eugene, OR, EUA). A interação proteína-anticorpo foi detectada com o anticorpo IgG anti-camundongo de camundongo conjugado com peroxidase (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA), usando sistema de detecção de western blotting AmershamTM ECL Plus (GE Healthcare Life Sciences, Reino Unido). A quantificação de proteínas foi realizada usando o software NIH ImageJ 1. 37V. O valor médio de cinza foi calculado dentro de áreas selecionadas como a soma dos valores de cinza de todos os pixels na seleção dividida pelo número de pixels. Atividades das enzimas da cadeia respiratória mitocondrial por análise espectrofotométrica
[0097] A análise das enzimas da RC mitocondriais foi desempenhada no tecido cerebral como descrito anteriormente (DiMauro, et al. 1987).
Métodos estatísticos
[0098] Os dados são expressos como a média ± SD de pelo menos 3 experiências por grupo. O teste de Gehan-Breslow-Wilcoxon foi usado para comparar a proporção de sobrevivência de cada grupo de camundongos. Um valor de p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Exemplo 2 - A administração de dC/dT a camundongos Tk2-/- retardou o início clínico da deficiência de TK2 e aumentou da sobrevivência
[0099] Uma dose de 260 e 520 mg/kg/dia cada de desoxinucleosídeos (dC/dT) foi administrada aos camundongos Tk2-/-. Essas doses de desoxinucleosídeos foram o equivalente molar de 400 e 800 mg/kg/dia de dCMP + dTMP, respectivamente.
[00100] Os camundongos tratados com dC+dT oralmente (260 ou 520mg/kg/dia a partir da idade de 4 dias) pareciam normais até o dia 21 pós-natal (Figura 1). Após a idade de 21 dias, camundongos mutantes tratados com uma dose de 260 mg/kg/dia (Tk2-/- 260 mg/kg/dia de dC/dT) pararam de ganhar peso e desenvolveram tremor leve na cabeça e fraqueza que levou à morte no dia pós-natal 31±4,3 (Figura 2).
[00101] Camundongos mutantes tratados com dC+dT a 520 mg/kg/dia (Tk2-/- 520 mg/kg/dia de dC/dT) continuaram a ganhar peso por uma semana a mais, mas subsequentemente manifestaram deterioração semelhante aos Tk2-/- 260 mg/kg/dia de dC/dT, e morreram no dia pós-natal 43±10. Esses resultados são comparáveis àqueles mostrados por camundongos Tk2-/- tratados com 200 ou 400 mg/kg/dia de tratamento oral com dCMP/dTMP. Tk2+ 260 mg/kg/dia de dC/dT e Tk2+ 520 mg/kg/dia de dCd/T foram acompanhados até o dia 60 pós-natal. Não foram observados efeitos colaterais.
[00102] Como mostrado, o tempo de vida dos Tk2-/- tratados foi significativamente aumentado. Camundongos Tk2-/- não tratados mostraram um tempo de vida médio de 13 dias, enquanto os camundongos tratados sobreviveram uma média de 31 e 40 dias com a dose de 260 e 520 mg/kg/dia, respectivamente (Figura 2). Um dos camundongos sobreviveu até o dia 56 pós-natal, que foi o tempo de vida mais longo para o modelo de camundongo com inserção de Tk2 até hoje. Exemplo 3- dC/dT por via oral melhora as anormalidades moleculares no cérebro e no fígado
[00103] A medição de dNTPs no extrato mitocondrial mostrou que tanto os Tk2-/- 260 mg/kg/dia de dC/dT quanto os Tk2-/- 520 mg/kg/dia de dC/dT não corrigiram completamente os desequilíbrios do pool de dNTP mitocondrial no dia 13 pós-natal e manifestaram efeitos variáveis em tecidos com um resgate completo dos déficits de dCTP no cérebro, enquanto o dTTP foi corrigido no fígado. Em contraste, deficiências de dTTP no cérebro e dCTP no fígado permaneceram graves apesar da suplementação com desoxinucleosídeo (Figura 3).
[00104] Em camundongos Tk2-/- 260 mg/kg/dia dC/dT e Tk2-/- 520 mg/kg/dia de dC/dT no dia 13 pós-natal, o tratamento impediu a depleção de mtDNA no coração, fígado, rim, intestino e músculo (Figura 4). Em contraste, o número de cópias de mtDNA foi somente parcialmente melhorado no cérebro no dia 13 pós-natal de uma maneira dependente da dose, com razões de mtDNA/nDNA em relação ao cérebro do controle atingindo 39% com 260 mg/kg/dia de dC+dT e 52% com 520 mg/kg/dia. As medições das bases dT e uracila no cérebro por HPLC mostraram níveis mais elevados em animais tratados com dC+dT ou com dCMP+dTMP (Figura 5), indicando adicionalmente que tanto os desoxinucleosídeos quanto os desoxinucleosídeos monofosfatos atravessam a barreira hematoencefálica. No dia 29 pós-natal, a depleção de mtDNA foi parcialmente resgatada pela terapia com 260 e 520 mg/kg/dia de dC+dT no coração (40 e 35%), fígado (46 e 45%), rim (38 e 42%) e músculo (24 e 35%), mas foi totalmente recuperada no intestino (82 e 84%) (Figura 4). Exemplo 4- dC/dT por via oral melhora as anormalidades bioquímicas no cérebro
[00105] As atividades das enzimas da cadeia respiratória (RCE) e os níveis de proteínas foram completamente recuperados no cérebro de TK2-/- 260 mg/kg/dia de dC / dT no dia 13 pós-natal (Figura 6). As atividades de RCE também foram restauradas no dia 29 pós-natal e somente uma pequena diminuição da atividade do complexo I pôde ser observada em TK2-/- 520 mg/kg/dia de dC/dT (Figura 6). Os níveis de proteínas RCE no cérebro foram parcialmente restaurados no dia 29 pós- natal com níveis mais elevados em TK2-/- 520 mg/kg/dia de dC/dT do que em TK2-/- 260 mg/kg/dia de dC/dT (Figura 7). Essas diferenças nos níveis de proteína foram consistentes com as diferenças na depleção de mtDNA em cérebros de camundongos mutantes tratados no dia 29 pós-natal e provavelmente influenciaram a sobrevivência prolongada observada com a dose mais elevada. Exemplo 5 - A administração de dC/dT em pacientes com deficiência de TK2 foi eficaz
[00106] Os sintomas, dosagens e resultados de pacientes com deficiência de TK2 que receberam terapia de desoxinucleosídeos sob a supervisão e controle dos inventores estão resumidos abaixo. Paciente 1
[00107] Esse paciente nasceu nos Estados Unidos em fevereiro de 2011. Seus sintomas se manifestaram aos 12 meses com hipotonia e cabeça fraca. Ele nunca andou. Ele também tem fraqueza muscular respiratória e foi submetido a ventilação mecânica aos 19 meses, à qual ele ainda é submetido 24 horas/dia. Ele também tem um tubo de alimentação desde os 19 meses.
[00108] Ele recebeu previamente 100 mg/kg/dia e então 200 mg/kg/dia de dCMP e dTMP. Nessa terapia, ele conseguiu segurar objetos pequenos e seu peso aumentou de 10,4 kg para 19,5 kg.
[00109] Em outubro de 2015 ele começou a receber 260 mg/kg/dia de dC e dT, que foi aumentado para 340 mg/kg/dia de dC e dT. Depois de dois meses ele passou a mover suas mãos e cabeça melhor, era capaz de ficar em pé por 5 minutos com o apoio de uma pessoa, começava a tossir e sua frequência cardíaca estava mais lenta (de 140 a 170 bpm durante o dia para 100 a 120 bpm durante o dia).
[00110] Em 23 de março de 2016 a dose foi aumentada para 400 mg/kg/dia de dC e dT. Após 6 semanas nessa terapia ele mostrou melhoras adicionais: ele conseguiu sentar-se em uma cadeira por cerca de 5 horas/dia; ficou em um "andador" (stander) por 1,5 horas; prestes a agarrar e segurar pequenos animais de pelúcia; pressionou botões de computador; desatou suas fraldas e apontou seu pênis para molhar a pessoa que trocava sua fralda; e manteve seus joelhos flexionados por alguns segundos.
[00111] O único efeito adverso observado durante o tratamento foi diarreia. Paciente 2
[00112] Esse paciente nasceu na Espanha em 1987. Ele começou a mostrar sintomas aos 3 anos de idade, incluindo fraqueza muscular proximal. Ele perdeu a capacidade de caminhar aos 13 anos e foi ventilado 24 horas por dia. Ele estava tomando previamente dAMP e dCMP a 200 mg/kg/dia e mostrou aumento de peso e uma diminuição de 24 a 22 horas por dia de ventilação.
[00113] Ele está em terapia de desoxinucleosídeos desde junho de 2015 a 400 mg/kg/dia de dC e dT e mostrou melhora na força muscular, seu peso e ventilação se estabilizaram e ele está desfrutando de uma melhor qualidade de vida.
[00114] Os únicos efeitos adversos observados durante o tratamento foram diarreia e perda de cabelo. Paciente 3
[00115] Esse paciente nasceu na Espanha em 1985. Seus sintomas começaram aos 6 anos de idade com fraqueza muscular facial, proximal e axial. Ele começou a 200 mg/kg/dia de dT e dC em junho de 2015 e, até hoje, sua condição melhorou com melhorias no teste de caminhada de 6 minutos, tempo de se levantar e andar, e subir e descer 4 degraus.
[00116] O único efeito adverso observado durante o tratamento foi diarreia. Paciente 4
[00117] Esse paciente nasceu na Espanha em fevereiro de 2009. Seus sintomas se manifestaram aos seis meses com a falhas no desenvolvimento. Ele começou a 230 mg/kg/dia de dC e dT em julho de 2015. Em janeiro de 2016 ele mostrou melhoras em sua condição e estava comendo melhor.
[00118] Não houve efeitos adversos observados. Paciente 5
[00119] Esse paciente nasceu na Espanha em 1957 e começou a ter sintomas aos 50 anos de idade com ortopneia e fraqueza diafragmática. Ele é colocado em BiPAP à noite. Ele começou a 200 mg/kg/dia de dC e dT em novembro de 2015.
[00120] Não houve efeitos adversos observados. Paciente 6
[00121] Esse paciente nasceu na Espanha em outubro de 2011 e começou a apresentar sintomas aos 15 meses, incluindo hipotonia e fraqueza. Ele perdeu a ambulação aos 22 meses e teve fraqueza muscular respiratória. Ele começou a receber ventilação mecânica aos 16 meses e atualmente é colocado em BiPAP doze horas por dia. Ele recebia anteriormente dCMP e dAMP a 100 mg/kg/dia que foi aumentado para 400 mg/kg/dia. Sua força como mostrado pela escala Egen Klassification melhorou (28/30 para 13/30) e seu peso aumentou de 9,8 kg para 12,3 kg.
[00122] Ele começou a terapia de desoxinucleosídeos em abril de 2015 a 400 mg/kg/dia de dC e dT. Em outubro de 2015 sua mudança na escala Egen Klassification foi de 13/30 a 11/30 e seu peso aumentou para 16,5 kg de 12,3 kg.
[00123] Não houve efeitos adversos observados. Paciente 7
[00124] Esse paciente nasceu na Espanha em novembro de 2012. Ele começou a mostrar sintomas aos 17 meses, incluindo fraqueza e hipotonia. Ele perdeu a ambulação aos 22 meses e começou a receber ventilação mecânica aos 29 meses. Ele recebia anteriormente dCMP e dAMP a 100 mg/kg/dia que foi aumentado para 400 mg/kg/dia. Sua força como mostrada pela escala Egen Klassification melhorou (30/30 para 24/30) e seu peso aumentou de 11 kg para 15,7 kg.
[00125] Ele começou a terapia de desoxinucleosídeos em abril de 2015 com uma dose de 400 mg/kg/dia de dT e dC. Em novembro de 2015, sua mudança na escala Egen Klassification passou de 24/30 a 19/30 e seu peso aumentou para 17 kg de 15,7 kg.
[00126] Não houve efeitos adversos observados. Paciente 8
[00127] Essa paciente nasceu no Chile em setembro de 1989 e começou a apresentar sintomas aos 11 meses com quedas frequentes e comprometimento progressivo da marcha. Ela perdeu a capacidade de andar sozinha aproximadamente aos 4 anos de idade. Ela já havia passado por terapia de nucleotídeos anteriormente e mostrou melhora na sua mobilidade, incluindo andar sem ajuda, ficar em pé por mais tempo, subir escadas, participar de aulas de ginástica e cuidar de necessidades pessoais.
[00128] Ela mudou para a terapia com desoxinucleosídeos em fevereiro de 2016 a uma dose de 260 mg/kg/dia de dC e dT e depois aumentou para uma dose de 400 mg/kg/dia de dC e dT em maio de 2016 e continuou a mostrar melhoras.
[00129] Não houve efeitos adversos observados. Paciente 9
[00130] Esse paciente nasceu na Guatemala em setembro de 1989. Ele começou a receber 130 mg/kg/dia de dC e dT em agosto de 2015 e aumentou para 260 mg/kg/dia em fevereiro de 2016. Ele mostrou energia melhorada.
[00131] Não houve efeitos adversos observados. REFERÊNCIAS Akman, et al. (2008) Thymidine kinase 2 (H126N) knock in mice show the essential role of balanced deoxynucleotide pools for mitochondrial DNA maintenance. Hum. Mol. Genet. 17: 2433-2440 Alston, et al. (2013) Late-onset respiratory failure due to TK2 mutations causing multiple mtDNA deletions. Neurology 81: 2051-3 Bartesaghi, et al. (2010) Loss of thymidine kinase 2 alters neuronal bioenergetics and leads to neurodegeneration. Hum. Mol. Genet. 19: 166977 Béhin, et al. (2012) Adult cases of mitochondrial DNA depletion due to TK2 defect An expanding spectrum. Neurology 78: 644-648 Blakely, et al. (2008) Novel mutations in the TK2 gene associated with fatal mitochondrial DNA depletion myopathy. Neuromuscular Disorders 18: 557-560 Bourdon, et al. (2007) Mutation of RRM2B, encoding p53-controlled ribonucleotide reductase (p53R2), causes severe mitochondrial DNA depletion. Nature Genetics 39: 776-780 Carrozzo, et al. 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Claims (3)

1.Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo uma mistura de desoxicitidina (dC) e desoxitimidina (dT) caracterizado pelo fato de ser para a fabricação ou preparação de um medicamento para o tratamento de síndrome de depleção do DNA mitocondrial relacionada a timidina quinase (TK2) em um sujeito humano.
2.Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a desoxicitidina (dC) e a desoxitimidina (dT) estão em uma razão de 50/50, 5/95, 10/90, 15/85, 20/80, 25/75, 30/70, 35/65, 40/60, 45/55, 55/45, 60/40, 65/35, 70/30, 75/25, 80/20, 85/15, 90/10 ou 95/5.
3.Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a razão de desoxicitidina (dC) e desoxitimidina (dT) é de 50/50.
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