BR112017018606B1 - Uso de álcool desidrogenase transformadora de tricoteceno, processo para transformação de tricotecenos e aditivos de transformação de tricotecenos e seu uso - Google Patents

Abstract

USO DE ÁLCOOL DESIDROGENASE TRANSFORMADORA DE TRICOTECENO, PROCESSO PARA TRANSFORMAÇÃO DE TRICOTECENOS E ADITIVOS DE TRANSFORMAÇÃO DE TRICOTECENOS E SEU USO. A invenção refere-se ao uso de uma álcool desidrogenase de ID de sequência no 1 contendo íons metálicos e um cofator de quinona, ou além disso, uma variante funcional exibindo uma identidade de sequência de pelo menos 80%, de preferência pelo menos 86%, especialmente preferido pelo menos 89%, e pelo menos um cofator redox para a trasformação de pelo menos um tricoteceno exibindo um grupo hidroxila no átomo C-3, bem como um procedimento para a transformação enzimática de tricotecenos e um aditivo transformador de tricoteceno.

Description

[001]. A presente invenção refere-se ao uso de uma álcool desi- drogenase transformadora de tricoteceno, um processo para a transformação de tricotecenos, assim como a um aditivo transformador de tricoteceno.

[002]. Tricotecenos representam um grupo de micotoxinas que ocorre frequentemente, que inclui desoxinivalenol (DON, CAS no 51481-10-8), toxina T-2 (CAS no 21259-20-1), toxina HT-2 (CAS no 26934-87-2), nivalenol (CAS no 23282-20-4), fuseranona-X (CAS no 23255-69-8), escripentriol, 15-acetoxiescirpenol (CAS no 2623-22-5), 4,15-diacetoxiscirpenol (CAS no 2270-40-8), tricodermol (CAS no 219893-8), verrucarin A (CAS no 3148-09-2), verrucarin J (CAS no 4643-587), isotricodermin (CAS no 91423-90-4), hidroxiisotricodermin (CAS no 344781-02-8), calonectrin (CAS no. 38818-51-8), T-2 tetraol (CAS no 34114-99-3), deacetilneosolaniol (CAS no 74833-39-9), neosolaniol (CAS no 36519-25-2), acetilneosolaniol (CAS no 65041-92-1), esporo- triciol (CAS no 101401-89-2), tricotriol (CAS no 109890-37-1), sambuci- nol (CAS no 90044-33-0), e culmorin (CAS no 18374-83-9), entre outros. Tricotecenos, particularmente DON, também conhecidos como vomitoxina, podem ser produzidos por um número de Fusarium fungi, especialmente F. graminearum e F. culmorum. Esses fungos atacam culturas, tais como milho, vários tipos de grãos, tais como trigo, aveia ou cevada, sendo que normalmente o ataque fúngico ocorre antes da colheita e o crescimento de fungos ou a formação de micotoxina também pode ocorrer antes ou, no caso de armazenamento impróprio, após a colheita.

[003]. A "Food and Agriculture Organization" (FAO) estima que no mundo todo 25% dos produtos agrícolas estejam contaminados com micotoxinas, o que resulta em perdas econômicas consideráveis. Em um estudo mais atual realizado mundialmente por I. Rodrigues e K. Naehrer, Toxins, 2012, 4, 663-675, durante um período de tempo de janeiro 2009 até dezembro de 2011 foram analisadas um total de 23.781 amostras, das quais 81% testaram positivo para pelo menos uma micotoxina e 59% testaram positivo para tricotecenos, especialmente DON. Tricotecenos, especialmente DON, puderam ser encontrados em todas as regiões do mundo, da mesma forma que em todas as classes de cereais e classes de rações testadas, como por exemplo, milho, soja, trigo, germe de trigo, DDGS (vinhaça seca), assim como em misturas prontas de ração puderam ser encontradas com uma frequência de até 100%. À parte dos alimentos básicos não processados, os tricotecenos também foram detectados em alimentos processados, tais como farinha, cereais matinais, massas, pão, pastelaria fina, e alimentos para crianças e bebês à base de trigo.

[004]. Tricotecenos possuem a seguinte formula estrutural:

[005]. na qual os diferentes radicais de substituição R1 a R5 são diferentes, dependendo do tipo de tricotecenos. Sabe-se que, além dos grupos epóxi, um grupo a-hidróxi intacto no átomo C-3 dos tricote- cenos também é parcialmente responsável para seu efeito tóxico. Tipos de tricotecenos com um grupo hidróxi no átomo C-3 incluem, entre outros, desoxinivalenol, toxina T-2, toxina HT-2, nivalenol, fuseranon- X, 15-acetoxiescirpenol, 4,15-diacetoxiescirpenol, tricodermol, T-2 te- traol, deacetilneosolaniol, acetilneosolaniol, sporotrichiol, tricotriol, sambucinol, e culmorin.

[006]. Desoxinivalenol (DON) possui uma característica de grupo carbonila no átomo C-8 e tem a seguinte fórmula estrutural:

[007]. assim como o nome IUPAC (3α,7α)-3,7,15-trihidroxi-12,13- epoxitricotec-9-en-8-ona. Na natureza, também ocorrem diversos sub- tipos de DON tóxicos com um grupo hidróxi no átomo C-3. Exemplos desses são os DON acetilados (p.ex., 15-acil-DON), DON glicosilados, DON sulfonados (e.g. DONS-1, DONS-2), ou sulfatos DON (sulfato- DON-15). Esses subtipos de DON também pertencem aos tipos de tricotecenos com um grupo hidróxi ou grupo hidróxi substituído no átomo C-3.

[008]. Devido ao efeito tóxico de DON, limites ou níveis máximos foram definidos pelas autoridades competentes para alimentos e rações. Assim, a União Europeia regulamentou o teor de DON em alimentos (EC no 1881/2006, EC no 1126/2007) e recomendou os níveis máximos para rações (2006/576/EC). Nos EUA, o FDA publicou os níveis máximos aconselháveis.

[009]. Doenças, que são causadas pela ingestão de micotoxinas em homens ou animais, são referidas como micotoxicoses. No caso de tricotecenos ou tipos de tricotecenos, essas também são referidas como "micotoxicoses por tricotecenos", mais especificamente como "mi- cotoxicoses causadas por tricotecenos exibindo um grupo hidroxila no átomo C-3", ou ainda mais especificamente como "micotoxicoses DON". É sabido que os efeitos tóxicos de tricotecenos em animais e seres humanos se baseiam em diversos fatores. Entre esses fatores estão a inibição da biossíntese de proteínas, as possíveis interações com receptores de serotonina e dopamina, assim como a regulação de citocinas pró-inflamatórias (EFSA Journal 2004, 73, 1-41). Além disso, as micotoxicoses DON causam mudanças em biomarcadores, conforme diagnosticado pelo aumento na concentração de IgA no sangue, o aumento na concentração de SOCS3 no fígado ou a redução dos níveis de IGFALS no plasma (Pestka et al. 2004, Toxicol. Lett. 153, 6173) bem como a redução da concentração de claudina no intestino (Pinton et al. 2009, Tox. Appl. Pharmacol. 237, 41-48).

[0010]. Micotoxicoses por tricotecenos em suínos se manifestam, por exemplo, por uma ingestão reduzida de ração, uma redução no crescimento, a ocorrência de vômito e diarreia, assim como por uma disfunção imunológica e absorção de nutrientes nos intestinos. No caso de aves, micotoxicoses por tricotecenos causam, entre outros, uma piora na ingestão de alimentos e um menor ganho de peso, a incidência de diarreia, assim como uma redução no peso da casca de ovos. No caso de ruminantes foram descritas, a redução na ingestão de ração e a diminuição na produção de leite. Na aquacultura, micotoxico- ses por tricotecenos causam uma piora da ingestão de alimentos e das taxas de crescimento em peixes (por exemplo, salmão, bagre, ou trutas) e camarão, entre outros (Binder et. al, Guide to Mykotoxins; ISBN 978-0-9573721-0-8). Efeitos tóxicos também foram descritos em cães e gatos (EFSA Journal 2004, 73, 1-41). Nos homens, micotoxicoses por tricotecenos podem causar náusea, vômito, diarreia, dores abdominais, dor de cabeça, ou febre, entre outros (Sobrova et. al, Interdisc. Toxicol. 2010, 3 (3), 94-99).

[0011]. A estratégia primária para a redução de uma contaminação por tricoteceno ou contaminação por DON de alimentos ou rações é a restrição da infestação fúngica, por exemplo, por manutenção de uma "boa prática agrícola". Isto inclui, entre outros, a utilização de sementes que estão livres de parasitas e fungos, ou a aração dos resíduos das culturas. Além disso, através da utilização correta de fungicidas, o crescimento de fungos no campo pode ser reduzido. Após a colheita, as safras deveriam ser armazenadas em um local com uma umidade residual abaixo de 15% e a uma baixa temperatura para evitar o crescimento de fungos. Da mesma forma, as safras contaminadas por infestação fúngica deveriam ser removidas antes de qualquer processamento posterior. Apesar desta lista de medidas, I. Rodriges e K. Naehrer reportaram (em 2012) que mesmo em regiões com os padrões de agricultura os mais elevados, como os EUA e a Europa central, nos anos de 2009 a 2011, 79% ou 72% de todas as amostras de milho testadas estavam contaminadas com DON.

[0012]. Outras opções para a redução da contaminação por mico- toxinas em alimentos ou rações são a sua adsorção ou transformação. Para a adsorção, é necessário que a ligação da micotoxina no adsor- vente seja forte e específica para uma ampla faixa de pH e que permaneça estável na área gastrointestinal durante todo o processo de digestão. Apesar de alguns adsorventes não biológicos, tais como carvão ativo, silicatos, ou polímeros sintéticos, como colestiramina, poderem ser utilizados eficazmente para aflatoxinas, seu emprego para outras micotoxinas, em particular para tricotecenos, não é eficaz. Adsor- ventes biológicos, tais como levedo ou extratos de levedo, também são descritos na literatura, mas têm uma limitação similar àquela dos adsorventes não biológicos. Uma desvantagem substancial dos adsor- ventes é a sua possível ligação não específica com outras moléculas, que podem ser essenciais para a nutrição.

[0013]. A transformação, especialmente a desintoxicação de trico- tecenos por tratamentos físicos e químicos também é limitada, porque DON é muito estável e permanece estável mesmo sob tratamentos térmicos de até 350°C.

[0014]. Uma possível transformação microbiana de DON foi descrita na EP-B 1 042 449, de acordo com a qual o microorganismo BBSH 797 (DSM 11798) é utilizado para a desintoxicação de DON. Aqui a desintoxicação é baseada na abertura do anel epóxido nos átomos C12 e C-13 de DON. A US 2012/0263827 A descreve a biotransforma- ção de DON para 3-epi-DON, por um microorganismo com o número de depósito canadense com acesso internacional 040408-1. Em muitos processos tecnológicos para rações ou para alimentos, entretanto, uma mistura de microorganismos ou adsorventes não é possível ou não é legalmente permitida, de modo que lá não é possível uma transformação ou uma desintoxicação de tricotecenos, tais como DON ou subtipos de DON.

[0015]. Tricotecenos, tais como DON e subtipos de DON são reabsorvidos rapidamente no trato gastrointestinal de seres humanos ou no corpo de animais, motivo pelo qual uma desintoxicação rápida e objetiva é importante.

[0016]. A álcool desidrogenase da SEQ ID no. 1 foi primeiro descrita na JP-A 2003/159079 para a produção de ácido 2-cetogulônico. O WO 2009/133464 descreve um processo para a oxidação de sacarí- deos por meio da enzima da SEQ ID no. 1, em alimentos e rações, para a oxidação de amido, especialmente na indústria de panificação, para a desaceleração do processo de envelhecimento no pão. Aqui, a álcool desidrogenase é utilizada para a oxidação de grupos hidróxi de carbohidratos.

[0017]. As álcool desidrogenases com os números de SEQ ID 2 e 3 foram identificadas no curso de um sequenciamento de genoma do microorganismo Devosia sp. e são armazenadas online no servidor do National Center for Biotechnology Information (NCBI) sob os números de identificação GI:737041022 e GI:630002266. Uma caracterização mais precisa das álcool desidrogenases com os números de SEQ ID 2 e 3 não foi feita no curso deste trabalho.

[0018]. Devido à variedade dos efeitos tóxicos dos tricotecenos e à frequência de sua ocorrência, existe com isso a necessidade de substâncias ou grupos de substâncias, tais como enzimas, que podem ser usadas para a transformação específica, segura e confiável, em especial a desintoxicação de tricotecenos.

[0019]. A presente invenção objetiva o uso de uma álcool desidro- genase específica e suas variantes com as quais é possível transformar pelo menos um tricoteceno, exibindo um grupo hidróxi no átomo C-3, em produtos menos tóxicos.

[0020]. Para solucionar a tarefa, foi demonstrado surpreendentemente que o uso de uma álcool desidrogenase da SEQ ID no. 1, contendo íons metálicos e um cofator de quinona, ou além disso, uma variante funcional que exibe uma identidade de sequência de pelo menos 80%, de preferência 86%, especialmente preferido pelo menos 89%, e pelo menos um cofator redox para a transformação de pelo menos um tricoteceno, exibindo um grupo hidróxi no átomo C-3, permite transformar, especificamente e confiavelmente, tricotecenos exibindo um grupo hidróxi no átomo C-3, como DON, toxina T-2, ou nivalenol.

[0021]. Por uma transformação compreende-se, a modificação da estrutura de toxinas, sendo que as toxinas, de preferência, são convertidas, i.e., transformadas em metabólicos não tóxicos ou metabólitos menos tóxicos. No presente caso a modificação estrutural ocorre, especialmente no átomo C-3 dos tricotecenos exibindo um grupo hidróxi no átomo C-3, devido à conversão catalítica do grupo hidróxi C-3 para um grupo ceto. Surpreendentemente, através da utilização da álcool desidrogenase de acordo com a invenção, é conseguida uma transformação de tricotecenos exibindo um grupo hidroxi no átomo C-3, es- pecialmente de DON, nos ambientes quimicamente e biologicamente os mais diversos, tais como em tamponadores, ração em pasta, saliva, ou rações contendo suco gástrico ou em trato intestinal contendo rações. Isto é extraordinário, porque nos respectivos meios ambientes para a atividade enzimática, parâmetros importantes, tais como o valor do pH, a concentração da protease, a força iônica, ou as matrizes de substância, são extremamente diferentes. Como um resultado, uma atividade da enzima pode ser garantida por adição de água ao alimento e à ração, para sua ingestão oral e também na boca e no trato gastro-intestinal. É surpreendente que, para certos meios, pode-se prescindir de uma adição externa de cofatores redox; isto se aplica, em particular, a misturas de ração, saliva, bem como aos sucos gástricos.

[0022]. A álcool desidrogenase da SEQ ID no. 1 é uma álcool desi- drogenase dependente do cofator de quinona. Para produzir uma ha- loenzima ativa ou uma álcool desidrogenase ativa, um cofator de qui- nona, de preferência uma pirroloquinolina quinona (PCC) na presença de um íon metálico, de preferência Ca2+, pode estar ligada à enzima. Portanto, a álcool desidrogenase ativada contém ambos o cofator de quinona como também o íon metálico, sendo que a proporção molar de enzima para cofator de quinona é de 1:1. Além disso, um cofator redox é requisitado para a atividade catalítica da álcool desidrogenase, onde tanto isto é usado na forma de um cofator redox sinteticamente produzido em adição à álcool desidrogenase ativada, ou um cofator redox também está presente em alimento ou ração, e podem ser usados em secreções de animais ou humanos. Esses cofatores redox naturais podem ser formados, por exemplo, e se necessário extraídos de alimentos ou rações no curso do fornecimento, processamento, ou digestão do alimento ou ração na boca e no trato gastrointestinal de humanos ou animais. Exemplos de secreções humanas ou animais, que contêm um cofator redox deste tipo natural, são secreções digestivas, tais como saliva, suco gástrico, suco intestinal, suco pancreático, bile, ou fluido do rúmen.

[0023]. As expressões "variantes do polipeptídeo" ou "variante" referem-se a polipeptídeos funcionais que, em comparação à SEQ ID no 1, têm pelo menos uma substituição amino ácida, sendo que a função enzimática é mantida. Compreende-se como função enzimática a transformação, especialmente a oxidação do grupo hidróxi no átomo C-3 de tricotecenos para um grupo ceto. Além disso, uma "variante de polipeptídeo" também pode ter inserções ou deleções de amino ácidos, especialmente uma sequência C ou N terminal, prolongada ou encurtada, relativa à sequência de polipeptídeos da SEQ ID no 1. Uma função enzimática é então "essencialmente mantida" se o mecanismo de reação enzimática permanece inalterado, i.e., o tricoteceno é oxidado no mesmo lugar e a atividade enzimática da variante é de pelo menos 10%, de preferência pelo menos 50%, mais preferentemente pelo menos 90%, especialmente > 100% baseado no polipeptídeo parental, original da SEQ ID no. 1.

[0024]. O termo "identidade de sequência" se refere a uma identidade de sequência percentual. Para sequências de aminoácidos e sequências de nucleotídeos a identidade de sequência pode ser visualmente determinada, mas de preferência calculada por um programa de computador. Como sequência de referência é definida a sequência de aminoácidos SEQ ID no. 1. A comparação de sequências também é realizada dentro dos segmentos de sequências, sendo que como segmento deve ser compreendida uma sequência contínua da sequência de referência. O comprimento dos segmentos de sequência para as sequências de peptídeo, é normalmente de 3 até 200, de preferência de 15 até 65, mais preferentemente de 30 até 50 aminoáci- dos. Existem muitos programas de bioinformática disponíveis à venda ou livres que podem ser usados para determinar a homologia e que ainda estão sendo continuamente desenvolvidos. Exemplos disto são: GCG Wisconsin BestFit package (Devereux et al. 1984), BLAST (Al- tschul et al. 1990) ou BLAST 2 (Tatusova e Madden 1999). Devido às diferentes opções de ajuste para esses algoritmos, é possível que eles cheguem a diferentes resultados para as mesmas sequências de input. Portanto, tal algoritmo deve ser definido assim como o ajuste associado a ele. No presente caso, o programa NCBI BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), especialmente com BLASTP para polipep- tideos, que estão disponíveis na homepage do "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) foi usado para calcular a identidade da sequência. Assim é possível comparar duas ou mais sequências entre si de acordo com o algorítmo de Altschul et al., 1997 (Nucleic Acids Res., 25:3389-3402). Aqui foram utilizados os programas na versão de 12 de agosto de 2014. Como configurações do programa foram usadas as versões básicas, especi-almente para a comparação da sequência de aminoácidos: "max target sequence" = 100; "expected threshold" = 10; "word size" = 3; "matrix" = BLOSOM62; "gap costs" = "existence: 11; extension: 1"; "computational adjustment" = "conditional compositional score matrix adjustment".

[0025]. Com a utilização de uma álcool desidrogenase contendo íons metálicos e um cofator de quinona de acordo com a invenção ou uma variante funcional dela, é possível transformar pelo menos 20%, de preferência pelo menos 50%, especialmente pelo menos 90%, de pelo menos um tricoteceno exibindo um grupo hidróxi no átomo C-3, especialmente DON, sendo que é suficiente trazer uma álcool desidro- genase contendo íons metálicos e um cofator de quinona ou uma sua variante funcional em contato com pelo menos um tricoteceno exibindo um grupo hidróxi no átomo C-3 por pelo menos um minuto, de prefe-rência pelo menos 5 minutos, especialmente pelo menos 60 minutos.

[0026]. De acordo com um outro modo de execução da invenção é utilizada a sequência de aminoácidos da variante funcional selecionada do grupo das SEQ ID números 2 até 4. Com essas variantes funcionais, que possuem uma identidade de sequência de pelo menos 86% para a álcool desidrogenase da SEQ ID no. 1, é possível transformar tricotecenos que exibem um grupo hidróxi no átomo C-3, especialmente DON, consistentemente com bons resultados.

[0027]. De acordo com um outro modo de execução da invenção, foi utilizado o cofator de quinona selecionado do grupo PCC, TTC, TPC, LTC, e CTC, de preferência PCC. Dado que foi utilizado um dos cofatores da pirroloquinolinquinona (PCC, CAS no. 72909-34-3), tripto- fano triptofilquinona (TTQ, CAS no. 134645-25-3), topaquinona (TPC, CAS no. 64192-68-3), lisina tirosilquinona (LTQ, CAS no. 178989-72-5) ou cisteína triptofilquinona (CTC, CAS no. 400616-72-0) nas álcool de- sidrogenases, é possível transformar tricotecenos que exibem um grupo hidróxi no átomo C-3, tal como DON, em derivados que, de um ponto de vista toxicológico, são não tóxicos ou inofensivos.

[0028]. Uma ligação especialmente rápida e completa do cofator de quinona na álcool desidrogenase é conseguida quando ela é ligada por meio de pelo menos um íon metálico selecionado do grupo Li+, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Zn2+, Zn3+, Mn2+, Mn3+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Cu3+, Co2+ e Co3, de preferência Ca2+ e Mg2+.

[0029]. Desde que adicionalmente seja empregado pelo menos um cofator redox selecionado do grupo metassulfato de fenazina (PMS), derivados PMS, hexacianoferrato (III) de potássio, hexacianoferrato (III) de sódio, citocroma C, coenzima Q1, coenzima Q10, azul de meti- leno e N,N,N’,N’-tetrametil-p-fenilenodiamina (TMPD), de preferência metosulfato de fenazina (PMS, CAS no: 299-11-6), coenzima Q1 e co- enzima Q10, uma transformação completa e rápida dos tricotecenos é possível exclusivamente na presença de umidade, de modo a garantir que os tricotecenos contidos nos componentes da ração já estejam transformados em derivados não tóxicos durante a produção de rações e em qualquer caso antes de seu emprego em animais. Derivados PMS são por exemplo: 1-hidroxifenazina, 2-(pentaprenilóxi)di- hidrofenazina, ácido 5,10-di-hidro-9-dimetilalilfenazina-1-carboxílico, ácido 5,10-di-hidrofenazina-1-carboxílico, 5-metilfenazínio metil sulfato, ácido 6-acetofenazina-1-carboxílico, bentofoenina, clofazimina, di- hidrometanofenazina, ácido esmeráldico, esmeraldina B, izumifenazina A - C, cátion Janus Green B, metanofenazina pelagiomicina A, fenazi- na, ácido fenazina-1,6-dicarboxílico, fenazina-1-carboxamida, ácido fenazina-1-carboxílico, fenosafranina, piocianina, safenamicina, ou me- til éster de ácido safênico. É possível evitar danos à saúde de animais e seres humanos com o uso de acordo com a invenção, devido à transformação dos tricotecenos exibindo um grupo hidróxi no átomo C3 em alimentos e rações, especialmente rações para suínos, aves, gado, cavalos, peixes, aquacultura e animais domésticos e em matérias primas à base de plantas para a produção ou processamento de alimentos e rações.

[0030]. A presente invenção objetiva, além disso, colocar à disposição um processo com o qual é possível transformar tricotecenos, especialmente tricotecenos que exibem um grupo hidróxi no átomo C-3, em produtos menos tóxicos de modo seguro e confiável, independente dos produtos agrários, nos quais eles estão presentes, se encontrarem ou não no estado processado.

[0031]. Para solucionar esta tarefa, o processo de acordo com a invenção para a transformação enzimática de tricotecenos é essencialmente caracterizado pelo fato de que pelo menos um tricoteceno que exibe um grupo hidróxi no átomo C-3 é colocado em contato com uma álcool desidrogenase da SEQ ID no 1 contendo íons metálicos e um cofator de quinona, ou com uma variante funcional que adicionalmente exibe uma identidade de sequência de pelo menos 80%, de preferên- cia pelo menos 86%, especialmente preferido pelo menos 89%, com pelo menos um cofator redox e água, e se necessário pelo menos um excipiente. Colocando um tricoteceno, que exibe um grupo hidróxi no átomo C-3, em contato com uma álcool desidrogenase da SEQ ID no. 1 contendo íons metálicos e um cofator de quinona, e além disso, pelo menos um cofator redox e água, é possível oxidar o grupo hidróxi presente no átomo C-3 dos tricotecenos para formar uma cetona, e neste caso o tricoteceno como tal é desintoxicado e é transformado em um composto não tóxico ou de baixa toxicidade.

[0032]. Desde que, além disso, ao invés da sequência de aminoá- cidos da SEQ ID No 1, uma variante dele seja empregada, selecionada do grupo da SEQ ID - Nos 2 até 4, podem ser obtidas vantagens idênticas, como as obtidas pelo emprego da álcool desidrogenase da SEQ ID No 1 e, em particular, rapidamente e de forma confiável é obter uma transformação dos tricotecenos contidos nos alimentos e/ou rações, independente de seu estado de processamento, isto é, se já se tratam de produtos agrários ou não.

[0033]. Uma transformação rápida e completa de um tricoteceno exibindo um grupo hidróxi no átomo C-3 é conseguida, com o processo de acordo com a invenção, a uma temperatura entre 5°C e 55°C, de preferência entre 10°C e 50°C, especialmente preferido entre 28°C e 45°C. Porque o procedimento de acordo com a invenção pode ser realizado em uma tal ampla faixa de temperatura, álcool desidrogenase da SEQ ID no. 1 ou suas variantes funcionais, que exibem uma sequência de pelo menos 80% da SEQ ID no. 1, pode ser usada nas mais diversas aplicações, tais como aquacultura ou também processos tecnológicos a elevadas temperaturas. Exemplos de tais processos tecnológicos, nos quais uma transformação de tricotecenos a elevadas temperaturas é importante, são por exemplo, processos para o pro-cessamento de rações, para a produção de massas e outros produtos de milho, tais como polenta, pipoca, flocos de milho, pão de milho ou tortillas, assim como processos de liquefação de amidos, processos de sacarificação ou processos de fermentação, como por exemplo o processo de maceração ou fermentação, especialmente na produção de bioetanol. Aqui é importante garantir que a comida ou ração, produzidos por esses processos, não contenham quaisquer quantidades prejudiciais de tricotecenos exibindo um grupo hidróxi no átomo C-3.

[0034]. De acordo com um outro modo de realização do procedimento de acordo com a invenção, isto é conduzido de tal modo que pelo menos um tricoteceno exibindo um grupo hidróxi no átomo C-3 é colocado em contato com a álcool desidrogenase contendo íons metálicos e um cofator, ou pelo menos uma variante funcional dela, com o fator redox, com água e se necessário com o excipiente, por pelo menos um minuto, de preferência por pelo menos 5 minutos, especialmente preferido por pelo menos 60 minutos. Porque os tempos de contato entre 1 minuto e mais do que 60 minutos são suficientes para conseguir a transformação adequada para derivados não tóxicos ou de baixa toxicidade, o procedimento de acordo com a invenção pode ser usado em um procedimento para processamento de materiais agrícolas para comida ou ração, por exemplo. Por outro lado, ele também pode ser administrado pelo fazendeiro imediatamente antes da ração, por exemplo, adicionando água à ração e deixando-a descansar entre 1 minuto e até aproximadamente 1 hora a uma temperatura entre 5°C e 55°C, que iniciará uma transformação nos tricotecenos em produtos não tóxicos.

[0035]. Uma transformação particularmente rápida e completa é possível se o cofator quinona é selecionado do grupo PCC, TTC, PTC, LTC e CTC, de preferência PCC, já que ele corresponde a um outro modo do processo de acordo com a invenção. Um tal cofator de qui- nona permite que a álcool desidrogenase ataque rápida e confiavel- mente o grupo hidróxi no átomo C-3 dos tricotecenos e o transforme em um grupo ceto contendo os derivados não-tóxicos.

[0036]. Uma outra conclusão geral da reação e, em particular, uma aceleração da reação são possíveis se o cofator, no procedimento de acordo com a invenção, estiver ligado à álcool desidrogenase por meio de pelo menos um íon metálico selecionado do grupo Li+, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Zn2+, Zn3+, Mn2+, Mn3+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Cu3+, Co2+ e Co3+, de preferência Ca2+ e Mg2+. Uma execução do procedimento de uma tal forma produz, não somente uma forte ligação do cofator de hidro- quinona à álcool desidrogenase, mas também permite uma rápida e confiável transformação dos tricotecenos.

[0037]. Para um outro aperfeiçoamento da transformação dos trico- tecenos, especialmente para completar a reação de transformação, o procedimento de acordo com a invenção é continuado de modo que é utilizado um cofator redox selecionado do grupo PMS, derivados de PMS, hexaciano ferrato (III) de potássio, hexaciano ferrato (III) de sódio, citocromo C, coenzima Q1, coenzima Q10, azul de metileno, e TMPD, de preferência PMS, coenzima Q1 e coenzima Q10. Por adição de um tal cofator redox é possível realizar a transformação dos tricote- cenos exibindo um grupo hidróxi no átomo C-3 em um meio aquoso, tal como por exemplo, em lama de ração ou ração, que é administrada a animais na aquacultura, sem que seja necessário adicionar ou que estejam presentes os fatores redox, que poderiam ser obtidos da saliva, suco gástrico ou suco intestinal, por exemplo, ou que o animal já tendo ingerido a lama da ração, ou a ração, nesse caso uma reabsorção de tricotecenos pelos animais que ingerem a ração pode ser evitada.

[0038]. A invenção visa finalmente, fornecer um aditivo transformador de tricoteceno com o qual seja possível transformar os tricotece- nos em ração ou alimento, de forma segura e confiável, formando de- rivados não tóxicos.

[0039]. Para solucionar esta tarefa, o aditivo de acordo com a invenção é essencialmente caracterizado pelo fato de que ele contém uma álcool desidrogenase da SEQ ID no. 1 contendo íons metálicos e um cofator de quinona, ou uma variante funcional adicionalmente exibindo uma identidade de sequência de pelo menos 80%, de preferência pelo menos 86%, especialmente preferido pelo menos 89%, e se necessário adicionalmente pelo menos um componente adicional selecionado do grupo que consiste de um cofator redox sintético e pelo menos um excipiente. Tais aditivos podem ser misturados com rações convencionais em baixas concentrações, como por exemplo, aproxi-madamente de 10 g a 1 kg a uma tonelada de ração, e permitem, em uma tal concentração baixa, transformar um tricoteceno exibindo um grupo hidróxi no átomo C-3, em derivados não tóxicos, de modo que no todo a saúde e a capacidade de desempenho dos animais que, por exemplo, foram alimentados com esta ração, melhorará e com isso não apenas as taxas de perdas podem ser reduzidas, como também por exemplo o aproveitamento da ração será aperfeiçoado.

[0040]. Compativelmente podem ser obtidos bons resultados com um aditivo de acordo com a invenção, no qual, ao invés da álcool de- sidrogenase da SEQ ID no. 1, está contida uma variante funcional da mesma, selecionada do grupo de SEQ ID nos 2 a 4. Para uma transformação essencialmente completa do grupo hidróxi presente no átomo C-3 de tricotecenos pelo aditivo de acordo com a invenção, esta é ainda mais desenvolvida se contiver um cofator quinona selecionado do grupo PCC, TTC, TPC, LTC, e CTC, bem como um íon metálico selecionado do grupo Li+, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Zn2+, Zn3+, Mn2+, Mn3+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Cu3+, Co2+ e Co3+. Com um modo de execução deste tipo, por um lado é possível ligar o cofator quinona de forma segura e confiável à álcool desidrogenase, e por outro lado com uma álcool de- sidrogenase que contém tais suplementos pode ser conseguida uma completa transformação de tricotecenos, como desoxinivalenol, que exibem um grupo hidróxi no átomo C-3 da molécula.

[0041]. Para que uma reação deste tipo possa ser realizada também sem a presença de cofatores redox, ou aqueles que ocorrem naturalmente, por exemplo, em saliva, suco gástrico ou suco intestinal, o aditivo de acordo com a invenção é desenvolvido ainda mais de modo que adicionalmente, como um outro cofator redox, um cofator redox sintético é adicionalmente selecionado do grupo dos PMS, derivados PMS, hexacianoferrato (III) de potássio, hexacianoferrato (III) de sódio, citocroma C, coenzima Q1, coenzima Q10, azul de metileno e, TMPD, de preferência PMS, coenzima Q1 e coenzima Q10.

[0042]. De acordo com um outro modo de execução da invenção, o aditivo é desenvolvido de tal forma que o excipiente é selecionado do grupo de carreadores inertes, vitaminas, substâncias minerais, substâncias fitogênicas, enzimas e outros componentes para desintoxicação de micotoxinas, tais como enzimas degradantes de micotoxina, especialmente aflatoxina-oxidases, ergotamina hidrolases, ergotamina amidases, zearalenona esterases, zearalenona lactonases, zearaleno- na hidrolases, ocratoxina amidases, fumonisina aminotransferases, fumonisina carboxiltransferases, amino poliol amina oxidases, deso- xinivalenol epóxido hidrolases, desoxinivalenol desidrogenases, deso- xinivalenol oxidases, tricoteceno desidrogenases, tricoteceno oxidases; e microorganismos transformadores de micotoxina, como por exemplo DSM 11798; e substâncias ligantes de micotoxina, tais como paredes celulares microbianas ou materiais inorgânicos semelhantes a bentonita ou esmectita. Através do uso de um aditivo deste tipo, pode- se garantir que as eventuais quantidades de tricotecenos que exibem um grupo hidróxi no átomo C-3, que podem estar contidos na ração ou alimento, bem como quaisquer micotoxinas adicionais, tais como as toxinas Fusarium, ergotaminas, ocratoxinas, são desintoxicadas com segurança até o ponto em que um efeito nocivo da micotoxina no organismo do indivíduo que ingeriu esta ração ou alimento esteja ausente.

[0043]. Outros campos de emprego da invenção são aditivos, que além de conter pelo menos uma álcool desidrogenase de acordo com a invenção, adicionalmente contêm pelo menos uma enzima que, por exemplo, está envolvida na quebra de proteínas, tais como por exemplo, proteases, ou que estão envolvidas no metabolismo do amido ou fibra ou gordura ou glicogênio, tais como amilase, celulase ou gluca- nase, e por exemplo hidrolases, enzimas liptolíticas, manosidases, oxidases, oxidoredutases, fitases ou xilanases.

[0044]. É desnecessário salientar que naturalmente o aditivo pode estar presente na forma encapsulada ou revestida, sendo que, para o encapsulamento ou revestimento, podem ser empregados métodos padrão, tais como aqueles descritos por exemplo, no WO 92;12645. Através de encapsulamento ou revestimento é possível transportar o aditivo à localização onde ele deve ser empregado sem modificação, especialmente sem qualquer degradação ou dano, de modo que o po- lipeptídeo começa a ter efeito somente depois que o envólucro é dissolvido, como por exemplo, no trato digestivo de animais, com o que pode ser obtida uma quebra mais certeira, mais rápida e mais completa dos tricotecenos que exibem um grupo hidróxi no átomo C-3, mesmo em um ambiente ácido, rico em protease, e anaeróbico. Além disso, é possível, por meio de encapsulamento ou revestimento, aumen-tar a estabilidade à temperatura da álcool desidrogenase no aditivo e, neste caso, seu emprego é aperfeiçoado, por exemplo no processo de peletização de rações.

[0045]. O aditivo de acordo com a invenção pode ser utilizado de muitas maneiras, como por exemplo, para a preparação de um prepa- rado para a profilaxia e/ou tratamento de tricoteceno-micotoxicoses, de preferência de micotoxicoses que são causadas por tricotecenos que exibem um grupo hidróxi no átomo C-3, como particularmente desoci- nivalenol-micotoxicoses. Tais micotoxicoses acarretam sérias consequências para humanos e animais. Em tais usos do aditivo é possível, no caso de uma profilaxia, manter o estado de saúde de homens ou animais essencialmente no mesmo nível sem ou com uma reduzida ingestão oral das toxinas de tricotecenos, especialmente de tricotece- nos que exibem um grupo hidróxi no átomo C-3, especialmente deso- xinivalenol. No caso do tratamento de micotoxicoses é possível aliviar os sintomas de uma tal doença, e em particular normalizar a concentração de SOCS3 no fígado ou os níveis de IGFALS no plasma, assim como a concentração de claudina nos intestinos.

[0046]. Além disso, é possível através de um tal uso aperfeiçoar a produtividade de animais úteis, especialmente a utilização da ração e aumento de peso, e baixar a taxa de mortalidade.

[0047]. A invenção é a seguir detalhadamente explicada por meio de exemplos de execução, assim como um desenho. Nesses: Fig. 1 mostra a transformação cronológica de desocinivalenol pela álcool desidrogenase ativada da SEQ ID no. 1, bem como um controle (CTR) como comparação, e Fig. 2 mostra a representação da transformação cronológica de DON pela álcool desidrogenase ativada da SEQ ID números 1 até 4, bem como um controle (CTR) como uma comparação.

Exemplo 1: Clonagem dos genes e purificação da álcool desidro- genase

[0048]. As sequências de nucleotídeos códon-otimizadas da álcool desidrogenase de SEQ ID números 1 até 4 para a respectiva célula hospedeira foram tiradas do DNA2.0 e continham nos sítios de restrição no nível do ácido nucleico, na extremidade 5' e na extremidade 3' da sequência, assim como no nível de aminoácidos, adicionalmente um 6xHis tag C-terminal ou N-terminal. Essas sequências de nucleotí- deos foram integradas por meio de métodos padrão em vetores de expressão para a expressão em Escherichia coli ou Komagataella pastoris, e transformadas em E. coli ou K. pastoris, e expressas em E. coli ou K. pastoris (J.M. Cregg, Pichia Protocols, segunda edição, ISBN-10: 1588294293, 2007; J. Sambrook et al. 2012, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th Edition, Cold Spring Harbor).

[0049]. As álcool desidrogenases com as SEQ ID números de 1 a 4 foram seletivamente cromatograficamente enriquecidas a partir de lisa- tos celulares solúveis, no caso da expressão em E. coli e da expressão intercelular em K. pastoris, ou do sobrenadante da cultura no caso da expressão extracelular em K. pastoris, por meio de processos padrão via colunas de níquel sefarose. Os eluatos seletivamente enriquecidos foram incubados e ativados na presença de íons metálicos, assim como de cofatores de quinona, sendo que no caso "ativados" significa que a álcool desidrogenase exibe tanto o íon metálico como também o cofator de quinona ligado. Essas álcool desidrogenases ati-vadas foram utilisadas para determinar as propriedades enzimáticas das álcool desidrogenases com as SEQ ID números 1 a 4 nos exemplos 3 a 7 a seguir. A determinação da concentração total de proteína ocorreu fotometricamente com o reagente Bradford (Sigma # B6916), sendo que as absorções foram medidas em um microprato em um fo- tômetro de placas de microtitulação (plate reader, Biotek, Synergy HT) a um comprimento de ondas de 595 nm. A concentração da proteína foi verificada por meio de uma curva de calibração que foi determinada por medição de soluções de albumina do soro bovino (BSA, Sigma #A4919) com concentrações de até um máximo de 1500 μg/ml usando um ensaio de Bradford.

Exemplo 2: Determinação da identificação da identidade de se- quência

[0050]. A determinação da identidade de sequência percentual ao longo do comprimento total da sequência de amino ácidos da álcool desidrogenase com as SEQ ID números 1-4 relativas umas às outras, foi determinada com o auxílio do programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), especialmente BLASTP, que está disponível para uso na homepage do National Center for Biotechnology Information (NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), com o qual é possível comparar duas ou mais sequências umas com as outras de acordo com o algoritmo de Altschul et al., 1997 (Nucleic Acids Res. (1997) 25:33893402). Como ajustes de programa foram utilisados os ajustes básicos, especialmente: "max target sequence" = 100; "expected threshold" = 10; "word size" = 3; "matrix" = BLOSOM62; "gap costs" = "existence: 11; extension: 1"; "computational adjustment" = "conditional compositional score matrix adjustment". As identidades percentuais das sequências de aminoácidos entre si são mostradas na Tabela 1. Exemplo 3: Transformação de tricotecenos exibindo um grupo hidróxi no átomo C-3

[0051]. Álcool desidrogenases com SEQ ID números 1-4 foram preparadas com um 6xHis tag C-terminal em E. coli, conforme descrito no Exemplo 1, para determinar sua adequação em transformar tricote- cenos, que exibem no átomo C-3 um grupo hidróxi, especialmente DON, nivalenol e toxina T-2.

[0052]. Uma transformação ocorre então quando a quantidade de um tricoteceno que exibe um grupo hidróxi no átomo C-3 é reduzida por colocação da mesma em contato com uma álcool desidrogenase ativada, isto é, uma álcool desidrogenase que contem íons metálicos e um cofator quinona.

[0053]. Em cada caso, 100 ml de uma cultura de E. coli com uma densidade ótica (OD600 nm) de 2,0 - 2,5 foi cultivada por centrifugação a 4°C e ressuspensa em 20 ml de solução tampão de fosfato de potássio. As suspensões celulares foram lisadas por tratamento com uma prensa francesa 3 vezes a 20.000 psi (1360 bar). Os lisatos celulares foram separados por centrifugação em partes solúveis e insolúveis. O sobrenadante foi filtrado esterilmente e a álcool desidrogenase foi enriquecida seletivamente por meio de métodos padrão de croma- tografia em colunas de níquel sefarose. Em seguida foi realizada uma troca de tamponador por meio de diálise com tubos específicos com um corte de dez quilodaltons. A concentração de proteína total resultante foi medida em um ensaio de Bradford.

[0054]. A ligação dos cofatores de quinona e os íons metálicos nas álcool desidrogenases ocorreu por incubação em solução aquosa. O cofator de quinona, como por exemplo, pirroloquinolina quinona (PCC, CAS no. 72909-34-3), triptofano triptofilquinona (TTC, CAS no 13464525-3), topaquinona (TPC, CAS no 64192-68-3), lisina tirosilquinona (LTC, CAS no 178989-72-5) e cisteína triptofilquinona (CTC, CAS no. 400616-72-0), é adicionado à concentração de proteína total existente como uma solução aquosa em um excesso molar de aproximadamente vinte vezes. Os íons metálicos selecionados de Li+, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Zn2+, Zn3+, Mn2+, Mn3+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Cu3+, Co2+ e Co3+ são utilizados como uma solução aquosa de um seu sal. A menos que nada diferente seja indicado, as álcool desidrogenases de acordo com o padrão foram ativadas com PCC (Sigma Aldrich #D7783) e Ca2+, como uma solução 5 mM de CaCl2. As enzimas purificadas e ativadas deste modo foram empregadas para ensaios de transformação in vitro de um tricoteceno apresentando um grupo hidróxi no átomo C-3. Quando nada diferente tiver sido indicado, sob os termos "enzima" ou "álcool de- sidrogenase" compreende-se sempre as álcool desidrogenases apro-priadamente ativadas, contendo os íons metálicos e cofator de quino- na.

[0055]. Os ensaios de transformação foram realizados em solução aquosa com os seguintes componentes: 100 mM Tris-HCl pH 7.5 ou 10% de Teorell Stenhagen pH 7.5; cofator redox sintético selecionado do grupo 1 mM metosulfato de fenazina PMS (Sigma Aldrich #P9625), 1 mM de azul de metileno (Sigma #M9140), 1 mM de coenzima Q10 (Sigma #C9538), 1 mM de coenzima Q1 (Sigma #C9538) e 20 mM de haxacianoferrato (III) de potássio PFC (III) (Fluka #60300); 10 ppm até um máximo de 100 ppm de um tricoteceno exibindo um grupo hidróxi no átomo C-3 por adição da quantidade desejada de uma solução mãe de substrato de toxina; e 10 nM a 100 nM, no máximo 300 nM de uma álcool desidrogenase ativada da SEQ ID no 1, 2, 3 ou 4 contendo íons metálicos e um cofator de quinona. Quando nada diferente é indicado, o tamponador tris-HCl, o cofator redox PMS, DON e a álcool desidro- genase da SEQ ID no. 1 são usados normalmente. Cada ensaio de transformação foi executado em um recipiente de reação Eppendorf marrom de 1,5 ml. As misturas de reação foram incubadas a 30°C em um thermoblock por até 120 minutos, pelo menos 40 minutos. Retirouse respectivamente uma amostra de 0,1 ml a cada 0, 10, 20, 30, e 40 minutos, e misturou-se com 0,1 ml de metanol e armazenou-se a - 20°C, ou alternativamente analisou-se imediatamente por meio de LC- MS/MS ou HPLC.

[0056]. Como solução mãe de substrato DON foi usada uma solução DON aquosa de 2000 ppm, esterilmente filtrada. Para preparar esta solução, DON na forma cristalina (Biopure Standard da Romer Labs, art. no. 001050, pureza de pelo menos 98%) foi pesada e dissol- vida.

[0057]. Para a quantificação dos tricotecenos que exibem um grupo hidróxi no átomo C-3, assim como seus metabólitos de transformação, foram realizadas análises HPLC, sendo que as substâncias foram separadas cromatograficamente por meio de uma coluna Phenomenex C18 Gemini NX com as dimensões de 150 mm x 4.6 mm e um tamanho de partícula de 5 μm. Uma mistura de metanol/água com uma concentração de acetato de amônio de 5 mm foi usada como eluente. O sinal UV foi registrado e avaliado em 220 nm. Para a quantificação por meio de análises LC-MS/MS, as substâncias foram separadas cromatograficamente por meio de uma coluna Zorbax eclipse C8 com dimensões de 150 mm x 4.6 mm e um tamanho de partículas de 5 μm. Como eluente foi utilizada uma mistura de metanol/água com uma concentração de acetato de amônio de 5 mM. O sinal UV em 220 nm foi registrado. Uma ionização por eletrospray (ESI) foi utilizada como fonte de ionização. Os tricotecenos exibindo um grupo hidróxi no átomo C-3 foram quantificados por meio de um QTrap/LC/MS/MS (triple quadrupole, Applied Biosystems) no "enhanced Modus".

[0058]. Como medida para a atividade de álcool desidrogenases foram utilizadas as inclinações negativas das linhas de transformação (= redução da concentração de toxina com o tempo) na faixa linear. Para determinar as atividades residuais, as atividades medidas para diferentes parâmetros relativo à atividade básica, medido sob condições padrão, especialmente 30°C e pH 7,5, foram aplicadas e usualmente representadas como porcentagens. Na Fig. 1 é mostrada a transformação cronológica de DON para a álcool desidrogenase ativada da SEQ ID no. 1 e na Fig. 2 é mostrada a transformação cronológica de DON para as álcool desidrogenases ativadas da SEQ ID números 2-4 (Fig. 1B). A partir das figuras fica claramente evidente que uma transformação de DON ocorre porque a concentração de DON foi re- duzida baseado no tempo real.

[0059]. Neste contexto é mostrada na Fig. 1 a transformação de DON com a álcool desidrogenase da SEQ ID no 1 em 100 mM tris HCl pH 7,5 na presença de 50 ppm de DON e 1 mM de PMS. Os resultados da medição foram obtidos por análise por LC-MS/MS (A) e a transformação de DON com as álcool desidrogenases da SEQ ID números 1-4 é mostrada na Fig. 2. Os resultados da medição foram obtidos por análises HPLC (B). CTR nos testes serviu como controle negativo, que continha todos os componentes do ensaio de transformação, até as álcool desidrogenases da SEQ ID números 1-4.

[0060]. Para comparação da eficácia dos cofatores de quinona, misturaram-se em ensaios de transformação respectivamente 10 nM da álcool desidrogenase da SEQ ID no. 1 ativada pelos cofatores de quinona PCC, TTC, TPC, LTC, e CTC, 10 ppm de DON, e 1 mM de cofator redox sintético PMS em 100 mM de tris-HCl pH 7,5 e incubou- se a 30°C. As concentrações de DON foram determinadas por meio de LC-MS/MS após 30 minutos, sendo que os resultados são mostrados na Tabela 2.

[0061]. Para comparar a eficácia dos cofatores redox sintéticos, nos ensaios de transformação, 10 nM de enzima ativada (álcool desi- drogenase da SEQ ID no 1), 10 ppm DON, e 1 mM ou 20 mM dos cofa- tores redox sintéticos a serem testados foram respectivamente misturados em 100 mM, tris-HCl pH 7,5 e incubados a 30°C. As concentrações de DON foram determinadas por LC-MS/MS após 30 minutos. Os resultados são mostrados na Tabela 2.

[0062]. Para testar a influência dos íons metálicos na enzima ativada sobre a transformação, a ativação da álcool hidrogenase da SEQ ID no 1 e PCC foi, entretanto, respectivamente realizada com diferentes íons metálicos, a saber com Mg2+, Ca2+, Zn2+, Mn2+, Fe2+ e Cu2+. Os ensaios de transformação continham respectivamente 10 nM de álcool desidrogenase ativada, 10 ppm de DON, e 1 mM de PMS em 100 mM de tris-HCl pH 7,5 respectivamente, e foram incubados a 30°C. As concentrações de DON foram determinadas por meio de LC- MS/MS após 30 minutos. Os resultados são mostrados na Tabela 3.

[0063]. Analogamente aos ensaios de transformação de DON acima mencionados, os ensaios da transformação foram realizados com outros tricotecenos exibindo um grupo hidróxi no átomo C-3. Nesses ensaios ao invés de 50 ppm de DON foram empregados 50 ppm de toxina T-2 ou 50 ppm de nivalenol. Todas as álcool desidrogenases da SEQ ID no 1 até 4, contendo quatro íons metálicos e o cofator de qui- nona, seriam capazes de transformar também a toxina T-2, assim como o nivalenol, sendo que, respectivamente, mais do que a metade da toxina originalmente empregada foi transformada num espaço de 30 minutos. Exemplo 4: Medição das áreas de atividade

[0064]. Para determinar a capacidade das álcool desidrogenases da SEQ ID números 1-4 de transformar DON sob diferentes condições, a álcool desidrogenase da SEQ ID no 1 foi usada como um exemplo.

[0065]. A álcool desidrogenase da SEQ ID no 1 foi preparada como descrito no Exemplo 3 e ativada com Ca2+ e PCC. Para determinar a atividade da enzima em uma faixa de temperatura de 10°C a 50°C e em uma faixa de pH de 3,0 a 9,0, foi utilizado um tamponador 10%Teorell Stenhagen ao invés do tamponador 100 mM tris-HCl com pH 7,5.

[0066]. Os ensaios de transformação para determinar as atividades a diferentes temperaturas foram realizados em uma solução aquosa com os seguintes componentes: 10% de Teorell Stenhagen pH 7,5, 1 mM de cofator redox sintético PMS, 50 ppm de DON, e 10 nM de álcool desidrogenases da SEQ ID no 1 ativados. As amostras de transformação foram incubadas por até 60 min em um termociclador (Eppen- dorf) com um gradiente de temperatura de 10°C a 50°C. Após 0, 10, 20, 30, 40, e 60 minutos, retirou-se uma amostra de 0,05 ml em cada tempo e misturou-se com 0,05 ml de metanol para interromper a reação, e armazenou-se a -20°C. As amostras foram preparadas para a LC-MS/MS, conforme descrito no Exemplo 3, e analisadas por meio de LC-MS/MS. O curso da redução de DON foi determinado para cada temperatura e a atividade foi calculada conforme descrito no Exemplo 3. A inclinação da faixa linear da linha de transformação a 30°C foi usada como valor de referência para o cálculo da atividade residual nas outras temperaturas. A Tabela 4 mostra as temperaturas em °C e as atividades residuais associadas em porcentagem. Surpreendentemente, mostrou-se que a álcool desidrogenase com a SEQ ID no 1 é ativa ao longo de uma ampla faixa de temperatura. A 10°C, foi medida uma atividade residual de 48%, e a aproximadamente 50°C, uma atividade residual de 67%.

[0067]. Os ensaios de transformação para determinar a atividade em uma faixa de pH de 4,0 a 9,0 foram realizados em uma solução aquosa com os seguintes componentes: 10% de Teorell Stenhagen pH 4,0 ao pH 10,0, 20 mM do cofator redox sintético PFC, 100 ppm de DON, e 20 nM de álcool desidrogenases ativadas da SEQ ID no 1. As amostras de transformação foram incubadas até 60 min em um termo- ciclador a 30°C. Após 0, 10, 20, 30, 40 e 60 minutos, uma amostra de 0,05 ml foi tirada em cada tempo e misturada com 0,05 ml de metanol para interromper a reação, e armazenada a -20°C. Conforme descrito no Exemplo 3, as amostras foram diluídas e analisadas por meio de LC-MS/MS. O curso da redução de DON foi determinado em cada valor de pH e a atividade foi calculada, conforme descrito no Exemplo 3. A inclinação da faixa linear da linha de transformação no pH 7,5 foi usada como um valor de referência para calcular a atividade residual nos outros valores de pH. A Tabela 5 mostra os valores de pH e as atividades residuais associadas (a redução de DON com base no valor de referência do pH de 7,5) em percentual. Exemplo 5: Determinação da estabilidade com a temperatura

[0068]. A estabilidade com a temperatura da álcool desidrogenase da SEQ ID no 1 foi determinada ao longo de uma faixa de 30°C a 55°C. Para isto a álcool desidrogenase ativada foi incubada em um tamponador de 100 mM tris-HCl, pH 7,5 por até 60 min a uma temperatura específica em um termociclador (Eppendorf). Após 0, 5, 10, 15, 20, 30, 40, e 60 minutos, uma alíquota da álcool desidrogenase foi tirada e a atividade foi determinada em uma amostra de transformação de DON, conforme descrito no Exemplo 3. As amostras de transformação continham os seguintes componentes: 100 mM de tris-HCl, pH 7,5, 1 mM de PMS, 50 ppm DON, 10 nM de álcool desidrogenases ativadas da SEQ ID no 1. Conforme descrito no Exemplo 3, as reações foram incubadas e a extração das amostras para determinar a atividade foi feita após 0, 10, 20, 30, 40 e 60 min. O curso da redução de DON foi determinado para cada temperatura para cada tempo de incubação. A inclinação da faixa linear da linha de transformação de DON foi calculada para determinar a estabilidade com a temperatura. A inclinação da faixa linear da linha de transformação de DON da respectiva temperatura no tempo t = 0 min foi usada como valor de referência para o cálculo das atividades residuais. A Tabela 6 mostra as temperaturas em °C, o tempo de incubação em minutos, e as atividades residuais associadas em percentual. A álcool desidrogenase da SEQ ID no 1 foi a mais estável quando armazenada por uma hora a temperaturas de 30°C e 37°C. Em comparação com isto, a álcool de- sidrogenase ainda tinha 73% de atividade residual a 40°C após ter sido armazenada por uma hora. Uma atividade 50% residual foi medida após ter sido armazenada a 45°C por 30 min. Surpreendentemente, uma atividade residual de 84% foi detectada após ter sido armazenada por 5 min a 50°C. Exemplo 6: Determinação da estabilidade do pH

[0069]. A estabilidade do pH da álcool desidrogenase ativada da SEQ ID no 1 foi determinada ao longo de uma faixa de pH 4,0 a pH 10,0. Para tanto, uma concentração dez vezes maior da álcool desi- drogenase ativada (100 nM) foi armazenada em um tamponador Teo- rell Stenhagen 10% pH 4,0 ao pH 10,0 por até 120 minutos a uma temperatura de 30°C. Após 0, 60, e 120 minutos, retirou-se uma alíquota da álcool desidrogenase e a atividade foi determinada em uma amostra de transformação, e conforme descrito no Exemplo 3, realiza-da a 30°C com os seguintes componentes: 100 mM de tris-HCl, pH 7,5, 1 mM de PMS, 50 ppm de DON, 10 nM de álcool desidrogenases ativadas da SEQ ID no 1. A coleta de amostras para determinar a atividade foi efetuada após 0, 10, 20, 30, e 40 min. O curso da redução de DON foi determinado para cada valor de pH para cada tempo. Para determinar a estabilidade, a inclinação da faixa linear da transformação de DON foi calculada para cada valor de pH no respectivo tempo. A inclinação da faixa linear da linha de transformação de DON do respectivo valor do pH no tempo t = 0 min foi utilizado como valor de referência para o cálculo das atividades dos tempos de incubação seguin- tes. A Tabela 7 mostra o valor do pH, o tempo da incubação do pH em minutos, e as atividades residuais associadas em percentual. A álcool desidrogenase da SEQ ID no 1 foi estável desde o pH 5,0 até o pH 9,0 após 60 minutos de incubação. Surpreendentemente, a álcool desi- drogenase exibiu uma estabilidade particularmente boa em um ambiente ácido (nenhuma perda de atividade ao pH 5,0) e em um meio/ambiente fortemente alcalino (nenhuma perda de atividade em uma incubação após 120 min ao pH 9,0). Exemplo 7: Transformação de DON em matrizes complexas

[0070]. Para determinar a capacidade das álcool desidrogenases ativadas em transformar tricotecenos em matrizes complexas mesmo sem uma adição externa de cofatores redox sintéticos, a álcool desi- drogenase ativada da SEQ ID no 1 foi preparada conforme descrito no Exemplo 3, e os ensaios de transformação de DON foram realizados em matrizes complexas. São compreendidas aqui por matrizes complexas, entre outros, sucos ruminal de gado, os conteúdos intestinais do jejuno de suínos, suco gástrico de suínos, saliva de seres humanos e suínos, ração granulada para criação de leitões (FAF), assim como ração granulada para criação de leitões misturada com saliva, fluido do rúmen, ou conteúdos intestinais. Para ter uma comparação com o sis- tema tamponador, os controles foram realizados com tris-HCl, conforme descrito no Exemplo 3. Para a ração de leitões, foi utilizada uma ração padrão baseada em milho, soja e cevada.

[0071]. Para determinar a atividade da álcool desidrogenase em suco ruminal (pH 5.9), 1 ml de filtrado de fluido ruminal estéril foi adicionado respectivamente a 100, 200, e 300 nM de álcool desidrogenase ativada da SEQ ID no 1 e 50 ppm de DON. As amostras de controle foram preparadas com solução aquosa, como descrito no Exemplo 3. Todas as amostras de transformação foram incubadas a 30°C em um termobloco por até 24 horas. A coleta de amostras foi feita após 0, 0,5, 1,0, 5,0, e 24,0 horas, em cada tempo retirou-se uma amostra de 0,1 ml e a reação foi interrompida com 0,1 ml de metanol. As amostras foram armazenadas a -20°C, descongeladas, e centrifugadas por 10 min a 13,000 rpm com uma centrífuga de mesa Eppendorf, e filtradas esterilmente com um filtro Spartan de 0,2 μM. Para a LC-MS/MS, as amostras foram diluídas conforme descrito no Exemplo 3 e analisadas por meio de LC-MS/MS. A concentração de DON no tempo t = 0 h foi utilizada como valor de referência (100%) para os valores seguintes. A tabela 8 mostra a porcentagem da concentração de DON que foi medida a um certo tempo relativo ao tempo t = 0 h. Para a atividade no tamponador tris-HCl, a presença de um cofator redox sintético externamente adicionado é necessária, porque a transformação de DON ocorre lentamente, e foi detectável somente 24 horas mais tarde com uma concentração de álcool desidrogenase de 300 nM. Surpreendentemente, demonstrou-se que, em um fluido ruminal estéril filtrado a um valor de pH de 5,9, DON é transformado sem a adição de um cofator redox sintético externo. Isto mostra claramente que existem substãn- cias no fluido ruminal que servem como cofatores redox naturais. Em uma concentração de 300 nM, somente 42% da quantidade inicial de DON está contida na preparação após 5 horas de incubação. Após 24 horas de incubação, DON é detectável somente em baixas quantidades com uma concentração de álcool desidrogenase maior do que 200 nM.

[0072]. Para determinar a atividade da álcool desidrogenase no suco gástrico puro de suínos sem pasta de ração com um valor de pH de aproximadamente 3, no conteúdo do trato intestinal de suínos com um valor de pH de aproximadamente 6, e em saliva de suínos e saliva de humanos, misturou-se 300 nM de álcool desidrogenase ativada da SEQ ID no 1, aproximadamente 20 ppm de DON com 1 ml de suco gástrico (esterilmente filtrado), 1 ml de conteúdo intestinal pastoso, ou 1 ml de saliva em cada caso. Como controle negativo, foram feitas amostras contendo apenas fluidos de digestão com 20 ppm de DON, e como um controle positivo, foram utilizadas amostras de transformação que continham todos os componentes, incluindo 20 mM do cofator redox sintético PFC (III). A coleta de amostras foi feita após 0, 3,0, 5,0, e 24,0 horas, sendo que em cada tempo retirou-se 0,1 ml de amostra, e a reação foi interrompida com 0,1 ml de metanol. As amostras foram armazenadas a -20°C, descongeladas e centrifugadas por 10 min a 13.000 rpm com uma centrífuga de mesa Eppendorf e filtradas esteril- mente (filtro Spartan de 0,2 μM). Para a LC-MS/MS, as amostras foram diluídas 1:10 no eluente (ver Exemplo 3) e analisadas por meio de LC-MS/MS como no Exemplo 3. A tabela 9 mostra as respectivas con- centrações de DON que foram medidas no tempo da coleta das amostras. Surpreendentemente, uma redução de DON na saliva ocorreu sem um cofator redox sintético externamente adicionado (independente das espécies). Isto mostra claramente que nas secreções da saliva de homens e suínos estão presentes substâncias que são apropriadas como cofatores redox naturais para a transformação de DON com a álcool desidrogenase da SEQ ID no 1. Nenhuma redução substancial da concentração de DON foi medida no suco gástrico puro sem pasta de ração. Uma redução da concentração de DON só ocorreu no conteúdo dos intestinos por adição do cofator redox sintético.

[0073]. Para determinar a atividade das álcool desidrogenases em uma ração para a criação de leitões (FAF), para cada 100 mg de ração para leitões misturou-se 400 μl de tamponador 100 mM tris-HCl, pH 7,5, 400 μl de salina suína, 400 μl de suco gástrico suíno estéril ou 400 μl de conteúdo intestinal de suínos, respectivamente. Essas suspensões de ração para leitões foram armazenadas durante a noite a 4°C. Depois disso, cerca de 20 ppm de DON, e/ou 300 nM de álcool desi- drogenases ativadas da SEQ ID no 1, e/ou 20 mM do cofator redox sin- tético PFC (III) foram adicionados a todas as amostras. Como controle negativo foram usadas as preparações sem álcool desidrogenase e sem o cofator redox sintético externo. Como controle positivo foram usadas as preparações com adição das álcool desidrogenases e o co- fator redox sintético. A coleta das amostras foi feita após 0, 3,0, 5,0, e 24,0 horas. Uma amostra inteira foi usada para cada tempo. Adicionou-se à amostra, 500 μl de metanol seguido por 30 min de homogeneização em um agitador com 300 rpm. Depois disso as amostras foram centrifugadas por 15 minutos (centrífuga de mesa Eppendorf, 13,000 rpm) e o sobrenadante foi filtrado com uma seringa através de um filtro Spartan de 0,2 μM. Os sobrenadantes foram armazenados a - 20°C, descongelados e diluídos no eluente 1:10 para a LC-MS/MS, e analisados por meio de LC-MS/MS conforme descrito no Exemplo 3.

[0074]. A Tabela 10 mostra a concentração de DON, que estava presente nas amostras nos respectivos tempos. Na mistura tampão FAF encontram-se substâncias que podem assumir o papel dos cofa- tores redox sintéticos externamente adicionados, já que a concentração de DON diminui continuamente na ausência do cofator redox sintético externo. Essas substâncias se originam da ração para criação de leitões, já que como anteriormente mostrado, nenhuma transformação de DON no tamponador poderia ser medida no tamponador sem um cofator redox sintético externo. Na presença do cofator redox sintético externo, a transformação de DON na mistura tamponadora FAF, em comparação, ocorre mais rapidamente.

[0075]. Na mistura de FAF e saliva, a álcool desidrogenase também exibiu atividade independentemente da presença do cofator redox sintético externo; sendo que nas amostras de transformação que continham o cofator redox sintético externo, ocorreu uma redução mais rápida de DON.

[0076]. Surpreendentemente, a álcool desidrogenase da SEQ ID no 1 na mistura de suco gástrico FAF sem adição do cofator redox sintético externo é igualmente ativa. Através da adição de FAF ao suco gástrico, por um lado, o pH do suco gástrico aumentou e por outro lado cofatores redox que ocorrem naturalmente, que podem substituir o co- fator redox sintético externo, foram desprendidos de FAF. A atividade da álcool desidrogenase foi verificada então no conteúdo intestinal apenas quando um cofator redox sintético externo foi adicionado ao ensaio de transformação.

Claims (20)

1. Uso de uma álcool desidrogenase de SEQ ID No 1, ou sua variante funcional de SEQ ID Nos 2 a 4, caracterizado pelo fato de que contém um íon metálico e um cofator de quinona, e pelo menos um cofator redox para a transformação de pelo menos um tricoteceno que exibe um grupo hidróxi no átomo C-3.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o cofator de quinona é selecionado do grupo pirroloquinoli- na quinona (PCC), triptofano triptofilquinona (TTC), topaquinona (TPC), lisina tirosilquinona (LTC), e cisteína triptofilquinona (CTC), de preferência PCC.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o cofator de quinona está ligado à álcool desidroge- nase por pelo menos um íon metálico selecionado do grupo Li+, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Zn2+, Zn3+, Mn2+, Mn3+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Cu3+, Co2+ e Co3, de preferência Ca2+ e Mg2+.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que pelo menos um cofator redox é selecionado dos grupos metosulfatos de fenazina (PMS), derivados de PMS, hexacianoferrato de potássio (III), hexacianoferrato de sódio (III), citocromo C, coenzima Q1, coenzima Q10, azul de metileno, e TMPD, de preferência PMS, coenzima Q1 e coenzima Q10.

5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a transformação dos tricotecenos, que exibem um grupo hidroxila no átomo C-3 em alimentos ou rações, especialmente para suínos, aves, gado, cavalos, peixes, aquacultura e animais domésticos, assim como em matérias-primas vegetais, é realizada na produção ou processamento de alimentos e rações.

6. Processo para a transformação enzimática de tricotece- nos, caracterizado pelo fato de que pelo menos um tricoteceno, que exibe um grupo hidroxila no átomo C3, é colocado em contato com uma álcool desidrogenase de SEQ ID No 1 contendo íons metálicos e um cofator de quinona, ou com uma variante funcional da mesma, com pelo menos um cofator redox e água, e se necessário pelo menos um excipiente.

7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido da variante funcional é selecionada do grupo de SEQ ID Nos 2 a 4.

8. Processo de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o tricoteceno que exibe um grupo hidroxila no átomo C-3 é transformado a uma temperatura entre 5°C e 55°C, de preferência entre 10°C e 50°C, especialmente preferido entre 28°C e 45°C.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que pelo menos um tricoteceno exibindo um grupo hidroxila no átomo C-3 é colocado em contato com a álcool desidrogenase contendo íons metálicos e um cofator de qui- nona, com o fator redox, com água, e se necessário com o excipiente, por pelo menos um minuto, de preferência pelo menos 5 minutos, especialmente pelo menos 60 minutos.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizado pelo fato de que o cofator de quinona é selecionado do grupo dos PCC, TTC, TPC, LTC, e CTC, de preferência PCC.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10, caracterizado pelo fato de que o cofator de quinona está ligado à álcool desidrogenase por pelo menos um íon metálico selecionado do grupo Li+, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Zn2+, Zn3+, Mn2+, Mn3+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Cu3+, Co2+ e Co3+, de preferência Ca2+ e Mg2+.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 6 a 11, caracterizado pelo fato de que pelo menos um cofator redox é selecionado dos grupos PMS, derivados de PMS, hexacianofer- rato de potássio (III), hexacianoferrato de sódio (III), citocroma C, co- enzima Q1, coenzima Q10, azul de metileno, TMPD, de preferência PMS, coenzima Q1, e coenzima Q10.

13. Aditivo de transformação de tricoteceno, caracterizado pelo fato de que contém uma álcool desidrogenase de SEQ ID No 1 contendo íons metálicos e um cofator de quinona, e opcionalmente, ainda pelo menos um componente adicional selecionado de um cofator redox e pelo menos um excipiente.

14. Aditivo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que contém uma variante funcional da álcool desidroge- nase de SEQ ID No 1 selecionada do grupo de SEQ ID Nos 2 a 4.

15. Aditivo de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que contém um cofator de quinona selecionado do grupo PCC, TTC, TPC, LTC, e CTC, de preferência PCC.

16. Aditivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de que contém o cofator de quinona ligado a álcool desidrogenase por pelo menos um íon metálico selecionado do grupo Li+, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Zn2+, Zn3+, Mn2+, Mn3+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Cu3+, Co2+ e Co3+, de preferência Ca2+ e Mg2+.

17. Aditivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo fato de que um cofator redox sintético é selecionado do grupo PMS, derivados de PMS, hexacianoferrato de potássio (III), hexacianoferrato de sódio (III), citocroma C, coenzima Q1, coenzima Q10, azul de metileno, e TMPD, de preferência PMS, coenzima Q1, e coenzima Q10 como o cofator redox.

18. Aditivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 17, caracterizado pelo fato de que o excipiente é selecionado do grupo dos carreadores inertes, vitaminas, substâncias minerais, subs- tâncias fitogenéticas, enzimas e componentes adicionais para a detoxi- ficação de micotoxinas, como as enzimas de degradação micotoxina, especialmente aflatoxina-oxidases, ergotamina hidrolases, ergotamina amidases, zearalenona esterases, zearalenona lactonases, zearaleno- na hidrolases, ocratoxina amidases, fumonisina aminotransferases, fumonisina carboxiltransferases, amino poliol amina oxidases, deso- xinivalenol epóxido hidrolases, desoxinivalenol desidrogenases, deso- xinivalenol oxidases, tricoteceno desidrogenases, tricoteceno oxidases; e micotoxina-transformadora de microorganismos tais como DSM 11798; e substâncias de ligação de micotoxinas, tais como paredes celulares microbianas ou materiais inorgânicos como bentonitas.

19. Aditivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 18, caracterizado pelo fato de que está presente em uma forma encapsulada ou revestida.

20. Uso de pelo menos um aditivo, como definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 19, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de uma composição para a prevenção e/ou tratamento de tricoteceno micotoxicoses, de preferência de micotoxicoses causadas por tricotecenos que exibem um grupo hidroxila no átomo C-3, especialmente desoxinivalenol-micotoxicoses.