BR112016029891B1

BR112016029891B1 - Método para recuperação de lipídeos a partir de biomassa microbiana

Info

Publication number: BR112016029891B1
Application number: BR112016029891-8A
Authority: BR
Inventors: Arto HEISKA; Jukka-Pekka PASANEN; Annika Malm
Original assignee: Neste Oyj
Priority date: 2014-06-17
Filing date: 2015-06-16
Publication date: 2022-04-12
Also published as: EP3158035A4; CA2951001C; BR112016029891A2; CA2951001A1; US20170137742A1; CN106459825A; US10597601B2; EP3158035A1; WO2015193547A1

Abstract

MÉTODO PARA RECUPERAÇÃO DE LIPÍDEOS A PARTIR DE BIOMASSA MICROBIANA. A presente invenção refere-se a um método para recuperação de lipídeos a partir de biomassa microbiana e a um método para produção de lipídeos utilizando o método para recuperação de lipídeos. No método, uma suspensão compreendendo caldo de fermentação aquosa contendo biomassa de levedura oleaginosa é submetida a tratamento hidrotérmico e os lipídeos são recuperados a partir da biomassa por meio de solventes.

Description

Campo da invenção

[0001] A presente invenção refere-se a um método para recuperação de lipídeos a partir de biomassa microbiana e a um método para produção de lipídeos utilizando o método para recuperação de lipídeos.

Antecedentes da invenção

[0002] Certos microrganismos, tais como bactérias, fungos e leveduras, são conhecidos por converter moléculas orgânicas em lipídeos. O óleo produzido por microrganismos heterotróficos é muitas vezes chamado de óleo de célula única ou óleo microbiano e os microrganismos produtores de lipídeos são chamados microrganismos oleaginosos.

[0003] O processo para a produção de óleo de célula única tipicamente compreende etapas de cultivo de microrganismos, permitindo que as células acumulem lipídeos, coletando células ricas em lipídeos e recuperando lipídeo de células microbianas. Os lipídeos baseados em microrganismos (ou seja, óleos de células únicas) podem ser utilizados como matérias-primas para a produção de biocombustíveis, como biodiesel, diesel renovável ou biocombustível de aviação.

[0004] Os microrganismos oleaginosos cultivados em um meio de crescimento podem conter lipídeos em até 80% do seu teor total de matéria seca. A eficiência do método utilizado para recuperar lipídeos a partir de biomassa microbiana é crucial para a produção economicamente viável de biocombustíveis através de fermentação microbiana. O método utilizado para a recuperação de lipídeos deve fornecer cerca de 95% de rendimento de óleo de modo a ser economicamente viável. Além disso, o método utilizado para recuperar os lipídeos não deve destruir o valor da biomassa residual, a partir da qual o óleo foi extraído ou diminuir a qualidade do óleo extraído, que pode ser posteriormente processado ou utilizado como tal.

[0005] Um processo de recuperação de lipídeos compreende tipicamente etapas de colheita das células microbianas a partir do meio de cultura, quebra das células microbianas e recuperação de óleo para se obter óleo microbiano bruto e uma fração de biomassa residual. O óleo pode ser recuperado a partir de biomassa úmida, ou em caso de extração por via seca, a biomassa microbiana é desidratada antes da recuperação do óleo. A fração de biomassa residual pode ser utilizada como alimento para animais, uma vez que contém frações proteicas valiosas ou ser utilizada para produção de energia através da combustão. O método para recuperar lipídeos basicamente determina o valor da biomassa residual como alimento animal uma vez que as proteínas de biomassa microbiana são facilmente degradadas durante as várias etapas do processo.

[0006] A etapa de colheita é utilizada para separar as células microbianas do meio de cultura. As técnicas de colheita convencionais incluem filtração e centrifugação. A biomassa microbiana também pode ser concentrada antes da etapa de secagem por meios mecânicos de desidratação antes da recuperação de lipídeos.

[0007] O óleo é normalmente recuperado a partir das células microbianas colhidas por extração com um solvente, tal como dióxido de carbono em estado subcrítico ou supercrítico ou hidrocarbonetos líquidos, tais como hexano. As células microbianas podem também ser quebradas antes da extração de lipídeos com métodos tais como ultrassonicação, choque osmótico, força mecânica de cisalhamento, tal como extrusão, prensa a frio e choque térmico. A necessidade de quebrar completamente as células microbianas depende do solvente utilizado para extrair os lipídeos. No caso de não ser possível a quebra completa das células, uma mistura de solventes não polares e polares pode ser utilizada na extração.

[0008] Na extração por via seca, a biomassa colhida é seca antes da extração com solvente para remover a maior quantidade possível de água livre. Os lipídeos também podem ser extraídos a partir da biomassa úmida. Na extração por via seca, a biomassa microbiana é tipicamente seca até um teor de matéria seca superior a 90% antes da extração com solvente. Na extração por via úmida, o teor de matéria seca da biomassa pode ser tão baixo como 5% na etapa de extração com solvente. No caso de extração por via úmida, a fração de biomassa úmida residual resultante deverá de ser seca se for utilizada em aplicações de valor acrescentado.

[0009] As técnicas tradicionais de colheita de células, tais como filtração e centrifugação, geralmente resultam em uma biomassa com conteúdo de matéria seca de 15% a 40%. O teor de matéria seca a partir da biomassa colhida pode ser adicionalmente aumentado pela secagem, que, no entanto, consome muita energia. A secagem pode ser realizada por aquecimento, secagem por congelamento ou secagem por pulverização (Farr, W.E. e Proctor, A., Green Vegetable Oil Processing, 2012, AOCS Press). Geralmente as biomassas com teor de matéria seca inferior a 30% em peso não são consideradas econômicas para secagem.

[0010] A seleção entre a extração por via seca e a extração por via úmida depende da facilidade de remoção do excesso de líquido a partir da biomassa microbiana. A extração por via úmida é usualmente preferencial se a biomassa não puder ser desidratada mecanicamente até um teor de matéria seca superior a 30%. A extração por via úmida também é preferencial se o processamento subsequente da biomassa residual não necessitar de secagem adicional, por exemplo, se a biomassa for processada por digestão anaeróbica ou por liquefação hidrotérmica.

[0011] A facilidade de remoção de água a partir da biomassa microbiana úmida depende do tipo de microrganismos na biomassa microbiana. Os organismos filamentosos são considerados muito mais fáceis de coletar devido ao seu grande tamanho celular, enquanto que a biomassa de algas é conhecida por ter uma capacidade de filtração fraca devido ao pequeno tamanho celular. A extração por via úmida tem sido sugerida como um método eficiente de recuperação de lipídeos para a biomassa de algas no Documento EP2450424A1, uma vez que é claramente indicado que não é necessário secar a biomassa microbiana úmida antes da extração. Assim, o Documento EP2450424A1 não diz respeito às etapas de filtração e secagem antes da extração. Além disso, o documento refere- se a uma pressão elevada da própria extração, uma vez que é utilizado propano, que requer uma pressão de pelo menos 20 bar durante a etapa de extração de modo a manter o agente de extração/solvente no estado líquido. No que diz respeito à etapa de aquecimento, não há menção sobre as pressões exatas utilizadas. Os exemplos de acordo com o Documento revelam rendimentos bastante baixos de lipídeos utilizando-se o método como divulgado no Documento e não há menção ao teor de nitrogênio nos óleos extraídos a partir da biomassa.

[0012] A água presente nas células colhidas é conhecida por diminuir a eficiência da extração com solvente, uma vez que protege os lipídeos hidrofóbicos do contato com solventes. Adicionalmente, a água tende a formar emulsões com o solvente, que adicionalmente diminui a eficiência de extração e torna mais difícil separar os lipídeos extraídos do resto da fase líquida. Consequentemente, a extração por via seca é usualmente preferencial em relação à extração por via úmida se a biomassa microbiana puder ser desidratada mecanicamente até mais de 30% de matéria seca.

[0013] Foi anteriormente descrito por Davies (Davies, R. 1992. Scale Up of Yeast Oil Technology, Applications Industrial of Single Cell Oils, editado por: D.J. Kyle e C. Ratledge, AOCS Publishing) que um separador de disco de bocal, que é tipicamente utilizado na indústria de cerveja e na indústria de panificação para colher levedura, não é eficiente para a colheita de leveduras oleaginosas quando o teor de óleo da biomassa é superior a 35% em relação ao peso seco. Com biomassas de levedura oleaginosa que possui um teor de óleo superior a 35% em relação ao peso seco, foi sugerida a filtração em fluxo cruzado. No entanto, este método de colheita possui a desvantagem de baixo fluxo e incrustação de membrana, o que significa que são necessárias grandes áreas de membrana.

[0014] Mesmo se o separador de disco de bocal é utilizado para colher levedura oleaginosa com teor de óleo inferior a 35% em relação ao peso seco, o creme de levedura concentrado resultante possui um teor de matéria seca de 15% a 20%. Isto é universalmente considerado um teor muito baixo de matéria seca para a secagem ser econômica. Por esta razão, a extração por via úmida é comumente preferencial na coleta de levedura oleaginosa com teor de óleo inferior a 35% em relação ao peso seco utilizando um separador de disco de bocal.

[0015] O Documento WO 2011/143380 descreve um método para separação de óleo a partir de células de algas, método em que a biomassa de algas úmidas é submetida a tratamento de carbonização hidrotérmica (“HTC”, na sigla em inglês), o óleo combinado resultante e a fração de carvão são separados da fração aquosa através de filtração e o óleo é separado da fração de carvão através de extração com solvente. O tratamento de carbonização hidrotérmica é conduzido a uma temperatura de 170°C a 225°C. O método possui a vantagem de produzir uma fração aquosa rica em nitrogênio, fósforo e potássio, que pode ser reutilizada na fase de crescimento como nutrientes. O tratamento de carbonização hidrotérmica não é relatado como tendo qualquer efeito na capacidade de filtração da biomassa ou na eficiência da etapa de extração. No entanto, o Documento parece exemplificar métodos baseados em grãos processados por destilação e outras matérias- primas. Este tipo de matéria-prima não contém muitos lipídeos e, como tal, não apresentaria quaisquer dificuldades na filtração da biomassa úmida onde o método não inclui uma etapa de tratamento térmico antes da filtração. Além disso, para se obter um rendimento elevado dos ésteres metílicos de ácidos graxos (“FAMEs”, na sigla em inglês), é necessário extrair o carvão seco e o filtrado aquoso. Além disso, a referência é silenciosa em relação à qualidade dos óleos recuperados, por exemplo, aos teores de nitrogênio ou fósforo. De fato, o Documento afirma claramente que o produto aquoso contém a maior parte do nitrogênio, fósforo e potássio originalmente presentes na biomassa e extrair a fase aquosa resultaria claramente em um teor de nitrogênio no mesmo nível do teor de nitrogênio da biomassa original.

[0016] A biomassa microbiana também é comumente pasteurizada na etapa de colheita, com o intuito de matar os microrganismos e desativar as enzimas, que de outra forma, poderiam destruir as estruturas lipídicas. No método descrito no Documento US2003/014369, a pasteurização é conduzida aquecendo-se a biomassa em seu meio de crescimento a uma temperatura de 60°C a 100°C durante até 90 minutos. A pasteurização não foi reportada como tendo qualquer efeito nas etapas subsequentes de desidratação ou extração de lipídeos.

[0017] O documento EP2450426 refere-se a um método para a purificação de materiais lipídicos já obtidos a partir de material biológico. O método compreende a utilização de pelo menos um solvente polar e pelo menos um solvente não polar, e demonstra várias condições de reação que influenciam o conteúdo de fósforo e metais nos óleos purificados. No entanto, o Documento é silencioso em relação ao teor de nitrogênio dos óleos extraídos e também é silencioso em relação a quaisquer métodos de extração de óleos a partir de uma biomassa ou quaisquer condições durante a extração que podem influenciar os conteúdos, por exemplo, nitrogênio nos óleos extraídos.

[0018] A presente invenção está relacionada com a recuperação de lipídeos a partir de biomassa de levedura oleaginosa e a um método para produção de lipídeos utilizando o método para recuperação de lipídeos.

[0019] Davies (Davies, R. 1992 Scale Up of Yeast Oil Technology. Industrial Applications of Single Cell Oils. Edited by: D. J. Kyle and C. Ratledge, AOCS Publishing) descreve a recuperação deficiente de células de levedura oleaginosa quando o teor de lipídeos da biomassa excede 35% em relação ao peso seco.

[0020] Verificou-se que a colheita de células de levedura oleaginosas com microfiltros de extremidades mortas era impossível devido à imediata cegueira das membranas de filtro devido à estrutura de células moles da biomassa de levedura. As experiências também indicaram que era possível colher células de levedura oleaginosa com uma disposição de filtração em fluxo cruzado, mas o resultado da filtração era fraco com apenas 28% de matéria seca da biomassa colhida, que é geralmente considerada demasiadamente baixa para a etapa de secagem subsequente. Verificou-se também que a presença de material lignocelulósico ou restos de material lignocelulósico na suspensão de biomassa a ser colhida torna a incrustação das membranas ainda pior.

[0021] Consequentemente, é necessário um método eficaz para a recuperação de lipídeos a partir de biomassa de levedura oleaginosa e especialmente a partir de biomassas de levedura com elevado teor de lipídeos, isto é, mais de 35% em relação ao peso seco, tal como, por exemplo, pelo menos cerca de 40% em relação ao peso seco, ou tal como, por exemplo, pelo menos cerca de 50% em relação ao peso seco, tal como, por exemplo, pelo menos cerca de 60% em relação ao peso seco, tal como, por exemplo, pelo menos cerca de 70% em relação ao peso seco, tal como, 80% em relação ao peso seco. Sumário da invenção

[0022] Um objetivo da presente invenção é fornecer um método eficaz para recuperação de lipídeos a partir de biomassa de levedura oleaginosa.

[0023] Em conformidade, um primeiro aspecto da presente invenção refere-se a um método para a recuperação de lipídeos microbianos a partir de biomassa de levedura oleaginosa, em que o referido método compreende as etapas de: (i) fornecer uma suspensão aquosa que compreende um caldo de fermentação contendo biomassa de levedura oleaginosa; (ii) submeter a referida suspensão a um tratamento hidrotérmico a uma temperatura de pelo menos 160°C durante 1 segundo a 360 minutos a uma pressão superior a 5 bar; (iii) submeter a suspensão tratada hidrotermicamente a uma fase de separação para obter uma fração líquida e uma fração de biomassa de levedura; (iv) submeter a fração de biomassa de levedura a uma etapa de secagem para obter uma fração de biomassa de levedura seca; (v) submeter a fração de biomassa seca a uma etapa de extração com um solvente líquido para produzir uma fração líquida que compreende lipídeos microbianos e uma fração sólida que compreende uma fração de biomassa de levedura residual; (vi) recuperar os lipídeos microbianos a partir da fração líquida da etapa (v); (vii) opcionalmente, isolar a fração de biomassa residual a partir do produto da etapa (v).

[0024] Um segundo objetivo da presente invenção é fornecer um método para a produção de lipídeos microbianos com leveduras oleaginosas utilizando o método para recuperação de lipídeos a partir de biomassa de levedura oleaginosa.

[0025] Consequentemente, um segundo aspecto da presente invenção refere-se a um método para a produção de lipídeos microbianos, em que o método compreende: (i) fornecer um meio de cultura; (ii) fornecer um caldo de fermentação através da inoculação do meio de cultura com uma levedura oleaginosa para produzir a biomassa de levedura oleaginosa; (iii) incubar o referido meio inoculado com a referida levedura oleaginosa, permitindo que o lipídeo se acumule; (iv) recuperar lipídeos microbianos a partir da referida biomassa de levedura oleaginosa com o método de acordo com qualquer um dos métodos para recuperação de lipídeos microbianos aqui descritos.

[0026] Outro aspecto da presente invenção refere-se à biomassa residual que pode ser obtida a partir do método das presentes invenções.

[0027] Outro aspecto adicional da presente invenção refere-se a lipídeos microbianos que podem ser obtidos através do método da presente invenção.

[0028] Em contraste com o estado da técnica, a presente invenção minimiza a quantidade de água antes da extração. Isto possui a vantagem de que a extração é conduzida de forma mais eficiente com biomassa seca, uma vez que se sabe que a água forma emulsões com lipídeos, o que perturba a etapa de extração com um solvente orgânico e torna difícil a separação da fase orgânica da fase líquida/aquosa. Além disso, pelos procedimentos da presente invenção, é fornecido um método mais eficiente em termos energéticos, uma vez que é removida a maior quantidade de água possível através de filtração antes da secagem da biomassa resultante.

[0029] A presente invenção também se refere à extração de biomassa seca sem a necessidade de qualquer extração da fração líquida separada.

[0030] Além disso, o método da presente invenção fornece óleo de alta qualidade que, por exemplo, se relaciona com um baixo teor de nitrogênio nos óleos extraídos. Isto é importante do ponto de vista do processo adicional dos óleos recuperados, uma vez um elevado teor de impurezas, tais como, por exemplo, nitrogênio, impedirá o processo catalítico dos óleos recuperados em combustíveis. Isto é também verdadeiro no que diz respeito às impurezas, tais como, por exemplo, resíduos de metal no óleo extraído. Deverá ser entendido que o significado de níveis baixos, por exemplo, de nitrogênio, significa que os níveis são inferiores à quantidade de nitrogênio presente na biomassa original.

[0031] A presente invenção também fornece um método que não requer a aplicação de pressão durante a extração e consequentemente não se relaciona com solventes do processo de extração que têm um ponto de ebulição baixo à pressão normal (1 atm). Um exemplo de um solvente com uma baixa temperatura de ebulição é o propano, que requer uma pressão externa de modo a ser mantido em um estado líquido em temperaturas normais, tais como temperaturas na gama de cerca de 20°C a cerca de 100oC.

Descrição detalhada da invenção

[0032] Ao descrever as modalidades da invenção, será utilizada uma terminologia específica por razões de clareza. No entanto, a invenção não se destina a ser limitada aos termos específicos assim selecionados, e entende-se que cada termo específico inclui todos os equivalentes técnicos que funcionam de uma maneira semelhante para realizar um propósito semelhante.

[0033] Quando se descrevem as modalidades da presente invenção, as combinações e permutações de todas as modalidades possíveis não foram explicitamente descritas. No entanto, o mero fato de certas medidas serem citadas em reivindicações dependentes mutuamente diferentes ou descritas em diferentes modalidades não indica que uma combinação destas medidas não possa ser utilizada como vantagem. A presente invenção contempla todas as combinações e permutações possíveis das modalidades descritas.

[0034] Um primeiro aspecto da presente invenção fornece um método para recuperação de lipídeos microbianos a partir de biomassa de levedura oleaginosa, em que o referido método compreende as etapas de: (i) fornecer uma suspensão aquosa que compreende um caldo de fermentação contendo biomassa de levedura oleaginosa; (ii) submeter a referida suspensão a um tratamento hidrotérmico a uma temperatura de pelo menos 160°C durante 1 segundo a 360 minutos a uma pressão superior a 5 bar; (iii) submeter a suspensão tratada hidrotermicamente a uma fase de separação para obter uma fração líquida e uma fração de biomassa de levedura; (iv) submeter a fração de biomassa de levedura a uma etapa de secagem para obter uma fração de biomassa de levedura seca; (v) submeter a fração de biomassa seca a uma etapa de extração com um solvente líquido para produzir uma fração líquida que compreende lipídeos microbianos e uma fração sólida que compreende uma fração de biomassa de levedura residual; (vi) recuperar os lipídeos microbianos a partir da fração líquida da etapa (v); (vii) opcionalmente, isolar a fração de biomassa residual a partir do produto da etapa (v).

[0035] Consequentemente, em um aspecto da presente invenção, a fração líquida obtida na etapa (iii) não é extraída com um solvente para se obter qualquer óleo.

[0036] Outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para produção de lipídeos microbianos, em que o método compreende: (a) fornecer um meio de cultura; (b) fornecer um caldo de fermentação através da inoculação do meio de cultura com uma levedura oleaginosa para produzir a biomassa de levedura oleaginosa; (c) incubar o referido meio inoculado com a referida levedura oleaginosa, permitindo que o lipídeo se acumule; (d) recuperar lipídeos microbianos a partir da referida biomassa de levedura oleaginosa com o método de acordo com qualquer um dos métodos para recuperação de lipídeos microbianos aqui descritos.

[0037] Assim, uma modalidade da presente invenção refere-se a um método para produção de lipídeos microbianos, em que o método compreende: (a) fornecer um meio de cultura; (b) fornecer um caldo de fermentação através da inoculação do meio de cultura com uma levedura oleaginosa para produzir a biomassa de levedura oleaginosa; (c) incubar o referido meio inoculado com a referida levedura oleaginosa, permitindo que o lipídeo se acumule; (i) fornecer uma suspensão aquosa que compreende o caldo de fermentação contendo biomassa de levedura oleaginosa da etapa (c); (ii) submeter a referida suspensão a um tratamento hidrotérmico a uma temperatura de pelo menos 160°C durante 1 segundo a 360 minutos a uma pressão superior a 5 bar, (iii) submeter a suspensão tratada hidrotermicamente a uma fase de separação para obter uma fração líquida e uma fração de biomassa de levedura, (iv) submeter a fração de biomassa de levedura a uma etapa de secagem para obter uma fração de biomassa de levedura seca; (v) submeter a fração de biomassa seca a uma etapa de extração com um solvente líquido para produzir uma fração líquida que compreende lipídeos microbianos e uma fração sólida que compreende uma fração de biomassa de levedura residual (vi) recuperar os lipídeos microbianos a partir da fração líquida da etapa (v); (vii) opcionalmente, isolar a fração de biomassa residual a partir do produto da etapa (v).

[0038] Em uma modalidade adicional, os nutrientes compreendidos na fração líquida obtida a partir da fase de separação (iii) são reciclados para o meio de cultura (a).

[0039] Outro aspecto da presente invenção fornece a biomassa residual que pode ser obtida com os métodos de acordo com a presente invenção.

[0040] Ainda em outro aspecto da presente invenção, a fração líquida obtida na etapa (iii) não é extraída com um solvente.

[0041] Os requerentes da presente invenção também descobriram que é vantajoso lavar a fração de biomassa de levedura separada na etapa (iii) com água antes da secagem na etapa (iv) e/ou a extração na etapa (v). Isto resulta em uma maior pureza dos óleos extraídos com pouca ou nenhuma necessidade de purificação adicional antes de reações subsequentes dos óleos em, por exemplo, produtos combustíveis.

[0042] Os requerentes surpreendentemente verificaram que os problemas, relacionados com a colheita de biomassa de levedura oleaginosa com alto teor de lipídeos, podem ser resolvidos submetendo-se uma suspensão aquosa que compreende biomassa de levedura oleaginosa a um tratamento hidrotérmico (“HTT”, na sigla em inglês) a uma temperatura acima de 160°C. Durante o tratamento hidrotérmico, a densidade da biomassa de levedura é diminuída e as células são combinadas em conjunto formando grupos, o que permite a separação eficiente da fração líquida através de métodos convencionais de filtração ou centrifugação. Sem estar vinculado a qualquer teoria, considera-se que, como resultado do tratamento térmico, as moléculas intracelulares da levedura são extraídas para fase aquosa, o que aumenta a quota de óleo e diminui a densidade da biomassa. Também é sugerido que o tratamento hidrotérmico altera a estrutura superficial e a carga superficial das células de levedura, o que leva à formação de grupos de células permitindo a separação através de filtração.

[0043] Verificou-se também que as condições adequadas de tratamento térmico (temperatura e tempo de tratamento, como variáveis) podem ser expressas utilizando o fator de severidade utilizado para simular a extração de carboidratos a partir de biomassas lignocelulósicas. O fator de severidade LogR0 pode ser calculado utilizando a fórmula (1) (Pedersen, M. e A.S. Meyer (2010) Lignocellulose pretreatment severity - relating pH to biomatrix opening. New Biotechnology 27(6): 739-750.).

[0044] O tratamento hidrotérmico (etapa (ii)) é conduzido a uma pressão superior a 5 bar, tal como na gama de 6 bar a 25 bar, por exemplo na gama de 10 bar a 25 bar, tal como na gama de 10 bar a 15 bar. Alternativamente, a pressão durante o tratamento hidrotérmico pode ser, por exemplo, na gama de cerca de 6,0 bar a cerca de 20,0 bar, tal como, por exemplo, de cerca de 6,0 bar a cerca de 7,0 bar, tal como, por exemplo, de cerca de 10,0 bar a cerca de 11,0 bar, tal como, por exemplo, de cerca de 13,0 bar a cerca de 18 bar, tal como, por exemplo, de cerca de 16 bar a cerca de 19 bar.

[0045] Consequentemente, as pressões acima mencionadas podem, por exemplo, ser distribuídas de acordo com quando a temperatura da reação é de cerca de 160°C, a pressão pode ser, por exemplo, de cerca de 6,2 bar a cerca de 6,8 bar, ou quando a temperatura é de cerca de 180°C, a pressão pode ser, por exemplo, de cerca de 10,3 bar a cerca de 11,0 bar, ou quando a temperatura é de cerca de 190°C, a pressão pode ser, por exemplo, de cerca de 13,7 bar a cerca de 18 bar, ou quando a temperatura é de cerca de 200°C, a pressão pode ser, por exemplo, de cerca de 16,2 bar, ou quando a temperatura é de cerca de 210°C, a pressão pode ser, por exemplo, de cerca de 19,6 bar.

[0046] O processamento hidrotérmico (etapa (ii)) é conduzido durante 1 segundo a 360 minutos, tal como na gama de 5 minutos a 240 minutos, por exemplo, na gama de 10 minutos a 120 minutos.

[0047] Em uma modalidade, o tratamento hidrotérmico (etapa (ii)) é conduzido a uma temperatura na gama de 160°C a 180°C durante 30 minutos a 180 minutos, tal como 160°C durante 180 minutos ou 180°C durante 30 minutos a 60 minutos.

[0048] Assim, em uma modalidade da presente invenção, o tratamento hidrotérmico é conduzido sob condições que correspondem a um fator de severidade LogR0 de, pelo menos, cerca de 3,5, preferivelmente pelo menos cerca de 3,9. Em outra modalidade, o fator de severidade está na gama de cerca de 3,5 a cerca de 5,5 tal como, por exemplo, cerca de 4 a cerca de 4,5. O tratamento térmico é tipicamente conduzido em um recipiente fechado.

[0049] Os requerentes surpreendentemente também descobriram que os lipídeos recuperados através de um método que compreende tratamento hidrotérmico de biomassa de levedura a uma temperatura acima de 160°C e subsequente extração com solvente, contêm quantidades muito pequenas de impurezas de fósforo e metal. Verificou-se que o tratamento hidrotérmico permite a colheita eficaz de células de microrganismos com elevado teor de lipídeos e a recuperação de óleo microbiano de alta qualidade com elevado rendimento.

[0050] Consequentemente, a presente invenção refere- se a um método em que o rendimento dos óleos ou lipídeos extraídos está na gama de pelo menos cerca de 70%, tal como, por exemplo, cerca de pelo menos 80%, tal como, por exemplo, cerca de pelo menos 90%, tal como, por exemplo, cerca de pelo menos 95%, tal como, por exemplo, cerca de pelo menos 98%, tal como, por exemplo, cerca de 100% com base no teor dos óleos ou lipídeos presentes na biomassa.

[0051] Os requerentes descobriram que o método da presente invenção permite a colheita eficiente de biomassa de levedura oleaginosa com um elevado teor de lipídeo microbiano (tal como um teor de lipídeos superior a 35%) sem perda importante de lipídeo microbiano.

[0052] Em uma modalidade da presente invenção, a biomassa de levedura possui um teor de lipídeos de pelo menos 20% em peso de massa celular. Em uma modalidade preferencial, a biomassa de levedura possui um teor de lipídeos de pelo menos 30% em peso de massa celular. Em uma modalidade ainda mais preferencial, a biomassa de levedura possui um teor de lipídeos de pelo menos 35% em peso de massa celular, tal como, por exemplo, pelo menos cerca de 40% em relação ao peso seco, tal como, por exemplo, pelo menos cerca de 50% em relação ao peso seco, tal como, por exemplo, pelo menos cerca de 60% em relação ao peso seco, tal como, por exemplo, pelo menos cerca de 70% em relação ao peso seco, tal como, por exemplo, pelo menos cerca de 80% em relação ao peso seco.

[0053] A extração de lipídeos pode ser realizada utilizando qualquer solvente tradicional, tal como etanol ou hidrocarbonetos. A extração utilizando hexano é preferencial, uma vez que garante um bom rendimento de extração e qualidade do óleo. A etapa de extração pode ser realizada com meios convencionais. Em uma modalidade da presente invenção, a etapa de extração (v) é realizada utilizando um solvente de hidrocarboneto, tal como um solvente de hidrocarboneto que compreende alcanos inferiores, preferivelmente alcanos alifáticos C2-C8. Ainda mais preferivelmente alcanos C5-C8, tal como, por exemplo, pentanos, hexanos, heptanos ou octanos.

[0054] Além disso, os requerentes surpreendentemente descobriram que, no caso de a suspensão aquosa compreender o caldo de fermentação obtido a partir da cultura de leveduras oleaginosas em um meio de cultura que compreende hidrolisado de lignocelulose, o tratamento hidrotérmico aumenta a quantidade de biomassa residual. Isto indica que o material lignocelulósico dissolvido presente no caldo de fermentação é transformado no estado sólido durante o tratamento hidrotérmico e separado com biomassa residual na etapa de separação subsequente. A recuperação do material lignocelulósico dissolvido da suspensão aquosa para a fração de biomassa sólida possui a vantagem de aumentar a quantidade de fração de biomassa residual valiosa obtida a partir do processo de recuperação. Simultaneamente, isto reduz a procura química de oxigênio da fração de águas residuais obtida a partir da produção de levedura oleaginosa utilizando material ou hidrolisado lignocelulósico.

[0055] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o caldo de fermentação é obtido a partir da cultura de leveduras oleaginosas em um meio de cultura que compreende material lignocelulósico. Em outra modalidade preferencial, o caldo de fermentação é obtido a partir da cultura de leveduras oleaginosas em um meio de cultura que compreende hidrolisado lignocelulósico.

[0056] As vantagens da presente invenção incluem o fato de que o tratamento hidrotérmico permite uma colheita eficiente de biomassa de levedura oleaginosa com elevado teor de lipídeos a partir de suspensões aquosas com meios de colheita convencionais, tais como filtração e centrifugação. Uma colheita eficiente significa que a biomassa colhida possui um elevado teor de matéria seca e que nenhum óleo, ou óleo contendo células, sejam perdidos durante o processo de colheita. Como resultado, apenas uma pequena quantidade de água precisa ser removida por secagem antes da etapa de extração subsequente e o óleo não é perdido durante o processamento.

[0057] A presente invenção permite assim a recuperação economicamente viável de lipídeos a partir de biomassa de levedura oleaginosa com elevado teor de lipídeos, uma vez que o tratamento hidrotérmico minimiza a necessidade de secagem, que é conhecido por ser a etapa energética mais intensiva do processo de recuperação.

[0058] A levedura oleaginosa pode ser qualquer levedura capaz de acumular lipídeos intercelulares, de tal modo que os lipídeos respondam por pelo menos 15% (em peso) da biomassa total (em relação ao peso seco da célula) da levedura quando é cultivada em condições adequadas. A levedura oleaginosa inclui espécies de leveduras oleaginosas dos gêneros Clavispora, Geotrichum, Deparyomyces, Pachysolen, Kluyveromyces, Galactomyces, Hansenula, Leucosporidium, Saccharomyces, Sporobolomyces, Sporidiobolus, Waltomyces, Endomycopsis, Cryptococcus, tais como Cryptococcus curvatus, Rhodosporidium, tais como Rhodosporidium toruloides ou Rhodosporidium fluviale, Rhodotorula, tais como Rhodotorula glutinis, Yarrowia, tais como Yarrowia lipolytica, Pichia, tais como Pichia stipitis, Candida tais como Candida curvata, Lipomyces tais como Lipomyces starkeyi e Trichosporon tais como Trichosporon cutaneum ou Trichosporon pullulans.

[0059] Preferivelmente, as cepas de leveduras são aquelas pertencentes à Candida, Rhodotorula, Trichosporon, Rhodosporidium, Lipomyces Cryptococcus ou Saccharomyces. Em uma modalidade preferencial da presente invenção, a levedura é uma levedura do gênero Rhodosporidium, Rhodotorula, Lipomyces Cryptococcus ou Saccharomyces. Em outra modalidade, a levedura oleaginosa utilizada pelo método da presente invenção é uma mistura de duas ou mais espécies de leveduras oleaginosas.

[0060] O tratamento hidrotérmico a uma temperatura superior a 160°C também quebra as células de levedura e permite a extração eficiente de lipídeos sem a etapa de separação celular em separado. Verificou-se que o óleo extraído a partir da biomassa de levedura tratada hidrotermicamente contém baixas quantidades de impurezas de fósforo e de metal, o que é essencial para o processamento subsequente de lipídeos em componentes de combustível e que reduz a necessidade de etapas de purificação adicionais para o óleo microbiano bruto.

Material lignocelulósico

[0061] Os termos "biomassa lignocelulósica" ou "material lignocelulósico" significam, mas não estão limitados a, plantas lenhosas ou plantas herbáceas não lenhosas ou outros materiais que compreendam celulose e/ou hemicelulose: Os materiais podem ser resíduos agrícolas (tais como palha de trigo, palha de arroz, casca, vagem, palha de milho, bagaço de cana-de-açúcar, cana-de-açúcar e folhas), culturas energéticas dedicadas (tais como Panicum virgatum, Miscanthus, Arundo donax, Phalaris arundinacea, salgueiro, jacinto de água, cana energética, sorgo energético), materiais ou resíduos de madeira (incluindo resíduos ou frações de serraria e de polpa e/ou de fábrica de papel, tais como hemicelulose, licor de sulfito exaurido, fibra de resíduos e/ou lama primária), musgo ou turfa ou resíduos de papel. O termo material lignocelulósico compreende também materiais de baixa lignina, materiais tais como biomassa de macroalgas. Adicionalmente, os materiais compreendem também frações de hemicelulose ou de celulose de práticas industriais. O termo material lignocelulósico engloba qualquer tipo de fração de celulose. As matérias- primas ou certas frações, tais como hemicelulose e/ou celulose, matérias-primas de origem diferente, espécies de plantas, ou processos industriais podem ser misturados em conjunto e utilizados como matérias-primas para a cultura da biomassa de microrganismos de acordo com a presente divulgação. Tipicamente, o teor de lignina em lignocelulose é superior a 5%. A biomassa lignocelulósica pode também conter amido, por exemplo, no caso de plantas inteiras.

[0062] O termo “material lignocelulósico” compreende, pelo menos, 50% em peso de lignocelulose, de um modo preferencial, pelo menos, 60% em peso de lignocelulose, mais preferivelmente pelo menos 70% em peso de lignocelulose, mais preferivelmente pelo menos 80% em peso de lignocelulose. Normalmente, o material lignocelulósico compreende de 60% a 95% em peso de lignocelulose, tipicamente de 70% a 90% em peso, ou de 80% a 90% em peso de lignocelulose.

Meio de cultura que compreende material lignocelulósico

[0063] "Um meio de cultura que compreende material lignocelulósico" significa um meio de cultura para cultivar um microrganismo, meio o qual compreende lignocelulose, fragmentos de lignocelulose ou produtos de hidrólise de lignocelulose, incluindo compostos de nitrogênio proveniente de proteínas e de metais, e outros componentes necessários para cultivar o referido microrganismo, tal como uma fonte de nitrogênio, fósforo, sais inorgânicos vestígios e/ou agentes de formação de espuma. A lignocelulose pode funcionar como uma fonte de carbono para o referido microrganismo, mas também pode possuir outras funções no meio de cultura. Hidrólise

[0064] A "hidrólise" refere-se aqui a sacarificação de açúcares poliméricos em oligômeros e monômeros de açúcar. A sacarificação é tipicamente realizada em duas fases: em primeiro lugar o substrato, ou seja, o material lignocelulósico ou lignocelulose é hidrolisado por meio de métodos químicos ou termoquímicos e, em seguida, por meio de enzimas capazes de hidrolisar açúcares poliméricos. Alternativamente, e dependendo do material lignocelulósico, a sacarificação pode ser realizada utilizando métodos químicos ou termoquímicos ou através de enzimas capazes de hidrolisar açúcares poliméricos ou alguma combinação destes métodos. Os métodos químicos incluem, mas não estão limitados ao tratamento com ácido.

Hidrolisado

[0065] Os termos "hidrolisado" ou "material hidrolisado" referem-se aqui ao material que foi submetido à hidrólise.

Hidrolisado de lignocelulose

[0066] O termo "hidrolisado de lignocelulose" refere-se aqui a produtos de hidrólise de lignocelulose ou material lignocelulósico que compreendem celulose e/ou hemicelulose, oligossacarídeos, mono- e/ou dissacarídeos, ácido acético, ácido fórmico, outros ácidos orgânicos, furfural, hidroximetil furfural, ácido levulínico, compostos fenólicos, outras hidrólises e/ou produtos de degradação formados a partir de lignina, celulose, hemicelulose e/ou outros componentes da lignocelulose, compostos de nitrogênio proveniente de proteínas, metais e/ou de fragmentos de não hidrolisados ou parcialmente hidrolisados de lignocelulose. Tratamento hidrotérmico

[0067] Os termos "tratamento hidrotérmico" ou "processo hidrotérmico" são utilizados aqui como sinônimos e referem-se a um processo no qual uma suspensão aquosa que compreende biomassa microbiana é aquecida a uma temperatura de pelo menos 160°C e submissão da suspensão aquosa que compreende a referida biomassa microbiana a uma temperatura de pelo menos 160°C durante 1 segundo a 360 minutos a uma pressão superior a 5 bar.

[0068] Deve ser notado que, no contexto da presente invenção, os métodos acima mencionados, ou seja, o tratamento termoquímico, a explosão de vapor, a extração de água quente, a auto-hidrólise, o tratamento subcrítico de água, o tratamento supercrítico de água, o tratamento com ácido forte, o tratamento com ácido suave, o tratamento alcalino (por exemplo, cal, amônia), o tratamento Organosolv (por exemplo, álcoois, ácidos orgânicos), o tratamento mecânico, o tratamento térmico mecânico e o tratamento líquido iônico não se enquadram na definição de processamento hidrotérmico (ou tratamento hidrotérmico, tratamento térmico, HTT).

Fator de severidade

[0069] O termo "fator de severidade" refere-se aqui a um parâmetro LogR0, que é calculado com base na equação seguinte e que descreve as condições hidrotérmicas em termos de temperatura e tempo.

[0070] Fórmula (1):

em que R0 é o fator de severidade, T(t) é a temperatura do tratamento em °C e t é o tempo de tratamento em minutos.

Microrganismo oleaginoso

[0071] O termo "microrganismo oleaginoso" refere-se a um microrganismo produtor de lipídeo. Assim, a levedura oleaginosa refere-se a um microrganismo produtor de lipídeo. Quando um microrganismo produtor de lipídeo é utilizado para a produção de óleo de célula única, a biomassa microbiana é a biomassa residual a partir de um único processo de produção de óleo de células.

[0072] A levedura oleaginosa aqui referida e utilizada pode facilmente acumular lipídeos ou pode ter sido geneticamente modificada para acumular lipídeos ou para melhorar a acumulação de lipídeos. Preferivelmente, a levedura oleaginosa que é capaz de utilizar açúcares C5 e C6 é utilizada.

[0073] No contexto da presente invenção, a levedura oleaginosa refere-se a uma levedura que é capaz de acumular lipídeos intercelulares, de tal modo que os lipídeos atinjam pelo menos 15% (em peso) da biomassa total (em relação ao peso seco das células) da levedura quando é cultivada sob condições adequadas. Em uma modalidade preferencial, o micróbio oleaginoso é capaz de acumular pelo menos 20% (em peso) da biomassa total do microrganismo (em relação ao peso seco das células). Em uma modalidade ainda mais preferencial, a levedura oleaginosa é capaz de acumular pelo menos 35% (em peso) da biomassa total da levedura (em relação ao peso seco das células). Ainda, em outra modalidade preferencial, a levedura oleaginosa é capaz de acumular pelo menos cerca de 40% (em peso) em relação ao peso seco, ou, tal como, por exemplo, pelo menos cerca de 50% (em peso) em relação ao peso seco, tal como, por exemplo, pelo menos cerca de 60% (em peso) em relação ao peso seco, tal como, por exemplo, pelo menos cerca de 70% (em peso) em relação ao peso seco, tal como, por exemplo, pelo menos cerca de 80% (em peso) em relação ao peso seco de lipídeos da biomassa total (em relação ao peso seco das células).

Lipídeo microbiano ou lipídeo

[0074] No contexto da presente invenção "lipídeo microbiano", "lipídeo" ou "lipídeo intracelular" ou "produto de óleo" refere-se a uma substância graxa, cuja molécula compreende geralmente, como uma parte, uma cadeia de hidrocarboneto alifático, o qual se dissolve em solvestes orgânicos não polares, mas é pouco solúvel em água. Os líquidos são um grupo essencial de moléculas grandes em células vivas. Os lipídeos são, por exemplo, gorduras, óleos, ceras, ésteres de cera, esteróis, terpenos, isoprenoides, carotenoides, poli-hidroxialcanoatos, ácidos nucleicos, ácidos graxos, álcoois graxos, aldeídos graxos, ésteres de ácidos graxos, fosfolipídeos, glicolipídeos, esfingolipídeos e acilgliceróis, tais como tri-acilgliceróis, diacilgliceróis ou monoacilgliceróis. Os lipídeos preferenciais na presente invenção são as gorduras, óleos, ceras, acilgliceróis e ácidos graxos e seus derivados, em especial os ésteres de cera e os triacilgliceróis. No contexto da presente invenção, os lipídeos são sintetizados e acumulados nos micróbios (lipídeos intracelulares). Em outra modalidade da invenção, os lipídeos são sintetizados e excretados pelos micróbios (lipídeos extracelulares).

[0075] No escopo da presente invenção, a célula única de óleo é utilizada como sinônimo de lipídeos e gordura.

[0076] O termo "acilglicerol" refere-se a um éster de glicerol e ácidos graxos. Os acilgliceróis ocorrem naturalmente como gorduras e óleos graxos. Exemplos de acilgliceróis incluem triacilgliceróis (TAG, os triglicerídeos), diacilglicerídeos (diglicerídeos) e monoacilglicerídeos (monoglicerídeos).

Biomassa

[0077] No contexto da presente invenção, o termo "biomassa" (ou "massa celular") refere-se ao material biológico derivado de organismos vivos ou não vivos. A "biomassa de levedura" refere-se, assim, a biomassa derivada de levedura. A biomassa microbiana pode ser obtida a partir de uma única espécie de levedura ou a partir de um conjunto de diferentes espécies de levedura. A biomassa de levedura pode existir em um estado vivo ou não vivo. No contexto da presente invenção, a biomassa de levedura, a qual foi submetida a tratamento hidrotérmico de calor (HTT), está em um estado não vivo.

Massa celular residual

[0078] No contexto da presente invenção a "massa celular residual" ou "fração de biomassa residual" refere- se a um sólido, fração ou fluxo de material semissólido, o qual contém microrganismos a partir dos quais os lipídeos intracelulares foram recuperados.

Matéria seca

[0079] O "peso seco" (ou "MS", na sigla em inglês) refere-se aqui a matéria seca e é uma medição da massa de um material quando ele tiver sido submetido a um tratamento que, essencialmente, remove a água a partir do referido material (ou seja, o material está completamente seco). Tratamento hidrotérmico da suspensão aquosa que compreende biomassa microbiana e subsequente transformação

[0080] A suspensão aquosa que compreende a biomassa pode ser processada hidrotermicamente bem como ser proveniente do cultivo, ou a suspensão pode ser primeiro concentrada. Também é possível ajustar o pH da suspensão a este ponto. Um pH mais ácido permite uma maior dissolução do material sólido levando a flutuação com alguma levedura em temperaturas mais baixas do que em pH mais elevado. No entanto, o ajuste do pH não afeta o fator de severidade necessário para fazer com que estas leveduras sejam filtráveis. Em uma modalidade da invenção, o valor do pH da suspensão aquosa na etapa (i) é inferior a 6, preferivelmente inferior a 5. No entanto, em outro aspecto da invenção, a acidificação externa não é necessária de modo que um componente ácido seja adicionado com o intuito de ajustar ou regular o pH da mistura reacional.

[0081] O tratamento hidrotérmico da suspensão de biomassa pode ser conduzido com aquecimento direto ou indireto. No aquecimento direto, a suspensão pode ser aquecida com vapor. No aquecimento indireto, a suspensão pode ser aquecida por meio de uma parede em um recipiente contendo a suspensão ou a suspensão circula através de tubos ou conchas de um permutador de calor. O aquecimento pode ser realizado de maneira contínua fechada ou em um sistema de lote.

[0082] A suspensão aquosa tipicamente possui um teor de matéria seca de pelo menos 3%, preferivelmente de pelo menos 10%, tal como de 15% a 35%.

[0083] Após o processamento hidrotérmico, o material sólido contendo o óleo pode ser separado a partir do líquido por meio de métodos, tais como centrifugação ou filtração. Em uma modalidade da presente invenção, a etapa de separação (iii) é realizada por meio de centrifugação ou envolve uma etapa de centrifugação. Em outra modalidade, a etapa de separação (iii) é realizada por meio de filtração ou envolve uma etapa de filtração.

[0084] A filtração é preferencial com a utilização de uma prensa de filtro, de modo que um elevado teor de matéria seca do material sólido (até 70%) é obtido. Em uma modalidade da presente invenção, a fração de biomassa de levedura obtida a partir da etapa de separação (iii) possui um teor de matéria seca de pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%. Em uma modalidade preferencial, a fração de biomassa de levedura obtida a partir da etapa de separação (iii) possui um teor de matéria seca de pelo menos 65%. Em outra modalidade preferencial, a fração de biomassa de levedura obtida a partir da etapa de separação (iii) possui um teor de matéria seca de pelo menos 70%.

[0085] A biomassa úmida colhida pode ser lavada com água para reduzir ainda mais as impurezas do óleo extraído (confira o Exemplo 9). Deste modo, em uma modalidade, a fração de biomassa de levedura obtida a partir da etapa de tratamento hidrotérmico é submetida a uma etapa de lavagem com água antes da etapa de extração (v).

[0086] Antes da extração com solvente de hidrocarboneto, mais preferivelmente hexano, o material sólido é seco até um teor de matéria seca > 90%. Em uma modalidade da presente invenção, a fração de biomassa seca (da etapa (iv)) possui um teor de matéria seca de pelo menos 90%, preferivelmente de pelo menos 95%.

[0087] Qualquer tecnologia de secagem conhecida pode ser utilizada, mas a escolha pode afetar a qualidade do óleo extraído (confira o Exemplo 9). Verificou-se que a quantidade de impurezas no óleo microbiano extraído, especialmente a quantidade de nitrogênio pode ser ajustado através da otimização da secagem da biomassa antes da etapa de extração do óleo. Em uma modalidade da presente invenção, a etapa de secagem (iv) é realizada a uma temperatura abaixo de 100°C, preferivelmente abaixo de 90°C. Em uma modalidade da presente invenção, a etapa de extração (v) é realizada a uma temperatura abaixo de 90°C, preferivelmente abaixo de 50°C. Em outra modalidade, a etapa de secagem (iv) é realizada em vácuo e a uma temperatura da biomassa abaixo de 90°C, preferivelmente abaixo de 70°C. Em outra modalidade, a etapa de extração (v) é realizada a uma temperatura abaixo de 90°C, preferivelmente abaixo de 70°C.

[0088] Em uma modalidade da presente invenção, a etapa de extração (v) é realizada utilizando-se um solvente de hidrocarboneto, tal como um solvente de hidrocarboneto que compreende alcanos inferiores, preferivelmente alcanos alifático C2-C8.

[0089] A etapa de extração pode ser realizada utilizando-se qualquer tecnologia de extração conhecida. O processo de extração produz o óleo microbiano bruto, e o óleo extraído da biomassa residual necessita ser dessolventizado antes da posterior utilização. Lipídeos microbianos obteníveis através do método da presente invenção.

[0090] Tal como aqui mencionado, os requerentes surpreendentemente descobriram que os lipídeos recuperados através de um método que compreende o tratamento hidrotérmico de biomassa de levedura a uma temperatura acima de 160°C e subsequente extração com solvente contêm quantidades muito pequenas de impurezas de fósforo e metais.

[0091] Consequentemente, um aspecto adicional da presente invenção refere-se aos lipídeos microbianos que podem ser obtidos através do método da presente invenção.

[0092] Os requerentes descobriram que a quantidade de fósforo elementar é reduzida se os lipídeos microbianos são obtidos através do método da presente divulgação. Assim, uma modalidade da presente invenção refere-se aos lipídeos microbianos que podem ser obtidos através do método da presente invenção, em que a concentração de fósforo elementar é não mais do que 20 mg/kg de lipídeo microbiana, preferivelmente não mais do que 10 mg/kg, ainda mais preferivelmente não mais do que 5 mg/kg, mais preferivelmente não mais do que 1 mg de fósforo elementar/kg de lipídeos microbianos.

[0093] Os requerentes adicionalmente descobriram que a quantidade de nitrogênio elementar é reduzida se os lipídeos microbianos são obtidos através do método da presente divulgação. Assim, uma modalidade da presente invenção refere-se aos lipídeos microbianos que podem ser obtidos por meio do método da presente invenção, em que a concentração de nitrogênio elementar é não mais do que 600 mg de nitrogênio elementar/kg de lipídeos microbianos, mais preferivelmente não mais do que 200 mg/kg, mais preferivelmente não mais do que 100 mg de nitrogênio elementar /kg de lipídeos microbianos.

[0094] Em outra modalidade, a concentração elementar de ferro, sódio, sílica, cálcio, magnésio, manganês ou potássio no óleo microbiano é não mais do que 20 mg/kg, preferivelmente não mais do que 10 mg/kg, ainda mais preferivelmente não mais do que 5 mg/kg, mais preferivelmente não mais do que 1 mg/kg. Para exemplos, a concentração de ferro elementar no óleo microbiano é não mais do que 20 mg/kg, preferivelmente não mais do que 10 mg/kg, ainda mais preferivelmente não mais do que 5 mg/kg, mais preferivelmente não mais do que 1 mg/kg.

[0095] Para exemplos, a concentração de sódio elementar no óleo microbiano é não mais do que 20 mg/kg, preferivelmente não mais do que 10 mg/kg, ainda mais preferivelmente não mais do que 5 mg/kg, mais preferivelmente não mais do que 1 mg/kg. Para exemplos, a concentração de sílica elementar no óleo microbiano é não mais do que 20 mg/kg, preferivelmente não mais do que 10 mg/kg, ainda mais preferivelmente não mais do que 5 mg/kg, mais preferivelmente não mais do que 1 mg/kg. Para exemplos, a concentração de cálcio elementar no óleo microbiano é não mais do que 20 mg/kg, preferivelmente não mais do que 10 mg/kg, ainda mais preferivelmente não mais do que 5 mg/kg, mais preferivelmente não mais do que 1 mg/kg. Para exemplos, a concentração de magnésio elementar no óleo microbiano é não mais do que 20 mg/kg, preferivelmente não mais do que 10 mg/kg, ainda mais preferivelmente não mais do que 5 mg/kg, mais preferivelmente não mais do que 1 mg/kg. Para exemplos, a concentração de manganês elementar no óleo microbiano é não mais do que 20 mg/kg, preferivelmente não mais do que 10 mg/kg, ainda mais preferivelmente não mais do que 5 mg/kg, mais preferivelmente não mais do que 1 mg/kg. Para exemplos, a concentração de potássio elementar no óleo microbiano é não mais do que 20 mg/kg, preferivelmente não mais do que 10 mg/kg, ainda mais preferivelmente não mais do que 5 mg/kg, mais preferivelmente não mais do que 1 mg/kg.

[0096] Adicionalmente, outro aspecto refere-se a um produto de óleo microbiano. Na modalidade da presente invenção, a concentração de fósforo elementar no produto de óleo microbiano é não mais do que 20 mg/kg de lipídeo microbiana, preferivelmente não mais do que 10 mg/kg, ainda mais preferivelmente não mais do que 5 mg/kg, mais preferivelmente não mais do que 1 mg de fósforo elementar/kg de produto de óleo microbiano.

[0097] Em uma segunda modalidade da presente invenção, a concentração de nitrogênio elementar no produto de óleo microbiano é não mais do que 600 mg de nitrogênio elementar/kg de lipídeos microbianos, mais preferivelmente não mais do que 200 mg/kg, mais preferivelmente é não mais do que 100 mg de nitrogênio elementar/kg de produto de óleo microbiano.

[0098] Em outra modalidade, a concentração elementar de ferro, sódio, sílica, cálcio, magnésio, manganês ou potássio no produto de óleo microbiano é não mais do que 20 mg/kg, preferivelmente não mais do que 10 mg/kg, ainda mais preferivelmente não mais do que 5 mg/kg, mais preferivelmente não mais do que 1 mg/kg. Para exemplos, a concentração de ferro elementar no produto de óleo microbiano é não mais do que 20 mg/kg, preferivelmente não mais do que 10 mg/kg, ainda mais preferivelmente não mais do que 5 mg/kg, mais preferivelmente não mais do que 1 mg/kg. Para exemplos, a concentração de sódio elementar no produto de óleo microbiano é não mais do que 20 mg/kg, preferivelmente não mais do que 10 mg/kg, ainda mais preferivelmente não mais do que 5 mg/kg, mais preferivelmente não mais do que 1 mg/kg. Para exemplos, a concentração de sílica elementar no produto de óleo microbiano é não mais do que 20 mg/kg, preferivelmente não mais do que 10 mg/kg, ainda mais preferivelmente não mais do que 5 mg/kg, mais preferivelmente não mais do que 1 mg/kg. Para exemplos, a concentração de cálcio elementar no produto de óleo microbiano é não mais do que 20 mg/kg, preferivelmente não mais do que 10 mg/kg, ainda mais preferivelmente não mais do que 5 mg/kg, mais preferivelmente não mais do que 1 mg/kg. Para exemplos, a concentração de magnésio elementar no produto de óleo microbiano é não mais do que 20 mg/kg, preferivelmente não mais do que 10 mg/kg, ainda mais preferivelmente não mais do que 5 mg/kg, mais preferivelmente não mais do que 1 mg/kg. Para exemplos, a concentração de manganês elementar no produto de óleo microbiano é não mais do que 20 mg/kg, preferivelmente não mais do que 10 mg/kg, ainda mais preferivelmente não mais do que 5 mg/kg, mais preferivelmente não mais do que 1 mg/kg. Para exemplos, a concentração de potássio elementar no produto de óleo microbiano é não mais do que 20 mg/kg, preferivelmente não mais do que 10 mg/kg, ainda mais preferivelmente não mais do que 5 mg/kg, mais preferivelmente não mais do que 1 mg/kg.

[0099] A invenção é ilustrada pelos seguintes itens não limitativos:

[0100] Item 1. Um método para recuperação de lipídeos microbianos a partir de biomassa de levedura oleaginosa, método que compreende as etapas de: (i) fornecer uma suspensão aquosa que compreende um caldo de fermentação contendo biomassa de levedura oleaginosa; (ii) submeter a referida suspensão a um tratamento hidrotérmico a uma temperatura de pelo menos 160°C durante 1 segundo a 360 minutos a uma pressão superior a 5 bar; (iii) submeter a suspensão tratada hidrotermicamente a uma fase de separação para obter uma fração líquida e uma fração de biomassa de levedura; (iv) submeter a fração de biomassa de levedura a uma etapa de secagem para obter uma fração de biomassa de levedura seca; (v) submeter a fração de biomassa seca a uma etapa de extração com um solvente líquido para produzir uma fração líquida que compreende lipídeos microbianos e uma fração sólida que compreende uma fração de biomassa de levedura residual; (vi) recuperar os lipídeos microbianos a partir da fração líquida da etapa (v); (vii) opcionalmente, isolar a fração de biomassa residual a partir do produto da etapa (v).

[0101] Item 2. O método, de acordo com o item 1, em que o caldo de fermentação é obtido a partir de cultura de leveduras oleaginosas em um meio de cultura que compreende material lignocelulósico.

[0102] Item 3. O método, de acordo com o item 1, em que o caldo de fermentação é obtido a partir de cultura de leveduras oleaginosas em um meio de cultura que compreende hidrolisado de lignocelulose.

[0103] Item 4. O método, de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 3, em que a fração de biomassa de levedura obtida a partir da etapa de separação possui um teor de matéria seca de pelo menos 50%, preferivelmente de pelo menos 60%.

[0104] Item 5. O método, de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 4, em que a fração de biomassa seca possui um teor de matéria seca de pelo menos 90%, preferivelmente de pelo menos 95%.

[0105] Item 6. O método, de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 5, em que o tratamento térmico é realizado em um recipiente fechado.

[0106] Item 7. O método, de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 6, em que o tratamento hidrotérmico é conduzido sob condições que correspondem a um fator de severidade LogR0 de pelo menos 3,5, preferivelmente de pelo menos 3,9.

[0107] Item 8. O método, de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 7, em que a biomassa de levedura possui um teor de lipídeos de pelo menos 20%, preferivelmente de pelo menos 30%, mais preferivelmente de pelo menos 35% em peso da massa de células.

[0108] Item 9. O método, de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 8, em que a fração de biomassa de levedura obtida a partir da etapa de tratamento hidrotérmico é submetida a etapa de lavagem com água antes da etapa de extração.

[0109] Item 10. O método, de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 9, em que a suspensão aquosa possui um teor de matéria seca de pelo menos 3%, preferivelmente de pelo menos 10%.

[0110] Item 11. O método, de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 10, em que a levedura é do gênero Rhodosporidium, Rhodotorula, Lipomyces, ou Cryptococcus ou Saccharomyces.

[0111] Item 12. O método, de acordo com qualquer um dos itens de 5 a 11, em que o solvente líquido é um solvente de hidrocarboneto que compreende alcanos inferiores, preferivelmente alcanos alifáticos C2-C8.

[0112] Item 13. O método, de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a separação (iii) é realizada por meio de centrifugação ou envolve uma etapa de centrifugação.

[0113] Item 14. O método, de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a separação (iii) é realizada por meio de filtração ou envolve uma etapa de filtração.

[0114] Item 15. O método, de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a etapa de secagem (iv) é realizada em vácuo e a uma temperatura da biomassa abaixo de 90°C, preferivelmente abaixo de 70°C.

[0115] Item 16. O método, de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a etapa de extração (v) é realizada a uma temperatura abaixo de 90°C, preferivelmente abaixo de 70°C.

[0116] Item 17. O método, de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o valor do pH da suspensão aquosa na etapa (i) é inferior a 6, preferivelmente inferior a 5.

[0117] Item 18. A biomassa residual é obtida através do método de acordo com qualquer dos itens de 1 a 17.

[0118] Item 19. Um método para produção de lipídeos microbianos, em que o método compreende: (a) fornecer um meio de cultura; (b) fornecer um caldo de fermentação através da inoculação do meio de cultura com uma levedura oleaginosa para produzir a biomassa de levedura oleaginosa; (c) incubar o referido meio inoculado com a referida levedura oleaginosa, permitindo que o lipídeo se acumule; (d) recuperar os lipídeos microbianos a partir da referida biomassa de levedura oleaginosa com o método de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 18.

[0119] Item 20. O método, de acordo com o item 19, em que os nutrientes compreendidos na fração líquida obtida a partir da etapa de separação são reciclados para o meio de cultura.

[0120] Item 21. Os lipídeos microbianos podem ser obtidos através do método de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 20.

[0121] Item 22. Um produto de óleo microbiano, em que o óleo não compreenda mais do que 20 mg/kg de fósforo elementar, preferivelmente não mais do que 10 mg/kg, ainda mais preferivelmente não mais do que 5 mg/kg, mais preferivelmente não mais do que 1 mg/kg de fósforo elementar.

[0122] Item 23. Um produto de óleo microbiano, de acordo com o item 22, em que o óleo não compreenda mais do que 600 mg/kg de nitrogênio elementar, mais preferivelmente não mais do que 200 mg/kg, mais preferivelmente não mais do que 100 mg/kg de nitrogênio elementar.

[0123] Item 24. Um produto de óleo microbiano, de acordo com o item 22 ou 23, em que o óleo não compreenda mais do que 20 mg/kg, preferivelmente não mais do que 10 mg/kg, ainda mais preferivelmente não mais do que 5 mg/kg, mais preferivelmente não mais do que 1 mg/kg de qualquer ferro, sódio, sílica, cálcio, magnésio, manganês ou potássio elementar.

[0124] A presente invenção também se refere a modalidades específicas de acordo com os seguintes Artigos: Artigos 1. Um método para recuperação de lipídeos microbianos a partir de biomassa de levedura oleaginosa, método que compreende as etapas de: (i) fornecer uma suspensão aquosa que compreende um caldo de fermentação contendo biomassa de levedura oleaginosa; (ii) submeter a referida suspensão a um tratamento hidrotérmico a uma temperatura de pelo menos 160°C durante 1 segundo a 360 minutos a uma pressão superior a 5 bar; (iii) submeter a suspensão tratada hidrotermicamente a uma etapa de separação para obter uma fração líquida e uma fração de biomassa de levedura; (iv) submeter a fração de biomassa de levedura a uma etapa de secagem para obter uma fração de biomassa de levedura seca; (v) submeter a fração de biomassa seca a uma etapa de extração com um solvente líquido para produzir uma fração líquida que compreende lipídeos microbianos e uma fração sólida que compreende uma fração de biomassa de levedura residual; (vi) recuperar os lipídeos microbianos a partir da fração líquida da etapa (v); (vii) opcionalmente, isolar a fração de biomassa residual a partir do produto da etapa (v). 2. O método, de acordo com o artigo 1, em que o caldo de fermentação é obtido a partir da cultura de leveduras oleaginosas em um meio de cultura que compreende hidrolisado de lignocelulose. 3. O método de acordo com qualquer um dos artigos 1 ou 2, em que a fração de biomassa de levedura obtida a partir da etapa de separação possui um teor de matéria seca de pelo menos 50%, preferivelmente de pelo menos 60%. 4. O método, de acordo com qualquer um dos artigos de 1 a 3, em que a fração de biomassa seca possui um teor de matéria seca de pelo menos 90%, preferivelmente de pelo menos 95%. 5. O método, de acordo com qualquer um dos artigos de 1 a 4, em que o tratamento hidrotérmico é conduzida sob condições que correspondem a um fator de severidade LogR0 de pelo menos 3,5, preferivelmente de pelo menos 3,9. 6. O método, de acordo com qualquer um dos artigos de 1 a 5, em que a biomassa de levedura possui um teor em lipídeos de pelo menos 20%, preferivelmente de pelo menos 30%, mais preferivelmente de pelo menos 35% em peso da massa de células. 7. O método, de acordo com qualquer um dos artigos de 1 a 6, em que a suspensão aquosa possui um teor de matéria seca de pelo menos 3%, preferivelmente de pelo menos 10%. 8. O método, de acordo com qualquer um dos artigos de 1 a 7, em que a levedura é do gênero Rhodosporidium, Rhodotorula, Lipomyces, Cryptococcus ou Saccharomyces. 9. O método, de acordo com qualquer um dos artigos anteriores, em que a separação (iii) é realizada por meio de centrifugação ou envolve uma etapa de centrifugação. 10. O método, de acordo com qualquer um dos artigos anteriores, em que a separação (iii) é realizada por meio de filtração ou envolve uma etapa de filtração. 11. O método, de acordo com qualquer um dos artigos anteriores, em que a etapa de secagem (iv) é realizada em vácuo e a uma temperatura da biomassa de abaixo de 90°C, preferivelmente abaixo de 70°C. 12. O método, de acordo com qualquer um dos artigos anteriores, em que a etapa de extração (v) é realizada a uma temperatura abaixo de 90°C, preferivelmente abaixo de 70°C. 13. O método, de acordo com qualquer um dos artigos anteriores, em que o valor do pH da suspensão aquosa na etapa (i) é inferior a 6, preferivelmente inferior a 5. 14. A biomassa residual obtenível através do método de acordo com qualquer um dos artigos de 1 a 13. 15. Os lipídeos microbianos obteníveis através do método de acordo com qualquer um dos artigos de 1 a 13. 16. Um produto de óleo microbiano que compreende não mais do que 20 mg/kg de fósforo elementar, preferivelmente não mais do que 10 mg/kg, ainda mais preferivelmente não mais do que 5 mg/kg, mais preferivelmente não mais do que 1 mg/kg de fósforo elementar. 17. Um produto de óleo microbiano, de acordo com o artigo 16, em que o óleo compreende não mais do que 600 mg/kg de nitrogênio elementar, mais preferivelmente não mais do que 200 mg/kg, mais preferivelmente não mais do que 100 mg/kg de nitrogênio elementar. 18. Um produto de óleo microbiano, de acordo com o artigo 16 ou 17, em que o óleo compreende não mais do que 20 mg/kg, preferivelmente não mais do que 10 mg/kg, ainda mais preferivelmente não mais do que 5 mg/kg, mais preferivelmente não mais do que 1 mg/kg de qualquer de ferro, sódio, sílica, cálcio, magnésio, manganês ou potássio elementar.

Exemplos

[0125] A invenção é ilustrada pelos seguintes exemplos não limitativos. A invenção pode ser aplicada a outros microrganismos diferentes dos ilustrados nos Exemplos. Deverá ser entendido que as modalidades oferecidas na descrição acima e nos exemplos são apenas para fins ilustrativos, e que várias alterações e modificações são possíveis dentro do escopo da invenção. Exemplo 1 Cultivo de biomassa de Rhodosporidium em açúcares puros para experimentos de colheita térmica

[0126] A cepa CBS 8587 de Rhodosporidium toruloides (ou outras cepas de R. toruloides, que estão prontamente disponíveis a partir de coleções de culturas microbianas reconhecidas) foi cultivada sob arejamento em um fermentador piloto. A fermentação foi efetuada como fermentação de lote alimentado com glicose como fonte de carbono. Após 24 horas de fase de lote, o xarope de glicose foi adicionado ao fermentador periodicamente durante todas 143 horas de cultura. O meio de crescimento foi suplementado com extrato de levedura (8 g/L), (NH4)2SO4 (3 g/L), MgCl2 (2 g/L), K2HPO4 (9 g/L) e CaCl2 (0,4 g/L) e traços minerais de ZnSO4 (0,0003 g/L), CuCl (0,0002 g/L) e MnCl2 (0,03 g/L). No final da cultura, o teor de óleo da biomassa foi de 46,8% do peso seco da célula. A suspensão de biomassa resultante foi pasteurizada e utilizada nos ensaios de colheita térmica nos exemplos seguintes. Exemplo 2 Cultivo de biomassa de Rhodosporidium em açúcares lignocelulósicos para os experimentos de colheita térmica Lote Número 1:

[0127] A cepa CBS 8587 de Rhodosporidium toruloides (ou outras cepas de R. toruloides, que estão prontamente disponíveis a partir de coleções de culturas microbianas reconhecidas) foi cultivada sob arejamento em um fermentador piloto. A fermentação foi efetuada como fermentação do lote alimentado com xarope de hidrolisado lignocelulósico como fonte de carbono. Após 12 horas de fermentação do lote alimentado, o xarope de hidrolisado lignocelulósico foi adicionado ao fermentador periodicamente durante todas as 144 horas de cultura. O meio de crescimento foi suplementado com extrato de levedura (17 g/L), (NH4)2SO4 (2,1 g/L), (NH4)2HPO4 (2,1 g/L), MgCl2 (3,3 g/L), K2HPO4 (5 g/L) e CaCl2 (0,2 g/L) e traços minerais de ZnSO4 (0,0005 g/L), CuCl (0,0003 g/L) e MnCl2 (0,05 g/L). No final da cultura, o teor de óleo da biomassa foi de 34,6% do peso seco da célula. A suspensão de biomassa resultante foi pasteurizada e utilizada nos ensaios de colheita térmica nos exemplos seguintes. Lote Número 2:

[0128] A cepa CBS 8761 de Rhodosporidium toruloides (ou outras cepas de R. toruloides, que estão prontamente disponíveis a partir de coleções de culturas microbianas reconhecidas) foi cultivada sob arejamento em um fermentador piloto. A fermentação foi efetuada como fermentação do lote alimentado com xarope de hidrolisado lignocelulósico como fonte de carbono. O xarope de hidrolisado lignocelulósico foi adicionado ao fermentador periodicamente durante todas as 154 horas de cultura. O meio de crescimento foi suplementado com extrato de levedura (8,3 g/L), (NH4)2SO4 (1,3 g/L), (NH4)2HPO4 (2,0 g/L), MgCl2 (1,7 g/L), KH2PO4 (1,8 g/L) e traços minerais de ZnSO4 (0,0005 g/L), CuCl2 (0,0003 g/L) e MnCl2 (0,05 g/L), Na2MoO4 (0,0003 g/L). No final da cultura, o teor de óleo da biomassa foi de 47,7% do peso seco da célula. A suspensão de biomassa resultante foi pasteurizada e utilizada nos ensaios de colheita térmica nos exemplos seguintes. Exemplo 3 Cultivo de biomassa de Cryptococcus em açúcar puro para experimentos de colheita térmica

[0129] Três lotes de biomassa de Cryptococcus foram utilizadas nos ensaios de colheita térmica. Lote Número 1:

[0130] A cepa CBS 5324 de Cryptococcus curvatus (ou outras cepas de C. curvatus, que estão prontamente disponíveis a partir de coleções de culturas microbianas reconhecidas) foi cultivada sob arejamento em um fermentador piloto. A fermentação foi efetuada como fermentação do lote alimentado com glicose como fonte de carbono. O xarope de glicose foi adicionado ao fermentador periodicamente durante todas as 119 horas de cultura. O meio de crescimento foi suplementado com extrato de levedura (10 g/L), extrato de malte (3 g/L), (NH4)2SO4 (1,5 g/L), (NH4)2HPO4 (1,5 g/L), MgCl2 (1,8 g/L), KH2PO4 (3 g/L), K2HPO4 (1 g/L) e CaCl2 (0,4 g/L) e traços minerais de ZnSO4 (0,0003 g/L), CuCl (0,0002 g/L) e MnCl2 (0,03 g/L). No final da cultura, o teor de óleo da biomassa foi de 38,5% do peso seco da célula. A suspensão de biomassa resultante foi pasteurizada e utilizada nos ensaios de colheita térmica nos exemplos seguintes. Lote Número 2:

[0131] A cepa CBS 5324 TKK mutante 40 de Cryptococcus curvatus (ou outras cepas de C. curvatus, que estão prontamente disponíveis a partir de coleções de culturas microbianas reconhecidas) foi cultivada sob arejamento em um fermentador piloto. A fermentação foi efetuada como fermentação de lote alimentado com glicose como fonte de carbono. O xarope de glicose foi adicionado ao fermentador periodicamente durante todas as 114 horas de cultura. O meio de crescimento foi suplementado com extrato de levedura (6 g/L), (NH4)2SO4 (1,8 g/L), (NH4)2HPO4 (1,8 g/L), MgCl2 (1,8 g/L), KH2PO4 (3 g/L) e CaCl2 (0,3 g/L) e traços minerais de ZnSO4 (0,0003 g/L), CuCl (0,0002 g/L) e MnCl2 (0,03 g/L). No final da cultura, o teor de óleo da biomassa foi de 47,9% do peso seco da célula. A suspensão de biomassa resultante foi pasteurizada e utilizada nos ensaios de colheita térmica nos exemplos seguintes. Lote Número 3:

[0132] A cepa CBS 5324 TKK mutante 40 de Cryptococcus curvatus (ou outras cepas de C. curvatus, que estão prontamente disponíveis a partir de coleções de culturas microbianas reconhecidas) foi cultivada sob arejamento em um fermentador piloto. A fermentação foi efetuada como fermentação de lote alimentado com glicose como fonte de carbono. O xarope de glicose foi adicionado ao fermentador periodicamente durante todas as 90 horas de cultivo. O meio de crescimento foi suplementado com extrato de levedura (6 g/L), (NH4)2SO4 (1,8 g/L), (NH4)2HPO4 (1,8 g/L), MgCl2 (1,8 g/L), KH2PO4 (3 g/L) e CaCl2 (0,3 g/L) e traços minerais de ZnSO4 (0,0003 g/L), CuCl (0,0002 g/L) e MnCl2 (0,03 g/L). No final da cultura, o teor de óleo da biomassa foi de 40,3% do peso seco da célula. A suspensão de biomassa resultante foi pasteurizada e utilizada nos ensaios de colheita térmica nos exemplos seguintes. Exemplo 4 Efeito do tratamento hidrotérmico sobre a capacidade de filtração das biomassas de levedura

[0133] As condições de tratamento térmico (temperatura e tempo de tratamento, como variáveis) são expressas utilizando-se o fator de severidade empregado para simular a extração de carboidratos a partir de biomassas lignocelulósicas. O fator de severidade LogR0 é calculado utilizando-se a Fórmula (1) (Pedersen e Meyer, 2010).

[0134] As suspensões aquosas de levedura foram tratadas com diferentes fatores de severidade em um reator de pressão de 1L (Parr Instruments). O reator foi aquecido, sob agitação (500 rpm) e amostras foram retiradas sob certos valores de severidade LogR0. A capacidade de filtração das amostras retiradas foi testada com um filtro de 2 μm. O efeito de HTT sobre a capacidade de filtração das suspensões de biomassa de levedura é mostrado nas Tabelas de 1 a 3. Tabela 1. Capacidade de filtração da biomassa de levedura Rhodosporidium do Exemplo 1 Peso seco de sólidos 5,93% em peso, pH 5,75

Tabela 2. Capacidade de filtração da biomassa de levedura Rhodosporidium do Exemplo 2, lote 1

Tabela 3. Capacidade de filtração da biomassa de levedura Cryptococcus do Exemplo 3, lote 1

[0135] Com base nos resultados do Exemplo 4, o fator de severidade necessário do tratamento hidrotérmico (HTT) para fazer com que a suspensão aquosa contendo biomassa de levedura seja filtrável depende do gênero de levedura e, em certa medida, do valor do pH da suspensão aquosa. Geralmente um fator de severidade LogR0 > 3,9 de HTT é necessário para fazer com que a suspensão aquosa contendo biomassa de levedura seja filtrável. Exemplo 5 Efeito do tratamento hidrotérmico em relação ao rendimento da extração de óleo microbiano

[0136] A suspensão de levedura Rhodosporidium do Exemplo 1 foi submetida a diferentes tratamentos hidrotérmicos para estudar o efeito da severidade de HTT em relação ao rendimento de extração de lipídeos.

[0137] Em primeiro lugar a suspensão de biomassa pasteurizada (80°C, 15 minutos) foi centrifugada com a centrifuga Sorvall a 10.000 rpm/20 minutos para se obter uma suspensão de sólidos com teor de matéria seca de 25%. O material sólido resultante foi seco até um teor de matéria sólida seca de 98%, criando assim uma biomassa de levedura colhida sem o uso de tratamento hidrotérmico. Esta biomassa é nomeada "sem HTT" na Tabela 4 deste exemplo.

[0138] Além disso, a suspensão de levedura do Exemplo 1 foi tratada hidrotermicamente utilizando diferentes fatores de severidade. Este tratamento hidrotérmico foi realizado através do tratamento da suspensão de biomassa de levedura no reator de pressão fechado (reator de Parr de 1 litro, agitação de 500 rpm) durante um determinado tempo e temperatura, e arrefecida até à temperatura ambiente. Os sólidos de biomassa foram filtrados a partir da suspensão de biomassa de levedura tratada com filtro de Buchner (filtro de 2 μm) e os sólidos separados foram secos até um teor de matéria sólida seca de 95%.

[0139] Os sólidos de biomassa de cada tratamento hidrotérmico foram moídos em moinho laboratorial Retch. Os sólidos moídos foram extraídos com heptano a 50°C (proporção de sólido/heptano 1:5 em peso) durante 1 hora, centrifugados para separar os sólidos e a fase de óleo-solvente. Os sólidos foram adicionalmente lavados com heptano fresco, centrifugados e a fase de óleo-solvente separada foi combinada com a fase de óleo-solvente da etapa de extração. O solvente foi evaporado para se obter uma fração de óleo microbiano bruto.

[0140] Os rendimentos de extração a partir de biomassa de levedura seca inicial (denominada "sem HTT") e as biomassas hidrotermicamente tratadas são apresentados na Tabela 4. Como pode ser visto a partir da Tabela 4, o rendimento de óleo a partir da biomassa seca inicial é baixo devido à quebra celular ineficiente. O tratamento da biomassa a 140°C/15 minutos também não é suficiente para romper as células e o rendimento de óleo é igualmente pobre. Após HTT em condições suficientes severas (LogR0 > 3,6), todo o óleo na biomassa pode ser extraído.

[0141] Quando a temperatura da reação é de 140°C, a pressão é de cerca de 5 bar. Quando a temperatura é de 160°C, a pressão é de 6,2 bar a 6,8 bar. Quando a temperatura é de 180°C, a pressão é de 10,3 bar a 11,0 bar. Quando a temperatura é de 210°C, a pressão é de 19,6 bar. Tabela 4. Rendimentos de óleo de levedura Rhodosporidium toruloides cultivada em açúcar puro após diferentes tratamentos hidrotérmicos, óleo extraído com heptano.

• Óleo na biomassa original = total de ácidos graxos analisados por GC. Exemplo 6 Efeito do tratamento hidrotérmico na qualidade do óleo extraído a partir da biomassa de levedura

[0142] As impurezas foram analisadas na forma três conjuntos de óleos microbianos brutos. No primeiro exemplo comparativo, os óleos microbianos brutos extraídos a partir da biomassa de Rhodosporidium, tal como descrito no Exemplo 5 anterior, foram analisados em relação às impurezas (metais, fósforo) por ICP.

[0143] No segundo exemplo comparativo, os óleos microbianos brutos a partir dos lotes 1 e 2 de biomassa de Cryptococcus cultivada em açúcares puros, tal como descrito no Exemplo 3 e similarmente tratada hidrotermicamente como as biomassas de Rhodosporidium no Exemplo 5, foram analisadas para as mesmas impurezas.

[0144] No terceiro exemplo comparativo, os óleos microbianos brutos a partir dos lotes 1 e 2 das biomassas de Rhodosporidium cultivadas em açúcares lignocelulósicos, tal como descrito no Exemplo 2 e, similarmente tratada hidrotermicamente como as biomassas de Rhodosporidium no Exemplo 5, foram analisadas para as impurezas.

[0145] O óleo extraído a partir da biomassa tratada hidrotermicamente possui boa qualidade, assim como o óleo a partir da biomassa não tratada hidrotermicamente. Em termos de algumas impurezas (P, Ca, Mg e N), o óleo tratado hidrotermicamente é ainda mais puro do que o óleo microbiano, que não foi submetido a um tratamento hidrotérmico, como pode ser visto a partir dos resultados das análises apresentadas nas Tabelas 5, 6 e 7. Para as leveduras Cryptococcus e Rhodosporidium, a colheita térmica parece ser muito eficaz na produção de óleo com quantidades insignificantes de metais e fósforo e, assim, um pré- tratamento mínimo é necessário antes da conversão catalítica de óleo microbiano em combustíveis ou produtos químicos.

[0146] Alterando as condições de tratamento hidrotérmico, especialmente a temperatura, é possível alterar a qualidade do óleo. Ao reduzir a temperatura, menos compostos nitrogenados são introduzidos no óleo, embora, o teor de nitrogênio na água residual é tão alto quanto em tratamentos de calor feitos a uma temperatura mais elevada. Tabela 5. Comparação entre o óleo microbiano extraído a partir de biomassa de Rhodosporidium toruloides cultivada em açúcar, tratada hidrotermicamente e não tratada hidrotermicamente do Exemplo 5

Tabela 6. Comparação entre o óleo microbiano extraído a partir de biomassa de Cryptococcus curvatus cultivada em açúcar, tratada hidrotermicamente e não tratada hidrotermicamente do Exemplo 3

Tabela 7. Comparação entre o óleo microbiano extraído a partir de biomassa de Rhodosporidium toruloides cultivada em lignocelulose, tratada hidrotermicamente e não tratada hidrotermicamente do Exemplo 2.

Exemplo 7 Efeito do tratamento hidrotérmico na remoção de material de lignocelulose dissolvido a partir da fase aquosa com levedura cultivada em hidrolisado de lignocelulose

[0147] A suspensão de levedura Rhodosporidium toruloides do lote 1 do Exemplo 2 foi tratada hidrotermicamente em escala laboratorial em diferentes severidades. Após este processo, os sólidos foram removidos por meio de filtração, criando assim um fluxo de líquido sobrenadante. Como primeiro caso comparativo, o sobrenadante líquido foi recuperado a partir da suspensão de levedura sem tratamento hidrotérmico através de centrifugação e sem pasteurização da suspensão ("sem HTT" na Tabela 8). Como um segundo caso comparativo, a suspensão de levedura foi primeiramente pasteurizada e o sobrenadante líquido foi recuperado a partir da suspensão de levedura sem tratamento hidrotérmico através de centrifugação ("Pasteurização 105°C/5 minutos na Tabela 8).

[0148] A Tabela 8 mostra como as características do sobrenadante são alteradas pelas condições de diferentes processamentos. A demanda química de oxigênio (“COD”, na sigla em inglês) do sobrenadante líquido foi reduzida em 21% no tratamento hidrotérmico da suspensão de levedura a 180°C/1 hora e em 47% no tratamento hidrotérmico a 250°C/1 hora. Quanto maior a severidade do tratamento hidrotérmico, maior será a quantidade de material dissolvido presente nos meios de cultura solidificada durante os tratamentos, e esta pode ser recuperada com a biomassa de levedura por meio de filtração. Em contraste, a mera pasteurização libera material a partir da biomassa para o líquido, criando assim mais material líquido dissolvido, tal como mostrado na Tabela 8 na linha chamada "Peso seco-% do inicial".

[0149] Nem todo o material dissolvido é transferido para a fração de biomassa sólida separável, uma vez que partes do material dissolvido e da biomassa são gaseificadas durante o tratamento térmico. A quantidade de gases é de 2% a 5% da matéria seca inicial e os gases consistem principalmente em monóxido de carbono, dióxido de carbono, oxigênio e vários hidrocarbonetos. Tabela 8. Resultados das análises sobre os líquidos sobrenadantes separados após o tratamento hidrotérmico em condições diferentes.

Exemplo 8 Efeito da lavagem da biomassa microbiana tratada hidrotermicamente sobre a qualidade do óleo extraído

[0150] Este exemplo mostra que uma lavagem com água da biomassa de levedura tratada hidrotermicamente antes da extração do óleo reduz eficazmente a quantidade de nitrogênio e de metais no óleo, tal como mostrado na Tabela 9. Isto é muito benéfico e diminui significativamente a necessidade de purificação e pode até mesmo eliminar a necessidade da etapa de pré-tratamento antes da conversão catalítica de óleo microbiano bruto em combustíveis ou produtos químicos. Tabela 9. Comparação entre o óleo de levedura extraído a partir da biomassa tratada hidrotermicamente, com e sem lavagem com água

Exemplo 10 Efeito das temperaturas de secagem e de extração do óleo sobre a qualidade do óleo extraído

[0151] Verificou-se que a quantidade de impurezas no óleo microbiano extraído, especialmente a quantidade de nitrogênio pode ser ajustada através da otimização da secagem da biomassa antes da etapa de extração do óleo (Tabela 10) e através da otimização da temperatura de extração do óleo (Tabela 11). Os resultados mostram que temperaturas de secagem e de extração mais baixas são benéficas para a qualidade do óleo extraído. Tabela 10. Comparação entre o óleo microbiano extraído a partir da biomassa de levedura tratada hidrotermicamente utilizando n-hexano após a utilização de diferentes condições de secagem.

Tabela 11. Comparação entre o óleo microbiano extraído a partir de biomassa de levedura tratada hidrotermicamente com diferentes temperaturas de extração utilizando n-heptano como solvente

[0152] Os resultados deste exemplo mostram que a secagem da biomassa tratada hidrotermicamente com temperaturas inferiores a 85°C pode reduzir significativamente a quantidade de nitrogênio no óleo microbiano extraído. Também é mostrado que, mediante a realização da extração de óleo em temperatura ambiente (“RT”, na sigla em inglês), a quantidade de nitrogênio no óleo microbiano extraído é, além disso, reduzida em comparação com a extração em temperaturas mais elevadas. Exemplo 11 Efeito do ajuste do pH sobre a colheita hidrotérmica e sobre a qualidade do óleo extraído

[0153] Durante a colheita hidrotérmica verificou-se que o pH da suspensão diminui naturalmente, como pode ser visto a partir da Tabela 12. Também é possível ajustar o pH da suspensão antes da colheita hidrotérmica, o que aumenta a quantidade de biomassa que se torna solúvel na suspensão durante o período de aquecimento. Com algumas biomassas de leveduras testadas, tornar a biomassa mais ácida antes de HTT faz com que as células de levedura flutuem em tratamentos mais curtos e com temperaturas mais baixas. Embora, esta flutuação mais cedo e mais fácil não altere a severidade necessária para fazer com que estas leveduras sejam filtrável e, assim, o ajuste do pH cria uma vantagem apenas se a separação das células de levedura com centrifugação for considerada necessária. Deverá ser notado, neste caso, que o fator de severidade não é suficientemente alto para permitir a quebra eficiente das células e, assim, o rendimento de óleo permanece baixo.

[0154] O ajuste do pH também pode exercer um efeito sobre a qualidade do óleo final. Na Tabela 13, o fator de severidade do tratamento hidrotérmico para ambas as suspensões de biomassa foi o mesmo, mas o pH da outra suspensão de biomassa foi ajustado para ácido antes do tratamento hidrotérmico. O teor de nitrogênio no óleo extraído a partir da biomassa neste último é ligeiramente maior. Tabela 12. Efeito do ajuste do pH das suspensões de biomassa (Rhodosporidium toruloides cultivadas em açúcar) antes de HTT sobre a taxa de dissolução da biomassa para a fase líquida.

Tabela 13. Efeito do ajuste do pH da suspensão de biomassa (Cryptococcus curvatus cultivada em açúcar, lote 2) antes de HTT sobre a qualidade do óleo.

Claims

1. Método para recuperação de lipídeos microbianos a partir de biomassa de levedura oleaginosa caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (i) fornecer uma suspensão aquosa que compreende um caldo de fermentação contendo biomassa de levedura oleaginosa; (ii) submeter a referida suspensão a um tratamento hidrotérmico a uma temperatura de pelo menos 160°C durante 1 segundo a 360 minutos a uma pressão superior a 5 bar (500000 Pa); (iii) submeter a suspensão tratada hidrotermicamente a uma etapa de separação para obter uma fração líquida e uma fração de biomassa de levedura; (iv) submeter a fração de biomassa de levedura a uma etapa de secagem para obter uma fração de biomassa de levedura seca, em que a temperatura de secagem é inferior a 85oC; (v) submeter a fração de biomassa seca a uma etapa de extração com um solvente líquido para produzir uma fração líquida que compreende lipídeos microbianos e uma fração sólida que compreende uma fração de biomassa de levedura residual, em que a etapa de extração é conduzido à temperatura ambiente; (vi) recuperar os lipídeos microbianos a partir da fração líquida da etapa (v); e (vii) opcionalmente, isolar a fração de biomassa residual a partir do produto da etapa (v).

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o caldo de fermentação é obtido a partir da cultura de leveduras oleaginosas em um meio de cultura que compreende hidrolisado de lignocelulose.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a fração de biomassa de levedura separada na etapa (iii) é lavada com água antes da secagem na etapa (iv) e/ou extração na etapa (v).

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a fração de biomassa de levedura, obtida a partir da etapa de separação, possui um teor de matéria seca de pelo menos 50% (p/p).

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a fração de biomassa seca possui um teor de matéria seca de pelo menos 90% (p/p).

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o tratamento hidrotérmico é conduzido sob condições que correspondem a um fator de severidade LogR0 de pelo menos 3,5.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o tratamento hidrotérmico é conduzido sob condições que correspondem a um fator de severidade LogR0 de 3,5 a 5,5.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a biomassa de levedura possui um teor de lipídeos de pelo menos 20% em peso da massa de células.

9. Método, de acordo a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a suspensão aquosa possui um teor de matéria seca de pelo menos 3% (p/p).

10. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a levedura é do gênero Rhodosporidium, Rhodotorula, Lipomyces, Cryptococcus ou Saccharomyces.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a separação (iii) é realizada por centrifugação ou envolve uma etapa de centrifugação.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a separação (iii) é realizada por meio de filtração ou envolve uma etapa de filtração.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de secagem (iv) é realizada em vácuo e a uma temperatura da biomassa abaixo de 90°C.

14. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a etapa de extração (v) é realizada a uma temperatura abaixo de 90°C.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o valor do pH da suspensão aquosa na etapa (i) é inferior a 6.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método não compreende uma extração da fração líquida separada na etapa (iii).

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tratamento hidrotérmico na etapa (ii) é realizado a uma pressão no intervalo de 6 bar (600000 Pa) a 25 bar (2500000 Pa).

18. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o tratamento hidrotérmico na etapa (ii) é realizado no intervalo de temperatura de 180 oC a 210 oC.

19. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o tratamento hidrotérmico na etapa (ii) é realizado com temperaturas e pressões distribuídas de acordo com quando a temperatura da reação é de 160 oC e a pressão é de 6,2 bar (620000 Pa) a 6,8 bar (680000 Pa).

20. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o rendimento dos óleos ou lipídeos extraídos se encontra no intervalo de pelo menos 70% (p/p) com base no teor dos óleos ou lipídeos presentes na biomassa.

21. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a fração de biomassa de levedura obtida pela etapa de separação possui um teor de matéria seca de pelo menos 60% (p/p); em que a fração de biomassa seca possui um teor de matéria seca de pelo menos 95% (p/p); em que a fração de biomassa de levedura possui um teor de lipídios de pelos menos 35% em peso de massa celular; em que a suspensão aquosa possui um teor de matéria seca de pelo menos 10% (p/p); e em que o rendimento dos óleos ou lipídios extraídos está na faixa de 100% (p/p) com base no teor de óleos ou lipídios presente na biomassa; em que o método compreende: realizar o tratamento hidrotérmico sob condições que correspondem a um fator de severidade LogR0 de pelo menos 3,9; realizar o tratamento hidrotérmico sob condições que correspondem a um fator de severidade LogR0 de 4,0 a 4,5; realizar a etapa de secagem (iv) sob vácuo e a uma temperatura da biomassa inferior a 70oC; realizar a etapa de extração (v) a uma temperatura da biomassa inferior a 70oC; em que o valor de pH da suspensão aquosa na etapa (i) é inferior a 5; realizar o tratamento hidrotérmico na etapa (ii) a uma pressão na faixa de 10 (1000000 Pa) a 25 bar (2500000 Pa); realizar o tratamento hidrotérmico na etapa (ii) a uma temperatura na faixa de 190 oC a 200 oC; e realizar o tratamento hidrotérmico na etapa (ii) a temperatura e pressão distribuída de acordo com quando uma temperatura de reação é de 160 oC e a pressão é de 19,6 bar (1960000 Pa).