BR112015023405B1 - Método para fazer células recombinantes - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA FAZER CÉLULAS RECOMBINANTES, OLIGONUCLEOTÍDEO EFETOR, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E SEU USO. A invenção proporciona composições e métodos para fazer e utilizar oligonucleotídeos efetores, incluindo oligonucleotídeos efetores com mais de um desemparelhamento em comparação com sua sequência alvo. Estes oligonucleotídeos efetores são úteis para melhorar a eficiência de edição genômica, bem como proporcionar benefícios terapêuticos a indivíduos em necessidade dos mesmos.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do pedido provisório de patente dos Estados Unidos N° de série 61/801.822, depositado em 15 de março de 2013 e pedido provisório de patente dos Estados Unidos N.° de série 61/867.522, depositado em 19 de agosto de 2013, cujo conteúdo está aqui incorporado por referência em sua totalidade.

APRESENTAÇÃO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS EM ARQUIVO DE TEXTO ASCII

[002] O conteúdo da seguinte apresentação no arquivo de texto ASCII está aqui incorporado por referência em sua totalidade: uma forma legível por computador (CRF) da Listagem de Sequências (nome do arquivo: 873892000140.txt, data de gravação: 13 de março de 2014, tamanho: 26.630 bytes).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Os oligonucleotídeos que são parcialmente complementares à sequência de DNA genômico podem associar-se ao DNA de fita dupla de uma forma específica à sequência. Ver, por exemplo, WO2011/133802. Os oligonucleotídeos compreendendo sequências que variam, em parte, a partir das sequências correspondentes de DNA genômico foram utilizados para editar DNA cromossômico por recombinação da sequência codificada pelo oligonucleotídeo no genoma.

[004] Considerando que os oligonucleotídeos são também utilizados em pesquisa biológica, um principal uso pretendido de oligonucleotídeos na terapia celular é corrigir sequências genéticas associadas à doença nas células para a produção de preparações de células terapêuticas para utilização. No entanto, a eficiência da alteração do genoma mediada por oligonucleotídeo é muito baixa, o que limita a aplicabilidade desta abordagem. Ao mesmo tempo, devido à ineficiência do processo, acredita-se que a alteração fora do alvo do genoma também seja baixa. Consequentemente, os métodos que utilizam oligonucleotídeos para produzir células terapêuticas sem aumentar sua baixa atividade esperada fora do alvo e que produzem rendimentos aumentados de células otimamente modificadas seriam de interesse para permitir uma terapia celular mais eficaz e segura.

[005] A sequência de um oligonucleotídeo utilizado para introduzir uma alteração genética é tipicamente desenhada para corresponder a uma fita de uma sequência de DNA cromossômico alvo de fita dupla de interesse, geralmente a sequência de codificação ou o promotor de um gene de interesse, em que o oligonucleotídeo é adicionalmente desenhado para compreender um desemparelhamento em relação à sequência alvo. Acredita-se que os oligonucleotídeos se associem às suas sequências alvo correspondentes no genoma. Em alguns casos, a sequência desemparelhada é introduzida no genoma após eventos de recombinação.

[006] A eficiência da alteração do genoma mediada por oligonucleotídeo é baixa. Várias publicações descrevem que os oligonucleotídeos devem ser desenhados para conter sequências que sejam essencialmente idênticas às suas sequências alvo correspondentes de modo a funcionar. Por exemplo, US 2010/0172882 descreve que um maior número de posições homólogas dentro do oligonucleotídeo irá aumentar a probabilidade de que haja recombinação na sequência alvo, ou região alvo ou sítio alvo. Assim, ter mais desemparelhamento é desencorajado pelas publicações existentes. Muitos oligonucleotídeos, utilizados para alterar o genoma através de recombinação, relatados até o momento foram desenhados para introduzir uma mutação pontual ou para alterar uma única base. Ver, por exemplo, Bonner M., et al. 1:e18. doi: 10.1038/mtna.2012.9 Mol. Ther. Nucleic Acids (2012); Bertoni C, et al. 37(22):7468-82. doi: 10.1093/nar/gkp757 Nucleic Acids Res. (2009) e Andrieu-Soler C, et al. Nucleic Acids Res. 7;33(12):3733-42 (2005).

[007] A fim de aumentar a eficiência da edição do genoma utilizando oligonucleotídeos, outras referências (por exemplo, US 2011/0262406) descrevem a utilização de moléculas formadoras de triplex, que é descrito como um par de moléculas de fita única, ou uma única molécula composta por um par de moléculas conectadas por um ligante, que facilitam o deslocamento da fita e a formação do triplex, em que uma molécula ligada à fita alvo através de ligação de Hoogsteen e a outra molécula se ligam às fitas alvo por ligação de Watson-Crick de maneira específica em relação à sequência. Acredita-se que estas moléculas recrutem fatores celulares que estão envolvidos na recombinação, que funcionam para aumentar a eficiência com a qual os oligonucleotídeos desenhados para editar o genoma são recombinados no genoma, e estas foram utilizadas na edição do genoma de células para o tratamento de várias doenças, tais como HIV. O uso de vários compostos aqui é uma maneira de abordar a edição genômica. No entanto, mesmo em combinação com estas moléculas, a eficiência da modificação do genoma utilizando oligonucleotídeos permanece baixa. Existe uma necessidade de resolver o problema da recombinação ineficiente, edição genômica ineficiente e aumento da atividade fora do alvo, bem como benefícios adicionais de apresentar composições e métodos de produção de células terapêuticas sem aumentar sua baixa atividade esperada fora do alvo e aumentar os rendimentos de células otimamente modificadas.

[008] O vírus da imunodeficiência humana (HIV) infectou milhões de pessoas em todo o mundo. Foram feitos muitos esforços para combater a infecção pelo HIV. Algumas abordagens concentram-se em pequenas moléculas para afetar o ciclo de replicação do vírus. Outros esforços concentraram-se no lado da terapia celular. Uma vez que CCR5 é conhecido por ser um correceptor necessário para muitos isolados de HIV, foram feitos esforços para atingir CCR5 para a terapia contra HIV. Ver, por exemplo, WO 2009/06336, US 2005/0220772 e US 2009/0202496.

[009] A cura relatada do paciente de Berlim estimulou esforços para criar terapias celulares com base na interpretação de que qualquer interrupção do CCR5 pode ser a base de uma terapia celular segura e eficaz. Um relato sobre um paciente em estudo referido como o "paciente de Berlim" descreveu como o paciente foi curado após um transplante de medula óssea usando medula óssea originada de um indivíduo homozigoto Δ32, ou um indivíduo portador somente desta variante em particular do gene e nenhuma variante selvagem ou outra variante. Ver, por exemplo, Auers K, et al. Blood 117(10):2791-9 (2011). A variante Δ32 de CCR5 representa uma variante interrompida do gene selvagem que ocorre em um pequeno percentual de norte-americanos e europeus, mas é quase inexistente em asiáticos e africanos. De modo a infectar as células-alvo, o HIV deve primeiro acoplar ao seu receptor e correceptor, CD4 e CCR5, respectivamente, ambos os quais são expressos na superfície das células alvo. Indivíduo homozigotos Δ32 são naturalmente resistentes ao HIV/AIDS e, assim, saudáveis. Deste modo, acreditou-se que a interrupção de CCR5 por si só pode ser usada como a base de uma terapia celular contra HIV/AIDS. No entanto, várias mutações do CCR5 (por exemplo, introdução de códon(s) de parada) não se comprovaram abordagens viáveis de terapia celular.

[0010] Foram feitas tentativas para isolar diferentes tipos de células, tais como células-tronco (por exemplo, células-tronco originadas do sangue do cordão umbilical e células-tronco hematopoiéticas) que possuem mutações Δ32 de ocorrência natural, e para expandir estas células-tronco isoladas com a mutação Δ32 de ocorrência natural. No entanto, não houve grande sucesso com a expansão de populações de células-tronco com mutações Δ32 de ocorrência natural. Há muitos problemas ao produzir mutações adequadas em CCR5 que fazem com que a célula modificada seja menos suscetível de ser infectada pelo HIV. Como tal, um problema a ser resolvido é a modificação de CCR5 em células que são suscetíveis à infecção pelo HIV de modo que as células resultantes sejam menos suscetíveis de serem infectadas pelo HIV. Além disso, outro problema é o isolamento e/ou a expansão de células-tronco com as mutações Δ32 exatas na medida em que existam células suficientes para a terapia celular para o indivíduo infectado pelo HIV, com suspeita de infecção pelo HIV ou em risco de infecção pelo HIV. Além disso, há outro problema com o isolamento e/ou purificação da população correta de células-tronco com a deleção Δ32 exata em CCR5.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0011] A invenção apresenta, inter alia, composições e métodos para produzir e utilizar oligonucleotídeos efetores que são desenhados para alterar uma sequência de ácido nucleico (sequência alvo), tais como uma sequência genômica alvo. Os oligonucleotídeos efetores da invenção podem ser utilizados para o tratamento de diferentes condições e/ou doenças em que a edição genômica de duas ou mais bases pode ser benéfica. Por conseguinte, em um aspecto, a invenção apresenta oligonucleotídeos efetores que compreendem mais do que um desemparelhamento em comparação com sua sequência alvo.

[0012] Em alguns aspectos, a invenção apresenta oligonucleotídeos efetores que compreendem mais do que um desemparelhamento em comparação com sua sequência alvo. Em outros aspectos, a invenção apresenta oligonucleotídeos efetores que compreendem 2 a 100 ou mais desemparelhamentos, incluindo oligonucleotídeos efetores compreendendo desemparelhamentos selecionados a partir do grupo que consiste em: 2 a 50 desemparelhamentos, 2 a 40 desemparelhamentos, 2 a 30 desemparelhamentos, 5 a 50 desemparelhamentos, 5 a 40 desemparelhamentos, 5 a 30 desemparelhamentos, 10 a 50 desemparelhamentos, 10 a 40 desemparelhamentos, 10 a 30 desemparelhamentos, 15 a 50 desemparelhamentos, 15 a 40 desemparelhamentos, 15 a 30 desemparelhamentos, 20 a 50 desemparelhamentos, 25 a 50 desemparelhamentos, 25 a 40 desemparelhamentos, 2 a 5 desemparelhamentos, 6 a 10 desemparelhamentos, 11 a 15 desemparelhamentos, 16 a 20 desemparelhamentos, 21 a 25 desemparelhamentos, 26 a 31 desemparelhamentos, 32 a 40 desemparelhamentos, 30 a 50 desemparelhamentos, e 50 ou mais desemparelhamentos comparação com sua sequência alvo. em

[0013] Em qualquer uma das modalidades acima, a sequência alvo é qualquer sequência cromossômica ou genômica, incluindo uma sequência que compreende um gene, ou uma fração deste, ou uma sequência que codifica um mRNA ou proteína, ou uma fração deste. Em algumas modalidades, a sequência alvo compreende uma variante ou forma alélica conhecida do gene ou uma fração desta forma de polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP) do gene ou fração desta, uma forma de comprimento completa ou truncada de um gene, uma forma mutada do gene ou uma fração desta, ou uma combinação de qualquer uma destas. Em algumas modalidades, a sequência alvo corresponde a uma variante de um gene, ou uma fração desta, que está ligada ou associada com uma doença ou infecção ou suscetibilidade a uma doença ou infecção.

[0014] Em qualquer uma das modalidades acima, a sequência alvo é um receptor de vírus. Em qualquer uma das modalidades acima, o desemparelhamento no oligonucleotídeo efetor refere-se a uma sequência a ser deletada de um receptor de vírus. Em qualquer uma das modalidades acima, o oligonucleotídeo efetor compreende uma sequência que não se emparelha a uma sequência a ser deletada, e que compreende emparelhamentos com a sequência alvo antes da sequência a ser deletada e compreende emparelhamentos com a sequência alvo após a sequência a ser deletada. Em qualquer uma das modalidades acima, o oligonucleotídeo efetor possui cerca de 10 a 200 emparelhamentos com a sequência alvo antes da sequência a ser deletada. Em qualquer uma das modalidades acima, o oligonucleotídeo efetor possui cerca de 10 a 200 emparelhamentos com a sequência alvo após a sequência a ser deletada. Em qualquer uma das modalidades acima, o oligonucleotídeo efetor possui cerca de 10 a 200 emparelhamentos com a sequência alvo antes do sítio de deleção e cerca de 10 a 200 emparelhamentos com a sequência alvo após o sítio de deleção. Em qualquer uma das modalidades acima, o oligonucleotídeo efetor possui cerca de 40 a 200 emparelhamentos com a sequência alvo antes da sequência a ser deletada. Em qualquer uma das modalidades acima, o oligonucleotídeo efetor possui cerca de 40 a 200 emparelhamentos com a sequência alvo após a sequência a ser deletada. Em qualquer uma das modalidades acima, o oligonucleotídeo efetor possui cerca de 40 a 200 emparelhamentos com a sequência alvo antes do sítio de deleção e cerca de 40 a 200 emparelhamentos com a sequência alvo após o sítio de deleção. Em qualquer uma das modalidades acima, o oligonucleotídeo efetor possui cerca de 10 a 40 emparelhamentos com a sequência alvo antes da sequência a ser deletada. Em qualquer uma das modalidades acima, o oligonucleotídeo efetor possui cerca de 10 a 40 emparelhamentos com a sequência alvo após a sequência a ser deletada. Em qualquer uma das modalidades acima, o oligonucleotídeo efetor possui cerca de 10 a 40 emparelhamentos com a sequência alvo antes da sequência a ser deletada e cerca de 10 a 40 emparelhamentos com a sequência alvo após a sequência a ser deletada. Em qualquer uma das modalidades acima, o oligonucleotídeo efetor possui cerca de 40 a 200 emparelhamentos com a sequência alvo antes da sequência a ser deletada e cerca de 10 a 40 emparelhamentos com a sequência alvo após a sequência a ser deletada. Em qualquer uma das modalidades acima, o oligonucleotídeo efetor possui cerca de 10 a 40 emparelhamentos com a sequência alvo antes da sequência a ser deletada e cerca de 40 a 200 emparelhamentos com a sequência alvo após a sequência a ser deletada.

[0015] Em qualquer uma das modalidades acima, em que o oligonucleotídeo efetor compreende uma sequência que não se emparelha a uma sequência a ser deletada, e que compreende emparelhamentos com a sequência alvo antes da sequência a ser deletada e compreende emparelhamentos com a sequência alvo após a sequência a ser deletada, a sequência a ser deletada é composta por 2 ou mais bases (ou seja, 2 ou mais desemparelhamentos). Em algumas modalidades, a sequência a ser deletada é de 10 ou mais bases de comprimento. Em algumas modalidades, a sequência a ser deletada é de 20 ou mais bases de comprimento. Em algumas modalidades, a sequência a ser deletada é de 40 ou mais bases. Em algumas modalidades, a sequência a ser deletada consiste em 2 a 500 bases. Em algumas modalidades, a sequência a ser deletada consiste em 20 a 40 bases.

[0016] Em qualquer uma das modalidades acima, a sequência alvo é um receptor do HIV. Em qualquer uma das modalidades acima, o receptor do HIV é o CCR5. Em qualquer uma das modalidades acima, o desemparelhamento no oligonucleotídeo efetor corresponde a uma sequência alvo de 32 bases que é deletada em uma variante delta-32 (Δ32) de CCR5, em que a variante Δ32 é comparada com a sequência selvagem de CCR5. Em qualquer uma das modalidades acima, o oligonucleotídeo efetor compreende uma sequência que compreende emparelhamentos com a sequência alvo antes da sequência a ser deletada e compreende emparelhamentos com a sequência alvo após a sequência a ser deletada. Em qualquer uma das modalidades acima, o oligonucleotídeo efetor compreende pelo menos 40 emparelhamentos com a sequência alvo antes do sítio da deleção Δ32 em CCR5. Em qualquer uma das modalidades acima, o oligonucleotídeo efetor compreende pelo menos 40 emparelhamentos com a sequência alvo após o sítio da deleção Δ32 em CCR5. Em qualquer uma das modalidades acima, o oligonucleotídeo efetor é selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) oligonucleotídeos efetores compreendendo uma sequência que corresponde à variante Δ32 de CCR5, (b) oligonucleotídeos efetores compreendendo uma sequência que corresponde à variante Δ32 de CCR5 e que corresponde a uma sequência de codificação da variante Δ32 de CCR5, e (c) oligonucleotídeos efetores que são desenhados para mimetizar a variante Δ32 de CCR5.

[0017] Em outros aspectos, a invenção apresenta composições compreendendo qualquer um dos oligonucleotídeos efetores em qualquer uma das modalidades acima.

[0018] Em outros aspectos, a invenção apresenta células recombinantes isoladas compreendendo uma sequência alvo que corresponde a qualquer um dos oligonucleotídeos efetores em qualquer uma das modalidades acima. Em algumas modalidades, as células recombinantes isoladas compreendem uma sequência recombinada resultante do contato de uma célula que compreende uma sequência alvo com um oligonucleotídeo efetor dirigido à sequência alvo. Em algumas modalidades, as células recombinantes isoladas compreendem uma sequência recombinada resultante do contato da célula que compreende uma sequência alvo com qualquer uma das sequências recombinadas correspondentes aos oligonucleotídeos efetores em qualquer uma das modalidades acima.

[0019] Em outros aspectos, a invenção apresenta métodos de edição genômica ex vivo, cujo método compreende contatar uma célula com qualquer um dos oligonucleotídeos efetores em qualquer uma das modalidades acima, em condições suficientes para a entrada do oligonucleotídeo efetor na célula e permite que o oligonucleotídeo efetor edite o DNA cromossômico da célula.

[0020] Em alguns aspectos, a invenção apresenta a utilização de um oligonucleotídeo efetor para corrigir, alterar ou eliminar a sequência associada com uma doença ou infecção ou suscetibilidade à doença ou infecção, em que o oligonucleotídeo efetor é dirigido contra uma variante de um gene ou fração deste, que está ligado ou associado com uma doença ou infecção ou suscetibilidade a uma doença ou infecção.

[0021] Em alguns aspectos, a invenção apresenta um método de tratamento de uma doença em um sujeito, que compreende a administração de uma quantidade eficaz de um oligonucleotídeo efetor a um sujeito em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades do método de tratamento de uma doença em um sujeito, o oligonucleotídeo efetor é dirigido contra uma variante de um gene ou fração deste, que está ligada ou associada com a doença.

[0022] Em alguns aspectos, a invenção apresenta um método de tratamento de uma infecção em um indivíduo que compreende a administração de uma quantidade eficaz de um oligonucleotídeo efetor a um sujeito em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades do método de tratamento de uma infecção em um sujeito, o oligonucleotídeo efetor é dirigido contra uma variante de um gene ou fração deste, que está ligada ou associada com a infecção.

[0023] Em alguns aspectos, a invenção apresenta um método para prevenir uma doença ou infecção em um sujeito que compreende a administração de uma quantidade eficaz de um oligonucleotídeo efetor a um sujeito em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades do método de prevenção de uma doença ou infecção em um sujeito, o oligonucleotídeo efetor é dirigido contra uma variante de um gene ou fração deste, que está ligado ou associado com a suscetibilidade à doença ou infecção.

[0024] Em alguns aspectos, a invenção apresenta um método de produção de células recombinantes compreendendo células que compreendem o contato de uma sequência alvo dentro de um gene a ser alterado com um oligonucleotídeo efetor dirigido contra a sequência alvo e que compreende mais de um desemparelhamentos em comparação com a sequência alvo; e permitindo que o oligonucleotídeo efetor altere a sequência alvo nas células. Em algumas modalidades, o método de produção das células recombinantes possuindo uma alteração gênica específica compreende: (a) fornecer o oligonucleotídeo efetor dirigido contra uma sequência alvo e compreender mais do que um desemparelhamento em comparação com a sequência alvo para as células que compreendem a sequência alvo dentro do gene a ser alterado; e (b) incubar as células em condições suficientes para a entrada do oligonucleotídeo efetor nas células e permitir que o oligonucleotídeo efetor altere a sequência alvo nas células, para gerar as células recombinantes.

[0025] Em alguns aspectos, a invenção apresenta um método de preparar uma população substancialmente enriquecida de células recombinantes, cujo método compreende contatar células que compreendem uma sequência alvo dentro de um gene a ser alterada com um oligonucleotídeo efetor dirigido contra a sequência alvo e compreendendo mais de um desemparelhamento em comparação com a sequência alvo; permitir que o oligonucleotídeo efetor altere a sequência alvo nas células; isolar pelo menos uma das células recombinantes; e crescer pelo menos uma célula recombinante em condições de fornecer a população substancialmente enriquecida de células recombinantes. Em algumas modalidades, o método de preparar a população substancialmente enriquecida de células recombinantes compreende: (a) fornecer o oligonucleotídeo efetor dirigido contra uma sequência alvo e compreendendo mais do que um desemparelhamento em comparação com a sequência alvo às células que compreendem a sequência alvo dentro do gene a ser alterada; (b) incubar as células em condições suficientes para a entrada do oligonucleotídeo efetor nas células e permitir que o oligonucleotídeo efetor altere a sequência alvo nas células para fornecer as células recombinantes; (c) isolar pelo menos uma das células recombinantes; e (d) crescer pelo menos uma célula recombinante em condições de fornecer a população substancialmente enriquecida de células recombinantes. Em algumas modalidades, a população substancialmente enriquecida de células recombinantes é adicionalmente purificada ao separar as células recombinantes do meio de crescimento e suspender as células em um meio adequado para utilização na terapia celular.

[0026] Em alguns aspectos, a invenção apresenta um método de tratamento de uma doença em um sujeito, que compreende a administração a um sujeito que necessite de uma quantidade eficaz de uma célula recombinante compreendendo uma sequência recombinada resultante do contato de uma célula que compreende uma sequência alvo dentro de um gene com um oligonucleotídeo efetor dirigido contra a sequência alvo e compreendendo mais do que um desemparelhamento em comparação com a sequência alvo, em condições suficientes para a entrada do oligonucleotídeo efetor na célula e permitindo que o oligonucleotídeo efetor altere a sequência alvo. Em algumas modalidades do método de tratamento de uma doença em um sujeito, o oligonucleotídeo efetor é dirigido contra uma variante de um gene ou fração deste, que está ligada ou associada com a doença.

[0027] Em alguns aspectos, a invenção apresenta um método de tratamento de uma infecção em um sujeito que compreende a administração a um sujeito que necessite de uma quantidade eficaz de uma célula recombinante compreendendo uma sequência recombinada resultante do contato de uma célula que compreende uma sequência alvo dentro de um gene com um oligonucleotídeo efetor dirigido contra a sequência alvo e compreendendo mais do que um desemparelhamento em comparação com a sequência alvo, em condições suficientes para a entrada do oligonucleotídeo efetor na célula e permitindo que o oligonucleotídeo efetor altere a sequência alvo. Em algumas modalidades do método de tratamento de uma infecção em um sujeito, o oligonucleotídeo efetor é dirigido contra uma variante de um gene ou fração deste, que está ligada ou associada com a infecção. Em algumas modalidades, a infecção é pelo HIV e o sujeito tem ou é suspeito de ter uma infecção pelo HIV.

[0028] Em alguns aspectos, a invenção apresenta um método de prevenção de uma doença ou infecção em um sujeito que compreende a administração a um sujeito que necessite de uma quantidade eficaz de uma célula recombinante compreendendo uma sequência recombinada resultante do contato de uma célula que compreende uma sequência alvo dentro de um gene com um oligonucleotídeo efetor dirigido contra a sequência alvo e compreendendo mais do que um desemparelhamento em comparação com a sequência alvo, em condições suficientes para a entrada do oligonucleotídeo efetor na célula e permitindo que o oligonucleotídeo efetor altere a sequência alvo. Em algumas modalidades do método de prevenção de uma doença ou infecção em um sujeito, o oligonucleotídeo efetor é dirigido contra uma variante de um gene ou fração deste, que está ligada ou associada com a suscetibilidade à doença ou infecção. Em algumas modalidades, a infecção é pelo HIV e o sujeito é suscetível à infecção pelo HIV.

[0029] Em qualquer uma das modalidades acima, a célula é selecionada a partir do grupo que consiste em células de mamíferos, células humanas, células animais, células de plantas, células de levedura, células de insetos e células de répteis. Em qualquer uma das modalidades acima, a célula de mamífero é selecionada a partir do grupo que consiste em células-tronco embrionárias, células-tronco pluripotentes induzidas, células-tronco adultas, células-tronco do sangue do cordão umbilical, células-tronco hematopoiéticas, células- tronco de câncer, células progenitoras multipotentes, células progenitoras restritas em linhagem, células progenitoras mieloides comuns, células progenitoras de granulócito-macrófago, células progenitoras de megacariócito-eritroide, células imunes, células imunes diferenciadas e células imunes CD4-positivas. Em qualquer uma das modalidades acima, o método compreende ainda contatar a célula com oligonucleotídeos formadores de triplex ou oligonucleotídeos pseudocomplementares. Em qualquer uma das modalidades acima, o oligonucleotídeo formador de triplex compreende um PNA. Em qualquer uma das modalidades acima, o método compreende ainda a detecção das células compreendendo a sequência codificada pelo oligonucleotídeo efetor, utilizando sondas de oligonucleotídeo fluorogênico. Em qualquer uma das modalidades acima, as células detectadas são isolados por separação de célula ativada por fluorescência.

[0030] Em alguns aspectos, a invenção apresenta uma composição compreendendo uma célula recombinante que compreende uma sequência alvo alterada e um oligonucleotídeo efetor dirigido contra a sequência alvo. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo efetor é complementar pelo menos uma fração da sequência alvo alterada sem quaisquer desemparelhamentos. Em algumas modalidades, a sequência alvo alterada é o resultado de uma deleção Δ32 do gene CCR5. Em algumas modalidades, a composição compreende ainda uma ferramenta de detecção. Em algumas modalidades, a ferramenta de detecção é uma sonda de oligonucleotídeo fluorogênico tal como usado na tecnologia Chromovert®.

[0031] Em alguns aspectos, a invenção apresenta, inter alia, composições de células-tronco e populações de células-tronco que foram manipuladas para modificações no gene CCR5 e métodos para produzir e utilizar estas populações de células-tronco modificadas. Estas modificações (por exemplo, deleção Δ32) resultam em mutações da fase de leitura que tornam as células-tronco e populações de células- tronco resultantes mais refratárias à infecção pelo HIV.

[0032] Em um aspecto, a invenção apresenta composições que compreendem uma população substancialmente pura de células-tronco recombinantes, em que as células-tronco compreendem uma modificação no gene CCR5, que resulta em uma fase de leitura. Em uma modalidade a modificação é uma deleção Δ32 em um gene CCR5. Em outras modalidades, a mutação Δ32 compreende a deleção da SEQ ID NO:4 a partir do gene CCR5 selvagem. Em qualquer uma das modalidades e combinação de modalidades aqui, pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80 ou 90% das células-tronco na população compreendem a deleção Δ32. Em qualquer uma das modalidades e combinação de modalidades aqui, pelo menos 50% das células-tronco na população compreendem a deleção Δ32. Em qualquer uma das modalidades e combinação de modalidades aqui, 5 a 90%, 10 a 90%, 15 a 90%, 20 a 90%, 25 a 90%, 30 a 90%, 35 a 90%, 40 a 90%, 45 a 90%, ou 50 a 90% das células-tronco na população compreendem a deleção Δ32. Em qualquer uma das modalidades e combinação de modalidades aqui, a células-tronco é selecionada a partir do grupo que consiste em: células-tronco embrionárias, células-tronco pluripotentes induzidas, células-tronco hematopoiéticas, células-tronco adultas, células-tronco do sangue do cordão umbilical, células-tronco de câncer, células progenitoras multipotentes, células progenitoras restritas em linhagem, células progenitoras mieloides comuns, células, células progenitoras de granulócito-macrófago e células progenitoras de megacariócito-eritroide. Em qualquer uma das modalidades e combinação de modalidades aqui, as células-tronco na população expressam um ou mais dos marcadores escolhidos a partir do grupo que consiste em: CD34, CD133, CD105, CD45, CD59, Thy1/CD90, C- kit (CD117) e família SLAM de marcadores de superfície celular. Em qualquer uma das modalidades e combinação de modalidades aqui, pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80 ou 90% das células-tronco expressam um ou mais dos marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em: CD34, CD133, CD105, CD45, CD59, Thy1/CD90, C-kit (CD117) e família SLAM de marcadores de superfície celular. Em qualquer uma das modalidades e combinação de modalidades aqui, pelo menos, 50% das células-tronco expressam um ou mais dos marcadores escolhidos selecionados a partir do grupo que consiste em: CD34, CD133, CD105, CD45, CD59, Thy1/CD90, C-kit (CDl 17) e família SLAM de marcadores da superfície celular. Em qualquer uma das modalidades e combinação de modalidades aqui, 5 a 90%, 10 a 90%, 15 a 90%, 20 a 90%, 25 a 90%, 30 a 90%, 35 a 90%, 40 a 90%, 45 a 90%, ou 50 a 90% das células-tronco expressam um ou mais dos marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em: CD34, CD133, CD105, CD45, CD59, Thy1/CD90, C-kit (CD117) e família SLAM de marcadores da superfície celular. Em qualquer uma das modalidades e combinação de modalidades aqui, a família SLAM de marcadores de superfície celular é selecionada a partir do grupo que consiste em CD48, CD150 e CD244. Em qualquer uma das modalidades e combinação de modalidades aqui, as células-tronco na população não expressam um ou mais dos marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em: CD13, CD33, CD71, CD19 e CD61. Em qualquer uma das modalidades e combinação de modalidades aqui, as células-tronco na população compreendem um RNA correspondente a um marcador de células-tronco intracelular, não localizado na superfície celular ou localizado na superfície celular. Em qualquer uma das modalidades e combinação de modalidades aqui, o marcador de células-tronco é selecionado a partir do grupo que consiste em: famílias de fatores de transcrição gênica, genes das vias de sinalização e os genes de quinases. Em qualquer uma das modalidades e combinação de modalidades aqui, a deleção Δ32 ocorre em um alelo. Em qualquer uma das modalidades e combinação de modalidades aqui, a deleção Δ32 ocorre em ambos os alelos. Em qualquer uma das modalidades e combinação de modalidades aqui, as células-tronco da população ainda compreendem uma ferramenta de detecção, em que a ferramenta de detecção permite a detecção de uma célula-tronco com deleção Δ32. Em qualquer uma das modalidades e combinação de modalidades aqui, a ferramenta de detecção compreende um fluoróforo. Em qualquer uma das modalidades e combinação de modalidades aqui, a ferramenta de detecção compreende ainda um supressor. Em qualquer uma das modalidades e combinação de modalidades aqui, a ferramenta de detecção é uma sonda de oligonucleotídeo fluorogênico tal como utilizado na tecnologia Chromovert®.

[0033] Em outros aspectos, a invenção apresenta métodos de preparação de uma composição que compreende uma população substancialmente pura de células-tronco recombinantes, ou uma população de células enriquecida em células-tronco recombinantes, em que as células-tronco compreendem deleção Δ32 no gene CCR5, cujo referido método compreende: (a) fornecer um ou mais oligonucleotídeos efetores capazes de deletar a sequência de 32 pares de base da SEQ ID NO:4 em uma ou mais células-tronco; (b) cultivar as células-tronco para aumentar o número de células-tronco, produzindo assim uma população substancialmente pura de células-tronco recombinantes compreendendo deleção Δ32. Em qualquer uma das modalidades e combinação de modalidades aqui, o método compreende ainda a introdução de uma ferramenta de detecção nas células-tronco da etapa (a). Em qualquer uma das modalidades e combinação de modalidades aqui, a ferramenta de detecção é uma sonda de oligonucleotídeo fluorogênico tal como utilizado na tecnologia Chromovert®.

[0034] Em outros aspectos, a invenção apresenta métodos de tratamento de um indivíduo com infecção pelo HIV ou em risco de infecção pelo HIV compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de qualquer uma das composições de células-tronco modificadas e/ou composição compreendendo uma população de células-tronco modificadas aqui divulgada. Em qualquer uma das modalidades e combinação de modalidades aqui, as composições de células-tronco modificadas e/ou composição que compreende uma população de células-tronco modificadas são autólogas para o indivíduo.

[0035] Em outros aspectos, a invenção apresenta métodos de tratamento de um indivíduo em necessidade do mesmo que compreende a administração de uma composição farmaceuticamente aceitável compreendendo um ou mais oligonucleotídeos efetores em qualquer uma das modalidades acima.

[0036] Em outros aspectos, a invenção apresenta métodos de tratamento de um indivíduo em necessidade do mesmo que compreende a administração de uma composição farmaceuticamente aceitável que compreende as células recombinantes de qualquer uma das modalidades acima. Em qualquer uma das modalidades acima, o indivíduo tem ou é suspeito de ter infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV).

[0037] Em qualquer uma das modalidades acima, o oligonucleotídeo efetor é um oligonucleotídeo que não ocorre naturalmente.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0038] A Figura 1 mostra a sequência de codificação do gene CCR5 (SEQ ID NO:1) com as 32 bases que são deletadas na variante Δ32 de CCR5 sublinhadas.

[0039] A Figura 2 apresenta as sequências proteicas correspondentes de CCR5 selvagem (SEQ ID NO:2), indicando também a sequência mantida nas variantes Δ32 de CCR5. Os aminoácidos da variante selvagem de CCR5 que são conservados na variante Δ32 são indicados em texto não sublinhado. Uma vez que a deleção de base 32 da variante Δ32 de CCR5 introduz uma mutação de fase de leitura, a variante Δ32 carece dos aminoácidos da variante selvagem de CCR5 indicado em texto sublinhado.

[0040] A Figura 3 representa a sequência da proteína Δ32 CCR5 (SEQ ID NO:3) com a nova cauda C-terminal de 31 aminoácidos resultante da deleção Δ32 sublinhada.

[0041] A Figura 4A representa oligonucleotídeos efetores utilizados para introduzir alterações genômicas maiores do que uma base. Modificações químicas usadas, se houver, estão listadas. Todos estes oligonucleotídeos correspondem à sequência da variante Δ32 do gene CCR5. Todos os oligonucleotídeos foram sintetizados por Genelink, Inc. e purificados em gel. Note-se que as letras "T" ou "B" no nome do oligonucleotídeo referem-se ao fato de a sequência do oligonucleotídeo corresponder à fita senso ou antissenso, respectivamente. Cada nome de oligonucleotídeo contém dois números separados por um ponto. O primeiro número indica o número de bases no oligonucleotídeo que emparelha com a sequência do gene CCR5 antes do sítio da deleção de 32 bases e o segundo número indica o número de bases no oligonucleotídeo que emparelha com a sequência do gene CCR5 após o sítio da deleção de 32 bases presente na variante Δ32 do gene CCR5.

[0042] A Figura 4B mostra o alinhamento dos oligonucleotídeos efetores contra o seu alvo genômico correspondente. A Figura 4B representa a posição de cada oligonucleotídeo efetor em relação à sequência da variante Δ32 de CCR5. As duas longas linhas horizontais indicam uma fração da sequência de CCR5. A linha vertical espessa indica o local da deleção de 32 bases que caracteriza a variante Δ32 em comparação à variante selvagem do gene CCR5. A distância entre cada uma das duas linhas verticais indica 10 bases. A posição de cada oligonucleotídeo efetor em relação a esta sequência é indicada por uma linha horizontal para cada oligonucleotídeo efetor, qual é identificado através do seu identificador numérico. Os oligonucleotídeos efetores 1, 3, 5, 7 e 19 correspondem em sequência à fita senso ou codificadora, enquanto os oligonucleotídeos efetores 2, 4, 6, 8 e 20 correspondem em sequência à fita não codificadora.

[0043] A Figura 5 representa os resultados de PCR genômica mostrando a detecção da alteração do genoma mediada pelo oligonucleotídeo efetor utilizando oligonucleotídeos efetores para introduzir alterações genômicas maiores do que uma base. Células K562 e células THP foram eletroporadas com os oligonucleotídeos efetores, tal como indicado acima de cada linha pela numeração apresentada na Figura 1A, ou seja, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 19, 20 ou "C" (controle sem oligonucleotídeo efetor). Células K562 e THP foram, cada, eletroporadas em uma alta (1.000.000 células/~120 μl) ou baixa (500.000 células/~120 μL) densidade celular. A linha superior mostra os resultados para células K562 em baixas (colunas 1 a 12) e altas (colunas 14 a 23) densidades celulares. A linha inferior mostra os resultados para células THP eletroporadas em altas (colunas 1 a 12) e baixas (colunas 14 a 23) densidades celulares. "M" indica colunas que receberam aplicação com o marcador de peso molecular (coluna 13, linhas superior e inferior). A PCR genômica foi realizada em DNA genômico obtido a partir das células aproximadamente 2 dias após eletroporação, utilizando iniciadores genômicos específicos do CCR5. O pequeno gel na parte inferior da Figura mostra os resultados de PCR utilizando plasmídeo contendo CCR5 selvagem (linha marcada como W) ou plasmídeo compreendendo a mutação Δ32 CCR5 (linha marcada como D) como molde, e marcador na linha marcada como M. O marcador de peso molecular compreende as bandas de DNA de 100, 200 e 300 bases, iniciando a partir da parte inferior.

[0044] A Figura 6 representa um diagrama esquemático das sequências de aminoácidos (AA) das variantes selvagem (WT) e Δ32 CCR5. O número total de aminoácidos para cada variante está indicado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0045] A invenção apresenta composições e métodos para produzir e utilizar oligonucleotídeos efetores, incluindo oligonucleotídeos efetores maiores com mais do que um desemparelhamento em relação à sua sequência alvo. Estes oligonucleotídeos efetores são úteis para melhorar a eficiência da edição genômica, bem como fornecer benefícios terapêuticos a indivíduos em necessidade da mesma. A invenção também apresenta composições de células recombinantes e populações de células recombinantes que foram manipuladas para modificações nas sequências gênicas utilizando os oligonucleotídeos efetores, tal como aqui descrito.

[0046] A invenção também apresenta, inter alia, composições de células recombinantes e populações de células recombinantes que foram manipuladas para modificações em um gene. Em algumas modalidades, as células recombinantes são células-tronco manipuladas para modificações no gene CCR5. Em algumas modalidades, estas modificações (por exemplo, deleção Δ32) resultam em uma mutação de fase de leitura que torna as células-tronco e células diferenciadas a partir destas células-tronco (e quaisquer células intermediárias) menos suscetíveis de serem infectadas pelo HIV. Estas células-tronco recombinantes são úteis para o tratamento de indivíduos com infecção pelo HIV, com suspeita de infecção pelo HIV, e/ou em risco de infecção pelo HIV. A invenção também apresenta métodos para produzir e utilizar essas células-tronco recombinantes para terapia celular. As células- tronco recombinantes podem se diferenciar, transdiferenciar ou desdiferenciar durante o curso do tratamento, mas a característica comum é que as células-tronco contêm as modificações ao CCR5 (por exemplo, mutação Δ32) aqui descritas, de tal modo que as células- tronco (e qualquer intermediário e população celular resultante) são mais refratárias à infecção pelo HIV.

A. Técnicas Gerais

[0047] A prática da presente invenção empregará, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de biologia das células-tronco, cultura de células, biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que estão dentro da perícia na técnica. Tais técnicas estão completamente explicadas na literatura, tais como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook et al., 2001) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (Herdewijn, ed., 2004); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); The Immunoassay Handbook (D. Wild, ed., Stockton Press NY, 1994); Bioconjugate Techniques(Greg T. Hermanson, ed., Academic Press, 1996); e Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W.H. Albert, and N.A. Staines, eds., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999), Embryonic Stem Cells: A Practical Approach (Notaranni et al. eds., Oxford University Press 2006); Essentials of Stem Cell Biology (R. Lanza, ed., Elsevier Academic Press 2006); Stem Cell Assays (Methods in Molecular Biology) (Mohan C. Vemuri, Ed., Humana Press; first edition (August 10, 2007); Mesenchymal Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Darwin J. Prockop, Donald G. Phinney, Bruce A. Bunnell, Eds., first edition (March 7, 2008)); Handbook of Stem Cells (Robert Lanza, et al., Eds., Academic Press (September 14, 2004); Stem Cell Culture Vol 86: Methods in Cell Biology (Jennie P. Mather, Ed., Academic Press, first edition (May 15, 2008)); Practical Hematopoietic Stem Cell Transplantation (Andrew J. Cant, et al. Eds., Wiley-Blackwell, first edition (January 22, 2007)); Hematopoietic Stem Cell Protocols (Kevin D. Bunting, Ed., Humana Press, 2nd ed. edition (January 31, 2008)); Bone Marrow and Stem Cell Transplantation (Methods in Molecular Medicine) (Meral Beksac, Ed., Humana Press; first edition (May 3, 2007)); Stem Cell Therapy and Tissue Engineering for Cardiovascular Repair: From Basic Research to Clinical Applications (Nabil Dib, et al., Eds., Springer, first edition (November 16, 2005)); Blood And Marrow Stem Cell Transplantation: Principles, Practice, And Nursing Insights (Kim Schmit-Pokorny (Author) and Susan Ezzone (Editor), Jones & Bartlett Publishers; third edition (May 22, 2006)); Hematopoietic Stem Cell Protocols (Christopher A. Klug and Craig T. Jordan, Eds., Humana Press; first edition (December 15, 2001)); e Clinical Bone Marrow and Blood Stem Cell Transplantation (Kerry Atkinson, et al., Eds., Cambridge University Press; third edition (December 8, 2003)).

B. Definições

[0048] Tal como aqui utilizado, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem referências plurais, salvo indicação em contrário. Por exemplo, "um" oligonucleotídeo efetor inclui um ou mais oligonucleotídeos efetores.

[0049] A referência a "cerca de" um valor ou parâmetro aqui refere- se ao intervalo de erro usual para o respectivo valor prontamente conhecido dos especialistas na técnica. A referência a "cerca de" um valor ou parâmetro aqui inclui (e descreve) aspectos que são direcionados a esse valor ou parâmetro per se. Por exemplo, uma descrição a "cerca de X" inclui a descrição de "X".

[0050] Entende-se que os aspectos da invenção aqui descritos incluem aspectos "compreendendo", "consistindo", e "consistindo essencialmente em".

[0051] Tal como aqui utilizados de modo intercambiável, os termos "polinucleotídeos" ou "oligonucleotídeo" ou "oligo" incluem DNA de fita simples (ssDNA), DNA de fita dupla (dsDNA), RNA de fita simples (ssRNA) e RNA de fita dupla (dsRNA), oligonucleotídeos modificados e oligonucleosídeos ou combinações destes. O oligonucleotídeo pode ter configuração linear ou circular ou o oligonucleotídeo pode conter ambos os segmentos linear e circular. Os oligonucleotídeos são polímeros de nucleosídeos unidos, geralmente, através de ligações fosfodiéster, embora ligações alternativas, tais como ésteres de fosforotioato também possam ser utilizadas em oligonucleotídeos. Um nucleosídeo é composto de uma base purínica (adenina (A) ou guanina (G) ou derivado destas) ou pirimidínica (timina (T), citosina (C) ou uracila (U), ou um derivado destas) ligada a um açúcar. As quatro unidades nucleosídicas (ou bases) no DNA são chamadas deoxiadenosina, deoxiguanosina, desoxitimidina e desoxicitidina. Um nucleotídeo é um éster de fosfato de um nucleosídeo. Os oligonucleotídeos podem também incluir bases que não ocorrem naturalmente (por exemplo, bases modificadas ou substituídas). Os oligonucleotídeos podem compreender adicionalmente um ou mais compostos, proteínas, toxinas, enzimas, hormônios, moléculas de sinalização, moléculas fluorescentes, supressores, substâncias químicas e ligantes, ou uma combinação destes, ligados covalentemente. Os oligonucleotídeos podem compreender uma ou mais frações ou bases que sejam covalentemente ligadas de forma cruzada a outras frações ou bases.

[0052] Um "oligonucleotídeo que não ocorre naturalmente", tal como aqui utilizado, refere-se a um oligonucleotídeo possuindo pelo menos uma modificação ou substituição na ligação internucleosídica, fração de açúcar ou base nucleosídica não encontrado nos ácidos nucleicos naturais. Os oligonucleotídeos efetores, tais como aqui descritos, incluem os oligonucleotídeos que não ocorrem naturalmente, tais como aqui serão descritos.

[0053] Uma "sequência alvo", tal como aqui utilizada, refere-se geralmente a qualquer sequência de ácido nucleico, tal como sequências genômicas, que deve ser alterada pelo oligonucleotídeo efetor, por exemplo, pelo contato de uma célula com o oligonucleotídeo efetor em condições adequadas para alterar a sequência genômica na célula. A sequência alvo pode ser uma sequência dentro de um gene de interesse, ou seja, um gene a ser alterado, de tal modo que o gene de interesse possa ser alterado pela alteração da sequência alvo. O oligonucleotídeo efetor se emparelha, ou é complementar a, pelo menos uma fração da sequência alvo, e também inclui pelo menos uma fração que não se emparelha com a sequência alvo, ou em que a sequência alvo inclui uma fração que não se emparelha com o oligonucleotídeo efetor (por exemplo, possuindo pelo menos 2 ou mais desemparelhamentos).

[0054] Um "desemparelhamento" ou "desemparelhamentos", tal como aqui utilizado, refere-se a frações de um oligonucleotídeo efetor que não se emparelham com frações de uma sequência alvo, ou frações da sequência alvo que não se emparelham com o oligonucleotídeo efetor, tal como aqui descrito. Os desemparelhamentos podem ser inserções (por exemplo, bases adicionais no oligonucleotídeo efetor que não se emparelham com a sequência alvo, resultando na adição de bases à sequência alvo), deleções (por exemplo, bases ausentes no oligonucleotídeo efetor que se encontram na sequência alvo, por exemplo, em que o oligonucleotídeo efetor possui frações que se emparelham a uma fração da sequência alvo antes e uma fração da sequência após uma sequência que esteja na sequência alvo que não se emparelhe com o oligonucleotídeo efetor, resultando na deleção da sequência não emparelhada a partir da sequência alvo), ou bases não complementares (por exemplo, resultando em alterações na sequência alvo), ou quaisquer combinações dos mesmos. O oligonucleotídeo efetor é desenhado para resultar na alteração da sequência alvo, por exemplo, quando a sequência alvo alterada resultante se emparelha ao oligonucleotídeo efetor sem quaisquer desemparelhamentos.

[0055] Um "indivíduo", "sujeito" ou "paciente" é um vertebrado. Em certas modalidades, o vertebrado é um mamífero. Os mamíferos incluem, entre outros, primatas (incluindo primatas humanos e não humanos), animais de estimação (por exemplo, cães, gatos, coelhos, etc.), animais agrícolas (por exemplo, vacas, gado, etc.), animais de desporto (por exemplo, cavalos), e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em certas modalidades, um mamífero é um ser humano.

[0056] Uma "quantidade eficaz" ou uma "quantidade suficiente" de uma substância é a quantidade suficiente para efetuar resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clínicos e, como tal, uma "quantidade eficaz" depende do contexto em que está sendo aplicada. No contexto da administração de uma composição que compreende um ou mais oligonucleotídeos efetores da invenção, uma quantidade eficaz de um oligonucleotídeo efetor é uma quantidade suficiente para obter a recombinação do oligonucleotídeo efetor no seu sítio alvo correspondente no genoma em comparação com a recombinação do oligonucleotídeo efetor em outros sítios no genoma, ou para obter uma maior taxa ou frequência de recombinação do oligonucleotídeo efetor no seu sítio alvo correspondente no genoma em comparação com a taxa ou frequência de recombinação do oligonucleotídeo efetor em outros sítios no genoma em células tratadas com o oligonucleotídeo efetor. Quando utilizada no contexto de tratamento ou profilaxia, ou no contexto de minimizar a dor ou aliviar os sintomas de uma condição em particular, uma quantidade eficaz, por exemplo, de um oligonucleotídeo efetor, ou de uma célula recombinante resultante da alteração mediada por um oligonucleotídeo efetor, é uma quantidade suficiente para efetuar resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clínicos. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Para os fins desta invenção, por exemplo, uma quantidade eficaz de células recombinantes (por exemplo, células- tronco Δ32 CCR5) é uma determinada quantidade de células modificadas que pode reduzir um ou mais sintomas das condições para as quais o indivíduo está sendo tratado (por exemplo, carga viral de HIV). Como um exemplo, uma quantidade eficaz de células-tronco modificadas (por exemplo, células-tronco Δ32 CCR5) abrange a utilização destas células-tronco modificadas quando estão sendo cultivadas ou proliferadas em seu estado pluripotente e indiferenciado, bem como a utilização de células-tronco modificadas quando foram cultivadas ainda para induzi-las a se diferenciarem por uma via em particular. Quando utilizada no contexto de "terapia auxiliar," uma quantidade eficaz intensifica um regime terapêutico (em comparação com um regime carente de células-tronco modificadas) e, como tal, proporciona um resultado benéfico ou desejado.

[0057] Tal como aqui utilizado, e como bem entendido na técnica, "tratamento" ou "tratar" é uma abordagem para obtenção de resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clínicos. Para os fins desta invenção, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, entre outros, alívio ou melhora de um ou mais sintomas, diminuição da extensão da doença, estabilização (ou seja, sem agravamento) do estado da doença, prevenção da disseminação da doença, retardo ou desaceleração da progressão da doença, melhora ou paliação do estado da doença, e remissão (parcial ou total), seja detectável ou não detectável. "Tratamento" ou "tratar" também pode significar prolongar a sobrevida em comparação com a sobrevida esperada se não estivesse recebendo o tratamento. "Tratamento" ou "tratar" também pode significar conferir resistência à infecção. "Recebendo tratamento" inclui tratamento inicial e/ou continuação do tratamento. Em alguns aspectos, o tratamento com um ou mais células aqui descritas é acompanhado por nenhuma ou menos efeitos colaterais que estão associados com as terapias atualmente disponíveis. No contexto da presente invenção, os sintomas de AIDS e quaisquer condições relacionadas com a AIDS estão englobadas dentro deste escopo.

[0058] "Paliação" de uma doença ou distúrbio significa que a extensão e/ou manifestações clínicas indesejáveis de um distúrbio ou um estado de doença são reduzidas e/ou o curso temporal da progressão é desacelerado ou prolongado, em comparação a não tratar o distúrbio. Especialmente no caso do HIV/AIDS, como é bem compreendido pelos especialistas na técnica, esta pode incluir um ou mais dos seguintes: reduzir a carga viral, ou a concentração ou contagem de vírus, no indivíduo ou nos fluidos corporais do indivíduo, aumentar o número de células imunes CD4-positiva no indivíduo, aumentar a força do sistema imune, a eficiência ou confiabilidade do sistema imune ou a resposta imune em indivíduos, diminuir ou inibir a replicação ou propagação do HIV no indivíduo, diminuir ou eliminar a integração do material genético correspondente ao HIV no genoma das células do indivíduo, diminuir ou tornar hostis ou não infectáveis os possíveis alvos celulares ou reservatórios do indivíduo que podem ser infectados pelo HIV ou utilizados pelo HIV para se replicar ou propagar, eliminar do indivíduo as células do indivíduo que estão infectadas ou são infectáveis pelo HIV ou nas quais o material genético do HIV tornou- se integrado, atenuar ou diminuir os efeitos colaterais ou efeitos negativos de HIV/AIDS no tecidos ou órgãos do indivíduo e/ou diminuir a capacidade de infecção do indivíduo ou a propensão ou capacidade do indivíduo para infectar outras pessoas através de fluidos corporais infectados. Além disso, paliação não ocorre necessariamente através da administração de uma única dose, mas frequentemente ocorre com a administração de uma série de doses de um tratamento ou terapia. Assim, uma quantidade de um tratamento ou terapia suficiente para paliar uma resposta ou distúrbio pode ser administrada em uma ou mais administrações.

[0059] Tal como aqui utilizado, "refratário" ou "resistente" à infecção pelo HIV refere-se à redução da (ou diminuição da) infecção pelo HIV em células que são suscetíveis à infecção pelo HIV. Pode ser uma diminuição da taxa de infecção, diminuição da carga viral de células infectadas, redução da carga viral em uma amostra biológica a ser testada, bem como em nível celular. Não se pretende exigir que 100% das células em uma população ou amostra em particular não estejam infectadas.

[0060] Tal como aqui utilizado, "retardar" o desenvolvimento de uma doença ou condição significa adiar, impedir, desacelerar, atrasar, estabilizar e/ou postergar o desenvolvimento da doença ou condição. Este retardo pode ser de diferentes durações de tempo, dependendo do histórico da doença e/ou indivíduo a ser tratado. Como é evidente para um especialista na técnica, um retardo suficiente ou significativo pode, na prática, incluir a prevenção, em que o indivíduo não desenvolve a doença ou condição. Por exemplo, o método pode reduzir a probabilidade de desenvolvimento da doença em um determinado intervalo de tempo e/ou reduzir a extensão da doença em um determinado intervalo de tempo, em comparação a não utilizar o método. Em alguns aspectos, tais comparações são baseadas em estudos clínicos usando um número estatisticamente significativo de indivíduos. O desenvolvimento da doença pode ser detectada usando técnicas clínicas padrão. O desenvolvimento também pode se referir à progressão da doença, que pode ser inicialmente indetectável e incluir ocorrência, recorrência e início.

[0061] Tal como aqui utilizado, "em necessidade do mesmo" inclui os indivíduos que têm uma condição ou doença ou que estão "em risco" para a condição ou doença. Tal como aqui utilizado, um "indivíduo em risco" é um indivíduo que está em risco de desenvolvimento de uma condição. Um indivíduo "em risco" pode, ou não, ter uma doença ou condição detectável e pode, ou não, ter apresentado doença detectável antes dos métodos de tratamento aqui descritos. "Em risco" significa que um indivíduo tem um ou mais dos chamados fatores de risco, que são parâmetros mensuráveis que se correlacionam com o desenvolvimento de uma doença ou condição e são conhecidos na técnica. Um indivíduo que tem um ou mais destes fatores de risco possui uma maior probabilidade de desenvolver a doença ou condição do que um indivíduo sem este(s) fator(es) de risco. Estes fatores de risco incluem, entre outros, idade, sexo, dieta, histórico de doença anterior, presença de doença precursora, considerações genéticas (ou seja, hereditárias), protocolos e considerações quanto à reprodução e exposição ambiental.

[0062] "Células-tronco", tal como aqui utilizadas, referem-se a células com capacidade de autorregeneração e a capacidade de se tornarem outro tipo de célula em sua via de diferenciação. Tais como aqui utilizadas, as células-tronco são células que são totipotentes, pluripotentes, multipotentes, oligopotentes e/ou unipotentes.

[0063] Tal como aqui utilizado, "delta-32" e "Δ32" são intercambiáveis e referem-se a uma extensão de 32 bases na sequência do CCR5, que é removida da sequência de CCR5 (ver Figura 1).

[0064] Tal como aqui utilizado, o termo "população isolada" de células-tronco refere-se a uma população de uma ou mais células- tronco que foram manipuladas para fornecer uma preparação de células que é substancialmente isenta de componentes adicionais (por exemplo, detritos celulares). Vários aspectos de populações isoladas são aqui descritos. O termo "população isolada" de células-tronco também pode referir-se a uma população de uma ou mais células-tronco que foram manipuladas ou enriquecidas em células que foram manipuladas, incluindo geneticamente manipuladas, que tenham sido isoladas ou enriquecidas a partir de uma população de células que foi tratada para manipulá-la. Por exemplo, algumas populações de células que são tratadas para formar as células alteradas não irão ser alteradas, e a população de células alteradas pode ser isolada ou enriquecida em relação à população inalterada.

[0065] Tal como aqui utilizado, os termos "população homogênea" e "população altamente homogênea" e "população enriquecida" de células-tronco referem-se a uma população de células onde uma fração significativa da população é composta por células-tronco, ou em que uma população de células-tronco é alterada para fornecer uma célula- tronco recombinante que pode ser enriquecida em relação às células- tronco inalteradas, ou, onde uma fração significativa da população é composta por células-tronco possuindo um genótipo específico no que diz respeito a uma ou mais sequências ou marcadores. Várias modalidades que refletem a homogeneidade incluindo graus de homogeneidade são aqui descritas e também podem ser descritas utilizando o termo "substancialmente pura" ou "substancialmente enriquecida".

[0066] "Pureza", tal como utilizada para descrever a pureza das células-tronco, não refere-se necessariamente à presença de apenas células-tronco na composição, mas indica que as células-tronco foram manipuladas de modo que foram removidas do seu ambiente tecidual natural e indica sua relação com as outras células presentes na população resultante. "Pureza", tal como utilizada para descrever a pureza das células-tronco, pode também indicar que as células-tronco foram manipuladas de tal modo que tenham um genótipo específico no que diz respeito a uma ou mais sequências ou marcadores.

[0067] Por "veículo farmaceuticamente aceitável" entende-se qualquer material que, quando combinado com um princípio ativo, permite que o ingrediente retenha atividade biológica e não provoque uma resposta imune inaceitável (por exemplo, uma alergia grave ou choque anafilático) com base no conhecimento de um especialista na técnica. Exemplos incluem, entre outros, qualquer um dos veículos farmacêuticos padrão, tais como carboximetilcelulose (CMC), soluções salinas tamponadas com fosfato, água, emulsões tais como emulsão de óleo/água, e vários tipos de agentes umectantes. Exemplos de diluentes para administração por aerossol ou parentérica são solução salina tamponada com fosfato ou salina normal (0,9%). Um exemplo de veículo para a infusão de células é CMC. As composições que compreendem tais veículos são formuladas por métodos convencionais bem conhecidos (ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; and Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000, que estão aqui incorporados por referência em sua totalidade, particularmente no que diz respeito às formulações).

[0068] A referência geral à "composição" ou "composições" inclui e é aplicável às composições da invenção. A invenção também apresenta composições farmacêuticas compreendendo os componentes aqui descritos.

C. Oligonucleotídeos efetores

[0069] Os oligonucleotídeos efetores são oligonucleotídeos de comprimento variado que podem se ligar a sequências alvo. Diferentes tipos de sequências alvo, incluindo os genes com relação causal ou correlativa a doenças e estados de doença estão contempladas dentro do escopo da invenção. Diferentes tipos de sequências alvo, incluindo os genes com relação causal ou correlativa a infecções ou suscetibilidade à infecção por agentes infecciosos ou vírus estão contemplados dentro do escopo da invenção. As sequências alvo estão descritas mais detalhadamente abaixo.

[0070] Em um aspecto, o oligonucleotídeo efetor possui um desemparelhamento em relação à sua sequência alvo. Em outros aspectos, o oligonucleotídeo efetor possui mais do que um desemparelhamento em comparação com sua sequência alvo. Estes oligonucleotídeos efetores com desemparelhamento(s) podem ser usados para produzir grandes alterações do genoma, por exemplo, para adicionar, substituir ou deletar mais do que uma base de DNA de uma sequência alvo. Tais alterações genômicas do genoma poderiam ser utilizadas, por exemplo, para adicionar, alterar ou deletar aminoácidos de uma proteína codificada, modificar uma sequência promotora e sua atividade, modificar um sítio de splicing e splicing alternativo, modificar outros elementos de regulação gênica ou sítios de ligação ao DNA dentro do genoma. Assim, os oligonucleotídeos efetores da invenção podem possuir mais do um desemparelhamento, tal como 2 a 500 desemparelhamentos, por exemplo, mais do que 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 a 15, 16 a 25, 26 a 40, 41-100 ou mais do que 100 desemparelhamentos. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo efetor possui 2 a 500, 2 a 400, 2 a 300, 2 a 200, 2 a 100, 5 a 500, 5 a 400, 5 a 300, 5 a 200, 5 a 100, 10 a 500, 10 a 400, 10 a 300, 10 a 200, 10 a 100, 15 a 500, 15 a 400, 15 a 300, 15 a 200, 15 a 100, 20 a 500, 20 a 400, 20 a 300, 20 a 200, 20 a 100, 25 a 500, 25 a 400, 25 a 300, 25 a 200, 25 a 100, 30 a 500, 30 a 400, 30 a 300, 30 a 200, 30 a 100, 35 a 500, 35 a 400, 35 a 300, 35 a 200, 35 a 100, 40 a 500, 40 a 400, 40 a 300, 40 a 200, 40 a 100, 45 a 500, 45 a 400, 45 a 300, 45 a 200, 45 a 100, 50 a 500, 50 a 400, 50 a 300, 50 a 200, 50 a 100, 2 a 75, 2 a 50, 2 a 40, 2 a 30, 5 a 75, 5 a 50, 5 a 40, 5 a 30, 10 a 75, 10 a 50, 10 a 40, 10 a 30, 15 a 75, 15 a 50, 15 a 40, 15 a 30, 20 a 75, 20 a 50, 20 a 40, 20 a 30, 25 a 75, 25 a 50, 25 a 40, 25 a 30, 30 a 75, 30 a 50, 30 a 40, 2 a 5, 6 a 10, 11 a 15, 16 a 20, 21 a 25, 26 a 31, 32 a 40, 40 a 50, ou 50 ou mais desemparelhamentos, em comparação com sua sequência alvo.

[0071] Os oligonucleotídeos efetores que podem ser utilizados para alterar o genoma em mais do que uma base de DNA são descritos. Estes oligonucleotídeos efetores podem ser sintetizados para ter comprimentos variados, incluindo 20 a 10000 bases, por exemplo 20, 20 a 500, 20 a 400, 20 a 300, 20 a 200, 20 a 100, 21 a 30, 31 a 40, 41 a 50, 51 a 60, 61 a 70, 71 a 80, 81 a 90, 91 a 100, 100 a 500, 100 a 400, 100 a 300, 100 a 200, 101 a 120, 121 a 140, 141 a 160, 161 a 180, 181 a 200, 200 a 500, 200 a 400, 200 a 300, 201 a 250, 251 a 300, 300 a 500, 300 a 400, 301 a 350, 351 a 400, 401 a 500, 500 a 600, 600 a 700, 700 a 800, 800 a 900, 900 a 1000, 1000 a 1500, 1500 a 2000, 2000 a 3000, 3000 a 4000, 4000 a 5000, 5000 a 10000 ou mais do que 10000 bases. Os oligonucleotídeos efetores podem compreender um ou mais sítios que compreendem um desemparelhamento em relação às suas sequências alvo correspondente, em que pelo menos um destes sítios compreende um desemparelhamento que possui 2 a 100 bases desemparelhadas, tais como pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20 a 25, 25 a 30, 31, 32, 33, 34, 35, 35 a 40, 40 a 50, 50 a 60, 60 a 70, 70 a 80, 80 a 90, 90 a 100 ou mais do que 100 bases desemparelhadas. Onde dois ou mais sítios dentro de um oligonucleotídeo efetor compreender bases desemparelhadas, os dois ou mais sítios podem estar, cada, espaçados entre si por 1 a 100 bases, tais como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20 a 25, 25 a 30, 31, 32, 33, 34, 35, 35 a 40, 40 a 50, 50 a 60, 60 a 70, 70 a 80, 80 a 90, 90 a 100 ou mais do que 100 bases.

[0072] Os oligonucleotídeos efetores podem ser utilizados para alterar o genoma pela deleção de uma sequência de um gene. Em algumas modalidades, tais oligonucleotídeos efetores compreendem uma sequência que corresponde uma primeira fração de uma sequência alvo e uma segunda fração de uma sequência alvo, em que a primeira fração da sequência alvo está antes da sequência a ser deletada e a segunda fração da sequência alvo está depois da sequência a ser deletada, em que o oligonucleotídeo efetor não se emparelha com a sequência a ser deletada. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo efetor compreende a sequência que se emparelha à primeira fração da sequência alvo diretamente ligada a uma sequência que corresponde à segunda fração da sequência alvo. Em algumas modalidades, a sequência que se emparelha à sequência alvo antes da sequência a ser deletada possui 10 a 500, 10 a 400, 10 a 300, 10 a 200, 10 a 125, 10 a 60, 20 a 500, 20 a 400, 20 a 300, 20 a 200, 20 a 125, 20 a 60, 30 a 500, 30 a 400, 30 a 300, 30 a 200, 30 a 125, 30 a 60, 40 a 500, 40 a 400, 40 a 300, 40 a 200, 40 a 125, ou 40 a 60 bases. Em algumas modalidades, a sequência que se emparelha à sequência alvo após a sequência a ser deletada possui 10 a 500, 10 a 400, 10 a 300, 10 a 200, 10 a 125, 10 a 60, 20 a 500, 20 a 400, 20 a 300, 20 a 200, 20 a 125, 20 a 60, 30 a 500, 30 a 400, 30 a 300, 30 a 200, 30 a 125, 30 a 60, 40 a 500, 40 a 400, 40 a 300, 40 a 200, 40 a 125, ou 40 a 60 bases. Em algumas modalidades, a sequência que se emparelha à sequência alvo antes da sequência a ser deletada possui 10 a 500, 10 a 400, 10 a 300, 10 a 200, 10 a 125, 10 a 60, 20 a 500, 20 a 400, 20 a 300, 20 a 200, 20 a 125, 20 a 60, 30 a 500, 30 a 400, 30 a 300, 30 a 200, 30 a 125, 30 a 60, 40 a 500, 40 a 400, 40 a 300, 40 a 200, 40 a 125, ou 40 a 60 bases e a sequência que se emparelha à sequência alvo após a sequência a ser deletada possui 10 a 500, 10 a 400, 10 a 300, 10 a 200, 10 a 125, 10 a 60, 20 a 500, 20 a 400, 20 a 300, 20 a 200, 20 a 125, 20 a 60, 30 a 500, 30 a 400, 30 a 300, 30 a 200, 30 a 125, 30 a 60, 40 a 500, 40 a 400, 40 a 300, 40 a 200, 40 a 125, ou 40 a 60 bases. Em algumas modalidades, a sequência a ser deletada do gene possui 2 a 500, 2 a 400, 2 a 300, 2 a 200, 2 a 100, 5 a 500, 5 a 400, 5 a 300, 5 a 200, 5 a 100, 10 a 500, 10 a 400, 10 a 300, 10 a 200, 10 a 100, 15 a 500, 15 a 400, 15 a 300, 15 a 200, 15 a 100, 20 a 500, 20 a 400, 20 a 300, 20 a 200, 20 a 100, 25 a 500, 25 a 400, 25 a 300, 25 a 200, 25 a 100, 30 a 500, 30 a 400, 30 a 300, 30 a 200, 30 a 100, 35 a 500, 35 a 400, 35 a 300, 35 a 200, 35 a 100, 40 a 500, 40 a 400, 40 a 300, 40 a 200, 40 a 100, 45 a 500, 45 a 400, 45 a 300, 45 a 200, 45 a 100, 50 a 500, 50 a 400, 50 a 300, 50 a 200, 50 a 100, 2 a 75, 2 a 50, 2 a 40, 2 a 30, 5 a 75, 5 a 50, 5 a 40, 5 a 30, 10 a 75, 10 a 50, 10 a 40, 10 a 30, 15 a 75, 15 a 50, 15 a 40, 15 a 30, 20 a 75, 20 a 50, 20 a 40, 20 a 30, 25 a 75, 25 a 50, 25 a 40, 25 a 30, 30 a 75, 30 a 50, 30 a 40, 2 a 5, 6 a 10, 11 a 15, 16 a 20, 21 a 25, 26 a 31, 32 a 40, 40 a 50, ou 50 ou mais bases. Em algumas modalidades, a sequência a ser deletada possui 1 a 100 bases (isto é, 1 a 100 bases não emparelhadas com o oligonucleotídeo efetor), 1 a 200 bases, 1 a 300 bases, 1 a 400 bases ou 1 a 500 bases, tais como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1 a 90, 1 a 80, 1 a 70, 1 a 60, 1 a 50, 20 a 25, 25 a 30, 31, 32, 33, 34, 35, 35 a 40, 40 a 50, 50 a 60, 60 a 70, 70 a 80, 80 a 90, 90 a 100 ou mais do que 100 bases que representam uma sequência a ser deletada do gene.

[0073] Os oligonucleotídeos efetores podem ser produzidos utilizando bases de DNA ou bases de DNA quimicamente modificadas. As modificações químicas podem incluir modificações de bases de DNA, açúcares e ligações entre estes, ou qualquer combinação destes, para fornecer um oligonucleotídeo efetor que não ocorre naturalmente. Os oligonucleotídeos efetores podem compreender um ou mais diferentes tipos de modificações químicas. Em algumas modalidades, as ligações fosforotioato podem ser usadas. Inúmeras modificações são conhecidas na técnica e podem ser consideradas para utilização. Em particular, modificações utilizadas em siRNAs ou oligonucleotídeos antissenso seriam de interesse, assim como modificações químicas que aumentam a força da ligação ou hibridização do oligonucleotídeo às sequências alvo, especificidade da hibridização do oligonucleotídeo às sequências alvo, eficiência e/ou consistência da entrega do oligonucleotídeo às células, e/ou resistência, estabilidade ou meia-vida dos oligonucleotídeos à degradação nos tampões e nas células. Exemplos não limitantes de modificações químicas que podem ser utilizadas incluem: um ou mais das bases 2'OH de estrutura tipo açúcar- fosfodiéster podem ser modificadas. A substituição da ligação fosfodiéster inclui, entre outras, --OP(OH)(O)O--, --OP(O-M+)(O)O--, -- OP(SH)(O)O--, --OP(S-M+)(O)O--, --NHP(O)2O--, --OC(O)2O--, -- OCH2C(O)2 NH--, --OCH2C(O)2O--, --OP(CH3)(O)O-- , --OP(CH2C6H5)(O)O--, --P(S)(O)O-- and --OC(O)2NH--. M+é um cátion inorgânico ou orgânico. A estrutura também pode ser ácido nucleico peptídico (PNA), em que a estrutura de fosfato de desoxirribose está substituída por uma estrutura pseudopeptídica. O ácido nucleico peptídico é descrito por Hyrup e Nielsen, Bioorganic & Medicinal Chemistry 4:5-23, 1996, e Hydig-Hielsen e Godskesen, WO 95/32305, cada um dos quais está aqui incorporado por referência.

[0074] A posição 2' do açúcar inclui, entre outros, H, OH, C1-C4 alcóxi, OCH2-CH=CH2, OCH2-CH=CH-CH3, OCH2-CH=CH-(CH2)nCH3 (n=0,1 ...30), halogênio (F, Cl, Br, I), C1-C6 alquila e OCH3. C1-C4 alcóxi e C1-C6 alquila podem ser ou podem incluir grupos que são de fita linear, ramificada ou cíclica.

[0075] O oligonucleotídeo pode também incluir um ou mais nucleotídeos ligados (BNA), ou seja, ácidos nucleicos com pelo menos um açúcar possuindo uma ponte entre duas das posições do anel de açúcar, tais como frações de açúcar ligados 1',4' ou 2',4' ou 3',4'. Veja, por exemplo, Takeshi Imanishi and Satoshi Obika, Chem. Commun., 2002, 1653-1659; Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research, 2009, 37(4):1225-1238; Hari et al., Tetrahedron, 2003, 59:5123-5128; Rahman et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2007, 46:4306-4309; Rahman et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130:4886-4896.

[0076] As bases do nucleotídeo podem ser qualquer uma entre adenina, guanina, citosina, timina, uracila, inosina ou as anteriores com modificações. Bases modificadas incluem, entre outras, N4-metil deoxiguanosina, purinas e pirimidinas deaza ou aza. Os nitrogênios do anel, tais como N1 da adenina, N7 da guanina, N3 da citosina podem estar alquilados. As bases pirimidínicas podem ser substituídas na posição 5 ou 6, e as bases purínicas podem ser substituídas na posição 2, 6 ou 8. Ver, por exemplo, Cook, WO 93/13121; Sanger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag, New York (1984), aqui incorporado por referência.

[0077] Os derivados dos nucleotídeos convencionais são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, moléculas possuindo um diferente tipo de açúcar. A posição O4' do açúcar pode ser substituída por S ou CH2. Por exemplo, uma sequência de reconhecimento de bases nucleotídicas pode ter frações ciclobutil ligadas por frações ligantes, em que as frações ciclobutil possuem bases heterocíclicas ligadas. Ver, por exemplo, Cook et al., Publicação Internacional WO 94/19023 (aqui incorporado por referência).

[0078] Outras modificações químicas aos oligonucleotídeos (por exemplo, sondas, oligonucleotídeos efetores) úteis para facilitar a entrega dos oligonucleotídeos às células incluem, entre outras, colesterol, peptídeos de transdução (por exemplo, TAT, penetratina, etc.).

[0079] Uma ou mais das bases 2'OH de estrutura tipo açúcar- fosfodiéster e purínica ou pirimidínica são modificadas. Em uma modalidade, a estrutura de desoxirribose é substituída por ácidos nucleicos peptídicos.

[0080] Os oligonucleotídeos efetores podem ser desenhados de modo que pelo menos um dos sítios de bases desemparelhadas no oligonucleotídeo efetor em relação ao seu alvo genômico correspondente esteja em qualquer posição dentro do oligo, incluindo na sua extremidade 5', extremidade 3', ou em um ponto dentro do oligo, por exemplo, posicionado em um sítio que esteja localizado em um sítio a partir da extremidade 5' do oligonucleotídeo que corresponde a 5%, 5 a 10%, 10 a 20%, 20 a 30%, 30 a 40%, 40 a 50%, 50 a 60%, 60 a 70%, 70 a 80%, 80 a 90%, ou 90 a 95% do comprimento total do oligo.

[0081] As bases desemparelhadas nos oligonucleotídeos efetores podem introduzir uma alteração da sequência de DNA no genoma que adiciona, substitui ou deleta bases do alvo genômico correspondente do oligonucleotídeo efetor após recombinação do oligonucleotídeo efetor no genoma. A adição de bases pode ser utilizada para 1) introduzir mutações de fase de leitura, 2) codificar aminoácidos adicionais na extremidade N-terminal, C-terminal ou dentro da proteína codificada pela sequência genética alvo onde esta sequência é uma sequência codificadora de proteína, 3) modificar o promotor de um gene de interesse, por exemplo, para aumentar ou diminuir ou para aumentar ou diminuir condicionalmente sua atividade, 4) modificar um elemento de regulação gênica ou de sequência de ligação ao DNA, 5) introduzir mutações silenciosas ou otimizar códons na sequência de codificação de um gene de interesse, 6) modificar sítios de reconhecimento de splicing dentro do genoma. A alteração de bases pode ser utilizada para 1) alterar aminoácidos na extremidade N-terminal, C-terminal ou dentro da proteína codificada pela sequência genética alvo onde esta sequência é uma sequência codificadora de proteína, 2) modificar o promotor de um gene de interesse, por exemplo, para aumentar ou diminuir ou para aumentar ou diminuir condicionalmente sua atividade, 3) modificar um elemento de regulação gênica ou de sequência de ligação ao DNA, 5) introduzir mutações silenciosas ou otimizar códons na sequência de codificação de um gene de interesse, 6) modificar os sítios de reconhecimento de splicing dentro do genoma. A deleção de bases pode ser utilizada para 1) introduzir mutações de fase de leitura, 2) deletar aminoácidos na extremidade N-terminal, C-terminal ou dentro da proteína codificada pela sequência genética alvo onde esta sequência é uma sequência codificadora de proteína, 3) modificar o promotor de um gene de interesse, por exemplo, para aumentar ou diminuir ou para aumentar ou diminuir condicionalmente sua atividade, 4) modificar um elemento de regulação gênica ou de sequência de ligação ao DNA, 5) introduzir mutações silenciosas ou otimizar códons na sequência de codificação de um gene de interesse, ou 6) modificar sítios de reconhecimento de splicing dentro do genoma.

[0082] Exemplos de oligonucleotídeos efetores incluem, sem limitação, um oligonucleotídeo efetor manipulado para gerar a variante Δ32 de CCR5, em que o oligonucleotídeo efetor possui uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, e SEQ ID NO:37. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo efetor possui uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, e SEQ ID NO:16. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo efetor possui uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:15, e SEQ ID NO:16. As SEQ ID NO:5-16 são apresentadas na Figura 4A, e as SEQ ID NOs: 17-37 são apresentadas no Exemplo 3.

[0083] Composições compreendendo oligonucleotídeos efetores são contempladas dentro do escopo da invenção. Em alguns aspectos, a composição inclui um excipiente farmaceuticamente aceitável. Por "farmaceuticamente aceitável", entende-se que o veículo, diluente ou excipiente deve ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não deletério para seu receptor. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica e incluem água estéril, as soluções isotônicas, tais como solução salina e solução salina tamponada com fosfato, e outros excipientes conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th edition, 1995, Gennavo, ed.)

D. Sequências e regiões alvo

[0084] Os oligonucleotídeos efetores interagem com sequências alvo e/ou regiões alvo. O efeito pretendido é sobre a(s) sequência(s) alvo e/ou regiões alvo. Em algumas modalidades, a sequência alvo é o DNA cromossômico. Em outras modalidades, a sequência alvo é DNA genômico.

[0085] A sequência alvo pode ser qualquer sequência cromossômica ou genômica, incluindo uma sequência que compreende um gene ou uma sequência que codifica um mRNA ou proteína. As sequências alvo podem incluir qualquer gene, incluindo qualquer variante ou forma alélica conhecida do gene, forma de polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP) do gene, forma de comprimento completo ou truncada do gene, forma mutada do gene, ou uma combinação de qualquer uma destas. As sequências alvo também podem corresponder a uma variante de um gene que está ligado ou associado com uma doença ou infecção ou suscetibilidade a uma doença ou infecção, em que oligonucleotídeos efetores correspondentes podem ser usados para corrigir, alterar ou eliminar a sequência associada com a doença ou infecção ou suscetibilidade à doença ou infecção. As sequências alvo podem também compreender sequência de DNA que compreende, em parte, a sequência genômica do hospedeiro e que, além disso, também compreende, em parte, sequência genômica derivada de uma fonte ou agente estranho, incluindo após um evento de integração, por exemplo, a sequência viral introduzida no genoma após integração de uma sequência de ácido nucleico viralmente codificada. As variantes ou formas de um gene que estão associadas ou ligadas com uma doença ou infecção ou suscetibilidade a uma doença ou infecção podem incluir a forma selvagem ou predominante do gene, ou podem variar a partir da variante ou forma selvagem do gene em relação a uma ou mais bases, em que a única ou mais bases variáveis possuem uma sequência diferente, são bases adicionais ou são bases que estão faltando ou que foram deletadas em comparação à forma selvagem ou predominante do gene.

[0086] Sequências alvo que codificam um RNA ou proteína podem codificar qualquer RNA ou proteína, incluindo uma forma de splicing alternativo do RNA ou proteína, ou uma variante genética conhecida do RNA ou proteína, incluindo uma variante genética conhecida do RNA ou proteínas associada com ou ligada a uma doença ou infecção ou suscetibilidade a uma doença ou infecção.

[0087] A sequência alvo pode também ser uma sequência de DNA cromossômico ou genômico que compreende um elemento regulador, incluindo um elemento regulador que pode regular ou influenciar o nível de expressão de um gene, por exemplo, um promotor ou o sítio de ligação de um fator de transcrição. A sequência alvo pode ser um elemento regulador de DNA que pode influenciar o dobramento ou a estrutura do DNA, incluindo a organização do genoma ou sua acessibilidade. Outros exemplos de sequências alvo incluem sequências que compreendem éxons, íntrons, sequências de consenso para sítios de reconhecimento éxon-íntron, sequências que se ligam a proteínas, elementos repetitivos de DNA, sequências que compõem telômeros ou repetições teloméricas, sequências que correspondem aos centrômeros, ou sequências que codificam RNAs incluindo RNAs codificadores e não codificadores, RNAs estruturais, mRNAs, RNA inibitórios, RNA antissenso, RNA responsáveis por mediar a interferência de RNA e/ou RNAs com atividade catalítica. Dependendo da natureza ou tipo de uma sequência alvo a ser editada, a sequência alvo pode compreender qualquer número de bases variando de 5 a 50000, 5 a 10, 10 a 30, 30 a 40, 40 a 100, 100 a 200, 200 a 500, 500 a 1000, 1000 a 2000, 2000 a 5000, 5000 a 10000, 10000 a 15000, 15000 a 20000, 20000 a 50000 ou mais do que 50000 bases.

[0088] No caso de uma sequência alvo que compreende uma forma variante ou sequência de um gene que está correlacionada, associada ou ligada a uma doença ou infecção ou à suscetibilidade a uma doença ou infecção, os oligonucleotídeos efetores correspondentes à sequência alvo podem ser desenhados para corrigir a variante ou alterá-la de tal modo que sua correlação, associação ou ligação com a doença ou infecção ou suscetibilidade à doença ou infecção seja alterada, reduzida ou eliminada.

[0089] No caso de uma sequência alvo que compreende uma forma variante ou sequência de um gene que está correlacionada, associada ou ligada a uma função fisiológica ou biológica que está implicada na saúde ou doença, os oligonucleotídeos efetores correspondentes à sequência alvo podem ser desenhados para alterar a variante de tal modo que sua função fisiológica ou biológica associada ou ligada seja alterada, melhorada, reduzida, ativada ou eliminada.

[0090] No caso de uma sequência alvo que compreende um promotor ou elemento regulador do gene, os oligonucleotídeos efetores correspondentes à sequência alvo podem ser desenhados para utilização e utilizados para alterar a sequência a fim de aumentar, diminuir, alterar, melhorar, ou eliminar a função ou atividade da sequência alvo.

[0091] Os oligonucleotídeos efetores podem ser utilizados para alterar qualquer sequência alvo no genoma, alterando a sequência, ou adicionando a ou deletando da sequência. Esta alteração pode compreender 1 a 100, 1 a 200, 1 a 300, 1 a 400, 1 a 500, ou mais bases, tais como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 a 15, 15 a 20, 20 a 25, 26 a 30, 31, 32, 33 a 40, 41 a 50, 50 a 60, 60 a 70, 70 a 100, ou mais do que 100 bases. Em algumas modalidades, a alteração compreende bases consecutivas, por exemplo, adição ou deleção de uma sequência. Em algumas modalidades, a alteração compreende bases não consecutivas, ou mais de um conjunto de bases consecutivas, por exemplo, deleção de uma ou mais bases de locais diferentes (não consecutivos) na sequência alvo, ou adição e/ou deleção de mais de uma sequência, onde as duas sequências adicionadas e/ou deletadas não são consecutivas, ou quaisquer combinações das mesmas.

[0092] As sequências alvo podem ser genes ou regiões gênicas que estão associadas com, correlacionam-se com ou causam doenças, ou suscetibilidade à doença ou infecção, e outras condições fisiológicas. Os oligonucleotídeos efetores da invenção podem ser usados para se dirigirem contra sequências onde duas ou mais bases produzem doenças ou resultam na suscetibilidade a uma doença. Em alguns casos, a sequência alvo é um receptor viral, tal como um receptor do HIV. Um exemplo não limitante é a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) que é causada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV). A sequência alvo do oligonucleotídeo efetor é um receptor do HIV, tal como CCR5. Em um exemplo, o desemparelhamento no oligonucleotídeo efetor é uma deleção. Por exemplo, o oligonucleotídeo efetor não se emparelha com uma sequência alvo a ser deletada, mas se emparelha com as sequências no alvo que estão antes e depois da sequência a ser deletada. Em um exemplo, uma sequência alvo de 32 bases é deletada em uma variante de Δ32 do CCR5, em que a variante Δ32 é comparada com a sequência selvagem de CCR5. O oligonucleotídeo efetor compreende uma sequência que emparelhamentos com a sequência alvo antes da sequência Δ32 a ser deletada e compreende emparelhamentos para a sequência alvo após a sequência Δ32 a ser deletada, mas não se emparelha à sequência Δ32 a ser deletada. Tais deleções podem ser efetuadas de forma semelhante em qualquer sequência alvo para fornecer a célula resultante possuindo a sequência desejada deletada.

E. Métodos de utilização dos oligonucleotídeos efetores para a edição genômica

[0093] Os oligonucleotídeos efetores podem ser contatados com as células ou introduzidos nas células. Vários parâmetros podem ser alterados para aumentar a eficiência da alteração do genoma mediada por oligonucleotídeos efetores. Parâmetros, e quaisquer combinações dos mesmos, que podem ser ajustados para aumentar a eficiência do processo de incluir qualquer um de: alteração das condições utilizadas para introduzir oligonucleotídeos efetores nas células, incluindo a utilização de células em pontos específicos no ciclo celular, estimulação das células utilizadas, variação de métodos utilizados para introduzir oligonucleotídeos efetores nas células, incluindo eletroporação ou introdução quimicamente mediada de oligonucleotídeos, variação da densidade de células expostas aos oligonucleotídeos efetores, variação da concentração de oligonucleotídeos efetores, variação dos tempos de incubação e das temperaturas utilizados durante a introdução dos oligonucleotídeos efetores e, após esta etapa, bem como a adição de concentrações variadas de um ou mais reagentes que aumentam a introdução de ácido nucleico nas células, ou as frequências de recombinação ou eficiência de recombinação do oligonucleotídeo efetor com o genoma de células, durante as etapas utilizadas para introduzir oligonucleotídeos efetores nas células bem como durante as etapas anteriores e subsequentes de incubação. Reagentes de PNA ou oligonucleotídeos pseudocomplementares (tais como aqueles descritos na Patente US 8.309.356, cuja divulgação está aqui incorporada por referência) e outras moléculas que têm como alvo e se ligam a ou na proximidade das sequências alvo de oligonucleotídeos efetores podem também ser usados para aumentar a eficiência da alteração do genoma mediada por oligonucleotídeos efetores.

[0094] As células enriquecidas ou selecionadas para células em pontos particulares do ciclo celular podem ser utilizadas para aumentar a eficiência da alteração do genoma mediada por oligonucleotídeos efetores. A organização do genoma de uma célula e a acessibilidade de determinados genes em uma célula podem variar em função das condições utilizadas para cultivar as células ou o estágio ou ponto das células no ciclo celular (incluindo mitose, G0, G1, G2 ou fase S ou senescência). As células usadas podem ser cultivadas em diferentes condições de cultura ou podem ser sincronizadas de modo a enriquecer ou selecionar células em um determinado estágio ou ponto no ciclo celular. Por exemplo, meio risco em nutrientes ou esgotado de nutrientes pode ser utilizado para cultivar células (por exemplo, a concentração de soro, fatores de crescimento, citocinas, açúcares, aminoácidos, vitaminas, hormônios de crescimento ou qualquer um ou mais destes ou de outros reagentes utilizados na cultura de tecidos variar). Além disso, meio condicionado pode ser utilizado ou as células podem ser cultivadas na presença de células irradiadas ou alimentadoras. As células usadas podem ser sincronizadas em qualquer estágio ou ponto do ciclo celular por meio de agentes químicos, por privação de nutrientes, ou por métodos mecânicos de repique. Métodos mecânicos de repique para sincronizar as células incluem o aproveitamento da menor aderência das células mitóticas à superfície das cubas de crescimento em que bater nos frascos leva à liberação preferencial na cultura, que podem ser então coletadas para enriquecer células mitóticas. As células podem ser utilizadas enquanto estão em um estágio do ciclo celular ou após a liberação de tal estágio. Um ou mais destes métodos podem ser aplicados a qualquer tipo de célula, fornecendo células em diferentes condições ou estados.

[0095] A estimulação das células utilizadas pode também ser ajustada para aumentar a eficiência da alteração do genoma mediada por oligonucleotídeos efetores. As células usadas podem ser estimuladas ou tratadas com substâncias químicas ou reagentes em qualquer ponto durante as etapas do método, incluindo antes, durante ou após a introdução de oligonucleotídeos efetores nas células, por exemplo, utilizando eletroporação. Por exemplo, as células podem ser expostas a fatores de crescimento, fatores de sinalização celular, hormônios, citocinas, nutrientes, toxinas, agentes mutagênicos, fármacos, açúcares, ingredientes de meios de cultura de tecidos, soro, proteínas, substâncias químicas, moléculas pequenas ou uma mistura de um ou mais destes. Tais agentes podem alterar as propriedades de crescimento ou estado das células, a permeabilidade das células, a organização do genoma das células, a acessibilidade dos genes alvo dentro das células, a expressão de genes incluindo genes alvo pelas células, a viabilidade das células ou outras propriedades das células.

[0096] Os métodos utilizados para introduzir oligonucleotídeos efetores nas células, incluindo eletroporação ou introdução de oligonucleotídeos efetores mediada quimicamente, também podem ser ajustados para aumentar a eficiência da alteração do genoma mediada por oligonucleotídeos efetores. Dependendo do tipo de célula, há um grande número de métodos que podem ser utilizados para introduzir moléculas tais como os oligonucleotídeos, oligonucleotídeos quimicamente modificados e oligonucleotídeos marcados nas células. Os ácidos nucleicos, incluindo oligonucleotídeos efetores, podem ser introduzidos nas células utilizando métodos conhecidos. As técnicas para a introdução de ácidos nucleicos nas células são bem conhecidas e facilmente apreciadas pelos especialistas. Os métodos incluem, entre outros, transfecção, entrega viral, inserção mediada por proteína ou peptídeo, métodos de coprecipitação, reagentes de entrega à base de lipídios (lipofecção), citofecção, entrega por lipopoliamina, reagentes de entrega por dendrímero, eletroporação ou entrega mecânica. Exemplos de reagentes de transfecção são GENEPORTER, GENEPORTER2, LIPOFECTAMINE, LIPOFECTAMINE 2000, FUGENE 6, FUGENE HD, TFX-10, TFX-20, TFX-50, OLIGOFECTAMINE, TRANSFAST, TRANSFECTAM, GENESHUTTLE, TROJENE, GENESILENCER, X- TREMEGENE, PERFECTIN, CYTOFECTIN, SIPORT, UNIFECTOR, SIFECTOR, TRANSIT-LT1, TRANSIT-LT2, TRANSIT-EXPRESS, IFECT, RNAISHUTTLE, METAFECTENE, LYOVEC, LIPOTAXI, GENEERASER, GENEJUICE, CYTOPURE, JETSI, JETPEI, MEGAFECTIN, POLYFECT, TRANSMESSANGER, RNAiFECT, SUPERFECT, EFFECTENE, TF-PEI-KIT, CLONFECTIN, e METAFECTINE. Além da utilização de reagentes químicos utilizados para transfectar estas e outras moléculas nas células, a eletroporação pode ser utilizada. Além disso, podem ser utilizados meios mecânicos, incluindo, por exemplo, passar uma mistura de células na presença das moléculas a serem introduzidas através de uma agulha de seringa várias vezes ou por raspagem celular, onde um raspador de células é utilizado para raspar as células em crescimento em um frasco de cultura na presença da molécula a ser introduzida. Além disso, reagentes formadores de poros podem ser utilizados para criar furos nas membranas celulares através dos quais as moléculas a serem introduzidas podem passar. Outros métodos incluem nanopartículas que são desenhadas para penetrar nas células, onde estas podem ser complexadas com ou revestidas pela molécula a ser entregue. Podem também ser utilizados métodos balísticos incluindo biobalística. A difusão passiva de moléculas adicionadas aos meios de cultura pode também ser utilizada. O método de escolha depende do tipo de célula a ser utilizado e intenso ensinamento na técnica existe de modo que o método apropriado para um determinado tipo de célula ou aplicação possa ser selecionado.

[0097] Outro parâmetro que pode ser ajustado para aumentar a eficiência da alteração do genoma mediada por oligonucleotídeos efetores é variando a densidade de células expostas aos oligonucleotídeos efetores. Podem ser utilizadas densidades celulares variando de 10.000 células/mL ou menos até 10.000.000 células/mL ou mais. Em algumas modalidades, a densidade celular varia de 10.000 células/mL a 100.000.000 células/mL, 10.000 células/mL a 50.000.000 células/mL, 10.000 células/mL a 10.000.000 células/mL, 50.000 células/mL a 10.000.000 células/mL, 100,000 células/mL a 10.000.000 células/mL, 500000 células/mL a 10.000.000 células/mL ou 1.000.000 células/mL a 10.000.000 células/mL. Quando expostas ao oligonucleotídeo efetor, a concentração de células utilizadas pode depender do método que é usado para introduzir os reagentes, tais como oligonucleotídeos efetores ou sondas fluorogênicas nas células.

[0098] Outro parâmetro que pode ser ajustado para aumentar a eficiência da alteração do genoma mediada por oligonucleotídeos efetores é a concentração de oligonucleotídeos efetores. A concentração de oligonucleotídeos efetores a ser utilizada pode variar de concentrações nM a concentrações mM, por exemplo, variando de 1 nM a 1000 mm, 50 nM a 100 mM, ou 100 nM a 1 mM. Na maioria dos casos, os oligonucleotídeos efetores seriam usados em concentrações μM, por exemplo, 0,1 μM a 1000 μM, 0,1 a 100 μM, 0,1 a 50 μM, 0,1 a 10 μM, ou 0,1 a 1 μM. A concentração exata do oligonucleotídeo efetor utilizada pode ser otimizada empiricamente dependendo de fatores, incluindo o tipo de célula e método de administração utilizado, assim como, por exemplo, a acessibilidade do alvo ou a eficiência com que um oligonucleotídeo efetor em particular é recombinado no genoma em seu sítio alvo correspondente.

[0099] A eficiência da alteração do genoma mediada por oligonucleotídeos efetores também pode ser aumentada através da variação dos tempos de incubação utilizados durante a introdução do oligonucleotídeo efetor nas células. Nos métodos utilizados para expor ou contatar as células aos oligonucleotídeos efetores ou para introduzir oligonucleotídeos efetores nas células, há uma série de possíveis etapas de incubação, cuja duração de qualquer uma pode variar, incluindo, entre outros: 1) dependendo do método de entrega usado, os reagentes utilizados para mediar ou facilitar a entrega de oligonucleotídeos podem ser incubados e pré-incubados com o oligonucleotídeo efetor, 2) as células podem ser incubadas com oligonucleotídeo efetor, possivelmente na presença de outros reagentes, e 3) as células podem ser incubadas com o oligonucleotídeo efetor após etapas, tais como eletroporação, métodos quimicamente mediados ou mecânicos utilizados para introduzir os oligonucleotídeos efetores. Estas incubações podem ocorrer de 1 a 5 minutos até 1 a 5 horas até pernoite ou mais tempo. Por exemplo, após a etapa utilizada para introduzir oligonucleotídeos efetores nas células, as células podem ser incubadas ou cultivadas sem a remoção dos oligonucleotídeos efetores ou dos meios utilizados durante esta etapa. Neste caso, as células podem ser incubadas durante vários dias no mesmo meio utilizado durante esta etapa, ou meio adicional pode ser adicionado em algum momento posterior após pelo menos 1 a 2 horas até 1 a 5 dias ou mais tempo em cultura.

[00100] A eficiência da alteração do genoma mediada por oligonucleotídeos efetores também pode ser aumentada através da variação das temperaturas utilizadas durante uma ou mais das etapas de incubação. Em algumas modalidades, para as incubações aqui descritas, a temperatura pode variar de frio glacial (ou seja, de 0 a 4°C) a 65°C, dependendo da duração da incubação. Geralmente, as temperaturas de incubação que são compatíveis com a viabilidade celular variam de frio glacial a 37°C ou 37 a 45°C. Incubações em temperaturas mais elevadas também podem ser usadas, por exemplo, até ou maior do que 45°C a 70°C; no entanto, dependendo do tipo de célula, estas incubações devem ser de 1 a 5 minutos até menos de 60 minutos, a fim de preservar a viabilidade celular. Na maioria dos casos, as incubações irão variar na temperatura de frio glacial a 37°C.

[00101] Outro parâmetro que pode ser ajustado para aumentar a eficiência da alteração do genoma mediada por oligonucleotídeos efetores é pela adição de várias concentrações de um ou mais reagentes que aumentam a introdução de ácidos nucleicos nas células ou que aumentam as frequências de recombinação ou a eficiência nas células. Os reagentes que podem ser utilizados incluem DMSO ou outros solventes que desempenham um papel na permeabilidade celular e acessibilidade ao oligonucleotídeo/DNA/estrutura genômica ou a associação entre dois ou mais ácidos nucleicos, incluindo oligonucleotídeos efetores e sequências alvo. No caso de DMSO, as concentrações que variam de 0,1% a 5% seriam as mais preferidas, embora para incubações mais curtas possam ser utilizadas concentrações até 10% ou mais. Outros reagentes a serem utilizados aqui incluem polietilenoglicol, heparina e/ou dextranos de vários comprimentos.

[00102] O número de oligonucleotídeos efetores utilizados pode ser variado para aumentar a eficiência da alteração do genoma mediada por oligonucleotídeos efetores. Em uma modalidade, podem ser utilizados dois ou mais oligonucleotídeos efetores para genes diferentes. Alternativamente, podem ser utilizados dois ou mais oligonucleotídeos efetores para o mesmo gene, mas dirigidos contra diferentes frações do mesmo gene, em que a detecção de células positivas para a recombinação mediada por cada um destes diferentes oligonucleotídeos efetores pode ser usada para enriquecer células que sofreram recombinação em ambos os loci cromossômicos do gene alvo. Além disso, dois ou mais oligonucleotídeos efetores desenhados para alterar o mesmo ponto ou sequência no mesmo gene ou alvo podem ser utilizados, por exemplo, onde cada um dos oligonucleotídeos efetores pode variar em comprimento, ou por modificação química. Neste caso, todos os oligonucleotídeos efetores seriam desenhados para corresponder a uma fita da sequência alvo, de tal modo que eles não hibridizem entre si.

I. Células para uso com oligonucleotídeos efetores

[00103] Tal como apresentado nos exemplos de Figuras, a Figura 5 mostra os resultados para dois tipos de células de mamíferos, células K562 e THP, tratadas com os oligonucleotídeos efetores descritos na Figura 4. As etapas e os métodos utilizados para introduzir oligonucleotídeos efetores nas células implicam métodos conhecidos na técnica, e existem métodos análogos para introduzir oligonucleotídeos efetores em outros tipos de células. As etapas relativas à recombinação mediada por oligonucleotídeos efetores subsequente à introdução de oligonucleotídeos efetores nas células não são específicas para o tipo de célula. Por conseguinte, os métodos descritos aqui podem ser aplicados a tipos celulares adicionais, incluindo os tipos de células de origem bacteriana e eucariótica, incluindo de origem de mamíferos, humana, animais, plantas, leveduras, insetos e répteis. Tipos de células de mamíferos que podem ser usados incluem células-tronco e células adultas ou diferenciadas de diferentes origens. Os tipos de células- tronco que podem ser usados incluem células-tronco embrionárias, células-tronco pluripotentes induzidas, células-tronco adultas, células- tronco hematopoiéticas, células-tronco adultas provenientes de vários tecidos ou órgãos de vários tipos, células-tronco do sangue do cordão umbilical, e células-tronco de câncer. Os tipos adicionais de células incluem células progenitoras multipotentes, células progenitoras restritas em linhagem, células progenitoras mieloides comuns, células progenitoras de granulócito-macrófago, e células progenitoras de megacariócito-eritroide. Tipos de células diferenciadas que podem ser usados incluem células imunes, células musculares, células musculares cardíacas, células do olho, células da pele, células ciliadas, células epiteliais, células do pulmão, células de rim, células intersticiais, células neuronais e qualquer outro tipo de célula que seja encontrado no corpo.

[00104] Qualquer tipo de célula desejado pode ser utilizado para as células da invenção. As células podem ser procarióticas ou eucarióticas. As células podem expressar a proteína de interesse (ou seja, uma proteína que será alterada pelo tratamento com o oligonucleotídeo efetor) no seu estado nativo ou não. As células eucarióticas que podem ser utilizadas incluem, entre outras, células de fungos tais como células de levedura, células vegetais e células animais. As células animais que podem ser utilizadas incluem, entre outras, células de mamíferos e células de inseto, e células primárias ou imortalizadas derivadas de camadas da mesoderma, ectoderma ou endoderme de organismos eucarióticos. As células podem ser endoteliais, epidérmicas, mesenquimais, neuronais, renais, hepáticas, hematopoiéticas ou células imunes. Por exemplo, as células podem ser células das criptas ou vilosidades intestinais, células de Clara, células do cólon, células intestinais, células caliciformes, células enterocromafim, células enteroendócrinas. As células de mamíferos que são úteis no método incluem, entre outras, células humanas, de primatas não humanos, vaca, cavalo, cabra, ovelha, porco, roedor (incluindo camundongo, rato, hamster, cobaia), marsupiais, coelho, cão e gato. As células podem ser células diferenciadas ou células-tronco, incluindo células-tronco embrionárias.

[00105] As células da invenção podem ser primárias, transformadas, oncogenicamente transformadas, viralmente transformadas, imortalizadas, condicionalmente transformadas, explantes, células de seções teciduais, animais, plantas, fungos, protistas, arqueobactérias e eubactérias, mamíferos, aves, peixes, répteis, anfíbios e artrópodes, aviárias, galinha, réptil, anfíbio, rã, lagarto, serpente, peixes, vermes, lula, lagosta, ouriço-do-mar, lesma do mar, ascídia, mosca, lula, hidra, artrópodes, besouros, frango, lampreia, peixe-arroz, mandarim, baiacu, e peixe-zebra.

[00106] Além disso, células tais como células imunes/sanguíneas, endócrinas (tireoide, paratireoide, suprarrenal), gastrointestinais (boca, estômago, intestino), hepáticas, pancreáticas, da vesícula biliar, respiratórias (pulmão, traqueia, faringe), cartilaginosas, ósseas, musculares, da pele, pelos, urinárias (rim, bexiga) e reprodutivas (esperma, óvulo, testículos, útero, ovário, pênis, vagina), sensoriais (olho, orelha, nariz, boca, língua, neurônios sensoriais), células sanguíneas/imunes tais como células B, células T (células T citotóxicas, células T natural killer, células T reguladoras, células T auxiliares, células T Yδ), células natural killer, granulócitos (granulócitos basófilos, granulócitos eosinófilos, granulócitos neutrófilos/neutrófilos hipersegmentados), monócitos/macrófagos, eritrócitos (reticulócitos), mastócitos, trombócitos/megacariócitos, células dendríticas; células endócrinas tais como: células da tireoide (células epiteliais da tireoide, célula parafolicular), paratireoide (células principais da paratireoide, células oxífilas), suprarrenais (células cromafins), células do sistema nervoso tais como: células gliais (astrócitos, microglia), célula neurossecretora magnocelular, célula estrelada, celular nuclear em fita, célula de Boettcher, hipofisária (gonadotrópica, corticotrópica, tireotrópica, somatotrópica, lactotrófica), células do sistema respiratório como pneumócitos (pneumócito tipo I, pneumócito tipo II), células de Clara, células caliciformes; células do sistema circulatório tais como miocardiócitos, pericitos; células do sistema digestivo como estômago (célula principal gástrica, células parietais), células caliciformes, células de Paneth, células G, células D, células ECL, células I, células K, células enteroendócrinas, célula enterocromafim, célula APUD, fígado (hepatócitos, células de Kupffer), pâncreas (células beta, células alfa), vesícula biliar; células da cartilagem/osso/músculo/sistema tegumentar, como osteoblastos, osteócitos, osteoclastos, células dentárias (cementoblastos, ameloblastos), células de cartilagem: condroblastos, condrócitos, células da pele/cabelo: tricócitos, queratinócitos, melanócitos, células musculares: miócitos, adipócitos, fibroblastos, células do sistema urinário, como podócitos, célula justaglomerular, célula mesangial intraglomerular/célula mesangial extraglomerular, célula das microvilosidades do túbulo renal proximal, célula da mácula densa; células do sistema reprodutor, como espermatozoide, células de Sertoli, células de Leydig, óvulo, célula do folículo ovariano; células sensoriais, como órgão de células de Corti, epitélio olfativo, neurônios sensoriais sensíveis à temperatura, células de Merckel, neurônio receptor olfativo, neurônios sensíveis à dor, células fotorreceptoras, células do paladar, células ciliadas do aparelho vestibular, células do corpo carotídeo são úteis para produzir as células ou linhagens celulares da invenção.

[00107] As células vegetais que são úteis incluem raízes, caules e folhas e os tecidos vegetais incluem tecidos meristemáticos, parênquima, colênquima, esclerênquima, tecidos secretores, xilema, floema, epiderme, periderme (casca).

[00108] As células que são úteis para as células e linhagens celulares da invenção também incluem, entre outras: células de ovário de hamster chinês (CHO), linhagens de células neuronais estabelecidas, feocromocitomas, fibroblastos de neuroblastomas, rabdomiossarcomas, células do gânglio da raiz dorsal, células NS0, células CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BSC-1 (ATCC CCL 26), MRC-5 (ATCC CCL 171), células L, HEK-293 (ATCC CRL1573) e PC12 (ATCC CRL-1721), HEK293T (ATCC CRL- 11268), RBL (ATCC CRL-1378), SH-SY5Y (ATCC CRL-2266), MDCK (ATCC CCL-34), SJ-RH30 (ATCC CRL-2061), HepG2 (ATCC HB- 8065), ND7/23 (ECACC 92090903), CHO (ECACC 85050302), Vero (ATCC CCL 81), Caco-2 (ATCC HTB 37), K562 (ATCC CCL 243), Jurkat (ATCC TIB-152), Per.C6 (Crucell, Leiden, The Netherlands), Huvec (ATCC Human Primary PCS 100-010, Mouse CRL 2514, CRL 2515, CRL 2516), HuH-7D12 (ECACC 01042712), 293 (ATCC CRL 10852), A549 (ATCC CCL 185), IMR-90 (ATCC CCL 186), MCF-7 (ATC HTB- 22), U-2 OS (ATCC HTB-96), T84 (ATCC CCL 248), ou qualquer linhagem celular estabelecida (polarizada ou não polarizada) ou qualquer linhagem celular disponível a partir de repositórios, como American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Blvd. Manassas, Va. 20110-2209 EUA) ou European Collection of Cell Cultures (ECACC, Salisbury Wiltshire SP4 0JG England).

[00109] Além disso, as células que são úteis no método da invenção são células de mamífero suscetíveis ao crescimento em meio contendo soro, meio isento de soro, meio totalmente definido sem quaisquer produtos derivados de animais, e células que podem ser convertidas a partir de uma destas condições para outra.

II. Composição de células-tronco e métodos para a modificação de células-tronco

[00110] A invenção apresenta uma composição de células-tronco e/ou uma população de células-tronco que foram manipuladas usando um oligonucleotídeo efetor, tal como aqui descrito. Em alguns casos, as células-tronco foram manipuladas para serem refratárias à infecção pelo HIV. Em um exemplo, isto é obtido através da introdução de uma mutação no gene de CCR5 que cria uma mutação de fase de leitura. Em uma modalidade, a variante CCR5 possui 32 bases deletadas a partir de CCR5 para criar uma variante de CCR5. Especificamente, a variante Δ32 de CCR5 é criado por uma deleção de 32 bases do gene, resultando em uma mutação de fase de leitura. Esta deleção ocorre a jusante do códon de iniciação em uma posição de tal modo que 52% anteriores de CCR5 mais um adicional de 31 novos aminoácidos da extremidade carbóxi-terminal codificados pela mutação de fase de leitura persistam. Em outras modalidades, uma variante de CCR5 é gerada de tal modo que menos de 32 bases são deletadas, mas ainda resulta em uma mutação de fase de leitura de tal modo que novos aminoácidos adicionais da extremidade carbóxi-terminal sejam codificados pela mutação de fase de leitura.

[00111] As células-tronco que são usadas para a invenção podem ser obtidas a partir de diferentes fontes de partida, incluindo, entre outras, sangue periférico, culturas de células, tecidos adultos ou fetais. As células- tronco que são utilizadas para a invenção para a manipulação molecular são as células que têm capacidade de autorregeneração e a capacidade de se tornaram outro tipo de célula em sua via de diferenciação. As células- tronco que são usadas como uma fonte de partida podem ser totipotentes, pluripotentes, multipotentes, oligopotentes e/ou unipotentes. Em algumas modalidades, as células são obtidas a partir de sangue periférico. Em outras modalidades, um tratamento é utilizado para mobilizar células- tronco imunes no sangue periférico antes de o sangue ser coletado, incluindo, entre outros, tratamento com uma citocina tal como G-CSF. Em outras modalidades, as células são obtidas a partir de sangue do cordão umbilical.

[00112] Em outras modalidades, o ciclo inicial das células-tronco pode ser células-tronco pluripotentes induzidas (células iPS de iPSC). Como é conhecido por um especialista na técnica, as células iPS pode ser obtidas pela introdução de um coquetel de genes nas células diferenciadas. O coquetel de genes inclui, entre outros, Oct 3/4, Sox2, Nanog, c-Myc e LIN-28. Alternativamente, uma mistura de substâncias químicas conhecidas por um especialista na técnica, compostos estruturalmente relacionados, compostos funcionalmente relacionados ou uma combinação destes pode ser usada para gerar células iPS. Ver, por exemplo, Hou P., et al. Science Vol. 341 No. 6146 pp. 651-654; August 9, 2013. Em algumas modalidades, o sistema transponível combinado é usado para introduzir a mistura de genes para uma produção sem vestígios de iPSC onde os genes podem ser removidos após sua atividade desejada sem pegadas de DNA ou resíduos de DNA deixados para trás sobre o genoma das células tratadas. Veja, por exemplo, Lacoste, A., et al., Cell Stem Cell. 2009 Sep 4;5(3):332-42. doi: 10.1016/j.stem.2009.07.011.

[00113] Em outras modalidades, as células são obtidas a partir de tecidos adultos ou fetais, incluindo um órgão, a medula óssea, baço, timo ou fígado. Os métodos para o isolamento de vários tipos de células- tronco a partir destes órgãos são conhecidos pelos especialistas na técnica.

[00114] Outros exemplos não limitantes de células de partida que podem ser utilizados incluem: células-tronco que estão ou não sujeitas à infecção pelo HIV, células-tronco em que o lócus genético compreende o gene CCR5 está ou não está transcricionalmente ativo nas células-tronco.

[00115] Em outras modalidades, os tipos de células-tronco podem ser qualquer uma ou mais das células no grupo que consiste em células- tronco embrionárias, células-tronco pluripotentes induzidas, células- tronco hematopoiéticas, células-tronco do cordão umbilical, células progenitoras multipotentes, células progenitoras restritas em linhagem, células progenitoras mieloides comuns, células progenitoras de granulócito-macrófago e células progenitoras de megacariócito- eritroide.

[00116] Em outras modalidades, as células-tronco que são utilizadas expressam um ou mais dos marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em: CD34, CD133, CD105, CD45, CD59, Thy1 (CD90), C- kit (CD117) e família SLAM de marcadores da superfície celular. Em algumas modalidades, a família SLAM de marcadores de superfície celular é selecionada a partir do grupo que consiste em CD48, CD150 e CD244. Em outras modalidades, as células-tronco não expressam um ou mais dos marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em: CD13, CD33, CD71, CD19 e CD61.

[00117] Em outras modalidades, as células-tronco compreendem um RNA correspondendo a um marcador de célula-tronco intracelular, não localizado da superfície celular ou localizado na superfície celular. Exemplos adicionais não limitantes destes marcadores de células- tronco incluem as famílias de genes de fatores de transcrição, genes de vias de sinalização, genes de quinases. Ver, por exemplo, Kim Y.C., et al. PNAS Vol. 106(20):8278-83 (2009), cujo conteúdo está aqui expressamente incorporado para os marcadores, perfis de expressão gênica e assinaturas gênicas de células-tronco hematopoiéticas CD34+. Exemplos não limitantes de famílias de genes de fatores de transcrição incluem: zf-C2H2, KRAB, Homeobox, HLH, BTB, SCAN, receptor hormonal, zf-C4, bZIP, ETS, Fork head, PAS, TIG, PHD, GATA, e MYB de ligação ao DNA. Exemplos não limitantes de genes da via de sinalização detectados em células hematopoiéticas CD34+ incluem: via de sinalização do cálcio, via de sinalização de ERB B, via de sinalização de Hedgehog, via de sinalização de JAK-STAT, via de sinalização de MAPK, via de sinalização de mTOR, via de sinalização de Notch, sistema de sinalização do fosfatidilinositol, via de sinalização de TGF- beta, via de sinalização do VEGF, e via de sinalização de WNT. Exemplos não limitantes de genes de quinases detectados em células hematopoiéticas CD34+ incluem: AGC, quinases atípicas reguladas por cálcio/calmodulina, quinase caseína, CMGC, receptor da guanilato ciclase, STE, semelhante à tirosina-quinase, e tirosina-quinases. Outros marcadores e perfis de expressão que podem ser utilizados são revelados em Liu, X., et. al., J. Leukocyte Biology, Vol 82 (4) pp 9861002, October 2007, cujo conteúdo está aqui expressamente incorporado para os marcadores, perfis de expressão gênica e assinaturas gênicas de células-tronco hematopoiéticas CD34+.

[00118] A fonte inicial de células-tronco inclui células-tronco onde existe pelo menos uma cópia de CCR5 selvagem. Isto é, as células- tronco que contêm, pelo menos, uma cópia de CCR5, que não têm quaisquer mutações em CCR5, deleções em CCR5 (por exemplo, resultando em uma fase de leitura), e/ou truncamento em CCR5. Em alguns casos, as células-tronco contêm 2 cópias do CCR5 selvagem. Em alguns casos, as células-tronco possuem uma ou duas cópias de uma variante do CCR5 que codifica uma proteína que pode agir como um receptor ou correceptor para a entrada ou acoplamento do HIV.

[00119] Além disso, a fonte inicial de células-tronco inclui as células- tronco que têm o potencial de se tornarem infectadas pelo HIV e/ou células-tronco que podem se diferenciar em células que poderiam se tornar infectadas pelo HIV. Os exemplos não limitantes incluem as células-tronco que podem se tornar células imunes, tais como células T CD4+ e células-tronco CD4+.

F. Detecção, seleção e/ou isolamento de células com edição mediada por oligonucleotídeos efetores

[00120] Após o tratamento de células com oligonucleotídeos efetores destinados a alterar o genoma das células, sondas de oligonucleotídeo fluorogênico em combinação com a separação de células ativada por fluorescência podem ser utilizadas para detectar e isolar seletivamente as células otimamente modificadas raras que compreendem a sequência genética alterada resultante da recombinação da sequência desemparelhada codificada pelo oligonucleotídeo efetor no genoma. A fim de aumentar a razão entre sinal e ruído para a detecção de células otimamente manipuladas a partir de células não manipuladas utilizando as sondas fluorogênicas dirigidas para detectar a sequência alterada, oligonucleotídeos efetores desenhados para introduzir mais do que um desemparelhamento foram testados. Oligonucleotídeos efetores que compreendem mais do que um único desemparelhamento resultaram em alteração do genoma mediada por oligonucleotídeos efetores, um resultado inesperado em vista do ensinamento na técnica de que os oligonucleotídeos efetores devem ser essencialmente idênticos às suas sequências alvo correspondentes.

[00121] Em algumas modalidades, após a alteração do genoma mediada por oligonucleotídeos efetores nas células, células otimamente manipuladas podem ser detectadas e isoladas utilizando sondas de oligonucleotídeo fluorogênico. Exemplos de métodos e composições que podem ser utilizados para a detecção e/ou isolamento incluem US2006/147937, US2010/212040, US2009/106853, e US2012/015841 (cujos conteúdos estão aqui expressamente incorporados por referência para o ensino de sondas de oligonucleotídeo fluorogênico, e outras composições para a detecção e/ou isolamento de células manipuladas). Em algumas modalidades em que a recombinação mediada por oligonucleotídeos efetores resulta na expressão de uma sequência genética alterada após eventos de recombinação, as células que tinham sofrido recombinação podem ser detectadas de forma positiva ou isoladas utilizando sondas fluorogênicas que são desenhadas para detectar e relatar a presença da sequência expressa resultante. Em algumas modalidades em que a recombinação mediada por oligonucleotídeos efetores resulta na expressão de uma sequência genética alterada após eventos de recombinação, células que tinham sofrido recombinação podem ser negativamente detectadas ou isoladas utilizando sondas fluorogênicas que são desenhadas para detectar e relatar a presença da sequência expressa original não recombinada. Em algumas modalidades em que a recombinação mediada por oligonucleotídeos efetores resulta na expressão de uma sequência genética alterada após eventos de recombinação, células que tinham sofrido recombinação podem ser detectadas de forma positiva ou isoladas utilizando sondas fluorogênicas que são desenhadas para detectar um alvo dentro da sequência expressa que está presente em ambas as sequências recombinada e não recombinada, mas que é detectável ou acessível diferencialmente em células que compreendem a sequência recombinada. Em algumas modalidades em que a recombinação mediada por oligonucleotídeos efetores resulta na expressão de uma sequência genética alterada após eventos de recombinação, células que tinham sofrido recombinação podem ser detectadas de forma negativa utilizando sondas fluorogênicas que são desenhadas para detectar um alvo dentro da sequência expressa que está presente em ambas as sequências recombinada e não recombinada, mas que é detectável ou acessível diferencialmente em células que compreendem a sequência não recombinada. Em algumas modalidades em que a recombinação mediada por oligonucleotídeos efetores resulta no aumento da expressão de uma sequência genética, as células que tinham sofrido recombinação podem ser detectadas positivamente usando sondas fluorogênicas que são desenhadas para detectar e relatar a presença da sequência expressa, em que as células com um aumento de sinal para a sonda seriam identificadas. Em algumas modalidades em que a recombinação mediada por oligonucleotídeos efetores resulta na diminuição da expressão de uma sequência genética, as células que tinham sofrido recombinação podem ser detectadas de forma negativa utilizando sondas fluorogênicas que são elaboradas para detectar e relatar a presença da sequência expressa, em que as células com um sinal de diminuição para a sonda seriam identificadas.

[00122] Em qualquer um dos exemplos acima, as células que são detectadas positivamente ou negativamente podem ser isoladas, por exemplo, utilizando separação de células ativada por fluorescência. As células isoladas podem ser isoladas individualmente ou em lotes ou agregados. As células isoladas podem ser clonalmente expandidas em cultura, ou em agregados ou lotes. A cultura celular expandida resultante pode ser ainda processada para remover o meio de cultura das células resultantes, e as células podem ser ressuspensas em um meio apropriado para utilização em terapia celular.

[00123] Células tratadas com oligonucleotídeos efetores ou células que são células isoladas ou as células expandidas a partir das células isoladas podem ser submetidas á análise a jusante, incluindo PCR, PCR genômica, RT-PCR, sequenciamento de DNA, sequenciamento do genoma completo, hibridização in situ, imunofluorescência, Western blotting, ensaios funcionais, ensaios cinéticos, ou qualquer outro teste a jusante que seja conhecido na técnica para estudar e caracterizar células ou frações e preparações subcelulares. As células tratadas com os oligonucleotídeos efetores, as células isoladas ou as células expandidas a partir das células isoladas podem ser usadas para a terapia celular ou para preparar preparações de células terapêuticas ou reagentes celulares para aplicações de terapia celular. As células tratadas com os oligonucleotídeos efetores, as células isoladas, as células expandidas a partir das células isoladas ou preparações de qualquer uma destas pode ser introduzidas em seres humanos ou animais para testes ou aplicações terapêuticas.

[00124] Um ou mais dos métodos de teste a jusante podem ser utilizados para testar as células tratadas com oligonucleotídeos efetores, as células isoladas ou as células expandidas a partir das células isoladas para a sequência alterada ou desemparelhada codificada pelos oligonucleotídeos efetores utilizados para tratar as células. Por exemplo, PCR ou DNA ou sequenciamento de genoma podem ser utilizados para este fim. Além disso, PCR ou DNA ou análise genômica incluindo análise ou sequenciamento do genoma completo podem ser utilizados para testar a presença de qualquer atividade fora do alvo não intencional ou a modificação do genoma após o tratamento com oligonucleotídeo efetor. Este teste pode ser aplicado às células expandidas a partir de células isoladas individualmente tratadas com oligonucleotídeos efetores ou células tratadas com oligonucleotídeo efetor isoladas como um agregado ou lotes. Células ou preparações celulares que são confirmadas por compreender a modificação genômica pretendida introduzida pelo oligonucleotídeo efetor e uma baixa frequência de ou nenhuma outra alteração do genoma poderiam ser identificadas. Estas células podem ser utilizadas em aplicações a jusante, incluindo terapia celular, onde se pode esperar que elas resultem em uma maior probabilidade de eficácia e probabilidade reduzida de efeitos colaterais ou efeitos adversos não intencionais devido à modificação fora do alvo ou não intencional do genoma.

[00125] A Figura 4A e o Exemplo 3 abaixo descrevem uma série de oligonucleotídeos efetores, cada um dos quais compreende um desemparelhamento maior do que uma base e que foram utilizados ou podem ser utilizados para tratar células para introduzir uma alteração genômica. Vários oligos foram detectados por produzirem a alteração genômica pretendida em uma fração das células que foram tratadas. Este conjunto de oligos foi dirigido para introduzir uma alteração no gene CCR5. Os oligos também podem ser desenhados para introduzir alterações genômicas em outros genes ou sequências de DNA, incluindo sequências não codificadoras, tais como promotores, elementos de regulação gênica e sítios de ligação ao DNA. Qualquer gene ou sequência de DNA pode ser alvo de acordo com os métodos descritos.

G. Deleção de CCR5 e populações de células-tronco com CCR5 modificado

[00126] As células-tronco modificadas da presente invenção possuem CCR5 alterado de tal modo que existe uma mutação de fase de leitura. Um exemplo de modalidade é mostrado na Figura 1 de uma mutação em que 32 bases do CCR5 são deletadas (sequência sublinhada em negrito na Figura 1). Esta também é referida como "deleção delta-32" ou "deleção Δ32". As 32 bases que são deletadas possuem a sequência de: 5'-GTCAGTATCAATTCTGGAAGAATTTCCAGACA (SEQ ID NO:4). Outras mutações de fase de leitura são contempladas dentro do escopo da invenção, por exemplo, aquelas em que 29 bases, 26 bases, etc., são removidos de tal modo que resulte em uma fase de leitura e onde novos aminoácidos carbóxi-terminais são adicionados, tal como exemplificado na Figura 6. Em algumas modalidades, as mutações que resultam em um ou mais códons de terminação estão excluídas das modalidades específicas da invenção.

[00127] Os oligonucleotídeos podem ser utilizados para modificar a variante selvagem de CCR5 para a variante Δ32 de CCR5 no genoma de células-tronco. Estes oligonucleotídeos são otimizados para entrega nas células-tronco. Considerações sobre a otimização incluem, entre outras, (i) oligonucleotídeos devem ser não tóxicos e compatível com a viabilidade celular, (ii) atingir a entrega de uma concentração de oligonucleotídeo nas células que resulta em uma modificação precisa de CCR5, (iii) são totalmente definidos e passíveis de controle de qualidade e maior otimização, e (iv) produzir células-tronco, onde a capacidade das células-tronco isoladas para dar origem às células imunes não é perturbada. Exemplos de oligonucleotídeos que podem ser utilizados são descritos mais detalhadamente na seção de exemplos.

[00128] Em algumas modalidades, as células-tronco que são usadas foram manipuladas (por exemplo, por indução) de tal modo que elas expressam transitoriamente o CCR5 nas células-tronco imunes sem perda da função de células-tronco. A indução da expressão do lócus de CCR5 em células-tronco imunes pode ser útil quando ferramentas de detecção, tais como sondas de sinais moleculares (por exemplo, sondas Chromovert®), são usadas para detectar células que compreendem o Δ32 CCR5.

[00129] Utilizando a metodologia aqui descrita, um especialista na técnica pode modificar a sequência de CCR5 nas células-tronco para criar uma população de células-tronco modificadas ou recombinantes contendo modificações em CCR5 (por exemplo, deleção Δ32) de tal forma que se tornem refratárias à infecção pelo HIV. As células que se diferenciam a partir destas células-tronco também se tornam refratárias à infecção pelo HIV. Entende-se que a referência a uma população de células aqui descrita contemple e inclua populações isoladas.

[00130] Em algumas modalidades, a invenção apresenta composições que compreendem uma população substancialmente pura de células-tronco recombinantes, em que as células-tronco compreendem uma deleção Δ32 em um gene CCR5. A deleção pode estar em um alelo ou ambos os alelos. Em uma modalidade, a sequência Δ32 deletada é a SEQ ID NO:4.

[00131] A invenção apresenta populações homogêneas ou substancialmente puras de células-tronco recombinantes que contêm a deleção Δ32 CCR5 e composições compreendendo estas populações. Por conseguinte, em algumas modalidades, a população contém pelo menos cerca de 5% das células-tronco na população com a deleção Δ32. Em outras modalidades, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% das células-tronco na população com a deleção Δ32. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de inclui um limite superior de cerca de 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, ou 90%, por exemplo, pelo menos cerca de 50% é de cerca de 50% a 90%, 50% a 91%, 50% a 92%, 50% a 93%, 50% a 94%, 50% a 95%, 50% a 96%, 50% e 97%, 50% a 98%, 50% a 99%, ou 50% a 100%.

[00132] As populações homogêneas ou substancialmente puras de células-tronco recombinantes que contêm a deleção Δ32 CCR5 podem ser ainda caracterizadas por seus marcadores (intracelulares e extracelulares). As células-tronco podem expressar um ou mais marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em: CD34, CD133, CD105, CD45, CD59, Thy1/CD90, C-kit (CD117) e família SLAM de marcadores de superfície celular ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a família SLAM de marcadores de superfície celular é selecionado a partir do grupo que consiste em CD48, CD150 e CD244. Em outras modalidades, as células-tronco não expressam um ou mais dos marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em: CD13, CD33, CD71, CD19 e CD61.

[00133] Em outras modalidades, as células-tronco compreendem um RNA correspondente a um marcador de célula-tronco intracelular, não localizado na superfície celular ou localizado na superfície celular. Exemplos adicionais não limitantes destes marcadores de células- tronco incluem as famílias de genes de fatores de transcrição, genes de vias de sinalização, genes de quinases. Exemplos não limitantes de famílias de genes de fatores de transcrição incluem: zf-C2H2, KRAB, Homeobox, HLH, BTB, SCAN, receptor hormonal, zf-C4, bZIP, ETS, Fork head, PAS, TIG, PHD, GATA, e MYB de ligação ao DNA. Exemplos não limitantes de genes de vias de sinalização detectados em células hematopoiéticas CD34+ incluem: via de sinalização do cálcio, via de sinalização de ERB B, via de sinalização de Hedgehog, via de sinalização de JAK-STAT, via de sinalização de MAPK, via de sinalização de mTOR, via de sinalização de Notch, sistema de sinalização do fosfatidilinositol, via de sinalização de TGF-beta, via de sinalização do VEGF, e via de sinalização de WNT. Exemplos não limitantes de genes de quinases detectados em células hematopoiéticas CD34+ incluem: AGC, quinases atípicas reguladas por cálcio/calmodulina, quinase caseína, CMGC, receptor da guanilato ciclase, STE, semelhante à tirosina-quinase, e tirosina-quinases. Outros marcadores e perfis de expressão que podem ser utilizados são revelados em Liu, X., et. al, J. Leukocyte Biology, Vol 82 (4) pp 9861002, October 2007, cujo conteúdo está aqui expressamente incorporado para os marcadores, perfis de expressão gênica e assinaturas gênicas de células-tronco hematopoiéticas CD34+.

[00134] Por conseguinte, em algumas modalidades, a população contém pelo menos cerca de 5% das células-tronco na população com um ou mais perfis de marcadores (ou combinação de marcadores) descritos acima. Em outras modalidades, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% das células-tronco na população com um ou mais perfis de marcadores (ou combinação de marcadores) descritos acima. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de inclui um limite superior de cerca de 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, ou 90%, por exemplo pelo menos cerca de 50% é de cerca de 50% a 90%, 50% a 91%, 50% a 92%, 50% a 93%, 50% a 94%, 50% a 95%, 50% a 96%, 50% e 97%, 50% a 98%, 50% a 99%, ou 50% a 100%.

[00135] Vários métodos podem ser usados para obter uma população substancialmente pura ou homogênea de células-tronco modificadas. Ferramentas de detecção, tais como aquelas que envolvem marcações ou sondas fluorescentes (por exemplo, fluoróforos, supressores, sondas de sinais moleculares e semelhantes), podem ser usadas para selecionar as células-tronco que possuem a modificação Δ32. Um exemplo não limitante de um sistema que pode ser usado em conjunto com as células-tronco é a tecnologia Chromovert® (ver, por exemplo, Patente US 6.692.965). A tecnologia Chromovert® pode ser usada para isolar e purificar rapidamente as células-tronco que possuem CCR5 modificado (por exemplo, deleção Δ32 em CCR5). Esta tecnologia pode ser utilizada com as sondas otimizadas para detectar e isolar células-tronco imunes que compreendem a variante Δ32 de CCR5 são estabelecidas, onde as condições: (i) proporcionar a maior razão entre sinal e ruído para Δ32 versus CCR5 selvagem, (ii) ser compatíveis com a detecção e isolamento de células viáveis, e (iii) produzir células-tronco imunes onde a capacidade das células-tronco isoladas em dar origem a células imunes não é perturbada.

[00136] Um especialista na técnica irá apreciar que existem outros métodos para obter e/ou detectar a população substancialmente pura ou homogênea de células modificadas, tais como células-tronco. Por exemplo, separação celular ativada por fluorescência (FACS) pode ser utilizada para selecionar células-tronco específicas usando a coloração positiva ou, em alternativa, para excluir por coloração negativa (por exemplo, para descartar uma população de células-tronco que for negativa para CCR5).

[00137] As células-tronco da invenção podem dar origem a todas as células do sistema imune ou podem dar origem às linhagens mieloide (monócitos, macrófagos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, eritrócitos, megacariócitos, plaquetas, células dendríticas) ou linfoide (células T, células B, células NK). Em algumas modalidades, as células-tronco podem ser enviesadas para células mieloides, enviesadas para células linfoides, ou não enviesadas no que diz respeito aos tipos de células diferenciadas que podem se originar das células-tronco.

[00138] Em algumas modalidades, as células-tronco são modificadas e a diferenciação é permitida para tipos de células imunes que são normalmente suscetíveis à infecção pelo HIV. Com as modificações aqui descritas, estas células-tronco e células diferenciadas derivadas das células-tronco podem ser usadas de acordo com a invenção para produzir tipos de células ou tipos de células imunes correspondentes que são resistentes à infecção pelo HIV. Em uma modalidade, o tipo de célula diferenciada é uma célula T imune. Em outra modalidade, o tipo de célula diferenciada é um tipo de célula em que o lócus genético que compreende o gene CCR5 está ou não está transcricionalmente ativo. Em algumas modalidades, as células diferenciadas tratadas resultantes podem ser transdiferenciadas ou desdiferenciadas em outros tipos de células, incluindo em tipos de células-tronco para testes ou utilização terapêutica subsequentes. Em uma modalidade, as células tratadas do método podem ser desdiferenciadas em células-tronco hematopoiéticas.

H. Métodos de tratamento de indivíduos com células recombinantes produzidos pela alteração mediada por oligonucleotídeos efetores

[00139] A população de células modificadas (isto é, células recombinantes), tal como aqui descrita, pode ser expandida por cultura celular padrão para células que são conhecidas pelos especialistas na técnica. A população de células modificadas pode ser misturada com um veículo farmaceuticamente aceitável para criar uma composição farmacêutica adequada para a terapia celular. A composição farmacêutica compreendendo as células modificadas, tais como células-tronco, tal como aqui descritas, incluem pelo menos um adjuvante e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável, como são bem conhecidos dos especialistas na técnica. A população de células modificadas pode ser testada em modelos animais não humanos da doença a ser tratada para determinar a quantidade eficaz ou o intervalo da quantidade eficaz de células modificadas que podem ser utilizados. Os modelos animais não humanos também podem ser utilizados para avaliar a retenção da função das células por parte da população de células modificadas.

[00140] Como um exemplo não limitante, uma população de células- tronco modificadas, tal como aqui descrita, pode ser expandida por cultura celular padrão para células-tronco que são conhecidas de um especialista na técnica. A população de células-tronco modificados pode ser misturada com um veículo farmaceuticamente aceitável para criar uma composição farmacêutica adequada para a terapia celular. A população de células-tronco modificadas pode ser testada em modelos animais não humanos de HIV para determinar a quantidade eficaz ou o intervalo da quantidade eficaz de células-tronco modificadas que podem ser utilizadas. Os modelos animais não humanos de HIV podem também ser utilizados para avaliar a retenção da função das células- tronco por parte da população de células-tronco modificadas.

[00141] Tal como mencionado acima, as células-tronco podem se diferenciar em um ou mais tipos de células, em particular, quando introduzidas in vivo e expostas ao ambiente biológico de fatores de crescimento, citocinas e outros fatores biológicos que induziriam uma célula-tronco em se diferenciar. Sem estar limitada pela teoria, a população de células-tronco modificadas pode se autorrenovar para gerar um suprimento infinito de células-tronco modificadas, bem como se diferenciar em células que sejam refratárias à infecção pelo HIV. Exemplos de tais células diferenciadas incluem, entre outras, tipos de células imunes que normalmente são de outra forma suscetíveis a infecção pelo HIV. Em uma modalidade, o tipo de célula diferenciada é uma célula T imune. Em outra modalidade, o tipo de célula diferenciada é um tipo de célula em que o lócus genético que compreende o gene CCR5 está ou não está transcricionalmente ativo.

[00142] Além disso, a população de células modificadas (por exemplo, células-tronco) pode ser testada para determinar a integridade genômica e para avaliar se existem quaisquer modificações genômicas não intencionais (e/ou indesejadas). Um especialista na técnica pode utilizar quaisquer técnicas de biologia molecular para detectar e medir a frequência da modificação aberrante no genoma. Esta avaliação pode ser importante para determinar a segurança da terapia celular utilizando várias populações de células modificadas, tais como células-tronco modificadas.

[00143] A população de células-tronco modificadas pode ser testada para determinar se determinadas coortes de indivíduos fornecem células que compreendem as características ideais para a terapia celular bem-sucedida. Exemplos não limitantes de características que podem ser avaliadas incluem: marcadores (intracelular e extracelular), longevidade na cultura de células, potencial de renovação, taxa de expansão, perfis de expressão gênica, proteômica e funcionalidade (por exemplo, capacidade de se diferenciar em certos tipos de células).

[00144] A análise das características de populações de células- tronco a partir de determinadas coortes pode ser benéfica ao desenhar planos de tratamento, incluindo a utilização da terapia celular como tratamento primário, assim como usá-la para auxiliar no tratamento da infecção pelo HIV. Determinadas subpopulações evidentes podem ser identificadas como sendo particularmente receptivas ao tratamento com uma população de células-tronco modificadas.

I. Métodos de tratamento de indivíduos com oligonucleotídeos efetores

[00145] Nas aplicações de terapia celular em seres humanos ou animais, sequências genéticas preferidas que podem ser selecionadas para servir como alvos para a alteração do genoma mediada por oligonucleotídeos efetores incluem sequências implicadas na doença ou infecção, ou suscetibilidade à doença ou infecção. Em particular, as sequências genéticas ou variações de duas ou mais bases que produzem doenças ou resultam na suscetibilidade a uma doença ou infecção seriam sequências alvo preferidas para a modificação por recombinação mediada por oligonucleotídeos efetores. Exemplos de tais sequências incluem o gene ou lócus CCR5, em que a alteração da sequência selvagem em células do sistema imune de indivíduos que compreendem CCR5 selvagem pode ser utilizada como parte de uma terapia celular para HIV/AIDS. A alteração do CCR5 pode ser desenhada para mimetizar, replicar ou aproximar a variante Δ32 da sequência de CCR5. Há inúmeras doenças ou infecções ou suscetibilidades à doença ou infecção que resultam de uma ou mais variações ou mutações conhecidas do DNA. Estas sequências representam alvos preferidos para modificação usando recombinação mediada por oligonucleotídeos efetores.

[00146] Os oligonucleotídeos efetores também podem ser utilizados para tratar um sujeito em necessidade do mesmo, ou seja, em vez de tratar um indivíduo por métodos de terapia celular utilizando uma célula recombinante que tenha sido alterada pelo tratamento com um oligonucleotídeo efetor, o oligonucleotídeo efetor pode ser administrado ao sujeito para mediar a alteração das células alvo dentro do sujeito. A invenção apresenta a utilização de um oligonucleotídeo efetor para corrigir, alterar ou eliminar a sequência associada com uma doença ou infecção ou suscetibilidade à doença ou infecção, em que o oligonucleotídeo efetor é dirigido contra uma variante de um gene ou uma fração deste, que está ligada ou associada com uma doença ou infecção ou suscetibilidade a uma doença ou infecção. Como tal, a invenção apresenta um método de tratamento de uma doença ou infecção, ou suscetibilidade à doença ou infecção, em um sujeito que compreende a administração de uma quantidade eficaz de um oligonucleotídeo efetor ao sujeito em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades do método de tratamento de uma doença ou infecção em um sujeito, o oligonucleotídeo efetor é dirigido contra uma variante de um gene ou fração deste, que está ligada ou associada com a doença ou infecção.

J. Composições farmaceuticamente aceitáveis

[00147] Os oligonucleotídeos efetores para utilização nos métodos de tratamento, tais como aqui descritos, por exemplo, o tratamento pela administração de um ou mais oligonucleotídeos efetores, tal como aqui descrito, pode ser administrado na forma de composições farmacêuticas. Estes oligonucleotídeos efetores e suas composições farmacêuticas podem ser administrados por uma série de vias incluindo oral, retal, cefalorraquidiana, transdérmica, subcutânea, tópica, transmucosa, nasofaríngea, pulmonar, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular e intranasal. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos efetores são administrados sistemicamente, em que a administração é a administração intravenosa ou intraperitoneal.

[00148] Assim, são aqui apresentadas composições farmacêuticas que contêm, como o princípio ativo, um ou mais dos oligonucleotídeos efetores, tais como aqui descritos, associados com um ou mais excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Na produção das composições da presente invenção, o princípio ativo é geralmente misturado com um excipiente ou veículo, diluído por um excipiente ou veículo ou encerrado dentro de tal excipiente ou veículo que pode estar na forma de uma cápsula, sachê, papel ou outro recipiente. Quando o excipiente ou veículo serve como um diluente, ele pode ser um material sólido, semissólido ou líquido, que age como um veículo, transportador ou meio para o princípio ativo. Assim, as composições podem estar na forma de comprimidos, pílulas, pós, pastilhas, sachês, hóstias, elixires, suspensões, emulsões, soluções, xaropes, aerossóis (como sólido ou em meio líquido), pomadas contendo, por exemplo, até 10% por peso do princípio ativo, cápsulas de gelatina mole e dura, supositórios, soluções injetáveis estéreis, e pós embalados estéreis.

[00149] Alguns exemplos de excipientes ou veículos adequados incluem lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amidos, goma acácia, fosfato de cálcio, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de cálcio, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, celulose, água estéril, xarope e metilcelulose. Além disso, as formulações podem incluir: agentes lubrificantes tais como talco, estearato de magnésio e óleo mineral; agentes umectantes; agentes emulsionantes e suspensores; agentes conservantes tais como metil- e propil-hidróxi- benzoatos; agentes edulcorantes; e agentes aromatizantes. As composições da invenção podem ser formuladas de modo a proporcionar uma liberação rápida, prolongada ou retardada do princípio ativo após administração ao paciente, ao empregar procedimentos conhecidos na técnica.

[00150] Em outro aspecto, um ou mais oligonucleotídeos efetores, tais como aqui descritos, são encapsulados dentro de um microtransportador para entrega a um indivíduo. Em algumas modalidades, o microtransportador encapsula mais do que uma espécie de oligonucleotídeo efetor. Em algumas modalidades, a única ou mais espécies de oligonucleotídeos efetores encapsulados dentro do microtransportador compreendem uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 5-37. Métodos de encapsulamento de oligonucleotídeos em microtransportadores são bem conhecidos na técnica, e descritos, por exemplo, no pedido de patente internacional WO98/55495. Os sistemas de dispersão coloidal, tais como microesferas, esferas, complexos macromoleculares, nanocápsulas e sistema à base de lipídios, tais como emulsões óleo-em-água, micelas, micelas mistas e lipossomos, podem proporcionar encapsulamento eficaz de oligonucleotídeos dentro de composições em microtransportadores. A composição de encapsulamento pode ainda compreender qualquer uma de uma grande variedade de componentes. Estes incluem, entre outros, alúmen, lipídios, fosfolipídios, estruturas da membrana lipídica (LMS), polietilenoglicol (PEG) e outros polímeros, tais como polipeptídeos, polissacarídeos e glicopeptídeos.

[00151] Em algumas modalidades, as composições podem ser formuladas em uma apresentação unitária, cada dosagem contendo de cerca de 1 mg a cerca de 1000 mg ou mais, tais como qualquer um de cerca de 1 mg a cerca de 900 mg, cerca de 1 mg a cerca de 800 mg, cerca de 1 mg a cerca de 700 mg, cerca de 1 mg a cerca de 600 mg, cerca de 1 mg a cerca de 500 mg, cerca de 5 mg a cerca de 1000 mg, cerca de 5 mg a cerca de 900 mg, cerca de 5 mg a cerca de 800 mg, cerca de 5 mg a cerca de 700 mg, cerca de 5 mg a cerca de 600 mg, ou cerca de 5 mg a cerca de 500 mg, inclusive, incluindo qualquer intervalo entre estes valores, do princípio ativo, isto é, um ou mais oligonucleotídeos efetores. Em algumas modalidades, as composições podem ser formuladas em uma apresentação unitária, cada dosagem contendo de cerca de 1 μg a cerca de 1000 μg ou mais, tais como qualquer um de cerca de 1 μg a cerca de 900 μg, cerca de 1 μg a cerca de 800 μg, cerca de 1 μg a cerca de 700 μg, cerca de 1 μg a cerca de 600 μg, cerca de 1 μg a cerca de 500 μg, cerca de 5 μg a cerca de 1000 μg, cerca de 5 μg a cerca de 900 μg, cerca de 5 μg a cerca de 800 μg, cerca de 5 μg a cerca de 700 μg, cerca de 5 μg a cerca de 600 μg, ou cerca de 5 μg até cerca de 500 μg, inclusive, incluindo qualquer intervalo entre estes valores, do princípio ativo, isto é, um ou mais oligonucleotídeos efetores. O termo "apresentações unitárias" refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para sujeitos, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de material ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com um excipiente ou veículo farmacêutico adequado.

[00152] As terapias aqui descritas são eficazes em uma ampla gama de dosagem e são geralmente administradas em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Será entendido, no entanto, que a quantidade do oligonucleotídeo efetor realmente administrado será determinada por um médico, à luz das circunstâncias relevantes, incluindo a condição a ser tratada, a via de administração escolhida, o composto real administrado, a idade, peso, e resposta de cada sujeito, a gravidade dos sintomas do sujeito, e assim por diante.

[00153] Para a preparação de composições sólidas tais como comprimidos, o oligonucleotídeo efetor é misturado com um excipiente ou veículo farmacêutico para formar uma composição de pré- formulação sólida contendo uma mistura homogênea de um oligonucleotídeo efetor da presente invenção. Quando nos referimos a estas composições de pré-formulação como homogêneas, pretende-se significar que o princípio ativo está disperso uniformemente por toda a composição de modo que a composição possa ser facilmente subdividida em apresentações unitárias igualmente eficazes tais como comprimidos, pílulas e cápsulas.

[00154] Os comprimidos ou pílulas da presente invenção podem ser revestidos ou compostos de outro modo para proporcionar uma apresentação responsável pela vantagem da ação prolongada e de proteger o oligonucleotídeo efetor da hidrólise ácida no estômago. Por exemplo, o comprimido ou pílula pode compreender uma dosagem interna e um componente externo da dosagem, estando o último na forma de um envelope sobre o primeiro. Os dois componentes podem ser separados por uma camada entérica que serve para resistir à desintegração no estômago e permitir que o componente interno passe intacto pelo duodeno, ou seja, retardado na liberação. Uma série de materiais pode ser utilizada para tais camadas ou revestimentos entéricos, tais materiais incluindo uma série de ácidos poliméricos e misturas de ácidos poliméricos com materiais tais como goma-laca, álcool cetílico, e acetato de celulose.

[00155] As formas líquidas nas quais as composições da presente invenção podem ser incorporadas para administração por via oral ou por injeção incluem soluções aquosas, xaropes adequadamente aromatizados, suspensões aquosas ou oleosas e emulsões aromatizadas com óleos comestíveis tais como óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de sésamo, óleo de coco, ou óleo de amendoim, bem como elixires e veículos farmacêuticos semelhantes.

[00156] As vias parentéricas de administração incluem, entre outras, injeção direta em uma linha venosa central, injeção intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea. As formulações adequadas para administração parentérica (por exemplo, um oligonucleotídeo efetor, tal como aqui descrito, em uma formulação por microtransportador) são geralmente formuladas em água USP ou água para injeção e podem ainda compreender tampões de pH, sais, agentes de volume, agentes conservantes, e outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Os oligonucleotídeos efetores, tal como aqui descritos, por exemplo, na forma de complexos ou encapsulados em microtransportadores, para injeção parentérica podem ser formulados em soluções isotônicas estéreis farmaceuticamente aceitáveis tais como solução salina e solução salina tamponada com fosfato para injeção.

[00157] As composições para inalação ou insuflação incluem soluções e suspensões em solventes aquosos ou orgânicos, ou misturas destes, e pós farmaceuticamente aceitáveis. As composições líquidas ou sólidas podem conter excipientes adequados farmaceuticamente aceitáveis, tais como aqui descritos. As composições podem ser administradas por via respiratória oral ou nasal para efeito local ou sistêmico. As composições em solventes farmaceuticamente aceitáveis podem ser nebulizadas pela utilização de gases inertes. As soluções nebulizadas podem ser inaladas diretamente a partir de dispositivo nebulizador ou o dispositivo nebulizador pode a ser conectado a uma tenda de máscara facial, ou máquina de respiração de pressão positiva intermitente. As composições em solução, suspensão ou pó também podem ser administradas, oral ou nasalmente, a partir de dispositivos que liberam a formulação de um modo apropriado.

K. Artigos de fabricação e kits

[00158] A invenção também apresenta kits e artigos de fabricação para utilização nos presentes métodos. Os kits da invenção incluem um ou mais recipientes compreendendo um ou mais oligonucleotídeos efetores, tais como aqui descritos, e instruções para utilização de acordo com qualquer um dos métodos da invenção aqui descritos.

[00159] Em algumas modalidades, estas instruções compreendem uma descrição da administração dos oligonucleotídeos efetores para o tratamento da infecção pelo HIV, AIDS, ou qualquer doença em que uma variação genética de duas ou mais bases causa ou está associada com a doença ou a suscetibilidade à doença ou infecção. O kit pode ainda compreender uma descrição da seleção de células ou um indivíduo adequado para tratamento com base em identificar se as células ou aquele indivíduo possui a doença e o estágio da doença ou a suscetibilidade à infecção.

[00160] As instruções relativas à utilização dos oligonucleotídeos efetores podem incluir geralmente informações quanto à dosagem, cronograma de dosagem, e via de administração para o tratamento pretendido. Os recipientes podem ser doses unitárias, embalagens a granel (por exemplo, pacotes multidose) ou doses subunitárias. As instruções fornecidas nos kits da invenção são tipicamente instruções por escrito em um rótulo ou bula (por exemplo, uma folha de papel incluída no kit), mas instruções legíveis por máquina (por exemplo, instruções transportadas em um disco de armazenamento magnético ou óptico) também são aceitáveis.

[00161] O rótulo ou a bula podem indicar que a composição é utilizada para o tratamento da suscetibilidade à infecção pelo HIV, infecção pelo HIV, AIDS, ou qualquer doença em que uma variação genética de duas ou mais bases causa ou está associada com a doença ou quaisquer outras utilizações aqui descritas. Podem ser fornecidas instruções para a prática de qualquer um dos métodos aqui descritos.

[00162] Os kits desta invenção estão em embalagens apropriadas. Embalagem adequada inclui, entre outras, frascos-ampola, fracos, jarros, embalagens flexíveis (por exemplo, Mylar selado ou sacos plásticos), e semelhantes. Também estão contempladas as embalagens para utilização em combinação com um dispositivo específico, tais como seringa, seringa pré-envasada, cubas de eletroporação, um inalador, dispositivo de administração nasal (por exemplo, um atomizador) ou um dispositivo de infusão tal como uma minibomba. Um kit pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco-ampola possuindo um batoque perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). O recipiente pode também ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco-ampola possuindo um batoque perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um princípio ativo na composição é um oligonucleotídeo efetor, tal como aqui descrito. O recipiente pode ainda compreender um segundo princípio farmaceuticamente ativo. O kit pode compreender componentes adequados para o tratamento de células para preparar células com potencial terapêutico, incluindo componentes para isolar as células a serem tratadas a partir de um indivíduo a ser tratado ou um indivíduo doador, componentes para contatar as células com o oligonucleotídeo efetor, e componentes para utilização na detecção e no isolamento das células tratadas com o oligonucleotídeo efetor para compreender uma sequência codificada pelo oligonucleotídeo efetor. Os componentes do kit podem incluir tampões e reagentes para a eletroporação, separação de células ativada por fluorescência e para a cultura e a expansão de células.

[00163] Os kits podem fornecer opcionalmente componentes adicionais tais como tampões e informações interpretativas. Normalmente, o kit compreende um recipiente e um rótulo ou bula(s) sobre ou associado com o recipiente.

[00164] Ao longo desta especificação, várias patentes, pedidos de patentes e outros tipos de publicações (por exemplo, artigos de revistas) são citados. A divulgação de todas as patentes, pedidos de patentes e publicações aqui citados estão aqui incorporados por referência em sua totalidade para todos os fins.

[00165] A invenção pode ser melhor e mais completamente compreendida por referência aos exemplos seguintes, que são apresentados a título de ilustração e não se destinam a ser limitantes do escopo da invenção. Todas as citações ao longo da descrição são aqui expressamente incorporadas por referência.

EXEMPLOS Exemplo 1: Eletroporação de oligonucleotídeos efetores em células THP ou K562

[00166] Células THP ou K562 foram cultivadas em uma densidade máxima de 2 x 106 por mL em meio de cultura RPMI (Gibco CAT 61870036) suplementado com 10% de FBS (SAFC Biosciences CAT-12103C- 500ML). As células foram lavadas com meio RPMI isento de soro e ressuspensas em 10 x 106 ou 5 x 106 células/mL. Os oligonucleotídeos efetores testados foram os números 1-8, 19 e 20 da Figura 4A. Para cada reação, 10 μL de uma solução de estoque 3,2 μM do oligonucleotídeo efetor testado e 7 μL de uma solução estoque 100 μM de reagente PNA foram adicionados a 100 μL das células K562 e THP em qualquer uma das concentrações e foram adicionados a um poço da placa de 96 poços de eletroporação (Biorad CAT 1652681). O PNA usado aqui foi anteriormente descrito PNA "tcPNA-679" (N- Lys-Lys- Lys-JTJTTJTTJT-OOO-TCTTCTTCTCATTTC-Lys-Lys-Lys-C) (SEQ ID NO:58). As amostras foram incubadas em gelo por 30-60 minutos, pulsadas uma vez a 350 volts por 12 μS usando GenePulser MXCell (Biorad) e, em seguida, novamente incubadas em gelo por 15-30 minutos antes de serem transferidas para os poços de uma placa de cultura tecidual de 12 poços usando 500 μL de meio de cultura e incubadas em uma incubadora de cultura tecidual a 37°C, CO2 5%. O DNA genômico foi preparado a partir das amostras após 2-3 dias (Molecular Cloning Protocol: A Laboratory Manual, Volume 1, Sambrook and Russel, pp. 6.28-6.33) para análise por PCR.

Exemplo 2: PCR genômico em THP recombinante ou as células K562

[00167] Utilizou-se PCR para amplificar uma fração do DNA genômico de CCR5 purificado a partir de células tratadas do Exemplo 1. Os iniciadores forward e reverso usados foram ATCACTTGGGTGGTGGCTGTGTTTGCGTCTC (SEQ ID NO:59) para o iniciador forward e AGTAGCAGATGACCATGACAAGCAGCGGCAG (SEQ ID NO:60) para o iniciador reverso. As condições de PCR incluíram uma primeira etapa de 95°C por 5 minutos, e de 45 a 50 ciclos das três etapas seguintes: 1) 95°C por 30 segundos, 2) 65°C por 30 segundos, e 3) 72°C por 20 segundos. 20 μL de reações de PCR foram ajustados para cada amostra e cobertos com uma gota de óleo mineral. DNA polimerase Taq foi utilizada com os componentes em concentrações de acordo com as instruções do fabricante (Roche, CAT 4738225001). Um produto de PCR com um tamanho de aproximadamente 193 bases era esperado para a sequência genômica correspondente ao CCR5 selvagem e um produto de PCR com um tamanho de aproximadamente 161 bases era esperado para a sequência genômica correspondente à variante Δ32 de CCR5. A Figura 5 mostra os resultados para células K562 (conjunto superior de linhas) ou células THP (conjunto inferior de linhas), com CCR5 selvagem controle (linha 1) ou CCR5 deletado (linha 2) com marcador de peso molecular (linha 3) mostrados separadamente na parte inferior central do gel. As linhas são rotuladas na parte superior com o número do oligonucleotídeo efetor (ver Figura 4A) ou controle (C, sem oligonucleotídeo efetor adicionado) ou marcador (M). As linhas 1-10, tanto na parte superior quanto inferior, mostram os oligonucleotídeos efetores 1-8, 19 e 20, respectivamente, com a linha 11 como nenhum controle efetor, e linha 12 como marcador de peso molecular. As linhas 13-22 para ambas as partes superior e inferior mostram os oligonucleotídeos efetores 1-8, 19 e 20, respectivamente, com a linha 11 como nenhum controle efetor. As amostras acima (células K562) estão em uma densidade de ~4,3 x 106 células/mL nas linhas 1-10 e ~8,6 x 106 células/mL nas linhas 13-22, enquanto que as amostras abaixo (células THP) estão em uma densidade de ~4,3 x 106 células/mL nas linhas 13-22 e ~8,6 x 106 células/mL nas linhas 1-10. A banda dupla próxima ao marcador de peso molecular (MW) de 200 mostra que CCR5 selvagem e CCR5 com deleção Δ32 estão presentes nas amostras tratadas com oligonucleotídeos efetores.

Exemplo 3: Oligonucleotídeos efetores e métodos de criar Δ32 CCR5 em células-tronco imunes

[00168] Este exemplo descreve vários oligonucleotídeos otimizados que são utilizados para modificar a variante selvagem de CCR5 para a variante Δ32 de CCR5 no genoma de células-tronco imunes. Exemplos de oligonucleotídeos são apresentados na Figura 4A.

[00169] As condições que otimizam a entrega dos oligonucleotídeos nas células-tronco imunes são estabelecidas. As condições são que os oligonucleotídeos: (i) são não tóxicos e compatíveis com a viabilidade celular, (ii) atingem a liberação de uma concentração de oligonucleotídeo nas células que resulta em uma modificação precisa de CCR5, (iii) são totalmente definidos e passíveis de controle de qualidade e uma maior otimização, e (iv) produzem células-tronco imunes onde a capacidade das células-tronco isoladas em dar origem a células do sistema imune não é perturbada.

[00170] Além das células-tronco imunes, linhagens celulares imunes imortalizadas (incluindo, entre outras, células THP e K562) são utilizadas como um substituto para as células-tronco imunes. A identificação das condições que se aplicam a todos estes tipos de células indica ampla aplicabilidade dos métodos. PCR genômica do DNA isolado a partir de células tratadas utilizando condições de oligonucleotídeos e eletroporação em teste é utilizada para avaliar sua eficácia (Ver Exemplos 1 e 2).

[00171] Os seguintes oligonucleotídeos efetores são testados em adição aos descritos acima:

[00172] Legenda para as modificações, os oligonucleotídeos são 5' a 3'.: BNA (ácidos nucleicos ligados) - indicados com bases sublinhadas 6-Tio-2'-deoxiguanosina - indicada por g minúsculo 8-amino-2'-deoxiadenosina - indicada por a minúsculo GAAGGTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACATTAAAG ATAGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGCTTG (SEQ ID NO:17) GAAGGTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACATTAAAG ATAGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGCTTG (SEQ ID NO:18) GAAGGTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACATTAAAG ATAGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGCTTG (SEQ ID NO:19) GAAGGTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACATTAAAG ATAGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGCTTG (SEQ ID NO:20) gAAggTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACATTAAAGA TAGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGCTTG (SEQ ID NO:21) gaaggTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACATTAAAGAT AGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGCTTG (SEQ ID NO:22) gAAggTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACATTAAAGA TAGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCgCTgCTTG (SEQ ID NO:23) gaaggTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACATTAAAGAT AGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGCTTG (SEQ ID NO:24) GAAGGTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACATTAAAG ATAGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGCTTGTCATGGTCATC TGCTACTCG (SEQ ID NO:25) GAAGGTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACATTAAAG ATAGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGCTTGTCATGGTCATC TGCTACTCG (SEQ ID NO:26) GAAGGTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACATTAAAG ATAGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGCTTGTCATGGTCATC TGCTACTCG (SEQ ID NO:27) GAAGGTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACATTAAAG ATAGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGCTTGTCATGGTCATC TGCTACTCG (SEQ ID NO:28) GAAGGTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACATTAAAG ATAGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGCTTGTCATGGTCATC TGCTACTCG (SEQ ID NO:29) GAAGGTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACATTAAAG ATAGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGCTTGTCATGGTCATC TGCTACTCG (SEQ ID NO:30) GAAGgTCTTCaTTaCACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACATTAAAGA TAGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGCTTGTCATggTCaTCTg CTaCTCG (SEQ ID NO:31) gaaggTCTTCaTTaCACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACATTAAAGAT AGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGCTTGTCATggTCaTCTgC TaCTCg (SEQ ID NO:32) gaaggTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACATTAAAGAT AGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGCTTGTCATggTCaTCTGC TACTCg (SEQ ID NO:33) GAAGGTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACATTAAAG ATAGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTgCTTgTCaTggTCaTCTG CTACTCg (SEQ ID NO:34) GAAGGTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACATTAAAG ATAGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTgCTTgTCaTggTCaTCTG CTACTCg (SEQ ID NO:35) GAAGGTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACATTAAAG ATAGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGCTTGTCATGGTCATC TGCTACTCG (SEQ ID NO:36) GAAGGTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACATTAAAG ATAGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGCTTGTCATGGTCATC TGCTACTCG (SEQ ID NO:37)

Exemplo 4 - Detecção e isolamento de células-tronco imunes tratadas para compreender Δ32 CCR5

[00173] Este exemplo descreve a utilização de sondas de sinais moleculares otimizadas (incluindo, entre outras, sondas Chromovert®) para detectar e isolar células-tronco imunes compreendendo Δ32 CCR5 criado como um resultado dos Exemplos 1 e 2, ou semelhantemente tratadas com oligonucleotídeos efetores do Exemplo 3. Este exemplo utiliza a tecnologia Chromovert® como uma modalidade específica, mas os especialistas na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina, outros equivalentes à modalidade específica e aos métodos aqui discutidos.

[00174] Condições Chromovert® para utilização das sondas otimizadas para detectar e isolar células-tronco imunes que compreendem a variante Δ32 de CCR5 são estabelecidas, onde as condições: (i) proporcionar a maior razão entre sinal e ruído para Δ32 versus CCR5 selvagem, (ii) ser compatíveis com a detecção e isolamento de células viáveis, e (iii) produzir células-tronco imunes onde a capacidade das células-tronco isoladas em dar origem a células imunes não é perturbada.

[00175] Além das células-tronco imunes, linhagens celulares imunes imortalizadas (incluindo, entre outras, células THP e K562) são utilizadas como um substituto para as células-tronco imunes. Sondas e condições Chromovert® ótimas são determinadas pela aplicação de sondas de teste e métodos para uma mistura de células compreendendo variantes Δ32 ou selvagem de CCR5, isolando células positivas, e usando métodos genômicos e RT-PCR para avaliar qualquer enriquecimento de células que expressam a variante Δ32 do CCR5.

[00176] As sondas Chromovert® são desenvolvidas por ciclos iterativos de testes começando com o desenho e ensaio de um primeiro conjunto de sondas. As sondas são desenhadas para corresponderem à sequência e serem específicas para a variante Δ32 de CCR5. Especificamente, a fração em alça da sonda foi desenhada para hibridizar com a sequência pontual ramificada dentro da sequência da variante Δ32 de CCR5 que se justapõe às bases a montante e a jusante da deleção de 32 bases. Além disso, as sondas são desenhadas para detectar frações da sequência de CCR5 que são previstas por serem acessíveis para a ligação à sonda apenas no contexto da sequência de variante Δ32 do CCR5, mas não no contexto da sequência selvagem de CCR5. Tais sondas são sintetizadas e testadas usando células tratadas para expressar a variante Δ32 ou variante selvagem de CCR5 e aquelas sondas que produzem as maiores razões entre sinal e ruído são identificadas. Sabe-se que o CCR5 possui duas regiões 5' não traduzidas alternativas. Sondas que podem detectar a variante Δ32 de CCR5 compreendendo qualquer uma das regiões 5' não traduzidas são identificadas e priorizadas para uma maior otimização.

[00177] Os seguintes parâmetros são utilizados para a seleção de sondas: (i) comprimento da alça e/ou tronco e (ii) incorporação e extensão de uma ou mais bases quimicamente modificadas na alça e/ou tronco. Outros parâmetros e condições utilizados para desenvolver e otimizar sondas de sinais moleculares são opcionalmente almejados para o desenvolvimento de sondas Chromovert® que possam detectar a sequência Δ32 em nível do DNA.

[00178] Condições Chromovert® são desenvolvidas e otimizadas para as células-tronco imunes, incluindo linhagens celulares imunes imortalizadas. Métodos eletroporação são otimizados para esta aplicação e tipos específicos de células. Os seguintes parâmetros são utilizados para otimizar os métodos de eletroporação: (i) tensão e duração de eletroporação, (ii) número de pulsos, (iii) tampão de eletroporação, (iv) temperatura, (v) concentração de células, (vi) concentração de oligonucleotídeos, e (vii) adição de reagentes que podem melhorar a eficiência do processo global, incluindo DMSO e outros solventes. Como os especialistas na técnica reconhecerão, outros parâmetros e condições podem também ser utilizados se necessário.

[00179] Os exemplos a seguir de sondas serão utilizados e testados para uma maior otimização. O comprimento irá variar, assim como a composição química, por exemplo, pela incorporação de um ou mais das seguintes listas não limitantes de modificações em várias posições dentro do oligo (outras modificações químicas podem ser utilizadas, tal como aqui discutidas abaixo ou conhecidas na técnica).

[00180] Legenda para as modificações, os oligonucleotídeos são 5' a 3': BNA (ácidos nucleicos ligados) - indicados com bases sublinhadas 7-desaza-8-aza-2'-deoxiadenosina - indicada por a minúsculo (nas sondas B15 - B18) 5-propinil-2'-desoxiuridina - indicada por t minúsculo (nas sondas B15 - B19) 2'-deóxi-isoguanosina - indicada por g minúsculo (nas sondas B15 - B17) Sonda sem modificações: 5'- GCGAGGACTATCTTTAATGTATGGAAAATCTCGC (SEQ ID NO:38), onde as bases em negrito são dirigidas contra a sequência recombinante Δ32-CCR5 (as bases situadas nas extremidades terminais, ou seja, que não estão em negrito, constituem o tronco):

[00181] --as bases no tronco podem ser substituídas por outras sequências

[00182] --a sequência alvo pode corresponder a outra sequência específica para Δ32, por exemplo, pode ser mais longa, mais curta ou corresponder a uma fração diferente da região que abrange a delação de 32 bases, ou pode ser uma sequência dentro da sequência de CCR5, que também existe na variante Δ32 de CCR5, mas que é acessível diferencialmente na sequência Δ32 vs selvagem. Além disso, as sequências apresentadas são desenhadas para detectar o mRNA expresso a partir de CCR5. Para sondas para o DNA, as sondas dirigidas contra qualquer uma das fitas do CCR5 pode ser usada. 81) GCGAGGACTATCTTTAATGTATGGAAAATCTCGC (SEQ ID NO:39) 82) GCGAGGACTATCTTTAATGTATGGAAAATCTCGC (SEQ ID NO:40) 83) GCGAGGACTATCTTTAATGTATGGAAAATCTCGC (SEQ ID NO:41) 84) GCGAGGACTATCTTTAATGTATGGAAAATCTCGC (SEQ ID NO:42) 85) GCGAGGACTATCTTTAATGTATGGAAAATCTCGC (SEQ ID NO:43) 86) GCGAGGACTATCTTTAATGTATGGAAAATCTCGC (SEQ ID NO:44) 87) GCGAGGACTATCTTTAATGTATGGAAAATCTCGC (SEQ ID NO:45) 88) GCGAGGACTATCTTTAATGTATGGAAAATCTCGC (SEQ ID NO:46) 89) GCGAGGACTATCTTTAATGTATGGAAAATCTCGC (SEQ ID NO:47) 810) GCGAGGACTATCTTTAATGTATGGAAAATCTCGC (SEQ ID NO:48) 811) GCGAGGACTATCTTTAATGTATGGAAAATCTCGC (SEQ ID NO:49) 812) GCGAGGACTATCTTTAATGTATGGAAAATCTCGC (SEQ ID NO:50) 813) GCGAGGACTATCTTTAATGTATGGAAAATCTCGC (SEQ ID NO:51) 814) GCGAGGACTATCTTTAATGTATGGAAAATCTCGC (SEQ ID NO:52) 815) GCGAGGACTATCTTTaatgTATGGAAAATCTCGC (SEQ ID NO:53) 816) GCGAGGACTATCTTTaatgTATGGAAAATCTCGC (SEQ ID NO:54) 817) GCGAGGACTATCTTTaatgTATGGAAAATCTCGC (SEQ ID NO:55) B18) GCGAGGACTATCtttAATGtatGGAAAATCTCGC (SEQ ID NO:56) B19) GCGAGGACTATCtttAATGtAtGGAAAATCTCGC (SEQ ID NO:57)

[00183] A Tabela 1 lista as possíveis modificações que são usadas nos em oligonucleotídeos efetores para interromper CCR5 bem como nas sondas, independentemente de como são classificados abaixo, uma vez que também serão testados em combinação.

Exemplo 5 - Induzindo a expressão de CCR5 em células-tronco imunes

[00184] Este exemplo descreve métodos para induzir transitoriamente a expressão de CCR5 em células-tronco imunes sem perda da função de células-tronco.

[00185] A indução da expressão do lócus CCR5 em células-tronco imunes é necessária para utilizar as sondas de sinais moleculares (por exemplo, sondas Chromovert®) e condições para detectar células que compreendem Δ32 CCR5. Os reagentes e um regime de tratamento que possam induzir a expressão transitória máxima de CCR5 nas células- tronco imunes são selecionados por teste combinatório de citocinas. As condições iniciais eficazes que são identificadas são derivadas para uma maior otimização.

[00186] Os parâmetros a seguir são utilizados para a seleção e otimização: (i) uma combinação de duas ou mais citocinas, (ii) concentração de cada citocina utilizada, (iii) tratamento simultâneo ou sequencial utilizando as citocinas no caso em que mais do que uma é utilizada, (iv) densidade de células durante o tratamento, (v) duração do tempo de tratamento, (vi) etapa de choque térmico ou tratamento, e (vii) utilização de meio condicionado ou cocultura de células alimentadoras. Parâmetros semelhantes são usados para testar reagentes (isoladamente ou em combinação com citocinas) para ativar ou mobilizar células-tronco imunes.

[00187] Métodos de RT-PCR de rotina são então utilizados para identificar condições que resultem na indução transitória da expressão de CCR5. As células identificadas são, então, testadas quanto à ausência de qualquer perturbação da função das células-tronco através da aplicação de métodos para obter as células diferenciadas do sistema imune a partir das células-tronco imunes tratadas e a partir das células- tronco imunes controle não tratadas e comparação.

Exemplo 6 - Avaliando a extensão da modificação genômica

[00188] Este exemplo descreve métodos para testar a integridade genômica de células-tronco imunes tratadas utilizando abordagens baseadas em PCR para determinar se há qualquer modificação genômica indesejada. A discussão que se segue utiliza abordagens de sequenciamento amplo do genoma como uma modalidade específica, mas os especialistas na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina, outros equivalentes à modalidade específica e métodos aqui discutidos.

[00189] Em comparação com os métodos de terapia celular baseada em vetores (por exemplo, métodos ZFN e RNAi), os métodos baseados em oligonucleotídeos não exigem a utilização de vetores, eliminando o risco de introdução aberrante da sequência codificada do vetor no genoma das células tratadas. Além disso, relata-se que métodos baseados em oligonucleotídeos são altamente ineficientes, sugerindo que uma modificação do genoma fora do alvo ou não intencional é improvável ou altamente infrequente. No entanto, a extensão de tais modificações genômicas não intencionais é avaliada para assegurar a segurança dos métodos da presente invenção.

[00190] Métodos baseados em PCR para a detecção de sequência codificada por oligonucleotídeos no genoma das células tratadas são desenvolvidos como uma primeira linha de teste. Tal método serve para amplificar o DNA genômico digerido das células tratadas usando um iniciador com base na sequência do oligonucleotídeo, mais uma mistura de outros iniciadores. A análise dos produtos amplificados de PCR por eletroforese em gel em células tratadas versus células controle é, então, usada para detectar quaisquer diferenças que possam indicar a presença de sequências codificadas por oligonucleotídeos no genoma. Este método pode não identificar modificações genômicas muito raras; no entanto, é eficaz na detecção de modificações generalizadas e não intencionais do genoma.

[00191] O genoma completo das células tratadas que passam da primeira linha de teste é, então, sequenciado para detectar qualquer modificação aberrante pelos oligonucleotídeos. Métodos analíticos são desenvolvidos e testados para assegurar que todas as possíveis e pequenas alterações aberrantes do genoma provocadas pelos oligonucleotídeos sejam confiavelmente detectadas. Por exemplo, são desenvolvidos métodos para avaliar o número de genomas completos que devem ser sequenciados para determinar com uma certeza estatística o nível de risco que qualquer modificação aberrante do genoma possa apresentar. Parâmetros como a frequência e a probabilidade de interromper uma codificação ou outro elemento funcional da sequência dentro do genoma são considerados para estabelecer a certeza estatística.

Exemplo 7 - Identificando características de células-tronco imunes correlacionadas ao sucesso para utilização nos métodos da invenção

[00192] Este exemplo descreve métodos para identificar os atributos de células-tronco imunes de um indivíduo que possam estar correlacionados com a operação eficiente dos métodos da presente invenção.

[00193] Idealmente, uma terapia celular para o HIV/AIDS deve ser igualmente aplicável em diferentes pacientes, independentemente de sexo, idade, etnia ou status de HIV/AIDS. Mas, devido à variabilidade das células-tronco de diferentes indivíduos, a taxa de sucesso da terapia pode variar entre os diferentes cortes de pacientes. Para determinar se o sucesso de qualquer aspecto da invenção está correlacionado a uma característica em particular das células-tronco imunes, uma alíquota das células-tronco utilizadas em cada etapa relevante dos métodos é avaliada e caracterizados utilizando uma série de testes. Por exemplo, as células são caracterizadas utilizando RT-PCR e imunocoloração para avaliar a expressão de marcadores importantes de células-tronco imunes e células imunes diferenciadas e comparadas.

[00194] Isto permite a identificação de padrões ou características que possam estar correlacionados com a efetividade destas etapas ou células nestas etapas. A identificação de quaisquer destas características também pode informar e auxiliar no desenvolvimento de métodos que são mais amplamente aplicáveis.

Exemplo 8 - Desenvolvendo métodos para terapia celular

[00195] Este exemplo descreve a sequência de etapas e tecnologias implementadas para a terapia celular para HIV/AIDS desenvolvida pela presente invenção. Uma modalidade da invenção emprega as seguintes etapas e tecnologias: (i) as células-tronco imunes são tratadas utilizando o oligonucleotídeo efetor e métodos desenvolvidos nos Exemplos 1 a 3, (ii) a expressão de CCR5 é transitoriamente induzida nas células tratadas utilizando os reagentes e métodos do Exemplo 5, (iii) as sondas Chromovert® e condições do Exemplo 4 são utilizadas para detectar e isolar as células tratadas que compreendem a variante Δ32 de CCR5; (iv) opcionalmente, os atributos de quaisquer indivíduos ou suas células- tronco imunes que se correlacionam aos resultados bem sucedidos da invenção, tais como identificados no Exemplo 7, são usados para priorizar as células-tronco imunes mais promissoras para a terapia celular para HIV/AIDS; e (v) isolar células-tronco imunes geradas pelas etapas acima que sejam (1) enriquecidas para a mutação Δ32 em um ou ambos os alelos, (2) viáveis, e (3) com a função de células-tronco preservada. Como os especialistas na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina, outras etapas e tecnologias podem ser empregadas ou substituídas por qualquer uma das etapas anteriores para obter a mesma função e resultados.

[00196] As condições ótimas para satisfazer os desfechos de qualquer uma das etapas anteriores podem impactar negativamente o cumprimento dos desfechos das outras etapas. Por exemplo, as condições que induzem maximamente a expressão de CCR5 poderia afetar negativamente a preservação da função de células-tronco das células que são isoladas utilizando as sondas Chromovert® e condições relevantes. Consequentemente, as condições para a indução da expressão de CCR5 e o processo Chromovert® são ajustados de modo que a expressão suficiente de CCR5 seja induzida enquanto a função de células-tronco das células isoladas também seja preservada. Os intervalos dos parâmetros e condições utilizados em qualquer uma das etapas são considerados e posteriormente explorados para atingir este equilíbrio.

[00197] Tais condições incluem a produção máxima de células que compreendem a variante Δ32 de CCR5. Elevadas concentrações de oligonucleotídeos e condições potentes de eletroporação para introduzir os oligonucleotídeos nas células podem atingir o maior número de células modificadas. No entanto, estas condições podem também aumentar a ocorrência de modificações não intencionais fora do alvo no genoma. Outros testes das diferentes condições são realizados para atingir um equilíbrio entre obter eficiência máxima em criar células que compreendem Δ32 CCR5 e manter modificações fora do alvo no genoma no mínimo.

[00198] Tais condições incluem a produção máxima de células terapêuticas. Altas velocidades de separação celular durante o processo Chromovert® para detectar e isolar células tratadas compreendendo Δ32 CCR5 podem aumentar a produção destas células; no entanto, a separação celular de alta velocidade pode levar a uma diminuição da viabilidade celular e perda da função das células- tronco. Ensaios de diferentes velocidades de separação celular são realizados para atingir um equilíbrio entre obter produção máxima e retenção máxima da viabilidade e função das células-tronco.

[00199] Tais condições incluem o isolamento de células enriquecidas para compreender exclusivamente a variante Δ32 de CCR5. Métodos Chromovert® que se baseiam na utilização de sondas múltiplas Chromovert® são utilizados para permitir a detecção de células tratadas com sucesso para compreender a variante Δ32 de CCR5 em ambos os loci cromossômicos. A título de exemplo, além do uso de uma sonda Chromovert® desenhada para detectar a variante Δ32 do CCR5, a utilização simultânea ou sequencial de outra sonda Chromovert® desenhada para detectar a variante selvagem de CCR5 também é utilizada para selecionar células que sejam relatadas como positivas para CCR5 selvagem. Empregar estes métodos pode exigir etapas e manipulações adicionais das células. O teste das diferentes sondas Chromovert® em combinação com as possíveis etapas adicionais é realizado para obter um equilíbrio entre enriquecer células modificadas otimamente e preservar a viabilidade e a capacidade funcional das células isoladas resultantes. Esta modalidade utiliza Chromovert® como um exemplo, mas os especialistas na técnica reconhecerão que outras sondas de sinais moleculares podem ser usadas de forma semelhante.

Exemplo 9 - Testes pré-clínicos e verificação da terapia celular

[00200] Este exemplo descreve métodos para testar a eficácia pré- clínica, eficácia e segurança dos métodos da invenção. Os métodos incluem ensaios celulares in vitro e em modelos animais in vivo que foram previamente estabelecidos e são confiáveis em testes pré- clínicos.

[00201] O teste celular, que é realizada primeiramente, inclui testes desenhados para avaliar: (i) o percentual de células tratadas com oligonucleotídeo compreendendo a variante Δ32 de CCR5 e o percentual que compreende a variante Δ32 em ambos os loci cromossômicos, (ii) a eficácia do enriquecimento de células compreendendo a variante Δ32 de CCR5 em um ou ambos os loci cromossômicos desenvolvida utilizando as sondas e condições Chromovert®, (iii) a preservação da função das células-tronco a partir das células isoladas após as etapas de tratamento com o oligonucleotídeos e passagem pelo processo Chromovert®, (iv) a extensão e a natureza das modificações aberrantes do genoma, se houver, e (v) a resistência das células imunes diferenciadas a partir das células-tronco imunes tratadas e selecionadas para a infecção pelo HIV. Como condições iniciais promissoras são obtidas no contexto destes ensaios celulares, uma avaliação mais completa da eficácia pré-clínica e segurança é então realizada, incluindo: (i) sequenciamento de genoma amplo para determinar a extensão e a natureza exata das modificações aberrantes do genoma, como um efeito colateral do método, que inclui ainda uma determinação estatística da taxa ou frequência, (ii) a utilização de modelos animais para avaliar a preservação da função das células-tronco a partir das células isoladas in vivo, e (iii) a utilização de modelos animais para determinar e caracterizar a resistência ao HIV pelas células tratadas. Os seguintes testes 1-9 são exemplos dos métodos de teste que podem ser utilizados.

[00202] Teste 1: Avaliação celular de métodos mediados por oligonucleotídeos para replicar a variante Δ32 de CCR5 em células- tronco imunes. São estabelecidos métodos de PCR e de sequenciamento para avaliar a eficácia da criação da modificação Δ32 nas células-tronco imunes usando oligonucleotídeos. Os métodos para determinar o percentual de células tratadas que são modificadas em um ou em ambos os loci cromossômicos são desenvolvidos e empregados na invenção.

[00203] Teste 2: Avaliação celular da eficiência de sondas e condições Chromovert® para detectar e isolar células-tronco imunes tratadas para compreender a variante Δ32 de CCR5. As células tratadas com os oligonucleotídeos otimizados para produzir a variante Δ32 de CCR5 estão sujeitas à separação de células, utilizando reagentes e condições Chromovert®. Ver, por exemplo, Larsson H.M., etal., PLOSOne. 2012;7(11):e49874. doi: 10.1371/journal.pone.0049874. Epub 2012 Nov 27. As células isoladas são testados utilizando PCR genômica e sequenciamento para detectar o nível de enriquecimento destas células em comparação com a população de entrada. A viabilidade das células separadas é então avaliada utilizando método conhecido. As células podem ser tratadas para induzir transitoriamente a expressão do lócus CCR5 antes ou durante a aplicação das sondas ou processo Chromovert.

[00204] Teste 3: Avaliação celular da preservação da função das células-tronco pelas células-tronco imunes isoladas tratadas para compreender a variante Δ32 de CCR5. Células-tronco imunes isoladas tratadas para compreender a variante CCR5 de Δ32 são testadas para avaliar o nível ao qual elas preservaram sua função de célula-tronco. As condições utilizadas para levar à diferenciação das células imunes maduras a partir de células-tronco imunes são aplicadas e as células resultantes são caracterizadas para determinar se todas as células esperadas do sistema imune foram geradas.

[00205] Teste 4: Avaliação baseada em PCR in vitro da extensão das alterações não intencionais do genoma das células tratadas. Métodos para amplificar as sequências genômicas que compreendem sequências codificadas por oligonucleotídeos são desenvolvidos e usados para aproximar o nível de modificações aberrantes fora do alvo no genoma das células tratadas.

[00206] Teste 5: Avaliação celular da resistência à infecção pelo HIV das células imunes maduras diferenciadas obtidas a partir das células- tronco isoladas. Células-tronco imunes isoladas compreendendo a variante Δ32 de CCR5 de acordo com a invenção são cultivadas, utilizando métodos convencionais para dar origem a células imunes maduras, incluindo as populações de células T CD4+ imunes que constituem o alvo e são infectadas pelo HIV. As células resultantes são, em seguida, infectadas pelo HIV. A resistência destas células em comparação com células T CD4+ controle é avaliada como uma primeira medida para avaliar sua resistência à infecção pelo HIV.

[00207] Teste 6: Sequenciamento do genoma completo para uma avaliação refinada incluindo uma medida estatisticamente significativa da extensão e natureza das modificações não intencionais no genoma das células tratadas. Após condições que resultam na menor taxa possível de modificações do genoma aberrantes e não intencionais fora do alvo são estabelecidas, mais testes, incluindo o sequenciamento do genoma completo são usados para um exame mais detalhado da extensão e natureza de tal modificação, se houver. Se necessário, o teste é expandido para obter dados de sequenciamento do genoma completo em um número suficiente de células de tal modo que uma taxa estatisticamente significativa de atividade fora do alvo possa ser determinada.

[00208] Teste 7: Estudos animais in vivo para avaliação da preservação da função de células-tronco pelas células-tronco imunes isoladas tratadas para compreender a variante Δ32 de CCR5. Células- tronco imunes isoladas compreendendo a variante Δ32 de CCR5 são introduzidas em camundongos nude seguindo métodos estabelecidos utilizados para gerar sistemas imunes humanos neste modelo. A análise das células imunes produzidas pelos camundongos transformados é realizada para avaliar a preservação da função de células-tronco pelas células-tronco imunes.

[00209] Teste 8: Estudos animais in vivo para avaliar a resistência à infecção pelo HIV das células imunes maduras diferenciadas obtidas a partir das células-tronco isoladas. Em caso de sucesso no Teste 7, os camundongos nude transformados são expostos ao HIV e, em seguida, testados para a infecção por utilização de métodos estabelecidos.

[00210] Teste 9: Amostras biológicas de pacientes são utilizadas e analisadas para as células-tronco que foram modificadas por mutação Δ32 em CCR5 e/ou células diferenciadas a partir de células-tronco que foram modificadas pela mutação Δ32 em CCR5. A mutação CCR5 em particular é analisada para avaliar os efeitos da terapia com células- tronco.

Claims (5)

1. Método para fazer células recombinantes, caracterizado pelo fato de que compreende contatar células compreendendo uma sequência alvo a ser deletada dentro de um gene do receptor de quimiocina C-C do tipo 5 (CCR5) com um oligonucleotídeo efetor dirigido para a sequência alvo, em que o oligonucleotídeo efetor compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11; contatar a célula com oligonucleotídeos formadores de triplex ou oligonucleotídeos pseudocomplementares; permitindo que o oligonucleotídeo efetor delete a sequência alvo nas células, em que a sequência a ser deletada é uma deleção Δ32.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células são selecionadas do grupo consistindo de células-tronco embrionárias, células-tronco pluripotentes induzidas, células-tronco adultas, células-tronco do sangue do cordão umbilical, células-tronco hematopoiéticas, células-tronco de câncer, células progenitoras multipotentes, células progenitoras restritas à linhagem, células progenitoras mieloides comuns, células progenitoras de granulócito-macrófago, células progenitoras de megacariócito-eritróide, células do sistema imune, células do sistema imune diferenciadas e células do sistema imune CD4-positivas.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as células são células-tronco.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que os oligonucleotídeos formadores de triplex compreendem um ácido nucleico peptídico (PNA).

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda isolar pelo menos uma das células recombinantes para fornecer uma população enriquecida de células recombinantes.