BR112015023307B1

BR112015023307B1 - Sistemas e métodos para propagação de levedura

Info

Publication number: BR112015023307B1
Application number: BR112015023307-4A
Authority: BR
Inventors: Neelakantam V. Narendranath; Stephen M Lewis
Original assignee: Poet Research, Incorporated
Priority date: 2013-03-14
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2022-11-29
Also published as: CA2902223A1; CA2902223C; EP2970862A1; BR112015023307A2; US9034631B2; US20140273167A1; WO2014160184A1; CN105264062A; EP2970862A4

Abstract

SISTEMAS E MÉTODOS PARA PROPAGAÇÃO DE LEVEDURA A presente invenção refere-se a sistemas e métodos para a propagação de levedura usando uma matéria-prima tal como amido e uma ou mais enzimas (por exemplo, um coquetel de enzimas) para quebrar a matéria-prima em um ou mais monossacarídeos em uma taxa suficiente de modo que a levedura possa usar os monossacarídeos como uma fonte de carbono para produzir mais células de levedura enquanto não produzindo uma quantidade indevida de álcool.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Não Provisório U.S. No 13/804.364, depositado em 14 de março de 2013 e intitulado “SISTEMAS E MÉTODOS PARA PROPAGAÇÃO DE LEVEDURA” pedido este que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002]A presente invenção refere-se ao crescimento de levedura tal como Saccharomyces cerevisiae. Mais particularmente, a presente invenção refere-se ao crescimento de levedura usando uma matéria-prima tal como amido e uma ou mais enzimas (por exemplo, um coquetel de enzimas).

FUNDAMENTOS

[003] Produtores de etanol frequentemente adquirem levedura para fermen-tação a partir de um fornecedor de levedura (por exemplo, na forma seca, e/ou como uma suspensão líquida cremosa). Levedura pode constituir um grande custo opera-cional para muitos produtores de etanol, e como tal, muitos produtores de etanol adi-cionam o mínimo possível de levedura aos processos de fermentação.

[004]Entretanto, pode haver vários benefícios em aumentar a carga de leve-dura dentro de uma fermentação. Por exemplo, um benefício substancial pode ser um período de tempo reduzido para fermentação, desse modo aumentando eficaz-mente a produtividade para uma instalação de produção de etanol dada. Um outro benefício principal de carga de levedura aumentada pode ser uma redução em per-das referindo-se à contaminação por bactérias lácticas. Uma carga de levedura mais alta pode significar que contaminantes não podem competir com a população de le-vedura dominante, garantindo assim uma operação mais limpa. Infelizmente, dado o custo da levedura, a inoculação aumentada de fermentações é frequentemente de custo proibitivo.

[005]Se instalações de produção de etanol podem desenvolver sua própria levedura em uma maneira eficaz de custo, então doses maiores de levedura podem ser adicionadas aos fermentadores. Isto pode resultar em benefícios múltiplos, inclu-indo custos de levedura reduzidos, fermentação mais rápida (aumentando eficaz-mente a capacidade da usina), e/ou riscos de contaminação microbiana reduzidos (devido à competição de bactérias lácticas pela maior população de levedura).

[006] Entretanto, o crescimento (propagação) de levedura tal como, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae pode ser desafiador. Por exemplo, se a levedura for cultivada em uma concentração muito alta de glicose, a levedura pode mudar das vias metabólicas aeróbicas para o metabolismo anaeróbico de produção de eta- nol, mesmo sob condições altamente aeradas. Esta mudança, quando da propagação de levedura não é geralmente desejável se o propósito for gerar números substanciais de células de levedura. Mesmo sob condições altamente aeradas, se a concentração de glicose em um meio de propagação excede cerca de 5 g/L, a levedura, S. cerevisiae, pode algumas vezes começar a fabricar etanol (via fermentativa). Isto é conhecido como o efeito “Crabtree” (supressão da respiração por alto teor de glicose). Do mesmo modo, quando não oxigênio suficiente está presente, o metabolismo pode mudar para a via fermentativa.

[007] Para ajudar a evitar o Efeito Crabtree, a levedura Saccharomyces cere- visiae é frequentemente cultivada por fornecedores de leveduras em tanques de propagação de levedura bem aerados com alimentação de glicose severamente monitorada (tipicamente matéria-prima de melaço é usada em um processo semi- descontínuo) para ajudar a garantir que níveis de glicose permaneçam baixos o bas-tante que o metabolismo permaneça aeróbico.

[008] Infelizmente, para a grande maioria de produtores de etanol, manter as condições necessárias para cultivar sua própria levedura pode ser economicamente e/ou tecnicamente impraticável. O equipamento e especialidade técnica necessários para criar levedura em volumes apreciáveis são frequentemente de risco e custo muito grandes, e como tal eles devem frequentemente contar com fornecedores de leveduras. Por exemplo, medição cuidadosa da corrente de glicose por um produtor de etanol pode ser tecnicamente difícil devido à variação grande de lote-a-lote no melaço, e promove um risco maior se feito impropriamente devido aos fechamentos de instalações associados com uma falta de estoque de levedura. Além disso, mela-ço não é tipicamente utilizado em uma instalação de produção de etanol nos Esta-dos Unidos (América do Norte), e a logística necessária para ter o melaço liberado frequentemente seria um obstáculo maior ao cultivo de levedura por um produtor de etanol.

[009]Seria vantajoso levar em consideração sistemas e métodos alternativos para propagar levedura, por exemplo, sistemas e métodos que não requerem siste-mas de medição de melaço severos. Tais sistemas e métodos podem levar em con-sideração a dosagem de levedura mais preferida em fermentações de etanol.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[010]A presente invenção refere-se ao cultivo de levedura usando uma maté-ria-prima e uma ou mais enzimas (por exemplo, um coquetel de enzimas) que podem quebrar polissacarídeo(s) e/ou oligossacarídeo(s) na matéria-prima em um ou mais monossacarídeos em uma taxa suficiente de modo que a levedura possa usar os monossacarídeos como uma fonte de carbono para produzir mais células de le-vedura embora não produzindo uma quantidade indevida de álcool. Selecionando-se os tipos e quantidades de matéria-prima(s) e tipos e quantidades de enzima(s), mo- nossacarídeos podem ser gerados em uma taxa desejada.

[011] Fornecer monossacarídeos em uma tal maneira pode ser relativamente simples, robusto e fácil. Por exemplo, a propagação de levedura de acordo com a presente invenção pode ser realizada de acordo com um processo contínuo simples, e um processo semi-descontínuo não é necessário.

[012]Também, muitas instalações de produção de etanol, especialmente aquelas que usam amido para fabricar etanol, podem cultivar suas próprias popula-ções de levedura de acordo com os sistemas e métodos da presente invenção, e frequentemente sem incorrer custos adicionais substanciais. Usar os sistemas e mé-todos de acordo com a presente invenção tem o potencial de reduzir eficazmente o custo global de etanol para a indústria de combustível, e eventualmente ser capaz de auxiliar em outros bioprodutos que podem ser gerados usando leveduras, espe-cialmente leveduras modificadas.

[013]Adicionalmente, em algumas formas de realização, sistemas e métodos de acordo com a presente invenção podem permitir que produtores de etanol gerem culturas de levedura no local de trabalho em um custo significantemente reduzido. Isto pode permitir não apenas economias monetárias, mas também a capacidade de produtores de etanol aumentar a carga de levedura na fermentação de modo a au-mentar os rendimentos, diminuir o risco de contaminação microbiana, condicionar a produção de levedura ao meio de produção, e/ou condicionar a levedura que ex-pressa enzima amilolítica tal como a levedura Saccharomyces cerevisiae para gerar enzimas adaptadas à matéria-prima que é usada para a produção de etanol.

[014]De acordo com um aspecto da presente invenção, um método de pro-pagação de levedura inclui: fornecer uma composição incluindo: um meio de propagação incluindo: uma fonte de nutriente; uma fonte de carbono compreendendo uma matéria-prima tendo uma ou mais polissacarídeos e/ou um ou mais oligossacarídeos; e uma ou mais enzimas que podem converter pelo menos uma porção de o um ou mais polissacarídeos e/ou um ou mais oligossacarídeos em um ou mais mo- nossacarídeos; e uma primeira massa celular da levedura, em que a levedura pode usar pelo menos uma porção de o um ou mais monossacarídeos para cultivar a primeira massa celular da levedura por um período de tempo para formar uma segunda massa celular da levedura; e cultivar a primeira massa celular de levedura por um período de tempo para formar uma segunda massa celular de levedura que é maior do que a primeira mas-sa celular de levedura.

[015]De acordo com um outro aspecto da presente invenção, um sistema pa-ra propagação de levedura inclui: um vaso do reator de propagação incluindo uma composição tendo: um meio de propagação incluindo: uma fonte de nutriente; uma fonte de carbono incluindo uma matéria-prima tendo um ou mais polis- sacarídeos e/ou um ou mais oligossacarídeos; e uma ou mais enzimas que podem converter pelo menos uma porção de o um ou mais polissacarídeos e/ou um ou mais oligossacarídeos em um ou mais mo- nossacarídeos; e uma primeira massa celular da levedura, em que a levedura pode usar pelo menos uma porção de o um ou mais monossacarídeos para cultivar a primeira massa celular da levedura por um período de tempo para formar uma segunda massa celular da levedura que é maior do que a primeira massa celular de levedura; e um aerador ligado ao vaso do reator de propagação para aerar a composição.

[016] Em formas de realização preferidas, uma ou mais enzimas incluem glu- coamilase e/ou alfa-amilase fúngica.

[017] Em formas de realização preferidas, o um ou mais polissacarídeos e/ou um ou mais oligossacarídeos incluem material de amido tal como amido de milho.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[018]A FIGURA 1 mostra uma vista em perspectiva de uma biorrefinaria in-cluindo uma instalação de produção de etanol.

[019]As FIGURAS 2A e 2B mostram diagramas de fluxo de processo exem-plares ilustrando etapas usadas para gerar etanol em uma instalação de produção de etanol com base em grão.

[020]A FIGURA 3 mostra um diagrama de bloco esquemático exemplar de um sistema de propagação de acordo com a presente invenção.

[021]A FIGURA 4 mostra um gráfico do etanol produzido sob condições de fermentação variadas de acordo com o Exemplo 4.

[022]A FIGURA 5A mostra a Tabela 1 do Exemplo 1.

[023]A FIGURA 5B mostra a Tabela 2 do Exemplo 1.

[024]A FIGURA 6A mostra a Tabela 3 do Exemplo 2.

[025]A FIGURA 6B mostra a Tabela 4 do Exemplo 2.

[026]A FIGURA 7A mostra a Tabela 5 do Exemplo 3.

[027]A FIGURA 7B mostra a Tabela 6 do Exemplo 3.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[028]A presente invenção será agora descrita em detalhe com referência a várias formas de realização desta e como ilustrado nos desenhos anexos. Na des-crição seguinte, numerosos detalhes específicos são apresentados de modo a for-necer um entendimento completo das formas de realização da presente invenção. Estará evidente, entretanto, a uma pessoa habilitada na técnica, que formas de rea-lização podem ser praticadas sem alguns ou todos estes detalhes específicos. Em outros exemplos, etapas de processo e/ou estruturas bem conhecidos não foram descritos em detalhe de modo a não obscurecer desnecessariamente a presente invenção. As características e vantagens de formas de realização podem ser mais bem entendidas com referência aos desenhos e debates que seguem.

[029] Propagação de levedura de acordo com a presente invenção inclui for-necer uma composição incluindo um meio de propagação e uma primeira massa celular da levedura.

[030]Um meio de propagação para propagação de levedura geralmente inclui pelo menos uma fonte de nutriente, uma fonte de carbono, e água para formar um meio que pode facilitar o crescimento de uma quantidade suficiente de massa celular de levedura para inoculação a um sistema de fermentação. A massa celular inicial de levedura pode ser incluída enquanto o meio está sendo formado, depois que o meio é formado, ou ambos.

[031] Ingredientes exemplares que podem ser incluídos na fonte de nutriente incluem um ou mais de extrato de levedura, ureia, fosfato de diamônio, sulfato de magnésio, sulfato de zinco ou outros sais, e semelhantes.

[032]Além de uma fonte de nutriente, um meio de propagação de acordo com a presente invenção também inclui uma fonte de carbono que inclui uma matéria-prima, e uma ou mais enzimas.

[033] Pelo menos uma porção da matéria-prima inclui um ou mais polissaca- rídeos e/ou um ou mais oligossacarídeos. O um ou mais polissacarídeos e/ou um ou mais oligossacarídeos podem ser quebrados (por exemplo, por intermédio de hidróli-se enzimática) em um ou mais monossacarídeos durante a propagação e função como uma fonte de carbono para a levedura para produzir mais células de levedura. Polissacarídeos e/ou oligossacarídeos exemplares incluem aqueles que podem ser quebrados em monossacarídeos C6. Em uma forma de realização preferida, um po- lissacarídeo inclui amido e um monossacarídeo correspondente inclui glicose.

[034]Matérias-primas exemplares podem ser preparadas a partir de um ou mais grãos tais como milho, soja, sorgo/milho, cevada, trigo, etc., ou uma combina-ção de tais grãos. Em algumas formas de realização, a matéria-prima é preferivel-mente preparada a partir de grão de milho integral ou uma ou mais porções de milho fracionado.

[035] Matéria-prima bruta tal como grãos de milho é preferivelmente prepara-da para fabricar a matéria-prima acessível por uma ou mais enzimas de modo que as enzimas possam quebrar os polissacarídeos e/ou oligossacarídeos a um ou mais monossacarídeos em uma taxa desejada. Como debatido aqui, uma taxa desejada de produção de monossacarídeo (por exemplo, glicose) inclui uma taxa que produz glicose o bastante para propagar a levedura dentro de um período de tempo desejado (por exemplo, 24 horas) ainda evita a produção de uma quantidade indevida de etanol por intermédio do efeito Crabtree. Uma taxa desejada de hidrolisar polissaca- rídeos e/ou oligossacarídeos em uma matéria-prima a um ou mais monossacarídeos pode incluir uma taxa que imita taxas convencionalmente usadas para alimentar ma-nualmente o material contendo glicose (por exemplo, melaço) em um sistema de propagação semi-descontínuo. Métodos exemplares de preparar a matéria-prima para o uso em um meio de propagação de acordo com a presente invenção incluem aqueles usados para preparar a matéria-prima para hidrólise enzimática em proces-sos de etanol debatidos abaixo em relação ao sistema de preparação 204 nas FIGURAS 2A e 2B (por exemplo, moagem).

[036]Em algumas formas de realização, a matéria-prima inclui um ou mais de amido de milho, endosperma de milho moído, farinha de sorgo, farinha de soja, farinha de trigo, amido derivado de biomassa, e farinha de cevada.

[037]A matéria-prima pode ser incluída em qualquer quantidade que forneça uma quantidade suficiente de monossacarídeo (por exemplo, glicose) por intermédio de hidrólise enzimática como descrito aqui para suportar uma quantidade desejada de levedura que cresce dentro de um período de tempo desejado. Quantidades exemplares de matéria-prima que podem ser incluídas em um meio de propagação que pode suportar a produção de levedura o bastante dentro de cerca de 12 a 48 horas para um sistema de fermentação de etanol comercial incluem amido em uma faixa de 15 - 75 gramas de farinha seca por litro de meio de propagação.

[038]Além de uma matéria-prima como descrito aqui, um meio de propagação de acordo com a presente invenção inclui uma ou mais enzimas que podem converter pelo menos uma porção de o um ou mais polissacarídeos e/ou um ou mais oligossacarídeos em um ou mais monossacarídeos por intermédio de hidrólise e funcionam como uma fonte de carbono para suportar a reprodução de células de levedura. A velocidade da hidrólise é dependente de fatores tais como níveis de car-ga enzimática, atividade enzimática, e o pH e temperatura do meio de propagação. Em formas de realização preferidas, uma ou mais enzimas incluem uma ou mais enzimas amilolíticas. Enzimas amilolíticas exemplares incluem uma ou mais de alfa- amilase (por exemplo, alfa-amilase fúngica), glucoamilase, outras amilases, e amilo- glucosidases.

[039] Em algumas formas de realização, uma ou mais enzimas podem incluir a glucoamilase presente em uma quantidade na faixa de 0,25 a 30 unidades de glu- coamilase (AGUs) por grama de sólidos secos no meio de propagação (preferivel-mente de 0,75 a 30 unidades de glucoamilase (AGUs) por grama de sólidos secos no meio de propagação); alfa-amilase fúngica presente em uma quantidade na faixa de 0,03 a 4 unidades de alfa-amilase fúngica (FAU-F) por grama de sólidos secos no meio de propagação (preferivelmente de 0,05 a 4 unidades de alfa-amilase fúngica (FAU-F) por grama de sólidos secos no meio de propagação); e combinações destes. Enzimas tais como estas que podem degradar a matéria-prima de acordo com a presente invenção são bem conhecidas e podem ser comercialmente obtidas de, por exemplo, Novozymes®, Bagsvaerd Denmark.

[040]Opcionalmente, uma ou mais enzimas adicionais podem ser incluídas em um meio de propagação tais como proteases, fitases, celulases e hemicelulases, como pode ser desejado para qualquer propagação de levedura particular (tipica-mente dependente do suprimento de matéria-prima/amido sendo utilizado).

[041]Agentes adicionais opcionais para propagação de levedura são bem conhecidos e incluem, por exemplo, agentes fornecidos com a levedura tais como antibióticos, enzimas suplementares ou acessórias, materiais para ajustar e manter o pH, nutrientes ou outros componentes que fornecem benefícios nutricionais ou ou-tros à levedura.

[042]Os métodos de propagação descritos aqui podem ser desejáveis para o crescimento de muitos tipos de leveduras. Em muitas formas de realização, a leve-dura inclui uma levedura que pode beneficiar-se de ser propagada em um meio que introduz uma fonte de carbono tal como glicose em uma maneira relativamente con-trolada por intermédio de hidrólise enzimática de uma matéria-prima de modo que a levedura possa reproduzir ainda não produz uma quantidade indevida de álcool por intermédio de fermentação (por exemplo, supressão da respiração devido ao efeito Crabtree). Leveduras exemplares incluem Saccharomyces cerevisiae que pode pro-pagar usando pelo menos glicose como uma fonte de carbono. Em algumas formas de realização, a levedura pode incluir levedura não geneticamente modificada tal como Saccharomyces cerevisiae não geneticamente modificada. Em outras formas de realização, a levedura pode incluir levedura geneticamente modificada tal como Saccharomyces cerevisiae recombinante geneticamente modificada.

[043]A levedura pode ser introduzida na propagação em qualquer quantida-de inicial. Tipicamente, a quantidade inicial é determinada com base em considera-ções tais como o período de tempo desejado para concluir a propagação e a conta-gem de célula desejada no final da propagação, a fonte de nutriente, a fonte de car-bono incluindo a matéria-prima, a(s) enzima(s), temperatura, pH e semelhantes. Em algumas formas de realização, a levedura é fornecida ao meio de propagação em uma quantidade na faixa de 0,01 a 10 gramas de levedura seca por litro do meio de propagação, preferivelmente em uma quantidade na faixa de 0,02 a 5 gramas de levedura seca por litro do meio de propagação.

[044]Como mencionado, um método de propagação de levedura de acordo com a presente invenção inclui fornecer uma composição que inclui um meio de propagação e uma primeira massa celular de levedura; e depois cultivar a primeira massa celular de levedura por um período de tempo para formar uma segunda mas-sa celular de levedura que é maior do que a primeira massa celular de levedura.

[045]De acordo com a presente invenção, os tipos e quantidades de uma ou mais enzimas e matéria-prima são selecionados de modo que as enzimas quebram os polissacarídeos e/ou oligossacarídeos da matéria-prima por intermédio de hidróli-se enzimática em monossacarídeos de modo que os monossacarídeos (por exemplo, glicose) são introduzidos como uma fonte de carbono para a levedura em uma maneira relativamente controlada de modo que a levedura possa reproduzir em um período de tempo desejado ainda não produz uma quantidade indevida de álcool por intermédio de fermentação (por exemplo, supressão da respiração devido ao efeito Crabtree).

[046] Preferivelmente, uma ou mais enzimas estão presentes em uma quan-tidade e a matéria-prima está presente em uma quantidade de modo que substanci-almente nenhum etanol é produzido pela levedura durante pelo menos uma porção do período de tempo. Preferivelmente, substancialmente nenhum etanol é produzido pela levedura durante o período de tempo de crescimento inteiro. Como usado aqui, “substancialmente nenhum etanol” significa que o nível de etanol produzido é 1 por cento v/v ou menos, preferivelmente 0,5 por cento v/v ou menos, preferivelmente 0,05 por cento v/v ou menos.

[047] Preferivelmente, uma ou mais enzimas estão presentes em uma quan-tidade e a matéria-prima está presente em uma quantidade para produzir um ou mais monossacarídeos em uma quantidade para cultivar uma segunda massa celular de levedura dentro de um período de tempo desejado. Por exemplo, uma taxa de produção de monossacarídeo alvo pode incluir produzir glicose em uma quantidade em uma faixa de 0,1 a 5 por cento p/v dentro de um período de tempo de 24 horas, preferivelmente em uma faixa de 0,5 a 3 por cento p/v dentro de um período de tem-po de 24 horas. Preferivelmente, a quantidade de glicose produzida dentro de um período de tempo de 24 horas é menos do que 75 g/L, preferivelmente 30 g/L ou menos.

[048]Outras condições também podem ser selecionadas para promover crescimento de levedura desejado tal como temperatura do meio de propagação, nível de oxigênio do meio de propagação (aeração), condições de agita- ção/excitação, pH do meio de propagação, e semelhantes.

[049] Pelo menos uma porção do período de tempo de propagação, e preferi-velmente o período de tempo de propagação inteiro, é realizada enquanto oxigênio suficiente está presente de modo que a levedura produza mais levedura por inter-médio de respiração aeróbica e não produza uma quantidade indevida de álcool (por exemplo, etanol) por intermédio de uma via fermentativa anaeróbica. Uma quantida-de adequada de oxigênio para respiração é bem conhecida e pode ser fornecida em um vaso do reator de propagação por qualquer aparelho aerador bem conhecido tal como um sistema de injeção de ar.

[050]Além disso, aeração suficiente pode ser promovida agitando-se o meio de propagação. A agitação é bem conhecida e pode ser fornecida, por exemplo, por agitação mecânica.

[051]A temperatura e/ou o pH do meio de propagação podem ser qualquer temperatura que permite que os conteúdos do meio de propagação funcionem apro-priadamente tal como permitindo-se que as enzimas quebrem a matéria-prima em açúcares e a levedura reproduza. Temperaturas exemplares incluem uma tempera-tura na faixa de 15 °C a 50 °C, preferivelmente de 20 °C a 40 °C, e ainda mais prefe-rivelmente de 25 °C a 37 °C. Valores de pH exemplares incluem um pH na faixa de 2 a 8, preferivelmente de 3 a 7,5, e ainda mais preferivelmente de 3,5 a 6,5.

[052]Uma vez que a levedura está presente no meio de propagação, a leve-dura pode cultivar por qualquer período de tempo desejado. Tipicamente, a levedura será cultivada sob condições para fornecer uma quantidade suficiente de células de levedura para realizar a produção de etanol por intermédio de fermentação. Também, as células de levedura são tipicamente cultivadas por um período de tempo economicamente eficiente. Períodos de tempo exemplares incluem de 30 minutos a 72 horas, preferivelmente de 10 a 48 horas, e ainda mais preferivelmente de 12 a 24 horas.

[053] Propagando-se a levedura em uma maneira descrita aqui, as enzimas podem interagir com a matéria-prima tal como amido de modo a hidrolisar uma quantidade suficiente de amido, embora ainda não muito, em glicose dentro de um período de tempo desejado. Além disso, as condições descritas aqui podem ser con-troladas de modo a garantir que a glicose permaneça suficientemente baixa como para manter a levedura em modo de respiração. Desta maneira, uma instalação de fabricação de etanol pode aderir a diretrizes de temperatura, dosagem enzimática e inoculação de levedura sem a necessidade de monitorar níveis de glicose no reator, ou medir uma corrente de glicose/melaço ao reator.

[054]Um sistema de propagação exemplar será agora descrito em relação à FIGURA 3. Como mostrado na FIGURA 3, uma matéria-prima incluindo corrente de amido 302 pode ser adicionada a um reator de propagação 308, por exemplo, por intermédio de um transportador. Reatores de propagação são bem conhecidos e incluem tanques agitados assim como outros reatores.

[055]Além do amido 302, uma inoculação inicial 304 de levedura, e uma do-sagem de enzimas amilolíticas (um “coquetel de enzimas”) 306 são adicionadas. Opcionalmente, uma ou mais enzimas (por exemplo, o coquetel de enzimas de en-zimas amilolíticas) podem ser adicionadas em um estágio mais tardio depois que uma fase de retardo do crescimento da levedura ocorreu. Por exemplo, um sistema de medição (não mostrado) pode ser usado para adicionar o coquetel de enzimas ao reator 308. Como descrito aqui, o açúcar (glicose) que é gerado conforme as enzi-mas quebram o amido funciona como parte de, ou toda, uma fonte de carbono para propagar a levedura. Embora não mostrado na FIGURA 3, uma fonte de nutriente pode ser adicionada ao reator 308, assim como quaisquer agentes opcionais que são bem conhecidos para o uso em um meio de propagação de levedura.

[056]O inóculo de levedura 304 é deixado propagar no reator 308 por um pe-ríodo de tempo fixo sob concentrações de oxigênio altas. O oxigênio pode ser forne-cido por um sistema de aeração 310 que pode injetar ar através do reator 308 e também pode incluir agitação mecânica.

[057]Depois da propagação, a cultura de levedura resultante 312 pode ser coletada e, por exemplo, liberada para aplicações a jusante.

[058]Em algumas formas de realização, o reator de propagação 308 pode ser usado dentro de uma instalação de produção de etanol como descrito abaixo com respeito às FIGURAS 1, 2A, e 2B para propagação no local de trabalho da levedura.

[059] Por exemplo, depois que a propagação é concluída, uma cultura de le-vedura 312 pode ser removida do reator 308 e fornecida à fermentação tal como o sistema de fermentação 222, ou de outro modo preparada para o armazenamento. Em muitos casos, onde a levedura é cultivada no sítio de uso, o teor do reator pro-pagador 308 pode ser inteiramente fornecido à fermentação. Em outras formas de realização, pode ser desejoso separar as células de levedura e/ou lavar a levedura do meio de propagação.

[060]De modo a ilustrar como um sistema de propagação de acordo com a presente invenção pode ser usado no local de trabalho em uma instalação de produ-ção de etanol, as FIGURAS 1, 2A, e 2B não serão descritas. A FIGURA 1 é uma vista em perspectiva de uma biorrefinaria exemplar 100 incluindo uma instalação de produção de etanol configurada para produzir etanol a partir de milho (ou outra fonte de amido). A biorrefinaria 100 inclui uma área 102 onde milho (ou outro material adequado incluindo, mas não limitado a, biomassa, açúcares, e outros produtos de amido) é liberado e preparado para ser fornecido à instalação de produção de eta- nol. A instalação de produção de etanol inclui o aparelho 104 para preparação e tra-tamento (por exemplo, moagem) do milho em amido de milho adequado para fer-mentação em produto de fermentação em um sistema de fermentação 106. A insta-lação de produção de etanol inclui um sistema de destilação 108 em que o produto de fermentação é destilado e desidratado em etanol. A biorrefinaria 100 também po-de incluir, em algumas formas de realização, um sistema de tratamento de subpro-duto (por exemplo, uma centrífuga, um secador, e/ou um evaporador).

[061] Em algumas formas de realização, a biorrefinaria 100 pode ser referida como uma instalação de produção de etanol de “fracionamento”, onde o caroço de milho, antes da moagem, é fracionado em suas três partes componentes. Estes in-cluem a casca externa (farelo de milho), que é predominantemente um material fi-broso, o endosperma cheio com amido, e uma porção de germe rica em proteína. O benefício do fracionamento é que os componentes com baixo teor de amido podem ser absorvidos em diferentes correntes de processo se desejado, desse modo ga-rantindo que apenas o endosperma com alto teor de amido passa por liquefação, fermentação e destilação. Isto fornece uma operação que pode ser mais eficiente, têm necessidades de levedura e enzima mais baixas, e têm energia mais baixa gasta por galão de etanol produzido. Por fim, as frações de germe e farelo de milho podem ser vendidas como coprodutos adicionais para a indústria alimentícia, ou podem ser processados ainda para gerar coprodutos de valor mais alto.

[062] Embora muito do debate abaixo seja em relação a uma biorrefinaria de estilo de caroço integral, é considerado dentro do escopo da presente divulgação que usinas de fracionamento também podem ser instalações adequadas para incluir propagação de levedura no local de trabalho como descrito aqui. Adicionalmente, como observado aqui, qualquer uma das instalações de produção de etanol divulga-das pode incluir modificações para o processamento de outras matérias-primas ao invés, ou além de, caroços de milho.

[063]As Figuras 2A e 2B são diagramas de fluxo de processo exemplares ilustrando etapas usadas para gerar etanol em uma instalação de produção de eta- nol. Em um processo de produção de etanol, milho 202 (ou outro material de alimen-tação adequado) pode ser preparado para tratamento adicional em um sistema de preparação 204. Como observado na Figura 2B, o sistema de preparação 204 pode incluir um sistema de fracionamento 206 para fracionar o caroço de milho em seus três constituintes, como descrito acima. O fracionamento pode utilizar moinhos, ex-clusão por tamanho e separação por densidade de modo a ser eficaz. Os compo-nentes do farelo e germe 210 podem ser removidos para processamento adicional ou venda como matérias-primas. Em alguns casos, um processo de triagem pode ser realizado antes ou após o fracionamento que remove o material estranho, tais como pedras, sujeira, areia, pedaços de espigas e haste do milho, e outro material não fermentável (por exemplo, componentes removidos).

[064]Depois do fracionamento, o tamanho de partícula do endosperma pode ser reduzido por moagem 208 para facilitar o processamento adicional. O milho moí-do é empastado com água, enzimas e agentes 218 para facilitar a conversão de amido em açúcar (por exemplo, glicose), tal como em um primeiro sistema de trata-mento 216. Em instalações de milho-a-etanol “convencionais” a pasta fluida de fari-nha é tipicamente aquecida em um fogão a jato de modo a converter o amido em açúcar. Usando-se um método enzimático, sem qualquer aquecimento externo, um processo de “cozimento a frio” processo é obtido. O cozimento a frio beneficia-se de uma redução em energia necessária, custos globais reduzidos, e dano térmico mí-nimo ao amido e proteínas da farinha de endosperma. Certamente a propagação da levedura pode ser de benefício em uma instalação de fabricação de etanol conven-cional envolvendo um cozimento térmico alto, assim como em instalações de cozi-mento a frio.

[065]O açúcar (por exemplo, componente tratado) é convertido em etanol por um etanologene (por exemplo, levedura ou outros agentes 224) em um sistema de fermentação 222. A levedura 224 pode incluir cultura de levedura 312 do reator de propagação 308. O reator 308 pode estar no local de trabalho ou localizado em uma outra instalação do fabricante de etanol.

[066]O produto de fermentação (produto de fermentação) é tipicamente refe-rido como “cerveja” e inclui um componente líquido, incluindo etanol e água e com-ponentes solúveis, e um componente sólido, incluindo matéria particulada não fer-mentada (entre outras coisas). O produto de fermentação pode ser opcionalmente tratado com agentes 230 em um segundo sistema de tratamento 228.

[067]A carga de levedura é tipicamente otimizada para garantir um tempo de fermentação razoável, atenuação do risco de contaminação por bactérias lácticas, e ainda como uma dosagem baixa quanto possível forneceu o custo alto da levedura dado que ela deve ser adquirida de um fornecedor. Em uma instalação que utiliza propagação de levedura, níveis de carga iniciais podem ser dramaticamente aumen-tados (na ordem de 10 a 100x níveis de carga) desse modo fornecendo fermentações dramaticamente reduzidas, risco muito baixo de contaminação microbiana, e economias globais comparadas à aquisição de levedura de um fornecedor.

[068]Na instalação padrão ilustrada, o produto de fermentação tratado é en-viado a um sistema de destilação 232. No sistema de destilação 232, o produto de fermentação (tratado) é destilado e desidratado em etanol 234. Em algumas formas de realização, os componentes removidos 236 (por exemplo, resíduo de destilaria integral), que compreendem água, componentes solúveis, óleo e sólidos não fermentados (por exemplo, o componente sólido da cerveja com substancialmente todo o etanol removido), pode ser seco em grãos de destiladores secos (DDG) em um ter-ceiro sistema de tratamento (onde os componentes removidos podem ser tratados com agentes) e vendidos como um produto de alimentação animal. Outros coprodu- tos, por exemplo, xarope (e óleo contido no xarope), também podem ser recuperados do resíduo de destilaria.

EXEMPLOS

[069]A presente invenção será debatida ainda por referência aos Exemplos abaixo.

Exemplo 1

[070]O sistema similar àquele como mostrado na Figura 3 foi usado em um experimento para testar a efetividade da propagação de levedura usando pasta fluida de amido que é enzimaticamente tratada. Neste exemplo, a cepa de S. cerevisiae foi transferida de uma placa de ágar YPD para 50 mL de meios estéreis de Extrato de Levedura-Peptona (YP) suplementados com 3 % p/v de glicose. A cultura foi cul-tivada a 30 °C durante a noite (aproximadamente 17 horas) para atingir uma densi-dade óptica em 600 nm de pelo menos 7,5.

[071]O meio de crescimento para propagação tem amido de milho como a única fonte de carbono em 30 g/L (25,6 g seco/L) em combinação com aproximada-mente 15 g/L de resíduo de destilaria fino purificado e 0,24 g/L de ureia. Resíduo de destilaria fino purificado é a fase líquida resultante da centrifugação de 7 % de resí-duo de destilaria fino sólido total em 4900 x g por 20 minutos. Esta camada líquida é quase destituída de sólidos colocados em suspensão.

[072]As quantidades necessárias de resíduo de destilaria fino purificado, ureia e água foram adicionadas ao reator de 5 L e submetidas à autoclave a 110 °C por 6 min. Uma vez resfriado até 31,1 °C, Lactoside247™ (comercialmente disponível da Lallemand Ethanol Technology, Milwaukee, WI) foi adicionado até a concen-tração final de 5 ppm para evitar a contaminação bacteriana. Este meio de cresci- mento foi inoculado com a cultura de levedura noturna para ter uma taxa de inocula-ção de 0,1 g (levedura seca)/L. Exatamente antes da inoculação da levedura, amido de milho foi adicionado e o pH foi ajustado para 5,0 usando hidróxido de amônio ou ácido sulfúrico. O reator foi agitado a 450 rpm, e fluxo de ar foi regulado em 0,8 litros padrão por minuto (SLPM), (0,5 volumes de ar por volume de meio por minuto, vvm), para garantir aeração adequada.

[073]O coquetel de enzimas, incluindo alfa-amilase fúngica e glucoamilase fúngica) foi adicionado a 0,016 mL por g de sólidos do milho (19 AGU/g DS; 1,8 FAU-F/g DS). A temperatura do reator foi mantida a 31,1 °C durante a duração inteira do estudo (24 horas). Amostras foram retiradas periodicamente dos reatores e analisadas quanto ao crescimento, consumo de glicose e produção de etanol. O teor de oxigênio dissolvido e pH dos reatores também foram monitorados (não mantidos).

[074]Observando a Tabela 1 na FIGURA 5A, está claro que nenhum etanol foi produzido no final do ciclo de 24 horas. Além disso, toda a glicose gerada pela enzima e os outros componentes tais como ácido láctico, ácido acético e glicerol fo-ram todos consumidos pela levedura para produzir massa celular de levedura.

[075]Neste mesmo estudo um outro reator foi incluído com apenas o meio de crescimento e o coquetel de enzimas, mas nenhuma levedura, apenas para ob-servar a produção de glicose pela enzima sob as condições de crescimento aeróbi- co. Como é evidenciado na tabela 2 na FIGURA 5B mais de 2 % p/v de glicose foi produzido.

[076]Com base na glicose produzida e nos sólidos colocados em suspensão presentes depois de 24 horas, pode ser calculado que aproximadamente 12 g de levedura seca/L foram produzidos durante esta propagação.

[077]Como pode ser observado, este estudo revelou que a cepa testada produziu mais massa celular e nenhum etanol sob condições altamente aeradas. Isto sugeriu que a levedura pode ser propagada ainda em meio com base em amido com as enzimas amilolíticas apropriadas que liberam glicose lentamente para evitar o efeito Crabtree.

Exemplo 2

[078] Neste segundo exemplo, as descobertas do exemplo 1 foram confirma-das usando linhagens de levedura múltiplas. Os procedimentos de preparação e propagação de inóculo foram os mesmos como no exemplo 1. Entretanto, neste es-tudo, dois reatores de propagação foram configurados: (i) levedura geneticamente modificada; e (ii) levedura não geneticamente modificada. Em ambos os reatores, a levedura foi inoculada em 0,12 g/L.

[079]A Tabela 3 na FIGURA 6A e a Tabela 4 na FIGURA 6B ilustram os re-sultados deste estudo de exemplo. Os resultados obtidos neste estudo sugeriram que este protocolo pode ser usado para propagar qualquer número de cepas de Saccharomyces cerevisiae, tanto geneticamente modificadas quanto não modifica-das (tipo selvagem). Nenhuma produção de etanol foi observada no caso de qual-quer uma das cepas.

Exemplo 3

[080] Neste terceiro exemplo, um estudo foi realizado para confirmar o con-ceito de produção de etanol sobre a produção de glicose e biomassa celular em meios com base em amido. Neste estudo, os sólidos do milho foram aumentados para 86 g de sólidos do milho secos/L (para obter aproximadamente 60 g/L de glicose depois da hidrólise do amido). Os tratamentos incluíram: (i) milho em 86 g/L, dose de coquetel de enzimas em 6,1 AGU/g de sólidos secos e 0,6 FAU-F/g de sólidos secos (adicionados 3 horas depois da inoculação de levedura), levedura em 0,12 g/L (Tabela 5); e (ii) Glicose em aproximadamente 60 g/L, nenhuma enzima, e levedura em 0,12 g/L (Tabela 6). Os protocolos de preparação e propagação de inóculo foram similares àquele usado no exemplo 1.

[081]A Tabela 6 na FIGURA 7A e a Tabela 7 na FIGURA 7B indicam os re- sultados destas amostras. Os resultados foram similares em termos de produção de etanol. Entretanto, a captação de outros metabólitos tais como glicerol, ácidos láctico e acético pela levedura indica a diferença em padrões de crescimento entre os dois substratos usados. Basicamente, otimizando-se níveis de dosagem da enzima, o teor de glicose das amostras cultivadas com amido pode permanecer baixo o bastante tal que nenhum etanol é produzido (como foi observado no exemplo 1). A dosagem da enzima variará como uma função de cargas de amido, temperatura, duração da propagação, cepa(s) de expressão de enzima, atividade enzimática, fonte de amido, e cepa da levedura. Além disso, pode ser desejável, em algumas formas de realização, adicionar níveis mais altos de enzimas depois de um período da propagação tal que a produção de glicose iguala-se ao aumento em células que são pro-pagadas.

Exemplo 4

[082] Neste exemplo, um estudo foi realizado por meio do qual as células de levedura cultivadas no exemplo 3 foram usadas para inocular uma fermentação com cozimento a frio em laboratório padrão. Propagando-se a cepa de levedura em meio com base em milho e inoculando-se na fermentação com cozimento a frio, a dose da enzima de sacarificação exógena na fermentação pode ser reduzida em 60 %, como pode ser observado em relação à FIGURA 4.

[083]Neste gráfico de exemplo 400, o nível de carga de enzima é indicado no eixo horizontal 404, e o rendimento de etanol é indicado no eixo vertical 402. Em dosagens de enzima baixas a levedura que foi propagada no meio de amido desem-penha substancialmente melhor do que a levedura cultivada em glicose. Isto indica que algumas enzimas amilolíticas foram produzidas pela cepa de levedura geneti-camente modificada de expressão de enzima durante a fase de propagação.

Exemplo 5

[084] Neste exemplo o protocolo foi modificado para adicionar as enzimas amilolíticas depois de 3 horas de adicionar o inóculo de levedura ao reator de propagação. Esta adição retardada de enzima ajuda a não gerar glicose adicional antes do crescimento inicial da levedura. Uma dose de enzima otimizada também foi usada. A levedura pode ser adicionada na forma seca ativa ou forma de creme líquido estabilizado ou a partir de um frasco congelado cultivado no laboratório em extrato de levedura estéril, meio de peptona suplementado com glicose. O meio de propagação consistiu em amido de milho moído dosado em um nível para fornecer cerca de 3 % de amido em base de peso seco no reator, resíduo de destilaria fino da bior- refinaria de etanol de milho em 20 g de sólidos secos/L. Ureia foi adicionada em 0,24 g/L (~4 mM). Lactoside247™ (comercialmente disponível da Lallemand Ethanol Technology, Milwaukee, WI) foi adicionado a uma concentração de final de 5 ppm para impedir a contaminação bacteriana. O pH do meio depois foi ajustado para 5,0 usando hidróxido de amônio. A temperatura para propagação foi ajustada para 31,1 °C (88 °F). Os conteúdos foram misturados bem e a levedura foi inoculada em 0,1 g (levedura seca)/L. O ar foi ligado e a aeração foi ajustada para 1 volume de ar por volume de meio por minuto (vvm), e a agitação foi ajustada para 450 rpm. Depois de 3 horas de inoculação de levedura, a combinação de enzima, BPX10.5 foi adicionada. As atividades correspondentes para alfa amilase e glucoamilase fúngicas com base na dosagem da enzima usada foram 0,07 FAU-F/g de sólidos secos e 0,74 AGU/g de sólidos secos, respectivamente. A propagação foi continuada por 16 horas depois do que um aumento de 100 vezes aproximado na massa da levedura foi obtido. Os açúcares, ácidos orgânicos, e etanol depois de 16 h de crescimento da levedura aeróbico de rodadas experimentais duplicadas são mostrados nas tabelas 7 e 8 abaixo.Açúcares, Ácidos orgânicos e Etanol depois de 16 h de crescimento aeróbi- co da levedura em meio com base em amido com resíduo de destilaria fino como fonte de nutriente.

[085]As formas de realização como divulgado e descrito no pedido (incluindo as Figuras e Exemplos) são intencionadas a serem ilustrativas e explanatórias da presente invenção. Modificações e variações das formas de realização divulgadas, por exemplo, do aparelho e processos utilizados (ou a serem utilizados) assim como das composições e tratamentos usados (ou a serem usados), são possíveis; todas as tais modificações e variações são intencionadas a estarem dentro do escopo da presente invenção.

Claims

1. Método de propagação de levedura CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) combinar (i) um meio de propagação compreendendo: uma fonte de nutriente; (ii) uma fonte de carbono compreendendo um material de matéria-prima de amido tendo um ou mais polissacarídeos e/ou um ou mais oligossacarídeos; e (iii) uma ou mais enzimas amilolíticas que podem converter pelo menos uma porção do um ou mais polissacarídeos e/ou um ou mais oligossacarídeos em um ou mais monossacarídeos; e (iv) uma primeira massa celular da levedura, em que a levedura pode usar pelo menos uma porção do um ou mais monossacarídeos para cultivar a primeira massa celular da levedura por um período de tempo para formar uma segunda mas-sa celular da levedura; e (b) converter enzimaticamente pelo menos uma porção do um ou mais polis- sacarídeos e/ou um ou mais oligossacarídeos em um ou mais monossacarídeos em uma temperatura na faixa de 25 °C a 37 °C; e (c) cultivar a primeira massa celular de levedura no meio de propagação em uma temperatura na faixa de 25 °C a 37 °C por um período de tempo para formar uma segunda massa celular de levedura que é maior do que a primeira massa celu-lar de levedura.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a uma ou mais enzimas amilolíticas estão presentes em uma quantidade e o um ou mais polissacarídeos e/ou um ou mais oligossacarídeos estão presentes em uma quantidade de modo que nenhum etanol é produzido pela levedura durante pelo menos uma porção do período de tempo.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que nenhum etanol é produzido pela levedura durante o período de tempo de cres-cimento inteiro.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a uma ou mais enzimas amilolíticas estão presentes em uma quantidade e o um ou mais polissacarídeos e/ou um ou mais oligossacarídeos estão presentes em uma quantidade para produzir o um ou mais monossacarídeos em uma quantidade para cultivar a segunda massa celular de levedura dentro do período de tempo.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o um ou mais monossacarídeos compreendem glicose e em que a quantidade de glicose produzida dentro de um período de tempo de 24 horas é menor do que 75 g/L.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda fornecer a segunda massa celular de levedura a um proces-so de fermentação.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o material de amido compreende pelo menos um de amido de milho, endosper- ma de milho moído, farinha de sorgo, farinha de soja, farinha de trigo, amido deriva-do de biomassa, e farinha de cevada.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o material de amido está presente em uma quantidade na faixa de 15 a 75 gra-mas de material de amido por litro do meio de propagação.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira massa celular de levedura é fornecida ao meio de propagação em uma quantidade na faixa de 0,02 a 5 gramas de levedura seca por litro do meio de propagação.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a uma ou mais enzimas amilolíticas compreendem glucoamilase presente em uma quantidade na faixa de 0,25 a 30 unidades de glucoamilase (AGUs) por grama de sólidos secos no meio de propagação.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a uma ou mais enzimas amilolíticas compreendem alfa-amilase fúngica pre-sente em uma quantidade na faixa de 0,03 a 4 unidades de alfa-amilase fúngica (FAU-F) por grama de sólidos secos no meio de propagação.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a uma ou mais enzimas amilolíticas compreendem 0,25 a 30 unidades de glucoamilase (AGUs) por grama de sólidos secos no meio de propagação e aproxi-madamente 0,03 a 4 unidades de alfa-amilase fúngica (FAU-F) por grama de sólidos secos no meio de propagação.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a levedura compreende Saccharomyces cerevisiae geneticamente modifica-da que pode converter pelo menos glicose e/ou xilose a etanol.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o crescimento é realizado por um período de tempo na faixa de 12 a 24 ho-ras.

15. Sistema para propagação de levedura CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) um vaso do reator de propagação compreendendo uma composição compreendendo: um meio de propagação compreendendo: (i) uma fonte de nutriente; (ii) uma fonte de carbono compreendendo um material de matéria-prima de amido tendo um ou mais polissacarídeos e/ou um ou mais oligossacarídeos; e (iii) uma ou mais enzimas amilolíticas que podem converter pelo menos uma porção do um ou mais polissacarídeos e/ou um ou mais oligossacarídeos em um ou mais monossacarídeos em uma temperatura na faixa de 25 °C a 37 °C; e (iv) uma primeira massa celular da levedura, em que a levedura pode usar pelo menos uma porção do um ou mais monossacarídeos como uma fonte de ali-mentação; em que o vaso do reator de propagação é configurado para hidrólise enzimá- tica do material de matéria-prima de amido, e para crescimento da primeira massa celular de levedura em uma temperatura na faixa de 25 °C a 37 °C para formar uma segunda massa celular da levedura; e (b) um aerador ligado ao vaso do reator de propagação.