BR112015018213B1 - Métodos para determinar a síndrome da angústia respiratória aguda (ards) e para monitorar o desenvolvimento desta e kit para diagnóstico - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA DETERMINAR A SÍNDROME DA ANGÚSTIA RESPIRATÓRIA AGUDA (ARDS) E PARA MONITORAR O DESENVOLVIMENTO DESTA E KIT PARA DIAGNÓSTICO. A presente invenção refere-se aos métodos para o monitoramento do desenvolvimento de ARDS em um paciente. O método para o monitoramento do desenvolvimento da ARDS é baseado na comparação do nível ou da atividade dos biomarcadores obtidos em uma amostra retirada em um ponto de tempo posterior aos níveis ou atividades dos mesmos biomarcadores em uma amostra obtida em um ponto de tempo anterior. A invenção diz respeito a outro método para determinação simultânea de um múltiplo de biomarcadores em uma amostra, onde os referidos biomarcadores estão relacionados à ARDS. O nível ou a atividade dos biomarcadores é determinado. A invenção também diz respeito a um kit diagnóstico útil para a realização do método, particularmente um kit compreende um chip, tal como, um microarranjo adequado para uso na tecnologia do biochip.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se aos métodos para o monitoramento do desenvolvimento de e para o tratamento da síndrome da angústia respiratória aguda (ARDS) em um paciente. O método para o monitoramento do desenvolvimento da ARDS é com base na comparação do nível ou da atividade dos biomarcadores obtidos em uma amostra retirada em um ponto de tempo posterior aos níveis ou atividades dos mesmos biomarcadores em uma amostra retirada em um ponto de tempo anterior. Uma alteração favorável no nível ou na atividade de um certo biomarcador representa uma regressão da doença (recuperação do paciente), e, reciprocamente, uma alteração adversa no nível ou na atividade de um certo biomarcador representa um agravamento da doença. Se, por exemplo, o nível ou a atividade de um ou mais dos biomarcadores monitorado se interrompem para mostrar uma alteração favorável ou iniciar para mostrar uma alteração desfavorável, o tratamento do paciente é aumentado administrando-se um agente terapeuticamente ativo útil no tratamento da ARDS.

[002] A invenção diz respeito a um outro método para determinação simultânea de um múltiplo de biomarcadores em uma amostra de um paciente, onde os referidos biomarcadores estão relacionados à ARDS. Os níveis ou as atividades dos biomarcadores são determinados. A invenção também diz respeito a um kit diagnóstico útil para a realização do método, particularmente um kit compreendendo um chip, tal como, um microarranjo adequado para o uso na tecnologia do biochip.

Antecedentes da Invenção

[003] As publicações e outros materiais empregados aqui para esclarecer os antecedentes da invenção, e em particular, os casos para fornecer os detalhes adicionais em relação à prática, são incorporados por referência.

[004] Os ensaios multiplex, isto é, os métodos para quantificação ou detecção simultânea de um múltiplo de analisados em uma amostra são como tal bem conhecidos. Tais ensaios são os ensaios que simultaneamente medem os múltiplos analisados em um ciclo único. Os ensaios multiplex podem ser classificados com base em quantos analisados podem ser medidos por ensaio: a quantidade de analisados varia de um pouco (pelo menos dois) até um número muito alto. Os ensaios multiplex comerciais são tipicamente destinados para detecção simultânea de até cerca de 50 analisados. Estes métodos podem ser empregaods para análises de proteínas e ácidos nucléicos, tais como, anticorpos. Da mesma forma os carboidratos e outros compostos químicos podem ser medidos.

[005] Os métodos multiplex podem ser realizados de muitos modos alternativos.

[006] Como um exemplo pode ser mencionado um microarranjo que é um arranjo 2D em um suporte sólido que simultaneamente ensaio um grande número de analisados biológicos. Em um microensaio de proteína, tal como, um microensaio de anticorpo de diferentes anticorpos foi afixado em um suporte sólido em locais separados em um padrão predeterminado. Estes anticorpos são empregados como moléculas de captura capazes de capturar os analisados (proteínas) presentes em uma amostra.

[007] Como um exemplo de um ensaio comercialmente disponível pode ser mencionada a Tecnologia Luminex® xMAP, que é um ensaio com base em conta realizado diretamente em uma placa de mi- cro-título. Cada ensaio contém uma mistura de diferentes microesferas (mistura de contas), onde cada tipo de conta é definido por meio de um tom individual de cor fluorescente para classificação do analisado e contém um reagente específico de captura, tais como, proteínas específicas (anticorpos) em sua superfície. Durante a incubação da mistura de contas com o par de reação complementar da amostra do paciente (antígenos) se liga aos anticorpos de captura nas micro-esferas. Em uma segunda etapa de incubação os antígenos de ligação são detectados com os anticorpos marcadores transportando um marcador fluorescente específico. A quantidade de analisado de ligação (antígeno) se correlaciona diretamente à intensidade fluorescente do anticorpo de detecção permitindo a quantificação dos analisados. A classificação das contas e a quantificação dos antígenos são realizadas com o sistema de análise Luminex, que é com base na tecnologia da citometria de fluxo empregando dois diferentes lâseres.

[008] O uso de múltiplos biomarcadores sequenciais para diagnose e prognóstico das doenças tem, da mesma forma, sido sugerido.

[009] Chirag R Parikh e outros, Crit Care Med 2008 Vol. 36, No. 4 (Suppl); p S159-S165, sugere o uso de múltiplos biomarcadores sequenciais para avaliação da duração de AKI (lesão renal aguda) e para previsão do prognóstico global no que diz respeito à necessidade de diálise e mortalidade. Os biomarcadores foram NGAL (lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos) e cistatina C em um painel de plasma e NGAL, IL-18 (interleucina-18) e KIM-1 (molécula da lesão renal - 1) em um painel de urina.

[0010] O Beran e outros, Eur J Clin Microbiol Infect Dis (2009) 28: 793-799 descreve a análise sequencial dos biomarcadores, tais como, IL-6 (interleucina-6), IL-1ra (antagonista de receptor de interleucina-1), IL-1beta (interleucina-1beta), IL-8 (interleucina-8),.MIP-1beta (proteína - 1 beta inflamatória de macrófagos) e MCP-1 (proteína-1 quimioatra- ente de monócito) e sua correlação com IMD (doença meningocócica invasiva) e a sua gravidade.

[0011] WO 2009/053523, Faron Pharmaceuticals Oy, descreve que CD73 é um biomarcador útil para o monitoramento do desenvolvimento das doenças inflamatórias, em particular SIRS (síndrome da resposta inflamatória sistêmica), ALI (lesão pulmonar aguda), ARDS e MOF (falência múltipla de órgãos) em um paciente. As amostras de fluidos dos tecidos foram retiradas dos pacientes em diferentes pontos de tempo e a atividade da CD73 nas amostras foi determinada. Um nível aumentado de atividade da CD73 foi constatado se correlacionar com a regressão da doença.

[0012] Por enquanto, ninguém sugeriu o uso de múltiplos biomar- cadores sequenciais para o monitoramento do desenvolvimento da ARDS em um paciente. Particularmente, ninguém sugeriu o uso de um conjunto de biomarcadores consistindo em ou incluindo a CD73 e IL-6 para este propósito.

Sumário da Invenção

[0013] O objetivo desta invenção é fornecer os métodos e os meios para acompanhar a gravidade da ARDS durante o período de tratamento desta condição. Geralmente os pacientes com ARDS recebem o melhor cuidado intensivo possível, mas mais importantemente, o uso de biomarcadores para prognosticar qualquer tratamento farmacológico é o recurso adequado muito valioso para avaliar a eficácia do tratamento. Um tal tratamento é Traumakine® FP-1201 (interferon beta), que tem mostrado reduzir a mortalidade dos pacientes com ARDS. Tendo-se valiosos dados previsíveis sobre a condição do paciente o médico de UTI pode otimisar cuidado do paciente.

[0014] Deste modo, em um aspecto, a invenção diz respeito a um método para determinação simultânea de um múltiplo dos biomarcado- res relacionados a ARDS em uma amostra retirada de um paciente, em que um dos biomarcadores é a proteína CD73. De acordo com a invenção, o método compreende as etapas de

[0015] i) quantificar os níveis dos biomarcadores na referida amostra por submeter a amostra aos aglutinantes reconhecendo os biomar- cadores, ou

[0016] ii) determinar as atividades dos biomarcadores na referida amostra utilizando-se a cromatografia em camada fina ou por submeter a referida amostra aos substratos para os biomarcadores, e monitoramento da alteração dos referidos substratos.

[0017] Em outro aspecto, esta invenção diz respeito a um kit diagnóstico para uso em um método de ensaio da bioafinidade para determinação simultânea de um múltiplo dos biomarcadores relacionados a ARDS em uma amostra retirada de um paciente, onde o número de biomarcadores incluindo CD73 e biomarcadores adicionais é pelo menos 2, de preferência de 2 a 50, mais de preferência de 2 a 8. De acordo com a invenção o referido kit compreende

[0018] - um conjunto de aglutinantes de captura imobilizado para um suporte sólido ou capaz de ser imobilizado para um suporte sólido, onde cada aglutinante de captura é específico para um certo biomar- cador a ser determinado, e

[0019] - um conjunto de componentes de bioafinidade rotulados,onde cada tal componente de bioafinidade rotulado tem uma bioafini- dade específica para um certo biomarcador imobilizado, ou em que cada tal componente de bioafinidade rotulado tem uma capacidade de competir para o local de ligação com um certo biomarcador imobilizado.

[0020] Em um terceiro aspecto estas invenções dizem respeito a um método para monitoramento do desenvolvimento da ARDS em um paciente, onde pelo menos 2, de preferência de 2 a 50, mais de preferência de 2 a 8, os biomarcadores relacionados a ARDS nas amostras retiradas de um paciente em diferentes pontos de tempo foram determinadas, e em que um dos biomarcadores é a proteína CD73, o referido método sendo com base na comparação dos níveis ou atividades dos biomarcadores obtidos em uma amostra retirada em um ponto de tempo posterior aos níveis ou atividades dos mesmos biomarcadores em uma amostra retirada em um ponto de tempo anterior, em que uma alteração favorável no nível ou na atividade de um certo biomarcador representa uma regressão da doença, e onde uma alteração adversa no nível ou na atividade de um certo biomarcador representa um agravamento da doença.

[0021] Em um quarto aspecto esta invenção diz respeito a um método para o tratamento de um paciente sofrendo da ARDS administrando-se ao paciente um agente terapeuticamente ativo eficaz no tratamento da ARDS, onde a adminsitração é iniciada assim que um ou mais dos biomarcadores empregados no monitoramento do desenvolvimento da ARDS de acordo com esta invenção:

[0022] - interromper para mostrar uma alteração favorável, ou

[0023] - iniciar para mostrar uma alteração desfavorável.

Breve Descrição dos Desenhos

[0024] A Figura 1A mostra um suporte com sinais capazes de ligar os aglutinantes de captura,

[0025] A Figura 1B mostra o suporte da Figura 1A em que os aglutinantes de captura são imobilizados,

[0026] A Figura 1C mostra o suporte da Figura 1B em que os bio- marcadores a serem determinados foram imobilizados para os aglutinantes de captura,

[0027] A Figura 1D mostra o suporte da Figura 1C em que os aglutinantes marcadores foram imobilizados para os biomarcadores a serem determinados,

[0028] A Figura 2 mostra um anticorpo marcador compreendendo um conjunto de anticorpo primário direcionado ao biomarcador e um segundo anticorpo, que transporta o marcador e o liga à região Fc do anticorpo primário,

[0029] A Figura 3 mostra o conjunto de curvas para os níveis de biomarcadores medidos como a função do tempo. As linhas inteiras de B1 a B4 indicam que as alterações ao longo do tempo são favoráveis. A linha pontilhada para B5 significa que a diminuição de seu nível representa uma alteração adversa.

[0030] As Figuras de 4a a 4h mostram o nível ou a atividade de oito biomarcadores como função do tempo para um grupo de pacientes recuperados de ALI ou ARDS (figuras de 4a a 4g mostram o nívell; a figura 4h mostra a atividade).

[0031] A Figura 5 mostra tanto a atividade quanto o nível (concentração) de CD73 solúvel como função do tempo para um paciente recuperado de ALI ou ARDS como um exemplo. A atividade da CD73 solúvel (■, eixo y da esquerda) e concentração de CD73 solúvel (•, eixo y da direita) foram medidas a partir das alíquotas das mesmas amostras. A Figura 5 mostra que as medições da atividade e da concentração são comparáveis. Pode-se ver que os valores da CD73 (figura 5) e IL-6 (figura 4b) mostram uma alteração dramática nas con-centrações de plasma, o que indica as alterações favoráveis.

Descrição Detalhada da Invenção

[0032] A amostra pode ser qualquer fluido de tecido, que banha e envolve as células. O termo inclui, por exemplo, plasma sanguíneo, soro, sangue total, linfa, urina, exsudatos (pleural, peritoneal) e fluido cerebroespinal.

[0033] Os biomarcadores relacionados à ARDS se referem a um conjunto de biomarcadores presente em uma amostra derivada do paciente. O conjunto de biomarcadores compreende pelo menos dois, de preferência de dois a oito biomarcadores, particularmente cerca de cinco biomarcadores, dos quais um é a proteína CD73. Como exemplos de outros biomarcadores podem ser mencionados como citocinas, que são as proteínas ou os peptídeos empregados nos organismos como compostos de sinalização. As citocinas incluem, por exemplo, interferons, interleucinas, particularmente IL-6, quimiocincomo, tais como, eotaxinas. Como exemplos de outros biomarcadores adequados podem ser mencionados a CRP (Proteína Reativa C) e outras pentraxinas.

[0034] De preferência, os biomarcadores são selecionados a partir do grupo incluindo o que segue: IL-1β, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL- 7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17A, FGF Básico, Eota- xina, G-CSF, GM-CSF, IFN-Y, IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, PDGF- BB, RANTES, TNF-α, VEGF, IL-1α, IL-2Rα, IL-3, IL-12 (p70), IL-16, IL- 18, CTACK, GRO-α, HGF, IFN-α2, LIF, MCP-3, M-CSF, MIF, MIG, β- NGF, SCF, SCGF-β, SDF-1α, TNF-β, TRAIL, CD73, CRP, Neopterina, MxA, e beta-2-microglobulina.

[0035] Um conjunto particularmente preferido de biomarcadores inclui CD73 e IL-6, ou estes dois biomarcadores, ou estes dois biomar- cadores em combinação com um ou alguns biomarcadores adicionais. Em particular, tal biomarcador adicional é selecionado a partir do grupo consistindo em IL-8, IL-15, Eotaxina, MPC-1, MIP-1a e IL-1ra. De preferência, tal conjunto de biomarcadores compreende de três a oito dos biomarcadores CD73, IL-6, IL-8, IL-15, Eotaxina, MPC-1, MIP-1a e IL-1ra, devido a pelo menos dois deles serem CD73 e IL-6. Um conjunto particularmente preferido compreende todos os oito biomarcadores CD73, IL-6, IL-8, IL-15, Eotaxina, MPC-1, MIP-1a e IL-1ra.

[0036] Em uma alternativa, as atividades dos biomarcadores são de-terminadas. Esta é realizada, por exemplo, ou utilizando-se a cromato- grafia em camada fina ou por submeter a amostra aos substrates para os biomarcadores, e monitoramento da alteração dos referidos substratos.

[0037] A atividade dos biomarcadores pode, por exemplo, ser medida empregando a cromatografia em camada fina de acordo com protocolos publicados. A atividade pode ser, da mesma forma, medida empregando qualquer ensaio enzimático que mede a conversão de um substrato adequado. Por exemplo, para a CD73 a atividade pode ser medida por meio da conversão de AMP ou outro mononucleotídeo de purina que pode ser empregado como um substrato de CD73, no nu- cleosídeo correspondente. Por exemplo, o ensaio pode ser com base na conversão dos substratos radioativamente ou fluorescentemente marcadores. Os métodos de detecção podem depende da quantificação da diminuição em uma concentração de substrato, ou um aumento na concentração do produto ou a liberação do grupo de fosfato. A de-pendência da CD73 da reação pode ser determinada por meio da realização do ensaio na presenca e ausência de um inibidor de CD73 conhecido, tal como, AMPCP.

[0038] De modo geral, as linhas celulares repórteres para medições da atividade são tais linhas celulares geneticamente planejadas em que um composto ou molécula (isto é, o biomarcador) de interesse especificamente induz uma expressão de gene repórter. Tal expressão de gene repórter pode resultar em produção de luz ou em outra função mensurável que é quantificável. A quantificação da atividade do gene reporter pode em seguida ser empregada para calcular a atividade e/ ou o nível do composto ou molécula de interesse.

[0039] Os anticorpos monoclonais específicos para os biomarca- dores mencionados acima são descritos na literatura e são disponíveis a partir de muitas fontes comerciais, tais como, Bio-Rad Laboratories, Inc., Jena Bioscience GmbH e Sino Biological, Inc.

[0040] Para qualificar um "biomarcador relacionado a ARDS", o referido biomarcador deve ter sido constatado para ser correlacionar ao estado da doença ARDS, a fim de que um nível alterado do biomarca- dor ao longo do tempo indique a alteração do estado da doença. Esses biomarcadores com associações mais fortes devem ser combinados ao painel biomarcador da ARDS. Por exemplo, um nível aumentado de CD73 a partir de um ponto de tempo para um ponto de tempo posterior indica a eficiência de um tratamento com um agente terapeu- ticamente ativo e consequentemente, a regressão da ARDS. Para a CRP, de algum modo, um nível aumentado indica o agravamento da doença. É, por esse motive, importante para o primeiro estudo de cada biomarcador adequado para constatar se um aumento ou diminuição de seu nível é uma alteração favorável ou uma alteração adversa no que diz respeito ao estado da doença.

[0041] O "ensaio da bioafinidade" ou pode ser um imunoensaio se os biomarcadores são proteínas. Alternativamente, se refere a um ensaio de hibridação se os biomarcadores são ácidos nucléicos.

[0042] O "aglutinante" (aglutinante de captura ou aglutinante marcador) se refere aos anticorpos ou outros mais (por exemplo, affibodi- es e aptâmeros) quando os biomarcadores a serem determinados são proteínas ou peptídeos. Se os biomarcadores são ácidos nucléicos os aglutinantes são, de preferência, oligonucleotídeos.

[0043] O termo "suporte sólido" é, por exemplo, uma microesfera ou conta, que transporta um marcador. Alternativamente, o suporte sólido se refere a uma placa de micro-título ou um chip. De preferência, o suporte sólido é um chip, tal como, um microarranjo, adequado para uso em uma tecnologia de biochip. Neste ponto, o microarranjo é um componento em um conjunto de tecnologia de biochip compreendendo ainda aos meios para a transdução, o processamento do sinal e exibição dos resultados.

[0044] O termo "anticorpo" será entendido para incluir os anticorpos monoclonais e policlonais, qualquer fragmento destes e anticorpos geneticamente planejados.

[0045] O "marcador" pode ser, por exemplo, uma enzima ou um marcador fluorescente. Um grupo particularmente preferido de marcadores fluorescentes é os marcadores fluorescentes resolvidos com o tempo, tais como, quelatos lantanídeos. Se o marcador é uma enzima, um substrato para a referida enzima é adicionado, onde a reação subsequente entre a enzima e seu substrato produz um sinal detectável. Se o marcador é um marcador fluorescente, a excitação é realizada por meio da radiação, por exemplo, por meio de laser, onde um sinal detectável é criado.

[0046] De preferência, todos os biomarcadores a serem determinados são proteínas ou peptídeos, cada um dos quais pode ser imobilizado para um certo anticorpo de captura. Neste caso, os aglutinantes marcadores são, também, anticorpos. Cada anticorpo marcador é direcionado a um epítopo de um certo biomarcador, onde o referido epí- topo é diferente daquele do epítopo, que se liga ao anticorpo de captura.

[0047] Um múltiplo de biomarcadores relacionados a ARDS é simultaneamente determinado a partir da amostra empregando um ensaio de bioafinidade interpretado, por exemplo, como segue: Os aglutinantes de captura são imobilizados nas posições predeterminadas na superfície de um suporte sólido, tipicamente nos sinais biotinilados ou cavidades de uma placa de micro-título ou outros mais. Os aglutinantes de captura devem, deste modo, se tornarem dispostos na forma de um arranjo no suporte sólido (placa de micro-título). Cada aglutinante de captura é específico para um certo biomarcador a ser determinado. Adicionar a amostra ao arranjo e incubar os biomarcadores aqui com os aglutinantes imobilizados de captura produz a imobilização de cada biomarcador ao aglutinante de captura correspondente.

[0048] A detecção dos biomarcadores pode ser realizada de dois modos: por meio de um ensaio não competitivo assim chamado “en- saio em camadas" ou por meio de um competitivo. No ensaio não competitivo os componentes de bioafinidade rotulados, por exemplo, os anticorpos marcadores, são adicionados à transportando os bio- marcadores imobilizados. Após a incubação e opcionalmente a remoção dos componentes de bioafinidade rotulados não ligados, o marcador é excitado para produzir um sinal detectável. Nesta espécie de ensaio, a intensidade do sinal é diretamente proporcional à concentração do biomarcador imobilizado. A posição das "camadas" na placa de micro-título informa que o biomarcador tem foi detectado.

[0049] Na tecnologia Luminex®, os anticorpos de captura são imobilizados com contas, o marcador com cores fluorescentes, a fim de que uma certa cor se refira a uma certa espécie de anticorpos de captura. Após a incubação com a amostra contendo os biomarcadores a serem detectado e subsequente adição de um conjunto de segundos anticorpos (anticorpos marcadores marcados com uma cor fluorescente diferente da cor da conta) uma camada compreendendo "conta - anticorpo de captura - biomarcador - anticorpo marcador" é formada. Cada tal camada é transportada para um citômetro de fluxo e cada camada é classificada e quantificada empregando um equipamento de laser dual.

[0050] Em um ensaio competitivo, a placa transportando os bio- marcadores imobilizados derivados da amostra é submetida a um conjunto de antígenos marcadores, onde cada antígeno marcador é capaz de competir para o local de ligação no aglutinante de captura com o biomarcador imobilizado correspondente derivado da amostra. Quando o marcador é excitado, o sinal detectado deve ser indiretamente proporcional à concentração do biomarcador derivado da amostra.

[0051] A invenção é ilustrada mais em detalhes por meio de referência aos desenhos em que a Figura 1A (placa de micro-título) com sinais de S1 a S5. Os anticorpos de captura de C1 a C5 foram ligados aos sinais predeterminados (Figura 1B), que podem ser biotinilados para permitir a ligação dos anticorpos de captura sobre eles. Cada anticorpo de captura é específico para um certo biomarcador de B1 a B5 a ser determinado. Após a adição da amostra à placa mostrada na Figura 1B, cada anticorpo de captura imobilizará o biomarcador para o anticorpo de captura foi aumentada. Os biomarcadores não ligados podem ser lavados embora antes da adição dos anticorpos marcadores de L1 a L5, dos quais um anticorpo marcador é específico para um certo biomarcador imobilizado. Após a excitação do marcador L (irradiação ou adição de um substrato de enzima, dependendo do marcador L), um sinal detectável é criado.

[0052] Mesmo que o anticorpo marcador possa ser um único anticorpo transportando a especificidade necessária e o marcador, o anticorpo marcador pode, alternativamente, ser um conjunto de anticorpo primário (PA) direcionado ao biomarcador e um segundo anticorpo (SA), que transporta o marcador L e se liga à região Fc do anticorpo primário. Ver a Figura 2. Ste conjunto evita o processo caro de criação dos anticorpos marcadores para cada biomarcador, um pode querer detectar.

[0053] Quando o método é repetido com as amostras retiradas em pontos de tempo separados, o sinal obtido a partir de cada anticorpo marcador é registrado e planejado versus tempo (Figura 3). Para alguns biomarcadores (B1 e B2), um nível aumentado representa uma alteração favorável da doença do paciente, ao mesmo tempo em que um nível aumentado de B3 e B4 da mesma forma, representa uma alteração favorável. Ao contrário, o nível diminuído de B5 representa uma alteração adversa da doença do paciente e, por esse motivo, a curva pode, de preferência, ser planejada em diferentes sinais ou cor, a fim de rapidamente diferenciar das curvas, que representa uma alteração favorável.

[0054] Os dados das determinações são coletados em uma base de dados, opcionalmente juntamente com as observações clínicas, medições terapêuticas, etc.

[0055] A invenção é ilustrada pelos exemplos não restritivos que seguem.

Exemplo 1

[0056] Em um estudo clínico 26 pacientes com ALI ou ARDS foram dadas doses de 10 microgramas de interferon beta-1a durante seis dias consecutivos. O tratamento reduz a mortalidade em 75% se comparada a frequência normal observada sem tratamento. As amostras de soro derivadas dos pacientes foram analisadas no que diz respeito aos biomarcadores que seguem: IL-1ra (ra= antagonista de receptor), IL-6, IL-8, IL-15, Eotaxina, MCP-1 (proteína 1 quimiotá- tica de monócitos), MIP-1a (proteína inflamatória de macrófagos) e CD73. Na Figura 4, a) a h) o nível de cada biomarcador (atividade para CD73) são mostradas como valor médio para todos os pacien-tes juntamente com os erros padrões das médias (S.E.M), é planejado versus tempo. Dia 1 se refere ao valor antes da administração do interferon beta. Dia 2 se refere ao valor de 22 horas após a primeira administração de interferon beta; Dia 3 se refere ao valor de 22 horas após a segunda dose (Dia 2) e assim por diante. Dia 7 representa os níveis de 22 horas após a última administração de interferon beta. A Figura 4 mostra que o nível dos biomarcadores de IL- 1ra, IL-6, IL-8, IL-15 e MCP-1 diminuiu rapidamente com o tempo, isto é, com a recuperação dos pacientes. Por outro lado, a atividade da CD73 solúvel (nmol/ mL/ hora) aumentou até o Dia 9, isto é, dois dias após a última dose, seguida por uma diminuição para os valores de linha de base. O nível dos biomarcadores de Eotaxina e MIP- 1a, da mesma forma, aumentou com o tempo, isto é, com a recuperação dos pacientes.

Exemplo 2

[0057] A atividade da CD73 solúvel foi medida a partir das amostras de um dos pacientes tratados no estudo mencionado acima nos pontos do tempo indicados (ver Figura 5) empregando a técnica com base na cromatografia em camada fina previamente publicada. Este paciente apresentou indução muito forte na atividade da CD73 solúvel. A concentração de CD73 solúvel foi medida por um ensaio ELISA com base no uso de um anticorpo de captura e um anticorpo de detecção em um ensaio em camadas. A atividade e a concentração da CD73 solúvel foram medidas a partir das alíquotas das mesmas amostras. A Figura 5 mostra que a atividade da CD73 solúvel e a concentração comportarm-se similarmente.

[0058] Deve ser observado que os métodos da presente invenção podem ser incorporados na forma de uma variedade de modalidades, apenas alguns dos quais são descritos aqui. Deve ser evidente para o versado experte no campo que outras modalidades existem e não se afasta do espírito da invenção. Deste modo, as modalidades descritas são ilustrativas e não devem ser interpretadas como restritivas.

Claims (10)

1. Método para o monitoramento do desenvolvimento da ARDS em um paciente, caracterizado pelo fato de que 3 a 8 os biomarcadores relacionados a ARDS (síndrome de angústia respiratória aguda) em soro de amostras obtidas em diferentes pontos de tempo foram determinadas, e em pelo menos dois dos biomarcadores são a proteína CD73 e IL-6 e outros biomarcadores são selecionados do grupo consistindo em IL-8, IL-15, Eotaxina, MPC-1, MIP-1a e IL-1ra, o referido método sendo com base na comparação dos níveis ou atividades dos biomarcadores obtidos no soro da amostra obtida em um ponto de tempo posterior aos níveis ou atividades dos mesmos biomarcadores no soro da amostra obtida em um ponto de tempo anterior, em que uma alteração favorável no nível ou na atividade de um certo biomarcador representa uma regressão da doença, e onde uma alteração adversa no nível ou na atividade de um certo biomarcador representa um agravamento da doença.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os biomarcadores são determinados pelo método compreendendo i) quantificar os níveis dos biomarcadores na referida amostra por submeter a amostra aos aglutinantes reconhecendo os biomarcadores, ou por ii) determinar as atividades dos biomarcadores na referida amostra utilizando-se, por exemplo, a cromatografia em camada fina ou por submeter a referida amostra aos substratos para os biomarcadores, e monitoramento da alteração dos referidos substratos.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que os biomarcadores são determinados por um método que é um método de ensaio da bioafinidade, compreendendo as etapas de a) contatar um conjunto de aglutinantes de captura com uma amostra compreendendo diversos biomarcadores a ser determinado, em que cada aglutinante de captura é específico para um certo biomarcador a ser determinado, b) incubar os biomarcadores na amostra com os aglutinantes de captura, a fim de que cada biomarcador torne-se ligado ao aglutinante de captura correspondente, c) adicionar ao arranjo a partir da etapa b) um conjunto de componentes de bioafinidade rotulados, em que cada tal componente de bioafinidade rotulado tem uma bioafinidade específica para um certo biomarcador que está ligado ao aglutinante de captura, ou em que cada tal componente de bioafinidade rotulado tem uma capacidade de competir para o local de ligação no aglutinante de captura com um certo biomarcador a ser determinado, d) excitar o marcador a fim de formar um sinal detectável, e) comparar o sinal com um controle para indicar a presença de um certo biomarcador e/ ou para indicar o nível de certo biomarcador na amostra.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a) cada aglutinante de captura é imobilizado em uma posição predeterminada na superfície de um suporte a fim de que os aglutinantes de captura tornem-se dispostos na forma de um arranjo no suporte, b) a amostra é adicionada ao arranjo e os biomarcadores aqui são incubados com os aglutinantes imobilizados, c) um conjunto de componentes de bioafinidade rotulados é adicionado ao arranjo a partir da etapa b), em que cada tal componente de bioafinidade rotulado tem uma bioafinidade específica para um certo biomarcador imobilizado, ou em que cada tal componente de bioafinidade rotulado tem uma capacidade de competir para o local de ligação no aglutinante de captura com um certo biomarcador imobilizado, d) o marcador é excitado a fim de formar um sinal detectável, e) o sinal é comparado com um controle para indicar a presença de um certo biomarcador e/ ou para indicar o nível de certo biomarcador na amostra.

5. Método, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o método é um método imunométrico, onde os aglutinantes de captura são anticorpos, aptâmeros ou affibodies, de preferência anticorpos monoclonais.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o método é um imunoensaio em camadas, onde os componentes de bioafinidade rotulados são anticorpos, aptâmeros ou affibodies, de preferência anticorpos monoclonais, cada um direcionado para um outro epítopo no biomarcador do que o ocupado pelo aglutinante de captura.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o método é um método competitivo, em que os componentes de bioafinidade rotulados são um conjunto de antígenos marcadores, em que cada antígeno marcador é capaz de competir para o local de ligação no aglutinante de captura com o biomarcador imobilizado correspondente derivado da amostra.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 3 a 7, caracterizado pelo fato de que o marcador é uma enzima ou um marcador fluorescente.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o marcador é uma enzima e um substrato para a referida enzima é adicionado, onde a reação subsequente entre a enzima e seu substrato produz um sinal detectável.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 9, caracterizado pelo fato de que o referido método é repetido em outra amostra obtida após um certo tempo, e que os sinais atribuídos a cada biomarcador são comparados aos sinais correspondentes do ensaio anterior e que as diferenças são registradas.

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