BR112015008419B1 - Composição imunogênica, vacina, e, uso de uma composição imunogênica ou de uma vacina - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, VACINA, E, USO DE UMA COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA OU DE UMA VACINA. A presente invenção refere-se a composições imunogênicas compreendendo um ou mais de conjugados de sacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae e um componente de proteína compreendendo proteína E e/ou PilA de Haemophilus influenzae.

Description

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção refere-se a composições imunogênicas compreendendo um ou mais conjugados de sacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae e um componente de proteína compreendendo Proteína E e/ou PilA de Haemophilus influenzae.

FUNDAMENTOS

[002] Haemophilus influenzae não tipificável (NTHi) é um patógeno respiratório importante e comum que causa otite média em bebês e crianças. NTHi é, depois de Streptococcus pneumoniae, a causa mais comum de otite média aguda em crianças (J. Immunology 183: 2593-2601 (2009), Pediatrics 113:1451-1465 (2004)). Ele é uma importante causa de sinusite em crianças e adultos. (Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009)). Ele tem sido associado com o aumento do risco de exacerbações na doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) em adultos. (Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease 3:109-115 (2006)). Além disso, H. influenzae não tipificável provoca pneumonia adquirida em comunidade em adultos e pode causar pneumonia em crianças nos países em desenvolvimento. (Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009)).

[003] Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae), também conhecido como o pneumococo, é uma bactéria gram-positiva. S. pneumoniae é um importante problema de saúde pública em todo o mundo sendo responsável por considerável morbidade e mortalidade, especialmente entre as crianças, idosos e pessoas imunodeprimidas. S. pneumoniae provoca uma ampla variedade de patologias humanas importantes, incluindo pneumonia adquirida na comunidade, sinusite aguda, otite média, meningite, bacteremia, septicemia, osteomielite, artrite séptica, endocardite, peritonite, pericardite, celulite e abscesso cerebral. S. pneumoniae é estimada como sendo o agente causal em 3.000 casos de meningite, 50.000 casos de bacteremia, 500.000 casos de pneumonia, e 7.000.000 casos de otite média anualmente apenas nos Estados Unidos (Reichler, M. R. et al., 1992, J. Infect. Dis. 166: 1346; Stool, S. E. e Field, M. J., 1989 Pediatr. Infect. Dis J. 8: S11). As taxas de mortalidade devido à doença pneumocócica são especialmente altas em crianças menores de 5 anos de idade de tanto os países desenvolvidos como os em desenvolvimento. Os idosos, imunocomprometidos e pacientes com outras condições subjacentes (diabetes, asma) também são particularmente suscetíveis à doença.

[004] As principais síndromes clínicas causadas por S. pneumoniae são amplamente reconhecidas e discutidas em textos de medicina padrões (Fedson D S, Muscher D M. Em: Plotkin S A, Orenstein W A, editores. Vaccines. 4a. ed. Philadelphia WB Saunders Co, 2004a: 529-588). Por exemplo, a doença pneumocócica invasiva (IPD) é definida como qualquer infecção em que S. pneumoniae é isolado a partir do sangue ou de outro sítio normalmente estéril (Musher D M. Streptococcus pneumoniae. Em Mandell G L, Bennett J E, Dolin R (eds). Principles e Practice of Infectious Diseases (5a. ed.). New York, Churchill Livingstone, 2001, p 2128-2147).

[005] A doença pulmonar obstrutiva crônica é uma doença inflamatória crônica dos pulmões e uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Aproximadamente uma em cada 20 mortes em 2005, nos Estados Unidos, tinham COPD como a causa básica. (Drugs and Aging 26:985-999 (2009)). Projeta-se que, em 2020, COPD irá se tornar a quinta causa principal de anos de vida tornados incapacitantes, doenças crônicas invalidantes, e como a terceira causa mais importante de mortalidade (Lancet 349:1498-1504 (1997)).

[006] Assim, existe a necessidade de uma combinação de vacinas contra Streptococcus pneumoniae e Haemophilus influenzae.

[007] Proteína E (PE) é uma lipoproteína de membrana externa com propriedades adesivas. Ela desempenha um papel na adesão / invasão de Haemophilus influenzae não tipificável (NTHi) para células epiteliais. (J. Immunology 183: 2593-2601 (2009); The Journal de Infectious Diseases 199:522-531 (2009), Microbes e Infection 10:87-96 (2008)). Ela é altamente conservada em tanto Haemophilus influenzae encapsulada como H. influenzae não tipificável e tem um domínio de ligação epitelial conservado. (The Journal de Infectious Diseases 201:414-419 (2010)). Treze mutações pontuais diferentes têm sido descritas em diferentes espécies de Haemophilus quando comparadas com Rd de Haemophilus influenzae como uma cepa de referência. A sua expressão é observada tanto em bactérias de crescimento logarítmico como de fase estacionária. (WO2007/084053).

[008] Proteína E também está envolvida na resistência de complemento humano através de ligação de vitronectina. (Immunology 183: 2593-2601 (2009)). PE, pelo domínio de ligação PKRYARSVRQ YKILNCANYH LTQVR (SEQ ID NO. 1, correspondendo aos aminoácidos 84-108 de SEQ ID NO. 4), liga-se a vitronectina, que é um inibidor importante da via do complemento terminal. (J. Immunology 183:2593-2601 (2009)).

[009] Pilina A (PilA) é provavelmente a principal subunidade de pilina de Pilus Tipo IV de H. influenzae (Tfp) envolvida em espasmos de mobilidade (Infection and Immunity, 73: 1635-1643 (2005)). NTHi PilA é uma adesina conservada expressada in vivo. Ela foi demonstrada como estando envolvida na aderência de NTHi, colonização e formação de biofilmes. (Molecular Microbiology 65: 1288-1299 (2007)).

[0010] Os inventores descobriram que PilA e PE podem estar beneficamente presentes em uma composição imunogênica para a prevenção de H.influenzae e, além disso, que PilA e Proteína E podem ser adicionadas a uma composição compreendendo sacarídeos capsulares de S.pneumoniae de modo a fornecer uma composição imunogênica que pode evitar a infecção por H.influenzae e S.pneumoniae. O versado estaria ciente do efeito de supressão epitópica induzida por carreador, e saber que a exposição geralmente simultânea a vários antígenos conjugados pode resultar em respostas imunes melhoradas ou diminuídas (Plotkin et al, Vaccines 4a. ed. 2003).

BREVE SUMÁRIO

[0011] Os inventores descobriram que PilA, PE (ou seus fragmentos) e sacarídeos a partir de Streptococcus pneumoniae podem ser beneficamente combinados em uma composição imunogênica para proporcionar uma proteção eficaz contra H.influenzae e S.pneumoniae.

[0012] Assim em um primeiro aspecto, provê-se uma composição imunogênica compreendendo 1 ou mais (por exemplo, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) conjugados de sacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae e um componente de proteína compreendendo Proteína E ou um fragmento imunogênico de Proteína E e/ou PilA (ou um fragmento imunogênico de PilA) a partir de Haemophilus influenzae.

[0013] Em um segundo aspecto, provê-se uma vacina compreendendo uma composição imunogênica da invenção e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0014] Em um terceiro aspecto, provê-se um método de imunização de um indivíduo contra doenças causadas por infecção por Streptococcus pneumoniae compreendendo a administração ao indivíduo de uma dose terapeuticamente eficaz da composição imunogênica da invenção ou da vacina da invenção.

[0015] Em um quarto aspecto, provê-se um método de imunização de um indivíduo contra doenças causadas por infecção por Haemophilus influenzae compreendendo a administração ao indivíduo de uma dose terapeuticamente eficaz da composição imunogênica da invenção ou da vacina da invenção.

[0016] Em um quinto aspecto, provê-se uma composição imunogênica da invenção ou uma vacina da invenção para uso no tratamento ou prevenção de doenças causadas por infecção por Streptococcus pneumoniae.

[0017] Em um sexto aspecto, provê-se uma composição imunogênica da invenção ou uma vacina da invenção para uso no tratamento ou prevenção de doenças causadas por infecção por Haemophilus influenzae.

[0018] Em um sétimo aspecto, provê-se um uso da composição imunogênica da invenção ou da vacina da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doenças causadas por infecção por Streptococcus pneumoniae.

[0019] Em um oitavo aspecto, provê-se um uso da composição imunogênica da invenção ou da vacina da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doenças causadas por infecção por Haemophilus influenzae.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0020] Figura 1. SDS-PAGE de extratos bacterianos induzidos para construtos de proteínas de fusão LVL291, LVL268 e LVL269. Fração Insolúvel (I), fração solúvel (S) e fração de meios de cultura (M) foram carregadas para LVL291, LVL268 e LVL269 antes e depois de indução (ind).

[0021] Figura 2. SDS-PAGE e Western blot relacionados para extratos de purificação para construtos de proteína de fusão LVL291, LVL268 e LVL269. Fração de fluxo atravessante (Ft), fração de lavagem (W) e fração de eluição (E) foram carregadas para purificação de LVL291, LVL268 e LVL269. Etiqueta anti-his foi usada para sondar extratos.

[0022] Figura 3. SDS-PAGE de extratos bacterianos induzidos e de purificação para construtos de proteínas de fusão LVL291 e LVL315. Fração de meios de cultura (M), fração solúvel (Sol), fração insolúvel (Ins), fração de fluxo atravessante (Ft), fração de lavagem #1 (W1), fração de lavagem #2 (W2) e fração de eluição (E) foram carregadas para LVL291 e LVL315.

[0023] Figura 4. SDS-PAGE de extratos bacterianos induzidos e de purificação para construto de proteína de fusão LVL312. Fração de meios de cultura (M), fração solúvel (Sol), fração insolúvel (Ins), fração de fluxo atravessante (Ft), fração de lavagem #1 (W1), fração de lavagem #2 (W2) e fração de eluição (E) foram carregadas para LVL312.

[0024] Figura 5. SDS-PAGE de extratos bacterianos induzidos (1 mM de IPTG e 10 μM) para construto de proteína de fusão LVL317. Extratos de antes (NI) e após a indução (In), fração solúvel (S), fração insolúvel (I).

[0025] Figura 6. SDS-PAGE de extratos bacterianos induzidos (1 mM de IPTG e 10 μM) para construto de proteína de fusão LVL318. Extratos de antes (NI) e após a indução (In), fração de meios de cultura (M), fração solúvel (S), fração insolúvel (I).

[0026] Figura 7. Espectros CD de proteínas de fusão PE, PilA e PE- PilA.

[0027] Figura 8. Combinação de PE e espectro CD de PilA.

[0028] Figura 9. Curva de desnaturação térmica de PilA.

[0029] Figura 10. Curva de desnaturação PE.

[0030] Figura 11. Curva de desnaturação térmica de proteína de fusão PE-PilA.

[0031] Figura 12. Cromatograma de fluxo rápido SepharoseTM SP típico.

[0032] Figura 13. Cromatograma de fluxo rápido SepharoseTM Q típico.

[0033] Figura 14. SDS-PAGE de amostras de em processo a partir de processo de purificação de proteína de fusão PE-PilA.

[0034] Figura 15. Western Blot de amostras em-processo de processo de purificação a partir de proteína de fusão PE-PilA. Blot usando anti-PE policlonal de coelho.

[0035] Figura 16. Western Blot de amostras em-processo de processo de purificação a partir de proteína de fusão PE-PilA. Blot usando anti-E.coli policlonal de coelho (BLR).

[0036] Figura 17. Transição térmica de proteína de fusão PE-PilA e proteínas PE e PilA. Curvas: PilA (1), Proteína E (Prot E, PE) (2), PE-PilA purificada em bruto não diluída, 737μg/ml (3), E PE-PilA purificada em bruto não diluída em uma concentração final de recipiente 60μg/ml (4).

[0037] Figura 18. Respostas de anticorpos contra proteína de fusão LVL291 PE-PilA e contra PE e PilA monovalente no modelo de camundongo BALB/C.

[0038] Figura 19. Efeito de vacinação de proteína de fusão PE-PilA em depuração bacteriana de NTHi cepa 86-028NP em nasofaringe de camundongo.

[0039] Figura 20. Efeito de vacinação de proteína de fusão PE-PilA em depuração bacteriana de NTHi cepa 3224A em nasofaringe de camundongo.

[0040] Figura 21. Efeito de vacinação de PilA em depuração bacteriana em nasofaringe de camundongo.

[0041] Figura 22. Efeito de vacinação de PE em depuração bacteriana em nasofaringe de camundongo.

[0042] Figura 23. Proteína de fusão (a) LVL317 PE-PilA ligando a vitronectina e (b) proteína de fusão LVL317 e LVL735 PE-PilA ligada a vitronectina.

[0043] Figura 24. Inibição de ligação de vitronectina por anticorpos policlonais contra proteína de fusão PE-PilA.

[0044] Figura 25. SDS-PAGE da frações solúveis de extratos bacterianos induzidos para construtos de proteínas de fusão de vetor LVL291, LVL702, LVL736, LVL737, LVL738, LVL739, LVL740 e pET26b (controle negativo). (a) Experimento 1 (b) Experimento 2 (c) Experimento 3. Proteína de fusão PE-PilA indicada pela seta.

[0045] Figura 26. O percentual de faixa média de proteína de fusão na fração solúvel a partir de Experimentos 1, 2 e 3.

[0046] Figura 27. Resposta de anticorpos de PE e PilA e LVL317 e LVL735.

[0047] Figura 28. Efeito de vacinação de LVL735 e LVL317 em depuração bacteriana em um modelo de camundongo de colonização da nasofaringe por Haemophilus influenzae não tipificável.

[0048] Figura 29. Gráfico comparando a imunogenicidade de uma composição compreendendo 12 conjugados de sacarídeos, PhtD, dPly E PE- PilA (12V + prot) com uma composição compreendendo 12 conjugados de sacarídeos (12V) e uma composição compreendendo 10 conjugados de sacarídeos (10V) como medido após injeção de camundongos usando um teste Elisa anti-sacarídeo. GMC= concentração geométrica média. IC = intervalos de confiança.

[0049] Figura 30. Gráfico comparando a imunogenicidade de uma composição compreendendo 12 conjugados de sacarídeos, PhtD, dPly e PE- PilA (12V + prot) com uma composição compreendendo 12 conjugados de sacarídeos (12V) e uma composição compreendendo 10 conjugados de sacarídeos (10V) como medido após a injeção de camundongos usando um teste de opsonofagocitose. GMT = Título geométrico médio.

[0050] Figura 31. Gráfico comparando a imunogenicidade de uma composição compreendendo 12 conjugados de sacarídeos, PhtD, dPly e PE- PilA (12V + prot) COM uma composição compreendendo PhtD, dPly e PE- PilA sozinhos (prot) como medido após a injeção de camundongos usando um teste Elisa anti-proteína. GMC= concentração geométrica média. IC = intervalos de confiança.

[0051] Figura 32. Gráfico comparando a imunogenicidade de uma composição compreendendo 12 conjugadosde sacarídeos, PhtD, dPly E PE- PilA (12V + prot) com uma composição compreendendo 12 conjugados de sacarídeos (12V) e uma composição compreendendo 10 conjugados de sacarídeos (10V) como medido após a injeção de porquinhos da índia usando um teste de opsonofagocitose. GMT = Título geométrico médio.

[0052] Figura 33. Gráfico comparando a imunogenia DE uma composição compreendendo 12 conjugados de sacarídeos, PhtD, dPly E PE- PilA (12V + prot) com uma composição compreendendo 12 conjugados de sacarídeos (12V) E uma composição compreendendo 10 conjugados de sacarídeos (10V) como medido após a injeção de porquinhos da índia usando um Elisa anti-sacarídeo. GMC= concentração geométricA média. IC = intervalos de confiança.

[0053] Figura 34. Gráfico comparando a imunogenia de uma composição compreendendo 12 conjugados de sacarídeos, PhtD, dPly E PE- PilA (12V + prot) com uma composição compreendendo PhtD, dPly E PE- PilA sozinhos, (prot) como medido após a injeção de porquinhos da índia usando um Elisa anti-proteína. GMC= concentração geométrica média. ic = intervalos de confiança.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0054] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição imunogênica compreendendo 1 ou mais (por exemplo, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) conjugados de sacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae e um componente de proteína compreendendo Proteína E (ou um fragmento imunogênico da mesma) e/ou PilA (ou um fragmento imunogênico da mesma) a partir de Haemophilus influenzae.

[0055] O termo “componente de proteína” refere-se a uma sequência de aminoácidos compreendendo Proteína E (ou um fragmento imunogênico da mesma) e/ou PilA (ou um fragmento imunogênico da mesma), o componente de proteína pode compreender Proteína E sozinha, PilA sozinha, um fragmento imunogênico de Proteína E sozinha, um fragmento imunogênico de PilA sozinha, Proteína E e PilA, um fragmento imunogênico de Proteína E e PilA, um fragmento imunogênico de Proteína E e um fragmento imunogênico de PilA ou Proteína E e um fragmento imunogênico de PilA (por exemplo, como uma proteína de fusão). O componente de proteína pode ainda compreender sequências adicionais.

Proteína E

[0056] Tal como aqui usado “Proteína E”, “proteína E”, “Prot E”, e “PE” significam Proteína E de H. influenzae. Proteína E pode consistir de ou compreender a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 4 (MKKIILTLSL TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK) bem como sequências com pelo menos ou exatamente 75%, 77%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou 100% identidade, sobre o comprimento completo, para SEQ ID NO. 4. Comparação de 53 sequências de Proteína E de Haemophilus influenzae (Tabela 1, SEQ ID NO. 5 - SEQ ID NO. 57) demonstrou aproximadamente 77% a aproximadamente 100% identidade para Proteína E, como especificado em SEQ ID NO. 4. Por exemplo, na sequência de aminoácidos Proteína E, aminoácido #20 pode ser isoleucina (I) ou treonina (T); aminoácido #23 pode ser alanina (A) ou valina (V); aminoácido #24 pode ser lisina (K) ou ácido glutâmico (E); aminoácido #31 pode ser alanina (A) ou treonina (T); aminoácido #32 pode ser prolina (P) ou alanina (A); aminoácido #34 pode ser treonina (T) ou alanina (A); aminoácido #37 pode ser arginina (R) ou glutamina (Q); aminoácido #47 pode ser valina (V) ou alanina (A); aminoácido #57 pode ser triptofano (W) ou pode estar ausente (-); aminoácido #70 pode ser alanina (A) ou treonina (T); aminoácido #93 pode ser glutamina (Q) ou ausente (-); aminoácido #109 pode ser treonina (T) ou isoleucina (I); aminoácido #119 pode ser glicina (G) ou serina (S); aminoácido #153 pode ser ácido glutâmico (E) ou lisina (K); aminoácido #156 pode ser serina (S) ou leucina (L); aminoácido #160 pode ser lisina (K) ou asparagina (N); aminoácido #161 pode ser lisina (K), isoleucina (I) ou ausente (-); aminoácidos #162 - #195 pode estar ausente, ou como especificado em SEQ ID NO. 15 (com (-) indicando que aminoácido #166 está ausente) ou como especificado em SEQ ID NO. 16; ou qualquer combinação dos mesmos.

[0057] Proteína E pode consistir de ou compreender uma sequência de aminoácidos que difere de SEQ ID NO. 4 em qualquer um ou mais aminoácidos selecionados dentre o grupo consistindo de: aminoácido #20, aminoácido #23, aminoácido #24, aminoácido #31, aminoácido #32, aminoácido #34, aminoácido #37, aminoácido #47, aminoácido #57, aminoácido #70, aminoácido #93, aminoácido #109, aminoácido #119, aminoácido #153, aminoácido #156, aminoácido #160, aminoácido #161 e aminoácidos #162-#195, em que aminoácido #20 é treonina (T); aminoácido #23 é valina (V); aminoácido #24 é lisina (K); aminoácido #31 é treonina (T); aminoácido #32 é alanina (A); aminoácido #34 é alanina (A); aminoácido #37 é glutamina (Q); aminoácido #47 é alanina (A); aminoácido #57 está ausente (-); aminoácido #70 é treonina (T); aminoácido #93 está ausente (-); aminoácido #109 é isoleucina (I); aminoácido #119 é serina (S); aminoácido #153 é lisina (K); aminoácido #156 é leucina (L); aminoácido #160 é asparagina (N); aminoácido #161 é lisina (K) ou isoleucina (I); ou aminoácidos #162 - #195 são como especificados emSEQ ID NO. 15 (com (-) indicando que aminoácido #166 está ausente) ou como especificado em SEQ ID NO. 16. Tabela 1: Sequência de aminoácidos Proteína E de 53 cepas de Haemophilus influenzae (SEQ ID NO. 5 - SEQ ID NO. 57). - indica que o aminoácido está ausente.

[0058] Proteína E pode ser Proteína E de cepas de H. influenzae 3224A, RdKW20, 86-028NP, R2846, R2866, 3655, PittAA, PittEE, PittHH, PittII, R3021, 22.4-21, 3219C, 3185, 3241A, 038144S1, 810956, 821246, 840645, 902550Z19, A840177, A860514, A950014, 306543X4, A930105, 901905U, A920030, 3221B, 27W116791N, N218, N163, N162, N107, N91, D211PG, D211PD, D201PG, D201PD, D198PG, D198PD, D195PD, D189PG, D189PD, D129CG, D124PG, D124PD, D58PG, D33OD, BS433, BS432, 1714, 1128 ou BS430. Proteína E pode ser Proteína E como especificada em qualquer uma de SEQ ID NO. 5 - SEQ ID NO. 57.

[0059] Proteína E pode ser uma sequência com pelo menos 95% ou 98%, 99% identidade, sobre o comprimento completo, em qualquer SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 57. Proteína E pode ser uma sequência com pelo menos 95% identidade, sobre o comprimento completo, para qualquer uma das sequências definidas em Tabela 1, SEQ ID NO. 5 - SEQ ID NO. 57.

[0060] Fragmentos imunogênicos de Proteína E compreendem fragmentos imunogênicos de pelo menos 7, 10, 15, 20, 25, 30 ou 50 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO. 4. Em uma forma de realização, o fragmento é menor do que 150, 125, 100, 75, ou 60 aminoácidos Proteína E, por exemplo, em uma forma de realização, a composição imunogênica da invenção compreende menos do que 150, 125, 100, 75 ou 60 amonoácidos Proteína E. Os fragmentos imunogênicos podem elicitar anticorpos que podem se ligar a SEQ ID NO. 4. O fragmento imunogênico pode compreender um epítopo de células B e/ou T de SEQ ID NO:4.

[0061] Fragmentos imunogênicos de Proteína E podem compreender fragmentos imunogênicos de, pelo menos, 7, 10, 15, 20, 25, 30 ou 50 aminoácidos contíguos de qualquer um de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 57. Os fragmentos imunogênicos podem elicitar anticorpos que podem se ligar à sequência de comprimento completo a partir da qual o fragmento foi derivado. O fragmento imunogênico pode compreender um epítopo de células B e/ou T de SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO. 57. Em uma forma de realização, o fragmento imunogênico de Proteína E é selecionado dentre o grupo consistindo de aminoácidos 17-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 122), aminoácidos 18-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 123), aminoácidos 19-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 124), aminoácidos 20-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 125) e aminoácidos 22-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 126). Em outra forma de realização, o fragmento imunogênico de proteína E é selecionado dentre o grupo consistindo de aminoácidos 17-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 122), aminoácidos 18-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 123), aminoácidos 19-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 124), aminoácidos 20-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 125), aminoácidos 22-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 126), aminoácidos 23-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 179) e aminoácidos 24-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 180). Em outra forma de realização, o fragmento imunogênico de Proteína E de H. influenzae é selecionado dentre o grupo consistindo de aminoácidos 17-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 122), aminoácidos 18- 160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 123), aminoácidos 20-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 125), aminoácidos 22-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 126), aminoácidos 23-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 179) e aminoácidos 24-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 180). Mais especificamente, em uma forma de realização, o fragmento imunogênico é SEQ ID NO. 124, aminoácidos 19-160 de SEQ ID NO. 4. Em outra forma de realização, o fragmento imunogênico é SEQ ID NO.125, aminoácidos 20-160 de SEQ ID NO. 5. Em outra forma de realização, o fragmento imunogênico é um fragmento imunogênico de Proteína E de H. influenzae selecionado dentre o grupo consistindo de aminoácidos 23-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 179) e aminoácidos 24-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 180).

[0062] Proteína E contém uma região de ligação de células epiteliais (PKRYARSVRQ YKILNCANYH LTQVR, SEQ ID NO. 128) que foram relatadas como sendo conservadas entre mais de 100 isolados clínicos de NTHi, H. influenzae encapsulada, e cepas colecção de culturas analisadas (Singh et al, J. Infect. Dis. 201(3):414-9 (2010)). Singh et al. relataram que Proteína E foi altamente conservada em ambos NTHi e H. influenzae encapsulada (96,9% - 100% identidade sem o peptídeo de sinal). Em uma forma de realização, o fragmento de Proteína E compreende a região de ligação de SEQ ID NO. 128 (PKRYARSVRQ YKILNCANYH LTQVR)

[0063] Proteína E - SEQ ID NO. 4

[0064] MKKIILTLSL GLLTACSAQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK

[0065] Aminoácidos 17-160 de Proteína E de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 122

[0066] SAQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK

[0067] Aminoácidos 18-160 de Proteína E de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 123

[0068] AQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK

[0069] Aminoácidos 19-160 de Proteína E de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 124

[0070] QI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK

[0071] Aminoácidos 20-160 de Proteína E de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 125 TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK

[0072] I QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK

[0073] Aminoácidos 22-160 de Proteína E de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 126

[0074] KAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK

[0075] Aminoácidos 23-160 de Proteína E de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 179

[0076] AEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK

[0077] Aminoácidos 24-160 Proteína E de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 180

[0078] EQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK

[0079] Em uma forma de realização, a Proteína E ou um fragmento imunogênico da mesma é capaz de elicitar uma resposta imune que reconhece SEQ ID NO:4. Se ou não uma primeira proteína é capaz de elicitar uma resposta imune que reconhece uma segunda proteína pode ser determinado usando um teste ELISA (por exemplo, o ELISA descrito no exemplo 22). PilA

[0080] Tal como aqui usado “PilA” significa Pilin A a partir de H. influenzae. PilA pode consistir de ou compreender a sequência de proteína de SEQ ID NO. 58 (MKLTTQQTLK KGFTLIELMI VIAIIAILAT IAIPSYQNYT KKAAVSELLQ ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIA ADITTAKGYV KSVTTSNGAI TVKGDGTLAN MEYILQATGN AATGVTWTTT CKGTDASLFP ANFCGSVTQ) bem como as sequências com 80% a 100% de identidade para SEQ ID NO. 58. Por exemplo, PilA pode ser pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% idêntico à SEQ ID NO. 58. Comparação de comprimento total de 64 sequências de PilA de Haemophilus influenzae (Tabela 2, SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121) demonstrou aproximadamente 80% para 100% de identidade para PilA, como especificado em SEQ ID NO. 58. Por exemplo, na sequência de aminoácidos de PilA, aminoácido #6 pode ser glutamina (Q) ou leucina (L); aminoácido #7 pode ser glutamina (Q) ou treonina (T); aminoácido #37 pode ser glutamina (Q) ou lisina (K); aminoácido #44 pode ser alanina (A) ou serina (S); aminoácido #57 pode ser alanina (A) ou serina (S); aminoácido #67 pode ser asparagina (N) ou glicina (G); aminoácido #68 pode ser ácido glutâmico (E) ou lisina (K); aminoácido #69 pode ser treonina (T) ou prolina (P); aminoácido #71 pode ser lisina (K), asparagina (N), serina (S) ou treonina (T); aminoácido #73 pode ser treonina (T), serina (S) ou metionina (M); aminoácido #76 pode ser lisina (K), serina (S) ou asparagina (N); aminoácido #84 pode ser treonina (T) ou lisina (K); aminoácido #86 pode ser alanina (A) ou valina (V); aminoácido #91 pode ser lisina (K) ou alanina (A); aminoácido #94 pode ser treonina (T), isoleucina (I) ou lisina (K); aminoácido #96 pode ser serina (S) ou glutamina (Q); aminoácido #97 pode ser asparagina (N) ou serina (S); aminoácido #99 pode ser alanina (A) ou glicina (G); aminoácido #103 pode ser alanina (A) ou lisina (K); aminoácido #109 pode ser ácido aspártico (D), alanina (A) ou treonina (T); aminoácido #110 pode ser glicina (G), asparagina (N), ou arginina (R); aminoácido #112 pode ser serina (S) ou ácido glutâmico (E); aminoácido #114 pode ser treonina (T) ou isoleucina (I); aminoácido #116 pode ser treonina (T) ou glutamina (Q); aminoácido #118 pode ser ácido glutâmico (E), treonina (T), alanina (A), lisina (K) ou serina (S); aminoácido #121 pode ser serina (S) ou alanina (A); aminoácido #122 pode ser alanina (A) ou treonina (T); aminoácido #123 pode ser lisina (K), treonina (T) ou alanina (A); aminoácido #128 pode ser lisina (K) ou treonina (T); aminoácido #135 pode ser ácido aspártico (D) ou ácido glutâmico (E); aminoácido #136 pode ser alanina (A) ou treonina (T); aminoácido #145 pode ser glicina (G) ou arginina (R); aminoácido #149 pode ser glutamina (Q) ou lisina (K); ou qualquer combinação dos mesmos.

[0081] PilA pode consistir de ou compreender uma sequência de aminoácidos que difere de SEQ ID NO. 58 em qualquer um ou mais aminoácidos selecionados dentre o grupo consistindo de aminoácido #6, aminoácido #7, aminoácido #37, aminoácido #44, aminoácido #57, aminoácido #67, aminoácido #68, aminoácido #69, aminoácido #71, aminoácido #73, aminoácido #76, aminoácido #84, aminoácido #86, aminoácido #91, aminoácido #94, aminoácido #96, aminoácido #97, aminoácido #99, aminoácido #103, aminoácido #109, aminoácido #110, aminoácido #112, aminoácido #114, aminoácido #116, aminoácido #118 aminoácido, #121, aminoácido #122, aminoácido #123, aminoácido #128, aminoácido #135, aminoácido #136, aminoácido #145 e aminoácido #149, em que aminoácido #6 é leucina (L); aminoácido #7 é treonina (T); aminoácido #37 é lisina (K); aminoácido #44 é serina (S); aminoácido #57 é serina (S); aminoácido #67 é glicina (G); aminoácido #68 é lisina (K); aminoácido #69 é prolina (P); aminoácido #71 é lisina (K), serina (S) ou treonina (T); aminoácido #73 é serina (S) ou metionina (M); aminoácido #76 é serina (S) ou asparagina (N); aminoácido #84 é lisina (K); aminoácido #86 é valina (V); aminoácido #91 é alanina (A); aminoácido #94 é isoleucina (I) ou lisina (K); aminoácido #96 é glutamina (Q); aminoácido #97 é serina (S); aminoácido #99 é glicina (G); aminoácido #103 é alanina (A); aminoácido #109 é ácido aspártico (D) ou treonina (T); aminoácido #110 é glicina (G) ou arginina (R); aminoácido #112 é serina (S); aminoácido #114 é treonina (T); aminoácido #116 é treonina (T); aminoácido #118 é ácido glutâmico (E), alanina (A), lisina (K) ou serina (S); aminoácido #121 é serina (S); aminoácido #122 é treonina (T); aminoácido #123 é lisina (K) ou alanina (A); aminoácido #128 é lisina (K); aminoácido #135 é ácido glutâmico (E); aminoácido #136 é treonina (T); aminoácido #145 é arginina (R); aminoácido #149 é lisina (K). Tabela 2: Sequências de aminoácidos de Pilin A a partir de 64 cepas de Haemophilus influenzae (SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121)

[0082] PilA pode ser PilA de cepas de H. influenzae NTHi3219C, NTHi3224A, NTHi12, NTHi44, NTHi67, 1054MEE, 1729MEE, 1728MEE, 1885MEE, 1060MEE, RdKW20, 214NP, 1236MEE, 1714MEE, 1128MEE, 86-028NP, R2846, R2866, 3655, PittAA, PittGG, PittII, R3021, 22.4-21, 3185A, 3221B, 3241A, 038144S1, 821246, 840645, 902550Z19, A840177, A920030, A950014, 901905U, A920029, A930105, 306543X4, N218, N163, N162, N120, N107, N92, N91, D219PG, D211PG, D211PD, D204CD, D198PG, D198PD, D195PD, D195CD, D189PG, D189PD, D124PG, D124PD, D124CG, D58PG, BS433, BS432, BS430, 1714 ou 1128. Uma sequência de aminoácidos para PilA de cepa de H. influenzae D204CD é especificada em SEQ ID NO. 106, em que X na posição #116 é ou glutamina (Q) ou leucina (L); ambiguidade quanto ao aminoácido na posição #116 poderia ser esclarecida por resolução técnica do segundo nucleotídeo codificando aminoácido #116, esclarecendo a sequência de PilA para cepa D204CD. PilA pode ser PilA como especificada em qualquer uma de SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121.

[0083] PilA pode ser uma sequência com pelo menos 95%, 98%, ou 99% identidade, sobre o comprimento completo, em qualquer SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121 (como especificado na Tabela 2).

[0084] Fragmentos imunogênicos de PilA compreendem fragmentos imunogênicos de, pelo menos, 7, 10, 15, 20, 25, 30 ou 50 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121. Os fragmentos imunogênicos podem elicitar anticorpos que podem se ligar às sequência de comprimento completo a partir do qual o fragmento foi derivado. Os fragmentos imunogênicos podem compreender um epítopo de células B e/ou T de SEQ ID NO. 58-SEQ ID NO:121.

[0085] Por exemplo, fragmentos imunogênicos of PilA compreendem fragmentos imunogênicos de, pelo menos, 7, 10, 15, 20, 25, 30 ou 50 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO. 58. Em uma forma de realização, o fragmento imunogênico de PilA compreende menos do que 150, 125, 100, 75, ou 60 aminoácidos of PilA, em outra forma de realização a composição imunogênica compreende menos do que 150, 125, 100, 75 ou 60 aminoácidos de PilA. Os fragmentos imunogênicos podem elicitar anticorpos que podem se ligar a SEQ ID NO. 58. Os fragmentos imunogênicos podem compreender um epítopo de células B e/ou T de SEQ ID NO:58.

[0086] Em uma forma de realização, o fragmento imunogênico de PilA é um fragmento de cepa de H. influenzae 86-028NP em que PilA é SEQ ID NO. 58.

[0087] PilA de cepa de H. influenzae 86-028NP - SEQ ID NO. 58 AATGVTWTTT CKGTDASLFP ANFCGSVTQL

[0088] Em outra forma de realização, o fragmento imunogênico de PilA é um fragmento pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% idêntico à SEQ ID NO. 127. Mais especificamente, em uma forma de realização o fragmento imunogênico de PilA é SEQ ID NO. 127, um fragmento consistindo de aminoácidos 40-149 de SEQ ID NO. 58.

[0089] Aminoácidos 40-149 of PilA de cepa de H. influenzae 86- 028NP - SEQ ID NO. 127.

[0090] T KKAAVSELLQ ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIA ADITTAKGYV KSVTTSNGAI TVKGDGTLAN MEYILQATGN AATGVTWTTT CKGTDASLFP ANFCGSVTQ

[0091] Em outra forma de realização, o fragmento imunogênico de PilA consiste de aminoácidos 40-149 de qualquer SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121. Em uma forma de realização adicional, o fragmento imunogênico é pelo menos 95% idêntico aos aminoácidos 40-149 de qualquer uma de SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121

[0092] Identidade entre polipeptídeos pode ser calculada por vários algoritmos. Por exemplo, o programa Needle, de pacote EMBOSS (software livre; EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000). Trends in Genetics 16(6): 276—277) e o programa Gap do pacote GCG® (Accelrys Inc.) podem ser usados. Este programa Gap é uma implementação do algoritmo de Needleman-Wunsch descrito em: Needleman, S. B. e Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. A matriz de escore BLOSUM62 foi usada, e as diferenças de penalidades abertas e de extensão foram, respectivamente, de 8 e 2.

[0093] Olhando para o alinhamento computadorizado, resíduos idênticos entre duas sequências comparadas podem ser observados. Uma percentagem de identidade pode ser calculada por (1) cálculo do número de identidades, dividido pelo comprimento do alinhamento, multiplicado por 100 (por exemplo, para a análise de programa Needle), (2) cálculo do número de identidades dividido pelo comprimento da sequência mais longa, multiplicado por 100, (3) o cálculo do número de identidades, dividido pelo comprimento da sequência mais curto, multiplicado por 100, ou (4) o cálculo do número de identidades, dividido pelo número de resíduos alinhados, multiplicado por 100 (um resíduo está alinhado se ele está em frente do outro) (por exemplo, para a análise do programa Gap).

[0094] Em uma forma de realização, PilA é capaz de elicitar uma resposta imune que reconhece SEQ ID NO. 58.

Proteína E/ proteína de fusão PilA

[0095] Em uma forma de realização Proteína E e PilA estão presentes em uma proteína de fusão. Em outra forma de realização, a proteína de fusão tem fórmula (I): L(X) m - (Ri)n - A - (Y) o - B - (Z)p (fórmula I) em que: X é um peptídeo de sinal ou MHHHHHH (SEQ ID NO. 2); m é 0 ou 1; R1 é um aminoácido; n é 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6; A é Proteína E de Haemophilus influenzae ou um fragmento imunogênico da mesma, ou PilA de Haemophilus influenzae ou um fragmento imunogênico da mesma; Y é selecionado dentre o grupo consistindo de GG, SG, SS e (G)h em que h é 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10; o é 0 ou 1; B é PilA de Haemophilus influenzae ou um fragmento imunogênico da mesma, ou Proteína E de Haemophilus influenzae ou um fragmento imunogênico da mesma; Z é GGHHHHHH (SEQ ID NO: 3); e p é 0 ou 1.

[0096] Em uma forma de realização, as proteínas de fusão de fórmula (I) são definidas em que X é selecionado dentre o grupo consistindo da sequência de sinal de CcmH (proteína de membrana de citocromo c H), DsbA (proteína periplasmática dissulfeto isomerise I), DsbB (proteína de membrana de ligação de dissulfeto B), FlgI (proteína de anel de peptidoglicano flagelar), FocC (F1c proteína “Chaperone”), MalE (maltose transportador- subunidade E), NadA (quinolinato sintase - subunidade A), NikA (componente A de transportador de níquel ABC), NspA (proteína A de superfície neisserial), Omp26 (proteína de membrana externa 26), OmpA (proteína de membrana externa A), OspA (proteína de superfície externa A), pelB (pectato liase B), PhoA (fosfatase alcalina bacteriana), PhtD (proteína D de tríade de poli histidina), PhtE (proteína E de tríade de poli histidina), SfmC (chaperone de pilina periplasmática), Sip1 (proteína imunogênica de superfície), TolB (Componente B de complexo de envelope de célula Tol-), TorA (sistema de trimetilamina N-óxido redutase - subunidade A), TorT (sistema de trimetilamina N-óxido redutase - proteína periplasmática T) e Yral (chaperone de pilina periplasmática putativa); ou qualquer subgrupo dos mesmos. Em uma forma de realização, X é um peptídeo de sinal co- translacional ou um peptídeo de sinal pós-translacional. Em uma forma de realização X é a sequência de sinal de FlgI (flgI sp). Em outra forma de realização particular, X é a sequência de sinal de pelB (pelB sp). Em outra forma de realização, X é um peptídeo de sinal pós-translacional. Em outra forma de realização, X é selecionado dentre o grupo consistindo da sequência de sinal de FlgI, NadA e pelB.

[0097] Em uma forma de realização, as proteínas de fusão de fórmula (I) são definidas em que m é 1. Em outra forma de realização, m é 0,

[0098] Em uma forma particular de realização, R1 e n são definidas em que (R1)n é 1 a 6 aminoácidos enriquecidos em aminoácidos pequenos, geralmente hidrofílicos. Aminoácidos hidrofílicos incluem ácido glutâmico (E), ácido aspártico (D) e asparagina (N).

[0099] Em uma forma de realização, as proteínas de fusão de fórmula (I) são definidas em que n é selecionado dentre o grupo consistindo de 0, 1, 2 e 6. Em uma forma particular de realização, R1 e n são definidas em que (R1)n é selecionado dentre o grupo consistindo de D, E, ATNDDD (SEQ ID NO. 178) e MD, ou qualquer subconjunto dos mesmos.

[00100] Em uma forma particular de realização, n é selecionado dentre o grupo consistindo de 1, 2 e 6. Em uma forma particular de realização, n é 0,

[00101] Em uma forma de realização, as proteínas de fusão de fórmula (I) são definidas em que A é Proteína E de H. influenzae. Em outra forma de realização, as proteínas de fusão de fórmula (I) são definidas em que A é Proteína E como codificada por uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo de SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 38, SEQ ID NO.39, SEQ ID NO. 40, SEQ ID NO. 41, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 43 SEQ ID NO. 44, SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47, SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 56 e SEQ ID NO. 57; ou qualquer subconjunto de SEQ ID NO. 5 até SEQ ID NO. 57. Em outra forma de realização, as proteínas de fusão de fórmula (I) são definidas em que A é Proteína E, em que Proteína E é um fragmento pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98% ou 99% idêntico à sequência de amonoácidos Proteína E especificada em SEQ ID NO: 4. Em outra forma de realização, A é Proteína E em que Proteína E é um fragmento de 90% a 100% idêntico à sequência de amonoácidos Proteína E especificada em SEQ ID NO: 4. Em outra forma de realização, A é Proteína E em que Proteína E é pelo menos 95% idêntica à sequência de amonoácidos Proteína E especificada em SEQ ID NO: 4. Em forma adicional de realização, A é Proteína E em que Proteína E é pelo menos 95% idêntica à Proteína E, como definida para qualquer uma de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 57. Em uma forma particular de realização, A é Proteína E tendo a sequência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO. 4.

[00102] Em outra forma de realização, as proteínas de fusão de fórmula (I) são definidas em que A é um fragmento imunogênico de Proteína E de H. influenzae. Em outra forma de realização, A é um fragmento imunogênico de Proteína E em que Proteína E tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo de SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 38, SEQ ID NO.39, SEQ ID NO. 40, SEQ ID NO. 41, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 43 SEQ ID NO. 44, SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47, SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 56 e SEQ ID NO. 57; ou qualquer subconjunto de SEQ ID NO. 4 até SEQ ID NO. 57. Em outra forma de realização, A é um fragmento imunogênico de Proteína E, em que Proteína E é um fragmento 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98% ou 99% idêntico à sequência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 4. Em outra forma de realização, A é um fragmento imunogênico de Proteína E, em que Proteína E é um fragmento de 90% a 100% idêntico à SEQ ID NO. 4. Em uma forma adicional de realização, A é um fragmento imunogênico de Proteína E, em que Proteína E é pelo menos 95% idêntica a qualquer uma de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 57. Mais especificamente, em uma forma de realização, A é um fragmento imunogênico de Proteína E, em que Proteína E é pelo menos 93%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO. 124. Em uma forma particular de realização, A é um fragmento imunogênico de Proteína E em que Proteína E é SEQ ID NO. 4.

[00103] Em outra forma de realização, A é um fragmento imunogênico de Proteína E de H. influenzae selecionada dentre o grupo consistindo de aminoácidos 17-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 122), aminoácidos 18160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 123), aminoácidos 19-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 124), aminoácidos 20-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 125) e aminoácidos 22-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 126). Em outra forma de realização, A é um fragmento imunogênico de Proteína E de H. influenzae selecionada dentre o grupo consistindo de aminoácidos 17-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 122), aminoácidos 18-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 123), aminoácidos 19-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 124), aminoácidos 20-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 125), aminoácidos 22-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 126), aminoácidos 23-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 179) e aminoácidos 24-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 180). Em outra forma de realização, A é um fragmento imunogênico de Proteína E de H. influenzae selecionada dentre o grupo consistindo de aminoácidos 17-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 122), aminoácidos 18160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 123), aminoácidos 20-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 125), aminoácidos 22-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 126), aminoácidos 23-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 179) e aminoácidos 24-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 180). Mais especificamente, em uma forma de realização, A é SEQ ID NO. 124, aminoácidos 19-160 de SEQ ID NO. 4. Em uma forma adicional de realização, A é SEQ ID NO.125, aminoácidos 20-160 de SEQ ID NO. 5. Em outra forma de realização, A é fragmento imunogênico de Proteína E de H. influenzae selecionada dentre o grupo consistindo de aminoácidos 23-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 179) e aminoácidos 24-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 180).

[00104] Proteína E - SEQ ID NO. 4

[00105] MKKIILTLSL GLLTACSAQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK

[00106] Aminoácidos 17-160 de Proteína E de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 122

[00107] SAQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK

[00108] Aminoácidos 18-160 de Proteína E de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 123

[00109] AQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK

[00110] Aminoácidos 19-160 de Proteína E de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 124

[00111] QI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK

[00112] Aminoácidos 20-160 de Proteína E de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 125 TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK

[00113] I QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK

[00114] Aminoácidos 22-160 de Proteína E de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 126

[00115] KAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK

[00116] Aminoácidos 23-160 de Proteína E de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 179

[00117] AEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK

[00118] Aminoácidos 24-160 Proteína E de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 180

[00119] EQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK

[00120] Em outra forma de realização, as proteínas de fusão de fórmula (I) são definidas em que A é PilA de H. influenzae. Em outra forma de realização, as proteínas de fusão de fórmula (I) são definidas em que A é PilA de H. influenzae tendo uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 61, SEQ ID NO. 62, SEQ ID NO. 63, SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO. 66, SEQ ID NO. 67, SEQ ID NO. 68, SEQ ID NO. 69, SEQ ID NO. 70, SEQ ID NO. 71, SEQ ID NO.72, SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75, SEQ ID NO. 76, SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO. 80, SEQ ID NO. 81, SEQ ID NO. 82, SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. 84, SEQ ID NO. 85, SEQ ID NO. 86, SEQ ID NO. 87, SEQ ID NO. 88, SEQ ID NO. 89, SEQ ID NO. 90, SEQ ID NO. 91, SEQ ID NO. 92, SEQ ID NO. 93, SEQ ID NO. 94, SEQ ID NO. 95, SEQ ID NO. 96, SEQ ID NO. 97, SEQ ID NO. 98, SEQ ID NO. 99, SEQ ID NO. 100, SEQ ID NO. 101, SEQ ID NO. 102, SEQ ID NO. 103, SEQ ID NO. 104, SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106, SEQ ID NO. 107, SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109, SEQ ID NO. 110, SEQ ID NO. 111, SEQ ID NO. 112, SEQ ID NO. 113, SEQ ID NO. 114, SEQ ID NO. 115, SEQ ID NO. 116, SEQ ID NO. 117, SEQ ID NO. 118, SEQ ID NO. 119, SEQ ID NO. 120 e SEQ ID NO. 121; ou qualquer subconjunto de SEQ ID NO. 58 até SEQ ID NO. 121. Em outra forma de realização, A é PilA em que PilA é um fragmento de pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98% ou 99% idêntico à SEQ ID NO. 58. Em outra forma de realização, A é PilA em que PilA é pelo menos 95% idêntica a qualquer uma dentre SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121. Em uma forma particular de realização, A é PilA de SEQ ID NO. 58.

[00121] Em outra forma de realização, as proteínas de fusão de fórmula (I) são definidas em que A é um fragmento imunogênico de PilA de H. influenzae. Em outra forma de realização, A é um fragmento imunogênico de PilA em que PilA é um fragmento de pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98% ou 99% idêntico à SEQ ID NO. 58. Por exemplo, A é um fragmento imunogênico de PilA em que PilA tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 61, SEQ ID NO. 62, SEQ ID NO. 63, SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO. 66, SEQ ID NO. 67, SEQ ID NO. 68, SEQ ID NO. 69, SEQ ID NO. 70, SEQ ID NO. 71, SEQ ID NO.72, SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75, SEQ ID NO. 76, SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO. 80, SEQ ID NO. 81, SEQ ID NO. 82, SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. 84, SEQ ID NO. 85, SEQ ID NO. 86, SEQ ID NO. 87, SEQ ID NO. 88, SEQ ID NO. 89, SEQ ID NO. 90, SEQ ID NO. 91, SEQ ID NO. 92, SEQ ID NO. 93, SEQ ID NO. 94, SEQ ID NO. 95, SEQ ID NO. 96, SEQ ID NO. 97, SEQ ID NO. 98, SEQ ID NO. 99, SEQ ID NO. 100, SEQ ID NO. 101, SEQ ID NO. 102, SEQ ID NO. 103, SEQ ID NO. 104, SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106, SEQ ID NO. 107, SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109, SEQ ID NO. 110, SEQ ID NO. 111, SEQ ID NO. 112, SEQ ID NO. 113, SEQ ID NO. 114, SEQ ID NO. 115, SEQ ID NO. 116, SEQ ID NO. 117, SEQ ID NO. 118, SEQ ID NO. 119, SEQ ID NO. 120 e SEQ ID NO. 121; ou qualquer subconjunto SEQ ID NO. 58 até SEQ ID NO. 121. Em uma forma adicional de realização, A é um fragmento imunogênico de PilA em que PilA é pelo menos 95% idêntica a qualquer uma de SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121. Em uma forma particular de realização, A é um fragmento imunogênico de PilA de cepa de H. influenzae 86-028NP em que PilA é SEQ ID NO. 58.

[00122] PilA de cepa de H. influenzae 86-028NP - SEQ ID NO. 58 AATGVTWTTT CKGTDASLFP ANFCGSVTQL

[00123] Em outra forma de realização, A é um fragmento imunogênico de PilA aproximadamente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98% ou 99% idêntico à SEQ ID NO. 127. Mais especificamente, em uma forma de realização A é SEQ ID NO. 127, um fragmento consistindo de aminoácidos 40-149 de SEQ ID NO. 58.

[00124] Aminoácidos 40-149 de PilA a partir de cepa H. influenzae 86- 028NP - SEQ ID NO. 127.

[00125] T KKAAVSELLQ ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIA ADITTAKGYV KSVTTSNGAI TVKGDGTLAN MEYILQATGN AATGVTWTTT CKGTDASLFP ANFCGSVTQ

[00126] Em outra forma de realização, A é um fragmento imunogênico de PilA consistindo de aminoácidos 40-149 de qualquer uma de SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121. Em uma forma adicional de realização, A é fragmento imunogênico pelo menos 95% idêntico à aminoácidos 40-149 de qualquer uma de SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121.

[00127] Em uma forma de realização, as proteínas de fusão de fórmula (I) são definidas em que Y é selecionado dentre o grupo consistindo de GG, SG e SS. Em outra forma de realização, as proteínas de fusão de fórmula (I) são definidas em que Y é GG ou SG. Em uma forma particular de realização, Y é GG.

[00128] Em uma forma de realização, as proteínas de fusão de fórmula (I) são definidas em que o é 1. Em outra forma de realização, o é 0,

[00129] Em uma forma de realização, as proteínas de fusão de fórmula (I) são definidas em que B é PilA de H. influenzae ou um fragmento imunogênico de PilA de H. influenzae quando A é Proteína E de H. influenzae ou um fragmento imunogênico de Proteína E de H. influenzae. Por exemplo, B é PilA de H. influenzae cepa 86-028NP. Em outra forma de realização, B é PilA de H. influenzae tendo uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 61, SEQ ID NO. 62, SEQ ID NO. 63, SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO. 66, SEQ ID NO. 67, SEQ ID NO. 68, SEQ ID NO. 69, SEQ ID NO. 70, SEQ ID NO. 71, SEQ ID NO.72, SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75, SEQ ID NO. 76, SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO. 80, SEQ ID NO. 81, SEQ ID NO. 82, SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. 84, SEQ ID NO. 85, SEQ ID NO. 86, SEQ ID NO. 87, SEQ ID NO. 88, SEQ ID NO. 89, SEQ ID NO. 90, SEQ ID NO. 91, SEQ ID NO. 92, SEQ ID NO. 93, SEQ ID NO. 94, SEQ ID NO. 95, SEQ ID NO. 96, SEQ ID NO. 97, SEQ ID NO. 98, SEQ ID NO. 99, SEQ ID NO. 100, SEQ ID NO. 101, SEQ ID NO. 102, SEQ ID NO. 103, SEQ ID NO. 104, SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106, SEQ ID NO. 107, SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109, SEQ ID NO. 110, SEQ ID NO. 111, SEQ ID NO. 112, SEQ ID NO. 113, SEQ ID NO. 114, SEQ ID NO. 115, SEQ ID NO. 116, SEQ ID NO. 117, SEQ ID NO. 118, SEQ ID NO. 119, SEQ ID NO. 120 e SEQ ID NO. 121; ou qualquer subconjunto de SEQ ID NO. 58 até SEQ ID NO. 121. Em outra forma de realização, B é PilA em que PilA é um fragmento pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98% ou 99% idêntico à SEQ ID NO. 58. Em outra forma de realização, B é PilA em que PilA é pelo menos 95%, 98% ou 99% idêntica a qualquer uma dentre SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121. Em uma forma particular de realização, B é PilA de SEQ ID NO. 58.

[00130] Em outra forma de realização, B é PilA em que PilA é pelo menos 95%, 98% ou 99% idêntica a qualquer uma dentre SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121 e A é PE em que PE é pelo menos 95%, 98% ou 99% idêntica a qualquer uma dentre SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 57.

[00131] Em outra forma de realização, as proteínas de fusão de fórmula (I) são definidas em que B é um fragmento imunogênico de PilA de H. influenzae quando A é um fragmento imunogênico de Proteína E de H. influenzae. Por exemplo, B é um fragmento imunogênico de PilA de H. influenzae cepa 86-028NP. Em outra forma de realização, B é um fragmento imunogênico de PilA em que PilA é um fragmento pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% idêntico à SEQ ID NO: 58. Em outra forma de realização, B é um fragmento imunogênico de PilA em que PilA tem um aminoácido selecionado dentre o grupo consistindo de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 61, SEQ ID NO. 62, SEQ ID NO. 63, SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO. 66, SEQ ID NO. 67, SEQ ID NO. 68, SEQ ID NO. 69, SEQ ID NO. 70, SEQ ID NO. 71, SEQ ID NO.72, SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75, SEQ ID NO. 76, SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO. 80, SEQ ID NO. 81, SEQ ID NO. 82, SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. 84, SEQ ID NO. 85, SEQ ID NO. 86, SEQ ID NO. 87, SEQ ID NO. 88, SEQ ID NO. 89, SEQ ID NO. 90, SEQ ID NO. 91, SEQ ID NO. 92, SEQ ID NO. 93, SEQ ID NO. 94, SEQ ID NO. 95, SEQ ID NO. 96, SEQ ID NO. 97, SEQ ID NO. 98, SEQ ID NO. 99, SEQ ID NO. 100, SEQ ID NO. 101, SEQ ID NO. 102, SEQ ID NO. 103, SEQ ID NO. 104, SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106, SEQ ID NO. 107, SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109, SEQ ID NO. 110, SEQ ID NO. 111, SEQ ID NO. 112, SEQ ID NO. 113, SEQ ID NO. 114, SEQ ID NO. 115, SEQ ID NO. 116, SEQ ID NO. 117, SEQ ID NO. 118, SEQ ID NO. 119, SEQ ID NO. 120 e SEQ ID NO. 121; ou qualquer subconjunto de SEQ ID NO. 58 até SEQ ID NO. 121. Em outra forma de realização, B é um fragmento imunogênico de PilA em que PilA é pelo menos 95%, 98% ou 99% idêntica a qualquer uma dentre SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121. Em uma forma particular de realização, B é um fragmento imunogênico de PilA de H. influenzae em que PilA tem a sequência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO. 58. Em outra forma de realização, B é um fragmento imunogênico de PilA consistindo em aminoácidos 40-149 de qualquer uma dentre SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121. Mais especificamente, em uma forma de realização B é o fragmento de PilA como especificada em SEQ ID NO. 127. Em uma forma adicional de realização, B é um fragmento imunogênico pelo menos 95%, 98% ou 99% idêntico à aminoácidos 40-149 de qualquer de SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121.

[00132] Em uma forma particular de realização, B é o fragmento de PilA como especificada em SEQ ID NO. 127 e A é um fragmento imunogênico de Proteína E selecionado dentre o grupo consistindo de SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 124, SEQ ID NO. 125 e SEQ ID NO. 126. Mais particularmente, B é o fragmento de PilA como especificada em SEQ ID NO. 127 e A é o fragmento de Proteína E como especificada em SEQ ID NO. 124, aminoácidos 19-160 de Proteína E de SEQ ID NO. 4. Em outra forma de realização, B é o fragmento de PilA como especificada em SEQ ID NO. 127 e A é o fragmento de Proteína E como especificada em SEQ ID NO. 125.

[00133] Em outra forma de realização, B é um fragmento imunogênico de PilA em que PilA é pelo menos 95% idêntica a qualquer uma dentre SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121 e A é um fragmento imunogênico de PE em que PE é pelo menos 95% idêntica a qualquer uma dentre SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 57.

[00134] Em outra forma de realização, as proteínas de fusão de fórmula (I) são definidas em que B é Proteína E de H. influenzae quando A é PilA de H. influenzae. Por exemplo, B é Proteína E tendo uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo de SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 38, SEQ ID NO.39, SEQ ID NO. 40, SEQ ID NO. 41, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 43 SEQ ID NO. 44, SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47, SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 56 e SEQ ID NO. 57; ou qualquer subconjunto de SEQ ID NO. 4 até SEQ ID NO. 57. Em outra forma de realização, as proteínas de fusão de fórmula (I) são definidas em que B é Proteína E em que Proteína E é um fragmento pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% idêntico à sequência de amonoácidos Proteína E especificada em SEQ ID NO: 4. Em outra forma de realização, B é Proteína E em que Proteína E é um fragmento de 90%, 95%, 98%, ou 99% idêntico à sequência de amonoácidos Proteína E especificada em SEQ ID NO: 4. Por exemplo, B é Proteína E em que Proteína E é pelo menos 95% idêntica à Proteína E como especificada em SEQ ID NO. 4. Em outra forma de realização, B é Proteína E em que Proteína E é pelo menos 95% idêntica a qualquer uma dentre SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 57. Em uma forma particular de realização, B é Proteína E tendo a sequência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO. 4.

[00135] Em outra forma de realização, as proteínas de fusão de fórmula (I) são definidas em que B é um fragmento imunogênico de Proteína E de H. influenzae quando A é um fragmento imunogênico de PilA de H. influenzae. Por exemplo, B é um fragmento imunogênico de Proteína E em que Proteína E tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo de SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 38, SEQ ID NO.39, SEQ ID NO. 40, SEQ ID NO. 41, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 43, SEQ ID NO. 44, SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47, SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 56 e SEQ ID NO. 57; ou qualquer subconjunto de SEQ ID NO. 4 até SEQ ID NO. 57. Em outra forma de realização, as proteínas de fusão de fórmula (I) são definidas em que B é um fragmento imunogênico de Proteína E em que Proteína E é um fragmento pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% idêntico à the sequência de amonoácidos Proteína E especificada em SEQ ID NO. 4. Em outra forma de realização, B é um fragmento imunogênico de Proteína E em que a Proteína E é um fragmento 90% a 100% idêntico à sequência de amonoácidos Proteína E especificada em SEQ ID NO: 4. Em uma forma particular de realização, B é um fragmento imunogênico de Proteína E tendo a sequência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO. 4. Em uma forma adicional de realização, B é um fragmento imunogênico de Proteína E, em que Proteína E é pelo menos 95% idêntica a qualquer uma dentre SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 57.

[00136] Em outra forma de realização, B é a fragmento de Proteína E de H. influenzae selecionada dentre o grupo consistindo de aminoácidos 17160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 122), aminoácidos 18-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 123), aminoácidos 19-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 124), aminoácidos 20-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 125) e aminoácidos 22-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 126). Em outra forma de realização, B é um fragmento imunogênico de Proteína E de H. influenzae selecionada dentre o grupo consistindo de aminoácidos 17-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 122), aminoácidos 18-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 123), aminoácidos 19-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 124), aminoácidos 20-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 125), aminoácidos 22160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 126), aminoácidos 23-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 179) e aminoácidos 24-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 180). Mais especificamente, em uma forma de realização, B é o fragmento de Proteína E como especificada em SEQ ID NO. 123, aminoácidos 18-160 de SEQ ID NO. 4.

[00137] Em uma forma particular de realização B é um fragmento imunogênico de Proteína E como especificada em SEQ ID NO. 123, aminoácidos 18-160 de SEQ ID NO. 4, quando A é um fragmento imunogênico de PilA como especificada em SEQ ID NO. 127.

[00138] Em uma forma de realização, as proteínas de fusão de fórmula (I) são definidas em que p é 0, Em outra forma de realização, as proteínas de fusão de fórmula (I) são definidas em que p é 1.

[00139] Em uma forma de realização, a proteína de fusão de fórmula (I) é selecionada dentre o grupo consistindo de SEQ ID NO. 136, SEQ ID NO. 138, SEQ ID NO. 140, SEQ ID NO. 142, SEQ ID NO. 144, SEQ ID NO. 146, SEQ ID NO. 148, SEQ ID NO. 150, SEQ ID NO. 182, SEQ ID NO. 184, SEQ ID NO. 186, SEQ ID NO. 188, SEQ ID NO. 190, SEQ ID NO. 192, SEQ ID NO. 194, SEQ ID NO. 196, SEQ ID NO. 198, SEQ ID NO. 200, SEQ ID NO. 202 e SEQ ID NO. 204; ou qualquer subconjunto das mesmas. Em outra forma de realização, a proteína de fusão de fórmula (I) é um fragmento 85%, 88%, 90%, 92%, 95% ou 98% idêntico a qualquer uma dentre SEQ ID NO. 136, SEQ ID NO. 138, SEQ ID NO. 140, SEQ ID NO. 142, SEQ ID NO. 144, SEQ ID NO. 146, SEQ ID NO. 148, SEQ ID NO. 150, SEQ ID NO. 182, SEQ ID NO. 184, SEQ ID NO. 186, SEQ ID NO. 188, SEQ ID NO. 190, SEQ ID NO. 192, SEQ ID NO. 194, SEQ ID NO. 196, SEQ ID NO. 198, SEQ ID NO. 200, SEQ ID NO. 202 ou SEQ ID NO. 204.

[00140] Em uma forma de realização, a proteína de fusão de fórmula (I) é a proteína de fusão de SEQ ID NO.148 em que o peptídeo de sinal foi removido SEQ ID NO. 177 (QIQKAEQN DVKLAPPTDV RSGYIRLVKN VNYYIDSESI WVDNQEPQIV HFDAVVNLDK GLYVYPEPKR YARSVRQYKI LNCANYHLTQ VRTDFYDEFW GQGLRAAPKK QKKHTLSLTP DTTLYNAAQI ICANYGEAFS VDKKGGTKKA AVSELLQASA PYKADVELCV YSTNETTNCT GGKNGIAADI TTAKGYVKSV TTSNGAITVK GDGTLANMEY ILQATGNAAT GVTWTTTCKG TDASLFPANF CGSVTQ).

[00141] Em uma forma de realização, a proteína de fusão de fórmula (I) é a proteína de fusão de SEQ ID NO.194 em que o peptídeo de sinal foi removido SEQ ID NO. 219 (IQKAEQND VKLAPPTDVR SGYIRLVKNV NYYIDSESIW VDNQEPQIVH FDAVVNLDKG LYVYPEPKRY ARSVRQYKIL NCANYHLTQV RTDFYDEFWG QGLRAAPKKQ KKHTLSLTPD TTLYNAAQII CANYGEAFSV DKKGGTKKAA VSELLQASAP YKADVELCVY STNETTNCTG GKNGIAADIT TAKGYVKSVT TSNGAITVKG DGTLANMEYI LQATGNAATG VTWTTTCKGT DASLFPANFC GSVTQ).

Conjugados de sacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae

[00142] O termo sacarídeo capsular inclui os polissacarídeos capsulares e oligossacarídeos deriváveis do polissacarídeo capsular. Um oligossacarídeo contém pelo menos 4 resíduos de açúcar. Os termos conjugado e conjugado referem-se a um sacarídeo capsular covalentemente ligado a uma proteína transportadora.

[00143] Em uma composição imunogênica, o número total de sorotipos sacarídeos é opcionalmente menor do que ou igual a 23. Em uma forma de realização, a composição imunogênica compreende menos do que 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, ou 13 sacarídeos de Streptococcus pneumoniae, opcionalmente a composição imunogênica compreendendo 10-23 sorotipos, 10-16 sorotipos, 10-15 sorotipos, 10-14 sorotipos, 10-13 sorotipos ou 10-12 sorotipos.

[00144] Em uma forma de realização, os conjugados de sacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae serão derivados dos seguintes sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F, embora seja apreciado que um ou dois de outros sorotipos pode ser substituído, dependendo da idade do receptor recebendo a vacina e a localização geográfica onde a composição imunogênica será administrada. Por exemplo, uma composição imunogênica 7-valente pode compreender sacarídeos de sorotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F. Uma composição imunogênica 10 valente pode ainda compreender sacarídeos derivado de sorotipos 1, 5 e 7F. Uma composição imunogênica 12- valente pode ainda compreender sacarídeos derivados de sorotipos 6A, 19A. Uma composição imunogênica 15-valente pode ainda compreender sacarídeos derivados de sorotipos 22F e 33F.

[00145] Outros antígenos de sacarídeo, por exemplo, valente-23 (tais como sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F), também são contemplados pela invenção.

[00146] O termo “proteína transportadora” destina-se a cobrir tanto os peptídeos pequenos como os polipeptídeos grandes (>10 kDa). A proteína transportadora pode ser qualquer peptídeo ou proteína. Ela po compreender um ou mais epítopos T auxiliadores. A proteína transportadora pode ser um toxóide do tétano (TT), fragmento de toxóide de tétano C, mutantes não tóxicos de toxina de tétano [note-se que todas essas variantes de TT são consideradas como sendo do mesmo tipo de proteína transportadora para os fins desta invenção], polipeptídeos compreendendo epitopos de células T de toxina de tétano, tais como N19 (WO2006/067632), toxóide de difteria (DT), CRM197 (material de reação cruzada 197), outros mutantes não tóxicos de toxina da difteria [como CRM176, CRM 197, CRM228, CRM 45 (Uchida et al J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM 9, CRM 45, CRM102, CRM 103 e CRM107 (onde CRM significa um material de reação cruzada) e outras mutações descritas por Nicholls e Youle em Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; deleção ou mutação de Glu-148 para Asp, Gln ou Ser e/ou Ala 158 para Gly e outras mutações descritas em US 4709017 ou US 4950740; mutação de pelo menos um ou mais resíduos Lys 516, Lys 526, Phe 530 e/ou Lys 534 e outras mutações descritas em US 5917017 ou US 6455673; ou fragmento descrito em US 5843711] (note-se que todas essas variantes de DT são consideradas como sendo o mesmo tipo de proteína transportadora para os fins desta invenção), pneumolisina pneumocócica (Kuo et al (1995) Infect Immun 63; 2706-13), OMPC (proteína de membrana externa de meningococos C extraída geralmente de N. meningitidis sorogrupo B - EP0372501), peptídeos sintéticos (EP0378881, EP0427347), proteínas de choque térmico (WO 93/17712, WO 94/03208), proteínas de coqueluche (WO 98/58668, EP0471177), citocinas, linfocinas, fatores de crescimento ou hormônios (WO 91/01146), proteínas artificiais compreendendo epítopos de células T CD4+múltiplos humanos a partir de vários antígenos derivados de patógenos (Falugi et al (2001) Eur J Immunol 31; 3816-3824) tais como proteína N19 (Baraldoi et al (2004) Infect Immun 72; 4884-7), proteínas de superfície de pneumococo PspA (WO 02/091998), proteínas de absorção de ferro (WO 01/72337), toxina A ou toxina B de Clostridium difficile (WO 00/61761), Proteína D de H. influenzae (EP594610 e WO 00/56360), PhtA pneumocócico (WO 98/18930, também referido como Sp36), PhtD pneumocócico (tríade D de poli histidina descrita em WO 00/37105, também referido para Sp036D), PhtB pneumocócico (tríade B de poli histidina descrita em WO 00/37105, também referido como Sp036B), ou PhtE (tríade E de poli histidina descrita em WO00/30299, sendo referida como BVH-3).

[00147] Em uma forma de realização, os conjugados de sacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae são conjugados a uma proteína transportadora, independentemente selecionados dentre o grupo constindo de toxóide de tétano (TT), fragmento C de TT, toxóide de difteria, CRM197 (material de reação cruzada 197), pneumolisina detoxificada, proteína D (de H.influenzae), PhtD, PhtDE (uma proteína contendo proteína D de tríade de poli histidina e proteína E de tríade de poli histidina) e N19. Em outra forma de realização, os conjugados de sacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae são todos conjugados independentemente de CRM197.

[00148] O termo ‘conjugado a’ neste contexto significa que a proteína está ligada covalentemente a um sacarídeo; nesta situação a proteína é actuante como uma proteína transportadora.

[00149] Em uma forma de realização, a composição imunogênica compreendendo pelo menos um sacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae conjugado à proteína D. Em uma forma de realização uma minoria dos sacarídeos conjugados a Streptococcus pneumoniae são conjugados à proteína D em que o termo ‘minoria’ refere-se a menos de metade do número total de sacarídeos na composição sendo conjugados à proteína D. Em outra forma de realização a composição imunogênica compreende entre 1-20, 1-18, 1-16, 1-14, 1-12, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 14, 1-4 ou 1-2 sacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae conjugados à proteína D. Em uma forma de realização, a composição imunogênica compreende pelo menos um sacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae conjugado ao toxóide de difteria. Em outra forma de realização a composição imunogênica compreendendo 19F é conjugada ao toxóide de difteria. Em uma forma de realização, a composição imunogênica compreende pelo menos um sacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae conjugado ao toxóide de tétano. Em outra forma de realização a composição imunogênica compreendendo 18C é conjugado ao toxóide de tétano.

[00150] Em uma forma de realização, a composição imunogênica compreende um sacarídeo conjugado de sorotipo 1 conjugado à proteína D ou CRM197. Em uma forma de realização, a composição imunogênica compreende um sacarídeo conjugado de sorotipo 4 conjugado à proteína D ou CRM197. Em uma forma de realização, a composição imunogênica compreende um sacarídeo conjugado de sorotipo 5 em que o sacarídeo de sorotipo 5 é conjugado à proteína D ou CRM197. Em uma forma de realização, a composição imunogênica compreende um sacarídeo conjugado de sorotipo 6B em que o sacarídeo de sorotipo 6B é conjugado à proteína D ou CRM197. Em uma forma de realização, a composição imunogênica compreende um sacarídeo conjugado de sorotipo 7F em que o sacarídeo de sorotipo 7F é conjugado à proteína D ou CRM197. Em uma forma de realização, a composição imunogênica compreende um sacarídeo conjugado de sorotipo 9V em que o sacarídeo 9V é conjugado à proteína D ou CRM197. Em uma forma de realização, a composição imunogênica compreende um sacarídeo conjugado de sorotipo 14 em que o sacarídeo de sorotipo 14 é conjugado à proteína D ou CRM197. Em uma forma de realização, a composição imunogênica compreende um sacarídeo conjugado de sorotipo 18C em que o sacarídeo de sorotipo 18C é conjugado ao toxóide de tétano ou CRM197. Em uma forma de realização, a composição imunogênica compreendendo um sacarídeo conjugado 19F em que o sacarídeo de sorotipo 19F é conjugado ao toxóide de difteria ou CRM197. Em uma forma de realização a composição imunogênica compreendendo um sacarídeo conjugado 23F em que o sacarídeo de sorotipo 23F é conjugado à proteína D ou CRM197. Em uma forma de realização, a composição imunogênica compreende um sacarídeo conjugado 6A conjugado a CRM197. Em uma forma de realização, a composição imunogênica compreende um sacarídeo conjugado 19A conjugado a CRM197.

[00151] Em uma forma de realização, a composição imunogênica compreende um sacarídeo de sorotipo 1 de Streptococcus pneumoniae conjugado à proteína D, um sacarídeo de sorotipo 4 de Streptococcus pneumoniae conjugado à proteína D, um sacarídeo de sorotipo 5 de Streptococcus pneumoniae conjugado à proteína D, um sacarídeo de sorotipo 6B de Streptococcus pneumoniae conjugado à proteína D, um sacarídeo de sorotipo 7F de Streptococcus pneumoniae conjugado à proteína D, um sacarídeo de sorotipo 9V de Streptococcus pneumoniae conjugado à proteína D, um sacarídeo de sorotipo 14 de Streptococcus pneumoniae conjugado à proteína D, um sacarídeo de sorotipo 23F de Streptococcus pneumoniae conjugado à proteína D, um sacarídeo de sorotipo 18C de Streptococcus pneumoniae conjugado ao toxóide de tétano e um sacarídeo 19F Streptococcus pneumoniae conjugado ao toxóide de difteria. Em uma forma de realização, a composição imunogênica ainda compreende um sorotipo 6A de Streptococcus pneumoniae conjugado a CRM197 e um sorotipo 19A de Streptococcus pneumoniae conjugado a CRM197.

[00152] Opcionalmente a razão de proteína transportadora para sacarídeo de S. pneumoniae está entre 1:5 e 5:1; 1:2 e 2.5:1; 1:1 e 2:1 (p/p). Em uma forma de realização, a maioria dos conjugados, por exemplo, 6, 7, 8, 9 ou mais dos conjugados têm uma razão de proteína transportadora para sacarídeo que é maior do que 1:1, por exemplo 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1 ou 1,6:1.

[00153] Em geral, a composição imunogênica da invenção pode compreender uma dose de cada sacarídeo conjugado entre 0,1 e 20μg, 1 e 5μg, 1 e 10 μg ou 1 e 3 μg de sacarídeo.

[00154] Em uma forma de realização, a composição imunogênica da invenção contém cada conjugado de sacarídeo capsular de S. pneumoniae a uma dose de entre 0,1-20μg; 0,5-10μg; 0,5- 5μg ou 1-3μg de sacarídeo. Em uma forma de realização, sacarídeos capsulares podem estar presentes em diferentes dosagens, por exemplo, alguns sacarídeos capsulares podem estar presentes a uma dose de exatamente 1μg ou alguns sacarídeos capsulares podem estar presentes a uma dose de exatamente 3μg. Em uma forma de realização, sacarídeos de sorotipos 3, 18C e 19F (ou 4, 18C e 19F) estão presentes a uma dose mais elevada do que os outros sacarídeos. Em um aspecto desta forma de realização, sorotipos 3, 18C e 19F (ou 4, 18C e 19F) estão presentes a uma dose de em torno de ou exatamente 3 μg ao passo que outros sacarídeos na composição imunogênica estão presentes a uma dose de em torno de ou exatamente de 1μg. Em uma forma de realização, os sorotipos 1, 5, 6B, 7F, 9V, 14 e 23F estão presentes a uma dose de em torno de ou exatamente 1μg.

[00155] O termo “sacarídeo” em todo o relatório descritivo pode indicar polissacarídeo ou oligossacarídeo e incluindo ambos. Polissacarídeos são isolados a partir de bactérias e podem ser dimensionado em certo grau por meio de métodos conhecidos (ver, por exemplo, EP497524 e EP497525) e opcionalmente por microfluidização. Polisacarídeos podem ser dimensionados de modo a reduzir a viscosidade em amostras de polissacarídeo e/ou para melhorar a capacidade de filtração para produtos conjugados. Oligossacarídeos têm um baixo número de unidades de repetição (tipicamente 5-30unidades de repetição) e são tipicamente polissacarídeos hidrolisados.

[00156] Polissacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae compreendem unidades de repetição de oligossacarídeo que podem conter até 8 resíduos de açúcar. Para uma revisão das unidades de oligossacarídeos para a chave de sorotipos de Streptococcus pneumoniae ver JONES, Christopher. Vaccines based on the cell surface carbohydrates of pathogenic bacteria. An. Acad. Bras. Cienc., June 2005, vol.77, no.2, p.293-324. ISSN 0001-3765. Em uma forma de realização, um antígeno de sacarídeo capsular pode ser um polissacarídeo de comprimento total, no entanto em outros pode ser uma unidade de oligossacarídeo, ou cadeia de sacarídeos de comprimento mais curto do que o nativa de unidades de repetição de oligossacarídeo. Em uma forma de realização, todos os sacarídeos presentes na vacina são polissacarídeos. Polisacarídeos de comprimento total podem ser “dimensionados”, isto é, o seu tamanho pode ser reduzido através de vários métodos tais como tratamento de hidrólise ácida, tratamento com peróxido de hidrogênio, dimensionamento com emulsiflex® seguido por um tratamento com peróxido de hidrogênio para gerar fragmentos de oligossacarídeo ou microfluidização.

[00157] Em uma forma de realização, a composição imunogênica compreende ainda sacarídeos de S.penumoniae não conjugados de sorotipos diferentes daqueles conjugados, de tal modo que o número de sorotipos de sacarídeos conjugados e não conjugados é menor do que ou igual a 23.

Conjugação

[00158] Os conjugados de sacarídeos presentes nas composições imunogênicas da invenção podem ser conjugados a uma proteína transportadora usando qualquer técnica de conjugação.

[00159] Em uma forma de realização, o sacarídeo de Streptococcus pneumoniae é conjugado à proteína transportadora através de um ligador, por exemplo, um ligador bifuncional. O ligador é opcionalmente heterobifuncional ou homobifuncional, tendo, por exemplo, um grupo amino reativo e um grupo de ácido carboxílico reativo, dois grupos amino reativos ou dois grupos de ácidos carboxílicos reativos. O ligador tem, por exemplo, entre 4 e 20, 4 e 12, 5 e 10 átomos de carbono. Um possível ligador é di- hidrazida de ácido adípico (ADH). Outros ligadores incluem B-propionamido (WO 00/10599), nitrofenil-etilamina (Gever et al (1979) Med. Microbiol. Immunol. 165; 171-288), haletos de haloalquila (US4057685), ligações glicosídicas (US4673574, US4808700), hexano diamina e ácido 6- aminocapróico (US4459286). Em uma forma de realização, ADH é usado como um ligador para conjugar sacarídeo de sorotipo 18C.

[00160] Os conjugados de sacarídeos presentes na composição imunogênicas da invenção podem ser preparados por qualquer técnica de copulação conhecida. O método de conjugação pode se basear na ativação do sacarídeo com tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino piridínio (CDAP) para formar um éster cianato. O sacarídeo ativado pode ser assim copulado diretamente ou via um grupo espaçador (ligador) a um grupo amino sobre a proteína transportadora. Por exemplo, o espaçador pode ser cistamina ou cisteamina para dar um polissacarídeo tiolado que poderia ser copulado ao transportador através de uma ligação tioéter obtida após a reação com uma proteína transportadora ativada por maleimida (por exemplo, usando GMBS) ou uma proteína transportadora haloacetilada (por exemplo, usando iodoacetimida [por exemplo, iodoacetimida de etila HCl] ou N-succinimidil bromoacetato ou SIAB, ou SIA, ou SBAP). Opcionalmente, o éster de cianato (opcionalmente feito por química CDAP) é copulado com hexano diamina ou ADH e o sacarídeo amino derivatizado é conjugado com a proteína transportadora usando química de carbodiimida (por exemplo, EDAC ou EDC) através de um grupo carboxila no transportador de proteína. Estes conjugados são descritos no pedido PCT WO 93/15760 publicado, Uniformed Services University e WO 95/08348 e WO 96/29094.

[00161] Outras técnicas apropriadas usam carbodiimidas, carbiinidas, hidrazidas, ésteres ativos, norborano, ácido p-nitrobenzóico, N-hidroxi succinimidea, S-NHS, EDC, TSTU. Muitas são descritas em WO 98/42721. A conjugação pode envolver um ligador carbonila que pode ser formado por reação de um grupo hidroxila livre do sacarídeo com CDI (Bethell et al J. Biol. Chem. 1979, 254; 2572-4, Hearn et al J. Chromatogr. 1981. 218; 50918) seguido por reação com uma proteína para formar uma ligação carbamato. Isto pode envolver a redução do término anomérico para um grupo hidroxila primária, uma proteção / desproteção opcional da reação do grupo hidroxila primária do grupo hidroxila primária com CDI para formar um intermediário de carbamato CDI e a copulação do intermediário de carbamato CDI com um grupo amino em uma proteína.

[00162] Os conjugados podem também ser preparados por métodos de aminação redutora direta, como descrito em US 4365170 (Jennings) e US 4673574 (Anderson). Outros métodos são descritos em EP-0-161-188, EP208375 e EP-0-477508.

[00163] Outro método envolve o copulação de um sacarídeo ativado de brometo de cianogênio (ou CDAP), derivatizado com di-hidrazida de ácido adípico (ADH) para a proteína transportadora por condensação de carbodiimida (Chu C. et al Infect. Immunity, 1983 245 256), por exemplo, usando EDAC (cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida).

[00164] Em uma forma de realização,um grupo hidroxila (opcionalmente um grupo hidroxila ativado, por exemplo, um grupo hidroxila ativado para fazer um éster de cianato [por exemplo, usando CDAP]) sobre um sacarídeo é ligado a um grupo amino ou carboxílico em uma proteína, quer diretamente ou indiretamente (através de um ligador). Onde um ligador está presente, um grupo hidroxila em um sacarídeo é opcionalmente ligado a um grupo amino em um ligador, por exemplo, usando conjugação de CDAP. Um grupo amino adicional no ligador, por exemplo, ADH, pode ser conjugado com um grupo de ácido carboxílico em uma proteína, por exemplo, usando a química de carbodiimida, por exemplo, usando EDAC. Em uma forma de realização, o(s) sacarídeo(s) capsular(es) pneumocócico é conjugado ao ligador antes do ligador ser conjugado com a proteína transportadora. Alternativamente, o ligador pode ser conjugado com o transportador antes da conjugação com o sacarídeo.

[00165] Uma combinação de técnicas pode também ser usada, com alguns conjugados de sacarídeo-proteína sendo preparados por CDAP, e alguns por aminação redutora.

[00166] Em geral os seguintes tipos de grupos químicos sobre uma proteína transportadora podem ser usados para a copulação/conjugação: A) Carboxila (por exemplo, via ácido aspártico ou ácido glutâmico). Em uma forma de realização este grupo é ligado a grupos amino em sacarídeos diretamente ou a um grupo amino em um ligador com uma química de carbodiimida por exemplo, com EDAC. B) Grupo amino (por exemplo, via lisina). Em uma forma de realização, este grupo é ligado a grupos carboxila em sacarídeos diretamente ou a um grupo carboxila em um ligador com química de carbodiimida, por exemplo, com EDAC. Em outra forma de realização este grupo é ligado a grupos hidroxila ativados com CDAP ou CNBr em sacarídeos diretamente ou a tais grupos em um ligador; a sacarídeos ou ligadores tendo um grupo aldeído; a sacarídeos ou ligadors tendo um grupo de éster de succinimida. C) Sulfidrila (por exemplo, via cisteína). Em uma forma de realização este grupo é ligado a um sacarídeo acetilado com bromo ou cloro ou ligador com química maleimida. Em uma forma de realização, este grupo é ativado/modificado com bis diazobenzidina. D) Grupo hidroxila (por exemplo, via tirosina). Em uma forma de realização, este s grupo é ativado/modificado com bis diazobenzidina. E) Grupo imidazolila (por exemplo, via histidina). Em uma forma de realização, este grupo é ativado/modificado com bis diazobenzidina. F) Grupo guanidila (por exemplo, via arginina). G) Grupo indolila (por exemplo, via triptofano).

[00167] Em um sacarídeo, em geral os seguintes grupos podem ser usados para um acoplamento: OH, COOH ou NH2. Os grupos aldeído podem ser gerados após diferentes tratamentos conhecidos na técnica como: periodato, hidrólise de ácido, peróxido de hidrogênio, etc.

[00168] Abordagens de copulação direta: Sacarídeo-OH + CNBr ou CDAP > éster de cianato + NH2-Prot > conjugado Sacarídeo-aldeído + NH2-Prot > base de Schiff + NaCNBH3 > conjugado Sacarídeo-COOH + NH2-Prot + EDAC > conjugado Sacarídeo-NH2 + COOH-Prot + EDAC > conjugado Abordagens de copulação indireta via espaçador (ligador): Sacarídeo-OH + CNBr ou CDAP ---> éster de cianato + NH2-- - -NH2 > sacarídeo NH2 + COOH-Prot + EDAC > conjugado Sacarídeo-OH + CNBr ou CDAP > éster de cianato + NH2- SH > sacarídeo SH + SH-Prot (Proteína nativa com uma cisteína exposta ou obtida após a modificação de grupos amino de uma proteína por SPDP por exemplo) > sacarídeo-S-S-Prot Sacarídeo-OH + CNBr ou CDAP ---> éster de cianato + NH2-- - -SH > sacarídeo SH + maleimida-Prot (modificação de grupos amino) > conjugado Sacarídeo-OH + CNBr ou CDAP ---> éster de cianato + NH2-- - --SH ---> Sacarídeo-SH + haloacetilado-Prot > Conjugado Sacarídeo-COOH + EDAC + NH2 NH2 ---> sacarídeo - NH2 + EDAC + COOH-Prot > conjugado Sacarídeo-COOH + EDAC+ NH2 SH > sacarídeo SH + SH-Prot (Proteína nativa com uma cisteína exposta ou obtida após a modificação de grupos amino de uma proteína por SPDP por exemplo) > sacarídeo-S-S-Prot Sacarídeo-COOH + EDAC+ NH2 SH > sacarídeo SH + maleimida-Prot (modificação de grupos amino) > conjugado Sacarídeo-COOH + EDAC + NH2 SH ---> Sacarídeo-SH + haloacetilado-Prot > Conjugado Sacarídeo-Aldeído + NH2 NH2 > sacarídeo---NH2 + EDAC + COOH-Prot > conjugado

[00169] Nota: em vez de EDAC acima, qualquer carbodiimida apropriada pode ser usada.

[00170] Em sumário, os tipos de grupo químico de transportador de proteína que podem ser geralmente usados para a copulação com um sacarídeo são grupos amino (por exemplo, em resíduos de lisina), grupos COOH (por exemplo, em resíduos de ácido aspártico e glutâmico) e grupos SH (se acessíveis) (por exemplo, em resíduos de cisteína.

[00171] Em uma forma de realização pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, ou 23 sacarídeos de S.pneumoniae são conjugados a uma proteína transportadora por meio de aminação redutora. Em uma forma de realização menos do que 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 sacarídeos de S.pneumoniae são conjugados a uma proteína transportadora por meio de aminação redutora. Em uma forma de realização entre 1 e 23, 2 e 22, 3 e 21, 4 e 20, 5 e 19, 6 e 18, 7 e 17, 8 e 16, 9 e 15, 10 e 14, 11 e 13, 1 e 23, e 22, 1 e 21, 1 e 20, 1 e 19, 1 e 18, 1 e 17, 1 e 16, 1 e 15, 1 e 14, 1 e 13, 1 e 12, 1 e 11, 1 e 10, 1 e 9, 1 e 8, 1 e 7, 1 e 6, 1 e 5, 1 e 4, 1 e 3, ou 1 ou 2 sacarídeos de S.pneumoniae são conjugados a uma proteína transportadora por meio de aminação redutora. Em outra forma de realização todos os sacarídeos capsulares de S.pneumoniae são conjugados a uma proteína transportadora por meio de aminação redutora.

[00172] Em uma forma de realização pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, ou 23 sacarídeos de S.pneumoniae são conjugados à uma proteína transportadora através de química CDAP. Em uma forma de realização, menos do que 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 sacarídeos de S.pneumoniae são conjugados a uma proteína transportadora através de química CDAP. Em uma forma de realização entre 1 e 23, 2 e 22, 3 e 21, 4 e 20, 5 e 19, 6 e 18, 7 e 17, 8 e 16, 9 e 15, 10 e 14, 11 e 13, 1 e 23, e 22, 1 e 21, 10 e 23, 10 e 22, 10 e 21, 10 e 20, 10 e 19, 10 e 18, 10 e 17, 10 e 16, 10 e 15, 10 e 14, 10 e 13, 10 e 12, 10 e 11, 1 e 20, 1 e 19, 1 e 18, 1 e 17, 1 e 16, 1 e 15, 1 e 14, 1 e 13, 1 e 12, 1 e 11, 1 e 10, 1 e 9, 1 e 8, 1 e 7, 1 e 6, 1 e 5, 1 e 4, 1 e 3, ou 1 ou 2 sacarídeos de S.pneumoniae são conjugados a uma proteína transportadora através de química CDAP. Em outra forma de realização, todos os sacarídeos capsulares de S.pneumoniae são conjugados a uma proteína transportadora através de química CDAP.

[00173] Em uma forma de realização, a composição imunogênica da invenção compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 sacarídeos conjugados a uma proteína transportadora por meio de aminação redutora e compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ou 22 sacarídeos conjugados a uma proteína transportadora através uma química diferente da aminação redutora, por exemplo, química de CDAP.

[00174] Em uma forma de realização, os sacarídeos capsulares de pelo menos um dentre os sorotipos selecionados dentre o grupo consistindo de sorotipos 1, 3, 19A e 19F são conjugados através de uma química diferente de aminação redutora e pelo menos um dos sorotipos selecionados dentre o grupo consistindo de sorotipos 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7F, 9V, 14, 18C e 23F são conjugados através aminação redutora. Em uma forma de realização, a composição imunogênica da invenção compreende sacarídeo(s) capsular(es) de S. pneumoniae de sorotipo 1 ou 3 ou 19A ou 19F; 1 e 3; 1 e 19A; 1 e 19F; 3 e 19A; 3 e 19F; 19A e 19F; 1, 3 e 19A; 1, 3 e 19F, 1, 19A e 19F; 3, 19A e 19F ou 1, 3, 19A e 19F conjugados a uma proteína transportadora através de uma química diferente de aminação redutora. Em uma forma de realização, 19F é conjugado a uma proteína transportadora através de química diferente de aminação redutora. Em uma forma de realização, a composição imunogênica da invenção compreende sacarídeo capsular de S. pneumoniae de sorotipo 1 ou 3 ou 19A ou 19F; 1 e 3; 1 e 19A; 1 e 19F; 3 e 19A; 3 e 19F; 19A e 19F; 1, 3 e 19A; 1, 3 e 19F, 1, 19A e 19F; 3, 19A e 19F ou 1, 3, 19A e 19F conjugados à uma proteína transportadora através de química de cianilação, como química de CDAP. Em uma forma de realização, 19F é conjugado a uma proteína transportadora por química de CDAP. Em uma forma de realização da invenção, o seguinte sacarídeo capsular de S. pneumoniae ou sacarídeos é/são conjugados a uma proteína transportadora por aminação redutora; sorotipo 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C ou 23F, 4 e 5, 4 e 6A, 4 e 6B, 4 e 7F, 4 e 9V, 4 e 14, 4 e 18C, 4 e 23F, 5 e 6A, 5 e 6B, 5 e 7F, 5 e 9V, 5 e 14, 5 e 18C, 5 e 23F, 6A e 6B, 6A e 7F, 6A e 9V, 6A e 14, 6A e 18C, 6A e 23F, 6B e 7F, 6B e 9V, 6B e 14, 6B e 18C, 6B e 23F, 7F e 9V, 7F e 14, 7F e 18C, 7F e 23F, 9V e 14, 9V e 18C, 9V e 23F, 14 e 18C, 14 e 23F ou 18C e 23F. Em uma forma de realização, sorotipo 23F é conjugado a uma proteína transportadora por química aminação redutora.

Proteína de Streptococcus pneumoniae não conjugada ou conjugada

[00175] Composições imunogênicas da invenção podem compreender pelo menos uma proteína de S.pneumoniae não conjugada ou conjugada. Em uma forma de realização, a e pelo menos uma proteína de S.pneumoniae não conjugada ou conjugada é selecionada dentre o grupo consistindo da família de tríade de poli histidina (PhtX), pneumolisina detoxificada (dPly), família de proteína de ligação de colina (CbpX), truncados de CbpX, família de LytX (enzimas autoliticas), truncados de LytX, proteínas quiméricas de truncado de CbpX - truncado de LytX, PcpA (proteína A de ligação a colina pneumocócica), PspA (proteína de superfície pneumocócica A), PsaA (proteína de adesão de superfície Pneumocócica A), Sp128, Sp101 (Streptococcus pneumoniae 101), Sp130 (Streptococcus pneumoniae 130), SP125 (Streptococcus pneumoniae 125) e SP133 (Streptococcus pneumoniae 133).

[00176] A família de Pht (tríade de poli histidina) compreende proteínas PhtA, PhtB, PhtD, e PhtE. Note-se que a família de Pht pode ser referida como ou a família da tríade de poli histidina ou família de tríade de histidina pneumocócica, assim os termos ‘tríade’ de poli histidina e ‘tríade de histidina pneumocócica” podem ser considerados como sendo interpermutáveis. A família de é, caracterizada por uma sequência de lipidação, dois domínios separados por uma região rica em prolina e várias tríades de histidina, possivelmente envolvidas em ligação de nucleosídeos ou metal ou atividade enzimática, (3-5) regiões em espiral espiralada, um término N conservado e um término C heterogêneo. Ela está presente em todas as cepas de pneumococos testados. Proteínas homólogas também foram encontrados em outros Streptococci e Neisseria. Em uma forma de realização da invenção, a proteína Pht da invenção é PhtD. Entende-se, no entanto, que os termos PhtA, PhtB, PhtD e PhtE referem-se a proteínas tendo as sequências descritas nas citações abaixo, bem como de ocorrência natural (e feitas pelo homem); variantes das mesmas que tem uma homologia de sequência que é pelo menos 90% idêntica à das proteínas referenciadas. Opcionalmente, é pelo menos 95% idêntica ou pelo menos 97% idêntica.

[00177] Com relação às proteínas PhtX, PhtA é descrito em WO 98/18930, e é também referido como Sp36. Como notado acima, ela é uma proteína da família de Pht e tem o motivo de sinal de tipo II de LXXC. PhtD é descrito em WO 00/37105, e é também referido para Sp036D. Como notado acima, ela é também uma proteína a da família de Pht e tem o motivo de sinal de tipo II LXXC. Em uma forma de realização, o termo ‘PhtD’ refere-se a SEQ ID NO:220. PhtB é descrito em WO 00/37105, e é também referido como Sp036B. Outro membro da família de PhtB é o polipeptídeo de degradação C3, como descrito em WO 00/17370. Esta proteína é também da família de Pht e tem o motivo de sinal de tipo II LXXC. Por exemplo, um equivalente imunologicamente funcional é a proteína Sp42 descrita em WO 98/18930. Um truncado de PhtB (aproximadamente 79kD) é descrito em WO99/15675 que é também considerado um membro da família de Pht. PhtE é descrito em WO00/39299 e é referido como BVH-3. Onde qualquer proteína Pht é referida aqui, significa-se que os fragmentos imunogênicos ou fusões dos mesmos da proteína Pht podem ser usados. Por exemplo, uma referência a PhtX inclui fragmentos imunogênicos ou fusões dos mesmos a partir de qualquer proteína Pht. Uma referência a PhtD ou PhtB não exclui PhtDE (uma proteína de fusão compreendendo PhtD e PhtE) ou PhtBE (uma proteína de fusão compreendendo PhtB e PhtE), respectivamente, como encontrado, por exemplo, em WO0198334.

[00178] Em uma forma de realização a pelo menos uma proteína de Streptococccus pneumoniae não conjugada à conjugada compreende, pelo menos, uma proteína de família de tríade de poli histidina de (por exemplo, a proteína pode ser selecionada dentre o grupo consistindo de proteínas de fusão PhtD, PhtBD e PhtDE). Em outra forma de realização a pelo menos uma proteína de Streptococcus pneumoniae não conjugada ou conjugada é uma proteína PhtD. Em outra forma de realização, a proteína PhtD compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos 21-838 de

SEQUENCE ID No,4 de WO00/37105.

[00179] Em uma forma de realização a pelo menos uma proteína de Streptococcus pneumoniae não conjugada ou conjugada é pneumolisina detoxificada (dPly). Em uma forma de realização a pneumolisina foi quimicamente detoxificada. Em outra forma de realização a pneumolisina foi quimicamente detoxificada. Em ainda outra forma de realização a pneumolisina foi tanto quimicamente como geneticamente detoxificada.

[00180] Em outra forma de realização a composição imunogênica da invenção compreende pneumolisina detoxificada (dPly) e PhtD. Em outra forma de realização a composição imunogênica da invenção compreende pneumolisina não conjugada detoxificada (dPly) e PhtD não conjugado.

[00181] Com relação à família de proteína de ligação de colina (CbpX), membros desta família de foram originalmente identificados como proteínas de pneumococos que podem ser purificadas por cromatografia de afinidade de colina. As proteínas de ligação de colina não são covalentemente ligadas a unidades de fosforilcolina de ácido teicóico de parede celular e ácido lipoteicóico associado a membrana. Estruturalmente, elas têm várias regiões em comum com a família de completa, embora a natureza exata das proteínas (sequências de aminoácidos, comprimento, etc.) poder variar. Em geral, as proteínas de ligação de colina compreendem uma região N terminal (N), regiões de repetição conservadas (R1 e/ou R2), uma região rica em prolina (P) e uma região de ligação de colina conservada (C), constituídas por múltiplas repetições, que compreende aproximadamente uma metade da proteína. Tal como usado neste pedido, o termo "família de proteína de ligação de colina (CbpX)" inclui proteínas do grupo consistindo de proteínas de ligação de colina como identificadas em WO97/41151, PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD e CbpG. CbpA é descrita em WO97/41151. CbpD e CbpG são descritas em WO00/29434. PspC é descrita em WO97/09994. PbcA é descrita em WO98/21337.SpsA é uma proteína de ligação de colina descrita em WO 98/39450. Opcionalmente as proteínas de ligação de colina são selecionadas dentre o grupo consistindo de CbpA, PbcA, SpsA e PspC.

[00182] Uma forma de realização da invenção compreende truncados de CbpX em que “CbpX” é definido acima e “truncado” refere-se a proteínas de CbpX faltando 50% ou ou mais da região de ligação de colina (C). Opcionalmente estas proteínas carecem de toda a região de ligação de colina. Opcionalmente, os truncados de proteína carecem (i) da região de ligação de colina e (ii) uma porção da metade N-terminal de uma proteína também, ainda retendo, pelo menos, uma região de repetição (R1 ou R2). Opcionalmente, o truncado retém 2 regiões de repetição (R1 e R2). Exemplos de tal formas de realização são NR1xR2 e R1xR2, como ilustrado em WO99/51266 ou WO99/51188, no entanto, outras proteínas de ligação de colina faltando uma região de ligação de colina similar são também contempladas dentro do escopo desta invenção.

[00183] A família de LytX são as proteínas associadas com membranas associadas com a lise celular. O domínio N-terminal compreende domínio(s) de ligação de colina. No entanto, a família de LytX não tem todos os aspectos encontrados na família de CbpX notada acima. Para a presente invenção, a família de LytX é considerada distinta da família de CbpX. Em contraste com a família de CbpX, o domínio C-terminal da família de LytX contém o domínio catalítico da proteína LytX. A família compreende LytA, LytB e LytC. Com relação à família de LytX, LytA é descrita em Ronda et al., Eur J Biochem, 164:621-624 (1987). LytB é descrita em WO 98/18930, e é também referida como Sp46. LytC é também descrita em WO 98/18930, e é também referida como Sp91. Uma forma de realização da invenção compreende LytC.

[00184] Outra forma de realização compreende truncados de LytX em que “LytX” é definido acima e “truncado” refere-se a proteínas de LytX faltando 50% ou mais da região de ligação de colina. Opcionalmente estas proteínas carecem da região de ligação de colina completa. Ainda outra forma de realização desta invenção compreende proteínas quiméricas de truncado de CbpX - truncado de LytX ou proteínas de fusão. Opcionalmente a proteína de fusão compreende NR1xR2 (ou R1xR2) de CbpX e a porção C-terminal (Cterm, isto é, uma proteína sem os domínios de ligação de colina) de LytX (por exemplo, LytCCterm ou Sp91Cterm). Opcionalmente CbpX é selecionada dentre o grupo consistindo de CbpA, PbcA, SpsA e PspC. Opcionalmente, é CbpA. Opcionalmente, LytX é LytC (também referido como Sp91). Outra forma de realização da presente invenção é um truncado de PspA ou PsaA faltando o domínio de ligação de colina (C) e expressado como uma proteína de fusão com LytX. Opcionalmente, LytX é LytC.

[00185] Com relação a PsaA e PspA, ambas são discutidas na técnica. Por exemplo, PsaA e variantes de deleção de transmembrana da mesma foram descritas por Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec;64(12):5255-62. PspA e variantes de deleção de transmembrana da mesma foram descritas em, por exemplo, US 5804193, WO 92/14488, e WO 99/53940.

[00186] Com relação a PcpA, esta proteína foi descrita na técnica, por exemplo PcpA foi descrita em WO2011/075823. O termo ‘PcpA’ refere-se a uma proteína compreendendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO:2 ou 7 a partir de WO2011/075823 ou fragmentos de, pelo menos, 100, 150, 200, 25 ou mais aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO:2 ou 7 a partir de WO2011/075823.

[00187] Sp128 e Sp130 são descritos em WO00/76540. Sp125 é um exemplo de uma proteína de superfície de pneumococo com o motivo ancorado na parede celular de LPXTG (onde X é qualquer aminoácido). Proteinas dentro desta classe de proteínas de superfície de pneumococos com este motivo foram verificadas como sendo utilizáveis no contexto desta invenção, sendo assim consideradas como uma outra proteína da invenção. Sp125 é descrita, sozinha, em WO 98/18930, e é também conhecido como ZmpB - um zinco metaloproteinase. Sp101 é descrita em WO 98/06734 (onde recebeu a referência # y85993). Ela é, caracterizada por uma sequência de sinal de Tipo I. Sp133 é descrita em WO 98/06734 (onde recebeu a referência # y85992). Ela é também, caracterizada por uma sequência de sinal de Tipo I.

[00188] Qualquer uma destas outras proteínas de S.pneumoniae pode estar presente é em uma forma não conjugada ou conjugada. Uma ou mais proteínas de S.pneumoniae é opcionalmente conjugada a um de sacarídeo S.pneumoniae (descrito na seção entitulada conjugados de sacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae acima). Opcionalmente uma ou mais proteínas de S.pneumoniae é conjugada a um sacarídeo a partir de uma bactéria diferente.

[00189] O termo ‘conjugado a’ neste contexto significa que a proteína está ligada covalentemente a um sacarídeo, nesta situação a proteína é atuante como a proteína transportadora.

[00190] Em uma forma de realização a pelo menos uma outra proteína de S.pneumoniae não conjugada ou conjugada compreende uma família de poli histidina (PhtX) selecionada dentre o grupo consistindo de PhtB, PhtE, PhtA, PhtBD e PhtDE.

Adjuvantes

[00191] Em uma forma de realização, a composição imunogênica ainda compreende um adjuvante.

[00192] Os adjuvantes apropriados incluem, mas não são limitados a, sais de alumínio (por exemplo, fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio), monofosforil lipídeo A (por exemplo, 3D-MPL), saponinas (por exemplo, QS21), emulsões de óleo em água, preparações de vesículas de membrana externa ou de pequenas bolhas a partir de cepas bacterianas Gram negativas (tais como as ensinadas por WO02/09746), lipídeo A ou seus derivados, fosfatos de alquil glucosamida ou combinações de dois ou mais destes adjuvantes. Em uma forma de realização, o adjuvante é fosfato de alumínio. Em outra forma de realização o adjuvante compreende 100-750, 150-600, 200-500, 250-450, 300-400, ou em torno de 350μg de alumínio como fosfato de alumínio por dose humana.

Vacinas

[00193] A presente invenção fornece uma vacina compreendendo as composições imunogênicas da invenção. Formas de realização com relação às “composições imunogênicas” da invenção são também aplicáveis a formas de realização com relação a “vacinas” da invenção, e vice versa. Em uma forma de realização, a vacina compreende a composição imunogênica da invenção e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00194] As vacinas da invenção podem ser administradas por qualquer via de liberação apropriada, tais como intradérmica, mucosal por exemplo, intranasal, oral, intramuscular ou subcutânea. Outras vias de liberação são bem conhecidas na técnica. A preparação de vacinas é geralmente descrita em Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach” (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York).

[00195] Em um aspecto, a composição imunogênica da invenção é administrada por via de liberação intramuscular. a administração intramuscular pode ser na coxa ou parte superior do braço. Injeção é tipicamente via uma agulha (por exemplo, uma agulha hipodérmica), mas injeção sem agulha pode ser usada em alternativa. Uma dose intramuscular típica é de 0,5 ml.

[00196] Outro aspecto da invenção é um método de fabricação de uma vacina da invenção compreendendo as etapas de misturar a proteína de S. pneumoniae não conjugada com a composição de adjuvante.

[00197] Em um aspecto da invenção provê-se um método de imunizar um indivíduo contra doenças causadas por infecção por Streptococcus pneumoniae compreendendo a administração ao indivíduo de uma dose terapeuticamente eficaz da composição imunogênica ou vacina da invenção. Em outro aspecto da invenção provê-se um método de imunizar um indivíduo contra doenças causadas por infecção por Haemophilus influenzae compreendendo a administração ao indivíduo de uma dose terapeuticamente eficaz da composição imunogênica ou vacina da invenção. Em outra forma de realização provê-se um método de imunizar um indivíduo contra doenças causadas por Streptococcus pneumoniae e infecção por Haemophilus influenzae compreendendo a administração ao indivíduo de uma dose terapeuticamente eficaz da composição imunogênica ou vacina da invenção. Em uma forma de realização as doenças compreendem pelo menos uma doença selecionada dentre o grupo consistindo de pneumonia, doença pneumocócica invasiva (IPD), exacerbações da doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), otite média, meningite, bacteremia, e conjuntivite. Em uma forma de realização, o indivíduo é um indivíduo mamífero. Em outra forma de realização o indivíduo mamífero é selecionado dentre o grupo consistindo de camundongo, porquinho da índia e humano. Em uma forma de realização, o indivíduo é um adulto humano, opcionalmente um humano idoso. Em outra forma de realização o indivíduo é um humano infantil.

[00198] Em outro aspecto da invenção provê-se uma composição imunogênica ou vacina da invenção para uso no tratamento ou prevenção de doença causada por infecção por Streptococcus pneumoniae. Em outro aspecto da invenção provê-se uma composição imunogênica ou vacina da invenção para uso no tratamento ou prevenção de doença causada por infecção por Haemophilus influenzae. Em outra forma de realização provê-se uma composição imunogênica ou vacina da invenção para uso no tratamento ou prevenção de doença causada por Streptococcus pneumoniae e infecção por Haemophilus influenzae. Em uma forma de realização, o uso compreende a administração da composição imunogênica para um hospedeiro humano adulto, opcionalmente um hospedeiro humano idoso. Em outra forma de realização o uso compreende a administração da composição imunogênica a um hospedeiro infantil. Em outra forma de realização, as doenças compreendem pelo menos uma doença selecionada dentre o grupo consistindo de pneumonia, doença pneumocócica invasiva (IPD), exacerbações da doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), otite média, meningite, bacteremia, e conjuntivite.

[00199] Em outro aspecto da invenção provê-se um uso da composição imunogênica ou vacina da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doenças causadas por infecção por Streptococcus pneumoniae. Em outro aspecto da invenção provê-se o uso da composição imunogênica ou vacina da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doenças causadas por infecção por Haemophilus influenzae. Em outra forma de realização provê-se um uso da composição imunogênica ou vacina da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doenças causadas por Haemophilus influenzae e infecção por Streptococcus pneumoniae. Em uma forma de realização, as doenças compreendem pelo menos uma doença selecionada dentre o grupo consistindo de pneumonia, doença pneumocócica invasiva (IPD), exacerbações da doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), otite média, meningite, bacteremia, e conjuntivite,

[00200] Em uma forma de realização, o uso compreende a administração da composição imunogênica ou vacina da invenção a um hospedeiro selecionado dentre o grupo consistindo de um hospedeiro humano adulto, um hospedeiro humano idoso e um hospedeiro humano infantil.

[00201] Proteínas de fusão de fórmula (I) e conjugados de sacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae são utilizáveis como imunogenes em indivíduos tais como mamíferos, particularmente humanos. Em particular, as proteínas de fusão de fórmula (I) e conjugados de sacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae são utilizáveis para induzir uma resposta imune contra H. influenzae em indivíduos, particularmente humanos. Adicionalmente, as proteínas de fusão de fórmula (I) e conjugados de sacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae são utilizáveis para induzir uma resposta imune contra Streptococcus pneumoniae em indivíduos, particularmente humanos. Mais especificamente, as proteínas de fusão de fórmula (I) são utilizáveis no tratamento ou prevenção de otite média e/ou AECOPD e/ou pneumonia.

[00202] Em uma forma de realização, a invenção ainda provê um método para o tratamento ou prevenção de otite média em um indivíduo em necessidade do mesmo compreendendo a administração ao referido indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição imunogênica compreendendo as proteínas de fusão de fórmula (I) e conjugados de sacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae como aqui descrito. Em outra forma de realização, a invenção provê um método para o tratamento ou prevenção de exacerbações agudas de doença pulmonar obstrutiva crônica (AECOPD) em um indivíduo em necessidade do mesmo compreendendo a administração ao referido indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição imunogênica compreendendo as proteínas de fusão de fórmula (I) e conjugados de sacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae como aqui descrito.

[00203] Em outra forma de realização, a invenção provê um método para o tratamento ou prevenção de pneumonia em um indivíduo em necessidade do mesmo compreendendo a administração ao referido indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição imunogênica compreendendo as proteínas de fusão de fórmula (I) e conjugados de sacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae como aqui descrito.

[00204] Em outra forma de realização, a invenção provê um método para o tratamento ou prevenção de uma infecção ou doença por H. influenzae em um indivíduo em necessidade do mesmo, o referido método compreendendo a administração ao referido indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição imunogênica compreendendo as proteínas de fusão de fórmula (I) e conjugados de sacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae como aqui descrito.

[00205] Em outra forma de realização, a invenção provê um método para o tratamento ou prevenção de uma infecção por S. pneumoniae ou doença em um indivíduo em necessidade do mesmo, o referido método compreendendo a administração ao referido indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição imunogênica compreendendo as proteínas de fusão de fórmula (I) e conjugados de sacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae como aqui descrito.

Outras definições

[00206] Salvo de outra forma explicado ou definido aqui, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um versado na técnica à qual pertence esta descrição. Por exemplo, as definições dos termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology e Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

[00207] Os termos no singular "um", "uma", e "o" e “a” incluem referências no plural, salvo se o contexto indicar claramente o contrário. Da mesma forma, a palavra "ou" destina-se a incluir "e" salvo se o contexto indicar claramente o contrário. Deve ser ainda compreendido que todos os tamanhos de bases ou tamanhos de aminoácidos, e todos os valores de peso molecular ou de massa molecular, dados para ácidos nucleicos ou polipeptídeos são aproximados, e são dados para a descrição. Além disso, limitações numéricas dadas com respeito às concentrações ou níveis de uma substância, tal como um antígeno podem ser aproximadas. Assim, sempre que uma concentração é indicada para ser (por exemplo) aproximadamente 200 pg, pretende-se que a concentração inclua valores um pouco maiores ou um pouco menores do que ("cerca de" ou "~") de 200 pg

[00208] Embora os métodos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos possam ser usados na prática ou testes da presente descrição, os métodos e materiais adequados são descritos abaixo.

[00209] O termo “compreende” significa “inclui”. Assim, salvo se o contexto exigir de outra forma, a palavra "compreende" e variações tais como "compreendem" e "compreendendo" será entendida como implicando a inclusão de um composto ou composição indicada (e.g., ácido nucleico, polipeptídeo, antígeno) ou etapa, ou grupo de compostos ou etapas, mas não a exclusão de quaisquer outros compostos, composição, etapas, ou grupos dos mesmos. A abreviatura “e.g." é derivada de exempli gratia em latim, e é aqui usada para indicar um exemplo não limitativo. Assim, a abreviatura "e.g." é sinônimo do termo "por exemplo."

[00210] Um "indivíduo", como aqui usado, é um mamífero, incluindo os seres humanos, primatas não humanos e mamíferos não primatas, tais como os membros do gênero de roedores (incluindo mas não limitado a camundongos e ratos) e membros da ordem Lagomorpha (incluindo mas não se limitando a coelhos).

[00211] Tal como aqui usado, "adjuvante" significa um composto ou substância que, quando administrado a um indivíduo em conjunto com uma vacina, imunoterapêutico, ou outra composição contendo antígeno ou imunogene, aumenta ou intensifica a resposta imune do indivíduo a ser administrado com o antígeno ou imunogene (em comparação com a resposta imune que seria obtido na ausência de adjuvante). Isto deve ser distinguido de "terapia adjuvante", como definido pelo National Cancer Institute of the United States Institutes of Health no contexto de tratamento de câncer como tratamento adicional dado após o tratamento primário, para diminuir o risco de recorrência do câncer.

[00212] As substituições conservativas são bem conhecidas e são geralmente configuradas como as matrizes de escore de default em programas de computador de alinhamento de sequências. Estes programas incluem PAM250 (Dayhoft M.O. et al., (1978), “A model de evolutionary changes in proteins”, Em “Atlas of Protein sequência and structure” 5(3) M.O. Dayhoft (ed.), 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington, e Blosum 62 (Steven Henikoft e Jorja G. Henikoft (1992), “Amino acid substitution matrices from protein blocks”),), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919. A invenção ainda fornece proteínas de fusão de fórmula (I) contendo substituições conservativas de aminoácidos. Por exemplo, as proteínas de fusão de fórmula (I) podem conter uma substituição conservativa de qualquer aminoácido de PE ou PilA de H. influenzae como descrito em qualquer uma das sequências aqui especificadas (por exemplo, qualquer sequência de PE especificada em SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 57 e/ou qualquer sequência de PilA especificada em SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121)

[00213] Tal como aqui usado “peptídeo de sinal” refere-se a a um polipeptídeo curto (menos do que 60 aminoácidos, por exemplo, 3 a 60 aminoácidos) presentes em proteínas precursoras (tipicamente no N término), e que está tipicamente ausente da proteína madura. O peptídeo de sinal (sp) é tipicamente rico em aminoácidos hidrofóbicos. O peptídeo de sinal dirige o transporte e/ou secreção da proteína traduzida através da membrana. Peptídeos de sinais também pode ser chamados de sinais de alvo-marcação, peptídeos de trânsito, sinais de localização ou sequências de sinal. Por exemplo, a sequência de sinal pode ser um peptídeo de sinal co-traducional ou pós-traducional.

[00214] Um peptídeo de sinal heterólogo pode ser clivado a partir de um construto de proteína de fusão por peptídeo de sinal peptidases durante ou após o transporte ou secreção da proteína. Por exemplo, o peptídeo de sinal peptidase é peptídeo de sinal peptidase I. Um peptídeo de sinal “heterólogo” é um que não é associado com a proteína como ele existe em natureza.

[00215] Tal como aqui usado “tratamento” significa a prevenção de ocorrência de sintomas da condição ou doença em um indivíduo, a prevenção de recorrência de sintomas da condição ou doença em um indivíduo, o atraso de recorrência de sintomas da condição ou doença em um indivíduo, a diminuição em severidade ou frequência de sintomas da condição ou doença em um indivíduo, retardo ou eliminação da progressão da condição e a eliminação parcial ou total de sintomas da condição ou doença em um indivíduo.

[00216] Tal como aqui usado, “opcionalmente” significa que o(s) evento(s) subsequentemente descrito pode ou não ocorrer, e inclui ambo(s) o(s) evento(s) que ocorre(m) e eventos que não ocorrem.

[00217] Todas as referências e pedidos de patentes citados neste relatório descritivo de patente são aqui incorporados por referência.

[00218] Tal como aqui usado ‘infantil’ refere-se a um humano de 0-2 anos de idade.

[00219] Tal como aqui usado ‘adulto’ refere-se a um humano com mais de 18 anos de idade.

[00220] Tal como aqui usado ‘adulto idoso’ refere-se a um humano com mais de 60 anos de idade, opcionalmente mais do que 65 anos de idade.

Exemplos

[00221] Nos exemplos, os seguintes termos tem o significado designado: 6xhis = seis histidinas; xg = força centrífuga (gravidade numérica) ATP = adenosina trifosfato; BCA = ácido bicinconínico; BSA = albumina de soro bovino; °C = graus Celsius; CaCl2 = cloreto de cálcio; CV = volume da coluna; DNA = ácido deoxirribonucleico; DSC = colorimetria diferencial de varredura; DTT = ditiotreitol; dNTP = deoxinucleosídeo trifosfato; EDTA = ácido etilenodiaminatetraacético; FT = fluxo atravessante; HCl = cloreto de hidrogênio; His = his = histidina; HEPES = ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina etanossulfônico; IMAC = cromatografia de afinidade de metal imobilizado; IPTG = isopropil β-D-1-tiogalactopiranosideo; KCl = cloreto de potássio; K2HPO4 = fosfato de potássio dibásico; KH2PO4 = fosfato de potássio monobásico; LDS = dodecil sulfato de lítio; L = litro; MES = ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico; MgCl2 = cloreto de magnésio; ml = mililitro; RPM = revoluções por minuto; min = minuto; mM = milimolar; μL = microlitro; NaCl = cloreto de sódio; Na2HPO4 = fosfato de sódio dibásico; NaH2PO4 = fosfato de sódio monobásico; ng = nanograma; nm = nanômetro; O/N = durante a noite; PBS = solução salina tamponada com fosfato; PCR = reação de cadeia polimerase; SB = tampão de amostra; sec = segundo; p/v = peso/volume PS=polissacarídeo e pode ser usado de modo interpermutável com o termo ‘sacarídeo’.

1. EXEMPLOS Exemplo 1: Proteínas de fusão

[00222] Proteínas de fusão foram produzidas com diferentes peptídeos de sinal E sequências de ligação de aminoácido. Estas proteínas de fusão permitiram a secreção de ambas as Proteínas E PilA (ou seus fragmentos) sem serem limitadas a uma única cepa bacteriana. A proteína de fusão É liberada no periplasma após remoção do peptídeo de sinal heterólogo por uma peptídeo de sinal peptidase. Proteína de fusão purificada A PARTIR da bacteria não contém o peptídeo de sinal heterólogo. as proteínas“Purificadas” são removidas da bactéria E carecem do peptídeo de sinal.

[00223] A seguinte tabela descreve os construtos de proteína de fusão feitos. Tabela 3: construtos de proteína de fusão contendo PilA E Proteína E.

sp = peptídeo de sinal; A.A. = aminoácido As sequências de DNA E de aminoácidos para cada um dos peptídeos de sinal E plasmídeos listados na Tabela 3 são especificadas abaixo. SEQUÊNCIAS DE SINAL: peptídeo de sinal pelB (DNA) - SEQ ID NO. 129: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggcc peptídeo de sinal pelB (Aminoácido) - SEQ ID NO. 130: Mkyllptaaa gllllaaqpa ma peptídeo de sinal FlgI (DNA) - SEQ ID NO. 131: atgattaaatttctctctgcattaattcttctactggtcacgacggcggctcaggct peptídeo de sinal FlgI (Aminoácido) - SEQ ID NO. 132: MIKFLSALIL LLVTTAAQA peptídeo de sinal NadA (DNA) - SEQ ID NO. 133: atgaaacactttccatccaaagtactgaccacagccatccttgccactttctgtagcggcg cactggca peptídeo de sinal NadA (Aminoácido) - SEQ ID NO. 134: MKHFPSKVLT TAILATFCSG ALA CONSTRUÇÃO DE SEQUÊNCIAS DE PROTEÍNA DE FUSÃO:

[00224] A única porção sublinhada das sequências de aminoácidos é de PilA Haemophilus influenzae cepa 86-028NP. A porção sublinhada em negrito das sequências de aminoácidos foi derivada de Proteína E de Haemophilus influenza cepa 772. LVL312 (DNA) - SEQ ID NO. 135: atgattaaatttctctctgcattaattcttctactggtcacgacggcggctcaggctgagact aaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagc acaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatg taaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatatt ttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttc cagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggcgcgcagattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagct ggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatc gatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgttt atcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagt acgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgtt aagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgat aaaaaaggcggccaccaccaccaccaccactaa LVL312 (proteína): (flgI sp)(E)(PilA aa 40-149)(GG)(ProtE aa 18- 160)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 136 MIKFLSALIL LLVTTAAQAE TKKAAVSELL QASAPYKADV ELCVYSTNET TNCTGGKNGI AADITTAKGY VKSVTTSNGA ITVKGDGTLA NMEYILQATG NAATGVTWTT TCKGTDASLF PANFCGSVTQ GGAQIQKAEQ NDVKLAPPTD VRSGYIRLVK NVNYYIDSES IWVDNQEPQI VHFDAVVNLD KGLYVYPEPK RYARSVRQYK ILNCANYHLT QVRTDFYDEF WGQGLRAAPK KQKKHTLSLT PDTTLYNAAQ IICANYGEAF SVDKKGGHHH HHH LVL291 (DNA) - SEQ ID NO. 137: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggcccagattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggata tatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaatt gtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttc gtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggaca gggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgc tgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggt atctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaaca aactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaa caagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggt aatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcg gaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccactaa LVL291 (PROTEÍNA)(pelB sp)(ProtE aa 19-160)(GG)(PilA aa40- 149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 138 MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAQIQKAEQN DVKLAPPTDV RSGYIRLVKN VNYYIDSESI WVDNQEPQIV HFDAVVNLDK GLYVYPEPKR YARSVRQYKI LNCANYHLTQ VRTDFYDEFW GQGLRAAPKK QKKHTLSLTP DTTLYNAAQI ICANYGEAFS VDKKGGTKKA AVSELLQASA PYKADVELCV YSTNETTNCT GGKNGIAADI TTAKGYVKSV TTSNGAITVK GDGTLANMEY ILQATGNAAT GVTWTTTCKG TDASLFPANF CGSVTQGGHH HHHH LVL268 (DNA) - SEQ ID NO. 139: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggccgatattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatat atacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattg tacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcg tcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacag ggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgct gctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggta tctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaa actgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaac aagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggta atgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcgg aagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac LVL268 (PROTEÍNA): (pelB sp)(D)(ProtE aa 20-160)(GG)(PilA aa40- 149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 140: MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MADIQKAEQN DVKLAPPTDV RSGYIRLVKN VNYYIDSESI WVDNQEPQIV HFDAVVNLDK GLYVYPEPKR YARSVRQYKI LNCANYHLTQ VRTDFYDEFW GQGLRAAPKK QKKHTLSLTP DTTLYNAAQI ICANYGEAFS VDKKGGTKKA AVSELLQASA PYKADVELCV YSTNETTNCT GGKNGIAADI TTAKGYVKSV TTSNGAITVK GDGTLANMEY ILQATGNAAT GVTWTTTCKG TDASLFPANF CGSVTQGGHH HHHH LVL269 (DNA) - SEQ ID NO. 141: atgaaacactttccatccaaagtactgaccacagccatccttgccactttctgtagcggcg cactggcagccacaaacgacgacgataaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtac gaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaaga gccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgc acgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaat tttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacg ctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaa agcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaat gaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaat cagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaa gctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagca aatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccactaa LVL269 (proteína): (nadA sp)(ATNDDD)(ProtE aa 22-160)(GG)(PilA aa 40- 149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO.142 MKHFPSKVLT TAILATFCSG ALAATNDDDK AEQNDVKLAP PTDVRSGYIR LVKNVNYYID SESIWVDNQE PQIVHFDAVV NLDKGLYVYP EPKRYARSVR QYKILNCANY HLTQVRTDFY DEFWGQGLRA APKKQKKHTL SLTPDTTLYN AAQIICANYG EAFSVDKKGG TKKAAVSELL QASAPYKADV ELCVYSTNET TNCTGGKNGI AADITTAKGY VKSVTTSNGA ITVKGDGTLA NMEYILQATG NAATGVTWTT TCKGTDASLF PANFCGSVTQ GGHHHHHH LVL270 (DNA) - SEQ ID NO. 143: atgcaccaccaccaccaccacagcgcgcagattcagaaggctgaacaaaatgatgtga agctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtg aatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgta tgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactc aagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacat acgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttca gttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctg atgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagata taaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggca cattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaa aggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaataa LVL270 (proteína): (MHHHHHH)(ProtE aa 17-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ ID NO. 144: MHHHHHHSAQ IQKAEQNDVK LAPPTDVRSG YIRLVKNVNY YIDSESIWVD NQEPQIVHFD AVVNLDKGLY VYPEPKRYAR SVRQYKILNC ANYHLTQVRT DFYDEFWGQG LRAAPKKQKK HTLSLTPDTT LYNAAQIICA NYGEAFSVDK KGGTKKAAVS ELLQASAPYK ADVELCVYST NETTNCTGGK NGIAADITTA KGYVKSVTTS NGAITVKGDG TLANMEYILQ ATGNAATGVT WTTTCKGTDA SLFPANFCGS VTQ LVL315 (DNA) - SEQ ID NO. 145: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggccatggataaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatata cgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtac attttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtca gtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggt ttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgct cagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatct gaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaac tgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaa gcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaat gctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaa gtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccactaa LVL315 (proteína): (pelB sp)(MD)(ProtE aa 22-160)(GG)(PilA aa40- 149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 146: MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAMDKAEQND VKLAPPTDVR SGYIRLVKNV NYYIDSESIW VDNQEPQIVH FDAVVNLDKG LYVYPEPKRY ARSVRQYKIL NCANYHLTQV RTDFYDEFWG QGLRAAPKKQ KKHTLSLTPD TTLYNAAQII CANYGEAFSV DKKGGTKKAA VSELLQASAP YKADVELCVY STNETTNCTG GKNGIAADIT TAKGYVKSVT TSNGAITVKG DGTLANMEYI LQATGNAATG VTWTTTCKGT DASLFPANFC GSVTQGGHHH HHH LVL317 (DNA) - SEQ ID NO. 147: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggcccagattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggata tatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaatt gtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttc gtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggaca gggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgc tgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggt atctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaaca aactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaa caagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggt aatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcg gaagtgtcacacaataa LVL317 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 19-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ ID NO. 148: MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAQIQKAEQN DVKLAPPTDV RSGYIRLVKN VNYYIDSESI WVDNQEPQIV CGSVTQ LVL318 (DNA) - SEQ ID NO. 149: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggccatggataaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatata cgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtac attttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtca gtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggt ttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgct cagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatct gaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaac tgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaa gcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaat gctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaa gtgtcacacaataa LVL318 (proteína): (pelB sp)(MD)(ProtE aa 22-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ ID NO. 150: MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAMDKAEQND VKLAPPTDVR SGYIRLVKNV NYYIDSESIW VDNQEPQIVH FDAVVNLDKG LYVYPEPKRY ARSVRQYKIL NCANYHLTQV RTDFYDEFWG QGLRAAPKKQ KKHTLSLTPD TTLYNAAQII CANYGEAFSV DKKGGTKKAA VSELLQASAP YKADVELCVY STNETTNCTG GKNGIAADIT TAKGYVKSVT TSNGAITVKG DGTLANMEYI LQATGNAATG VTWTTTCKGT DASLFPANFC GSVTQ LVL702 (DNA) - SEQ ID NO. 181: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggccattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatata cgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtac attttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtca gtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggt ttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgct cagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatct gaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaac tgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaa gcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaat gctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaa gtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac LVL702 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 20-160)(GG)(PilA aa40- 149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 182: MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MA IQKAEQND VKLAPPTDVR SGYIRLVKNV NYYIDSESIW VDNQEPQIVH FDAVVNLDKG LYVYPEPKRY ARSVRQYKIL NCANYHLTQV RTDFYDEFWG QGLRAAPKKQ KKHTLSLTPD TTLYNAAQII CANYGEAFSV DKKGGTKKAA VSELLQASAP YKADVELCVY STNETTNCTG GKNGIAADIT TAKGYVKSVT TSNGAITVKG DGTLANMEYI LQATGNAATG VTWTTTCKGT DASLFPANFC GSVTQGGHHH HHH LVL736 (DNA) - SEQ ID NO. 183: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggccagcgcccagattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaag cggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagcca caaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgtt ctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttgg ggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgcttta taatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagca gcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaa caacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagt gacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagcta caggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaattt ttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac LVL736 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 17-160)(GG)(PilA aa40- 149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 184: MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MASAQIQKAE QNDVKLAPPT DVRSGYIRLV KNVNYYIDSE SIWVDNQEPQ IVHFDAVVNL DKGLYVYPEP KRYARSVRQY KILNCANYHL TQVRTDFYDE FWGQGLRAAP KKQKKHTLSL TPDTTLYNAA QIICANYGEA FSVDKKGGTK KAAVSELLQA SAPYKADVEL CVYSTNETTN CTGGKNGIAA DITTAKGYVK SVTTSNGAIT VKGDGTLANM EYILQATGNA ATGVTWTTTC KGTDASLFPA NFCGSVTQGG HHHHHH LVL737 (DNA) - SEQ ID NO. 185: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggccgcccagattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcg gatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccaca aattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttct gttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggg gacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttat aatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagca gcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaa caacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagt gacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagcta caggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaattt ttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac LVL737 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 18-160)(GG)(PilA aa40- 149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 186: MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAAQIQKAEQ NDVKLAPPTD VRSGYIRLVK NVNYYIDSES IWVDNQEPQI LVL738 (DNA) - SEQ ID NO. 187: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggccaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttg gtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttg atgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtata agatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgc gggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcaga ttatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaatt actgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtac gggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaac ggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgc aacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtc acacaaggcggccaccaccaccaccaccac LVL738 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 22-160)(GG)(PilA aa40- 149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 188: MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAKAEQNDVK LAPPTDVRSG YIRLVKNVNY YIDSESIWVD NQEPQIVHFD AVVNLDKGLY VYPEPKRYAR SVRQYKILNC ANYHLTQVRT DFYDEFWGQG LRAAPKKQKK HTLSLTPDTT LYNAAQIICA NYGEAFSVDK KGGTKKAAVS ELLQASAPYK ADVELCVYST NETTNCTGGK NGIAADITTA KGYVKSVTTS NGAITVKGDG TLANMEYILQ ATGNAATGVT WTTTCKGTDA SLFPANFCGS VTQGGHHHHHH LVL739 (DNA) - SEQ ID NO. 189: ATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGC TGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCCGCTGAACAAAATGATG TGAAGCTGGCACCGCCGACTGATGTACGAAGCGGATATATACGTT TGGTAAAGAATGTGAATTATTACATCGATAGTGAATCGATCTGGGT GGATAACCAAGAGCCACAAATTGTACATTTTGATGCAGTGGTGAA TTTAGATAAGGGATTGTATGTTTATCCTGAGCCTAAACGTTATGCA CGTTCTGTTCGTCAGTATAAGATCTTGAATTGTGCAAATTATCATTT AACTCAAGTACGAACTGATTTCTATGATGAATTTTGGGGACAGGGT TTGCGGGCAGCACCTAAAAAGCAAAAGAAACATACGTTAAGTTTA ACACCTGATACAACGCTTTATAATGCTGCTCAGATTATTTGTGCGA ACTATGGTGAAGCATTTTCAGTTGATAAAAAAGGCGGCACTAAAA AAGCAGCGGTATCTGAATTACTGCAAGCGTCAGCGCCTTATAAGG CTGATGTGGAATTATGTGTATATAGCACAAATGAAACAACAAACT GTACGGGTGGAAAAAATGGTATTGCAGCAGATATAACCACAGCAA AAGGCTATGTAAAATCAGTGACAACAAGCAACGGTGCAATAACAG TAAAAGGGGATGGCACATTGGCAAATATGGAATATATTTTGCAAG CTACAGGTAATGCTGCAACAGGTGTAACTTGGACAACAACTTGCA AAGGAACGGATGCCTCTTTATTTCCAGCAAATTTTTGCGGAAGTGT CACACAAGGCGGCCACCACCACCACCACCAC LVL739 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 23-160)(GG)(PilA aa40- 149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 190: MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK GGTKKAAVSE LLQASAPYKA DVELCVYSTN ETTNCTGGKN GIAADITTAK GYVKSVTTSN GAITVKGDGT LANMEYILQA TGNAATGVTW TTTCKGTDAS LFPANFCGSV TQGGHHHHHH LVL740 (DNA) - SEQ ID NO. 191: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggccgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaag aatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagt ggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttg aattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagc acctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtg cgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaa gcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtgg aaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgca ataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggt gtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaag gcggccaccaccaccaccaccac LVL740 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 24-160)(GG)(PilA aa40- 149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 192: MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAEQNDVKLA PPTDVRSGYI RLVKNVNYYI DSESIWVDNQ EPQIVHFDAV VNLDKGLYVY PEPKRYARSV RQYKILNCAN YHLTQVRTDF YDEFWGQGLR AAPKKQKKHT LSLTPDTTLY NAAQIICANY GEAFSVDKKG GTKKAAVSEL LQASAPYKAD VELCVYSTNE TTNCTGGKNG IAADITTAKG YVKSVTTSNG AITVKGDGTL ANMEYILQAT GNAATGVTWT TTCKGTDASL FPANFCGSVT QGGHHHHHH LVL735 (DNA) - SEQ ID NO. 193: ATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCG CTGCCCAGCCGGCGATGGCCATTCAGAAGGCTGAACAAAATGATG TGAAGCTGGCACCGCCGACTGATGTACGAAGCGGATATATACGTT TGGTAAAGAATGTGAATTATTACATCGATAGTGAATCGATCTGGGT GGATAACCAAGAGCCACAAATTGTACATTTTGATGCAGTGGTGAA TTTAGATAAGGGATTGTATGTTTATCCTGAGCCTAAACGTTATGCA CGTTCTGTTCGTCAGTATAAGATCTTGAATTGTGCAAATTATCATTT AACTCAAGTACGAACTGATTTCTATGATGAATTTTGGGGACAGGGT TTGCGGGCAGCACCTAAAAAGCAAAAGAAACATACGTTAAGTTTA ACACCTGATACAACGCTTTATAATGCTGCTCAGATTATTTGTGCGA ACTATGGTGAAGCATTTTCAGTTGATAAAAAAGGCGGCACTAAAA AAGCAGCGGTATCTGAATTACTGCAAGCGTCAGCGCCTTATAAGG CTGATGTGGAATTATGTGTATATAGCACAAATGAAACAACAAACT GTACGGGTGGAAAAAATGGTATTGCAGCAGATATAACCACAGCAA AAGGCTATGTAAAATCAGTGACAACAAGCAACGGTGCAATAACAG TAAAAGGGGATGGCACATTGGCAAATATGGAATATATTTTGCAAG CTACAGGTAATGCTGCAACAGGTGTAACTTGGACAACAACTTGCA AAGGAACGGATGCCTCTTTATTTCCAGCAAATTTTTGCGGAAGTGT CACACAA LVL735 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 20-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ ID NO. 194: MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA NYYIDSESIW MAIQKAEQND VDNQEPQIVH VKLAPPTDVR SGYIRLVKNV FDAVVNLDKG LYVYPEPKRY ARSVRQYKIL NCANYHLTQV RTDFYDEFWG QGLRAAPKKQ KKHTLSLTPD TTLYNAAQII CANYGEAFSV DKKGGTKKAA VSELLQASAP YKADVELCVY STNETTNCTG GKNGIAADIT TAKGYVKSVT TSNGAITVKG DGTLANMEYI LQATGNAATG VTWTTTCKGT DASLFPANFC GSVTQ LVL778 (DNA) - SEQ ID NO. 195: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggccagcgcccagattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaag cggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagcca caaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgtt ctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttgg ggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgcttta taatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagca gcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaa caacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagt gacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagcta caggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaattt ttgcggaagtgtcacacaa LVL778 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 17-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ ID NO. 196: MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MASAQIQKAE QNDVKLAPPT DVRSGYIRLV KNVNYYIDSE SIWVDNQEPQ NFCGSVTQ LVL779 (DNA) - SEQ ID NO. 197: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggccgcccagattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcg gatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccaca aattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttct gttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggg gacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttat aatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagca gcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaa caacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagt gacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagcta caggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaattt ttgcggaagtgtcacacaa LVL779 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 18-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ ID NO. 198: MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAAQIQKAEQ NDVKLAPPTD VRSGYIRLVK NVNYYIDSES IWVDNQEPQI VHFDAVVNLD KGLYVYPEPK RYARSVRQYK ILNCANYHLT QVRTDFYDEF WGQGLRAAPK KQKKHTLSLT PDTTLYNAAQ IICANYGEAF SVDKKGGTKK AAVSELLQAS APYKADVELC VYSTNETTNC TGGKNGIAAD ITTAKGYVKS VTTSNGAITV KGDGTLANME YILQATGNAA TGVTWTTTCK GTDASLFPAN FCGSVTQ LVL780 (DNA) - SEQ ID NO. 199: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggccaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttg gtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttg atgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtata agatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgc gggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcaga ttatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaatt actgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtac gggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaac ggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgc aacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtc acacaa LVL780 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 22-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ ID NO. 200: MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAKAEQNDVK LAPPTDVRSG YIRLVKNVNY YIDSESIWVD NQEPQIVHFD AVVNLDKGLY VYPEPKRYAR SVRQYKILNC ANYHLTQVRT DFYDEFWGQG LRAAPKKQKK HTLSLTPDTT LYNAAQIICA NYGEAFSVDK KGGTKKAAVS ELLQASAPYK ADVELCVYST NETTNCTGGK NGIAADITTA KGYVKSVTTS NGAITVKGDG TLANMEYILQ ATGNAATGVT WTTTCKGTDA SLFPANFCGS VTQ LVL781 (DNA) - SEQ ID NO. 201: Atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggccgctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggta aagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatg cagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataaga tcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcggg cagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattat ttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattact gcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgg gtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacgg tgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaac aggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcaca caa LVL781 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 23-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ ID NO. 202: MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK GGTKKAAVSE LLQASAPYKA DVELCVYSTN ETTNCTGGKN GIAADITTAK GYVKSVTTSN GAITVKGDGT LANMEYILQA TGNAATGVTW TTTCKGTDAS LFPANFCGSV TQ LVL782 (DNA) - SEQ ID NO. 203: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggccgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaag aatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagt ggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttg aattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagc acctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtg cgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaa gcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtgg aaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgca ataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggt gtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaa LVL782 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 24-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ ID NO. 204: MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAEQNDVKLA PPTDVRSGYI RLVKNVNYYI DSESIWVDNQ EPQIVHFDAV VNLDKGLYVY PEPKRYARSV RQYKILNCAN YHLTQVRTDF YDEFWGQGLR AAPKKQKKHT LSLTPDTTLY NAAQIICANY GEAFSVDKKG GTKKAAVSEL LQASAPYKAD VELCVYSTNE TTNCTGGKNG IAADITTAKG YVKSVTTSNG AITVKGDGTL ANMEYILQAT GNAATGVTWT TTCKGTDASL FPANFCGSVT Q

[00225] A sequência de comprimento completo para PE e PilA a partir das quais as sequências acima foram obtidas são especificadas em SEQ ID NO. 4 (PE) E SEQ ID NO. 58 (PilA), respectivmente.

Exemplo 2: Construção e transformação do vetor

[00226] Iniciadores para amplificar PE H. influenzae cepa 772 foram projetados com base na sequência de H. influenzae cepa Hi Rd. A sequência de iniciador 5’ contém uma diferença de nucleotídeos comparada com a sequência NTHi 772, introduzindo uma diferença de aminoácidos na posição 24 quando comparada com a sequência de genoma NTHi 772 atualmente reportada. Aminoácido #24 nos construtos de proteína de fusão é E (ácido glutâmico) em vez de K (lisina) como encontrado em NTHi 772. Sequência de DNA para PE de H. influenzae cepa Rd. - SEQ ID NO. 151 atgaaaaaaattattttaacattatcacttgggttacttaccgcttgttctgctcaaatccaaa aggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaat gtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgctgtggt gaatttagataggggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagattttgaatt gtgcaaattatcatttaactcaaatacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacct aaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcaaa ttatggtaaagcattttcagttgataaaaaataa Sequência de proteína para PE DE H. influenzae cepa Rd. - SEQ ID NO. 152 MKKIILTLSL GLLTACSAQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDRGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQIRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGKAFSVDKK Sequência de DNA para PE de H. influenzae cepa 772 (como especificado em: Microbes & Infection, Corrigendum to “Identification of a novel Haemophilus influenzae protein important for adhesion to epithelia cells” [Microbes Infect. 10 (2008) 87-97], disponível online 6 de julho de 2010, “artigo no prelo”)) - SEQ ID NO. 153 atgaaaaaaattattttaacattatcacttgggttacttactgcctgttctgctcaaatccaaa aggctaaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaat gtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtgg tgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaa ttgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcac ctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcg aactatggtgaagcattttcagttgataaaaaa Sequência de proteína para PE de H. influenzae cepa 772 (como especificado em: Microbes & Infection, Corrigendum to “Identification of a novel Haemophilus influenzae protein important for adhesion to epithelia cells” [Microbes Infect. 10 (2008) 87-97], disponível on line 6 de julho de 2010, “artigo no prelo”)) - SEQ ID NO. 154 MKKIILTLSL GLLTACSAQI QKAKQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK

Construção de vetor:

[00227] Para gerar LVL312, LVL291, LVL268, LVL269, LVL270, LVL702, LVL735, LVL778, LVL779, LVL780, LVL781 e LVL782, a preparação de reação de cadeia polimerase (PCR) dos seguintes componentes foi preparada (componentes específicos são subsequentemente exemplificados): 36,6 μl de água deionizada, 5 μl de tampão #1 10X, 5 μl de dNTPs 2mM, 2 μl MgCl2 25 mM, 0,4 μl de iniciador #1 (50 μM), 0,4 μl de iniciador #2 (50 μM), 0,5 μl de gabarito (100 ng/μl) e 0,4 μl de KOD HiFi DNA polimerase 2,5 unidades/μl (NOVAGEN®) foram formulados. Reação de cadeia polimerase envolveu 25 ciclos de 15 segundos de desnaturação a 98°C, 2 segundos para anelamento a 55°C e 20 segundos de extensão de iniciador a 72°C. Os produtos PCR foram purificados usando kit de purificação QIAQUICK® PCR (QIAGEN®). Este produto foi usado sob condições recomendadas pelo fornecedor que foram: a adição de 5 volumes Tampão PB, fornecido no kit de purificação QIAQUICK® PCR, para 1 volume da preparação de PCR. A preparação de PCR com Tampão PB foi subsequentemente misturada por vórtice. Uma coluna QIAQUICK® foi colocada em um tubo de coleta de2 ml. Para ligar DNA na preparação de PCR na coluna, a amostra misturada foi aplicada à coluna QIAQUICK® e centrifugada durante 30-60 segundos a 14 000 RPM. O fluxo atravessante foi descartado e a coluna QIAQUICK ® foi colocada de volta no mesmo tubo. Para lavar o DNA ligado, 0,75 ml Tampão PE, fornecido no kit de purificação QIAQUICK ® PCR, foi adicionado na coluna QIAQUICK ®, e a coluna foi centrifugada durante 30-60 segundos a 14 000 RPM. O fluxo atravessante foi descartado e a coluna QIAQUICK ® foi colocada de volta no mesmo tubo. A coluna QIAQUICK ® foi centrifugada uma vez mis no tubo de coleta de 2 ml durante 1 minuto para remover a água de lavagem residual. Cada coluna QIAQUICK ® foi colocada em um tubo de microcentrifuga de 1,5 ml. Para eluir o DNA, 33 μl de água foram adicionados para o centro da membrana de QIAQUICK ® e a coluna foi centrifugada durante 1 minuto a 14 000 RPM. Enzimas de restrição e tampão relacionados foram obtidos a partir de New England BioLabs. Por exemplo, aproximadamente 5 μl de vetor pET26b (100 ng/μl), 2 μl de Tampão NE 2 (New England Biolabs, 1X NE Tampão 2: 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol, pH 7,9 a 25°C), 1 μl de NdeI (20 000 unidades/ml), 1 μl de HindIII (20 000 unidades/ml) e 11 μl de água deionizada foram misturados e incubados durante 2 horas a 37°C para digestão de DNA. A seguir uma segunda etapa de purificação foi realizada usando o kit de purificação PCR QIAQUICK ® (QIAGEN®) com o procedimento descrito acima.

[00228] Ligação foi realizada usando Quick T4 DNA ligase e tampão de reação Quick Ligação Reação a partir de New England BioLabs. Por exemplo, em torno de 10 ng de vetor e 30 ng de inserto em 10 μl de água deionizada foram misturados com 10 μl de tampão de reação 2X Quick Ligação (New England Biolabs, 132 mM Tris-HCl, 20 mM MgCl2, 2mM ditiotreitol, 2 mM ATP, 15% polietileno glicol, pH 7,6 a 25°C) e 1 μl de DNA ligase Quick T4 (New England Biolabs). A reação enzimática foi incubada durante 5 minutos em temperatura ambiente antes da transformação.

[00229] Para gerar LVL315, LVL317, LVL318, LVL736, LVL737, LVL738, LVL739 e LVL740, a preparação de PCR dos seguintes componentes foi preparada: 40 μl de água deionizada, 5 μl de tampão de reação 10X, 1 μl de dNTPs mix, 1 μl de iniciador #1 (10 μM), 1 μl de iniciador #2 (10 μM), 1 μl de gabarito (25 ng/μl) e 1 μl de PfuUltra High- Fidelity DNA polimerase 2,5 unidades/μl (kit de mutagenese sítio-dirigida QuikChange II, Agilent Technologies, Stratagene Division) foram formulados. Reação de cadeia polimerase envolveu um ciclo de desnaturação a 95°C durante 30 s, 18 ciclos de 30 s de desnaturação a 95°C, 1 min para anelamento a 55°C e 5 min 30 s de extensão de iniciador a 68°C. Os produtos de PCR foram digeridos usando 1 μl de enzima de restrição DpnI a 37°C durante uma hora antes da transformação.

[00230] Uma lista detalhada de sequências de iniciadores PCR usados para as amplificações é ilustrada em Tabela 4.

[00231] Para gerar pRIT16711, o fragmento de gene de PE codificando para aminoácidos 22 a 160 de SEQ ID NO. 4, que exclui a sequência codificando para seu sinal de secreção correspondente, foi amplificado por PCR a partir de DNA genômico de NTHi cepa 772. Os iniciadores de amplificação foram projetados com base na sequência disponível de cepa Hi Rd (neste momento, a sequência 772 não era conhecida). A sequência de iniciador 5’ contém uma mutação comparada com a sequência NTHi 772 (sequência agora disponível), introduzindo uma diferença de aminoácido na PE sequência de codificação na posição 24, ácido glutâmico (E) em vez de lisina (K). Após a amplificação PCR, o inserto foi clonado no vetor de expressão pET-26(+) (NOVAGEN®) usando sítios de restrição BamHI e XhoI.

[00232] Para gerar pRIT16671, um fragmento de DNA codificando para fragmento de gene de PilA (aminoácidos 40 a 149 de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127), que exclui seu peptídeo líder, assim como uma porção da alfa hélica hidrofóbica prevista, foi amplificado a partir de DNA genômico de NTHi cepa 86-028NP e clonado no vetor de expressão de pET15. O vetor pRIT16790 (contendo aminoácidos 40 a 149 a partir de NTHi cepa 86- 028NP) foi usado como um gabarito para gerar o vetor pRIT16671. O fragmento de gene de PilA foi amplificado por PCR usando o vetor pRIT16790 e iniciadores MDES PILA-3 e MDES PILA-4. O fragmento de PilA foi clonado no vetor de expressão pET-26 usando sítios de restrição NdeI / XhoI. A sequência de DNA codificando aminoácidos de seis histidinas (his) foi incorporada no iniciador 5’ para adicionar seis histidians (6xhis) na extremidade N-terminal da sequência de PilA (MDES PILA-3).

[00233] Para gerar LVL312 (peptídeo de sinal FlgI -E-fragmento de PilA-GG-fragmento de PE-GGHHHHHH), a reação de cadeia polimerase foi realizada para amplificar o gene de PilA (aminoácidos 40-149 / cepa 86- 028NP) usando o vetor pRIT16671 como um gabarito e iniciadores CAN534 e CAN537. Sequência de DNA correspondendo a peptídeo de sinal FlgI (sp) e aminoácido de ácido glutâmico (E) foi incorporada no iniciador 5’ (CAN534). Para ligar a sequência de PilA à sequência de PE, Sequência de DNA correspondendo aos ligadores de dois aminoácidos de glicina (GG) e os amonoácidos PE N-terminais foram incorporados no iniciador 3’ (CAN537). Outra reação de cadeia polimerase foi realizada para amplificar os genes de PE (aminoácidos 18-160) usando vetor pRIT16711 como um gabarito e iniciadores CAN536 e CAN538. Sequências de DNA correspondendo aos aminoácidos PilA C-terminais e aminoácidos GG foram incorporadas no iniciador 5’ para ligar pilA à sequência de PE (CAN536). Sequências de DNA correspondendo aos ligadores de aminoácidos GG e aminoácidos 6xhis foram incorporadas no iniciador 3’ (CAN538). Finalmente, para gerar LVL312, uma terceira reação de cadeia polimerase foi realizada para amplificar os genes de PilA e PE em fusão com o peptídeo de sinal FlgI no N-término, para aminoácido de ácido glutâmico (E) entre FlgI e pilA, um ligador de GG entre sequências de PilA e PE e um ligador de GG entre PE e os aminoácidos 6xhis no C-término. Para obter esta amplificação, os produtos das duas reações de cadeia polimerase descritas acima foram usados como um gabarito com iniciadores CAN534 e CAN538. Sequências de DNA correspondendo a sítio de restrição NdeI foram incorporadas no iniciador 5’ e sítio de restrição HindIII foi incorporado em iniciador 3’. O produto de PCR gerado foi então inserido no vetor de clonagem pET-26b(+) (NOVAGEN®).

[00234] Para gerar LVL291 (pelB peptídeo de sinal-fragmento de PE- GG-fragmento de PilA-GG-6xhis), a reação de cadeia polimerase foi realizada para amplificar os genes de PE (aminoácidos 19-160) usando o vetor pRIT16711 como um gabarito e iniciadores CAN544 e CAN546. Sequência de DNA correspondendo a aminoácidos de peptídeo de sinal (sp) de pelB foi incorporada no iniciador 5’ (CAN544). Para ligar a PilA sequência à sequência de PE, sequência de DNA correspondendo a ligadores de aminoácidos GG e os aminoácidos PilA N-terminais foram incorporadas no iniciador 3’ (CAN546). Outra reação de cadeia polimerase foi realizada para amplificar os genes de PilA (aminoácidos 40-149 de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127) usando o vetor pRIT16671 como um gabarito com iniciadores CAN545 e CAN535. Sequência de DNA correspondendo aos aminoácidos PE C-terminais e aminoácidos GG foram incorporadas no iniciador 5’ (CAN545) para ligar a sequência de PilA à sequência de PE. Sequências de DNA correspondendo aos ligadores de aminoácidos GG e aminoácidos 6xhis foram incorporadas no iniciador 3’ (CAN535). Finalmente, para gerar LVL291, uma terceira reação de cadeia polimerase foi realizada para amplificar os genes de PE e PilA em fusão com o peptídeo de sinal pelB no N-término, um ligador de GG entre as sequências de PE e PilA e um ligador de GG entre aminoácidos PilA e 6xhis no C-término. Para obter esta amplificação, os produtos de duas reações de cadeia polimerase descritas acima foram usados como um gabarito com iniciadores CAN544 e CAN535. Sequência de DNA correspondendo a sítio de restrição NdeI foi incorporada no iniciador 5’ e sítio de restrição HindIII foi incorporada no iniciador 3’. O produto de PCR gerado foi então inserido no vetor de clonagem pET-26b(+) (NOVAGEN®).

[00235] Para gerar LVL268 (peptídeo de sinal pelB -D-fragmento de PE-GG-fragmento de PilA-GG-6xhis), yna reação de cadeia polimerase foi realizada para amplificar o gene de PE (aminoácidos 20-160) usando o vetor pRIT16711 como um gabarito com iniciadores CAN547 e CAN546. Sequências de DNA correspondendo aos aminoácidos peptídeo de sinal pelB (sp) e aminoácidos ácido aspártico (D) foram incorporadas no iniciador 5’ (CAN547). Para ligar a sequência de PilA à sequência de PE, sequência de DNA correspondendo a ligador de aminoácidos GG e aminoácidos PilA N- terminais foram incorporados no iniciador 3’ (CAN546). Outra reação de cadeia polimerase foi realizada para amplificar os gene de PilA (aminoácidos 40-149 / NTHi cepa 86-028NP) usando o vetor pRIT16671 como um gabarito com CAN545 e CAN535. Sequências de DNA correspondendo aos aminoácidos PE C-terminais e aminoácidos GG foram incorporadas no iniciador 5’ (CAN545) para ligar a sequência de PilA à sequência de PE. Sequências de DNA correspondendo a ligador de aminoácidos GG e aminoácidos 6xhis foram incorporadas no iniciador 3’ (CAN535). Finalmente, para gerar LVL268, uma terceira reação de cadeia polimerase foi realizada para amplificar os genes de PE e PilA em fusão com o peptídeo de sinal pelB no N-término, um aminoácido D entre peptídeo de sinal pelB e PE, um ligador de GG entre sequências de PE e PilA e um ligador GG entre aminoácidos PilA e 6xhis em C-termo. Para obter esta amplificação, os produtos das duas reações de cadeia polimerase descritas acima foram usados como um gabarito com iniciadores CAN547 e CAN535. Sequência de DNA correspondendo a NdeI sítio de restrição foi incorporada no iniciador 5’ e sítio de restrição HindIII foi incorporado em iniciador 3’. O produto de PCR gerado foi então inserido no vetor de clonagem pET-26b(+) (NOVAGEN®).

[00236] Para gerar LVL269 (peptídeo de sinal NadA -ATNDDD- fragmento de PE-GG-fragmento de PilA-GG-6xhis), a reação de cadeia polimerase foi realizada para amplificar os genes de PE (aminoácidos 22-160 de SEQ ID NO. 4) usando o vetor pRIT16711 como um gabarito com iniciadores CAN548 e CAN546. Sequências de DNA correspondendo aminoácidos peptídeo de sinal pelB (sp) e aminoácidos ATNDDD foram incorporadas em iniciador 5’ (CAN548). Para ligar a sequência de PilA à sequência de PE, sequência de DNA correspondendo aos ligadores de aminoácidos GG e os aminoácidos PilA N-terminais foram incorporados no iniciador 3’ (CAN546). Outra reação de cadeia polimerase foi realizada para amplificar os genes de PilA (aminoácidos 40-149 de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127) usando o vetor pRIT16671 como um gabarito com iniciadores CAN545 e CAN535. Sequências de DNA correspondendo aos aminoácidos PE C-terminais e aminoácidos GG foram incorporadas no iniciador 5’ para ligar a sequência de PilA à sequência de PE (CAN545). Sequências de DNA correspondendo a um ligador de aminoácidos GG e aminoácidos 6xhis foram incorporadas no iniciador 3’ (CAN535). Finalmente, para gerar LVL269, uma terceira reação de cadeia polimerase foi realizada para amplificar os genes de PE e PilA em fusão com o peptídeo de sinal NadA no N-término, aminoácidos ATNDDD entre o peptídeo de sinal pelB e PE, um ligador de GG entre as sequências de PE e PilA e um ligador de GG entre aminoácidos PilA e 6xhis no C-término. Para obter esta amplificação, os produtos das duas reações de cadeia polimerase descritos acima foram usados como um gabarito com iniciadores CAN548 e CAN535. Sequência de DNA correspondendo a sítio de restrição NdeI foi incorporada no iniciador 5’ e sítio de restrição HindIII foi incorporado no iniciador 3’. O produto de PCR gerado foi então inserido no vetor de clonagem pET-26b(+) (NOVAGEN®).

[00237] Para gerar LVL270 (M-6xHis-fragmento de PE-GG-PilA fragment), a reação de cadeia polimerase foi realizada para amplificar o gene de PE (aminoácidos 17-160) usando o vetor pRIT16711 como um gabarito com iniciadores CAN540 e CAN542. Sequências de DNA correspondendo a 6xhis aminoácidos foram incorporadas no iniciador 5’ (CAN540). Para ligar a sequência de PilA à sequência de PE, sequências de DNA correspondendo ao ligador de aminoácidos GG e os aminoácidos de PilA N-terminais foram incorporadas no iniciador 3’ (CAN542). Outra reação de cadeia polimerase foi realizada para amplificar o gene de PilA (aminoácidos 40-149 / NTHi cepa 86-028NP) usando vetor pRIT16671 como um gabarito com iniciadores CAN541 e CAN543. Sequência de DNA correspondendo aos aminoácidos PE C-terminais e aminoácidos GG foram incorporadas no iniciador 5’ (CAN541) para ligar PilA à sequência de PE. Finalmente, para gerar LVL270, uma terceira reação de cadeia polimerase foi realizada para amplificar os genes 6- his-PE-GG-PilA em fusão. Para obter esta amplificação, os produtos das duas reações de cadeia polimerase descritas acima foram usados como um gabarito com iniciadores CAN540 e CAN543. Sequência de DNA correspondendo a sítio de restrição NdeI foi incorporada no iniciador 5’ e sítio de restrição HindIII foi incorporado no iniciador 3’. O produto de PCR gerado foi então inserido no vetor pET-26b(+) vetor de clonagem (NOVAGEN®).

[00238] Para gerar LVL315 (peptídeo de sinal pelB -MD-fragmento de PE-GG-fragmento de PilA-GG-6xhis), uma mutagenese sítio-dirigida foi realizada para mudar a sequência de aminoácidos PE N-terminais a partir de QIQ a MD usando LVL291 como um gabarito com iniciadores CAN670 e CAN671 e o kit de mutagenese sítio-dirigida QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).

[00239] Para gerar LVL317 (peptídeo de sinal pelB -fragmento de PEGG- fragmento de pilA), uma mutagenese sítio-dirigida foi realizada para incorporar um códon de parada entre o gene de PilA e a Sequência de DNA correspondendo a resíduos de aminoácidos GGHHHHHH (SEQ ID NO: 3) usando LVL291 como um gabarito com iniciadores CAN678 e CAN679 e o kit de mutagenese sítio-dirigida QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).

[00240] Para gerar LVL318 (peptídeo de sinal pelB -MD-PE-GG- PilA), uma mutagenese sítio-dirigida foi realizada para incorporar um códon de parada entre o gene de PilA e a sequência de DNA correspondendo a resíduos de aminoácidos GGHHHHHH (SEQ ID NO: 3) usando LVL315 como um gabarito com iniciadores CAN678 e CAN679 e o kit de mutagenese sítio-dirigida QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).

[00241] Para gerar LVL702 (LVL291 ΔQ), a reação de cadeia polimerase foi realizada usando o vetor LVL291 como gabarito e iniciadores CAN1517 e CAN1518. Deleção de três nucleotídeos correspondendo ao aminoácido Q na posição 23 em sequência LVL291 foi incorporada no iniciador 5’. A única diferença entre LVL702 e LVL291 é a deleção de aminoácido Q na posição 23 em sequência LVL291. Os sítios de restrição NdeI e HindIII foram incorporados em iniciadores 5’ e 3’ respectivamente. O produto de PCR gerado foi então inserido no vetor de clonagem pET-26b(+) (NOVAGEN®).

[00242] Para gerar LVL735 (LVL317 ΔQ), a reação de cadeia polimerase foi realizada usando o vetor LVL317 como gabarito e iniciadores CAN1517 e CAN1519. Deleção de três nucleotídeos correspondendo ao aminoácido Q na posição 23 em sequência LVL317 foi incorporada ao iniciador 5’. A única diferença entre LVL735 e LVL317 é a deleção de aminoácido Q na posição 23 em sequência LVL317. Os sítios de restrição NdeI e HindIII foram incorporados em iniciadores 5’ e 3’ respectivamente. O produto de PCR gerado foi então inserido no vetor de clonagem pET-26b(+) (NOVAGEN®).

[00243] Para gerar LVL736 (LVL291 + SA), uma mutagenese sítio- dirigida foi realizada para adiconar aminoácidos S e A entre aminoácidos 22 e 23 em sequência LVL291. LVL291 foi usado como gabarito com iniciadores CAN1531 e CAN1532 e o kit de mutagenese sítio-dirigida QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).

[00244] Para gerar LVL737 (LVL291 + A), uma mutagenese sítio- dirigida foi realizada para adicionar aminoácido A entre aminoácidos 22 e 23 em sequência LVL291. LVL291 foi usado como gabarito com iniciadores CAN1529 e CAN1530 e o kit de mutagenese sítio-dirigida QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).

[00245] Para gerar LVL738 (LVL291 ΔQIQ), uma mutagenese sítio- dirigida foi realizada para deletar os aminoácidos Q, I e Q na posiçãos 23 a 25 em sequência LVL291. LVL291 foi usado como gabarito com iniciadores CAN1523 e CAN1524 e o kit de mutagenese sítio-dirigida QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).

[00246] Para gerar LVL739 (LVL291 ΔQIQK), uma mutagenese sítio- dirigida foi realizada para deletar aminoácidos Q, I, Q e K nas posições 23 a 26 em sequência LVL291. LVL291 foi usado como gabarito com iniciadores CAN1525 e CAN1526 e o kit de mutagenese sítio-dirigida QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).

[00247] Para gerar LVL740 (LVL291 ΔQIQKA), uma mutagenese sítio-dirigida foi realizada para deletar aminoácidos Q, I, Q, K e A nas posições 23 a 27 em sequência LVL291. LVL291 foi usado como gabarito com iniciadores CAN1527 e CAN1528 e o kit de mutagenese sítio-dirigida QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).

[00248] Para gerar LVL778 (LVL736 Δ6xHis tag), LVL779 (LVL737 Δ6xHis tag), LVL780 (LVL738 Δ6xHis tag), LVL781 (LVL739 Δ6xHis tag) e LVL782 (LVL740 Δ6xHis tag) a reação de cadeia polimerase foi realizada usando os vetores LVL736, LVL737, LVL738, LVL739 e LVL740 como gabarito, respectivamente, com iniciadores CAN1669 e CAN543. Deleção de 6xHis tag corresponde à e sequência de aminoácidos GGHHHHHH (SEQ ID NO. 3) na sequências C-terminais. Esta deleção foi incorporada para o iniciador 3’. Os sítios de restrição NdeI e HindIII foram incorporados em iniciadores 5’ e 3’ respectivamente. O produto de PCR gerado foi então inserido no vetor de clonagem pET-26b(+) (NOVAGEN®). Tabela 4: Sequências de iniciadores PCR usadas para amplificações de PE, PilA e PE-PilA

Transformação

[00249] Células de Escherichia coli BLR (DE3) ou E. coli HMS (DE3) foram transformadas com DNA plasmídeo de acordo com métodos padrões com células tratadas com CaCl2-. (Hanahan D. « Plasmid transformação by Simanis. » em Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135.). Bremente, as células competentes BLR (DE3) ou HMS174(DE3) foram suavemente descongeladas em gelo. Aproximadamente 4μl de plasmídeo (10-100 ng) foram misturados usando 50-100 μl de células competentes. A seguir, esta formulação foi incubada em gelo durante 30 min. Para realizar a reação de transformação, a formulação foi pulsada com calor a 42OC durante 45 segundos então incubada em gelo durante 2 minutos. Aproximadamente 0,5 ml de meio SOC (caldo Super Optimal com repressão catalólica) foi adicionado às células transformadas E a cultura de células foi incubada a 37°C durante uma hora antes da colocação em placa de agar Luria- Bertani (LB) com 50 ug/ml canamicina. Em torno de 100 μl de cultura de células transformadas foram colocados em placas e incubados durante a noite a 37OC.

[00250] BLR (DE3): BLR é um derivado recA- de BL21 (F- ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm (DE3). Esta cepa de E. coli usada para expressão de proteínas recombinantes melhoa os rendimentos de monômero de plasmídeo e pode ajudar a estabilizar os plasmídeos alvo contendo sequências repetitivas ou os produtos podem causar a perda de profago DE3. (Studier, F.W. (1991) J. Mol. Biol. 219: 37-44). O genótipo detalhado de E.coli BLR (DE3) foi

publicado por NOVAGEN®. (F- ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm Δ(srl- recA)306::Tn10 (TetR) (DE3).

[00251] Cepas HMS174 (DE3): HMS174 fornecem a mutação recA em um fundo K-12. Como BLR, estas cepas podem estabilizar alguns genes alvo cujos produtos podem causar a perda do profago DE3. O genótipo detalhado de E.coli HMS174 (DE3) foi publicado por NOVAGEN®. (F- recAl hsdR (rK12- mK12+) (DE3) (Rif R ). Produção usando BLR (DE3) e caracterização de construtos etiquetados His são descritos em Exemplo 3 até Exemplo 6

Exemplo 3: Expressão de proteína usando frasco agitado

[00252] Geralmente, uma placa de agar confluente agar inoculada com Escherichia coli BLR (DE3) transformada com plasmídeo recombinante foi extraída, recolocada em suspensão em meio de cultura e usada para inocular 800 ml de caldo LB (Becton, Dickinson and Company) ± 1% (peso/volume, p/v) glicose (Laboratoire MAT, número de catálogo: GR-0101) e 50μg/ml canamicina (Sigma) para obter O.D.600nm entre 0,1 e 0,2. Culturas foram incubadas a 37 °C com agitação de 250 RPM para alcançar um O.D.600nm de ~0.8.

[00253] Um ml de cada cultura foi então coletado, centrifugado a 14 000 RPM durante 5 minutos e sobrenadantes e grânulos foram congelados a - 20°C separadamente.

[00254] A um O.D .600nm ~0,8, as culturas BLR (DE3) foram resfriadas (-20°C, 20 minutos ou 4°C, 1 hora, preferivelmente a 4°C for 1 hora) antes de induzir a expressão da proteína recombinante por adição de 1 mM isopropil β- D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG; EMD Chemicals Inc., número de catálogo: 5815) e incubação durante a noite a 16, 22 e 30°C, ou 3 horas a 37°C com agitação de 250 RPM, preferivelmente durante a noite a 22°C. After o período de indução, as culturas foram centrifugadas a 14 000 RPM durante 5 minutos ou 6 000 RPM durante 15 minutos e sobrenadante (amostra de fração média) e grânulos (contendo frações solúveis e insolúveis) foram congelados a -20°C separadamente.

[00255] Estas condições são usadas para expressão de proteína periplasmática.

Exemplo 4: Purificação de proteína usando construtos etiquetados his, de pastas celulares em frasco agitado

[00256] Cada grânulo bacteriano obtido após a indução foi recolocado em suspensão em 20 mM de tampão de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina etanossulfônico (HEPES) (pH 8,0) contendo 500 mM NaCl, 10 mM imidazol e coquetel inibidor de Protease COMPLETE® de Roche (1 comprimido/50 ml de tampão HEPES contendo 500 mM NaCl, comprimidos COMPLETE® ULTRA de Roche, Roche Diagnostics Corporação).

[00257] Alternativamente, 20 a 50 mM de tampão bicina podem ser usados em vez de tampão HEPES contendo NaCl. Por exemplo, 20 mM tampão bicina pode ser usado. Bactérias foram lisadas usando um sistema Constant System 1.1 KW 2 X 30 000 PSI = 206,8 kPa (libras por polegada quadrada). Os componentes solúvel (sobrenadante) e insolúvel (grânulo) foram separados por centrifugação a 20 000g durante 20 min a 4°C.

[00258] Proteínas etiquetadas com 6-His foram purificadas sob condições nativas em cromatografia de afinidade com metal imobilizado (IMAC) usando protocolo de purificação de proteína PROFINIATM (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Os componentes solúveis foram carregados em uma coluna de 5ml His Trap (Bio-Rad Laboratories, Inc.) preequilibrada com o mesmo tampão usado para recolocação em suspensão bacteriana; os componentes solúveis foram adicionados a até 5 ml/min (produzindo uma “fração de fluxo atravessante”) Após carregar na coluna, a coluna foi lavada com 10 volumesde coluna do mesmo tampão a uma taxa de 10 ml/min (produzindo uma “fração de lavagem #1). Uma segunda lavagem usando 20 mM tampão bicina ou 20 mM tampão HEPES (pH 8,0) contendo 500 mM NaCl e 20 mM imidazol foi realizada, produzindo uma “fração de lavagem #2). Eluiçã foi realizada usando 2 volumes de coluna de 20mM tampão HEPES ou 50mM tampão bicina (pH 8,0) contendo 500 mM NaCl e 250 mM imidazol a uma taxa de 10 ml/min, produzindo uma “fração de eluição”.

[00259] Para melhorar a pureza da proteína, frações positivas de eluição a partir de IMAC foram reunidas e carregadas em uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) (HILOADTM SUPERDEXTM 200 26/60 a partir de GE Healthcare) preequilibrada em solução salina tamponada com fosfato sem cálcio ou magnésio (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8,1 mM, KH2PO4 1,47 mM, pH 7,4). Amostras a partir de frações de eluição foram analisadas por eletroforese de gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). Amostras foram concentradas usando Centricon 10 000 MW (Millipore).

[00260] A concentração da proteína foi determinada usando espectrofotômetro.

Exemplo 5: Análise de SDS-PAGE e Western Blot de construtos etiquetados com His e análise SDS-PAGE de construtos LVL317 e LVL318 não etiquetados com his Preparação de fração solúvel e insolúvel

[00261] Por exemplo, 1 ml de cultura após a indução (ver, por exemplo, Exemplo 3 acima) foi centrifugado a 14 000 RPM durante 2 min. O grânulo foi ressolubilizado usando 40 μl de reagente de extração de proteína BUGBUSTER® (NOVAGEN®, EMD4 Biosciences, Merck), criando uma suspensão de células. A suspensão de células foi incubada em uma plataforma giratória durante 10 min em temperatura ambiente. A suspensão de células foi então centrifugada a 14 000 RPM durante 2 min para separar a fração solúvel. O grânulo resultante (fração insolúvel) foi ressolubilizado usando 70 μl de água deionizada, 5 μl de ditiotreitol (DTT) 1M e 25 μl de tampão de amostra 4X NUPAGE® LDS (dodecil sulfato de lítio) (INVITROGENTM). A fração solúvel (sobrenadante a partir da suspensão de células do grânulo ressolubilizado) foi adicionada a 30 μl de água deionizada, 5 μl de DTT 1M e 25 μl de tampão de amostra 4X LDS.

Preparação de fração de meio

[00262] Por exemplo, para preparar a fração de meio, 100 μl de sobrenadante a partir da cultura de células totais induzidas após centrifugação (ver, por exemplo, Exemplo 3 acima) foram concentrados por adição de 500 μl de reagente RC I (Bio-Rad Laboratories, Inc.); a amostra foi misturada e incubada durante 1 min em temperatura ambiente. Então, 500 μl de Reagent II (Bio-Rad Laboratories, Inc.) foram adicionados à amostra e misturados. Esta formulação foi centrifugada a 14 000 RPM durante 10 min. O grânulo foi ressolubilizado usando 28 μl de água deionizada, 2 μl de DTT 1M e 10 μl de LDS SB 4X.

Preparação de fração de purificação

[00263] Por exemplo, proteínas purificadas (por exemplo, obtidas como descritas em Exemplo 4) foram preparadas para análise de SDS-PAGE por adição de 70 μl de amostra, 5 μl de DTT 1M e 25 μl de tampão de amostra 4X LDS.

Análise de SDS-PAGE e transferência para membrana de nitrocelulose

[00264] Análise de SDS-PAGE e transferência para membrana de nitrocelulose foram realizadas de acordo com recomendações de fabricante (Invitrogen) usando géis a 4-12% Bis-Tris NUPAGE®. Preparações de amostras, tampões e condições de migração foram feitas sob condições recomendadas pelos fornecedores.

[00265] Em um exemplo, o gel foi carregado com uma amostra de 20 ul a partir de uma mistura mestre compreendendo 70 μl de uma fração de proteína purificada, 5 μl de DTT 1M e 25 μl de LDS SB 4X.

[00266] Após as amostras foram cicladas em géis a 4-12%Bis-Tris NUPAGE®, as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose.

[00267] As membranas de nitrocelulose foram bloqueadas durante 30 minutos a 37oC, 60 RPM usando 3 % leite / PBS 1X solução fresca. Após a incubação de bloqueio, anticorpos primários foram adicionados (anticorpo 6X His Tag®, Abcam PLC, número de catálogo: ab9108) em uma diluição de: 1:1000 em 3 % leite / PBS 1X solução fresca durante 1 hora a 37oC, 60 RPM. Após isto, membranas foram lavadas três vezes, durante 5 minutos cada, em temperatura ambiente usando 0,02% polsorbate 20 (por exemplo, TWEENTM 20) / PBS 1X. Os anticorpos secundários (fosfatase alcalina (AP) coelho anti- IgG (H+L) Rabbit, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) foram adicionados a uma diluição de 1:14 000 usando 3 % leite / PBS 1X solução fresca. Membranas foram incubadas durante 1 hora a 37oC, 60 RPM. Após isto, membranas foram lavadas três vezes durante 5 minutos em temperatura ambiente usando 0,02% polysorbate 20 (por exemplo, TWEENTM 20) / PBS 1X antes das exposições da membrana a 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitro azul tetrazólio (por exemplo, BCIP®/NBT a partir de Sigma- Aldrich®, 1 comprimido / 10 ml água).

[00268] Ver Figura 1 para SDS-PAGE de extratos bacterianos induzidos para construtos de proteínas de fusão LVL291, LVL268 e LVL269. Fração insolúvel (I), fração solúvel (S) e fração de meios de cultura (M) foram carregadas para LVL291, LVL268 e LVL269 antes e depois de indução (ind).

[00269] Ver Figura 2 para SDS-PAGE e Western blot relacionados com os extratos de purificação de construtos de proteína de fusão LVL291, LVL268 e LVL269. A fração de fluxo atravessante (Ft), fração de lavagem (W) e fração de eluição (E) foram carregadas para purificação de LVL291, LVL268 e LVL269. Anti-his foi usado para sondar extratos.

[00270] Ver Figura para SDS-PAGE de extratos bacterianos induzidos e de purificação para construtos de proteínas de fusão LVL291 e LVL315. Fração de meios de cultura (M), fração solúvel (Sol), fração insolúvel (Ins), fração de fluxo atravessante (Ft), fração de lavagem #1 (W1), fração de lavagem #2 (W2) e fração de eluição (E) foram carregadas para LVL291 e LVL315.

[00271] Ver Figura 4 para SDS-PAGE de extratos bacterianos induzidos e de purificação para construto de proteína de fusão LVL312. Fração de meios de cultura (M), fração solúvel (Sol), fração insolúvel (Ins), fração de fluxo atravessante (Ft), fração de lavagem #1 (W1), fração de lavagem #2 (W2) e fração de eluição (E) foram carregadas para LVL312.

[00272] Ver Figura 25 para SDS-PAGE de frações solúveis de extratos bacterianos induzidos para construtos de proteína de fusão LVL291, LVL702, LVL736, LVL737, LVL738, LVL739, LVL740 e vetor pET26b (controle negativo). (a) Experimento 1 (b) Experimento 2 (c) Experimento 3. Proteína de fusão PE-PilA indicada por seta.

[00273] Ver Figura 26 para a porcentagem de banda média de proteína de fusão na fração solúvel a partir de Experimentos 1, 2 e 3.

[00274] Extratos bacterianos LVL317 e LVL318 usados em análise SDS-PAGE em Figura 5 e Figura 6, respectivamente, foram preparados geralmente como descritos acima.

[00275] Figura 5. SDS-PAGE de extratos bacterianos induzidos (1 mM de IPTG e 10 μM) para construto de proteína de fusão LVL317. Extratos de antes (NI) e após a indução (In), fração solúvel (S), fração insolúvel (I).

[00276] Figura 6. SDS-PAGE de extratos bacterianos induzidos (1 mM de IPTG e 10 μM) para construto de proteína de fusão LVL318. Extratos de antes (NI) e após a indução (In), fração de meios de cultura (M), fração solúvel (S), fração insolúvel (I).

[00277] Proteínas separadas por SDS-PAGE foram transferidas para uma membrana Immobilon-P. As bandas de proteína coloridas com azul Coomassie foram cortadas colocadas em um reator tipo sequenator. O sequenciamento foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante usando um Proteinator de Applied Biosystems PROCISE®, modelo 494-cLC. Tabela 5: Perfís de expressão de proteína em frasco agitado e clivagem de peptídeo de sinal para construtos de proteína de fusão.

So = fração solúvel. In = fração insolúvel. Se = Proteína secretada na fração do meio. Nt = não testado. As seguintes classificações foram baseadas em uma inspecção visual (coomassie) + : baixa expressão; ++ : expressão média; +++ : expressão alta; - : sem expressãowww

Exemplo 6: Caracterização de proteína de fusão LVL291 PROPRIEDADES FÍSICAS DE LVL291: Duplicação de PE E PilA em LVL291 e Ponto de Fusão Dicroísmo circular: Análise de estrutura secundária

[00278] Dicroísmo circular (CD) é usado para determinar a composição de estrutura secundária de uma proteína por medir a diferença na absorção de luz polarizada à esquerda versus luz polarizada à direita que é devido à assimetria estrutural. A forma e a magnitude dos espectros CD na região de UV distante (190-250nm) são diferentes se a proteína exibir uma estrutura de beta-folha, alfa-hélice ou de espiral aleatória. A abundância relativa de cada tipo de estrutura secundária em uma amostra de proteína dada pode ser calculada por comparação com os espectros de referência.

[00279] Os espectros de UV distante são medidos usando um trajeto óptico de 0,01cm a partir de 178 a 250nm, com uma resolução de 1nm e largura da banda em um espectropolarímetro Jasco J-720. A temperatura da célula é mantida a 23°C por um bloco de células tratadas em termostato RTE- 111 Peltier. Um fluxo de nitrogênio de 10L/min é mantido durante as medições.

Resultados:

[00280] Os espectros de CD de UV distante obtidos para PE (a partir de construto pRIT16762), PilA (a partir de construto pRIT 16790) e proteínas PE-PilA são características de proteínas duplicadas contendo uma mistura de estruturas alfa e beta, mas PE é significantemente mais rico em hélice alfa do que PilA e PE-PilA (Figura 7, espectros de CD de PE, PilA e PE-PilA proteínas de fusão).

[00281] A fim de avaliar a integridade da duplicação de proteínas individuais de PE e PilA novamente ligadas juntas em uma proteína quimérica e então verificar uma possível interação entre ambas, espectros de diferença foram calculados.

[00282] Quando os espectros PE e PilA UV distante são combinados, a sobreposição do espectro resultante para o espectro de quimera PE-PilA (Figura 8, combinação de PE e espectro de PilA CD). Este resultado sugere que a quimera PE-PilA contém todas as estruturas secundárias que são detectadas nos componentes individuais. Também sugere que a fusão das proteínas não tem principal impacto sobre as estruturas secundárias dos componentes individuais e consequentemente que a duplicação de PE e PilA não é significantemente diferente se as proteínas são separadas ou em fusão.

Avaliação de ponto de fusão:

[00283] A fim de avaliar se a expressão em fusão tem um impacto sobre as propriedades termodinâmicas das proteínas individuais, os pontos de fusão de PE, PilA e PE-PilA foram avaliados por monitoração da des- duplicação da hélice alfa com temperatura por dicroísmo circular.

[00284] A presença de hélice alfa é caracterizada por um mínimo no sinal de dicroísmo circular a 222nm, assim um aumento significante no sinal CD a 222nm durante o aumento de temperatura é uma indicação de desnaturação de proteína. A determinação da temperatura a qual a proteína sofre perda na estrutura secundária permite a determinação do ponto de fusão (Tm), que corresponde à temperatura em que metade das proteínas perderam a sua estrutura.

[00285] Ponto de fusão pode ser determinado por identificação do ponto de inflexão na curva de desnaturação térmica obtida a partir do gráfico de temperatura versus CD 222nm.

[00286] Ponto de fusão de PilA e PE como determinado por CD de UV distante são respectivamente de 52°C e 68°C (Figura 9, curva de desnaturação térmica de PilA; Figura 10, curva de desnaturação térmica PE).

[00287] A proteína de fusão PE-PilA exibe dois Tm’s distintos a 48°C e 71°C (Figura 11, curva de desnaturação térmica de proteína de fusão PE- PilA). Os valores indicam que as proteínas PE e PilA são ainda independentemente duplicaram quando ligadas em uma quimera e que eles des-duplicaram em uma temperatura similar se eles são separados ou em fusão. A observação que a des-duplicação da porção PilA a 48°C não causa precipitação ou impacto sobre o Tm da porção PE a 71°C é uma indicação forte que a interação entre PE e PilA dentro da fusão é mínima e que elas não têm um impacto principal observável em cada outra. Os pontos de fusão de proteínas são sensíveis a várias condições externas, incluindo composição de tampão ou presença de moléculas que interagem; que nenhuma variação principal é observada quando da fusão de PE e PilA é uma indicação forte da conservação da maior parte da estrutura e das properiedades de ambas PE e PilA quando elas são ligadas juntos.

Exemplo 7: Processo de fermentação

[00288] Proteínas de fusão da invenção podem ser preparadas por métodos conhecidos pelo versado na técnica.

Exemplo 8: Purificação de proteína de PE, PilA, e LVL317 PE purificação de proteína a partir de pRIT16762:

[00289] Para gerar o vetor de expressão pRIT16762, o vetor pRIT16711 foi digerido usando enzimas de restrição BamHI e NcoI a fim de deletar 6 resíduos de aminoácidos entre a sequência de sinal (pelB) e PE. O vetor obtido foi nomeado pRIT16712. Neste vetor, têm 3 aminoácidos entre a sequência de sinal pelB e PE: MDP. Em uma segunda etapa, um mutagênese de sítio dirigido foi realizada mudança da sequência de aminoácidos a partir de MDP a QIQ usando pRIT16712 como gabarito com iniciadores MnoNTHi-44 e MnoNTHi-45 (descritos em Tabela 4) e o kit de mutagenese sítio-dirigida QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).

[00290] A semente de trabalho de E. coli BLR(DE3) contendo PE QIQ (a partir do construto pRIT16762) foi descongelada a partir de -80°C e usada para preparar 100 ml de pre-cultura em caldo LB durante incubação na noite a 37°C sob agitação a 215 RPM. Após incubação durante a noite, oito frascos contendo 800 ml de LB APS foram inoculados com 12,5 ml de pre-cultura e OD600 medidos em torno de 0,06. As culturas foram incubadas 3h a 37°C com agitação. A um OD600 em torno de 0,9, 1mM IPTG foi adicionado para iniciar a indução. Durante a indução, as culturas foram incubadas 19h a 22°C com agitação. Após a indução, OD600 estava em torno de 2,2. As culturas de células foram transferidas em 1L sacos de centrífugas colocadas dentro de frascos de 1L e centrifugadas a 4°C durante 30 minutos a 6.000xg e sobrenadante descartado. 1ml de alíquotas de cultura pre- e pós-indução e sobrenadante foram mantidos para análise futura. Lise do BLR(DE3) induzida com PE QIQ

[00291] Os sacos de centrífuga foram removidos a partir das garrafas de centrifugação, abertos e o grânulo foram expulsos a partir do saco em um béquer. Os oito grânulos foram puxados juntos e recolocados em suspensão em 100ml de tampão de ligação (20mM de Hepes, 10mM de imidazol, 500mM de NaCl, pH 8.01). O E.coli BLR (DE3) contendo o construto QIQ de PE foram disrompidos com o dispositivo TS Series Bench Top cell disrupter de Constant Systems Ltd. (1x30 kPsi; 1x15kPsi). O lisato foi centrifugado 30 minutos, 6000RPM, 4°C. O sobrenadante foi mantido e carregado em uma coluna IMAC. Purificação IMAC de QIQ de PE

[00292] Coluna IMAC (BioRad, Bio-Scale Mini Profinity IMAC cartridge 5ml) foi equilibrada com 5CV de tampão de ligação (20mM de HEPES, 10mM de imidazol, 500mM de NaCl, pH 8,01) a 5ml/min. 100ml de sobrenadante lisato foi carregado em IMAC a 2,5mL/min. Fluxo através foi coletado em 50ml frações para análise futura. A coluna foi lavada com 3CV de tampão de ligação para remover proteína não ligada. Amostra contendo proteínas não ligadas foi coletada em uma alíquota de 15 ml em um tubo de 50 ml. A coluna foi lavada com 2CV de tampão de lavagem (20mM de HEPES, 20mM de imidazol, 500mM de NaCl, pH 8,01) coletado em 2 ml de frações em uma placa de 96 cavidades. A proteína ligada foi então eluída com 6CV de 100% de tampão de eluição (20mM de HEPES, 250mM de imidazol, 500mM de NaCl, pH 8,01). A proteína eluída foi coletada em 2 ml de frações em placas de 96 cavidades. Lavagem e eluição foram realizadas a 5ml/min. Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) no pool IMAC de QIQ de PE

[00293] Coluna SEC (GE healthcare, tipo prep. HILOADTM 26/60 SUPERDEXTM 75, 60cm de altura aproximadamente 319ml em volume) foi equilibrada com 3CV de tampão SEC (20mM de HEPES, 150mM de NaCl, pH 8,49). 11 ml de IMAC eluado foi carregado sobre a coluna a uma taxa de fluxo de 2,5 ml/min. 2ml de frações foram coletadas a partir de 0,3CV a 0,9CV. Dois ciclos foram realizados então as frações foram analisadas por SDS-PAGE. Frações a partir dos dois ciclos contendo Prot E proteína foram reunidas juntas (“SEC pool” , 48ml aproximadamente de volume total). 500mM de arginina foi adicionado no pool de SEC. Dosagem das amostras reunidas de QIQ de PE geradas no protocolo SEC acima

[00294] O pool de SEC foi dosado com o método RCDC (agente redutor e detergente compatível) a partir do kit Bio-Rad RC DCTM seguindo o protocolo do fabricante:

[00295] Para cada amostra testada e padrão, 25μL foi distribuída em tubos de microcentrífuga em duplicado. 125μL de reagente Bio-Rad RC I foi adicionado em cada tubo; cada tubo foi submetido a vórtice e incubado durante 1 minuto em temperatura ambiente. 125μL de reagente Bio-Rad RC II é adicionado em cada tubo; cada tubo é submetido a vórtice e então centrifugado a 14.000xg durante 5 minutos. Os sobrenadantes são descartados por inverter os tubos on clean, adsorvente de papel tecido, permitindo o líquido para drenar completamente dos tubos. 25,4 μL de reagente A (prontamente preparado por misturar 20μL de reagente S por 1ml de reagente A) são adicionados acada tubo; cada tubo é submetido a vórtice e incubado em temperatura ambiente durante 5 minutos, ou até o precipitado é completamente dissolvido. Submeter a vórtice antes da próxima etapa. Adicionar 200μL de reagente DC B em cada tubo e submeter a vórtice imediatamente. Incubar em temperatura ambiente durante 15 minutos. Transferir todas as amostras a uma placa de 96 cavidades e ler a absorvância em 750nm para determinar a proteína concentração para cada amostra de proteína desconhecida.

[00296] A concentração ProtE foi de 1,069 mg/ml

Purificação de proteína etiquetada PilA His-:

[00297] PilA foi purificada seguindo o procedimento geral abaixo:

[00298] Células de E. coli contendo um construto codificando PilA ou um fragmento do mesmo são colocados em suspensão BUGBUSTER® e BENZONASE® nuclease (NOVAGEN®), por exemplom 10 ml BUGBUSTER® e 10 ul BENZONASE® nuclease. O lisato de célula é misturado em temperatura ambiente em uma plataforma rotativa, por exemplo, durante 15 minutos. O lisato de célula é centrifugado a 4°C, por exemplo a 16.000g durante 20 minutos. O sobrenadante contendo a proteína é adicionado a uma coluna de Ni NTA contendo resina Ni NTA HIS • BIND® e misturado a 4°C, por exemplo, durante 1 hora. A coluna pode consistir de 2 ml de resina Ni NTA HIS •BIND® (NOVAGEN®) e 10 ml 1X de tampão de ligação (de kit de tampão Ni-NTA de NOVAGEN®). O fluxo de coluna através é então coletado. A resina é lavada duas vezes com 1X de tampão de lavagem, por exemplo, contendo 300 mM de NaCl, 50mM de NaH2PO4, 25 mM de imidazona, pH 8.0). A lavagem é coletada por gravidade de fluxo. A proteína é eluída a partir da coluna com 1X tampão de eluição, por exemplo, 300 mM de NaCl, 50mM de NaH2PO4, 250 mM de imidazona, pH 8.0. A proteína pode ser ainda purificada por diálise com o tampão de ligação e novamente ciclada sobre uma coluna Ni NTA como descrito acima. Clivagem de trombina de PilA.

[00299] PilA é então incubada com trombina (diluída 1/50) em temperatura ambiente durante 16h, para remover a etiqueta de histidina.

[00300] Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) em PilA clivada com trombina. Coluna SEC (GE healthcare, HILOADTM 26/60 SUPERDEXTM 75 tipo prep., 60 cm de altura aproximadamente 319ml de volume) foi equilibrada com 5CV de tampão SEC (20mM de HEPES, 150mM de NaCl, pH 8.52). Aproximadamente 10 ml de PilA clivado foi carregado sobre a coluna a uma taxa de fluxo de 2,5 ml/min. 2ml de frações coletadas a partir de 0,3CV a 0,9CV. Dois ciclos foram realizados então frações foram analisadas por SDS-PAGE. Frações a partir de dois ciclos contendo PilA clivada proteína foram reunidas juntas (“pool SEC”, 52ml aproximadamente de volume total). Dosagem de PilA, pool SEC.

[00301] O pool SEC foi dosado com o método RCDC como descrito acima. A concentração PilA clivada foi a 5,37 mg/ml. Diálise do pool SEC de PilA com PBS 1x pH 7,4 (fator de diálise = 1600) e dosagem por RCDC

[00302] A concentração pós-diálise determinada por RCDC foi a 3,0 mg/ml.

Purificação de LVL317 Choque osmótico

[00303] Porque a proteína de fusão LVL317 é expressa e processada em periplasma bacteriano, a proteína foi extraída por choque osmótico.

[00304] Pastas de células B2448 de E. coli congeladas (-20°C) coletadas contendo LVL317 a partir de 4 L de fermentor cultura foram reunidas e recolocadas em suspensão em um tampão hipertônico consistindo em 24 mM de Tris-HCl, 16% (p/v) sacaroso, 9,9% (p/v) glicose, 10 mM de EDTA, pH 8,0 até um volume final de 4L. A suspensão foi misturada suavemente durante 30 min em temperatura ambiente usando um propulsor de 3 pás, instalado em agitador básico RW 16, a velocidade média. A suspensão foi centrifugada a 15.900 x g durante 30 minutos em temperatura ambiente. Sobrenadante (SN1) foi mantido para análise em gel.

[00305] O grânulo resultante foi recolocado em suspensão em uma solução hipotônica; 38 mM de MgCl2, e misturado durante 30 min em temperatura ambiente. A mistura foi centrifugada a 15.900 x g durante 30 minutos em temperatura ambiente e o antígeno recuperado no sobrenadante (SN2).

[00306] Uma clarificação do SN2 foi realizada por filtração através a 0,45/0,2 μm filtro Sartorius Sartopore 2 MidiCap de poliétersulfona, a 600ml/min de taxa de fluxo.

[00307] O SN2 foi diluído 1:3 com 20 mM de NaH2PO4 -Na2HPO4, pH 7,0, o pH ajustado a 7,0 se necessário e outra clarificação por filtração através de um Sartorius Sartopore 2 MidiCap de poliétersulfona de 0,45/0,2 μm, a 600ml/min foi realizada. Cromatografia de fluxo rápido SP SEPHAROSE™ (SP FF)

[00308] O SN2 diluído/filtrado foi carregado e capturado em uma resina trocadora catiônica forte (SP SEPHAROSE™ FF - GE Healthcare) em um 14 cm ID (diâmetro interno) x 20 cm coluna de comprimento (volume de coluna 3100ml) equilibrada com 2CV de 20 mM de tampão NaH2PO4 / Na2HPO4 pH 7.0. Após lavagem a coluna com 5CV de 20 mM de tampão NaH2PO4 / Na2HPO4 pH 7,0, o antígeno (contido dentro de LVL317) foi eluída por aumentar a concentração de NaCl até 100 mM no mesmo tampão de lavagem.

[00309] Ver Figura 12 para um cromatograma de fluxo rápido típico SP SEPHAROSETM.

Cromatografia Q SEPHAROSE™ de fluxo rápido (Q FF)

[00310] O antígeno presente no SP FF eluado foi diluído 1:4 com um 20 mM Tris pH 8,5, pH ajustado a 8,5 se necessário e passada através uma resina trocadora aniônica forte (Q SEPHAROSE™ FF - GE Healthcare) em uma 14 cm ID x 11,8 cm coluna de comprimento (volume de coluna 1800ml) equilibrada com 2CV de 20 mM de tampão Tris pH 8,5. O antígeno foi recuperado no fluxo atravessante fração.

[00311] Ver Figura 13 para um Q SEPHAROSETM cromatograma de fluxo rápido típico. Concentração, diaflitração, adição de polisorbato 80 e filtração estéril

[00312] O fluxo atravessante de Q FF contendo o antígeno foi concentrado até 0,7-0,8 mg/ml com base no cromatograma UV e diafiltrado com 5DV de 10 mM de tampão KH2PO4 / K2HPO4 pH 6,5 usando uma membrana de corte de 10 kDa Pellicon-2™ (Millipore).

[00313] Usando uma solução de carga a 5%, Polisorbato 80 (por exemplo, TWEENTM 80) foi adicionado ao retentato de ultrafiltração e agitado durante 30 minutos com agitador magnético a 130rpm a 4°C. A concentração final de Polisorbato 80 foi 0,04%. Retentado de ultrafiltração foi esterilizado por filtração através a 0,45/0,2 μm membrana de acetato de celulose (Sartobran 300, Sartorius). O volume purificado foi armazenado a - 20°C OU -80°C. A proteína concentração absoluta foi medida por AAA (análise de aminoácido) a 0,737mg/ml.

Exemplo 9: Uso de Polisorbato 80

[00314] Um experimento de titração indicou que a adição de Polisorbato 80, especificamente, TWEENTM 80 a uma concentração final de 0,04% (p/v) do volume purificado anterior a filtração estéril reduziu a formulação de partícula filamentosa e aggregação.

[00315] De acordo com a análise de DSC, TWEENTM 80 reduziu o grau de mudança estrutural (30-45°C) visto após ciclos de congelamento/descongelamento após armazenamento a -20°C e após armazenamento 4 dias a 4°C, -20°C e -80°C e 37°C. Exemplo 10: Análise de SDS-PAGE e Western Blot LVL317 Análise de SDS-PAGE e Western Blot:

[00316]Gel a 4-12% Bis-Tris NUPAGE® foi carregado como descrito abaixo com 10μg de amostra em tampão de amostra NUPAGE® LDS contendo 50mM de DTT aquecido 5min a 95°C (20μL de amostra foi carregado para amostras tendo concentração baixa). Migração: 35 minutos a 200Volts em temperatura ambiente (RT) em tampão de ciclo NUPAGE® MES. Colorido em gel 2 horas em azul instantâneo (Novexin cat.: ISB01L) e descolorido durante a noite em água. Conteúdos da trilha: 1: padrão MW (10μL) 2: Início (fração total) (10μg) 13: Tira Q FF (4,8μg) 14: Retido TFF antes 0,04% TWEENTM 80 acentuado (10μg) 15: Volume purificado não filtrado 0,04% TWEENTM 80 acentuado (10μg) 16: Volume purificado estéril filtrado 0,04% TWEENTM 80 acentuado (10μg) 17: Volume purificado estéril filtrado 0,04% TWEENTM 80 acentuado (20μg + acentuado lisado de células de E. Coli Rix (1μg)) 18: Lisado de células de E. Coli Rix (2μg) 19: Lisado de células de E. Coli Rix (1μg) 20: Lisado de células de E. Coli Rix (0,5μg)

[00317] Ver Figura 14 para um SDS-PAGE em processo de amostras a partir de processo de purificação de proteína de fusão PE-PilA.

[00318] Para Western Blot, as proteínas foram transferidas a 4°C durante a noite a 30Volts em tampão de transferência NUPAGE® + 20% de metanol, 0,1% de SDS em membrana de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas 1 hora com 50mM de Tris, 150mM de NaCl pH 7,4 + 5% de leite em pó sem gordura, incubadas 2 horas em anticorpo primário de coelho policlonal diluído em tampão de bloqueio (anti-Prot-E 1/50 000 e anti-Ecoli (BLR) 1/1 000), lavadas 3x5minutos em 50mM de Tris pH 7,4 + 0,05% Tween 20, incubadas 1 hora em anticorpo secundário (anti-coelho de cabra conjugado à fosfatase alcalina diluído 1/5000 em tampão de bloqueio), lavada 3x5minutos em tampão de lavagem e desenvolvido em substrato BCIP/NBT (1 comprimido por 10ml). Todas as incubações realizadas em 25ml por membrana.

[00319] Ver Figura 15 para um Western Blot em processo de amostras de processo de purificação a partir de proteína de fusão PE-PilA. Blot usando anticorpo policlonal de coelho anti-PE. Conteúdos da trilha: 1: padrão MW (10μL) 3: SN1 não filtrado (10μg) 5: Não extraído (10μg) 7: Fluxo através SP FF (6,9μg) 9: Eluição SP FF (10μg) 11: Carga Q FF (8,9μg) 13: Tira Q FF (4,8μg) 14: Retido de TFF antes 0,04% TWEENTM 80 acentuado (10μg) 15: Volume purificado não filtrado 0,04% TWEENTM 80 acentuado (10μg) 16: Volume purificado estéril filtrado 0,04% TWEENTM 80 acentuado (10μg) 17: Volume purificado estéril filtrado 0,04% TWEENTM 80 acentuado (20μg + lisado acentuado de células de E. Coli Rix (1μg)) 18: Lisado de células de E. Coli Rix (2μg) 19: Lisado de células de E. Coli Rix (1μg) 20: Lisado de células de E. Coli Rix (0.5μg)

[00320] Ver Figura 16 para um Western Blot em processo de amostras de processo de purificação a partir de proteína de fusão PE-PilA. Blot usando anticorpo policlonal de coelho anti-E.coli (BLR). Conteúdos da trilha: 1: padrão MW (10μL) 3: SN1 não filtrado (10μg) 5: Não extraído (10μg) 7: Fluxo através SP FF (6,9μg) 9: Eluição SP FF (10μg) 11: Carga Q FF (8,9μg) 13: Tira Q FF (4,8μg) 14: Retido de TFF antes de 0,04% TWEENTM 80 acentuado (10μg) 15: Volume purificado não filtrado 0,04% TWEENTM 80 acentuado (10μg) 16: Volume purificado estéril filtrado 0,04% TWEENTM 80 acentuado (10μg) 17: Volume purificado estéril filtrado 0,04% TWEENTM 80 acentuado (20μg + lisado acentuado de células de E. Coli Rix (1μg)) 18: Lisado de células de E. Coli Rix (2μg) 19: Lisado de células de E. Coli Rix (1μg) 20: Lisado de células de E. Coli Rix (0,5μg)

[00321] Figuras e comentários de SDS-PAGE e Western Blot: A proteína de fusão PE-PilA migra a 30kDa. A extração por extratos de choque osmótico a proteína de fusão expressa e processada em bactérias periplasma e reduzir a contaminação a partir de bactérias. Pequena perda de proteína de fusão durante tratamento hipertônico (trilha 3). Uma proporção pequena não é extraída por tratamento hipotônico e permanece associado com células (trilha 5). Pequena perda em fluxo SP FF através (trilha 7) e na fração de tira de ambas colunas (lanes 10 e 13). Porque o volume total de fração de tira é baixo a perda de proteína de fusão não é significante. Bandas degradadas são visíveis em frações de extração, mas não no produto final. Nenhuma contaminação significante a partir de proteínas de células hospedeiras E. coli em volume purificado (trilha 16).

[00322] Análise de LVL735 e LVL778 deu perfis similares como LVL317.

Exemplo 11: Dados do ponto de fusão para PE, PilA e LVL317

[00323] Transição térmica de proteína não etiquetada His de fusão PE- PilA (LVL317) foi comparada com a transição térmica de ambas as proteínas PE etiquetado His (como descrito no Exemplo 8) e PilA clivada (como descrito no Exemplo 8), purificado como descrito acima.

[00324] Antes de DSC, PE E PilA foram dialisadas durante a noite em 10mM de K2HPO4/KH2PO4 pH 6,5 + 0,04% Tween 80 (1:250 amostra:razão em volume de tampão) para ter os mesmos no mesmo tampão como a proteína de fusão. Após diálise, a concentração de proteínas foi medida por BCA E ajustado a 300μg/ml (PE) E 500μg/ml (PilA).

[00325] Análise feita em VPTM-DSC a partir de MicroCal, LLC (parte de GE Healthcare). O tampão de diálise final foi usado como referência e subtraído a partir das varreduras. A varredura DSC foi a 90°C/h. A fim de avaliar a capacidade para medir a transição térmica no recipiente final (FC) após formulação, a proteína de fusão foi diluída na concentração FC (60μg/ml). Dados do recipiente finais não mostrados.

Resultados:

[00326] Ver Figura 17 para transição térmica de proteína de fusão PE- PilA e proteínas PE e PilA. Curvas: PilA (1), proteína E (Prot E, PE) (2), PE- PilA PB não diluída 737μg/ml (3), e PE-PilA PB diluída a FC concentração 60μg/ml (4). 1 - PilA Tm: 53°C 2 - Proteína E Tm: 63 3 - PB de PE-PilA (volume purificado) não diluído 737μg/ml Tmi : 53,7°C E Tm2 : 66,1°C 4 - PB de PE-PilA diluídas a concentração FC 60μg/ml Tm1: 53,2°C E Tm2: 67,6°C

[00327] Duas transições foram detectadas na proteína purificada de fusão (LVL317) (curvas 3 e 4).

[00328] O Tm1 (53.7°C) da proteína de fusão PE-PilA é similar para transição PilA (53°C).

[00329] Deslocamento significante de Tm2 em PE-PilA (66,1°C) como comparado a transição PE (63°C). A fusão de ambos os domínios parece estabilizar o fragmento PE.

[00330] O deslocamento de Tm2 na proteína de fusão diluída como comparado a não diluída é um artefato de concentração que surge de inclinação de diminuição íngreme típica de agregação que é dependente da concentração.

[00331] Análise de duplicação de antígeno de LVL735 E LVL778 foi similares à de LVL317.

Exemplo 12: Resposta de imunogenecidade anti-PilA LVL291 de construto de proteína de fusão PE-PilA em camundongos Balb/c.

[00332] A resposta imune dirigida contra proteína de fusão PE-PilA LVL291 purificada (a proteína de fusão LVL291 sem o peptídeo de sinal heterólogo) formulado em AS03A foi avaliado em camundongos Balb/c. Animais (20 camundongos/grupo) foram imunizados pela via intramuscular nos dias 0, 14 e 28 com 10 μg de PE (a partir de vetor pRIT16762), PilA (a partir de vetor pRIT16790) ou PE-PilA, cada formulado em AS03A. O grupo de controle foi vacinado com AS03A sozinho. Resposta de anticorpo dirigido contra cada antígeno foi determinada em soros individuais coletado no dia 42. Nenhuma resposta de anticorpo foi obtida com o controle negativo. Como mostrado na Figura 18, a resposta do anticorpo dirigida contra PilA foi superior em camundongos imunizados com a fusão PE-PilA comparado a resposta do anticorpo em camundongos imunizados com PilA monovalente. As respostas de anticorpo dirigidas contra PE foram similares em camundongos imunizados com a proteína de fusão e camundongos imunizados com PE monovalente. GMT = título geométrico médio. Dados foram capturados e analisados com o SOFTMAX® Pro Software (Molecular Devices) correndo em WINDOWS® (Microsoft); a função log da logística de de quatro parâmetros foi usada para calcular a curva padrão. A função log da logística de de quatro parâmetros descreve, com um grau elevado de precisão, a curva do soro de referência exibindo uma forma sigmoidal pronunciada quando traçada em gráfigo em uma escala (log) de densidade-versus- concentração óptica. As concentrações de anticorpos foram calculadas a cada diluição de amostras de soro de camundongos por interpolação da curva padrão. O anticorpo nos soros de controle de qualidade e em amostras de soro desconhecidas é obtido tirando a média os valores a partir de todas as diluições que estão dentro da faixa de trabalho (10-80 %) da curva de diluição da referência.

[00333] Resultados são mostrados na Figura 18, que os gráficos as respostas de anticorpos contra LVL291 proteína de fusão PE-PilA e contra monovalente PE e PilA no balb/c modelo de camundongo.

Exemplo 13: Modelo de colonização nasofaringeal de murinos. Imunização com PE-PilA. Desafio com NTHi cepa 86-028NP e NTHi cepa 3224A.

[00334] Camundongos Balb/c fêmeas (20/grupo) foram imunizados intranasalmente nos dias 0 e 14 com 6μg de uma proteína purificada de fusão PE-PilA (LVL291 para desafio com 86-028NP; LVL317 para desafio com cepa 3224A) formulado com LT (toxina lábil a calor de Escheria coli) e no dia 28 com 6 μg de uma proteína purificada de fusão PE-PilA em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Camundongos de controle (20/grupo) foram vacinados com LT apenas. Camundongos foram subsequentemente desafiados intranasalmente com 5 x 106 CFU (unidades formadoras de colônias) de homólogo NTHi cepa 86-028NP e heterológo NTHi cepa 3224A. Homologia e heterologia são determinados por referência com a cepa NTHi com a qual os camundongos foram imunizados. Colônias bacterianas foram contadas em cavidades nasais removidaa 1 e 2 dias após o desafio. D1 = dia 1. D2 = dia 2.

[00335] Vacinação PE-PilA aumentou a depuração de NTHi cepa 86- 028NP e cepa 3224A na nasofaringe no dia 1 e dia 2 após o desafio.

[00336] Para o experimento realizado com NTHi cepa 86-028NP: Um ANOVA de 2 vias fixo foi realizado usando os valores de log10 das contagens como resposta, os fatores fixos sendo o grupo (4 níveis) e o dia (2 níveis). A suposição de heterogeneidade de variância foi rejeitada e um modelo com variâncias heterogêneas foi equipado com os dados. Nenhuma interação significante foi detectada entre os 2 fatores. A fusão do grupo PE- PilA (6 μg por camundongo) significantemente reduziu CFU comparado com o grupo de controle (LT); a razão média geométrica sendo igual a 0,06 com um intervalo de confiança de 95% de 0,01, 0,25.

[00337] Para o experimento conduzido com NTHi cepa 3224A: Um ANOVA de três vias fixo foi realizado usando os valores de log10 como resposta, os fatores fixos sendo o grupo, o dia, e o experimento. O teste de Shapiro-Wilk e Levene’s não rejeitou as suposições de normalidade e de homogeneidade das variâncias. Nenhuma interação significante entre qualquer um dos 2 fatores ou entre os 3 fatores foi detectada e apenas principais fatores foram mantidos na análise. PE-PilA / LT significantemente reduziu CFU comparado com o grupo de controle; a razão média geométrica sendo igual a 0,11 com um intervalo de confiança de 95% de 0,02, 0,61.

[00338] Ver Figura 19 para efeito de vacinação com proteína de fusão PE-PilA em depuração bacterianade de NTHi cepa 86-028NP em nasofaringe do camundongo.

[00339] Ver Figura 20 para efeito de vacinação de proteína de fusão PE-PilA em depuração bacteriana de NTHi cepa 3224A em nasofaringe do camundongo.

Exemplo 14: Modelo de colonização nasofaringeal de murinos. Imunização com PilA. Desafio com NTHi cepa 3219C.

[00340] Camundongos OF1 fêmeas (20 camundongos/grupo) foram imunizados intranasalmente nos dias 0 E 14 com 3μg PilA (a partir de vetor 16790) formulado com LT E no dia 28 com 3 μg PilA em PBS. Camundongos de controle foram vacinados com LT apenas. Camundongos foram subsequentemente desafiados intranasalmente com 5 x 106 CFU de NTHi cepa 3219C. Colônias bacterianas foram contadas em cavidades nasais removidas 3 e 4 dias após o desafio. D3 = dia 3. D4 = dia 4.

[00341] Ver Figura 21 para efeito de vacinação com PilA em depuração bacteriana nasofaringeal em camundongos.

Exemplo 15: Modelo de colonização nasofaringeal de murinos. Imunização com PE. Desafio com NTHi cepa 3224A.

[00342] Camundongos Balb/c fêmeas (20 camundongos/grupo) foram imunizados intranasalmente nos dias 0 e 14 com 3μg PE (a partir de vetor pRIT16762) formulado com LT e no dia 28 com 3 μg PE em PBS. Camundongos de controle foram vacinados com LT apenas. Camundongos foram subsequentemente desafiados intranasalmente com 5 x 106 CFU de NTHi cepa 3224A. As colônias bacterianas foram contadas em cavidades nasais removidas 3 e 4 dias após o desafio. 10 camundongos foram examinados no dia 3 (D3). 10 camundongos foram examinados no dia 4 (D4). Vacinação de PE aumentou significantemente a depuração de NTHi na naso- faringe no dia 4 após o desafio (Figura 22), usando no teste Dunn para análise estatística.

[00343] Ver Figura 22 para efeito de vacinação PE em depuração bacteriana na nasofaringe de camundongos.

Exemplo 16: Ligação de vitronectina. Inibição de ligação de vitronectina por proteína de fusão PE-PilA de LVL317 e LVL735.

[00344] A capacidade de PE no construto de proteína de fusão PE-PilA LVL317 purificado para ligar a vitronectina foi evaliado. Placas de microtitulação (POLYSORPTM, Nunc, Thermo Fisher Scientific) foram revestidas com PE (a partir de vetor pRIT16762) ou com proteína de fusão PE-PilA LVL317 purificada (10 μg/ml). As placas foram lavadas quatro vezes com NaCl 150mM-Polisorbato 20, 0,05% (por exemplo, TWEENTM 20) e bloqueadas durante uma a duas horas com PBS-BSA 1%. Após quatro lavagens, vitronectina (Vitronectina de plasma humano, SIGMA- ALDRICH®) foi adicionada (10 μg/ml), duas vezes diluída (12 diluições), e as placas foram incubadas durante 1h em temperatura ambiente. As placas foram então lavadas 4 vezes com NaCl 150mM-Polisorbato 20, 0,05% (por exemplo, TWEENTM 20). Após lavagems, a vitronectina ligada foi detectada usando peroxidase vitronectina anti-humana de ovelha (US Biological) seguido pela adição de substrato orto-fenileno diamina/H2O2. A cor revelada é diretamente proporcional à quantidade de anticorpo fixado na vitronectina.

[00345] Ver Figura 23 para (a) LVL317 proteína de fusão PE-PilA por uma vitronectina. PilA = PilA a partir de NTHi cepa 86-028NP (como descrito para pRIT16790); PE = Proteína E (como descrito para pRIT16762) E (b) LVL317 E LVL735 proteína de fusão PE-PilA ligada a vitronectina.

Exemplo 17: Ligação de vitronectina. Inibição de ligação de vitronectina por anticorpos dirigidos contra proteína de fusão PE-PilA LVL291.

[00346] Placas de microtitulação (POLYSORPTM, Nunc, Thermo Fisher Scientific) foram revestidas com PE (a partir de vetor pRIT16762) ou com a proteína purificada de fusão PE-PilA (10 μg/ml). As placas foram lavadas quatro vezes com NaCl 150mM-Polisorbato 20, 0,05% (por exemplo, TWEENTM 20) e bloqueadas durante duas horas com PBS-BSA 1%. Após lavagems, vitronectina (Vitronectina de plasma humano, SIGMA- ALDRICH®) foi adicionado a 50μg/ml e anticorpos anti-PE-PilA purificados (produzidos e purificados em cas) foram duas vezes diluídos em série e incubados durante 1h em temperatura ambiente. As placas foram então lavadas 4 vezes com NaCl 150mM-Polisorbato 20, 0,05% (por exemplo, TWEENTM 20). Após quatro lavagens, a vitronectina ligada foi detectada usando peroxidase anti-vitronectina de ovelha (US Biological) seguido pela adição de substrato orto-fenileno diamina/H2O2. A cor revelada é diretamente proporcional à quantidade de anticorpo fixado na vitronectina.

[00347] Inibição de ligação de vitronectina para PE por anticorpos policlonais dirigidos contra PE-PilA foi observada.

[00348] Ver Figura 24 para inibição da ligação de vitronectina pelos anticorpos policlonais contra proteína de fusão PE-PilA.

Exemplo 18: Antigenicidade de proteína de fusão PE-PilA LVL291. ELISA.

[00349] LVL291 proteína de fusão PE-PilA purificada foi validada em um teste de antigenicidade com proteínas monovalentes como controle. A proteína de fusão foi testada em um sanduíche ELISA desenvolvido com anticorpos policlonais (coelho e porquinho da índia) gerados contra os pe gene fragmento codificando para aminoácidos 22 a 160 de SEQ ID NO: 4 (como descrito para pRIT16711) ou contra PilA a partir de NTHi cepa 86- 028NP (a partir de vetor pRIT16790).

[00350] PilA ou PE foi adicionado a 100 ng/ml e em série duas vezes diluído. Após 30 minutos incubação e após lavagem, o antígeno ligado foi detectado por um soro de coelho policlonal obtido após imunização com PE ou PilA. Os anticorpos ligados foram detectados usando uma peroxidase anticoelho Ig (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) seguido pela adição de orto-fenileno-diamina/H2O2 substrato. A cor revelada é diretamente proporcional à quantidade de antígeno presente. As leituras de absorbância foram medidas usando um espectrofotômetro para placas de microtitulação. A antigenicidade das amostras foi determinada por comparação na curva do comprimento completo PE ou comprimento completo PilA antígeno de referência e é expresso em ug/ml. A referência representada 100% de antigenicidade.

[00351] Como observado na Tabela 6: A antigenicidade foi observada com a proteína de fusão PE-PilA LVL291 purificada comparado aos antígenos PE E PilA monovalentes. Tabela 6: Antigenicidade relativa obtido com purificado proteína de fusão PE- PilA LVL291 no teste de antigenicidade.

Exemplo 19: Imunogenicidade de proteína de fusão PE-PilA LVL735.

[00352] Camundongos fêmeas Balb/c (n = 34) foram imunizados pela via intramuscular nos dias 0, 14 e 28 com 50 μl de formulação de vacina contendo 1, 0,2 ou 0,04 μg de proteína de fusão PE-PilA LVL317 ou LVL735 formulado dentro de AS01E ou AlPO4 (fosfato de alumínio). As respostas de anticorpos para PE e PilA foram determinadas em soros individuais coletados a dia 42 e o nível de IgG contra PE e PilA foi medido e expresso em μg /ml.

[00353] Ver Figura 27 para resposta de anticorpos PE e PilA para LVL317 e LVL735. GMC = concentração média geométrica. GMT = título médio geométrico. IC = intervalos de confiança.

Exemplo 20: Eficácia protetora das proteínas de fusão LVL735 e LVL317 em um modelo de colonização nasofaringeal de camundongo não tipificável de Haemophilus influenzae.

[00354] Camundongos fêmeas Balb/c foram intranasalmente imunizados nos dias 0 e 14 com 10 μl de formulação de vacina contendo 5,8 μg de LVL735 ou LVL317 misturado com 0,5 μg de E. coli labile toxina (LT). Uma dose reforçada de 5,8 μg de LVL735 ou LVL317 sem adjuvante foi administrada a dia 28. Camundongos de controle foram vacinados com LT apenas nos dias 0 e 14, e PBS a dia 28. Animals foram intranasalmente desafiados com 5 x 106 cfu de cepa NTHi 3224A a dia 42. Colônias bacterianas foram contadas em cavidades nasais removidas 1 e 2 dias após o desafio (n = 10/tempo-ponto).

[00355] Cavidades nasais são homogeneizadas em meio e uma quantificação bacteriana é realizada. Os resultados são bem expressos em CFU/ml.

[00356] Ver Figura 28 para o efeito de vacinação LVL735 e LVL317 sobre depuração bacteriana em um modelo de camundongo de colonização nasofaringeal de Haemophilus influenzae não tipificável.

Exemplo 21: Formulação de vacinas multivalentes compreendendo a proteína de fusão PE-PilA

[00357] 3 vacinas foram projetadas:

[00358] 10V: Uma vacina dez valente (10V) contendo os seguintes dez conjugados de sacarídeos capsulares de S. pneumoniae: sacarídeo capsular de sorotipo 1 conjugado à proteína D (1-PD), sacarídeo capsular de sorotipo 4 conjugado à proteína D (4-PD), sacarídeo capsular de sorotipo 5 conjugado à proteína D (5-PD), sacarídeo capsular de sorotipo 6B conjugado à proteína D (6B-PD), sacarídeo capsular de sorotipo 7F conjugado à proteína D (7F-PD), sacarídeo capsular de sorotipo 9V conjugado à proteína D (9V-PD), sacarídeo capsular de sorotipo 14 conjugado à proteína D (14-PD), sacarídeo capsular de sorotipo 23F conjugado à proteína D (23F-PD), sacarídeo capsular de sorotipo 18C conjugado ao toxóide de tétano (18C-TT) e sacarídeo capsular de sorotipo 19F conjugado à difteria toxina (19F-DT).

[00359] 12V: Uma vacina doze valente (12V) contendo os mesmos dez conjugados de sacarídeos capsulares de S. pneumoniae como 10V com um adicional de dois sacarídeos conjugados de S. pneumoniae, 19A conjugado à CRM197 (19ACRM) e 6A conjugado à CRM197 (6ACRM).

[00360] Proteínas 12V+ (12V+prot): uma vacina contendo os mesmos doze conjugados de sacarídeos capsulares de S. pneumoniae como 12V com a adição de PhtD, dPly e proteína de fusão PE-PilA.

[00361] Preparação de dPly: Pneumolisina pneumocócica foi preparada e detoxificada como descrito em WO2004/081515 e WO2006/32499 usando detoxicação de formaldeído.

Expressão e purificação de PhtD:

[00362] EXPRESSÃO DE PhtD: O pHtD proteína é um membro da família de proteínas da tríase histidina pneumocócica (Pht) caracterizada pela presença de tríades de histidina. PhtD é a 838 aa- molécula e carrega 5 tríades de histidina (ver Medlmmune WO00/37105 SEQ ID NO: 4 para sequência de aminoácidos e SEQ ID NO: 5 para sequência de DNA). PhtD também contém uma região rica em prolina no meio (posição de aminoácido 348-380). PhtD tem uma sequência de sinal 20 aa-N-terminal. Preparação e purificação de PhtD é descrito em WO2007/071710 (ver, por exemplo, Exemplo 1b). A sequência de aminoácidos 21-838 de SEQ ID NO:4 a partir de WO00/37105 corresponde a SEQ ID NO:220. SEQ ID NO:220 Ser Tyr Glu Leu Gly Arg His Gln Ala Gly Gln Val Lys Lys Glu Ser Asn Arg Val Ser Tyr Ile Asp Gly Asp Gln Ala Gly Gln Lys Ala Glu Asn Leu Thr Pro Asp Glu Val Ser Lys Arg Glu Gly Ile Asn Ala Glu Gln Ile Val Ile Lys Ile Thr Asp Gln Gly Tyr Val Thr Ser His Gly Asp His Tyr His Tyr Tyr Asn Gly Lys Val Pro Tyr Asp Ala Ile Ile Ser Glu Glu Leu Leu Met Lys Asp Pro Asn Tyr Gln Leu Lys Asp Ser Asp Ile Val Asn Glu Ile Lys Gly Gly Tyr Val Ile Lys Val Asp Gly Lys Tyr Tyr Val Tyr Leu Lys Asp Ala Ala His Ala Asp Asn Ile Arg Thr Lys Glu Glu Ile Lys Arg Gln Lys Gln Glu His Ser His Asn His Gly Gly Gly Ser Asn Asp Gln Ala Val Val Ala Ala Arg Ala Gln Gly Arg Tyr Thr Thr Asp Asp Gly Tyr Ile Phe Asn Ala Ser Asp Ile Ile Glu Asp Thr Gly Asp Ala Tyr Ile Val Pro His Gly Asp His Tyr His Tyr Ile Pro Lys Asn Glu Leu Ser Ala Ser Glu Leu Ala Ala Ala Glu Ala Tyr Trp Asn Gly Lys Gln Gly Ser Arg Pro Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Asn Ala Asn Pro Ala Gln Pro Arg Leu Ser Glu Asn His Asn Leu Thr Val Thr Pro Thr Tyr His Gln Asn Gln Gly Glu Asn Ile Ser Ser Leu Leu Arg Glu Leu Tyr Ala Lys Pro Leu Ser Glu Arg His Val Glu Ser Asp Gly Leu Ile Phe Asp Pro Ala Gln Ile Thr Ser Arg Thr Ala Arg Gly Val Ala Val Pro His Gly Asn His Tyr His Phe Ile Pro Tyr Glu Gln Met Ser Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ala Arg Ile Ile Pro Leu Arg Tyr Arg Ser Asn His Trp Val Pro Asp Ser Arg Pro Glu Gln Pro Ser Pro Gln Ser Thr Pro Glu Pro Ser Pro Ser Pro Gln Pro Ala Pro Asn Pro Gln Pro Ala Pro Ser Asn Pro Ile Asp Glu Lys Leu Val Lys Glu Ala Val Arg Lys Val Gly Asp Gly Tyr Val Phe Glu Glu Asn Gly Val Ser Arg Tyr Ile Pro Ala Lys Asp Leu Ser Ala Glu Thr Ala Ala Gly Ile Asp Ser Lys Leu Ala Lys Gln Glu Ser Leu Ser His Lys Leu Gly Ala Lys Lys Thr Asp Leu Pro Ser Ser Asp Arg Glu Phe Tyr Asn Lys Ala Tyr Asp Leu Leu Ala Arg Ile His Gln Asp Leu Leu Asp Asn Lys Gly Arg Gln Val Asp Phe Glu Ala Leu Asp Asn Leu Leu Glu Arg Leu Lys Asp Val Pro Ser Asp Lys Val Lys Leu Val Asp Asp Ile Leu Ala Phe Leu Ala Pro Ile Arg His Pro Glu Arg Leu Gly Lys Pro Asn Ala Gln Ile Thr Tyr Thr Asp Asp Glu Ile Gln Val Ala Lys Leu Ala Gly Lys Tyr Thr Thr Glu Asp Gly Tyr Ile Phe Asp Pro Arg Asp Ile Thr Ser Asp Glu Gly Asp Ala Tyr Val Thr Pro His Met Thr His Ser His Trp Ile Lys Lys Asp Ser Leu Ser Glu Ala Glu Arg Ala Ala Ala Gln Ala Tyr Ala Lys Glu Lys Gly Leu Thr Pro Pro Ser Thr Asp His Gln Asp Ser Gly Asn Thr Glu Ala Lys Gly Ala Glu Ala Ile Tyr Asn Arg Val Lys Ala Ala Lys Lys Val Pro Leu Asp Arg Met Pro Tyr Asn Leu Gln Tyr Thr Val Glu Val Lys Asn Gly Ser Leu Ile Ile Pro His Tyr Asp His Tyr His Asn Ile Lys Phe Glu Trp Phe Asp Glu Gly Leu Tyr Glu Ala Pro Lys Gly Tyr Thr Leu Glu Asp Leu Leu Ala Thr Val Lys Tyr Tyr Val Glu His Pro Asn Glu Arg Pro His Ser Asp Asn Gly Phe Gly Asn Ala Ser Asp His Val Arg Lys Asn Lys Val Asp Gln Asp Ser Lys Pro Asp Glu Asp Lys Glu His Asp Glu Val Ser Glu Pro Thr His Pro Glu Ser Asp Glu Lys Glu Asn His Ala Gly Leu Asn Pro Ser Ala Asp Asn Leu Tyr Lys Pro Ser Thr Asp Thr Glu Glu Thr Glu Glu Glu Ala Glu Asp Thr Thr Asp Glu Ala Glu Ile Pro Gln Val Glu Asn Ser Val Ile Asn Ala Lys Ile Ala Asp Ala Glu Ala Leu Leu Glu Lys Val Thr Asp Pro Ser Ile Arg Gln Asn Ala Met Glu Thr Leu Thr Gly Leu Lys Ser Ser Leu Leu Leu Gly Thr Lys Asp Asn Asn Thr Ile Ser Ala Glu Val Asp Ser Leu Leu Ala Leu Leu Lys Glu Ser Gln Pro Ala Pro Ile

Expressão de proteína D

[00363] Proteína D foi expressa como descrito em WO2007/071710 Expressão e purificação de CRM197 E. coli:

[00364] A fim de melhorar o rendimento de processo para a produção de CRM197, modos de expressão alternativos foram avaliados com uma marcação de um aumento de 10 vezes de rendimento do processo. A construção selecionada foi expressa em cepa de Escherichia coli (B834 (DE3)) como uma fusão entre a sequência de sinal Flgl a partir de E. coli (19aa) e CRM197 (537aa). A sequência de sinal é clivada quando transportada para o periplasma. O CRM197 é extraído por choque osmótico antes de ser purificado. O processo de purificação é similar a um descrito em WO2006/100108 exceto que uma etapa cromatográfica adicional (Phenyl Sepharose) foi adicionado entre as etapas Q-Sepharose-XL e hidroxiapatita e a última etapa cromatográfica sobre o octil-Sepharose 4FF foi removido.

Preparação de conjugados

[00365] É bem conhecido na técnica como fazer polissacarídeos pneumococcal purificados. Para os fins destes exemplos os polissacarídeos foram feitos essencialmente como descritos em EP072513 ou por métodos intimamente relacionados. Antes da conjugação, os polissacarídeos podem ser dimensionados por microfluidização como descrito abaixo.

[00366] As condições de ativação e copulação são específicas para cada polissacarídeo. Estes são dados na Tabela 1. Polissacarídeo dimensionado (exceto para 6B e 23F) foi dissolvido em NaCl 2M, NaCl 0,2M ou em água para injeção (WFI). A concentração de polissacarídeo ótimo foi avaliada para todos os sorotipos. Todos os sorotipos exceto sorotipo 18C foram conjugados diretamente para a proteína transportadora como detalhado abaixo.

[00367] A partir de uma solução de carga a 100 mg/ml em solução de acetonitrila ou acetonitrila/água (50%/50%), CDAP (tetrafluoroborato de 1- ciano-4-dimetilaminopiridínio) (razão CDAP/PS 0,5-1,5 mg/mg PS) foi adicionado na solução de polissacarídeo. 1,5 minutos depois, 0,2M-0,3M de NaOH foi adicionado para obter o pH da ativação específica. A ativação do polissacarídeo foi realizada a este pH durante 3 minutos a 25 °C. A proteína purificada (proteína D, CRM197 ou DT) (a quantidade depende fs razão da de PS inicial/ proteína transportadora) foi adicionada no polissacarídeo ativado e a reação de copulação foi realizada no pH específico durante até 2 horas (dependendo do sorotipo) sob regulação do pH. A fim de resfriar grupos éster de cianato não reagidos, uma solução de glicina a 2M foi então adicionado na mistura. O pH foi ajustado ao pH de extinção (pH 9,0). A solução foi agitada durante 30 minutos a 25 °C e então incubada durante a noite a 2-8 °C com agitação lenta contínua.

Preparação de 18C:

[00368] 18C foi ligado na proteína transportadora através de um ligador - dihidrazida de ácido adípico (ADH)

[00369] Sorotipo de polisacarídeo 18C foi microfluidizado antes da conjugação.

Derivatização de toxóide do tétano com EDAC (cloridrato de 2-etil-3-(3- dimetilaminopropil) carbodiimida)

[00370] Para derivatização do toxóide do tétano, TT purificado foi diluído a 25 mg/ml em 0,2M de NaCl e o espaçador ADH foi adicionado a fim de alcançar uma concentração final de 0,2M. Quando a dissolução do espaçador foi completa, o pH foi ajustado a 6.2. EDAC (1-etil-3-(3-dimetil- aminopropil) carbodiimida) foi então adicionado para alcançar uma concentração final de 0,02M e a mistura foi agitada durante 1 hora sob regulação do pH. A reação de condensação foi parada por aumentar o pH até 9,0 durante pelo menos 30 minutos a 25°C.

[00371] TT derivatizado foi então diafiltrado (10 kDa de membrana CO) a fim de remover ADH residual e reagente EDAC.

[00372] TTAH (Toxóide do tétano conjugado à um ligador ADH) em volume foi finalmente filtrado de modo estéril até a etapa de copulação e armazenado a -70°C. Copulação química de TTAH a PS 18C

[00373] Detalhes dos parâmetros de conjugação podem ser encontrados na Tabela 1.

[00374] 2 gramas de PS microfluidizado foram diluídos na concentração definida em água e ajustado a 2M de NaCl por adição de pó de NaCl.

[00375] Solução de CDAP (100 mg/ml recentemente preparado em 50/50 v/v acetonitrila/WFI) foi adicionado para alcançar a razão CDAP/PS apropriada. O pH foi elevado até a ativação pH 9,0 pela adição de 0,3M de NaOH e foi estabilizado neste pH até adição de TTAH.

[00376] After 3 minutos, TTAH derivatizado (20 mg/ml em 0,2 M de NaCl) foi adicionado para alcançar uma razão TTAH /PS de 2; o pH foi regulado na copulação pH 9,0. A solução foi deixada uma hora sob regulação do pH.

[00377] Para extinção, uma solução de glicina a 2M, foi adicionada na mistura PS/TTAH/CDAP.

[00378] O pH foi ajustado até o pH de extinção pH (pH 9,0).

[00379] A solução foi agitada durante 30 min a 25 °C, e então durante a noite a 2-8°C com agitação lenta contínua.

Condições específicas de ativação/copulação/extinção de conjugados de sacarídeo capsular de S. pneumoniae -Proteína D/TT/DT/PhtD/Ply

[00380] Onde “μfluido” aparece em um cabeçalho, indica que o sacarídeo foi dimensionado por microfluidização antes da conjugação. Tamanhos de sacarídeos seguindo microfluidização são dados na Tabela 2. Tabela 1 - Condições específicas de ativação/copulação/extinção de conjugados de sacarídeo capsular de S. pneumoniae -Proteína D/TT/DT/CRM197

Nota: pHa,c,q corresponde ao pH para ativação, copulação e extinção, respectivamente

Purificação dos conjugados:

[00381] Os conjugados foram purificados por filtração em gel usando uma coluna de filtração em gel Sephacryl S400HR equilibrados com 0,15M de NaCl (exceto S500HR foi usado como tampão durante 18C e 20mM de acetato contendo 1,15M de NaCl pH 6,2 foi usado durante 19A) para remover pequenas moléculas (incluindo DMAP) e sacarídeo não conjugado e proteína. Com base nos tamanhos moleculares diferentes dos componentes de reação, conjugados PS-PD, PS-TT, PS-CRM197 ou PS-DT são eluídos primeiro, seguido por PS livre, então por transportadora de proteína livre e finalmente DMAP e outros sais (NaCl, glicina).

[00382] Frações contendo conjugados são detectadas por UV280 nm. Frações são reunidas de acordo com seu Kd, estéril filtrado (0,22 μm) e armazenado a +2-8°C. As razões de PS/proteína nas preparações de conjugado foram determinadas.

Formulação das vacinas

[00383] A vacina 10V contém conjugados de sacarídeo capsular de S. pneumoniae de sorotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F absorvidos sobre fosfato de alumínio juntos em uma dose humana de 1, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 3, 1 μg (os sacarídeos foram individualmente adsorvidos para fosfato de alumínio, eles foram então misturados juntos e o nível de fosfato de alumínio ajustado a 500μg).

[00384] A vacina 12V foi feita no mesmo modo como a vacina 10V com sorotipos adicionais 19A e 6A conjugados a doses de 2μg absorvidos sobre fosfato de alumínio adicionado.

[00385] A vacina 12V - proteínas foi feita no mesmo modo como a vacina 12V exceto proteínas PhtD, dPly e PE-PilA foram adicionadas. O PE- PilA foi produzido como aqui descrito. Os 12 conjugados e as proteínas foram misturados juntos usando as dosagens descritas durante 12V acima e as proteínas em dosagens de 30μg cada (nota-se que isto refere-se a 30μg de PE- PilA, e não 30μg de PE e 30μg de PilA).

Exemplo 22: Comparação da imunogenicidade de 10V, 12V E 12V+proteínas vacinas em camundongos Descrição do ELISA PS polissacarídeo anti-pneumocócico (polissacarídeo)

[00386] As microplacas foram revestidas durante 2 horas a 37°C com polissacarídeo capsular (CPS) (100 μl por cavidade de 2,5 μg/ml de PS1 e PS3, 5 μg/ml de PS4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V ou 14; 10 μg/ml de PS19A e 23F ou 40 μg/ml de PS18C e PS19F em PBS). As placas foram lavadas três vezes com NaCl 150 mM (0,9%) -Polisorbato 20 0,05%. Soros foram diluídos (1/2 para 6A e 6B e 1/10 para os outros sorotipos) em PBS-Polisorbato20 0,05% contendo CPS (1 mg CPS/ml de soro não diluído exceto ou 6A e 6B que foi a 2,5mg/ml) V/V e incubados durante 1 hora a 37°C a fim de neutralizar os anticorpos dirigidos para os CPS. Os soros a partir de camundongos imunizados como descrito na seção entitulada ‘imunogenicidade de três formulações de vacinas em camundongos’ ou uma referência (uma referência interna calibrada com IgG de camundongo Chrompure) foi adicionado nas microcavidades e diluídas em série 100 μl (etapa de diluição de duas vezes) em PBS-Polisorbato20 0,05%. As placas foram incubadas sob agitação durante 30 minutos em temperatura ambiente. As placas foram lavadas como acima e anticorpos IgG anti-camundongo conjugados à peroxidase (100 μl por cavidade) foi adicionado, as placas foram incubadas durante 30 minutos em temperatura ambiente com agitação. Após agitação, o substrato (4 mg de OPDA (orto fenilen-diamina) em 10 ml de citrato 0,1M pH 4,5-4,6 e 5 μl de H2O2) foi adicionado em cada cavidade (100 μl) e as placas incubadas durante 15 minutos no escuro. A reação foi parada por adição de HCl 1N (50μl). A absorbância foi lida a 490nm ou 620nm para a referência usando um espectrofotômetro. A cor revelada é diretamente proporcional à quantidade de anticorpo presente no soro.

Descrição de ELISA para medir anticorpos PD, PE e PilA

[00387] As placas foram revestidas durante a noite a 4°C com 100 μl por cavidade de 2 μg/ml de PD (1 mg/ml), 2 μg/ml de PE (1500 μg/ml), 2 μg/ml de PilA (3660 μg/ml) em tampão carbonato pH 9,6. As placas foram lavadas quatro vezes com NaCl 0,9% Polisorbato 20 0,05%. Para PE e PilA ELISA, as placas foram saturadas durante 30 min em temperatura ambiente (com agitação) com PBS-BSA1%. Após lavagem, soros a partir de camundongos imunizados como descrito na seção entitulada ‘imunogenicidade de três formulações de vacinas em camundongos’ ou uma referência (uma referência interna calibrada com IgG de camundongo Chrompure) foi adicionado a microcavidades e diluídas em série 100 μl (etapa de diluição de duas vezes) em PBS Polisorbato 20 0,05% (para o teste PD) e PBS Polisorbato 20 0,05% BSA 0,1% (para o teste PE e PilA). As placas foram então incubadas durante 30 min em temperatura ambiente com agitação. Após lavagem, as placas foram incubadas com um anticorpo IgG anti-camundongo conjugado à peroxidaseperoxidase (100 μl por cavidade) em temperatura ambiente durante 30 minutos com agitação. As placas foram então lavadas como acima e o substrato conjugado (4 mg de OPDA (orto fenilen-diamina) em 10 ml de citrato 0,1M pH 4,5-4,6 e 5 μl de H2O2) como adicionado em cada cavidade (100 μl) durante 15 min na escuridão. A reação foi parada por adição de HCl 1N 50 μl e a absorbância foi lida a 490 nm (620 nm para a referência).

Descrição de ELISA para medir anticorpos PhtD e dPly

[00388] As placas foram revestidas durante 2 horas a 37°C com 100 μl por cavidade de 1 μg/ml de PhtD (1021 μg/ml) ou 4μg/ml de Ply (367μg/ml). As placas foram então lavadas três vezes com NaCl 0,09% Polisorbato 0,05%. Após lavagem, soros a partir de camundongos imunizados como descrito na seção entitulada ‘imunogenicidade de três formulações de vacinas em camundongos’ ou uma referência (uma referência interna calibrada com IgG de camundongo Chrompure) (como adicionado a microcavidades e diluídas em série 100 μl (etapa de diluição de duas vezes) em PBS Polisorbato 20 0,05%. As placas foram incubadas durante 30 min em temperatura ambiente com agitação. Após lavagem, as placas foram incubadas com um anticorpo IgG anti-camundongo conjugado à peroxidase (100 μl por cavidade) em temperatura ambiente durante 30 minutos com agitação. As placas foram lavadas como acima e o substrato conjugado (4 mg de OPDA em 10 ml de citrato 0,1M ph 4,5 e 5 μl de H2O2) foi adicionado em cada cavidade (100 μl) durante 15 min na escuridão. A reação foi parada por adição de HCl 1N 50 μl e a absorbância foi lida a 490 nm (620 nm para o filtro de referência).

Descrição de teste opsonofagocitose (OPA)

[00389] Amostras de soro foram aquecidas durante 45 min a 56 °C para inativar qualquer complemento endógeno restante. Vinte e cinco alíquotas de microlitros de cada 1:2 amostra de soro diluída foram duas vezes diluídas em série em 25 μl de tampão OPA (HBSS (solução de sal equilibrada de Hanks)-14,4% FCS inativado (soro de bezerro fetal)) por cavidade de uma placa de 24 cavidades de microlitro de fundo redondo. Subsequentemente, 25 μl de uma mistura de células HL-60 ativadas (1 x 107 células/ml), semente de trabalho pneumocócica recentemente descongelada e complemento de coelho bebê recentemente descongelado em um, por exemplo, razão 4/2/1 (v/v/v) (exceto para sorotipos 1, 6B e 6A para a qual a razão foi 4/2/2) foram adicionados nos soros diluídos para dar um volume final de 50 μl. A placa de teste foi incubada durante 2 h a 37 °C com agitação orbital (210 rpm) para promover o processo fagocítico. A reação foi parada colocando uma microplaca em gelo durante pelo menos 1 min, a placa é mantidad em gelo até uso. Uma alíquota de 20 μl de cada cavidade da placa foi então transferida para a cavidade correspondente de uma microplaca de 96 cavidades de fundo plano e 50 μl de caldo Todd-Hewitt-0,9% de agar foi adicionado a cada cavidade. Após incubação durante a noite a 37 °C e 5% CO2, colônias pneumococcal que apareceram no agar foram contadas usando um sistema de análise de imagem automatizada (KS 400, Zeiss, Oberkochen, Alemanha). Oito cavidades sem amostra de soro foram usadas como controles bacterianos para determinar o número de pneumococci por cavidade. O número médio de CFU das cavidades de controle foi determinado e usado para o cálculo da atividade de extermínio para cada amostra de soro. O título de OPA para as amostras de soro foi determinado pela diluição recíproca de soro capaz de facilitar 50% de extermínio do pneumococci. O título de opsonofagocítico foi calculado por por uso de uma análise de ajuste de curva de 4 parâmetros.

Imunogenicidade de três formulações de vacina em camundongos.

[00390] 2 grupos de 27 camundongos Balb/c fêmeas distribuídos em 2 experimentos foram imunizados por injeções intramuscular (IM) nos dias 0, 14 e 28 com 1/10 de dose humana de formulação diferente incluindo apenas proteínas (PhtD, dPly e PEPilA), Prevnar 13 ™ (uma vacina para estreptococos comercialmente disponível - resultados não apresentados) lotes de GMP de proteínas 10V, 12V (DSP2A017) e 12V+ (DSP2A012). Camundongos receberam uma administração em uma perna diferente (imitando sítios diferentes em crianças pequenas e experiências clínicas) 1/10o. de dose humana de Infanrix Hexa (TM uma vacina compreendendo toxóide de difteria, toxóide do tétano, toxóide de coqueluche, hemaglutinina filamentosa, pertactina, antígeno de superfície de hepatite B, virus da pólio inativado tipos 1, 2 e 3 e sacarídeo b Haemophilus influenzae (PRP)).

[00391] Níveis anti-IgG e títulos opsonofagocitose foram determinados respectivamente em soros individuais e reunidos e coletados em 42 dias.

[00392] O potencial das vacinas proteínas de 12V + para induzir os títulos de anticorpo IgG e atividade opsônica foi avaliado e comparado ao das vacinas 12V e 10V.

[00393] Soros a partir de camundongos injetados com as formulações diferentes foram testados em ELISA (como descrito acima) contra os sorotipos de polissacarídeos e proteínas e em OPA contra os 12 sorotipos de polissacarídeos.

[00394] A vacina de proteínas 12V + proteínas induziu uma resposta similar para o 12V na maior parte dos sorotipos.

[00395] Os resultados na Figura 31 demonstraram que não houve nenhuma diferença estatística entre as respostas de anticorpos PE, PilA, PhtD, Ply e PD medidos para a formulação 12V+ e uma formulação que não compreende os conjugados de sacarídeos de S. pneumoniae.

Exemplo 23: Comparação da imunogenicidade de vacinas de proteínas 10V, 12V E 12V+ em porquinhos da índia Descrição de ELISA PS polissacarídeo anti-pneumocócicol

[00396] Microplacas foram revestidas durante 2 horas a 37°C com 100 μl por cavidade de 2,5 μg/ml de PS1, 5 μg/ml de PS4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V ou 14; 10 μg/ml de PS19A e 23F, 40 μg/ml de PS18C e PS19F ou IgG anti- porquinho da índia de cabra Affinipure (2,4 mg/ml) diluídas a 2 μg/ml para as cavidades de referência em PBS. As placas foram lavadas três vezes com NaCl 150 mM (0,9%)-Polisorbato20 0,05%. Soro reunido a partir de cada grupo foi diluído (1/2 para PS 6A e 6B e 1/10 para todos os outros sorotipos) em PBS-Polisorbato20 0,05% contendo CPS (1 mg CPS/ml de soro não diluído exceto para 6A e 6B a 2,5 mg/ml) V/V e incubados durante 1 hora a 37°C a fim de neutralizar os anticorpos dirigidos para CPS. O soro a partir de porquinhos da índia imunizado como descrito na seção entitulada ‘imunogenicidade de três formulações de vacinas nos porquinhos da índia’ foi adicionado nas microcavidades e diluídas em série 100 μl (etapa de diluição de duas vezes) em PBS-Polisorbato20 0,05% ou uma referência (IgG porquinho da índia Chrompure (11mg/ml) diluídas a 0,25μg/ml em PBS- Polisorbato20 0,05%) foi adicionado. As placas foram incubadas sob agitação durante 30 minutos em temperatura ambiente. As placas foram lavadas como acima e anticorpos de IgG anti-porquinho da índia conjugado a peroxidase (100 μl por cavidade) foram adicionados e as placas incubadas durante 30 minutos em temperatura ambiente com agitação. Após agitação, o substrato (4 mg de OPDA em 10 ml de citrato 0,1M pH 4,5-4,6 e 5 μl de H2O2) foi adicionado em cada cavidade (100 μl) e incubadas durante 15 minutos no escuro. A reação foi parada por adição de HCl 1N. Absorbância foi lida a 490nm (620nm para a referência) usando um espectrofotômetro. A cor revelada é diretamente proporcional à quantidade de anticorpo presente no soro.

Descrição de ELISA para medir anticorpos anti PD, PE, e PilA,

[00397] As placas foram revestidas durante 2 horas a 37°C com 100 μl por cavidade de 2 μg/ml de PD (1 mg/ml), 2 μg/ml de PE (1500 μg/ml), ou 2 μg/ml de PilA (3660 μg/ml) em tampão carbonato pH 9,6 em PBS ou IgG anti-porquinho da índia de cabra Affinipure (2,4mg/ml) diluídas a 2μg/m para as cavidades de referência em PBS. As placas foram lavadas 4 vezes com NaCl 0,9% Polisorbato 20 0,05%. Para ELISAs de PE e PilA (esta etapa não foi realizada para os PD e Ply ELISAs), as placas foram saturadas 30 min em temperatura ambiente com PBS-BSA1%. Após lavagem, soros a partir de porquinhos da índia imunizado como descrito na seção entitulada ‘imunogenicidade de três formulações nos porquinhos da índia’ ou uma amostra de soro de referência (uma referência interna calibrada com IgG porquinho da índia Chrompure) foi adicionado a microcavidades e diluídas em série 100 μl (etapa de diluição de duas vezes) em PBS Polisorbato 20 0,05% (para o PD ELISA) e PBS Polisorbato 20 0,05% BSA 0,1% para o PE e PilA ELISAs. As placas foram incubadas durante 30 min em temperatura ambiente. Após lavagem, as placas foram incubadas com um anticorpo IgG anti-porquinho da índia conjugado à peroxidase (100 μl por cavidade) em temperatura ambiente durante 30 minutos com agitação. As placas foram lavadas como acima e o substrato conjugado (4 mg de OPDA em 10 ml de citrato 0,1M pH 4,5-4,6 e 5 μl de H2O2) foi adicionado em cada cavidade (100 μl) durante 15 min no escuro. A reação foi parada por adição de HCl 1N 50 μl e a absorbância é lida a 490 nm (620 nm para o filtro de referência).

Descrição de ELISA para medir anticorpos PhtD e dPly

[00398] As placas foram revestidas durante 2 horas a 37°C com 100 μl por cavidade de 1 μg/ml de PhtD (1021 μg/ml) ou 2μg/ml Ply (376μg/ml) em PBS. As placas foram então lavadas 4 vezes com NaCl 0,9% Polisorbato 20 0,05%. Após lavagem, soros de porquinhos da índia imunizados como descrito na seção entitulada ‘imunogenicidade de três formulações de vacinas nos porquinhos da índia’ ou uma referência (uma referência interna calibrada com IgG de porquinho da índia Chrompure) foi adicionado a microcavidades e diluídas em série 100 μl (etapa de diluição de duas vezes) em PBS Polisorbato 20 0,05%. As placas foram incubadas durante 30 min em temperatura ambiente com agitação. Após lavagem, as placas foram incubadas com um anticorpo IgG anti-porquinho da índia conjugado à peroxidase (100 μl por cavidade) em temperatura ambiente durante 30 minutos com agitação. As placas foram lavadas como acima e o substrato conjugado (4 mg de OPDA em 10 ml de citrato 0,1M pH 4,5-4,6 e 5 μl de H2O2) foi adicionado em cada cavidade (100 μl) durante 15 min no escuro. A reação foi parada por adição de HCl 1N 50 μl e a absorbância foi lida a 490 nm (620 nm para o filtro de referência).

Teste de opsonofagocitose

[00399] Amostras de soro foram aquecidas durante 45 min a 56 °C para inativar qualquer complemento endógeno restante. Vinte e cinco alíquotas de microlitros de cada 1:2 amostra de soro diluída foi duas vezes diluída em série em 25 μl de tampão OPA (HBSS (solução de sal equilibrada de Hanks)-14,4% de FCS inativado (soro de bezerro fetal)) por cavidade de uma placa de 24 cavidades de microlitro de fundo redondo. Subsequentemente, 25 μl de uma mistura de células HL-60 ativadas (1 x 107 células/ml), semente de trabalho de pneumococos recentemente descongelada e complemento de coelho bebê recentemente descongelado em, por exemplo, uma razão de 4/2/1 (v/v/v) (exceto para sorotipos 1,6B e 6A para a qual a razão foi de 4/2/2) foi adicionado no soro diluído para dar um volume final de 50 μl. A placa de teste foi incubada durante 2 h a 37 °C com agitação orbital (210 rpm) para promover o processo fagocítico. A reação foi parada colocando em uma microplaca em gelo durante pelo menos 1 min (a placa deve ser mantida no gelo até uso posterior. Uma alíquota de 20 μl de cada cavidade da placa foi então transferida para a cavidade correspondente de uma microplaca de 96 cavidades de fundo plano e 50 μl de caldo Todd- Hewitt-0,9% de agar foi adicionado em cada cavidade. Após incubação durante a noite a 37 °C e 5% de CO2, colônias pneumocócidas que aparecem no agar foram contadas usando um sistema de análise de imagem automatizada (KS 400, Zeiss, Oberkochen, Alemanha). Oito cavidades sem amotra de soro foram usadas como controles bacterianos para determinar o número de pneumococci por cavidade. O número médio de CFU das cavidades de controle foi determinado e usado para o cálculo da atividade de extermínio para cada amostra de soro. O título de OPA para as amostras de soro foi determinado pela diluição recíproca de soro capaz de facilitar 50% de extermínio do pneumococos. O título opsonofagocítico foi calculado por uso de uma análise de ajuste de 4 parâmetros.

Imunogenicidade de três formulações em porquinhos da índia

[00400] 2 grupos de 17 porquinhos da índia distribuídos em 2 experimentos foram imunizados por injeções intramuscular (IM) nos dias 0, 14 e 28 com ^ de dose humana de formulação diferente incluindo apenas proteínas (PhtD, dPly e PEPilA), Prevnar 13 ™ (vacina contra estreptococos comercialmente disponível - resultados não apresentados) 10V, 12V (DSP2A017) e 12V+ proteínas (DSP2A012) lotes GMP. Porquinhos da índia receberam em uma perna diferente (imitando a co-administração em sítios diferentes em crianças pequenas e experiências clínicas) ^ de dose humana de Infanrix Hexa ™ (uma vacina compreendendo toxóide de difteria, toxóide do tétano, toxóide de coqueluche, hemaglutinina filamentosa, pertactina, antígeno de superfície de hepatite B, vírus da pólio inativada tipos 1, 2 e 3 e sacarídeo b de Haemophilus influenzae (PRP).

[00401] Níveis anti-IgG e títulos de opsonofagocitose foram determinados respectivamente em soros individuais e reunidos em pools e coletados em 42 dias.

[00402] Os títulos de anticorpo IgG e a atividade opsônica foi avaliada e comparada entre as 12V+proteínas, vacinas 12V e 10V.

[00403] Soros a porquinhos da índia injetados com as formulações diferentes foram testados em ELISA contra os sorotipos de polissacarídeos e proteínas e em OPA contra os 12 sorotipos na formulação.

[00404] As 12V + proteínas induziram respostas similares para a formulação 12V.

[00405] Os resultados na Figura 34 demonstraram que não existe impacto negativo sobre a imunogenicidade dos conjugados 12-valente quando eles são combinados com PEPilA.

[00406] Os resultados obtidos com formulação GMP de 12V+proteínas demonstraram imunogenicidade dos polissacarídeos 10V, bem como as proteínas e suportam a avaliação clínica desta formulação.

Claims (13)

1. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de compreender conjugados de sacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae e um componente de proteína, em que o número de sorotipos de sacarídeos de Streptococcus pneumoniae é menor ou igual a 23 e em que a composição imunogênica compreende proteína E e PilA, em que a proteína E e PilA estão presentes em uma proteína de fusão.

2. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão tem fórmula I: (X) m - (R1)n - A - (Y) o - B - (Z)p (fórmula I) em que: X é um peptídeo de sinal ou MHHHHHH (SEQ ID NO. 2); m é 0; R1 é um aminoácido; n é 0; o é 0 ou 1; Z é GGHHHHHH (SEQ ID NO: 3); p é 0 ou 1; A é um fragmento imunogênico de Proteína E como definido na SEQ ID NO: 125; Y é GG; e B é um fragmento imunogênico de PilA como definido na~SEQ ID NO: 127.

3. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão é SEQ ID NO.194.

4. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão é qualquer uma dentre SEQ ID NO. 136, SEQ ID NO. 138, SEQ ID NO. 140, SEQ ID NO. 142, SEQ ID NO. 144, SEQ ID NO. 146, SEQ ID NO. 148, SEQ ID NO. 150, SEQ ID NO. 182, SEQ ID NO. 184, SEQ ID NO. 186, SEQ ID NO. 186, SEQ ID NO. 188, SEQ ID NO. 190, SEQ ID NO. 192, SEQ ID NO. 194, SEQ ID NO. 196, SEQ ID NO. 198, SEQ ID NO. 200, SEQ ID NO. 202 ou SEQ ID NO. 204, opcionalmente em que o peptídeo de sinal foi removido.

5. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão é SEQ ID NO. 148 e o peptídeo de sinal foi removido (SEQ ID NO. 177) ou em que a proteína de fusão é SEQ ID NO. 194 e o peptídeo de sinal foi removido (SEQ ID NO. 219).

6. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que os conjugados de sacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae compreendem um de sacarídeo de sorotipo 1 conjugado, um sacarídeo de sorotipo 4 conjugado, um sacarídeo de sorotipo 5 conjugado, um sacarídeo de sorotipo 6B conjugado, um sacarídeo de sorotipo 7F conjugado, um sacarídeo de sorotipo 9V conjugado, um sacarídeo de sorotipo 14 conjugado, um sacarídeo de sorotipo 18C conjugado, um sacarídeo de sorotipo 19F conjugado e um sacarídeo de sorotipo 23F conjugado.

7. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que os conjugados de sacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae compreendem adicionalmente um sacarídeo de sorotipo 6A conjugado e um sacarídeo de sorotipo 19A conjugado.

8. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que os conjugados de sacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae compreendem um sacarídeo de sorotipo 33F conjugado e um sacarídeo de sorotipo 22F conjugado.

9. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que os conjugados de sacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae são conjugados a uma proteína transportadora independentemente selecionada do grupo consistindo de toxóide de tétano (TT), fragmento C de TT, toxóide de difteria, CRM197 (material de reação cruzada 197), Pneumolisina, proteína D (de H. influenzae), PhtD (D de tríade de poli histidina), PhtDE (uma fusão entre D e E de tríade de histidina pneumococcal) e N19.

10. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que os conjugados de sacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae compreende um sacarídeo de sorotipo 1 conjugado à proteína D, um sacarídeo de sorotipo 4 conjugado à proteína D, um sacarídeo de sorotipo 5 conjugado à proteína D, um sacarídeo de sorotipo 6B conjugado à proteína D, um sacarídeo de sorotipo 7F conjugado à proteína D, um sacarídeo de sorotipo 9V conjugado à proteína D, um sacarídeo de sorotipo 14 conjugado à proteína D, um sacarídeo de sorotipo 14 conjugado à proteína D, um sacarídeo de sorotipo 23F conjugado à proteína D, um sacarídeo de sorotipo 18C conjugado ao toxóide de tétano e um sacarídeo de sorotipo 19F conjugado ao toxóide de difteria.

11. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a composição imunogênica compreende ainda pelo menos uma proteína de Streptococcus pneumoniae não conjugada ou conjugada selecionada dentre o grupo consistindo de família de tríade de poli histidina (PhtX), pneumolisina detoxificada (dPly), família de proteína de ligação de colina (CbpX), truncados de CbpX, família LytX (enzimas autolíticas), truncados de LytX, proteínas quiméricas de truncado de CbpX - truncado de LytX, PcpA (proteína de ligação de colina pneumocócica A), PspA (proteína de superfície pneumocócica A), PsaA (adesina de superfície pneumocócica A), Sp128 (Streptococcus pneumoniae 128), Sp101 (Streptococcus pneumoniae 101), Sp130 (Streptococcus pneumoniae 130), SP125 (Streptococcus pneumoniae 125) e SP133 (Streptococcus pneumoniae 133).

12. Vacina, caracterizada pelo fato de compreender a composição imunogênica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

13. Uso de uma composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou uma vacina de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de ser na manufatura de um medicamento para o tratamento ou na prevenção de doenças causadas por infecção por Streptococcus pneumoniae ou Haemophilus influenzae em que as doenças compreendem pelo menos uma doença selecionada dentre o grupo consistindo de pneumonia, doença pneumocócica invasiva (IPD), exacerbações da doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), otite média, meningite, bacteremia e conjuntivite.

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