BR112015001735A2 - Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração. - Google Patents
Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração. Download PDFInfo
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Abstract
"formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração". a presente invenção refere-se a uma formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração, que compreende uma quantidade farmaceuticamente eficaz de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração consistindo de um peptídeo fisiologicamente ativo, que é um peptídeo insulinotrópico, e uma região fe da imunoglobulina; e um estabilizador isento de albumina, em que o estabilizador compreende um tampão, um álcool de açúcar, um tensoativo não iônico, e um agente isotônico, e refere-se a um método de preparação da formulação. um conservante pode ser adicionado para evitar contaminação microbiana. a formulação líquida da presente invenção está isenta de albumina sérica humana e de outros fatores potencialmente perigosos para o organismo, não havendo risco de contaminação viral, e pode por isso proporcionar excelente estabilidade em armazenamento ao conjugado de peptídeo insulinotrópico em concentração.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "FORMULAÇÃO LÍQUIDA
[001] A presente invenção refere-se a uma formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração, que compreende uma quantidade farmaceuticamente eficaz de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração, em que um peptídeo fisiologicamente ativo, que é um peptídeo insulinotrópico, está ligado a uma região Fc da imunoglobulina, e um estabilizador isento de albumina, em que o estabilizador compreende um tampão, um álcool de açúcar, um tensoativo não iônico, e um agente isotônico, e refere-se a um método para a preparação da formulação.
[002] A diabetes é uma doença derivada de múltiplos fatores patogenéticos e geralmente há dois tipos de diabetes. Os doentes com diabetes tipo I ou diabetes mellitus insulino-dependente (DMID) mal produzem ou não produzem insulina, que é um hormônio que regula a utilização dos hidratos de carbono. Os doentes com diabetes do tipo II ou diabetes mellitus não insulino-dependente (DMNID) apresentam um nível plasmático de insulina igual ou superior ao dos indivíduos sem diabetes. No entanto, os doentes com diabetes tipo II desenvolvem uma resistência ao metabolismo da glicose estimulado pela insulina e ao metabolismo lipídico em tecidos principais sensíveis à insulina, isto é, músculo, fígado, e tecido adiposo. Embora o nível de insulina no plasma possa aumentar, não é suficiente para superar a considerável resistência à insulina, provocando assim hiperglicemia. Hiperglicemia continuada ou não regulada está associada a um aumento na taxa de morbidade e taxa de mortalidade precoce. Muitas vezes, um aumento anormal no nível de açúcar está direta e indiretamente relacionado com alterações metabólicas e hemodinâmicas nas doenças associadas com o metabolismo de lipídeos, lipoproteínas, apolipoproteínas, e outros. Por exemplo, os doentes de diabetes mellitus tipo II em particular têm um elevado risco de desenvolver uma doença coronária, acidente vascular cerebral, doença vascular periférica, hipertensão, nefropatia, e neuropatia, bem como hemangiomas e complicações microvasculares.
[003] As terapias usadas atualmente no tratamento da diabetes tipo II incluem a administração de insulina exógena, a administração oral de fármacos, um regime alimentar terapêutico e exercício físico. Em 2005, a exenatida (Exendin-4: Byetta®) foi aprovada pela FDA como uma terapia complementar para doentes com diabetes tipo II que não atingem regulação adequada da glicose, mesmo com tratamento de metformina e/ou sulfonilureia.
[004] A exenatida (exendina-4) é um potente agonista do receptor do GLP- 1 e é produzida pela glândula salivar de lagarto. A exendina-4 apresenta afinidade com a insulina, suprime a ingestão de alimentos e o esvaziamento gástrico, e apresenta afinidade para células β em roedores (Parks et. al., Metabolism. 50:583-589, 2001; Aziz and Anderson, J. Nutr. 132: 990-995, 2002; and Egan et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 87: 1282-1290, 2002). Além disso, uma vez que a glicina está presente na posição 2 do terminal N da exidina-4, não é um substrato para a DPP IV, ao contrário do GLP-1. A desvantagem da exenatida é a sua semivida (t1/2) curta, que é de apenas 2 a 4 horas, e, portanto, tem de ser injetada duas vezes por dia (Kolterman et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 88: 3082-3089, 2003 and Fineman et al.,Diabetes Care. 26: 2370-2377, 2003).
[005] Peptídeos como a exenatida atrás descrita são facilmente desnaturados ou degradados por proteases no organismo devido à sua baixa estabilidade e perda de atividade. Além disso, o tamanho das exenatidas é relativamente pequeno e, portanto, são facilmente removidas pelo rim. Assim, os fármacos que contêm peptídeos como princípios farmaceuticamente ativos têm de ser administrados frequentemente aos doentes a fim de manter o nível desejado no soro e o título. Na maior parte dos casos, os fármacos peptídicos são administrados por injeção e a uma frequência elevada para manter o nível sérico do peptídeo fisiologicamente ativo, mas isto é muito doloroso para os doentes.
[006] Têm-se envidado muitos esforços no sentido de resolver estes problemas, e um deles foi administrar um fármaco peptídico por inalação oral ou nasal, aumentando a permeabilidade da biomembrana do fármaco peptídico. No entanto, este método tem uma eficiência de entrega do peptídeo ao organismo muito baixa comparada com a via de injeção. Portanto, há ainda muitas dificuldades para manter a atividade do fármaco peptídico in vivo no nível requerido.
[007] Por outro lado, têm-se feito esforços contínuos para maximizar os efeitos terapêuticos do fármaco, melhorando a estabilidade do fármaco peptídico no sangue e mantendo um nível sérico de fármaco elevado durante um longo período. Estas formulações de fármacos peptídicos de ação de longa duração deveriam promover um aumento na estabilidade do fármaco peptídico e também manter um título suficientemente elevado do fármaco em si, sem induzir respostas imunitárias nos doentes.
[008] Como método de estabilização de peptídeos e prevenção da sua degradação pela protease, tem havido muitas tentativas para modificar uma sequência específica de aminoácidos sensíveis à protease. Por exemplo, o GLP-1 (amida 7-37 ou 7-36), que é eficaz para o tratamento de diabetes tipo II através da redução do nível de glicose no sangue, tem uma semivida muito curta, de menos de quatro minutos (Kreymann et al., 1987). A curta semivida resulta da perda de título do GLP-1 devido à clivagem peptídica entre os aminoácidos n.º 8 (Ala) e n.º 9 (Asp) do GLP-1 pela dipeptidil-pepdidase IV (DPP IV). Assim, têm-se conduzido muitos estudos sobre o desenvolvimento de derivados do GLP-1 resistentes à DPP IV, e nestes estudos Ala8 foi substituído por Gly (Deacon et al., 1998; Burcelin et al., 1999), ou por Leu ou D- Ala (Xiao et al., 2001) para aumentar a resistência à DPP IV, mantendo ao mesmo tempo a atividade do peptídeo. Além disso, o aminoácido N-terminal do
GLP-1, His7, é um aminoácido importante para a atividade do GLP-1 e é também um alvo da DPP IV; assim, no documento US 5 545 618, o terminal N foi substituído com um grupo alquilo ou acilo. Da mesma forma, em Gallwitz et al., His7 foi N-metilado ou alfa-metilado, ou a sua totalidade foi substituída por imidazol para se aumentar a resistência do peptídeo à DPP IV, mantendo ao mesmo tempo a bioatividade (Baptist Gallwitz, et al., Regulatory Peptides 86, 103 -111, 2000).
[009] Além destas variantes, a exenatida (exendina-4, US 5 424 686), que é um derivado de GLP-1 purificado a partir da glândula salivar do monstro-de- gila, apresenta uma resistência à DPP IV e uma bioatividade superior à do GLP-1, tendo assim uma semivida no organismo de 2 a 4 horas, que é bastante mais longa do que a do GLP-1. No entanto, uma duração de bioatividade suficiente in vivo não pode ser obtida unicamente pelo aumento da resistência do peptídeo à DPP IV. Por exemplo, a exendina-4 (exenatida) atualmente disponível tem de ser administrada duas vezes por dia por injeção, o que constitui um fardo excessivo para os doentes.
[010] Uma limitação destes peptídeos insulinotrópicos é que o tamanho do peptídeo é muito pequeno para ser capturado no rim e, portanto, perde-se facilmente para fora do organismo. Por conseguinte, a fim de evitar a perda do peptídeo no rim, uma macromolécula altamente solúvel, tal como polietilenoglicol (PEG), foi ligada à superfície do peptídeo.
[011] O PEG liga-se a um local específico, ou não especificamente a vários locais de um peptídeo alvo e aumenta o seu peso molecular, o que impede então a perda do peptídeo no rim e hidrólise do mesmo, sem ocorrência de efeitos colaterais. Por exemplo, WO2006/076471 relata que através da fixação de PEG a um peptídeo natriurético tipo B (BNP), o qual ativa a produção de GMPc através da ligação a NPR-A e reduz a pressão intra- arterial, sendo eficaz como agente terapêutico para a insuficiência cardíaca congestiva, a bioatividade do BNP pode ser mantida. De igual modo, US 6 924 264 descreve um método para aumentar a durabilidade in vivo da exidina-4 por ligação de PEG ao resíduo de lisina de uma exidina-4. No entanto, embora estes métodos possam prolongar a durabilidade in vivo de um fármaco peptídico pelo aumento do peso molecular de PEG, o título do fármaco peptídico decresce notavelmente quando o peso molecular de PEG aumenta. Além disso, a reatividade de PEG com o peptídeo diminui, e consequentemente o rendimento também.
[012] Como uma alternativa para aumentar a estabilidade in vivo do peptídeo fisiologicamente ativo, foi desenvolvido um método de produção de uma proteína de fusão em que os genes para o peptídeo e para a proteína fisiologicamente ativa são unidos através de recombinação genética e as células transformadas com o gene recombinante são cultivadas. A título de exemplo, uma proteína de fusão produtora de exendina-4, fundida com transferrina (Tf) através de um ligante polipeptídico, foi divulgada (Pedido de Patente Coreana n.º 10-2009-7003679). De igual modo, como método de utilização de imunoglobulina, uma proteína de fusão de um derivado de GLP-1, com o derivado de GLP-1 fundido a Fc de IgG4, foi também descrito antes (Pedido de Patente Coreana n.° 10-2007-7014068).
[013] Recentemente, como formulação farmacêutica de peptídeo e proteína, de ação de longa duração, capaz de promover uma redução mínima na atividade e um aumento na estabilidade, um conjugado gerado pela combinação da região Fc de imunoglobulina, um polímero não peptídico e um polipeptídeo fisiologicamente ativo, foi divulgado na Patente Coreana n.º 10- 0567902 (Conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo com durabilidade in vivo melhorada) e na Patente Coreana n.º 10-0725315 (Complexo de proteína utilizando um fragmento de imunoglobulina e método para a sua preparação).
[014] No método anterior, um peptídeo insulinotrópico é utilizado como polipeptídeo fisiologicamente ativo na preparação de um conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração (Patente Coreana n.º 10- 2008-0001479). Para produzir o fármaco do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração, é essencial evitar alterações físico-
químicas, tais como desnaturação induzida pelo calor, agregação, adsorção, ou hidrólise causada pela luz, calor, ou impurezas nos aditivos durante os processos de armazenamento e de distribuição, mantendo assim a eficácia in vivo. Em particular, um conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração tem um volume e um peso molecular mais elevados do que o próprio peptídeo insulinotrópico, e por isso é difícil de estabilizar.
[015] Geralmente, as proteínas e peptídeos têm uma semivida curta e podem sofrer desnaturação na forma de agregação de monómeros, precipitação por agregação, e adsorção à superfície do recipiente, quando expostos a temperaturas inadequadas, à interface ar-água, alta pressão, ou tensão física ou mecânica, solventes orgânicos, e contaminação microbiana. As proteínas e peptídeos desnaturados perdem as suas propriedades físico- químicas e atividade fisiológica inerentes. Uma vez que a desnaturação das proteínas é irreversível na maioria dos casos, as proteínas desnaturadas e os peptídeos não podem recuperar as suas propriedades inerentes. Além disso, é provável que as proteínas sejam instáveis e facilmente afetadas por fatores externos, tais como temperatura, humidade, oxigénio, raios ultravioleta, e, portanto, sofrem alterações físicas ou químicas, incluindo agregação, polimerização, ou oxidação, perdendo assim a atividade.
[016] Além disso, as proteínas e peptídeos adsorvidos podem agregar-se ao desnaturar e quando as proteínas e peptídeos agregados são introduzidos no organismo podem causar a formação de anticorpos. Assim, devem ser administrados proteínas e peptídeos suficientemente estáveis. A este respeito, têm-se desenvolvido vários métodos para evitar a desnaturação de proteínas e peptídeos em solução (John Geigert, J. Parenteral Sci. Tech., 43, No5, 220- 224, 1989, David Wong, Pharm. Tech. October, 34-48, 1997, Wei Wang., Int. J. Pharm., 185, 129-188, 1999, Willem Norde, Adv. Colloid Interface Sci., 25, 267- 340, 1986, Michelle etal., Int. J. Pharm. 120, 179-188, 1995).
[017] Na produção de alguns fármacos de proteína e peptídeo, tem-se utilizado um processo de liofilização para resolver os problemas de estabilidade. Este processo, porém, é inconveniente na medida em que os produtos liofilizados têm de ser dissolvidos em solventes para injeção antes de utilização e em que exige um investimento em larga escala, pois é necessário um grande número de congeladores-secadores para levar a cabo a liofilização do processo de fabricação. Alternativamente, tem-se recorrido a um método de pulverização que emprega secagem por pulverização. No entanto, este método é pouco rentável devido ao baixo rendimento do produto e pode ter um efeito negativo na estabilidade do produto uma vez que as proteínas são expostas a alta temperatura.
[018] Em uma abordagem alternativa à resolução destas limitações, foi investigada a adição de estabilizadores à solução de proteína e peptídeo para evitar alterações físico-químicas no fármaco proteico, mantendo ao mesmo tempo a sua eficácia in vivo durante o armazenamento de longo prazo. Um tipo de proteína, a albumina de soro humano, tem sido amplamente utilizada como estabilizador em vários fármacos proteicos e a sua eficácia foi aprovada (Edward Tarelli et al., Biologicals (1998) 26, 331-346).
[019] A purificação da albumina de soro humano requer a inativação de contaminantes biológicos, tais como micoplasma, priões, bactérias e vírus, ou o rastreio ou inspeção de um ou mais contaminantes biológicos ou agentes patogénicos, mas mesmo através desses processos, esses contaminantes podem não ser completamente removidos ou inativados. Deste modo, os doentes podem ser expostos a contaminantes biológicos ou agentes patogénicos quando administrados com albumina do soro humano. A título de exemplo, embora o processo de rastreio envolva a inspeção de certos vírus na amostra de sangue do dador, o processo de inspeção nem sempre é fiável e não consegue detectar certos vírus que estão presentes em pequeno número.
[020] Devido às suas diferenças químicas, diferentes proteínas podem ser inativadas gradualmente a taxas diferentes, em condições diferentes, durante o armazenamento. Isto é, o prolongamento do período de armazenamento alcançado por um estabilizador não é o mesmo para proteínas diferentes. Por este motivo, a proporção, concentração e tipo de estabilizadores que são apropriados para melhorar a estabilidade de armazenamento de proteínas variam de acordo com as propriedades físico-químicas da proteína alvo. Além disso, quando diferentes estabilizadores são usados em conjunto, podem induzir efeitos adversos diferentes dos efeitos desejados, devido à interação e efeitos colaterais concorrentes. Ademais, durante o armazenamento, as propriedades da proteínas ou a sua concentração podem alterar-se, causando efeitos diferentes.
[021] Por conseguinte, são necessários muitos esforços e cuidados para estabilizar as proteínas em solução. Particularmente, um conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração com uma durabilidade e estabilidade in vivo melhoradas tem a forma de um peptídeo insulinotrópico combinado com a região Fc de imunoglobulina, e, portanto, tem um peso molecular e volume significativamente diferentes do peptídeo insulinotrópico de base. Como tal, é necessária uma composição especial para estabilizar a proteína. Além disso, um peptídeo insulinotrópico e uma região Fc da imunoglobulina são peptídeos ou proteínas fisioquimicamente diferentes e, assim, têm de ser estabilizados simultaneamente. No entanto, como descrito anteriormente, devido às suas diferenças físico-químicas, diferentes peptídeos ou proteínas podem ser gradualmente inativados a taxas diferentes, sob diferentes condições, em armazenamento. Além disso, quando os estabilizadores adequados para o peptídeo ou para a proteína são usados em conjunto, podem induzir efeitos adversos diferentes dos efeitos desejados devido à interação e aos efeitos colaterais concorrentes. Portanto, é muito difícil encontrar uma composição estabilizadora para um conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração, que possa simultaneamente estabilizar um peptídeo insulinotrópico e uma região Fc da imunoglobulina.
[022] Recentemente, foi desenvolvida uma formulação de proteína e peptídeo que pode ser utilizada repetidamente para conveniência dos doentes.
No entanto, a formulação de múltipla utilização tem de conter um conservante para prevenir a contaminação microbiana após repetidas administrações e antes de ser descartada. A formulação de múltipla utilização contendo conservante tem algumas vantagens em comparação com uma formulação de utilização única. Por exemplo, no caso da formulação de utilização única, uma grande quantidade de fármaco é desperdiçada, dependendo da diferença na dosagem. Ao utilizar uma formulação de múltiplas utilizações, porém, a quantidade de produto desperdiçado pode ser reduzida. Além disso, a formulação de múltiplas utilizações pode ser usada várias vezes sem problemas de crescimento microbiano, por um determinado período, e uma vez que pode ser fornecida em um único recipiente, a embalagem pode ser minimizada, resultando em vantagens económicas.
[023] No entanto, o uso de conservante pode afetar a estabilidade da proteína. O problema mais bem conhecido na utilização de conservante é o da precipitação. A precipitação da proteína pode reduzir os efeitos terapêuticos do fármaco e, quando administrada ao organismo, pode induzir uma resposta imunitária inesperada. Portanto, é crucial escolher um tipo e concentração de conservante que mantenham a capacidade de evitar contaminação microbiana sem simultaneamente afetar a estabilidade da proteína.
[024] Em um esforço para proporcionar uma formulação líquida estável de um conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração, em que este possa ser armazenado sem o risco de contaminação viral durante um longo período, a presente invenção constatou que uma formulação que melhora a estabilidade do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração pode ser obtida por meio de um estabilizador constituído por um tampão, um álcool de açúcar, um tensoativo não iônico, e um agente isotônico, ou adicionalmente metionina, e que a formulação pode ser utilizada várias vezes quando adicionalmente nela se inclui um conservante, completando assim uma formulação líquida de custo eficaz e estável.
[025] Um objeto da presente invenção consiste em proporcionar uma formulação líquida de um conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração que compreenda uma quantidade farmaceuticamente eficaz do mesmo, em que um peptídeo fisiologicamente ativo, ou seja, um peptídeo insulinotrópico, está ligado a uma região Fc da imunoglobulina; e um estabilizador isento de albumina, em que o estabilizador compreende um tampão, um álcool de açúcar, um tensoativo não iônico, e um agente isotônico.
[026] Outro objeto da presente invenção consiste em proporcionar uma formulação líquida de um conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração para administrações múltiplas, que compreende adicionalmente um conservante para além do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração e do estabilizador isento de albumina.
[027] Outro objetivo da presente invenção é proporcionar um método para a preparação da formulação líquida de um conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração.
[028] Uma vez que a formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração da presente invenção compreende um tampão, um agente isotônico, um álcool de açúcar, e um tensoativo não- iônico, ou adicionalmente, metionina, mas está isenta de albumina de soro humano e de outros fatores potencialmente perigosos para o organismo, não há risco de contaminação viral. Além disso, pode proporcionar uma excelente estabilidade de armazenamento ao conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração compreendido por um peptídeo insulinotrópico e uma região Fc da imunoglobulina, tendo deste modo um peso molecular mais elevado e uma duração da atividade fisiológica in vivo melhorada em relação à proteína do tipo selvagem. Tal formulação líquida da presente invenção pode proporcionar uma estabilidade de armazenamento excelente com uma formulação simples, obtendo-se um fármaco peptídico mais económico do que outro estabilizador e liofilizador. Se um conservante for adicionado à formulação, a formulação pode ser utilizada várias vezes. Além disso, a presente formulação pode reter a atividade da proteína no organismo por um período mais longo do que uma formulação de peptídeo insulinotrópico convencional, e, portanto, pode ser utilizada como uma formulação farmacêutica eficaz.
[029] A Figura 1 é um gráfico da análise por RP-HPLC da estabilidade do peptídeo na formulação líquida de escolha a um pH de 5,2 (Formulação Líquida #1), na formulação líquida preparada pela adição de um conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração a uma composição estabilizadora de uma formulação líquida de fármaco de peptídeo insulinotrópico disponível comercialmente, a exenatida, ou seja, a exendina-4 (Byetta) (Formulação Líquida # 2), na formulação líquida preparada pela adição de um conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração a uma composição estabilizadora de formulação líquida de fármaco de proteína de fusão de imunoglobulina, etanercept (proteína de fusão TNFR-Fc, ENBREL) (Formulação Líquida #3), e em um grupo de controle (Formulação Líquida #4), tendo sido todas armazenados a 25 ± 2ºC durante 8 semanas.
[030] A Figura 2 é um gráfico da análise por RP-HPLC da proporção de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração oxidado na formulação líquida de escolha a um pH de 5,2, sem metionina (Formulação Líquida #1) e na formulação líquida a um pH 5,2, com metionina (Formulação Líquida #2), armazenadas a 25 ± 2ºC e a 40 ± 2ºC durante 4 semanas.
[031] A Figura 3 mostra os resultados da monitorização de ocorrência de precipitação nas composições de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de acordo com a Tabela 18, a olho nu e a 40ºC, durante 48 horas. A duração da ausência de precipitação indica o período tempo após armazenamento do peptídeo em que não ocorreu precipitação de proteína.
[032] A Figura 4 mostra os resultados da monitorização de ocorrência de precipitação nas composições de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de acordo com a Tabela 19, a olho nu e a 40ºC, durante 7 dias. A duração da ausência de precipitação indica o período tempo após armazenamento do peptídeo em que não ocorreu precipitação de proteína.
[033] Em um aspeto, a presente invenção proporciona uma formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração, que compreende uma quantidade farmaceuticamente eficaz de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração, em que um peptídeo insulinotrópico está ligado a uma região Fc da imunoglobulina; e um estabilizador isento de albumina, em que o estabilizador compreende um tampão, um álcool de açúcar, um tensoativo não iônico, e um agente isotônico.
[034] Além disso, a presente invenção proporciona uma formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de administrações múltiplas, que compreende ainda um conservante para além do conjugado de peptídeo insulinotrópico e do estabilizador isento de albumina.
[035] Tal como aqui utilizado, «conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração» refere-se a um conjugado em que um peptídeo insulinotrópico fisiologicamente ativo, compreendendo um derivado, variante, precursor, e fragmento e uma região Fc da imunoglobulina estão ligados, e pode ainda referir-se a um conjugado com uma duração in vivo da atividade fisiológica aumentada em relação a um peptídeo insulinotrópico do tipo selvagem.
[036] Tal como aqui utilizado, o termo «longa duração de ação» refere-se a um aumento na duração da atividade fisiológica em comparação com a de um tipo selvagem. O termo «conjugado» refere-se à forma como um peptídeo insulinotrópico e uma região Fc da imunoglobulina estão combinados.
[037] O peptídeo insulinotrópico utilizado na presente invenção tem a função de segregar insulina e estimula a síntese e expressão de insulina em células pancreáticas β. O tipo de peptídeo insulinotrópico inclui precursor, agonista, derivados, fragmentos e variantes. De preferência, o peptídeo insulinotrópico pode ser um peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1), um peptídeo-2 semelhante ao glucagon (GLP-2), exendina-3, exendina-4, e imidazoacetil exendina-4 (CA), e mais de preferência imidazoacetil exendina-4 (CA). Qualquer peptídeo insulinotrópico, nativo ou recombinante pode ser utilizado e, preferencialmente, é um peptídeo insulinotrópico recombinante gerado a partir de E. coli como célula hospedeira. Contanto que a sua atividade biológica não seja afetada de forma significativa, quaisquer seus derivados gerados por substituição, deleção ou inserção de aminoácidos podem ser utilizados na presente invenção.
[038] A sequência do peptídeo insulinotrópico pode ser obtida de bancos de dados conhecidos, como o GenBank de NCBI, e pode ter 70% ou mais, de preferência 80% ou mais, mais preferencialmente 90% ou mais, ainda mais preferencialmente 95% ou mais, e ainda mais preferencialmente 98% ou mais de homologia de sequências com uma proteína do tipo selvagem, desde que demonstre a atividade de um peptídeo insulinotrópico.
[039] Além disso, a Fc de imunoglobulina útil na presente invenção pode ser uma Fc de imunoglobulina humana ou seu análogo intimamente relacionado, ou Fc de imunoglobulina derivada de animais, tais como vacas, cabras, porcos, ratinhos, coelhos, hamsters, ratos e porquinhos-da-índia. Além disso, a região Fc da imunoglobulina pode ser derivada de IgG, IgA, IgD, IgE e IgM, ou de uma sua combinação ou seu híbrido. De preferência, é derivada de IgG ou de IgM, que são as mais abundantes no sangue humano, e mais preferivelmente é derivada de IgG, que se sabe aumentar a semivida da proteína de ligação ao ligando. Além disso, a região Fc da imunoglobulina pode ser um dímero ou multímero de imunoglobulinas de cadeia simples com domínios da mesma origem. A região Fc da imunoglobulina pode ser gerada por tratamento de uma IgG nativa com uma determinada protease, ou por células transformadas por uma técnica de recombinação genética. De preferência, a Fc de imunoglobulina é uma Fc de imunoglobulina humana recombinante produzida em E. coli.
[040] Por outro lado, a IgG pode ser dividida nas subclasses IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, e na presente invenção, pode ser utilizada uma combinação ou híbrido das mesmas. São preferidas as subclasses IgG2 e IgG4, e a mais preferida é a região Fc da IgG4 que raramente apresenta a função efetora, tal como a citotoxicidade dependente do complemento (CDC). Isto é, como transportador farmacêutico da presente invenção, a porção Fc da imunoglobulina mais preferida é uma porção Fc não glicosilada derivada de IgG4 humana. A porção Fc de origem humana é preferida a uma porção Fc de origem não humana, a qual pode atuar como antígeno no corpo humano e provocar respostas imunitárias indesejáveis, tais como a produção de um novo anticorpo.
[041] O polímero não peptídico utilizado na reticulação pode ser selecionado do grupo composto por polietilenoglicol, polipropilenoglicol, copolímeros de etilenoglicol e propilenoglicol, polióis polioxietilados, álcool polivinílico, polissacarídeos, dextrano, éter poliviniletílico, polímeros biodegradáveis tais como PLA (poli(ácido láctico)) e PLGA (ácido poli(láctico- co-glicólico)), polímeros de lipídeos, quitinas, ácido hialurônico ou uma sua combinação. O polietilenoglicol é preferencialmente utilizado mas não se lhe está limitado. Os seus derivados bem conhecidos na arte e derivados que podem ser facilmente preparados por um método conhecido na arte estão incluídos no âmbito da presente invenção
[042] Para a preparação do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração utilizado na presente invenção, pode referir-se a Patente Coreana n.º 10-0725315, a Publicação de Patente Coreana n.º 10-2009- 0008151, e a Patente Coreana n.º 10-1058290. Os peritos na arte poderão produzir um conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração da presente invenção por consulta destas referências.
[043] A formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração da presente invenção compreende um conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração em quantidade terapeuticamente eficaz. Em geral, a quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo insulinotrópico, especialmente de exendina-4 (Byetta), refere-se a 250 mcg em uma caneta injetora. A concentração de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração utilizada na presente invenção varia de 0,1 mg/ml a 200 mg/ml, e de preferência de 0,5 mg/ml a 150 mg/ml. O peptídeo insulinotrópico pode de preferência ser um conjugado de exendina-4 CA de ação de longa duração. A formulação líquida do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração da presente invenção pode armazenar o conjugado de forma estável, sem precipitação, não só quando o conjugado de peptídeo insulinotrópico está presente em baixa concentração, como também em alta concentração. Portanto, a presente formulação proporciona de forma estável o peptídeo insulinotrópico, em concentração elevada, no organismo.
[044] Tal como aqui utilizado, o termo «estabilizador» refere-se a uma substância que permite o armazenamento estável do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração. O termo «estabilização» refere-se ao estado em que a perda de um princípio ativo é inferior a um determinado valor, tipicamente inferior a 10%, durante um determinado período e sob condições específicas de armazenamento. Uma formulação é considerada como uma formulação estável quando a pureza residual do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração nela contido é de 90% ou mais, e mais preferencialmente de 92 a 95% após armazenamento a 5 ± 3ºC por 2 anos, a 25 ± 2ºC durante 6 meses, ou a 40 ± 2ºC durante 1 a 2 semanas. Quanto às proteínas semelhantes ao conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração, a sua estabilidade em armazenamento é importante para se obter uma dose exata, bem como para suprimir a potencial formação de substâncias antigénicas contra o conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração. Durante o armazenamento, uma perda de 10% de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração é aceitável para uma administração substancial, a menos que cause a formação de agregados ou fragmentos na composição que conduzam à formação de compostos antigénicos.
[045] O estabilizador da presente invenção compreende preferencialmente um tampão, um álcool de açúcar, um agente isotônico tal como cloreto de sódio, e um tensoativo não iônico, e mais preferencialmente compreende adicionalmente metionina para estabilizar o conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração.
[046] O tampão serve para manter o pH da solução e evitar uma mudança brusca de pH na formulação líquida a fim de estabilizar o conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração. O tampão pode incluir um sal alcalino (fosfato de sódio ou de potássio ou seus sais hidrogeno ou di- hidrogeno), citrato de sódio/ácido cítrico, acetato de sódio/ácido acético, histidina/cloridrato de histidina, qualquer outro tampão de pH farmaceuticamente aceitável conhecido na arte, e uma combinação dos mesmos. O exemplo preferido de tampão inclui um tampão de citrato, um tampão acetato e um tampão de histidina. A concentração de tampão é preferencialmente de 5 mM a 100 mM, mais preferencialmente de 10 mM a 50 mM. O pH do tampão é preferencialmente de 4,0 a 7,0, mais preferencialmente de 5,0 a 7,0, ainda mais preferencialmente de 5,2 a 7,0, e ainda muito mais preferencialmente de 5,2 a 6,0.
[047] O álcool de açúcar atua no sentido de aumentar a estabilidade do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração. A concentração do álcool de açúcar usado na presente invenção é preferencialmente de 1 a 20% (p/v) com base no volume total de solução, mais preferencialmente de 3 a 10% (p/v) com base no volume total de solução. O álcool de açúcar pode ser um ou mais do grupo composto por manitol, sorbitol, e sacarose, mas não lhes está limitado.
[048] Um agente isotônico atua no sentido de manter uma pressão osmótica adequada quando o conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração em solução é administrado ao organismo, e atua igualmente no sentido de estabilizar o conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração em solução. A pressão osmótica da formulação é ajustada para ser isotônica com o sangue. Estas formulações líquidas isotônicas têm geralmente uma pressão osmótica de cerca de 300 mOsm/kg. Entre os exemplos representativos de um agente isotônico constam um álcool de açúcar, um sal inorgânico solúvel em água, um aminoácido, e o exemplo preferido é um sal inorgânico solúvel em água, isto é, cloreto de sódio. A concentração de cloreto de sódio como agente isotônico é de preferência de 0 a 150 mM, e pode ser ajustada consoante o tipo e quantidade de componentes incluídos na formulação, de tal modo que a formulação líquida, incluindo toda a mistura, é isotônica.
[049] O tensoativo não iônico diminui a tensão superficial da solução de proteína para evitar a absorção ou a agregação de proteínas em uma superfície hidrofóbica. Como exemplos de tensoativos não iônicos úteis na presente invenção podem referir-se polissorbatos, poloxâmeros e as suas combinações, com preferência para os polissorbatos. Entre os agentes tensoativos não iônicos de polissorbatos constam o polissorbato 20, o polissorbato 40, o polissorbato 60, e o polissorbato 80. O tensoativo não iônico mais preferido é o polissorbato 20.
[050] Não se deve utilizar um tensoativo não iônico a uma concentração elevada na formulação líquida, pois o tensoativo não iônico a uma concentração elevada induz efeitos de interferência na medição da concentração de proteína e na determinação da estabilidade da proteína por métodos analíticos, tais como espectroscopia de UV ou focalização isoelétrica, causando assim dificuldades na avaliação precisa da estabilidade da proteína. Portanto, a formulação líquida da presente invenção compreende o tensoativo não iônico, de preferência a uma concentração baixa, não superior a 0,2% (p/v), mais de preferência de 0,001% a 0,05% (p/v).
[051] De acordo com um exemplo da presente invenção, demonstrou-se que quando se adiciona cloreto de sódio como agente isotônico na presença de tampão, álcool de açúcar, e tensoativo não iônico, a estabilidade em armazenamento de longa duração do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração em baixa concentração aumenta significativamente. Isto sugere que o uso de cloreto de sódio como agente isotônico simultaneamente com tampão, álcool de açúcar, e tensoativo não iônico induz efeitos sinérgicos, permitindo assim que o conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração tenha uma estabilidade elevada. No entanto, no que diz respeito ao conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração em concentração elevada, quando o cloreto de sódio é excluído, não ocorreu precipitação e a solubilidade da proteína melhorou. Estes resultados sugerem que quando cloreto de sódio é utilizado como agente isotônico, o seu teor pode ser ajustado de acordo com a concentração do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração.
[052] Além disso, confirmou-se que um conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração em baixa concentração é mais estável em um tampão a um pH de 5,2, enquanto um conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração a uma concentração elevada é mais estável em um tampão a um pH de 5,4 ou 5,6. Foi assim determinado que o pH do tampão pode ser ajustado adequadamente em função da concentração de conjugado.
[053] A metionina compreendida no estabilizador da presente invenção suprime a formação de impurezas que pode ocorrer por oxidação das proteínas em solução, estabilizando assim ainda mais a proteína-alvo. A concentração de metionina é de 0,005 a 0,1% (p/v) no volume total de solução, de preferência de 0,01 a 0,1% (p/v).
[054] De preferência, o estabilizador da presente invenção não contém albumina. Uma vez que a albumina de soro humano disponível como estabilizador de proteína é produzida a partir de soro humano, é sempre possível que esteja contaminada com vírus patogénicos de origem humana. A gelatina ou albumina de soro bovino pode causar doenças ou induzir uma reação alérgica em alguns doentes. Isento de proteínas heterólogas, tais como albuminas séricas de origem humana ou animal ou gelatina purificada, o estabilizador da presente invenção não poderá causar contaminação viral.
[055] Além disso, o estabilizador da presente invenção pode ainda compreender açúcares, poliálcool ou aminoácidos. Os exemplos preferidos de açúcares que podem ser adicionados para aumentar ainda mais a estabilidade durante o armazenamento de longa duração do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração incluem monossacarídeos como manose, glicose, fucose e xilose, e polissacarídeos como lactose, maltose, sacarose, rafinose e dextrano. Os exemplos preferidos de poliálcool incluem propilenoglicol, polietilenoglicol de baixo peso molecular, glicerol, polipropilenoglicol de baixo peso molecular e uma sua combinação.
[056] A formulação líquida da presente invenção pode ainda compreender um conservante, para além dos atrás referidos conjugado, tampão, agente isotônico, álcool de açúcar, e tensoativo não iônico, ou adicionalmente metionina, com a finalidade de prevenir a contaminação microbiana da formulação de utilização múltipla.
[057] Como aqui utilizado, «conservante» refere-se a um composto que é adicionado a uma formulação farmacêutica para atuar como agente antimicrobiano. Como exemplos de conservantes podem referir-se benzetónio, cloroexidina, fenol, m-cresol, álcool benzílico, metilparabeno, propilparabeno, clorobutanol, o-cresol, p-cresol, clorocresol, cloreto de benzalcónio, nitrato de fenilmercúrio, timerosal, ácido benzóico, mas não lhes estando limitados. Um único tipo de conservante pode ser utilizado individualmente, ou uma combinação aleatória de dois ou mais tipos de conservante pode ser usada. De preferência, a formulação líquida da presente invenção pode compreender um ou mais entre m-cresol, fenol e álcool benzílico como conservante.
[058] A formulação líquida da presente invenção pode compreender de
0,001% a 1% (p/v) de conservante, e de preferência de 0,001% a 0,5% (p/v) de conservante, e mais de preferência de 0,001 a 0,25% (p/v) de conservante.
[059] Em um exemplo da presente invenção, adicionou-se 0,22% (p/v) de m-cresol como conservante à formulação líquida da presente invenção e avaliou-se o efeito do cresol na estabilidade do conjugado de peptídeo insulinotrópico. Como resultado, confirmou-se que o conjugado manteve-se estável, sem precipitar, na formulação com o conservante adicionado. Portanto, a formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico da presente invenção, que compreende conservante para além de estabilizador, pode ser usada para administrações múltiplas.
[060] A formulação líquida da presente invenção pode ainda compreender outras substâncias e materiais conhecidos na arte, de forma seletiva, para além dos atrás descritos tampão, agente isotônico, álcool de açúcar, e tensoativo não iônico, ou adicionalmente, metionina e conservante, desde que o efeito da presente invenção não seja afetado.
[061] A formulação líquida isenta de albumina de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de acordo com a presente invenção, que confere estabilidade ao conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração, não apresenta riscos de contaminação viral e proporciona simultaneamente uma excelente estabilidade em armazenamento, com uma formulação simples, podendo assim ser fornecida de forma mais económica do que outras formulações estabilizadoras ou liofilizadas.
[062] Além disso, uma vez que a formulação líquida da presente invenção compreende o conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração com uma duração de atividade fisiológica aumentada em relação ao tipo selvagem, pode ser utilizada como formulação farmacêutica eficaz, retendo a atividade da proteína no organismo por um período mais longo do que a formulação de peptídeo insulinotrópico convencional. Acresce que a presente formulação líquida proporciona uma excelente estabilidade, adequada ao armazenamento de um conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração em concentração elevada, bem como em baixa concentração.
[063] Em um outro aspeto, a presente invenção proporciona um método para a preparação da formulação líquida da presente invenção.
[064] Uma formulação líquida estável de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração pode ser preparada pela geração do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração, seguido de mistura do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração gerado com um estabilizador constituído por um tampão, álcool de açúcar, tensoativo não iônico e agente isotônico. Além disso, para utilizações múltiplas, uma formulação líquida estável de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração pode ser produzida pela mistura adicional de um conservante, para além dos estabilizadores. Modo para a Invenção
[065] A presente invenção será doravante descrita em mais pormenor com referência aos Exemplos. No entanto, estes exemplos são apenas para fins ilustrativos e não pretendem limitar o âmbito da invenção. Exemplo 1: Avaliação da estabilidade do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração na presença ou ausência de um agente isotônico tal como sal
[066] A estabilidade do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração (15,41 µg/mL de exendina-4 CA, concentração nominal) foi avaliada na presença ou ausência de cloreto de sódio como agente isotônico na formulação composta por um tampão, um álcool de açúcar, e um agente tensoativo não iônico como estabilizador; e na formulação composta por um tampão, um álcool de açúcar, um agente tensoativo não iônico, e metionina como estabilizador. Para este efeito, o conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração foi armazenado a 25ºC e a 40ºC entre 0 e 4 semanas nas composições apresentadas na Tabela 1, e a estabilidade do conjugado foi analisada por cromatografia líquida de alta resolução-fase inversa (RP-HPLC) e cromatografia líquida de alta resolução-exclusão molecular (SE-HPLC). Como tampão utilizou-se tampão de citrato, manitol foi usado como o álcool de açúcar, e polissorbato 20 foi usado como o tensoativo não iônico.
Nas Tabelas 2 e 3, RP-HPLC (%) e SE-HPLC (%) representam o valor de «Área %/Área Inicial %», que reflete a pureza residual do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração comparada com a pureza inicial.
A Tabela 2 mostra a pureza residual do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração após armazenamento a 25ºC, e a Tabela 3 mostra a pureza residual do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração após armazenamento a 40ºC.
Tabela 1 No.
Concent.
Tampão Sal Álcool de açúcar Tensoativo 1 0,2 mg/ml Citrato-Na NaCl 0,005% 20 mM (pH 5,2) 150 nM 5% Manitol Polissorbato 20 2 0,2 mg/ml Citrato-Na - 0,005% 20 mM (pH 5,2) 5% Manitol Polissorbato 20 3 0,2 mg/ml Citrato-Na - 5% Manitol/ 0,005% 20 mM (pH 5,2) 0,1 mg/ml metionina Polissorbato 20 4 0,2 mg/ml Citrato-Na NaCl 5% Manitol/ 0,005% 20 mM (pH 5,2) 150 nM 0,1 mg/ml metionina Polissorbato 20 Tabela 2 RP-HPLC (%) SE-HPLC (%) No 0 1 2 4 0 1 2 4 . seman seman semana semana seman seman semana semana a a s s a a s s 1 100 99,3 99,2 97,1 100 99,8 100,1 100,2 2 100 99,1 99,1 96,9 100 99,8 100,1 100,1 3 100 99,8 99,5 97,9 100 99,8 100,0 100,1 4 100 99,5 99,8 98,4 100 99,9 100,2 100,2 Tabela 3 RP-HPLC (%) SE-HPLC (%) No 0 1 2 4 0 1 2 4 . seman seman semana semana seman seman semana semana a a s s a a s s
1 100 96,6 93,7 88,0 100 100 98,8 97,2 2 100 precipit precipit precipit 100 precipit precipit precipit 3 100 98,1 precipit precipit 100 99,9 precipit precipit 4 100 96,9 95,2 90,6 100 100,0 99,0 97,2
[067] Ao comparar os grupos de teste #1 e #2, e os grupos #3 e #4 nas Tabelas 2 e 3, é evidente que, quando a formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração foi armazenada a 25ºC e a 40ºC, especialmente a 40ºC durante 4 semanas e na presença de NaCl como agente isotônico, particularmente NaCl 150 mM, a estabilidade do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração permaneceu extremamente elevada (Tabelas 2 e 3). Exemplo 2: Avaliação da estabilidade do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração a vários valores de pH do tampão
[068] Enquanto o intervalo de pH de um fármaco proteico liquefeito é em geral de 5 a 7, o pH da formulação líquida de exendina-4 (Byetta), um fármaco de peptídeo insulinotrópico, é de 4,5, o que é inferior ao usual intervalo de pH. Portanto, neste exemplo, avaliou-se o efeito do pH do tampão na estabilidade do conjugado para um conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração compreendendo um peptídeo insulinotrópico e proteína Fc de imunoglobulina, de preferência um conjugado de imidazoacetil exendina-4 (CA) de ação de longa duração.
[069] Como tampão utilizou-se tampão de citrato, manitol foi usado como um álcool de açúcar, cloreto de sódio foi utilizado como agente isotônico, e polissorbato 80 foi utilizado como tensoativo não iônico. As seguintes composições apresentadas na Tabela 4 foram utilizadas como estabilizador do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração. Em seguida, as composições de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração foram armazenadas a 25 ± 2ºC durante 4 semanas e a sua estabilidade foi avaliada por cromatografia de exclusão molecular (SE-HPLC) e cromatografia de fase inversa (RP-HPLC). RP-HPLC (%) e SE-HPLC (%) na Tabela 5 representam «área %/área inicial %», que reflete a pureza residual do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração comparada com a pureza inicial. Tabela 4 Formulação Concent. Tampão Tensoativo Álcool de Agente No. (mcg/ml) açúcar e isotónico outros Citrato-Na 0,005% 5% NaCl 1 197,6 20 mM (pH Polissorbato 80 Manitol 150 mM 5,2) Citrato-Na 0,005% 5% NaCl 2 197,6 20 mM (pH Polissorbato 80 Manitol 150 mM 5,5) Citrato-Na 0,005% 5% NaCl 3 197,6 20 mM (pH Polissorbato 80 Manitol 100 mM 6,0) Tabela 5 Formul. RP-HPLC (%) SE-HPLC (%) No. pH (Área %/Área Inicial %) (Área %/Área Inicial %) 0S 1S 2S 4S 0S 1S 2S 4S 1 5,2 100 99,1 98,6 97,5 100 100 100,5 100,5 2 5,5 100 99,8 97,7 95,0 100 99,6 100,8 100,7 3 6,0 100 98,3 98,1 94,8 100 99,6 100,7 100,7
[070] Como se pode ver atrás, a maior estabilidade do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração registou-se a um pH de 5,2 da formulação líquida (Tabela 5). Exemplo 3: Avaliação da estabilidade do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração em função do tipo e concentração do tensoativo não iônico
[071] A estabilidade do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração foi examinada para diferentes tipos e concentrações de polissorbato, que é um tensoativo não iônico presente no estabilizador da presente invenção.
[072] Os tensoativos não iônicos, ou seja, o polissorbato 80 e o polissorbato 20, foram testados em ambas as concentrações, 0,005% e 0,01%. A composição de estabilizador compreende um tampão, um álcool de açúcar, um agente isotônico e um tensoativo, tal como no exemplo anterior, para conferir estabilidade ao conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração. Tampão de citrato a um pH de 5,2, que resultou em uma elevada estabilidade no Exemplo 2, foi usado como tampão, manitol foi usado como álcool de açúcar, e cloreto de sódio foi utilizado como agente isotônico.
[073] As seguintes composições apresentadas na Tabela 6 foram utilizadas como estabilizador para o conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração, de preferência para o conjugado de exendina-4 CA de ação de longa duração. Em seguida, as composições foram armazenadas a 25 ± 2ºC durante 8 semanas e a sua estabilidade foi analisada por RP-HPLC e por SE-HPLC. RP-HPLC (%) e SE-HPLC (%) na Tabela 7 representam a pureza residual do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração em comparação com a pureza inicial. Tabela 6 Formulação Concent. Tampão Tensoativo Álcool de Agente No. (mcg/ml) açúcar e isotónico outros Citrato-Na 0,005% 5% NaCl 1 197,6 20 mM (pH Polissorbato 80 Manitol 150 Mm 5,2) Citrato-Na 0,001% 5% NaCl 2 197,6 20 mM (pH Polissorbato 80 Manitol 150 mM 5,2) Citrato-Na 0,005% 5% NaCl 3 197,6 20 mM (pH Polissorbato 20 Manitol 150 mM 5,2) Citrato-Na 0,01% 5% NaCl 4 197,6 20 mM (pH Polissorbato 20 Manitol 150 mM
5,2) Tabela 7 Formulação RP-HPLC (%) SE-HPLC (%) No. Tensoativo (Área %/Área Inicial %) (Área %/Área Inicial %) 0S 2S 4S 8S 0S 2S 4S 8S 1 0,005% 100,0 97,5 94,1 90,9 100,0 100,0 100,0 99,9 Polissorbato 80 2 0,01% 100,0 98,3 95,2 92,6 100,0 99,9 99,9 99,8 Polissorbato 80 3 0,005% 100,0 98,9 97,5 93,8 100,0 100,0 99,9 99,9 Polissorbato 80 4 0,01% 100,0 98,69 97,0 92,2 100,0 100,0 100,0 99,1 Polissorbato 80
[074] Como se pode ver atrás com base nos resultados da análise por SE- HPLC, a estabilidade do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração permaneceu praticamente constante, mesmo na presença de diferentes tipos e concentrações de polissorbatos. No entanto, com base nos resultados da análise por RP-HPLC, observou-se que na presença de polissorbato 20, a estabilidade do conjugado de peptídeo era semelhante ou mais elevada do que na presença de polissorbato 80 à mesma concentração. Além disso, registou-se uma estabilidade de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração mais elevada na formulação líquida de 0,005% de polissorbato 20 do que na de 0,01% de polissorbato 20 (Tabela 7). Exemplo 4: Comparação da estabilidade entre a formulação líquida de escolha de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração e a formulação líquida comercialmente disponível de fármaco de peptídeo ou proteína contendo o mesmo
[075] No presente exemplo, avaliou-se a estabilidade da formulação selecionada através dos testes de estabilidade dos Exemplos de 1 a 3. A formulação de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de escolha compreende tampão de citrato a um pH de 5,2, cloreto de sódio,
manitol, e polissorbato 20. Para este efeito, a estabilidade das formulações de fármacos foi comparada entre as formulações líquidas preparadas pela adição do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração a uma formulação líquida de fármaco de peptídeo insulinotrópico disponível comercialmente, a exendina-4 (Byetta); e a uma formulação líquida de fármaco de proteína de fusão de imunoglobulina, Etanercept (proteína de fusão TNFR- Fc, ENBREL).
[076] Usando as composições seguidamente apresentadas na Tabela 8, as seguintes formulações foram preparadas: uma formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração, mais preferencialmente conjugado de exendina-4 CA de ação de longa duração (Formulação Líquida #1); uma formulação líquida preparada pela adição do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração à composição estabilizadora da formulação líquida de fármaco de peptídeo insulinotrópico, exendina-4 (Byetta) (Formulação Líquida# 2); e uma formulação líquida preparada pela adição do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração à composição estabilizadora da formulação líquida de fármaco de proteína de fusão de imunoglobulina, Etanercept (proteína de fusão TNFR- Fc, ENBREL) (Formulação Líquida #3). Como grupo de controle, preparou-se uma formulação líquida pela adição do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração a uma composição estabilizadora composta apenas por PBS (Formulação Líquida #4). Subsequentemente, as formulações foram armazenadas a 25 ± 2ºC durante 8 semanas e a sua estabilidade foi analisada por RP-HPLC e SE-HPLC. RP-HPLC (%) e de SE-HPLC (%) na Tabela 9 mostram a pureza residual do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração comparada com a pureza inicial. Tabela 8 Formulação Concent. Tampão Tensoativo Álcool de Agente No. (mcg/ml) açúcar e isotónico outros
Citrato-Na 0,005% 5% Manitol NaCl 1 197,6 20 mM (pH Polissorbato 20 150 mM 5,2) Acetato-Na - 5% Manitol - 2 197,6 20 mM (pH 4,5) Fosfato-Na - 1% Sacarose NaCl 3 197,6 20 mM (pH L-Arginina 25 100 mM 6,3) mM 4 197,6 PBS - - - Tabela 9 RP-HPLC (%) SE-HPLC (%) No. (Área %/Área Inicial %) (Área %/Área Inicial %) 0S 2S 4S 8S 0S 2S 4S 8S 1 100,0 98,9 97,5 93,8 100,0 100,0 100,0 99,9 2 100,0 98,4 96,6 90,9 100,0 100,1 99,9 99,2 3 100,0 95,4 89,1 N/A 100,0 100,0 100,0 99,7 4 100,0 92,7 84,1 69,2 100,0 100,0 99,9 99,6
[077] Como resultado do teste de estabilidade, verificou-se que a formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração da presente invenção apresentava maior estabilidade do que as formulações líquidas preparadas pela adição do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração às formulações líquidas de fármaco de peptídeo insulinotrópico disponíveis comercialmente, a exendina-4 (Byetta), e de fármaco de proteína de fusão de imunoglobulina, a Etanercept (proteína de fusão TNFR-Fc, ENBREL), como se pode ver na Figura 1 e na Tabela 9. Exemplo 5: Avaliação da estabilidade do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração em função da adição de metionina
[078] Para determinar o efeito da metionina na estabilidade do conjugado, a formulação líquida foi preparada por adição de metionina, esta destinada a impedir a oxidação, à composição composta por tampão de citrato a um pH de
5,2, cloreto de sódio, manitol, e polissorbato 20, como nos Exemplos anteriores. As formulações foram armazenadas a 25 ± 2ºC durante 4 semanas e a 40 ± 2ºC durante 4 semanas, e a sua estabilidade foi em seguida analisada.
[079] A formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração, mais preferencialmente o conjugado de exendina-4 CA de ação de longa duração, foi preparado com as composições apresentadas seguidamente na Tabela 10 e a estabilidade das mesmas foi analisada. RP- HPLC (%) e SE-HPLC (%) nas Tabelas 11 a 14 representam as proporções do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração e as impurezas em cada ponto no tempo. A Tabela 11 mostra os resultados do teste de estabilidade acelerada por RP-HPLC (25 ± 2ºC) e a Tabela 12 mostra os resultados do teste de estabilidade acelerada por SE-HPLC (25 ± 2ºC). A Tabela 13 mostra os resultados do teste da intensidade da instabilidade por RP-HPLC (40 ± 2ºC) e a Tabela 14 mostra os resultados do teste da intensidade da instabilidade por SE-HPLC (40 ± 2ºC). A Impureza #3 representa a forma oxidada do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração. No entanto, uma vez que a SE-HPLC separa a amostra por peso molecular e a diferença de peso molecular entre a forma oxidada e forma não oxidada é insignificante, foi difícil isolar a forma oxidada do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração por SE-HPLC. Tabela 10 Formulação Concent. Tampão Tensoativo Álcool de Agente No. (mcg/ml) açúcar e isotónico metionina Citrato-Na 0,005% 5% Manitol NaCl 1 200 20 mM (pH Polissorbato 20 150 mM 5,2) Citrato-Na 0,005% 5% Manitol NaCl 2 200 20 mM (pH Polissorbato 20 0,01% Metionina 150 mM 5,2)
Tabela 11 Formulação Duração Proporção de conjugado e impurezas (Área %) No. armazen. #1 #2 #3 Conjugado #4 #5 #6 Outros 0 0,1 0,1 0,8 93,5 3,2 1,7 0,4 0,1 semanas 1 1 0,1 0,2 1,0 92,8 3,8 1,8 0,3 < 0,1 semanas 2 0,2 0,2 1,4 92,7 3,2 2,0 0,3 < 0,1 semanas 4 0,1 0,3 1,8 90,8 4,6 1,7 0,3 0,6 semanas 0 0,1 0,2 0,7 93,7 3,5 1,4 0,4 < 0,1 semanas 2 1 0,1 0,2 0,7 93,2 3,3 1,6 0,3 < 0,1 semanas 2 0,1 0,2 0,8 93,5 3,2 1,8 0,3 < 0,1 semanas 4 0,1 0,3 0,6 92,2 4,3 2,0 0,4 0,2 semanas Tabela 12 Formulação Duração Proporção de conjugado e impurezas (Área %) No. armazen. #1 #2 #3 Conjugado #4 #5 Outros 0 0,2 0,3 0,0 99,5 0,0 0,0 0,0 semanas 1 1 0,2 0,5 0,0 99,3 0,0 0,0 0,0 semanas 2 0,2 0,2 0,0 99,6 0,0 0,0 0,0 semanas 4 0,1 0,2 0,0 99,7 0,0 0,0 0,0 semanas 0 0,3 0,2 0,0 99,5 0,0 0,0 0,0 semanas 2 1 0,3 0,3 0,0 99,4 0,0 0,0 0,0 semanas
2 0,2 0,1 0,0 99,7 0,0 0,0 0,0 Semanas 4 0,2 0,1 0,0 99,7 0,0 0,0 0,0 semanas Tabela 13 Formulação Duração Proporção de conjugado e impurezas (Área %) No. armazen. #1 #2 #3 Conjugado #4 #5 #6 Outros 0 0,1 0,1 0,8 93,5 3,2 1,7 0,4 0,1 semanas 1 1 0,2 0,3 1,5 90,3 5,0 2,4 0,3 < 0,1 semanas 2 0,1 0,5 2,1 87,6 6,2 3,2 0,3 < 0,1 semanas 4 0,1 1,1 3,7 82,3 8,5 3,8 0,3 0,2 semanas 0 0,1 0,2 0,7 93,7 3,5 1,4 0,4 < 0,1 semanas 2 1 0,1 0,4 0,7 90,8 4,9 2,8 0,3 0,1 semanas 2 0,1 0,5 0,7 89,2 5,9 3,2 0,3 0,0 semanas 4 0,1 1,0 0,8 84,9 8,5 3,9 0,3 0,5 semanas Tabela 14 Formulação Duração Proporção de conjugado e impurezas (Área %) No. armazen. #1 #2 #3 Conjugado #4 #5 Outros 0 0,2 0,3 0,0 99,5 0,0 0,0 0,0 semanas 1 1 0,2 0,3 0,0 99,5 0,0 0,0 0,0 semanas 2 0,2 0,0 0,0 98,3 1,3 0,3 0,0 semanas 4 0,1 0,0 0,0 96,7 2,7 0,4 0,0 semanas
0 0,3 0,2 0,0 99,5 0,0 0,0 0,0 semanas 2 1 0,2 0,3 0,0 99,5 0,0 0,0 0,0 semanas 2 0,1 0,0 0,0 98,5 1,1 0,3 0,0 semanas 4 0,1 0,0 0,0 96,7 2,8 0,5 0,0 semanas
[080] Como os resultados do teste de estabilidade acelerada e do teste da intensidade da instabilidade mostram, e como também ilustrado na Figura 2, observou-se que a proporção de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração oxidado (Impureza #3 na análise por RP-HPLC) aumentou na formulação líquida sem metionina, mas não aumentou na formulação líquida com 0,01% de metionina (Figura 2). Por conseguinte, foi confirmado que a formulação líquida contendo metionina pode conferir estabilidade ao conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de forma mais eficaz. Exemplo 6: Avaliação da estabilidade em armazenamento de longo prazo da formulação líquida de escolha do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração
[081] No presente exemplo, a formulação líquida que foi por fim escolhida através dos exemplos anteriores foi avaliada quanto à sua estabilidade em armazenamento de longo prazo e à sua estabilidade acelerada. A formulação líquida de escolha compreende tampão de citrato a um pH de 5,2, cloreto de sódio, manitol, polissorbato 20 e metionina. Para este efeito, as formulações foram armazenadas a 5 ± 3ºC durante 6 meses, e a 25 ± 2ºC durante 6 meses, e a sua estabilidade foi analisada. Os resultados estão apresentados nas Tabelas 15 e 16, em que RP-HPLC (%), SE-HPLC (%), teor de proteína (%) e teste de atividade específica (%) representam a pureza residual do conjugado em comparação com a pureza inicial. A Tabela 15 mostra os resultados dos testes de estabilidade em armazenamento de longo prazo da formulação após armazenamento da mesma a 5 ± 3ºC e a Tabela 16 mostra os resultados do teste de estabilidade acelerada após armazenamento da mesma a 25 ± 2ºC. Tabela 15 Avaliação da estabilidade em armazenamento de longo prazo (armazenado a 5 ± 3ºC) Duração Cor p Teste Teste pureza Teor Atividade Armaze H confirmação Proteín específic n RP- Wester SDS- RP- RP- Endotoxin a a HPLC n blot PAGE HPL HPL a (%) (%)
C C (%) (%) Início Incolor/ 5, Corresp Aceitáv. Aceitáv 100,0 100,0 Aceitável 100,0 100,0 Transpar 2 . . . 1 mês Incolor/ 5, Corresp Aceitáv. Aceitáv 100,1 99,7 Aceitável 105,8 114,3 Transpar 2 . . . 3 meses Incolor/ 5, Corresp Aceitáv. Aceitáv 100,1 99,6 Aceitável 100,0 115,7 Transpar 2 . . . 6 meses Incolor/ 5, Corresp Aceitáv. Aceitáv 100,0 99,5 Aceitável 100,0 97,0 Transpar 2 . . .
Tabela 16 Avaliação da estabilidade em armazenamento de longo prazo (armazenado a 25 ± 2ºC) Dura Cor pH Teste Teste pureza Teor Atividade ção confirmação Proteín específic Arma RP- Wester SDS- RP- RP- Endotoxi a a zen HPLC n blot PAGE HPL HPLC na (%) (%) C (%) (%) Início Incolor/ 5,2 Corres Aceitáv. Aceitáv 100,0 100,0 Aceitável 100,0 100,0 transpar p. . . 1 Incolor/ 5,2 Corres Aceitáv. Aceitáv 99,6 98,4 Aceitável 105,8 116,4 mês transpar p. . . 3 Incolor/ 5,2 Corres Aceitáv. Aceitáv 98,0 98,6 Aceitável 103,8 95,8 mese transpar p. . s . 6 Incolor/ 5,2 Corres Aceitáv. Aceitáv 95,4 97,7 Aceitável 103,8 90,5 mese transpar p. . s .
[082] Os resultados do teste de estabilidade em armazenamento de longo prazo mostram que o conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração permaneceu estável durante mais de 6 meses na formulação líquida da presente invenção. Além disso, mesmo quando armazenado em condições aceleradas durante 6 meses, os resultados da análise por RP-HPLC mostram que 95,4% ou mais do conjugado de peptídeo permaneceu intato na formulação, confirmando assim que a presente formulação líquida proporciona ao conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração uma excelente estabilidade em armazenamento. Exemplo 7: Avaliação da estabilidade do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração em função da concentração de proteína
[083] O efeito de uma concentração elevada de conjugado foi analisado para a formulação líquida de escolha, composta por tampão de citrato a um pH de 5,2, cloreto de sódio, manitol, polissorbato 20, e metionina para impedir a oxidação. Para este efeito, a precipitação na formulação foi monitorizada a olho nu e a 40ºC para várias concentrações de conjugado, tal como se mostra na Tabela 17. Após 72 horas de monitorização, observou-se precipitação em todas as formulações de concentração elevada (4 mg/ml ou mais). Além disso, com o aumento da concentração, a ocorrência de precipitação também aumentou. Tabela 17 No. Concent. Tampão Sal Álcool de açúcar e outros Tensoativo Citrato-Na NaCl 5% Manitol/ 0,005% 1 0,52 mg/ml 20 mM (pH 5,2) 150 mM 0,1 mg/ml Metionina Polissorbato 20 Citrato-Na NaCl 5% Manitol/ 0,005% 2 4,0 mg/ml 20 mM (pH 5,2) 150 mM 0,1 mg/ml Metionina Polissorbato 20 Citrato-Na NaCl 5% Manitol/ 0,005% 3 5,0 mg/ml 20 mM (pH 5,2) 150 mM 0,1 mg/ml Metionina Polissorbato 20 Citrato-Na NaCl 5% Manitol/ 0,005% 4 8,0 mg/ml 20 mM (pH 5,2) 150 mM 0,1 mg/ml Metionina Polissorbato 20
Citrato-Na NaCl 5% Manitol/ 0,005% 5 10,0 mg/ml 20 mM (pH 5,2) 150 mM 0,1 mg/ml Metionina Polissorbato 20 Citrato-Na NaCl 5% Manitol/ 0,005% 6 13,0 mg/ml 20 mM (pH 5,2) 150 mM 0,1 mg/ml Metionina Polissorbato 20 Exemplo 8: Avaliação da estabilidade do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração em concentração elevada em função da concentração do sal e do álcool de açúcar, e na presença de metionina
[084] O efeito da concentração de NaCl e de manitol como álcool de açúcar na prevenção da precipitação foi examinado para a formulação líquida de escolha de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração em concentração elevada. As formulações foram preparadas com as composições apresentadas seguidamente na Tabela 18 e monitorizadas a olho nu e a 40ºC quanto à ocorrência de precipitação, durante 48 horas. A duração da ausência de precipitação apresentada na Figura 3 mostra o tempo após armazenamento em que não ocorreu precipitação de proteína. Tabela 18 No. Concent. Tampão Sal Álcool de açúcar e outros Tensoativo Citrato-Na NaCl 5% Manitol/ 0,005% 1 5,0 mg/ml 20 mM (pH 5,2) 150 mM 0,1 mg/ml Metionina Polissorbato 20 Citrato-Na NaCl 10% Manitol/ 0,005% 2 5,0 mg/ml 20 mM (pH 5,2) 150 mM 0,1 mg/ml Metionina Polissorbato 20 Citrato-Na NaCl 5% Manitol/ 0,005% 3 5,0 mg/ml 20 mM (pH 5,2) 150 mM 0,1 mg/ml Metionina Polissorbato 20 Citrato-Na NaCl 5% Manitol/ 0,005% 4 5,0 mg/ml 20 mM (pH 5,2) 150 mM Polissorbato 20
[085] Como se pode ver por estes resultados, confirma-se que a concentração de NaCl não afeta significativamente nem a ocorrência de precipitação nem a estabilidade do conjugado de peptídeo insulinotrópico em concentração elevada, com base na observação a olho nu. No entanto, quando a concentração de manitol como álcool de açúcar é aumentada de 5% para
10%, a precipitação pode ser suprimida de forma significativa (Figura 3). Além disso, quando não se adiciona metionina à formulação, a precipitação pode igualmente ser suprimida. Exemplo 9: Avaliação da estabilidade do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração em concentração elevada em função da presença de sal e a vários pH a. Com 10% de manitol tal como no Exemplo 8, examinou-se o efeito do pH na supressão de precipitação e na promoção da estabilidade do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração em concentração elevada. Como tampão utilizou-se tampão de citrato e polissorbato 20 foi usado como tensoativo não iônico. De acordo com o Exemplo 8, a precipitação pode ser suprimida sem a presença de metionina na formulação. Ainda assim, adicionou-se metionina à formulação para impedir a oxidação da proteína. Além disso, para confirmar o efeito sinérgico entre o NaCl e o pH, a formulação foi testada sem NaCl ou com NaCl 150 mM. O conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração em concentração elevada foi preparado nas composições apresentadas seguidamente na Tabela 19, que foram monitorizadas quanto à ocorrência de precipitação a 40ºC, durante 7 dias. Após 7 dias de armazenamento, as amostras foram analisadas por RP-HPLC e SE-HPLC.
[086] A duração da ausência de precipitação que se mostra na Figura 4 indica o tempo decorrido após armazenamento em que não houve precipitação de proteína. RP-HPLC (%) da Tabela 20 e SE-HPLC (%) da Tabela 21 indicam a pureza residual do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração em comparação com a pureza inicial. Tabela 19 No. Concent. Tampão Sal Álcool de açúcar e outros Tensoativo Citrato-Na 5% Manitol/ 0,005% 1 5,0 mg/ml 20 mM (pH 5,2) 0,1 mg/ml Metionina Polissorbato 20
Citrato-Na NaCl 5% Manitol/ 0,005% 2 5,0 mg/ml 20 mM (pH 5,2) 150 mM 0,1 mg/ml Metionina Polissorbato 20 Citrato-Na 5% Manitol/ 0,005% 3 5,0 mg/ml 20 mM (pH 5,4) 0,1 mg/ml Metionina Polissorbato 20 Citrato-Na NaCl 5% Manitol/ 0,005% 4 5,0 mg/ml 20 mM (pH 5,4) 150 mM 0,1 mg/ml Metionina Polissorbato 20 Citrato-Na 5% Manitol/ 0,005% 5 5,0 mg/ml 20 mM (pH 5,6) 0,1 mg/ml Metionina Polissorbato 20 Citrato-Na NaCl 5% Manitol/ 0,005% 6 5,0 mg/ml 20 mM (pH 5,6) 150 mM 0,1 mg/ml Metionina Polissorbato 20 Tabela 20 No. RP-HPLC (Área %) 0d 1d 2d 3d 4d 7d 1 98,5 Precipitação Precipitação Precipitação Precipitação Precipitação 2 98,4 98,0 Precipitação Precipitação Precipitação Precipitação 3 98,4 97,9 97,7 97,6 97,3 96,8 4 98,3 98,0 97,7 97,6 97,2 96,3 5 98,2 97,8 97,8 97,5 97,4 96,5 6 98,3 98,1 97,9 97,5 97,2 96,5 Tabela 21 No. RP-HPLC (Área %) 0d 1d 2d 3d 4d 7d 1 Precipitação Precipitação Precipitação Precipitação Precipitação 2 98,3 95,6 Precipitação Precipitação Precipitação Precipitação 3 98,3 98,0 97,8 97,5 97,4 97,4 4 98,4 98,1 97,9 97,4 97,3 97,6 5 98,5 98,0 98,9 97,9 97,8 97,6 6 98,5 98,1 98,1 98,0 97,9 97,8
[087] Como se pode ver por estes resultados, a precipitação foi melhor suprimida a um pH elevado de 5,4 e 5,6 do que ao pH de 5,2. Após 7 dias de armazenamento, foi observada precipitação em todas as formulações. No entanto, na composição composta por 10% de manitol e NaCl 150 mM a um pH de 5,6 (Composição No. 6), a quantidade de impurezas gerada foi menor. Ao pH de 5,4 e 5,6, a presença de NaCl não teve um efeito significativo na estabilidade do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração em concentração elevada, com exceção da precipitação (Tabelas 20 e 21, e Figura 4). Exemplo 10: Avaliação da estabilidade do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração em concentração elevada em função da concentração do álcool de açúcar e a vários pH
[088] Com base nos Exemplos anteriores, examinou-se o efeito da concentração do álcool de açúcar e do pH na estabilidade do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração em concentração elevada. Como tampão utilizou-se tampão de citrato e polissorbato 20 foi utilizado como tensoativo não iônico. Metionina foi adicionada à formulação para impedir a oxidação. Além disso, com base nos resultados observados no Exemplo 9, foi excluído NaCl da formulação de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração em concentração elevada. O conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração em concentração elevada foi formulado com as composições apresentadas seguidamente na Tabela 22, que foram armazenadas a 40ºC durante 5 dias, mudadas para a temperatura de 25ºC, e armazenadas durante mais 4 semanas. Todas as semanas, a estabilidade da proteína foi analisada por SE-HPLC, IE-HPLC e RP-HPLC. SE- HPLC (%) da Tabela 23, IE-HPLC (%) da Tabela 24, e RP-HPLC (%) da Tabela 25 representam a pureza residual do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração. Tabela 22 No. Concent. Tampão Sal Álcool de açúcar e outros Tensoativo Citrato-Na 10% Manitol/ 0,005% 1 10,0 mg/ml 20 mM (pH 0,1 mg/ml Metionina Polissorbato 20 5,6)
Citrato-Na 10% Manitol/ 0,005% 2 10,0 mg/ml 20 mM (pH 0,1 mg/ml Metionina Polissorbato 20 5,2) Citrato-Na 10% Manitol/ 0,005% 3 10,0 mg/ml 20 mM (pH 0,1 mg/ml Metionina Polissorbato 20 6,0) Citrato-Na 2% Manitol/ 0,005% 4 10,0 mg/ml 20 mM (pH 0,1 mg/ml Metionina Polissorbato 20 6,0) Citrato-Na 2% Manitol/ 0,005% 5 10,0 mg/ml 20 mM (pH 0,1 mg/ml Metionina Polissorbato 20 6,4) Citrato-Na 5% Manitol/ 0,005% 6 10,0 mg/ml 20 mM (pH 0,1 mg/ml Metionina Polissorbato 20 6,0) Citrato-Na 5% Manitol/ 0,005% 7 10,0 mg/ml 20 mM (pH 0,1 mg/ml Metionina Polissorbato 20 6,4) Tabela 23 No.
SE-HPLC (Área %) 0S 1S 2S 3S 4S 1 99,4 98,3 98,3 98,2 98,0 2 99,3 98,0 98,0 97,8 97,6 3 99,3 98,1 98,1 98,0 97,9 4 99,3 97,9 97,8 97,8 97,7 5 99,0 97,7 97,6 97,6 97,5 6 99,3 98,1 98,0 98,0 97,7 7 99,0 97,7 97,7 97,6 97,5 Tabela 24 No.
IE-HPLC (Área %) 0S 1S 2S 3S 4S 1 95,6 81,7 78,2 75,7 65,3 2 95,7 73,8 69,0 64,6 53,3
3 95,7 81,7 79,9 77,1 69,1 4 95,6 80,3 78,0 75,3 66,4 5 95,6 72,7 70,8 68,3 60,2 6 95,7 80,6 77,1 72,3 61,6 7 95,7 74,1 72,0 69,8 62,7 Tabela 25 No. RP-HPLC (Área %) 0S 1S 2S 3S 4S 1 97,5 87,2 84,1 81,0 75,7 2 97,6 80,0 77,6 67,5 60,3 3 97,5 87,5 84,9 81,0 76,0 4 97,5 86,6 83,4 79,2 72,9 5 96,5 84,5 79,5 76,2 72,9 6 97,5 86,1 82,8 77,1 69,7 7 96,6 82,9 80,1 77,2 71,9
[089] Como os resultados anteriores indicam, a valores de pH baixo, a estabilidade é menor do que a valores de pH elevado. A estabilidade mais elevada do conjugado foi observada para 10% de manitol, enquanto 2% e 5% de manitol não afetaram a estabilidade do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração em concentração elevada. Exemplo 11: Avaliação da estabilidade do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração em concentração elevada em função do tipo e concentração do álcool de açúcar
[090] A fim de desenvolver uma formulação líquida isotônica, foi avaliado o efeito que o tipo e a concentração de um álcool de açúcar, o qual afeta de forma significativa a pressão osmótica da formulação, exerce na estabilidade do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração sob as mesmas condições dos Exemplos anteriores. O tipo de álcool de açúcar foi alterado para sacarose. Com base na Formulação No. 1 do Exemplo 10, 10% de manitol foi substituído por 5% e 7% de sacarose (Tabela 26). As formulações foram armazenadas a 25ºC durante 4 semanas e a sua estabilidade foi analisada todas as semanas por SE-HPLC, IE-HPLC e RP- HPLC.
SE-HPLC (%) da Tabela 27, IE-HPLC (%) da Tabela 28, e RP-HPLC (%) da Tabela 29 representam a pureza residual do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração.
Tabela 26
No.
Concent.
Tampão Sal Álcool de açúcar e outros Tensoativo Citrato-Na 10% Manitol/ 0,005% 1 10,0 mg/ml 20 mM (pH 5,6) 0,1 mg/ml Metionina Polissorbato 20 Citrato-Na 5% Sacarose/ 0,005% 2 10,0 mg/ml 20 mM (pH 5,6) 0,1 mg/ml Metionina Polissorbato 20 Citrato-Na 7% Sacarose/ 0,005% 3 10,0 mg/ml 20 mM (pH 5,6) 0,1 mg/ml Metionina Polissorbato 20 Tabela 27 No.
SE-HPLC (Área %) 0S 1S 2S 3S 4S 1 99,4 98,3 98,3 98,2 98,0 2 99,5 98,4 98,3 98,2 98,0 3 99,5 98,5 98,4 98,3 98,1 Tabela 28 No.
IE-HPLC (Área %) 0S 1S 2S 3S 4S 1 95,6 81,7 78,2 75,7 65,3 2 95,6 83,1 79,9 76,5 68,8 3 95,7 83,8 81,3 78,1 69,6 Tabela 29 No.
SE-HPLC (Área %) 0S 1S 2S 3S 4S 1 97,5 87,2 84,1 81,0 75,7 2 97,5 88,5 85,0 80,9 75,3
Claims (30)
1. Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração, caracterizada por compreender uma quantidade farmaceuticamente eficaz de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração, em que um peptídeo insulinotrópico, que é um peptídeo fisiologicamente ativo, esú{ ligado a uma região Fe da imunoglobulina; e um estabilizador isento de albumina, em que o estabilizador compreende um tampão, um álcool de açúcar, um tensoativo não iônico, e um agente isotônico.
2. Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o peptídeo insulinotrópico ser selecionado do grupo constituído por peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1), peptídeo-2 semelhante ao glucagon (GLP-2), exendina-3, exendina-4, os precursores, agonistas, derivados, fragmentos, e variantes dos mesmos, e uma sua combinação.
3. Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por a variante do peptídeo insulinotrópico ser imidazo-acetil exendina-4.
4. Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a região Fe da imunoglobulina ser uma região Fe derivada de lgG, lgA, lgD, lgE, ou lgM.
5. Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por a região Fe da imunoglobulina ser um híbrido de domínios de diferentes origens derivados de imunoglobulinas selecionadas do grupo composto por lgG, lgA, lgD, lgE, e lgM.
6. Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por a região Fe da imunoglobulina ser um dímero ou multímero consistindo de imunoglobulinas de cadeia.símple-, compostas por domínios da mesma origem.
,.. , -· 2/5
7. Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por a região Fe da imunoglobulina ser uma região Fe de lgG4.
8. Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por a região Fe da imunoglobulina ser uma região Fe de lgG4 humana não glicosilada.
9. Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o conjugado ser gerado por utilização de um polímero não peptídico ou técnica recombinante.
1 O. Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por o polímero não peptídico ser um polietilenoglicol.
11. Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de acordo com a reivindicação 1 O, caracterizada por o polímero não peptídico ser selecionado do grupo composto por um polímero biodegradável tal como um polipropilenoglicol, um copolímero de etilenoglicol e propilenoglicol, um poliol polioxietilado, álcool polivinílico, polissacarídeo, dextrano, éter poliviniletílic.o, ácido poliláctico (PLA) e ácido poliláctico-glicólico (PLGA); um polímero de lipídeos; quitinas; um ácido hialurônico; e uma combinação destes.
12. Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a quantidade farmaceuticamente eficaz do conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração corresponder a uma concentração de 0,5 mg/ml a 150 mg/ml.
13. Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o álcool de açúcar ser um ou mais selecionados do grupo composto por manitol, : ...•
sorbitol, e sacarose.
14. Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por a concentração do álcool de açúcar ser de 3% (p/v) a 15% (p/v) com base no volume total de solução. ~
15. Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada por o tampão ser um tampão de citrato, um tampão de acetato, ou um tampão de histidina.
16. Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a faixa de pH do tampão ser de 4 a 7.
17. Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por a faixa de pH do tampão ser de 5 a 7.
18. Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de ..Elcordo com a reivindicação 1, caracterizada por o agente isotônico ser cloreto de sódio com uma concentração de O mM a 200 mM.
19. Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada por o tensoativo não iônico ser o polissorbato 80 ou o polissorbato 20.
20. Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de acordo com a reivindicação 19, caracterizada por o tensoativo não iônico estar em uma concentração de 0,001% (p/v) a 0,05% (p/v).
21. Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o estabilizador compreender ~dicionalmente metionina.
22. Formulação l.íquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de acordo com a reivindicação 21, caracterizada por a concentração de metionina ser de 0,005% (p/v) a O, 1 % (p/v) com base no volume total de solução.
23. Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada por o estabilizador compreender adicionalmente uma ou mais substâncias selecionadas do grupo composto por açúcares, polialcoóis e aminoácidos.
24. Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração que compreende um conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração, caracterizada por o peptídeo insulinotrópico e uma região Fe da imunoglobulina estarem ligados por polietilenoglicol; e um estabilizador isento de albumina, em que o estabilizador compreende tampão de citrato, manitol, polissorbato 20 e cloreto de sódio.
25. Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender adicionalmente um ou mais conservantes selecionados do grupo composto por m-cresol, fenol e álcool benzílico.
26. Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de acordo com a reivindicação 25, caracterizada por a concentração do conservante ser de 0,001% a 1 % (p/v) com base no volume total de solução.
27. Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de acordo com a reivindicação 25, caracterizada por o conservante ser m-cresol.
28. Formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração de acordo com a reivindicação 25, caracterizada por ser para utilizações múltiplas.
29. Método de preparação da formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração tal como descrito em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24, caracterizado por compreender
.
5/5 \'" (a) preparar um conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração; e (b) misturar o conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração preparado no passo (a) com um estabilizador constituído por tampão, álcool de açúcar, tensoativo não iônico, cloreto de sódio como agente isotônico, e metionina.
30. Método de preparação da formulação líquida de conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração tal como descrito em qualquer uma das reivindicações de 27 a 30, caracterizado por compreender (a) preparar um conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração; e (b) misturar o conjugado de peptídeo insulinotrópico de ação de longa duração preparado no passo (a) com um estabilizador constituído por tampão, álcool de açúcar, tensoativo não iônico, cloreto de sódio como agente isotônico, metionina e um conservante.
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