BR112014019575B1

BR112014019575B1 - método para a produção de uma solução de açúcar

Info

Publication number: BR112014019575B1
Application number: BR112014019575A
Authority: BR
Inventors: Minamino Atsushi; Kurihara Hiroyuki; Kishimoto Junpei; Yamada Katsushige; Niwa Masahiro; Shindo Sho; Nishida Takanori
Original assignee: Jx Nippon Oil & Energy Corp; Toray Industries
Priority date: 2012-02-13
Filing date: 2013-02-12
Publication date: 2019-12-17
Also published as: JP2013162777A; EP2816124A4; BR112014019575A2; US10087469B2; US20150004647A1; CA2864256A1; EP2816124B1; CA2864256C; EP2816124A1; WO2013122051A1; BR112014019575A8; ES2613682T3

Abstract

método para a produção de uma solução de açúcar a presente invenção se refere a um método para a produção de uma solução de açúcar da presente invenção que inclui uma etapa de prétratamento da biomassa celulósica tratada com um agente de tratamento que contém amônia para obter um produto tratado com amônia (etapa s11), uma etapa de preparação da solução de açúcar tratada com amônia da sacarificação enzimática do produto tratado com amônia para obter uma solução de açúcar tratada com amônia (etapa s12), e uma etapa de preparação da solução de açúcar purificada removendo a coumaramida e/ou a ferulamida na solução de açúcar tratada com amônia através da purificação para obter uma solução de açúcar purificada que possui uma concentração de coumaramida e/ou de ferulamida de 10 a 1.100 ppm (etapa s13).

Description

“MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA SOLUÇÃO DE AÇÚCAR” Campo da Invenção [001] A presente invenção se refere a um método para a produção de uma solução de açúcar a partir da biomassa celulósica, à solução de açúcar, e a um método para a produção de etanol.

Antecedentes Da Invenção [002] Um processo de produção de fermentação de uma substância química a partir do açúcar como matéria prima é utilizado na produção de diversas matérias primas industriais. Recentemente, tal como o açúcar que é utilizado como uma matéria prima de fermentação, uma substância derivada de uma matéria prima comestível, tais como a cana de açúcar, amido e açúcar de beterraba, é utilizada industrialmente. No entanto, as matérias primas comestíveis podem ser poucas devido a um aumento na população global no futuro, e isso pode ocasionar um súbito aumento nos preços. Por conseguinte, o desenvolvimento de um processo para a produção eficiente de uma solução de açúcar a partir de um material não comestível, isto é, a biomassa celulósica se tornou um problema.

[003] A biomassa celulósica principalmente inclui a lignina que é um polímero aromático, celulose e hemicelulose, cada um é um polímero de monossacarídeos. Os exemplos de um método para a produção de uma solução de açúcar a partir da biomassa celulósica como uma matéria prima incluem um método para diretamente hidrolisar a biomassa celulósica, como uma matéria prima, utilizando o ácido sulfúrico concentrado ou similar, e um método de sacarificação enzimática de pré-tratamento em que a biomassa celulósica que é submetida a um pré-tratamento, tal como um tratamento de vapor, tratamento de pulverização fina, e um tratamento com ácido sulfúrico diluída com antecedência, para separar a celulose e a hemicelulose da lignina, e a hemicelulose e a celulose são hidrolisadas com a enzima diastática, tal

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 14/98

2/40 como a celulase.

[004] Uma solução de açúcar produzida a partir da biomassa celulósica obtida através destes métodos apresenta um problema em que durante um processo para a produção da solução de açúcar, um inibidor de fermentação, tais como o furfural de hidroximetila (HMF), furfural, e vanilina são produzidos, e durante a produção de álcool e similares através da fermentação da solução de açúcar obtida, a fermentação da solução de açúcar é inibida. Além disso, a concentração de açúcar de uma solução de açúcar a ser obtida pode ser baixa dependendo das condições de tratamento da produção da solução de açúcar. Neste caso, a solução de açúcar precisa ser diversas vezes mais concentrada, cerca de 10 vezes antes da etapa de fermentação. Como um método para remover o inibidor de fermentação na solução de açúcar e, ao mesmo tempo, aumentar a concentração de açúcar durante a produção da solução de açúcar a partir da biomassa celulósica como a matéria prima, está descrito um método para o tratamento da solução de açúcar utilizando uma membrana de nanofiltração (por exemplo, vide Literaturas de Patentes 1 e 2).

[005] Em geral, o método de sacarificação enzimática de prétratamento apresenta uma vantagem que o impacto ambiental é inferior em comparação com o método para diretamente hidrolisar a matéria prima, por outro lado, o rendimento de açúcar é baixo. Como um método de prétratamento em que o impacto ambiental é pequeno e o rendimento elevado de açúcar é obtido, foi proposto um método de pré-tratamento utilizando um

agente de tratamento que contém amônia.	1:	panfleto	da	publicação
[006] Literatura	de Patente
internacional 2009/110.374
[007] Literatura	de Patente	2:	panfleto	da	publicação
internacional 2010/067785
[008] Literatura	de Patente 3:	Pedido de Patente	Publicado

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 15/98

3/40

Japonês 2008-161125

Descrição Resumida da Invenção [009] Em geral, em uma solução de açúcar obtida a partir da biomassa celulósica que é submetida a um pré-tratamento, tal como um tratamento de vapor, conforme descrito acima, um inibidor de fermentação, tais como o furfural de hidroximetila (HMF), furfural, e vanilina são produzidos durante um processo de produção da solução de açúcar, e a fermentação da solução de açúcar é inibida durante a produção de álcool e similares através da fermentação da solução de açúcar obtida.

[010] Por outro lado, em uma solução de açúcar obtida através do método de sacarificação enzimática de pré-tratamento utilizando o prétratamento com o agente de tratamento que contém amônia, conforme descrito na Literatura de Patente 3, o inibidor da fermentação conhecido descrito acima é detectado, mas descobriu-se que a fermentação da solução de açúcar é inibida como uma solução de açúcar obtida a partir da biomassa celulósica.

[011] Por conseguinte, é um objeto da presente invenção fornecer um método para a produção de uma solução de açúcar que é capaz de aprimorar a eficiência da fermentação da solução de açúcar durante a fermentação da solução de açúcar que é obtida utilizando a biomassa celulósica pré-tratada com um agente de tratamento que contém amônia que pode alcançar rendimento elevado de açúcar para visar o aprimoramento da eficiência da produção de etanol e similares, utilizando a solução de açúcar obtida a partir da biomassa celulósica, assim como para fornecer uma solução de açúcar e um método para a produção de etanol.

[012] Para resolver o problema e a atingir o objeto, os presentes Depositantes intensivamente investigaram um método para a produção de uma solução de açúcar, uma solução de açúcar, e um método para a produção de etanol. Como resultado, os Depositantes descobriram que um hidrolisado

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 16/98

4/40 (solução de açúcar tratada com amônia), obtido através da hidrólise, com uma enzima, a biomassa celulósica pré-tratada com amônia inclui a coumaramida e ferulamida como inibidores de fermentação específicos. Com base na descoberta obtida, os Depositantes descobriram que quando a coumaramida e/ou a ferulamida na solução de açúcar tratada com amônia são removidas através da purificação para definir a concentração de coumaramida e/ou ferulamida para um intervalo pré-determinado, a eficiência da fermentação da solução de açúcar tratada com amônia pode ser aprimorada. A presente invenção foi concluída em função das descobertas.

[013] Mais especificamente, a presente invenção possui as seguintes configurações de (1) a (6).

(1) Um método para produção de uma solução de açúcar, que inclui:

a etapa de pré-tratamento da biomassa celulósica com um agente de tratamento que contém amônia para obter um produto tratado com amônia;

uma etapa de preparação da solução de açúcar tratada com amônia enzimaticamente sacarificando o produto tratado com amônia para obter uma solução de açúcar tratada com amônia; e uma etapa de preparação da solução de açúcar purificada removendo a coumaramida e/ou ferulamida na solução de açúcar tratada com amônia através da purificação para obter uma solução de açúcar purificada que possui uma concentração de coumaramida e/ou de ferulamida de 10 a 1.100 ppm.

(2) O método para a produção de uma solução de açúcar, de acordo com o descrito acima (1), em que a biomassa celulósica contém a biomassa herbácea.

(3) O método para a produção de uma solução de açúcar, de

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 17/98

5/40 acordo com o descrito acima (1) ou (2), em que em um tratamento da purificação da solução de açúcar tratada com amônia, é utilizada uma membrana de nanofiltração.

(4) O método para a produção de uma solução de açúcar, de acordo com qualquer um dos descrito acima de (1) a (3), em que o produto tratado com amônia é enzimaticamente sacarificado com uma solução que possui uma concentração de matéria sólida do produto tratado com amônia no intervalo de 1 a 10% em massa, durante a sacarificação enzimática do produto tratado com amônia.

(5) Uma solução de açúcar obtida através do método para a produção uma solução de açúcar, de acordo com qualquer um dos descritos acima de (1) a (4).

(6) Um método para a produção do etanol utilizando a solução de açúcar produzida de acordo com o (5) descrito acima, como uma matéria prima de fermentação.

Efeitos Vantajosos da Invenção [014] De acordo com a presente invenção, quando uma solução de açúcar obtida utilizando a biomassa celulósica pré-tratada com um agente de tratamento que contém amônia é fermentada, a eficiência de fermentação da solução de açúcar pode ser aprimorada.

Breve Descrição das Figuras [015] A Figura 1 é um fluxograma que mostra um exemplo de um método para a produção de uma solução de açúcar produzida de acordo com uma realização da presente invenção.

[016] A Figura 2 é um diagrama que mostra os resultados da análise dos compostos aromáticos em uma solução de açúcar tratada com amônia através de HPLC.

[017] A Figura 3 é um diagrama que mostra um espectro de

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 18/98

6/40 absorção de UV do pico 1 da solução de açúcar tratada com amônia.

[018] A Figura 4 é um diagrama que mostra um espectro de absorção de UV do pico 2 da solução de açúcar tratada com amônia.

[019] A Figura 5 é um diagrama que mostra um espectro de absorção de UV de uma amostra padrão da coumaramida.

[020] A Figura 6 é um diagrama que mostra um espectro de absorção de UV de uma amostra padrão de ferulamida.

[021] A Figura 7 é um diagrama que mostra a relação entre um tempo de fermentação e uma concentração de etanol de uma solução de NF concentrada e uma solução de RO concentrada.

[022] A Figura 8 é um diagrama que mostra a relação entre um tempo de fermentação e uma concentração de xilose da solução de NF concentrada e da solução de RO concentrada.

[023] A Figura 9 é um diagrama que mostra a relação entre o tempo de fermentação e a concentração do etanol da solução de NF concentrada e da solução de RO concentrada.

[024] A Figura 10 é um diagrama que mostra a relação entre o tempo de fermentação e a concentração de xilose da solução de NF concentrada e da solução de RO concentrada.

Descrição Detalhada da Invenção [025] Daqui em diante, uma realização da presente invenção (daqui em diante referida como a realização) será descrita em detalhes com referência às figuras. A presente invenção não se limita à seguinte realização para a realização da presente invenção. Além disso, os constituintes na realização seguinte incluem aqueles que facilmente podem ser assumidos pelos técnicos do assunto, aqueles que são substancialmente equivalentes, e os denominados equivalentes. Além disso, os componentes descritos na seguinte realização podem ser utilizados em uma combinação adequada ou

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 19/98

7/40 através da seleção adequada.

[026] O método para a produção de uma solução de açúcar, de acordo com a realização da presente invenção, será descrito com referência às Figuras. A Figura 1 é um fluxograma que mostra um exemplo do método para a produção de uma solução de açúcar produzida de acordo com esta realização. Conforme mostrado na Figura 1, o método para a produção de uma solução de açúcar, de acordo com esta realização inclui as seguintes etapas:

(A) uma etapa de pré-tratamento da biomassa celulósica tratada com um agente de tratamento que contém amônia para obter um produto tratado com amônia (etapa S11);

(B) uma etapa de preparação da solução de açúcar tratada com amônia para enzimaticamente sacarificar o produto tratado com amônia para preparar uma solução de açúcar tratada com amônia (etapa S12); e (C) uma etapa de preparação da solução de açúcar purificada removendo a coumaramida e/ou a ferulamida da solução de açúcar tratada com amônia através da purificação para obter uma solução de açúcar purificada que possui uma concentração de coumaramida e/ou de ferulamida de 10 a 1.100 ppm (etapa S13).

[027] No presente, a biomassa celulósica significa a biomassa herbácea, tais como o bagaço, gramínea do gênero Panicum (switchgrass), capim elefante, erianthus, palha de milho (caule de milho), palha de arroz e palha de cevada, ou a biomassa lenhosa, tais como os resíduos da árvore e dos materiais de construção. A biomassa celulósica contém o polissacarídeo, tais como a celulose e a hemicelulose. Uma solução de açúcar pode ser produzida através da hidrólise de tal polissacarídeo.

[028] Em geral, a hidrólise da biomassa celulósica é referida como sacarificação. Nesta realização, uma solução de açúcar produzida através da sacarificação da biomassa celulósica é referida como uma solução

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 20/98

8/40 de açúcar derivada da celulose. A solução de açúcar derivada da celulose inclui os monossacarídeos, tais como a glicose, xilose, manose, e arabinose e os polissacarídeo hidrossolúveis, tais como a celobiose, celooligossacarídeo, e xilooligossacarídeo. Esses sacarídeos podem ser utilizados como uma matéria prima de fermentação (fonte de carbono) de um microrganismo, e convertidos através dos microrganismos em diversas substâncias químicas, tais como o etanol, o ácido láctico e o aminoácido.

Etapa de Pré-tratamento

Etapa S11 [029] A biomassa celulósica é tratada com um agente de tratamento que contém amônia para obter um produto tratado com amônia (etapa de pré-tratamento: etapa S11). Em geral, os exemplos de um método de pré-tratamento da biomassa celulósica pode incluir um tratamento a vapor, tratamento de pulverização fina, um tratamento de jateamento, um tratamento de ácido com uma solução ácida de ácido sulfúrico ou similar, um tratamento alcalino com uma solução alcalina de hidróxido de sódio ou similares, um tratamento com amônia (NH3), um tratamento enzimático, e um tratamento com um composto que contém um grupo amino (NH2). Entre os métodos de prétratamento, de acordo com esta realização, a biomassa celulósica é pré-tratada com um agente de tratamento que contém amônia. Amônia é facilmente obtida e manipulada. Através de um método de pré-tratamento com um agente de tratamento que contém amônia, a biomassa celulósica pode ser efetivamente sacarificada em comparação com outros métodos de pré-tratamento. Quando biomassa celulósica é pré-tratada com um agente de tratamento que contém amônia antes da sacarificação, a eficiência da sacarificação da biomassa celulósica pode ser aprimorada.

[030] Como o agente de tratamento que contém amônia, amônia pode ser utilizada em combinação com algum de um composto que contém um

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 21/98

9/40 grupo amino e um outro composto. Os exemplos do composto que contém um grupo amino incluem a metilamina, etilamina, propilamina, butilamina, hidrazina, etilenodiamina, propanodiamina e butanodiamina. Os exemplos do outro composto podem incluir o dióxido de carbono, nitrogênio, etileno, metano, etano, propano, butano, pentano, hexano, tolueno, benzeno, fenol, dioxano, ácido sulfúrico, acetona, clorofórmio, tetracloreto de carbono, etanol, metanol, propanol e butanol.

[031] Nesta realização, o agente de tratamento que contém amônia pode ser qualquer de um líquido, um gás, e uma fase mista de gáslíquido. Mesmo quando amônia é utilizada em qualquer estado de um líquido, um gás, e uma fase mista de gás-líquido, a biomassa celulósica que possui uma excelente eficiência de sacarificação enzimática pode ser obtida. O agente de tratamento que contém amônia pode ser um fluido de amônia supercrítico ou um fluido de amônia subcrítico. Um método de tratamento com o fluido de amônia supercrítico não é particularmente limitado, e pode ser adequadamente selecionado dependendo de um propósito. Por exemplo, este método de tratamento pode ser realizado através da introdução da biomassa celulósica e amônia em um reator tal como uma autoclave, e da aplicação de calor e pressão no interior do reator para produzir amônia no estado supercrítico. Uma vez que o fluido de amônia supercrítico possui uma permeabilidade elevada para o interior da biomassa celulósica, a biomassa celulósica adequada para a sacarificação enzimática pode ser obtida eficientemente e rapidamente.

[032] Nesta realização, a biomassa celulósica acumulada pode ser utilizada como tal, ou a biomassa celulósica pode ser cortada ou pulverizada com antecedência antes de um pré-tratamento, para formar as partículas da biomassa celulósicas que possui um diâmetro de partícula média que é igual ou inferior a um diâmetro pré-determinado da partícula e, em seguida, pré-tratada. Quando o diâmetro da partícula da biomassa celulósica é

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 22/98

10/40 reduzido com antecedência, o manuseio é fácil e a eficiência do tratamento com o agente de tratamento que contém amônia pode ser aprimorado.

[033] O diâmetro da partícula das partículas da biomassa celulósica não é particularmente limitado, e pode ser adequadamente selecionado dependendo dos seus propósitos. Por exemplo, o diâmetro da partícula, de preferência, é de 5 mm ou inferior, de maior preferência, de 1 mm ou inferior, e, de maior preferência ainda, de 0,1 mm ou inferior. Quando o diâmetro da partícula das partículas da biomassa celulósica é superior a 5 mm, a biomassa celulósica não pode ser submetida a um tratamento de sacarificação. Quando o diâmetro da partícula das partículas da biomassa celulósica está dentro do intervalo descrito acima, um tempo necessário para o tratamento da sacarificação da biomassa celulósica pode ser encurtado e a quantidade de amônia a ser utilizada pode ser reduzida.

[034] Nesta realização, a biomassa celulósica acumulada pode ser utilizada como tal e pré-tratada com o agente de tratamento que contém amônia, mas a presente invenção não está limitada a isto. Do ponto de vista da recuperação da amônia para ser utilizada em um pré-tratamento da biomassa celulósica, a biomassa celulósica pode ser secada e pré-tratada através da adição do agente de tratamento que contém amônia.

[035] Nesta realização, como o método de pré-tratamento da biomassa celulósica, um método de tratamento com o agente de tratamento que contém amônia é utilizado, mas o método de tratamento com o agente de tratamento que contém amônia pode ser utilizado em combinação com outro método de pré-tratamento da biomassa celulósica, conforme descrito acima.

Etapa de Preparação da Solução de Açúcar Tratada com amônia Etapa S12 [036] Uma enzima é adicionada ao produto tratado com amônia, obtido na etapa de pré-tratamento (etapa S11), para realizar a sacarificação

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 23/98

11/40 através de um tratamento enzimático e uma solução de açúcar tratada com amônia (hidrólise) é obtida (etapa de preparação da solução de açúcar tratada com amônia: etapa S12). Nesta realização, a solução de açúcar obtida através da sacarificação da biomassa celulósica tratada com o agente de tratamento que contém amônia é referida como uma solução de açúcar tratada com amônia.

[037] A solução de açúcar preparada a partir da biomassa celulósica (solução de açúcar derivada da celulose) contém um inibidor(es) de fermentação, em que a quantidade ou o componente varia dependendo de um método de pré-tratamento ou sacarificação. A inibição da fermentação significa um fenômeno em quando uma substância química é produzida como uma matéria prima de fermentação a partir da solução de açúcar derivada da celulose, a taxa de crescimento de um microrganismo, a quantidade de produção, a dose cumulativa e a taxa de produção da substância química, reduz em comparação com a utilização de um monossacarídeo da amostra como a matéria prima de fermentação. O inibidor de fermentação representa uma substância causadora para causar um fenômeno da inibição da fermentação em uma etapa de fermentação para evitar uma reação de fermentação. Os exemplos específicos do inibidor de fermentação podem incluir o ácido acético, ácido fórmico, ácido levulínico, furfural, e hidroximetila de furfural (HMF) que são substâncias excessivamente decompostas do açúcar e vanilina, acetovanilina e guaiacol que são compostos aromáticos derivados da lignina.

[038] A solução de açúcar tratada com amônia contém a coumaramida e a ferulamida como os inibidores da fermentação. A coumaramida e a ferulamida não estão contidas em uma solução de açúcar derivada de celulose obtida através de um tratamento diferente do tratamento com amônia, mas estão contidas na solução de açúcar tratada com amônia.

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 24/98

12/40

Por conseguinte, a coumaramida e a ferulamida são inibidores específicos da fermentação contidos na solução de açúcar tratada com amônia. A coumaramida e a ferulamida são compostos de amida produzidas através da condensação do ácido cumárico e ácido ferúlico com amônia, respectivamente. O ácido cumárico ou o ácido ferúlico está contido na biomassa celulósica. Por conseguinte, a coumaramida e a ferulamida na solução de açúcar tratada com amônia são produzidas através das reações de condensação do ácido cumárico e ácido ferúlico, respectivamente, na biomassa celulósica com uma molécula de amônia através do tratamento de amônia durante a adição do agente de tratamento que contém amônia para a biomassa celulósica na etapa de pré-tratamento (etapa S11).

[039] Até mesmo quando a biomassa celulósica herbácea ou lenhosa é utilizada como matéria prima, a coumaramida e a ferulamida estão contidas na solução de açúcar tratada com amônia. No entanto, quando a biomassa herbácea é utilizada como matéria prima, a coumaramida e a ferulamida estão contidas em quantidades maiores. Por conseguinte, quando a solução de açúcar tratada com amônia é utilizada como a matéria prima de fermentação, como tal, sem a purificação, a eficiência da fermentação quando a biomassa herbácea é utilizada como matéria prima é inferior que quando a biomassa lenhosa é utilizada como a matéria prima. No entanto, de acordo com a presente invenção, até mesmo quando a biomassa herbácea ou lenhosa é utilizada como matéria prima, a mesma eficiência de fermentação pode ser obtida através da purificação da solução de açúcar tratada com amônia. A razão por que as quantidades de coumaramida e de ferulamida na solução de açúcar tratada com amônia quando a biomassa herbácea é utilizada como a matéria prima são superiores que aquelas em que a biomassa lenhosa é utilizada como matéria prima é devido às quantidades de ácido cumárico e ácido ferúlico na biomassa herbácea são originalmente superiores que aquelas

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 25/98

13/40 na biomassa lenhosa.

[040] De preferência, o produto tratado com amônia é enzimaticamente sacarificado com uma solução que possui uma concentração das matérias sólidas do produto tratado com amônia dentro de um intervalo de 1% em massa ou superior e 10% em massa ou inferior durante a sacarificação enzimática do produto tratado com amônia. A concentração das matérias sólidas do produto tratado com amônia, de maior preferência, é de 5% em massa ou superior, e inferior a 10% em massa. Quando a concentração das matérias sólidas do produto tratado com amônia é de 10% em massa ou inferior, uma reação de sacarificação não é inibida durante a sacarificação enzimática do produto tratado com amônia através da adição de uma enzima para o produto tratado com amônia na etapa de preparação da solução de açúcar tratada com amônia, conforme descrito abaixo (etapa S12). Além disso, um aumento na concentração do inibidor da fermentação na solução de açúcar tratada com amônia pode ser suprimido. Quando a concentração das matérias sólidas do produto tratado com amônia é de 1% em massa, ou superior, o tempo de energia e de tratamento pode ser suprimido durante a concentração para uma concentração necessária para a utilização como matéria prima para a produção de fermentação, e o custo pode ser reduzido. Por conseguinte, isto é economicamente vantajoso.

[041] Um componente de solvente que contém as matérias sólidas do produto tratado com amônia não é limitado desde as matérias sólidas do produto tratado com amônia possam ser dispersas no mesmo. A água ou similar é utilizada.

[042] A enzima utilizada para a sacarificação enzimática do produto tratado com amônia não é particularmente limitada desde que seja uma enzima que apresente uma atividade de decomposição da celulose (celulase). Como a enzima, a celulase que contém a celulase do tipo exo ou a

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 26/98

14/40 celulase do tipo endo que possui uma atividade de decomposição da celulose cristalina, de preferência, é utilizada. De preferência, essa celulase é a celulase produzida por fungos filamentosos, de maior preferência, a celulase produzida por Trichoderma spp., entre os fungos filamentosos e além disso, de preferência, a celulase produzida por Trichoderma reesei entre Trichoderma spp.

[043] A sacarificação enzimática, de preferência, é realizada a um pH de cerca de 3 a cerca de 7 e, de maior preferência, de cerca de 5. Além disso, a temperatura de reação da sacarificação enzimática, de preferência, é de 40 a 70° C e, de maior preferência, de cerca de 50° C.

[044] A solução de açúcar tratada com amônia obtida através da sacarificação enzimática pode ser submetida a uma etapa seguinte como tal, ou após a remoção das matérias sólidas através da separação do sólidolíquido, tal como um método de separação centrífuga e um método de separação por membrana.

Etapa de Preparação da Solução de Açúcar Purificada

Etapa S13 [045] A coumaramida e/ou a ferulamida contidas na solução de açúcar tratada com amônia obtida na etapa de preparação da solução de açúcar tratada com amônia (etapa S12) são removidas através da purificação para obter uma solução de açúcar purificada que possui uma concentração pré-determinada (etapa de preparação da solução de açúcar purificada: etapa S13).

[046] A concentração de coumaramida e/ou ferulamida na solução de açúcar purificada está dentro de um intervalo de 10 a 1.100 ppm, de preferência, de 10 a 800 ppm e, de maior preferência, de 10 a 450 ppm. Quando a concentração de coumaramida e/ou de ferulamida na solução de açúcar purificada é de 1.100 ppm ou inferior, a eficiência de fermentação é

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 27/98

15/40 significativamente aprimorada. Quando a concentração na solução de açúcar purificada é de 10 ppm ou superior, um aumento da energia e do custo necessários para a purificação da solução de açúcar tratada com amônia pode ser suprimido. Em outras palavras, apesar da eficiência da fermentação da solução de açúcar purificada ser mais aprimorada à medida que a concentração de coumaramida e/ou de ferulamida é reduzida, quando a concentração na solução de açúcar purificada é inferior a 10 ppm, a eficiência da fermentação a solução de açúcar purificada não é aprimorada ainda e a energia e o custos necessários para a purificação da solução de açúcar tratada com amônia apenas aumenta. Por conseguinte, isto é economicamente desvantajoso, e não é preferido.

[047] Um método de purificação da solução de açúcar tratada com amônia não é particularmente limitado, e os seus exemplos podem incluir a destilação, extração, cristalização, recristalização, cromatografia em coluna, e membrana de separação. Estes métodos de purificação da solução de açúcar tratada com amônia podem ser utilizados isoladamente ou uma pluralidade de métodos pode ser utilizada em combinação. Entre os métodos de purificação da solução de açúcar tratada com amônia, um tratamento de membrana, de preferência, é utilizado, e em particular, a membrana de nanofiltração, de preferência, é utilizada. A membrana de nanofiltração é capaz de prevenir a permeação do açúcar na solução de açúcar tratada com amônia e permite que a coumaramida e/ou a ferulamida permeie. Por conseguinte, a utilização da membrana de nanofiltração na purificação da solução de açúcar tratada com amônia permite a concentração de açúcar e a remoção da ferulamida e da coumaramida.

[048] A membrana de nanofiltração é uma membrana de separação que, em geral, é definida como “membrana que permite que os íons monovalentes permeiem e impede os íons bivalentes” e também é referida

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 28/98

16/40 como um nanofiltro, uma membrana de nanofiltração ou uma membrana de NF. A membrana de nanofiltração é uma membrana que possui espaços vazios finos de alguns nanômetros, e principalmente é utilizada para a prevenção das partículas finas, moléculas, íons, sais e outros similares, na água.

[049] Como um material para a formação da membrana de nanofiltração, um material macromolecular, tais como o polímero à base de acetato de celulose, poliamida, poliéster, poliimida, polímero de vinila podem ser utilizado. A membrana de nanofiltração não se limita a um filme produzido de um tipo dos materiais anteriores, e a membrana que contém uma pluralidade de materiais de membrana podem ser utilizadas. A estrutura da membrana da membrana de nanofiltração pode ser que uma membrana assimétrica que possui uma camada compacta em, pelo menos, um lado e os microporos em que os diâmetros gradualmente aumentam a partir da camada compacta para a parte interna da membrana ou para outro lado ou uma membrana compósita que possui uma camada funcional muito fina produzida de outro material na camada compacta das membranas assimétricas. Como a membrana compósita, por exemplo, uma membrana compósita que consiste em um nanofiltro que possui uma camada funcional de poliamida em uma membrana de suporte produzida de polissulfona como um material de membrana pode ser utilizada. Por exemplo, essa membrana compósita está descrita na publicação do pedido de patente japonesa Sho. 62-201.606.

[050] Em particular, uma membrana compósita que possui resistência elevada de pressão, permeabilidade elevada à água e desempenho elevado de remoção de solutos e excelente potencial, e inclui uma camada de poliamida funcional é preferida. Para manter a durabilidade contra a pressão de operação, a permeabilidade elevada à água, o desempenho de prevenção, uma membrana que possui uma estrutura em que uma camada funcional é a poliamida e é realizada por uma membrana porosa ou um suporte produzido de

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 29/98

17/40 tecidos não tecidos é adequada. É adequada que uma membrana semipermeável de poliamida seja uma membrana compósita semipermeável que possui uma camada funcional de poliamida reticulada obtida através de uma reação de policondensação de uma amina polifuncional com um halogeneto de ácido polifuncional sobre um suporte.

[051] Os exemplos de componente de ácido carboxílico preferidos é um monômero que consiste em poliamida em membrana de nanofiltração que possui uma camada funcional de poliamida pode incluir um ácido carboxílico aromático, tais como o ácido trimésico, ácido tetracarboxílico de benzofenona, ácido trimelítico, ácido piromelítico, ácido isoftálico, ácido tereftálico, ácido naftalenodicarboxilico, ácido difenilcarboxílico, e ácido carboxílico de piridina. Em consideração a solubilidade a um solvente para a formação de uma membrana, o ácido trimésico, ácido isoftálico, ácido tereftálico, e uma mistura dos mesmos são de maior preferência.

[052] Os exemplos dos compostos de amina preferidos é um monômero que consiste em poliamida que pode incluir a diamina primária que possui um aromático anel, tais como a m-fenilenodiamina, p-fenilenodiamina, benzidina, metilenobisdianilina, éter 4,4'-diaminobifenila, dianisidina, éter 3,3',4triaminobifenila, éter 3,3',4,4'-tetraminobifenila, 3,3'-dioxibenzidina, 1,8naftalenodiamina, m(p)-monometilfenilenodiamina, éter 3,3'-monometilamino-

4,4-diaminobifenila, 4,N,N-(4-aminobenzoil)-p(m)-fenilenodiamina-2,2'-bis(4aminofenilbenzimidazol), 2,2'-bis(4-aminofenilbenzoxazol), e 2,2'-bis(4aminofenilbenzotiazol), e a diamina secundária tal como a piperazina, piperidina, e seus derivados. Em particular, uma membrana de nanofiltração que possui uma camada funcional de poliamida reticulada que contém a piperazina ou piperidina como o monômero, de preferência, é utilizada, uma vez que possui a resistência ao calor e a resistência química, além da resistência à pressão e durabilidade. A poliamida que contém a poliamida de

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 30/98

18/40 piperazina reticulada ou a poliamida de piperidina reticulada, como um componente principal e um componente representado pela seguinte Fórmula Química (1) é, de maior preferência, e a poliamida que contém a poliamida de piperidina reticulada como componente principal e o componente representado pela seguinte Fórmula Química (1) é, de maior preferência. O componente representado é, de maior preferência em que n é 3, de preferência, é utilizado. Os exemplos de uma membrana de nanofiltração que possui uma camada funcional de poliamida contém a poliamida de piperazina reticulada como componente principal e o componente representado pela seguinte Fórmula Química (1) podem incluir aqueles descritos na publicação do pedido de patente japonesa Sho. 62-201606. Os seus exemplos específicos podem incluir uma membrana de nanofiltração UTC60 à base de poliamida de piperazina reticulada disponível de Toray Industries, Inc., que possui uma camada de poliamida funcional que contém a poliamida de piperazina reticulada como componente principal e o componente representado pela seguinte Fórmula Química (1) em que n é 3.

(n é um número inteiro 1 ou superior.) [053] A membrana de nanofiltração, em geral é utilizada como um módulo de membrana em espiral. A membrana de nanofiltração utilizada nesta realização, de preferência, é utilizada como um módulo de membrana em espiral. Os exemplos específicos de módulo de membrana de nanofiltração preferido pode incluir um membrana de nanofiltração GEsepa disponível da GE Osmonics, Inc, que é uma membrana de nanofiltração à base de acetato de celulose, uma membrana de nanofiltração de NF99 ou NF99HF disponível Alfa Lavai, que possui uma camada funcional de poliamida, uma membrana de

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 31/98

19/40 nanofiltração de NF-45, NF-90, NF-200, NF-270, NF-400 disponível de Filmtech Corporation, que possui uma camada funcional de poliamida de piperazina reticulada, e um módulo de membrana de nanofiltração SU-210, SU-220, SU600 ou SU-610 disponível de Toray Industries, Inc., incluindo a UTC60 disponível de Toray Industries, Inc., que possui uma camada funcional que contém a poliamida de piperazina reticulada, como um componente principal e uma poliamida que contém um componente representado pela Fórmula Química (1) acima. A membrana de nanofiltração NF99 ou NF99HF disponível de Alfa Laval, que possui uma camada funcional de poliamida, uma membrana de nanofiltração de NF-45, NF-90, NF-200, 400 ou NF-30 disponível de

Filmtech Corporation, que possui uma camada funcional de poliamida de piperazina reticulada, e um módulo de membrana de nanofiltração SU-210, SU220, SU-600 ou SU-610 disponível de Toray Industries, Inc., incluindo a UTC60 disponível de Toray Industries, Inc., que possui uma camada funcional que contém poliamida de piperazina reticulada como componente principal e uma poliamida que contém um componente representado pela Fórmula Química (1) acima é de preferência. Um módulo de membrana de nanofiltração SU-210, SU-220, SU-600 ou SU-610 disponível de Toray Industries, INC, incluindo a UTC60 disponível de Toray Industries, Inc. que possui uma camada funcional que contém a poliamida de piperidina reticulada como componente principal e uma poliamida que contém um componente representado pela Fórmula Química (1) acima é de preferência.

[054] O pH da solução de açúcar tratada com amônia para passar através da membrana de nanofiltração não é particularmente limitado, e o pH, de preferência, é de 1 a 5. Quando o pH é inferior a 1, a membrana é desnaturada através da utilização durante um período de tempo prolongado, e os desempenhos das membranas, tais como a taxa de fluxo 20 e a permeabilidade reduz significativamente. Quando o pH é superior a 5, a taxa de

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 32/98

20/40 remoção do inibidor de fermentação pode reduzir significativamente. Quando o pH da solução de açúcar tratada com amônia está ajustado dentro do intervalo e a solução de açúcar tratada com amônia é submetida à filtração através da membrana de nanofiltração, a taxa de remoção do inibidor de fermentação pode ser aprimorada. Quando o pH da solução de açúcar tratada com amônia reduz dentro do intervalo, existe um efeito de suprimir a incrustação da membrana de nanofiltração. Por conseguinte, a membranas de nanofiltração pode ser utilizada de forma estável durante um período de tempo prolongado.

[055] O ácido ou o alcalino utilizado no ajuste de pH da solução de açúcar tratada com amônia não é particularmente limitado. Os exemplos do ácido incluem o ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, e ácido fosfórico. O ácido sulfúrico, o ácido nítrico, e o ácido fosfórico são de preferência, do ponto de vista da dificuldade ou da inibição durante a fermentação, e o ácido sulfúrico é, de maior preferência, do ponto de vista da economia. De preferência, o alcalino é amônia, hidróxido de sódio, hidróxido de cálcio, ou uma solução aquosa que contém qualquer um deles a partir do ponto de vista da economia, de maior preferência, amônia ou o hidróxido de sódio, que é um íon monovalente, a partir do ponto de vista da incrustação da membrana e, de maior preferência ainda, amônia a partir do ponto de vista da dificuldade ou inibição durante a fermentação.

[056] Uma etapa de ajuste do pH da solução de açúcar tratada com amônia pode ser realizada em qualquer momento, desde que a etapa seja executada antes da solução de açúcar tratada com amônia precisar passar através das membranas de nanofiltração. Quando uma enzima é utilizada para a hidrólise da biomassa celulósica, o pH pode ser ajustado para 5 ou inferior durante uma reação de hidrólise. Quando o pH é reduzido para 4 ou inferior em um processo de reciclagem de uma enzima contida em um filtrado, é provável que ocorra a desativação da enzima. Por conseguinte, de preferência, o pH é

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 33/98

21/40 ajustado após a remoção da enzima contida no filtrado.

[057] A temperatura da solução de açúcar tratada com amônia que precisa a passar através da membrana de nanofiltração não é particularmente limitada. A temperatura pode ser adequadamente definida a partir do ponto de vista do aumento do desempenho da remoção do inibidor da fermentação durante a filtração através da utilização da membrana de nanofiltração. Especificamente, quando a membrana de nanofiltração é utilizada para a filtração, de preferência, a temperatura da solução de açúcar tratada com amônia é de 40° C a 80° C. Isto é devido a que o desempenho da remoção do inibidor de fermentação na membrana de nanofiltração é intensificado. Quando a temperatura da solução de açúcar tratada com amônia durante a filtração através da membrana de nanofiltração é de 40° C ou superior, o desempenho de remoção do inibidor de fermentação na solução de açúcar tratada com amônia aumenta. Quando a temperatura da solução de açúcar tratada com amônia é superior a 80° C, a membrana de nanofiltração é desnaturada. Por conseguinte, as propriedades da membrana podem ser perdidas. Consequentemente, quando a temperatura da solução de açúcar tratada com amônia reduz dentro do intervalo mencionado acima, o desempenho de remoção do inibidor da fermentação através da membrana de nanofiltração pode ser aprimorado.

[058] Especificamente, um método utilizando a nanofiltração pode ser realizado de acordo com um método descrito na publicação internacional 15. 2010/067.785.

[059] Quando a solução de açúcar tratada com amônia é submetida à filtração através de membrana de nanofiltração, o inibidor da fermentação pode ser removido mais efetivamente através da adição de água para a solução de açúcar tratada com amônia. Pela quantidade de água a ser adicionado, o teor do inibidor de fermentação contido na solução de açúcar

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 34/98

22/40 purificada após a nanofiltração pode ser ajustado. Especificamente, como a quantidade de água a ser adicionada é maior, o teor do inibidor de fermentação contido na solução de açúcar purificada após a nanofiltração reduz.

[060] A coumaramida e/ou a ferulamida na solução de açúcar tratada com amônia, por conseguinte, são removidas através da purificação, para obter uma solução de açúcar purificada com uma concentração prédeterminada.

[061] Conforme descrito acima, de acordo com o método para a produção de uma solução de açúcar produzida de acordo com esta realização, a coumaramida e/ou a ferulamida na solução de açúcar tratada com amônia que é obtida através da sacarificação enzimática do produto tratado com amônia obtido através do tratamento com a biomassa celulósica com o agente de tratamento que contém amônia são removidas através da purificação. Por conseguinte, uma solução de açúcar purificada que possui uma concentração pré-determinada pode ser obtida. Quando a coumaramida e/ou a ferulamida específica contida na solução de açúcar tratada com amônia como inibidores da fermentação são reduzidos com antecedência antes fermentação da solução de açúcar, a eficiência da fermentação pode ser aprimorada.

[062] Através da fermentação da solução de açúcar purificada resultante utilizada como uma matéria prima de fermentação, o etanol pode ser produzido. Um método para a produção do etanol a partir da solução de açúcar purificada obtida através do método para a produção de uma solução de açúcar, produzida de acordo com esta realização não está particularmente limitado. Os exemplos do método para a produção de etanol podem incluir um processo de fermentação em duas etapas descrito na publicação do pedido de patente japonesa 2009/296.983. No processo de fermentação em duas etapas, uma hexose, tais como a glicose e manose é convertida por levedura ou bactéria em uma etapa de fermentação primária em etanol, e uma pentose, tal

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 35/98

23/40 como a xilose, em seguida, é convertida em uma etapa de fermentação secundária em etanol. Como o fungo utilizado na etapa de fermentação primária, os germes conhecidos podem ser utilizados. Entre os fungos, a levedura Saccharomyces cerevisiae é de preferência. Isso ocorre devido a que a levedura possui resistência elevada ao etanol que possui uma concentração de 5% ou superior para ser produzida. Como os fungos utilizados na etapa de fermentação secundária, uma pentose de assimilação da levedura tal como a Pichia stipitis pode ser utilizada e, em particular, uma cepa que é fornecida com um desempenho resistente ao inibidor de fermentação é de preferência.

[063] Na solução de açúcar purificada obtida através do método para a produção de uma solução de açúcar produzida de acordo com esta realização, a coumaramida e/ou a ferulamida específica contida como os inibidores da fermentação na solução de açúcar tratada com amônia que é obtida através do tratamento biomassa celulósica com o agente de tratamento que contém amônia são removidas. Por conseguinte, quando a solução de açúcar purificada é utilizada como uma matéria prima de fermentação, a fermentação não é inibida. Consequentemente, a utilização da solução de açúcar purificada obtida através do método para a produção de uma solução de açúcar, de acordo com esta realização como uma matéria prima de fermentação pode aprimorar a eficiência da produção do etanol.

Exemplos [064] Daqui em diante, o conteúdo da presente invenção será descrito em detalhes com referência aos Exemplos e Exemplos Comparativos, mas a presente invenção não está limitada aos Exemplos seguintes.

Exemplo 1

Preparação e Análise da Solução de Açúcar Purificada (A) Preparação da Solução de Açúcar Tratada com amônia (1) Tratamento de Trituração da Biomassa Celulósica [065] O erianthus foi utilizado como a biomassa celulósica. O

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 36/98

24/40 erianthus foi triturado com um moinho de corte, enquanto que o tamanho da partícula foi controlado com uma tela que possui uma abertura de 4 mm. Um diâmetro médio das partículas (d50) medido através de um método de difração a laser foi de cerca de 975 pm. O erianthus triturado foi secado a uma temperatura de 40° C, sob uma pressão reduzida ou 5 kPa durante o dia e a noite. O teor de umidade do erianthus seco foi de cerca de 0,5% em massa com base na massa do erianthus seco.

(2) Tratamento da Biomassa Celulósica com amônia [066] A celulose triturada e seca como os pedaços de celulose foi tratada com amônia. Uma autoclave de aço inoxidável equipada com um impulsor que possui uma capacidade de cerca de 5 L foi carregada com 200 g de pedaços de celulose. Posteriormente, a introdução do gás de nitrogênio pressurizado na autoclave e a despressurização foram repetidas para remover o ar da autoclave e substituir o ar pelo gás de nitrogênio. A autoclave, em seguida, foi aquecida a 120° C. Após o aquecimento, a autoclave foi despressurizada, e o gás de nitrogênio foram evacuados sob pressão reduzida. Por outro lado, amônia pressurizada foi introduzida um outro recipiente de pressão, e aquecida a uma temperatura um pouco mais elevada que 120° C. Em seguida, uma válvula fornecida em uma tubulação de ligação do autoclave e do vaso de pressão foi aberta para introduzir amônia na autoclave, de maneira que a pressão a uma temperatura de 120° C foi de 1,2 MPa. Os pedaços de celulose tratados com amônia sob as condições de temperatura e de pressão durante 2,5 horas com a agitação. Posteriormente, a autoclave foi despressurizada e amônia foi evacuada. Além disso, o gás de nitrogênio precisou passar através da autoclave para remover amônia residual nas partículas dos pedaços de celulose. Por conseguinte, a biomassa pré-tratada foi obtida. Essa biomassa foi utilizada como a celulose tratada com amônia (produto tratado com amônia).

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 37/98

25/40 (3) Hidrólise da Celulose Tratada com amônia [067] 7,6 kg de água foram adicionados a 0,4 kg de celulose tratada com amônia de maneira que a concentração da celulose tratada com amônia foi de 5%. Ao resultante, uma pequena quantidade de ácido sulfúrico concentrado ou de hidróxido de sódio aquoso foi adicionado para ajustar o pH a 5. Posteriormente, uma preparação de celulase derivado de Trichoderma reesei (Accellerase Duet, disponível de Genencor, Inc.) foi adicionada em uma quantidade de 1/100 da quantidade de celulose tratada com amônia seca em termos da quantidade de proteína da enzima. A reação de sacarificação foi realizada a 50° C durante 24 horas. A substância obtida através da reação de sacarificação foi utilizada como um hidrolisado.

(4) SEPARAÇÃO SÓLIDO-LÍQUIDO do Hidrolisado [068] O hidrolisado resultante foi centrifugado e separado em um componente de solução, assim como uma celulose e lignina não decompostas. O componente da solução foi submetido à filtração através de uma membrana de microfiltração que possui um diâmetro de microporo de 0,45 pm (Stericup, disponível de Millipore Corporation) para remover as partículas insolúveis de escala mícron. O componente da solução obtido através do método descrito acima foi utilizado como uma solução de açúcar tratada com amônia.

(B) Preparação da Solução de Açúcar Purificada (5) Condensação do Açúcar através da Membrana de Nanofiltração [069] A solução de açúcar tratada com amônia resultante foi submetida à filtração através de uma membrana de nanofiltração (UTC-60, disponível de Toray Industries, LLC.) em temperatura normal e uma pressão de operação de 4 MPa. A solução concentrada obtida através da filtração foi utilizada como uma solução de açúcar purificada. Como o dispositivo da separação de membrana, foi utilizada uma unidade de membrana plana (SEPA CF II, disponível de GE Osmonics, área eficaz de membrana: 140 cm²).

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 38/98

26/40 (C) Análise da Solução de Açúcar Tratada com amônia [070] Os sacarídeos, ácidos orgânicos, e um composto aromático na solução de açúcar tratada com amônia obtida em “(4) Separação Sólidolíquido do Hidrolisado” foram analisados. Cada condição da análise dos sacarídeos, ácido orgânico, e composto aromático na solução de açúcar tratada com amônia é mostrada abaixo.

Condição da Análise de HPLC (1) Condição da Análise de Sacarídeos [071] As concentrações de glicose e xilose na solução de açúcar tratada com amônia foram determinados sob condições da cromatografia líquida de desempenho elevado (HPLC) mostradas abaixo através da comparação com uma amostra padrão.

Aparelho: Sistema Acquity UPLC (fabricado pela Waters)

Coluna: Coluna de 2,1 x 100 mm de 1,7 pm de amida Acquity UPLC BEH (fabricada por Waters)

Fase móvel: líquido (A); 80% de acetonitrila + 0,2% de TEA, líquido (B); 30% de acetonitrila + 0,2% de TEA

Taxa de fluxo: 0,3 mL/min

Temperatura: 55° C (2) Condição da Análise dos ácidos Orgânicos [072] A concentração do ácido acético na solução de açúcar tratada com amônia foi determinada em condições de HPLC mostradas abaixo através da comparação com a amostra padrão

Aparelho: Cromatógrafo Líquido de Desempenho Elevado Hitachi elite LaChrom (fabricado pela Hitachi)

Coluna; GL-C610H-S (fabricada pela Hitachi)

Fase móvel: 3 mM de ácido perclórico

Líquido de reação: solução de bromotimol azul

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 39/98

27/40

Método de detecção: detector UV-VIS

Taxa de fluxo da fase móvel: 0,5 mL/min, líquido de reação: 0,6 mL/min

Temperatura: 60° C (3) Condição da Análise do Composto Aromático [073] As concentrações do ácido cumárico, coumaramida, e ferulamida na solução de açúcar tratada com amônia foram determinadas em condições de HPLC mostradas abaixo através da comparação com a amostra padrão. Neste momento, foi obtido o espectro da absorção de UV (medição do comprimento de onda: 200 nm para 400 nm) de cada detecção dos picos.

Aparelho: Cromatógrafo Líquido de Desempenho Elevado

Hitachi elite LaChrom (fabricado pela Hitachi)

Coluna: 2,5 pm de Hydro-RP 100A Synergi (fabricada pela Phenomenex)

Método de detecção: Detector de Matriz Diode

Taxa de fluxo: 0,6 mL/min Temperatura: 40° C [074] Os sacarídeos na solução de açúcar tratada com amônia foram analisados nas condições de HPLC descritas em “(1) Condição da Análise dos Sacarídeos”. Conforme confirmado a partir do resultado, a glicose e a xilose são contidas como os componentes principais de sacarídeos. O ácido orgânico na solução de açúcar tratada com amônia foi analisado nas condições de HPLC descritas em “(2) Condição da Análise do Ácido Orgânico”. Conforme observado a partir do resultado, o ácido acético foi contido como um componente de ácido orgânico principal. O composto aromático na solução de açúcar tratada com amônia foi analisado nas condições de HPLC descritas em “(3) Condição da Análise do Composto Aromático”. O resultado é mostrado na Figura 2. Conforme observado na Figura 2, três picos principais (vide Picos 1,

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 40/98

28/40

2, e 3) foram detectados a partir da solução de açúcar tratada com amônia.

[075] Entre estes, descobriu-se que o pico 3 é um pico do ácido cumárico uma vez que os tempos de eluição de HPLC do pico 3 e a amostra padrão do ácido cumárico coincidiu com cada outro. Os tempos de eluição dos dois compostos restantes (picos 1 e 2) não coincidiram com aqueles de todas as amostras padrão de HMF, furfural, vanilina, acetovanilona, ácido ferúlico, aldeído de coniferila e guaiacol, que são conhecidos como um composto aromático contido em uma solução de açúcar derivada a partir da biomassa celulósica. Os dois picos (picos 1 e 2) foram isolados por HPLC, e os seus pesos moleculares foram analisados por LC / MS (LCMS-IT-TOF e LC20A, fabricados por Shimadzu Corp).

[076] Conforme mostrado a partir dos resultados, os pesos moleculares dos picos 1 e 2 foram 163,063 e 193,074, respectivamente. Presume-se que o ácido cumárico e o ácido ferúlico são submetidos a uma reação de condensação com as moléculas de amônia, para a produção de coumaramida e ferulamida, respectivamente. Os pesos moleculares calculados a partir das fórmulas estruturais de coumaramida ou ferulamida foram de 163,172 e 193,198, respectivamente, e correspondem aos pesos moleculares obtidos por LC / MS, respectivamente. Por conseguinte, estima-se que os dois picos restante (picos 1 e 2) na solução de açúcar de celulose tratada com amônia são a coumaramida e a ferulamida.

[077] As amostras padrão de coumaramida e ferulamida foram preparadas através da síntese de costume (contratante: VSN, Inc. synthesis laboratory), e os tempos de eluição de HPLC das amostras padrão sintetizados foram medidos. Como resultado, os tempos de eluição (3,74 min), do pico 1 na solução de açúcar tratada com amônia e a amostra padrão de coumaramida em uma solução mista de amostras padrão completamente coincidiram entre si, e os tempos de eluição (25,5 min) do pico 2 na solução de açúcar tratada

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 41/98

29/40 com amônia e a amostra padrão da ferulamida em uma solução mista das amostras padrão completamente coincidiram entre si (vide, Figura 2).

[078] As Figuras 3 a 6 mostram cada espectro de absorção UV dos picos 1 e 2 na solução de açúcar tratada com amônia, a amostra padrão de coumaramida, e a amostra padrão de ferulamida, que foram obtidas através de HPLC. No presente, a medição de comprimento de onda é de 200 nm a 400 nm. Conforme mostrado nas Figuras 3 e 5, o espectro de absorção de UV do pico 1 na solução de açúcar tratada com amônia e a amostra padrão de coumaramida coincidiram entre si. Conforme mostrado nas Figuras 4 e 6, os espectros de absorção de UV do pico 2 na solução de açúcar tratada com amônia e a amostra padrão de ferulamida coincidiram entre si.

[079] Conforme pode ser observado a partir dos resultados da análise, os picos 1 e 2 na solução de açúcar tratada com amônia que é um hidrolisado da celulose tratada com amônia são a coumaramida e a ferulamida, respectivamente, e a solução de açúcar tratada com amônia continha uma grande quantidade de compostos.

(D) Análise da Solução de Açúcar Purificada [080] A Tabela 1 mostra a concentração de cada componente na solução da matéria prima (solução de açúcar tratada com amônia) antes da filtração, a solução de açúcar concentrada (solução de açúcar purificada) após a filtração, e uma solução de permeação. A análise dos componentes foi realizada de acordo com as condições de análise de HPLC descritas em “(C) Análise da Solução de Açúcar Tratada com amônia”.

Tabela 1

	Glicose (g/L)	Xilose (g/L)	Ácido acético (g/L)	Ácido coumárico (g/L)	Coumara mida (g/L)	Ferulamida (g/L)
Solução de matéria prima	17,0	11,0	0,157	0,037	0,491	0,189

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 42/98

30/40

	Glicose (g/L)	Xilose (g/L)	Ácido acético (g/L)	Ácido coumárico (g/L)	Coumara mida (g/L)	Ferulamida (g/L)
Solução de açúcar concentrada	99,6	53,9	0,151	0,079	0,622	0,454
Solução de permeação	1,16	1,4	0,169	0,030	0,317	0,064

[081] Conforme é evidente a partir da Tabela 1, quando a solução de açúcar tratada com amônia foi submetida à filtração através das membranas de nanofiltração, os componentes de sacarídeos, isto é, a glicose e a xilose, na solução de açúcar concentrada foram concentradas 5,9 vezes e 4,9 vezes, respectivamente. Por outro lado, os componentes diferentes do sacarídeo (ácido acético, ácido cumárico, coumaramida, e ferulamida) foram concentrados cerca de 1 a cerca de 2,4 vezes. Quando a solução de açúcar tratada com amônia foi submetida à filtração através da membrana de nanofiltração, a maior parte dos componentes de sacarídeos na solução de matéria prima e a maior parte dos componentes diferentes de sacarídeos poderiam ser efetivamente separadas em um lado de não permeação e um lado de permeação, respectivamente.

Exemplo Comparativo 1

Consideração do Caso em que o Sacarídeo é Concentrado a partir da Solução de Açúcar Tratada com amônia Utilizando a Membranas de Osmose [082] A filtração foi realizada da mesma maneira que em “(5) Condensação de Sacarídeo através da Membrana de Nanofiltração” do Exemplo 1, exceto que uma membrana de osmose reversa (UTC-80, disponível de Toray Industries, Inc.) foi utilizada como uma membrana de separação e a pressão de operação foi de 5 MPa. A Tabela 2 mostra a concentração de cada

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 43/98

31/40 componente da solução de matéria prima (solução de açúcar tratada com amônia) antes da filtração, a solução de açúcar concentrada (solução de açúcar purificada) após a filtração, e uma solução de permeação. Observe que os componentes foram analisados por HPLC, da mesma maneira conforme descrito acima.

Tabela 2

	Glicose (g/L)	Xilose (g/L)	Ácido acético (g/L)	Ácido coumárico (g/L)	Coumarami da (g/L)	Ferulamida (g/L)
Solução da matéria prima	17,0	11,0	0,157	0,037	0,491	0,189
Solução de açúcar concentrada	102,9	59,5	0,743	0,160	2,050	2,053
Solução de permeação	0,2	0,1	0	0	0	0

[083] Conforme é evidente a partir da Tabela 2, os componentes de monossacarídeos, incluindo a glicose e a xilose e outros componentes raramente foram contidos na solução de permeação Está confirmado que, quando a membrana de osmose reversa utilizada como uma membrana de separação, os componentes de sacarídeos e a coumaramida e a ferulamida na solução de açúcar tratada com amônia não podem ser separados.

Exemplo 2

Teste de Crescimento Utilizando a Solução Modelo que Contém a Coumaramida, Ácido Cumárico e a Ferulamida [084] Na cultura principal do “(A) Teste de Crescimento de Pichia stipitis Utilizando a Solução de Açúcar Modelo“ descrito abaixo, qualquer um de coumaramida, ácido cumárico, e ferulamida foi adicionado em uma concentração de 2 ppm a 200 ppm, como um aditivo em um meio, e o meio foi submetido a um teste de crescimento. Como um controle positivo, um meio

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 44/98

32/40

YPDX livre de um aditivo foi submetido ao mesmo teste.

(A) Teste de Crescimento de Pichia Stipitis Utilizando a Solução de Açúcar Modelo [085] Uma cepa Pichia stipitis NBRC1687 foi estaticamente cultivada a 25° C em um meio de agar YPDX produzido através da adição de 2% de ágar para um meio YPDX mostrado na Tabela 3 abaixo (pré-précultura). Uma das colônias formada no meio agar foi inoculada em 10 mL de meio YPDX com um circuito de platina, e cultivada a 25° C e 120 spm em um tubo de teste com um volume de 20 mL durante 48 horas, sob agitação (précultura). Um (1) mL de meio após a pré-cultura foi adicionado a 9 mL de meio YPDX, e a cultura ainda foi continuada a 25° C e 60 spm em um tubo de teste com um volume de 20 mL (cultura principal). 0, 24, e 48 horas após o início da cultura, a amostragem foi realizada, a concentração de monossacarídeos e a absorbância (OD 660) foram medidas. Por conseguinte, o crescimento dos corpos dos fungos foi observado.

Tabela 3

Composição	Concentração da composição (g/L)
Glicose	10
Xilose	10
Polipeptona	20
Extrato de levedura	10

[086] A Tabela 4 mostra os resultados da análise das concentrações da glicose e da xilose no meio durante a amostragem, neste Exemplo.

Tabela 4

Glicose	PC	Coumaramida (ppm)	Ácido coumárico (ppm)	Ferulamida (ppm)
0	2	20	200	2	20	200	2	20	200
0 h	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 45/98

33/40

Glicose	PC	Coumaramida (ppm)	Ácido coumárico (ppm)	Ferulamida (ppm)
0	2	20	200	2	20	200	2	20	200
24 h	2,4	2,3	4,82	5,9	2,6	2,6	3,6	2,3	6,6	6,7
48 h	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Xilose	PC	Coumaramida (ppm)	Ácido coumárico (ppm)	Ferulamida (ppm)
0	2	20	200	2	20	200	2	20	200
0 h	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
24 h	2,4	2,3	9,7	9,5	2,6	8,7	9,2	2,3	9,3	9,7
48 h	0	0	0	0,4	0	0	0	0	0	5,2

[087] Conforme é evidente a partir da Tabela 4, quando as concentrações do aditivo foram de 20 ppm ou superior, o consumo de xilose foi retardado em todos os aditivos em comparação com o controle positivo, e ocorreu a inibição do crescimento. Por outro lado, quando as concentrações dos aditivos foram de 2 ppm, a inibição do crescimento não foi observada em todos os aditivos. A coumaramida e a ferulamida foram superiores ao ácido cumárico no inibidor do crescimento, descobriu-se que essa tendência foi particularmente notável em uma taxa de consumo de glicose. Especificamente, descobriu-se que a coumaramida e a ferulamida eram inibidores da fermentação na cultura de Pichia stipitis.

Exemplo 3 Teste de Crescimento da Solução de Açúcar Concentrado através da Membrana de Nanofiltração [088] Uma solução de açúcar concentrada da solução de açúcar tratada com amônia através da membrana de nanofiltração (daqui em diante referida como solução 1 de NF concentrada) foi ajustada para o método descrito em “(5) Condensação de Sacarídeo através da Membrana de Nanofiltração” no Exemplo 1. Na solução 1 de NF concentrada, a água foi misturada em uma mesma a quantidade da solução 1 de NF concentrada, e a filtração através da membrana de nanofiltração foi novamente realizada sob as

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 46/98

34/40 condições descritas em “(5) Condensação de Sacarídeo através da Membrana de Nanofiltração” do Exemplo 1, para obter uma solução 2 de NF concentrada. Para a solução 2 de NF concentrada, a água foi adicionada em uma mesma quantidade como a quantidade da solução 2 de NF concentrada, e a filtração através de membrana de nanofiltração foi novamente realizada sob as condições descritas em “(5) Condensação de Sacarídeo através da Membrana de Nanofiltração” no Exemplo 1 para obter uma solução 3 de NF concentrada. A Tabela 5 mostra a concentração de cada componente das soluções de 1 a 3 de NF concentrada e a solução de açúcar concentrada obtida através de uma membrana de osmose reversa (daqui em diante solução de RO concentrada) através do método descrito no Exemplo Comparativo 1.

[089] Um teste de crescimento foi realizado utilizando cada solução de açúcar através de um método descrito em “(B) Teste do Crescimento de Pichia Stipitis Utilizando a Solução Concentrada da Solução de Açúcar Tratada com amônia“ descrita abaixo. Os resultados do teste são mostrados na Tabela 5. Nos resultados no teste de crescimento, os casos em que a absorbância (OD 660) 48 horas após o início da cultura é de 50% a 100%, 10% e 50%, e inferior a 10%, em relação ao controle positivo são representados por + +, +, e -, respectivamente. A absorbância (DO 660) do controle positivo, após 48 horas, foi de cerca de 15.

(B) Teste do Crescimento de Pichia Stipitis Utilizando a Solução Concentrada da Solução de Açúcar Tratada com amônia [090] Em um teste do crescimento utilizando a solução concentrada da solução de açúcar tratada com amônia, a cultura foi realizada da mesma maneira como em “(A) Teste de Crescimento de Pichia Stipitis Utilizando a Solução de Açúcar Modelo“, exceto que um meio em que a polipeptona e um extrato de levedura foram adicionados à solução concentrada da solução de açúcar tratada com amônia de maneira que as suas

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 47/98

35/40 concentrações foram as mesmas que aquelas no meio YPDX descritas na Tabela 3, foi utilizada como o meio de uma cultura principal. O controle positivo foi cultivado da mesma maneira que no “(A) Teste de Crescimento de Pichia Stipitis Utilizando a Solução de Açúcar Modelo“.

Tabela 5

	Glicose (g/L)	Xilose (g/L)	Ácido coumarico (g/L)	Coumaramida (g/L)	Ferulamida (g/L)	(a) + (b) (ppm)	Crescimen to do microrgani smo
Solução 1 de NF concentra da	99,6	53,9	0,079	0,622	0,454	1.076	+
Solução 2 de NF concentra da	98,3	51,5	0,053	0,436	0,345	781	+
Solução 3 de NF concentra da	97,7	50,2	0,032	0,213	0,217	430	++
Solução de RO concentra da (Exemplo Comparati vo)	102,9	59,5	0,160	2,050	0,809	2859	-

[091] Conforme é evidente a partir da Tabela 5, em cada tempo quando a adição de água à solução de NF concentrada e a nanofiltração foram repetidas, as concentrações do ácido cumárico, coumaramida, e ferulamida reduziram. Por outro lado, quando a filtração através da membrana de osmose reversa foi realizada, essas substâncias foram acentuadamente concentradas. A partir dos resultados do teste de crescimento, quando a concentração total de coumaramida e de ferulamida na solução de açúcar é de 1.100 ppm ou

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 48/98

36/40 inferior, o crescimento é possível. A partir dos resultados, foi confirmado que a remoção de coumaramida e a ferulamida requer tratamento com membrana de nano filtração, mas não com membrana de osmose reversa. Conforme pode ser observado a partir dos resultados e Exemplo 2, quando a purificação foi realizada na nanofiltração de maneira que a concentração total de coumaramida e ferulamida foi de 1.100 ppm ou inferior, foi possível o crescimento eficaz de um microrganismo.

Exemplo 4

Teste da Produção de Etanol Utilizando a Solução de Açúcar Tratada COM AMÔNIA [092] O etanol foi produzido utilizando a solução de açúcar concentrada (solução de NF concentrada) obtida a partir da solução de açúcar tratada com amônia através da membrana de nanofiltração e da solução de açúcar concentrada (solução de RO concentrada), obtida utilizando a membrana de osmose reversa, através do método descrito no Exemplo Comparativo 1, de acordo com “(C) Teste da Produção de Etanol de Pichia Stipitis Utilizando a Solução de Açúcar Tratada com amônia“, descrito abaixo. As suas propriedades de fermentação em comparação entre si.

(C) Teste da Produção de Etanol de Pichia Stipitis Utilizando a Solução de Açúcar Tratada com amônia [093] O teste de produção de etanol a partir da solução de açúcar tratada com amônia foi realizado de acordo com um processo de fermentação em duas etapas descrito na publicação do pedido de patente japonesa 2009/296983. A Saccharomyces cerevisiae foi cultivada utilizando uma solução concentrada da solução de açúcar tratada com amônia para converter a glicose em etanol como a fermentação primária. Neste caso, foi confirmado que mesmo quando alguma solução de NF concentrada e a

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 49/98

37/40 solução de RO concentrada foram utilizadas, a fermentação não foi inibida.

[094] Posteriormente, a Pichia stipitis foi cultivada utilizando uma solução de fermentação primária em que a concentração de etanol foi ajustada a 10 g/L com um evaporador rotativo para converter a xilose na solução de fermentação primária em etanol na solução de fermentação secundária. Na fermentação secundária, a relação entre o tempo de fermentação e a concentração de etanol da solução de fermentação primária derivada da solução de NF concentrada e a solução de fermentação primária derivada da solução de RO concentrada é mostrada na Figura 7, e o relação entre o tempo de fermentação e a concentração de xilose da solução de fermentação primária derivada da solução de NF concentrada e a solução de fermentação primária derivada da solução de RO concentrada é mostrada na Figura 8. Conforme mostrado nas Figuras 7 e 8, a produção de etanol através da solução de fermentação primária derivada da solução de RO concentrada foi amplamente inibida na fermentação secundária por Pichia stipitis. A taxa de consumo da xilose, a taxa de produção de etanol, e a concentração de produção final de etanol reduziu em comparação com a produção do etanol através da solução de fermentação primária derivada da solução de NF concentrada. Por conseguinte, era evidente que um inibidor da fermentação alcoólica foi acentuadamente concentrado através da concentração por meio da membrana de osmose reversa em comparação com a concentração através da membrana de nanofiltração.

Exemplo 5 Verificação da Inibição da Produção de Etanol através da Solução de Permeação após a Filtração da Membrana [095] O etanol foi produzido utilizando um filtrado (solução de permeação) obtido durante a produção da solução de NF concentrada e uma solução de RO concentrada. As soluções de permeação derivadas a partir da

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 50/98

38/40 solução de NF concentrada e a solução de RO concentrada são referidas como solução de NF de permeação e uma solução de RO de permeação, respectivamente. Cada solução de permeação foi concentrado 3 vezes com um evaporador rotativo. Um extrato de levedura, a polipeptona e a xilose foram adicionados à solução de permeação concentrada de maneira que as concentrações finais foram de 0,5%, 1,0% e 7,0%, respectivamente. Para o meio líquido preparado, a Pichia stipitis foi adicionada, para a produção de etanol. Como um controle, um meio líquido em que um extrato de levedura, a polipeptona, e a xilose foram adicionados à água de maneira que a composição que foi a mesma, conforme descrita acima, foi utilizada, e a verificação foi realizada.

[096] A Figura 9 mostra a relação entre o tempo de fermentação e a concentração de etanol da solução de NF concentrada e a solução de RO concentrada. A Figura 10 mostra a relação entre o tempo de fermentação e a concentração de xilose da solução de NF concentrada e a solução de RO concentrada. Conforme mostrado nas Figuras 9 e 10, o consumo de xilose e a produção de etanol foram os mesmos que aqueles no controle que foram realizados em um meio que contém a solução de RO de permeação. Em um meio que contém a solução de NF de permeação, a taxa de consumo de xilose reduziu para cerca de 75% que aquela do controle, e a taxa de produção do etanol reduziu para cerca de 60%. Conforme é evidente a partir dos resultados, um inibidor de produção de etanol permeou na membrana de nanofiltração em um tratamento da concentração da solução de açúcar tratada com amônia através da membrana de nanofiltração e foi acumulado no filtrado. Por conseguinte, o inibidor de produção de etanol pode ser removido através do tratamento da concentração por meio da membrana de nanofiltração.

Exemplo 6

Concentração da Celulose Tratada com amônia durante a Sacarificação [097] A água foi adicionada a 0,4 kg da celulose tratada com

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 51/98

39/40 amônia descrita em “(2) Tratamento da Biomassa Celulósica com amônia do Exemplo 1 de acordo com a quantidade a ser adicionada durante a preparação descrita na Tabela 6 para ajustar a concentração de celulose tratada com amônia para 5, 10, 15, e 20%. Ao resultante, uma pequena quantidade de ácido sulfúrico concentrado foi adicionada para ajustar o pH a 5, e uma preparação de celulase (Accellerase Duet, disponível de Genencor), em seguida, foi adicionada em uma quantidade de 1/100 da quantidade de celulose tratada com amônia secado em termos da quantidade de proteína enzimática. Uma reação da sacarificação enzimática foi efetuada a 50° C durante 24 horas. O hidrolisado resultante foi centrifugado e separado em um componente da solução, assim como uma celulose ou lignina não decomposta. O componente da solução foi submetido à filtração através uma membrana de microfiltragem que possui um diâmetro de microporos de 0,45 pm (Stericup, disponível de Millipore Corporation) para remover as partículas insolúveis da escala mícron. O componente da solução obtido através do método foi submetido a um tratamento da membrana de nanofiltração de acordo com a “(5) Condensação de Sacarídeo através da Membrana de Nanofiltração” do Exemplo 1, para obter uma solução de NF concentrada. A relação de concentração foi ajustada de maneira que a concentração de glicose na solução concentrada foi de cerca de 10%. Cada componente da concentração na solução concentrada é mostrado na Tabela 7.

Tabela 6

Concentração de celulose tratada com amônia (% em massa) durante a sacarificação enzimática	Quantidade de água adicionada durante a preparação (kg)
5	7,6
10	3,6
15	2,6
20	1,6

Petição 870190072385, de 29/07/2019, pág. 52/98

40/40

Tabela 7

Concentração da celulose tratada com amônia (% em massa) durante a sacarificação enzimática	Concentração na solução de NF concentrada (g/L)
Glicose	Xilose	Coumaramida (a)	Ferulamida (b)	(a) + (b) (ppm)
5	99,6	53,9	0,62	0,45	1.070
10	101,2	53,4	0,61	0,47	1.080
15	100,4	52,2	0,72	0,53	1.250
20	102,3	52,8	0,80	0,59	1.390

[098] Conforme é evidente a partir da Tabela 7, quando a concentração da celulose tratada com amônia durante a sacarificação enzimática foi de 5% e 10%, a concentração total de coumaramida e ferulamida na solução de NF concentrada foi de 1.100 ppm ou inferior. Quando a concentração da celulose tratada com amônia durante a sacarificação enzimática foi de 15% e 20%, as concentrações totais de coumaramida e de ferulamida aumentou acentuadamente, e foram de 1.250 ppm e 1.390 ppm, respectivamente. Conforme pode ser observado a partir dos resultados e Exemplo 5, quando a concentração total de coumaramida e de ferulamida na solução de açúcar é de 1.100 ppm ou inferior, um microrganismo é viável, e o etanol pode ser eficientemente produzido através do microrganismo. Por conseguinte, de preferência, a concentração da celulose tratada com amônia durante a sacarificação enzimática é de 10% ou inferior.

Claims

1. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA SOLUÇÃO DE AÇÚCAR, caracterizado por compreender:

uma etapa de pré-tratamento (S11) da biomassa celulósica tratada com um agente de tratamento que contém amônia para obter um produto tratado com amônia;

uma etapa de preparação da solução de açúcar tratada com amônia (S12) para enzimaticamente sacarificar o produto tratado com amônia para obter uma solução de açúcar tratada com amônia; e uma etapa de preparação da solução de açúcar purificada (S13) removendo a coumaramida e/ou a ferulamida da solução de açúcar tratada com amônia por purificação para obter uma solução de açúcar purificada que possui uma concentração de coumaramida e/ou de ferulamida de 10 a 1100 ppm.

2. MÉTODO, de acordo com reivindicação 1, caracterizado pela biomassa celulósica conter biomassa herbácea.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por, em um tratamento de purificação da solução de açúcar tratada com amônia, ser utilizada uma membrana de nanofiltração.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo produto tratado com amônia ser enzimaticamente sacarificado com uma solução que possui uma concentração de um material sólido do produto tratado com amônia dentro de um intervalo de 1 a 10% em massa durante a sacarificação enzimática do produto tratado com amônia.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por compreender adicionalmente usar a solução de açúcar obtida como uma matéria-prima de fermentação para a produção de etanol.