BR112014009785B1

BR112014009785B1 - método cosmético para tratar ou reduzir panniculopatia fibrosclerótica edematória (pef)

Info

Publication number: BR112014009785B1
Application number: BR112014009785-2A
Authority: BR
Inventors: Susan G. Emeigh Hart
Original assignee: Auxilium International Holdings, Inc.
Priority date: 2011-10-21
Filing date: 2012-10-19
Publication date: 2020-06-30
Also published as: PT3581199T; MX2019007779A; NZ624057A; EP2768523A4; PL3581199T3; PT2768523T; AU2022202987A1; JP2014530873A; CA2852942C; AU2020200763B2; DK3581199T3; US20140335072A1; EP2768523A1; JP2018027968A; FI3581199T3; HUE044650T2; JP2020158521A; CA2852942A1; NZ737403A; WO2013059619A1

Abstract

COLAGENASE PARA USO EM UM MÉTODO PARA TRATAR OU REDUZIR EFP A presente invenção é dirigida a um método para tratar ou reduzir PFE em um paciente que compreende administrar uma ou múltiplas injeções de baixa dose de colagenase a uma área afetada por PFE. A invenção abrange métodos em que a dose de colagenase por injeção está entre cerca de 50 a cerca de 200 unidades ABC e/ou em que a concentração de colagenase está entre cerca de 50 a cerca de 2000 unidades ABC/mililitro (ml).

Description

MÉTODO COSMÉTICO PARA TRATAR OU REDUZIR PANNICULOPATIA FIBROSCLERÓTICA EDEMATÓRIA (PEF)

PEDIDO RELACIONADO

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US 61/549.863, depositado em 21 de outubro de 2011. A totalidade do conteúdo do pedido acima mencionado é aqui incorporada por referência.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] A panniculopatia fibrosclerótica edematosa (EFP), mais comumente denominada como celulite, é uma condição que se apresenta como uma alteração topográfica na aparência da pele e afeta cerca de 90% das mulheres pós-púberes (Rawlings (2006), Int J Cosmetic Sci 2006; 28: 175-90; Khan et al. (2010), J Am Acad Dermatol 2010, 62: 361-70). EFP aparece como pele com ondas e confere à pele o que é comumente descrito como um aspecto de casca de laranja. Os septos dérmicos, compostos de colagenase, acredita-se desempenharem um papel causal nas ondulações na pele.

[003] Colagenase, uma enzima que tem a capacidade específica para digerir o colágeno, foi utilizada para tratar uma variedade de doenças mediadas por colágeno, incluindo, por exemplo, contratura de Dupuytren, doença de Peyronie, lipoma e capsulite adesiva. A Patente US 4.645.668 e Publicação de Pedido de Patente US 20070224184 também divulgam certos usos da colagenase. Uma das principais fontes de colagenase é a partir da fermentação da bactéria Clostridium histolyticum. Uma formulação injetável contendo colagenase I e II colagenase de C. histolyticum é vendida sob o nome comercial XIAFLEX® e é aprovada pelo U.S. Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento da contratura de Dupuytren.

[004] A presente invenção é dirigida a um método para tratar ou reduzir EFP que compreende uma ou uma pluralidade de injeções de colagenase a uma área afetada por EFP.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] A presente invenção baseia-se na descoberta de que uma ou mais injeções de doses baixas de colagenase a uma área afetada por EFP são eficazes para reduzir ou tratar dita EFP. A quantidade de colagenase em uma única injeção pode ser tão baixa quanto 5 unidades ABC ou 0,00029 mg (0,29 pg). A dose total de colagenase administrada depende do tamanho da área de tratamento, e é, portanto, entre cerca de 5 e cerca de 5000 unidades ABC. A concentração de colagenase está entre cerca de 50 e cerca de 2000 unidades ABC/mililitro (ml). 10.000 unidades ABC são equivalentes a 0,58 mg de colagenase.

[006] Em uma modalidade, a invenção é dirigida a um método para tratar ou reduzir EFP em um paciente, que compreende administrar ao dito paciente uma ou uma pluralidade de injeções subdérmicas de colagenase a uma área afetada por EFP, em que a dose de colagenase por injeção está entre cerca 5 e cerca de 200 unidades ABC, e em que a pluralidade de injeções subdérmicas é administrada a uma pluralidade de sítios de injeção. Em certos aspectos, uma pluralidade de injeções subdérmicas é administrada a uma pluralidade de sítios de injeção. Em modalidades adicionais, a concentração de colagenase administrada está entre cerca de 50 e cerca de 2000 unidades ABC por mililitro. Em certas modalidades adicionais, cada injeção de colagenase é administrada em um volume de cerca de 0,5 ml ou menos. Em um aspecto adicional, a dose total de colagenase administrada está entre cerca de 5 e cerca de 2000 unidades ABC.

[007] Em outra modalidade, a invenção é dirigida a um método para tratar ou reduzir EFP em um paciente, que compreende administrar ao dito paciente uma ou uma pluralidade de injeções subdérmicas de colagenase dentro de uma área afetada por EFP, em que a dose total de colagenase administrada à afetada área está entre cerca de 5 e cerca de 5000 unidades ABC, e em que a pluralidade de injeções é administrada em uma pluralidade de sítios de injeção. Em certos aspectos, cada injeção está entre cerca de 5 e cerca de 200 unidades ABC. Em algumas modalidades, a concentração de colagenase administrada está entre cerca de 50 e cerca de 2000 unidades ABC por mililitro e/ou cada injeção de colagenase é administrada em um volume de cerca de 0,5 ml ou menos.

[008] Ainda em outra modalidade, a invenção é um método para tratar ou reduzir EFP em um paciente, que compreende administrar ao dito paciente uma ou uma pluralidade de injeções subdérmicas de colagenase a uma área afetada por EFP, em que a dose de colagenase administrada por injeção para a área afetada está entre cerca de 5 e cerca de 200 unidades ABC e em que a concentração de colagenase administrada a área afetada está entre cerca de 50 e cerca de 2000 unidades ABC por mililitro.

[009] Em outro aspecto, a invenção é dirigida a um método para tratar ou reduzir EFP em um paciente que compreende administrar uma ou de uma pluralidade de injeções subdérmicas de colagenase a uma área afetada por EFP em que a concentração de colagenase administrada a área afetada está entre cerca 50 e cerca de 2000 unidades ABC por mililitro, e em que o volume de cada injeção de colagenase é de cerca de 0,5 ml ou menos.

[010] Em algumas modalidades, a dose de colagenase administrada por injeção está entre cerca de 5 e cerca de 100 unidades ABC. Em modalidades adicionais, a dose de colagenase administrada por injeção está entre cerca de 5 e cerca de 50 unidades ABC.

[011] A colagenase pode ser derivada a partir de uma fonte bacteriana ou podem ser uma forma recombinante da colagenase. Em algumas modalidades, a colagenase é purificada a partir de Clostridium histolyticum. Em uma modalidade adicional, o colagenase compreende colagenase I e colagenase II. Ainda em outras modalidades, a colagenase é colagenase I e colagenase II purificada a partir de Clostridium histolyticum e compreende colagenase I e colagenase II.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[012] O que precede e outros objetos, características e vantagens da invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição mais particular das modalidades preferenciais da invenção, como ilustrado nos desenhos anexos, nos quais caracteres de referência iguais se referem às mesmas partes ao longo das diferentes vistas. Os desenhos não estão necessariamente em escala, em vez disso, a ênfase está colocada para ilustrar os princípios da invenção.

[013] A FIG. 1 é uma descrição do modelo de injeção, onde cada ponto dentro de um octógono representa um sítio de injeção. O X dentro do círculo representa o sítio de injeção com a “ondulação central.” Os quatro cantos são rotulados como superior direito (UR), inferior direito (LR), superior esquerdo (UL), e inferior esquerdo (LL).

[014] A FIG. 2 é uma descrição da nádega e coxa posterior com marcações dos cantos modelo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[015] Uma descrição das modalidades preferenciais da invenção se segue.

[016] Como discutido acima, a presente invenção baseia-se na descoberta de que as injeções de dose baixa de colagenase a uma área afetada por EFP são eficazes para a lise de colágeno e, portanto, reduzir ou tratar EFP. A quantidade de colagenase em uma única injeção pode ser tão baixa quanto 5 unidades ABC ou 0,00029 mg. A dose total de colagenase administrada depende do tamanho da área de tratamento e, portanto, está entre cerca de 5 e cerca de 5000 unidades ABC e/ou em que a concentração de colagenase está entre cerca de 50 e cerca de 2000 unidades ABC/mililitro (ml). As doses e concentrações de colagenase empregadas de acordo com o método da presente invenção são substancialmente mais baixas do que as doses e concentrações de colagenase atualmente usadas e aprovadas pelo U.S. FDA para tratar contratura de Dupuytren.

[017] As palavras “um” ou “uma” pretendem incluir um ou mais, salvo indicação em contrário.

[018] “Tratar” ou “tratamento” de EFP inclui administrar as composições ou agentes aqui descritos para melhorar a aparência da pele anteriormente afetada por EFP e/ou para conseguir um resultado estético melhorado. Tratamento de EFP pode, por exemplo, incluir uma redução visual na gravidade de EFP ou uma redução visual na gravidade ou no número de ondulações na pele.

[019] A invenção inclui um método para tratar ou reduzir EFP em um paciente, que compreende administrar uma ou uma pluralidade de injeções subdérmicas de colagenase a uma área afetada por EFP, em que a pluralidade de injeções é injetada em uma pluralidade de sítios de injeções dentro de uma área afetada por EFP, em que a dose de colagenase administrada por injeção está entre cerca de 5 e cerca de 200 unidades ABC. Em modalidades adicionais, a dose de colagenase por injeção está entre cerca de 5 e cerca de 100 unidades ABC, ou cerca de 5 e cerca de 50 unidades ABC, ou entre cerca de 10 e cerca de 100 unidades ABC, ou entre cerca de 10 e cerca de 50 unidades ABC. Em modalidades adicionais, a dose total de colagenase administrada a área afetada está entre cerca de 5 e cerca de 5000 unidades ABC. A invenção também inclui um método que compreende administrar colagenase a uma área afetada por EFP em que a concentração de colagenase administrada a área afetada está entre cerca de 50 e cerca de 2000 unidades ABC/ml. A invenção, adicionalmente, inclui um método para tratar ou reduzir EFP em um paciente que compreende administrar uma pluralidade de injeções de colagenase a uma área afetada por EFP, em que a dose de colagenase por injeção está entre cerca de 5 e cerca de 200 unidades ABC.

[020] Uma área afetada por EFP (também aqui referida como a “área alvo” ou “área de tratamento”) é tipicamente uma área da pele sobre as coxas e/ou nádegas caracterizada por uma ou mais ondulações. Em algumas modalidades, a área de EFP tratada com uma ou uma pluralidade de injeções de colagenase é uma área do aspecto superior lateral da coxa ou uma área das nádegas e não envolve a prega glútea. A área alvo a ser tratada com colagenase também pode ser uma área que tem um escore de escala de gravidade de EFP fotonumérica (CSS) de ≥ 10 representando gravidade de EFP moderada a severa dentro da nádega direita ou esquerda ou da coxa direita ou esquerda (Hexsel et al. (2009). A validated photonumeric EFP severity scale. JEADV 2009; 23:523-52; o conteúdos do qual é aqui expressamente incorporado por referência aqui). CSS é uma escala fotonumérica que olha para cinco características morfológicas principais de EFP: (A) número de depressões, (B) profundidade das depressões, (C) aparência morfológica da superfície da pele, (D) frouxidão, flacidez ou enfraquecimento da pele, e (E) a escala de classificação descrita originalmente por Nürnberger e Müller, J Dermatol Surg Oncol 1978; 4 (3): 221-29) (Hexsel et al., 2009). Cada uma destas características é avaliada em uma escala de 4 pontos de um mínimo de 0 a um máximo de 3. A escala varia de 0 a 15.

[021] A área alvo tratada com uma ou uma pluralidade de injeções de EFP é geralmente uma área da pele caracterizada por uma ou mais ondulações que são visualmente evidentes quando o paciente está em pé. A área geométrica da área de tratamento depende do tamanho da área afetada por EFP. Assim, por exemplo, se a área afetada por EFP inclui uma ondulação, a área geométrica da área alvo pode ser de cerca de 1 cm² a 5 cm². Em aspectos adicionais, a área afetada por EFP compreende várias ondulações e tem uma área geométrica superior a 1 cm². Em uma modalidade, a área alvo tem uma área geométrica entre cerca de 1 cm² e cerca de 200 cm². Como será entendido, devido a área de alvo ser geralmente uma área da coxa ou nádegas, a área pode, por exemplo, ser aproximadamente retangular e tem um comprimento de cerca de 1 e cerca de 15 cm, e uma largura de cerca de 1 e cerca de 10 cm. Em um exemplo adicional, a área alvo tem um comprimento de cerca de 6 e cerca de 15 cm e uma largura de cerca de 4 e cerca de 10 cm. O especialista na técnica compreenderá também que a área alvo pode ser mais ou menos circular ou de qualquer outra forma geométrica, dependendo da área desejada para o tratamento. A área alvo pode, opcionalmente, ser caracterizada por pelo menos uma ondulação da pele, aproximadamente no centro da área de EFP tratada, em que a área de EFP é tratada com uma ou uma pluralidade de injeções. Os sítios para injeção de colagenase podem ser numerados e espaçados dentro da área afetada por EFP de modo a permitir uma distribuição uniforme e eficácia da colagenase injetada. O número de injeções de colagenase geralmente dependerá do tamanho da área a ser tratada. Em algumas modalidades, o número de sítios de injeção, é pelo menos 1 ou mais. Em outros aspectos, o número de sítios de injeção é pelo menos cerca de 3 ou mais. Em outros aspectos, o número de sítios de injeção é pelo menos cerca de 5 ou mais. Ainda em outros aspectos, o número de sítios de injeção é pelo menos cerca de 7 ou mais. Em outro aspecto, o número de sítios de injeção é pelo menos 10 ou mais.

[022] Em uma modalidade, no qual a área a ser tratada é uma área de ondulação única ou de outra forma tendo uma área geométrica de menos de 5 cm², há apenas um único sítio de injeção, e entre cerca de 5 e cerca de 200 unidades ABC de colagenase são injetadas. Opcionalmente, a única injeção pode ser injetada no centro da ondulação. Nas modalidades em que a área de tratamento é maior, haverá múltiplos sítios de injeção, e entre cerca de 5 e cerca de 200 unidades ABC de colagenase são administradas por injeção. Opcionalmente, a pluralidade de injeções inclui, pelo menos, uma injeção administrada no centro de uma ondulação. Os sítios de injeção podem, por exemplo, ser de cerca de 1 e cerca de 4 cm uns dos outros. Ainda em outros aspectos, os sítios de injeção podem ser de cerca de 2 e cerca de 3 cm uns dos outros. Por exemplo, em certas modalidades, a área afetada por EFP tem uma largura de cerca de 8 cm e um comprimento de cerca de 10 cm de dimensões e o número de injeções de colagenase administrado é de 10 e a distância entre os sítios de injeção está entre cerca de 2,5 cm. Em certos aspectos, um modelo de injeção (por exemplo, feito de um material transparente fino) que inclui marcas que mostram os sítios de injeção destinados é colocado sobre a área alvo e as uma ou mais injeções são feitas nos locais indicados pelo modelo.

[023] A área alvo é tratada com uma ou uma pluralidade de injeções simultâneas de colagenase. Como aqui utilizado, injeções simultâneas são injeções administradas ao mesmo tempo ou sequencialmente, no mesmo período de tempo, ou seja, durante uma sessão de tratamento. Como discutido acima, a dose total de colagenase administrada a área afetada por EFP está entre cerca de 5 e cerca de 5000 unidades ABC de colagenase. A dose total de colagenase administrada depende do tamanho da área de tratamento. A dose total de colagenase é a soma das doses administradas utilizando uma ou uma pluralidade de injeções de colagenase. Em certos aspectos, cada injeção de colagenase compreenderá doses iguais de colagenase. Por exemplo, quando o número de injeções é de 10, a serem distribuídas sobre a área de tratamento, e cada injeção é de 200 unidades ABC de colagenase, a dose total de colagenase a ser administrada a área alvo será de 2000 unidades ABC. A título de exemplo adicional, quando o número de injeções é de 10 a ser distribuído sobre a área de tratamento, e cada injeção é de 5 unidades ABC de colagenase, a dose total de colagenase a ser administrada a área alvo será de 50 unidades ABC. A título de exemplo adicional, quando o número de injeções é de 5 a ser distribuída sobre a área de tratamento, e, cada injeção é de 5 unidades ABC de colagenase, a dose total de colagenase a ser administrada a área alvo será de 25 unidades ABC. Quando apenas uma única injeção deve ser realizada e a dose selecionada é de 5 unidades ABC, a dose total de colagenase administrada será de 5 unidades ABC. A concentração de colagenase administrada a área afetada por colagenase está entre cerca de 50 unidades ABC/ml e cerca de 2000 unidades ABC/ml. A colagenase pode ser administrada em um volume por injeção de cerca de 0,5 ml ou menos. Em outro aspecto, a colagenase pode ser administrada em um volume por injeção de cerca de 0,1 ml e cerca de 0,5 ml. O volume total de colagenase injetada pode, por exemplo, estar entre cerca de 0,1 ml (quando apenas um único sítio de injeção é utilizado) e cerca de 7 ml (para múltiplos sítios de injeções) e maior para as áreas de tratamento de tamanhos maiores. Em uma modalidade onde a área de tratamento é de cerca de 80 cm², o volume total injetada está entre cerca de 1 e cerca de 5 ml, somados a partir de 10 injeções de entre 0,1 ml e 0,5 ml.

[024] A colagenase é uma enzima que tem a capacidade específica para digerir o colágeno. Uma fonte comercial de colagenase é de fermentação por Clostridium histolyticum. Em certos aspectos, a colagenase compreende uma combinação de colagenase I e colagenase II purificada de Clostridium histolyticum. Preferencialmente, a colagenase I e colagenase II estão presentes em uma razão em massa de cerca de 1 para 1. A colagenase AUX I tem uma única cadeia de polipeptídeos que consiste em aproximadamente 1000 aminoácidos com um peso molecular de 115 kDa. A colagenase AUX II também tem uma única cadeia de polipeptídeos que consiste em aproximadamente 1000 aminoácidos com um peso molecular de 110 kDa. A colagenase em bruto obtida a partir de C. histolyticum pode ser purificada por uma variedade de métodos conhecidos dos especialistas na técnica, incluindo, por exemplo, cromatografia por afinidade de heparina, precipitação com sulfato de amônio, cromatografia de hidroxilapatita, cromatografia por exclusão de tamanho, cromatografia de troca iônica, e cromatografia por quelante de metal. Métodos de purificação de colagenase em bruto obtidas a partir de C. histolyticum, também são descritos na Patente US 7.811.560, cujo conteúdo é expressamente aqui incorporada por referência. Como discutido acima, uma formulação injetável que compreende colagenase I e colagenase II de C. histolyticum é vendida nos EUA sob o nome comercial XIAFLEX® e é aprovado pelo U.S. FDA para tratar a contratura de Dupuytren. A colagenase pode, por exemplo, ser um produto liofilizado parenteral composto de duas colagenases em uma razão de massa aproximada de 1:1, colagenase I (AUX-I, colagenase tipo I Clostridial) e colagenase II (AUX-II, colagenase tipo II clostridial). Preferencialmente, a colagenase compreende colagenase I e colagenase II em uma razão de massa de cerca de 1 para 1, e tendo uma pureza de pelo menos cerca de 95% por área como determinado por cromatografia líquida de fase reversa de alto desempenho (como descrito, por exemplo, na Patente US 7.811.560).

[025] As composições de colagenase da invenção também podem ser preparadas por mistura de um número específico de unidades de atividade ou massas específicas das enzimas purificadas. Atividade de colagenase pode ser medida pela capacidade da enzima em hidrolisar qualquer peptídeo sintético ou substrato de colágeno. Os especialistas na técnica reconhecerão que outros ensaios enzimáticos que não os aqui divulgados também podem ser utilizados para definir e preparar composições de enzimas funcionalmente equivalentes.

[026] É entendido que os termos “Colagenase I”, “ABC I”, “AUX I”, “colagenase AUX I” e “colagenase ABC I” significam o mesmo e podem ser usados de forma intercambiável. Da mesma forma, os termos “Colagenase II”, “ABC II”, “AUX II”, “colagenase AUX II”, e “colagenase ABC II” referem- se à mesma enzima e também podem ser utilizados de forma intercambiável.

[027] Em certas modalidades adicionais, a colagenase administrada de acordo com um método aqui descrito é uma colagenase recombinante.

[028] A colagenase é administrada em uma composição farmacêutica que compreende a colagenase e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição não inclui uma enzima protease além da colagenase (com exceção de uma quantidade pequena ou traço de enzima proteolítica, que pode estar presente na colagenase purificada a partir de uma fermentação bacteriana). Em modalidades adicionais, a composição farmacêutica não inclui uma enzima além da colagenase (com exceção de uma pequena quantidade ou traço de enzima que pode estar presente na colagenase purificada a partir de uma fermentação bacteriana). O especialista na técnica entenderá que a colagenase derivada de uma fermentação bacteriana, mesmo depois da purificação, pode conter quantidades pequenas ou traços de impurezas, incluindo outras enzimas, como outras enzimas protease. A quantidade pequena ou traço de impureza pode, por exemplo, ser inferior a cerca de 5%, menos do que cerca de 4%, menos do que cerca de 3%, menos do que cerca de 2% ou menos do que cerca de 1% da composição de colagenase. Em algumas modalidades, a quantidade pequena ou traço de impureza pode ser inferior a cerca de 1%, 2%, 3%, 4% ou 5%, por área, como determinada por cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa. Em outro aspecto, a composição farmacêutica consiste essencialmente de colagenase e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável. Como aqui utilizado, uma composição farmacêutica “consiste essencialmente em colagenase e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável” pretende excluir as composições farmacêuticas de outras enzimas protease e hialuronidase além de pequenas ou quantidades ou traços, como descrito acima. Em certos aspectos adicionais, uma composição “que consiste essencialmente em colagenase” exclui as composições de uma enzima além da colagenase. Ainda em outra modalidade, a composição farmacêutica consiste em colagenase e um sal farmaceuticamente aceitável da mesma.

[029] O método para tratar ou reduzir EFP pode ainda incluir o pré- tratamento da área alvo com um agente anestésico local.

[030] Em outros aspectos, a invenção é dirigida para tratar ou reduzir EFP em um paciente que consiste essencialmente em administrar uma ou uma pluralidade de injeções de colagenase a uma área afetada por EFP em que a dose de colagenase administrada está entre cerca de 5 e cerca de 200 unidades ABC e, opcionalmente, ainda em que a concentração de colagenase está entre cerca de 50 e cerca de 2000 unidades ABC/ml. Ainda em um aspecto adicional, a invenção é dirigida para tratar ou reduzir de EFP em um paciente que consiste em administrar uma pluralidade de injeções de colagenase, em que a dose de colagenase administrada por injeção está entre cerca de 5 e cerca de 200 unidades ABC e, opcionalmente, ainda em que a concentração de colagenase está entre cerca de 50 e cerca de 2000 unidades ABC/ml.

[031] O transportador farmaceuticamente aceitável pode ser um ou mais transportadores líquidos ou excipientes apropriados para injeção. Como aqui utilizado, o termo “transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável” significa um material não tóxico, inerte, de enchimento líquido, diluente, de encapsulação ou auxiliar de formulação de qualquer tipo. Alguns exemplos de materiais que podem servir como transportadores farmaceuticamente aceitáveis são açúcares como lactose, glicose e sacarose; amidos como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados, como sais carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; tragacanto em pó; malte; gelatina; talco; glicóis como propilenoglicol; ésteres como oleato de etila e laurato de etila; ágar; agentes tamponantes como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água isenta de pirogênio; solução salina isotônica; Solução de Ringer; álcool etílico, e soluções de tampão fosfato, bem como outros lubrificantes compatíveis não tóxicos, como lauril sulfato de sódio e estearato de magnésio, bem como agentes corantes, agentes de liberação, agentes de revestimento, agentes perfumantes, conservantes e antioxidantes também podem estar presentes na composição, de acordo com o julgamento do formulador. As preparações injetáveis, por exemplo, suspensões aquosas ou oleaginosas injetáveis estéreis, podem ser formuladas de acordo com a técnica conhecida utilizando agentes dispersantes ou molhantes e agentes de suspensão. A preparação injetável estéril pode também ser uma solução injetável estéril, suspensão ou emulsão em um diluente ou solvente parenteral mente aceitável não tóxico, por exemplo, como uma solução em 1, 3-butanodiol. Entre os transportadores e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão a água, solução de Ringer, U.S.P. e solução isotônica de cloreto de sódio. Além disso, os óleos fixos estéreis são convencionalmente utilizados como um meio solvente ou de suspensão. Para este fim, qualquer óleo fixo brando pode ser empregado incluindo mono ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, ácidos graxos como ácido oleico são utilizados na preparação de injetáveis.

[032] As formulações injetáveis podem ser esterilizadas, por exemplo, por filtração através de um filtro de retenção de bactérias, ou por incorporação de agentes esterilizantes na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas ou dispersas em água estéril ou outro meio injetável estéril antes de usar. As soluções estéreis também podem ser liofilizadas para uso posterior. Em uma modalidade, a composição farmacêutica que compreende a colagenase é uma composição injetável liofilizado formulada com lactose. Em uma modalidade cada miligrama de colagenase injetável é formulada com 1,9 mg de lactose. Em outra modalidade, cada miligrama de injeção de colagenase tem preferencialmente cerca de 2800 unidades SRC e 51000 unidades medidas com um teste de potência usando um substrato sintético, pzGPGGPA.

[033] Em outra modalidade, a composição de colagenase usada de acordo com um método da invenção é uma composição injetável liofilizada formulada com sacarose, Tris a um nível de pH de cerca de 8,0. Por exemplo, 1,0 mg da substância da droga da invenção é formulado em 60 mM de sacarose, 10 mM Tris, com um pH de cerca de 8,0 (isto equivale a 20,5 mg/mL de sacarose, e 1,21 mg/mL de Tris, no tampão de formulação). Geralmente, uma fonte de cálcio é incluída na formulação, como cloreto de cálcio.

[034] A invenção será mais bem entendida em conexão com os exemplos seguintes, que se destinam apenas como ilustração e não limitam o escopo da invenção. Várias alterações e modificações às modalidades reveladas serão evidentes para os especialistas na técnica e ditas alterações e modificações podem ser realizadas sem se afastar do espírito da invenção e do escopo das reivindicações anexas.

EXEMPLOS Exemplo 1: Efetividade da Colagenase de Clostridium histolvticum em lise dérmica de coláaeno em mini porcos Göttingen

[035] Colagenase de Clostridium histolyticum (Auxilium Product Operation, Malvern, PA) é um produto liofilizado parenteral composto das duas colagenases em uma razão de massa aproximada de 1:1, Colagenase I (AUX-I, colagenase tipo I Clostridial) e Colagenase II (AUX-II; colagenase tipo II Clostridial). Estas colagenases são isoladas e purificadas a partir da fermentação de Clostridium histolyticum. O transportador para a reconstituição do produto liofilizado foi salina (cloreto de sódio a 0,9%) com 0,03% (2 mM) de cloreto de cálcio. O transportador para a diluição e preparação das formulações descritas em mais detalhe abaixo foi salina (cloreto de sódio a 0,9% injetável, Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL) com 10 mM (0,13%) TRIZMA® (Sigma Aldrich, Inc., St. Louis, MO), 60 mM (2,0%), sacarose (Sigma Aldrich, Inc., St. Louis, MO), e cloreto de cálcio 2 mM (pH 8,0) (Aldrich Chemical Corporation, Allentown, PA). HC1 1N (ácido clorídrico) foi utilizado para levar o pH do transportador para diluição a 8,0. O transportador para diluição foi misturado nos procedimentos de preparação, amostragem e administração das doses. O transportador para diluição foi então esterilizado por filtração usando um filtro de seringa PVDF de 0,22 μm em um frasco esterilizado e fechado com um septo. O transportador para diluição foi preparado utilizando uma técnica asséptica em uma capela de fluxo laminar utilizando material de vidro e utensílios esterilizados.

[036] As formulações de dosagem foram preparadas no artigo de teste (Colagenase de Clostridium histolyticum) nas concentrações indicadas na tabela seguinte:

^a = As formulações do artigo de teste não foram ajustadas para pureza.
^b = medição de pH utilizando papel de tornassol.

[037] As formulações de dosagem foram preparadas no dia da dosagem. O produto liofilizado foi reconstituído usando o transportador para reconstituição para obter uma solução de estoque do artigo de teste de 2,5 mg/mL. O transportador para a diluição foi utilizado para diluir a solução estoque do artigo de teste e preparação das formulações a ser utilizada para a administração. As formulações foram mantidas em gelo úmido, antes e durante a administração. As formulações foram preparadas utilizando uma técnica asséptica dentro de uma capela de fluxo laminar utilizando material de vidro e utensílios esterilizados.

[038] Mini porcos Gottingen foram usados como o sistema de teste neste estudo. Esta espécie e raça do animal é reconhecida como apropriada para estudos de toxicidade geral e foi utilizada como um modelo de pesquisa biomédica em uma ampla variedade de disciplinas. Suínos apresentam muitas semelhanças com o homem na anatomia e fisiologia cardiovascular, fisiologia digestiva e estrutura e função tegumentar. Devido à semelhança da anatomia e fisiologia da pele entre suínos e o homem, suínos tornaram-se modelos padrões para a cirurgia plástica, cicatrização de feridas, e estudos de toxicidade dérmica (Svendsen et al, (1998), Scandinavian Journal of Laboratory Animal Science 1998, 25 (suplemento 1):27-30). Historicamente, o suíno foi usado na avaliação de toxicológica da terapêutica prospectiva.

[039] Mini porcos Gottingen (4 machos e 3 fêmeas) foram recebidos em boas condições de saúde da Marshall BioResources, North Rose, NY. Os animais tinham aproximadamente 3 a 4 meses de idade no recebimento. Cada animal recebeu uma dose de todos os 12 tratamentos, para uma dose total por animal de cerca de 0,43 mg de Colagenase de Clostridium histolyticum. Os animais tinham aproximadamente 4 meses de idade na administração da dose. Os pesos corporais variaram de 7185 g a 8646 g para os machos e de 9333 g a 9633 g para as fêmeas na dosagem. As formulações do artigo de teste foram administradas aos animais anestesiados com telazol/xilazina no dia 0 do estudo por injeção subcutânea (bolus). O dia antes da injeção, as áreas designadas para injeção, foram presas, se necessário. Seis injeções foram administradas ao longo do tronco lateral direito e esquerdo de cada animal utilizando uma seringa e agulha de tamanho adequado (16-23 de calibre). Os animais não foram dosados no mesmo local mais do que uma vez. Cada injeção subcutânea consistiu de um tratamento diferente, designado aleatoriamente (combinação de concentração da formulação e do volume de dose). Os sítios de injeção foram espaçados suficientemente distantes para evitar possíveis reações dos sítios de injeção adjacentes. A área imediatamente em torno do sítio de deposição do teste artigo foi marcada com caneta permanente e observada, conforme necessário. Sítios de injeção individuais foram rotulados. A via selecionada da administração para este estudo foi injeção subcutânea.

[040] Nenhum efeito histológico relacionado com a droga foi detectado em adipócitos, nervos, estruturas anexas (folículos pilosos, glândulas sudoríparas e glândulas sebáceas) ou a epiderme sobrejacente. Não houve diferenças consistentes na lise de colágeno entre os sexos ou entre os animais sacrificados 24 ou 48 horas após a administração na extensão estimada de lise de colágeno e os resultados são combinados por sexo para as necropsias 24 e 48 horas após a dosagem na tabela abaixo. Em concentrações inferiores a 0,015 mg/mL, a extensão da lise de colágeno foi geralmente responsiva à dose. Em ≥ 0,015 mg/mL a extensão da lise de colágeno foi geralmente proporcional ao volume da dose injetada, em oposição à dose total ou concentração de formulação (por exemplo, artigos de teste 7 e 8 representam a mesma dose administrada em uma concentração inferior e volume superior para o artigo de teste 7).

^a = Para cada gênero, a extensão média de lise de colágeno foi combinada para todos os três animais nos intervalos de necropsia de 24 e 48 horas.

[041] Colagenase de Clostridium histolyticum administrada como injeções subcutâneas únicas em concentrações que variam de 0,0015 a 0,15 mg/mL resultou em inchaço local nos sítios tratados com concentrações de Colagenase de Clostridium histolyticum ≥ 0,015 mg/ml e lise de colágeno (o efeito farmacológico esperado de Colagenase de Clostridium histolyticum) em todas as doses, volumes de doses e concentrações de formulação neste estudo. A dose minimamente eficaz neste estudo foi de 0,0003 mg de proteína e a concentração minimamente efetiva foi de 0,0015 mg/mL. Em concentrações inferiores a 0,015 mg/mL, uma resposta à dose foi geralmente aparente para a extensão da lise de colágeno. Em concentrações ≥ 0,015 mg/ml, a extensão da lise de colágeno eficaz refletiu o volume da dose administrada mais do que a dose total ou concentração de formulação.

[042] Lise de colágeno foi acompanhada constantemente por uma série de mudanças secundárias. Estas mudanças incluíram o seguinte: hemorragia e/ou inflamação aguda observadas de forma consistente em todos os níveis de dose efetiva; necrose das fibras musculares do panículo carnosis a ≥ 0,003 mg/mL (doses totais ≥ 0,0006 mg de proteína); edema perivascular e intramural, neovascularização/fibrose, necrose vascular e/ou trombose observada esporadicamente em concentrações ≥ 0,009 mg/mL (doses totais ≥ 0,0018 mg de proteína); e hemorragia arterial intramural observada esporadicamente em concentrações de formulação ≥ 0,030 mg/ml (doses totais ≥ 0,003 mg de proteína). Não houve efeitos mediados por Colagenase de Clostridium histolyticum em adipócitos, nervos, estruturas anexas ou a epiderme sobrejacente.

[043] Os resultados deste estudo mostraram algum grau de lise de colágeno histologicamente detectável dos septos dérmicos em todas as concentrações de doses Colagenase de Clostridium histolyticum; no entanto, mais áreas de lise completa de septo dérmico foram observados nas concentrações ≥ 0,015 mg/mL. Nesse estudo, não houve nenhum efeito mediado por Colagenase de Clostridium histolyticum em adipócitos, nervos, pele estruturas anexas ou epiderme sobrejacente. Efeitos locais de Colagenase de Clostridium histolyticum (hemorragia e/ou inflamação aguda) em cada concentração foram observados no exame bruto e/ou microscópico na necropsia. Não houve diferenças consistentes na lise de colágeno entre os sexos ou entre os animais sacrificados aos 24 ou 48 horas após a dosagem na extensão estimada da lise de colágeno.

[044] Em concentrações eficazes na lise completa do septo dérmico, dose e a lise de colágeno dependente de volume foi notado para ocorrer dentro de um diâmetro de aproximadamente 2,5 cm no estudo de mini porcos.

Exemplo 2: Estudo de Fase 1 b, aberto, de escalonamento de dose e farmacocinético para tratar EFP

[045] Os objetivos deste estudo são avaliar a segurança, eficácia, farmacocinética, e imunogenicidade da Colagenase de Clostridium histolyticum para aumentar as doses totais em uma área de 80 cm², variando de 0,0029 mg a 0,116 mg (50 a 2000 unidades ABC) e concentrações crescentes que variam de 0,0029 mg/mL a 0,116 mg/mL (50 a 2000 unidades por ml de ABC) no tratamento de mulheres adultas com EFP.

[046] Com base nos resultados acima discutidos no estudo com mini porcos (Exemplo 1), o modelo de injeção para o estudo clínico de Fase 1 foi desenhado para permitir uma distância de aproximadamente 2,5 cm entre as injeções. Esta distância deverá permitir a distribuição adequada e atividade de Colagenase de Clostridium histolyticum dentro da área de 8 cm x 10 cm de EFP sem lacunas significativas ou sobreposição dentro da área de tratamento. Em uma tentativa para determinar a dose ideal para tratar EFP (por exemplo, eficaz com efeitos adversos locais mínimos), a seleção da dose foi feita após a consideração do perfil de segurança favorável de Colagenase de Clostridium histolyticum, até o momento tanto em desenvolvimento clínico quando na prática clínica bem como em dados do estudo mini porcos. Como resultado, uma dose inicial de 0,0029 mg injetada como 10 doses separadas de 0,00029 mg dentro de uma área alvo de EPF de 8 cm x 10 cm em uma concentração de 0,0029 mg/mL é proposta para o estudo de Fase 1.

[047] Este estudo é um estudo de Fase 1 b, aberto, de escalonamento de dose e farmacocinético. Durante a visita de triagem, enquanto o sujeito está de pé, o investigador ou pessoa designada qualificada examinará a nádega esquerda e a direita e a coxa direita e esquerda e selecionar um quadrante que tem um escore na escala de gravidade fotonumérica EFP (CSS) de ≥ 10 representando gravidade EFP de moderada a grave (Hexsel et al., 2009). O investigador ou designado qualificado irá identificar uma área de EFP dentro do quadrante selecionado que tenha pelo menos 8 cm x 10 cm (ou seja, área alvo EFP) e seja adequada para tratar (ou seja, que é no aspecto superior lateral da coxa ou na nádega e não envolve a prega glútea). A área EFP alvo deve ser evidente, quando o sujeito está em pé, sem o uso de qualquer tipo de manipulação, como apertando a pele ou contração do músculo. Cada sujeito será triado para elegibilidade do estudo no prazo de 21 dias antes da injeção da droga no Dia 1 do estudo.

[048] Neste estudo, 63 sujeitos receberão cada um 10 injeções simultâneas de volume igual de Colagenase de Clostridium histolyticum dentro da área EFP alvo. Após a triagem e determinação de elegibilidade do estudo, os sujeitos serão atribuídos sequencialmente às Coortes 1, 2, 3, e 4 (Tabela 3). Os primeiros nove sujeitos serão designados para a Coorte 1 (1 mL de volume total/área alvo EFP). Dentro de cada uma das seguintes Coortes 2 a 4, os primeiros nove sujeitos em cada coorte serão atribuídos para 5 mL de volume total/EFP alvo seguido pelos próximos nove sujeitos que serão atribuídos a um volume total de 1 mL/área EFP alvo. A dosagem começará com a Coorte 1. A dosagem nas Coortes 2 e 3 não começarão até que a segurança de sujeitos na Coorte 1 seja avaliada pelo comitê de monitoramento de segurança (SMC). A dosagem na Coorte 4 não começará até que a segurança dos sujeitos nas Coortes 2 e 3, seja avaliadas pelo SMC.

[049] As doses propostas para tratar de uma área EFP de 8 cm x 10 cm representam entre 0,5% (0,0029 mg) e 20% (0,116 mg) da dose utilizada em uma injeção única para contratura de Dupuytren, em uma concentração que está entre 0,1% (0,0029 mg/mL) e 5% (0,116 mg/mL) das concentrações utilizadas no produto aprovado para contratura de Dupuytren.

^a Um total de 10 injeções únicas nos sítios de injeção alvo através da área EPF alvo de 8 cm x 10 cm. CCH é Colagenase de Clostridium histolyticum
^b U são unidades ABC

[050] Os componentes da Colagenase Clostridium histolyticum são: colagenase mista AUX-I e AUX-II, 10 mM Tris, 60 mM de sacarose. Os componentes de Colagenase de Clostridium histolyticum diluente estéril A para reconstituição são: 0,03% (2 mM) cloreto de cálcio (CaCI) em 0,9% (154 mM) de cloreto de sódio (NaCL), pH 6,0-7,0, é fornecido como um líquido terminalmente esterilizado a 3,0 mL por frasco. Os componentes de Colagenase estéril de Clostridium histolyticum Diluente estéril B tamponado para posterior diluição são: 0,03% (2 mM) cloreto de cálcio e 0,12% (10 mM) trometamina (TRIS) em 0,9% (154 mM) de cloreto de sódio, pH 8,0 cloreto é fornecido como um líquido terminalmente esterilizado a 3,0 mL por frasco. Após a reconstituição com Diluente A e posterior diluição com Diluente B, a solução A4500 pode ser mantida em temperatura ambiente (20° a 25°C/68° a 77°F) durante até uma hora ou refrigerado a 2°C a 8°C (36° a 46° F) por até 4 horas antes da administração.

[051] Um modelo de injeção será feito de um material transparente fino. O modelo de injeção de 8 cm x 10 cm será pré-marcado com os sítios de injeção e diagrama mostrados na FIG. 1. Cada um dos pontos pretos dentro do octógono representa um sítio de injeção. O ‘X’ circulado representa o sítio de injeção da ondulação central (ou seja, a área da depressão mais profunda na área alvo (FIG. 1). Cada ponto negro (incluindo o sítio da ondulação central e os quatro cantos) será cortado para permitir que o investigador marque a área EFP alvo conforme necessário. Cada ponto dentro do octógono mostrado na FIG. 1 representa um sítio de injeção. O X dentro do círculo representa o sítio de injeção para a ‘ondulação central’. Os quatro cantos são marcados como superior direito (UR), inferior direito (LR), superior esquerdo (UL), e inferior esquerdo (LL).

[052] Durante a visita de triagem, enquanto o sujeito está de pé, o investigador ou pessoa designada qualificada examinará a nádega esquerda e a direita e esquerda e direita da parte posterior da coxa superior e selecionar um quadrante que tem EFP moderada a grave (escore CSS ≥ 10). O investigador ou pessoa designada qualificada irá identificar uma área EFP dentro do quadrante selecionado que seja pelo menos 8 cm x 10 cm (referido no presente exemplo, como área EFP alvo) e adequada para tratar (por exemplo, está na parte posterior da coxa ou na nádega e não envolve a prega glútea). A área EFP alvo deve também ser evidente quando o sujeito está em pé, sem o uso de qualquer tipo de manipulação (como beliscar a pele ou contração muscular).

[053] O investigador irá, em seguida, colocar o modelo de injeção sobre a área EFP alvo (enquanto o sujeito está em pé) e posicionar o modelo ‘X’ circulado sobre o centro mais profundo da depressão (por exemplo, a ondulação central) na área alvo. O investigador irá utilizar um marcador cirúrgico e a marca na pele do sujeito em dois cantos do modelo. O investigador irá remover o modelo e registrar que dois cantos do modelo foram marcados (por exemplo, superior direito, inferior direito, superior esquerdo, inferior esquerdo). O investigador usará uma fita métrica para medir como a seguir:

1. Identificar a linha média da coxa superior e nádega a partir do centro da fossa poplítea (FIG. 2).
2. Identificar a linha que é perpendicular à linha média, e passar pela primeira marca no canto do modelo (conforme ilustrado na FIG. 2, [Linha BC]). Medir a distância entre os Pontos B e C (registrar a distância).
3. Medir a distância do Ponto A ao Ponto B, conforme ilustrado na FIG. 2 (registrar a distância).
4. Repetir as etapas 2 e 3 para a medição da segunda marca no canto do modelo (FIG. 2, [Pontos A, D, e E]).

[054] Cada medição registrada será usada mais tarde para realocar a área EFP alvo de 8 cm x 10 cm antes da injeção e antes de cada momento de avaliação de eficácia.

[055] No dia 1, após o sítio de injeção ser identificado, marcado (como descrito acima), fotografado e as avaliações da eficácia pré-injeção foram concluídas, o sujeito será posicionado de bruços na mesa de exame de modo que a totalidade de 8 cm x 10 cm da área EFP alvo com os sítios de injeção previamente marcados seja visível e avaliável para o investigador. A área do sítio de injeção deve ser preparada com um antisséptico apropriado como álcool.

[056] Usando uma seringa de 5mL ou 1 ml previamente preparada (dependendo da designação da coorte) com uma agulha de calibre 30 ¼ de polegada, o investigador irá administrar uma dose de 0,5 mL ou 0,1 mL de Colagenase de Clostridium histolyticum em cada um dos 10 sítios de injeção. Em cada um dos 10 sítios, a droga do estudo será injetada perpendicular à pele do sujeito, a uma profundidade de ¼ de polegada (~ 7 mm).

[057] O investigador irá administrar a droga do estudo em uma sequência que garante cada um dos 10 sítios receberá uma única injeção de 0,5 mL ou 0,1 mL de Colagenase Clostridium histolyticum. Após a décima injeção, o volume máximo admissível da droga do estudo será administrado (5 mL ou 1 mL). Qualquer injetado na superfície de um sítio de injeção após a injeção (sugestivo de extravasamento) será notado e a localização da injeção associada será registrada. Nenhuma massagem ou palpação local será realizada posteriormente à injeção da droga do estudo.

[058] Os seguintes parâmetros primários serão avaliados no dia 90:

• Avaliação da escala de melhora estética global pelo Investigador da área EFP alvo;
• Avaliação da escala de melhora estética global pelo sujeito da área EFP alvo; e
• A análise da resposta com base na proporção de sujeitos com uma melhoria ≥30% do basal em desvio padrão do contorno na superfície da área EFP alvo com base em fotografia digital 3D.

[059] Embora esta invenção tenha sido particularmente demonstrada e descrita com referências às modalidades preferenciais da mesma, será entendido pelos especialistas na técnica que várias alterações na forma e detalhes podem ser realizadas sem se afastar do escopo da invenção incluído pelas reivindicações em anexo.

Claims

Método cosmético para tratar ou reduzir paniculopatia fibrosclerótica edematosa (PFE) em um paciente caracterizado pelo fato de que compreende a administração de pelo menos uma injeção de uma composição farmacêutica compreendendo colagenase e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que a colagenase é colagenase I e colagenase II em uma razão em massa de 1:1 com uma atividade específica de 10.000 unidades ABC por 0,58 mg de colagenase, em que as injeções são injeções subdérmicas com 5-200 unidades ABC de colagenase por injeção para um área afetada por PFE, e em que, quando injeções múltiplas são administradas, os sítios de injeção estão cerca de 1 a cerca de 4 cm um do outro.
Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma pluralidade de injeções subdérmicas é administrada a uma pluralidade de sítios de injeção.
Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração de colagenase administrada está entre 50 e 2000 unidades ABC por milímetro.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que cada injeção de colagenase é administrada num volume de cerca de 0,5 ml ou menos.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a dose total de colagenase administrada está entre cerca de 5 a cerca de 2000 unidades ABC.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a dose de colagenase por injeção está entre 5 a 100 unidades ABC, preferencial mente entre cerca de 5 a cerca de 50 unidades ABC.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a colagenase é purificada a partir de Clostridium histolyticum.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a colagenase é uma colagenase recombinante.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que pelo menos duas injeções, preferencialmente pelo menos cinco injeções, mais preferencialmente pelo menos dez injeções de colagenase são administradas a dois, cinco ou dez sítios de injeção, respectivamente, dentro da área afetada.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a área afetada por PFE possui uma área de 1 cm² a 200 cm².
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que uma pluralidade de injeções subdérmicas de colagenase é administrada e pelo fato de que a distância entre os sítios de injeção é de 2 a 3 cm.
Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a área afetada por PFE possui um comprimento de cerca de 10 cm e largura de cerca de 8 cm.
Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que há uma distância de cerca de 2,5 cm entre sítios de injeção.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que cada injeção tem um volume de cerca de 0,1 ml.
Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a dose total de colagenase administrada à área afetada está entre cerca de 5 a cerca de 1000 unidades ABC.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que cada injeção tem um volume de cerca de 0,2 ml ou menos.