BR112014008838B1

BR112014008838B1 - PRODUCTION OF ISOPROPANOL BY IMPROVED RECOMBINANT STRAINS

Info

Publication number: BR112014008838B1
Application number: BR112014008838-1A
Authority: BR
Inventors: Florent Collas; Rémy Marchal; Benjamin Clement; Ana Maria Lopez Contreras; Pieternel A.M. Claassen
Original assignee: IFP Energies Nouvelles; Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek
Priority date: 2011-10-11
Filing date: 2012-10-03
Publication date: 2023-08-29

Abstract

PRODUÇÃO DE ISOPROPANOL POR ESTIRPES RECOMBINANTES MELHORADAS. A presente invenção refere-se a um vetor de expressão que compreende os ácidos nucleicos que codificam os polipeptídios que formam um complexo de polipeptídico que possui atividade enzimática que converte acetoacetil-CoA em acetoacetato, opcionalmente, pelo menos um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo possuindo atividade enzimática para converter acetoacetato a acetona, e pelo menos um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo contendo a atividade enzimática para a conversão de acetona a isopropanol, a expressão do referido ácido nucleico é controlada por um único promotor constitutivo localizado a montante dos ácidos nucleicos acima mencionados.PRODUCTION OF ISOPROPANOL BY IMPROVED RECOMBINANT STRAINS. The present invention relates to an expression vector comprising nucleic acids encoding polypeptides forming a polypeptide complex having enzymatic activity that converts acetoacetyl-CoA to acetoacetate, optionally at least one nucleic acid encoding a polypeptide having enzymatic activity for converting acetoacetate to acetone, and at least one nucleic acid encoding a polypeptide containing the enzymatic activity for converting acetone to isopropanol, the expression of said nucleic acid is controlled by a single constitutive promoter located upstream of the above nucleic acids mentioned.

Description

[001] A presente invenção refere-se a um processo para a produção de isopropanol por estirpes recombinantes melhoradas.[001] The present invention relates to a process for the production of isopropanol by improved recombinant strains.

Bibliographic research

[002] Isopropanol, também chamado 2-propanol, ou álcool isopropílico, é usado principalmente como um solvente para a preparação de tintas e surfactantes. Outras aplicações referem-se às propriedades antisépticas do solvente de carboximetilcelulose (CMC). O isopropanol é também usada na produção de bases cosméticas, solventes ou pesticidas, como uma fonte de material em síntese orgânica. Para obter informações incluem a produção de isopropanol foi de 45 milhões de toneladas nos EUA em 1990 (Papa A, 2005).[002] Isopropanol, also called 2-propanol, or isopropyl alcohol, is mainly used as a solvent for the preparation of paints and surfactants. Other applications relate to the antiseptic properties of carboxymethyl cellulose (CMC) solvent. Isopropanol is also used in the production of cosmetic bases, solvents or pesticides, as a source of material in organic synthesis. For information include isopropanol production was 45 million tons in the USA in 1990 (Papa A, 2005).

[003] Hoje em dia, o isopropanol é produzido por um método essencialmente químico que consiste de hidratação de propileno em uma via direta ou indireta. A via indireta envolve dois passos. No primeiro passo, uma mistura de produtos dos ésteres de ácido sulfúrico e mono-, di- isopropilo, que são hidrolisados em uma segunda etapa, em isopropanol. A rota direta implementa a hidratação de propileno a alta pressão e baixa temperatura do catalisador em um ácido "leito fixo" (Logsdon JE e Loke R. A, 2001).[003] Nowadays, isopropanol is produced by an essentially chemical method that consists of hydrating propylene in a direct or indirect route. The indirect route involves two steps. In the first step, a mixture of sulfuric acid and mono-, di-isopropyl ester products, which are hydrolyzed in a second step, in isopropanol. The direct route implements high pressure, low temperature propylene hydration of the catalyst in an acidic "fixed bed" (Logsdon JE and Loke R. A, 2001).

[004] De 1942 a 1958, o isopropanol foi produzido em Taiwan por fermentação (Rogers et al., 2006). Substratos de fermentação foram batata-doce, mandioca, amido de trigo, enquanto que o microrganismo é uma estirpe selvagem. Hoje em dia, este método de produção de isopropanol não é mais utilizado industrialmente. De fato, os baixos rendimentos obtidos com as estirpes do tipo selvagem (entre 2 e 3 g / L de isopropanol por Clostridium. Beijerinckii) não permitem o estabelecimento de processos economicamente viáveis. Como ABE (acetona, butanol, etanol) fermentação solvantogene fermentação IBE (isopropanol, butanol, etanol) foi abandonado no início de 1960, juntamente com o desenvolvimento da indústria petroquímica.[004] From 1942 to 1958, isopropanol was produced in Taiwan by fermentation (Rogers et al., 2006). Fermentation substrates were sweet potato, cassava, wheat starch, while the microorganism is a wild strain. Nowadays, this method of producing isopropanol is no longer used industrially. In fact, the low yields obtained with wild-type strains (between 2 and 3 g/L of isopropanol per Clostridium. Beijerinckii) do not allow the establishment of economically viable processes. Like ABE (acetone, butanol, ethanol) solvantogene fermentation IBE (isopropanol, butanol, ethanol) fermentation was abandoned in the early 1960s along with the development of the petrochemical industry.

[005] Devido a preocupações ambientais e econômicas, a pesquisa sobre a fermentação microbiológica para produção de isopropanol tem atraído o interesse renovado nos últimos anos. A fermentação que produz isopropanol é conhecida como fermentação IBE. Difere dos outras produções de fermentação de solvente, ABE fermentação, na medida em que produz o isopropanol apenas ou principalmente à custa de acetona. Cepas produtoras de solvente pertencem ao gênero Clostridium. Eles foram reclassificados em quatro espécies: C. acetobutylicum, C. beijerinckii, C. aurantibutyricum, C. saccharoperbutylacetonicum (Keis et al 2001).[005] Due to environmental and economic concerns, research into microbiological fermentation for isopropanol production has attracted renewed interest in recent years. The fermentation that produces isopropanol is known as IBE fermentation. It differs from the other solvent fermentation productions, ABE fermentation, in that it produces isopropanol only or mainly at the expense of acetone. Solvent-producing strains belong to the genus Clostridium. They have been reclassified into four species: C. acetobutylicum, C. beijerinckii, C. aurantibutyricum, C. saccharoperbutylacetonicum (Keis et al 2001).

[006] C. acetobutylicum é uma cepa frequentemente usada em fermentação ABE. Os principais produtos de fermentação com C. acetobutylicum são acetona, etanol e butanol. Isopropanol não é produzida por cepas selvagens de C. acetobutylicum.O isopropanol é uma característica de um produto conhecido anteriormente como "Clostridium butylicum" microrganismo (Osburn et al 1937. Langlykke et al 1937.). Em 1983, George et al. demonstraram que a C. butylicum era semelhante a C. beijerinckii. Na classificação atual, a espécie C. beijerinckii, portanto, contém cepas que eram anteriormente classificados como C. butylicum. No entanto, todas as cepas de C. beijerinckii não produzem isopropanol. Por exemplo, a estirpe C. beijerinckii NRRL B593 no produto, enquanto que o C. beijerinckii NRRL B592 estirpe não produz.[006] C. acetobutylicum is a strain frequently used in ABE fermentation. The main fermentation products with C. acetobutylicum are acetone, ethanol and butanol. Isopropanol is not produced by wild strains of C. acetobutylicum. Isopropanol is a characteristic product of a product previously known as "Clostridium butylicum" microorganism (Osburn et al 1937. Langlykke et al 1937). In 1983, George et al. demonstrated that C. butylicum was similar to C. beijerinckii. In the current classification, the species C. beijerinckii therefore contains strains that were previously classified as C. butylicum. However, all strains of C. beijerinckii do not produce isopropanol. For example, the C. beijerinckii NRRL B593 strain in the product, while the C. beijerinckii NRRL B592 strain does not produce.

[007] A via de biossíntese de isopropanol em C. beijerinckii isopropanol compreende os passos seguintes:[007] The isopropanol biosynthesis pathway in C. beijerinckii isopropanol comprises the following steps:

[008] (i) duas moléculas de acetil-CoA são condensados para acetoacetil-CoA por acetil-CoA-transferase (EC 2.3.1.9), também conhecido como tiolase (THL);[008] (i) two acetyl-CoA molecules are condensed to acetoacetyl-CoA by acetyl-CoA-transferase (EC 2.3.1.9), also known as thiolase (THL);

[009] (ii) a CoA acetilCoA é transferido para acetato de etilo ou butirato-CoA transferase Pacétoacétyl (Ca CtfAB) (EC 2.8.3.9), para se obter acetoacetato;[009] (ii) acetylCoA CoA is transferred to ethyl acetate or Pacétoacetyl butyrate-CoA transferase (Ca CtfAB) (EC 2.8.3.9), to obtain acetoacetate;

[010] (iii) o acetoacetato é então convertido em acetona e C02 por descarboxilase de etilo (Ca_Adc) (EC 4.1.1.4), (iv) finalmente, a acetona é convertido para o isopropanol pela desidrogenase de álcool secundário (s Cb -ADH) (EC 1.1.1.2).[010] (iii) acetoacetate is then converted to acetone and C02 by ethyl decarboxylase (Ca_Adc) (EC 4.1.1.4), (iv) finally, acetone is converted to isopropanol by secondary alcohol dehydrogenase (s Cb - ADH) (EC 1.1.1.2).

[011] Comparação das atividades enzimáticas em C. beijerinckii NRRL B593 e C. beijerinckii NRRL B592 (que, respectivamente, produzida e não produz isopropanol) mostraram que a capacidade de excreção de isopropanol foi atividade do álcool desidrogenase Cb secundário Adh-s (Y uma et al., 1988). A enzima responsável foi purificada a partir de extractos isentos de células de C. beijerinckii NRRL B593 (Ismaiel et al. 1993). A C. beijerinckii NEST255 desidrogenase também foi purificado para fins de comparação. Álcool secundário desidrogenases cepas C. beijerinckii NRRL B593 e C. beijerinckii NEST255 são dependentes NADP. In vitro, eles usam como o álcool secundário esperado (isopropanol), mas também os álcoois primários, em especial butanol, no entanto, com uma atividade mais baixa. O estudo cinético da enzima foi confirmado que o substrato fisiológico da enzima álcool desidrogenase secundária não foi bem acetona e isopropanol (Chen et al. 1995). A desidrogenase do álcool secundário de C. beijerinckii (Cb Adh-S-) é claramente distinta da desidrogenase de álcool primário do mesmo microrganismo, o que reduz in vivo do butiraldeído a butanol.[011] Comparison of the enzymatic activities in C. beijerinckii NRRL B593 and C. beijerinckii NRRL B592 (which, respectively, produces and does not produce isopropanol) showed that the isopropanol excretion capacity was the activity of the alcohol dehydrogenase secondary Cb Adh-s (Y uma et al., 1988). The responsible enzyme was purified from cell-free extracts of C. beijerinckii NRRL B593 (Ismaiel et al. 1993). The C. beijerinckii NEST255 dehydrogenase was also purified for comparison purposes. Secondary alcohol dehydrogenases strains C. beijerinckii NRRL B593 and C. beijerinckii NEST255 are NADP dependent. In vitro, they use as the expected secondary alcohol (isopropanol), but also primary alcohols, in particular butanol, however, with a lower activity. The kinetic study of the enzyme was confirmed that the physiological substrate of the secondary alcohol dehydrogenase enzyme was not well acetone and isopropanol (Chen et al. 1995). The secondary alcohol dehydrogenase of C. beijerinckii (Cb Adh-S-) is clearly distinct from the primary alcohol dehydrogenase of the same microorganism, which reduces butyraldehyde to butanol in vivo.

[012] O gene que codifica para a s-Cb Adh foi sequenciado (Petretz et al. 1997). A estrutura da enzima foi determinada por raios-X s Adh-Cb é uma enzima zinco homotetrameric compreende quatro cadeias polipeptídicas de 351 aminoácidos. Cada monómero consiste em dois campos. O primeiro domínio (resíduos 154-294) permite a fixação do co-factor e a segunda inclui o domínio catalítico (resíduos 1-153 e 295-351) (Korkhin et al 1998. Goihberg et al 2010.). ADH-Cb s está perto de sua contraparte da bactéria termofílica Thermo anaeobacter brockii (ADH-Tb_s) por uma identidade de sequência de 75%. Em termos de propriedades, as duas enzimas diferem na termoestabilidade (Korkin et al. 1999). A substituição de Adh-Cb s GlnlOO ProlOO pela sequência de aminoácidos aumenta significativamente a estabilidade térmica de Cb-s Adh (Goihberg et al. 2007), que é inicialmente menor.[012] The gene that codes for s-Cb Adh has been sequenced (Petretz et al. 1997). The structure of the enzyme was determined by X-ray s Adh-Cb is a homotetrameric zinc enzyme comprising four polypeptide chains of 351 amino acids. Each monomer consists of two fields. The first domain (residues 154-294) allows the fixation of the cofactor and the second includes the catalytic domain (residues 1-153 and 295-351) (Korkhin et al 1998. Goihberg et al 2010.). ADH-Cb s is close to its counterpart from the thermophilic bacterium Thermo anaeobacter brockii (ADH-Tb_s) by a sequence identity of 75%. In terms of properties, the two enzymes differ in thermostability (Korkin et al. 1999). Replacing Adh-Cb s GlnlOO ProlOO with the amino acid sequence significantly increases the thermal stability of Cb-s Adh (Goihberg et al. 2007), which is initially lower.

[013] A capacidade de produção máxima de isopropanol é relativamente baixa (2-3 g / L) com estirpes selvagens de C. beijerinckii (Chen et al, 1986). O pedido de patente US2009/246842 descreve um método para a produção de isopropanol em uma estirpe de E. coli transformada com um vetor de expressão que compreende o gene que codifica a acetil-CoA-transferase C. acetobutylicum Ca_thl), os genes que codificam para acetoacetil-CoA- transferase de C. acetobutylicum (Ca_CtfAB), o gene que codifica para um acetato de descarboxilase (Ca_adc) de C. acetobutylicum e o gene que codifica a desidrogenase de álcool secundário (Cb_s-adh) de C. beijerinckii. Neste vetor, a expressão da enzima álcool desidrogenase secundário está sob o controlo do promotor PLlacO-1 que é indutivel por IPTG, enquanto que a expressão de genes Ca_thl, Ca_CtfAB Ca_adc e está sob o controlo do promotor nativo do gene de C. acetobutylicum Ca_thl. A desvantagem deste método é que é necessário o uso de um meio de produção rico, incluindo extracto de levedura (5 gL-1), e um indutor, tal como IPTG isopropil-ou β- tiogalactopiranósido. Além disso, a desidrogenase do álcool secundário é expresso em apenas qu'IPTG é adicionado no meio de cultura, atrasando assim a produção de isopropanol e limita a produtividade da fermentação. pedido internacional WO 11/037 414 descreve uma outra método capaz de produzir o método isopropanol é utilizar microrganismos do gênero Clostridium transformado por um vetor de expressão que compreende o gene que codifica a descarboxilase de etilo (Ca_adc) de C. acetobutylicum. os genes que codificam para acetoacetil-CoA-transferase. C. acetobutylicum (Ca_CtfAB) e o gene que codifica a desidrogenase de álcool secundário (ADH-Cb s) de C. beijerinckii Este vetor requer dois promotores: um promotor constitutivo Ca_thlp que controlam a expressão de álcool desidrogenase secundário e um promotor indutível Ca_adcp que controla a expressão da proteína Ca_CtfAB e Ca_Adc. Uma vez que as proteínas de Ca_CtfAB e Ca_Adc são expressos apenas durante a fase de solvantogenèse, desidrogenase de álcool secundário tem nenhum substrato (acetona) antes desta fase. Portanto, o isopropanol, o produto final da fermentação, é produzida após 15 horas de cultura, o que limita a produtividade do isopropanol por este método de produção.[013] The maximum production capacity of isopropanol is relatively low (2-3 g / L) with wild strains of C. beijerinckii (Chen et al, 1986). Patent application US2009/246842 describes a method for producing isopropanol in an E. coli strain transformed with an expression vector comprising the gene encoding the acetyl-CoA transferase C. acetobutylicum Ca_thl), the genes encoding for acetoacetyl-CoA-transferase from C. acetobutylicum (Ca_CtfAB), the gene encoding an acetate decarboxylase (Ca_adc) from C. acetobutylicum and the gene encoding the secondary alcohol dehydrogenase (Cb_s-adh) from C. beijerinckii. In this vector, the expression of the secondary alcohol dehydrogenase enzyme is under the control of the PLlacO-1 promoter which is inducible by IPTG, while the expression of Ca_thl, Ca_CtfAB and Ca_adc genes is under the control of the native promoter of the C. acetobutylicum Ca_thl gene. . The disadvantage of this method is that it is necessary to use a rich production medium, including yeast extract (5 gL-1), and an inducer such as isopropyl-IPTG or β-thiogalactopyranoside. Furthermore, secondary alcohol dehydrogenase is expressed only when IPTG is added to the culture medium, thus delaying isopropanol production and limiting fermentation productivity. international application WO 11/037 414 describes another method capable of producing isopropanol method is to use microorganisms of the genus Clostridium transformed by an expression vector comprising the gene encoding ethyl decarboxylase (Ca_adc) of C. acetobutylicum. the genes that code for acetoacetyl-CoA-transferase. C. acetobutylicum (Ca_CtfAB) and the gene encoding secondary alcohol dehydrogenase (ADH-Cb s) from C. beijerinckii This vector requires two promoters: a constitutive Ca_thlp promoter that controls expression of secondary alcohol dehydrogenase and an inducible Ca_adcp promoter that controls the expression of Ca_CtfAB and Ca_Adc protein. Since the Ca_CtfAB and Ca_Adc proteins are expressed only during the solvantogenesis phase, secondary alcohol dehydrogenase has no substrate (acetone) before this phase. Therefore, isopropanol, the final product of fermentation, is produced after 15 hours of culture, which limits the productivity of isopropanol by this production method.

[014] Por conseguinte, ainda há uma necessidade de desenvolver um método para a produção de isopropanol, com uma produtividade melhorada e um melhor desempenho.[014] Therefore, there is still a need to develop a method for producing isopropanol, with improved productivity and better performance.

[015] O objetivo da presente invenção é o de ultrapassar os inconvenientes da técnica anterior e proporcionar um método para a produção de isopropanol por fermentação com uma produtividade melhorada e um melhor desempenho.[015] The objective of the present invention is to overcome the drawbacks of the prior art and provide a method for producing isopropanol by fermentation with improved productivity and better performance.

Description of the Invention

[016] Os inventores descobriram que é possível, com vantagem, a produção de isopropanol utilizando microrganismos recombinantes nos quais vetores foram introduzidos compreendendo os genes que codificam as enzimas da via metabólica que conduzem acetoacetil-CoA à acetona, nomeadamente CoA transferase subunidades ou seja A e B, e descarboxilase de acetoacetato, e o gene que codifica a desidrogenase de álcool secundário de C. beijerinckii NRRL B593.[016] The inventors discovered that it is possible, with advantage, to produce isopropanol using recombinant microorganisms into which vectors were introduced comprising the genes encoding the enzymes of the metabolic pathway that lead acetoacetyl-CoA to acetone, namely CoA transferase subunits i.e. A and B, and acetoacetate decarboxylase, and the gene encoding secondary alcohol dehydrogenase from C. beijerinckii NRRL B593.

[017] O primeiro objetivo da presente invenção visa proporcionar um vetor de expressão que compreende:[017] The first objective of the present invention aims to provide an expression vector comprising:

[018] - os ácidos nucleicos que codificam os polipeptídios que formam um complexo de polipeptídico que possui atividade enzimática que converte acetoacetil-CoA em acetoacetato,[018] - nucleic acids that encode polypeptides that form a polypeptide complex that has enzymatic activity that converts acetoacetyl-CoA into acetoacetate,

[019] - pelo menos um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo contendo uma atividade de enzima para converter a acetona em isopropanol, e[019] - at least one nucleic acid encoding a polypeptide containing an enzyme activity to convert acetone into isopropanol, and

[020] - opcionalmente, pelo menos um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo contendo a atividade enzimática para a conversão de acetoacetato a acetona, a expressão do referido ácido nucleico é controlada por um único promotor constitutivo localizado a montante dos ácidos nucleicos acima mencionados.[020] - optionally, at least one nucleic acid encoding a polypeptide containing enzymatic activity for the conversion of acetoacetate to acetone, the expression of said nucleic acid is controlled by a single constitutive promoter located upstream of the aforementioned nucleic acids.

[021] O termo "vetor de expressão" é uma molécula exógena de DNA de forma circular que é capaz de replicação autônoma e independente do DNA cromossômico da célula hospedeira, permitindo a transcrição e tradução dos genes contidos na referida molécula DNA através das células hospedeiras.[021] The term "expression vector" is an exogenous DNA molecule of circular shape that is capable of autonomous and independent replication of the host cell's chromosomal DNA, allowing the transcription and translation of the genes contained in said DNA molecule through the host cells .

[022] Na presente invenção, o termo "vetor", e o termo "plasmídeo" são intercambiáveis.[022] In the present invention, the term "vector" and the term "plasmid" are interchangeable.

[023] O termo "promotor" se estende a região de DNA onde RNA polimerase se liga e dirige a enzima para o local onde a transcrição do gene será iniciada.[023] The term "promoter" extends to the region of DNA where RNA polymerase binds and directs the enzyme to the site where gene transcription will begin.

[024] Os promotores podem ser constitutivos ou indutíveis.[024] Promoters can be constitutive or inducible.

[025] Um "promotor constitutivo" se entende promotor não regulado que permite a transcrição contínua do gene associado.[025] A "constitutive promoter" is understood to be an unregulated promoter that allows continuous transcription of the associated gene.

[026] Em contraste a um promotor constitutivo, um promotor indutível permite a transcrição do gene associado em resposta a presença de um composto particular, por exemplo, a presença do gene de IPTG, ou a uma condição externa definida, por exemplo a temperatura elevada.[026] In contrast to a constitutive promoter, an inducible promoter allows transcription of the associated gene in response to the presence of a particular compound, for example, the presence of the IPTG gene, or to a defined external condition, for example elevated temperature .

[027] O termo "promotor localizado a montante ácidos nucleicos" entende-se um promotor situado antes das extremidades 5 'dos ácidos nucleicos.[027] The term "promoter located upstream of nucleic acids" is understood to mean a promoter located before the 5' ends of nucleic acids.

[028] A conversão de acetoacetil-CoA em acetoacetato é realizada pela transferase acetoacetil-CoA. Na maioria dos organismos, a enzima é composta de duas subunidades codificadas por dois genes diferentes. Assim, a acetoacetil-CoA-transferase de E. coli (Ato AD) é formada pelo unidades A e D, e acetoacetil-CoA-transferase de C. acetobutylicum (Ca_CtfAB) é formado pelo unidades A e B.[028] The conversion of acetoacetyl-CoA to acetoacetate is carried out by acetoacetyl-CoA transferase. In most organisms, the enzyme is composed of two subunits encoded by two different genes. Thus, acetoacetyl-CoA-transferase from E. coli (Ato AD) is formed by units A and D, and acetoacetyl-CoA-transferase from C. acetobutylicum (Ca_CtfAB) is formed by units A and B.

[029] Numa forma de realização particular, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende:[029] In a particular embodiment, the present invention relates to a vector comprising:

[030] - os ácidos nucleicos codificados para acetoacetil- CoA-transferase (Ca_CtfAB), e[030] - nucleic acids encoded for acetoacetyl-CoA-transferase (Ca_CtfAB), and

[031] - pelo menos um ácido nucleico codificado para o gene da desidrogenase de álcool- secundário C.beijerinckii (Cb_s-adh, e[031] - at least one nucleic acid encoded for the C.beijerinckii secondary alcohol dehydrogenase gene (Cb_s-adh, and

[032] - opcionalmente pelo menos um ácido nucleico que codifica para o gene da descarboxilase de acetoacetato (Ca_adc).[032] - optionally at least one nucleic acid encoding the acetoacetate decarboxylase gene (Ca_adc).

[033] A expressão do gene para desidrogenase de álcool- secundário C. beijerinckii NRRL B 593 assegura a conversão de acetona a isopropanol e a excreção dos mesmos. Uma estirpe recombinante que expressa a enzima pode reduzir quase toda a acetona e acetoina (3-hidroxi-2- butanona) a isopropanol e 2,3 - butanediol respectivamente. Embora seja conhecido que a enzima Cb_s-Adh, para a estirpe C. beijerinckii estirpe NRRL B 593, pode reduzir acetona e butanona, a atividade desta enzima em acetoína é reconhecida pela primeira vez pelos inventores.[033] Expression of the gene for secondary alcohol dehydrogenase C. beijerinckii NRRL B 593 ensures the conversion of acetone to isopropanol and their excretion. A recombinant strain expressing the enzyme can reduce almost all acetone and acetoin (3-hydroxy-2-butanone) to isopropanol and 2,3-butanediol respectively. Although it is known that the enzyme Cb_s-Adh, for the strain C. beijerinckii strain NRRL B 593, can reduce acetone and butanone, the activity of this enzyme on acetoin is recognized for the first time by the inventors.

[034] Numa concretização mais particular, a presente invenção refere-se a um vetor compreendendo:[034] In a more particular embodiment, the present invention relates to a vector comprising:

[035] - um ácido nucleico representado pela sequência SEQ ID NO: 1, ou um ácido nucleico possuindo uma identidade de sequência de pelo menos 85%, particularmente 90%, particularmente 95% da sequência SEQ ID NO: 1, e[035] - a nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 1, or a nucleic acid having a sequence identity of at least 85%, particularly 90%, particularly 95% of the sequence SEQ ID NO: 1, and

[036] - um ácido nucleico representado pela sequência SEQ ID NO: 2 ou um ácido nucleico possuindo uma identidade de sequência de pelo menos 85%, especialmente 90%, em particular 95% com a sequência SEQ ID NO: 2,[036] - a nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 2 or a nucleic acid having a sequence identity of at least 85%, especially 90%, in particular 95% with the sequence SEQ ID NO: 2,

[037] - um ácido nucleico representado pela sequência SEQ ID NO: 3 ou um ácido nucleico possuindo uma identidade de sequência de pelo menos 85%, especialmente 90%, em particular 95% com a sequência SEQ ID NO: 3, e[037] - a nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 3 or a nucleic acid having a sequence identity of at least 85%, especially 90%, in particular 95% with the sequence SEQ ID NO: 3, and

[038] - opcionalmente um ácido nucleico representado pela sequência SEQ ID NO: 4 ou um ácido nucleico possuindo uma identidade de sequência de pelo menos 85%, especialmente 90%, em particular 95% com a sequência SEQ ID NO: 4,[038] - optionally a nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 4 or a nucleic acid having a sequence identity of at least 85%, especially 90%, in particular 95% with the sequence SEQ ID NO: 4,

[039] A sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 1 codifica para a subunidade A da acetoacetil-CoA-transferase de C. acetobutylicum ATCC 824 (Ca_ctfA).[039] The nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 encodes the A subunit of the acetoacetyl-CoA-transferase of C. acetobutylicum ATCC 824 (Ca_ctfA).

[040] A sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 2 codifica a subunidade B da acetoacetil-CoA-transferase de C. acetobutylicum ATCC 824 (Ca_ctfB).[040] The nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 encodes the B subunit of the acetoacetyl-CoA-transferase of C. acetobutylicum ATCC 824 (Ca_ctfB).

[041] A sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 3 codifica a desidrogenase de álcool secundário C. beijerinckii (Cb_s-adh).[041] The nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 encodes the C. beijerinckii secondary alcohol dehydrogenase (Cb_s-adh).

[042] A sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 4 codifica o acetoacetato-descarboxilase de C. acetobutylicum (Ca_adc).[042] The nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 encodes the acetoacetate decarboxylase of C. acetobutylicum (Ca_adc).

[043] A percentagem de identidade entre duas sequências de peptídeos ou entre duas sequências de ácidos nucleicos pode ser calculada usando a fórmula: o número de resíduos idênticos x 100 o número de resíduos da sequência mais curta[043] The percentage of identity between two peptide sequences or between two nucleic acid sequences can be calculated using the formula: the number of identical residues x 100 the number of residues of the shorter sequence

[044] Combinações dos ácidos nucleicos acima mencionados (ou genes) operões de formulário "IPA". A expressão dos genes dos operões ipa são controladas por um único promotor constitutivo localizado a montante dos ácidos nucleicos acima mencionados (ou genes). Um promotor constitutivo, que controla somente a expressão de operões ipa, permite a expressão constitutiva dos mesmos, permitindo assim que uma estirpe contendo um vetor recombinante do invento para a produção de isopropanol a partir das primeiras horas da fermentação.[044] Combinations of the aforementioned nucleic acids (or genes) form "IPA" operons. The expression of the ipa operon genes is controlled by a single constitutive promoter located upstream of the aforementioned nucleic acids (or genes). A constitutive promoter, which controls only the expression of ipa operons, allows their constitutive expression, thus allowing a strain containing a recombinant vector of the invention to produce isopropanol from the first hours of fermentation.

[045] Com a expressão prematura do genes que levam à geração de isopropanol, o mecanismo é accionado anteriormente solvantogenèse numa estirpe que contém um vetor recombinante de acordo com a invenção, em que uma estirpe selvagem.Assim, duas fases de fermentação, isto é, a acidogênese e solvantogenèse, ocorrem simultaneamente numa estirpe que contém um vetor recombinante de acordo com a invenção, o que reduz, pelo menos, 20 horas de tempo de fermentação .[045] With the premature expression of the genes that lead to the generation of isopropanol, the mechanism is triggered previously solvantogenesis in a strain that contains a recombinant vector according to the invention, in which a wild strain. Thus, two phases of fermentation, i.e. , acidogenesis and solvantogenesis, occur simultaneously in a strain that contains a recombinant vector according to the invention, which reduces fermentation time by at least 20 hours.

[046] O promotor constitutivo utilizado na construção do vetor do presente invento pode ser o promotor do gene de tiolase de C. acetobutylicum ATCC 824, representado pela sequência SEQ ID NO: 5, ou o promotor do gene de C. pfiosphotransbutyrylase acetobutylicum ATCC 824, representado pela sequência SEQ ID NO: 6.[046] The constitutive promoter used in the construction of the vector of the present invention may be the promoter of the thiolase gene of C. acetobutylicum ATCC 824, represented by the sequence SEQ ID NO: 5, or the promoter of the gene of C. pfiosphotransbutyrylase acetobutylicum ATCC 824 , represented by the sequence SEQ ID NO: 6.

[047] Em uma forma de realização particular, o vetor da presente invenção, compreende a expressão:[047] In a particular embodiment, the vector of the present invention comprises the expression:

[048] - Um ácido nucleico representado pela sequência SEQ ID ácido NO: 1, ou um ácido nucleico possuindo uma identidade de sequência de pelo menos 85%, especialmente 90%, em particular 95% com a sequência SEQ ID NO: 1, que codifica para a subunidade A de acetoacetil-CoA transferase de C. acetobutylicum e[048] - A nucleic acid represented by the sequence SEQ ID acid NO: 1, or a nucleic acid having a sequence identity of at least 85%, especially 90%, in particular 95% with the sequence SEQ ID NO: 1, which encodes for the A subunit of acetoacetyl-CoA transferase from C. acetobutylicum and

[049] - um ácido nucleico representado pela sequência SEQ ID NO: 2 ou um ácido nucleico possuindo uma identidade de sequência de pelo menos 85%, especialmente 90%, em particular 95% com a sequência SEQ ID NO: 2, que codifica para a subunidade B da acetoacetil-CoA- transferase de C. acetobutylicum, e[049] - a nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 2 or a nucleic acid having a sequence identity of at least 85%, especially 90%, in particular 95% with the sequence SEQ ID NO: 2, which codes for the B subunit of acetoacetyl-CoA-transferase from C. acetobutylicum, and

[050] - opcionalmente, um ácido nucleico representado pela sequência SEQ ID NO: 4 ou um ácido nucleico possuindo uma identidade de sequência de pelo menos 85%, especialmente 90%, em particular 95% com a sequência SEQ ID NO: 4, codificando para acetoacetato de descarboxilase de C. acetobutylicum, e[050] - optionally, a nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 4 or a nucleic acid having a sequence identity of at least 85%, especially 90%, in particular 95% with the sequence SEQ ID NO: 4, encoding for decarboxylase acetoacetate from C. acetobutylicum, and

[051] - um ácido nucleico representado pela sequência SEQ ID NO: 3 ou um ácido nucleico possuindo uma identidade de sequência de pelo menos 85%, especialmente 90%, em particular 95% com a sequência SEQ ID NO: 3, que codifica para a desidrogenase álcool- secundário C. beijerinckii, a expressão do referido ácido nucleico é controlada por um único promotor constitutivo localizados a montante do ácido nucleico acima mencionado, o referido promotor sendo selecionado a partir da sequência do promotor, representada pela SEQ ID NO: 5 (promotor THL) e o promotor representada pela SEQ ID NO: 6.[051] - a nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 3 or a nucleic acid having a sequence identity of at least 85%, especially 90%, in particular 95% with the sequence SEQ ID NO: 3, which codes for the C. beijerinckii secondary alcohol dehydrogenase, the expression of said nucleic acid is controlled by a single constitutive promoter located upstream of the aforementioned nucleic acid, said promoter being selected from the promoter sequence represented by SEQ ID NO: 5 (THL promoter) and the promoter represented by SEQ ID NO: 6.

[052] Em uma forma de realização particular, o vetor da presente invenção compreende:[052] In a particular embodiment, the vector of the present invention comprises:

[053] - um ácido nucleico representado pela sequência SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2[053] - a nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2

[054] - um ácido nucleico representado pela sequência SEQ ID NO: 3,[054] - a nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 3,

[055] - um ácido nucleico representado pela sequência SEQ ID ácido NO:[055] - a nucleic acid represented by the sequence SEQ ID acid NO:

[056] - um 4, e ácido nucleico representado pela sequência NO: 5.[056] - a 4, and nucleic acid represented by the sequence NO: 5.

[057] - um promotor representado pela sequência SEQ ID[057] - a promoter represented by the sequence SEQ ID

[058] Este vetor designado por pFC007 contém, na ordem de 5 'para 3', o gene que codifica a desidrogenase de álcool secundário (ADH- Cb_s) C beijerinckii NRRL B 593 e o gene acetoacetato-descarboxilase (Ca_adc ) e os genes que codificam as subunidades A e B de coenzima A transferase (Ca CtfAB) de C. acetobutylicum ATCC 824. O vetor de sobre- expressão de genes permite pFC007 operon "ipa7" sob o controlo de um único promotor constitutivo, o gene da transferase de acetil-CoA (tiolase, Ca hl) de C. acetobutylicum ATCC 824. Portanto, a produção de suas respectivas enzimas (Cb s-ADH, Ca e Ca CtfAB ADC) começa nas primeiras horas da fermentação (após cerca de 4 a 10 horas).[058] This vector designated pFC007 contains, in the order of 5 'to 3', the gene encoding the secondary alcohol dehydrogenase (ADH-Cb_s) C beijerinckii NRRL B 593 and the acetoacetate-decarboxylase gene (Ca_adc) and the genes which encode subunits A and B of coenzyme A transferase (Ca CtfAB) from C. acetobutylicum ATCC 824. The gene overexpression vector allows pFC007 operon "ipa7" under the control of a single constitutive promoter, the transferase gene from acetyl-CoA (thiolase, Ca hl) from C. acetobutylicum ATCC 824. Therefore, the production of their respective enzymes (Cb s-ADH, Ca and Ca CtfAB ADC) begins in the first hours of fermentation (after about 4 to 10 hours ).

[059] Numa outra forma de realização particular, o vetor da presente invenção compreende: SEQ ID NO: 1[059] In another particular embodiment, the vector of the present invention comprises: SEQ ID NO: 1

[060] - um ácido nucleico representado pela sequência SEQ ID NO: 2,[060] - a nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 2,

[061] - um ácido nucleico representado pela sequência SEQ ID NO: 3, e[061] - a nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 3, and

[062] - um ácido nucleico representado pela sequência NO: 5.[062] - a nucleic acid represented by the sequence NO: 5.

[063] - um promotor representado pela sequência SEQ ID que codifica a[063] - a promoter represented by the SEQ ID sequence that encodes the

[064] Este vetor designado por pFC006 contém o gene desidrogenase de álcool secundário (ADH-Cb_s) de C. beijerinckii NRRL B 593 (DSMZ 6423) e os genes que codificam as subunidades A e B de coenzima A transferase (Ca CtfAB) de C. acetobutylicum ATCC 824. Estes genes estão sob o controlo de um único gene promotor constitutivo acetil-transferase CoA (tiolase ou ou Cajhl) de C. acetobutylicum ATCC 824.[064] This vector designated pFC006 contains the secondary alcohol dehydrogenase gene (ADH-Cb_s) from C. beijerinckii NRRL B 593 (DSMZ 6423) and the genes encoding the A and B subunits of coenzyme A transferase (Ca CtfAB) from C. acetobutylicum ATCC 824. These genes are under the control of a single constitutive acetyl-transferase CoA (thiolase or Cajhl) gene promoter from C. acetobutylicum ATCC 824.

[065] Os vetores de expressão do presente invento podem ainda compreender outros elementos necessários para a transcrição e tradução das enzimas acima referidas, tais como região RBS (sítio de ligação de ribossoma), um ou mais genes selecionados.[065] The expression vectors of the present invention may also comprise other elements necessary for the transcription and translation of the above-mentioned enzymes, such as the RBS region (ribosome binding site), one or more selected genes.

[066] Uma região de ligação permite que o ribossoma RBS para a molécula de mRNA, antes do codão de iniciação de um gene. A sequência da região do RBS usado nos vetores do presente invento pode ser qualquer sequência da região de origem procariótica RBS conhecidos dos peritos na arte.[066] A linker region allows the ribosome to RBS the mRNA molecule, before the start codon of a gene. The RBS region sequence used in the vectors of the present invention can be any prokaryotic RBS origin region sequence known to those skilled in the art.

[067] A presença de um gene de seleção de um vetor da invenção permite seleccionar os microrganismos transformados com sucesso. Um gene de seleção num vetor permite que os microorganismos compreendendo o referido gene de sobreviver em certas condições, ou levar a presença de uma molécula detectável facilmente. O gene de seleção usado nos vetores do presente invento podem ser quaisquer genes de seleção conhecidos pelos especialistas na arte, incluindo um gene que permite microrganismos resistentes a antibióticos, tais como o gene de Amp, ou ermB.[067] The presence of a vector selection gene of the invention makes it possible to select successfully transformed microorganisms. A selection gene in a vector allows microorganisms comprising said gene to survive under certain conditions, or carry the presence of an easily detectable molecule. The selection gene used in the vectors of the present invention can be any selection gene known to those skilled in the art, including a gene that allows antibiotic resistant microorganisms, such as the Amp gene, or ermB.

[068] Os vetores de expressão também incluem origens de replicação, que permitem que a iniciação da replicação do referido vetor nos microrganismos hospedeiros. A origem de replicação utilizadas nos vetores da presente invenção podem ser qualquer fonte conhecida dos peritos na arte.[068] Expression vectors also include origins of replication, which allow the initiation of replication of said vector in host microorganisms. The origin of replication used in the vectors of the present invention can be any source known to those skilled in the art.

[069] A presente invenção também tem como objectivo proporcionar um recombinante para a produção de isopropanol com melhor produtividade e um melhor desempenho do microrganismo.[069] The present invention also aims to provide a recombinant for the production of isopropanol with better productivity and better performance of the microorganism.

[070] O referido microrganismo compreende um vetor de expressão, tal como descrito na presente invenção.[070] Said microorganism comprises an expression vector, as described in the present invention.

[071] Particularmente, o referido microrganismo compreende um vetor compreendendo:[071] Particularly, said microorganism comprises a vector comprising:

[072] - um ácido nucleico representado pela sequência SEQ ID ácido NO: 1, ou um ácido nucleico possuindo uma identidade de sequência de pelo menos 85%, particularmente 90%, particularmente 95% com a sequência SEQ ID NO: 1, e[072] - a nucleic acid represented by the sequence SEQ ID acid NO: 1, or a nucleic acid having a sequence identity of at least 85%, particularly 90%, particularly 95% with the sequence SEQ ID NO: 1, and

[073] - um ácido nucleico representado pela sequência SEQ ID NO: 2 ou um ácido nucleico possuindo uma identidade de sequência de pelo menos 85%, especialmente 90%, em particular 95% com a sequência SEQ ID NO: 2, e[073] - a nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 2 or a nucleic acid having a sequence identity of at least 85%, especially 90%, in particular 95% with the sequence SEQ ID NO: 2, and

[074] - um ácido nucleico representado pela sequência SEQ ID NO: 3 ou um ácido nucleico possuindo uma identidade de sequência de pelo menos 85%, especialmente 90%, em particular 95% com a sequência SEQ ID NO: 3, e[074] - a nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 3 or a nucleic acid having a sequence identity of at least 85%, especially 90%, in particular 95% with the sequence SEQ ID NO: 3, and

[075] - Opcionalmente, um ácido nucleico representado pela sequência SEQ ID NO: 4 ou um ácido nucleico possuindo uma identidade de sequência de pelo menos 85%, especialmente 90%, em particular 95% com a sequência SEQ ID NO: 4,[075] - Optionally, a nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 4 or a nucleic acid having a sequence identity of at least 85%, especially 90%, in particular 95% with the sequence SEQ ID NO: 4,

[076] a expressão do referido ácido nucleico é controlado por um único promotor constitutivo localizados a montante do ácido nucleico acima mencionado, o referido promotor sendo selecionado a partir da sequência do promotor, representada pela SEQ ID NO: 5 (promotor THL) e a sequência do promotor, representada pela SEQ ID NO: 6.[076] the expression of said nucleic acid is controlled by a single constitutive promoter located upstream of the aforementioned nucleic acid, said promoter being selected from the promoter sequence, represented by SEQ ID NO: 5 (THL promoter) and the promoter sequence, represented by SEQ ID NO: 6.

[077] Numa forma de realização vantajosa, o referido microrganismo compreende o vetor pFC007.[077] In an advantageous embodiment, said microorganism comprises the vector pFC007.

[078] Numa outra forma de realização vantajosa, o referido microrganismo compreende o vetor pFC006.[078] In another advantageous embodiment, said microorganism comprises the vector pFC006.

[079] O referido microrganismo da presente invenção pode ser seleccionada a partir de bactérias do gênero Clostridium, tais como C. acetobutylicum, C. beijerinckii, C., C. saccharoperbutyacetonicum saccharobutylicum, bactérias do gênero Bacillus, tais como Bacillus subtilis, ou Enterobacteriaceae, tais como E. coli.[079] Said microorganism of the present invention can be selected from bacteria of the genus Clostridium, such as C. acetobutylicum, C. beijerinckii, C. saccharoperbutyacetonicum, saccharobutylicum, bacteria of the genus Bacillus, such as Bacillus subtilis, or Enterobacteriaceae , such as E. coli.

[080] Em uma forma de realização particular, o microrganismo de acordo com a invenção é C. acetobutylicum.[080] In a particular embodiment, the microorganism according to the invention is C. acetobutylicum.

[081] Numa concretização mais particular, o microrganismo de acordo com a invenção é a C. acetobutylicum ATCC estirpe 824.[081] In a more particular embodiment, the microorganism according to the invention is C. acetobutylicum ATCC strain 824.

[082] Numa forma de realização particularmente vantajosa, a invenção refere-se a uma estirpe recombinante de C. acetobutylicum ATCC 824 que compreende o vetor de pFC007. A estirpe recombinante foi nomeado ATCC 824 (pFC007).[082] In a particularly advantageous embodiment, the invention relates to a recombinant strain of C. acetobutylicum ATCC 824 comprising the pFC007 vector. The recombinant strain was named ATCC 824 (pFC007).

[083] Numa outra forma de realização particularmente vantajosa, a invenção refere-se a uma estirpe recombinante de C. acetobutylicum ATCC 824 compreendendo o vetor pFC006. A estirpe recombinante foi nomeado ATCC 824 (pFC006).[083] In another particularly advantageous embodiment, the invention relates to a recombinant strain of C. acetobutylicum ATCC 824 comprising the vector pFC006. The recombinant strain was named ATCC 824 (pFC006).

[084] Para duas estirpes recombinantes (ATCC 824 (pFC007) e ATCC 824 (pFC006)), a produção de isopropanol pode ser detectada nas primeiras 10 horas de cultura, ao passo que os vestígios de solventes (ABE) não é detectável em a estirpe de tipo selvagem de C. acetobutylicum ATCC 824 ou a estirpe recombinante C. acetobutylicum ATCC 824, que é inserido em um vetor que compreende o gene que codifica a desidrogenase de álcool secundário (ADH-Cb_s) de C. beijerinckii NRRL B 593.[084] For two recombinant strains (ATCC 824 (pFC007) and ATCC 824 (pFC006)), isopropanol production can be detected in the first 10 hours of culture, while traces of solvents (ABE) are not detectable in a wild-type strain of C. acetobutylicum ATCC 824 or the recombinant strain C. acetobutylicum ATCC 824, which is inserted into a vector comprising the gene encoding the secondary alcohol dehydrogenase (ADH-Cb_s) of C. beijerinckii NRRL B 593.

[085] A presente invenção também tem como objetivo proporcionar um método para a produção de isopropanol, e / ou D e L de 2,3- butanodiol, com melhor produtividade e um melhor desempenho.[085] The present invention also aims to provide a method for producing isopropanol, and/or D and L of 2,3-butanediol, with better productivity and better performance.

[086] O referido método compreende, pelo menos, os passos de:[086] Said method comprises, at least, the steps of:

[087] - cultura de um microorganismo de acordo com a invenção em um meio de cultura compreendendo pelo menos uma fonte de carbono e uma fonte de nitrogênio, sob condições que permitem a geração de isopropanol, por exemplo, o meio Cultura descrito por Gapes et al. (Gapes, 1996)[087] - culturing a microorganism according to the invention in a culture medium comprising at least one carbon source and one nitrogen source, under conditions that allow the generation of isopropanol, for example, the Culture medium described by Gapes et al. al. (Gapes, 1996)

[088] - recuperar o isopropanol, e / ou D e L de 2,3- butanediol, o meio de cultura.[088] - recover the isopropanol, and/or D and L of 2,3-butanediol, the culture medium.

[089] Os meios de cultura são conhecidos dos peritos na arte.[089] Culture media are known to those skilled in the art.

[090] A fonte de carbono pode ser amido, glicose, xilose, hidrolisados lignocelulósicos.[090] The carbon source can be starch, glucose, xylose, lignocellulosic hydrolysates.

[091] A fonte de nitrogênio pode ser amónia, extrato de levedura, peptona, ureia.[091] The nitrogen source can be ammonia, yeast extract, peptone, urea.

[092] As condições de cultura do microorganismo do gênero Clostridium, Bacillus ou bactérias E. coli que são conhecidos pelos peritos na arte.[092] The culture conditions of the microorganism of the genus Clostridium, Bacillus or E. coli bacteria are known to those skilled in the art.

[093] A recuperação do isopropanol e / ou L e D 2,3- butanodiol, o meio de cultura é realizada por destilação (2006 Mujiburohman et al.).[093] The recovery of isopropanol and/or L and D 2,3-butanediol from the culture medium is carried out by distillation (2006 Mujiburohman et al.).

[094] Os exemplos e figuras apresentados a seguir ilustram em mais detalhe o presente invento. No entanto, o âmbito da presente invenção não deve, de forma alguma, ser limitado a estes exemplos ou figuras.[094] The examples and figures presented below illustrate the present invention in more detail. However, the scope of the present invention should in no way be limited to these examples or figures.

Figures

[095] Figura 1: Esta figura ilustra a construção do vetor de plasmídeo pMTL500E pFC007.[095] Figure 1: This figure illustrates the construction of the plasmid vector pMTL500E pFC007.

[096] Figura 2: Esta figura mostra os locais de restrição de plasmídeo pMTL500E.[096] Figure 2: This figure shows the restriction sites of plasmid pMTL500E.

[097] Figura 3: Esta figura mostra o mapa de restrição do vetor de pFC007.[097] Figure 3: This figure shows the restriction map of the pFC007 vector.

Examples Materials and methods Equipment and materials

[098] Os kits utilizados nos estudos de biologia molecular (construção de vetores plasmídicos) são mostrados na Tabela 1. Tabela 1: Kits e materiais utilizados nos estudos de biologia molecular [098] The kits used in molecular biology studies (construction of plasmid vectors) are shown in Table 1. Table 1: Kits and materials used in molecular biology studies

[099] As estirpes utilizadas nos exemplos da presente invenção são os seguintes:[099] The strains used in the examples of the present invention are the following:

[100] • C. acetobutylicum ATCC 824, da coleção ATCC[100] • C. acetobutylicum ATCC 824, from the ATCC collection

[101] • C. beijerinckii NRRL B 593, a partir da coleção DSMZ (número 6423)[101] • C. beijerinckii NRRL B 593, from the DSMZ collection (number 6423)

[102] • E. coli XL1 azul, usado para a clonagem e manutenção de plasmídeos[102] • Blue E. coli XL1, used for cloning and maintenance of plasmids

[103] • E. coli DH10B (Pan2), usado para a metilação de plasmídeos.[103] • E. coli DH10B (Pan2), used for methylation of plasmids.

Determination of solvents (acetone, acetoin, isopropanol, butanol, butanediol) and carboxylic acids (acetic and butyric acid)

[104] As amostras de fermentação (2 ml) são centrifugadas durante 5 minutos a 20000 g e os sobrenadantes são utilizados para o ensaio de metabolitos de fermentação (glicose, ácido acético e ácido butírico, 2, 3-butanediol, acetona, etanol, isopropanol e butanol). Para cada amostra, um Equivolume de solução de ácido (0,5 mM de H 2 SO 4 ), contendo o padrão interno (30 mM de ácido 4-metilvalérico) é adicionado, a mistura é homogeneizada e depois filtrada (0,2 μm, whatman). 10μl da amostra é injetada e, em seguida, analisada num lonpack coluna Shodex KC-811 (PR). Os compostos ensaiados foram detectados na saída de coluna através 5 de dois detectores: refractômetro (Waters 2487) e um espectrômetro (Waters 2487), medindo a absorvância a 210 nm. O eluente utilizado é uma solução de ácido sulfúrico a 3 mM, a velocidade de eluição do eluente era de 1 ml / min ea temperatura da coluna é ajustada a 85 ° C.[104] Fermentation samples (2 ml) are centrifuged for 5 minutes at 20000 g and the supernatants are used for the assay of fermentation metabolites (glucose, acetic acid and butyric acid, 2, 3-butanediol, acetone, ethanol, isopropanol and butanol). For each sample, an Equivolume of acid solution (0.5 mM H 2 SO 4 ) containing the internal standard (30 mM 4-methylvaleric acid) is added, the mixture is homogenized and then filtered (0.2 μm , whatman). 10μl of the sample is injected and then analyzed on a Shodex KC-811 (PR) lonpack column. The tested compounds were detected at the column exit using two detectors: a refractometer (Waters 2487) and a spectrometer (Waters 2487), measuring the absorbance at 210 nm. The eluent used is 3 mM sulfuric acid solution, the elution rate of the eluent was 1 ml/min and the column temperature is set at 85 °C.

The construction of vectors

[105] As estruturas genéticas dos vetores utilizados ou construídos nos Exemplos da presente invenção encontram-se resumidos na Tabela 2 abaixo. Tabela 2: Estruturas Genéticas vetores ermB: gene de resistência à eritromicina ampR: gene de resistência à 15 ampicilina; ttc: gene de resistência à tetraciclina, Ca: O prefixo indica que o gene de C. acetobutylicum ATCC 824, Cb: O prefixo indica o gene de C. beijerinckii NRRL B593, Ca hl: tiolase gene; Cb_s-ADH: gene desidrogenase C. secundário beijerinckii NRRL B593; Ca_adc: gene descarboxilase de C. acetobutylicum ATCC 824 acetato; É CtfAB: gene da transferase CoA de C. acetobutylicum ATCC 824.[105] The genetic structures of the vectors used or constructed in the Examples of the present invention are summarized in Table 2 below. Table 2: Vector Genetic Structures ermB: erythromycin resistance gene ampR: ampicillin resistance gene; ttc: tetracycline resistance gene, Ca: The prefix indicates the gene from C. acetobutylicum ATCC 824, Cb: The prefix indicates the gene from C. beijerinckii NRRL B593, Ca hl: thiolase gene; Cb_s-ADH: dehydrogenase gene secondary C. beijerinckii NRRL B593; Ca_adc: C. acetobutylicum ATCC 824 acetate decarboxylase gene; It is CtfAB: CoA transferase gene from C. acetobutylicum ATCC 824.

[106] A construção do vetor pFC007 pMTL500E de plasmídeo (Figura 2) requer pelo menos três passos (Figura 1).[106] Construction of the plasmid pFC007 pMTL500E vector (Figure 2) requires at least three steps (Figure 1).

Step 1: Construction of the pFC002 vector

[107] O vetor pFC002 é construído a partir do plasmídeo pMTL500E. Este último é digerido com as enzimas de restrição Sphl e Xhol no gene lacZ. A digestão é então déphosporylé. Locais de restrição Sphl e Apal são adicionados respectivamente nas extremidades 5 'e 3' da sequência de ADN do promotor PTHL, pela técnica de PCR, utilizando os iniciadores para Ca_thlp-Ca_thlp_rev e a partir do ADN genómico de C. acetobutyliccum ATCC 824 (Nolling, J., et al, 2001) (NCBI referência: NC_003030.1 (http:/yvvww.ncbi.nlm.nih.gov/miccore/NC 00303Q) (Tabela 3) e os locais de restrição Apal são Xhol. adicionados respectivamente nas extremidades 5 'e 3' da sequência de ADN do gene adh-Cb_s C. beijerinckii NRRL B593, pela técnica de PCR, utilizando os iniciadores para Cb_s-adh e Cb-s-ADH-rev (Tabela 3).[107] The pFC002 vector is constructed from the pMTL500E plasmid. The latter is digested with the restriction enzymes Sphl and Xhol in the lacZ gene. Digestion is then déphosporylé. Sphl and Apal restriction sites are added respectively at the 5' and 3' ends of the PTHL promoter DNA sequence, by the PCR technique, using the primers for Ca_thlp-Ca_thlp_rev and from the genomic DNA of C. acetobutyliccum ATCC 824 (Nolling , J., et al, 2001) (NCBI reference: NC_003030.1 (http:/yvvww.ncbi.nlm.nih.gov/miccore/NC 00303Q) (Table 3) and the Apal restriction sites are Xhol. added respectively at the 5' and 3' ends of the DNA sequence of the C. beijerinckii NRRL B593 adh-Cb_s gene, by the PCR technique, using the primers for Cb_s-adh and Cb-s-ADH-rev (Table 3).

[108] O produto de PCR assim obtido foi digerido com as enzimas Apal e restrição Xhol. O plasmídeo digerido, o digerido e o promotor do gene de PCR digeridos foram ligados em conjunto para produzir um vetor designado por pFC002 (fig. 2). Este vetor é mantido e propagado em E. coli XL1 azul.[108] The PCR product thus obtained was digested with Apal and XhoI restriction enzymes. The digested plasmid, digest, and digested PCR gene promoter were ligated together to produce a vector designated pFC002 (Fig. 2). This vector is maintained and propagated in blue E. coli XL1.

Step 2: Construction of the pFC006 pFC002 plasmid vector

[109] PFC002 O vetor é digerido com as enzimas de restrição Xhol e Xbal. Os genes são amplificados em conjunto CtfAB Ca de genômica C. acetobutylicum ATCC 824 DNA, utilizando para Ca e Ca CtfAB CtfAB rev (Tabela 3) primers. O produto de PCR é digerido com as enzimas de restrição Xhol e Spel. PFC002 O vetor digerido e o fragmento de DNA contendo o gene digerido Ca CtfAB são ligados uns aos outros. O vetor assim obtido foi designado por pFC006 (Figura 1). O vetor é mantido e propagado em E. coli XL1 azul.[109] PFC002 The vector is digested with the restriction enzymes Xhol and Xbal. Genes are amplified in CtfAB Ca set from C. acetobutylicum ATCC 824 genomic DNA, using for Ca CtfAB and CtfAB rev (Table 3) primers. The PCR product is digested with the restriction enzymes XhoI and Spel. PFC002 The digested vector and the DNA fragment containing the digested Ca CtfAB gene are ligated together. The vector thus obtained was designated pFC006 (Figure 1). The vector is maintained and propagated in blue E. coli XL1.

Step 3: Construction of the pFC007 pFC006 plasmid vector

[110] PFC006 O vetor é digerido com as enzimas de restrição Xhol e Xbal. A codificação Ca_Adc gene é amplificado a partir de ADN genómico de C. acetobutylicum ATCC 824, utilizando os iniciadores e para Ca_adc Ca_adc rev (Tabela 3). O produto de PCR é digerido com as enzimas XhoI e SpeI. PFC006 O vetor digerido e o fragmento de ADN digerido contendo 10 o gene são ligados uns aos outros Ca_adc. O vetor assim obtido foi designado por pFC007 (Figuras 1 e 3). O vetor é mantido e propagado em E. coli XL1 azul. Tabela 3: Os iniciadores utilizados para os operões construção ipa [110] PFC006 The vector is digested with the restriction enzymes Xhol and Xbal. The gene encoding Ca_Adc is amplified from genomic DNA of C. acetobutylicum ATCC 824 using the primers Ca_adc and for Ca_adc rev (Table 3). The PCR product is digested with the enzymes XhoI and SpeI. PFC006 The digested vector and the digested DNA fragment containing the gene are ligated together Ca_adc. The vector thus obtained was designated pFC007 (Figures 1 and 3). The vector is maintained and propagated in blue E. coli XL1. Table 3: Primers used to construct ipa operons

[111] Sítios de restrição Adicionado (SphI Apal, Xhol Sali, XbaI e SPEL) estão sublinhados. Os locais de ligação ao ribossoma estão indicadas em negrito.[111] Added restriction sites (SphI Apal, Xhol Sali, XbaI and SPEL) are underlined. Ribosome binding sites are indicated in bold.

[112] O prefixo "Ca" indica que o iniciador é usado no ADN genómico de C. acetbutylicum[112] The prefix "Ca" indicates that the primer is used in C. acetbutylicum genomic DNA

[113] Cb O prefixo significa que o iniciador é usado no ADN genómico de C. beijerinckii NR LB 593[113] Cb The prefix means that the primer is used in the genomic DNA of C. beijerinckii NR LB 593

[114] Por métodos semelhantes, o gene que codifica Adc Ca pode ser inserida no vetor para se obter o vetor pFC002 pFC005.[114] By similar methods, the gene encoding Adc Ca can be inserted into the vector to obtain the vector pFC002 pFC005.

[115] De acordo com métodos similares, os genes que codificam CtfAB Ca pode então ser inserido no vetor para se obter o vetor pFC005 pFC008.[115] According to similar methods, the genes encoding CtfAB Ca can then be inserted into the vector to obtain the vector pFC005 pFC008.

Transformation of C. acetobutylicum

[116] Vetores PFC002 e pFC006 pFC007 são metilados primeiro, respectivamente, por co-transformação com PANL plasmídeo na E. coli DH10B.[116] Vectors PFC002 and pFC006 pFC007 are first methylated, respectively, by co-transformation with PANL plasmid in E. coli DH10B.

[117] A estirpe de tipo selvagem de C. acetobutylicum ATCC 824 é então transformado por vetores, respectivamente pFC002, pFC006 e pFC007 metilado de acordo com o protocolo descrito por Oultram (1988). As estirpes de C. acetobutylicum ATCC 824 transformadas por pFC002, pFC006 e pFC007 são denominados ATCC 824 (pFC002) 824 ATCC (pFC006) e ATCC 824 (pFC007), respectivamente.[117] The wild-type strain of C. acetobutylicum ATCC 824 is then transformed by vectors, respectively pFC002, pFC006 and methylated pFC007 according to the protocol described by Oultram (1988). The C. acetobutylicum ATCC 824 strains transformed by pFC002, pFC006 and pFC007 are named ATCC 824 (pFC002) 824 ATCC (pFC006) and ATCC 824 (pFC007), respectively.

Genetic characterization of recombinant strains

[118] Para confirmar a presença de um dos vetores acima descritos em C. acetobutylicum ATCC 824 estirpe após a transformação, um PCR específico do plasmídeo é realizada com o par de iniciadores diferentes. Os resultados apresentados na Tabela 4 confirmam a presença de vetores em estirpes recombinantes analisadas. Tabela 4: Identificação de vetores pFC005, pFC006 ou pFC007 em C. acetobutylicum ATCC 824 por PCR [118] To confirm the presence of one of the above-described vectors in C. acetobutylicum ATCC 824 strain after transformation, a plasmid-specific PCR is performed with the different primer pair. The results presented in Table 4 confirm the presence of vectors in analyzed recombinant strains. Table 4: Identification of pFC005, pFC006 or pFC007 vectors in C. acetobutylicum ATCC 824 by PCR

Fermentation of recombinant strains

[119] As fermentações foram realizadas no meio de cultura descrito por Gapes et al. (GAPES et al., 1996),), contendo 90 g / L de glicose, com estirpes selvagens, C. beijerinckii NPvRL B e C. acetobutylicum 5 ATCC 593 824, e nomeadamente os recombinantes C. acetobutylicum ATCC 824 estirpes respectivamente transformadas pelos vetores e pFC006 pFC007. Os resultados de fermentação são apresentados na Tabela 5. Tabela 5: Desempenho final de glicose por cepas selvagens e recombinantes de C. beijerinckii NRRL B 593 e C. acetobutylicum 10 ATCC 824 * tempo necessário para atingir 95% da produção final de solvente[119] Fermentations were carried out in the culture medium described by Gapes et al. (GAPES et al., 1996),), containing 90 g/L of glucose, with wild-type strains, C. beijerinckii NPvRL B and C. acetobutylicum 5 ATCC 593 824, and notably the recombinant C. acetobutylicum ATCC 824 strains respectively transformed by vectors and pFC006 pFC007. Fermentation results are presented in Table 5. Table 5: Final glucose performance by wild and recombinant strains of C. beijerinckii NRRL B 593 and C. acetobutylicum 10 ATCC 824 * time required to reach 95% of final solvent production

Glucose fermentation by the wild strain C. acetobutylicum ATCC 824

[120] Demora cerca de 50 horas de fermentação, atingindo 95% da produção final de solventes. A presença de solvente (butanol) pode ser detectada 11 horas após a inoculação. Ou isopropanol ou 2,3- butanodiol são produzidos pela estirpe selvagem C. acetobutylicum ATCC 824. A produção de acetona e de acetoína, que atingem, respectivamente, 5,7 g / L e 0,6 g / L. A produção final de butanol e etanol, respectivamente, atingir 9,0 g / L e 1,3 g / L.[120] It takes about 50 hours of fermentation, reaching 95% of the final solvent production. The presence of solvent (butanol) can be detected 11 hours after inoculation. Either isopropanol or 2,3-butanediol are produced by the wild strain C. acetobutylicum ATCC 824. The production of acetone and acetoin, which reach, respectively, 5.7 g/L and 0.6 g/L. The final production of butanol and ethanol, respectively, reach 9.0 g/L and 1.3 g/L.

Glucose fermentation by recombinant C. acetobutylicum ATCC 824 strain (pFC002)

[121] C. acetobutylicum ATCC 824 (pFC002) é uma cepa recombinante que recebeu pFC002 vetoriais. O vetor permite pFC002 no seu hospedeiro, a expressão constitutiva do gene da álcool-desidrogenase do secundário C. beijerinckii NRRL B 593 (Cb_s-adh) de codificação da enzima s- Cb Adh. Produção de s-Adh Cb na cepa recombinante ATCC 824 (pFC002) pode hidrogenar acetona e isopropanol respectivamente acetoína e 2,3- butanodiol. Acetoína é produzida naturalmente pela estirpe selvagem de C. acetobutylicum ATCC 824. No entanto, esta estirpe recombinante não é capaz de produzir isopropanol mais do que a estirpe selvagem de C. beijerinckii NRRL B593. Além disso, a estirpe ATCC 824 (pFC002) tem fermentações desempenho pobre, o isopropanol e da produção em geral e solventes, da estirpe ATCC 824 (pFC002) é inferior a 25% na produção de acetona e 20% na produção de solventes a partir da estirpe selvagem de C. acetobutylicum ATCC 824. Butirato de etilo são os produtos finais de a maioria da fermentação. A grande produção de ácido faz com que a queda de rendimento solventes, em seguida, uma porção de hidrato de carbono é usado na produção de ácidos.[121] C. acetobutylicum ATCC 824 (pFC002) is a recombinant strain that received vector pFC002. The vector allows pFC002 in its host, the constitutive expression of the alcohol dehydrogenase gene of the secondary C. beijerinckii NRRL B 593 (Cb_s-adh) encoding the s-Cb Adh enzyme. Production of s-Adh Cb in the recombinant strain ATCC 824 (pFC002) can hydrogenate acetone and isopropanol, respectively acetoin and 2,3-butanediol. Acetoin is naturally produced by the wild-type strain of C. acetobutylicum ATCC 824. However, this recombinant strain is not capable of producing isopropanol any more than the wild-type strain of C. beijerinckii NRRL B593. Furthermore, strain ATCC 824 (pFC002) has poor performance fermentations, isopropanol and general and solvent production, strain ATCC 824 (pFC002) is less than 25% in acetone production and 20% in solvent production from from the wild strain of C. acetobutylicum ATCC 824. Ethyl butyrate is the end product of most fermentation. The large production of acid causes the solvent yield to drop, so a portion of carbohydrate is used in the production of acids.

Glucose fermentation by recombinant C. acetobutylicum ATCC 824 strain (pFC006)

[122] Como o ATCC estirpe recombinante 824 (pFC002), a estirpe recombinante ATCC 824 (pFC006) produto de isopropanol e 2,3- butanodiol em vez de acetona e de acetoína.[122] Like the ATCC recombinant strain 824 (pFC002), the ATCC recombinant strain 824 (pFC006) produces isopropanol and 2,3-butanediol instead of acetone and acetoin.

[123] No entanto, ao contrário do perfil de produção para a estirpe recombinante ATCC 824 (pFC002) ATCC estirpe recombinante 824 (pFC006) pode atingir um elevado nível de produção de solventes em um tempo mais curto. O tempo necessário para atingir 95% da produção final de solvente para esta estirpe é de cerca de 30 horas. O consumo de ácido butírico é mais eficaz do que a estirpe do tipo selvagem ou a estirpe recombinante ATCC 824 (pFC002), mas continua a ser incompleta. Produção solvente nesta estirpe começa mais cedo do que a estirpe do tipo selvagem ou a estirpe recombinante ATCC 824 (pFC002). A produção de isopropanol pode ser detectada nas primeiras 10 horas de cultura da estirpe ATCC 824 (pFC006), enquanto os traços de solventes ainda não são detectáveis na estirpe de tipo selvagem ATCC 824 ou (pFC002) estirpe.[123] However, unlike the production profile for the ATCC recombinant strain 824 (pFC002) ATCC recombinant strain 824 (pFC006) can achieve a high level of solvent production in a shorter time. The time required to reach 95% of final solvent production for this strain is approximately 30 hours. Consumption of butyric acid is more effective than the wild-type strain or the recombinant strain ATCC 824 (pFC002), but remains incomplete. Solvent production in this strain begins earlier than the wild-type strain or the recombinant strain ATCC 824 (pFC002). Isopropanol production can be detected within the first 10 hours of culture of the ATCC 824 (pFC006) strain, while traces of solvents are not yet detectable in the wild-type ATCC 824 or (pFC002) strain.

[124] Além disso, a incorporação de acetato e de butirato na estirpe ATCC 824 (pFC006) são ambos melhorados, em comparação com os da estirpe selvagem, o que permite ter um desempenho melhor do que em isopropanol o rendimento da acetona a partir da estirpe selvagem. Para ATCC 824 (pFC007) estirpe, a respectivas faixas isopropanol, butanol e etanol é de 7,3 g / L, 11,8 g / L e 1,37 g / L, ou seja, 28 %, 6% e 31 % maior do que os da estirpe selvagem. A produtividade é aumentada em 0,41 g / Lh para uma cepa do tipo selvagem a 0,69 g / Lh para ATCC 824 (pFC007).[124] Furthermore, the incorporation of acetate and butyrate in the ATCC 824 (pFC006) strain are both improved, compared to those in the wild strain, which allows the acetone yield from the wild strain. For ATCC 824 (pFC007) strain, the respective isopropanol, butanol and ethanol ranges are 7.3 g/L, 11.8 g/L and 1.37 g/L, i.e. 28%, 6% and 31% greater than those of the wild strain. Productivity is increased from 0.41 g/Lh for a wild-type strain to 0.69 g/Lh for ATCC 824 (pFC007).

[125] ATCC estirpe 824 (pFC006) produz o dobro de 2,3- butanediol ATCC 824 (pFC002) estirpe, este aumento na produção de 2,3- butanediol pode ser devido a um melhor fluxo metabólico global.[125] ATCC strain 824 (pFC006) produces twice as much 2,3-butanediol as ATCC 824 (pFC002) strain, this increase in 2,3-butanediol production may be due to an improved overall metabolic flux.

[126] Acontece que a melhoria da incorporação de aminoácidos permite ATCC 824 (pFC006) produzem menos ácido e aumentar a sua produção de solventes.[126] It turns out that improving amino acid incorporation allows ATCC 824 (pFC006) to produce less acid and increase its solvent production.

[127] No entanto, não obstante a expressão excessiva de enzima CtfAB Ca, a produção final de etilo foi maior na estirpe ATCC 824 (pFC006) do que na estirpe selvagem, o que pode ser devido a uma elevada produção de ácido devido um fluxo metabólico geral melhorada.[127] However, despite the overexpression of CtfAB Ca enzyme, the final ethyl production was higher in the ATCC 824 (pFC006) strain than in the wild-type strain, which may be due to a high acid production due to a flux Improved overall metabolic rate.

Glucose fermentation by the recombinant strain C. acetobutylicum ATCC 824 transformed by pFC007

[128] A ATCC estirpe 824 (pFC007) tem um perfil semelhante ao da fermentação ATCC estirpe 824 (pFC006). O tempo para atingir 95% da produção final de solventes é inferior a 30 horas. A formação de ácido inicia normalmente. Os solventes na produção de ATCC 824 (pFC007) começa durante a fase exponencial e mais cedo do que na linhagem selvagem. A presença de isopropanol pode ser detectado no meio de cultura da estirpe ATCC 824 (pFC007), 4 horas após a inoculação, de modo que a acetona não é detectável no meio de cultura de uma estirpe selvagem.[128] ATCC strain 824 (pFC007) has a similar fermentation profile to ATCC strain 824 (pFC006). The time to reach 95% of final solvent production is less than 30 hours. Acid formation begins normally. Solvent production of ATCC 824 (pFC007) begins during the exponential phase and earlier than in the wild-type strain. The presence of isopropanol can be detected in the culture medium of strain ATCC 824 (pFC007) 4 hours after inoculation, so that acetone is not detectable in the culture medium of a wild-type strain.

[129] Além disso, a incorporação de acetato e de butirato na ATCC824 (pFC007) são ambos melhorados, em comparação com os da estirpe ATCC 824 (pFC006), o que permite ter um melhor desempenho de isopropanol em comparação com a da estirpe ATCC 824 (pFC006), ou outras estirpes descritas anteriormente. No ATCC 824 (pFC007) estirpe, as respectivas faixas de isopropanol, butanol e etanol é de 8,4 g / L, 13,0 g / L e 1,71 g / L, ou seja, 46 %, 44% e 36% mais elevada do que na estirpe selvagem. O aumento da produtividade de 0,41 g / L. h para a cepa selvagem de 0,81 g / Lh para ATCC 824 (pFC007) tensão.[129] Furthermore, the incorporation of acetate and butyrate in ATCC824 (pFC007) are both improved compared to that of the ATCC 824 (pFC006) strain, which allows it to have better isopropanol performance compared to that of the ATCC strain 824 (pFC006), or other strains described previously. In the ATCC 824 (pFC007) strain, the respective ranges of isopropanol, butanol and ethanol are 8.4 g/L, 13.0 g/L and 1.71 g/L, i.e. 46%, 44% and 36%. % higher than in the wild strain. The productivity increased from 0.41 g/L h for the wild-type strain to 0.81 g/L h for ATCC 824 (pFC007) strain.

[130] A produção de 2,3-butanediol, a estirpe ATCC 824 (pFC007) é semelhante à da estirpe ATCC 824 (pFC006). Tal como acontece com a estirpe ATCC 824 (pFC006), este aumento na produção de 2,3- butanediol pode ser devido a uma melhor fluxo metabólico global.[130] The production of 2,3-butanediol, strain ATCC 824 (pFC007) is similar to that of strain ATCC 824 (pFC006). As with strain ATCC 824 (pFC006), this increase in 2,3-butanediol production may be due to improved overall metabolic flux.

Glucose fermentation by the wild strain C. beijerinckii NRRL B 593

[131] A estirpe selvagem C. beijerinckii NRRL B 593 é cultivada nas mesmas condições que a estirpe C. acetobutylicum ATCC 824 selvagem ou recombinante.[131] The wild-type strain C. beijerinckii NRRL B 593 is cultivated under the same conditions as the wild-type or recombinant C. acetobutylicum ATCC 824 strain.

[132] Após 34 horas de fermentação, a estirpe selvagem de C. beijerinckii atinge 95% da produção final de solventes. No entanto, os produtos finais desta estirpe são apenas de 4,5 g / L de isopropanol, 8,1 g / L para o butanol e 0,1 g / L para a etanol, o qual é menor do que para a estirpe selvagem C. acetobutylicum ATCC 824 e C. acetobutylicum ATCC 824 linhagens recombinantes (824 cepas ATCC (pFC006) e ATCC 824 (pFC007).[132] After 34 hours of fermentation, the wild strain of C. beijerinckii reaches 95% of final solvent production. However, the end products of this strain are only 4.5 g/L for isopropanol, 8.1 g/L for butanol and 0.1 g/L for ethanol, which is less than that for the wild-type strain. C. acetobutylicum ATCC 824 and C. acetobutylicum ATCC 824 recombinant strains (824 strains ATCC (pFC006) and ATCC 824 (pFC007).

[133] Como esperado, a estirpe C. beijerinckii NRRL B 593 selvagem não produz acetoína ou butanediol.[133] As expected, the wild-type C. beijerinckii NRRL B 593 strain does not produce acetoin or butanediol.

Conclusion

[134] As linhagens recombinantes ATCC 824 (pFC006) e ATCC 824 (pFC007) ambos exibindo melhor produtividade de solventes que a estirpe selvagem de C. acetobutylicum ATCC 824 ou a estirpe selvagem C. beijerinckii NRRL B 593. A produtividade de solvente é multiplicada respectivamente por um fator de 1,8, com o ATCC 824 tensão (pFC006) e o fator 2 com o ATCC 824 tensão (pFC007). Estes resultados mostram que as duas estirpes podem produzir mais solventes em um tempo mais curto do que as estirpes selvagens. Além disso, a cepa ATCC 824 (pFC007) mostrou uma boa aptidão para a cultura contínua de fase única (um único fermentador). A produção de isopropanol, etanol e butanol foram observadas naqueles conhecidos para C. beijerinckii estirpe NRRL B 593 (Shrikant A., 2011) e C. acetohutylicum ATCC824 (pFC007) (Godin et al, 1990). Referência bibliográfica Chen JS (1995) Alcohol-Dehydrogenase - Multiplicity and Relatedness in the Solvent-Producing Clostridia. 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Production of isopropanol, ethanol and butanol were observed in those known for C. beijerinckii strain NRRL B 593 (Shrikant A., 2011) and C. acetohutylicum ATCC824 (pFC007) (Godin et al, 1990). Reference Chen JS (1995) Alcohol-Dehydrogenase - Multiplicity and Relatedness in the Solvent-Producing Clostridia. FEMS Microbiol Rev 17:263–273 Chen J-S, Hiu SF (1986) Acetone-butanol-isopropanol production by Clostridium beijerinckii (synonym, Clostridium butylicum). Biotechnol Lett 8:371–376 Gapes JR, Nimcevic D, Friedl A (1996) Long-Term Continuous Cultivation of Clostridium beijerinckii in a Two-Stage Chemostat with On-Line Solvent Removal. Appl Environ Microbiol 62:3210–3219 George HA, Johnson JL, Moore WEC, Holdeman LV, Chen JS (1983) Acetone, Isopropanol, and Butanol Production by Clostridium beijerinckii (syn. Clostridium butylicum) and Clostridium aurantibutyricum. Appl. Environ. 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Claims

1. Expression vector, characterized by comprising: - a nucleic acid represented by the sequence SEQ ID acid NO: 1, or a nucleic acid with the sequence SEQ ID NO: 1, which encodes the A subunit of acetoacetyl-CoA transferase of C acetobutylicum and - a nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 2, which codes for the B subunit of the acetoacetyl-CoA transferase of C. acetobutylicum, and - a nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 3, which codes for secondary alcohol dehydrogenase from C. beijerinckii, - optionally, a nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 4, coding for acetoacetate decarboxylase from C. acetobutylicum, wherein the expression of said nucleic acids is controlled by a single constitutive promoter located upstream of the aforementioned nucleic acids, said promoter being selected from the promoter sequence represented by SEQ ID NO: 5 (THL promoter) and the promoter represented by SEQ ID NO: 6.

2. Expression vector, according to claim 1, characterized in that it comprises: - a nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 1 - a nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 2, - a nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 3 - a nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 4, and - a promoter represented by the sequence SEQ ID NO: 5.

3. Expression vector, according to claim 1, characterized in that it comprises: - a nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 1 - a nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 2, - a nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 3, and - a promoter represented by the sequence SEQ ID NO: 5.

4. Microorganism comprising an expression vector as defined in claims 1 to 3, characterized in that said microorganism is selected from bacteria of the genera Clostridium, Bacillus or Enterobacter.

5. Microorganism according to claim 4, characterized in that it is selected from Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium saccharoperbutyacetonicum, Clostridium saccharobutylicum.

6. Microorganism, according to claim 4, characterized by being Bacillus subtilis.

7. Microorganism, according to claim 4, characterized by being E. coli.

8. Method of producing isopropanol, and/or D and L, 2,3-butanediol, characterized by comprising: . cultivating a microorganism as defined in any one of claims 4 to 7, in a culture medium comprising at least one carbon source and one nitrogen source, under conditions that allow the generation of isopropanol, and recovering the isopropanol, and/or the D and L of 2,3-butanediol, from the culture medium.