BR112013027811B1

BR112013027811B1 - METHOD TO PREPARE A BIOCHIP BY GELIFICATION OF A SOL COMPOSITION

Info

Publication number: BR112013027811B1
Application number: BR112013027811-0A
Authority: BR
Inventors: Jo Minjoung; Lee Seram
Original assignee: Pcl, Inc
Priority date: 2011-04-27
Filing date: 2011-04-27
Publication date: 2022-01-18
Also published as: WO2012148017A1; BR112013027811A2; CN102893149B; JP2014513797A; CN102893149A; JP5770366B2

Abstract

kit sol-gel para fabricação de biochip e método para fabricação de um biochip pelo uso do mesmo a presente invenção refere-se a um método para preparar um chip de proteína por gelificação de uma composição sol. no método, uma mistura de monômeros específicos de silicato, como solb1, solb2 e solb3, solbh, e uma mistura de solbs, água destilada e uma proteína detectora são misturados sequencialmente, de modo de gelificação da composição sol pode ser retardada, induzindo assim a gelificação estável da composição. ainda, o biochip pode ser fabricado de modo simples e fácil através da dispensação da composição sol por uso manual de um arranjador ou uma ferramenta como uma pipeta. além disso, um biochip uniforme pode ser preparado por dispensação da composição sol, solução i (solbh) e solução ii (uma mistura de tampão, solbs, água destilada e uma proteína detectora) sequencialmente sobre um substrato sem necessidade de um processo de pré-tratamento convencional como uma mistura.Sol-Gel Biochip Fabrication Kit and Method for Fabricating a Biochip Using the Same The present invention relates to a method for preparing a protein chip by gelling a sol composition. In the method, a mixture of silicate-specific monomers such as solb1, solb2 and solb3, solbh, and a mixture of solbs, distilled water and a detector protein are mixed sequentially, so gelation of the sol composition can be delayed, thus inducing the stable gelling of the composition. further, the biochip can be manufactured simply and easily by dispensing the sol composition by manual use of an arranger or a tool such as a pipette. Furthermore, a uniform biochip can be prepared by dispensing composition sol, solution i (solbh) and solution ii (a mixture of buffer, solbs, distilled water and a detector protein) sequentially onto a substrate without the need for a pre-processing process. conventional treatment as a mixture.

Description

TECHNICAL FIELD

[001] A presente invenção refere-se a um método para preparar um biochip de um modo simples usando uma composição sol, preparada pela mistura de soluções específicas, sequencialmente, ou por dispensação de ditas soluções, sequencialmente, sobre um substrato sem um processo de pré-tratamento, e a um kit sol-gel para a preparação do biochip.[001] The present invention relates to a method for preparing a biochip in a simple way using a sol composition, prepared by mixing specific solutions, sequentially, or by dispensing said solutions, sequentially, onto a substrate without a process of pre-treatment, and a sol-gel kit for biochip preparation.

STATUS OF THE TECHNIQUE

[002] A tecnologia de biochip é um exemplo representativo de uma nova tecnologia baseada em uma combinação de nanotecnologia (NT), biotecnologia (BT) e tecnologia da informação (IT). Biochips são microarranjos de alta densidade compreendendo uma variedade de biomateriais na superfície de um suporte sólido e podem ser divididos, de acordo com o tipo de biomaterial ligado à superfície do suporte, em um chip de DNA, um chip de proteína, um chip de célula, um chip de neurônio e semelhantes. Ainda, uma combinação de tecnologia de biochip com tecnologia de microfluidos permite o desenvolvimento de tecnologia LOC (lab- on-a-chip - “laboratório em um chip”). A tecnologia de biochip inclui uma técnica de imobilização de um biomaterial, uma técnica para preparar um suporte sólido compatível com um biomaterial, uma técnica para preparar microarranjos de biomaterial, uma técnica de ensaio para a realização de várias reações biológicas em um chip preparado, uma técnica para detectar os resultados da reação, engenharia da proteína de preparação do biomaterial a ser imobilizado, uma técnica de recombinação de gene, e outras semelhantes.[002] Biochip technology is a representative example of a new technology based on a combination of nanotechnology (NT), biotechnology (BT) and information technology (IT). Biochips are high-density microarrays comprising a variety of biomaterials on the surface of a solid support and can be divided, according to the type of biomaterial attached to the surface of the support, into a DNA chip, a protein chip, a cell chip. , a neuron chip and the like. Furthermore, a combination of biochip technology with microfluidic technology allows for the development of LOC (lab-on-a-chip) technology. Biochip technology includes a technique for immobilizing a biomaterial, a technique for preparing a solid support compatible with a biomaterial, a technique for preparing microarrays of a biomaterial, an assay technique for performing various biological reactions on a prepared chip, a technique for detecting reaction results, protein engineering for preparing the biomaterial to be immobilized, a gene recombination technique, and the like.

[003] Um chip de proteína, uma espécie de biochip, é um microarranjo de alta densidade compreendendo uma variedade de proteínas em uma área unitária da superfície de um suporte sólido. Nos anos recentes, tem havido esforços para fabricar chips de proteínas usando os princípios e técnicas para a fabricação de chips de DNA comercialmente disponíveis. Em geral, chips de DNA comercialmente disponíveis são principalmente fabricados por imobilização de DNA em um substrato de vidro, a superfície do qual foi previamente tratada com um material de revestimento. Quando um chip de proteína é fabricado usando um método semelhante a um método usado pra fabricar um chip de DNA, ou seja, quando um chip de proteína é fabricado por imobilização de proteínas em um substrato de vidro, a superfície do qual foi previamente tratada com um material de revestimento, vários problemas surgem devido à diferença nas propriedades físicas e químicas entre as proteínas alvo a serem imobilizadas.[003] A protein chip, a kind of biochip, is a high-density microarray comprising a variety of proteins in a unit area of the surface of a solid support. In recent years, there have been efforts to manufacture protein chips using the principles and techniques for making commercially available DNA chips. In general, commercially available DNA chips are primarily manufactured by immobilizing DNA on a glass substrate, the surface of which has been pre-treated with a coating material. When a protein chip is manufactured using a method similar to a method used to manufacture a DNA chip, i.e. when a protein chip is manufactured by immobilizing proteins on a glass substrate, the surface of which has been previously treated with a coating material, several problems arise due to the difference in physical and chemical properties between the target proteins to be immobilized.

[004] Os chips de proteína anteriores foram produzidos por proteínas de imobilização em um substrato de vidro tratado na superfície e usados para realizar um ensaio de ligação simples. O desempenho do chip de proteína foi determinado pela atividade da proteína imobilizada e foi difícil trabalhar de modo bem sucedido (MacBeath and Schreiber, Science 289:1760, 2000). Ditos problemas são causadas pela desnaturação, inativação e degradação de proteínas que resultam da diferença nas propriedades físicas e químicas inerentes às proteínas. Para superar estes problemas, estudos foram conduzidos em tecnologia de tratamento de superfície para as proteínas de imobilização apropriadas para as características da proteína que são distintas daquelas de DNA e em materiais para proteína de imobilização. Ditos estudos são focados em um método para realizar a imobilização na superfície de um chip de proteína enquanto mantém a atividade da proteína. Exemplos dos mesmos incluem lamínulas revestidas com HydrogelTM (PerkinElmer), Versalinx chip (Prolinx), PDC chip que é um biochip comercialmente disponível de Zyomyx, etc.[004] Previous protein chips were produced by immobilizing proteins on a surface-treated glass substrate and used to perform a single binding assay. The performance of the protein chip was determined by the activity of the immobilized protein and it was difficult to work successfully (MacBeath and Schreiber, Science 289:1760, 2000). Said problems are caused by the denaturation, inactivation and degradation of proteins that result from the difference in physical and chemical properties inherent to proteins. To overcome these problems, studies were conducted in surface treatment technology for appropriate immobilization proteins for protein characteristics that are distinct from those of DNA and in materials for immobilizing protein. Said studies are focused on a method to perform immobilization on the surface of a protein chip while maintaining protein activity. Examples thereof include Hydrogel™ coated coverslips (PerkinElmer), Versalinx chip (Prolinx), PDC chip which is a commercially available biochip from Zyomyx, etc.

[005] Entretanto, um processo sol-gel é uma tecnologia que foi usada para preparar uma microestrutura por microprocessamento. Particularmente, é uma tecnologia que compreende formar uma rede de ligação por um processo suave e biomoléculas de imobilização dentro da rede de ligação pelos métodos além de um método de ligação covalente, ao invés de biomoléculas de ligação química à um material inorgânico (Gill, I. and Ballesteros, A., Trends Biotechnol., 18:282, 2000).[005] However, a sol-gel process is a technology that has been used to prepare a microstructure by microprocessing. In particular, it is a technology that comprises forming a binding network by a gentle process and immobilizing biomolecules within the binding network by methods other than a covalently binding method, rather than chemically binding biomolecules to an inorganic material (Gill, I and Ballesteros, A., Trends Biotechnol., 18:282, 2000).

[006] Além disso, muitas biomoléculas, incluindo enzimas, são imobilizadas em uma matriz de sol-gel massa e usada para fabricar biocatalisadores ou biossensores (Reetz et al., Adv. Mater., 9:943, 1997). Particularmente, estas biomoléculas sãoainda usadas na detecção de desenvolvimento de cor óptica devido às suas propriedades ópticas transparentes (Edminston et al., J. Coll. Interf. Sci., 163:395, 1994). Ainda, biomoléculas são conhecidas não somente por serem quimicamente mas também termicamente estabilizadas quando são imobilizadas em uma matriz sol-gel (Dave et al., Anal. Chem., 66:1120, 1994).[006] In addition, many biomolecules, including enzymes, are immobilized in a mass sol-gel matrix and used to manufacture biocatalysts or biosensors (Reetz et al., Adv. Mater., 9:943, 1997). Particularly, these biomolecules are still used in detecting optical color development because of their transparent optical properties (Edminston et al., J. Coll. Interf. Sci., 163:395, 1994). Furthermore, biomolecules are known not only to be chemically but also thermally stabilized when immobilized in a sol-gel matrix (Dave et al., Anal. Chem., 66:1120, 1994).

[007] No caso de biossensores, a reação sol-gel é usada como um método para formar e padronizar uma microestrutura em um suporte sólido bem como para imobilização simples. Com relação a isto, o método de padronização inclui moldar um sol no estado líquido usando um molde por dinâmica de fluido, gelificando o material formado e removendo o molde, assim, formando um padrão. Por exemplo, uma tecnologia designada como tecnologia de micro- modulação em capilares (MIMIC) é uma técnica para padronizar sílica mesoscópica (Marzolin et al., Adv. Mater. 10:571, 1998; Schuller et al., Appl. Optics 38:5799, 1999). Esta tecnologia pode ser usada em padronização básica de engenharia de micro- fluido.[007] In the case of biosensors, the sol-gel reaction is used as a method to form and pattern a microstructure on a solid support as well as for simple immobilization. In this regard, the patterning method includes molding a sol in the liquid state using a fluid dynamics mold, gelling the formed material and removing the mold, thereby forming a pattern. For example, a technology called capillary micromodulation technology (MIMIC) is a technique for standardizing mesoscopic silica (Marzolin et al., Adv. Mater. 10:571, 1998; Schuller et al., Appl. Optics 38: 5799, 1999). This technology can be used in basic microfluid engineering standardization.

[008] No entanto, uma vez que a atividade de proteína pode ser afetada por vários fatores como pH, é importante para ajustar as condições para a manutenção da atividade adicionando proteína a partir de seu estado sol no processo sol-gel. Para esta finalidade, as tecnologias de padronização de uma proteína por pré-mistura da proteína com um sol usando várias condições suaves como pH neutro (Kim et al., Biotechnol. Bioeng. 73:331 a 337, 2001) foram propostas, mas houve problemas em que o processo sol-gel rapidamente progride em pH neutro e então rachaduras podem ocorrer ou o gel se torna opaco, de acordo com a escolha de aditivos. Além disso, houve um problema que, devido ao processo de pré-tratamento de mistura a proteína com um sol deve ser realizada, a concentração de pontos é possivelmente não uniforme.[008] However, since protein activity can be affected by many factors such as pH, it is important to adjust conditions for the maintenance of activity by adding protein from its sol state in the sol-gel process. To this end, technologies for standardizing a protein by pre-mixing the protein with a sol using various mild conditions such as neutral pH ( Kim et al., Biotechnol. Bioeng. 73:331 to 337, 2001 ) have been proposed, but there have been problems where the sol-gel process rapidly progresses at neutral pH and then cracking can occur or the gel becomes opaque, depending on the choice of additives. Also, there was an issue that due to the pre-treatment process of mixing the protein with a sol must be carried out, the spot concentration is possibly non-uniform.

[009] Nas patentes anteriores em relação aos processos de sol-gel, há uma relacionada a um biochip sol-gel para melhorar a reatividade de um biomaterial, em que o biochip sol-gel é fabricado por uma mistura de sol contendo o biomaterial é submetido à uma relação de gelificação em um substrato chip de modo que o biomaterial é preso nos poros da matriz em gel e encapsulado por poros formados na matriz em gel. Ainda, há patentes que se referem a um método para fabricar um biochip usando um processo sol-gel, o método compreendendo triar uma composição sol para biochips sol-gel, que impede a modificação de um biomaterial imobilizado ou aumenta a sensibilidade do biomaterial. No entanto, houve problemas em que o método de fabricação é complexo e em que, no processo de preparo da composição sol, a atividade do biomaterial é reduzido ou o biomaterial é decomposto.[009] In previous patents regarding sol-gel processes, there is one related to a sol-gel biochip to improve the reactivity of a biomaterial, in which the sol-gel biochip is manufactured by a mixture of sol containing the biomaterial is subjected to a gelling relationship on a chip substrate so that the biomaterial is trapped in the pores of the gel matrix and encapsulated by pores formed in the gel matrix. Further, there are patents that relate to a method for manufacturing a biochip using a sol-gel process, the method comprising screening a sol composition for sol-gel biochips, which prevents modification of an immobilized biomaterial or increases the sensitivity of the biomaterial. However, there were problems where the manufacturing method is complex and where, in the process of preparing the sol composition, the activity of the biomaterial is reduced or the biomaterial is decomposed.

[010] O documento de patente JP2005539215 intitulado Biochip prepared by gelation on a chip substrate descreve um biochip preparado por gelificação, sua preparação e o método de utilização do mesmo. Ao contrário dos biochips anteriormente conhecidos, onde os biomateriais são aderidos covalentamente à superfície do substrato, no biochip da invenção os biomateriais são pontos contidos nos poros de um gel de mancha e encapsulados neste, sendo cada ponto integrado e imobilizado no substrato do chip.[010] The patent document JP2005539215 entitled Biochip prepared by gelation on a chip substrate describes a biochip prepared by gelation, its preparation and its method of use. Unlike previously known biochips, where biomaterials are covalently adhered to the surface of the substrate, in the biochip of the invention the biomaterials are points contained in the pores of a stain gel and encapsulated in it, each point being integrated and immobilized on the chip substrate.

[011] O documento KR20100126994 intitulado Biochip Using Aptamer and Manufacturing Method Thereof diz respeito a um método para preparar um biochip utilizando um aptâmero para aumentar o grau de adesão e melhorar a capacidade de fixação. Tal biochip compreende: um substrato inferior; uma pluralidade de elétrodos condutores salientes; e um aptâmero aderido aos elétrodos salientes e que é usado para detectar um material alvo. O método de preparação do biochip compreende: um passo para formar um elétrodo inferior no substrato inferior; um passo de formação do elétrodo saliente; um passo de formação da parede exterior do substrato inferior para completar um receptáculo; e um passo que adere o aptâmero no elétrodo saliente.[011] Document KR20100126994 entitled Biochip Using Aptamer and Manufacturing Method Thereof concerns a method for preparing a biochip using an aptamer to increase the degree of adhesion and improve the attachment ability. Such a biochip comprises: an inferior substrate; a plurality of projecting conductive electrodes; and an aptamer adhered to the protruding electrodes and which is used to detect a target material. The biochip preparation method comprises: a step of forming a lower electrode on the lower substrate; a protruding electrode forming step; a step of forming the outer wall of the lower substrate to complete a receptacle; and a step which adheres the aptamer to the projecting electrode.

[012] O documento KR20050056517 intitulado Protein Chip Prepared by Using Sol/Gel Method, and Process for Preparing it trata de um chip de proteína fabricado mediante o método sol/gel e o respectivo método de fabricação. O termo “chip de proteína” refere-se a um microchip cuja função consiste em fixar várias amostras de proteínas em um substrato sólido, tal como uma lâmina de vidro ou de silício, para verificar a presença ou ausência de um material alvo que interaja com uma das amostras. Mais particularmente, é formada uma película fina sol-gel porosa na superfície de um substrato sólido, após o que as amostras de proteína são imobilizadas nos poros do filme fino, obtendo-se alta densidade de amostras por unidade de área. Como resultado, a desnaturação de proteínas pode ser reduzida, permitindo o armazenamento a longo prazo.[012] The document KR20050056517 entitled Protein Chip Prepared by Using Sol/Gel Method, and Process for Preparing it deals with a protein chip manufactured using the sol/gel method and the respective manufacturing method. The term “protein chip” refers to a microchip whose function is to fix several samples of proteins on a solid substrate, such as a glass or silicon slide, to verify the presence or absence of a target material that interacts with one of the samples. More particularly, a porous sol-gel thin film is formed on the surface of a solid substrate, after which protein samples are immobilized in the pores of the thin film, obtaining high sample density per unit area. As a result, protein denaturation can be reduced, allowing for long-term storage.

[013] O documento KR20070100836 intitulado Drug Delivery Materials Made by Sol/Gel Technology descreve um processo de fabricação de um material para entrega de fármacos, compreendendo as etapas de: encapsulamento de pelo menos um agente biológico e/ou terapêutico ativo numa cápsula; combinando o agente ativo encapsulado com um sol; e convertendo a combinação resultante num material de entrega de fármacos sólido ou semissólido. A invenção compreende ainda materiais de entrega de fármacos produzidos por tal processo, bem como implantes médicos contendo tais materiais de entrega de fármacos.[013] The document KR20070100836 entitled Drug Delivery Materials Made by Sol/Gel Technology describes a process for manufacturing a drug delivery material, comprising the steps of: encapsulating at least one active biological and/or therapeutic agent in a capsule; combining the encapsulated active agent with a sol; and converting the resulting combination into a solid or semi-solid drug delivery material. The invention further comprises drug delivery materials produced by such a process, as well as medical implants containing such drug delivery materials.

[014] Assim, os presentes inventores realizaram muitos esforços para prevenir a redução na atividade e a decomposição de um biomaterial durante a preparação de uma composição sol e, como resultado, demonstraram que, quando um monômero de silicato específico e aditivos são misturados sequencialmente em uma ordem específica e dispensados sobre um substrato ou quando estes componentes são dispensados sequencialmente diretamente em um substrato e gelificados, a taxa de gelificação do mesmo pode ser atrasada em comparação à dos métodos de fabricação convencionais, assim, tornando possível fabricar um biochip significativamente uniforme, e a redução na atividade e a decomposição de um biomaterial pelos componentes acima pode ser prevenida, portanto, tornando possível fabricar um biochip contendo uma sensibilidade muito alta, e, assim, completando a presente invenção.[014] Thus, the present inventors have made many efforts to prevent the reduction in activity and decomposition of a biomaterial during the preparation of a sol composition, and as a result, have demonstrated that when a specific silicate monomer and additives are sequentially mixed in a specific order and dispensed onto a substrate or when these components are sequentially dispensed directly onto a substrate and gelled, the gelling rate of the same can be delayed compared to conventional manufacturing methods, thus making it possible to manufacture a significantly uniform biochip, and the reduction in activity and decomposition of a biomaterial by the above components can be prevented, therefore, making it possible to manufacture a biochip having a very high sensitivity, and thus completing the present invention.

SUMMARY OF THE INVENTION

[015] É um objetivo principal da presente invenção fornecer um material sol-gel em uma forma de kit de modo que qualquer pessoa possa facilmente preparar e analisar um biochip usando o kit sem necessidade de equipamento ou tecnologia especial.[015] It is a primary objective of the present invention to provide a sol-gel material in a kit form so that anyone can easily prepare and analyze a biochip using the kit without the need for special equipment or technology.

[016] Outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para preparar um biochip uniforme sem qualquer processo de pré- tratamento, estabelecendo um método de preparação em que uma composição sol específica obtida por mistura de soluções sequencialmente é dispensada em um substrato ou em que as soluções são dispensadas sequencialmente diretamente em um substrato.[016] Another objective of the present invention is to provide a method for preparing a uniform biochip without any pre-treatment process, establishing a method of preparation in which a specific sol composition obtained by mixing solutions sequentially is dispensed onto a substrate or in which solutions are sequentially dispensed directly onto a substrate.

[017] Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para analisar um material alvo usando dito biochip.[017] Yet another objective of the present invention is to provide a method for analyzing a target material using said biochip.

[018] Para atingir os objetivos acima, de acordo com uma modalidade da presente invenção, é provido um método para preparar um biochip, o método incluindo as etapas de: misturar líquidos incluindo SolB1, SolB2, SolB3, SolBH e SolBS, sequencialmente, em um kit sol-gel (kit SolB); misturar o líquido misturado com um material detector (por exemplo, proteína); e dispensar a mistura em um substrato.[018] To achieve the above objects, in accordance with an embodiment of the present invention, a method is provided for preparing a biochip, the method including the steps of: mixing liquids including SolB1, SolB2, SolB3, SolBH and SolBS, sequentially, in a sol-gel kit (SolB kit); mixing the mixed liquid with a detector material (e.g. protein); and dispensing the mixture onto a substrate.

[019] De acordo com outra modalidade da presente invenção, é provido um método para preparar um biochip por gelificação de uma composição sol sem qualquer processo de pré-tratamento, o método incluindo as etapas de: dispensar em um substrato uma composição sol que consiste em SolB1, SolB2 e SolB3; dispensar SolBH no substrato; e dispensar no substrato uma solução contendo SolBS, uma proteína detectora e água destilada, e então gelificar as soluções dispensadas.[019] In accordance with another embodiment of the present invention, a method is provided for preparing a biochip by gelling a sol composition without any pre-treatment process, the method including the steps of: dispensing a sol composition into a substrate consisting of in SolB1, SolB2 and SolB3; dispensing SolBH on the substrate; and dispensing a solution containing SolBS, a detector protein and distilled water onto the substrate, and then gelling the dispensed solutions.

[020] Com relação a SolB1, SolB2 e SolB3 no kit SolB, que pode ser usado na preparação do biochip,(i) dito SolB1 pode ser pelo menos um primeiro monômero silicato selecionado do grupo que consiste em metiltrietoxisilano (MTES), etiltrietoxisilano (ETrEOS), silicato de sódio, tetrametil ortosilicato (TMOS), tetraetil ortosilicato (TEOS) e tetrametoxisilicato (TMS);(ii) dito SolB2 pode ser pelo menos um segundo monômero de silicato selecionado do grupo que consiste em 3- aminotrimetoxisilano (3-ATMS), diglicerilsilano (DGS), metiltrimetoxisilicato (MTMS), poliglicerilsilicato (PGS), polivinilacetato, polivinilpirrolidona, gliceril metacrilato, hidroxietil acrilato, N,N-dicusinimidilcarbonato (DSC), 1,3,5-trimetilbenzeno,cetiltrimetilamônio cloreto, cetiltrimetilamônio brometo, 3-(trietoxisili)propil succínico anidreto), N-(3-trietoxisilipropil)-4-hidroxibutilamida (SIT8189.5), N- (trietoxisililpropil)gluconamida (SIT8189.0), plurônico L121 e tetrametil amônio hidróxido; e(iii) dito SolB3 pode ser pelo menos um aditivo selecionado do grupo que consiste em aminopropiltrietoxisilano (APTES), 3-glicidoxipropiltrimetoxisilano (GPTMOS), N- trietoxisililpropil-O-polietileno óxido uretano (PEOU), glicerol, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 e PEG8000.[020] With respect to SolB1, SolB2 and SolB3 in the SolB kit, which can be used in biochip preparation, (i) said SolB1 can be at least a first silicate monomer selected from the group consisting of methyltriethoxysilane (MTES), ethyltriethoxysilane ( ETrEOS), sodium silicate, tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetraethyl orthosilicate (TEOS) and tetramethoxysilicate (TMS); (ii) said SolB2 may be at least a second silicate monomer selected from the group consisting of 3-aminotrimethoxysilane (3- ATMS), diglycerylsilane (DGS), methyltrimethoxysilicate (MTMS), polyglycerylsilicate (PGS), polyvinylacetate, polyvinylpyrrolidone, glyceryl methacrylate, hydroxyethyl acrylate, N,N-dicusinimidylcarbonate (DSC), 1,3,5-trimethylbenzene, cetyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium bromide , 3-(triethoxysily)propyl succinic anhydride, N-(3-triethoxysilypropyl)-4-hydroxybutylamide (SIT8189.5), N-(triethoxysilylpropyl)gluconamide (SIT8189.0), pluronic L121 and tetramethyl ammonium hydroxide; and (iii) said SolB3 may be at least one additive selected from the group consisting of aminopropyltriethoxysilane (APTES), 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMOS), N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (PEOU), glycerol, PEG200, PEG400, PEG600 , PEG1350 and PEG8000.

[021] Em detalhe, a presente invenção ainda fornece um método para preparar um biochip por gelificação de uma composição sol, o método compreendendo as etapas de:(a) adicionar à uma composição sol compreendendo SolB1, SolB2 e SolB3 uma solução SolBH (solução I) selecionada do grupo que consiste em HCl, H2SO4, HNO3 e CH3COOH;(b) misturar a solução da etapa (a) com tampão SolBS e água destilada, e então estabilizar a solução misturada em uma temperatura variando de -20°C a 4°C; e(c) misturar a solução estabilizada da etapa (b) com uma solução contendo um material biológico que interage com o material biológico alvo, dispensando a solução misturada em um substrato e gelificando a solução dispensada,[021] In detail, the present invention further provides a method for preparing a biochip by gelling a sol composition, the method comprising the steps of: (a) adding to a sol composition comprising SolB1, SolB2 and SolB3 a SolBH solution (solution I) selected from the group consisting of HCl, H2SO4, HNO3 and CH3COOH; (b) mixing the solution from step (a) with SolBS buffer and distilled water, and then stabilizing the mixed solution at a temperature ranging from -20°C to 4°C; and (c) mixing the stabilized solution from step (b) with a solution containing a biological material that interacts with the target biological material, dispensing the mixed solution onto a substrate and gelling the dispensed solution,

[022] em que:(i) dita SolB1 é pelo menos um primeiro monômero silicato selecionado do grupo que consiste em metiltrietoxisilano (MTES), etiltrietoxisilano (ETrEOS), silicato de sódio, tetrametil ortosilicato (TMOS), tetraetil ortosilicato (TEOS) e tetrametoxisilicato (TMS);(ii) dita SolB2 é pelo menos um segundo monômero de silicato selecionado do grupo que consiste em 3- aminotrimetoxisilano (3-ATMS), diglicerilsilano (DGS), metiltrimetoxisilicato (MTMS), poliglicerilsilicato(PGS), polivinilacetato, polivinilpirrolidona, gliceril metacrilato, hidroxietil acrilato, N,N-dicusinimidilcarbonato (DSC), 1,3,5-trimetilbenzeno,cetiltrimetilamônio cloreto, cetiltrimetilamônio brometo, 3-(trietoxisili)propil succínico anidreto, N-(3-trietoxisili propil)-4-hidroxi butilamida (SIT8189.5) 50%, N-(trietoxisililpropil)gluconamida (SIT8189.0), plurônico L121 e tetrametil amônio hidróxido; e(iii) dita SolB3 é pelo menos um aditivo selecionado do grupo que consiste em aminopropiltrietoxisilano (APTES), 3-glicidoxipropiltrimetoxisilano (GPTMOS), N-trietoxisililpropil-O-polietileno óxido uretano (PEOU), glicerol, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 e PEG8000.[022] wherein: (i) said SolB1 is at least a first silicate monomer selected from the group consisting of methyltriethoxysilane (MTES), ethyltriethoxysilane (ETrEOS), sodium silicate, tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetraethyl orthosilicate (TEOS) and tetramethoxysilicate (TMS); (ii) said SolB2 is at least a second silicate monomer selected from the group consisting of 3-aminotrimethoxysilane (3-ATMS), diglycerylsilane (DGS), methyltrimethoxysilicate (MTMS), polyglycerylsilicate (PGS), polyvinylacetate, polyvinylpyrrolidone, glyceryl methacrylate, hydroxyethyl acrylate, N,N-dicusinimidylcarbonate (DSC), 1,3,5-trimethylbenzene, cetyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium bromide, 3-(triethoxysily)propyl succinic anhydride, N-(3-triethoxysilylpropyl)-4 -hydroxybutylamide (SIT8189.5) 50%, N-(triethoxysilylpropyl)gluconamide (SIT8189.0), pluronic L121 and tetramethyl ammonium hydroxide; and (iii) said SolB3 is at least one additive selected from the group consisting of aminopropyltriethoxysilane (APTES), 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMOS), N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (PEOU), glycerol, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 and PEG8000.

[023] A presente invenção ainda fornece um método para preparar um biochip por gelificação de uma composição sol, o método compreendendo as etapas de:(a) dispensar no substrato uma composição sol que consiste em SolB1, SolB2 e SolB3 e dispensar SolBH (solução I) selecionada do grupo que consiste em HCl, H2SO4, HNO3 eCH3COOH no substrato em que a composição sol foi dispensada; e (b) dispensar a solução II, compreendendo tampão SolBS, um material biológico que interage com material biológico alvo e água destilada, no substrato em que a solução I foi dispensada, e então gelificar as soluções dispensadas,[023] The present invention further provides a method for preparing a biochip by gelling a sol composition, the method comprising the steps of: (a) dispensing into the substrate a sol composition consisting of SolB1, SolB2 and SolB3 and dispensing SolBH (solution I) selected from the group consisting of HCl, H2SO4, HNO3 and CH3COOH in the substrate on which the sol composition was dispensed; and (b) dispensing solution II, comprising SolBS buffer, a biological material that interacts with target biological material and distilled water, onto the substrate on which solution I was dispensed, and then gelling the dispensed solutions,

[024] em que(i) dita SolB1 é pelo menos um primeiro monômero silicato selecionado do grupo que consiste em metiltrietoxisilano (MTES), etiltrietoxisilano (ETrEOS), silicato de sódio, tetrametil ortosilicato (TMOS), tetraetil ortosilicato(TEOS) e tetrametoxisilicato (TMS);(ii) dita SolB2 é pelo menos um segundo monômero de silicato selecionado do grupo que consiste em 3- aminotrimetoxisilano (3-ATMS), diglicerilsilano (DGS), metiltrimetoxisilicato (MTMS), poliglicerilsilicato(PGS), polivinilacetato, polivinilpirrolidona, gliceril metacrilato, hidroxietil acrilato, N,N-dicusinimidilcarbonato (DSC), 1,3,5-trimetilbenzeno,cetiltrimetilamônio cloreto, cetiltrimetilamônio brometo, 3-(trietoxisili)propil succínico anidreto, N-(3-trietoxisilipropil)-4-hidroxi butilamida (SIT8189.5), N- (trietoxisililpropil)gluconamida (SIT8189.0) 50%,plurônico L121 e tetrametil amônio hidróxido; e (iii) dita SolB3 é pelo menos um aditivo selecionado do grupo que consiste em aminopropiltrietoxisilano (APTES), 3-glicidoxipropiltrimetoxisilano (GPTMOS), N-trietoxisililpropil-O-polietileno óxido uretano (PEOU), glicerol, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 e PEG8000.[024] wherein (i) said SolB1 is at least a first silicate monomer selected from the group consisting of methyltriethoxysilane (MTES), ethyltriethoxysilane (ETrEOS), sodium silicate, tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetraethyl orthosilicate (TEOS) and tetramethoxysilicate (TMS);(ii) said SolB2 is at least a second silicate monomer selected from the group consisting of 3-aminotrimethoxysilane (3-ATMS), diglycerylsilane (DGS), methyltrimethoxysilicate (MTMS), polyglycerylsilicate (PGS), polyvinylacetate, polyvinylpyrrolidone , glyceryl methacrylate, hydroxyethyl acrylate, N,N-dicusinimidylcarbonate (DSC), 1,3,5-trimethylbenzene, cetyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium bromide, 3-(triethoxysily)propyl succinic anhydride, N-(3-triethoxysilypropyl)-4-hydroxy butylamide (SIT8189.5), N-(triethoxysilylpropyl)gluconamide (SIT8189.0) 50%, pluronic L121 and tetramethyl ammonium hydroxide; and (iii) said SolB3 is at least one additive selected from the group consisting of aminopropyltriethoxysilane (APTES), 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMOS), N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (PEOU), glycerol, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 and PEG8000.

[025] A presente invenção ainda fornece um kit para preparar um biochip, em que o kit é usado em dito método de preparação e inclui um primeiro recipiente contendo pelo menos um primeiro monômero silicato, SolB1, selecionado do grupo que consiste em metiltrietoxisilano (MTES), etiltrietoxisilano (ETrEOS), silicato de sódio, tetrametil ortosilicato (TMOS), tetraetil ortosilicato (TEOS) e tetrametoxisilicato (TMS);um segundo recipiente contendo pelo menos um segundo monômero silicato, SolB2, selecionado do grupo que consiste em 3-aminotrimetoxisilano (3-ATMS), diglicerilsilano (DGS), metiltrimetoxisilicato (MTMS), poliglicerilsilicato (PGS), polivinilacetato, polivinilpirrolidona, gliceril metacrilato, hidroxietil acrilato, N,N-dicusinimidilcarbonato (DSC), 1,3,5- trimetilbenzeno, cetiltrimetilamônio cloreto,cetiltrimetilamônio brometo, 3-(trietoxisili)propil succínico anidreto, N-(3-trietoxisili propil)-4-hidroxi butilamida (SIT8189.5), N-(trietoxisililpropil)gluconamida (SIT8189.0), plurônico L121 e tetrametil amônio hidróxido; um terceiro recipiente contendo pelo menos um aditivo,SolB3, selecionado do grupo que consiste em aminopropiltrietoxisilano (APTES), 3-glicidoxipropiltrimetoxisilano (GPTMOS), N-trietoxisililpropil- O-polietileno óxido uretano (PEOU), glicerol, PEG200, PEG400,PEG600, PEG1350 e PEG8000;um quarto recipiente contendo SolBH selecionado do grupo que consiste em HCl, H2SO4, HNO3 e CH3COOH; eum quinto recipiente contendo tampão SolBS,em que SolBH selecionado do grupo que consiste em HCl, H2SO4, HNO3 e CH3COOH, tampão SolBS, água destilada e biological material que interage com material biológico alvo são adicionados sequencialmente à uma composição sol que consiste em SolB1, SolB2 e SolB3 de modo que a composição sol é gelificada.[025] The present invention further provides a kit for preparing a biochip, wherein the kit is used in said method of preparation and includes a first container containing at least a first silicate monomer, SolB1, selected from the group consisting of methyltriethoxysilane (MTES ), ethyltriethoxysilane (ETrEOS), sodium silicate, tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetraethyl orthosilicate (TEOS) and tetramethoxysilicate (TMS); a second container containing at least a second silicate monomer, SolB2, selected from the group consisting of 3-aminotrimethoxysilane (3-ATMS), diglycerylsilane (DGS), methyltrimethoxysilicate (MTMS), polyglycerylsilicate (PGS), polyvinylacetate, polyvinylpyrrolidone, glyceryl methacrylate, hydroxyethyl acrylate, N,N-dicusinimidylcarbonate (DSC), 1,3,5-trimethylbenzene, cetyltrimethylammonium chloride , cetyltrimethylammonium bromide, 3-(triethoxysilyl)propyl succinic anhydride, N-(3-triethoxysilylpropyl)-4-hydroxybutylamide (SIT8189.5), N-(triethoxysilylpropyl)gluconamide (SIT8189.0), pl uronic L121 and tetramethyl ammonium hydroxide; a third container containing at least one additive, SolB3, selected from the group consisting of aminopropyltriethoxysilane (APTES), 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMOS), N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (PEOU), glycerol, PEG200, PEG400,PEG600, PEG1350 and PEG8000; a fourth vessel containing SolBH selected from the group consisting of HCl, H2SO4, HNO3 and CH3COOH; and a fifth container containing SolBS buffer, in which SolBH selected from the group consisting of HCl, H2SO4, HNO3 and CH3COOH, SolBS buffer, distilled water and biological material that interacts with biological target material are sequentially added to a sol composition consisting of SolB1, SolB2 and SolB3 so that the sol composition is gelled.

[026] A presente invenção ainda fornece um biochip, preparado usando dito método de preparação e composição sol, um método para analisar um biomaterial alvo usando o biochip e um método para analisar um material biológico alvo, o método compreendendo uma etapa de adicionar uma amostra, que contém o material biológico alvo capaz de interagir com o material biológico que interage com material biológico alvo, ao biochip preparado pelo método.[026] The present invention further provides a biochip, prepared using said method of preparation and sol composition, a method for analyzing a target biomaterial using the biochip and a method for analyzing a target biological material, the method comprising a step of adding a sample , which contains the target biological material capable of interacting with the biological material that interacts with the target biological material, to the biochip prepared by the method.

BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

[027] A FIG. 1 mostra um biochip fabricado por dispensação de uma solução sol misturada da composição sol inventiva (S-Sol), solução I e solução II usando um arranjador.[027] FIG. 1 shows a biochip manufactured by dispensing a mixed sol solution of the inventive sol composition (S-Sol), solution I and solution II using an arranger.

[028] A FIG. 2 mostra uma resposta ao soro de um paciente HIV em pontos incluindo cinco antígenos HIV1 (1, 2, 3, 4 e 5 são marcadores para diagnóstico de anticorpo HIV1 e são p24, p31, gp41, gp120 e gp160, respectivamente).[028] FIG. 2 shows an HIV patient serum response at points including five HIV1 antigens (1, 2, 3, 4, and 5 are markers for HIV1 antibody diagnosis and are p24, p31, gp41, gp120, and gp160, respectively).

[029] A FIG. 3 mostra as respostas às diluições seriais do soro de um paciente HIV em pontos incluindo diluições seriais de antígeno.[029] FIG. 3 shows responses to serial dilutions of an HIV patient's serum at points including serial dilutions of antigen.

[030] A FIG. 4 é um gráfico que mostra os resultados da quantificação de uma resposta à um soro HIV padrão em pontos incluindo cada um dos cinco antígenos HIV1 (1, 2, 3, 4 e 5 são marcadores para diagnóstico de anticorpo HIV1 e são p24, p31, gp41, gp120 e gp160, respectivamente).[030] FIG. 4 is a graph showing the results of quantifying a response to a standard HIV serum at points including each of the five HIV1 antigens (1, 2, 3, 4 and 5 are markers for HIV1 antibody diagnosis and are p24, p31, gp41, gp120 and gp160, respectively).

[031] A FIG. 5 é uma tabela que mostra uma comparação dos resultados de detecção realizada usando o chip de proteína inventivo e um kit diagnóstico convencional com relação ao soro de paciente HIV1 coletado em vários dias após a infecção.[031] FIG. 5 is a table showing a comparison of detection results performed using the inventive protein chip and a conventional diagnostic kit against HIV1 patient serum collected several days after infection.

[032] A FIG. 6 mostra uma fotografia Axon GenePix scanner (A) e fotografia de imagem de câmera (B) de um chip fabricado usando sciFLEXARRYER S11.[032] FIG. 6 shows an Axon GenePix scanner photograph (A) and camera image photograph (B) of a chip manufactured using sciFLEXARRYER S11.

[033] A FIG. 7 mostra esquematicamente a configuração do chip de proteína inventiva, que contém proteínas detectoras em estruturas encapsuladas em micro-canais na superfície.[033] FIG. 7 schematically shows the configuration of the inventive protein chip, which contains detector proteins in structures encapsulated in microchannels on the surface.

[034] A FIG. 8 é um conjunto de fotografias que mostra uma comparação de uniformidade entre o biochip inventivo (direita) e um biochip convencional (esquerda).[034] FIG. 8 is a set of photographs showing a uniformity comparison between the inventive biochip (right) and a conventional biochip (left).

[035] A FIG. 9 é um conjunto de fotografias que mostra uma comparação de uniformidade e taxa de gelificação entre a mistura sol inventiva (A) e uma mistura sol (B) obtida por misturar aleatoriamente soluções.[035] FIG. 9 is a set of photographs showing a comparison of uniformity and gelation rate between the inventive sol mixture (A) and a sol mixture (B) obtained by randomly mixing solutions.

[036] A FIG. 10 mostra os resultados de análise de uma proteína específica usando um chip de proteína de acordo com a presente invenção.[036] FIG. 10 shows the results of analysis of a specific protein using a protein chip in accordance with the present invention.

[037] A FIG. 11 mostra os resultados de análise de um antígeno específico usando um chip de proteína de acordo com a presente invenção.[037] FIG. 11 shows the results of analysis of a specific antigen using a protein chip in accordance with the present invention.

[038] A FIG. 12 mostra os resultados de análise de um anticorpo contra uma doença específica usando um chip de proteína de acordo com a presente invenção.[038] FIG. 12 shows the results of analyzing an antibody against a specific disease using a protein chip in accordance with the present invention.

[039] A FIG. 13 mostra os resultados de avaliação de ligação entre um composto específico (bisfenol A) e um aptâmero de DNA usando um chip sol-gel de acordo com a presente invenção.[039] FIG. 13 shows the results of evaluating binding between a specific compound (bisphenol A) and a DNA aptamer using a sol-gel chip in accordance with the present invention.

[040] A FIG. 14 é uma imagem de um produto comercial compreendendo um chip sol-gel de proteína de acordo com a presente invenção.[040] FIG. 14 is an image of a commercial product comprising a protein sol-gel chip in accordance with the present invention.

DETAILED DESCRIPTION AND PREFERRED MODALITY

[041] Deste ponto em diante, a presente invenção será descrita em detalhes.[041] From this point forward, the present invention will be described in detail.

[042] Em um aspecto, a presente invenção é direcionada à um método para preparar um biochip por gelificação de uma composição sol, o método compreendendo as etapas de:(a) adicionar à uma composição sol compreendendo SolB1, SolB2 e SolB3 uma solução SolBH (solução I) selecionada do grupo que consiste em HCl, H2SO4, HNO3 e CH3COOH;(b) misturar a solução da etapa (a) com tampão SolBS e água destilada, e então estabilizar a solução misturada em uma temperatura variando de -20°C a 4°C; e(c) misturar a solução estabilizada da etapa (b) com a solução contendo um material biológico que interage com material biológico alvo, dispensando a solução misturada em um substrato e gelificar a solução dispensada,[042] In one aspect, the present invention is directed to a method for preparing a biochip by gelling a sol composition, the method comprising the steps of: (a) adding to a sol composition comprising SolB1, SolB2 and SolB3 a SolBH solution (solution I) selected from the group consisting of HCl, H2SO4, HNO3 and CH3COOH; (b) mix the solution from step (a) with SolBS buffer and distilled water, and then stabilize the mixed solution at a temperature ranging from -20° C to 4°C; and (c) mixing the stabilized solution from step (b) with the solution containing a biological material that interacts with target biological material, dispensing the mixed solution on a substrate and gelling the dispensed solution,

[043] em que(i) dita SolB1 é pelo menos um primeiro monômero silicato selecionado do grupo que consiste em metiltrietoxisilano (MTES), etiltrietoxisilano (ETrEOS), silicato de sódio, tetrametil ortosilicato (TMOS), tetraetil ortosilicato (TEOS) e tetrametoxisilicato (TMS);(ii) dita SolB2 é pelo menos um segundo monômero de silicato selecionado do grupo que consiste em 3- aminotrimetoxisilano (3-ATMS), diglicerilsilano (DGS), metiltrimetoxisilicato (MTMS), poliglicerilsilicato(PGS), polivinilacetato, polivinilpirrolidona, gliceril metacrilato, hidroxietil acrilato, N,N-dicusinimidilcarbonato (DSC), 1,3,5-trimetilbenzeno,cetiltrimetilamônio cloreto, cetiltrimetilamônio brometo, 3-(trietoxisili)propil succínico anidreto, N-(3-trietoxisili propil)-4-hidroxi butilamida (SIT8189.5) 50%, N-(trietoxisililpropil)gluconamida (SIT8189.0), plurônico L121 e tetrametil amônio hidróxido; e(iii) dita SolB3 é pelo menos um aditivo selecionado do grupo que consiste em aminopropiltrietoxisilano (APTES), 3-glicidoxipropiltrimetoxisilano (GPTMOS), N-trietoxisililpropil-O-polietileno óxido uretano (PEOU), glicerol, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 e PEG8000.[043] wherein (i) said SolB1 is at least a first silicate monomer selected from the group consisting of methyltriethoxysilane (MTES), ethyltriethoxysilane (ETrEOS), sodium silicate, tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetraethyl orthosilicate (TEOS) and tetramethoxysilicate (TMS);(ii) said SolB2 is at least a second silicate monomer selected from the group consisting of 3-aminotrimethoxysilane (3-ATMS), diglycerylsilane (DGS), methyltrimethoxysilicate (MTMS), polyglycerylsilicate (PGS), polyvinylacetate, polyvinylpyrrolidone , glyceryl methacrylate, hydroxyethyl acrylate, N,N-dicusinimidylcarbonate (DSC), 1,3,5-trimethylbenzene, cetyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium bromide, 3-(triethoxysily)propyl succinic anhydride, N-(3-triethoxysily propyl)-4- 50% hydroxy butylamide (SIT8189.5), N-(triethoxysilylpropyl)gluconamide (SIT8189.0), pluronic L121 and tetramethyl ammonium hydroxide; and (iii) said SolB3 is at least one additive selected from the group consisting of aminopropyltriethoxysilane (APTES), 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMOS), N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (PEOU), glycerol, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 and PEG8000.

[044] Na presente invenção, a SolBH preferencialmente tem uma concentração variando de 1 mM a 100 mM.[044] In the present invention, SolBH preferably has a concentration ranging from 1 mM to 100 mM.

[045] Na presente invenção, a SolBS pode ser pelo menos uma solução selecionada do grupo que consiste em NaH2PO4, Na2HPO4, e Na3PO4, que tem uma concentração variando de 1 mM a 100 mM.[045] In the present invention, SolBS can be at least one solution selected from the group consisting of NaH2PO4, Na2HPO4, and Na3PO4, which has a concentration ranging from 1 mM to 100 mM.

[046] Um método convencional para fabricar um biochip usando um processo sol-gel compreende misturar a composição sol, tampão e um material biológico que interage com material biológico alvo em ordem aleatória para preparar uma solução sol misturada, submeter a solução sol misturada à pós-tratamento como processo de vácuo, e gelificar a solução pós-tratada. Os métodos de mistura da composição sol, tampão e a proteína detectora incluem vortexar ou mistura ultrassônica, e os métodos para preparar formas sol-gel incluem um método para formar pontos em uma placa de poço de substrato, um método para revestir a superfície do substrato com uma solução sol-gel, ou um método para verter uma solução sol-gel em um molde e gelificar a solução vertida.[046] A conventional method for fabricating a biochip using a sol-gel process comprises mixing the sol composition, buffer and a biological material that interacts with target biological material in random order to prepare a sol-mixed solution, subjecting the sol-mixed solution to powders. -treatment as a vacuum process, and gelling the post-treated solution. Methods of mixing the sol, buffer and detector protein composition include vortexing or ultrasonic mixing, and methods of preparing sol-gel forms include a method of forming dots on a substrate well plate, a method of coating the surface of the substrate with a sol-gel solution, or a method of pouring a sol-gel solution into a mold and gelling the poured solution.

[047] Em ditos métodos, a concentração do material biológico que interage com material biológico alvo pode ser diferente entre os pontos formados da solução sol misturada e podem variar dependendo dos operadores. Ainda, a possibilidade de contaminação durante o processo de mistura é alto, e a viscosidade da mistura sol-gel pode ser diferente entre as amostras, e assim, o grau de formação de pontos, e o formato e tamanho dos pontos podem ser diferentes entre as amostras. Por esta razão, houve uma necessidade para um método capaz de preparar um biochip uniforme que pode superar ditos problemas.[047] In said methods, the concentration of the biological material that interacts with the target biological material can be different between the formed points of the mixed sol solution and can vary depending on the operators. Also, the possibility of contamination during the mixing process is high, and the viscosity of the sol-gel mixture may be different between samples, and thus, the degree of dot formation, and the shape and size of the dots may be different between samples. the samples. For this reason, there has been a need for a method capable of preparing a uniform biochip that can overcome these problems.

[048] De acordo com o método inventivo para preparar o biochip, o biochip é preparado usando um processo sol-gel simples, e a concentração do material biológico que interage com material biológico alvo é uniforme em todos os pontos, assim, tornando possível detectar proteína em alta eficiência em um modo mais preciso.[048] According to the inventive method for preparing the biochip, the biochip is prepared using a simple sol-gel process, and the concentration of the biological material that interacts with the target biological material is uniform at all points, thus making it possible to detect protein at high efficiency in a more accurate way.

[049] Uma modalidade do método inventivo para preparar o biochip será agora descrito em detalhe.[049] An embodiment of the inventive method for preparing the biochip will now be described in detail.

[050] Inicialmente, o primeiro monômero silicato SolB1, o segundo monômero silicato SolB2 e o aditivo SolB3 são misturados sequencialmente para preparar uma composição sol.[050] Initially, the first silicate monomer SolB1, the second silicate monomer SolB2 and the additive SolB3 are mixed sequentially to prepare a sol composition.

[051] A SolB1 que é usada na presente invenção é um ou mais compostos selecionados do grupo que consiste em metiltrietoxisilano (MTES), etiltrietoxisilano (ETrEOS), silicato de sódio, tetrametil ortosilicato (TMOS), tetraetil ortosilicato (TEOS) e tetrametoxisilicato (TMS). Em um Exemplo da presente invenção, TEOS foi usado como o primeiro monômero silicato.[051] The SolB1 that is used in the present invention is one or more compounds selected from the group consisting of methyltriethoxysilane (MTES), ethyltriethoxysilane (ETrEOS), sodium silicate, tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetraethyl orthosilicate (TEOS) and tetramethoxysilicate ( TMS). In an Example of the present invention, TEOS was used as the first silicate monomer.

[052] A SolB2 que é usada na presente invenção é um ou mais compostos selecionados do grupo que consiste em 3- aminotrimetoxisilano (3-ATMS), diglicerilsilano (DGS), metiltrimetoxisilicato (MTMS), poliglicerilsilicato (PGS), polivinilacetato, polivinilpirrolidona, gliceril metacrilato, hidroxietil acrilato, N,N-dicusinimidilcarbonato (DSC), 1,3,5- trimetilbenzeno, cetiltrimetilamônio cloreto, cetiltrimetilamônio brometo, 3-3-(trietoxisili)propil succínico anidreto, N-(3-trietoxisilipropil)-4-hidroxi butilamida (SIT8189.5), N-(trietoxisililpropil)gluconamida (SIT8189.0), plurônico L121 e tetrametil amônio hidróxido. Em um Exemplo da presente invenção, DGS foi usado como o segundo monômero silicato.[052] The SolB2 that is used in the present invention is one or more compounds selected from the group consisting of 3-aminotrimethoxysilane (3-ATMS), diglycerylsilane (DGS), methyltrimethoxysilicate (MTMS), polyglycerylsilicate (PGS), polyvinylacetate, polyvinylpyrrolidone, glyceryl methacrylate, hydroxyethyl acrylate, N,N-dicusinimidylcarbonate (DSC), 1,3,5-trimethylbenzene, cetyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium bromide, 3-3-(triethoxysily)propyl succinic anhydride, N-(3-triethoxysilypropyl)-4- hydroxy butylamide (SIT8189.5), N-(triethoxysilylpropyl)gluconamide (SIT8189.0), pluronic L121 and tetramethyl ammonium hydroxide. In an Example of the present invention, DGS was used as the second silicate monomer.

[053] Ainda, a SolB3, um aditivo que é usado na presente invenção, pode ser um ou mais compostos selecionados do grupo que consiste em aminopropiltrietoxisilano (APTES), 3- glicidoxipropiltrimetoxisilano (GPTMOS), N-trietoxisililpropil- O-polietileno óxido uretano (PEOU), glicerol, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 e PEG8000. Em um Exemplo da presente invenção, PEG foi usado como o aditivo SolB3.[053] Further, SolB3, an additive that is used in the present invention, may be one or more compounds selected from the group consisting of aminopropyltriethoxysilane (APTES), 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMOS), N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (PEOU), glycerol, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 and PEG8000. In an Example of the present invention, PEG was used as the SolB3 additive.

[054] O primeiro monômero silicato, o segundo monômero silicato e o aditivo podem ser apropriadamente selecionados dependendo das propriedades de um biomaterial a ser colocado nos monômeros ou na configuração de um chip sol-gel a ser preparado.[054] The first silicate monomer, the second silicate monomer and the additive can be appropriately selected depending on the properties of a biomaterial to be placed in the monomers or the configuration of a sol-gel chip to be prepared.

[055] A composição sol para preparar o biochip de acordo com a presente invenção preferencialmente compreende, baseado no volume total da composição sol, cerca de 2-30 %vol do primeiro monômero silicato, cerca de 2-8 %vol do segundo monômero silicato, e 0-5 %vol do aditivo. Devido à inalação da composição sol ter um efeito danoso no corpo humano, a preparação da composição sol é realizada em condições de boa ventilação.[055] The sol composition for preparing the biochip according to the present invention preferably comprises, based on the total volume of the sol composition, about 2-30 vol% of the first silicate monomer, about 2-8 vol% of the second silicate monomer , and 0-5 vol% of the additive. Because the inhalation of the sol composition has a harmful effect on the human body, the preparation of the sol composition is carried out under conditions of good ventilation.

[056] A composição sol inventiva para preparar o biochip é caracterizada pelo fato de que micro-canais são formados devido aos poros quando a composição é gelificada. Ou seja, ditos canais fornecem meios capazes de interagir com um material alvo a ser analisado. Particularmente, o aditivo (iii) serve para controlar o tamanho de micro-canais no gel.[056] The inventive sol composition for preparing the biochip is characterized by the fact that micro-channels are formed due to pores when the composition is gelled. That is, said channels provide means capable of interacting with a target material to be analyzed. Particularly, the additive (iii) serves to control the size of microchannels in the gel.

[057] Na presente invenção, uma técnica de hand-spotting é realizada sem o uso de qualquer arranjador ou um arranjador sem contato é usado.[057] In the present invention, a hand-spotting technique is performed without the use of any arranger or a non-contact arranger is used.

[058] Na presente invenção, o substrato pode ser otimizado em uma temperatura superior à do ponto de orvalho antes de seu uso, e “uma temperatura maior do que o ponto de orvalho” é uma temperatura maior do que a temperatura em que o orvalho é formado, e a temperatura pode ser variada dependendo da condição de umidade, por exemplo, o ponto de orvalho é 8,6°C quando uma temperatura da atmosfera é 20°C e umidade relativa é maior do que 50%, em geral, a temperatura é 14~17°C quando a umidade é 70~80%.[058] In the present invention, the substrate can be optimized at a temperature higher than the dew point before its use, and "a temperature greater than the dew point" is a temperature greater than the temperature at which the dew is formed, and the temperature can be varied depending on the humidity condition, for example, the dew point is 8.6°C when an atmosphere temperature is 20°C and the relative humidity is greater than 50%, in general, temperature is 14~17°C when humidity is 70~80%.

[059] Na presente invenção, o substrato pode ser preparado de qualquer um selecionado do grupo que consiste em polimetilmetacrilato (PMMA), plástico, silício, e vidro, etc.[059] In the present invention, the substrate can be prepared from any one selected from the group consisting of polymethylmethacrylate (PMMA), plastic, silicon, and glass, etc.

[060] Na presente invenção, o material biológico que interage com material biológico alvo pode ser qualquer um selecionado do grupo que consiste em ácido nucleico, proteína, peptídeo, material de peso molecular baixo, e célula.[060] In the present invention, the biological material that interacts with the target biological material can be any one selected from the group consisting of nucleic acid, protein, peptide, low molecular weight material, and cell.

[061] Na presente invenção, a solução adicionada na etapa (a), a mistura sol pode ser estabilizada permitindo que esta seja deixada em uma temperatura variando de -20°C a 4°C por 30 minutos ou mais. Ainda, um recipiente em que a composição sol deve ser introduzida usando um arranjador pode ser ajustado a 14-17°C (maior do que a temperatura de ponto de orvalho em uma umidade de 70-80%), e a composição sol pode ser dispensada em uma umidade de 70-80% e em uma temperatura atmosférica (temperatura do ar) de 20D , em que as condições de temperatura e umidade são ideais para a transição sol-gel.[061] In the present invention, the solution added in step (a), the sol mixture can be stabilized by allowing it to be left at a temperature ranging from -20°C to 4°C for 30 minutes or more. Further, a container into which the sol composition is to be introduced using an arranger can be set to 14-17°C (higher than the dew point temperature at a humidity of 70-80%), and the sol composition can be dispensed at a humidity of 70-80% and an atmospheric temperature (air temperature) of 20D, where temperature and humidity conditions are ideal for the sol-gel transition.

[062] Através de ditos processos de estabilização e otimização, a taxa de gelificação da composição gel pode ser retardada, por meio da qual a formação de pontos pode ser facilitada, a divisão dos pontos após gelificação pode ser prevenida, e a formação de micro-canais no chip pode ser facilitada.[062] Through said stabilization and optimization processes, the gelation rate of the gel composition can be retarded, whereby the formation of spots can be facilitated, the splitting of spots after gelation can be prevented, and the formation of micro -channels on the chip can be facilitated.

[063] Na presente invenção, a solução misturada da composição sol, a SolBH e a SolBS, e a água destilada e o material biológico que interage com material biológico alvo são misturados com cada outro em uma relação entre 3: 1: 4 e 1: 2: 8.[063] In the present invention, the mixed solution of the sol composition, the SolBH and the SolBS, and the distilled water and biological material that interacts with target biological material are mixed with each other in a ratio between 3: 1: 4 and 1 : 2: 8.

[064] Na presente invenção, a SolBH e a SolBS têm uma concentração variando de 1 mM a 100 mM.[064] In the present invention, SolBH and SolBS have a concentration ranging from 1 mM to 100 mM.

[065] Na presente invenção, a proporção de volume de SolBS: água destilada: material biológico que interage com material biológico alvo é entre 1:2:1 e 2:5:1.[065] In the present invention, the volume ratio of SolBS: distilled water: biological material that interacts with target biological material is between 1:2:1 and 2:5:1.

[066] Na presente invenção, o tampão é tampão fosfato de sódio contendo um pH variando de 3 a 8.[066] In the present invention, the buffer is sodium phosphate buffer containing a pH ranging from 3 to 8.

[067] Na presente invenção, o substrato é tratado na superfície de plasma, é gravado, ou é tratado com PDMS, monômero silicato, ou material polimérico.[067] In the present invention, the substrate is plasma surface treated, etched, or treated with PDMS, silicate monomer, or polymeric material.

[068] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada à um método para preparar um biochip por gelificação da composição sol, o método incluindo as etapas de:(a) dispensar sobre um substrato uma composição sol que consiste em SolB1, SolB2 e SolB3 e dispensar SolBH (solução I) selecionada do grupo que consiste em HCl, H2SO4, HNO3 e CH3COOH no substrato em que a composição sol foi dispensada; e(b) dispensar a solução II, compreendendo tampão SolBS, um material biológico que interage com material biológico alvo e água destilada, no substrato em que a solução I foi dispensada, e então gelificar as soluções dispensadas,[068] In another aspect, the present invention is directed to a method for preparing a biochip by gelling the sol composition, the method including the steps of: (a) dispensing onto a substrate a sol composition consisting of SolB1, SolB2 and SolB3 and dispensing SolBH (solution I) selected from the group consisting of HCl, H2SO4, HNO3 and CH3COOH onto the substrate on which the sol composition was dispensed; and (b) dispensing solution II, comprising SolBS buffer, a biological material that interacts with target biological material and distilled water, onto the substrate on which solution I was dispensed, and then gelling the dispensed solutions,

[069] em que (i) dita SolB1 é pelo menos um primeiro monômero silicato selecionado do grupo que consiste em metiltrietoxisilano (MTES), etiltrietoxisilano (ETrEOS), silicato de sódio, tetrametil ortosilicato (TMOS), tetraetil ortosilicato (TEOS) e tetrametoxisilicato (TMS);(ii) dita SolB2 é pelo menos um segundo monômero de silicato selecionado do grupo que consiste em 3- aminotrimetoxisilano (3-ATMS), diglicerilsilano (DGS), metiltrimetoxisilicato (MTMS), poliglicerilsilicato(PGS), polivinilacetato, polivinilpirrolidona, gliceril metacrilato, hidroxietil acrilato, N,N-dicusinimidilcarbonato (DSC), 1,3,5-trimetilbenzeno,cetiltrimetilamônio cloreto, cetiltrimetilamônio brometo, 3-(trietoxisili)propil succínico anidreto, N-(3-trietoxisilipropil)-4-hidroxi butilamida (SIT8189.5), N- (trietoxisililpropil)gluconamida (SIT8189.0), plurônico L121 e tetrametil amônio hidróxido;(iii) dita SolB3 é pelo menos um aditivo selecionado do grupo que consiste em aminopropiltrietoxisilano (APTES), 3-glicidoxipropiltrimetoxisilano (GPTMOS), N-trietoxisililpropil-O-polietileno óxido uretano (PEOU), glicerol, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 e PEG8000; (iv) dita SolBH solução é pelo menos uma solução selecionada do grupo que consiste em HCl, H2SO4, HNO3 e CH3COOH, que tem uma concentração variando de 1 mM a 100 mM; e(v) dita SolBS solução é pelo menos uma solução selecionada do grupo que consiste em NaH2PO4, Na2HPO4 e Na3PO4, que tem uma concentração variando de 1 mM a 100 mM.[069] wherein (i) said SolB1 is at least a first silicate monomer selected from the group consisting of methyltriethoxysilane (MTES), ethyltriethoxysilane (ETrEOS), sodium silicate, tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetraethyl orthosilicate (TEOS) and tetramethoxysilicate (TMS);(ii) said SolB2 is at least a second silicate monomer selected from the group consisting of 3-aminotrimethoxysilane (3-ATMS), diglycerylsilane (DGS), methyltrimethoxysilicate (MTMS), polyglycerylsilicate (PGS), polyvinylacetate, polyvinylpyrrolidone , glyceryl methacrylate, hydroxyethyl acrylate, N,N-dicusinimidylcarbonate (DSC), 1,3,5-trimethylbenzene, cetyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium bromide, 3-(triethoxysily)propyl succinic anhydride, N-(3-triethoxysilypropyl)-4-hydroxy butylamide (SIT8189.5), N-(triethoxysilylpropyl)gluconamide (SIT8189.0), pluronic L121 and tetramethyl ammonium hydroxide;(iii) said SolB3 is at least one additive selected from the group consisting of aminopropyltriethoxysilane (APTES), 3-gly cydoxypropyltrimethoxysilane (GPTMOS), N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (PEOU), glycerol, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 and PEG8000; (iv) said SolBH solution is at least one solution selected from the group consisting of HCl, H2SO4, HNO3 and CH3COOH, which has a concentration ranging from 1 mM to 100 mM; and (v) said SolBS solution is at least one solution selected from the group consisting of NaH2PO4, Na2HPO4 and Na3PO4, which has a concentration ranging from 1 mM to 100 mM.

[070] Na presente invenção, o substrato pode ser otimizado em uma temperatura maior do que o ponto de orvalho antes de seu uso, e “uma temperatura maior do que a do ponto de orvalho” é uma temperatura maior do que uma temperatura em que o orvalho é formado, e a temperatura pode ser variada dependendo da condição de umidade, por exemplo, o ponto de orvalho é 8,6°C quando a temperatura da atmosfera é 20°C e umidade relativa é maior do que 50%, em geral, a temperatura é 14~17°C quando a umidade é 70~80%.[070] In the present invention, the substrate can be optimized at a temperature greater than the dew point prior to use, and "a temperature greater than the dew point" is a temperature greater than a temperature at which dew is formed, and the temperature can be varied depending on the humidity condition, for example, the dew point is 8.6°C when the atmosphere temperature is 20°C and the relative humidity is greater than 50%, in In general, the temperature is 14~17°C when the humidity is 70~80%.

[071] Ao fazer isto, quando as soluções são dispensadas sequencialmente no substrato, a taxa de gelificação da composição sol pode ser retardada, por meio da qual a formação de pontos pode ser facilitada, a divisão dos pontos após a gelificação pode ser prevenida, e a formação de micro-canais no chip pode ser facilitada.[071] By doing this, when the solutions are sequentially dispensed onto the substrate, the gelation rate of the sol composition can be slowed, whereby dot formation can be facilitated, dot splitting after gelation can be prevented, and the formation of micro-channels on the chip can be facilitated.

[072] De acordo com o método da presente invenção, após a composição sol ser dispensada, SolBH (solução I) selecionada do grupo que consiste em HCl, H2SO4, HNO3 e CH3COOH é dispensada nesta. Solução I serve para preparar um ambiente de pH em que a gelificação da composição sol é induzida. A concentração de dito HCl, H2SO4, HNO3 ou CH3COOH é preferencialmente 5-30 mM. A Solução I serve para ajustar o pH da composição sol a 1-3.[072] According to the method of the present invention, after the sol composition is dispensed, SolBH (solution I) selected from the group consisting of HCl, H2SO4, HNO3 and CH3COOH is dispensed therein. Solution I serves to prepare a pH environment in which gelation of the sol composition is induced. The concentration of said HCl, H2SO4, HNO3 or CH3COOH is preferably 5-30 mM. Solution I serves to adjust the pH of the sol composition to 1-3.

[073] Finalmente, solução II, compreendendo o tampão SolBS, a proteína detectora e água destilada, é dispensada no substrato, e as soluções dispensadas são gelificadas.[073] Finally, solution II, comprising the SolBS buffer, the detector protein and distilled water, is dispensed onto the substrate, and the dispensed solutions are gelled.

[074] Na presente invenção, o tampão SolBS é tampão fosfato de sódio contendo um pH variando de 3 a 8.[074] In the present invention, the SolBS buffer is sodium phosphate buffer containing a pH ranging from 3 to 8.

[075] O tampão e água dupla destilada têm uma função de prevenir a decomposição de um biomaterial (por exemplo, proteína). Em um pH fora de uma faixa de pH apropriado, um biomaterial provavelmente reduz sua atividade ou é decomposto, e a gelificação de sol é inferior em pH maior e mais rápida em pH inferior. Por esta razão, é importante ajustar o pH da composição sol de modo que a gelificação da composição possa ser realizada por um tempo apropriado enquanto previne-se a redução na atividade do biomaterial e a decomposição do biomaterial. Em geral, um biomaterial é estavelmente presente em um pH variando de 5 a 8, e por esta razão, o tampão é usado para prevenir o biomaterial de ser decomposto devido ao pH ambiente causado pela solução I. Tampão que pode ser usado na presente invenção não é especificamente limitado e pode ser apropriadamente selecionado por uma pessoa especializada na técnica dependendo do biomaterial a ser adicionado. Em um Exemplo da presente invenção, tampão fosfato de sódio contendo um pH variando de 3 a 8 foi usado como o tampão.[075] Buffer and double distilled water have a function of preventing the decomposition of a biomaterial (eg protein). At a pH outside an appropriate pH range, a biomaterial is likely to reduce its activity or decompose, and sol gelling is slower at higher pH and faster at lower pH. For this reason, it is important to adjust the pH of the sol composition so that the gelation of the composition can be carried out for an appropriate time while preventing the reduction in the activity of the biomaterial and the decomposition of the biomaterial. In general, a biomaterial is stably present at a pH ranging from 5 to 8, and for this reason, the buffer is used to prevent the biomaterial from being decomposed due to the ambient pH caused by solution I. Buffer that can be used in the present invention is not specifically limited and may be appropriately selected by a person skilled in the art depending on the biomaterial to be added. In an Example of the present invention, sodium phosphate buffer having a pH ranging from 3 to 8 was used as the buffer.

[076] Ainda, como usado aqui, o termo “material biológico que interage com um material biológico alvo” ou “biomaterial” refere-se à um material biológico, que pode interagir com um material alvo (por exemplo, proteína alvo), e exemplos dos mesmos incluem ácidos nucleicos, proteínas, peptídeos, material de peso molecular baixos, células, e semelhantes. Para incorporar este material biológico que interage com a material biológico alvo ou biomaterial em solução II, um tampão apropriado pode ser usado. Ou seja, um biomaterial de interesse é adicionado à uma solução tampão para preparar solução para detecção. Por exemplo, se o biomaterial é uma proteína, tampão PBS (salina tamponado fosfato) pode ser usado, e se uma reação enzimática existe, HEPES, NaCl, EDTA e semelhantes podem, se necessário, ser usados em concentrações diferentes. Em um Exemplo da presente invenção, um anticorpo derivado de um paciente HIV1 (vírus da imunodeficiência humana 1) foi usado como o material biológico alvo (proteína alvo), e a solução de cinco marcadores de antígeno (capazes de se ligarem ao anticorpo HIV) em tampão PBS foi usado como a proteína detectora.[076] Further, as used herein, the term “biological material that interacts with a target biological material” or “biomaterial” refers to a biological material, which can interact with a target material (e.g., target protein), and examples thereof include nucleic acids, proteins, peptides, low molecular weight material, cells, and the like. To incorporate this biological material that interacts with the target biological material or biomaterial in solution II, an appropriate buffer can be used. That is, a biomaterial of interest is added to a buffer solution to prepare a solution for detection. For example, if the biomaterial is a protein, PBS (phosphate buffered saline) buffer can be used, and if an enzymatic reaction exists, HEPES, NaCl, EDTA and the like can, if necessary, be used at different concentrations. In an Example of the present invention, an antibody derived from an HIV1 patient (human immunodeficiency virus 1) was used as the biological target material (target protein), and the solution of five antigen markers (capable of binding to the HIV antibody) was used. in PBS buffer was used as the detector protein.

[077] Na presente invenção, a proporção de volume de tampão SolBS: água destilada: um material biológico que interage com o material biológico alvo na solução II é preferencialmente entre 1:2:1 e 2:5:1, e mais preferencialmente 1:2:1. Por exemplo, solução II pode compreender, baseado no volume total da solução II, cerca de 20-30 %vol de tampão, cerca de 40-60 %vol de água destilada e cerca de 20-30 %vol da proteína detectora. Em um Exemplo da presente invenção, uma mistura de 10 M de tampão, 20 M de água destilada e 10 M de uma solução contendo proteína detectora foi usada como a solução II.[077] In the present invention, the volume ratio of SolBS buffer: distilled water: a biological material that interacts with the target biological material in solution II is preferably between 1:2:1 and 2:5:1, and more preferably 1 :2:1. For example, solution II may comprise, based on the total volume of solution II, about 20-30 vol% buffer, about 40-60 vol% distilled water and about 20-30 vol% detector protein. In an Example of the present invention, a mixture of 10M buffer, 20M distilled water and 10M a solution containing detector protein was used as solution II.

[078] A presente invenção é caracterizada pelo fato de que a composição sol, solução I e solução II são dispensadas em quantidades precisas, assim, fabricando um chip de proteína uniforme.[078] The present invention is characterized by the fact that the composition sol, solution I and solution II are dispensed in precise amounts, thus manufacturing a uniform protein chip.

[079] Na presente invenção, a proporção das quantidades de composição sol: solução I: solução II que são dispensadas pode ser entre 3:1:4 e 1:2:8, e é preferencialmente 3:1:4. Por exemplo, a composição sol é preferencialmente dispensada em uma quantidade de 25-35 M, e mais preferencialmente cerca de 30 M. Ainda, solução I é preferencialmente dispensada em uma quantidade de 5-15 M, e mais preferencialmente cerca de 10 M. Além disso, a solução II é preferencialmente dispensada em uma quantidade de 35-45 M, e mais preferencialmente cerca de 40 M.[079] In the present invention, the ratio of the amounts of composition sol:solution I:solution II that are dispensed may be between 3:1:4 and 1:2:8, and is preferably 3:1:4. For example, the sol composition is preferably dispensed in an amount of 25-35M, and more preferably about 30M. Further, solution I is preferably dispensed in an amount of 5-15M, and more preferably about 10M. Furthermore, solution II is preferably dispensed in an amount of 35-45M, and more preferably about 40M.

[080] No método de preparação do biochip de acordo com a presente invenção, a composição sol, solução I e solução II são misturadas com cada outro e então dispensadas em um substrato. Neste caso, preferencialmente uma técnica hand-spotting usando uma pipeta ou outras ferramentas é realizada ou um arranjador sem contato é usado.[080] In the biochip preparation method according to the present invention, the composition sol, solution I and solution II are mixed with each other and then dispensed onto a substrate. In this case, preferably a hand-spotting technique using a pipette or other tools is performed or a non-contact arranger is used.

[081] Na presente invenção, o método não tem um processo de pré-tratamento. O processo de pré-tratamento pode ser um ou mais selecionado do grupo que consiste em (i) processo de mistura de SolB1, SolB2, SolB3, SolBH, SolBS, ou material biológico que interage com material biológico alvo; (ii) processo de vortexar a solução misturada de (i); e (iii) processo de estabilização da solução misturada de (i) ou (ii).[081] In the present invention, the method does not have a pretreatment process. The pretreatment process may be one or more selected from the group consisting of (i) the process of mixing SolB1, SolB2, SolB3, SolBH, SolBS, or biological material that interacts with target biological material; (ii) process of vortexing the mixed solution of (i); and (iii) process of stabilizing the mixed solution of (i) or (ii).

[082] Na presente invenção, SolB1, SolB2, SolB3, SolBH, SolBS e o material biológico que interage com material biológico alvo podem estar contidos no recipiente antes da dispensação, e a dispensação pode ser realizada por sucção ou através de um bocal.[082] In the present invention, SolB1, SolB2, SolB3, SolBH, SolBS and biological material that interacts with target biological material can be contained in the container prior to dispensing, and dispensing can be performed by suction or through a mouthpiece.

[083] Na presente invenção, SolB1, SolB2, SolB3, SolBH, SolBS e material biológico que interage com material biológico alvo podem estar contidos em um cartucho de produção em massa que se conecta com um bocal de dispensação, e uma quantidade de dispensação de mais do que 100 vezes comparado com o da dispensação pelo processo de sucção, assim, o método é capaz de atingir uma produção em massa.[083] In the present invention, SolB1, SolB2, SolB3, SolBH, SolBS and biological material that interacts with target biological material can be contained in a mass production cartridge that connects with a dispensing nozzle, and a dispensing amount of more than 100 times compared to dispensing by suction process, thus, the method is able to achieve mass production.

[084] Quando a composição sol, solução I e solução II são dispensadas sequencialmente diretamente no substrato sem um processo de pré-tratamento para fabricar um chip, a dispensação pode ser realizada usando um arranjador que permite a composição sol, soluções I e II sejam dispensadas em quantidades precisas. Com relação a isto, como o arranjador que pode ser usado para dispensar a composição sol, solução I e solução II em volumes precisos, um arranjador sem contato é preferencialmente usado.[084] When composition sol, solution I and solution II are sequentially dispensed directly onto the substrate without a pre-treatment process to manufacture a chip, dispensing can be performed using an arranger that allows composition sol, solutions I and II to be dispensed in precise amounts. In this regard, as the arranger which can be used to dispense the sol, solution I and solution II composition in precise volumes, a non-contact arranger is preferably used.

[085] Arranjadores são divididos, de acordo com um método para arranjar um material detector em um biochip, em um ‘arranjador de contato’ e um ‘arranjador sem contato’. O arranjador de contato arranja uma proteína detectora na superfície do chip usando, por exemplo, um pino contendo um espaço muito estreito neste. Neste método, a solução contendo a proteína detectora flui pouco a pouco a partir do pino e é arranjado na superfície do chip enquanto entra em contato direto com a superfície do chip. Este método tem uma vantagem em que este pode arranjar uma variedade de proteínas detectoras dentro um tempo curto, mas não pode precisamente controlar o volume da solução, e assim, a uniformidade do biochip resultante pode ser reduzido.[085] Arrangers are divided, according to a method for arranging a detector material on a biochip, into a 'contact arranger' and a 'non-contact arranger'. The contact arranger arranges a detector protein on the surface of the chip using, for example, a pin containing a very narrow space on the chip. In this method, the solution containing the detector protein flows little by little from the pin and is arranged on the surface of the chip while making direct contact with the surface of the chip. This method has an advantage in that it can arrange a variety of detector proteins within a short time, but cannot precisely control the volume of the solution, and thus, the uniformity of the resulting biochip can be reduced.

[086] Por outro lado, o arranjador sem contato é um método para arranjar proteínas detectoras na superfície do chip sem contato direto ao colocar uma solução contendo a proteína detectora em um tubo fino, colocando o tubo imediatamente acima da superfície do chip e aplicando certa pressão a este. Este método tem uma vantagem de que o volume da solução que édispensada pode ser precisamente determinado. Assim, quando a composição sol, solução I e solução II são dispensadassequencialmente sem um processo de pré-tratamento para fabricar um chip, o arranjador sem contato torna possível controlar ovolume de cada solução, que é dispensada, em um volumepredeterminado. Portanto, na presente invenção, este arranjador sem contato é preferencialmente usado.[086] On the other hand, contactless arranger is a method of arranging detector proteins on the chip surface without direct contact by placing a solution containing the detector protein in a thin tube, placing the tube just above the chip surface and applying pressure to this. This method has the advantage that the volume of solution that is dispensed can be precisely determined. Thus, when the composition sol, solution I and solution II are dispensed sequentially without a pre-treatment process to manufacture a chip, the contactless arranger makes it possible to control the volume of each solution, which is dispensed, at a predetermined volume. Therefore, in the present invention, this contactless arranger is preferably used.

[087] A composição sol, solução I selecionada do grupo que consiste em HCl, H2SO4, HNO3 e CH3COOH, e solução II (uma mistura de solução do material biológico que interage com o material biológico alvo, tampão e água destilada) podem ser dispensados sequencialmente em uma placa de poço do substrato usando o arranjador sem contato que permite que estes componentes sejam dispensados em volumes precisos. Quando outra solução é dispensada em pequenos pontos que foram dispensados na superfície, a solução irá formar formas de ponto sem ser propagado devido à tensão de superfície da solução. Neste tempo, a energia de superfície que ocorre quando a solução cai será convertida em vibração, por meio da qual o fluxo (convenção) do material ocorre nos pontos de modo que as duas soluções serão facilmente misturadas com cada outra. Usando este princípio, os presentes inventores projetaram um método automatizado para fabricar um chip sol-gel destacando os materiais diretamente na superfície do chip sem pré-tratar os materiais.[087] Sol composition, solution I selected from the group consisting of HCl, H2SO4, HNO3 and CH3COOH, and solution II (a mixture of biological material solution that interacts with the target biological material, buffer and distilled water) can be dispensed sequentially on a substrate well plate using the non-contact arranger that allows these components to be dispensed in precise volumes. When another solution is dispensed into small spots that have been dispensed onto the surface, the solution will form spot shapes without propagating due to the surface tension of the solution. At this time, the surface energy that occurs when the solution falls will be converted into vibration, whereby the flow (convention) of the material takes place at points so that the two solutions will be easily mixed with each other. Using this principle, the present inventors have designed an automated method to manufacture a sol-gel chip by highlighting materials directly onto the chip surface without pre-treating the materials.

[088] Por exemplo, um microarranjador (comercialmente disponível de Scienion AG) pode ser usado. Particularmente, o uso da tecnologia de controle do ponto de orvalho (Scienion AG) torna possível minimizar a incerteza da concentração resultante do congelamento da umidade na superfície de placa, assim, fabricando pontos contendo um volume e tamanho mais precisos. Em um Exemplo da presente invenção, sciFLEXARRAYER S11 (Scienion AG, Alemanha) foi usado como o arranjador.[088] For example, a microarranger (commercially available from Scienion AG) can be used. In particular, the use of dew point control technology (Scienion AG) makes it possible to minimize concentration uncertainty resulting from freezing of moisture on the plate surface, thus fabricating points containing a more accurate volume and size. In an Example of the present invention, sciFLEXARRAYER S11 (Scienion AG, Germany) was used as the arranger.

[089] Ou seja , na presente invenção, o microarranjador sem contato é usado na fabricação do biochip, por meio do qual o biochip pode ser fabricado em um modo mais conveniente ao dispensar um volume preciso de cada solução em um substrato, e um biochip mais uniforme pode ser fabricado, porque um processo de pré-tratamento de pré-mistura de um monômero sol-gel, tampão, uma amostra de proteína detectora e semelhantes não é requerido, diferente do método convencional.[089] That is, in the present invention, the contactless microarranger is used in the fabrication of the biochip, whereby the biochip can be manufactured in a more convenient manner by dispensing a precise volume of each solution onto a substrate, and a biochip more uniform can be manufactured, because a pre-treatment process of pre-mixing a sol-gel monomer, buffer, a detector protein sample and the like is not required, unlike the conventional method.

[090] Entretanto, o substrato que é usado na presente invenção tem a propriedade de ser transparente após a composição sol ter sido gelificada, e por esta razão, a placa de poço de substrato ou lamínula é preferencialmente feita de um material que pode manter boa transparência. Por exemplo, o substrato pode ser feito de um material plástico, como polimetilmetacrilato altamente transparente (PMMA), silício ou vidro.[090] However, the substrate that is used in the present invention has the property of being transparent after the sol composition has been gelled, and for this reason, the substrate well plate or coverslip is preferably made of a material that can maintain good transparency. For example, the substrate can be made of a plastic material such as highly transparent polymethylmethacrylate (PMMA), silicon or glass.

[091] Ainda, a superfície do substrato que é usada na presente invenção é usada após o tratamento da superfície de modo que uma solução sol misturada pode ser ficada ao substrato quando sendo gelificada. Um importante requisito para o biochip da presente invenção é que a solução sol misturada deve ser fixado fortemente ao substrato quando estiver sendo gelificado de modo que os pontos não devem ser destacados quando estes são permitidos reagir com uma solução contendo material alvo. Por esta razão, na análise do material alvo usando o biochip, um processo de lavagem forte é requerido após a reação com o material alvo, e assim, a fim de poder resistir a esta força física, uma forte fixação dos pontos é essencial. Para esta finalidade, é preferencial usar um substrato plástico cuja superfície não foi tratada, um substrato plástico cuja superfície tenha sido tratada com plasma, um substrato vidro cuja superfície não foi tratada, um substrato vidro cuja superfície foi tratada (por exemplo, um substrato vidro gravado), ou um chip silício contendo uma estrutura porosa.[091] Further, the substrate surface that is used in the present invention is used after surface treatment so that a mixed sol solution can be stuck to the substrate when being gelled. An important requirement for the biochip of the present invention is that the mixed sol solution must be strongly attached to the substrate when it is being gelled so that the dots must not be highlighted when they are allowed to react with a solution containing target material. For this reason, in the analysis of the target material using the biochip, a strong washing process is required after the reaction with the target material, and so, in order to be able to resist this physical force, a strong fixation of the points is essential. For this purpose, it is preferable to use a plastic substrate whose surface has not been treated, a plastic substrate whose surface has been plasma-treated, a glass substrate whose surface has not been treated, a glass substrate whose surface has been treated (e.g. a glass substrate etched), or a silicon chip containing a porous structure.

[092] Na presente invenção, uma superfície do substrato pode ser pré-tratadas com plasma. De outra forma, o substrato da presente invenção pode ser gravado ou tratado com PDMS ou um monômero silicato ou material polímero antecipadamente.[092] In the present invention, a substrate surface may be pre-treated with plasma. Otherwise, the substrate of the present invention may be etched or treated with PDMS or a silicate monomer or polymer material in advance.

[093] Quando o arranjador é usado na fabricação do biochip de acordo com a presente invenção, as seguintes precauções devem ser tomadas.[093] When the arranger is used in the fabrication of the biochip in accordance with the present invention, the following precautions must be taken.

[094] Primeiro, porque o biochip é preparado usando um material especial (sol) e tem a propriedade de ser gelificada com a passagem do tempo, diferente de um chip DNA, é muito importante dispensar o sol usando o arranjador dentro do tempo mais curto possível de modo a prevenir que o sol seja gelificado durante a dispensação.[094] First, because the biochip is prepared using a special material (sol) and has the property of being gelled with the passage of time, unlike a DNA chip, it is very important to dispense with the sun using the arranger within the shortest possible time. possible in order to prevent the sun from gelling during dispensing.

[095] Em segundo lugar, a umidade e temperatura são fatores importantes. Devido à taxa de gelificação e atividade de pontos formados no substrato serem determinados pela umidade e temperatura de um ambiente em que os pontos são formados, umidade inicial e temperatura são muito importantes. Assim, na fabricação do biochip usando a solução sol-gel, é muito importante pré-ajustar a temperatura e umidade circundantes ao arranjador.[095] Second, humidity and temperature are important factors. Because the rate of gelation and activity of dots formed on the substrate are determined by the humidity and temperature of an environment in which the dots are formed, initial moisture and temperature are very important. Thus, when manufacturing the biochip using the sol-gel solution, it is very important to pre-set the temperature and humidity surrounding the arranger.

[096] Na presente invenção, a umidade em que o processo de arranjo é realizado é cerca de 50% ou acima, e mais particularmente 70-80%, e a temperatura preferencial em que o processo de arranjo é realizado é de cerca de 25°C ou abaixo, e mais particularmente 10-25°C(temperatura ambiente).Particularmente, devido à umidade inicial alta ser um fator importante na gelificação dos pontos, a umidade deve ser ajustada em cerca de 80% antes do arranjo. Ainda, se a temperatura é 25°C ou acima, o sol é possível de ser gelificado rapidamente, e por isto, o processo de arranjo é preferencialmente realizado na temperatura mais baixa possível.[096] In the present invention, the humidity at which the arranging process is carried out is about 50% or above, and more particularly 70-80%, and the preferred temperature at which the arranging process is carried out is about 25°C. °C or below, and more particularly 10-25 °C (room temperature). Particularly because high initial humidity is an important factor in spot gelling, the humidity should be adjusted to about 80% prior to arrangement. Furthermore, if the temperature is 25°C or above, the sol is able to be gelled quickly, and therefore, the arranging process is preferably carried out at the lowest possible temperature.

[097] Como descrito acima, após temperatura e umidade terem sido pré-ajustadas e um programa que permite rápido arranjo ter sido preparado, as soluções são dispensadas em ordem.[097] As described above, after temperature and humidity have been pre-adjusted and a program allowing for quick set-up has been prepared, the solutions are dispensed in order.

[098] Na presente invenção, o material biológico que interage com material biológico alvo é qualquer um selecionado do grupo que consiste em ácido nucleico, proteína, peptídeo, material de peso molecular baixo, e célula.[098] In the present invention, the biological material that interacts with the target biological material is any selected from the group consisting of nucleic acid, protein, peptide, low molecular weight material, and cell.

[099] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um kit para preparar um biochip, o kit incluindo:- um primeiro recipiente contendo pelo menos um primeiro monômero silicato, SolB1, selecionado do grupo que consiste em metiltrietoxisilano (MTES), etiltrietoxisilano (ETrEOS), silicato de sódio, tetrametil ortosilicato (TMOS), tetraetil ortosilicato (TEOS) etetrametoxisilicato (TMS); - um segundo recipiente contendo pelo menos um segundo monômero silicato, SolB2, selecionado do grupo queconsiste em 3-aminotrimetoxisilano (3-ATMS),diglicerilsilano (DGS), metiltrimetoxisilicato (MTMS), poliglicerilsilicato (PGS), polivinilacetato,polivinilpirrolidona, gliceril metacrilato, hidroxietil acrilato, N,N-dicusinimidilcarbonato (DSC), 1,3,5- trimetilbenzeno, cetiltrimetilamônio cloreto,cetiltrimetilamônio brometo, 3-(trietoxisili)propilsuccínico anidreto, N-(3-trietoxisili propil)-4-hidroxi butilamida (SIT8189.5), N-(trietoxisililpropil)gluconamida (SIT8189.0), plurônico L121 e tetrametil amônio hidróxido;- um terceiro recipiente contendo pelo menos um aditivo, SolB3, selecionado do grupo que consiste em aminopropiltrietoxisilano (APTES), 3-glicidoxipropiltrimetoxisilano (GPTMOS), N-trietoxisililpropil-O-polietileno óxido uretano (PEOU), glicerol, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 e PEG8000;- um quarto recipiente contendo SolBH selecionado do grupo que consiste em HCl, H2SO4, HNO3 e CH3COOH; e um quinto recipiente uma solução tampão, SolBS,em que SolBH selecionado do grupo que consiste em HCl, H2SO4, HNO3 e CH3COOH, uma solução tampão, SolBS, água destilada e biomaterial que interage com biomaterial alvo são adicionados sequencialmente a uma composição sol que consiste em SolB1, SolB2 e SolB3 de modo que a composição sol é gelificada.[099] In another aspect, the present invention is directed to a kit for preparing a biochip, the kit including:- a first container containing at least a first silicate monomer, SolB1, selected from the group consisting of methyltriethoxysilane (MTES), ethyltriethoxysilane (ETrEOS), sodium silicate, tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetraethyl orthosilicate (TEOS) and tetramethoxysilicate (TMS); - a second container containing at least one second silicate monomer, SolB2, selected from the group consisting of 3-aminotrimethoxysilane (3-ATMS), diglycerylsilane (DGS), methyltrimethoxysilicate (MTMS), polyglycerylsilicate (PGS), polyvinylacetate, polyvinylpyrrolidone, glyceryl methacrylate, hydroxyethyl acrylate, N,N-dicusinimidylcarbonate (DSC), 1,3,5-trimethylbenzene, cetyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium bromide, 3-(triethoxysily)propyl succinic anhydride, N-(3-triethoxysilyl propyl)-4-hydroxybutylamide (SIT8189. 5), N-(triethoxysilylpropyl)gluconamide (SIT8189.0), pluronic L121 and tetramethyl ammonium hydroxide;- a third container containing at least one additive, SolB3, selected from the group consisting of aminopropyltriethoxysilane (APTES), 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMOS ), N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (PEOU), glycerol, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 and PEG8000;- a fourth container containing SolBH selected from the group consisting of HCl, H2SO4, HNO3 and CH3COOH; and a fifth container a buffer solution, SolBS, in which SolBH selected from the group consisting of HCl, H2SO4, HNO3 and CH3COOH, a buffer solution, SolBS, distilled water and biomaterial that interacts with target biomaterial are sequentially added to a sol composition that consists of SolB1, SolB2 and SolB3 so that the sol composition is gelled.

[0100] O material dos recipientes não é limitado. O kit pode ter a forma de garrafas, tubos, sachês, envelopes, tubos, ampolas e semelhantes que podem ser formados em parte ou em todo a partir de plástico, vidro, papel, folha, cera e semelhantes. Os recipientes sensores podem ser equipados com uma tampa destacável totalmente ou parcialmente que podem inicialmente pode ser parte do recipiente ou pode ser afixado ao recipiente por meio mecânico, adesivo ou outro. O kit pode compreender um pacote exterior que pode incluir instruções em relação ao uso dos componentes.[0100] The material of containers is not limited. The kit may be in the form of bottles, tubes, sachets, envelopes, tubes, ampoules and the like which may be formed in part or in whole from plastic, glass, paper, foil, wax and the like. Sensor containers may be equipped with a fully or partially detachable lid which may initially be part of the container or may be affixed to the container by mechanical, adhesive or other means. The kit may comprise an outer package which may include instructions regarding the use of the components.

[0101] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método para analisar um biomaterial alvo usando o biochip preparado de acordo com dito método de preparação.[0101] In another aspect, the present invention is directed to a method for analyzing a target biomaterial using the biochip prepared according to said method of preparation.

[0102] Mais especificamente, a presente invenção é direcionada a um método para analisar um material biológico alvo, o método compreendendo uma etapa para adicionar uma amostra, que contém o material biológico alvo capaz de interagir com um biomaterial que interage com material biológico alvo a ser detectado, à um biochip preparado de acordo com dito método de preparação.[0102] More specifically, the present invention is directed to a method for analyzing a target biological material, the method comprising a step of adding a sample, which contains the target biological material capable of interacting with a biomaterial that interacts with the target biological material to to be detected, to a biochip prepared according to said preparation method.

[0103] Após o chip de proteína ser deixado reagir com o material biológico alvo ter sido preparado como descrito acima, este é deixado reagir com uma solução contendo o material biológico alvo. A solução de solução é preferencialmente usada em uma quantidade de 50 ~ 100 $, no caso de um chip de 96 poços, e o tempo de reação é preferencialmente cerca de 1 hora. O material biológico alvo que interage com um material biológico que interage com material biológico alvo é ainda um material biológico, e exemplos do material biológico podem incluir ácidos nucleicos, proteínas, peptídeos, materiais de peso molecular baixo, e células.[0103] After the protein chip is allowed to react with the target biological material having been prepared as described above, it is allowed to react with a solution containing the target biological material. The solution solution is preferably used in an amount of 50~100$, in the case of a 96-well chip, and the reaction time is preferably about 1 hour. The target biological material that interacts with a biological material that interacts with the target biological material is still a biological material, and examples of the biological material may include nucleic acids, proteins, peptides, low molecular weight materials, and cells.

[0104] A solução de reação contendo o material biológico alvo penetra nos pontos através das estruturas microporosas dos pontos e interage e se liga com a proteína fixada nas estruturas encapsuladas (1a incubação). Após a reação, para analisar o material biológico alvo que não ligou ao material biológico que interage com biomaterial alvo nos pontos, o material biológico alvo pode ser deixado reagir com uma proteína marcadora para detectar o material biológico alvo. Em um Exemplo da presente invenção, um corante fluorescente conjugado a (Cy3) contra a proteína alvo foi usada (2a incubação). Com relação a isto, o tempo de reação é ajustado a 30 minutos, e a quantidade da solução de reação é ajustada a 50-100 ^. Os processos acima de 1a e 2a incubação são todos realizados em uma temperatura ambiente. Se a solução de reação contendo o material biológico alvo é uma mistura contendo vários materiais, um processo de bloqueio pode ser realizado antes do 1° processo de incubação para prevenir ligação não específica ao material biológico que interage com material biológico alvo contido no chip de proteína. Neste processo de bloqueio, uma solução de bloqueio como leite desnatado, BSA (albumina sérica bovina) ou IgG pode ser usada.[0104] The reaction solution containing the target biological material penetrates the spots through the microporous structures of the spots and interacts and binds with the protein fixed in the encapsulated structures (1st incubation). After the reaction, to analyze the target biological material that has not bound to the biological material that interacts with the target biomaterial at the spots, the target biological material can be allowed to react with a marker protein to detect the target biological material. In an Example of the present invention, a fluorescent dye conjugated to (Cy3) against the target protein was used (2nd incubation). In this regard, the reaction time is set to 30 minutes, and the amount of the reaction solution is set to 50-100^. The above 1st and 2nd incubation processes are all carried out at room temperature. If the reaction solution containing the target biological material is a mixture containing various materials, a blocking process can be performed before the 1st incubation process to prevent non-specific binding to the biological material that interacts with the target biological material contained in the protein chip. . In this blocking process, a blocking solution such as skim milk, BSA (bovine serum albumin) or IgG can be used.

[0105] Após cada um dos 1° e 2° processos de incubação, um processo de lavagem é realizado usando um tampão de lavagem convencional. Em um Exemplo da presente invenção, 0,2% tampão PBS contendo Tween-20 foi usado. No processo de lavagem, uma lavadora para ELISA é usada. O 1° processo de lavagem é repetido 4 vezes, e o 2° processo de lavagem é repetido 4 vezes. Após o processo de lavagem ter sido realizado, um processo de secagem é realizado até a solução ser completamente removido de cada poço.[0105] After each of the 1st and 2nd incubation processes, a wash process is performed using a conventional wash buffer. In an Example of the present invention, 0.2% PBS buffer containing Tween-20 was used. In the washing process, an ELISA washer is used. The 1st washing process is repeated 4 times, and the 2nd washing process is repeated 4 times. After the washing process has been carried out, a drying process is carried out until the solution is completely removed from each well.

[0106] Após a conclusão do processo secagem, se uma reação real ocorreu pode ser avaliada por triagem do poço em que a reação ocorreu, usando um scanner de imagem que pode detectar o corante fluorescente. Ainda, o grau da reação pode ser avaliado por medição da escuridão da imagem usando software. Ou seja, o método inventivo de análise do material biológico alvo adicionalmente compreende uma etapa para permitir que o material alvo reaja com um biomaterial, como uma proteína ou aptâmero marcado com um isótopo radioativo, um corante fluorescente ou outras substâncias marcadoras. Como usado aqui, o termo “aptâmero” refere-se a um pequeno oligonucleotídeos de fita simples que pode especificamente ligar ao material biológico que interage com material biológico alvo com alta afinidade.[0106] Upon completion of the drying process, whether an actual reaction has occurred can be assessed by screening the well in which the reaction took place, using an image scanner that can detect the fluorescent dye. Furthermore, the degree of reaction can be assessed by measuring the darkness of the image using software. That is, the inventive method of analyzing the target biological material further comprises a step to allow the target material to react with a biomaterial, such as a protein or aptamer labeled with a radioactive isotope, a fluorescent dye or other labeling substances. As used herein, the term "aptamer" refers to a small, single-stranded oligonucleotide that can specifically bind to biological material that interacts with target biological material with high affinity.

[0107] A presente invenção ainda fornece um kit de detecção compreendendo um biochip preparado por dito método de preparação.[0107] The present invention further provides a detection kit comprising a biochip prepared by said method of preparation.

[0108] O kit para detecção de um material biológico detector pode tomar a forma de garrafas, tubos, sachês, envelopes, tubos, ampolas, e semelhantes, que podem ser formados em parte ou em todo de plástico, vidro, papel, folha, cera e semelhantes. Os recipientes sensores podem ser equipados com uma tampa destacável total ou parcialmente que pode inicialmente ser parte do recipiente ou pode ser afixado ao recipiente por meio mecânico, adesivo ou outro. O kit pode compreender um pacote exterior que pode incluir instruções em relação ao uso dos componentes.[0108] The kit for detecting a biological material detector can take the form of bottles, tubes, sachets, envelopes, tubes, ampoules, and the like, which can be formed in part or in whole from plastic, glass, paper, foil, wax and the like. Sensor containers may be equipped with a fully or partially detachable lid which may initially be part of the container or may be affixed to the container by mechanical, adhesive or other means. The kit may comprise an outer package which may include instructions regarding the use of the components.

[0109] Deste ponto em diante, a presente invenção será descrita em detalhes com referência aos exemplos. É entendido, no entanto, que estes exemplos são para fins ilustrativos somente e não devem ser interpretados para limitar o escopo da presente invenção.[0109] From this point forward, the present invention will be described in detail with reference to examples. It is understood, however, that these examples are for illustrative purposes only and should not be interpreted to limit the scope of the present invention.

[0110] Exemplo 1: Preparação de cada solução constituinte para preparar biochip[0110] Example 1: Preparation of each constituent solution to prepare biochip

[0111] 20 M de SolBl, 6 M de SolB2 e 4 M de SolB3, cada uma das quais foi selecionada dos componentes mostrados na Tabela 1 abaixo, foram misturadas com cada outro para preparar a composição sol. Como solução I, 10 M de SolBH foi preparado.[Tabela 1]Componentes de cada solução

[0111] 20M SolBl, 6M SolB2 and 4M SolB3, each of which was selected from the components shown in Table 1 below, were mixed with each other to prepare the sol composition. As solution I, 10 M of SolBH was prepared.[Table 1]Components of each solution

[0112] Entretanto, 10 M de pelo menos SolBS selecionado do grupo que consiste em NaH2PO4, Na2HPO4 e Na3PO4 e 20 M de água dupla destilada (DDW) foram misturados com cada outro, enquanto 10-200 ng de cada uma das cinco proteínas detectoras (p24, p31, gp41, gp120 e gp160) capazes de interagirem com anticorpo HIV1 foi misturada com PBS tampão para preparar 10 M de uma solução de amostra. A solução de amostra foi adicionada à mistura, que foi então vortexada por 5 segundos e giradas para preparar solução II.[Tabela 2]Componentes de composição sol, solução I, solução II e proteínas detectoras.

Exemplo 2: Fabricação de biochip(1) Preparação de placa de poço substrato[0112] Meanwhile, 10 M of at least SolBS selected from the group consisting of NaH2PO4, Na2HPO4 and Na3PO4 and 20 M of double distilled water (DDW) were mixed with each other, while 10-200 ng of each of the five detector proteins (p24, p31, gp41, gp120 and gp160) capable of interacting with HIV1 antibody was mixed with PBS buffer to prepare 10 M sample solution. The sample solution was added to the mixture, which was then vortexed for 5 seconds and spun to prepare solution II.[Table 2]Composition components sol, solution I, solution II and detector proteins.

Example 2: Fabrication of Biochip(1) Preparation of Substrate Well Plate

[0113] Uma placa de 96 poços comercialmente disponívelfeita de PMMA, a superfície da qual foi tratada com plasma, foi adquirida de SPL Co., Ltd. (Coreia).(2) Fabricação de biochip (chip proteína)[0113] A commercially available 96-well plate made of PMMA, the surface of which was plasma treated, was purchased from SPL Co., Ltd. (Korea).(2) Biochip (protein chip) fabrication.

[0114] Para fabricar chip de proteína, um arranjador foi ajustado em uma temperatura de 16°C e uma umidade de 80%, e como uma placa de poço fonte à qual a solução sol misturada obtida no Exemplo 1 foi adicionada, uma placa geral de 384 poços foi preparada, e como uma placa de poço alvo, a placa de 96 poços feita de PMMA, preparação na seção acima (1), foi preparada. Ainda, um arranjador sciFLEXARRYER S11 (Scienion, Alemanha) que dispensa um volume preciso predeterminado foi preparado.[0114] To manufacture protein chip, an arranger was set at a temperature of 16°C and a humidity of 80%, and as a source well plate to which the mixed sol solution obtained in Example 1 was added, a general plate 384-well plate was prepared, and as a target well plate, the 96-well plate made of PMMA, preparation in the above section (1), was prepared. Furthermore, a sciFLEXARRYER S11 (Scienion, Germany) arranger that dispenses a precise predetermined volume was prepared.

[0115] Então, 30 M da composição sol preparada por mistura de 20 M de SolB1, 6 M de SolB2 e 4 M de SolB3 no Exemplo 1, 10 M de SolBH (solução I) e 40 M de Solução II foram adicionados à placa fonte do arranjador sciFLEXARRYER S11 (Scienion, Alemanha).[0115] Then 30M of the sol composition prepared by mixing 20M SolB1, 6M SolB2 and 4M SolB3 in Example 1, 10M SolBH (solution I) and 40M Solution II were added to the plate source from the sciFLEXARRYER S11 arranger (Scienion, Germany).

[0116] Volumes predeterminados da composição sol, solução I e solução II foram dispensados sequencialmente na placa preparada de 96 poços feitas de PMMA. Estas soluções foram dispensadas em uma quantidade de 450 pl ou menos por ponto usando bocal PDC90 (Scienion AG, Alemanha). A frequência de destaque foi ajustada a 500 Hz. O tamanho dos pontos formados foi de cerca de 300 ^ (8 gotas por ponto).[0116] Predetermined volumes of composition sol, solution I and solution II were sequentially dispensed into the prepared 96-well plate made of PMMA. These solutions were dispensed in an amount of 450 pl or less per spot using PDC90 nozzle (Scienion AG, Germany). The highlight frequency was set to 500 Hz. The size of the dots formed was about 300 ^ (8 drops per dot).

[0117] A FIG. 6 mostra uma fotografia (A) obtida por varredura em um scanner Axon GenePix (Axon) a 532 nm e uma fotografia de imagem (B) obtida usando sciFLEXARRAYER equipado com uma câmera. A distância (dot pitch) entre os pontos no chip de proteína foi de 600 ^.Exemplo comparativo 1: comparação de uniformidade com chip convencional de proteína[0117] FIG. 6 shows a photograph (A) taken by scanning an Axon GenePix (Axon) scanner at 532 nm and an image photograph (B) taken using a sciFLEXARRAYER equipped with a camera. The distance (dot pitch) between the dots on the protein chip was 600 ^.Comparative example 1: uniformity comparison with conventional protein chip

[0118] O chip de proteína de acordo com a presente invenção foi comparado com um chip convencional de proteína para avaliar se o chip de proteína da presente invenção tem uma uniformidade maior comparada ao chip convencional de proteína.[0118] The protein chip according to the present invention was compared with a conventional protein chip to assess whether the protein chip of the present invention has a higher uniformity compared to the conventional protein chip.

[0119] Primeiramente, como um controle, um chip de proteína foi fabricado de acordo com um método convencional. Um monômero silicato, HCl, DW, SP e uma solução de amostra foram misturados em ordem, e a solução misturada foi dispensada em uma placa fonte usando um arranjador em pino e manchado em uma placa de 96 poços feita de PMMA. Como o arranjador em pino, OnmiGrid Accent Arrayer (Genomic Solutions, USA) foi usado.[0119] First, as a control, a protein chip was manufactured according to a conventional method. A silicate monomer, HCl, DW, SP and a sample solution were mixed in order, and the mixed solution was dispensed into a source plate using a pin arranger and smeared onto a 96-well plate made of PMMA. As the pin arranger, OnmiGrid Accent Arrayer (Genomic Solutions, USA) was used.

[0120] Ainda, a imagem de chip de proteína fabricada de acordo com este método foi fotografada com uma câmera digital em um microscópio, e a fotografia de imagem foi comparado com a fotografia em imagem (FIG. 6B) do chip de proteína fabricado de acordo com o método dos Exemplos 1 e 2 da presente invenção.[0120] Further, the protein chip image manufactured according to this method was photographed with a digital camera under a microscope, and the image photograph was compared with the image photograph (FIG. 6B) of the protein chip manufactured from according to the method of Examples 1 and 2 of the present invention.

[0121] Como resultado, como pode ser observado na FIG. 8,no caso do chip inventivo da proteína fabricada usando a composição sol específica e dispensando a solução I e solução II sequencialmente sem um processo de pré-tratamento de misturar as soluções I e II, a forma e tamanho dos pontos foram constantes, mas no caso do chip de proteína fabricado de acordo com o método convencional, a forma ou tamanho dos pontos não foi constante. Isto sugere que o chip de proteína de acordo com a presente invenção tem uma uniformidade significativamente alta comparado ao chip convencional de proteína.[0121] As a result, as can be seen in FIG. 8, in the case of the inventive protein chip manufactured using the specific sol composition and dispensing solution I and solution II sequentially without a pre-treatment process of mixing solutions I and II, the shape and size of the dots were constant, but in the In the case of the protein chip manufactured according to the conventional method, the shape or size of the dots was not constant. This suggests that the protein chip according to the present invention has significantly high uniformity compared to the conventional protein chip.

Comparative example 2: comparison with the case where the mixing order was changed

[0122] A mistura sol obtida por mistura das soluções na ordem de mistura, de acordo com a presente invenção, foi comparada com uma mistura sol obtida por mistura das soluções em uma ordem diferente da ordem de mistura da presente invenção.[0122] The sol mixture obtained by mixing the solutions in the mixing order, according to the present invention, was compared with a sol mixture obtained by mixing the solutions in an order different from the mixing order of the present invention.

[0123] De acordo com a ordem de mistura da presente invenção, SolBH, SolBS, água destilada e tampão foram adicionados à composição sol que consiste em SolB1, SolB2 e SolB3 para preparar uma mistura. Para comparação, uma mistura foi preparada do mesmo modo, exceto que SolBH foi adicionado por último. As duas misturas foram fotografadas com uma câmara digital, e as fotografias foram comparados com cada outra.[0123] According to the mixing order of the present invention, SolBH, SolBS, distilled water and buffer were added to the sol composition consisting of SolB1, SolB2 and SolB3 to prepare a mixture. For comparison, a mixture was prepared in the same way, except that SolBH was added last. The two mixtures were photographed with a digital camera, and the photographs were compared to each other.

[0124] Como resultado, como pode ser observado na FIG. 9, quando a mistura foi preparada de acordo com a ordem de mistura da presente invenção, as soluções foram facilmente misturadas com cada outra, e assim, foram claras e não gelificadas por um tempo longo (FIG. 9A), mas quando a mistura foi preparada de acordo com a ordem de mistura diferente, as soluções não foram facilmente misturas com cada outra e foram gelificadas rapidamente (FIG. 9B).[0124] As a result, as can be seen in FIG. 9, when the mixture was prepared according to the mixing order of the present invention, the solutions were easily mixed with each other, and thus, they were clear and not gelled for a long time (FIG. 9A), but when the mixture was prepared according to different mixing order, the solutions were not easily mixed with each other and were quickly gelled (FIG. 9B).

Example 3: HIV analysis and diagnosis using protein chip

[0125] O chip de proteína fabricado no Exemplo 2 foi bloqueado usando 10% solução de leite desnatado, após o qual 50 $, de soro de paciente HIV diluído foi adicionado a cada poço do chip e primariamente incubado em temperatura ambiente por 1 hora. Após conclusão da incubação primária, o soro foi removido, e uma etapa de vortex do chip com 0,2% tampão contendo Tween-20 em uma lavadora para ELISA por 5 minutos foi repetida 4 vezes (primeira lavagem). Após conclusão da primeira lavagem, 50 $, de um anticorpo d-Humano-Cy3 que reconhece o anticorpo humano (Jackson ImmunoResearch) foi adicionado ao chip que foi então secundariamente incubado em temperatura ambiente por 1 hora.Após conclusão da incubação secundária, d-Humano-Cy3 foi removido, e uma etapa de vortex do chip com uma solução de lavagem em uma lavadora para ELISA por 5 minutos foi repetida 4 vezes (segunda lavagem).[0125] The protein chip manufactured in Example 2 was blocked using 10% skim milk solution, after which 50% of diluted HIV patient serum was added to each well of the chip and primarily incubated at room temperature for 1 hour. After completion of the primary incubation, the serum was removed, and a step of vortexing the chip with 0.2% buffer containing Tween-20 in an ELISA washer for 5 minutes was repeated 4 times (first wash). After completion of the first wash, 50$ of a d-Human-Cy3 antibody that recognizes the human antibody (Jackson ImmunoResearch) was added to the chip which was then secondarily incubated at room temperature for 1 hour. After completion of the secondary incubation, d- Human-Cy3 was removed, and a vortexing step of the chip with a wash solution in an ELISA washer for 5 minutes was repeated 4 times (second wash).

[0126] Após conclusão da segunda lavagem, cada poço foi seco deixando repousar em temperatura ambiente por 10 minutos ou mais, e os pontos em que a reação ocorreu foram triados com o scanner laser FUJI FLA-9000 scanner de imagem. Ainda, a intensidade de um sinal fluorescente em cada ponto em que a reação ocorreu foi medida usando o programa de análise de imagem ImageQuant TL, assim quantificando a reação e analisando o grau de reação.[0126] After completion of the second wash, each well was dried and allowed to stand at room temperature for 10 minutes or more, and the points where the reaction occurred were screened with the FUJI FLA-9000 laser image scanner. Furthermore, the intensity of a fluorescent signal at each point where the reaction occurred was measured using the ImageQuant TL image analysis program, thus quantifying the reaction and analyzing the degree of reaction.

[0127] Como mostrado na FIG. 2, os cinco marcadores (p24, p31, gp41, gp120 e gp160; Abcam Co., Ltd., Fitzerald Co., Ltd.) mostraram respostas ao soro do paciente, e o chip de controle negativo contendo nenhum marcador não mostrou resposta.[0127] As shown in FIG. 2, the five markers (p24, p31, gp41, gp120, and gp160; Abcam Co., Ltd., Fitzerald Co., Ltd.) showed responses to the patient's serum, and the negative control chip containing no markers showed no response.

[0128] A FIG. 3 mostra os resultados obtidos por diluição serial de 4 dos antígenos (p24, p31, gp41, gp120) que reagiram mais ativamente entre os cinco antígenos e um antígeno HIV1 tipo O, destacando cada uma das diluições em cada poço e deixando reagir com um soro padrão HIV. Como esperado, poderia ser observado que a quantificação da reação foi corretamente obtida. Os resultados acima indicam que a reação de antígeno- anticorpo no chip de proteína fabricado na presente invenção especificamente ocorre.[0128] FIG. 3 shows the results obtained by serial dilution of 4 of the antigens (p24, p31, gp41, gp120) that reacted most actively between the five antigens and an HIV1 type O antigen, highlighting each of the dilutions in each well and allowing to react with a serum HIV standard. As expected, it could be seen that the quantification of the reaction was correctly obtained. The above results indicate that the antigen-antibody reaction on the protein chip manufactured in the present invention specifically takes place.

[0129] A FIG. 4 mostra os resultados de quantificação da resposta ao soro padrão HIV1 em pontos contendo cada um dos cinco tipos de antígenos. O eixo X da FIG. 4 indica um título medido quando o HIV do soro padrão foi diagnosticado com um kit de diagnóstico ELISA convencional, e como pode ser observado na FIG. 4, os resultados da análise obtidos usando o chip de proteína da presente invenção têm correlação com os resultados da análise obtidos usando o chip de diagnóstico convencional. O PRB204-00 no eixo X foi amostra de soro padrão de paciente adquirida de Bostonbiomedica, Inc. O nome do produto foi painel de desempenho de título misturado Anti-HIV1 e número serial foi PRB204(M). O valor de título é valor s/co detectado por kit de diagnóstico convencional e o valor é sinal para razão de cutoff (valor padrão de positivo e negativo) e quando o valor é mais do que 1, o resultado é julgado como positivo. O eixo Y da FIG. 4 indica a intensidade (“sinal”) de um sinal fluorescente nos pontos, dividido pela intensidade (“controle”) de um sinal fluorescente nos pontos de controle negativo.[0129] FIG. 4 shows the results of quantitating the response to standard HIV1 serum at points containing each of the five types of antigens. The X axis of FIG. 4 indicates a titer measured when standard serum HIV was diagnosed with a conventional ELISA diagnostic kit, and as can be seen in FIG. 4, the analysis results obtained using the protein chip of the present invention correlate with the analysis results obtained using the conventional diagnostic chip. PRB204-00 on the X axis was standard patient serum sample purchased from Bostonbiomedica, Inc. Product name was Anti-HIV1 Mixed Titer Performance Panel and serial number was PRB204(M). The titer value is s/c value detected by conventional diagnostic kit and the value is signal to cutoff ratio (default value of positive and negative) and when the value is more than 1, the result is judged as positive. The Y axis of FIG. 4 indicates the intensity (“signal”) of a fluorescent signal at the points, divided by the intensity (“control”) of a fluorescent signal at the negative control points.

[0130] A FIG. 5 é uma tabela que mostra uma resposta aos painéis de soroconversão coletados a partir de um paciente infectado por HIV em vários dias, em comparação com o kit de diagnóstico convencional. O sodo do paciente é amostra padrão adquirida de Bostonbiomedica, Inc. O resultado de detecção usando kit de diagnóstico convencional foi ainda fornecido junto com a amostra padrão. O nome da amostra foi painel V de soroconversão Anti-HIV1 e número serial foi PRB922.[0130] FIG. 5 is a table showing a response to seroconversion panels collected from an HIV-infected patient over several days compared to the conventional diagnostic kit. The patient's soda is a standard sample purchased from Bostonbiomedica, Inc. The detection result using a conventional diagnostic kit was also provided along with the standard sample. The sample name was Anti-HIV1 Seroconversion Panel V and the serial number was PRB922.

[0131] Como pode ser observado neste, alguns dias após a infecção por HIV, o kit convencional ELISA de diagnóstico não detecta a infecção por HIV, mas o chip de proteína da presente invenção poderia detectar a infecção por HIV ainda no estágio inicial da infecção, como o kit de detecção do antígeno.[0131] As can be seen in this, a few days after HIV infection, the conventional diagnostic ELISA kit does not detect HIV infection, but the protein chip of the present invention could detect HIV infection even at the early stage of infection. , such as the antigen detection kit.

[0132] Isto indica que o biochip da presente invenção tem uma sensibilidade significativamente superior em comparação com o kit convencional ELISA de diagnóstico de anticorpo.Exemplo 4: substituição de método de Western blot por chip de proteína[0132] This indicates that the biochip of the present invention has a significantly higher sensitivity compared to the conventional antibody diagnostic ELISA kit.Example 4: Replacement of Western blot method by protein chip

[0133] Western blot e método de imunocoloração é uma técnica para encontrar uma proteína específica a partir de uma mistura de várias proteínas e é um método para detectar a presença de uma proteína específica causando uma reação de antígeno-anticorpo usando um anticorpo contra a proteína a ser encontrada.[0133] Western blot and immunostaining method is a technique for finding a specific protein from a mixture of several proteins and is a method for detecting the presence of a specific protein causing an antigen-antibody reaction using an antibody against the protein to be found.

[0134] Em geral, um processo para encontrar uma proteína específica por Western blot compreende eletroforese de uma mistura de proteínas em um gel SDS-poliacrilamida para separar a mistura de acordo com o tamanho, transferir a proteína à uma membrana de nitrocelulose ou náilon, e encontrar um antígeno contra um anticorpo específico na membrana à qual a proteína foi transferida. O anticorpo que é usado no processo é marcado com um isótopo radioativo ou conjugado com uma enzima específica (por exemplo, peroxidase de rabano silvestre) ou um corante fluorescente, e assim tornar possível visualizar a proteína a ser encontrada.[0134] In general, a process to find a specific protein by Western blot comprises electrophoresis of a mixture of proteins on an SDS-polyacrylamide gel to separate the mixture according to size, transfer the protein to a nitrocellulose or nylon membrane, and finding an antigen against a specific antibody on the membrane to which the protein has been transferred. The antibody that is used in the process is labeled with a radioactive isotope or conjugated with a specific enzyme (eg horseradish peroxidase) or a fluorescent dye, and thus makes it possible to visualize the protein to be found.

[0135] Quando o chip de proteína preparado no Exemplo 2 foi usado ao invés de Western blot compreendendo etapas complexas, uma proteína específica em uma mistura de proteína poderia ser encontrada em um modo simples e fácil por imobilização da mistura de proteína e então avaliar a mistura de proteína com um anticorpo conjugado a um corante fluorescente.[0135] When the protein chip prepared in Example 2 was used instead of Western blot comprising complex steps, a specific protein in a protein mixture could be found in a simple and easy way by immobilizing the protein mixture and then evaluating the mixing protein with an antibody conjugated to a fluorescent dye.

[0136] Ainda, devido à eletroforese de proteína é geralmente realizada em um estado reduzido, a proteína é deixada ligar com um anticorpo em um estado desnaturado. Se uma modalidade específica somente reconhece a forma nativa da proteína, a proteína não pode ser encontrada por Western blot geral. No entanto, o chip sol-gel de proteína de acordo com a presente invenção torna possível imobilizar a proteína em uma forma nativa, indicando que o chip da presente invenção é mais útil.[0136] Further, because protein electrophoresis is generally performed in a reduced state, the protein is allowed to bind with an antibody in a denatured state. If a specific modality only recognizes the native form of the protein, the protein cannot be found by general Western blotting. However, the protein sol-gel chip according to the present invention makes it possible to immobilize the protein in a native form, indicating that the chip of the present invention is more useful.

[0137] Os seguintes experimentos foram realizados usando o chip sol-gel preparado no Exemplo 2.[0137] The following experiments were performed using the sol-gel chip prepared in Example 2.

[0138] (1) Experimento de comparação de acordo com a formanativa e forma desnaturada de p24(i) Primeiro, um experimento foi realizado usando um anticorpo que liga somente à forma nativa sem ligar à forma desnaturada. Como resultado, nenhuma banda apareceu em Western blot, e somente o anticorpo foi positivo no chip sol-gel.(ii) análise Western blot e análise de chip sol-gel de proteína foram realizadas usando um anticorpo que é contra o mesmo antígeno mas liga à forma desnaturada. Como resultado, o anticorpo foi positivo em ambos Western blot e chip sol-gel.[0138] (1) Comparison experiment according to formative and denatured form of p24(i) First, an experiment was performed using an antibody that binds only to the native form without binding to the denatured form. As a result, no band appeared on Western blot, and only the antibody was positive on the sol-gel chip. (ii) Western blot analysis and protein sol-gel chip analysis were performed using an antibody that is against the same antigen but binds to the denatured form. As a result, the antibody was positive on both Western blot and sol-gel chip.

[0139] Isto sugere que o chip sol-gel de acordo com a presente invenção pode detectar ambas as formas desnaturada e nativa.[0139] This suggests that the sol-gel chip according to the present invention can detect both denatured and native forms.

[0140] (2) Experimento usando extrato bruto de E. coli emque proteína p24 foi expressa(i) Extrato bruto de E. coli em que a proteína p24 foi expressa foi fixada ao chip sol-gel de proteína em várias concentrações (Lisados 1, 2 e 3), e então avaliado com um anticorpo contra a proteína expressa. Como resultado, o anticorpo foi positivo no chip sol-gel de proteína (FIG. 10). (ii) Extrato bruto de E. coli (N) em que uma proteína específica não foi expressa foi fixado ao chip sol-gel de proteína e então avaliado com o anticorpo descrito acima. Como resultado, mostrado na FIG. 10, o anticorpo foi negativo no chip sol-gel de proteína (FIG. 10).[0140] (2) Experiment using crude extract of E. coli in which protein p24 was expressed (i) Crude extract of E. coli in which protein p24 was expressed was fixed to the protein sol-gel chip at various concentrations (Lysates 1 , 2 and 3), and then evaluated with an antibody against the expressed protein. As a result, the antibody was positive on the protein sol-gel chip (FIG. 10). (ii) E. coli crude extract (N) in which a specific protein was not expressed was fixed to the protein sol-gel chip and then evaluated with the antibody described above. As a result, shown in FIG. 10, the antibody was negative on the protein sol-gel chip (FIG. 10).

[0141] Na FIG. 10, “N” é um controle negativo ao qual oextrato bruto de E. coli em que uma proteína específica não foi expressão foi ligada, Lisado 1 é um grupo ao qual o extrato bruto de E. coli em que uma proteína específica foi expressa em uma concentração de 0,09μg/M foi fixado, Lisado 2 é um grupo ao qual o extrato bruto de E. coli em que uma proteína específica foi expressa em uma concentração de 0,18μμ/^ foi fixada, e Lisado 3 é um grupo ao qual extrato bruto de E. coli em que uma proteína específica foi expressa em uma concentração de 0,27μg/^ foi fixada. Ainda, “P” é um controle positivo ao qual o material fluorescente Cy3 foi fixado.[0141] In FIG. 10, “N” is a negative control to which the crude extract of E. coli in which a specific protein was not expressed was bound, Lysate 1 is a group to which the crude extract of E. coli in which a specific protein was expressed in a concentration of 0.09μg/M was fixed, Lysate 2 is a group to which the crude extract of E. coli in which a specific protein was expressed at a concentration of 0.18μμ/^ was fixed, and Lysate 3 is a group to which a crude extract of E. coli in which a specific protein was expressed at a concentration of 0.27μg/^ was fixed. Furthermore, “P” is a positive control to which the Cy3 fluorescent material was fixed.

[0142] (3) (i) Um anticorpo contra proteína p24 foi fixadoao chip sol-gel de proteína em várias concentrações e então avaliado usando um método de ensaio em sanduíche com extrato bruto de E. coli em que a proteína p24 foi super expressa. Então, o anticorpo foi deixado ligar ao chip de proteína e avaliado. Como resultado, a proteína foi positiva no chip sol-gel (FIG. 11).[0142] (3) (i) An antibody against p24 protein was fixed to the protein sol-gel chip at various concentrations and then evaluated using a crude E. coli extract sandwich assay method in which the p24 protein was overexpressed . Then, the antibody was allowed to bind to the protein chip and evaluated. As a result, the protein was positive on the sol-gel chip (FIG. 11).

[0143] (ii) Um anticorpo contra um antígeno a ser detectado foi fixado ao chip sol-gel de proteína em várias concentrações, e então avaliado usando um método de ensaio em sanduíche com extrato bruto de E. coli em que um antígeno específico não foi expresso. Então, o anticorpo foi deixado ligar ao chip e avaliado. Como resultado, o anticorpo foi negativo no chip solgel (FIG. 11).[0143] (ii) An antibody against an antigen to be detected was fixed to the protein sol-gel chip at various concentrations, and then evaluated using a crude E. coli extract sandwich assay method in which a specific antigen was not was expressed. Then, the antibody was allowed to bind to the chip and evaluated. As a result, the antibody was negative on the solgel chip (FIG. 11).

[0144] Na FIG. 11, “N” é um controle negativo ao qual oanticorpo não foi fixado, e Ab1 e Ab2 são fixados em várias concentrações (0,063μg/M, e 0,125ug/^). Ainda, “P” é um controle positivo ao qual o material fluorescente Cy3 foi fixado.[0144] In FIG. 11, “N” is a negative control to which the antibody was not fixed, and Ab1 and Ab2 are fixed at various concentrations (0.063μg/M, and 0.125ug/^). Furthermore, “P” is a positive control to which the Cy3 fluorescent material was fixed.

[0145] (4) (i) Antígenos (p24, p31, gp41, gp120 e gp160)contra um anticorpo para uma doença (AIDS) a ser detectada foram fixados ao chip sol-gel de proteína, e então avaliados com um material (soro positivo) contendo um anticorpo específico, como um soro de paciente. Como resultado, o anticorpo foi positivo no chip sol-gel (FIG. 12).[0145] (4) (i) Antigens (p24, p31, gp41, gp120 and gp160) against an antibody for a disease (AIDS) to be detected were fixed to the protein sol-gel chip, and then evaluated with a material ( positive serum) containing a specific antibody, such as a patient serum. As a result, the antibody was positive on the sol-gel chip (FIG. 12).

[0146] (ii) Antígenos contra um anticorpo a ser detectadoforam fixados ao chip sol-gel, e então avaliados com um material (soro negativo) não contendo nenhum anticorpo específico, como soro. Como resultado, o anticorpo foi negativo no chip sol-gel (FIG. 12). Exemplo 5: detecção de proteína ou material de ligação específico ao composto[0146] (ii) Antigens against an antibody to be detected were fixed to the sol-gel chip, and then evaluated with a material (negative serum) containing no specific antibody, such as serum. As a result, the antibody was negative on the sol-gel chip (FIG. 12). Example 5: detection of protein or compound-specific binding material

[0147] Como mostrado na FIG. 13, um composto específico (bisfenol A) foi fixado ao chip sol-gel fabricado no Exemplo 2. Como um controle negativo, somente uma solução tampão que foi usada para dissolver o composto foi fixado ao chip. Ainda, o chip foi analisado usando um aptâmero de DNA de fita dupla marcado com corante fluorescente (cy3) (PCL, Inc.) capaz de ligar a bisfenol A.[0147] As shown in FIG. 13, a specific compound (bisphenol A) was affixed to the sol-gel chip manufactured in Example 2. As a negative control, only a buffer solution that was used to dissolve the compound was affixed to the chip. Furthermore, the chip was analyzed using a fluorescent dye (cy3)-labeled double-stranded DNA aptamer (PCL, Inc.) capable of binding bisphenol A.

[0148] Ligação proteína-proteína pode ser detectado por dois híbridos de levedura ou imunoprecipitação (IP), mas os métodos capazes de facilmente detectar a ligação de composto- proteína ou ligação composto-DNA são raro. Como pode ser observado nos resultados experimentais acima, o chip de proteína fabricado no Exemplo 2 pode fixar os vários materiais, incluindo os materiais de peso molecular baixo, como compostos ou DNA, proteínas e anticorpos, e assim facilmente detectar a ligação dos vários materiais.[0148] Protein-protein binding can be detected by two yeast hybrids or immunoprecipitation (IP), but methods capable of easily detecting compound-protein binding or compound-DNA binding are rare. As can be seen from the above experimental results, the protein chip made in Example 2 can fix the various materials, including the low molecular weight materials such as compounds or DNA, proteins and antibodies, and thus easily detect the binding of the various materials.

[0149] Embora a presente invenção tenha sido descrita em detalhes com referência a situações específicas, fica evidente para os técnicos no assunto que esta descrição se refere somente a uma modalidade preferencial e não limita o escopo da presente invenção. Assim, o escopo substancial da presente invenção será definido pelas reivindicações anexadas e equivalentes dos mesmos.[0149] Although the present invention has been described in detail with reference to specific situations, it is evident to those skilled in the art that this description refers only to a preferred embodiment and does not limit the scope of the present invention. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.

INDUSTRIAL APPLICABILITY

[0150] Como descrito acima, quando o biochip é preparado por gelificação da composição sol de acordo com a presente invenção, a composição sol que consiste em SolB1, SolB2 e SolB3, SolBH, SolBS, DW e solução tampão são misturados em ordem, e então estabilizados em baixa temperatura, por meio da qual a taxa de gelificação da composição sol pode ser retardada e a gelificação estável da composição pode ser induzida, assim, facilitando a dispensação da solução sol e mantendo a atividade dos pontos. Ainda, um biochip uniforme pode ser fabricado em um modo simples e fácil destacando as soluções na superfície do substrato usando um arranjador sem um processo de pré- tratamento de pré-mistura das soluções.[0150] As described above, when the biochip is prepared by gelling the sol composition according to the present invention, the sol composition consisting of SolB1, SolB2 and SolB3, SolBH, SolBS, DW and buffer solution are mixed in order, and then stabilized at low temperature, whereby the rate of gelation of the sol composition can be retarded and stable gelation of the composition can be induced, thus facilitating the dispensing of the sol solution and maintaining the activity of the spots. Furthermore, a uniform biochip can be fabricated in a simple and easy way by highlighting the solutions on the surface of the substrate using an arranger without a pre-treatment process of pre-mixing the solutions.

Claims

1. Method for preparing a biochip by gelling a sol composition, characterized in that it comprises the sequential steps of: (a) dispensing on the substrate a sol composition consisting of SolB1, SolB2 and SolB3 and dispensing SolBH (solution I) selected from the group that consists of HCl, H2SO4, HNO3 and CH3COOH in the substrate on which the sol composition was dispensed; and (b) dispensing solution II, comprising SolBS buffer, a biological material that interacts with target biological material and distilled water, onto the substrate on which solution I was dispensed, and then gelling the dispensed solutions, where the method does not comprise a process a pretreatment which is one or more selected from the group consisting of (i) a process of mixing SolB1, SolB2, SolB3, SolBH, SolBS, or biological material that interacts with target biological material; (ii) process of vortexing the mixed solution of (i); and (iii) process of stabilizing the mixed solution of (i) or (ii), wherein (i) said SolB1 is at least a first silicate monomer selected from the group consisting of methyltriethoxysilane (MTES), ethyltriethoxysilane (ETrEOS), silicate of sodium, tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetraethyl orthosilicate (TEOS) and tetramethoxysilicate (TMS); (ii) said SolB2 is at least a second silicate monomer selected from the group consisting of 3-aminotrimethoxysilane (3-ATMS), diglycerylsilane ( DGS), methyltrimethoxysilicate (MTMS), polyglycerylsilicate (PGS), polyvinylacetate, polyvinylpyrrolidone, glyceryl methacrylate, hydroxyethyl acrylate, N,N-dicusinimidylcarbonate (DSC), 1,3,5-trimethylbenzene, cetyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium bromide, 3-(triethoxysilyl) )propyl succinic anhydride, N-(3-triethoxysilypropyl)-4-hydroxybutylamide (SIT8189.5), N-(triethoxysilylpropyl)gluconamide (SIT8189.0), pluronic L121 and tetramethyl ammonium hydroxide; and (iii) said SolB3 is at least one additive selected from the group consisting of aminopropyltriethoxysilane (APTES), 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMOS), N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (PEOU), glycerol, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 and PEG8000.

2. Method according to claim 1, characterized in that a hand-spotting technique is performed without using any arranger or a non-contact arranger is used.

3. Method according to claim 1, characterized in that SolBl, SolB2, SolB3, SolBH, SolBS and the biological material that interacts with target biological material are contained in a container before dispensing, and dispensing is performed by suction through a mouthpiece.

4. Method according to claim 1, characterized in that SolBl, SolB2, SolB3, SolBH, SolBS and biological material that interacts with target biological material are contained in a mass production cartridge that connects with a nozzle of dispensing, and a dispensing amount of more than 100 times the amount provided by the suction process, making it possible to achieve mass production.

5. Method according to claim 1, characterized in that the substrate comprises any one selected from the group consisting of polymethylmethacrylate (PMMA), plastic, silicon, and glass.

6. Method according to claim 1, characterized in that the biological material that interacts with the target biological material is one selected from the group consisting of nucleic acid, protein, peptide and low molecular weight material.

7. Method according to claim 1, characterized in that the substrate is optimized at a temperature above the dew point before use and the second solution is dispensed onto the substrate at a moisture content greater than 50 %.

8. Method, according to claim 1, characterized in that the proportion of the amounts of composition sol: solution I: solution II that are dispensed is between 3:1:4 and 1:2:8.

9. Method according to claim 1, characterized in that SolBH and SolBS have concentrations ranging from 1 mM to 100 mM.

10. Method according to claim 1, characterized in that the volume ratio of SolBS: distilled water: biological material that interacts with the target biological material is between 1:2:1 and 2:5:1.

11. Method according to claim 1, characterized in that the buffer is a sodium phosphate buffer containing a pH ranging from 3 to 8.

12. Method according to claim 1, characterized in that the substrate is surface treated with plasma, is etched or is treated with PDMS, silicate monomer, or polymeric material.

13. Method for preparing a biochip by gelling a sol composition, characterized in that it comprises the steps of: (a) adding to a sol composition comprising SolB1, SolB2 and SolB3 a SolBH solution (solution I) selected from the group consisting of HCl, H2SO4, HNO3 and CH3COOH; (b) mixing the solution from step (a) with SolBS buffer and distilled water, and then stabilizing the mixed solution at a temperature ranging from -20°C to 4°C; and (c) mixing the stabilized solution from step (b) with a solution containing a biological material that interacts with the target biological material, dispensing the mixed solution onto a substrate and gelling the dispensed solution, wherein (i) said SolB1 is at least least one first silicate monomer selected from the group consisting of methyltriethoxysilane (MTES), ethyltriethoxysilane (ETrEOS), sodium silicate, tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetraethyl orthosilicate (TEOS) and tetramethoxysilicate (TMS); wherein (ii) said SolB2 is at least one second silicate monomer selected from the group consisting of 3-aminotrimethoxysilane (3-ATMS), diglycerylsilane (DGS), methyltrimethoxysilicate (MTMS), polyglycerylsilicate (PGS), polyvinylacetate, polyvinylpyrrolidone, glyceryl methacrylate, hydroxyethyl acrylate, N,N -dicusinimidylcarbonate (DSC), 1,3,5-trimethylbenzene, cetyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium bromide, 3-(triethoxysily)propyl succinic anhydride, N-(3-triethoxysilylpropyl)-4-hydroxybutyl amide (SIT8189.5) 50%, N-(triethoxysilylpropyl)gluconamide (SIT8189.0), pluronic L121 and tetramethyl ammonium hydroxide; and wherein (iii) said SolB3 is at least one additive selected from the group consisting of aminopropyltriethoxysilane (APTES), 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMOS), N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (PEOU), glycerol, PEG200, PEG400, PEG600 , PEG1350 and PEG8000.