JP5770366B2 - Biochip manufacturing sol-gel kit and biochip manufacturing method using the same - Google Patents
Biochip manufacturing sol-gel kit and biochip manufacturing method using the same Download PDFInfo
- Publication number
- JP5770366B2 JP5770366B2 JP2014508266A JP2014508266A JP5770366B2 JP 5770366 B2 JP5770366 B2 JP 5770366B2 JP 2014508266 A JP2014508266 A JP 2014508266A JP 2014508266 A JP2014508266 A JP 2014508266A JP 5770366 B2 JP5770366 B2 JP 5770366B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- solution
- group
- sol
- protein
- manufacturing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 title claims description 73
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 58
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 109
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 108
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 105
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 102
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 86
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 74
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 46
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 44
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 32
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 31
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 26
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 22
- 238000001879 gelation Methods 0.000 claims description 22
- XDJICGGEEMYEQS-UHFFFAOYSA-N 3-(2,3-dihydroxypropylsilyl)propane-1,2-diol Chemical compound OCC(O)C[SiH2]CC(O)CO XDJICGGEEMYEQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N Tetraethyl orthosilicate Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)OCC BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- PFYXSUNOLOJMDX-UHFFFAOYSA-N bis(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) carbonate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)ON1C(=O)CCC1=O PFYXSUNOLOJMDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 20
- LFQCEHFDDXELDD-UHFFFAOYSA-N tetramethyl orthosilicate Chemical compound CO[Si](OC)(OC)OC LFQCEHFDDXELDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- WGTYBPLFGIVFAS-UHFFFAOYSA-M tetramethylammonium hydroxide Chemical compound [OH-].C[N+](C)(C)C WGTYBPLFGIVFAS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 20
- DENFJSAFJTVPJR-UHFFFAOYSA-N triethoxy(ethyl)silane Chemical compound CCO[Si](CC)(OCC)OCC DENFJSAFJTVPJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- CPUDPFPXCZDNGI-UHFFFAOYSA-N triethoxy(methyl)silane Chemical compound CCO[Si](C)(OCC)OCC CPUDPFPXCZDNGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 17
- -1 triethoxysilylpropyl Chemical group 0.000 claims description 15
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 claims description 14
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 claims description 11
- 239000004115 Sodium Silicate Substances 0.000 claims description 11
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 11
- 229920002689 polyvinyl acetate Polymers 0.000 claims description 11
- 239000011118 polyvinyl acetate Substances 0.000 claims description 11
- NTHWMYGWWRZVTN-UHFFFAOYSA-N sodium silicate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Si]([O-])=O NTHWMYGWWRZVTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229910052911 sodium silicate Inorganic materials 0.000 claims description 11
- JCZPMGDSEAFWDY-SQOUGZDYSA-N (2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanamide Chemical compound NC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO JCZPMGDSEAFWDY-SQOUGZDYSA-N 0.000 claims description 10
- AUHZEENZYGFFBQ-UHFFFAOYSA-N 1,3,5-trimethylbenzene Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1 AUHZEENZYGFFBQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- QRIMLDXJAPZHJE-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxypropyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCC(O)CO QRIMLDXJAPZHJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- GXDMUOPCQNLBCZ-UHFFFAOYSA-N 3-(3-triethoxysilylpropyl)oxolane-2,5-dione Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCC1CC(=O)OC1=O GXDMUOPCQNLBCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 229920002565 Polyethylene Glycol 400 Polymers 0.000 claims description 10
- 229920002582 Polyethylene Glycol 600 Polymers 0.000 claims description 10
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 claims description 10
- WOWHHFRSBJGXCM-UHFFFAOYSA-M cetyltrimethylammonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C WOWHHFRSBJGXCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 10
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 claims description 10
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 claims description 10
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims description 10
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims description 10
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims description 10
- OMIGHNLMNHATMP-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethyl prop-2-enoate Chemical compound OCCOC(=O)C=C OMIGHNLMNHATMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- QKDAMFXBOUOVMF-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-n-(3-triethoxysilylpropyl)butanamide Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCNC(=O)CCCO QKDAMFXBOUOVMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229920000604 Polyethylene Glycol 200 Polymers 0.000 claims description 9
- JLFNLZLINWHATN-UHFFFAOYSA-N pentaethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCO JLFNLZLINWHATN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 8
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 7
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 6
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims description 6
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 5
- ARYZCSRUUPFYMY-UHFFFAOYSA-N methoxysilane Chemical compound CO[SiH3] ARYZCSRUUPFYMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 4
- 239000010703 silicon Substances 0.000 claims description 4
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 claims description 3
- 235000013870 dimethyl polysiloxane Nutrition 0.000 claims description 3
- CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N octamethyltrisiloxane Chemical compound C[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)C CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004987 plasma desorption mass spectroscopy Methods 0.000 claims description 3
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 claims description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000004381 surface treatment Methods 0.000 claims description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 claims description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 2
- 238000005530 etching Methods 0.000 claims 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 45
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 23
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 22
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 19
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 13
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 11
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- WZEYZMKZKQPXSX-UHFFFAOYSA-N 1,3,5-trimethylbenzene Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1.CC1=CC(C)=CC(C)=C1 WZEYZMKZKQPXSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 6
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 6
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 6
- 238000003980 solgel method Methods 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- IISBACLAFKSPIT-UHFFFAOYSA-N bisphenol A Chemical compound C=1C=C(O)C=CC=1C(C)(C)C1=CC=C(O)C=C1 IISBACLAFKSPIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- BPSIOYPQMFLKFR-UHFFFAOYSA-N trimethoxy-[3-(oxiran-2-ylmethoxy)propyl]silane Chemical compound CO[Si](OC)(OC)CCCOCC1CO1 BPSIOYPQMFLKFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 238000000059 patterning Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002032 lab-on-a-chip Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KTFLAZUEXFFCFI-UHFFFAOYSA-N 4-(3-triethoxysilylpropylamino)butan-1-ol Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCNCCCCO KTFLAZUEXFFCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001598984 Bromius obscurus Species 0.000 description 1
- GAWIXWVDTYZWAW-UHFFFAOYSA-N C[CH]O Chemical group C[CH]O GAWIXWVDTYZWAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108091008102 DNA aptamers Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000012775 microarray technology Methods 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000010069 protein adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000009489 vacuum treatment Methods 0.000 description 1
- 238000001086 yeast two-hybrid system Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
- G01N33/552—Glass or silica
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
Description
本発明は、特定溶液を順次混合して製造したゾル組成物を利用するか、または前処理過程なしにこのような特定溶液を順次基板に直接分注して簡単にバイオチップを製造する方法及びバイオチップ製造用ゾル−ゲルキットに関するものである。 The present invention uses a sol composition prepared by sequentially mixing a specific solution, or a method for easily manufacturing a biochip by directly dispensing such a specific solution directly onto a substrate without a pretreatment process. The present invention relates to a sol-gel kit for producing a biochip.
バイオチップは、新しいナノテクノロジー(nanotechnology、NT)、バイオテクノロジー(biotechnology、BT)、情報テクノロジー(information technology、IT)が融合した技術の代表的な例である。バイオチップは、種々の生体物質を固体状支持体の表面に高集積微細配列(high-density microarray)としたもので、表面に付ける生体物質によりDNAチップ、蛋白質チップ、セルチップ、及びニューロンチップなど種々のチップに分けられる。また、バイオチップは、微細流体学技術と併せてLOC(lab-on-a-chip)として発展している。バイオチップの細部技術としては、生体物質を固定させる技術、固体支持体を生体物質親和的に作る技術、生体物質を微細配列する技術、作られたチップ上で種々の生体反応を実施するアッセイ技術、反応結果を感知する技術、固定化対象である生体物質を作る蛋白質工学、遺伝子組換え技術などがある。 A biochip is a representative example of a technology in which new nanotechnology (NT), biotechnology (BT), and information technology (IT) are fused. A biochip is a high-density microarray in which various biological materials are formed on the surface of a solid support. Depending on the biological material attached to the surface, various biochips such as DNA chips, protein chips, cell chips, and neuron chips can be used. Divided into chips. Biochips have also been developed as LOC (lab-on-a-chip) along with microfluidics technology. The biochip detail technology includes biological material immobilization technology, solid support technology for biomaterial affinity, biomaterial micro-array technology, and assay technology for performing various biological reactions on the produced chip. , Technology for detecting reaction results, protein engineering for producing biological material to be immobilized, and gene recombination technology.
蛋白質チップは、バイオチップ(biochip)の一種であり、種々の蛋白質を単位面積の固体状支持体の表面に高集積微細配列(intense microarray)したものである。最近、既に開発されて商用化されたDNAチップの製作原理及び製作技術要素を導入して蛋白質チップを製作しようとする努力が払われている。一般に、商用化されたDNAチップの多くは、コーティング物質で表面を前処理したガラス板上にDNAを固定化させて製作したものである。DNAチップの製作に用いられる方法と類似する方法で蛋白質チップを製造する場合、即ちコーティング物質で表面を前処理したガラス板上に蛋白質を固定化して蛋白質チップを製造する場合は、固定される標的蛋白質の物理化学的特性の差によって多様な問題が発生している。 The protein chip is a kind of biochip, in which various proteins are highly integrated microarray on the surface of a solid support having a unit area. Recently, efforts have been made to manufacture protein chips by introducing the manufacturing principles and manufacturing technology elements of DNA chips that have already been developed and commercialized. In general, many of the commercially available DNA chips are manufactured by immobilizing DNA on a glass plate whose surface has been pretreated with a coating substance. When a protein chip is manufactured by a method similar to the method used to manufacture a DNA chip, that is, when a protein chip is manufactured by immobilizing a protein on a glass plate whose surface has been pretreated with a coating substance, the target to be immobilized Various problems occur due to differences in physicochemical properties of proteins.
初期蛋白質チップは、表面処理されたガラス板上に蛋白質をそのまま付着させた後、簡単な結合分析(binding assay)を行うものであったが、固定化された蛋白質の活性可否により実際作動可否が左右されて、本来の目的を達成するのに困難が多かった(MacBeath and Schreiber, Science 289:1760, 2000)。このような問題点は前述した通り蛋白質が持つ固有な物理化学的特性の差によって発生する蛋白質の変成(denaturation)或いは不活性化、分解(degradation)等から引き起こされる。このような問題点を克服するために、DNAとは異なる蛋白質の特性に適した蛋白質付着表面処理技術及び蛋白質固定物質などに対する研究が行われている。これに対する研究は、蛋白質チップ表面上に固定反応を起こしながら、同時に蛋白質の活性を維持する方法を提供するのに焦点が合わせたもので、例えばパーキンエルマー(PerkinElmer)に最近買収されたパッカードバイオサイエンス(Packard Bioscience)のヒドロゲル(Hydrogel)TMコーティングスライド、プロリンクス(Prolinx)のバーサリンクス(versalinx)チップ、ザイオミックス(Zyomyx)のバイオチップのPDCチップなどが挙げられる。 The initial protein chip is a simple binding assay after the protein is directly deposited on the surface-treated glass plate. However, depending on whether the immobilized protein is active or not, the protein chip may actually be operated. Depending on the situation, it was difficult to achieve the original purpose (MacBeath and Schreiber, Science 289: 1760, 2000). Such problems are caused by protein denaturation or inactivation, degradation, etc., which are caused by differences in the intrinsic physicochemical properties of proteins as described above. In order to overcome such problems, research has been conducted on a protein adhesion surface treatment technique and a protein immobilizing material suitable for the characteristics of a protein different from DNA. Research on this has focused on providing a way to maintain the activity of the protein while at the same time causing an immobilization reaction on the surface of the protein chip, such as Packard Bioscience recently acquired by PerkinElmer. (Packard Bioscience) Hydrogel ™ coated slides, Prolinx Versalynx chips, Zyomyx Biochip PDC chips, and the like.
一方、ゾル−ゲル工程は、微細加工を介して微細構造を作るのに利用されてきた技術であり、特に無機物質に生体分子を化学的に付着させる代わりに穏やかな工程を介して結合網を形成して、この結合網中に生体分子を共有結合以外の方法で固定化するのに多く利用されてきた技術である(Gill I. and Ballesteros A.,Trends Biotechnol., 18:282, 2000)。 On the other hand, the sol-gel process is a technique that has been used to create a fine structure through microfabrication. In particular, instead of chemically attaching biomolecules to inorganic substances, a bonding network is formed through a gentle process. It is a technique that has been widely used to form and immobilize biomolecules in this binding network by methods other than covalent bonding (Gill I. and Ballesteros A., Trends Biotechnol., 18: 282, 2000) .
さらに、酵素をはじめとする多くの生体分子が塊状ゾル−ゲルマトリックス中に固定されて生体触媒やバイオセンサーの製作にも利用されており(Reetz, Adv. Mater., 9:943, 1997)、特に透明な光学的性質のために光学的発色検出にも利用されている(Edminston, et al., J. Coll. Interf. Sci., 163:395, 1994)。また、生体分子は、ゾル−ゲル反応によって固定化されると、化学的に安定化されるだけでなく、熱的にも非常に安定化されると知られている(Dave, et al., Anal. Chem., 66:1120, 1994)。 In addition, many biomolecules including enzymes are immobilized in a massive sol-gel matrix and used for the production of biocatalysts and biosensors (Reetz, Adv. Mater., 9: 943, 1997) It is also used for optical color detection due to its transparent optical properties (Edminston, et al., J. Coll. Interf. Sci., 163: 395, 1994). Biomolecules are known not only to be chemically stabilized but also to be highly thermally stabilized when immobilized by a sol-gel reaction (Dave, et al., Anal. Chem., 66: 1120, 1994).
バイオセンサーの場合、前記ゾル−ゲル反応は、単純な固定だけでなく、固体支持体上に微細構造を形成してパターン化(patterning)する方法で利用されている。この時、パターン化方法は、流体力学を利用して液相であるゾル状態でモールドで形を作ってゲル化させた後、モールドを外してパターンを作る。例えば、毛細管内マイクロ−モジュリング(micro-modulingin-capillaries、MIMIC)(Kim, J. Ferment. Bioeng., 82:239, 1995; Marzolin, Adv. Mater., 10:571, 1998; Schuller, et al., Appl. Optics., 38:5799, 1999)と呼ばれる技術は、メソコスピック(mesoscopic)シリカをパターン化する技術である。前記技術は、微細流体工学の基本的なパターン化に利用できる。 In the case of a biosensor, the sol-gel reaction is used not only by simple fixation but also by a method of patterning by forming a fine structure on a solid support. At this time, the patterning method uses hydrodynamics to form a gel with a mold in a sol state that is a liquid phase, and then forms a pattern by removing the mold. For example, micro-moduling in-capillaries (MIMIC) (Kim, J. Ferment. Bioeng., 82: 239, 1995; Marzolin, Adv. Mater., 10: 571, 1998; Schuller, et al , Appl. Optics., 38: 5799, 1999) is a technique for patterning mesoscopic silica. The technique can be used for basic patterning of microfluidics.
しかし、蛋白質の活性は、pHなどの種々の因子によって影響を受けるため、ゾル−ゲル過程では、ゾル状態から蛋白質を添加して活性を維持する条件を設定することが重要である。このため、中性pHなど種々の穏やかな条件を利用して蛋白質とゾルを共に予め混ぜて蛋白質をパターン化する技術(Kim, et al, Biotehnol. Bioeng., 73:331, 2001)が発表されているが、中性pHではゾル−ゲル過程が急激に進行して、添加剤の選択によって亀裂ができたり不透明になるなどの問題点があった。また、蛋白質とゾルを共に予め混ぜる前処理過程などを経なければならないため、スポットの濃度が不均一になりやすい問題点もあった。 However, since the protein activity is affected by various factors such as pH, it is important to set conditions for maintaining the activity by adding the protein from the sol state in the sol-gel process. For this reason, a technique (Kim, et al, Biotehnol. Bioeng., 73: 331, 2001) was published that pre-mixed protein and sol together using various mild conditions such as neutral pH. However, at a neutral pH, the sol-gel process progresses rapidly, and there are problems such as the formation of cracks and opaqueness depending on the choice of additive. Further, since a pretreatment process in which the protein and the sol are mixed together in advance is required, there is a problem that the spot density tends to be non-uniform.
また、ゾル−ゲル工程に関する先行特許として、生体物質を含んだゾル混合物をチップ基材上でゲル化反応させることによって、生体物質がゲルマトリックスによって形成されたフォア中に担持され、ゲルマトリックスで形成されたスポットによってカプセル化された状態で、生体物質の反応性を向上させるゾル−ゲルバイオチップがあり、または、このようなゾル−ゲル工程を利用したバイオチップの製造において、固定された生体物質の変形を防いだり、感度を高めるゾル−ゲルバイオチップ用ゾル組成物のスクリーニング方法に関する特許があるが、製造方法が複雑で、ゾル組成物の製作過程において生体物質の活性低下、破壊などの問題点が生じてきた。 In addition, as a prior patent related to the sol-gel process, a sol mixture containing a biological material is subjected to a gelation reaction on a chip substrate, whereby the biological material is supported in a fore formed by the gel matrix and formed by the gel matrix. There is a sol-gel biochip that improves the reactivity of a biological material in a state of being encapsulated by the formed spot, or in the production of a biochip using such a sol-gel process, a fixed biological material There is a patent on a sol-gel biochip sol composition screening method that prevents the deformation of the sol-gel and increases the sensitivity, but the manufacturing method is complicated, and there are problems such as decreased activity and destruction of biological substances in the manufacturing process of the sol composition A point has arisen.
そこで、本発明者等は、ゾル組成物の製造時生体物質の活性低下及び破壊を防止するために鋭意努力した結果、特定シリケート単量体及び添加剤を特定順序で順次混合して基板に分注するか、これらを順次基板に直接分注してゲル化させる場合、従来用いられた製造方法に比べてゲル化時間を遅らせて、より均一なバイオチップを製作できるだけでなく、前記成分によって生体物質の活性低下及び破壊が防止されて感度が非常に優秀なバイオチップを製作できることを確認して本発明を完成するようになった。 Therefore, as a result of diligent efforts to prevent a decrease in the activity and destruction of biological materials during the production of the sol composition, the present inventors sequentially mixed specific silicate monomers and additives in a specific order and distributed them to the substrate. In the case of pouring or sequentially dispensing these directly onto the substrate, the gelation time can be delayed compared to the conventional production method to produce a more uniform biochip. The present invention has been completed by confirming that it is possible to manufacture a biochip with extremely excellent sensitivity by preventing the decrease in activity and destruction of substances.
本発明の主な目的は、ゾルゲル物質をキット化して特別な装備や技術がなくても誰でも簡単にバイオチップを作って分析できるようにするところにある。
本発明の他の目的は、特定ゾル組成物を順次混合して基板に分注するか、又はこれらを順次基板に直接分注するなどの製造方法を確立して、前処理過程なしに均一なバイオチップを製造する方法を提供するところにある。
本発明のさらに他の目的は、前記バイオチップを利用した標的物質の分析方法を提供するところにある。
The main object of the present invention is to make a sol-gel material as a kit so that anyone can easily make and analyze a biochip without any special equipment or technology.
Another object of the present invention is to establish a manufacturing method such as sequentially mixing a specific sol composition and dispensing it onto a substrate, or dispensing them directly onto a substrate, so that a uniform process can be performed without a pretreatment process. A method for producing a biochip is provided.
Still another object of the present invention is to provide a method for analyzing a target substance using the biochip.
前記目的を達成するために、本発明は、一具現例で、(a)ゾル−ゲルキット(SolBキット)でSolB1、SolB2、SolB3、SolBH、SolBSで構成されている液体を順次混合して、探知物質(例えば、蛋白質)と混ぜた後基板に分注する製造方法、及び(b)前処理過程なしにバイオチップを製造するためにSolB1、SolB2、SolB3で構成されたゾル組成物を基板上に分注する工程;SolBHを分注する工程;SolBS、探知蛋白質及び蒸留水を含む溶液を基板上に分注した後、ゲル化させる工程を含む、ゾル組成物のゲル化を利用したバイオチップの製造方法を提供する。 In order to achieve the above object, the present invention is, in one embodiment, (a) sol-gel kit (SolB kit), which sequentially detects a liquid composed of SolB1, SolB2, SolB3, SolBH, and SolBS. (B) a sol composition composed of SolB1, SolB2, and SolB3 on a substrate for manufacturing a biochip without a pre-treatment process. A step of dispensing; a step of dispensing SolBH; and a step of dispensing a solution containing SolBS, a detection protein and distilled water onto a substrate and then gelling the biochip using gelation of a sol composition A manufacturing method is provided.
この時、用いられるバイオチップ製造のためのSolBキット中SolB1、SolB2、及びSolB3としては、
(i)SolB1で、メチルトリエトキシシラン(methyltriethoxysilane、MTES)、エチルトリエトキシシラン(ethyltriethoxysilane、ETrEOS)、ケイ酸ナトリウム(Sodium Silicate)、オルトケイ酸テトラメチル(tetramethyl orthosilicate、TMOS)、オルトケイ酸テトラエチル(tetraethyl orthosilicate、TEOS)及びテトラメトキシシリケート(tetramethoxysilicate、TMS)からなる群から選択された1種以上の第1シリケート単量体;
(ii)SolB2で、3−アミノトリメトキシシラン(3-aminotrimethoxysilane、3−ATMS)、ジグリセリルシラン(diglycerylsilane、DGS)、メチルトリメトキシシリケート(methyltrimethoxysilicate、MTMS)、ポリグリセリルシリケート(polyglycerylsilicate、PGS)、ポリビニルアセテート(polyvinylacetate)、ポリビニルピロリドン(polyvinylpyrrolidone)、グリセリルメタクリレート(glyceryl metaacrylate)、ヒドロキシエチルアクリレート(hydroxyethyl acrylate)、N,N−ジスクシンイミジルカルボネート(N,N’-disuccinimidyl carbonate、DSC)、1,3,5−トリメチルベンゼン(1,3,5-trimethylbenzene)、セチルトリメチルアンモニウムクロリド(cetyltrimethylammonium chloride)、セチルトリメチルアンモニウムブロミド(cetyltrimethylammonium bromide)、3−(トリエトキシシリル)プロピルコハク酸無水物(3-(triethoxysilyl)propyl succinic anhydride)、N−(3−トリエトキシシリルプロピル)−4−ヒドロキシブチルアミド(N-(3-triethoxysilyl propyl)-4-hydroxy butylamide、SIT8189.5)、N−(トリエトキシシリルプロピル)グルコンアミド(N-(triethoxysilyl propyl)gluconamide、SIT8189.0)50%、プルロニックL121(pluronic L121)及び水酸化テトラメチルアンモニウム(tetramethylammonium hydroxide)からなる群から選択された1種以上の第2シリケート単量体;及び
(iii)SolB3で、アミノプロピルトリエトキシラン(aminopropyltriethoxysilane、APTES)、3−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン(3-glycidoxypropyltrimethoxysilane、GPTMOS)、N−トリエトキシシリルプロピル−O−ポリエチレンオキシドウレタン(N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane、PEOU)、グリセロール、PEG200、PEG400、PEG600、PEG1350及びPEG8000からなる群から選択された1種以上の添加剤を含むことを特徴とする。
At this time, as SolB1, SolB2, and SolB3 in the SolB kit for biochip production used,
(I) SolB1, methyltriethoxysilane (MTES), ethyltriethoxysilane (ETrEOS), sodium silicate (Sodium Silicate), tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetraethyl orthosilicate (tetraethyl) one or more first silicate monomers selected from the group consisting of orthosilicate (TEOS) and tetramethoxysilicate (TMS);
(Ii) SolB2, 3-aminotrimethoxysilane (3-ATMS), diglycerylsilane (DGS), methyltrimethoxysilicate (MTMS), polyglycerylsilicate (polyGS), polyvinyl Acetate (polyvinylacetate), polyvinylpyrrolidone, glyceryl methacrylate, hydroxyethyl acrylate, N, N'-disuccinimidyl carbonate (DSC), 1, 3,5-trimethylbenzene (1,3,5-trimethylbenzene), cetyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium bromide, 3- (trie 3- (triethoxysilyl) propyl succinic anhydride, N- (3-triethoxysilylpropyl) -4-hydroxybutylamide, SIT8189 .5), N- (triethoxysilylpropyl) gluconamide (SIT8189.0) 50%, pluronic L121 and tetramethylammonium hydroxide One or more selected second silicate monomers; and (iii) SolB3, aminopropyltriethoxysilane (APTES), 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMOS), N -Triethoxysilylpropyl-O-polyethylene Oxide urethane (N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane, PEOU), glycerol, characterized in that it comprises a PEG 200, PEG 400, PEG 600, 1 or more additives selected from the group consisting of PEG1350 and PEG 8000.
具体的に、本発明は下記の工程を含む、ゾル組成物のゲル化を利用したバイオチップの製造方法であって、
(a)SolB1、SolB2及びSolB3を含むゾル組成物にHCl、H2SO4、HNO3及びCH3COOHからなる群から選択されたSolBH(溶液I)を混合する工程;
(b)緩衝液であるSolBSと蒸留水を工程(a)で混合された溶液と混合した後、−20〜4℃で安定化させる工程;及び
(c)標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質を含む溶液を工程(b)で安定化された溶液と混合して基板上に分注した後、ゲル化させる工程、
ここで、
(i)SolB1は、メチルトリエトキシシラン(MTES)、エチルトリエトキシシラン(ETrEOS)、ケイ酸ナトリウム、オルトケイ酸テトラメチル(TMOS)、オルトケイ酸テトラエチル(TEOS)及びテトラメトキシシリケート(TMS)からなる群から選択された1種以上の第1シリケート単量体であり;
(ii)SolB2は、3−アミノトリメトキシシラン(3−ATMS)、ジグリセリルシラン(DGS)、メチルトリメトキシシリケート(MTMS)、ポリグリセリルシリケート(PGS)、ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリドン、グリセリルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、N,N−ジスクシンイミジルカルボネート(DSC)、1,3,5−トリメチルベンゼン、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、3−(トリエトキシシリル)プロピルコハク酸無水物、N−(3−トリエトキシシリルプロピル)−4−ヒドロキシブチルアミド(SIT8189.5)、N−(トリエトキシシリルプロピル)グルコンアミド(SIT8189.0)50%、プルロニックL121及び水酸化テトラメチルアンモニウムからなる群から選択された1種以上の第2シリケート単量体であり;そして
(iii)SolB3は、アミノプロピルトリエトキシラン(APTES)、3−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン(GPTMOS)、N−トリエトキシシリルプロピル−O−ポリエチレンオキシドウレタン(PEOU)、グリセロール、PEG200、PEG400、PEG600、PEG1350及びPEG8000からなる群から選択された1種以上の添加剤であることを特徴とする製造方法を提供する。
Specifically, the present invention is a method for producing a biochip using gelation of a sol composition, comprising the following steps:
(A) mixing SolBH (solution I) selected from the group consisting of HCl, H 2 SO 4 , HNO 3 and CH 3 COOH into a sol composition containing SolB1, SolB2 and SolB3;
(B) a step of mixing SolBS, which is a buffer solution, and distilled water with the solution mixed in step (a) and then stabilizing at −20 to 4 ° C .; and (c) interacting with a target biological substance. A step of mixing a solution containing a biological substance with the solution stabilized in step (b) and dispensing the solution on a substrate, followed by gelling;
here,
(I) SolB1 is a group consisting of methyltriethoxysilane (MTES), ethyltriethoxysilane (ETrEOS), sodium silicate, tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetraethyl orthosilicate (TEOS) and tetramethoxysilicate (TMS). One or more first silicate monomers selected from:
(Ii) SolB2 is 3-aminotrimethoxysilane (3-ATMS), diglycerylsilane (DGS), methyltrimethoxysilicate (MTMS), polyglyceryl silicate (PGS), polyvinyl acetate, polyvinylpyrrolidone, glyceryl methacrylate, hydroxyethyl Acrylate, N, N-disuccinimidyl carbonate (DSC), 1,3,5-trimethylbenzene, cetyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium bromide, 3- (triethoxysilyl) propyl succinic anhydride, N- (3-triethoxysilylpropyl) -4-hydroxybutyramide (SIT8189.5), N- (triethoxysilylpropyl) gluconamide (SIT8189.0) 50%, Pluronic L And one or more second silicate monomers selected from the group consisting of 21 and tetramethylammonium hydroxide; and (iii) SolB3 is aminopropyltriethoxylane (APTES), 3-glycidoxypropyltri One or more additives selected from the group consisting of methoxysilane (GPTMOS), N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (PEOU), glycerol, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 and PEG8000. A featured manufacturing method is provided.
本発明は、また下記の工程を含む、ゾル組成物のゲル化を利用したバイオチップの製造方法であって、
(a)SolB1、SolB2及びSolB3で構成されたゾル組成物を基板上に分注した後、HCl、H2SO4、HNO3及びCH3COOHからなる群から選択されたSolBH(溶液I)を分注する工程;及び
(b)緩衝液であるSolBS、標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質及び蒸留水を含む溶液IIを基板上に分注した後、ゲル化させる工程、
ここで、
(i)SolB1は、メチルトリエトキシシラン(MTES)、エチルトリエトキシシラン(ETrEOS)、ケイ酸ナトリウム、オルトケイ酸テトラメチル(TMOS)、オルトケイ酸テトラエチル(TEOS)及びテトラメトキシシリケート(TMS)からなる群から選択された1種以上の第1シリケート単量体であり;
(ii)SolB2は、3−アミノトリメトキシシラン(3−ATMS)、ジグリセリルシラン(DGS)、メチルトリメトキシシリケート(MTMS)、ポリグリセリルシリケート(PGS)、ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリドン、グリセリルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、N,N−ジスクシンイミジルカルボネート(DSC)、1,3,5−トリメチルベンゼン、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、3−(トリエトキシシリル)プロピルコハク酸無水物、N−(3−トリエトキシシリルプロピル)−4−ヒドロキシブチルアミド(SIT8189.5)、N−(トリエトキシシリルプロピル)グルコンアミド(SIT8189.0)50%、プルロニックL121及び水酸化テトラメチルアンモニウムからなる群から選択された1種以上の第2シリケート単量体であり;そして
(iii)SolB3は、アミノプロピルトリエトキシラン(APTES)、3−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン(GPTMOS)、N−トリエトキシシリルプロピル−O−ポリエチレンオキシドウレタン(PEOU)、グリセロール、PEG200、PEG400、PEG600、PEG1350及びPEG8000からなる群から選択された1種以上の添加剤であることを特徴とする製造方法を提供する。
The present invention is also a method for producing a biochip using gelation of a sol composition, comprising the following steps:
(A) After dispensing a sol composition composed of SolB1, SolB2 and SolB3 onto a substrate, SolBH (solution I) selected from the group consisting of HCl, H 2 SO 4 , HNO 3 and CH 3 COOH is added. A step of dispensing; and (b) a solution II containing SolBS, which is a buffer solution, a biological material that interacts with the target biological material, and distilled water, is gelled after being dispensed on a substrate,
here,
(I) SolB1 is a group consisting of methyltriethoxysilane (MTES), ethyltriethoxysilane (ETrEOS), sodium silicate, tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetraethyl orthosilicate (TEOS) and tetramethoxysilicate (TMS). One or more first silicate monomers selected from:
(Ii) SolB2 is 3-aminotrimethoxysilane (3-ATMS), diglycerylsilane (DGS), methyltrimethoxysilicate (MTMS), polyglyceryl silicate (PGS), polyvinyl acetate, polyvinylpyrrolidone, glyceryl methacrylate, hydroxyethyl Acrylate, N, N-disuccinimidyl carbonate (DSC), 1,3,5-trimethylbenzene, cetyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium bromide, 3- (triethoxysilyl) propyl succinic anhydride, N- (3-triethoxysilylpropyl) -4-hydroxybutyramide (SIT8189.5), N- (triethoxysilylpropyl) gluconamide (SIT8189.0) 50%, Pluronic L And one or more second silicate monomers selected from the group consisting of 21 and tetramethylammonium hydroxide; and (iii) SolB3 is aminopropyltriethoxylane (APTES), 3-glycidoxypropyltri One or more additives selected from the group consisting of methoxysilane (GPTMOS), N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (PEOU), glycerol, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 and PEG8000. A featured manufacturing method is provided.
本発明は、また前記方法で用いられる、(i)メチルトリエトキシシラン(MTES)、エチルトリエトキシシラン(ETrEOS)、ケイ酸ナトリウム、オルトケイ酸テトラメチル(TMOS)、オルトケイ酸テトラエチル(TEOS)及びテトラメトキシシリケート(TMS)からなる群から選択された1種以上の第1シリケート単量体であるSolB1を含む第1容器;(ii)3−アミノトリメトキシシラン(3−ATMS)、ジグリセリルシラン(DGS)、メチルトリメトキシシリケート(MTMS)、ポリグリセリルシリケート(PGS)、ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリドン、グリセリルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、N,N−ジスクシンイミジルカルボネート(DSC)、1,3,5−トリメチルベンゼン、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、3−(トリエトキシシリル)プロピルコハク酸無水物、N−(3−トリエトキシシリルプロピル)−4−ヒドロキシブチルアミド(SIT8189.5)、N−(トリエトキシシリルプロピル)グルコンアミド(SIT8189.0)50%、プルロニックL121及び水酸化テトラメチルアンモニウムからなる群から選択された1種以上の第2シリケート単量体であるSolB2を含む第2容器;(iii)アミノプロピルトリエトキシラン(APTES)、3−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン(GPTMOS)、N−トリエトキシシリルプロピル−O−ポリエチレンオキシドウレタン(PEOU)、グリセロール、PEG200、PEG400、PEG600、PEG1350及びPEG8000からなる群から選択された1種以上の添加剤であるSolB3を含む第3容器;(iv)HCl、H2SO4、HNO3及びCH3COOHからなる群から選択されたSolBHを含む第4容器;及び(v)緩衝液であるSolBSを含む第5容器で構成されて、前記SolB1、SolB2及びSolB3を混合したゾル組成物にHCl、H2SO4、HNO3及びCH3COOHからなる群から選択されたSolBH、緩衝液であるSolBSと蒸留水、探知するための生物学的物質を順に混合することによって、ゾル混合物がゲル化されることを特徴とするバイオチップ製造用キットを提供する。 The present invention also relates to (i) methyltriethoxysilane (MTES), ethyltriethoxysilane (ETrEOS), sodium silicate, tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetraethyl orthosilicate (TEOS) and tetra A first container containing SolB1, which is one or more first silicate monomers selected from the group consisting of methoxysilicate (TMS); (ii) 3-aminotrimethoxysilane (3-ATMS), diglycerylsilane ( DGS), methyltrimethoxysilicate (MTMS), polyglyceryl silicate (PGS), polyvinyl acetate, polyvinylpyrrolidone, glyceryl methacrylate, hydroxyethyl acrylate, N, N-disuccinimidyl carbonate (DSC), 1,3,5- bird Tylbenzene, cetyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium bromide, 3- (triethoxysilyl) propylsuccinic anhydride, N- (3-triethoxysilylpropyl) -4-hydroxybutyramide (SIT8189.5), N- ( A second container comprising SolB2, which is one or more second silicate monomers selected from the group consisting of 50% triethoxysilylpropyl) gluconamide (SIT8189.0), Pluronic L121 and tetramethylammonium hydroxide; iii) aminopropyltriethoxylane (APTES), 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMOS), N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (PEOU), glycerol, PEG2 0, PEG400, PEG600, PEG1350 and the third container containing SolB3 is one or more additives selected from the group consisting of PEG8000; (iv) HCl, H 2 SO 4, the group consisting of HNO 3 and CH 3 COOH A fourth container containing SolBH selected from the above; and (v) a fifth container containing SolBS, which is a buffer solution, and a mixture of SolB1, SolB2, and SolB3 to the sol composition, HCl, H 2 SO 4 , The sol mixture is gelated by sequentially mixing SolBH selected from the group consisting of HNO 3 and CH 3 COOH, SolBS as a buffer solution, distilled water, and a biological substance for detection. A kit for producing a biochip is provided.
本発明は、また前記方法及びゾル組成物で製造したバイオチップ及びこれを利用して生体物質である標的物質を分析する方法で、前記方法で製造されたバイオチップに前記標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質と相互作用可能な標的生物学的物質を含有する試料を添加する工程を含む標的生物学的物質の分析方法を提供する。 The present invention also relates to a biochip manufactured by the method and the sol composition and a method of analyzing a target substance that is a biological material using the biochip, and the target biological substance is added to the biochip manufactured by the method. Provided is a method for analyzing a target biological material comprising the step of adding a sample containing a target biological material capable of interacting with an interacting biological material.
以下、本発明を詳細に説明する。
一観点において、本発明は、下記の工程を含む、ゾル組成物のゲル化を利用したバイオチップの製造方法であって、
(a)SolB1、SolB2及びSolB3を含むゾル組成物にHCl、H2SO4、HNO3及びCH3COOHからなる群から選択されたSolBH(溶液I)を混合する工程;
(b)緩衝液であるSolBSと蒸留水を工程(a)で混合された溶液と混合した後、−20〜4℃で安定化させる工程;及び
(c)標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質を含む溶液を工程(b)で安定化された溶液と混合して基板上に分注した後、ゲル化させる工程、
ここで、
(i)SolB1は、メチルトリエトキシシラン(MTES)、エチルトリエトキシシラン(ETrEOS)、ケイ酸ナトリウム、オルトケイ酸テトラメチル(TMOS)、オルトケイ酸テトラエチル(TEOS)及びテトラメトキシシリケート(TMS)からなる群から選択された1種以上の第1シリケート単量体であり;
(ii)SolB2は、3−アミノトリメトキシシラン(3−ATMS)、ジグリセリルシラン(DGS)、メチルトリメトキシシリケート(MTMS)、ポリグリセリルシリケート(PGS)、ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリドン、グリセリルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、N,N−ジスクシンイミジルカルボネート(DSC)、1,3,5−トリメチルベンゼン、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、3−(トリエトキシシリル)プロピルコハク酸無水物、N−(3−トリエトキシシリルプロピル)−4−ヒドロキシブチルアミド(SIT8189.5)、N−(トリエトキシシリルプロピル)グルコンアミド(SIT8189.0)50%、プルロニックL121及び水酸化テトラメチルアンモニウムからなる群から選択された1種以上の第2シリケート単量体であり;そして
(iii)SolB3は、アミノプロピルトリエトキシラン(APTES)、3−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン(GPTMOS)、N−トリエトキシシリルプロピル−O−ポリエチレンオキシドウレタン(PEOU)、グリセロール、PEG200、PEG400、PEG600、PEG1350及びPEG8000からなる群から選択された1種以上の添加剤であることを特徴とする製造方法に関するものである。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
In one aspect, the present invention is a method for producing a biochip using gelation of a sol composition, comprising the following steps:
(A) mixing SolBH (solution I) selected from the group consisting of HCl, H 2 SO 4 , HNO 3 and CH 3 COOH into a sol composition containing SolB1, SolB2 and SolB3;
(B) a step of mixing SolBS, which is a buffer solution, and distilled water with the solution mixed in step (a) and then stabilizing at −20 to 4 ° C .; and (c) interacting with a target biological substance. A step of mixing a solution containing a biological substance with the solution stabilized in step (b) and dispensing the solution on a substrate, followed by gelling;
here,
(I) SolB1 is a group consisting of methyltriethoxysilane (MTES), ethyltriethoxysilane (ETrEOS), sodium silicate, tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetraethyl orthosilicate (TEOS) and tetramethoxysilicate (TMS). One or more first silicate monomers selected from:
(Ii) SolB2 is 3-aminotrimethoxysilane (3-ATMS), diglycerylsilane (DGS), methyltrimethoxysilicate (MTMS), polyglyceryl silicate (PGS), polyvinyl acetate, polyvinylpyrrolidone, glyceryl methacrylate, hydroxyethyl Acrylate, N, N-disuccinimidyl carbonate (DSC), 1,3,5-trimethylbenzene, cetyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium bromide, 3- (triethoxysilyl) propyl succinic anhydride, N- (3-triethoxysilylpropyl) -4-hydroxybutyramide (SIT8189.5), N- (triethoxysilylpropyl) gluconamide (SIT8189.0) 50%, Pluronic L And one or more second silicate monomers selected from the group consisting of 21 and tetramethylammonium hydroxide; and (iii) SolB3 is aminopropyltriethoxylane (APTES), 3-glycidoxypropyltri One or more additives selected from the group consisting of methoxysilane (GPTMOS), N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (PEOU), glycerol, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 and PEG8000. The present invention relates to a characteristic manufacturing method.
本発明において、前記SolBHの濃度は、1mM〜100mMであることを特徴とする。 In the present invention, the concentration of the SolBH is 1 mM to 100 mM.
本発明において、前記SolBSは、1mM〜100mMの濃度範囲のNaH2PO4、Na2HPO4、Na3PO4からなる群から選択された1種以上の溶液であってもよい。 In the present invention, the SolBS may be one or more solutions selected from the group consisting of NaH 2 PO 4 , Na 2 HPO 4 , and Na 3 PO 4 in a concentration range of 1 mM to 100 mM.
ゾル−ゲル法を利用してバイオチップを製作する従来の方法では、ゾル組成物、緩衝液、及び標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質などを任意の順序で任意に混合して、まずゾル混合溶液を作った後、真空処理などの後処理を経てゲル化させる方法が利用されてきた。また、ゾル組成物と緩衝液及び探知蛋白質を混合する方法は、ボルテックス(vortex)や超音波振動(ultrasonic)を利用する方法などがあり、ゾル−ゲルの形を作る方法も基板用ウェル上にスポットを形成したり、表面をゾル−ゲルでコーティングしたり枠に注ぎ込んだ後、ゲル化させる方法などが利用されてきた。 In a conventional method of manufacturing a biochip using a sol-gel method, a sol composition, a buffer solution, a biological substance that interacts with a target biological substance, and the like are arbitrarily mixed in an arbitrary order. First, a method in which a sol mixed solution is first made and then gelled through post-treatment such as vacuum treatment has been used. In addition, the method of mixing the sol composition with the buffer solution and the detection protein includes a method using vortex or ultrasonic vibration, and a method for forming a sol-gel shape on the substrate well. A method of forming a spot after forming a spot, coating the surface with a sol-gel, pouring it into a frame, and the like has been used.
このような方法は、ゾル組成物混合溶液で形成させたスポット毎に含有している標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質の濃度が一定でない場合があり、また実施者による濃度も違いが生じ、混合する時汚染の可能性が大きく、サンプルによりゾルゲル混合物の粘度が変化したりもするため、スポットの形成程度や形、大きさにおいて差がでる場合がある。従って、このような問題点を解決できる、均質のバイオチップを製造できる方法の必要性がある。 In such a method, the concentration of the biological substance that interacts with the target biological substance contained in each spot formed with the sol composition mixed solution may not be constant, and the concentration by the practitioner is also different. Differences occur and the possibility of contamination when mixing is large, and the viscosity of the sol-gel mixture varies depending on the sample, so there may be a difference in the degree, shape, and size of spot formation. Therefore, there is a need for a method capable of manufacturing a homogeneous biochip that can solve such problems.
本発明のバイオチップ製作方法によると、ゾル−ケル法を利用して、簡易でありながらも、標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質がスポット毎に均一な濃度をなしており、より正確で高い効率で生物学的物質の探知が可能である。 According to the biochip manufacturing method of the present invention, the biological substance that interacts with the target biological substance has a uniform concentration for each spot, though simple, using the sol-kel method. Biological substances can be detected with higher accuracy and higher efficiency.
本発明のバイオチップの製造方法の一態様の具体的な説明は下記のとおりである。
まず、第1シリケート単量体であるSolB1、第2シリケート単量体であるSolB2及び添加剤であるSolB3を順に混合してゾル組成物を製造する。
The specific description of one embodiment of the biochip manufacturing method of the present invention is as follows.
First, SolB1 which is the first silicate monomer, SolB2 which is the second silicate monomer, and SolB3 which is the additive are sequentially mixed to produce a sol composition.
前記SolB1は、メチルトリエトキシシラン(MTES)、エチルトリエトキシシラン(ETrEOS)、ケイ酸ナトリウム、オルトケイ酸テトラメチル(TMOS)、オルトケイ酸テトラエチル(TEOS)及びテトラメトキシシリケート(TMS)からなる群から選択された1種以上の物質を用いてもよい。本発明の一実施例では、前記第1シリケート単量体の成分としてTEOSを選択して用いた。 SolB1 is selected from the group consisting of methyltriethoxysilane (MTES), ethyltriethoxysilane (ETrEOS), sodium silicate, tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetraethyl orthosilicate (TEOS) and tetramethoxysilicate (TMS). One or more kinds of substances may be used. In one embodiment of the present invention, TEOS was selected and used as a component of the first silicate monomer.
また、前記SolB2は、3−アミノトリメトキシシラン(3−ATMS)、ジグリセリルシラン(DGS)、メチルトリメトキシシリケート(MTMS)、ポリグリセリルシリケート(PGS)、ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリドン、グリセリルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、N,N−ジスクシンイミジルカルボネート(DSC)、1,3,5−トリメチルベンゼン、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、3−(トリエトキシシリル)プロピルコハク酸無水物、N−(3−トリエトキシシリルプロピル)−4−ヒドロキシブチルアミド(SIT8189.5)、N−(トリエトキシシリルプロピル)グルコンアミド(SIT8189.0)50%、プルロニックL121及び水酸化テトラメチルアンモニウムからなる群から選択された1種以上の物質を用いてもよい。本発明の一実施例では、前記第2シリケート単量体の成分としてDGSを選択して用いた。 The SolB2 is composed of 3-aminotrimethoxysilane (3-ATMS), diglycerylsilane (DGS), methyltrimethoxysilicate (MTMS), polyglyceryl silicate (PGS), polyvinyl acetate, polyvinylpyrrolidone, glyceryl methacrylate, hydroxyethyl. Acrylate, N, N-disuccinimidyl carbonate (DSC), 1,3,5-trimethylbenzene, cetyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium bromide, 3- (triethoxysilyl) propyl succinic anhydride, N- (3-Triethoxysilylpropyl) -4-hydroxybutyramide (SIT8189.5), N- (triethoxysilylpropyl) gluconamide (SIT8189.0) 50%, Pluronic One or more substances selected from 121 the group consisting of tetramethylammonium hydroxide may be used. In one embodiment of the present invention, DGS was selected and used as a component of the second silicate monomer.
そして、前記SolB3は、添加剤として、アミノプロピルトリエトキシラン(APTES)、3−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン(GPTMOS)、N−トリエトキシシリルプロピル−O−ポリエチレンオキシドウレタン(PEOU)、グリセロール、PEG200、PEG400、PEG600、PEG1350及びPEG8000からなる群から選択された1種以上の物質を用いてもよい。本発明の一実施例では、前記添加剤としてPEGを選択して用いた。 The SolB3 contains, as additives, aminopropyltriethoxylane (APTES), 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMOS), N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (PEOU), glycerol, One or more substances selected from the group consisting of PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350, and PEG8000 may be used. In one embodiment of the present invention, PEG was selected and used as the additive.
前記第1シリケート、第2シリケート単量体及び添加剤は、単量体内部生体物質の性質や作ろうとするゾル−ゲルチップの形により必要に応じて適宜選択して用いてもよい。 The first silicate, the second silicate monomer and the additive may be appropriately selected and used according to the nature of the monomer internal biological material and the shape of the sol-gel chip to be produced.
本発明のバイオチップ製造用ゾル組成物において、第1シリケート単量体は、ゾル組成物の全体積対して約2〜30体積%、前記第2シリケート単量体は、約2〜8体積%、そして添加剤は、約0〜5体積%で含まれることが好ましい。この時、前記ゾル組成物は、吸入時有害であるため、風通しがいい所で製造する。 In the sol composition for producing a biochip of the present invention, the first silicate monomer is about 2 to 30% by volume relative to the total volume of the sol composition, and the second silicate monomer is about 2 to 8% by volume. , And the additive is preferably included at about 0-5% by volume. At this time, since the sol composition is harmful when inhaled, it is manufactured in a well-ventilated place.
本発明の前記バイオチップ製造用前記ゾル組成物は、ゲル化させた時、孔隙による微細チャネルを形成することを特徴とする。即ち、このようなチャネルが分析する標的物質と相互作用を起こすことができるような手段になる。特に、前記(iii)構成要素の添加剤は、ゲル内のチャネルの大きさを調節するために利用される成分である。 The sol composition for producing the biochip of the present invention is characterized by forming a fine channel due to pores when gelled. That is, such a channel is a means that can interact with the target substance to be analyzed. In particular, the (iii) component additive is a component utilized to control the size of the channels in the gel.
本発明において、前記方法は、アレイヤーなしに手でスポッティングを行うこと、又は非接触型アレイヤーを利用して行える。 In the present invention, the method may be performed by spotting by hand without an arrayer or using a non-contact type arrayer.
本発明において、工程(c)で用いられる基板は、用いられる前に予め露点より高い温度で最適化され、ここで、露点より高い温度とは、基板に露を結び始める温度より高い温度を意味するものであり、湿度条件に応じてこのような露点は変わり、例えば、相対湿度50%以上で大気温度が20℃の場合、8.6℃であり、通常は湿度70〜80%で14〜17℃である。 In the present invention, the substrate used in the step (c) is optimized at a temperature higher than the dew point before being used. Here, the temperature higher than the dew point means a temperature higher than a temperature at which dew point starts to be formed on the substrate. Such a dew point changes depending on the humidity condition. For example, when the relative humidity is 50% or more and the atmospheric temperature is 20 ° C., the dew point is 8.6 ° C., and usually the humidity is 70 to 80% and 14 to 14%. 17 ° C.
本発明において、前記基板は、ポリメチルメタクリレート(polymethylmethacrylate、PMMA)、プラスチック、シリコン、及びガラスなどであってもよい。 In the present invention, the substrate may be polymethylmethacrylate (PMMA), plastic, silicon, glass, or the like.
本発明において、前記標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質は、核酸、蛋白質、ペプチド、低分子物質及び細胞からなる群から選択されたいずれか一つでありうる。 In the present invention, the biological substance that interacts with the target biological substance may be any one selected from the group consisting of nucleic acids, proteins, peptides, low molecular weight substances, and cells.
本発明において、前記工程(a)で混合された溶液、ゾル混合物は、温度−20〜4℃の条件で30分以上放置して安定化させることができ、アレイヤーでゾル組成物を入れる容器は、露点より高い温度、通常14〜17℃(湿度70〜80%時露点温度以上)、分注環境は、湿度70〜80%、大気温度20℃の条件を合わせてゾルゲルに最適化させることができる。 In the present invention, the solution and the sol mixture mixed in the step (a) can be allowed to stabilize for 30 minutes or more at a temperature of -20 to 4 ° C. A temperature higher than the dew point, usually 14 to 17 ° C. (more than the dew point temperature when the humidity is 70 to 80%), and the dispensing environment can be optimized for the sol-gel by combining the conditions of the humidity 70 to 80% and the atmospheric temperature 20 ° C. it can.
このような安定化及び最適化過程を介して、ゾル組成物のゲル化する速度を遅らせてスポット形成を容易にし、ゲル化した後のスポットの割れを防いでチップ内の微細チャネルがよく形成されるようにする。 Through this stabilization and optimization process, the gel formation rate of the sol composition is slowed to facilitate spot formation, and after the gelation, the cracks of the spot are prevented and fine channels in the chip are well formed. So that
本発明において、前記ゾル組成物とSolBHとSolBSの混合溶液、蒸留水、及び標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質は、各々3:1:4と1:2:8との間の範囲で混合され、前記SolBH及びSolBSの濃度は、1mM〜100mMであってもよい。 In the present invention, the sol composition and the mixed solution of SolBH and SolBS, distilled water, and the biological substance that interacts with the target biological substance are between 3: 1: 4 and 1: 2: 8, respectively. The concentration of SolBH and SolBS may be 1 mM to 100 mM.
本発明において、前記SolBS:蒸留水:標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質の体積比は、1:2:1と2:5:1との間の範囲である。 In the present invention, the volume ratio of the SolBS: distilled water: biological material that interacts with the target biological material ranges between 1: 2: 1 and 2: 5: 1.
本発明において、前記緩衝液は、pH3〜8の範囲のリン酸ナトリウム(sodium phosphate)であってもよい。 In the present invention, the buffer may be sodium phosphate having a pH in the range of 3-8.
本発明において、前記基板は、予めプラズマ表面処理されたり、エッチングされたり、又はPDMSやシリケート単量体、若しくは高分子物質で処理されることを特徴とする。 In the present invention, the substrate is preliminarily plasma-treated, etched, or treated with PDMS, a silicate monomer, or a polymer substance.
他の観点において、本発明は、下記の工程を含む、ゾル組成物のゲル化を利用したバイオチップの製造方法であって、
(a)SolB1、SolB2及びSolB3で構成されたゾル組成物を基板上に分注した後、HCl、H2SO4、HNO3及びCH3COOHからなる群から選択されたSolBH(溶液I)を分注する工程;及び
(b)緩衝液であるSolBS、標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質及び蒸留水を含む溶液IIを基板上に分注した後、ゲル化させる工程、
ここで、
(i)SolB1は、メチルトリエトキシシラン(MTES)、エチルトリエトキシシラン(ETrEOS)、ケイ酸ナトリウム、オルトケイ酸テトラメチル(TMOS)、オルトケイ酸テトラエチル(TEOS)及びテトラメトキシシリケート(TMS)からなる群から選択された1種以上の第1シリケート単量体であり;
(ii)SolB2は、3−アミノトリメトキシシラン(3−ATMS)、ジグリセリルシラン(DGS)、メチルトリメトキシシリケート(MTMS)、ポリグリセリルシリケート(PGS)、ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリドン、グリセリルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、N,N−ジスクシンイミジルカルボネート(DSC)、1,3,5−トリメチルベンゼン、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、3−(トリエトキシシリル)プロピルコハク酸無水物、N−(3−トリエトキシシリルプロピル)−4−ヒドロキシブチルアミド(SIT8189.5)、N−(トリエトキシシリルプロピル)グルコンアミド(SIT8189.0)50%、プルロニックL121及び水酸化テトラメチルアンモニウムからなる群から選択された1種以上の第2シリケート単量体であり;
(iii)SolB3は、アミノプロピルトリエトキシラン(APTES)、3−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン(GPTMOS)、N−トリエトキシシリルプロピル−O−ポリエチレンオキシドウレタン(PEOU)、グリセロール、PEG200、PEG400、PEG600、PEG1350及びPEG8000からなる群から選択された1種以上の添加剤であり;
(iv)SolBH溶液は、1mM〜100mMの濃度範囲のHCl、H2SO4、HNO3及びCH3COOHからなる群から選択された1種以上の溶液であり;そして
(v)SolBS溶液は、1mM〜100mMの濃度範囲のNaH2PO4、Na2HPO4、Na3PO4からなる群から選択された1種以上の溶液であであることを特徴とする製造方法に関するものである。
In another aspect, the present invention is a method for producing a biochip using gelation of a sol composition, comprising the following steps:
(A) After dispensing a sol composition composed of SolB1, SolB2 and SolB3 onto a substrate, SolBH (solution I) selected from the group consisting of HCl, H 2 SO 4 , HNO 3 and CH 3 COOH is added. A step of dispensing; and (b) a solution II containing SolBS, which is a buffer solution, a biological material that interacts with the target biological material, and distilled water, is gelled after being dispensed on a substrate,
here,
(I) SolB1 is a group consisting of methyltriethoxysilane (MTES), ethyltriethoxysilane (ETrEOS), sodium silicate, tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetraethyl orthosilicate (TEOS) and tetramethoxysilicate (TMS). One or more first silicate monomers selected from:
(Ii) SolB2 is 3-aminotrimethoxysilane (3-ATMS), diglycerylsilane (DGS), methyltrimethoxysilicate (MTMS), polyglyceryl silicate (PGS), polyvinyl acetate, polyvinylpyrrolidone, glyceryl methacrylate, hydroxyethyl Acrylate, N, N-disuccinimidyl carbonate (DSC), 1,3,5-trimethylbenzene, cetyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium bromide, 3- (triethoxysilyl) propyl succinic anhydride, N- (3-triethoxysilylpropyl) -4-hydroxybutyramide (SIT8189.5), N- (triethoxysilylpropyl) gluconamide (SIT8189.0) 50%, Pluronic L Be one or more second silicate monomers selected from 21 the group consisting of tetramethylammonium hydroxide;
(Iii) SolB3 is aminopropyltriethoxylane (APTES), 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMOS), N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (PEOU), glycerol, PEG200, PEG400, One or more additives selected from the group consisting of PEG600, PEG1350 and PEG8000;
(Iv) The SolBH solution is one or more solutions selected from the group consisting of HCl, H 2 SO 4 , HNO 3 and CH 3 COOH in a concentration range of 1 mM to 100 mM; and (v) the SolBS solution is The present invention relates to a production method characterized by being one or more solutions selected from the group consisting of NaH 2 PO 4 , Na 2 HPO 4 , and Na 3 PO 4 in a concentration range of 1 mM to 100 mM.
本発明において、工程(c)で用いられる基板は、用いられる前に予め露点より高い温度で最適化され、ここで、露点より高い温度とは、基板に露が結び始める温度より高い温度を意味し、湿度条件に応じてこのような露点は変わり、例えば、相対湿度50%以上で大気温度が20℃であると、8.6℃であり、通常は湿度70〜80%で14〜17℃である。 In the present invention, the substrate used in the step (c) is optimized at a temperature higher than the dew point in advance before being used. Here, the temperature higher than the dew point means a temperature higher than a temperature at which dew starts to form on the substrate. However, such a dew point changes depending on the humidity condition. For example, when the relative humidity is 50% or more and the atmospheric temperature is 20 ° C., it is 8.6 ° C., and usually the humidity is 70 to 80% and 14 to 17 ° C. It is.
このような最適化過程を介して、各溶液を順に分注時にゾル組成物のゲル化される速度を遅らせて、スポット形成を容易にし、ゲル化された後、スポットの割れを防いでチップ内の微細チャネルがよく形成されるようにする。 Through such an optimization process, when each solution is sequentially dispensed, the gelation rate of the sol composition is slowed to facilitate spot formation. The fine channel is formed well.
本発明の方法によると、ゾル組成物の分注後、HCl、H2SO4、HNO3及びCH3COOHからなる群から選択された溶液IのSolBHをその上に分注する。溶液Iは、前記ゾル組成物のゲル化を誘導するためのpH環境を作る役割を果たす。前記HCl、H2SO4、HNO3、またはCH3COOHの濃度は、5〜30mMが好ましい。pH1〜3で適正させる。 According to the method of the present invention, after dispensing the sol composition, SolBH of solution I selected from the group consisting of HCl, H 2 SO 4 , HNO 3 and CH 3 COOH is dispensed thereon. Solution I serves to create a pH environment for inducing gelation of the sol composition. The concentration of HCl, H 2 SO 4 , HNO 3 , or CH 3 COOH is preferably 5 to 30 mM. Adjust to pH 1-3.
最後に、緩衝液であるSolBS、標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質、及び蒸留水を含む溶液IIを基板上に分注してゲル化させる。 Finally, SolBS, which is a buffer solution, a biological substance that interacts with the target biological substance, and a solution II containing distilled water are dispensed on the substrate to be gelled.
本発明において、前記SolBSは、pH3〜8の範囲のリン酸ナトリウムであってもよい。 In the present invention, the SolBS may be sodium phosphate in the range of pH 3-8.
前記緩衝液及び2次蒸留水は、生体物質(例えば、蛋白質)の破壊を防ぐ機能を持つ。生体物質は、適正範囲から外れたpHでは、活性が低下したり破壊されやすく、ゾルのゲル化は、pHが高いほどゆっくり、pHが低いほどはやく進行されるため、生体物質の活性低下及び破壊を防ぎながら適正時間ゲル化を行えるようにpHを適正することが重要である。通常、生体物質はpH5〜8の範囲で安定的に存在するため、特に、前記溶液IによるpH環境が、生体物質の破壊を防ぐために、前記緩衝液を用いる。用いられる緩衝液は、特に制限されることなく、添加する生体物質に当業者が適切に選択して用いられる。本発明では、pH3〜8の範囲のリン酸ナトリウムバッファーを用いた。また、溶液IIに含まれている「標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質」または「生体物質」とは、検出しようとする対象物質(例、標的蛋白質)と相互作用できる生体内の物質のことをいい、例えば、核酸、蛋白質、ペプチド、低分子物質、または細胞などになりうる。このような探知蛋白質、または生体物質を、溶液IIに含ませるために、適当なバッファー(buffer)溶液が用いられる。即ち、実施のための生体物質をバッファー溶液に入れて、検出のためのサンプル溶液(sample solution)を作る。例えば、前記生体物質が蛋白質の場合には、PBS buffer(phosphate-buffered saline)を混ぜて用いて、酵素反応(enzyme reaction)がある時には、HEPES、NaCl、EDTAなどを必要に応じて適切に濃度を異ならせて混ぜて用いられる。本発明の一実施例では、前記対象物質(標的蛋白質)でHIV1(Human Immunodeficiency virus 1)患者の抗体を用いて、前記探知蛋白質で前記HIV抗体に結合できる5種の抗原マーカーをPBSバッファーに混ぜて用いた。 The buffer solution and the secondary distilled water have a function of preventing destruction of biological substances (for example, proteins). Biological substances are likely to have decreased activity or be destroyed at a pH outside the proper range, and the gelation of the sol proceeds more slowly as the pH is higher, and faster as the pH is lowered. It is important to adjust the pH so that gelation can be performed for an appropriate time while preventing the above. In general, the biological material is stably present in the range of pH 5 to 8, and thus the buffer solution is used particularly in order to prevent destruction of the biological material in the pH environment due to the solution I. The buffer used is not particularly limited, and is appropriately selected by those skilled in the art for the biological material to be added. In the present invention, a sodium phosphate buffer having a pH in the range of 3 to 8 was used. The “biological substance that interacts with the target biological substance” or “biological substance” contained in the solution II is an in vivo body that can interact with the target substance (eg, target protein) to be detected. For example, it can be a nucleic acid, a protein, a peptide, a low molecular weight substance, or a cell. In order to include such a detection protein or biological substance in the solution II, an appropriate buffer solution is used. That is, a biological material for implementation is placed in a buffer solution to make a sample solution for detection. For example, when the biological material is a protein, PBS buffer (phosphate-buffered saline) is mixed and used, and when there is an enzyme reaction, HEPES, NaCl, EDTA, etc. are appropriately concentrated as necessary. Are mixed and used. In one embodiment of the present invention, an HIV1 (Human Immunodeficiency virus 1) patient antibody is used as the target substance (target protein), and five antigen markers that can bind to the HIV antibody using the detection protein are mixed in a PBS buffer. Used.
この時、前記溶液IIで緩衝液であるSolBS:蒸留水:標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質の混合される体積比は、1:2:1から2:5:1の間の範囲であることが好ましく、最も好ましくは1:2:1である。例えば、溶液II全重量基準に緩衝液は約20〜30体積%、蒸留水は約40〜60%体積%、標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質は20〜30体積%であってもよい。本発明の一実施例では、緩衝液は10μL、蒸留水は20μL、探知蛋白質(標的蛋白質と相互作用する生物学的物質)等を含む溶液10μLで混合して用いた。 At this time, the volume ratio of SolBS: distilled water: biological substance that interacts with the target biological substance in the solution II is 1: 2: 1 to 2: 5: 1. Is preferred, and most preferred is 1: 2: 1. For example, the buffer is about 20-30% by volume, the distilled water is about 40-60% by volume, and the biological material interacting with the target biological material is 20-30% by volume based on the total weight of Solution II. May be. In one embodiment of the present invention, 10 μL of a buffer solution, 20 μL of distilled water, and 10 μL of a solution containing a detection protein (a biological substance that interacts with a target protein) were used.
本発明は、前記ゾル組成物、溶液I及び溶液IIを正確な量で順次分注することによって均質なバイオチップを製作することを特徴とする。 The present invention is characterized in that a homogeneous biochip is manufactured by sequentially dispensing the sol composition, the solution I and the solution II in an accurate amount.
本発明で分注される、前記ゾル組成物:溶液I:溶液IIの分注量の比は、3:1:4から1:2:8の間であることを特徴とし、好ましくは3:1:4である。例えば、前記ゾル組成物の分注量は、25〜35μLが好ましく、約30μLが最も好ましい。前記溶液Iの分注量は、5〜15μLが好ましく、約10μLが最も好ましい。前記溶液IIの分注量は、35〜45μLが好ましく、約40μLが最も好ましい。 The ratio of the sol composition: solution I: solution II dispensing amount dispensed in the present invention is between 3: 1: 4 and 1: 2: 8, preferably 3: 1: 4. For example, the amount of the sol composition dispensed is preferably 25 to 35 μL, and most preferably about 30 μL. The dispensing amount of the solution I is preferably 5 to 15 μL, and most preferably about 10 μL. The dispensing amount of the solution II is preferably 35 to 45 μL, and most preferably about 40 μL.
本発明に係るバイオチップ製造方法でゾル組成物と溶液I及び溶液IIを予め混合した後、基板に分注する時は、非接触型アレイヤー(non-contact arrayer)を用いるか、ピペットあるいは他の道具を利用して直接手でスポッティングすることが好ましい。 When the sol composition, the solution I and the solution II are mixed in advance in the biochip manufacturing method according to the present invention and then dispensed to the substrate, a non-contact arrayer is used, or a pipette or other It is preferable to spot directly by hand using a tool.
本発明において、前記製造方法は、前処理過程がないことを特徴とし、前記前処理過程は、(i)SolB1、SolB2、SolB3、SolBH、SolBS、または標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質を混合する過程;(ii)混合した後、ボルテックス(vortexing)する過程;及び(iii)混合した溶液を安定化する過程からなる群から選択されるいずれか一つ以上であることを特徴とする。 In the present invention, the manufacturing method is characterized in that there is no pretreatment process, and the pretreatment process includes (i) SolB1, SolB2, SolB3, SolBH, SolBS, or a biological substance that interacts with a target biological substance. A process of mixing a target substance; (ii) a process of mixing and then vortexing; and (iii) a process of stabilizing the mixed solution. And
vまた、本発明において、前記SolB1、SolB2、SolB3、SolBH、SolBS及び標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質を分注する前に容器に入れて、ノズルを利用して吸い上げる形態で分注してもよい。 v In the present invention, the SolB1, SolB2, SolB3, SolBH, SolBS and the biological substance that interacts with the target biological substance are put into a container before being dispensed and sucked up using a nozzle. You may dispense.
加えて、本発明において、SolB1、SolB2、SolB3、SolBH、SolBS及び標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質を分注する前に、予め分注するノズルが連結されている大容量カートリッジに入れて、一回で分注する量が、ノズルを利用して吸い上げる形態での分注と比べて100倍以上であるため、大量生産が可能になる。 In addition, in the present invention, a large-capacity cartridge to which a pre-dispensing nozzle is connected before dispensing biological materials that interact with SolB1, SolB2, SolB3, SolBH, SolBS and target biological materials. In addition, since the amount dispensed at a time is 100 times or more compared to the dispensing in the form of sucking up using a nozzle, mass production becomes possible.
前処理過程なしに基板上に直接ゾル組成物と溶液I及び溶液IIを順次分注してチップを製作する時は、正確な量で分注するアレイヤー(arrayer)を用いて実施されてもよい。この時、前記ゾル組成物、溶液I、及び溶液IIを正確な体積で分注するのに用いられるアレイヤーとしては、非接触型アレイヤーが好ましい。 When the chip is manufactured by sequentially dispensing the sol composition, the solution I, and the solution II directly onto the substrate without a pretreatment process, an arrayer that dispenses an accurate amount may be used. . At this time, as the arrayer used for dispensing the sol composition, the solution I, and the solution II in an accurate volume, a non-contact type arrayer is preferable.
バイオチップ上で探知物質を配列(array)させる方式により「接触型」と「非接触型」に分けられるが、接触型アレイヤーは、非常に細い空間が中にあるピン(pin)等を利用して探知蛋白質をチップ表面に配列させる。このような方法は、探知蛋白質が含まれた溶液がピンの外側に少しずつ抜け出して、表面に直接接触して配列する方式で、短い時間に種々の探知蛋白質を配列させることができる長所があるが、溶液の体積を正確に調節できないため、均一性が低くなりうる。それに対して、非接触型アレイヤーは、細い管に探知蛋白質が含まれた溶液を入れて、チップ表面の真上に位置させた後、管に一定圧力を与えることによって直接的な接触なしに表面の上に配列させる方法である。この方法は分注される溶液の体積を正確に決めることが可能な長所がある。従って、前処理過程なしにゾル組成物、溶液I及び溶液IIを順次分注してチップを製作する時、各溶液の分注される体積を比に合うように調節できるため、本発明ではこのような非接触型アレイヤーを用いることが好ましい。 Depending on the method of arraying the detection substances on the biochip, it can be divided into “contact type” and “non-contact type”, but the contact type arrayer uses a pin etc. with a very thin space inside. The detector protein is arranged on the chip surface. Such a method has a merit that a variety of detection proteins can be arranged in a short time by a method in which a solution containing the detection protein is gradually discharged outside the pins and arranged in direct contact with the surface. However, since the volume of the solution cannot be adjusted accurately, the uniformity can be lowered. In contrast, a non-contact type arrayer puts a solution containing a detection protein in a thin tube, positions it directly above the chip surface, and then applies a constant pressure to the surface without direct contact. It is the method of arranging on. This method has the advantage that the volume of the solution to be dispensed can be accurately determined. Therefore, when a chip is manufactured by sequentially dispensing the sol composition, the solution I, and the solution II without a pretreatment process, the dispensed volume of each solution can be adjusted to match the ratio. It is preferable to use such a non-contact type arrayer.
前記ゾル組成物;HCl、H2SO4、HNO3及びCH3COOHからなる群から選択された溶液I;及び前記標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質、緩衝液及び蒸留水の混合溶液の溶液IIを、正確な体積を分注する非接触型アレイヤーを利用して順次基板用ウェル上に分注させることができる。表面に分注されている小さいスポットに他の溶液が分注される時、溶液の表面張力のために、全溶液は広がることなく、スポットを形成することになるが、溶液が落ちる時発生する表面エネルギーが振動に転換されて、これによってスポット内で物質の流れ(対流)が発生して、二つの溶液が混ざりやすくことになる。このような原理を利用して、本発明では、前処理なしに表面に直接スポッティングを介して、ゾル−ゲルチップを製作する自動化方法を考案した。 Said sol composition; solution I selected from the group consisting of HCl, H 2 SO 4 , HNO 3 and CH 3 COOH; and biological substances, buffers and distilled water that interact with said target biological substance Solution II of the mixed solution can be sequentially dispensed onto the substrate well using a non-contact type arrayer that dispenses an accurate volume. When another solution is dispensed into a small spot dispensed on the surface, due to the surface tension of the solution, the whole solution will not spread but will form a spot, but will occur when the solution falls The surface energy is converted into vibration, which causes a material flow (convection) within the spot, making it easier for the two solutions to mix. Using this principle, the present invention has devised an automated method for producing a sol-gel chip through spotting directly on the surface without pretreatment.
例えば、Scienion AG社のマイクロアレイヤー(Microarrayer)を用いることができる。特に、Scienion AG社のデューポイントコントロールテクノロジー(dew point control technology)を利用すると、プレート表面に湿気が凝結されて生じる濃度の不確実性を極力防ぐことができてより正確な体積及び大きさのスポットが製作可能である。本発明の一実施例では、前記アレイヤーとして、sciFLEXARRAYER S11(Scienion AG、ドイツ)を用いた。 For example, Science Array AG's microarrayer can be used. In particular, the use of Science AG's dew point control technology prevents the uncertainty of concentration caused by moisture condensation on the plate surface as much as possible, enabling more accurate volume and size spots. Can be produced. In one embodiment of the present invention, scIFLEXARRAYER S11 (Scienion AG, Germany) was used as the arrayer.
即ち、本発明では、バイオチップ製作時に、前記非接触型アレイヤーを利用して基板に各々の溶液を正確な体積だけ分注するだけで、バイオチップをより手軽に作ることができて、従来方法のようにゾル−ゲルモノマー(sol-gel monomer)、緩衝液、探知蛋白質サンプルなどを予め混合する(premixing)等の前処理過程が必要ないため、より均質なバイオチップの製作が可能になる。 That is, according to the present invention, when the biochip is manufactured, the biochip can be more easily produced simply by dispensing each solution in an accurate volume using the non-contact type arrayer. Thus, since a pretreatment process such as premixing of a sol-gel monomer, a buffer solution, a detection protein sample or the like is not required, a more homogeneous biochip can be manufactured.
一方、本発明で用いる基板は、ゾル組成物がゲル化された時、透明になる性質を利用したものであるため、前記基板用ウェル(well)、またはスライドも、良い透明度を維持できる材料で作られたものがよい。例えば、透明性が非常に良いポリメチルメタクリレート(PMMA)成分と同じプラスチック、シリコンやガラス成分で製作されたものが用いられる。 On the other hand, since the substrate used in the present invention utilizes the property of becoming transparent when the sol composition is gelled, the substrate well or slide is also a material that can maintain good transparency. What was made is good. For example, a plastic made of the same plastic, silicon, or glass component as the polymethyl methacrylate (PMMA) component having very good transparency is used.
また、本発明で用いられる基板は、ゾル混合溶液がゲル化されながら基板に固定されるように表面処理されなければならない。本発明のバイオチップの重要な条件中一つは、ゾル混合溶液がゲル化されながら基板に強く固定されて、標的物質が入っている溶液と反応させる時、スポットが落ちてはいけない点である。従って、前記バイオチップを利用した標的物質分析において、標的物質と反応させた後、強い洗浄過程が必要で、従って、このような物理的力を克服するためには、スポットの強い固定が必須で、このために表面処理されなかったプラスチック基板、プラズマで表面処理されたプラスチック基板や表面処理されなかったガラス基板、表面処理されたガラス基板(例えば、エッチング(etching)されたガラス基板など)、あるいは多孔質構造を持つシリコンチップなどを利用することが好ましい。 Further, the substrate used in the present invention must be surface-treated so that the sol mixed solution is fixed to the substrate while being gelled. One of the important conditions of the biochip of the present invention is that when the sol mixed solution is gelled and firmly fixed to the substrate and reacted with the solution containing the target substance, the spot should not drop. . Therefore, in the target substance analysis using the biochip, a strong washing process is required after reacting with the target substance. Therefore, in order to overcome such physical force, strong fixation of the spot is indispensable. Plastic substrates that have not been surface-treated for this purpose, plastic substrates that have been surface-treated with plasma, glass substrates that have not been surface-treated, glass substrates that have been surface-treated (eg, etched glass substrates), or It is preferable to use a silicon chip having a porous structure.
本発明において、基板は予めプラズマ表面処理されるか、エッチングされるか、PDMSやシリケート単量体、または高分子物質で処理されたものであってもよい。
本発明のバイオチップ製造方法において、アレイヤーを用いるに当たり注意しなければならない事項は下記のとおりである。
In the present invention, the substrate may be previously plasma surface treated, etched, or treated with PDMS, a silicate monomer, or a polymer substance.
In the biochip manufacturing method of the present invention, the following points should be noted when using an arrayer.
第一に、DNAチップとは異なり、前記バイオチップはゾルという特殊な材料を用いて時間経過に伴ってゲル化される性質があるため、アレイヤーを利用して分注する途中にゾルがゲル化しないようできるだけ早いうちに分注させることが大変重要である。
第二に、湿度と温度である。基板にスポットがつくと同時に周囲の湿気量と温度に応じて前記スポットがゲル化される速度及びスポットの活性が左右されるため、最初の湿度と温度が大変重要になる。従って、常時前記ゾル−ゲルを利用したバイオチップを製作時には、アレイヤー周辺の湿度と温度を事前に整えることが大変重要になる。
First, unlike a DNA chip, the biochip has a property of gelling with the passage of time using a special material called a sol, so that the sol gels during dispensing using an arrayer. It is very important to have it dispensed as soon as possible.
Second is humidity and temperature. The initial humidity and temperature are very important because the spot is spotted on the substrate and the speed at which the spot is gelled and the activity of the spot depend on the amount and temperature of the surrounding moisture. Therefore, when manufacturing a biochip using the sol-gel at all times, it is very important to adjust the humidity and temperature around the arrayer in advance.
本発明で好ましい湿度は、約50%以上、または、より具体的には70〜80%である。そして、好ましい温度は、約25℃以下、より具体的には常温の範囲と言える10〜25℃の範囲である。特に、スポットのゲル化において最初の高い湿度が重要な要因であるため、必ずスポットの配列(arraying)前の湿度を80%程度に準備しなければならなく、また、温度が25℃以上の場合には、ゾルのゲル化がはやく進行される傾向があるため、極力低い温度で実験した方が良い。 The preferred humidity in the present invention is about 50% or more, or more specifically 70 to 80%. A preferable temperature is about 25 ° C. or less, more specifically, a range of 10 to 25 ° C. which can be said to be a range of normal temperature. In particular, since the first high humidity is an important factor in spot gelation, it is necessary to prepare the humidity before arraying the spots to about 80%, and when the temperature is 25 ° C. or higher. Therefore, it is better to experiment at a temperature as low as possible because the gelation of the sol tends to proceed quickly.
このように事前の温度、湿度の準備と、早いうちに集積させることができるプログラムを準備した後、各溶液を工程毎に分注するようになる。
本発明において、標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質は、核酸、蛋白質、ペプチド、低分子物質、または細胞であってもよい。
Thus, after preparing the temperature and humidity in advance and a program that can be accumulated earlier, each solution is dispensed for each process.
In the present invention, the biological substance that interacts with the target biological substance may be a nucleic acid, a protein, a peptide, a low molecular weight substance, or a cell.
また他の観点において、本発明は、(i)メチルトリエトキシシラン(MTES)、エチルトリエトキシシラン(ETrEOS)、ケイ酸ナトリウム、オルトケイ酸テトラメチル(TMOS)、オルトケイ酸テトラエチル(TEOS)及びテトラメトキシシリケート(TMS)からなる群から選択された1種以上の第1シリケート単量体であるSolB1を含む第1容器;(ii)3−アミノトリメトキシシラン(3−ATMS)、ジグリセリルシラン(DGS)、メチルトリメトキシシリケート(MTMS)、ポリグリセリルシリケート(PGS)、ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリドン、グリセリルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、N,N−ジスクシンイミジルカルボネート(DSC)、1,3,5−トリメチルベンゼン、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、3−(トリエトキシシリル)プロピルコハク酸無水物、N−(3−トリエトキシシリルプロピル)−4−ヒドロキシブチルアミド(SIT8189.5)、N−(トリエトキシシリルプロピル)グルコンアミド(SIT8189.0)50%、プルロニックL121及び水酸化テトラメチルアンモニウムからなる群から選択された1種以上の第2シリケート単量体であるSolB2を含む第2容器;(iii)アミノプロピルトリエトキシラン(APTES)、3−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン(GPTMOS)、N−トリエトキシシリルプロピル−O−ポリエチレンオキシドウレタン(PEOU)、グリセロール、PEG200、PEG400、PEG600、PEG1350及びPEG8000からなる群から選択された1種以上の添加剤であるSolB3を含む第3容器;(iv)HCl、H2SO4、HNO3及びCH3COOHからなる群から選択されたSolBHを含む第4容器;及び(v)緩衝液であるSolBSを含む第5容器で構成されて、前記SolB1、SolB2及びSolB3を混合したゾル組成物にHCl、H2SO4、HNO3及びCH3COOHからなる群から選択されたSolBH、緩衝液であるSolBSと蒸留水、探知するための生物学的物質を順に混合することによって、ゾル混合物がゲル化されることを特徴とするバイオチップ製造用キットに関するものである。 In another aspect, the present invention provides (i) methyltriethoxysilane (MTES), ethyltriethoxysilane (ETrEOS), sodium silicate, tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetraethyl orthosilicate (TEOS) and tetramethoxy. A first container containing SolB1, which is one or more first silicate monomers selected from the group consisting of silicate (TMS); (ii) 3-aminotrimethoxysilane (3-ATMS), diglycerylsilane (DGS) ), Methyltrimethoxysilicate (MTMS), polyglyceryl silicate (PGS), polyvinyl acetate, polyvinylpyrrolidone, glyceryl methacrylate, hydroxyethyl acrylate, N, N-disuccinimidyl carbonate (DSC), 1,3,5-trimethyl Benzene, cetyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium bromide, 3- (triethoxysilyl) propylsuccinic anhydride, N- (3-triethoxysilylpropyl) -4-hydroxybutyramide (SIT8189.5), N- ( A second container comprising SolB2, which is one or more second silicate monomers selected from the group consisting of 50% triethoxysilylpropyl) gluconamide (SIT8189.0), Pluronic L121 and tetramethylammonium hydroxide; iii) aminopropyltriethoxylane (APTES), 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMOS), N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (PEOU), glycerol, PEG200 PEG 400, PEG 600, third vessel containing PEG1350 and one or more additives selected from the group consisting of PEG8000 SolB3; (iv) HCl, selected from the group consisting of H 2 SO 4, HNO 3 and CH 3 COOH A fourth container containing the prepared SolBH; and (v) a fifth container containing SolBS as a buffer solution, and the sol composition obtained by mixing SolB1, SolB2 and SolB3 with HCl, H 2 SO 4 , HNO 3. And Sol BH selected from the group consisting of CH 3 COOH, SolBS as a buffer solution, distilled water, and biological material for detection are mixed in order to form a sol mixture into a gel. The present invention relates to a chip manufacturing kit.
前記容器は、その材質に制限がなく、このようなキットは、ビン、桶(tub)、小袋(sachet)、封筒(envelope)、チューブ、アンプル(ampoule)等のような形態を取ってもよく、これらは部分的に、または全体的にプラスチック、ガラス、紙、ホイール、ワックスなどから形成されてもよい。容器は、最初は容器の一部であるか、または機械的、接着性、またはその他の手段によって容器に付着することができる、完全に、または部分的に分離可能な栓を取り付けてもよい。前記キットは、外部パッケージを含んでもよく、外部パッケージは、構成要素の使用に関する使用説明書を含んでもよい。 The container is not limited in its material, and such a kit may take the form of a bottle, a tub, a sachet, an envelope, a tube, an ampoule, etc. These may be partly or wholly formed from plastic, glass, paper, wheels, waxes and the like. The container may be fitted with a fully or partially separable plug that is initially part of the container or can be attached to the container by mechanical, adhesive, or other means. The kit may include an external package, and the external package may include instructions for use of the component.
また他の観点において、本発明は、前記方法で製造されたバイオチップを利用して標的生物学的物質を分析する方法に関するものである。 In another aspect, the present invention relates to a method for analyzing a target biological substance using the biochip manufactured by the above method.
具体的に、前記方法で製造されたバイオチップに前記標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質と相互作用可能な標的生物学的物質を含有する試料を添加する工程を含む標的生物学的物質の分析方法に関するものである。ここで、前記標的生物学的物質は、核酸、蛋白質、ペプチド、低分子物質、及び細胞からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とし、前記標的生物学的物質を探知できる放射性同位元素、または蛍光染料、あるいは他の種類の標識物質で標識された蛋白質、アプタマーなどの生体物質と、追加で反応させる工程を含んでもよい。 Specifically, target biology including the step of adding a sample containing a target biological substance capable of interacting with a biological substance that interacts with the target biological substance to the biochip manufactured by the method The present invention relates to a method for analyzing chemical substances. Here, the target biological substance is any one selected from the group consisting of nucleic acids, proteins, peptides, low molecular substances, and cells, and the target biological substance can be detected. A step of additionally reacting with a biological substance such as a protein or aptamer labeled with a radioisotope, a fluorescent dye, or another type of labeling substance may be included.
前記で説明したとおり、標的生物学的物質と反応させるバイオチップが準備された後、実際に標的生物学的物質が入っている溶液と反応させる。反応溶液は、96ウェル(well)タイプの場合、50〜100μLの量が適切で、反応時間は1時間にする。標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質と相互作用する標的生物学的物質も生体内物質として、核酸、蛋白質、ペプチド、低分子物質、または細胞であってもよい。 As described above, after the biochip to be reacted with the target biological material is prepared, the biochip is actually reacted with the solution containing the target biological material. In the case of a 96-well type reaction solution, an amount of 50 to 100 μL is appropriate, and the reaction time is 1 hour. The target biological substance that interacts with the biological substance that interacts with the target biological substance may also be a nucleic acid, protein, peptide, low molecular weight substance, or cell as an in vivo substance.
標的生物学的物質が入っている反応溶液は、スポット内の微細孔隙構造を介してスポット内に浸透し、カプセル構造中に固定されている生物学的物質と接触し、相互作用を介して結合することになる(1st incubation)。前記反応後、スポット内で標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質と結合した標的生物学的物質を分析するために、前記標的生物学的物質を探知できるように標識因子の標識蛋白質と反応させてもよい。本発明の一実施例では、蛍光染料(Cy3)が付着した標的蛋白質に対する抗体を用いた(2nd incubation)。この時、反応時間は30分にして、反応溶液の量は50〜100μLにする。前記1st、2ndインキュベーション過程は、共に室温で行う。標的生物学的物質が入っている反応溶液が種々の物質が混ざっている混合物の場合に、バイオチップに入っている標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質との非特異的結合を防ぐために、1stインキュベーション過程前にブロッキング(blocking)過程を行ってもよい。この過程に必要なブロッキング溶液は、スキムミルクやBSA(bovine serum albumin)、あるいはIgGのようなものを用いてもよい。 The reaction solution containing the target biological substance penetrates into the spot through the microporous structure in the spot, contacts the biological substance immobilized in the capsule structure, and binds through the interaction (1st incubation). After the reaction, in order to analyze the target biological substance bound to the biological substance that interacts with the target biological substance in the spot, the labeling protein of the labeling factor is detected so that the target biological substance can be detected And may be reacted. In one embodiment of the present invention, an antibody against a target protein to which a fluorescent dye (Cy3) was attached was used (2nd incubation). At this time, the reaction time is 30 minutes and the amount of the reaction solution is 50 to 100 μL. Both the 1st and 2nd incubation steps are performed at room temperature. When the reaction solution containing the target biological substance is a mixture of various substances, nonspecific binding to the biological substance interacting with the target biological substance contained in the biochip is prevented. To prevent this, a blocking process may be performed before the 1st incubation process. As a blocking solution necessary for this process, skim milk, BSA (bovine serum albumin), or IgG may be used.
前記1st、2ndインキュベーションを終えた後には、洗浄過程(washing)を経ることになるが、洗浄液の成分としては、通常のものを用いてもよく、本発明の一実施例では、0.2%Tween−20が含まれているPBSバッファーを用いた。洗浄機としては、ELISA用洗浄機を用いた。1st洗浄工程で、4回の洗浄を行って、2nd洗浄工程で4回の洗浄を実施する。前記洗浄工程を経た後、ウェルで溶液がすべて取り除かれるまで乾燥させる。 After the 1st and 2nd incubations are completed, a washing process is performed. However, as a component of the washing solution, normal components may be used. In one embodiment of the present invention, 0.2% A PBS buffer containing Tween-20 was used. As the washer, an ELISA washer was used. In the 1st cleaning process, cleaning is performed 4 times, and in the 2nd cleaning process, cleaning is performed 4 times. After the washing step, the well is dried until all the solution is removed.
乾燥過程が終わった後、蛍光染料を探知できるイメージスキャナを介して反応を起こしたウェルをスキャンして実際反応が合ったか否かがわかり、イメージをソフトウェアを利用して濃さを測定してみることによって、どの程度の反応を起こしたかが分かる。即ち、本発明の標的生物学的物質を分析する方法は、放射性同位元素、蛍光染料、発光性物質、染料、あるいは他の種類の標識物質などで標識された蛋白質、またはアプタマーなどの生体物質と、追加で反応させる工程を含む。この時、アプタマーとは、高い親和性で標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質を特異的に認知できる小さい一本鎖オリゴ核酸を称する。
さらに本発明は、前記製造方法によって製造されたバイオチップを含む検出用キットを含む。
After the drying process is over, scan the wells that caused the reaction through an image scanner that can detect fluorescent dyes to see if the reaction was correct, and then measure the density of the image using software. This shows how much reaction has occurred. That is, the method for analyzing a target biological substance of the present invention comprises a biological substance such as an aptamer, a protein labeled with a radioisotope, a fluorescent dye, a luminescent substance, a dye, or another type of labeling substance. An additional reaction step. At this time, an aptamer refers to a small single-stranded oligonucleic acid that can specifically recognize a biological substance that interacts with a target biological substance with high affinity.
Furthermore, the present invention includes a detection kit including a biochip manufactured by the manufacturing method.
探知生物学的物質検出用キットは、瓶、筒、小袋、封筒、チューブ、アンプル等のような形態であってもよく、これらは部分的にまたは全体的にプラスチック、ガラス、紙、ホイール、ワックスなどから形成される。容器は、最初は容器の一部であるか、または機械的、接着性、またはその他の手段によって、容器に付着できる、完全にまたは部分的に分離可能な栓を取り付けることができる。前記キットは外部パッケージを有することができ、外部パッケージは構成要素の使用に関する使用説明書を含んでもよい。 Detection biological material detection kits may be in the form of bottles, tubes, sachets, envelopes, tubes, ampoules, etc., which are partially or wholly plastic, glass, paper, wheels, waxes Formed from. The container can be attached to a fully or partially separable plug that is initially part of the container or can be attached to the container by mechanical, adhesive, or other means. The kit may have an external package, which may include instructions for use of the component.
以下、実施例を通して、本発明をより一層詳細に説明する。この実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこの実施例によって制限されると解釈されないことは当業界の通常の知識を有する者には自明である。
≪実施例1:バイオチップ製造用各構成溶液の製造≫
次の表1に例示された成分ら中各々一つずつを選択したSolB1 20μL、SolB2 6μL、及びSolB3 4μLを混合してゾル組成物を製造した。尚、溶液Iとしては10μLのSolBHを準備した。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. It will be apparent to those skilled in the art that this example is merely illustrative of the invention and that the scope of the invention is not to be construed as limited by this example.
<< Example 1: Production of each constituent solution for biochip production >>
SolB1 20 μL, SolB2 6 μL, and SolB3 4 μL, each of which was selected from among the components exemplified in Table 1 below, were mixed to prepare a sol composition. As solution I, 10 μL of SolBH was prepared.
次に、NaH2PO4、Na2HPO4、Na3PO4からなる群から選択された1種以上のSolBS10μL及び2次蒸留水(double distilled water、DDW)20μLを混ぜる一方、HIV1抗体と相互作用できる5種の探知蛋白質(p24、p31、gp41、gp120、及びgp160)約10〜200ngずつPBS bufferに混ぜてサンプル溶液10μLを作り、これを前記混合物に添加した後、5秒の間ボルテックスしてスピン−ダウンして溶液IIを製造した。 Next, 10 μL of one or more SolBS selected from the group consisting of NaH 2 PO 4 , Na 2 HPO 4 , and Na 3 PO 4 and 20 μL of double distilled water (DDW) are mixed, while the HIV1 antibody and each other are mixed. About 10 to 200 ng of 5 kinds of detection proteins (p24, p31, gp41, gp120, and gp160) that can act are mixed with PBS buffer to make a sample solution of 10 μL, added to the mixture, and then vortexed for 5 seconds. Spin-down to prepare solution II.
≪実施例2:バイオチップの製作≫
(1)基板用ウェルの準備
プラズマ表面処理されて市販されているPMMA96ウェルプレートをSPL社(韓国)から購入して準備した。
(2)バイオチップ(蛋白質チップ)の製作
蛋白質チップを製作するために、スポッティングする前に、温度16℃、湿度80%でアレイヤーをセットし、前記実施例1で取得されたゾル混合溶液を入れるソースウェル(source well)としては、一般384ウェルを準備し、標的ウェル(target well)としては、前記(1)のPMMA96ウェルプレートを準備した。そして、設定した通り正確な体積を分注するsciFLEXARRYER S11(Scienion社、ドイツ)アレイヤーを準備した。
次に、sciFLEXARRYER S11(Scienion社、ドイツ)アレイヤーのソースプレート(source plate)に、前記実施例1でのSolB1 20μL、SolB2 6μL、及びSolB3 4μLを混合して製造したゾル組成物30μL、SolBH10μL(溶液I)、及び前記溶液II40μLずつ各々アレイヤーのソースプレートに入れた。
予め準備したPMMA96ウェルプレート上に、前記ゾル組成物、溶液I、及び前記溶液IIを順に決まった体積量だけ分注した。分注される量がスポット当たり450pl以下になるようにし、この時、ノズルPDC90(ScienionAG、ドイツ)を用いた。spotting frequencyは、500Hzにした。形成されたスポットの大きさは、約300um程度であった(スポット当たり8drops)。
<< Example 2: Production of biochip >>
(1) Preparation of substrate wells A PMMA 96 well plate that has been subjected to plasma surface treatment and is commercially available was purchased from SPL (Korea) and prepared.
(2) Production of biochip (protein chip) Before producing spotted protein chips, set an arrayer at a temperature of 16 ° C and a humidity of 80%, and put the sol mixed solution obtained in Example 1 above. As the source well, a general 384 well was prepared, and as the target well, the PMMA 96 well plate of the above (1) was prepared. And the scIFLEXARRYER S11 (Scienion, Germany) arrayer which dispenses an exact volume as set was prepared.
Next, sol composition 30 μL, SolBH 10 μL (solution) prepared by mixing 20 μL of SolB1 in Example 1 above, 6 μL of SolB2 and 4 μL of SolB3 in the source plate of sciFLEXARRYER S11 (Scienion, Germany) I) and 40 μL of the solution II were put on the source plate of the arrayer.
On the PMMA 96 well plate prepared in advance, the sol composition, the solution I, and the solution II were dispensed in a predetermined volume. The amount to be dispensed was 450 pl or less per spot, and at this time, nozzle PDC90 (Scienion AG, Germany) was used. The spotting frequency was set to 500 Hz. The size of the formed spot was about 300 μm (8 drops per spot).
図6に532nmでAxon GenePix scanner(Axon社)でスキャンした写真A及びカメラが取り付けられたsciFLEXARRAYERによるイメージ写真Bを図示した。蛋白質チップ上の互いのスポット間隔(dot pitch)は600umであった。 FIG. 6 shows a photograph A scanned with an Axon GenePix scanner (Axon) at 532 nm and an image photograph B by sciFLEXARRAYER with a camera attached. The mutual spot pitch (dot pitch) on the protein chip was 600 um.
≪比較例1:従来の蛋白質チップとの均質度比較≫
本発明の方法に係る蛋白質チップが、既に用いられている蛋白質チップと比較して顕著に優秀な均質度を持っているか否かを確認した。
まず、対照群として公知の既存の方法によって蛋白質チップを製作した。シリケート単量体(Silicate monomer)、HCl、DW、SP、及びサンプル溶液を順次混合して製造した後、ピンアレイヤー(pin arrayer)を利用してソースプレートに分注された混合溶液をPMMA96ウェルプレートにスポッティングした。ピンアレイヤーとしては、OnmiGrid Accent Arrayer(Genomic Solutions、米国)を用いた。
<< Comparative Example 1: Comparison of homogeneity with conventional protein chips >>
It was confirmed whether or not the protein chip according to the method of the present invention has a remarkably excellent homogeneity as compared with the protein chip already used.
First, a protein chip was manufactured by an existing method known as a control group. PMMA 96-well prepared by sequentially mixing silicate monomer, HCl, DW, SP, and sample solution, and then dispensed into a source plate using a pin arrayer Spotted on plate. As a pin array, OnmiGrid Agent Arrayer (Genomic Solutions, USA) was used.
尚、実施例1及び2の方法で製作した本発明の方法により製作された蛋白質チップのカメライメージ写真(図6のB)と、前記方法により製作された蛋白質チップが顕微鏡で観察される像をデジタルカメラで撮って比較した。
その結果、図8に示した通り、本発明の特定ゾル組成物の使用及び;溶液I、溶液IIと混合する前処理工程なしに順次分注することによって製作された蛋白質チップの場合には、スポットの形及び大きさが一定に配列されているが、従来方法による場合、スポットの形や大きさが一定でなかった。即ち、本発明に係る蛋白質チップが既存の蛋白質チップよりその均一な程度が顕著に優秀であることを確認することができた。
In addition, the camera image photograph (B of FIG. 6) of the protein chip manufactured by the method of the present invention manufactured by the method of Examples 1 and 2 and an image of the protein chip manufactured by the above method observed with a microscope. I compared it with a digital camera.
As a result, as shown in FIG. 8, in the case of a protein chip manufactured by using the specific sol composition of the present invention and by sequentially dispensing without a pretreatment step of mixing with the solution I and the solution II, Although the spot shape and size are arranged in a constant manner, the spot shape and size are not constant in the conventional method. That is, it could be confirmed that the protein chip according to the present invention is remarkably superior in uniformity to the existing protein chip.
≪比較例2:順序を異なるようにして混合した時の比較≫
本発明の方法に係る混合順に溶液を混合した時と順序を異なるようにして混合した時ゾル混合物の差を比較した。
本発明の混合順序に従って、SolB1、SolB2、及びSolB3からなるゾル組成物に順番どおり、SolBHとSolBS及び蒸留水とバッファー溶液を混ぜて混合物を準備し、比較のために同じ溶液を用いたが、SolBHを一番最後に混ぜて混合物を準備し、二つの混合物の差をデジタルカメラで撮って比較した。
その結果、図9に示された通り本発明の混合順序を守って混合物を準備した時には、溶液が互いに溶解しやすく、透明で長い間ゲル化が進行されなかったが(図9のA)、混合順序を異なるようにして準備した時は、溶液が溶けにくく、ゲル化もはやく進行されることを確認することができた(図9のB)。
<< Comparative Example 2: Comparison when mixing in different order >>
The difference in the sol mixture when the solutions were mixed in the order different from that when the solutions were mixed in the mixing order according to the method of the present invention was compared.
According to the mixing order of the present invention, a sol composition consisting of SolB1, SolB2, and SolB3 was prepared in order by mixing SolBH and SolBS, distilled water and buffer solution, and the same solution was used for comparison. SolBH was mixed at the end to prepare a mixture, and the difference between the two mixtures was compared with a digital camera.
As a result, when the mixture was prepared in accordance with the mixing order of the present invention as shown in FIG. 9, the solutions were easily dissolved in each other, and the gelation did not proceed for a long time (A in FIG. 9). When the mixture was prepared in a different order, it was confirmed that the solution was difficult to dissolve and gelation proceeded (B in FIG. 9).
≪実施例3:蛋白質チップを利用したHIV分析及び診断≫
前記実施例2で製作された蛋白質チップを10%スキムミルク溶液を利用してブロッキング(blocking)した後、各ウェルに希釈したHIV患者の血清を50μLずつ入れて、室温で1時間1次培養した。1次培養が終わった後、血清を取り除き、ELISA用洗浄機を利用して0.2%Tween−20が含まれた洗浄液を入れて、5分間ボルテックス(vortex)する工程を4回繰り返した(1次洗浄)。前記1次洗浄後、Cy3蛍光物質で標識されており、ヒトの抗体を認知する∂−Human抗体(∂-Human-Cy3、Jackson ImmunoResearch)を希釈して50μLを入れて、室温で1時間2次培養した。前記2次培養後、∂−Human−Cy3を取り除き、ELISA用洗浄機を利用して洗浄液を入れて、5分間ボルテックスする工程を4回繰り返した(2次洗浄)。
<< Example 3: HIV analysis and diagnosis using protein chip >>
After blocking the protein chip prepared in Example 2 using a 10% skim milk solution, 50 μL of diluted HIV patient serum was added to each well, followed by primary culture at room temperature for 1 hour. After the primary culture was completed, the serum was removed, a washing solution containing 0.2% Tween-20 was added using an ELISA washing machine, and the process of vortexing for 5 minutes was repeated four times ( Primary wash). After the primary washing, the ∂-Human antibody (∂-Human-Cy3, Jackson ImmunoResearch), which is labeled with Cy3 fluorescent substance and recognizes human antibodies, is diluted and put into 50 μL, and then secondary for 1 hour at room temperature. Cultured. After the secondary culture, ∂-Human-Cy3 was removed, and a washing solution was added using an ELISA washer and vortexed for 5 minutes (secondary washing).
前記2次洗浄後、反応が終結したウェルを室温で10分以上放置して乾燥させ、レーザースキャナであるFUJI FLA−9000イメージスキャナで反応が起きたスポットをスキャンした。また、イメージ分析プログラムであるImageQuant TLを利用して反応が起きた各スポットの蛍光信号の強度を測定して定量化して、反応が起きた程度を分析した。 After the secondary washing, the well in which the reaction was completed was allowed to stand at room temperature for 10 minutes or more and dried, and a spot where the reaction occurred was scanned with a laser scanner FUJI FLA-9000 image scanner. Further, the intensity of the fluorescence signal at each spot where the reaction occurred was measured and quantified using ImageQuant TL, which is an image analysis program, and the degree of the reaction was analyzed.
図2に示したとおり、患者血清により5個のマーカー(p24、p31、gp41、gp120及びgp160(Abcam社、Fitzerald社から入手)が、各々血清に対して反応を示し、抗原マーカーが入らなかった陰性対照群チップは反応を示さなかった。 As shown in FIG. 2, 5 markers (p24, p31, gp41, gp120 and gp160 (obtained from Abcam and Fitzerald)) each reacted to the serum and no antigen marker was entered. The negative control group chip showed no response.
図3は、5種の抗原中最も反応が起きた4種の抗原(p24、p31、gp41、gp120)とHIV1のO−type抗原1種を連続的に希釈してウェルにスポッティングして、HIV標準血清を順に希釈したものと反応させた結果を示しており、予想通り数量化(quantification)が定量的に行われたことを確認することができた。前記結果を基に、本発明で製作した蛋白質チップ上で抗原−抗体反応が特異的に起きることが分かる。 FIG. 3 shows that four antigens (p24, p31, gp41, gp120) that caused the most reaction among five antigens and one O-type antigen of HIV1 were serially diluted and spotted on a well. The result of reacting with standard diluted serial serum was shown, and it was confirmed that the quantification was quantitatively performed as expected. Based on the results, it can be seen that the antigen-antibody reaction occurs specifically on the protein chip produced in the present invention.
図4は、5種の抗原を各々含むスポットでHIV1標準血清に対する反応を定量化した結果を示す。図面のX軸は、標準血清を既存のELISA診断キットでHIVを診断した時、測定されたタイター(Titer)を示しており、本発明の蛋白質チップの分析結果と既存診断チップで分析した結果が相関性があることを見せる。X軸のPRB204−00は、Bostonbiomedica,Inc.から購入した患者の血清標準サンプルであり、製品名はAnti−HIV1 mixed titer performance panelであり、製品番号はPRB204(M)である。力価の値は、既存の診断キットで測定したs/co値であり、signal to cut−off(陽性と陰性の基準値)ratioを示し、1以上である時陽性とする。図面のY軸は、スポットの蛍光信号の強度(「signal」)値を陰性対照群スポットの蛍光信号の強度(「control」)値で割った値である。 FIG. 4 shows the results of quantifying the response to HIV1 standard serum at spots each containing 5 antigens. The X-axis of the drawing shows the titer measured when HIV was diagnosed with standard ELISA using an existing ELISA diagnostic kit. The analysis result of the protein chip of the present invention and the analysis result of the existing diagnostic chip are Show that there is a correlation. X-axis PRB204-00 is described in Boston Biomedica, Inc. Serum standard sample of a patient purchased from Japan, the product name is Anti-HIV1 mixed titer performance panel, and the product number is PRB204 (M). The titer value is an s / co value measured with an existing diagnostic kit, indicates signal to cut-off (positive and negative reference value) ratio, and is positive when it is 1 or more. The Y-axis of the drawing is the value obtained by dividing the intensity (“signal”) value of the fluorescent signal of the spot by the intensity (“control”) value of the fluorescent signal of the negative control group spot.
図5は、HIV感染した患者から日毎に採血したseroconversion panelに対する反応を既存の診断キットと比較した表である。患者の血清は、Bostonbiomedica,Inc.から購入した標準サンプルであり、既存の診断キットを利用した検出結果も、標準サンプルと共に提供を受けた。このサンプルの製品名は、Anti−HIV1 seroconversion panel Vで、製品番号はPRB922である。
感染してから間もない時には、既存の抗体診断ELISA診断キットでは、HIV感染を検出できなかったが、本発明の蛋白質チップでは抗原検出キット同様に感染初期から陽性と検出できることが分かる。
従って、前記バイオチップが、既存の抗体診断ELISAよりはるかに向上した感度を持っていることが分かる。
FIG. 5 is a table comparing the responses to seroconversion panels collected from HIV-infected patients on a daily basis with existing diagnostic kits. Patient sera were obtained from Boston Biomedica, Inc. Detection results using existing diagnostic kits were also provided with the standard samples. The product name of this sample is Anti-HIV1 seroconversion panel V, and the product number is PRB922.
It is understood that HIV infection could not be detected with the existing antibody diagnostic ELISA diagnostic kit shortly after the infection, but the protein chip of the present invention can be detected as positive from the early stage of infection like the antigen detection kit.
Therefore, it can be seen that the biochip has a much higher sensitivity than the existing antibody diagnostic ELISA.
≪実施例4:蛋白質チップを利用したウェスタンブロット方法の代替≫
ウェスタンブロットと免疫染色法は、種々の蛋白質の混合物からある特定蛋白質を捜し出す技法で、探そうとする蛋白質に対する抗体を用いて抗原−抗体反応を起こすことによって、特定蛋白質の存在可否を明らかにする方法である。
一般に、ウェスタンブロット(western blot)で特定蛋白質を捜し出す過程は、蛋白質混合物をSDS−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動して大きさ毎に分離させた後、ニトロセルロース、またはナイロンメンブレンに移して、蛋白質を移されたメンブレンで抗原−抗体反応を利用して特定抗体に対する抗原を捜し出すが、この時用いる抗体は、放射性同位元素で標識するか、特定の酵素(horseradish peroxidaseなど)、または蛍光を示す色素が結合していて、探そうとする蛋白質を可視化することができる。
«Example 4: Alternative to Western blot method using protein chip»
Western blotting and immunostaining are techniques for searching for a specific protein from a mixture of various proteins, and revealing the presence or absence of a specific protein by inducing an antigen-antibody reaction using an antibody against the protein to be searched. Is the method.
In general, the process of searching for a specific protein by Western blot is performed by separating the protein mixture by size on an SDS-polyacrylamide gel and then transferring it to a nitrocellulose or nylon membrane. The transferred membrane is searched for an antigen against a specific antibody using an antigen-antibody reaction. The antibody used at this time is labeled with a radioisotope, a specific enzyme (such as horseradish peroxidase), or a fluorescent dye. You can visualize the proteins that are bound and you are looking for.
前記の通りに、複雑な工程を経なければならないウェスタンブロットの代りに、前記実施例2で製作された蛋白質チップを利用して、蛋白質混合物を固定化した後、蛍光を示す色素が結合している抗体でアッセイして、手軽に蛋白質混合物内で特定蛋白質を捜し出すことができた。
また、一般に、蛋白質を電気泳動する際に還元状態下で実施するため、蛋白質が変性(denature)された状態で、抗体と結合をさせることになるが、特定抗体が蛋白質の本来の(native)形態だけを認識するならば、一般的なウェスタンブロット(western blot)では、蛋白質を捜し出すことができなくなる問題があるが、本発明に係るゾル−ゲル蛋白質チップは、蛋白質を本来の形態で固定化させることができるため、より有用である。
As described above, the protein mixture prepared by using the protein chip prepared in Example 2 is used instead of the Western blot, which requires a complicated process. We were able to easily locate specific proteins within the protein mixture by assaying with the antibodies present.
In general, when a protein is electrophoresed in a reduced state, it binds to an antibody in a denatured state of the protein, but the specific antibody is the native protein. If only the form is recognized, there is a problem that a general Western blot cannot find the protein, but the sol-gel protein chip according to the present invention immobilizes the protein in its original form. It can be made more useful.
前記実施例2で製造されたゾル−ゲルチップを利用して、下記の実験を行った。
(1)p24蛋白質のネイティブフォーム(Native form)及び変性フォーム(denature form)に係る結合比較実験
(i)先に、ネイティブ形態にだけ結合して、変性形態には結合しない抗体を利用して実験した。その結果、ウェスタンブロットではバンドが見られなく、ゾル−ゲル蛋白質チップだけで陽性と示された。
(ii)同じ抗原に対する抗体であるが、変性形態に結合する抗体を利用してウェスタンブロットとゾル−ゲル蛋白質チップに実験した結果、全部陽性と示された。
従って、本発明に係るゾル−ゲルチップは、変性及びネイティブ形態共に確認できることが明らかになった。
(2)p24蛋白質が発現したE.coli粗抽出物を利用した実験
(i)p24蛋白質が発現しているE.coli粗抽出物をゾル−ゲル蛋白質チップに濃度毎に(ライセート1、2、3)固定した後、発現した蛋白質に対する抗体でアッセイした結果、ゾル−ゲル蛋白質チップで陽性と示された(図10)。
(ii)特定蛋白質が発現していなかったE.coli粗抽出物(N)をゾル−ゲル蛋白質チップに固定した後、前記抗体でアッセイした結果、図10に示したように、ゾル−ゲル蛋白質チップで陰性と示された(図10)。
The following experiment was performed using the sol-gel chip manufactured in Example 2.
(1) Binding comparison experiment concerning native form and denaturation form of p24 protein (i) First, experiment using an antibody that binds only to native form but not to denatured form. did. As a result, no band was observed in the Western blot, and the sol-gel protein chip alone was positive.
(Ii) Although it was an antibody against the same antigen, it was shown to be positive as a result of experiments on Western blots and sol-gel protein chips using an antibody that binds to a denatured form.
Therefore, it was revealed that the sol-gel chip according to the present invention can be confirmed both in a denatured and native form.
(2) E. coli expressing p24 protein. Experiment using crude extract of E. coli (i) E. coli expressing p24 protein After the E. coli crude extract was immobilized on the sol-gel protein chip for each concentration (lysate 1, 2, 3), assayed with an antibody against the expressed protein, the sol-gel protein chip showed positive (FIG. 10). ).
(Ii) E. a specific protein was not expressed After the E. coli crude extract (N) was immobilized on a sol-gel protein chip and assayed with the antibody, as shown in FIG. 10, the sol-gel protein chip showed negative (FIG. 10).
図10で、Nは陰性対照群で、特定蛋白質が発現していなかったE.coli粗抽出物を固定したものであり、ライセート1は、特定蛋白質が0.09ug/ulの濃度で発現しているE.coli粗抽出物、ライセート2は、特定蛋白質が0.18ug/ulの濃度で発現しているE.coli粗抽出物、ライセート3は特定蛋白質が0.27ug/ulの濃度で発現しているE.coli粗抽出物を固定したものである。Pは、陽性対照群で、Cy3蛍光物質を固定したものである。 In FIG. 10, N is a negative control group and the specific protein was not expressed. E. coli crude extract was immobilized, and lysate 1 was an E. coli strain in which a specific protein was expressed at a concentration of 0.09 ug / ul. The crude extract of E. coli, lysate 2, is expressed in E. coli in which the specific protein is expressed at a concentration of 0.18 ug / ul. A crude extract of E. coli, lysate 3, is expressed in E. coli in which the specific protein is expressed at a concentration of 0.27 ug / ul. E. coli crude extract is fixed. P is a positive control group in which a Cy3 fluorescent substance is immobilized.
(3)(i)p24蛋白質に対する抗体を濃度毎にゾル−ゲル蛋白質チップに固定した後サンドイッチアッセイ方法を利用して、p24蛋白質が過発現しているE.coli粗抽出物でアッセイして、再度抗体を結合させて確認した結果、ゾル−ゲルチップでは陽性と示された(図11)。
(ii)探索しようとする抗原に対する抗体を濃度毎にゾル−ゲル蛋白質チップに固定した後、サンドイッチアッセイ方法を利用して特定抗原が発現しなかったE.coli粗抽出物でアッセイして、再度抗体を結合させて確認した結果、ゾル−ゲルチップでは陰性と示された(図11)。
図11で、Nは陰性対照群で、抗体を固定しなかったチップであり、Ab1及びAb2は、抗体を濃度毎に(0.063ug/ul、0.125ug/ul)固定したものである。Pは陽性対照群で、Cy3蛍光物質を固定したものである。
(4)(i)探索しようとする疾病(AIDS)の抗体に対する抗原(p24、p31、gp41、gp120及びgp160)をゾル−ゲル蛋白質チップに固定した後、患者血清等特定抗体が含まれている物質(陽性血清)でアッセイして確認した結果、ゾル−ゲルチップで陽性と示された(図12)。
(ii)探索しようとする抗体に対する抗原をゾル−ゲルチップに固定した後、血清等特定抗体が含まれていなかった物質(陰性血清)でアッセイして確認した結果、ゾル−ゲルチップで陰性と示された(図12)。
(3) (i) An antibody against p24 protein is immobilized on a sol-gel protein chip for each concentration and then sandwiched by a sandwich assay method. As a result of assaying with a crude E. coli extract and rebinding the antibody, the result was positive in the sol-gel chip (FIG. 11).
(Ii) The antibody against the antigen to be searched was immobilized on the sol-gel protein chip for each concentration, and then the specific antigen was not expressed using the sandwich assay method. As a result of assaying with a crude E. coli extract and rebinding the antibody, it was shown negative in the sol-gel chip (FIG. 11).
In FIG. 11, N is a negative control group, which is a chip on which no antibody is immobilized, and Ab1 and Ab2 are obtained by immobilizing an antibody for each concentration (0.063 ug / ul, 0.125 ug / ul). P is a positive control group in which a Cy3 fluorescent substance is immobilized.
(4) (i) Specific antibodies such as patient serum are included after antigens (p24, p31, gp41, gp120 and gp160) against the antibody of the disease to be searched (AIDS) are immobilized on a sol-gel protein chip As a result of confirming by assaying with the substance (positive serum), it was shown to be positive in the sol-gel chip (FIG. 12).
(Ii) After immobilizing an antigen against the antibody to be searched for on a sol-gel chip and confirming it by assaying with a substance that does not contain a specific antibody such as serum (negative serum), the result is negative on the sol-gel chip. (FIG. 12).
≪実施例5:化合物と結合する蛋白質、または特定物質の探索≫
図13に示された通り、特定化合物(ビスフェノールA)を実施例2で製作したゾル−ゲルチップに固定して、陰性対照群として化合物を溶解するのに用いるバッファー溶液だけをチップに固定した。そして、蛍光物質(cy3)で標識されており、ビスフェノールAと結合できる1本鎖DNAアプタマー(ピーシエル(株)社から購入)を利用して分析した。
Example 5: Search for a protein or specific substance that binds to a compound
As shown in FIG. 13, the specific compound (bisphenol A) was immobilized on the sol-gel chip prepared in Example 2, and only the buffer solution used to dissolve the compound as a negative control group was immobilized on the chip. And it was labeled with a fluorescent substance (cy3) and analyzed using a single-stranded DNA aptamer (purchased from PSI) that can bind to bisphenol A.
蛋白質−蛋白質の結合は、酵母ツーハイブリッド法(yeast two hybrid)や免疫沈降(IP)等で確認できるが、化合物と蛋白質の結合、または化合物とDNAの結合を手軽に確認できる方法は多くない。前記実験結果、実施例2で製作された蛋白質チップは、化合物やDNAをはじめとする低分子物質から蛋白質、抗体に至るまで様々な物質を固定することができ、種々の物質の結合を手軽に確認することができる。 Protein-protein binding can be confirmed by the yeast two hybrid method or immunoprecipitation (IP), but there are not many methods for easily confirming the binding between the compound and the protein, or the binding between the compound and the DNA. As a result of the experiment, the protein chip manufactured in Example 2 can immobilize various substances ranging from low molecular substances such as compounds and DNA to proteins and antibodies, and easily bind various substances. Can be confirmed.
本発明に係る前記ゾル組成物のゲル化を利用して、バイオチップを製造する場合、SolB1、SolB2、及びSolB3で構成されるゾル組成物とSolBH、SolBS、DWとバッファー溶液を順に混合した後、低温で安定化させることによって、ゾル組成物のゲル化時間を遅らせて安定化されたゲル化(gelation)を導いて、ゾル溶液の分注が容易で、スポットの活性を維持することができる。また、事前に混合(premixing)する前処理過程なしにアレイヤーを利用した表面スポッティングだけ利用して手軽に均質なバイオチップ製作が可能であるという有利な効果があって有用である。 When a biochip is manufactured using the gelation of the sol composition according to the present invention, a sol composition composed of SolB1, SolB2, and SolB3, SolBH, SolBS, DW, and a buffer solution are sequentially mixed. By stabilizing at a low temperature, the gelation time of the sol composition is delayed, leading to a stabilized gelation, so that the sol solution can be easily dispensed and the activity of the spot can be maintained. . Further, it is useful because it has an advantageous effect that it is possible to easily produce a homogeneous biochip by using only surface spotting using an arrayer without a pre-processing step of premixing.
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記術は単に望ましい実施様態であるだけであり、これによって本発明の範囲が制限されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は添付された請求範囲及びその等価物によって定義される。 Although specific portions of the subject matter of the present invention have been described in detail above, such specific notation is merely a preferred embodiment for those having ordinary skill in the art, thereby Obviously, the scope of the present invention is not limited. Accordingly, the substantial scope of the present invention is defined by the appended claims and equivalents thereof.
Claims (16)
(a)SolB1、SolB2及びSolB3で構成されたゾル組成物を基板上に分注した後、HCl、H2SO4、HNO3及びCH3COOHからなる群から選択されたSolBH(溶液I)を分注する工程;及び
(b)緩衝液であるSolBS、標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質及び蒸留水を含む溶液IIを基板上に分注した後、ゲル化させる工程、
ここで、
(i)SolB1は、メチルトリエトキシシラン(MTES)、エチルトリエトキシシラン(ETrEOS)、ケイ酸ナトリウム、オルトケイ酸テトラメチル(TMOS)、オルトケイ酸テトラエチル(TEOS)及びテトラメトキシシリケート(TMS)からなる群から選択された1種以上の第1シリケート単量体であり;
(ii)SolB2は、3−アミノトリメトキシシラン(3−ATMS)、ジグリセリルシラン(DGS)、メチルトリメトキシシリケート(MTMS)、ポリグリセリルシリケート(PGS)、ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリドン、グリセリルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、N,N−ジスクシンイミジルカルボネート(DSC)、1,3,5−トリメチルベンゼン、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、3−(トリエトキシシリル)プロピルコハク酸無水物、N−(3−トリエトキシシリルプロピル)−4−ヒドロキシブチルアミド(SIT8189.5)、N−(トリエトキシシリルプロピル)グルコンアミド(SIT8189.0)50%、プルロニックL121及び水酸化テトラメチルアンモニウムからなる群から選択された1種以上の第2シリケート単量体であり;そして
(iii)SolB3は、アミノプロピルトリエトキシラン(APTES)、3−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン(GPTMOS)、N−トリエトキシシリルプロピル−O−ポリエチレンオキシドウレタン(PEOU)、グリセロール、PEG200、PEG400、PEG600、PEG1350及びPEG8000からなる群から選択された1種以上の添加剤であることを特徴とし、
(i)SolB1、SolB2、SolB3、SolBH、SolBS、または標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質を混合する過程;(ii)前記過程(i)の混合液をボルテックスする過程;及び(iii)前記過程(i)または(ii)の混合液を安定化する過程からなる群から選択されるいずれか一つの前処理過程を含まないことを特徴とする、前記製造方法。 A method for producing a biochip using gelation of a sol composition, comprising performing the following steps (a) and (b) in that order :
(A) After dispensing a sol composition composed of SolB1, SolB2 and SolB3 onto a substrate, SolBH (solution I) selected from the group consisting of HCl, H 2 SO 4 , HNO 3 and CH 3 COOH is added. A step of dispensing; and (b) a solution II containing SolBS, which is a buffer solution, a biological material that interacts with the target biological material, and distilled water, is gelled after being dispensed on a substrate,
here,
(I) SolB1 is a group consisting of methyltriethoxysilane (MTES), ethyltriethoxysilane (ETrEOS), sodium silicate, tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetraethyl orthosilicate (TEOS) and tetramethoxysilicate (TMS). One or more first silicate monomers selected from:
(Ii) SolB2 is 3-aminotrimethoxysilane (3-ATMS), diglycerylsilane (DGS), methyltrimethoxysilicate (MTMS), polyglyceryl silicate (PGS), polyvinyl acetate, polyvinylpyrrolidone, glyceryl methacrylate, hydroxyethyl Acrylate, N, N-disuccinimidyl carbonate (DSC), 1,3,5-trimethylbenzene, cetyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium bromide, 3- (triethoxysilyl) propyl succinic anhydride, N- (3-triethoxysilylpropyl) -4-hydroxybutyramide (SIT8189.5), N- (triethoxysilylpropyl) gluconamide (SIT8189.0) 50%, Pluronic L And one or more second silicate monomers selected from the group consisting of 21 and tetramethylammonium hydroxide; and (iii) SolB3 is aminopropyltriethoxylane (APTES), 3-glycidoxypropyltri One or more additives selected from the group consisting of methoxysilane (GPTMOS), N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (PEOU), glycerol, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 and PEG8000. As a feature ,
(I) a process of mixing SolB1, SolB2, SolB3, SolBH, SolBS, or a biological substance that interacts with a target biological substance; (ii) a process of vortexing the mixture of the process (i); iii) The production method described above, which does not include any one pretreatment process selected from the group consisting of processes of stabilizing the mixed solution of the process (i) or (ii) .
(a)SolB1、SolB2及びSolB3を含むゾル組成物に、HCl、H2SO4、HNO3及びCH3COOHからなる群から選択されたSolBH(溶液I)を混合する工程;
(b)緩衝液であるSolBSと蒸留水を工程(a)で混合された溶液と混合した後、−20〜4℃で安定化させる工程;及び
(c)標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質を含む溶液を工程(b)で安定化された溶液と混合して基板上に分注した後、ゲル化させる工程、
ここで、
(i)SolB1は、メチルトリエトキシシラン(MTES)、エチルトリエトキシシラン(ETrEOS)、ケイ酸ナトリウム、オルトケイ酸テトラメチル(TMOS)、オルトケイ酸テトラエチル(TEOS)及びテトラメトキシシリケート(TMS)からなる群から選択された1種以上の第1シリケート単量体であり;
(ii)SolB2は、3−アミノトリメトキシシラン(3−ATMS)、ジグリセリルシラン(DGS)、メチルトリメトキシシリケート(MTMS)、ポリグリセリルシリケート(PGS)、ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリドン、グリセリルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、N,N−ジスクシンイミジルカルボネート(DSC)、1,3,5−トリメチルベンゼン、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、3−(トリエトキシシリル)プロピルコハク酸無水物、N−(3−トリエトキシシリルプロピル)−4−ヒドロキシブチルアミド(SIT8189.5)、N−(トリエトキシシリルプロピル)グルコンアミド(SIT8189.0)50%、プルロニックL121及び水酸化テトラメチルアンモニウムからなる群から選択された1種以上の第2シリケート単量体であり;及び
(iii)SolB3は、アミノプロピルトリエトキシラン(APTES)、3−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン(GPTMOS)、N−トリエトキシシリルプロピル−O−ポリエチレンオキシドウレタン(PEOU)、グリセロール、PEG200、PEG400、PEG600、PEG1350及びPEG8000からなる群から選択された1種以上の添加剤であることを特徴とする製造方法。 A method for producing a biochip using gelation of a sol composition , comprising performing the following steps (a) to (c) in that order :
(A) mixing SolBH (solution I) selected from the group consisting of HCl, H 2 SO 4 , HNO 3 and CH 3 COOH into a sol composition containing SolB1, SolB2 and SolB3;
(B) a step of mixing SolBS, which is a buffer solution, and distilled water with the solution mixed in step (a) and then stabilizing at −20 to 4 ° C .; and (c) interacting with a target biological substance. A step of mixing a solution containing a biological substance with the solution stabilized in step (b) and dispensing the solution on a substrate, followed by gelling;
here,
(I) SolB1 is a group consisting of methyltriethoxysilane (MTES), ethyltriethoxysilane (ETrEOS), sodium silicate, tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetraethyl orthosilicate (TEOS) and tetramethoxysilicate (TMS). One or more first silicate monomers selected from:
(Ii) SolB2 is 3-aminotrimethoxysilane (3-ATMS), diglycerylsilane (DGS), methyltrimethoxysilicate (MTMS), polyglyceryl silicate (PGS), polyvinyl acetate, polyvinylpyrrolidone, glyceryl methacrylate, hydroxyethyl Acrylate, N, N-disuccinimidyl carbonate (DSC), 1,3,5-trimethylbenzene, cetyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium bromide, 3- (triethoxysilyl) propyl succinic anhydride, N- (3-triethoxysilylpropyl) -4-hydroxybutyramide (SIT8189.5), N- (triethoxysilylpropyl) gluconamide (SIT8189.0) 50%, Pluronic L And one or more second silicate monomers selected from the group consisting of 21 and tetramethylammonium hydroxide; and (iii) SolB3 is aminopropyltriethoxylane (APTES), 3-glycidoxypropyltri One or more additives selected from the group consisting of methoxysilane (GPTMOS), N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (PEOU), glycerol, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 and PEG8000. A featured manufacturing method.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/KR2011/003105 WO2012148017A1 (en) | 2011-04-27 | 2011-04-27 | Sol-gel kit for manufacturing a biochip and method for manufacturing a biochip by using same |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2014513797A JP2014513797A (en) | 2014-06-05 |
JP5770366B2 true JP5770366B2 (en) | 2015-08-26 |
Family
ID=47072520
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014508266A Active JP5770366B2 (en) | 2011-04-27 | 2011-04-27 | Biochip manufacturing sol-gel kit and biochip manufacturing method using the same |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5770366B2 (en) |
CN (1) | CN102893149B (en) |
BR (1) | BR112013027811B1 (en) |
WO (1) | WO2012148017A1 (en) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6300260B2 (en) * | 2013-08-28 | 2018-03-28 | 国立大学法人埼玉大学 | Method for producing replica microarray and original microarray containing target substance produced by the method |
CN106872714A (en) * | 2017-02-28 | 2017-06-20 | 阿卡斯特(武汉)生物技术有限公司 | A kind of method of high flux Large-scale Screening histone modification conjugated protein |
EP3824082B1 (en) * | 2018-07-20 | 2022-05-04 | Alho de Andrade, Luís Filipe | Combined composite for stabilization of active biological materials, method of production and use thereof |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TW523548B (en) * | 2000-09-04 | 2003-03-11 | Ind Tech Res Inst | High-density functional slide and preparation method thereof |
AU2002353997A1 (en) * | 2001-11-01 | 2003-05-12 | Rensselaer Polytechnic Institute | In vitro metabolic engineering on microscale devices |
CN100412203C (en) * | 2002-09-13 | 2008-08-20 | 株式会社Lg生命科学 | Bio-chip prepared by gelation on a chip substrate |
WO2004039487A1 (en) * | 2002-11-01 | 2004-05-13 | Mcmaster University | Multicomponent protein microarrays |
GB0227424D0 (en) * | 2002-11-25 | 2002-12-31 | Univ Warwick | Coatings |
FR2854696A1 (en) * | 2003-05-06 | 2004-11-12 | Commissariat Energie Atomique | BIOPUCE SUPPORT USING THIN LAYERS OF SOL GEL MATERIAL AND METHOD OF MAKING SAME |
JP2005077153A (en) * | 2003-08-28 | 2005-03-24 | Seiko Epson Corp | Microarray manufacturing method and manufacture device therefor |
KR100577694B1 (en) * | 2003-12-10 | 2006-05-10 | 학교법인 서강대학교 | Process for preparing protein chip by using sol-gel method |
EA012083B1 (en) * | 2005-02-03 | 2009-08-28 | Синвеншен Аг | Drug delivery materials, process for manufacturing thereof and implantant comprising said material |
JP4231869B2 (en) * | 2005-12-09 | 2009-03-04 | シャープ株式会社 | Biochemical sensor and measuring device |
KR100784437B1 (en) * | 2006-01-27 | 2007-12-11 | 김소연 | Composition of Sol for Sol-Gel Biochip to Immobilize Probe On Substrate Without Surface Treatment and Method for Screening Thereof |
KR101022927B1 (en) * | 2009-05-25 | 2011-03-16 | 삼성전기주식회사 | Biochip using aptamer and manufacturing method thereof |
CA2763834A1 (en) * | 2009-05-29 | 2010-12-02 | Mcmaster University | Biosensors utilizing ink jet-printed biomolecule compatible sol gel inks and uses thereof |
-
2011
- 2011-04-27 CN CN201180002483.3A patent/CN102893149B/en active Active
- 2011-04-27 WO PCT/KR2011/003105 patent/WO2012148017A1/en active Application Filing
- 2011-04-27 BR BR112013027811-0A patent/BR112013027811B1/en active IP Right Grant
- 2011-04-27 JP JP2014508266A patent/JP5770366B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102893149B (en) | 2015-11-25 |
WO2012148017A1 (en) | 2012-11-01 |
BR112013027811B1 (en) | 2022-01-18 |
CN102893149A (en) | 2013-01-23 |
BR112013027811A2 (en) | 2017-04-04 |
JP2014513797A (en) | 2014-06-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101148860B1 (en) | Method of agitating solution | |
JP4307380B2 (en) | Biochip produced by gelation reaction on chip substrate | |
US10191045B2 (en) | Sol composition for sol-gel biochip to immobilize probe on substrate without surface treatment and method and screening thereof | |
US20200271643A1 (en) | Methods and systems for the detection of analyte molecules | |
KR20000071894A (en) | Multipurpose diagnostic systems using protein chips | |
JP5770366B2 (en) | Biochip manufacturing sol-gel kit and biochip manufacturing method using the same | |
JP2021099362A (en) | Methods, tools, and tool assemblies for biomolecular analysis using microarrays | |
US20160038903A1 (en) | Sol-gel kit for preparing biochip and methods for preparing biochip using the same | |
Kim et al. | Improved sensitivity and physical properties of sol− gel protein chips Using large-scale material screening and selection | |
EP2518503B1 (en) | Sol-gel kit for preparing biochip and method for preparing biochip using the same | |
CN114308154A (en) | Preparation method of double epoxy group modified biochip substrate | |
WO2013001894A1 (en) | Base material having hydrophilic layer | |
Winssinger et al. | Probing biology with small molecule microarrays (SMM) | |
Ewart et al. | High quality epoxysilane substrate for clinical multiplex serodiagnostic proteomic microarrays | |
CN111257553A (en) | Stabilizer of protein quality control chip and method for preparing protein quality control chip | |
JPWO2017126479A1 (en) | Target analysis method and target analysis chip |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20131219 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20140825 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140924 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20141224 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150126 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150602 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150624 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5770366 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |