BR112013023919B1

BR112013023919B1 - Método de expressão de uma molécula de ácido nucleico heteróloga em uma planta

Info

Publication number: BR112013023919B1
Application number: BR112013023919-0A
Authority: BR
Inventors: Bruce Held; Vaithilingam Sekar; Janell Eby; Carol Lewnau; Penny Perkins
Original assignee: Ms Technologies, Llc
Priority date: 2011-03-18
Filing date: 2012-03-07
Publication date: 2021-04-13
Also published as: US20120240291A1; WO2012128946A1; US8648230B2; CA2828931C; CA2828931A1; BR112013023919A2

Abstract

polinucleotídeo isolado, método para obtenção de uma célula, método para obtenção de uma planta, produto de grão, método de expressão de uma molécula, região reguladora, método de regulação da expressão de uma molécula. regiões reguladoras que regulam a expressão de urna molécula de ácido nucleico heteróloga operativamente ligada em plantas são mostradas. promotores que se expressam em níveis mais baixos em células polínicas do que em outras células vegetais são descritos. métodos de utilização de tal promotor para regular a expressão de urna molécula de ácido nucleico operativamente ligada são descritos. urna sequência de nucleotídeos de poliadenilação de soja é ainda apresentada.

Description

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0001] O pedido de patente contém uma listagem de sequências que foi apresentado em formato ASCII através de EFS -Web e é aqui incorporada por referência na sua totalidade. A referida cópia ASCII, criado em 28 de fevereiro de 2011, é denominada 210009.txt e possui 10.745 bytes de tamanho.

APLICAÇÕES RELACIONADAS

[0002] Este pedido reivindica prioridade ao anteriormente apresentado e co-pendente pedido USSN 13/ 051, 358, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] A expressão de uma sequência de nucleotídeos heteróloga em uma célula vegetal é impactada por ácidos nucleicos reguladores. Os promotores e os terminadores são dois tipos de elementos reguladores que impactam a expressão de tais sequências ligadas operativamente. Os promotores são ferramentas moleculares vitais que têm sido amplamente aplicados em biotecnologia vegetal para controlar a expressão de genes introduzidos. Um promotor é uma sequência de ácido nucleico ao qual a RNA polimerase tem de se ligar para transcrever o gene ligado em RNA mensageiro e, finalmente produzir proteína. Um promotor pode afetar um gene estrutural operacionalmente associado com o promotor de diferentes maneiras. Ele pode, por exemplo, aumentar ou reprimir a expressão de um gene estrutural associado, submeter o gene a regulação de desenvolvimento, ou contribuir para a regulação específica de tecido do referido gene. Existem diferentes tipos de promotores utilizados de acordo com a função desejada. Promotores constitutivos proporcionam a expressão em todos os tecidos da planta, onde os promotores preferenciais do tecido vão expressar a uma taxa superior em um (ou alguns) tecido selecionado da planta. Os promotores induzíveis são aqueles que induzem o efeito regulador do promotor em resposta a um estímulo, que pode ser, por exemplo, químico, de temperatura, tensão, ferimento ou outros estímulos. A sequência de nucleotídeos ligada pode executar qualquer uma de uma ampla variedade de funções desejadas, seja ela reprimir ou iniciar a expressão de uma característica ou uma proteína de interesse, proporcionando a superexpressão, modificando processos metabólicos e de desenvolvimento no interior do tecido da planta, ou semelhantes.

[0004] A origem de vários promotores de plantas e patógenos de plantas (bacterianos e virais) foi usada para dirigir a expressão do transgene nas plantas. Exemplos importantes incluem o promotor beta-faseolina do feijão francês (Bustos et al., 1989 The Pant Cell Vol. 1, 839-853), o promotor de sintase manopina de Agrobacterium tumefaciens (Leung et al., 1991 Mol. Gen. Genet. 230, 463-474), e o promotor 35S do vírus mosaico da couve-flor (Guilley e al. de 1982, Cell 30, 763-773). Estes e vários outros promotores em uso generalizado em plantas foram originalmente desenvolvidos e utilizados em espécies dicotiledôneas.

[0005] Sequências de terminação, também desempenham um papel importante na regulação da expressão gênica. O terminal 3' de uma sequência de nucleotídeos isolada é o local onde a transcrição para. Uma região terminal pode ser nativa com o promotor utilizado, pode ser nativa com as sequências heterólogas ligadas ou derivada de outra fonte.

[0006] Todas as referências aqui citadas são aqui incorporadas por referência.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0007] Regiões reguladoras de Glycine max foram identificadas, e funcionam como um promotor e um terminador demonstrado. As regiões promotoras expressam preferencialmente uma molécula de ácido nucleico operativamente ligada a níveis mais baixos do que em tecido de pólen de outro tecido da planta. A invenção é ainda dirigida a métodos de utilização e sequências que têm pelo menos 90% ou 95% de identidade e que hibridizam para a mesma sob circunstâncias altamente rigorosas e fragmentos funcionais. Uma região terminal é usada para regular mais profundamente a expressão de sequências ligadas.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0008] A Figura 1 mostra a sequência de 1059 pares de base do promotor GNR da invenção com a suposta caixa TATA sublinhada. (SEQ ID NO: 1).

[0009] A Figura 2 mostra a sequência 884 pares de base do promotor GSO da invenção (SEQ ID NO: 2) com a suposta caixa TATA sublinhada.

[0010] A Figura 3 mostra a sequência de 1110 pares de base do promotor 17 da invenção (SEQ ID NO: 3) com a suposta caixa TATA sublinhada.

[0011] A Figura 4 mostra a sequência de 1382 pares de base do promotor 185 da invenção (SEQ ID NO: 4) com a suposta caixa TATA sublinhada.

[0012] A Figura 5 mostra a sequência de 368 pares de base do terminador GSO (SEQ ID NO: 5).

[0013] A Figura 6 mostra um diagrama da construção pGNRproGUSGSOter.

[0014] A Figura 7 mostra um diagrama da construção pGSOproGUSGSOter.

[0015] A Figura 8 mostra um diagrama da construção pGNRGUSNPT.

[0016] A Figura 9 mostra um diagrama da construção pGSOGUSNPT.

[0017] A Figura 10 mostra um diagrama da construção 17GUSNPT.

[0018] A Figura 11 mostra um diagrama da construção 185GUSNPT.

DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERENCIAIS

[0019] Sequências nucleotídicas encontram-se descritas neste documento, que regula a transcrição de expressão preferida em células vegetais que não de pólen. Estas novas sequências de nucleotídeos foram isolados a partir de Glycine max. Quatro elementos promotores foram identificados. O elemento promotor GNR é uma sequência de 1059 pares de bases e é mostrada na Figura 1 (SEQ ID NO: 1). O elemento promotor GSO é uma sequência de 884 pares de bases e é mostrada na Figura 2 (SEQ ID NO: 2). O promotor 17 é uma sequência de 1110 pares de bases e é mostrada na Figura 3. O promotor 185 é uma sequência de 1382 pares de bases e é mostrada na Figura 4. A presente invenção também é direcionada a moléculas de ácidos nucleicos, incluindo o referido promotor, tais como uma construção de moléculas de ácido nucleico compreendendo o promotor operativamente ligado a uma ou mais moléculas de ácido nucleico. A invenção é ainda direcionada para o tecido vegetal transformado, incluindo a molécula de ácido nucleico, e para plantas e sementes transformadas a partir disso. O promotor é útil para a condução de sequências de nucleotídeos, por exemplo, um gene ou expressão de anti-sentido com o propósito de transmitir traços agronomicamente úteis, tais como, mas não limitados a, aumento da produtividade, resistência a doenças, resistência a insetos, tolerância a herbicidas, tolerância à seca e a sal nas plantas.

[0020] As regiões do promotor da presente invenção regulam a expressão de uma molécula de ácido nucleico operativamente ligada de tal forma que a molécula de ácido nucleico se expresse em níveis mais elevados em células vegetais que não sejam células polínicas. Assim, sempre que um polipeptídeo é traduzida a partir da molécula de ácido nucleico operativamente ligada, os níveis de expressão do polipeptídeo em células não polínicas é maior do que nas células polínicas. Ao referir-se a uma maior expressão também se busca incluir, onde a molécula de ácido nucleico operativamente ligada não codifica, um polipeptídeo (como, por exemplo, onde a molécula de ácido nucleico é uma sequência de nucleotídeos anti-sentido), e o produto de transcrição é encontrada em níveis mais elevados em células que não sejam polínicas. Tal como aqui utilizado, o termo promotor preferido de tecido não polínico ou um promotor que expressa a níveis mais baixos no pólen refere-se a uma sequência de ácido nucleico que regula a expressão de sequências de ácido nucleico seletivamente nas células ou tecidos que não sejam células ou tecidos de pólen da planta. Dito de outra maneira, a sequência de ácido nucleico é expressa de tal forma que ela se expresse em níveis mais baixos nas células polínicas do que em outras células da planta. Pólen aqui se refere ao grão de pólen e/ou micrósporos em uma planta de semente. Assim, uma molécula de ácido nucleico operativamente ligada se expressará em níveis mais altos em tecidos não pólen, tais como raízes, folhas, caule, e semelhantes, e em níveis mais baixos no pólen.

[0021] Tal promotor é útil em uma variedade de situações que podem ser evidentes para um perito na arte. A título de exemplo, sem pretender ser limitativo, o promotor pode ser ligado a uma molécula de ácido nucleico que, quando expressa, proporciona resistência ou tolerância a um herbicida ou outra composição citotóxica ou produto produzido por uma outra molécula de ácido nucleico que impacta negativamente células ou a expressão de gene. Quando exposto à composição ou produto do gene, o pólen é negativamente afetado, mas a parte restante da planta é tolerante à exposição à composição ou produto. A função ou a formação de pólen é interrompida. A planta resultante será, então, macho estéril. Em um exemplo, o promotor pode ser ligado a uma molécula de ácido nucleico que produz uma enzima EPSPS duplamente mutante, que fornece tolerância à exposição ao glifosato. Ver, por exemplo, Patente dos EUA Nos 7.045.684, 7.626.077 e GenBank Accession N° X63374, todas as quais são aqui incorporadas por referência em sua totalidade. Exemplos da ampla variedade de tais moléculas de ácido nucleico estão listados abaixo. Quando expostos ao herbicida, o tecido de pólen não é tolerante e é impactado pelo herbicida.

[0022] Em uma forma de realização, uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida na planta, o que destrói a função ou formação das células ou a função ou formação de um gene crítico para a célula. Muitas de tais moléculas de ácido nucleico são conhecidas, exemplos incluem as DNases e RNases (ver Patente dos EUA N° 5.633.441), moléculas de ácido nucleico que codificam a citotoxina (ver, por exemplo, Kenn et al (1986) J. Bacterol 168:595); genes metilase (ver, por exemplo, Patente dos EUA N° 5.689.049), gene da toxina CytA de Bacillus thuringiensis (Patente dos EUA N° 4.918.006) e ribonucleases, tais como a bRNAase (Patente dos EUA N° 5.689.041) . Os promotores da presente invenção podem ser ligados a uma molécula de ácido nucleico que evita o impacto negativo. Para ilustrar, sem limitação, onde a enzima bRNAase pode ser utilizado para interromper a função de células, o gene barstar de Bacillus amyloliquefaciences produz uma proteína que proporciona a molécula fundamental para a função celular. Um exemplo ilustrativo disto é ligar operativamente o promotor a uma anti-sentido à molécula de ácido nucleico, interrompendo, assim, a sua expressão em células não polínicas, como discutido abaixo. Obviamente, muitas variações são possíveis para o perito na arte.

[0023] O promotor da invenção pode ser utilmente empregado com qualquer molécula de ácido nucleico, cuja expressão é vantajosamente reduzida no tecido de pólen. Qualquer aplicação onde possa desejar-se uma menor expressão no pólen pode ser utilizada com o promotor da invenção. Outro exemplo é o caso em que uma proteína de B. thuringiensis se expressa em uma planta. Tais proteínas são expressas para limitar ou controlar ataques à planta por insetos lepidópteros e coleópteros que poderiam, em outras circunstâncias, danificar a planta. Esta proteína de controle de insetos ecologicamente correta é bem conhecida [ver a discussão sobre proteínas Cry em Crickmore et al. (1988) Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62:807-813] e é codificada por várias moléculas de ácido nucleico. Ver, a título de exemplo e sem pretender-se ser limitador WO02/057664 (discutindo um gene Cry2Ae), Patente dos EUA 7.049.491 (que discute um gene de Cry1Ab) e Patente dos EUA Nos 6.855.873 e 6.172.281, todas as quais são aqui incorporadas por referência. Verificou-se que a expressão de tais proteínas em pólen pode ser prejudicial para a planta. O promotor da presente invenção pode ser usado com uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de B. Thuringiensis, ou similar, com um efeito prejudicial reduzido sobre o pólen.

[0024] Além de ser usado para dirigir uma molécula de ácido nucleico produtora de proteína, os promotores da invenção podem ser usados com qualquer molécula de ácido nucleico, seja ela produtora de proteína ou não. O promotor pode ser utilizado para conduzir o RNA, que pode ser utilizados para um sistema de silenciamento qualquer, como o anti-sentido, em que não se produz proteína [Nellen et al. (1993) TIBS 18:419-423; Alexander et al. (1988) Gene 72:45-50]. Meios de aumentar ou inibir uma proteína são bem conhecidos para um perito na arte e, por meio de exemplo, podem incluir, ao lado de supressão anti-sentido, a supressão de sentido ou utilização de formações de hairpin loops, métodos de co- supressão incluindo, mas não limitados a, interferência de RNA. Pela sequência de nucleotídeos de DNA anti-sentido intenciona-se uma sequência que está na orientação inversa à orientação normal de 5' para 3' dessa sequência de nucleotídeos. Quando levada a uma célula vegetal, a expressão da sequência de DNA anti-sentido impede a expressão normal da sequência de nucleotídeos de DNA para o gene alvo. Ver, por exemplo, Patente dos EUAs Nos. 5.107.065 e 6.617.496 e Stone, et ai. (1999) Science 286:1729-1731, aqui incorporadas por referência. Tais moléculas de ácido nucleico anti-sentido têm sido amplamente utilizadas e são adaptadas ao sistema particular utilizado e a molécula de ácido nucleico a que se destina. Aqui, em uma forma de realização, a sequência de nucleotídeos anti-sentido codifica uma transcrição de RNA que é complementar a e capaz de hibridar com o mensageiro endógeno RNA (mRNA), produzido pela transcrição da sequência de nucleotídeos de planta que interrompe a função ou a formação de uma célula vegetal ou gene alvo. Tal DNA anti- sentido pode ser transcrito em uma sequência de RNA capaz de se ligar à(s) parte(s) codificadora e/ou não codificadora do RNA alvo, de modo a neutralizar a tradução do RNA alvo. Tais genes anti-sentido podem ser anti-sentido para um gene, por exemplo, que de outra forma impede a função ou a formação de uma célula vegetal ou gene alvo.

[0025] O polinucleotídeo para utilização na supressão anti- sentido pode corresponder a todo ou parte do complemento da sequência que codifica o alvo polipeptídio, todo ou parte do complemento da região não traduzida 5' e/ou 3' do transcrito do polipeptídio alvo, ou a totalidade ou parte do complemento tanto da sequência de codificação e as regiões não traduzidas de um transcrito que codifica o polipeptídio alvo. Além disso, o polinucleotídeo anti-sentido pode ser totalmente complementar (isto é, 100% idêntico ao complemento da sequência alvo) ou parcialmente complementar (isto é, menos do que 100% idêntico ao complemento da sequência alvo) à sequência alvo. Supressão anti- sentido pode ser utilizada para inibir a expressão de proteínas múltiplas na mesma planta. Além disso, porções dos nucleotídeos anti-sentido podem ser utilizadas para interromper a expressão do gene alvo. Geralmente, sequências de ao menos 20 sequências de nucleotídeos, 50 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 200 nucleotídeos, 300, 500, 550, 500, 550, ou mais podem ser utilizadas ou qualquer quantidade no intermediária.

[0026] Co-supressão é outro fenômeno que pode ser utilizado, onde uma sequência que é substancialmente homóloga ao transcrito correspondente da molécula de ácido nucleico de esterilidade masculina é fornecida e suprime a expressão da molécula de ácido nucleico de esterilidade. Ver, por exemplo, Jorgensen et al., Patente dos EUA N° 5.034.323.

[0027] Em algumas formas de realização da invenção, a inibição da expressão de um polipeptídeo alvo pode ser obtida pela interferência de um RNA de cadeia dupla (dsRNA). RNA, que é de cadeia dupla em parte ou completamente, é produzido com base na sequência da molécula de ácido nucleico alvo. Variações sobre os detalhes da produção do dsRNA podem ser empregadas. Exemplos incluem os descritas por Graham et al., Patente dos EUA N° 6.573.099, em que são utilizadas duas cópias de uma sequência que corresponde à sequência alvo, e, como o descrito por Fire et a., Patente dos EUA N° 6.326.193, onde uma primeira cadeia é RNA correspondente ao ácido nucleico alvo, e a segunda é complementar à sequência. As cadeias hibridizam para formar dsRNA inibidores. A expressão de moléculas de sentido e anti-sentido pode ser alcançada através da construção do cassete de expressão para incluir tanto uma sequência com sentido e uma sequência anti- sentido. Alternativamente, cassetes de expressão separados podem ser utilizados para as sequências de sentido e anti-sentido. Várias linhas de plantas transformadas com a cassete de expressão de interferência dsRNA ou cassetes de expressão são então pesquisadas para identificar linhas de plantas que apresentam a maior inibição da expressão do polipeptídeo.

[0028] Em algumas formas de realização da invenção, a inibição da expressão de um ou mais polipeptídeos alvos pode ser obtido por interferência de RNA hairpin (hpRNA) ou interferência de RNA hairpin que contenha um íntron (ihpRNA). Estes métodos são altamente eficazes na inibição da expressão de genes. Ver, Waterhouse e Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38 e as referências aí citadas.

[0029] Para interferência hpRNA, a cassete de expressão é construída para expressar uma molécula de RNA que hibrida com si própria para formar uma estrutura de hairpin, que compreende uma região de loop de cadeia simples e de uma haste de bases emparelhadas. A região da haste de bases emparelhadas compreende uma sequência de sentido correspondente à totalidade ou parte do RNA mensageiro endógeno, que codifica o gene cuja expressão é para ser inibido, e uma sequência anti-sentido que é total ou parcialmente complementar à sequência de sentido. Assim, a região da haste de bases emparelhadas da molécula geralmente determina a especificidade da interferência do RNA. As moléculas hpRNA são altamente eficientes na inibição da expressão de genes, e a interferência de RNA que elas induzem é herdada pelas gerações subsequentes de plantas. Ver, por exemplo, Chuang e Meyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 97:5985-5990, Stoutjesdijk et al. (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731 e Waterhouse e Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 5:29-38. Métodos para a utilização de interferência hpRNA para inibir ou silenciar a expressão de genes são descritos, por exemplo, em Chuang e Meyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 97:5985-5990, Stoutjesdijk et al. (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731, Waterhouse e Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 5:29-38, Pandolfini et al. BMC Biotechnology 03:07 e Patente dos EUA N° 20030175965. RNAs hairpin que possuem a capacidade para suprimir a expressão de um gene têm sido descritos [ver, por exemplo, Matzke et al. (2001) Curr. Opin. Genet. Devel. 11:221-227, Scheid et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci.., EUA 99:13659-13662, Waterhouse e Helliwell (2003) supra, Aufsaftz et al. (2002) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 99 (4):16499-16506 e Sijen et al., Curr. Biol. (2001) 11:436-440]. Um ensaio transitório para a eficiência do hpRNA construído para silenciar a expressão de genes in vivo foi descrita por Panstruga et al. (2003) Mol. Biol. Rep. 30:135-150.

[0030] Para o ihpRNA, as moléculas de interferência têm a mesma estrutura geral que para o hpRNA, mas a molécula do RNA, adicionalmente, compreende um íntron que é capaz de ser emendada na célula na qual se expressa o ihpRNA. O uso de um íntron minimiza o tamanho do loop na molécula RNA hairpin que advém da emenda, e isto aumenta a eficiência da interferência. Ver, por exemplo, Smith et a. (2000) Nature 507:319-320.

[0031] Em algumas formas de realização da invenção, a inibição da expressão de um ou mais polipeptídeos alvos pode ser obtida por interferência de RNA através da expressão de um gene que codifica um micro RNA (miRNA). miRNAs são agentes reguladores que consistem em cerca de 22 ribonucleotídeos. miRNA são altamente eficazes na inibição da expressão de genes endógenos. Ver, por exemplo, Javier et al. (2003) Nature 525: 257-263. Para interferência miRNA, a cassete de expressão é projetado para expressar uma molécula de RNA que é modelado em um gene miRNA endógen° O gene miRNA codifica um RNA, que forma uma estrutura de hairpin que contém uma sequência de 22 nucleotídeos que é complementar a um outro gene endógeno (sequência alvo). Para a supressão da expressão do polipeptídeo alvo, a sequência de 22 nucleotídeos é selecionada a partir de uma sequência de transcrição de destino e contém 22 nucleotídeos da referida sequência do polipeptídeos alvos na orientação de sentido e 21 nucleotídeos de uma sequência anti-sentido correspondente, que é complementar à sequência de sentido. Moléculas miRNA são altamente eficientes na inibição da expressão de genes endógenos, e a interferência de RNA que eles induzem é herdada por gerações subsequentes de plantas.

[0032] Em uma concretização, o polinucleotídeo codifica para uma proteína dedo de zinco que se liga a um gene que codifica um polipeptídeo alvo, resultando na redução da expressão do gene. Em concretizações particulares, a proteína dedo de zinco ligase a uma região reguladora de um gene do polipeptídeo alvo. Em outras formas de realização, a proteína de dedo de zinco ligase a um RNA mensageiro que codifica um polipeptídeo alvo e evita a sua tradução. Métodos de seleção dos locais para se direcionar por proteínas dedo de zinco foram descritos, por exemplo, em Patente dos EUA N° 6.553.252, e os métodos para a utilização de proteínas dedo de zinco para inibir a expressão de genes em plantas são descritos, por exemplo, na Patente dos EUA 7.151.201, ambas aqui incorporadas por referência.

[0033] Um hospedeiro recombinante pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica que contenha um vetor de clonagem ou um vetor de expressão. Este termo também inclui aquelas células procarióticas ou eucarióticas que tenham sido geneticamente modificadas para conter o(s) gene(s) clonado(s) no cromossoma ou genoma da célula hospedeira. O promotor é, em uma forma de realização, particularmente útil para a expressão de sequências de nucleotídeos em plantas. Ele pode ser utilizado em qualquer espécie de planta, incluindo plantas dicotiledôneas, tais como, a título de exemplo mas sem limitação, tabaco, tomate, batata, soja, algodão, canola, girassol e alfafa. Alternativamente, a planta pode ser uma planta monocotiledônea, a título de exemplo mas sem limitação, milho, trigo, centeio, arroz, aveia, cevada, relvada, sorgo, painço ou cana de açúcar.

[0034] O termo planta é aqui amplamente utilizado para incluir toda a planta em qualquer estágio de desenvolvimento, ou parte de uma planta, incluindo um corte da planta, uma célula vegetal, uma cultura de células vegetais, um órgão de planta, uma semente de planta, e uma plântula. Uma célula vegetal é a unidade estrutural e fisiológica da planta, que compreende um protoplasto e parede celular. Uma célula vegetal pode estar na forma de uma única célula isolada ou um agregado de células, tais como um calo friável, ou uma célula de cultura, ou pode ser parte de uma unidade de organização superior, por exemplo, um tecido de planta, um órgão de planta, ou uma planta. Assim, uma célula vegetal pode ser um protoplasto, uma célula produtora de gametas, ou uma célula ou um conjunto de células, que pode se regenerar em uma planta inteira. Desta forma, uma semente, que compreende várias células vegetais e é capaz de se regenerar uma planta inteira, é considerada uma célula vegetal para os fins desta divulgação. Um tecido ou órgão de planta podem ser uma semente, um protoplasto, um calo, ou qualquer outro grupo de células vegetais organizadas em uma unidade estrutural ou funcional. Partes especialmente úteis de uma planta incluem partes cultiváveis e partes úteis para a propagação de plantas descendentes. Uma parte cultivável de uma planta pode ser de qualquer parte útil de uma planta, por exemplo, flores, pólen, sementes, tubérculos, caules, folhas, frutos, sementes, raízes e semelhantes. Uma parte de uma planta útil para a propagação inclui, por exemplo, sementes, frutos, cortes, mudas, tubérculos, enxertos e semelhantes. A cultura de tecido será, de preferência, capaz de regenerar plantas que possuem as mesmas características morfológicas e fisiológicas daquela planta, e de regenerar plantas que tenham substancialmente o mesmo genótipo. De preferência, as células regeneráveis em tais culturas de tecidos serão embriões, protoplastos, células meristemáticas, calos, pólen, folhas, anteras, raízes, coifa, seda, flores, grãos, espiga, sabugos, cascas ou talos. Além disso, a presente invenção proporciona plantas regeneradas a partir de culturas de tecido da invenção.

[0035] Tal como aqui utilizado, os termos ácido nucleico ou polinucleotídeo referem-se à desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e polímeros dos mesmos, quer em forma simples ou em cadeia dupla. Desta forma, os termos incluem RNA e DNA, que pode ser um gene ou uma porção do mesmo, um cDNA, uma sequência de ácido polidesoxirribonucleico sintético, ou semelhante, e pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla, bem como um DNA/RNA híbrido. Além disso, os termos são aqui utilizados para incluir moléculas de ácido nucleico que ocorrem naturalmente, que podem ser isolados de uma célula, assim como moléculas sintéticas, que podem ser preparados, por exemplo, por métodos de síntese química ou por métodos enzimáticos, tais como a reação em cadeia da polimerase (PCR). A menos que especificamente limitados, os termos englobam os ácidos nucleicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação semelhantes ao ácido nucleico de referência e são metabolizados de forma similar aos nucleotídeos de ocorrência natural. Salvo indicação contrária, uma sequência de ácido nucleico particular também abrange, implicitamente, variantes conservadoramente modificadas do mesmo (por exemplo, substituições de códons degeneradas) e sequências complementares, assim como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, as substituições de códons degenerados podem ser conseguidas pela geração de sequências nas quais a terceira posição de um ou mais (ou todos) códons selecionados é substituída por resíduos de base mista e/ou desoxiinosina (Batzer et al. (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081, Ohtsuka et al (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608, Rossolini et al (1994) Mol. Cell. Probes. 8:91-98). O termo ácido nucleico é utilizado alternadamente com gene, cDNA e mRNA codificado por um gene.

[0036] "Variantes conservadoramente modificadas" se aplica tanto a sequências de aminoácidos e de ácidos nucleicos. No que diz respeito a determinadas sequências de ácidos nucleicos, variantes conservadoramente modificadas referem-se àqueles ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas, ou em que o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácidos, a sequências essencialmente idênticas. Devido à degenerescência do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codifica qualquer polipeptídeo. Por exemplo, os códons CGU, CGC, CGA, CGG, AGA e AGG todos codificam o aminoácido arginina. Assim, em cada posição em que uma arginina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer um dos códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácidos nucleicos são "substituições silenciosas" ou "variações silenciosas", que são uma espécie de "variações conservadoramente modificadas". Cada sequência de polinucleotídeos aqui descrita que codifica um polipeptídeo também descreve qualquer possível variação silenciosa, exceto quando é indicado o contrário. Assim, as substituições silenciosas são uma característica implícita de toda sequência de ácido nucleico que codifica um aminoácido. Um perito reconhecerá que cada códon em um ácido nucleico (exceto AUG, que é normalmente o único códon para a metionina) pode ser modificado para originar uma molécula funcionalmente idêntica através de técnicas convencionais. Em algumas formas de realização, as sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo de proteção são de preferência otimizadas para a expressão em uma célula hospedeira específica (por exemplo, de levedura, de mamíferos, plantas, fungos, e semelhantes) usada para produzir o polipeptídeo ou RNA.

[0037] Tal como com as sequências de aminoácidos, um perito reconhecerá que substituições individuais, deleções ou adições a um ácido nucleico, peptídeo, polipeptídeo ou sequência de proteína que alteram, adicionam ou eliminam um único aminoácido ou uma pequena percentagem de aminoácidos na sequência codificada são "variantes conservadoramente modificadas” aqui referidas como "variantes", onde a alteração resulta na substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente semelhante. Tabelas de substituição conservadoras que fornecem aminoácidos funcionalmente semelhantes são bem conhecidas na arte. Ver, por exemplo, Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology Appleton & Lange, Norwalk, Conn (1994) . Tais variantes conservadoramente modificadas são adicionais a, e não excluem variantes polimórficas, homólogos interespécies, e alelos da invenção.

[0038] Os oito grupos seguintes contêm cada um, aminoácidos que são substituições conservadoras umas de uma pela outra: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina; (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); e 8), cisteína (C), Metionina (M) (ver, por e x emplo, Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties WH Freeman & Co.; 2nd edition (Dezembro de 1993)).

[0039] Com respeito às moléculas de RNA, o termo ácido nucleico isolado refere-se primariamente a uma molécula de RNA codificada por uma molécula de DNA isolada como definida acima. Alternativamente, o termo pode referir-se a uma molécula de RNA que foi suficientemente separada de moléculas de RNA com as quais estaria associada no seu estado natural (isto é, em células ou tecidos), de tal modo que ela exista em uma forma substancialmente pura.

[0040] Por célula hospedeira entende-se uma célula que contenha um vetor e suporta a replicação e/ou expressão do vetor. As células hospedeiras podem ser células procarióticas, tais como Escherichia coli, ou células eucarióticas, tais como leveduras, insetos, anfíbios, ou células de mamíferos. De preferência, as células hospedeiras são células vegetais monocotiledóneas ou dicotiledóneas.

[0041] O termo complexo de hibridação faz referência a uma estrutura de ácido nucleico dupla formada por duas sequências de ácidos nucleicos de cadeia simples hibridadas seletivamente uma com a outro.

[0042] O termo “introduzida” no contexto da inserção de um ácido nucleico em uma célula inclui a transfecção ou transformação ou transdução e faz referência à incorporação de um ácido nucleico em uma célula eucariótica ou procariótica, onde o ácido nucleico pode ser incorporado no genoma da célula (por exemplo, cromossoma, plasmídeo, plasto ou DNA mitocondrial), convertido em um replicon autônomo, ou expresso transitoriamente (por exemplo, mRNA transfectado). Ao referir- se à introdução de uma sequência de nucleotídeos em uma planta faz-se referência à transformação na célula, bem como o cruzamento de uma planta que possui a sequência com uma outra planta, de forma que a segunda planta contenha a sequência heteróloga, como em técnicas convencionais de reprodução de plantas. Tais técnicas de reprodução são bem conhecidas de um perito na arte. Para uma discussão de técnicas de reprodução de plantas, ver Poehlman (1995) Breeding Field Crops. AVI Publication Co., Westport Conn, 4th Edit. Métodos de retrocruzamento podem ser utilizados para introduzir um gene nas plantas. Esta técnica tem sido usada há décadas para introduzir características em uma planta. Um exemplo de uma descrição disto e de outros métodos de reprodução de plantas, que são bem conhecidas podem ser encontrados em referências tais como Poehlman, supra, e Plant Breeding Methodology, edit. Neal Jensen, John Wiley & Sons, Inc. (1988). Em um protocolo típico de retrocruzamento, a variedade original de interesse (progenitor recorrente) é cruzada com uma segunda variedade (progenitor não recorrente) que transporta o gene único de interesse a ser transferido. Os descendentes resultantes deste cruzamento são então cruzados novamente com o progenitor recorrente e o processo é repetido até que seja obtida uma planta na qual essencialmente todas as características morfológicas e fisiológicas desejadas do progenitor recorrente são recuperadas na planta convertida, além do único gene transferido do progenitor não recorrente.

[0043] As moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser utilizadas para isolar sequências correspondentes de outros organismos, em particular de outras plantas, ou para sintetizar sequências sintéticas. Deste modo, os métodos tais como a reação em cadeia de polimerase (PCR), a hibridação, a construção do gene sintético e afins podem ser usadas para gerar ou identificar tais sequências com base na sua homologia de sequência às sequências aqui estabelecidas. As sequências identificadas, isoladas ou construídas com base na sua identidade de sequência com a totalidade ou qualquer parte das sequências promotoras estabelecidas estão englobadas pela presente invenção. A síntese de sequências apropriadamente empregues na presente invenção pode ser afetada por meio de oligonucleotídeos longos mutuamente iniciadores. Ver, por exemplo, Wosnick et al. (1987) Gene 60:115. Em uma abordagem de PCR, os primers de oligonucleotídeos podem ser concebidas para utilização em reações de PCR para amplificar sequências de DNA correspondentes a partir de cDNA ou DNA genômico extraído de qualquer planta de interesse. Métodos para conceber primers de PCR e clonagem de PCR são geralmente conhecidos na arte e são aqui divulgados (Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N. Y, Innis, M., Gelfand, D., Sninsky, J. e White, T. (1990) PCR Protocolos: A Guide to Methods and Applications Academic Press, New York, Innis, M. Gelfand, D. e Sninsky, J. (1995) PCR Strategies. Academic Press, New York, Innis, M., Gelfand, D. e Sninsky, J. (1999) PCR Applications: Protocols for Functional Genomics. Academic Press, New York. Além disso, as técnicas atuais que empregam a reação de PCR permitem a síntese de genes de até 1,8 quilobases de comprimento. Ver Adang et al. (1993) Plant Molec. Biol. 21:1131 e Bambot et al. (1993). PCR Methods and Applications 2:266. Métodos conhecidos de PCR incluem, mas sem limitação, os métodos que utilizam primers emparelhados, primers encaixados, primers degenerados, primers específicos do gene, primers específicos de vetor, primers parcialmente incompatíveis e afins. Além disso, os genes podem ser facilmente sintetizados por técnicas automatizadas convencionais.

[0044] Nas técnicas de hibridação, a totalidade ou parte de uma sequência de nucleotídeos conhecida é usada como sonda que híbrida seletivamente com outras sequências de nucleotídeos correspondentes presentes em uma população de fragmentos de DNA genômico clonados ou fragmentos de cDNA (isto é, bibliotecas genómicas ou de cDNA) de um organismo escolhido. As sondas de hibridação podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA ou outros oligonucleotídeos e podem ser marcadas com um grupo detectável, tal como 32P ou qualquer outro marcador detectável. Assim, por exemplo, sondas para a hibridação podem ser feitas pela marcação de oligonucleotídeos sintéticos baseada nas sequências de DNA da invenção. Métodos para a preparação de sondas para hibridação e para a construção de bibliotecas genómicas e de cDNA são geralmente conhecidos na arte e são aqui divulgados (Sambrook et al., 1989, supra).

[0045] Por exemplo, a sequência do promotores aqui descrita, ou uma ou mais porções da mesma, podem ser utilizadas como uma sonda capaz de hibridar especificamente com sequências correspondentes. Para conseguir a hibridação específica sob uma variedade de condições, tais sondas incluem sequências que são únicas entre as sequências a serem selecionadas e têm, de preferência, ao menos cerca de 10 nucleotídeos de comprimento, e mais preferivelmente ao menos cerca de 20 nucleotídeos de comprimento. Tais sequências podem, alternativamente, ser utilizadas para amplificar sequências correspondentes de uma planta escolhida por PCR. Esta técnica pode ser utilizada para isolar sequências de uma planta desejada ou como ensaio de diagnóstico para determinar a presença de sequências em uma planta. As técnicas de hibridação incluem rastreio de hibridação de bibliotecas de DNA revestida tanto como placas ou colônias (Sambrook et al., 1989, supra).

[0046] A hibridação de tais sequências pode ser realizada sob condições rigorosas. Por "condições rigorosas" ou "condições de hibridação rigorosas" entende-se condições em que uma sonda irá hibridar com a sua sequência alvo a um grau detectavelmente maior do que com outras sequências (por exemplo, pelo menos duas vezes ao longo do fundo). As condições rigorosas são dependentes da sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Controlando-se o rigor da hibridação e / ou condições de lavagem, as sequências alvo que são 100% complementares à sonda podem ser identificadas (sondagem homóloga). Alternativamente, as condições rigorosas podem ser ajustadas para permitir alguns descasamentos em sequências de modo que sejam detectados graus inferiores de semelhança (sondagem heteróloga). Geralmente, uma sonda é menor do que cerca de 1000 nucleotídeos de comprimento, preferencialmente menor que 500 nucleotídeos de comprimento.

[0047] O termo condições rigorosas ou condições de hibridação rigorosas faz referência a condições sob as quais uma sonda irá hibridar com a sua sequência alvo, a um grau detectavelmente maior do que com outras sequências (por exemplo, pelo menos duas vezes ao longo do fundo). As condições rigorosas são dependentes da sequência e podem ser diferentes em diferentes circunstâncias. Controlando-se o rigor da hibridação e / ou condições de lavagem, as sequências alvo que são 100% complementares à sonda podem ser identificadas (sondagem homóloga). Alternativamente, as condições rigorosas podem ser ajustadas para permitir alguns descasamentos em sequências de modo que sejam detectados graus inferiores de semelhança (sondagem heteróloga). Geralmente, uma sonda é menor do que cerca de 1000 nucleotídeos de comprimento, preferencialmente menor que 500 nucleotídeos de comprimento.

[0048] Normalmente, condições rigorosas serão aquelas em que a concentração de sal é inferior a cerca de 1,5 M íon Na, em geral cerca de 0,01 a 1,0 M NA íon de concentração (ou outros sais) a um pH de 7,0 a 8,3 e temperatura de pelo menos cerca de 30° C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60° C para sondas longas (por exemplo, maior do que 50 nucleotídeos). As condições rigorosas podem também ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizadores tais como a formamida. Exemplos de condições de baixo rigor incluem hibridação com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, 1 M NaCl, 1% de SDS (dodecilsulfato de sódio) a 37° C, e uma lavagem em 1X a 2X SSX (20X SSC = 3,0 M NaC1/0,3 M de citrato trissódico), entre 50 e 55° C. Exemplos de condições de restringência moderadas incluem hibridação em 40 a 45% de formamida, 1 M NaC1, 1% de SDS a 37° C, e uma lavagem em 0,5X a 1X SSC entre 55 e 50° C. Exemplos de condições de elevado rigor incluem hibridação em 50% de formamida, 1 M NaC1, 0,1% de SDS a 37 ° C, e uma lavagem em 0,1X SSC entre 60 e 65° C.

[0049] A especificidade é tipicamente a função de lavagens pós-hibridação, sendo os fatores críticos a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos de DNA- DNA, a Tm pode ser aproximada a partir da equação de Meinkoth e Wahl, Anal. Biochem. , 138:267-284 (1984): Tm=81,5oC + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) —0,61 (% form) - 500/L, em que M representa a molaridade de cátions monovalentes,%GC é o percentual de nucleotídeos guanosina e citosina no DNA,% form é o percentual de formamida na solução de hibridação, e L é o comprimento do híbrido em pares de bases. A Tm é a temperatura (sob força iónica e pH definidos) à qual 50% da sequência alvo complementar hibrida com uma sonda perfeitamente correspondente. Tm é reduzida em cerca de 1 °C por cada 1% de descasamentos, assim, Tm, a hibridação e/ou condições de lavagem podem ser ajustadas para hibridar com sequências da identidade desejada. Por exemplo, se as sequências com identidade ^ 90% são procuradas, a Tm pode ser reduzida em 10°C. Geralmente, as condições rigorosas são selecionadas para serem cerca de 5°C abaixo do ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência específica e seu complemento a uma força iônica e pH definidos. No entanto, condições severamente rigorosas podem utilizar uma hibridação e/ou de lavagem a 1, 2, 3, ou 4°C abaixo do ponto de fusão térmica (Tm), condições moderadamente rigorosas podem utilizar uma hibridação e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9, ou 10°C abaixo do ponto de fusão térmica (Tm) e condições pouco rigorosas pode utilizar uma hibridação e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15, ou 20 °C abaixo do ponto de fusão térmico (Tm). Utilizando-se a equação, as composições de hibridação e de lavagem e a Tm desejada, os peritos compreenderão que variações no rigor das soluções de hibridação e/ou de lavagem são inerentemente descritas. Se o grau desejado de descasamento resulta em uma Tm inferior a 45°C (solução aquosa) ou a 32°C (solução de formamida), é preferível aumentar-se a concentração de SSC de modo que uma temperatura mais levada possa ser usada. Um extenso guia para a hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acids Probes, Part I, Chapter 2, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley- Interscience, New York (1995) e Ausubel et al, (1997) Short Protocols in Molecular Biology, page 2-40, Third Edit.

[0050] Em geral, as sequências que correspondem às sequências de nucleotídeos da presente invenção e hibridam com a sequência de nucleotídeos aqui descrita terão pelo menos 50% de homologia, 70% de homologia, e mesmo 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de homologia ou mais com a sequência divulgada. Isto é, a semelhança de sequência entre a sonda e o alvo pode variar, partilhando, pelo menos, cerca de 50%, cerca de 70%, e ainda cerca de 85% ou mais de semelhança de sequência.

[0051] Os termos seguintes são usados para descrever as relações de sequência entre dois ou mais ácidos nucleicos ou polinucleotídeos: (a) "sequência de referência", (b), "janela de comparação", (c) "identidade de sequência" e (d) "percentagem de identidade de sequência".

[0052] (a) Tal como aqui se utiliza, "sequência de referência" é uma sequência definida utilizada como uma base para a comparação de sequências. Uma sequência de referência pode ser um subconjunto ou a totalidade de uma sequência especificada, por exemplo, como um segmento de uma sequência promotora de comprimento total, ou a sequência dos promotores completa.

[0053] (b) Tal como aqui utilizado, "janela de comparação" faz referência a um segmento contíguo e especificado de uma sequência de polinucleotídeos, em que a sequência de polinucleotídeos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (ou seja, lacunas) em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas sequências. Geralmente, a janela de comparação é de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de comprimento, e opcionalmente pode ser de 30, 40, 50, 100, ou maior. Os peritos na arte entendem que para refletir com precisão a semelhança com uma sequência de referência devido à inclusão de lacunas na sequência de polinucleotídeos, uma penalidade de lacuna é tipicamente introduzidas e é subtraída do número de correspondências.

[0054] Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na arte. Assim, a determinação do percentual de identidade entre duas sequências quaisquer pode ser realizada usando-se um algoritmo matemático.

[0055] O alinhamento ótimo de sequências para comparação pode usar quaisquer meios para analisar a identidade de sequência (homologia) conhecidos na técnica, por exemplo, através do método de alinhamento progressivo denominado "PILEUP " (Morrison, (1997) Mol. Biol. Evol. 14:428-441, as an example of the use of PILEUP), pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970))s, pelo método de busca por similaridades de Pearson Pearson (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)), por implementações computadorizadas destes algoritmos (por exemplo, GAP, BEST FIT, FASTA, and TFASTA no pacote do Wisconsin Genetics Software, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), ClustalW (CLUSTAL no programa PC/Gene por Intelligenetics, Mountain View, Calif., descrito por, por exemplo, Higgins(1988), Gene 73: 237-244, Corpet (1988), Nucleic Acids Res. 16:10881-10890, Huang, Computer Applications in the Biosciences 8:155-165 (1992) e Pearson (1994), Methods in Mol. Biol. 24:307-331), Pfam (Sonnhammer (1998), Nucleic Acids Res. 26:322-325), TreeAlign (Hein (1994), Methods Mol. Biol. 25:349364) e os programas de computador para alinhamento de sequências MEG-ALIGN e SAM, ou por inspeção visual manual.

[0056] Outro exemplo de algoritmo que é adequado para determinar a similaridade de sequências é o algoritmo BLAST, que está descrito em Altschul et al, (1990) J. Mol. Biol. 215: 403- 410. Os programas BLAST (Ferramenta de Busca de Alinhamento Básico Local) de Altschul, S. F., et al., (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410, pesquisa de acordo com parâmetros padrão para a identidade com sequencias contidas no banco de dados "GENEMBL" do BLAST. Uma sequência pode ser analisada para a identidade com todas as sequências de DNA publicamente disponíveis contidas na base de dados GENEMBL utilizando-se o algoritmo BLASTN sob os parâmetros padrão.

[0057] O software para a realização de análises BLAST é disponibilizado ao público através do National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nlm.nih.gov/, ver também Zhang (1997), Genome Res. 7:649-656 para a variação "PowerBLAST". Este algoritmo envolve a identificação inicial de pares de sequencia de pontuação alta (HSPs) através da identificação de palavras curtas de comprimento W na sequencia de consulta que corresponde ou satisfaz alguns limiares de pontuação de valor positivo T quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequencia de dados. T refere-se à vizinhança do limiar de pontuação de palavras (Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215: 403-410). Estes acertos iniciais de palavras na vizinhança agem como estimuladores para a iniciação de buscas para encontrar HSPs mais longos que as contenham. Os acertos de palavras são estendidos em ambos os sentidos ao longo de cada sequência, para tão longe quanto a pontuação de alinhamento cumulativo puder ser aumentada. A extensão dos acertos de palavras em cada sentido é interrompida quando: a pontuação do alinhamento cumulativo cai pela quantidade X a partir do seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa vai para zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos com pontuação negativa; ou quando o fim de qualquer sequência é alcançado. Os parâmetros W,T e X do algoritmo BLAST determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLAST utiliza como padrão um comprimento de palavra (W), de 11, os alinhamentos (B) de 50 da matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919), a expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as cadeias. O termo BLAST refere-se ao algoritmo BLAST que realiza uma análise estatística da similaridade entre duas sequências, ver, por exemplo, Karlin (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787. Uma medida da similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma correspondência entre duas sequências de nucleotídeos ou aminoácidos ocorreria por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado semelhante a uma sequência de referência se a menor probabilidade de soma em uma comparação entre o ácido nucleico do teste com o ácido nucleico de referência é menor do que cerca de 0,1, mais preferencialmente inferior a cerca de 0,01, e mais preferivelmente inferior a cerca 0.001.

[0058] Em uma forma de realização, o GAP (programa de alinhamento global) pode ser usado. O GAP utiliza o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970) para encontrar o alinhamento de duas sequências completas que maximiza o número de correspondências e minimiza o número de lacunas. Valores padrão de penalidade pela criação de lacunas e de extensão lacunas na comumente usada versão 10 do Wisconsin Package® (Accelrys, Inc., San Diego, CA) para sequencias de proteína são 8 e 2, respectivamente. Para sequencias de nucleotídeos a penalidade padrão pela criação de lacunas é 50, enquanto a penalidade padrão pela extensão de lacunas é 3. Similaridade percentual é a percentagem dos símbolos que são semelhantes. Os símbolos que estão ao lado de lacunas são ignorados. Uma semelhança é pontuada quando o valor da matriz de pontuação para um par de símbolos é superior ou igual a 0,50, o limiar de similaridade. Um sistema de pontuação de objetivos gerais é a matriz BLOSUM62 (Henikoff e Henikoff (1993), Proteins 17: 49-61), que atualmente é a opção padrão para os programas BLAST. BLOSUM62 utiliza uma combinação de três matrizes para cobrir todas as eventualidades. Altschul, J. Mol.. Biol. 36: 290-300 (1993), aqui incorporado por referência na sua totalidade, é a matriz de pontuação utilizada na versão 10 do Wisconsin Package® (Accelrys, Inc., San Diego, CA) (ver Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).

[0059] (c) Tal como aqui utilizado, "identidade de sequência" e "identidade" no contexto de duas sequências de ácidos nucleicos fazem referência aos resíduos nas duas sequências que são iguais quando alinhados para a correspondência máxima sob uma janela de comparação específica.

[0060] (d) Tal como aqui utilizado, "percentagem de identidade de sequência" significa o valor determinado por comparação de duas sequências otimamente alinhadas sob uma janela de comparação, em que a porção da sequência de polinucleotídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (ou seja, lacunas) em comparação à sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas sequências. A percentagem é calculada determinando-se o número de posições nas quais a base de ácido nucleico idêntica ocorre em ambas as sequências, para originar o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para dar a percentagem de identidade de sequência.

[0061] Identidade com a sequência da presente invenção significa uma sequência de polinucleotídeos que possua ao menos 65% de identidade de sequência, mais preferivelmente ao menos 70% de identidade de sequência, mais preferivelmente ao menos 75% de identidade de sequência, mais preferivelmente ao menos 80% de identidade, mais preferencialmente ao menos, 85% 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência.

[0062] De acordo com uma forma de realização, um novo promotor é construído através dos seguintes passos. A sequência de um promotor conhecido ou recentemente descoberto é comparada com sequências de ácidos nucleicos conhecidos, tais como sequências em bancos de dados genômicos. Em uma realização, esta comparação é feita na base de dados GenBank utilizando-se um programa, tal como FASTA (Genetics Computer Group, Madison, Wis.). Bases de dados adequadas adicionais e programas de comparação são conhecidos de um perito na arte. Segmentos da sequência semelhante à sequência de busca, ou seja, o promotor conhecido ou recém-descoberto são identificados e selecionados. Os segmentos são considerados semelhantes se tiverem entre 60% e 100% de identidade de sequência ao longo do segmento examinado. Estes segmentos podem ser de 20-100 bases de comprimento, embora os segmentos menores ou maiores, também possam ser selecionados. As sequências selecionadas estão alinhadas em ordem linear, de acordo com a sequência do promotor a ser modificado. O promotor resultante é um promotor híbrido constituído por sequências semelhantes, porém diferentes, do promotor original. Os segmentos curtos que compõem o promotor híbrido sintético podem ser partes de promotores ou regiões reguladoras de outros genes. O promotor híbrido sintético é então construído e empiricamente testado em um sistema de expressão de teste para determinar suas características quantitativas e qualitativas. Se o promotor híbrido sintético houver mantido ou melhorado a atividade, ele pode ser utilizado diretamente. Se o promotor híbrido sintético tem uma atividade menor, a sequência do promotor híbrido sintético é ainda modificada através da substituição de algumas das bases para gerar um novo promotor híbrido. O novo promotor híbrido é mais uma vez construído e testado para determinar se ele tem a desejada atividade mantida ou melhorada. Este procedimento pode ser realizado quantas vezes for necessário para se obter o promotor híbrido final que tenha a atividade desejada.

[0063] A invenção é estendida para "variantes funcionais" da sequência reguladora divulgada. Variantes funcionais incluem, por exemplo, sequências reguladoras da invenção que possuem uma ou mais substituições de nucleotídeos, deleções ou inserções, e nas quais a variante retém a atividade do promotor, em particular a capacidade para dirigir a expressão, preferencialmente, para o embrião de uma planta. Variantes funcionais podem ser criados por qualquer um de uma série de métodos disponíveis para um perito na arte, tais como por mutagénese dirigida ao local, mutação induzida, identificada como variantes alélicas, clivagem por meio do uso de enzimas restritivas, ou similares. A atividade pode também ser medida por uma variedade de técnicas, incluindo a medição da atividade de relator, como é descrito na Patente dos EUA N° 6.844.484, a análise Northern blot, ou técnicas semelhantes. A patente’484 descreve a identificação de variantes funcionais de diferentes promotores.

[0064] A invenção engloba ainda um "fragmento funcional", isto é, um fragmento da sequência reguladora formado por uma ou mais deleções de um elemento regulador maior. Por exemplo, a porção 5' de um promotor até caixa TATA próxima ao local de início da transcrição pode ser deletada sem eliminar a atividade do promotor, tal como descrito por Opsahl-Sorteberg, H-G. et al., 2004 Gene 341:49-58. Estes fragmentos devem manter a atividade do promotor, em particular a capacidade para dirigir a expressão de sequências de nucleotídeos operacionalmente ligadas e, em uma forma de realização preferível, a capacidade de dirigir a expressão de tal forma que a expressão é mais elevada em células vegetais não-polínicas. A atividade pode ser medida por análise de Northern blot, medições de atividade do relator quando se utilizam fusões de transcrição, e afins. Ver, por exemplo, Sambrook et al. (1989) supra. Fragmentos funcionais podem ser obtidos através da utilização de enzimas restritivas para clivar o as sequências de nucleotídeos cujo elemento regulador ocorre naturalmente, aqui divulgados, pela síntese de uma sequência de nucleotídeos a partir da sequência de DNA que ocorre naturalmente, ou pode ser obtida através do uso de tecnologia de PCR (ver, em particular, Mullis et al. (1987) Methods Enzymol. 155:335-350 e Erlich, ed. (1989) PCR Technology (Stockton Press, New York)). Tal fragmento funcional pode compreender, pelo menos, cerca de 75, 85, 90, 95, 110, 125, 250, 400, 500, 600, 700, 800, ou o comprimento total de nucleotídeos contíguos ou qualquer quantidade intermediária.

[0065] Por exemplo, um procedimento de rotina para remover parte de uma sequência de DNA é a utilização de uma exonuclease, em combinação com a amplificação de DNA para produzir deleções aninhadas unidirecionais de clones de DNA de cadeia dupla. Um kit comercial para esta finalidade é vendido sob o nome comercial de Exo-Size (TM) (New England Biolabs, Beverly, Mass). Resumidamente, este procedimento envolve a incubação de DNA com exonuclease III para progressivamente remover nucleotídeos no sentido 3' para 5' em saliências em 5', em pontas partidas ou cortes no modelo de DNA. No entanto, a exonuclease III, é incapaz de remover nucleotídeos em 3', saliências de 4 bases. Sintéticos temporizados de um clone com esta enzima produzem deleções aninhadas unidirecionais.

[0066] O promotor da presente invenção pode ser usado com qualquer sequência de ácido nucleico heteróloga. Uma tal molécula de ácido nucleico "heterólogo" é qualquer um que não é naturalmente encontrada ao lado da molécula de ácido nucleico adjacente. Quando se refere a uma molécula de ácido nucleico heteróloga ligada ao promotor da invenção entende-se uma que não ocorre naturalmente com a sequência promotora da presente invenção ou que é introduzida na planta. A sequência de nucleotídeos é heteróloga para a sequência promotora, mas pode ser de qualquer fonte e pode ser nativa e descoberta naturalmente ocorrendo na célula vegetal, ou fora planta hospedeira.

[0067] Por "promotor" entende-se um elemento de regulação de DNA capaz de regular a transcrição de uma sequência ligada ao mesmo. Ele geralmente compreende uma caixa TATA capaz de dirigir a RNA polimerase II para iniciar a síntese de RNA no local de iniciação da transcrição apropriada para uma sequência de codificação particular. O promotor é a sequência mínima suficiente para dirigir a transcrição de uma maneira desejada. O termo "elemento regulador", neste contexto, é também usado para se referir à sequência capaz de "atividade de elemento regulador", isto é, a regulação da transcrição de uma maneira desejada. Por conseguinte, a invenção é dirigida ao o elemento de regulação aqui descrito, incluindo as sequências que hibridizam com o mesmo e têm a identidade com o mesmo, tal como indicado, e fragmentos e variantes do mesmo que têm atividade reguladora.

[0068] As sequências promotoras da presente invenção podem ser modificadas para fornecer uma variedade de expressões da sequência de ácido nucleico heteróloga e podem ser modificados para serem promotores fracos ou promotores fortes. Geralmente, um "promotor fraco" significa um promotor que dirige a expressão de uma sequência de codificação a um nível baixo. Por um "nível baixo" de expressão entende-se a expressão em níveis de cerca de 1/1.000 a cerca de 1/10.000 transcritos até cerca de 1/100.000 transcritos até cerca de 1/500.000 transcritos. Por outro lado, um "promotor forte" dirige a expressão de uma sequência de codificação a um nível elevado, ou a cerca de 1/10 transcritos até cerca de 1/100 transcritos até cerca de 1/1.000 transcritos.

[0069] O promotor da invenção também pode ser usado em conjunção com um outro promotor. Em uma forma de realização, o marcador de seleção da planta e a sequência de nucleotídeos de interesse podem ser funcionalmente ligados ao mesmo promotor. Em uma outra forma de realização, o marcador de seleção da planta e a sequência de nucleotídeos de interesse podem ser funcionalmente ligado a diferentes promotores. Ainda em uma terceira e quarta formas de realização, o vetor de expressão pode conter duas ou mais sequências de nucleotídeos de interesse que podem ser ligados ao mesmo promotor ou diferentes promotores. Por exemplo, o promotor descrito aqui pode ser utilizado para conduzir o gene de interesse e o marcador selecionável, ou um diferente promotor usado para um ou o outro. Estes outros elementos promotores podem ser aqueles que são constitutivos ou suficientes para tornar a expressão do gene dependente do promotor controlável como sendo específico do tipo de célula, tecido ou específico de tempo ou estágio de desenvolvimento, ou sendo induzida por sinais ou agentes externos. Tais elementos podem estar localizados nas regiões 5' ou 3' do gene. Embora o promotor adicional possa ser o promotor endógeno de um gene estrutural de interesse, o promotor pode também ser uma sequência reguladora externa. Elementos promotores utilizados para controlar a expressão de produtos de proteínas e do gene de seleção podem ser quaisquer promotores compatíveis de plantas. Estes podem ser promotores de genes de plantas, tais como, por exemplo, um promotor de ubiquitina (pedido de patente europeu n° 0 342 926), o promotor para a pequena subunidade da carboxilase de ribulose -1,5-bis-fosfato (ssRUBISCO) (Coruzzi et al, 1984 Tissue-specific and light-regulated expression of a pea nuclear gene encoding the small subunit of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase. EMBO J. 3, 1671-1679, Broglie et al., 1984 Light- regulated expression of a pea ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit gene in transformed plant cells. Science 224, 838-843), ou promotores de plasmídeos indutores de tumor de Agrobacterium tumefaciens, tais como os promotores da sintase de nopalina, sintase de octopina e da sintase de manopina (Velten, J. e Schell, J. (1985) Seletion-expression plasmid vetors for use in genetic transformation of higher plants. Nucleic Acids Res. 13, 6981-6998), que têm atividade de planta, ou promotores virais, tais como os promotores 19S e 35S do vírus mosaico da couve-flor (CaMV) (Guilley et al., 1982 Transcription of Cauliflower mosaic virus DNA: detection of promoter sequences, and characterization of transcripts. Cell 30, 763773, Odell et al., 1985 Identification of DNA sequences required for ativity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature 313, 810-812), o promotor FLt do vírus do mosaico de escrofulária (Maiti et al., 1997 Promoter/leader deletion analysis and plant expression vetors with the figwort mosaic virus (FMV) full length transcript (FLt) promoter containing single or double enhancer domains. Transgenic Res. 6, 143-156) ou o promotor da proteína de revestimento de TMV (Grdzelishvili et al., 2000 Mapping of the tobacco mosaic virus movement protein and coat protein subgenomic RNA promoters in vivo. Virology 275, 177-192).

[0070] A gama de promotores disponíveis compatíveis com plantas inclui promotores específicos de tecido e induzíveis. Um elemento regulador induzível é um que é capaz de, direta ou indiretamente, ativar a transcrição de uma ou mais sequências de DNA ou genes em resposta a um indutor. Na ausência de um indutor as sequências de DNA ou genes não serão transcritos. Tipicamente o fator de proteína que se liga especificamente a um elemento regulador induzível para ativar a transcrição está presente em uma forma inativa, a qual é então, direta ou indiretamente, convertida à forma ativa pelo indutor. O indutor pode ser um agente químico tal como uma proteína, metabolito, regulador de crescimento, herbicidas ou composto fenólico ou um estresse fisiológico diretamente imposto pelo calor, frio, sal, ou elementos tóxicos ou indiretamente imposto através da actina de um agente patogênico ou de doença, tal como um vírus. Uma célula vegetal que contém um elemento regulador induzível pode ser exposta a um indutor aplicando-se o indutor externamente à célula ou planta, tais como por pulverização, rega, aquecimento ou métodos semelhantes. Qualquer promotor induzível pode ser usado na presente invenção. Veja Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 361-366. Exemplos de promotores induzíveis incluem os promotores do receptor da Ecdisona, patente dos EUA N° 6.504.082, promotores de sistema ACE1, que responde ao cobre (Mett et al. (1993) PNAS 90: 4567-4571), os genes In2-1 e IN2-2 do milho, que respondem a fitoprotetores herbicidas benzenossulfonamida (patente dos EUA n° 5.364.780), o promotor GST de milho, que é ativado por compostos eletrófilos hidrófobos, que são usados como herbicidas pré-emergentes, e o promotor PR-1a do tabaco, o qual é ativado por ácido salicílico. Outros promotores químico- regulados de interesse incluem promotores esteróide-responsivos (ver, por exemplo, o promotor induzível por glucocorticóide, em Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425 and McNellis et al. (1998) Plant J. 14(2):247-257)) e promotores induzíveis e repressíveis por tetraciclina (see, for example, Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237, and U.S. Pat. Nos. 5,814,618 and 5,789,156). Alternativamente, os promotores de plantas, tais como os promotores de choque de calor, por exemplo, hsp 17,5-E de soja (Gurley et al., 1986 Mol. Cell. Biol. 6, 559-565), ou promotores induzíveis por etanol (Caddick et al., 1998 Nat. Biotechnol. 16, 177-180) podem ser usados. Ver Pedido de Patente Internacional N° WO 91/19806 para uma revisão de promotores de plantas ilustrativos adequadamente empregues na presente invenção.

[0071] Promotores preferíveis de tecido podem ser utilizados para alvejar melhora da transcrição e/ou expressão em um determinado tecido vegetal. Os promotores podem se expressar no tecido de interesse, juntamente com a expressão em outros tecidos vegetais, podem se expressar fortemente no tecido de interesse e a um grau muito menor do que o em outros tecidos, ou pode se expressar muito mais preferencialmente no tecido de interesse. Promotores preferíveis de tecido podem ser utilizados para alvejar melhora da transcrição e/ou expressão em um determinado tecido vegetal. Quando se refere a expressão preferencial, o que se quer dizer é expressão a um nível superior no tecido vegetal particular do que em outros tecidos da vegetais. Exemplos destes tipos de promotores incluem expressão preferencial de sementes, tais como o proporcionado pelo promotor de faseolina (Bustos et al.1989. supra) e o gene globulina-1 do milho (Belanger et al. 1991 Genetics 129:863-972). Para dicotiledóneas, promotores preferenciais de sementes incluem, mas não estão limitados a, β- faseolina de feijão, napina, β-conglicinina, lectina de soja, cruciferina e semelhantes. Para monocotiledóneas, os promotores preferenciais de sementes incluem, mas não estão limitadas a, zeína 15 kDa de milho, zeína 22 kDa, zeína 27 kDa, zeína-y, waxy, shrunken 1, shrunken 2, globulina 1, etc. Há uma grande variedade de promotores preferenciais de tecido e, por meio de exemplo, incluem-se os descritos em Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12 (2): 255-265, Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7): 792-803, Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343, Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168, Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3): 1331-1341, Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2): 525-535, Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2): 513-524, Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5): 773-778, Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 181-196, Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6): 1129-1138, Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20): 9586-9590.

[0072] O promotor pode compreender adicionalmente outras sequências de reconhecimento, geralmente posicionadas a montante ou 5' à caixa TATA, referidas como elementos promotores a montante, que influenciam a taxa de iniciação da transcrição. Utilizando-se as sequências promotoras aqui descritas, é possível isolar e identificar outros elementos reguladores na região 5’, a montante da região específica do promotor identificada. Assim, a região promotora descrita é geralmente adicionalmente definida por compreender elementos reguladores a montante, tais como os responsáveis pelo elevado nível e expressão temporal da sequência de codificação, intensificadores e afins. Da mesma forma, os elementos promotores que permitem a expressão de baixo a elevado nível podem ser identificados, isolados, e utilizados com outros promotores centrais para confirmar a expressão preferencial do embrião. Por promotor central entende-se a sequência, por vezes referida como a caixa TATA (ou sequência semelhante), que é comum à promotores na maior parte dos genes que codificam as proteínas. Assim, o promotor a montante do promotor pode, opcionalmente, ser utilizado em conjunto com os seus próprios promotores ou promotores centrais de outras fontes.

[0073] Qualquer promotor de planta pode ser utilizado como um elemento regulador 5’ para modular a expressão de um gene particular ou genes operativamente associados ao mesmo. Quando operativamente ligado a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita, um promotor tipicamente faz com que a molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita, seja transcrita de uma maneira que é similar àquela à qual o promotor é normalmente associado. Os promotores de plantas podem incluir promotores produzidos através da manipulação de promotores conhecidos para produzir promotores artificiais, quiméricos ou híbridos. Tais promotores podem também combinar elementos cis de um ou mais promotores, por exemplo, pela adição de um elemento de regulação heterólogo a um promotor ativo com os seus próprios elementos reguladores parciais ou completos. Assim, a concepção, a construção e a utilização de promotores quiméricos ou híbridos, compreendendo ao menos um elemento cis de SEQ ID Nos: 1, 2, 3 ou 4, para modular a expressão de sequências de polinucleotídeos operativamente ligados é englobada pela presente invenção.

[0074] Tal como aqui utilizado, o termo "elemento cis" refere- se a um elemento de regulação da transcrição que atuam em cis que confere um aspecto do controle geral da expressão do gene. Um elemento cis pode funcionar para ligar fatores de transcrição, fatores de proteína que agem em trans que regulam a transcrição. Alguns elementos cis ligam mais do que um fator de transcrição e fatores de transcrição podem interagir com diferentes afinidades com mais de um elemento cis. Os promotores da presente invenção contêm desejavelmente elementos cis que podem conferir ou modular a expressão do gene. Elementos cis podem ser identificados por um número de técnicas, incluindo análise de deleção, isto é, a supressão de um ou mais nucleotídeos a partir da extremidade 5’ ou interna a um promotor, análise de proteína de ligação de DNA utilizando as pegadas de DNAase I, interferência de metilação, ensaios de desvio de mobilidade de electroforese, pegadas genômicas in vivo por PCR por ligação mediada, e outros ensaios convencionais, ou por análise de similaridade de sequências de DNA com motivos de elementos cis conhecidos por métodos convencionais de comparação de sequências de DNA. A estrutura fina de um elemento cis pode ser estudada mais profundamente por mutagénese (ou substituição) de um ou mais nucleotídeos ou por outros métodos convencionais. Elementos cis podem ser obtidos por síntese química ou por isolamento a partir de promotores que incluem tais elementos e eles podem ser sintetizados com os nucleotídeos adicionais que flanqueiam e contêm locais para enzimas de restrição úteis para facilitar a manipulação da subsequência.

[0075] Como aqui utilizado, um segmento de nucleotídeos considerado operativamente ligado quando é colocado em uma relação funcional com outro segmento de nucleotídeos. Por exemplo, o DNA para uma sequência de sinal está operativamente ligado ao polipetídeo que codifica DNA se for expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipetídeo. Um promotor ou um intensificador está operativamente ligado a uma sequência codificadora se estimula a transcrição da sequência. Geralmente, as moléculas de ácido nucleico que estão operativamente ligadas são contíguas, e, no caso de uma sequência de sinal, tanto contíguas quanto em fase de leitura. Contudo, os intensificadores não precisam ser contíguos às sequências codificadoras cuja transcrição eles controlam. A ligação é conseguida pela ligadura em locais convencionais de restrição ou em adaptadores ou ligadores inseridos em seu lugar. O cassete de expressão pode incluir um ou mais intensificadores, além do promotor. Por intensificador entende-se uma sequência que atua em cis que aumenta a utilização de um promotor. Tais intensificadores podem ser nativos a um gene ou de um gene heterólogo. Além disso, reconhece-se que alguns promotores podem conter um ou mais elementos intensificadores nativos ou elementos similares a intensificadores nativos. Um exemplo de tal intensificador é o intensificador 35S, que pode ser um único intensificador, ou duplicado. Ver, por exemplo, McPherson et al, patente dos EUA 5.322.938.

[0076] Os promotores da presente invenção podem ser combinados com qualquer número de outros componentes para serem introduzidos na planta, incluindo a combinação com uma sequência de nucleotídeos de interesse a ser expresso na planta. A "sequência de nucleotídeos de interesse" refere-se a uma sequência de nucleotídeos que codifica para um desejado polipeptídeo ou proteína, mas também pode referir-se a sequências de nucleotídeos que não constituem um gene inteiro, e que não necessariamente codificam um polipetídeo ou proteína. Por exemplo, quando utilizado em um processo de recombinação homóloga, o promotor pode ser colocado em uma construção com uma sequência que tem como alvo uma região do cromossoma da planta, mas pode não codificar uma proteína. A utilização de versões anti-sentido de uma sequência de ácidos nucleicos é um outro exemplo onde o uso de uma sequência pode não resultar em uma proteína codificada. Se desejado, a sequência de nucleotídeos de interesse pode ser otimizada para tradução em planta através da otimização dos códons utilizados por plantas e a sequência em torno do local de iniciação da tradução para as plantas. As sequências que resultam na instabilidade potencial de mRNA podem também ser evitadas.

[0077] Em geral, os métodos disponíveis para a construção de genes recombinantes, compreendendo, opcionalmente, várias modificações para melhorar a expressão, pode diferir em detalhes. No entanto, os métodos convencionalmente empregues incluem amplificação por PCR, ou a concepção e síntese de oligonucleotídeos sintéticos complementares sobrepostos, que são recozidos e ligados uns aos outros para se obter um gene com sítios de restrição convenientes para clonagem, ou subclonagem de uma outra já clonada fonte, ou clonagem a partir de uma biblioteca. Os métodos envolvidos são métodos padrão para um biólogo molecular (Sambrook et al., 1989, supra). Um vetor de expressão é uma molécula de DNA compreendendo um gene ou DNA anti-sentido que se expressa em uma célula hospedeira. Tipicamente, a expressão do gene é tida sob o controle de certos elementos reguladores, incluindo promotores constitutivos ou induzíveis, elementos reguladores específicos de tecido, e intensificadores.

[0078] Um perito na arte reconhece facilmente que o promotor pode ser utilizado com qualquer uma de uma variedade de sequências de nucleotídeos compreendendo a sequência de nucleotídeos de interesse a ser expressa em plantas. Ao referir- se a uma sequência de nucleotídeos operativamente ligada entende-se uma ligação funcional entre um promotor e uma outra sequência onde o promotor inicia e medeia a transcrição da sequência de nucleotídeos. Por exemplo, a sequência de nucleotídeos de interesse pode codificar uma proteína que é útil para fins industriais ou farmacêuticos ou similares, ou para impactar a planta em si, através, por exemplo, da expressão de uma proteína que ofereça resistência a doenças, resistência a insetos, resistência a um herbicida, ou que impacta características agronômicas, bem como características de qualidade de grãos. Sequências de DNA nativas de plantas, assim como sequências de DNA não nativas, podem ser transformadas em plantas e utilizadas para modular os níveis de proteínas nativas ou não nativas. Uma ou mais destas sequências e/ou cassetes de expressão podem ser transformados em uma célula da planta (uma célula da planta refere-se também a células sem membranas vegetais, tais como protoplastos).

[0079] Estas sequências de nucleotídeos incluem, mas não estão limitadas, aos exemplos fornecidos abaixo:

[0080] 1. Genes ou sequência de codificação que conferem resistência a pragas ou doenças

[0081] (A) Genes de resistência a doenças de plantas. Defesas das plantas são muitas vezes ativadas pela interação específica entre o produto de um gene de resistência a doença (R) na planta e o produto de um gene de avirulência correspondente (Avr) no patógen° Uma variedade de planta pode ser transformadas com o gene de resistência clonado para desenvolver plantas que sejam resistentes às estirpes de patógenos específicas. Exemplos de tais genes incluem o gene de tomate Cf-9 para resistência a Cladosporium fulvum (Jones et al., 1994 Science 266:789), gene de tomate Pto, que codifica uma proteína quinase, para resistência a Pseudomonas syringae pv. tomate (Martin et al., 1993 Science 262:1432), e do gene de Arabidopsis RSSP2 para resistência a Pseudomonas syringae (Mindrinos et al., 1994 Cell 78:1089).

[0082] (B). Uma proteína B. thuringiensis, um derivado seu ou um polipetídeo sintético nele modelado, tais como, uma sequência de nucleotídeos de um gene δ-endotoxina B. thuringiensis (Geiser et al. 1986, Gene 48:109), e um gene inseticida vegetativo (VIP) (ver, por exemplo, Estruch et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5389-94). Além disso, as moléculas de DNA que codificam genes δ-endotoxinas podem ser adquiridos na American Type Culture Collection (Rockville, Md.), sob os números de acesso ATCC 40098, 67136, 31995 e 31998.

[0083] (C), Uma lectina, tal como, as sequências de nucleotídeos de vários genes de lectina de ligação a manose Clivia miniata (Van Damme et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:825).

[0084] (D) Uma proteína que se liga a uma vitamina, tais como avidina e homólogos de avidina, que são úteis como larvicidas contra pragas de insetos. Ver patente dos EUA N° 5.659.026.

[0085] (E) um inibidor de enzima, por exemplo, um inibidor da protease ou um inibidor da amilase. Exemplos de tais genes incluem, um inibidor de proteinase cisteína de arroz (Abe et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:16793), um inibidor da protease do tabaco I (Huub et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:985), e um inibidor α -amilase (Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243).

[0086] (F) Um hormônio ou feromônio específico de inseto tal como ecdisteróide e um hormônio juvenil, um variante do mesmo, um mimético baseado no mesmo, ou um antagonista ou agonista do mesmo, tal como, expressão de baculovírus de esterase de hormônio juvenil clonado, um inativador do hormônio juvenil (Hammock et al., 1990 Nature 344:458).

[0087] (G) Um peptídeo ou neuropeptídeo específico de inseto, que, após a expressão, perturba a fisiologia da praga afetada. J. Biol. Chem. 269:9 Exemplos de tais genes incluem um receptor de hormônio diurético de inseto (Regan, 1994), um allostatin identificado em Diploptera punctata (Pratt, 1989) Biochem. Biophvs. Res. Comm. 163:1243, neurotoxinas paralisantes específicas para insetos (patente dos EUA N° 5.266.361) .

[0088] (H) Um veneno específico de inseto produzido na natureza por uma cobra, uma vespa, etc, tal como, um peptídeo inseto-tóxico de escorpião (Pang, 1992 Gene 116:165).

[0089] (I) Uma enzima responsável por uma hiperacumulação de monoterpeno, um sesquiterpeno, um esteróide, ácido hidroxâmico, um derivado de fenilpropanóide ou outra molécula não proteica com atividade inseticida.

[0090] (J), uma enzima envolvida na modificação, incluindo a modificação pós- translacional de uma molécula biologicamente ativa, por exemplo, uma enzima glicolítica, uma enzima proteolítica, uma enzima lipolítica, uma nuclease, uma ciclase, uma transaminase, uma esterase, uma hidrolase, uma fosfatase, uma quinase, uma fosforilase, uma polimerase, uma elastase, uma quitinase e uma glucanase, de ocorrência natural ou sintética. Exemplos de tais genes incluem o gene calas (pedido patente publicado PCT WO93/02197), sequências de codificação de quitinase (que podem ser obtidas, por exemplo, na ATCC sob os números de acesso 3999637 e 67152), quitinase do ancilóstomo do tabaco (Kramer et al., 1993 Insect Molec. Biol. 23:691) e o gene poliubiquitina ubi4-2 da salsa (Kawalleck et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:673).

[0091] (K) Uma molécula que estimula a transdução de sinal. Exemplos de tais moléculas incluem as sequências de nucleotídeos de clones cDNA de calmodulina de feijão mungo (Botella et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:757) e uma sequência de nucleotídeos de um clone cDNA de calmodulina de milho (Griess et al., 1994 Plant Physiol. 104:1467).

[0092] (L) Um peptídeo de momento hidrofóbico. Ver patente dos EUA Nos. 5.659.026 e 5.607.914, esta última ensina peptídeos antimicrobianos sintéticos que conferem resistência a doenças.

[0093] (M) Uma permease da membrana, um canal formador ou um canal bloqueador, tal como um análogo do peptídeo lítico cecropina-β (Jaynes et al., 1993 Plant. Sci. 89:43), o que torna as plantas de tabaco transgênicas resistentes a Pseudomonas solanacearum.

[0094] (N) Uma proteína viral invasiva ou uma toxina complexa dela derivada. Por exemplo, a acumulação de proteínas de revestimento viral em células vegetais transformadas confere resistência à infecção viral e/ou desenvolvimento da doença efetuada pelo vírus a partir do qual o gene da proteína de revestimento é derivado, bem como pelos vírus relacionados. Resistência mediada à proteína de revestimento foi conferida a plantas transformadas contra o vírus do mosaico da alfafa, o vírus do mosaico do pepino, vírus streak do tabaco, vírus X da batata, vírus Y da batata, vírus etch do tabaco, vírus rattle do tabaco e vírus do mosaico do tabaco. Ver, por exemplo, Beachy et al. (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451.

[0095] (O) Um anticorpo específico de inseto ou uma imunotoxina derivada dele. Assim, um anticorpo orientado para uma função metabólica crítico no intestino do inseto iria inativar uma enzima afetada, matando o inseto. Por exemplo, Taylor et al. (1994) Abstract # 497, Seventh Int'l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions mostra a inativação enzimática em tabaco transgênico via produção de fragmentos de anticorpos de cadeia simples.

[0096] (P) Um anticorpo específico para o vírus. Ver, por exemplo, Tavladoraki et al. (1993) Nature 266:469, que mostra que as plantas transgênicas que expressam os genes dos anticorpos recombinantes são protegidas contra ataques de vírus.

[0097] (Q) Uma proteína inibidora de desenvolvimento produzida na natureza por um agente patogênico ou um parasita. Assim, poligalacturonases endo α-1,4-D fúngicas facilitam a colonização fúngica e a liberação de nutrientes pela solubilização da galacturonase homo-α-1,4-D da parede celular vegetal (Lamb et al., 1992 Bio/Technology 10:1436). A clonagem e caracterização de um gene que codifica uma proteína inibidora de endopoligalacturonase do feijão é descrita por Toubart et al. (1992 Plant J. 2:367).

[0098] (R) Uma proteína inibidora de desenvolvimento produzida na natureza por uma planta, tal como o gene de inativação de ribossomo de cevada tem uma maior resistência a doença fúngica (Longemann et al., 1992. Bio/Technology 10:3305).

[0099] (S) A interferência de RNA em que uma molécula de RNA é utilizada para inibir a expressão de um gene alvo. Uma molécula de RNA, em um exemplo, é parcialmente ou totalmente de cadeia dupla, o que provoca uma resposta de silenciamento, resultando na clivagem do dsRNA em pequenos RNAs de interferência, que são então incorporados no complexo alvo que destrói mRNAs homólogos. Ver, por exemplo, Fire et al., patente dos EUA n° 6.506.559 e Graham et al., patente dos EUA n° 6.573.099.

[0100] 2. Genes que conferem resistência a um herbicida

[0101] (A), genes que codificam resistência ou tolerância a um herbicida que inibe o ponto de crescimento ou meristema, tal como um imidazolinona ou uma sulfonilureia. Exemplos de genes nesta categoria codificam para a sintase de acetolactato mutante (ALS) (Lee et al., 1988, EMBO J. 7:1241), também conhecida como enzima de sintase de ácido acetohidróxi (AHAS) (Miki et al. De 1990, Theor. Appl. Genet. 80: 449).

[0102] (B) Um ou mais genes adicionais que codificam resistência ou tolerância a glifosato transmitida por sintase de EPSP mutante e genes aroA, ou através de inativação metabólica por genes tais como o GAT (glifosato acetil trasnferase) ou GOX (glifosato oxidase) e outros compostos de fosfono, tais como glufosinato (PAT e os genes bar), e os ácidos piridinoxi ou fenoxi propriônico e cicloexadienos (genes codificadores do inibidor ACCase) . Ver, por exemplo, a patente dos EUA n° 4.940.835, que descreve a sequência de nucleotídeos de uma forma de EPSPS que pode conferir resistência ao glifosato. Uma molécula de DNA que codifica um gene aroA mutante pode ser obtido na instituição ATCC com o número de acesso 39256, e a sequência de nucleotídeos do gene mutante está descrita na patente dos EUA n° 4.769.061. O pedido de patente europeu n ° 0 333 033 e a patente dos EUA n° 4.975.374 descrevem sequências de nucleotídeos de genes de sintetase de glutamina que conferem resistência a herbicidas, tais como L-fosfinotricina. A sequência de nucleotídeos de um gene de transferase phosphinothricinacetyl é fornecida no pedido de patente europeu n ° 0 242 246. De Greef et al. (1989) Bio/Technology 7:61 descreve a produção de plantas transgênicas que expressam genes bar quiméricos que codificam para atividade transferase acetil fosfinotricina. Exemplos de genes que conferem resistência a ácidos fenoxi propriônicos e cicloexadienos, como setoxidim e haloxifope, são os genes, Accl- S1, Accl-S2 e Accl-S3 descritos por Marshall et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435.

[0103] (C), os genes que codificam resistência ou tolerância a um herbicida que inibe a fotossíntese, tal como uma triazina (psbA e genes gs+) e uma benzonitrila (gene de nitrilase). Przibilla et al. (1991) Plant Cell 3:169 descreve a utilização de plasmídeos que codificam os genes psbA mutantes para transformar Chlamydomonas. As sequências de nucleotídeos para os genes de nitrilase são descritas na patente dos EUA n° 4.810.648, e moléculas de DNA que contêm esses genes estão disponíveis na ATCC sob os números de acesso 53435, 67441 e 67442. A Clonagem e a expressão de DNA que codifica para uma S-transferase glutationa são descritas por Hayes et al. (1992) Biochem. J. 285:173.

[0104] (D) os genes que codificam resistência ou tolerância a um herbicida que se liga a dioxigenases hidroxifenilpiruvato (HPPD), enzimas que catalisam a reação na qual para- hidroxifenilpiruvato (HPP) é transformado em homogentísico. Isto inclui herbicidas, tais como isoxazóis (EP418175, EP470856, EP487352, EP527036, EP560482, EP682659, patente dos EUA N° 5.424.276), em particular isoxaflutole, que é um herbicida seletivo para o milho, diketonitrilos (EP496630, EP496631), em particular 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO2CH3-4-CF3 fenil)- propano-1,3-diona e 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO2CH3-4- 2,3Cl2fenil) propano-1,3-diona, tricetonas (EP625505, EP625508, patente dos EUA n° 5.506.195), em particular a sulcotriona, ou então pyrazolinatos. Um gene que produz uma grande abundância de HPPD nas plantas pode proporcionar resistência ou tolerância a esses herbicidas, incluindo, por exemplo, genes descritos nas patentes dos EUA n°s 6.268.549 e 6.245.968 e na publicação dos EUA n° 20030066102.

[0105] (E), os genes que codificam resistência ou tolerância a herbicidas fenoxi auxina, como por exemplo, ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D) e que também podem conferir resistência ou tolerância a herbicidas ariloxifenoxipropionatos (AOPP). Exemplos de tais genes incluem o gene da enzima dioxigenase α-cetoglutarato-dependente (AAD-1), descrito na publicação dos EUA 20090093366.

[0106] (F) Os genes que codificam resistência ou tolerância a herbicidas fenoxi auxina, como por exemplo, ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D), e que também podem conferir resistência ou tolerância a herbicidas piridiloxi auxina, tais como fluroxipir ou triclopir. Exemplos de tais genes incluem o gene da enzima dioxigenase α-cetoglutarato-dependente (DAA -12), descrito em WO 2007/ 053482 A2.

[0107] (G) os genes que codificam resistência ou tolerância a dicambia (ver, por exemplo, a publicação de patente dos EUA 20030135879).

[0108] (H) Os genes que fornecem resistência ou tolerância a herbicidas que inibem a oxidase de protoporfirinogênio (PPO) (ver patente dos EUA n° 5.767.373)

[0109] (I) Os genes que fornecem resistência ou tolerância a herbicidas de triazina (por exemplo, atrazina) e herbicidas derivados de ureia (tal como diuron), que se ligam a proteínas centrais de centros de reação de fotossistema II (PS II) (Ver Brussian et al., (1989) EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245).

[0110] 3. Genes que conferem ou contribuem para uma Característica de Valor Agregado

[0111] (A) Metabolismo de ácidos graxos modificados, por exemplo, através da transformação de milho ou de Brassica com um gene anti-sentido ou desasturase estearoil-ACP para aumentar o conteúdo de ácido esteárico da planta (Knultzon et al., 1992. Proc. Nat. Acad. Sci. EUA 89:2624.

[0112] (B) Conteúdo de fitato diminuído

[0113] (1) Introdução de um gene que codifica a fitase melhoraria a repartição do fitato, adicionando-se mais fosfato livre para a planta transformada, tal como o gene de fitase Aspergillus niger (Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87).

[0114] (2) Um gene que reduz o teor de fitato pode ser introduzido. No milho, isto, por exemplo, pode ser realizado pela clonagem e então reintrodução de DNA associado com o único alelo que é responsável por mutantes de milho caracterizados por baixos níveis de ácido fítico (Raboy et al., 1990 Maydica 35:383).

[0115] (C) A composição de hidratos de carbono modificada efetuada, por exemplo, pela transformação de plantas com um gene que codifica para uma enzima que altera o padrão de ramificação do amido. Exemplos de tais enzimas incluem o gene da frutosiltransferase de Streptococcus mucus (Shiroza et al., 1988 J. Bacteriol. 170:810), o gene da levansucrase de Bacillus subtilis (Steinmetz et al., 1985 Mol. Gen. Genel. 200:220), α- amilase de Bacillus licheniformis (Pen et al., 1992 Bio/Technology 10:292), os genes da invertase de tomate (Elliott et al., 1993 Plant. Molec. Biol. 21:515), do gene da amilase de cevada (Sogaard et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:22480), e a enzima II de ramificação de amido de endosperma do milho (Fisher et al., 1993 Plant Physiol. 102:1045).

[0116] A sequência de nucleotídeos de interesse, também pode ser uma sequência de nucleotídeos utilizada para alvejar uma área do genoma da planta por meio de recombinação homóloga. O promotor pode ser colocado em uma construção com tal sequência, cuja sequência não irá necessariamente codificar uma proteína. A sequência recombina no genoma e o promotor pode ser colocado no local alvo desejado pelas sequências para regular a sequência de nucleotídeos endógena desejada.

[0117] Além disso, o promotor pode ser utilizado para conduzir mRNA que pode ser utilizado para um sistema silenciador, tais como são discutidos em supra.

[0118] Uma região de terminação pode também ser incluída no vetor. Uma forma de realização da invenção é a sequência de terminação da presente invenção, SEQ ID NO: 5. Alternativamente, um outro terminador pode ser usado em conjunto com o promotor da invenção. Ao referir-se a uma sequência de terminação refere-se a uma sequência de nucleotídeos que sinaliza o fim da transcrição. Regiões de terminação convenientes estão disponíveis do plasmídeo Ti de A, tumefaciens, tais como a sintase de octopina (MacDonald et al., 1991 Nuc. Acids Res. 19 (20) 5575-5581) e regiões de terminação de sintase de nopalina (Depicker et al., (1982) Mol. and Appl. Genet. 1:561-573 e Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Research Vol. 12, n° 20, PP 78317846 (nos)). Exemplos de vários outros terminadores incluem o terminador pin II do gene II inibidor da protease da batata (An, et al. (1989) Plant Cell 1, 115-122. Ver também, Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144, Proudfoot (1991) Cell 64:671-674, Sanfacon et al (1991) Genes Dev 5:141-149, Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-127,; Munroe. et al (1990) Gene 91:151-158, Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903 e Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.)

[0119] Em uma forma de realização, o vetor de expressão também contém uma sequência de nucleotídeos que codifica um marcador selecionável ou contáveis que está operativamente ou funcionalmente ligado a um promotor que controla a iniciação da transcrição, que pode ser o promotor da presente invenção ou um outro promotor. Para uma descrição geral de vetores de expressão de plantas e genes relatores, ver Gruber et al. (1993) Vetors for plant transformation. In: Glick, B. R. and Thompson J. E. (Eds.) Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, pp. 89-119. Por exemplo, o gene seletivo é um DNA que codifica a resistência ao glufosinato ou do gene de transferase acetil fosfinotricina (PAT) ou um gene de milho PAT optimizado, ou o gene de bar pode ser usado sob o controle do promotor CaMV 35S ou outro. Tais genes PAT confere resistência ao herbicida bialafos (Gordon- Kamm et al, 1990 Plant Cell 2, 603-618, Wohllenben et al. 1988 Gene 70, 25-37). Outros exemplos, sem a intenção de ser limitador, são genes de fosfotransferase de higromicina, sintase EPSP e genes que codificam dihidropteroato. (Veja Miki et al. (1993), "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology Glick et al. (eds) CRC Press, pp. 67-88).

[0120] Além disso, os marcadores que facilitam a identificação de uma célula vegetal que contenha o polinucleotídeo que codifica o marcador podem ser empregues. Marcadores contáveis ou rastreáveis são úteis, onde que a presença da sequência produz um produto mensurável e pode produzir o produto sem a destruição da célula da planta. Exemplos incluem um gene β -glucuronidase ou uidA (GUS) que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, patentes dos EUA 5.268.463 e 5.599.670), transferase acetil (Jefferson et al. The EMBO Journal vol. 6 n° 13, pp. 3901-3907), fosfatase alcalina. Em uma forma de realização preferível, o marcador utilizado é o beta-caroteno ou provitamen A (Ye et al. Science 287:303-305-(2000)). O gene foi usado para melhorar a nutrição de arroz, mas neste caso é utilizado alternativamente como um marcador rastreável, e a presença do gene ligado a um gene de interesse é detectada pela cor dourada fornecida. Ao contrário da situação em que o gene é utilizado pela sua contribuição nutricional para a planta, uma quantidade menor da proteína é necessária. Outros marcadores detectáveis incluem os genes antocianina/flavonóide em geral (Ver discussão em Taylor e Briggs, The Plant Cell (1990) 2:115127), incluindo, por exemplo, um gene R-locus, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos antocianinos (cor vermelha) nos tecidos vegetais (Dellaporta et al., in Chromosome Structure and Function, Kluwer Academic Publishers, Appels and Gustafson eds., pp. 263-282 (1988)), os genes que controlam a biossíntese de pigmentos flavonóides, tais como o gene C1 do milho (Kao et al., Plant Cell (1996) 8: 1171-1179; Scheffler et al. Mol. Gen. Genet. (1994) 242:40-48) e o gene C2 do milho (Wienand et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 203:202-207), o gene B (Chandler et al., Plant Cell (1989) 1:1175-1183), o gene p1 (Grotewold et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA (1991) 88:4587-4591, Grotewold et al., Cell (1994) 76:543-553, Sidorenko et al., Plant Mol. Biol. (1999)39:11-19), os genes locus bronze (Ralston et al., Genetics (1988) 119:185-197, Nash et al., Plant Cell (1990) 2(11): 1039-1049), entre outros. No entanto, outros exemplos de marcadores adequados incluem o gene da proteína fluorescente de ciano (CYP) (Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54 e Kato et al. (2002) Plant Physiol 129: 913-42), o gene da proteína fluorescente amarela (PhiYFP™ from Evrogen; see Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54); gene lux, que codifica uma luciferase, cuja presença pode ser detectado utilizando-se, por exemplo, filme de raio-X, contagem de cintilação, espectrofotometria fluorescente, câmeras de vídeo de baixa luz, câmeras de contagem de fótons ou luminometria de vários poços (Teeri et al (1989) EMBO J. 8:343), um gene de proteína verde fluorescente (GFP) (Sheen et al., Plant J. (1995) 8 (5):777-84) e DsRed2, onde as células vegetais transformadas com o gene marcador são da cor vermelha, e, assim, visualmente selecionáveis (Dietrich et al. (2002) Biotechniques 2(2):286- 293). Exemplos adicionais incluem um gene p-lactamase (Sutcliffe, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. (1978) 75:3737), que codifica uma enzima pela qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênico), um gene xylE (Zukowsky et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80:1101), que codifica uma dioxigenase de catecol que pode converter catecóis cromogênicos, um gene α-amilase (Ikuta et al., Biotech. (1990) 8:241) e um gene tirosinase (Katz et al., J. Gen. Microbiol. (1983) 129:2703), que codifica uma enzima capaz de oxidar a tirosina para DOPA e dopaquinona, que, por sua vez, se condensa para formar o composto melanina facilmente detectável. Evidentemente, muitos destes marcadores estão disponíveis para um perito na arte.

[0121] O vetor de expressão pode também opcionalmente conter uma sequência de sinal localizado entre o promotor e o gene de interesse e/ou após o gene de interesse. Uma sequência sinal é uma sequência de nucleotídeos traduzida para dar uma sequência de aminoácidos, que é usada por uma célula para dirigir a proteína ou o polipeptídio de interesse para ser colocado em um local específico dentro ou fora da célula eucariótica. Um exemplo de uma sequência de sinal da planta é o sinal de secreção α- amilase de cevada (Rogers, 1985, J. Biol. Chem. 260, 3731-3738) . Muitas sequências de sinal são conhecidas na arte. Veja-se, por exemplo, Becker, T. W., Templeman, T. S., Viret, J. F. e Bogorad, L. (1992) The cab-m7 gene: a light-inducible, mesophyll-specific gene of maize. Plant Mol. Biol. 20, 49-60, Fontes, et al. (1991) Characterization of an immunoglobulin binding protein homolog in the maize floury-2 endosperm mutant. Plant Cell 3, 483-496, Matsuoka, K. and Nakamura, K. (1991) Propeptide of a precursor to a plant vacuolar protein required for vacuolar targeting. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 834-838, Gould et al. (1989) A conserved tripeptide sorts proteins to peroxisomes. J. Cell. Biol. 108, 1657-1664, Creissen et al. (1992) Molecular characterization of glutathione reductase cDNA from pea (Pisum sativum L.). Plant J. 2, 129-131, Kalderon et al. (1984) A short amino acid sequence able to specify nuclear location. Cell 39, 499-509 e Stiefel et al. (1990) Expression of a maize cell wall hydroxyproline-rich glycoprotein gene in early leaf and root vascular differentiation. Plant Cell 2, 785-793.

[0122] Sequências líder podem ser incluídas para melhorar a tradução. Várias sequências líder disponíveis podem ser substituídas ou adicionadas. Os líderes de tradução são conhecidos na arte e incluem, por exemplo: líderes picornavirus, por exemplo, líder EMCV (região não codificadora encefalomiocardite 5’) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130), líderes potyvirus, por exemplo líder TEV (vírus Etch do Tabaco) (Gallie et al. (1995) Gene 165 (2) :233-8), proteína de ligação de cadeia pesada da imunoglobulina humana (BiP), (Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94); líder não traduzido do mRNA da proteína revestidora do vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625), líder do vírus do mosaico do tabaco (TMV) (Gallie. (1987) Nucleic Acids Res. 15(8):3257-73), e líder do vírus do mosqueado clorótico do milho (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Veja também, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology 84:965-968. Outros métodos conhecidos para melhorar a tradução também podem ser utilizados, como por exemplo, íntrons e semelhantes. Obviamente, muitas variações sobre os promotores, marcadores selecionáveis, sequências de sinal, sequências líder, sequências de terminação, intensificadores, íntrons e outros componentes do vetor estão disponíveis para um perito na arte.

[0123] Se necessário, a sequência de nucleotídeos pode ser otimizada para aumentar a expressão na planta transformada. Ou seja, os genes podem ser sintetizados utilizando-se códons preferíveis de plantas para uma expressão melhorada. Ver, por exemplo, Campbell and Gowri (1990) (1990) Plant Physiol. 92: 111 para uma discussão sobre a utilização de códons preferíveis para o hospedeiro. Métodos estão disponíveis na arte para a síntese de genes preferíveis de plantas. Ver, por exemplo, as patentes dos EUA n°s 5.380.831, 5.436.391, e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498. Modificações de sequências adicionais são conhecidas para aumentar a expressão do gene em uma planta. Estes incluem a eliminação de sequências que codificam sinais de poliadenilação espúrios, sinais de local de junção exon-íntron, repetições do tipo transposão e outras sequências bem caracterizadas que possam ser deletérias para a expressão do gene. O conteúdo de G-C da sequência pode ser ajustado para níveis médios para um dado hospedeiro celular, conforme calculado por referência para genes conhecidos expressos na célula hospedeira. Quando possível, a sequência é modificada para evitar estruturas de mRNA hairpin secundárias preditas.

[0124] Na preparação da estrutura de nucleotídeos, os vários fragmentos de sequência de nucleotídeos podem ser manipulados, de modo a prover para as sequências de nucleotídeos na orientação correta e, conforme apropriado, no quadro de leitura correto. Para este fim, os adaptadores ou ligadores podem ser utilizados para unir os fragmentos de sequência de nucleotídeos ou outras manipulações podem ser envolvidas para prover para locais de restrição convenientes, remoção de sequências de nucleotídeos supérfluas, remoção de locais de restrição ou semelhantes. Para este efeito, mutagénese in vitro, reparação de primer, restrição, hibridação, resubstituições, por exemplo, transições e transversões, podem estar envolvidas.

[0125] Métodos para a introdução de vetores de expressão em tecido vegetal disponíveis para um perito na arte são variados e dependerão da planta selecionada. Procedimentos para a transformação de uma grande variedade de espécies de plantas são bem conhecidos e descritos ao longo da literatura. (Ver, por exemplo, Miki e McHugh (2004) Biotechnol 107, 193-232, Klein et al. (1992) Biotechnology (NY) 10, 286-291 e Weising et al. (1988) Annu. Rev. Genet. 22, 421-477). Por exemplo, a construção de DNA pode ser introduzido no DNA genômico da célula vegetal utilizando-se técnicas tais como entrega mediada por microprojéteis (Klein et al. 1992, supra), eletroporação (Fromm et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824-5828), precipitação de polietileno-glicol (PEG) (Mathur and Koncz, 1998 Methods Mol. Biol. 82, 267-276), transferência direta de genes (WO 85/01856 e EP-A-275 069), transformação in vitro de protoplasto (patente dos EUA n° 4.684.611), e micro-injeção de protoplastos ou de calo embriogênico de células vegetais (Crossway, A. (1985) Mol. Gen. Genet. 202, 179-185). Métodos de transformação de Agrobacterium de Ishida et al. (1996) e também descritos na patente dos EUA n° 5.591.616 são mais uma opção. A co-cultura de tecido de planta com A. tumefaciens é uma variação, onde as construções de DNA são colocadas em um sistema de vetor binário (Ishida et al., 1996 Nat. Biotechnol. 14, 745-750). As funções de virulência do hospedeiro A. tumefaciens vão conduzir a inserção da construção no DNA de célula vegetal quando a célula for infectada pela bactéria. Ver, por exemplo, Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4803-4807. Agrobacterium é usado principalmente em dicotiledôneas, mas monocotiledôneas, incluindo o milho, podem ser transformada por Agrobacterium. Ver, por exemplo, a patente dos EUA n° 5.550.318. Em uma das muitas variações do método, a infecção por Agrobacterium do milho pode ser usada com choque térmico de embriões imaturos (Wilson et al., patente dos EUA n° 6.420.630) ou com a seleção antibiótica de calo Tipo II (Wilson et al., patente dos EUA n° 6.919.494).

[0126] A transformação do arroz é descrito por Hiei et al. (1994) Plant J. 6, 271-282 e Lee et al. (1991) Proc. Nat. Acad. Sci. EUA 88, 6389-6393. Métodos convencionais para a transformação de canola são descritos por Moloney et al. (1989) Plant Cell Reports 8, 238-242. A transformação do milho é descrito por Fromm et al. (1990) Biotechnology (NY), 8, 833-839 e Gordon-Kamm et al. (1990) supra. O trigo pode ser transformado por técnicas semelhantes àquelas utilizadas para a transformação de milho ou arroz. A transformação do sorgo é descrita por Casas et al. (Casas et al. (1993) Transgenic sorghum plants via microprojectile bombardment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11212-11216) e a transformação da cevada é descrita por Wan e Lemaux (Wan e Lemaux (1994) Generation of large em umbers of independently transformed fertile barley plants. Plant Physiol. 104, 37-48). A transformação da soja é descrita em várias publicações, incluindo a patente dos EUA n° 5.015.580.

[0127] Em um método preferível, o uso de tecnologia de feixe de aerossol para a introdução de sequências de nucleotídeos em células é empregue. A tecnologia de feixe de aerossol emprega a expansão de jato de um gás inerte à medida que ele passa de uma região de maior pressão de gás para uma região de menor pressão de gás através de um pequeno orifício. O gás em expansão acelera as gotículas de aerossol contendo as moléculas a serem introduzidas em uma célula ou tecido. Gotículas de aerossol produzidas são tipicamente menores do que 0,1 mícron de diâmetro no ponto de impacto com as células-alvo. O DNA carregado em gotas de aerossol deste pequeno tamanho penetra nas células apenas devido à velocidade atingida pelas gotas de aerossol. A velocidade alcançada pelo método do feixe de aerossol da invenção é supersônica e pode chegar a 2.000 metros/segundo. Em uma forma de realização preferível, o processo inclui (i) a cultura de uma fonte de células, (II), opcionalmente, o pré-tratamento de células para se obter tecido com maior capacidade de absorção e a integração através da tecnologia de feixe aerossol, (III) a transformando do referido tecido com uma sequência de nucleotídeos exógena pelo método de feixe de aerossol da invenção, (IV), opcionalmente, a identificação ou seleção para tecido transformado, (V), opcionalmente, a regeneração de plantas transgênicas a partir de células ou tecidos transformadas, e (VI) opcionalmente, a produção de descendentes das referidas plantas transgênicas. Este processo é descrito em detalhe nas patentes dos EUA de Held et al., n°s 6.809.232, 7.067.716 e 7.026.286 (todas aqui incorporadas por referência na sua totalidade).

[0128] De acordo com a presente invenção, uma planta transgênica que contenha um promotor preferível não polínico introduzido pode ser produzida. Ele pode ser combinado com qualquer um dos componentes acima mencionados.

[0129] Em uma outra forma de realização, o cruzamento de plantas pode ser utilizado para introduzir as sequências de nucleotídeos em outras plantas, uma vez que tenha ocorrido a transformação. Isto pode ser realizado por quaisquer meios conhecidos na arte para as plantas de reprodução, tais como, por exemplo, a polinização cruzada de plantas transgênicas descritas acima com outras plantas, e seleção para plantas das gerações subsequentes, que contenham o ácido nucleico e/ou expressem a sequência de aminoácidos ou característica. Os métodos de cruzamento de plantas usados aqui são bem conhecidos para um perito na arte. Para uma discussão de técnicas de cruzamento de plantas, Poehlman, J. M. and Sleper, D. A. (1995) Breeding Field Crops, 4th Edition, Iowa State University Press. Muitas plantas cultiváveis úteis neste método são criadas através de técnicas que se aproveitam do método de polinização da planta. Uma planta é de auto-polinização se o pólen de uma flor é transferido para a mesma flor ou para outra flor da mesma planta. A planta é de polinização cruzada, se o pólen vem de uma flor em uma planta diferente. Por exemplo, em Brassica, a planta é normalmente auto estéril e pode apenas ser polinizada de forma cruzada, a menos que, através da descoberta de um mutante ou através de intervenção genética, a auto-compatibilidade seja obtido. Em espécies de auto-polinização, tais como o arroz, a aveia, o trigo, a cevada, a ervilha, o feijão, a soja, o tabaco e o algodão, as plantas masculinas e femininas se anatomicamente justapostas. Durante a polinização natural, os órgãos reprodutores masculinos de uma determinada flor polinizam os órgãos reprodutivos femininos da mesma flor. As plantas de milho (Zea mays L.), podem ser produzido tanto por técnicas de auto- polinização quanto de polinização cruzada. O milho possui flores masculinas, localizadas no cabelo do milho, e flores femininas, localizadas na espiga, da mesma planta. Ela pode se auto- polinizar ou fazer a polinização cruzada.

[0130] A polinização pode ser feita por diversos meios, incluindo, mas não limitados, a mão, pelo vento ou através de insetos ou por contato mecânico entre a planta masculina fértil e a planta masculina estéril. Para a produção de sementes híbridas em escala comercial, na maior parte das espécies de plantas, a polinização pelo vento ou por insetos é preferível. Maior controle do processo de polinização pode ser atingido pela utilização de uma variedade de métodos para tornar um conjunto de plantas masculino estéril, e o outro o masculino fértil doador de pólen. Isto pode ser conseguido pela remoção a mão das flores produtoras de pólen, esterilização masculina citoplasmática, ou o controlo de esterilidade masculina por meio de uma variedade de métodos bem conhecidos dos peritos de cultivo. Exemplos de sistemas mais sofisticados de esterilização masculina incluem os descritos por Brar et al., patentes dos EUA n°s 4.654.465 e 4.727.219 e Albertsen et al., patentes dos EUA n°s 5.859.341 e 6.013.859.

[0131] Métodos de retrocruzamento podem ser usados para introduzir o gene nas plantas. Esta técnica tem sido usada há décadas para apresentar características em uma planta. Um exemplo de uma descrição deste e de outros métodos de melhoramento de plantas que são bem conhecidos pode ser encontrado em referências tais como Poehlman et al. (1995) supra.

[0132] Além disso, a planta, semente ou tecido pode ser ainda processado em um produto de planta, tal como pela inclusão de produtos de cereais, como farinha, farelo e grãos ou separados de amidos, óleos, proteínas e afins. EXEMPLOS

[0133] Os exemplos seguintes são apresentados para ilustrar uma forma de realização da invenção e não limita o escopo da invenção, ao contrário do que é estabelecido. Exemplo 1 Promotores de soja que não se expressam no pólen.

[0134] Um rastreamento foi realizado para identificar promotores que não possuem expressão no pólen de soja, utilizando-se a análise gene-chip. Para atingir este objetivo, o RNA total dos tecidos de folhas, raízes, e de pólen foi isolada usando o 'Plant RNeasy Kit’ de Qiagen. Preparações duplicadas foram feitas a partir de cada um destes tecidos em dois dias diferentes. Mais de 30 μg de amostras extremamente puras de RNA de cada tipo de tecido foram obtidos a partir de cada preparação replicada. Estas amostras foram submetidas à instalação de GeneChip da Iowa State University para análise. A análise da expressão do gene de soja para cada tipo de tecido foi feita em duplicado. Um total de cerca de 38.000 pontos de dados de genes foram recolhidos por chip. A partir dos resultados, quatro genes candidatos que se expressaram em níveis baixos ou não se expressam em pólen, mas que se expressaram nas folhas e raízes foram escolhidos. Estes candidatos foram chamados GSO, GNR, 185, e 17.

[0135] As sequências completas destes genes, incluindo o seu promotor e sequências de terminação foram obtidas a partir da base de dados do genoma de soja recentemente publicada. (www.phytozome.net/search.php?show=blast&blastdb=soybean, University of California Regents, Center for Integrative Genetics, 2010). Esta informação foi utilizada na concepção dos seguintes primers específicos para amplificar as regiões promotoras : GNR: GATCTTCATTTATCCATTGGGGTACTTGTTTC (SEQ ID NO: 6) TGAGGAAATTAAATGAAAGGAAAAGAAAATTAGAG (SEQ ID NO: 7) GSO: GAAGGAGATCTAGTTCACTGGTTAAATAAGATGTG (SEQ ID NO: 8) GGTCTACTGAGGCGTGTGGCTGGAGTGAGG (SEQ ID NO: 9) GSOter: TTAACCAGTGCATGATGCTGAATTAAATG (SEQ ID NO: 10) TTATAATGTAGTTTCAACTTGAATCC (SEQ ID NO: 11) 17: ATCCCATGGTCGCGGACGATGTAATAGAAC (SEQ ID NO: 12) ATCGGATCCACCCGCCCATACATCGTAACCAC (SEQ ID NO: 13) 185: ACTGCGGCCGCGAGTATGACCCTTGATGCCGC (SEQ ID NO: 14) ACTGGATCCACCTTAGTTAGGATTTTGTGTTTT (SEQ ID NO: 15)

[0136] Usando-se o DNA genômico da soja Jack [ver, Nickell, C. D., Noel, G. R., Thomas, D. J. and Waller, R. (1990) Registration of ‘Jack’ soybean. Crop Sci 1365. 30] como molde e os primers específicos, os promotores foram amplificadas por PCR. Os fragmentos amplificados foram clonados no vetor pGEM-T Easy e clones corretos contendo as inserções de GNR, GSO, 17 e 185 foram identificadas por análises de digestão de restrição. As sequências de nucleotídeos dos clones dos promotores GNR (fig. 1), GSO (Fig. 2), 17 (Fig. 3) e 185 (Fig. 4) foram determinados. A Comparação (GAP) dessas sequências com as sequências GNR, GSO, 17, e 185 publicadas na ‘base de dados do genoma de soja' revelou que as sequências promotoras clonadas foram >99,5% idênticas às sequências publicadas.

[0137] Os promotores amplificados GNR e GSO clonados em vetores pGEM-Teasy foram extraídos como fragmentos EcoRI/BamHI (fragmento GNR de 1065 bp e fragmento GSO de 890 bp). Estes fragmentos foram introduzidos em um vetor plasmídico digerido EcoRI/BamHI. Subsequentemente, o terminador GNR (Fig. 5) foi introduzida nestas construções (com fragmentos AscI/SacI) para gerar as construções pGNRproGSOter e pGSOproGSOter.

[0138] Um gene GUS foi amplificada como um fragmento BamHI/AscI através de PCR e o fragmento amplificado foi clonado no vetor pGEM-T. Um clone correto pGEM-T/GUS foi identificado por análise de digestão de restrição. A inserção por GUS deste clone foi extraída como um fragmento BamHI/AscI e foi introduzido na estruturas principais pGNRproGSOter e pGSOproGSOter digeridas por BamHI/AscI para gerar construções pGNRproGUSGSOter e pGSOproGUSGSOter, respectivamente (Figs. 6 e 7).

[0139] As construções pGNRproGUSGSOter e pGSOproGUSGSOter foram linearizados com EcoRI e Sall. O cassete NPTII (35S NPTII Ocs) foi removido como um fragmento EcoRI e Sall e introduzidos nas construções pGNRproGUSGSOter e pGSOproGUSGSOter digeridas por EcoRI / Sall digeridos para gerar pGNRGUSNPT e pGSOGUSNPT, respectivamente (Figs. 8 e 9). Estas construções foram usadas para a transformação da soja.

[0140] Promotores 17 e 185 foram amplificados com PCR, como é comum na arte, para facilitar a clonagem dos mesmos a montante de um gene GUS. Os primers utilizados para amplificar o promotor 17 foram (actcaattgacccgcccatacatcgtaaccactata) (SEQ ID NO: 16) e (atcggatcccgcggacgatgtaatagaactagctag) (SEQ ID NO: 17). Os primers utilizados para amplificar o promotor 185 foram (actcaattggagtatgacccttgatgccgccaag) (SEQ ID NO: 18) e (actggatccaccttagttaggattttgtgttttgagtg) (SEQ ID NO: 19). As bandas amplificadas foram clonados para vetores pGEM-T Easy de acordo com o fabricante Promega. Os promotores 17 e 185 em pGEM- T foram digeridos com MfeI e BamHI e clonados para os locais EcoRI e BamHI de pGSOproGUSGSOterNPT, portanto, substituindo o promotor GSO com os promotores 17 e 185, respectivamente. As construções resultantes foram chamadas 17GUSNPT (fig. 10) e 185GUSNPT (Fig. 11). Estas construções foram usadas para a transformação da soja. A soja foi transformada de acordo com o procedimento descrito na patente dos EUA 6.809.232, aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[0141] Tecido vegetal transgênico foi avaliado para a expressão de GUS utilizando-se um procedimento de coloração histoquímico. Tecido foliar e pólen foram incubados na presença do substrato X-gluc (Gold Biotechnology, Inc.) a uma concentração de 0,5 mg/ml em uma solução tampão de 0,1 M de fosfato de sódio pH 7,0 e 0,1% de Triton-X-100 a 37 graus Celsius durante 1-8 horas. Foram obtidas plantas que expressaram GUS nas folhas, mas sem expressão detectável no pólen para os promotores 17, 185, GNR e GSO.

Claims

1. Método de expressão de uma molécula de ácido nucleico heteróloga em uma planta caracterizado por o método compreender (A) introduzir na referida planta uma molécula de ácido nucleico heteróloga operacionalmente ligada a um promotor consistindo em um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) uma sequência de nucleotídeos consistindo na SEQ ID NO: 1; (b) uma sequência de nucleotídeos consistindo na SEQ ID NO: 2; (c) uma sequência de nucleotídeos consistindo na SEQ ID NO: 3; (d) uma sequência de nucleotídeos consistindo na SEQ ID NO: 4; e (e) um fragmento funcional de qualquer uma das sequências nos itens (a)-(d), em que a referida sequência de nucleotídeos ou o referido fragmento direciona a expressão de uma molécula de ácido nucleico heteróloga de modo que a referida molécula de ácido nucleico é expressa em folha e não é expressa em pólen; e (B) detectar expressão da referida molécula de ácido nucleico heteróloga no tecido da referida planta de modo que nenhuma expressão detectável é encontrada em pólen e a referida molécula de ácido nucleico expressa em tecido de folha.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida molécula de ácido nucleico heteróloga, que é expressa em níveis mais baixos nas células polínicas da referida planta do que nas outras células da referida planta, codifica um produto mensurável.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida molécula de ácido nucleico heteróloga codifica um polipeptídeo que confere tolerância a um herbicida.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida molécula de ácido nucleico heteróloga codifica um polipeptídeo Bacillus thuringiensis.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda produzir um produto de grão a partir da referida planta.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida molécula de ácido nucleico heteróloga ser operacionalmente ligada a SEQ ID NO: 5.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda introduzir o referido promotor operacionalmente ligado à referida molécula de ácido nucleico heteróloga em pelo menos uma planta e selecionar uma planta na qual a referida molécula de ácido nucleico heteróloga é expressa no tecido de folha e na qual a referida molécula de ácido nucleico heteróloga não tem expressão detectável em pólen.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida planta é cruzada com uma segunda planta.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma progênie é produzida a partir da referida planta.

10. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o produto mensurável é um polipeptídeo e a presença do referido polipeptídeo é detectada.

11. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido produto mensurável pode ser visualmente observado.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo referido promotor ser selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) uma sequência de nucleotídeos consistindo na SEQ ID NO: 1; (b) uma sequência de nucleotídeos consistindo na SEQ ID NO: 2; (c) uma sequência de nucleotídeos consistindo na SEQ ID NO: 3; e (d) uma sequência de nucleotídeos consistindo na SEQ ID NO: 4.