BR112013022285B1

BR112013022285B1 - Proteína de fusão de fgfr-fc e o seu uso

Info

Publication number: BR112013022285B1
Application number: BR112013022285-9A
Authority: BR
Inventors: Fang Jianmin; Dong Li
Original assignee: Yantai Rongchang Biotechnologies Co., Ltd.
Priority date: 2011-05-20
Filing date: 2012-05-18
Publication date: 2020-05-12
Also published as: RU2560573C2; BR112013022285A2; AU2012261412A1; CN102219860B; AU2012261412B2; RU2013140184A; KR20160011241A; CN102219860A; CA2834584C; EP2711376A4; KR101660336B1; EP2711376A1; CA2834584A1; EP2711376B1; US20130195864A1; WO2012159550A1; DK3173102T3; US9273137B2; JP2014513941A; EP3173102B1

Abstract

proteína de fusão de fgfr-fc e o seu uso é apresentada uma proteína de fusão compreendendo a parte sequência funcional intermédia (ifs) do domínio fgfr lg-like, segundo domínio lg-like fgfr (d2), terceiro domínio lg-like fgfr (d3), e a região fc de imunoglobulina, molécula de ácido nucleico codificadora da proteína de fusão e o veículo e célula hospedeira contendo a molécula de ácido nucleico. é também apresentado um método de preparação para a proteína de fusão e o uso de veículos ou células compreendendo a proteína de fusão, a molécula de ácido nucleico codificadora da proteína de fusão ou a molécula de ácido nucleico na preparação de medicamentos para o tratamento de doenças relacionadas com a regulação da angiogênese.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “PROTEÍNA DE FUSÃO DE FGFR-Fc E O SEU USO”.

CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção pertence ao domínio da biotecnologia e está relacionada com o tratamento de doenças, especialmente o tratamento de doenças relacionadas com a sobre-expressào de FGF. Em particular, a presente invenção está relacionada com proteínas de fusão FGFR-Fc e respectiva utilização no tratamento de doenças relacionadas com a regulação da angiogênese. Mais particularmente, a presente invenção está relacionada com proteínas de fusão FGFR-Fc isoladas, solúveis e respectiva aplicação na produção do medicamento destinado ao tratamento de doenças relacionadas com a regulação da angiogênese.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] Angiogênese é um dos fatores primários que resultam no crescimento e metástase de tumor maligno [1]. O processo de angiogênese é regulado por vários fatores, entre os quais alguns fatores promovem a angiogênese enquanto outros inibem a Angiogênese. Consequentemente, a regulação de Angiogênese é um processo de equilíbrio dinâmico complicado [2]. Pretende-se que o tratamento anti-angiogênese controle o crescimento do tumor ao bloquear fatores angiogênicos estimulantes ou ao evitar a angiogênese no tumor utilizando inibidores da angiogênese. Atualmente, conhece-se uma grande quantidade de fatores estimulantes angiogênicos, tais como, por exemplo, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento do fibroblasto (FGF), fator de crescimento do hepatócito (HGF), etc. os quais podem estimular a divisão e diferenciação de células endoteliais vasculares e a morfogênese de vasos sanguíneos. Entre estes fatores acima mencionados, sabe-se que o VEGF é o fator de crescimento mais eficaz e específico da angiogênese [3, 4].

[003] Em um ambiente hipóxico dentro do tecido do tumor, são segregados inúmeros VEGFs pelas células do tumor, as quais induzem à

2/50 divisão e migração de endoteliócitos vasculares, resultando finalmente no estabelecimento de rede vascular do tumor. Foi demonstrado por uma série de experiências animais que o inibidor do VEGF pode prevenir a angiogênese e ainda inibir o crescimento do tumor. Por esta razão, o VEGF e seus receptores tornam-se alvos importantes para os fármacos anti-angiogênese. Atualmente, os fármacos anti-angiogênese que demonstraram, em estudos clínicos, ser de eficácia relevante incluem Bevacizumab (sob o nome de Avastina), o qual tem capacidade para bloquear o VEGF diretamente e inibir a Angiogênese do tumor. Bevacizumab foi aprovado no Mercado pela FDA em 2004 e sendo considerado um fármaco de primeira linha para o câncer retal, é o primeiro fármaco aprovado no mercado que desempenha um papel importante na anticarcinogênese ao inibir a angiogênese. Avastina é um anticorpo monoclonal anti-VEGF humanizado, o qual é produzido por uma empresa biotecnológica famosa americana Genentech. Em um ensaio clínico de Fase III de larga escala, a terapia combinada de Avastina e quimioterapia pode aumentar significativamente o tempo de sobrevivência dos doentes que sofrem de vários tipos de cancro, incluindo câncer retal, cancro do pulmão, cancro da mama e cancro renal, etc. [5, 6] O sucesso clínico da Avastina é um marco, demonstrando que o tratamento anti-angiogênese que utilize o sistema vascular do tumor como o alvo é uma medida clinicamente eficaz e que apresenta uma novo caminho para o tratamento do tumor. Nos países ocidentais, a Avastina foi já amplamente utilizada para a terapia do tumor e é um dos fármacos que detém a posição mais importante no mercado.

[004] Para além da Avastina, encontram-se também na última fase de estudo clínico humano alguns fármacos para sinalização anti-VEGF em países estrangeiros, os quais se espera que sejam aplicados clinicamente nos próximos anos. Entre outros, Aflibercept (também denominado VEGF-Trap), desenvolvido pela colaboração entre a empresa biotecnológica Americana Regeneron e Sanofi-Aventis, encontra-se agora em ensaio clínico de Fase III de larga escala [7]. Uma droga IMC-1121B (Imclone) de anticorpos

3/50 monoclonais de receptor II anti-VEGF (VEGFR2) encontra-se igualmente em ensaio clínico de Fase III [8]. Na China, o desenvolvimento de novos medicamentos concentra-se agora também nos medicamentos antitumoral com anti-angiogênese como alvo. Medicamentos com VEGF e respectivo receptor ou outros alvos angiogênicos encontram-se atualmente em desenvolvimento por parte de várias empresas ou instituições de pesquisa chinesas. Estas novas drogas irào definitivamente proporcionar novas escolhas para a terapia do cancro e nova esperança aos doentes.

[005] Tem sido obtido grande sucesso no tratamento clínico de tumores, utilizando medicamentos anti-VEGF. No entanto, foi igualmente demonstrado em ensaios clínicos que o tratamento anti-VEGF é também consideravelmente limitado. Do ponto de vista do efeito do tratamento do tumor, a Avastina pode prolongar o tempo de sobrevivência médio do doente com cancro do cólon por aproximadamente 3-4 meses [9, 10], e prolongar o tempo de sobrevivência médio do doente com cancro da mama por aproximadamente 7-8 meses [11]. Deste modo, a Avastina, não tem capacidade para inibir de forma eficaz o crescimento dos vasos do tumor em um longo prazo. Por conseguinte, é necessário que os investigadores na área de tumores resolvam o problema de como continuar a melhorar o efeito de tratamento clínico utilizando métodos anti-angiogênese. É este igualmente o ponto principal da pesquisa e desenvolvimento dos medicamentos anti-angiogênese de próxima geração.

[006] As causas primárias que resultam na falha do tratamento anti-VEGF ou no aparecimento de resistência podem depender da regulação de angiogênese do tumor por uma pluralidade de fatores. Embora o VEGF tenha uma função importante na Angiogênese, não é o único fator estimulante da Angiogênese. Entretanto, devido à heterogeneidade das células do tumor, a complexidade do microambiente do tumor e do mecanismo de resposta de compensação do corpo, quando a atividade de VEGF é inibida durante um período longo de tempo, são expressos outros fatores estimulantes de Angiogênese [12] e, deste modo, o crescimento dos vasos sanguíneos do

4/50 tumor não é mais dependente do caminho de sinalização do VEGF. A variação de fatores de angiogênese expressos pelo tumor foi estudada durante o tratamento anti-VEGFR2 para o tumor pancreático pelo grupo Hanahan (University of California, San Francisco, US), indicando que a expressão de vários genes sofreu alterações durante o tratamento anti-VEGF, no qual a expressão de FGF-2 registrou um aumento significativo. Foi demonstrado que a expressão de FGF, principalmente FGF-2, aumentou significativamente no tumor resistente ao tratamento anti-VEGF de modo que a antiogênese foi de novo ativada e a repopulação do tumor foi inibida após bloqueio o caminho de sinal FGF [13]. Pode eventualmente observar-se que a sobre-expressão de FGF-2 se encontra intimamente relacionada com a capacidade do tumor de fugir ao tratamento anti-VEGF. Por conseguinte, acreditamos que a angiogênese do tumor pode ser prevenida de forma eficaz e o crescimento do tumor pode ser inibido por meio do bloqueio da via FGF, de forma que as doenças relacionadas com a angiogênese podem ser tratadas exclusivamente através do tratamento anti-FGF ou através de uma terapia combinada de antiFGF e anti-VEGF.

[007] O fator de crescimento do fibroblasto (FGF) é uma família do fator de crescimento para ligação da heparina, e existem 22 membros nos mamíferos (FGF 1-14, 16-23). FGF desempenha um importante papel em muitas funções biológicas, por exemplo, proliferação celular, diferenciação, migração, angiogênese e tumorigênese, etc. O receptor do fator de crescimento fibroblasto (FGFR) é o receptor que liga os membros da família do fator de crescimento do fibroblasto. FGF pode ligar FGFR e ativar a via de sinal a jusante, que desempenha um importante papel em um processo fisiológico e patológico, tal como embriogênese, desenvolvimento, vasculogênese, vasodilatação, neurorregulação, proteção contra isquemia, cicatrização e tumorigênese, etc. [14, 15] Fcou já demonstrado que a sobre-expressão de FGF/FGFR in vivo está intimamente relacionada com muitas doenças, incluindo tumores (tais como fibroma, neuroglioma, melanoma, carcinoma da próstata,

5/50 linfomata, leucemia, cancro do sistema urinário, etc.), doenças do sistema esquelético (nanismo, craniocistose, acondroplasia, acanthosis nigricans) e falência renal, etc. Foi registrado que um nível maior de expressão de FGF e do respectivo receptor pode promover diretamente a sobrevivência e proliferação de células de tumor e a sobrevivência de células de carcinoma hepático sofre uma redução significativa com a sub-regulação de FGF por meio de siARN [22]. Por conseguinte, espera-se bloquear a via FGF construindo uma proteína de fusão FGFR-Fc com capacidade para antagonizar FGF, que tem o potencial para tratar doenças relacionadas com a sobre-expressão de FGF.

[008] De momento, poucas pesquisas incidem no desenvolvimento de novo medicamento anti-angiogênese utilizando FGF e o respectivo receptor como o alvo em ensaios clínicos. Por exemplo, FP-1039, uma proteína de fusão constituída por domínio celular inteiro de FGFR1 humno e fragmento lgG1 Fc humano, encontra-se em desenvolvimento pela empresa norteamericana Five Prime em fase de recrutamento de voluntários para o ensaio clínico de fase I. No entanto, foi sugerido por investigadores da Wang e Olsen que o primeiro domínio lg-like do domínio extracelular de FGFR1 humano e o fragmento de ligação entre o primeiro e o segundo domínio lg-like do domínio extracelular de FGFR1 pode inibir a ligação de FGFR1 e FGF [20, 21].

[009] Por conseguinte, espera-se bloquear a via FGF construindo uma proteína de fusão FGFR-Fc com capacidade para antagonizar FGF, de forma a que seja possível inibir eficientemente a angiogênese ou possa agir em células de tumor diretamente e inibir o respectivo crescimento e que tem o potencial para tratar doenças relacionadas com a sobre-expressão de FGF para curar doenças relacionadas com a angiogênese, tais como tumores.

Resumo [010] A estrutura espacial da proteína encontra-se intimamente relacionada com a respectiva função biológica. A capacidade de ligação de FGF é diretamente influenciada pela diferença entre as conformações de cada

6/50 domínio lg-like do domínio extracellular de FGFR e o fragmento de ligação. Diferentes proteínas de fusão, constituídas pelos fragmentos do domínio extracelular de FGFR de vários comprimentos e IgG Fc são construídas por meio de manipulação genética, para se obter proteínas de fusão com diferentes conformações, de forma que podem ser selecionadas as proteínas de fusão com elevada eficiência de ligação de FGF e atividade biológica.

[011] Existem quatro genes FGFR nos mamíferos: fgfR1-fgfR4. O receptor do fator de crescimento fibroblasto é composto de domínio extracelular, domínio transmembrana e domínio intracelular. Existem muitos membros na família FGFR que possuem domínio extracelular similar mas que variam quanto à propriedade de ligação do ligando e domínio quinase. Os respectivos domínios extracelular incluem três domínios de tipo imunoglobulina (lg-ike): o primeiro domínio lg-like, o segundo domínio lg-like e o terceiro domínio lg-like e existe uma sequência entre o primeiro e o segundo domínio lg-like que é designada como a sequência funcional intermédia do domínio lg-like de FGFR (abreviado para IFS) na presente especificação. A sequência funcional intermédia pode compreendes um segmento de aminoácido ácido, designado como caixa ácida (AB).

[012] A presente invenção refere-se a uma proteína de fusão solúvel isolada do receptor do fator de crescimento de fibroblasto (FGFR) que compreende: a parte derivada da região de sequência funcional intermédia (também designada IFS) do domínio lg-like de FGFR, o segundo domínio lglike (também designado D2) de FGFR e o terceiro domínio lg-like (também designado D3) de FGFR e a região Fc de imunoglobulina.

[013] A presente invenção refere-se a uma proteína de fusão constituída por: a parte derivada da região de sequência funcional intermédia do domínio lg-like de FGFR, o segundo domínio lg-like de FGFR, o terceiro domínio lg-like de FGFR e a região Fc de jmunoglobulina. Em algumas formas de realização, a parte derivada de IFS contém a caixa ácida. Em algumas outras realizações, a parte de IFS possui a sequência de aminoácidos correspondente à posição 134

7/50 até à posição 162, a posição 145 até à posição 162 ou a posição 151 até à posição 162 de SEQ ID NO: 1, ou a sequência de aminoácidos que partilha, pelo menos, 90% de identidade, de preferência, pelo menos, 80%, 93%, 95%, 97%, 98%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da posição 134 até à posição 162, a posição 145 até à posição 162 ou a posição 151 até à posição 162 de SEQ ID NO: 1.

[014] A presente invenção refere-se ainda a uma proteína de fusão constituída por: o primeiro domínio lg-like (também designado D1) de FGFR ou uma fração deste, a parte derivada da região de sequência funcional intermédia do domínio lg-like de FGFR, o segundo domínio lg-like de FGFR, o terceiro domínio lg-like de FGFR e a região Fc de imunoglobulina. De preferência, o referido domínio D1 ou respectiva fração possui:

a sequência de aminoácidos correspondente à posição 40 até à posição 118 da SEQ ID NO: 1, ou a sequência de aminoácidos que partilha, pelo menos, 70% de identidade, de preferência, pelo menos, 80%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência da posição 40 até à posição 118 de SEQ ID NO: 1; ou a sequência de aminoácidos correspondente à posição 77 até à posição 118 da SEQ ID NO: 1, ou a sequência de aminoácidos que partilha, pelo menos, 70% de identidade, de preferência, pelo menos, 80%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência da posição 77 até à posição 118 de SEQ ID NO: 1.

[015] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma proteína de fusão que compreende ou consiste em: a sequência funcional intermédia do domínio lg-like de FGFR ou uma respectiva fração, o segundo domínio lg-like de FGFR, o terceiro domínio lg-like de FGFR e a região Fc de imunoglobulina, em que:

o segundo domínio lg-like de FGFR possui a sequência de aminoácidos correspondente à posição 163 até à posição 247 da SEQ ID NO: 1, ou a sequência de aminoácidos que partilha, pelo menos, 70% de

8/50 identidade, de preferência, pelo menos, 80%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da posição 163 para a posição 247 de SEQ ID NO: 1 e/ou o terceiro domínio lg-like de FGFR possui a sequência de aminoácidos correspondente à posição 270 até à posição 359 da SEQ ID NO:

I, ou a sequência de aminoácidos que partilha, pelo menos, 70% de identidade, de preferência, pelo menos, 80%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da posição 270 para a posição 359 de SEQ ID NO: 1.

[016] A presente invenção refere-se ainda a uma proteína de fusão que compreende uma região derivada do domínio extracelular de FGFR e a região Fc de imunoglobulina ou é constituída destas, em que a região derivada do domínio extracelular de FGFR:

(1) possui a sequência de aminoácidos como indicado por qualquer uma das posições 358-580 de SEQ ID NO: 9, das posições 304-526 de SEQ ID NO: 10, das posições 278-500 de SEQ ID NO: 11, das posições 246-468 de SEQ ID NO: 12, das posições 235-457 de SEQ ID NO: 13, das posições 229-451 de SEQ ID NO: 14, das posições 224-446 de SEQ ID NO: 15 ou a sequência de aminoácidos indicada codificada pela sequência de nucleotídeos tal como indicado por qualquer uma das posições 1074-1740 de SEQ ID NO: 16, das posições 912-1578 de SEQ ID NO: 17, das posições 8341500 de SEQ ID NO: 18,, das posições 738-1404 de SEQ ID NO: 19, das posições 705-1371 de SEQ ID NO: 20, das posições 687-1353 de SEQ ID NO: 21, das posições 672-1338 de SEQ ID NO: 22.

(2) compreende e consiste na sequência de aminoácidos com uma identidade de pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos tal como indicado por qualquer uma das posições 358-580 da SEQ ID NO: 9, das posições 304-526 de SEQ ID NO: 10, das posições 278-500 de SEQ ID NO:

II, das posições 246-468 de SEQ ID NO: 12, das posições 235-457 de SEQ ID

9/50

NO: 13, das posições 229-451 de SEQ ID NO: 14, das posições 224-446 de SEQ ID NO: 15 ou (3) compreende e consiste na sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos partilhando uma identidade de pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos tal como indicado por qualquer uma das posições 1074-1740 da SEQ ID NO: 16, das posições 9121578 de SEQ ID NO: 17, das posições 834-1500 de SEQ ID NO: 18, das posições 738-1404 de SEQ ID NO: 19, das posições 705-1371 de SEQ ID NO: 20, das posições 687-1353 de SEQ ID NO: 21, das posições 672-1338 de SEQ ID NO: 22.

[017] A presente invenção refere-se ainda a uma proteína de fusão, a qual:

(1) compreende a sequência de aminoácidos indicada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 9-15 ou a sequência de aminoácidos indicada codificada pela sequência de nucleotídeos tal como indicado por qualquer uma de SEQ ID NO: 16-22;

(2) compreende e consiste na sequência de aminoácidos com uma identidade de pelo menos 70%, .de preferência pelo menos 80%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos tal como indicado por qualquer uma de SEQ ID NO: 9-15; ou (3) compreende e consiste na sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos partilhando uma identidade de pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos tal como indicado por qualquer uma de SEQ ID NO: 16-22;

[018] De preferência, na proteína de fusão da presente invenção, a região Fc de imunoglobulina é a região IgG Fc humana e mais preferencialmente, compreende:

a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, ou a sequência de

10/50 aminoácidos que partilha, pelo menos, 70% de identidade, de preferência, pelo menos, 80%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; ou a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos correspondente a SEQ ID NO: 8, ou a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos que partilha, pelo menos, 70% de identidade, de preferência, pelo menos, 80%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 8.

[019] Em uma realização da presente invenção, a região Fc de imunoglobulina encontra-se localizada no terminal-C da proteína de fusão.

[020] De preferência, a presente invenção refere-se a um precursor de proteína de fusão compreende uma região do peptídeo de sinal secretora, por exemplo, região VEGFR1 do peptídeo de sinal, sendo preferível que a região do peptídeo sinal secretor contenha uma sequência de aminoácidos de posição 1 para a posição 26 de SEQ ID NO: 2 ou a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos indicada pela SEQ ID NO: 23. Preferencialmente, o a região do peptídeo sinal encontra-se localizado no terminal-N do precursor.

[021] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma proteína de fusão que compreende sequencialmente, do terminal N ao terminal C: a parte derivada de IFR, D2, D3 e região Fc de imunoglobulina.

[022] Em um outro aspecto, os domínios e/ou regiões envolvidas na proteína de fusão da presente invenção encontram-se diretamente ligadas e/ou através de um ligante. Em uma realização, a região derivada do domínio extracelular de FGFR e a região Fc de imunoglobulina encontram-se diretamente ligadas. Noutra realização, a região derivada do domínio extracelular de FGFR e a região Fc de imunoglobulina encontram-se ligadas por um ligante.

[023] Em um outro aspecto, a proteína de fusão da presente invenção inibe a angiogênese. Em um outro aspecto, a proteína de fusão da presente

11/50 invenção liga FGF, de preferência FGF2, in vivo e/ou in vitro. Em um outro aspecto, a proteína de fusão da presente invenção inibe diretamente as células de tumor.

[024] A presente invenção refere-se ainda a uma proteína de fusão FGFRFc que compreende uma parte derivada do domínio extracelular de FGFR e uma parte derivada da região Fc de imunoglobulina. Em particular, a parte derivada do domínio extracelular de FGFR é a parte derivada do domínio extracelular de FGFR1. De preferência, a região Fc de imunoglobulina é a região Fc de imunoglobulina humana, por exemplo a região Fc IgG humana. Em um aspecto da presente invenção, a proteína de fusão FGFR-Fc da presente invenção tem a capacidade de ligar e/ou antagonizar FGF e, assim, inibir a angiogênese.

[025] Na proteína de fusão FGFR-Fc da presente invenção, a parte derivada do domínio extracelular FGFR pode compreender um ou mais selecionados do grupo que consiste de: domínio D1 ou uma fração deste, a parte derivada de IFS, domínio D2 ou uma fração deste e domínio D3 ou fração deste. Em uma realização, a parte derivada do domínio extracelular de FGFR pode compreender D1 ou uma fração deste, a parte derivada de IFS, domínio D2 e domínio D3. Noutra realização, a parte derivada do domínio extracelular de FGFR pode compreender a parte derivada de IFS, domínio D2 e domínio D3 e preferencialmente a parte derivada de IFS possui a sequência de aminoácidos correspondente à posição 134 até à posição 162, a posição 145 até à posição 162 ou a posição 151 até à posição 162 de SEQ ID NO: 1. Em algumas realizações preferidas, a proteína de fusão FGFR-Fc da presente invenção não contém D1 ou uma fração deste. Em algumas outras realizações preferíveis, a proteína de fusão FGFR-Fc da presente invenção não contém qualquer parte de IFS para além da sequência de aminoácidos correspondente à posição 134 até à posição 162, a posição 145 até à posição 162 ou a posição 151 até à posição 162 de SEQ ID NO: 1.

[026] Em algumas realizações da presente invenção, a ordem do terminal12/50

N para o terminal-C de qualquer região e/ou cada domínio envolvido na proteína de fusão FGFR-Fc pode encontrar-se presente por qualquer ordem. Em algumas outras realizações, a referida ordem pode ser a apresentada na Fig. 1. Em algumas outras realizações, a referida ordem pode ser diferente da apresentada na Fig. 1.

[027] Em algumas realizações, a proteína de fusão FGFR-Fc da presente invenção inclui ainda uma ou mais ligações de dissulfureto intracadeia e compreende preferencialmente uma ou mais ligações dissulfureto intracadeia no domínio lg-like.

[028] Em um aspecto da presente invenção, a proteína de fusão FGFR-Fc pode ser produzida pela expressão do ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos indicada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16-22 em uma linha celular de mamíferos. Em particular, a linha celular de mamíferos pode se a linha celular CHO.

[029] Adicionalmente, uma proteína de fusão FGFR-Fc é igualmente apresentada na presente invenção, em que os domínios e/ou regiões envolvidas na proteína de fusão da presente invenção encontram-se ligadas operacionalmente e/ou através de um ligante.

[030] Ainda noutro aspecto da presente invenção, é apresentada uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica a proteína de fusào ou o precursor da proteína de fusão da presente invenção De preferência, a molécula de ácido nucleico inclui a sequência de nucleotídeo indicada por qualquer um dos SEQ ID NOs: 16-22;

[031] Em um outro aspecto da presente invenção, é apresentado um vetor que inclui a molécula de ácido nucleico da presente invenção.

[032] Ainda noutro aspecto da presente invenção, são apresentadas células, de preferência células CHO, transfectadas pelo vetor.

[033] Na presente invenção, é apresentada uma composição que inclui a proteína de fusão da presente invenção, a qual é misturada com um veículo farmaceuticamente aceitável.

13/50 [034] Na presente invenção, é apresentada uma composição farmacêutica que inclui a proteína de fusão, a molécula de ácido nucleico, o vetor ou as células da presente invenção, assim como um veículo farmaceuticamente aceitável.

[035] Noutro aspecto da presente invenção, é apresentado um método para a produção da proteína de fusão inibidora da angiogênese, que é alcançado através da expressão da proteína de fusão da presente invenção em células procariotas ou eucariotas, especialmente em linhagens de células de mamífero.

[036] A presente invenção refere-se ainda a um método para a produção da proteína de fusão inibidora da angiogênese, que é alcançado através da expressão da molécula de ácido nucleico da presente invenção em linhagens de células de mamífero. De preferência, a linhagem de células de mamíferos pode ser a linhagem de células CHO.

[037] Ainda noutro aspecto da presente invenção, é apresentado o método para inibição de angiogênese, que inclui a administração de quantidade eficaz para inibir a angiogênese da proteína de fusão FGFR-Rc, a molécula de ácido nucleico, vetor que compreende a molécula de ácido nucleico e/ou, a composição farmacêutica compreendendo qualquer um dos anteriores de acordo com a presente invenção ao sujeito em necessidade da mesma. De preferência, o método é executado em mamíferos.

[038] Ainda noutro aspecto da presente invenção, é apresentado de tratamento ou prevenção de tumores em mamíferos, que inclui a administração de quantidade com eficácia terapêutica ou preventiva da proteína de fusão FGFR-Rc, da proteína codificadora da molécula de ácido nucleico, do vetor que compreende a molécula de ácido nucleico e/ou, a composição farmacêutica compreendendo qualquer um dos anteriores de acordo com a presente invenção ao sujeito em necessidade da mesma e preferencialmente o tumor é um tumor sólido.

[039] Ainda noutro aspecto da presente invenção, é apresentado de

14/50 tratamento ou prevenção de doenças relacionadas com angiogênese oftálmica, que inclui a administração de quantidade com eficácia terapêutica ou preventiva da proteína de fusão FGFR-Rc, da proteína codificadora da molécula de ácido nucleico, do vetor que compreende a molécula de ácido nucleico e/ou, a composição farmacêutica compreendendo qualquer um dos anteriores de acordo com a presente invenção ao sujeito em necessidade da mesma e preferencialmente a doença relacionada com a angiogenes oftálmica é a degenerescência macular senil.

[040] A presente invenção refere-se ainda à utilização da proteína de fusão FGFR-Fc, da molécula de ácido nucleico que codifica a referida proteína, o vetor que inclui a molécula de ácido nucleico e/ou uma composição farmacêutica compreendendo qualquer uma das referidas de acordo com a presente invenção na produção dum medicamento para inibir a angiogênese. Além disso, a presente invenção refere-se ainda à utilização da proteína de fusão FGFR-Fc, da molécula de ácido nucleico que codifica a referida proteína, o vetor que inclui a molécula de ácido nucleico e/ou uma composição farmacêutica compreendendo qualquer uma das referidas de acordo com a presente invenção na produção dum medicamento para o tratamento ou prevenção de doenças relacionadas com a angiogênese e preferencialmente a doença relacionada com a angiogênese é um tumor ou uma doença relacionada com a angiogênese oftálmica.

[041] Face a diferentes disposições para o objeto protegido nos sistemas de patentes de diferentes países, esta divulgação apresenta ainda utilizações farmacêuticas que correspondem aos métodos acima referidos e medicamentos para as utilizações pretendidas. Estas várias utilizações farmacêuticas e medicamentos são igualmente cobertos pelo âmbito de proteção da presente invenção, como se encontram já particularmente descritos na presente divulgação.

[042] Nesta divulgação, são apenas ilustradas algumas realizações que reivindicam proteção e a título de exemplo. Nestas realizações as

15/50 características técnicas descritas em uma ou mais propostas técnicas podem ser combinadas com qualquer uma ou mais propostas técnicas. Estas propostas técnicas obtidas por combinação estão igualmente cobertas pelo âmbito de proteção do pedido de patente, como se estas propostas técnicas obtidas por combinação se encontrassem já particularmente descritas na divulgação.

[043] Com referência às figuras e descrição em maior detalhe que se segue, a presente invenção será ilustrada apenas a título de exemplo. Deverá ser entendido que a descrição abaixo é apenas ilustrada a título de exemplo para as pospostas técnicas que reivindicam proteção pela presente invenção e que não são entendidas como qualquer limitação nestas propostas. O âmbito de proteção da presente invenção será definido pelas reivindicações anexas. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [044] Fig. 1 é uma representação estrutural da proteína de fusão FGFRFc. A proteína de fusão FGFR1-Fc é representada por uma linha sólida e o aminoácido eliminado é representado a tracejado; o domínio tipo-anticorpo é representado por um círculo; diferentes domínios tipo-anticorpo são representados pelos números 1-3; a ligação de dissulfureto é representada por s; lgG1 Fc humana é representada por uma caixa cinzenta; o peptídeo sinal VEGFR1 é representado por SP; a sequência de ligação (G4S)3 é representada por três caixas diamante; a sequência de caixa ácida é representada por uma caixa com a letra AB.

[045] Fig. 2 mostra a comparação da ligação FGF-2 entre várias proteínas de fusão FGFR1-Fc. Ligação de heparina (100 ng/mL) contendo FGF-2 (50 ng/mL) ou FGF-2 (50 ng/mL) apenas a cada proteína de fusão FGFR1-Fc (20 ng/mL) detectada por meio de ELISA.

[046] Fig. 3 mostra SDS-PAGE da proteína de fusão FGFR1 -Fc 26#.

[047] Fig. 4 apresenta a ligação de FGF-2 a uma concentração gradiente da proteína de fusão FGFR1-Fc 26#.

[048] Fig. 5 mostra a afinidade entre a proteína de fusão FGFR1-Fc 26# e

16/50

FGF-2.

[049] Fig. 6 mostra o efeito da proteína de fusão FGFR1 -Fc 26# na divisão celular HUVEC induzida FGF-2.

DESCRIÇÃO DAS REALIZAÇÕES PREFERIDAS

Definições [050] Salvo indicação contrária, todos os termos científicos presentemente utilizados têm o mesmo significado como comummente entendido pelos especialistas na técnica. No que respeita às definições e termos na técnica, os especialistas na técnica deverão fazer referência a Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel) . O código padrão de três e/ou uma letra utilizado para expressar um de 20 L-aminoácidos comuns na técnica é adotado como abreviatura de resíduos de aminoácidos.

[051] Embora os números variem e sejam apresentados valores de parâmetros aproximados em uma ampla variedade na presente invenção, todos os números/valores apresentados nos exemplos específicos são descritos com a maior precisão possível. No entanto, existem alguns erros essencialmente nos valores em uméricos, os quais podem ser resultado de desvio padrão durante a avaliação de cada um deles. Mais ainda, deverá ser entendido que todas as variações presentemente divulgadas englobam toda e qualquer sub-variação possível nas mesmas contida. Por exemplo, deverá ser entendido que a variação “de 1 a 10”, tal como presentemente descrito, engloba toda e qualquer sub-variação possível entre o mínimo 1 e o máximo 10 (incluindo os pontos finais), isto é, todas as sub-variações iniciadas a partir do mínimo 1 ou mais, por exemplo, 1 a 6.1 e todas as sub-variações terminadas no máximo 10 ou menos, por exemplo, 5.5 a 10. Para além disso, deverá ser entendido que qualquer referência referida como “presentemente incluída” é incluída na sua totalidade.

[052] Mais ainda, deverá ser considerado que salvo indicação expressa em contrário, a forma singular inclui referência plural, tal como utilizado na presente invenção. Os termos “ou” e o termo “e/ou” são utilizados

17/50 altemadamente, salvo indicação expressa em contrário no seu contexto.

[053] Tal como presentemente utilizado, o termo ”Fc”, região Fc”, “fragmento Fc” ou “região Fc da imunoglobulina” refere-se ao fragmento cristalizável de imunoglobulina e, na presente invenção, esta região Fc é preferencialmente a região Fc lgG1 humana.

[054] O termo “proteína de fusão Fc” refere-se à molécula tipo-anticorpo, a qual inclui a especificidade de ligação duma proteína heteróloga e a função efetora duma região constante duma imunoglobulina. No termo de estrutura molecular, uma proteína de fusão Fc inclui a sequência de aminoácidos com a especificidade de ligação exigida e a sequência duma região constante duma imunoglobulina. Uma molécula de proteína de fusão Fc inclui normalmente um local de ligação dum receptor ou ligante. A sequência de região constante de imunoglobulina pode ser derivada de qualquer imunoglobulina, por exemplo, de sub-tipo lgG-1, lgG-2, lgG-3 ou lgG-4, IgA (incluindo lgA-1 e lgA-2), IgE, IgD ou IgM.

[055] O termo proteína “solúvel” tal como presentemente utilizado, referese à proteína que pode ser dissolvida em uma solução aquosa a uma temperatura biologicamente relevante, nível pH e pressão osmótica. Pretendese que a “proteína de fusão solúvel”, tal como presentemente utilizada, signifique que a proteína de fusão não contém uma região transmembrana ou uma região intracelular.

[056] Tal como presentemente utilizado, o termo “isolado” refere-se à seguinte substância e/ou entidade: (1) que é isolada de, pelo menos, alguns componentes, que se encontram presentes quando inicialmente produzida (em um ambiente natural e/ou em um aparelho experimental) e relacionados com a mesma e/ou (2) que é produzida, preparada e/ou fabricada artificialmente. A substância isolada e/ou entidade pode ser isolada de, pelo menos, aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%,

18/50 aproximadamente 95%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99%, substancialmente 100% ou 100% de outros componentes inicialmente relacionados com a mesma.

[057] O termo “parte” e “fragmento” refere-se alternadamente a uma parte de polipeptídeo, ácido nucleico ou outra construção molecular.

[058] O termo “domínio lg-like”, tal como presentemente utilizado, referese ao domínio imunoglobulina-like, o qual pode ser encontrado em uma pluralidade de famílias de proteínas e envolvido em inúmeras funções biológicas, incluindo reconhecimento de célula-célula, receptor de superfície celular, função imune e semelhantes.

[059] O fator de crescimento do fibroblasto (FGF) é uma família do fator de crescimento ligado à heparina, o qual possui 22 membros de famílias nos mamíferos (FGF 1-14, 16-23). FGF possui muitas funções biológicas importantes, tais como, multiplicação de células, diferenciação, migração, angiogênese e tumorigênese. FGF exerce inúmeras funções biológicas ao ligar e ativar o receptor FGF de superfície celular (FGFR). (ver por exemplo, Eswarakumar et al. Cytokine Growth Factor Rev. 16: 139-149, 2005). Ο receptor do fator de crescimento fibroblasto (FGFR) é o receptor que liga os membros da família do fator de crescimento do fibroblasto. Uma parte do receptor do fator de crescimento fibroblasto é envolvida no processo de doença. Nos mamíferos, existe 4 genes FGFR: fgfR1-fgfR4. O receptor do fator de crescimento fibroblasto é composto de domínio extracelular, domínio transmembrana e domínio intracelular. Existem muitos membros da família de FGFR que são diferentes uns dos outros em termos de propriedades de ligações de ligantes e domínios quinase. No entanto, os domínios extracelulares dos mesmos são semelhantes. O primeiro domínio lg-like, o segundo domínio lg-like e o terceiro domínio lg-like e existe igualmente um sequência que se encontra contida entre o primeiro e o segundo domínio lglike. o primeiro domínio lg-like, o segundo domínio lg-like e o terceiro domínio lg-like e existe igualmente um sequência que se encontra contida entre o

19/50 primeiro e o segundo domínio lg-like. Esta sequência contida entre o primeiro e o segundo domínio lg-like é presentemente referida como a região de sequência funcional intermédia do domínio lg-like do FGFR. Esta região de sequência de regulação intermédia compreende uma região de aminoácidos ácidos, referidos como caixa ácida (AB).

[060] Tal como presentemente utilizado, o termo “o primeiro domínio lglike” ou “o primeiro domínio lg-like de FGFR1” refere-se ao primeiro domínio lglike na proteína FGFR ou do terminal-N, o qual tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos que corresponde à posição 40 para a posição 118 de SEQ ID NO: 1. De modo idêntico, o termo “o segundo domínio lg-like de FGFR” ou “o segundo domínio lg-like de FGFR1” refere-se ao segundo domínio lg-like na proteína FGFR ou FGFR1 do terminal-N, o qual tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos que corresponde à posição 163 para a posição 247 de SEQ ID NO: 1; o termo “o terceiro domínio lg-like de FGFR” ou “o terceiro domínio lglike de FGFR1” refere-se ao primeiro domínio lg-like na proteína FGFR ou FGFR1 do terminal-N, o qual tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos que corresponde à posição 270 para a posição 359 de SEQ ID NO: 1. Preferencialmente, o FGFR é FGFR1 e o primeiro domínio lg-like de FGFR é o primeiro domínio lg-like de FGFR1 e o segundo domínio lg-like de FGFR é o segundo domínio lg-like de FGFR1, e o terceiro domínio lg-like de FGFR é o terceiro domínio lg-like de FGFR1.

[061] Uma parte da sequência de hFGFRI é apresentada como segue, na qual cada domínio lg-like é apresentado em área sombreada, vide http: //http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Drotein/AAH15035.1 [062] MWSWKCLLFWAVLVTATLCTARPSPTLPEQAQPWGAPVEVESFL liO’GDLLQLRCflH^iMSINWLRDGVQLAESNRTRITGEEVEVQDSVPADS GLYACVTSSPSGSDTTYFSVNVSDALPSSEDDDDDDDSSSEEKETDNTKPNP VAPYWTSPEKMEKKH^P^^SKÊKÇPSSM8ÕTPNPTLRyyLKN®SB ERIGGY^RVA^SnM^gfflgKGN^ÍyÊNEYGSiNH^ÍLDWgRSP H R PILQ AG LP AN KTVALGSS^MCKWG^QPHÍQWLKHÍEVNG SKl G P300O

20/50 kpyVqilktagvnttdkemevlhlrnvsfedageytclagnsiglshhsawl

TVLEALEER [063] A sequência de- aminoácido de FGFR1 pode ser encontrada em SEQ ID NO: 1, e sua sequência cADN pode ser encontrada em SEQ ID NO: 4.

[064] Tal como presentemente utilizado, o termo “a região da sequência funcional intermédia do domínio lg-like de FGFR” ou “a sequência funcional intermédia do domínio lg-like de FGFR” ou “IFS” refere-se à sequência entre o primeiro domínio lg-like e o segundo domínio lg-like na proteína FGFR e, de preferência, a sequência IFS possui a sequência de aminoácido correspondente à posição 118 para a posição 162 de SEQ ID NO: 1. Inesperadamente, foi descoberto pelo autor da presente invenção que existe um efeito significativo da região da sequência funcional intermédia na função do domínio lg-like. Em algumas realizações da presente invenção, a proteína de fusão FGFR que inclui várias partes de vários comprimentos derivadas da região de sequência funcional intermédia e com particular preferência, a parte derivada da região de sequência funcional intermédia não contém qualquer caixa ácida. Mais preferencialmente, a parte derivada de IFS possui a sequência de aminoácidos correspondente à posição 134 até à posição 162, a posição 145 até à posição 162 de SEQ ID NO: 1. A proteína FGFR é preferencialmente FGFR1 (SEQ ID NO: 1) principalmente a proteína humana FGFR1. A sequência de aminoácidos da proteína humana FGFR1 pode ser encontrada na SEQ ID NO: 1, e sua sequência cADN pode ser encontrada em SEQ ID NO: 4.

[065] O termo FGFR, tal como presentemente utilizado, refere-se ao receptor do fator de crescimento do fibroblasto, o qual pode ser FGFR1, FGFR2, FGFR3 e/ou VEGFR4. De preferência, o FGFR na presente invenção é FGFR1 e, preferencialmente, é FGFR1 humano.

[066] Tal como presentemente utilizado, pretende-se que o termo “variante degenerada” signifique que a variante degenerada inclui uma alteração degenerada na terceira posição do codão de aminoácido de modo a que as

21/50 variantes degeneradas codifiquem o mesmo aminoácido, por exemplo, a posição de oscilação dum código triplo que inclui uma ou mais variantes alteradas (também referidas como sinônimo de variante).

[067] Tal como presentemente utilizado, o termo “sujeito” refere-se a mamíferos, tal como humano. No entanto, podem também ser outros animais, tais como animais domésticos (tal como, cão e gato, etc.), criações de animais (tais como, bovinos, ovelhas, porcos e cavalos, etc.) ou animais de laboratório (tais como, macacos, ratos, ratinhos, coelhos e porquinhos da índia, etc).

[068] Tal como presentemente utilizado, o termo “percentagem de identidade”, “homologia” ou “identidade” refere-se à sequência de identidade entre duas sequências de aminoácidos ou sequências de ácido nucleico. A percentagem de identidade pode ser determinada pelo alinhamento entre duas sequências e a percentagem de identidade refere-se à quantidade do mesmo resíduo (isto é, aminoácido ou nucleotídeo) na mesma posição na sequência alinhada. O alinhamento da sequência e comparação pode ser realizado utilizando algoritmos padrão na técnica (por exemplo Smitha and Waterman, 1981, Adv. Appl . Math. 2. 482; Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48 ) 443; Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 2444) ou por versões informatizadas destes algoritmos (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wl). Estas versões informatizadas publicamente disponíveis são BLAST e FASTA. Para além disso, a ENTREZ disponível através de National Institutes of Health (Bethesda MD) pode ser utilizada para o alinhamento da sequência. Quando se utilize a BLAST e GAP-BLAST, podem ser utilizados parâmetros por defeito para cada programa (por exemplo, BLASTN, disponível no website da National Center for Biotechnology Information). Em uma realização, a percentagem de identidade entre duas sequências pode ser determinada utilizando GCG com um intervalo de peso de 1 por forma a que o peso existente de cada intervalo de aminoácido pareça tratar-se de um desajustamento único do aminoácido entre duas sequências. Alternativamente,

22/50 pode ser utilizado o ALIGN (versão 2.0), que é uma parte do GCG (Accelrys, San Diego, CA) Sequence Alignment Software Package.

[069] Tal como presentemente utilizado, o termo hibridação” refere-se ao processo pelo qual um polinucleotídeo estável de cadeia dupla é formado por ligação não covalente entre dois polinucleotídeos de cadeia simples. O termo hibridação” pode igualmente referir-se a hibridação de cadeia tripla. O polinucleotídeo de cadeia dupla (normalmente) produzido é o “híbrido” ou “duplex”. A condição para hibridação inclui normalmente uma concentração de sal inferior a aproximadamente 1 M, e mais normalmente, inferior a aproximadamente 500 mM, e inferior a aproximadamente 200 mM. A temperatura da hibridação pode ser tão baixa quanto 5°C, mas é normalmente superior a aproximadamente 22°C e mais normalmente superior a aproximadamente 30°C e, de preferência, superior a aproximadamente 37°C. A hibridação é normalmente conduzida sob condições restritas (isto é, condições sob as quais a sonda irá hibridizar para a sua sequência alvo). Condições rígidas de hibridação estão dependentes da sequência e serão variadas mediante condições diferentes. Será possivelmente necessária uma temperatura de hibridação mais elevada para segmentos maiores para hibridação específica. Uma vez que o rigor de hibridação pode ser influenciado por outros fatores (incluindo composição base comprimento da cadeia complementar, a presença de solvente orgânico e o grau de desajustamento base), a combinação de parâmetros é mais importante que o valor absoluto de qualquer parâmetro simples. Normalmente, a condição rigorosa é selecionada como 5°C abaixo da Tm da sequência sob determinada força iônica e pH. Condições rigorosas exemplares incluem pH 7.0 a 8.3, concentração de íon sódio (ou outros sais) de, pelo menos, 0,01 M a não mais do que 1 M e temperatura de, pelo menos, 25°C. Para condições rigorosas, vide, por exemplo, Sambrook, Fritsche and Maniatis “Molecular Cloning A laboratory Manual”, 2^a edição, Cold Spring Harbor Press (1989) and Anderson “Nucleic Acid Hybridization”, T edição, BIOS Scientific Publishers Limited (1999), que

23/50 estão presentemente incluídos como referência para todos os efeitos acima mencionados.

[070] Tal como presentemente utilizado, o termo “ligante”, “ligante peptídeo”, “sequência de ligação” ou “sequência do ligante refere-se a uma sequência pequena de aminoácidos, através da qual domínio e/ou região individual envolvida na presente proteína de fusão se encontra ligada e o comprimento da pequena sequência de aminoácidos é normalmente 0-20 aminoácidos e, de preferência 2-10 aminoácidos.

[071] Tal como presentemente utilizado, o termo “sequência de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: N em uma proteína de fusão ou parte ou domínio é suposto significar que a referida proteína de fusão ou parte ou domínio possui substancialmente a sequência de aminoácidos tal como indicado em SEQ ID NO: N e, de preferência, contém não mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 10 ou 20 substituições, adições e supressão de aminoácidos, e ainda preferencialmente a referida proteína de fusão partilha, pelo menos, 80%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: N e, mais preferencialmente, a referida proteína de fusão ou parte ou domínio possui a sequência de aminoácidos tal como indicado em SEQ ID NO: N.

[072] Tal como presentemente utilizado, o termo “proteína de fusão FGFRFc” refere-se a uma proteína de fusão que inclui a parte derivada do domínio extracelular de FGFR e a parte da região Fc de imunoglobulina, em que a parte derivada do domínio extracelular de FGFR pode: (1) compreender a sequência de aminoácidos com uma identidade de pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos tal como indicado por qualquer uma de SEQ ID NO: 9-15 ou constituída pelas mesmas; (2) compreender a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos com uma identidade de pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos tal como indicado por

24/50 qualquer uma de SEQ ID NO: 16-22 ou constituída pelas mesmas; ou (3) possuir a sequência de aminoácidos indicada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 9-15 ou a sequência de aminoácidos indicada codificada pela sequência de nucleotídeos tal como indicado por qualquer uma de SEQ ID NO: 16-22;

[073] Em algumas realizações preferidas, a proteína de fusão FGFR-Fc pode ser codificada pelo ácido nucleico, no qual a sequência de nucleotídeos codificadora da parte derivada do domínio extracelular de FGFR compreende a sequência em que a sequência complementar é hibridizada com a sequência de nucleotídeos tal como indicado por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16-22 mediante condições rigorosas ou incluindo a variante degenerada da sequência de nucleotídeos tal como indicado por qualquer uma das SEQ ID Nos: 16-22; Em algumas realizações preferidas, a sequência de nucleotídeos codificadora da região Fc de imunoglobulina compreende a sequência em que a sequência complementar é hibridizada com a sequência de nucleotídeos tal como indicado na SEQ ID NO: 8 mediante condições rigorosas ou incluindo a variante degenerada da sequência de nucleotídeos indicada por SEQ ID NO: 8. [074] Noutra realização preferível, a proteína de fusão FGFR-Fc inclui a variante da proteína de fusão FGFR-Fc. Em uma realização, a variante inclui a variante que não contém mais de 2, 3, 4, 5 ou 10 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos na parte derivada de IFS correspondente à sequência de aminoácidos indicada pela posição 134 até à posição 162, a posição 145 até à posição 162 ou a posição 151 até à posição 162 de SEQ ID NO: 1 e preferencialmente a variante retém a capacidade inibidora da angiogênese. Noutra realização, a variante inclui a variante que não contém mais de 2, 3, 4, 5, 10 ou 20 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos no domínio D2 correspondente à sequência de aminoácidos indicada pela posição 163 até à posição 247 de SEQ ID NO: 1 e preferencialmente a variante retém a capacidade inibidora da angiogênese. Noutra realização, a variante inclui a variante que não contém mais de 2, 3, 4, 5, 10 ou 20 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos no domínio

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D3 correspondente à sequência de aminoácidos indicada pela posição 270 até à posição 359 de SEQ IQ NO: 1 e preferencialmente a variante retém a capacidade inibidora da angiogênese. Em uma outra realização, a substituição, adição ou supressão encontra-se localizada na parte derivada da região Fc de imunoglobulina.

[075] Para além das modificações que ocorrem naturalmente na parte derivada do domínio extracelular de FGFR e na parte derivada da região Fc de imunoglobulina, podem igualmente incluir-se outras modificações pós translacionais na proteína de fusão FGFR-Fc. Estas modificações incluem, mas não se limitam a, acetilação, carboxilação, glicosilaçào, fosforilação, esterificação e acilaçâo. Consequentemente, componentes não aminoácidos podem ser incluídos na proteína de fusão FGFR-Fc modificada, por exemplo, polietilenoglicol, lípidos, polissacarídeo ou monossacarídeo e ácido fosfórico. O efeito destes componentes não aminoácidos na função da proteína de fusão FGFR-Fc pode ser testado tal como descrito para outras variantes de proteína de fusão FGFR-Fc aqui presentes. Quando a proteína de fusão FGFR-Fc é produzida em uma célula, o processamento pós-tradução é também possivelmente importante para dobragem correta e/ou função da proteína. Existem máquinas celulares especiais e mecanismos úteis em células diferentes (por exemplo, CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 ou HEK293) para estas atividades pós translacionais e podem ser selecionados células diferentes para efeitos de certificação de modificação correta e processamento da proteína de fusão FGFR-Fc.

[076] A proteína de fusão, tal como presentemente descrita, pode ser produzida por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, pode ser produzida por síntese química ou a partir de expressão de ácido nucleico. Os peptídeos utilizados na presente invenção podem ser facilmente preparados de acordo com o líquido padrão estabelecido ou, de preferência, método de síntese de peptídeos em fase sólida conhecido na técnica (vide, por exemplo, J. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2^a edição,

26/50

Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984), in M. Bodanzsky, and A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984)). A proteína de fusão pode ser produzida pelas técnicas conhecidas na técnica de modo a que uma ou mais ligações cruzadas intramoleculares possam ser formadas entre resíduos de cisteínas localizados na sequência do polipeptídeo que se espera existir na proteína (vide, por exemplo, patente americana No. 5478925). Além disso, podem ser realizadas modificações gerais à proteína presentemente descrita ao se adicionar cisteína ou biotina ao terminal-C ou terminal-N da proteína.

[077] Tal como presentemente utilizado, quantidade terapeuticamente eficaz ou quantidade eficaz refere-se à dosagem que é suficiente para mostrar o benefício ao sujeito a quem é administrada a mesma. A dosagem atualmente administrada, a taxa e o curso de tempo de administração estão dependentes da condição do doente e da gravidade da doença. Finalmente, o médico é responsável pela prescrição (por exemplo, decisão sobre a dosagem, etc) e tomará uma decisão para o tratamento, normalmente ao considerar a doença tratada, condição individual do doente, a posição de aplicação, o método para administração e outros fatores conhecidos do médico.

[078] É construída uma série de proteínas de fusão isoladas solúveis de FGFR-Fc pelo autor da invenção, a qual pode ligar FGF inibir eficazmente a divisão da célula induzida por FGF. A proteína de fusão inclui preferencialmente: a parte derivada de IFS, D2, D3 e região Fc de imunoglobulina.

[079] Inesperadamente, o autor da presente invenção constatou também que a ligação de FGF pela proteína de fusão é significativamente influenciada pelo comprimento da parte derivada de IFS. Por conseguinte, em algumas realizações da presente invenção, as proteínas de fusão incluindo partes derivadas de IFS de diferentes comprimentos. Preferencialmente, a parte derivada de IFS não inclui caixa ácida e mais preferencialmente possui a sequência de aminoácidos correspondente à posição 134 até à posição 162, a

27/50 posição 145 até à posição 162 e a posição 151 até à posição 162 de SEQ ID NO: 1. Em algumas realizações preferíveis, a parte derivada de IFS inclui a proteína de fusão correspondente à posição 145 até à posição 162 de SEQ ID NO: 1, a qual possui uma afinidade FGF extremamente elevada e pode particularmente, inibir com eficácia a divisão celular induzida por FGF.

[080] Em algumas realizações da presente invenção, é apresentada uma proteína de fusão FGFR-Fc solúvel, a qual inclui: D1, uma parte derivada de IFS, D2, D3 e região Fc de imunoglobulina. Preferencialmente, a parte derivada de IFS nào inclui caixa ácida e mais preferencialmente possui a sequência de aminoácidos correspondente à posição 134 até à posição 162, a posição 145 até à posição 162 e a posição 151 até à posição 162 de SEQ ID NO: 1.

[081] Em algumas outras realizações da presente invenção, é apresentada uma proteína de fusão FGFR-Fc solúvel, a qual inclui: uma parte D1, uma parte derivada de IFS, D2, D3 e região Fc de imunoglobulina. Preferencialmente, a parte derivada de IFS não inclui caixa ácida e mais preferencialmente possui a sequência de aminoácidos correspondente à posição 134 até à posição 162, a posição 145 até à posição 162 e a posição 151 até à posição 162 de SEQ ID NO: 1.

[082] Em algumas outras realizações da presente invenção, é apresentada uma proteína de fusão FGFR-Fc solúvel, a qual inclui: uma parte derivada de IFS, D2, D3 e,região Fc de imunoglobulina. Preferencialmente, a parte derivada de IFS não inclui caixa ácida e mais preferencialmente possui a sequência de aminoácidos correspondente à posição 134 até à posição 162, a posição 145 até à posição 162 e a posição 151 até à posição 162 de SEQ ID NO: 1.

[083] Em algumas outras realizações da presente invenção, é apresentada uma proteína de fusão FGFR-Fc solúvel, a qual é sequencialmente constituída por, do terminal N até ao terminal C, uma parte derivada de IFS, D2, D3 e região Fc de imunoglobulina. Preferencialmente, a parte derivada de IFS não inclui caixa ácida e mais preferencialmente possui a

28/50 sequência de aminoácidos correspondente à posição 134 até à posição 162, a posição 145 até à posição 162 e a posição 151 até à posição 162 de SEQ ID NO: 1.

[084] Em algumas outras realizações da presente invenção, é apresentada uma proteína de fusão FGFR-Fc solúvel, a qual pode inibir direta ou indiretamente células de tumor. Preferencialmente, a proteína de fusão FGFR-Fc da presente invenção inibe diretamente as células de tumor. Mais preferencialmente, o crescimento de células de tumor é inibida pela proteína de fusão FGFR-Fc da presente invenção em pelo menos, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 80%, 90%, 95%, etc. As células de tumor podem ser células de qualquer tumor, por exemplo leucemia, cancro do pulmão, cancro hepático, cancro da cabeça ou pescoço, cancro do estômago, cancro da bexiga, carcinoma do cérvix uterino, etc. Particularmente, a inibição é alcançada pela ligação direta a células do tumor.

[085] Em algumas realizações, a presente invenção inclui a utilização de (i) proteína de fusão FGFR-Fc, ou (ii) o polinucleotídeo que codifica esta proteína de fusão na preparação de composições ou medicamentos para o tratamento de doenças mediadas por ou relacionadas com angiogênese. Por exemplo, em uma realização, a presente invenção inclui a utilização de (i) proteína de fusão FGFR-Fc, ou (ii) polinucleotídeo que codifica esta proteína de fusão na preparação de medicamentos como inibidores de angiogênese.

[086] Em algumas realizações, a proteína de fusão FGFR-Fc, de acordo com a presente invenção, pode ser produzida pela expressão da sequência de nucleotídeos tal como indicado por qualquer uma das SEQ ID Nos: 16-22 em uma linha celular de mamíferos. Em particular, a linha celular de mamíferos pode se a linha celular CHO.

[087] Mais ainda, é apresentada, na presente invenção, a proteína de fusão FGFR-Fc tal como abaixo descrito, na qual uma parte derivada do domínio extracelular de FGFR pode ser fundida com a região Fc de imunoglobulina com ou sem um ligante.

29/50 [088] Em algumas outras realizações, a presente invenção inclui moléculas de ácido nucleico isoladas codificadoras da proteína de fusão FGFRFc e a presente invenção inclui igualmente a utilização destas moléculas na produção do medicamento. O ácido nucleico pode ser recombinante, sintético ou produzido por qualquer dos métodos disponíveis na técnica e o método inclui clonagem por meio da utilização duma técnica standard.

[089] Em algumas outras realizações, a presente invenção inclui um vetor que compreende a molécula de ácido nucleico isolada da presente invenção. O vetor pode ser um vetor expressão, no qual o ácido nucleico é ligado de modo operacional a uma sequência de controlo, a qual tem capacidade de facultar a expressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira. Pode ser utilizada uma pluralidade de vetores. Por exemplo, vetores adequados podem incluir vírus (por exemplo, poxvirus, adenovirus, baculovírus, etc.), vetor levedura, bacteriófago, cromossoma, cromossoma artificial, plasmídeo, cosmídeo.

[090] Em algumas realizações, a presente invenção inclui ainda as células transfectadas por estes vetores de modo a que a proteína de fusão FGFR-Fc seja expressa. A célula hospedeira adequada para a presente invenção pode ser célula procariota ou célula eucariota. Estas incluem bactérias, por exemplo, E. coli, levedura, células de insetos e células de mamíferos. As linhas celulares de mamíferos que podem ser utilizadas incluem, mas não se limitam a, célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO), célula de rim de hamster bebê, célula de mieloma de rato NS0, linhas celulares humanas e de macacos, e linhas celulares derivadas dos mesmos, etc.

[091] Em um outro aspecto da presente invenção, é apresentado um método para inibição de angiogênese, que inclui a administração da proteína de fusão -FGFR-Fc da presente invenção a um sujeito em necessidade da mesma. De preferência, o método é executado em mamíferos.

[092] Em um outro aspecto da presente invenção, é apresentado um método para ligar FGF e/ou VEGF in vitro ou in vivo que inclui estabelecer o contacto entre FGF e a proteína de fusão da presente invenção.

30/50 [093] Em um outro aspecto’ da presente invenção, é apresentado um método para o tratamento ou prevenção de tumores nos mamíferos, compreendendo a administração da proteína de fusão FGFR-Fc da presente invenção ao indivíduo necessitado deste e preferencialmente o tumor é um tumor sólido.

[094] Em um outro aspecto da presente invenção, é apresentado um método para o tratamento ou prevenção de doenças relacionadas com a angiogênese oftálmica nos mamíferos, compreendendo a administração da proteína de fusão FGFR-Fc da presente invenção ao indivíduo necessitado deste e preferencialmente a doença relacionada com a angiogênese oftálmica é degenerescência macular relacionada com a idade.

[095] A presente invenção refere-se igualmente à utilização de da proteína de fusão FGFR-Fc na preparação de medicamentos para a inibição da angiogênese. Além disso, a presente invenção refere-se igualmente à utilização de da proteína de fusão FGFR-Fc na preparação de medicamentos para o tratamento ou prevenção de doenças relacionadas com a angiogênese e, preferencialmente as doenças relacionadas com a angiogênese são tumores ou doenças relacionadas com a angiogênese oftálmica.

[096] As doenças relacionadas com a angiogênese descritas na presente invenção incluem, sem constituir limitação, cancros dependentes da angiogênese, compreendendo, por exemplo, tumores sólidos, tumores hematogênicos (por exemplo leucemia) e metástases tumorais; tumores benignos, por exemplo, angioma, neuroma acústico, neurofibroma, tracoma e granuloma piogênico; artrite reumatóide, psoríase, rubeose, síndroma de OslerWebber, angiogênese do miocárdio, neovascularização da placa, telangiectasia, articulação hemofílica e angiofibroma.

[097] Em algumas realizações dos métodos descritos, uma ou mais proteínas de fusão FGFR-Fc pode ser administrada conjuntamente (simultaneamente) ou em um momento diferente (sequencialmente). Além disso, a proteína de fusão pode ser administrada conjuntamente com um

31/50 medicamento adicional utilizado no tratamento do cancro ou na inibição da angiogênese.

[098] Em algumas formas de realização, o método apresentado na presente invenção pode ser utilizado isoladamente. Em alternativa, o método objeto pode ser combinado com outras terapias anticancro convencionais para o tratamento ou prevenção de doenças proliferativas (por exemplo tumores). Por exemplo, estes métodos podem ser utilizados para a prevenção de cancros, para a prevenção de recidivas de cancro e metástases pósoperatórias e pode ser utilizado como suplemento noutras terapias contra o cancro. Como apresentado na presente invenção, a eficácia das terapias contra o cancro convencionais (por exemplo, quimioterapia, radioterapia, fototerapia, imunoterapia e intervenção cirúrgica) pode ser intensificada recorrendo a agentes terapêuticos polipeptídeos.

[099] Em oftalmologia, a angiogênese está relacionada com, por exemplo, retinopatia diabética, retinopatia em prematuros, degeneração macular senil, rejeição de transplante da córnea, glaucoma neovascular e RLF (fibroplasia retrolental). A proteína de fusão FGFR-Fc apresentada pode ser administrada no interior do olho ou por outras vias. Outras doenças relacionadas com a angiogênese em oftalmologia incluem sem constituir limitação, queratoconjuntivite epidêmica, deficiência de vitamina A, uso excessivo de lentes de contacto, queratite atópica, queratite límbica superior, queratite seca pterígio, Sjorgen, acne rosácea.flictenose, sífilis, infecção por micobactérias, degenerescência lipídica, queimaduras devido a produtos químicos, úlcera bacteriana, úlcera fúngica, infecção por herpes simplex, infecção por herpes zoster, infecção por protozoários, sarcoma de Kaposi, úlcera de Mooren, degenerescência marginal de Terrien, queratolise marginal, artrite reumatóide, lúpos sistêmico, poliarterite, traumatismo, sarcoidose de Wegener, esclerite, doença de Steven”s Johnson, queratotomia radial perifigóide e rejeição do enxerto corneano, anemia falsiforme, sarcoide, pseudoxantoma elástico, doença de Paget, oclusão venosa, oclusão arterial, doença obstrutiva da

32/50 carótida, uveite crônica/vitrite, infecções por micobactérias, doença de Lyme, lúpos sistêmico eritematoso, retinopatia do prematuro, doença de Eales, doença de Bechets, infecção que degenera em retinite ou coroidite, histoplasmose ocular presumida, doença de Bests, miopia, fissura óptica, doença de Stargats, pars planite, descolamento crônico da retina, síndromes da hiperviscosidade, toxoplasmose, traumatismo e complicações póslaser.Outras doenças incluem, sem constituir limitação, rubeose (neovascularização do ângulo) doenças relacionadas e doenças induzidas por hiperplasia anômala dos vasos sanguíneos fibrosos ou do tecido fibroso, incluindo todos os tipos de vitreoretinopatia proliferativa.

Administração [0100] A proteína de fusão da presente invenção pode ser administrada isoladamente, mas, de preferência, como composição farmacêutica que contém normalmente um excipiente, diluente ou veículo farmacêutico adequado, selecionado de acordo com a via de administração pretendida. A proteína de fusão pode ser administrada ao doente necessitado desta através de qualquer via adequada. Uma posologia precisa irá depender de múltiplos fatores, incluindo propriedades exatas da proteína de fusão.

[0101] Algumas vias de administração adequadas incluem (sem constituir limitação) as vias oral, retal, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), subcutânea, vaginal e parentérica (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal e extradural).

[0102] No caso da injeção intravenosa e injeção no sítio focal, estão presentes ingredientes ativos no ponto focal como uma solução aquosa parentericamente aceitável, apirogênica e com um pH, isotonicidade e estabilidade apropriado.

[0103] Uma solução aceitável pode ser formulada por um perito na técnica com, por exemplo, excipientes isotônicos, tais como injeção de cloreto de sódio, injeção de solução de Ringer, injeção de lactato de Ringer. Conforme o necessário poderão ser acrescentados conservantes, estabilizantes, agentes

33/50 tampão, antioxidantes e/ou outros aditivos. A composição farmacêutica administrada por via oral pode encontrar-se sob a forma de comprimidos, cápsulas, pós ou líquido oral, etc. Veículos sólidos, tais como gelatina ou adjuvante, podem estar contidos em um comprimido. A composição farmacêutica líquida contém normalmente veículos líquidos, tais como água, petróleo, óleo animal ou vegetal, óleo mineral ou óleo sintético. Pode também incluir soro fisiológico normal, glucose ou outras soluções de açúcar ou glicóis, tais como etilenoglicol, propilenoglicol ou polietilenoglicol.

[0104] Exemplos das técnicas e esquemas tais como referidos anteriormente e outras técnicas e esquemas segundo a utilização de acordo com a presente invenção podem ser consultados em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^a edição, Oslo, A. (ed), 1980.

[0105] Clonagem da proteína de fusão e construção do plasm ideo de expressão [0106] O fragmento receptor FGF são obtidos a partir da amplificação do modelo cADN do receptor correspondente por meio de PCR e o fragmento lgG1 Fc é obtido a partir da amplificação de cADN do lgG1 derivado de humano através de PCR. Quando os iniciadores de PCR são concebidos, são introduzidas sequências de ligação entre os diferentes fragmentos, de forma que estes diferentes fragmentos podem ser finalmente ligados por PCR de sobreposição para formar quadros de leitura para diferentes proteínas de fusão e são acrescentados locais BspE I e Pst I endonuclease a ambas as extremidades do cADN. Os cADN para diferentes proteínas de fusão podem ser clonados no plasm ideo de expressão após digestão por BspE I e Pst I. O plasmídeo após clonagem pode ser determinado por meio de digestão de endonuclease, eletroforese e finalmente, sequenciação de ADN.

Expressão e Purificação de Proteínas de Fusão:

[0107] A presente proteína de fusão pode ser expressa e purificada por meio de técnicas vulgarmente utilizadas na técnica. O ADN do plasmídeo da proteína de fusão correspondente foi purificado com um kit e purificação de

34/50 plasmideo (MAX) disponibilizado pela Qiagen, e a concentração de ADN de plasmídeo foi determinada por meio de espectrofotometria UV e o plasmídeo foi transfectado para células CHO com lipossoma FUGENE 6 (Roche). O método específico para a transfecção foi executado de acordo com a especificação do produto. Com base na quantidade de expressão necessária para as proteínas, foram empregues dois métodos para a expressão de proteína na presente invenção. (1) expressão transitória, em que a proteína de fusão contida no sobrenadante da cultura foi habitualmente colhido 48-72 h depois da transfecção e o teor relativo da proteína de fusão foi depois determinado utilizando ELISA IgG humano, de forma que a proteína de fusão possa ser obtida com rapidez e eficiência; (2) estabelecimento de uma linhagem celular estável e produção do sistema de expressão de células CHO deficitárias em DHFR comum utilizando a expressão do medicamento da proteína recombinante, o processo básico que inclui transfecção celular, seleção de células transfectadas com estabilidade, separação de clones, amplificação do stress, meio de cultura e otimização do processo e semelhantes, e finalmente execução de uma cultura em suspensão em grande escala da estirpe celular manipulada CHO em um meio de cultura isento de soro. O produto da cultura foi recolhido e a proteína de fusão foi purificada em coluna de afinidade com proteína A. A proteína purificada foi analisada em eletroforese de gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e posteriormente todos os eluídos que continham o produto de expressão necessário foram combinados e filtrados com um filtro de 0,22 pm e depois foi executada a quantificação de proteína de acordo com uma pluralidade de métodos, tais como o ensaio de proteína de Lowry. O volume de cultura de células CHO na presente invenção encontrava-se a um nível de biorreator de 10 L, através do qual a proteína d,e fusão obtida após a purificação satisfazia a quantidade de proteína necessária nas experiências com animais e foi ainda estabelecida uma base para uma futura ampliação da escala.

[0108] A neutralização de FGF pela proteína de fusão foi validada ao nível

35/50 da proteína.

[0109] Depois de obtida a proteína de fusão expressa por CHO, a capacidade de ligação da proteína de fusão a FGF é avaliada na presente invenção a um nível de proteína. Foram executadas experiências de ligação e experiências de afinidade para validação na presente invenção, em cujas fases da experiência de ligação se incluíam: depois de inicialmente revestida uma placa ELISA de 96 poços com FGF-2, o poço revestido foi bloqueado com BSA, seguido de adição de cada proteína de fusão à mesma concentração e depois adicionou-se um anticorpo secundário de IgG Fc-HRP humano depois da lavagem e as amostras foram reveladas, paradas e lidas a 450 nm em uma placa ELISA e finalmente a proteína de fusão que tinha capacidade de ligação a VEGF e FGF-2 foi separada com base na intensidade de sinal. A experiência de afinidade foi executada a fim de determinar a afinidade da proteína de fusão com FGF-2 no sistema de solução, que compreendia as seguintes fases: FGF2 foram inicialmente aplicados em uma placa ELISA de 96 poços para capturar o anticorpo e depois o poço revestido foi bloqueado com BSA e posteriormente uma mistura da proteína de fusão e ou FGF-2, previamente preparados e incubados, foram adicionados com um gradiente de padrões diluídos e, após a incubação, adicionou-se um anticorpo de detecção marcado com HRP (recorrendo ao anticorpo 2 que detectou especificamente VEGF ou FGF-2 livre) e posteriormente as amostras foram reveladas, paradas e lidas a 450 nm em placa ELISA e finalmente a concentração relativa de VEGF ou FGF-2 livre foi detectada na mistura da proteína de fusão e VEGF ou FGF-2. Através das experiências descritas, a proteína de fusão com um efeito de bloqueio em FGF2 foi separada.

[0110] A neutralização de FGF pela proteína de fusão foi validada ao nível celular.

[0111] Depois de determinada a capacidade de ligação da proteína de fusão a FGF-2 ao nível da proteína, procede-se ainda à validação do efeito inibidor da angiogênese ao nível celular na presente invenção. A capacidade

36/50 de inibição da proteína de fusão na divisão e migração do endoteliócito vascular é examinada com o teste de divisão recorrendo a células endoteliais da veia umbilical humanas (human umbilical vein endothelial cell - HUVEC) e ao teste da migração de células HUEVC. A capacidade de inibição da proteína de fusão na divisão da célula HUVEC pode ser examinada através do teste de divisão celular HUVEC, que compreende as seguintes fases durante a experiência: Foram inoculadas 3000 células HUVEC/poço em uma placa de 96 poços e foram cultivadas a 37 °C em incubadora suplementada com 5% CO2 e depois adicionaram-se FGF-2 assim como uma mistura da proteína de fusão a diferentes concentrações com FGF-2 e, depois de cultivar durante mais 3-4 dias, adiciona-se CCK-8 a 10% e cultiva-se durante mais 2 h antes da amostra ser lida a 450 nm em placa ELISA. A capacidade de inibição da proteína de fusão na divisão dos endoteliócitos vasculares, induzida por FGF-2 foi avaliada com base na diferença de absorção e a concentração efectiva mediana da proteína de fusão foi obtida para a inibição de FGF-2. A capacidade de inibição da proteína de fusão na migração celular HUVEC foi examinada através do teste da migração celular HUVEC, a qual compreende as seguintes fases durante a experiência: lnocularam-se inicialmente 50000 células HUVEC assim como a proteína de fusão a várias concentrações na câmara superior, enquanto se adicionaram 600 pL VEGF ou FGF-2 contendo líquido de cultura à câmara inferior e, seguidamente, a amostra foi cultivada a 37 °C em uma incubadora suplementada com 5% de CO₂ durante 20-24h antes de serem removidas as células no lado da face da membrana da câmara superior e depois serem fixadas as células no lado traseiro da membrana, e serem submetidas a coloração e lavadas com PBS antes de serem observadas e contadas em microscópio invertido. A migração das células HUVEC induzida pela estimulação de FGF-2 ficou demonstrada pela contagem das células HUVEC no lado traseiro da membrana e a capacidade de inibição da proteína de fusão na migração dos endotelócitos vasculares foi testada mediante adição da proteína de fusão a várias concentrações no líquido de cultura. Através das

37/50 experiências referidas, a capacidade de inibição da nova proteína de fusão construída na presente invenção foi validada quanto à divisão e migração dos endotelócitos vasculares induzida por FGF-2, que também proporcionou uma base para experiências futuras em animais.

[0112] A capacidade inibidora do crescimento do tumor veiculada pela proteína de fusão ficou validade pelo modelo tumoral.

[0113] Depois de demonstrado o efeito de bloqueio da nova proteína de fusão na presente invenção no sinal FGF-2 através das experiências a um nível proteico e ao nível celular, a capacidade anti-tumor seria experimentada em modelos de tumor em animais na presente invenção. Na presente invenção, o efeito anti-angiogênese e anti-tumor da proteína de fusão seria validado através de modelos utilizados na pesquisa de medicamento para a angiogênese e tumores, por exemplo cancro do pulmão em ratinho LLC, gliocitoma U87, melanoma B16, etc. Em experiências com animais, para além dos grupos de controlo convencionais, medicamentos de controlo, como VEGFTrap, FP-1039, seriam também incluídos de forma a obter-se dados comparativos da capacidade anti-tumor. Durante as experiências, injetou-se por via subcutânea 100 pL de líquido celular com quantidade apropriada em ratinhos C57 de um lado das costas e foi sendo medido o volume do tumor com um nônio de Vernier duas vezes por semana. Assim que o tumor atingiu cerca de 200 mm³, a proteína de fusão foi injetada por via subcutânea a diferentes concentrações e os ratinhos foram sacrificados ao fim de 2-3 semanas. Seguidamente mediu-se o volume do tumor com um nônio de Vernier o efeito anti-tumor da proteína de fusão ficou validade pelo tamanho do tumor. Além disso, analisou-se tecido tumoral individual pelos métodos tais como a imunohistoquímica para investigar os mecanismos de regulação da angiogênese Exemplos [0114] Exemplo 1: Construção do plasmídeo de expressão recombinante para a proteína de fusão FGFR1 -Fc [0115] O fragmento receptor FGF é obtido a partir da amplificação do

38/50 modelo cADN do receptor por meio de PCR e o fragmento lgG1 Fc é obtido a partir da amplificação de cADN do lgG1 derivado de humano através de PCR. Foi utilizado um cADN disponível no comércio (cADN Primeira Cadeia Pronto para PCR, derivado de tecido do cancro do cólon de adulto, BioChain) como modelo para o fragmento FGFR1. Foi extraído o ARN total do sangue de sujeitos humanos saudáveis com um kit de recolha de ARN do sangue (QIAGEN). De acordo com as instruções do fabricante do kit de transcrição inversa (Promega), executou-se RT-PCR com transcriptase inversa M-MLV (Promega) de forma que o ARN foi submetido a transcrição inversa em cADN, o qual foi utilizado como modelo do fragmento lgG1 Fc. De acordo com as instruções do fabricante do kit de transcrição inversa (Promega), executou-se RT-PCR com as seguintes fases: Oligo dT, dNTP, ARN total e DEPC H2O foram misturados homogeneamente e feitos reagir a 70 °C durante 10 min antes de serem colocados em gelo durante 5 min e posteriormente adicionaram-se inibidor de RNase, transcriptase inversa M-MLV e tampão de reação. A mistura foi feita reagir a 42 °C durante 1 h e posteriormente a 70 °C durante 15 min e o cADN obtido pode ser utilizado como modelo.

[0116] Vários fragmentos de FGFR1 foram individualmente amplificados por meio de PCR, utilizando o cADN de tecido de cancro do cólon de ser humano adulto como modelo (os iniciadores encontram-se discriminados no quadro 1) e o fragmento de VEGFR2 foi amplificado por meio de PCR, com cADN de sangue humano como modelo (os iniciadores encontram-se discriminados nos quadros 1 e 2). As condições de reação para o PCR foram as seguintes: 5 min de pré-desnaturação a 98 °C, total de 30 ciclos de 30 s de desnaturação a 98 °C, 45 s de têmpera a 56 °C e 2 min de extensão a 72 °C e finalmente outros 10 min de extensão. Quando os iniciadores PCR foram concebidos, 20 ou mais sequências de base complementares foram introduzidas como sequência de ligação entre o fragmento FGFR1 e o fragmento lgG1 FC de forma que cada fragmento FGFR1 e fragmento IgGI Fc pode ser posteriormente ligado por meio de PCR de sobreposição para formar quadros de leitura para diferentes

39/50 proteínas de fusão e, em simultâneo, foram acrescentados locais endonuclease de restrição BspE I e Pst I em ambas as extremidades do produto PCR.

[0117] Posteriormente, executou-se sobreposição PCR para obter cada fragmento da proteína de fusão FGFR1-Fc por meio de amplificação. O processo da reação de PCR de sobreposição pode ser dividido em duas rondas, nas quais o fragmento necessário para a ligação e sem conter iniciador foi incluído na primeira ronda com as seguintes condições de reação: 5 min de pré-desnaturaçâo a 98 °C, total de 6 ciclos de 30 s de desnaturação a 98 °C, 45 s de hibridação a 56 °C e 5 min de extensão a 72 °C e finalmente outros 10 min de extensão a 72 °C, após estas ronda foi executada a segunda ronda de PCR através da adição dos iniciadores de ambas as extremidades com as seguintes condições de reação: 5 min de pré-desnaturação a 98 °C, total de 30 ciclos de 30 s de desnaturação a 98 °C, 45 s de hibridação a 56 °C e 2 min de extensão a 72 °C e finalmente outros 10 min de extensão; através do processo anterior, os quadros de leitura para as diferentes proteínas de fusão foram excisados e simultaneamente foram adicionados os locais das endonuclease de restrição BspE I e Pst I em ambas as extremidades do cADN.

[0118] Após a amplificação, os fragmentos amplificados por PCR foram purificados com o kit de purificação por PCR QIAquick (QIAGEN) CADN de várias proteínas de fusão e plasmídeo de expressão eucariota pSV2-dhfr (ATCC) foram digeridos por BspE i e PST I, respectivamente. Seguidamente, executou-se eletroforese em gel de agarose 1% nas amostras digeridas a uma tensão de 90 V. Os fragmentos alvo foram recuperados com kit de extração em gel QIAquick (QIAGEN) antes da ligação a 16 °C durante 1 h com ligase (NEB). A mistura para a reação de ligação foi transformada no E. coli Top10 competente nas condições de 90 s de reação a 42 °C seguido de 3 min de repouso em gelo. Depois de adicionado o caldo de cultura LB (isento de anticorpos), a mistura foi agitada a 250 rpm em um agitador a 37 °C durante 1 h antes de se aplicar em uma placa LB suplementada com ampicilina. A placa foi cultivada de um dia para outro em incubadora com termostato a 37 °C, e

40/50 depois forma selecionadas colônias individuais e transferidas para um caldo de cultura LB com ampicilina. O caldo de cultura inoculado foi agitado a 250 rpm em um agitador a 37 °C de um dia para outro, antes de se extrair o plasmídeo por lise alcalina. Seguidamente, a amostra foi digerida por endonuclease de restrição antes de ser avaliada em eletroforese em gel de agarose 1 % a uma tensão de 90 V. O plasmídeo recombinante com digestão de endonuclease correta foi confirmado por meio de sequenciação de ADN. Com base nos passos indicados anteriormente foram construídos os plasmídeos de expressão 19#, 13#, 22#, 23#, 26#, 29# e 8# para a proteína de fusão FGFRI-Fc. A sequência de proteínas de FGFR1-Fc e, cada proteína de fusão e a respectiva sequência de nucleotídeos codificadora encontram-se discriminados no quadro

3. O diagrama esquemático da estrutura da proteína de fusão encontra-se na fig· 1.

[0119] Quadro 1: Iniciadores utilizados para amplificação do fragmento FGFR1

Proteína de fusão	Iniciador a montante	Iniciador a jusante
19#	19#-FGFR1For (SEQ ID NO: 24) TAGTTCCGGAAGGCCGTCCCCGACCTT GCCTG	FGFRIRev (SEQ ID NO: 31) G I I I IGTCCTCCA GGTACAGGGGCG AGGTC
13#	13#-FGFR1For (SEQ ID NO: 25) TAGTTCCGGAAAAAATCGCACCCGCAT CACAG	FGFR1 Rev
22#	22#-FGFR1For (SEQ ID NO: 26) TAGTTCCGGAGTAACCAGCAGCCCCTC GGGC	FGFR1Rev
23#	23#-FGFR1 For (SEQ ID NO: 27)	FGFRIRev

41/50

	TAGTTCCGGATCCTCTTCAGAGGAGAA AGAAAC
26#	26#-FGFR1For (SEQ ID NO: 28) TAGTTCCGGAAAACCTAACCCCGTAGC TCCAT	FGFR1Rev
29#	29#-FGFR1 For (SEQ ID NO: 29) TAGTTCCGGACCATATTGGACATCCCC AGAAAAG	FGFR1 Rev
8#	8#-FGFR1 For (SEQ ID NO: 30) CTAGCTCCGGACCAGAAAAGATGGAAA AGAAATTGC	FGFRIRev

[0120] Quadro 2: Iniciadores utilizados para amplificação do fragmento lgG1 Fc

	Iniciador a montante	Iniciador a jusante
Fragmento lgG1 Fc	FcFor (SEQ ID NO: 32) CTGTACCTGGAGGACAAAACTCAC ACATGC	FcRev (SEQ ID NO: 33) GATATCTGCAGTC Al I IACCCGGAG ACAGG

[0121] Quadro 3: Sequências de proteínas sequências de nucleotídeos para proteínas de fusão FGFR1 -Fc

Proteína de fusão	Iniciador a montante	Iniciador a jusante
19#	SEQ ID NO: 9.	SEQ ID NO: 16.
13#	SEQ ID NO: 10	SEQ ID NO: 17.

42/50

22#	SEQ ID NO: 11.	SEQ ID NO: 18.
23#	SEQ ID NO: 12.	SEQ ID NO: 19.
26#	SEQ ID NO: 13.	SEQ ID NO: 20.
29#	SEQ ID NO: 14.	SEQ ID NO: 21.
8#	SEQ ID NO: 15.	SEQ ID NO: 22.

[0122] Exemplo 2: Expressão transitória e quantificação de proteínas de fusão [0123] O ADN do plasmídeo da proteína de fusão individual foi purificado com o Kit de Purificação de Plasmídeo MAX (Qiagen). A concentração do ADN plasmídeo foi determinado por meio de espectrofotometria UV. 1 pg de plasmídeo recombinante e 6 pL de lipossoma (FuGENE 6 Transfection Reagent, Roche) foram misturados homogeneamente em 100 pL de caldo de cultura IMDM (GIBCO); depois de repousar durante 15 min, a mistura foi adicionada às células CHO (ATCC) cultivadas de um dia para outro após a inoculação a uma densidade celular de 3x10⁵/ml_ em uma placa de 6 poços; a mistura foi cultivada a 37 °C em uma incubadora suplementada com 5% CO₂durante 48 h, com um caldo de cultura de células completo (meio IMDM contendo FBS 10%, HT 1% e glutamina 1% fornecidos pela GIBCO); posteriormente os sobrenadantes foram recolhidos e o teor relativo da proteína de fusão foi determinado com um kit ELISA IgG humano para quantificação de proteínas (BETHYL). O teor relativo da proteína de fusão expressa e segregada por CHO foi determinado com as seguintes fases: 100 pL de proteína IgG-Fc anti-humano (10 pg/mL) purificado por meio de afinidade foi aplicado em uma placa ELISA de 96 poços (IMMULON) e posteriormente

43/50 lavada por 5 vezes com 300 pl_ de solução de lavagem PBST; cada poço revestido foi bloqueado com 200 pL de solução de trabalho de bloqueio preparada de fresco (solução mãe de bloqueio : PBS=1: 19) e incubado a 37 °C durante 1 h; depois de lavagem em 300 pL de solução de lavagem PBST por 5 vezes, 100 pL de solução IgG diluída em um gradiente (200 ng/mL da concentração original e diluída com PBS na proporção múltipla de 1: 2) como padrão e 100 pl_ de sobrenadante da cultura de cada proteína de fusão diluída em um gradiente (a começar com a concentração de cada sobrenadante de cultura e diluído por PBS na proporção múltipla de 1: 5) foram adicionados a cada poço e incubados a 37 °C durante 2 h; depois de lavagem em 300 pL de solução de lavagem PBST por 5 vezes, 100 pL de anticorpos secundários IgG Fc-HRP anti-humano, diluídos com PBS em uma proporção de 1: 10000 foram adicionados e incubados a 37 °C durante 1 h, após lavagem o poço foi revelado com adição de 100 μΙ_ de solução de revelação (KPL); finalmente, depois de parada a revelação com adição de 100 μΙ_ de solução de paragem (KPL), foi feita a leitura da absorbància da placa ELISA a um comprimento de onda de 450 nm em um leitor ELISA. As concentrações de várias proteínas de fusão podem ser determinadas de acordo com a curva padrão.

[0124] Exemplo 3: Ligação das proteínas de fusão [0125] A capacidade de ligação da proteínas de fusão 19#, 13#, 22#, 23#, 26#, 29# e 8#, construídas anteriormente, com FGF foi detectada por meio de ELISA. Inicialmente, revestiu-se uma placa ELISA (IMMULON Company) de 96 poços com 100 pL de solução contendo 50 ng/mL de FGF-2 (R&D Systems) assim como 100 ng/mL de heparina (Sigma Company) e 50 ng/mL FGF-2. Seguidamente, a placa foi lavada em 300 pL de solução de lavagem PBST 5 vezes antes de cada poço revestido ser bloqueado em 200 pL de solução de trabalho de bloqueio preparada de fresco (Empresa KPL) (solução mãe de bloqueio: PBS = 1:19) e incubada a 37 °C durante 1 h. Depois de lavado em 300 pL de solução de lavagem PBST por 5 vezes, soluções de 100 pL de várias proteínas de fusão (dissolvidas em PBS, pH=7,2, concentração de 20

44/50 ng/ml) foram adicionadas ejncubadas a 37 °C durante 2 h. Depois de lavado em 300 pL de solução de lavagem PBST por 5 vezes, 100 pL de anticorpos secundários contra IgG Fc-HRP humano (Empresa BETHYL), diluídos com PBS em uma proporção de 1:10000 foram adicionados e incubados a 37 °C durante 1 h. Após lavagem em 300 pL de solução de lavagem PBST por 5 vezes, o poço foi revelado até à presença de cor à temperatura ambiente em um local escuro com adição de 100 pL de solução de revelação (Empresa KPL); finalmente, depois de parada a revelação com adição de 100 μΙ_ de solução de paragem (Empresa KPL), antes de ser feita a leitura da absorbância da placa ELISA a um comprimento de onda de 450 nm em um leitor ELISA. Quanto maior a capacidade de ligação da proteína de fusão a FGF2, maior a absorbância e mais intenso o sinal. Com base na intensidade do sinal, determinou-se que a proteína de fusão 26# possui máxima capacidade de ligação a FGF-2. Fig. 2 mostra a comparação da ligação FGF-2 entre várias proteínas de fusão. Como se pode ver na fig. 2, as proteínas de fusão 19#, 13#, 22#, 23#, 26# e 29# construídas na presente invenção ligadas a FGF com diferentes extensões na presença de heparina, e particularmente, a extensão de ligação de 23#, 26# e 29# foi extremamente maior do que o controlo e superior a 19#, 13# e 22#, indicando que as proteínas de fusão sem caixa ácida de acordo com a presente invenção possuíam um excelente efeito. Entre outros aspectos, ficou demonstrado em especial a elevada extensão de ligação em 26#, que nos indicou uma pista de que a proteína de fusão da presente invenção tinha um efeito de ligação significativamente melhor quando compreende uma parte de determinado comprimento derivado da sequência funcional intermédia do domínio lg-like de FGFR.

[0126] Exemplo 4: Expressão estável e purificação de proteínas de fusão: [0127] Células CHO deficientes em DHFR (ATCC) foram transfectadas pelo plasmídeo de expressão recombinante da proteína de fusão 25# (com elevada capacidade de ligação a FGF-2) através de um lipossoma (Roche). Em particular, 5 pg de plasmídeo recombinante e 30 pL de lipossoma (FuGENE 6

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Transfection Reagent, Roche) foram misturados homogeneamente em 100 μΙ_ de caldo de cultura IMDM (GIBCO); depois de repousar durante 15 min, a mistura foi adicionada às células CHO deficientes em DHFR (ATCC) cultivadas de um dia para outro após a inoculação a uma densidade celular de 3x10⁵/mL em um prato de cultura de 20 cm (Coming); a mistura foi cultivada a 37 °C em uma incubadora suplementada com 5% CO2 durante 2-3 dias, com um caldo de cultura de células completo FBS 10%, HT 1% e glutamina 1% em meio de cultura IMDM (todos fornecidos pela GIBCO); posteriormente as celular foram digeridas com tripsina (GIBCO), inoculadas a uma densidade celular de 3x10⁵/ml_ em 30 mL de meio de cultura 302 isento de soro (SAFC) em um balão e cultivados seletivamente a 37 °C em uma incubadora suplementada com 5% de CO2 a 100 rpm até uma densidade celular de 10⁶/mL. Seguidamente, foram inoculadas 3000 células em uma placa de cultura de 10 cm (Croning) ( contendo o caldo de cultura 10% de FBS e 1% glutamina em um meio de cultura IMDM) e foram cultivadas a 37 °C em uma incubadora suplementada com 5% CO₂ para formar clones individuais. Estes clones individuais foram selecionados e cultivados em uma placa de 96 poços (Corning). O teor relativo de proteína de fusão expressa e segregada por cada clone foi determinado com um kit ELISA IgG humano para quantificação proteica (BETHYL) nas mesmas condições e fases descritas no exemplo 2 para a determinação do teor relativo de proteína de fusão. O clone com a maior quantidade de expressão foi separado e transferido para uma placa de 6 poços para cultura ate uma taxa de confluência de cerca de 70%. As células foram digeridas com tripsina e transferidas para um prato de cultura de 10 cm. Seguidamente, foi executado uma amplificação gradual do stress mediante adição de metotrexato (MTX Sigma) com várias concentrações (10 nM, 20 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM e 500 nM). Depois da amplificação do stress, as células foram digeridas com tripsina e inoculadas até uma densidade celular de 3x10⁵/mL em um balão. A quantidade de expressão de uma única célula foi determinada de foram a obterem-se colorações geneticamente modificadas de

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CHO para expressão de uma proteína de fusão particular. Finalmente, executou-se a cultura da suspensão em grande escala (volume 10 L) da coloração geneticamente modificada de CHO a 37 °C, 5% CO₂₎ 40% de oxigênio dissolvido e 80 rpm em um meio de cultura 302 isento de soro (pH 7,0, SAFO). O produto da cultura foi recolhido por meio de centrifugação. Depois de filtrado o sobrenadante com filtro de membrana de 0,45 pm (Millipore), executou-se cromatografia de afinidade de acordo com o manual de instruções da coluna de afinidade de proteína A (GE) com os passos específicos seguintes: inicialmente equilibrou-se uma coluna de afinidade proteína A com tampão PBS (pH 7,0); seguidamente, o sobrenadante foi carregado na coluna e novamente lavado com o tampão PBS; finalmente, a coluna foi eluída com um tampão ácido cítrico (pH 3,0) e o eluente foi recolhido e filtrado com um filtro de membrana de 0,45 pm. Após a inativação do vírus por meio de adição de S/D (0,3% de fosfato de tributilo/1 % Tween 80) a 24 °C durante 6 h, a proteína alvo foi ainda purificada em cromatografia em crivo molecular com as seguintes fases: primeira, o eluente obtido da cromatografia de afinidade da proteína A foi dializado em saco de diálise contra tampão PBS; seguidamente, a amostra foi concentrada em um copo de ultrafiltração de 10 KD (Millipore); a amostra concentrada com o copo de ultrafiltração foi depois carregado em uma coluna de cromatografia com crivo molecular Superdex 200 (GE), equilibrada com um tampão de PBS e seguidarnente a coluna foi eluída com um tampão de PBS e o pico de eluição foi recolhido. A proteína purificada foi analisada por SDSPAGE (fig. 3) e seguidamente os eluídos contendo o produto de expressão necessário foram combinados e filtrados com um filtro de membrana de 0,22 pm (Millipore) antes de o teor proteico ser determinado com vários métodos tais como o ensaio de proteína de Lowry.

[0128] Exemplo 5: Experiência da ligação com base no gradiente das proteínas de fusão [0129] As capacidades de ligação das proteínas de fusão, segundo a construção anterior para FGF-2, foram detectadas com ELISA, de modo similar

47/50 ao Exemplo 3. Inicialmente, revestiu-se uma placa ELISA de 96 poços com 100 pL de solução contendo 50 ng/mL FGF-2 (R & D Systems). Seguidamente, a placa foi lavada em 300 pL de solução de lavagem PBST 5 vezes antes de cada poço revestido ser bloqueado em 200 pL de solução de trabalho de bloqueio preparada de fresco (KPL) (solução mãe de bloqueio: PBS = 1: 19) e incubada a 37 °C durante 1 h. Depois de lavada em solução de lavagem PBST 300 pL por 5 vezes, foram adicionadas soluções de 100 pL contendo várias proteínas de fusão a diferentes concentrações (o teor proteico inicial foi de 16000 pM e foi diluído em uma proporção de 1: 3) e incubadas a 37 °C durante 2 h. Depois de lavado em 300 pL de solução de lavagem PBST por 5 vezes, 100 pL de anticorpos secundários IgG Fc-HRP anti-humano (Empresa BETHYL), diluídos com PBS em uma proporção de 1: 10000 foram adicionados e incubados a 37 °C durante 1 h. Após lavagem em 300 pL de solução de lavagem PBST por 5 vezes, o poço foi revelado com adição de 100 pL de solução de revelação (KPL); finalmente, depois de parada a revelação com adição de 100 pL de solução de paragem (KPL), antes de ser feita a leitura da absorbância da placa ELISA a um comprimento de onda de 450 nm em um leitor ELISA. Com base na intensidade do sinal, determinou-se as capacidades de ligação com base no gradiente das proteínas de fusão a FGF-2. Na experiências referida, podem ser encontradas condições e fases específicas no exemplo 3. A comparação entre a capacidade de ligação com base no gradiente da proteína de fusão 26# a FGF-2 encontra-se na fig. 4. Pode-se observar que a capacidade de ligação da proteína de fusão 26# a FGF-2 dependia da dose. Foi sugerido com este exemplo, que a capacidade de ligação a FGF-2 aumenta à medida que a concentração molar da proteína de fusão 25#, o que ficou indicado por um sinal mais forte no comprimento de onda de 450 nm, enquanto a capacidade de ligação a FGF-2 diminuiu de forma correspondente com a diluição do gradiente da concentração molar da proteína de fusão 26#.

[0130] Exemplo 6: Experiência afinidade das proteínas de fusão

48/50 [0131] A experiência de afinidade foi executada a fim de determinar a afinidade da proteína de fusào com FGF-2 no sistema de solução, que compreendia as seguintes fases: Inicialmente, revestiu-se uma placa ELISA de 96 poços com 100 pL de solução contendo 2,0 ng/mL de anticorpos de captura de FGF-2 (R&D Systems). Seguidamente, a placa foi lavada em 300 pL de solução de lavagem PBST 5 vezes antes de cada poço revestido ser bloqueado em 200 pL de solução de trabalho de bloqueio preparada de fresco (KPL) (como se pode ver no exemplo 3) e incubada a 37 °C durante 1 h. Depois de lavada com 300 pL de solução de lavagem PBST por 5 vezes, a mistura previamente preparada e incubada (4 °C de um dia para outro) das proteínas de fusão e FGF-2 assim como o padrão (R&D Systems) diluído em um gradiente foram adicionados, tendo sido a preparação específica da mistura a seguinte: a concentração de partida da proteína de fusão 26# foi 400 pM (dissolvido em PBS) e diluído em uma razão entre gradientes de 2 vezes, e as soluções da proteína de fusão foram .1: 1 misturadas com solução 20 pM FGF2 (dissolvido em PBS), isto é, a concentração final de partida de cada proteína de fusão foi 200 pM e a concentração final de FGF-2 foi 10 pM na solução de mistura. A placa foi incubada a 37 °C durante 2 h e lavada em 300 pL de solução de lavagem PBST por 5 vezes antes de ser adicionados 100 pL de solução de anticorpos de detecção de FGF-2 (250 ng/mL) (R&D Systems, que podem detectar especificamente anticorpos livres contra FGF-2). A placa foi incubada a 37 °C durante 2 h e lavada em 300 pL de solução de lavagem PBST por 5 vezes e seguidamente adicionou-se estreptavidina marcada com HRP (R&D Systems) (diluída com PBS em 1: 200 A placa foi incubada a 37 °C durante 2 h e lavada em 300 pL de solução de lavagem PBST por 5 vezes antes do poço ser revelado à temperatura ambiente em um local escuro por um espaço de tempo apropriado (cerca de 15-30 min) mediante adição de 100 pL de solução de revelação (KPL). Por fim, depois de parar a revelação com adição de 100 pL de solução de paragem (KPL) foi feita a leitura da absorbância da placa ELISA a um comprimento de onda de 4540 nm no leitor

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ELISA. Foi determinada a concentração relativa de FGF-2 livre na mistura da proteína de fusão e FGF-2. Fig. 5 mostra a afinidade entre a proteína de fusão 26# e FGF-2 em um sistema solução. Como ficou demonstrado neste exemplo, a proteína de fusão 26# possui uma afinidade com FGF-2 em um sistema solução. A afinidade aumentou com o aumento da concentração, que se manifestou em uma menor quantidade de FGF-2 livre com uma maior concentração da proteína de fusão. Fig. 5 mostra a afinidade entre a proteína de fusão 26# e FGF-2 em um sistema solução. Como ficou demonstrado neste exemplo, a proteína de fusão 26# possui uma afinidade com FGF-2 em um sistema solução. A afinidade aumentou com o aumento da concentração, que se manifestou em uma menor quantidade de FGF-2 livre.

[0132] Exemplo 7: Experiência de inibição para divisão em células endoteliais da veia umbilical humana [0133] A capacidade de inibição das proteínas de fusão na divisão de células endoteliais vasculares foi examinada em uma experiência de divisão de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC). As células HUVEC (AllCells) foram cultivadas até à fase de crescimento exponencial em meio completo HUVEC (AllCells) a 37 °C, em incubadora suplementada com 5% CO2. As células HUVEC foram contadas depois de digeridas com tripsina. Foram inoculadas 3000 células HUVEC por poço em meio basal HUVEC contendo 1% FBS (AllCells) em uma placa de 96 poços. A placa foi cultivada de um dia para outro a 37 °C, em incubadora suplementada com 5% CO₂.

[0134] 100 pL de solução FGF-2 (R&D Systems) (concentração final de 5 ng/mL) diluído com meio basal HUVEC contendo 1% de FBS, assim como 100 pL de mistura de várias quantidades da proteínas de fusão 26# e FGF-2 (em que a concentração final da proteína de fusão foi 40 pM, diluído em meio basal HUVEC contendo 1% FBS em uma proporção de 1:10 e a concentração final de FGF-2 foi 5 ng/mL) foram adicionados e cultivados durante mais 3-4 dias. Seguidamente, o meio de cultura foi retirado e foi adicionado o meio de cultura contendo 10% CCK-8 (DOJINDO) durante outras 2 h de cultura antes de se

50/50 proceder à leitura da absorbância da placa de 96 poços a um comprimento de onda de 450 nm em um leitor ELISA. Com base na diferença da absorbância, foi determinada a capacidade inibidora das proteína de fusão na divisão celular de células endoteliais vasculares induzidas por FGF-2. O efeito da proteína de fusão na divisão celular HUVEC induzida por FGF-2 encontra-se na fig. 6. Como ficou demonstrado neste exemplo, a proteína de fusão 26# possui uma atividade e função biológica ao nível celular que pode inibir a divisão celular HUVEC induzida por FGF-2 e possui a capacidade de ligação com FGF-2. Esta capacidade de ligação aumenta com o aumento da concentração molar da proteína de fusão 26#, que ficou indicada pela inibição da divisão celular HUEC induzida por FGF-2.

[0135] A presente invenção foi já ilustrada através de exemplos específicos. No entanto, quem possuir competência ordinária na técnica terá noção que a presente invenção não se encontra limitada a cada uma das realizações específicas. Podem ser introduzidas várias alterações e modificações por alguém com competência ordinária na técnica dentro do âmbito da presente invenção, e cada característica técnica mencionada na especificação pode ser combinada sem se afastar do espírito e âmbito da invenção. Estas alterações e modificações estão dentro do âmbito da presente invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Proteína de fusão solúvel isolada do receptor do fator de crescimento de fibroblastos (FGFR), caracterizada por consistir em uma parte derivada do domínio extracelular do FGFR e na região Fc da imunoglobulina, em que a parte derivada do domínio extracelular do FGFR consiste nas posições 1-230 da SEQ ID NO: 13 ou codificado pela sequência nucleotídica das posições 1-690 da SEQ ID NO: 20.
2. Proteína de fusão solúvel isolada do receptor do fator de crescimento de fibroblastos (FGFR), caracterizada por consistir na sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 13 ou na sequência de aminoácidos codificada pela molécula de ácido nucleico da sequência nucleotídica indicada pela SEQ ID NO: 20.
3. Molécula de ácido nucleico isolada que codifica a proteína de fusão de qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por consistir na sequência de nucleotídeos indicada pela SEQ ID NO: 20.
4. Vetor caracterizado por conter a molécula de ácido nucleico da reivindicação 3.
5. Composição farmacêutica, caracterizada por compreender a proteína de fusão de acordo com as reivindicações 1 ou 2, a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3, o vetor de acordo com a reivindicação 4, bem como um veículo farmaceuticamente aceitável.
6. Uso da proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1 ou 2, da molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3, o vetor de acordo com a reivindicação 4, ou da composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por ser para preparar um medicamento para a inibição da angiogênese nos mamíferos.
7. Uso da proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1 ou 2, da molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3, o vetor de acordo com a reivindicação 4, ou da composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por ser para preparar um medicamento para tratamento ou prevenção de tumores.