BR112012008950A2 - método de ensaio e dispositivo que envolvem o uso de partículas magnéticas - Google Patents

Abstract

MÉTODO DE ENSAIO E DISPOSITIVO QUE ENVOLVEM O USO DE PARTÍCULAS MAGNÉTICAS. A presente invenção refere-se a um dispositivo de ensaio e a um método para realizar um ensaio, para determinar a presença e, opcionalmente, a quantidade de um analito, usando uma primeira molécula de captura, capaz de se ligar ao analito, e uma segunda molécula de captura também capaz de se ligar ao analito, em que a primeira molécula de captura transporta um primeiro marcador que não é um marcador magnético, e a segunda molécula de captura é fixada a uma partícula magnética.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO DE ' ENSAIO E DISPOSITIVOS QUE ENVOLVEM O USO DE PARTÍCULAS MAGNÉTICAS". Campo da Técnica da Invenção A presente invenção refere-se ao campo de ensaios de diagnós- tico e, em particular, ensaios de fluxo lateral aberto ou pelo menos parcial- mente aberto, onde um analito a ser detectado encontra-se presente em uma amostra biológica complexa.

A invenção disponibiliza dispositivos e mé- todos para aprimorar a manipulação de amostras; por exemplo, aprimorar a cinética de reação e, deste modo, aprimorar a sensibilidade do ensaio, com á base no uso de partículas magnéticas como as moléculas de captura de - transporte de fase sólida.

Antecedentes da Invenção Atualmente, os ensaios de diagnóstico são difundidos e centrais parao diagnóstico, tratamento e controle de muitas doenças.

Diferentes ti- pos de ensaios de diagnóstico foram desenvolvidos ao longo dos anos, a fim de simplificar a detecção de diversos analitos em amostras clínicas, tais co- mo, sangue, soro, plasma, urina, saliva, biópsias de tecido, fezes, esputo, e esfregaços de pele ou garganta.

Frequentemente, espera-se que estes en- saios forneçam um resultado rápido e confiável, sendo fáceis de usar e com baixo custo de fabricação.

De maneira indesejável, é difícil atender todos estes requisitos em um mesmo ensaio.

Na prática, muitos ensaios são limi- tados por sua velocidade.

Outro parâmetro importante é a sensibilidade.

Os desenvolvimentos recentes na tecnologia de ensaio levaram a testes pro- gressivamente mais sensíveis que permitem a detecção de um analito em quantidades traço e, também, a detecção de indicadores de doença em uma amostra no menor tempo possível.

O tipo mais comum de dispositivo de ensaio descartável consiste em uma zona ou área para receber a amostra, uma zona de reação e, op- cionalmente, uma zona de transporte ou incubação que conecta a zona de recebimento e reação, respectivamente.

Estes dispositivos de ensaio são conhecidos como dispositivos de ensaio de cromatografia ou simplesmente referidos como tiras de teste. Eles empregam um material poroso que define Ú uma trajetória para o fluxo de fluido capaz de suportar o fluxo capilar, por . exemplo, um material de filtro. A zona de recebimento de amostra frequentemente consiste em um material mais poroso, capaz de absorver a amostra, e, quando a separa- ção de células sanguíneas for desejada, também, é eficaz para capturar os glóbulos vermelhos. Os exemplos de tais materiais são materiais fibrosos, tais como, papel, lã, gel ou tecido, que compreendem, por exemplo, celulo- se, lã, fibra de vidro, asbestos, fibras sintéticas, polímeros, ou misturas dos mesmos. À A zona de transporte ou incubação consiste comumente dos r mesmos materiais ou similares, muitas vezes, com uma porosidade diferente daquela na zona de recebimento de amostra. Igualmente, a zona de reação, que pode ser integrada à zona de incubação, ou constituir a parte mais distal desta, consiste comumente na absorção de materiais fibrosos similares, ou qualquer um dos materiais listados acima.

Em um dispositivo de ensaio ou tira de teste, os materiais poro- sos são montados em um veículo, tal como, uma tira de material termoplás- tico, papel, papelão, ou similar. Ademais, a cobertura pode ser proporciona- da,sendo que a dita cobertura tem pelo menos uma abertura para receber a amostra, e uma área de abertura ou transparente para permitir uma leitura do resultado do ensaio.

Os materiais de nitrocelulose são frequentemente usados como a matriz que constitui a zona de transporte ou reação, que conecta a zona —derecebimento e a zona de reação. Uma desvantagem significativa da nitro- celulose é a sua alta ligação não específica de proteínas e outras biomolécu- las. As tiras de teste presentes, entietanto, muitas vezes manipulam um ex- cedente de amostra, que reduz a influência desta ligação. Entretanto, é de- sejável minimizar o volume de amostra, de acordo com a tendência a reduzir todoo teste, que inclui minimizar as quantidades de reagentes, sem com- prometer a precisão e confiabilidade.

Um tipo específico de dispositivos de ensaio é o ensaio não po-

roso, por exemplo, o dispositivo de fluxo de lateral aberta, conforme descrito ] nos documentos WO 03/103835, WO 2005/089082, WO 2005/118139 e WO y 2006/137785.

O documento WO 03/103835 menciona resumidamente a incor- poração de "compartimentos, elementos e/ou dispositivos de processamen- to" em um dispositivo de ensaio que tem uma estrutura capilar que facilita ou aciona o fluxo capilar de um líquido ao longo da dita estrutura. Estes "com- partimentos, elementos e/ou dispositivos de processamento" incluem "meios magnéticos para capturar componentes magnéticos do dito líquido". Ade- mais, o documento WO 2003/103835 ensina que "ímãs ou meios para de- ' tecção de substâncias magnéticas também podem ser dispostos na ou ao : redor das trajetórias de fluxo. Deste modo, as partículas magnéticas podem ser capturadas e retidas nos locais desejados na estrutura, e a propriedade magnética das partículas, deste modo, podem ser usadas como um marca- dor ou indicador do transporte bem-sucedido até um determinado ponto no sistema. Além disso, as partículas magnéticas podem ser revestidas com substâncias com afinidade biológica e usadas em diferentes tipos de ensai- os". O ensinamento do documento WO 2003/103835 é focalizado no uso das propriedades magnéticas como outro marcador. Embora sugira que as partí- culas magnéticas também podem ser usadas como veículos, por exemplo, revestidas com substâncias com afinidade biológica, o documento WO 2003/103835 não mostra como isto poderia ser colocado em prática.

O documento WO 2005/089082 menciona o uso de partículas magnéticas em um ensaio não poroso, onde os meios magnéticos são usa- dosparaa separação de componentes indesejados da amostra.

O documento WO 2006/13454686 diz respeito ao uso de marcado- res magnéticos em um dispositivo de captação que compreende pelo menos uma superfície de captação, a superfície de captação que compreende pelo menos um tipo de local de ligação capaz de se fixar especificamente em pe- lomenos um tipo de entidade biológica vinculada aos marcadores magnéti- cos. O dispositivo de captação compreende adicionalmente pelo menos um elemento de sensor magnético, o dispositivo de captação que compreende adicionalmente meios de distinção para distinguir entre os marcadores mag- Í néticos especificamente fixados aos locais de ligação versus marcadores E não especificamente fixados de uma maneira que seja resolvida no tempo. . O documento WO 2007/110779 descreve um método e disposi- tivo de ensaio, onde uma amostra é misturada com partículas magnetica- mente suscetíveis, e onde as ditas partículas podem ser manipuladas atra- vés de um campo magnético aplicado.

O documento WO 2007/129275 descreve um sistema onde as partículas magnéticas são movidas ao longo de uma superfície de sensor dentro de uma câmara de reação, onde as sondas analito-específicas ou É analito-análogas são ligadas à superfície de sensor.

- O documento US 2008160630 descreve um dispositivo para de- tectar um analito em uma amostra, o dito dispositivo que compreende uma rede fluídica que tem uma zona de amostra, uma zona de limpeza e uma zonade detecção. O analito interage com as partículas magnéticas que po- dem ser movidas dentro da rede fluídica que usa microarranjos de bobina ou imãs permanentes mecanicamente móveis.

O documento WO 2009/009408 diz respeito a um sistema e mé- todos para detectar analitos, tais como, células patogênicas. Os métodos permitem a medição direta do analito, tais como, organismos patogênicos, sem a necessidade de preparação de amostra e/ou PCR. O método envolve o uso de esferas magnéticas que têm uma superfície externa que compre- ende uma pluralidade de ligantes que se ligam especificamente a um analito alvo.

Os biossensores que dependem do uso de partículas magnéti- cas tendem a se acumular no ensaio tipo sanduíche tradicional, onde a pri- meira molécula de captura ou elemento de captura é ligado à esfera magné- tica, e a segunda molécula de captura ou elemento de captura é ligado à fase sólida, e o foco principal consiste na utilização das propriedades mag- —néticas para a detecção precisa, até a sensibilidade de única esfera (Jans- sen e outros, in Biosensors and Bioelectronics, 23 (2008) 833-838).

Existe uma necessidade de cinética adicionalmente aprimorada,

sensibilidade aumentada e especificidade nos métodos e dispositivos para í ensaios bioquímicos e biomoleculares, em particular, para ensaios de diag- Ss nóstico onde os requisitos para sensibilidade e precisão são muito altos.

Sumário da Invenção Os presentes inventores tornam disponível um método para a detecção de um analito em uma amostra de líquido que usa um dispositivo de ensaio de fluxo lateral, de preferência, um dispositivo de ensaio de fluxo lateral aberto, que inclui pelo menos uma zona de adição de amostra, pelo menos uma zona de reação, e pelo menos um dissipador em uma superfície, asditas zonas que formam uma trajetória de fluxo capilar para a dita amos- ' tra na dita superfície; uma primeira molécula de captura, capaz de se ligar ao + dito analito, e uma segunda molécula de captura também capaz de se ligar ao dito analito, em que a dita primeira molécula de captura transporta um primeiro marcador que não é um marcador magnético, e a dita segunda mo- lécula de captura é fixada a uma partícula magnética.

Nos métodos, de acordo com as modalidades da invenção, a di- ta partícula magnética tem, de preferência, um tamanho no intervalo de cer- ca de 5 nm a cerca de 5000 nm e, mais preferencialmente, cerca de 50 a cerca de 500 nm. A dita segunda molécula de captura e/ou dita partícula magnética também pode transportar um segundo marcador, distinguível do dito primeiro marcador.

Em uma modalidade, a dita segunda molécula de captura ligada a uma partícula magnética que forma um conjugado de captura, é pré- depositada no dito dispositivo de ensaio, e a dita segunda molécula de cap- tura ligada a um marcador não magnético, que forma um conjugado de de- tecção, é adicionada antes ou simultaneamente à adição da dita amostra.

De maneira alternativa, a dita primeira molécula de captura é pré-depositada no dito dispositivo de ensaio, e a dita segunda molécula de captura é adicionada após ou simultaneamente à adição da dita amostra.

De preferência, tanto as ditas primeiras como as segundas mo- léculas de captura são pré-depositadas no dito dispositivo de ensaio.

De acordo com outra modalidade, livremente combinável com a primeira modalidade descrita, tanto a dita primeira como a dita segunda mo- é lécula de captura são depositadas na dita zona de adição de amostra, e ca- . pazes de serem transportadas ao longo da dita trajetória de fluxo mediante a adição de uma amostra à dita zona de adição de amostra, e reagirem com o analito formando, deste modo, um complexo de detecção que consiste no dito analito, primeira e segunda moléculas de captura, e o dito marcador e partícula magnética.

Na modalidade acima, as ditas primeira e segunda moléculas de captura são transportadas pela amostra, através da influência de força capi- lar, até a dita zona de reação, que forma o dito complexo de detecção.

' De acordo com outra modalidade, livremente combinável com as 7 modalidades descritas acima, uma força magnética é aplicada, a fim de mo- ver a dita segunda molécula de captura com sua partícula magnética fixada para dentro da dita zona de reação. Nesta modalidade, o complexo de de- tecçãoé movido para dentro da zona de reação, por exemplo, retardado ou acelerado, oscilado ou movido para trás e para frente e, de preferência fi- nalmente concentrado em uma localização discreta usando a força magnéti- ca antes da detecção qualitativa ou quantitativa do dito primeiro e/ou segun- do marcador.

A dita amostra pode ser qualquer amostra biológica, ambiental ou clínica, porém, é preferencialmente uma amostra tomada a partir de um mamífero, a amostra escolhida a partir de sangue, soro, plasma, urina, sali- va, biópsias de tecido, fezes, esputo, e esfregaços, tais como, esfregaços de pele ou mucosa, tal como, nariz, garganta e esfregaços genitais, mencio- —nando-se alguns exemplos não limitativos.

As ditas primeira e segunda moléculas de captura podem ser qualquer molécula adequada com afinidade para o analito alvo a ser detec- tado ou quantificado, porém, é preferencialmente escolhido a partir do grupo que consiste em anticorpos, fragmentos de anticorpos, aptâmeros, e se- —quências de ácido nucleico, específicos para o analito a ser detectado.

O dito primeiro e/ou segundo marcador pode ser qualquer mar- cador adequado, porém, preferencialmente escolhido a partir dos cromófo-

ros, fluoróforos, marcadores radioativos e enzimas. á Uma modalidade particular da invenção consiste em um método . para a detecção de um analito em uma amostra de líquido que usa um dis- positivo de ensaio de fluxo lateral que inclui pelo menos uma zona de adição de amostra, pelo menos uma zona de reação e pelo menos um dissipador, as ditas zonas que formam uma trajetória de fluxo capilar para a dita amos- tra; uma primeira molécula de captura, capaz de se ligar ao dito analito, e uma segunda molécula de captura também capaz de se ligar ao dito analito, em que a dita primeira molécula de captura transporta um primeiro marcador que nãoé um marcador magnético, e a dita segunda molécula de captura é ' fixada a uma partícula magnética, em que a dita amostra, e as ditas primeira - e segunda moléculas de captura, são transportadas ao longo da trajetória de fluxo através da influência da força capilar.

Outra modalidade consiste em um método para a detecção de um analito em uma amostra de líquido que usa um dispositivo de ensaio de fluxo lateral que inclui pelo menos uma zona de adição de amostra, uma zo- na de reação, e um dissipador, as ditas zonas que formam uma trajetória de fluxo capilar para a dita amostra; uma primeira molécula de captura, capaz de se ligar ao dito analito, e uma segunda molécula de captura também ca- paz de se ligar ao dito analito, em que a dita primeira molécula de captura transporta um primeiro marcador que não é um marcador magnético, e a dita segunda molécula de captura é fixada a uma partícula magnética, em que as ditas primeira e segunda moléculas de captura são manipuladas através da influência da força magnética.

De acordo com uma modalidade, a força magnética também po- de ser aplicada a partir do lado "aberto" do ensaio. A força magnética, deste modo, pode ser aplicada, não apenas através do substrato, atraindo as par- tículas portadoras magnéticas em direção ao substrato, porém, a partir de cima, ou a partir do lado aberto da estrutura capilar. Os experimentos reali- zados pelos inventores mostram que as partículas magnéticas se concen- tram sob a interface de líquido-ar, sem sair da fase líquida. Isto permite a detecção qualitativa e quantitativa do resultado acima, desimpedido pelo substrato; isto é, sem ter que compensar a influência do substrato em inten- í sidade, distorção de sinal etc. . Os inventores também tornam disponível um dispositivo de en- saio aprimorado para a detecção de um analito em uma amostra, o dito dis- positivo que compreende uma zona de adição de amostra, opcionalmente, uma zona de conjugado, uma zona de reação e um dissipador, as ditas zo- nas que formam uma trajetória de fluxo; uma primeira molécula de captura, capaz de se ligar ao dito analito, opcionalmente depositada no dispositivo; e uma segunda molécula de captura também capaz de se ligar ao dito analito, opcionalmente depositada no dito dispositivo, em que a dita primeira molécu- ' la de captura transporta um primeiro marcador que não é um marcador - magnético, e a dita segunda molécula de captura é fixada a uma partícula magnética.

Em um dispositivo de ensaio, de acordo com a modalidade aci- ma, adita partícula magnética tem, de preferência, um tamanho no intervalo de cerca de 5 nm a cerca de 5000 nm, mais preferencialmente cerca de 50 a cerca de 500 nm. A dita segunda molécula de captura e a partícula magnéti- ca opcionalmente também transportam um segundo marcador, distinguível do dito primeiro marcador.

Em uma modalidade, livremente combinável com a modalidade acima, a dita segunda molécula de captura é pré-depositada no dito disposi- tivo de ensaio. De maneira alternativa, a dita primeira molécula de captura é pré-depositada no dito dispositivo de ensaio. De preferência, tanto as ditas primeiras como as segundas moléculas de captura são pré-depositadas no ditodispositivo de ensaio.

Em outra modalidade, livremente combinável com as modalida- des acima, tanto a dita primeira como a dita segunda moléculas de captura são depositadas na dita zona de adição de amostra, e capazes de serem transportadas ao longo da dita trajetória de fluxo mediante a adição de uma amostra àditazona de adição de amostra.

Em uma modalidade preferida, livremente combinável com as modalidades acima, pelo menos o dito dissipador consiste em projeções,

substancialmente perpendiculares à superfície do dispositivo, e que têm uma Í altura, largura e espaçamento recíproco, de modo que o fluxo capilar seja . induzido na trajetória de fluxo.

De preferência, a trajetória de fluxo consiste em micropilares que são projeções substancialmente verticais em relação a uma superfície, e que têm uma altura, diâmetro e espaçamento recíproco capaz de criar o fluxo lateral da amostra na dita trajetória de fluxo.

De maneira alternativa, a trajetória de fluxo compreende um ma- terial à base de nitrocelulose.

Em uma modalidade, livremente combinável com as modalida- á des acima, a trajetória de fluxo é coberta por uma tampa. A dita tampa ofe- " rece, de preferência, apenas proteção mecânica da trajetória de fluxo, po- rém, não participada da criação do fluxo capilar. Quando uma tampa estiver presente, a mesma é disposta a uma distância da trajetória de fluxo, a dita distância que excede a distância capilar.

De acordo com outra modalidade, livremente combinável com as modalidades acima, a trajetória de fluxo compreende uma área sem micropi- lares dentro da zona de reação. De maneira alternativa, ou, além disso, uma área sem micropilares é proporcionada adjacente à dita trajetória de fluxo em conexão fluida com a mesma.

Ademais, a trajetória de fluxo compreende, de preferência, pelo menos uma área discreta com micropilares que têm uma altura, diâmetro ou espaçamento recíproco diferente dos micropilares nas proximidades da traje- tória de fluxo.

Ainda de acordo com outra modalidade, livremente combinável com as modalidades acima, o dito dispositivo compreende elementos mag- néticos. Os ditos elementos magnéticos são, de preferência, ímãs perma- nentes, incorporados no dispositivo. De maneira alternativa, os ditos elemen- tos magnéticos são elementos capazes de gerar um campo magnético — quando submetidos a um sinal externo; por exemplo, a aplicação de uma corrente elétrica através de um elemento condutor.

Ademais, o dito dispositivo compreende, de preferência, uma á-

rea discreta em conexão com a trajetória de fluxo, a dita área que tem recur- Í sos que aprimoram a leitura do resultado do ensaio. . Em qualquer uma das modalidades acima, o dispositivo é, de preferência, um dispositivo de ensaio descartável.

Ademais, em qualquer uma das modalidades acima, as ditas primeira e segunda moléculas de captura podem ser qualquer molécula a- dequada com afinidade com o analito alvo a ser detectado ou quantificado, porém, são, de preferência, escolhidas a partir do grupo que consiste em anticorpos, fragmentos de anticorpos, aptâmeros, e sequências de ácido —nucleico, específicos para o analito a ser detectado. " Ademais, o dito primeiro e/ou segundo marcador pode ser qual- - quer marcador adequado, porém, é preferencialmente escolhido a partir dos cromóforos, fluoróforos, marcadores radioativos e enzimas. Os inventores também tornam disponível um dispositivo para ler (um leitor) o resultado de um ensaio realizado em um dispositivo de ensaio (uma plataforma de ensaio), em que o dito dispositivo compreende meios para ler um sinal emitido por, ou refletido a partir do dito complexo de detec- ção, meios para computar o sinal e exibir um resultado, e meios capazes de manipular componentes magnéticos presentes no dito dispositivo de ensaio. Em uma modalidade do dispositivo, os ditos meios capazes de manipular os componentes magnéticos presentes no dito dispositivo de en- saio são, de preferência, meios para ativar um elemento ou elementos pre- sentes no dispositivo de ensaio. De maneira alternativa, em outra modalidade do dispositivo, os ditosmeios capazes de manipular os componentes magnéticos presentes no dito dispositivo de ensaio são meios magnéticos capazes de serem coloca- dos a uma distância efetiva do dispositivo de ensaio para manipular os com- ponentes magnéticos presentes no dispositivo de ensaio. Os ditos meios magnéticos podem ser, por exemplo, ímãs permanentes, colocados em con- tato coma uma distância efetiva do dispositivo de ensaio; ou eletroimâãs, presentes a uma distância efetiva do dispositivo, e ativados quando a influ- ência de força magnética for desejada.

Em cada uma das modalidades acima, os ditos meios capazes ó de manipular os componentes magnéticos presentes no dito dispositivo de . ensaio também podem compreender o primeiro meio presente no dito dispo- sitivo para ler o resultado (o leitor), que ativa o segundo meio, presente no dispositivo de ensaio (a plataforma de ensaio), que mediante a ativação gera um campo magnético.

Outra modalidade consiste em um dispositivo para ler o resulta- do de um ensaio realizado em um dispositivo de ensaio, em que o dito dis- positivo compreende um detector capaz de ler um sinal emitido a partir de ou refletido a partir de pelo menos um complexo de detecção presente em uma À localização definida do dito dispositivo de ensaio, e meios capazes de atrair . os componentes magnéticos presentes no dito dispositivo de ensaio até a dita localização antes de ler o dito sinal.

Na modalidade acima, o dito meio pode compreender o primeiro meio presente no dito dispositivo para ler o resultado, que ativa o segundo meio, presente no dispositivo de ensaio, que mediante a ativação gera um campo magnético capaz de atrair os componentes magnéticos presentes no dito dispositivo de ensaio até a localização definida antes de ler o dito sinal.

Em cada uma das modalidades acima, a leitura é escolhida, de preferência, a partir da detecção e/ou quantificação de cor, fluorescência, radioatividade ou atividade enzimática.

O método, o dispositivo de ensaio e o leitor, de acordo com uma modalidade da invenção, têm muitas vantagens, principalmente relacionadas à cinética de reação aprimorada das reações imunoquímicas e da sensibili- dade aumentada do ensaio.

Outra vantagem consiste no fato de que o método pode ser apli- cado em plataformas de ensaio existentes e, em particular, na plataforma de fluxo lateral aberto.

Uma vantagem adicional consiste no fato de que a deposição da segunda molécula de captura, covalentemente acoplada à partícula magné- tica, na zona de adição de amostra é mais fácil que a imobilização covalente separada e discreta das moléculas de captura em uma ou diversas posições na zona de reação que omite a ativação da superfície de canal de fluxo. í Deste modo, o método e o dispositivo, de acordo com diversas modalidades . da invenção, tornam possível manipular as moléculas de captura em um ambiente na medida do possível otimizado para as ditas entidades, sem ter quelevarem consideração os requisitos de posicionamento e imobilização precisos. Em vez disso, a imobilização é atingida aplicando-se uma força magnética externa.

A molécula de captura que é fixada a uma partícula magnética pode ser manipulada dentro da trajetória de fluxo, de preferência, agitada, oscilada, transportada, imobilizada, e similares, a fim de aprimorar a mistura í e, deste modo, a cinética de reação, prolongar o tempo de contato entre o * analito e as moléculas de captura, e focalizar os conjugados de detecção antes de ler o resultado do ensaio.

Ademais, não apenas o conjugado de captura, mas, também, o complexo de detecção que compreende as primeira e segunda moléculas de captura, o analito, a partícula magnética e um ou mais marcadores, pode ser manipulado, de preferência, imobilizado ou oscilado. No caso de o sistema ser satisfeito, a oscilação das partículas durante a leitura do sinal irá aprimo- rar a leitura, à medida que as partículas, de outro modo, podem escurecer os marcadores.

Também, é uma vantagem ser capaz de concentrar o complexo de detecção a uma localização específica, dentro da trajetória de fluxo, ou fora da mesma, antes da leitura do resultado. Isto é vantajoso, por exemplo, em situações onde o fundo é alto.

Ainda uma vantagem adicional consiste no fato de que a super- fície do dispositivo de ensaio requer apenas mínima ou nenhuma modifica- ção química para acomodar a reação química, à medida que toda química se situa nas partículas.

Estes e outros recursos e vantagens serão adicionalmente dis- cutidos na descrição detalhada a seguir, que pode ser lida em conjunto com os desenhos em anexo.

Breve Descrição dos Desenhos

— — 13/31 A invenção será descrita em mais detalhes abaixo, na descrição ' e nos exemplos não limitativos, e com referência aos desenhos em anexo, . em que: a figura 1 mostra esquematicamente uma plataforma de ensaio defluxolateral,de acordo com uma modalidade exemplificativa da invenção; a figura 2 mostra esquematicamente a captura e detecção de um analito que usa duas moléculas de captura, a partir do qual uma molécula de captura é acoplada a uma partícula magnética; as figuras 3a, b, c e d mostram esquematicamente diversas mo- —dalidades de um dispositivo de ensaio de fluxo lateral, de acordo com a in- | venção;

. as figuras 4 a e b mostram duas modalidades de uma plataforma de ensaio de fluxo lateral onde uma localização discreta é formada, mostra- da aqui como um anexo à trajetória de fluxo principal, em conexão fluida comamesma;e a figura 5 mostra os resultados de um ensaio de ligação ao ana- lito de ligação CRP marcada por fluoróforo medido como o sinal (RFU) em diversas concentrações de anticorpo anti-CRP ligado a esferas magnéticas retardadas por um ímã.

Descrição Detalhada da invenção Antes de a invenção ser revelada e descrita em detalhes, deve- se entender que esta invenção não se limita aos dispositivos, compostos, configurações, etapas de método, substratos e materiais particulares descri- tos no presente documento, tais como, dispositivos, compostos, configura- ções, etapas de método, substratos e materiais podem variar um pouco.

Também, deve-se entender que a terminologia empregada no presente do- cumento é usada para o propósito apenas de descrever as modalidades par- ticulares e não se destina a ser limitativa, uma vez que o escopo da presente invenção é limitado apenas pelas reivindicações em anexo e equivalentes dasmesmas.

Deve-se notar que, conforme usado no relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" inclu-

em referentes no plural, exceto onde o contexto indica claramente em con- ' trário. . Se nada mais for definido, quaisquer termos e terminologia cien- tífica usados no presente documento se destinam a ter os significados co- mumente entendidos por aqueles versados na técnica à qual esta invenção pertence.

O termo "cerca de", conforme usado em conexão com um valor numérico ao longo da descrição e das reivindicações denota um intervalo de precisão, familiar e aceitável para uma pessoa versada na técnica. O dito intervalo é de +- 10%.

' O termo "molécula de captura" significa uma molécula adequa- . damente escolhida por sua afinidade com o composto ou compostos biológi- cos alvos ou sua afinidade com as modificações relevantes do dito composto ou compostos biológicos alvos. Por exemplo, se os compostos biológicos alvos forem DNA, a molécula de captura pode ser, porém, não se limita a, oligonucleotídeos sintéticos, análogos destes ou anticorpos específicos. Um exemplo não limitativo de uma modificação adequada de uma molécula de captura é um composto biológico alvo substituído por biotina, em tal caso, a sonda pode sustentar a funcionalidade da avidina.

O termo "marcador" designa um agente que é detectável em re- lação à sua distribuição física e/ou a intensidade do sinal que este distribui, tal como, porém, não limitado às moléculas luminescentes (por exemplo, agentes fluorescentes, agentes fosforescentes, agentes quimiluminescentes, agentes bioluminescentes, e similares), moléculas coloridas, moléculas que produzem cores mediante reação, enzimas, radioisótopos, ligantes que exi- bem ligação específica, e similares.

Dois marcadores são "distinguíveis" quando eles puderem ser individualmente detectados e, de preferência, simultaneamente quantifica- dos, sem perturbar, interferir ou arrefecer uns aos outros.

O termo "manipulado" se destina a significar exercer uma influ- ência nas partículas magnéticas, e nas moléculas de captura ligadas a es- tas, ou todo o complexo de detecção, que compreende uma partícula mag-

nética. "Manipular" compreende tanto retardar como acelerar o movimento í das partículas em relação ao seu movimento na ausência da força magnéti- k ca. Este termo também abrange as partículas que são movidas em uma, du- as ou três direções, tais como, para trás e para frente em relação ao fluxo da amostra, transversalmente em relação ao fluxo da amostra, ou oscilados dentro da camada de amostra no dispositivo de ensaio. O termo também abrange as moléculas de captura, ou todo o complexo de detecção, que são movidos até localizações diferentes no dispositivo de ensaio, por exemplo, retornados até a zona de adição de amostra para contato prolongado com a amostra, circulados dentro da zona de reação para cinética aprimorada, ou À concentrados em uma localização específica para ler o resultado do ensaio, p etc.

"Dissipador" conforme usado ao longo das reivindicações e da descrição denota uma área com a capacidade de receber a amostra de lí- quido.

Os presentes inventores tornam disponível um método para a detecção de um analito em uma amostra de líquido que usa um dispositivo de ensaio de fluxo lateral que inclui pelo menos uma zona de adição de a- mostra, pelo menos uma zona de reação, e pelo menos um dissipador, as ditas zonas que formam uma trajetória de fluxo capilar para a dita amostra; uma primeira molécula de captura, capaz de se ligar ao dito analito, e uma segunda molécula de captura também capaz de se ligar ao dito analito, em que a dita primeira molécula de captura transporta um primeiro marcador que não é um marcador magnético, e a dita segunda molécula de captura é fixadaauma partícula magnética.

A Figura 2 mostra esquematicamente a captura e detecção de um analito 16, usando os conjugados de detecção 10 que compreendem uma primeira molécula de captura 11 e um marcador 12, por exemplo, um fluoróforo, e conjugados de captura 13 que compreendem uma segunda mo- —léculade captura 14, que é igual ou diferente da primeira molécula de captu- ra 11, e uma partícula magnética 15. Quando colocados em contato com o analito 16, os conjugados de detecção e captura 10 e 13 formam respecti-

vamente um complexo de detecção 17. De acordo com uma modalidade da i invenção, este complexo de detecção 17 pode ser manipulado usando um y imã 18, por exemplo, imobilizado em uma localização específica na superfi- cie de um dispositivo de ensaio, por exemplo, um chip, esquematicamente indicado aqui como 19. Nos métodos, de acordo com as modalidades da invenção, a di- ta partícula magnética tem, de preferência, um tamanho no intervalo de cer- ca de 5 nm a cerca de 5000 nm e, mais preferencialmente, cerca de 50 a cerca de 500 nm. As partículas magnéticas adequadas são conhecidas na literatu- í ra, e disponíveis a partir de fornecedores comerciais [[,]]; por exemplo, Che- F micell GmbH, de Berlin, Alemanha; Bioclone Inc., de San Diego, CA, USA; Nanoestruturad & Amorphous Materials, Inc., de Huston, TX, USA. As partí- culas magnéticas conhecidas para biosseparação consistem em um ou mais núcleos magnéticos com uma matriz de revestimento de polímeros, sílica ou hidroxilapatita com grupos terminais funcionalizados. O núcleo magnético geralmente consiste em magnetita (FesOs) ou maghemita (gamma Fe2Oz) com propriedades superparamagnéticas ou ferromagnéticas. De maneira alternativa, os núcleos magnéticos produzidos com ferritas magnéticas, tal como, ferrita de cobalto ou ferrita de manganês tam- bém podem ser produzidos. As partículas magnéticas também podem ser fabricadas em ordem, e dadas as propriedades desejadas para uma deter- minada aplicação. Os exemplos não limitativos de partículas magnéticas são fornecidos na Tabela 1: Tabela 1 e Eme com poliestireno ça PN PAN (PN 113 e) França

NO LA PAM (PN 145TTb)

Descrição Diametro Fabricante . médio (um) Adembeads |Nanopartículas — superparamag-|0,2 ' néticas uniformes IMCASCR lÁcido algínico — partículas de NA magnetita AEHMBP Partículas de magnetita revesti-/0,5— 1,0 NA das com ácido [(2-amino- etil)hidroximetileno]-biofosfônico Microesferas | Partículas magnéticas revestidas [2,5 NA de po-|com poli(2-hidroxietil metacrilato- : l(HEMA-co- |coetileno dimetacrilato) EDMA) - Microesferas | Poli(glicidilmetacrilato) 2,9 NA de PGMA A dita segunda molécula de capturar/ou a dita partícula magnéti- ca também pode transportar um segundo marcador, distinguível do dito pri- meiro marcador. Em uma modalidade, o dito primeiro conjugado de detecção é —pré-depositado no dito dispositivo de ensaio, e o dito segundo conjugado de captura é adicionado após ou juntamente com a adição da dita amostra. AI- ternativamente, o dito segundo dito segundo conjugado de capturar pré- depositado no dito dispositivo de ensaio, e o dito primeiro conjugado de de- tecção é adicionado após ou simultaneamente com a adição da dita amos- tra. De preferência, tanto os ditos conjugados de detecção como de captura são pré-depositados no dito dispositivo de ensaio.

Na modalidade acima, as ditas primeira e segunda moléculas de captura são transportadas pela amostra, apesar da influência de força capi- ; lar, para a dita zona de reação, formando o dito complexo de detecção.

De acordo com outra modalidade, livremente combinável com as modalidades descritas acima, uma força magnética é aplicada para mover a dita segunda molécula de captura com sua partícula magnética fixada dentro da dita zona de reação. O conjugado de captura pode ser retardado, acele- rado, oscilado, movido para trás e para frente, ou manipulado de qualquer p——<qºú O ne, 18/31 outra maneira adequada. Em uma modalidade preferida, o complexo de de- ' tecção é concentrado em um local distinto utilizando força magnética antes : da detecção qualitativa ou quantitativa do dito primeiro e/ou segundo marca- dor.

A dita amostra é, de preferência, uma amostra retirada de um mamífero, selecionada a partir de sangue, soro, plasma, urina, saliva, bióp- sias de tecido, fezes, e os denominados esfregaços, como esfregaços de pele ou membranas da mucosa, por exemplo, porém sem caráter limitativo, nariz, garganta ou genitália.

As ditas primeira e segunda moléculas de captura são, de prefe- rência, selecionadas a partir do grupo que consiste em anticorpos, fragmen- - tos de anticorpos, aptâmeros, e sequências de ácido nucleico, específicas para o analito a ser detectado.

O dito primeiro e/ou segundo marcador é, de preferência, um marcador selecionado a partir de cromóforos, fluoróforos, marcadores radio- ativos, e enzimas. Os marcadores adequados estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais, proporcionando uma ampla gama de corantes para a marcação de anticorpos, proteínas, e ácidos nucleicos. Há, por exemplo, fluoróforos que atravessam praticamente todo o espectro visível e infraver- melho. Os marcadores fluorescentes ou fosforescentes adequados incluem, por exemplo, porém sem caráter limitativo, fluoresceínas, Cy3, Cy5 e simila- res. Os marcadores quimioluminescentes adequados são, por exemplo, po- rém sem caráter limitativo, luminol, cialume e similares. Similarmente, os marcadores radioativos estão comercialmente disponíveis, ou as moléculas de captura podem ser sintetizadas de modo que essas incorporem um marcador radioativo. Os marcadores radioativos adequados são, por exemplo, porém sem caráter limitativo, iodo e fósforo radioativo; por exemplo, 1251 e 32P.

Os marcadores enzimáticos adequados são, por exemplo, po- rém sem caráter limitativo, peroxidase de raiz-forte, beta-galactosidase, luci- ferase, fosfatase alcalina e similares. Uma modalidade particular da invenção é um método para a de-

tecção de um analito em uma amostra líquida utilizando um dispositivo de ' ensaio de fluxo lateral que inclui pelo menos uma zona de adição de amos- . tra, pelo menos uma zona de reação, e pelo menos um dissipador sobre uma superfície, sendo que as ditas zonas formam uma trajetória de fluxo —capilarparaa dita amostra sobre a dita superfície; uma primeira molécula de captura, capaz de se ligar ao dito analito, e uma segunda molécula de captu- ra também capaz de se ligar ao dito analito, em que a dita primeira molécula de captura transporta um primeiro marcador que não é um marcador magné- tico, e a dita segunda molécula de captura é fixada em uma partícula magné- tica, em que a dita amostra, e as ditas primeira e segunda moléculas de cap- tura, são transportadas pela amostra alongo da trajetória de fluxo por meio - da influência de força capilar.

Outra modalidade é um método para a detecção de um analito em uma amostra líquida utilizando um dispositivo de ensaio de fluxo lateral —queinclui pelo menos uma zona de adição de amostra, uma Zona de reação, e um dissipador sobre uma superfície, sendo que as ditas zonas formam uma trajetória de fluxo capilar para a dita amostra sobre a dita superfície; uma primeira molécula de captura, capaz de se ligar ao dito analito, e uma segunda molécula de captura também capaz de se ligar ao dito analito, em queadita primeira molécula de captura porta um primeiro marcador que não é um marcador magnético, e a dita segunda molécula de captura é fixada em uma partícula magnética, em que as ditas primeira e segunda moléculas de captura são manipuladas através da influência da força magnética.

As moléculas ligadas às partículas magnéticas podem ser retardadas e acele- —radas em relação ao seu movimento na ausência da força magnética.

O re- tardo do movimento de uma partícula fará com que essa se mova mais len- tamente do que a amostra, e pode prolongar o tempo de contato.

A acelera- ção da partícula pode ajudar a agitar a amostra, também aprimorando o con- tato e a cinética da reação.

A manipulação das partículas também abrange que as partículas são movidas em uma, duas ou três direções, como para trás e para frente em relação ao fluxo da amostra, transversalmente em rela- | ção ao fluxo da amostra, ou osciladas dentro da camada de amostra sobre o dispositivo de ensaio. Isso também abrange que as moléculas de captura, ou : todo o complexo de detecção, são movidas para locais diferentes no disposi- y tivo de ensaio, por exemplo, retornadas para a zona de adição de amostra para um contato prolongado com a amostra, circuladas dentro da zona de reação para cinética aprimorada, ou concentradas em um local específico para ler o resultado do ensaio, etc.

De acordo com uma modalidade da invenção, o método é apli- cado a um ensaio de fluxo lateral, por exemplo, um ensaio realizado em uma plataforma como esquematicamente mostrado na Figura 1. Essa plataforma de ensaio de fluxo lateral, ou o denominado chip de ensaio 1, possui pelo i menos uma zona de amostra 2, opcionalmente pelo menos uma zona de p conjugado 3, pelo menos uma zona de reação 4 opcionalmente compreen- dendo várias zonas de reação (não mostradas), colocadas em paralelo entre a zona de amostra e pelo menos um dissipador 5. A trajetória de fluxo pode compreender trajetórias abertas ou fechadas, sulcos e/ou capilares. De pre- ferência, a trajetória de fluxo compreende uma trajetória de fluxo lateral de projeções adjacentes, cada uma possuindo um tamanho, formato e espaça- mento mútuo de modo que o fluxo capilar seja mantido através da dita traje- tória de fluxo. A Figura 1 também indica esquematicamente a posição de um oumais elementos magnéticos 6, incorporados na plataforma de ensaio, ou elementos de um leitor (não mostrado), que podem ser colocados em conta- to operacional com o chip de ensaio 1.

Em uma modalidade a trajetória de fluxo está pelo menos parci- almente aberta. Em outra modalidade a trajetória de fluxo está completa- mente aberta. "Aberto" de acordo com essa invenção significa que não há tampa ou cobertura em uma distância capilar. Deste modo, a tampa, se pre- sente como uma proteção física para a trajetória de fluxo, não contribui para o fluxo capilar na dita trajetória de fluxo. Uma trajetória de fluxo lateral aberta é descrita por exemplo, nos seguintes pedidos publicados: WO | 30 2003/103835, WO 2005/089082; WO 2005/118139; WO 2006/137785; e WO 2007/149042. Detalhes sobre os micropilares bem como sua altura, diâmetro e espaçamento recíproco podem ser obtidos a partir desses documentos,

incorporados aqui em sua totalidade. i De acordo com uma modalidade do método, a força magnética é A aplicada ao lado "aberto" do ensaio. A força magnética é, deste modo, apli- cada de cima, ou a partir do lado aberto da estrutura capilar. Os experimen- tos realizados pelos inventores mostram que as partículas magnéticas se concentram sob a interface líquido-ar, sem sair da fase líquida. Isso permite a detecção qualitativa e quantitativa do resultado acima, desimpedida pelo substrato:isto é, sem ter que compensar a influência do substrato sobre a intensidade, distorção de sinal, etc. Os inventores também tornam disponível um dispositivo de en- : saio aprimorado para a detecção de um analito em uma amostra, sendo que . o dito dispositivo compreende uma zona de adição de amostra, uma zona de reação, e um dissipador, sendo que as ditas zonas formam uma trajetória de fluxo; uma primeira molécula de captura, capaz de se ligar ao dito analito, opcionalmente depositado no dispositivo; e uma segunda molécula de captu- ra também capaz de se ligar ao dito analito, opcionalmente depositado no dito dispositivo, em que a dita primeira molécula de captura porta um primei- ro marcador que não é um marcador magnético, e a dita segunda molécula de captura é fixada em uma partícula magnética.

Em um dispositivo de ensaio de acordo com a modalidade aci- ma, a dita partícula magnética possui, de preferência, um tamanho no inter- valo de cerca de 5 nm a cerca de 5000 nm, com mais preferência, cerca de 50 a cerca de 500 nm. A dita segunda molécula de captura e a partícula magnética opcionalmente também portam um segundo marcador, distinguí- —veldodito primeiro marcador.

| Em uma modalidade, livremente combinável com a modalidade acima, a dita segunda molécula de captura é pré-depositada no dito disposi- tivo de ensaio. Alternativamente, a dita primeira molécula de captura é pré- depositada no dito dispositivo de ensaio. De preferência, as ditas primeira e | 30 segunda moléculas de captura são pré-depositadas no dito dispositivo de ensaio.

Em outra modalidade, livremente combinável com as modalida-

des acima, a dita primeira e a dita segunda moléculas de captura são depo- í sitadas na dita zona de adição de amostra, e capazes de serem transporta- . das ao longo da dita trajetória de fluxo mediante a adição de uma amostra à dita zona de adição de amostra.

Em uma modalidade preferida, livremente combinável com as modalidades acima, pelo menos o dito dissipador consiste em projeções, substancialmente perpendiculares à superfície do dispositivo, e possui uma altura, largura, e espaçamento recíproco de modo que o fluxo capilar seja induzido na trajetória de fluxo.

De preferência, a trajetória de fluxo consiste em micropilares que : são projeções substancialmente verticais em relação a uma superfície, e - possuem uma altura, diâmetro e espaçamento recíproco capazes de criar um fluxo lateral da amostra na dita trajetória de fluxo. Como descrito acima, uma trajetória de fluxo lateral aberta foi descrita e definida, por exemplo, nos seguintes pedidos publicados: WO 2003/103835, WO 2005/089082; WO 2005/118139; WO 2006/137785; e WO 2007/149042.

Um dispositivo de acordo com a invenção é esquematicamente mostrado nas Figuras 3a- 3d, onde uma seção da trajetória de fluxo ou zona dereação4 é mostrada em vistas alternativas, sendo que cada vista ilustra uma modalidade diferente da invenção, livremente combinável com outras modalidades.

A Figura 3a mostra um corte transversal parcial esquemático de um dispositivo ou plataforma de ensaio de acordo com uma modalidade em queos conjugados que compreendem uma molécula de captura e uma par- tícula magnética são manipulados utilizando força magnética, ilustrados aqui como elementos magnéticos 20, 22, 24, 26, e 28 dispostos ou colocados em uma distância operacional do dispositivo de ensaio para influenciar o movi- mento e/ou posição das moléculas de captura ligadas às partículas magnéti- cas, ouao complexo de detecção, compreendendo partículas magnéticas. Os elementos magnéticos 20, 22, 24, 26, e 28 podem ser colocados em con- tato operacional com o dispositivo, ou ativados, em série, em paralelo, ou em uma sequência ou padrão desejado para influenciar o tempo de contato en- f tre as moléculas de captura e a amostra, aprimorar a mistura e a cinética de . reação. Isso pode ser realizado, por exemplo, ao mover mecanicamente um Ímã, ou ao ativar um ou mais eletroímãs.

Como descrito acima, em relação ao método, aqui também as moléculas ligadas às partículas magnéticas também podem ser retardadas e aceleradas em relação ao seu movimento na ausência da força magnética. O retardo do movimento de uma partícula fará com que essa se mova mais lentamente do que a amostra, e pode prolongar o tempo de contato. A acele- ração da partícula pode ajudar a agitar a amostra, também aprimorando o À contato e a cinética da reação. A manipulação das partículas também a- " brange que as partículas são movidas em uma, duas ou três direções, como para trás e para frente em relação ao fluxo da amostra, transversalmente em relação ao fluxo da amostra, ou osciladas dentro da camada de amostra so- breo dispositivo de ensaio. Isso também abrange que as moléculas de cap- tura, ou todo o complexo de detecção, são movidas para locais diferentes no dispositivo de ensaio, por exemplo, retornadas para a zona de adição de amostra para um contato prolongado com a amostra, circuladas dentro da zona de reação para cinética aprimorada, ou concentradas em um local es- pecífico para lero resultado do ensaio, etc.

A Figura 3b mostra uma modalidade de um dispositivo de ensai- o1de acordo com outra modalidade, que possui uma trajetória de fluxo, mos- trada aqui como parte da zona de reação 4, em que os conjugados que compreendem uma molécula de captura e uma partícula magnética são au- —xiliados por um elemento magnético móvel 32 na ligação de uma lacuna ou descontinuidade 30 na trajetória de fluxo, por exemplo, uma porção sem mi- cropilares, uma porção com fluxo capilar reduzido, uma porta de tempo, etc.

A Figura 3c mostra outra modalidade de um dispositivo de en- saio1de acordo com outra modalidade, que possui uma trajetória de fluxo; por exemplo, a zona de reação 4, onde os conjugados que compreendem uma molécula de captura e uma partícula magnética são puxados por força magnética para um ou mais locais específicos, distintos na plataforma de ensaio; por exemplo, uma seção da trajetória de fluxo, um local fora da traje- ' tória de fluxo, ou outro local, por exemplo, para facilitar a leitura do resultado. . Um local distinto é ilustrado aqui como uma área 42 sem micropilares dentro da trajetória de fluxo. Um elemento 40; por exemplo, um ímã permanente ou um eletroímã, é esquematicamente mostrado em uma posição correspon- dente ao local da área 42. Esse elemento pode ser integrado no dispositivo de ensaio1, ou, de preferência, parte de um dispositivo para ler o resultado. A Figura 3d mostra outra modalidade de um dispositivo de en- saio 1 que possui uma trajetória de fluxo, por exemplo, a zona de reação 4, em que um elemento magnético estacionário 50 em associação com uma descontinuidade 52 na trajetória de fluxo, pode funcionar como uma válvula « ou porta de tempo. A descontinuidade na trajetória de fluxo constitui uma descontinuidade na força capilar, e impede que a mistura de amostra e as moléculas de captura avancem ao longo da trajetória de fluxo sob a influên- ciada dita força capilar. Ao ativar o elemento magnético, as moléculas de captura ligadas às partículas magnéticas, bem como os complexos de de- tecção que compreendem partículas magnéticas, são puxadas para a des- continuidade, umedecendo a extremidade oposta da trajetória de fluxo e res- tabelecendo o fluxo capilar.

O dispositivo de ensaio de acordo com as modalidades da in- venção também pode ser aplicado a outros formatos e plataformas, como materiais absorventes, por exemplo, materiais à base de fibra de nitrocelulo- se. Um dispositivo de ensaio de acordo com as modalidades da invenção também pode ser um recipiente de reação, como um poço de uma placa de microtitulação.

Alternativamente, a trajetória de fluxo compreende um material à base de nitrocelulose.

Em uma modalidade, livremente combinável com as modalida- des acima, a trajetória de fluxo é coberta por uma tampa. A dita tampa, de preferência, não participa na criação de fluxo capilar.

De acordo com outra modalidade, livremente combinável com as modalidades acima, a trajetória de fluxo compreende uma área sem micropi-

lares dentro da zona de reação. Alternativamente, ou, além disso, uma área ' sem micropilares é proporcionada adjacente à dita trajetória de fluxo em co- . nexão fluida com essa. A descrição anterior é ilustrada na Figura 4a, que mostra uma — modalidade de uma plataforma de fluxo ensaio de fluxo lateral, ou o denomi- nado chip de ensaio 1, que possui uma zona de adição de amostra 2, uma zona de conjugado 3, uma zona de reação 4, e um dissipador 5, formando uma trajetória de fluxo entre a dita zona de adição de amostra e o dito dissi- pador, onde um local distinto 60 é formado, mostrado aqui como um apêndi- ceparaa trajetória de fluxo principal, em conexão fluida com esse. Ademais, a Figura 4b mostra como o local distinto, denotado a- , qui 62 pode ser um apêndice para a zona de reação 4 em uma plataforma ou chip de ensaio 1. Essa área 62 também está em conexão fluida com a trajetória de fluxo, porém possui, entretanto, uma estrutura diferente, mos- trada aqui como uma área sem micropilares.

De acordo com outra modalidade, livremente combinável com as modalidades acima, a trajetória de fluxo compreende, de preferência, pelo menos uma área distinta com micropilares possuindo uma altura, diâmetro ou espaçamento recíproco diferente daquele dos micropilares na trajetória defluxocircundante.

Ainda de acordo com outra modalidade, também livremente combinável com as modalidades acima, o dito dispositivo compreende ele- mentos magnéticos. Os ditos elementos magnéticos são, por exemplo, ímãs permanentes, incorporados no dispositivo. Alternativamente, os ditos ele- mentos magnéticos são elementos capazes de gerar um campo magnético quando submetidos a um sinal externo; por exemplo, a aplicação de uma corrente elétrica através do dito elemento.

Ademais, o dito dispositivo compreende, de preferência, uma á- rea distinta em conjunto com a trajetória de fluxo, sendo que a dita área pos- suicaracterísticas que aprimoram a leitura do resultado do ensaio.

Em qualquer uma das modalidades acima, o dispositivo é, de preferência, um dispositivo de ensaio descartável.

Ademais, em qualquer uma das modalidades acima, as ditas " primeira e segunda moléculas de captura são, de preferência, selecionadas . a partir do grupo que consiste em anticorpos, fragmentos de anticorpo, ap- tâmeros, e sequências de ácido nucleico, específicos para o analito a ser detectado.

Ademais, o dito primeiro e/ou segundo marcador é, de preferên- cia, um marcador selecionado a partir de cromóforos, fluoróforos, marcado- res radioativos, e enzimas. Exemplos de marcadores são dados acima na descrição anterior, e igualmente aplicáveis nesse contexto.

O dispositivo e métodos de ensaio de acordo com as modalida- des da invenção também podem ser aplicados a outros formatos de ensaio e , plataformas de ensaio, como ensaios conduzidos em materiais absorventes, como materiais à base de fibra de nitrocelulose. O dispositivo e métodos de ensaio de acordo com as modalidades da invenção também podem ser apli- cados a ensaios conduzidos em suspensão, em recipientes de reação, ou pelo menos parcialmente ligados às paredes de recipientes de reação.

Os inventores também tornam disponível um dispositivo para ler (um leitor) o resultado de um ensaio realizado em um dispositivo de ensaio (uma plataforma de ensaio), em que o dito dispositivo compreende meios —paraler um sinal emitido, ou refletido do dito complexo de detecção, meios para computar o sinal e exibir um resultado, e meios capazes de manipular os componentes magnéticos presentes no dito dispositivo de ensaio.

De acordo com uma modalidade do dispositivo, os ditos meios capazes de manipular os componentes magnéticos presentes no dito dispo- sitivo de ensaio compreendem um ou mais ímãs permanentes que podem ser colocados em contato eficaz ou eletroímãs ativados dentro da distância eficaz do dispositivo ou chip de ensaio.

Em outra modalidade do dispositivo, os ditos meios capazes de manipular os componentes magnéticos presentes no dito dispositivo de en- saio são meios para induzir uma força magnética, ativar os eletroímãs ou outros elementos presentes no dispositivo de ensaio.

Exemplos de elementos que podem ser ativados incluem, porém sem caráter limitativo, elementos magnéticos termicamente ativados, ele- . mentos como bobinas que são eletricamente ativadas, elementos de condu- . ção que induzem um campo magnético quando submetidos a uma corrente elétrica, e elementos à base de Fe que são magnetizados quando colocados emcontato com um ímã externo.

Alternativamente, em outra modalidade do dispositivo, os ditos meios capazes de manipular os componentes magnéticos presentes no dito dispositivo de ensaio são meios magnéticos que são parte de um dispositivo para ler os resultados do ensaio, e capazes de ser colocados em uma dis- tância eficaz do dispositivo de ensaio para manipular os componentes mag- néticos presentes no dispositivo de ensaio. De preferência, os eletroímãs r são dispostos no leitor em uma distância eficaz do dispositivo de ensaio, ou chip, quando na posição no leitor, e os ditos eletroímãs podem ser então ativados quando desejado, para exercer uma influência sobre as partículas magnéticas no conjugado de captura ou no complexo de detecção.

Em cada modalidade acima, os ditos meios capazes de manipu- lar os componentes magnéticos presentes no dito dispositivo de ensaio tam- bém podem compreender um primeiro meio presente no dito dispositivo para ler o resultado (o leitor), que ativa o segundo meio, presente no dispositivo deensaio(a plataforma de ensaio), que mediante a ativação gera um campo magnético.

Outra modalidade é um dispositivo para ler o resultado de um ensaio realizado em um dispositivo de ensaio, em que o dito dispositivo compreende um detector capaz de ler um sinal emitido ou refletido de pelo menos um complexo de detecção presente em um local definido do dito dis- positivo de ensaio, e meios capazes de puxar os componentes magnéticos presentes no dito dispositivo de ensaio para o dito local antes de ler o dito sinal.

Na modalidade acima, os ditos meios consistem no primeiro meio presente no dito dispositivo para ler o resultado, que ativa o segundo meio, presente no dispositivo de ensaio, que mediante a ativação gera um campo magnético capaz de puxar os componentes magnéticos presentes no dito dispositivo de ensaio para o dito local antes de ler o dito sinal. Em cada Í modalidade acima, a leitura é, de preferência, selecionada a partir da detec- . ção e/ou quantificação de cor, fluorescência, radioatividade ou atividade en- zimática.

Será entendido que essa invenção não se limita às modalidades particulares mostradas aqui. Os seguintes exemplos são fornecidos para propósitos ilustrativos e não pretendem limitar o escopo da invenção visto que o escopo da presente invenção é limitado apenas pelas reivindicações em anexo e equivalentes dessas.

Exemplos : Exemplo 1 - A vantagem de se utilizar esferas magnéticas como a fase sólida em um ensaio de fluxo lateral foi demonstrada em um ensaio de ligação ao analito utilizando um desenho de ensaio padrão para comparação, isto é, ondeo anticorpo de captura está ligado à trajetória de fluxo. O analito usado foi a proteina C-reativa (CRP), um marcador para inflamação e insuficiência cardíaca. O teste foi realizado em um veículo não poroso, que possui uma disposição de micropilar que define uma trajetória de fluxo lateral aberta, como descrito, por exemplo, em um entre WO 2003/103835, WO 2005/089082; WO 2005/118139; WO 2006/137785; e WO 2007/149042. Os chips de substrato plástico feitos de Zeonor8 (Zeon Corporation, Japão) fo- ram fabricados por Amic AB, Uppsala, Sweden. OS chips ou dispositivos de ensaio foram projetados substancialmente como ilustrado na Figura 1. Um anticorpo anti-CRP M701189 (Fitzgerald, USA) foi ligado a esferas paramagnéticas de diâmetro 0,2 um (Adembeads, Ademtech, Fran- ça) em tampão de reação (25 mM de tampão MES, pH 6,0) formando o pro- duto conta-aCRP. As esferas carboxiladas (4x10E11partículas) foram incu- badas com 50 mg/ml de cloridrato de 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodi- imida e 50 mg/ml de Sulfo-N-hidroxil succinimida éster durante 30 min em temperatura ambiente, em um volume total de 100 ul de tampão de reação. As esferas foram lavadas duas vezes com 100 ul de tampão, a- plicando-se um ímã forte para a remoção de soluções. As esferas ativadas foram subsequentemente incubadas com 132 um 2,1 mg/ml de anticorpos anti-CRP durante 30 minutos em temperatura ambiente.

O excesso de anti- . corpo foi removido por lavagem duas vezes com 300 ul de tampão de reação seguido por duas vezes com 300 ul de tampão de armazenamento (0,1M de TrisHCIl pH7,5, 0,35 M de NaCl, SMM de CaC12, 0,4% de BSA, 0,2% de Tri- ton X-100, 0,05%> NaN;) e por fim ressuspenso em tampão de armazena- mento.

A CRP marcada com fluoróforo (CRP*) foi obtida ao aplicar o kit de marcação de anticorpo Dylight 649 (prod nr 53050, Thermo Scientific). Um ensaio de ligação ao analito em relação à CRP foi realizado em chips de fluxo lateral abertos similares ao desenho mostrado na Figura 1. O chip foi colocado em um suporte de chip com ímãs (uma pilha de três imãs em bloco de Immcom 3x3mm de espessura, Neodym35, ELF A, Suécia) fixado em estreita proximidade à superfície inferior do chip, abaixo da trajetó- ria de fluxo.

O suporte de chip foi então colocado em uma câmara de umida- de 5uldetampão de armazenamento foram adicionados antes da aplicação da amostra.

O anticorpo Conta-antiCRP bem como CRP* foram diluídos se- paradamente em soro (soro isento de TSH, US Biological), e um conjunto de diluições de anticorpo conta-antiCRP foram preparadas.

Cada amostra de ensaio individual foi preparada ao misturar volumes iguais de 20 ng/ml de CRP*eo anticorpo conta-antiCRP permitindo 30 segundos de reação de ligação antes da aplicação de 10 ul de mistura na zona de amostra de chip.

O excesso de reagentes foi removido por lavagem três vezes com 7,5 ul de soro.

Como controle, o sinal de fundo gerado pelas próprias esferas foi regis- trado;isto é, nenhuma CRP* foi adicionada, porém a diluição de anticorpo —conta-antiCRP foi aplicada como a amostra.

No protocolo de ensaio padrão, os chips contendo o anticorpo anti-CRP foram produzidos por deposição de 60 nl de 1,0 mg/ml de anticorpo (em 50 mM de tampão fosfato de sódio pH 7,5, 2% de Trealose) por Biodot AD3200. As intensidades de sinal foram re- gistradas em um protótipo de scanner de fluorescência de iluminação de |i- —nha(Amic AB, Sweden). O experimento foi repetido várias vezes, utilizando variantes de chip diferentes, e materiais preparados e os experimentos reali-

zados por pessoas diferentes.

A Figura 5 mostra os resultados de um ensaio de ligação de ' analito de ligação de CRP marcada por fluoróforo CRP em várias concentra- . ções de anticorpo anti-CRP ligado a esferas magnéticas retardadas por imã. Os simbolos vazios exibem esferas misturadas com CRP* e os símbolos preenchidos indicam apenas as esferas. Trinta segundos de ligação foram permitidos antes da aplicação sobre o chip. A linha pontilhada corresponde à ligação de CRP marcada ao anticorpo anti-CRP depositado na trajetória de chip. Símbolos diferentes (quadrados, círculos, triângulos) na Figura 5 indi cam séries diferentes, realizadas na mesma concentração, porém sob con- dições diferentes (preparação, experimentalista e variante de chip).

É evidente a partir da Figura 5 que a presente invenção aumenta mais significativamente (mais de 3 vezes) o sinal específico em um desenho de ensaio de fluxo lateral utilizando esferas magnéticas como a fase sólida comparado com o ensaio padrão que possui os anticorpos de captura sobre asuperfície da trajetória de fluxo. Exemplo 2 Os experimentos foram realizados com o mesmo desenho de chip ou similar como no Exemplo 1, utilizando o mesmo anticorpo anti-CRP e esferas paramagnéticas. Ao contrário do procedimento no Exemplo 1, os ímãs (uma pilha de três ímãs em blocos de Immcom 3x3mm de espessura, Neodym35, ELFA, Sweden) foram mantidos sobre a trajetória de fluxo, em estreita proximidade ao chip. Surpreendentemente, as esferas não saíram da fase liquida, em vez disso, foram acumuladas logo abaixo da superfície líquida. Sem se ater à teoria, os inventores especulam que a tensão superfi- cialfoi suficiente para impedir que as esferas saíssem da fase líquida. Os experimentos mostraram que as partículas magnéticas podem ser usadas em um sistema de fluxo lateral aberto, e livremente manipuladas dentro da fase líquida, por exemplo, movidas em qualquer direção ou ainda osciladas dentro da fase líquida. Além da mistura e cinética de reação aprimoradas, essa modali- dade torna possível concentrar os conjugados de detecção na interface li- quido-ar. Isso torna possível ler o sinal diretamente, a partir do lado da traje-

tória de fluxo, e não por baixo, através do substrato como geralmente é o : caso.

Isso, por sua vez, evita problemas com a distorção de sinal, enfraque- : cimento de sinal, e outras consequências de medição através do substrato.

Ademais, a extração dos conjugados de detecção da trajetória defluxona supeifície da fase líquida pode ajudar a remover os conjugados da estrutura física da trajetória de fluxo, independente se esses compreen- dem fibras ou microestruturas, e puxar os conjugados de detecção para den- tro de um local uniforme e distinto bem definido.

Os elementos versados na técnica irão avaliar que a invenção e asmodalidades dessa descritas aqui são suscetíveis a variações e modifica- : ções exceto aquelas especificamente descritas.

Será entendido que a inven- ção inclui todas essas variações e modificações.

A invenção também inclui todas as etapas e características referidas nesse relatório descritivo, indivi- dual ou coletivamente, e qualquer e todas as combinações de quaisquer du- asoumais das ditas etapas ou características.

Claims (27)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para a detecção de um analito em uma amostra líqui- da que usa um dispositivo de ensaio de fluxo lateral (1) que inclui pelo me- nos uma zona de adição de amostra (2), pelo menos uma zona de reação (4),e pelomenos uma zona de absorção (5), as zonas formando uma traje- tória de fluxo para a amostra no substrato; uma primeira molécula de captura no dispositivo de ensaio (1) capaz de se ligar ao analito, e uma segunda mo- lécula de captura também capaz de se ligar ao analito, em que a primeira molécula de captura transporta um primeiro marcador que não é um marca- dor magnético, e a segunda molécula de captura é fixada a uma partícula magnética, em que pelo menos uma porção da trajetória de fluxo inclui mi- cropilares que são projeções substancialmente verticais em relação a uma superfície, e que têm uma altura, diâmetro e espaçamento recíproco capa- zes de criar o fluxo lateral da amostra na trajetória de fluxo, e em que adicio- nalmente uma força magnética móvel é aplicada para mover a segunda mo- lécula de captura com sua partícula magnética fixada.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, que inclui a etapa de pré-depositar a segunda molécula de captura fixada à partícula magnéti- ca no dispositivo de ensaio, e adicionar a primeira molécula de captura após ousimultaneamente à adição da amostra.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, que inclui a etapa de pré-depositar tanto a primeira como a segunda molécula de captura no dispositivo de ensaio.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, que inclui a etapa de depositar tanto a primeira como a segunda moléculas de captura na zona de adição de amostra em que cada uma das moléculas de captura é trans- portada ao longo da trajetória de fluxo mediante a adição de uma amostra à zona de adição de amostra, e reagir com o analito que forma, deste modo, um complexo de detecção que consiste no analito, nas primeira e segunda moléculas de captura, e nos marcadores e partícula magnética.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a segunda molécula de captura e/ou a partícula magnética também transporta um se-

gundo marcador, distinguível do primeiro marcador.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a amostra é uma amostra tomada a partir de um mamífero, escolhida a partir de sangue, soro, plasma, urina, saliva, biópsias de tecido, fezes, esputo e esfregaços de pelee garganta.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a primeira e segunda moléculas de captura são escolhidas a partir do grupo que consiste em anticorpos, fragmentos de anticorpos, aptâmeros e sequências de ácido nucleico, específicos para o analito a ser detectado.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o primeiro e/ou segundo marcador é um marcador escolhido a partir de cromóforos, fluoróforos, marcadores radioativos e enzimas.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a força magnética móvel é atingida movendo-se mecanicamente um ímã ou ativan- do-seumou mais eletroímãs.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o movi- mento das segundas moléculas de captura ligadas às partículas magnéticas pode ser tanto retardado como acelerado pela força magnética móvel.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que as se- —gundas moléculas de captura são aceleradas para agitar a amostra.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a força magnética é movida em até três direções.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a trajetória de fluxo tem um vão ou descontinuidade e a segunda molécula de captura é movida através da descontinuidade pela força magnética móvel.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, em que descon- tinuidade é uma porta de tempo.

15. Dispositivo de ensaio (1) para a detecção de um analito em uma amostra, o dispositivo (1) compreendendo uma zona de adição de a- mostra (2), uma zona de reação (4) e uma zona de absorção (5), as zonas formando uma trajetória de fluxo para a amostra no substrato; a primeira mo- lécula de captura, capaz de se ligar ao analito, opcionalmente depositada no dispositivo; e uma segunda molécula de captura também capaz de se ligar ao analito, opcionalmente depositada no dispositivo, em que a primeira mo- lécula de captura transporta um primeiro marcador que não é um marcador magnético, e a segunda molécula de captura é fixada a uma partícula mag- nética, em que pelo menos uma porção da trajetória de fluxo inclui micropila- res que são projeções substancialmente verticais em relação a uma superfí- cie, e que têm uma altura, diâmetro e espaçamento recíproco capazes de criar o fluxo lateral da amostra na trajetória de fluxo.

16. Dispositivo de ensaio, de acordo com a reivindicação 15, em que a segunda molécula de captura e a partícula magnética transportam a- dicionalmente um segundo marcador, distinguível do primeiro marcador.

17. Dispositivo de ensaio, de acordo com a reivindicação 15, em que a segunda molécula de captura fixada à partícula magnética é pré- depositada no dispositivo de ensaio.

18. Dispositivo de ensaio, de acordo com a reivindicação 15, em que as primeira e segunda moléculas de captura são pré-depositadas no dispositivo de ensaio.

19. Dispositivo de ensaio, de acordo com a reivindicação 15, em que o dispositivo compreende elementos magnéticos.

20. Dispositivo de ensaio, de acordo com a reivindicação 19, em que os elementos magnéticos são ímãs permanentes incorporados no dis- positivo.

21. Dispositivo de ensaio, de acordo com a reivindicação 19, em que os elementos magnéticos são elementos capazes de gerar um campo magnético quando submetidos a um sinal externo, o sinal sendo a aplicação de uma corrente através do elemento.

22. Dispositivo para ler o resultado de um ensaio realizado em um dispositivo de ensaio, em que o dispositivo compreende um detector pa- ra ler um sinal emitido por, ou refletido a partir de um complexo de detecção, meios para computar o sinal e exibir um resultado e meios capazes de ma- nipular os componentes magnéticos presentes no dispositivo de ensaio.

23. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 22, em que os meios capazes de manipular os componentes magnéticos presentes no dis- positivo de ensaio são meios no dispositivo para ler, presentes a uma dis- tância efetiva a partir do dispositivo de ensaio quando em posição no dispo- sitivo para ler, ou dispostos de maneira móvel para serem colocados em tal distância efetiva do dispositivo de ensaio.

24. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 23, em que os meios no dispositivo para ler são escolhidos a partir de ímãs permanentes e eletroímãs.

25. Dispositivo para ler o resultado de um ensaio realizado em um dispositivo de ensaio, em que o dispositivo compreende um detector ca- paz de ler um sinal emitido a partir de ou refletido a partir de pelo menos um complexo de detecção presente em uma localização definida do dispositivo de ensaio, e um meio capaz de atrair os componentes magnéticos presentes no dispositivo de ensaio até a localização definida antes de ler o sinal.

26. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 22 ou 25, em que o meio é o primeiro meio presente no dispositivo para ler o resultado, que ativa o segundo meio, presente no dispositivo de ensaio, que mediante a ativação gera um campo magnético capaz de atrair os componentes magné- ticos presentes no dispositivo de ensaio até a localização antes de ler o si- nal.

27. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 22 ou 25, em que a leitura é escolhida a partir da detecção e/ou quantificação de cor, fluores- cência, radioatividade ou atividade enzimática.