BR102022019252A2 - Peptídeos motifs do tipo integrina funcionalizados com cumarina, composições e usos - Google Patents
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Abstract
A presente invenção trata-se de peptídeos multicomponentes, derivados de sequências motifs de interação com receptores do tipo integrinas, associados a moléculas de cumarina em suas regiões amino (N-terminal) e carboxi (Cterminal) terminais, incorporados ou não em um sistema de transporte de alta performance hidrofílico não iônico. A invenção trata também de composições dermocosméticas, cosméticas e bio-farmacêuticas contendo esses peptídeos funcionalizados com a cumarina. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a ligações da cumarina às regiões terminais dos peptídeos de maneira estratégica e cartesiana, favorecendo uma interface de interação mais complexa capaz de fornecer um reconhecimento amplificado entre os sítios de reconhecimento de integrinas e liberação estratégica das cumarinas. As formulações com os peptídeos inovadores contém alto poder de absorção pela pele e induz com alta eficácia estímulos de start dos processos de cicatrização e reparo tecidual, através da diferenciação e migração de células endoteliais, sequestro de actina e vascularização (processo de angiogênese).
Description
[01] A presente invenção trata-se de peptídeos multicomponentes, derivados de sequências motifs de interação com receptores do tipo integrinas, associados a moléculas de cumarina em suas regiões amino (N-terminal) e carboxi (C- terminal) terminais, incorporados ou não em um sistema de transporte de alta performance hidrofílico não iônico. A invenção trata também de composições dermocosméticas, cosméticas e bio-farmacêuticas contendo esses peptídeos funcionalizados com a cumarina. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a ligações da cumarina às regiões terminais dos peptídeos de maneira estratégica e cartesiana, favorecendo uma interface de interação mais complexa capaz de fornecer um reconhecimento amplificado entre os sítios de reconhecimento de integrinas e liberação estratégica das cumarinas. As formulações com os peptídeos inovadores contém alto poder de absorção pela pele e induz com alta eficácia estímulos de start dos processos de cicatrização e reparo tecidual, através da diferenciação e migração de células endoteliais, sequestro de actina e vascularização (processo de angiogênese). Os peptídeos funcionalizados com cumarina apresentaram mais eficácia nos processos citados do que as sequências RGD e PHSRN sozinhas ou a cumarina na sua forma isolada.
[02] Com o avanço nas pesquisas nas últimas décadas sobre a biologia e função das plaquetas, tem sido evidenciadas várias facetas dessas células anucleadas que as apontam como grande potencial biotecnológico. Como células secretoras e altamente responsivas, as plaquetas podem ser exploradas para desenvolver soluções que alteram microambientes de lesões teciduais, por meio de materiais sintéticos espelhados ao seu conteúdo (plaquetário), e assim utilizados como “pistas” / sinais extracelulares instrutivos para morfogênese e como consequência para os processos de cicatrização e regeneração tecidual [1-3] (1) Gurtner, G.C.; Werner, S.; Barrandon, Y.; Longaker, M.T. Wound repair and regeneration. Nature 2008, 453, 314-21; (2) Nurden, A.T.; Nurden, P.; Sanchez, M.; Andia, I.; Anitua, E. Platelets and wound healing. Frontiers in Bioscience 2008, 13, 3525-3548. (3) Yan, C.; Grimm, W.A.; Garner, W.L.; Qin, L.; Travis, T.; Tan, N.; Han, Y. P. Epithelial to mesenchymal transition in human skin wound healing is induced by tumor necrosis factor-alpha through bone morphogenic protein-2. Am J Pathol. 2010, 176(5), 2247-2258.
[03] Neste contexto, surge a plataforma biomimética do conteúdo plaquetário, a Biotech-educated platelets detalhada e publicada em artigos científicos, sendo o conteúdo plaquetário a nossa “fábrica natural de fatores de crescimento” [2,4,5] (2) Nurden, A.T.; Nurden, P.; Sanchez, M.; Andia, I.; Anitua, E. Platelets and wound healing. Frontiers in Bioscience 2008, 13, 3525-3548; (4) Andrade, S.A.; Faria, A.V.S.; Fuhler, G.M.; Peppelenbosch, M.P.; Ferreira-Halder, C.V. Biotech- educated Platelets: beyond tissue regeneration 2.0. in press. 2020. (5) Andrade, S.S.; Faria, A.S.; Queluz, D.P.; Ferreira-Halder, C. Platelets as a ‘natural factory’ for growth factor production that sustains normal (and pathological) cell biology, Biological Chemistry 2020, 401, 471-476.
[04] Com esses dados foram desenhados peptídeos com assinaturas plaquetárias, peptídeos bio-similares/biomiméticos do conteúdo das plaquetas através de plataformas de “high throughput screening”, para produzir soluções biomiméticas sintéticas para a indústria de dermocosméticos.
[05] Nosso estado da arte em biologia plaquetária possibilitou o desenho de um ciclo de transformação, que nos instigou na tentativa de compreender a seguinte questão: "Como as plaquetas resolvem problemas em múltiplos sistemas (pato-) fisiológicos?". Para responder a essa questão criamos um ciclo de leitura biológica plaquetária para a síntese peptídica biomimética com assinatura plaquetária, uma leitura/análise de conteúdo de maneira agonista dependente, por tecnologia ômicas (como a secretômica, e shedômica) e plataformas Multiplex, e desta forma, a Biotech-educated platelets que vem se revelando com alto poder de aplicabilidade. Sabe-se que os fatores de crescimento plaquetários (enfaticamente no plural) são uma vasta coleção de compostos de alto valor biológico, e modelos biomiméticos, e permitem a convergência entre os sistemas biológicos (de ocorrência natural) e a química sintética para criar (in silico) uma nova geração de peptídeos biomiméticos, os PlateSimilis, uma biblioteca de peptídeos e outras biomoléculas de sinalização artificiais capazes de desempenhar suas conhecidas funções biomiméticas ou até novas funções [4] (4) Andrade, S.A.; Faria, A.V.S.; Fuhler, G.M.; Peppelenbosch, M.P.; Ferreira-Halder, C.V. Biotech-educated Platelets: beyond tissue regeneration 2.0. in press. 2020.
[06] De maneira mais específica, com a plataforma Biotech-educated platelets (agonista plaquetário dependente) foram identificadas assinaturas plaquetárias para os processos de cicatrização e regeneração tecidual, como a liberação de substâncias estratégicas a partir dos grânulos plaquetários, como os grânulos alfas, contendo um conteúdo estratégico de fatores de crescimento e citocinas, alguns com sequências de reconhecimento para receptores do tipo integrina. Esses receptores do tipo integrinas são proteínas de adesão presentes na membrana celular e estão dispostas/inseridas de forma transmembrânica, permitindo que uma de suas extremidades fique voltada para a área externa da membrana para sua ligação/comunicação com os componentes da matriz e que a outra extremidade se liga, através da proteína talina à porção do citoesqueleto constituído de actina. Dessa maneira, as integrinas dispõem de uma localização estratégica para uma comunicação crucial entre a matriz extracelular com o citoplasma, com comunicação com o citoesqueleto, através da membrana plasmática (as integrinas permitem a ação da matriz extracelular sobre o citoesqueleto). [6] (6) Kechagia, J.Z., Ivaska, J. & Roca-Cusachs, P. Integrins as biomechanical sensors of the microenvironment. Nat Ver Mol Cell Biol 20, 457473 (2019). https://doi.org/10.1038/s41580-019-0134-2.
[07] Nesta invenção, seguimos com nosso conhecimento da função, biologia e conteúdo das plaquetas. Um exemplo de mecanismo de ação de receptores do tipo integrina é encontrado nas plaquetas para o reparo e reconstrução de vasos sanguíneos. Este processo é também dependente da contração da parede vascular, bem como da liberação do conteúdo plaquetário, onde a plaqueta fornece desde fatores de coagulação, fatores de crescimento, citocinas, aminas bioativas, íons divalentes, entre outros mensageiros e executores, para o pronto estancamento sanguíneo, iniciando e coordenando os processos multifatoriais de cicatrização e regeneração tecidual. Neste cenário de reconstrução as plaquetas se ligam, de maneira estratégica e peculiar, principalmente via receptores do tipo integrinas de suas membranas à fibronectina e ao fibrinogênio, formando uma ponte de ligação (mediada por integrinas) entre plaquetas e o tecido vascular. Há também simultaneamente, a liberação de fatores de crescimento no local da lesão, enfrentando a tensão de cisalhamento por adesão ao sítio de reparo [7] (7) Faria, A.V.S.; Andrade, S.S.; Reijm, A.N.; Spaander, M.C.W.; de Maat, M.P.M.; Peppelenbosch, M.P.; Ferreira-Halder, C.V.; Fuhler, G.M. Platelets in aging and cancer double-edged sword. Cancer and Metastasis Reviews, 2020, v. 1, p.1205-1221.
[08] Neste contexto, o controle do microambiente celular fornece aos cientistas de biomateriais a oportunidade de modular eventos celulares como crescimento, diferenciação e angiogênese, que influenciam estruturas supramoleculares no tecido em desenvolvimento; fornece ao biólogo molecular um meio de conectar interações extracelulares com eventos bioquímicos no citoplasma e no núcleo da célula.
[09] Na presente invenção, focamos na síntese e modificação de materiais que interagem seletivamente com células por meio de eventos específicos de reconhecimento biomolecular, como as sequências motif de reconhecimento de integrinas. Empregamos uma técnica em que o microambiente da célula é controlado e a interface do biomaterial torna-se bioativa, criando substratos funcionalizados, ou seja sequências motifs de integrinas ligadas a um composto estratégico e de reconhecida ação no processo de angiogênese e microcirculação, como a cumarina [8] (8) Beninatto R, Barbera C, De Lucchi O, Borsato G, Serena E, Guarise C, Pavan M, Luni C, Martewicz S, Galesso D, Elvassore N. Photocrosslinked hydrogels from coumarin derivatives of hyaluronic acid for tissue engineering applications. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2019Um dos ligantes mais comumente usados em biomateriais, e sequência motif de ligação mais fisiologicamente onipresente é a sequência peptídica curta, um tripeptídeo contendo arginina-glicina-ácido aspártico (RGD). RGD foi identificado através de ensaios de ligação competitiva envolvendo a família integrina de receptores de superfície celular. Estudos mostraram e comprovaram que interfaces modificadas por RGD podem promover adesão e migração mediada por integrina [5-9]. Peptídeos adicionais, como REDV e PHSRN da fibronectina, têm sido explorados quando conferem uma vantagem específica ao substrato ou servem como um novo desenho estratégico para processos complexos como o reparo tecidual (9) Ochsenhirt SE, Kokkoli E, McCarthy JB, Tirrell M. Effect of RGD secondary structure and the synergy site PHSRN on cell adhesion, spreading and specific integrin engagement. Biomaterials. 2006; 27(20):3863-74. doi: 10.1016/j.biomaterials.2005.12.012; (10) Ruoslahti E. RGD and other recognition sequences for integrins. Annu Rev Cell Dev Biol 1996;12:697-715; (11) Massia SP, Hubbell JA. Vascular endothelial cell adhesion and spreading promoted by the peptide REDV of the IIICS region of plasma fibronectin is mediated by integrin a4b1. J Biol Chem 1992; 267:14019-26; (12) Aota S, Nomizu M, Yamada KM. The short amino acid sequence Pro- His-Ser-Arg-Asn in human fibronectin enhances cell-adhesive function. J Biol Chem 1994;269:24756-61; (13) Altroff H, van der Walle CF, Asselin J, Fairless R, Cambell ID, Mardon HJ. The eighth FIII domain of human fibronectin promotes integrin a5b1 binding via stabilization of the ninth FIII domain. J Biol Chem 2001; 276:38885-92.
[010] Especificamente nesta invenção, usaremos sistemas de peptídeos multicomponentes contendo as sequências motif RGD e PHSRN, que detém sítios de sinergia principalmente com a integrina alpha5 beta1, mimético a fibronectina III9, mas não restrito a esta integrina, somado à ligação da cumarina em suas regiões amino (N-terminal) e carboxi (C-terminal) terminais, realizada através de duas reações 1) uma ligação amida e/ou 2) por uma cadeia alquilideno que liga a cumarina C-4 com o carbono α do aminoácido. Essas ligações da cumarina e as regiões terminais de peptídeos nós denominamos de fusão cartesiana. Nossos resultados demonstraram que essa interface de biomaterial mais complexa é capaz de fornecer uma interação a integrina alpha5 beta1 aumentada, com proeminente adesão mediada e instrutiva para as células aderirem, espalharem, diferenciarem, migrarem e mineralizarem de forma mais eficaz do que as sequências RGD e PHSRN sozinhas ou a cumarina na sua forma isolada.
[011] No contexto da microcirculação cutânea, a cumarina é reconhecida pela sua ação farmacológica de estimular a microcirculação em membros inferiores, proporcionando alívio de dores causadas por problemas circulatórios locais. Já as sequências motif dos sítios de reconhecimento de receptores do tipo integrina também atuam na indução da restauração da homeostase celular, bem como são atuantes no dinâmico processo de reparo tecidual [8] (8) Beninatto R, Barbera C, De Lucchi O, Borsato G, Serena E, Guarise C, Pavan M, Luni C, Martewicz S, Galesso D, Elvassore N. Photocrosslinked hydrogels from coumarin derivatives of hyaluronic acid for tissue engineering applications. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2019; (9) Ochsenhirt SE, Kokkoli E, McCarthy JB, Tirrell M. Effect of RGD secondary structure and the synergy site PHSRN on cell adhesion, spreading and specific integrin engagement. Biomaterials. 2006; 27(20):3863-74. doi: 10.1016/j.biomaterials.2005.12.012.
[012] A união das ações da cumarina e de sequências motif do tipo integrina se mostra estratégica, uma vez que tem como objetivo a ação sinérgica e simultânea em eventos críticos essenciais para o desempenho das células da pele frente a i) fatores estressores externos e ou quadros intrínsecos individuais (carga genética); ii) em processos de rápida resposta, como requer um processo de reparo tecidual e até no iii) processo de envelhecimento, onde as células se encontram com suas atividades metabólicas reduzidas. Neste cenário, a união/ligação estratégica e inovadora da cumarina as extremidades C- e N- terminais de peptídeos com sequências motit de integrina, se apresenta como uma solução para prevenir e estimular, retardar ou reverter quadros de agravamento local de microcirculação, que podem surgir de acordo com características individuais e ou devido ao processo de envelhecimento da pele, como acontece em quadros de celulite.
[013] Analisando de maneira mais detalhada o quadro da celulite, uma condição dermatológica que recebe o nome clínico de paniculopatia edematosa fibroesclerótica ou lipodistrofia ginoide, e que causa uma disfunção do tecido conjuntivo hormônio/estrógeno dependente, o que a torna um quadro que acomete em sua maioria mulheres. É uma condição que vai além do acúmulo de gordura, a celulite refere-se à ocorrência de edema no tecido conjuntivo que ocasiona grande acúmulo de água e a gera, ou que ela resulta da alteração da microcirculação pela compressão dos sistemas venosos e linfáticos. A “celulite” provoca alterações estruturais na pele, com alterações na microcirculação e no metabolismo dos adipócitos, o quadro pode variar em 4 graus, de acordo com os autores Rao et al. e Rossi e Verganini. No grau 1 apresenta alterações somente histopatológicas. No grau 2 a celulite é perceptível quando o músculo é contraído ou ao toque e compressão da pele. Neste grau, ocorre diminuição de temperatura local, perda de elasticidade da pele (perda expressiva de colágeno, por conta do processo de envelhecimento ou ganho de peso) e alteração circulatória. No grau 3, o tecido acometido pela celulite apresenta nódulos, e se torna visível mesmo sem a compressão dos tecidos e até mesmo com alterações de sensibilidade da pele. Já no grau 4, a pele fica enrugada, flácida, com nódulos grandes e dolorosos, além de fibrose (perda de sensibilidade, elasticidade e drástica redução de micro vasculatura). Neste caso a celulite é aparente em qualquer posição anatômica (13) Disorders of Fat and Cellulite Advances in Diagnosis and Treatment Edited by David J. Goldberg Alexander L. Berlin; (14) Hexsel D, Hexsel C. The role of skin tightening in improving cellulite. Dermatol Surg 2014; 40: S180-S183; (15) Sadick N. Treatment for cellulite. Int J Womens Dermatol 2018; 5: 68-72.
[014] Dentro deste cenário e do exposto anteriormente, reforça, portanto, a importância da invenção aqui apresentada, onde há a união de compostos como a cumarina e peptídeo biomimético com sequências motif do receptor do tipo integrina, que de maneira sinérgica proporcionam estímulos que levam a síntese de colágeno, com o reparo tecidual adequado, burlando o processo de fibrose, com consequente melhora na microcirculação do tecido afetado pelo quadro dermatológico da celulite.
[015] Em buscas realizadas em bancos de patentes, foi encontrado documento relacionado ao uso de cumarina agregada a outros elementos em composições cosméticas antioxidantes (KR102038697B1); outro documento rastreado que descreve uma matriz extracelular para cicatrização de feridas compreendendo uma proteína de fibronectina recombinante e uma matriz de esqueleto, em que a proteína de fibronectina recombinante compreende peptídeos de dois ou mais domínios de fibronectina, dentre eles RGD e PHSRN (WO1999042126) e um terceirodocumento que descreve moléculas orgânicas ligadas a substratos polimérico ou metálicos que compreentem também os peptídeos RGD e PHSRN.
[016] Nas buscas pode-se observar que tecnologias que apresentavam alguns dos peptídeos motifs estavam relacionadas a hidrogels e polímeros de revestimento de próteses, manutenção da córnea, regeneração tecidual de órgãos, composições para cicatrização e até mesmo anti-idade. No entanto, tanto os peptídeos quanto a cumarina estavam associados a outros componentes e em nenhum documento foi encontrada a associação dos peptídeos RGD e PHSRN à cumarina.
[017] Na presente invenção os peptídeos RGD e PHSRN foram funcionalizados com a cumarina de maneira estratégica e cartesiana, favorecendo uma interface de interação complexa capaz de fornecer reconhecimento amplificado entre as integrinas, induzindo com alta eficácia estímulos de start dos processos de cicatrização e reparo tecidual, através da diferenciação e migração de células endoteliais, sequestro de actina e vascularização (processo de angiogênese). Os peptídeos funcionalizados com cumarina apresentaram mais eficácia nos processos citados do que as sequências RGD e PHSRN sozinhas ou a cumarina na sua forma isolada. Além disso, visando uma aplicação tópica e a incorporação dos peptídeos funcionalizados a formulações dermocosméticas, estes foram inseridos a um sistema de delivery em nano-esferas nanopoliméricas a base de copolímero biocompatível.
[018] Figura 1. Adesão, migração e proliferação de HaCat e HFF-1 sob tratamento com peptídeo cartesiano, em plataforma cytation “time-lapse”. Imagens representativas dos vídeos capturados por 48 h (1 imagem capturada a cada 10 min por 48 h). (A-D) Controles e HaCat na presença do peptídeo cartesiano (1%); (E-H) Controles e HFF-1 na presença do peptídeo cartesiano (1%).
[019] Figura 2. Análise da viabilidade celular por redução de MTT, células expostas ao peptídeo Cartesiano SEQ ID N°1 (MCA-PHSRN-GGRGDS- AMC). Queratinócitos e fibroblastos de pele humana (HaCat e HFF-1, respectivamente) destacadas na figura foram tratadas com o peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC) (1% p/v) Primeiro Gráfico - célula recém colocadas em cultivo expostas ao peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN- GGRGDS-AMC). (A-D) Células em cultivo com metabolismo ativo foram expostas ao peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC). O tratamento das células com Peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC) não altera o metabolismo celular, as células se mantiveram viáveis e com metabolismo ativo, (ensaio em triplicata) *p<0,001.
[020] Figuras 3. Análise de Cicatrização pelo Processo de Migração Celular, linhagem HFF-1 analisadas em 24h e 48h sob tratamento do peptídeo Cartesiano SEQ ID N°1 (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC). Os ensaios de “wound healing” por “scratch” na cultura de HFF-1 (fibroblastos de pele humana, com mais de 90% confluência) foram realizados na presença ou na ausência do peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC) (1%). Observamos redução da ferida/aumento da cicatrização de 71% em 24 h de tratamento com Peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC). Assim, como observamos em 48h uma cicatrização de 96 ± 1,2. Controle com SFB (soro fetal bovino, 2%). As imagens representativas são mostradas com ampliação de 10X. A área de migração foi quantificada pelo software ImageJ. Gráfico representativo da quantificação da ferida versus o tempo (24 e 48 h). Estatística ANOVA GraphPad. Imagens representativas de três experimentos independentes.
[021] Figura 4. Atividade Gelatinolítica de enzimas proteolíticas (MMPs-2 e -9) secretadas por HUVEC após tratamento com o peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC), detecção por zimografia. Nas imagens pode- se observar que a linhagem HUVEC tratada com peptídeo Cartesiano (MCA- PHSRN-GGRGDS-AMC) apresentaram atividade mais controlada de MMPs-2 e MMP-9, com a detecção das bandas das formas pro- e das enzimas ativas. Observa-se também que nenhum dos tratamentos foi capaz de interferir na atividade das enzimas presentes no secretoma da HUVEC.
[022] Figura 5. Formação, compactação e proliferação de esferoides de células HFF-1 tratado com peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN-GGRGDS- AMC) em sistema de delivery em nano-esferas. Células HFF-1 foram plaqueadas de acordo com métodos para formação de esferoides, uma vez o esferoide formado, introduziu-se na cultura 3D o peptídeo Cartesiano (MCA- PHSRN-GGRGDS-AMC) em sistema de delivery em nano-esferas (A) Imagens em microscopia de contraste de luz em magnificação de 10X. (B) Gráfico demonstrando média do tamanho dos esferoides e taxa de crescimento da massa esferoidal. Imagens representativas dos experimentos realizados em triplicata. Número de experimentos realizados (formação de esferoides, n=3). Escala 100 μm, gráficos representam o aumento do tamanho do esferoide na presença de peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC) e na ausência. Barras representam ± médias e desvio padrão, teste utilizado ANOVA GraphPad.
[023] Figura 6. Quantificação colorimétrica de colágenos tipos I e III, em esferoides de fibroblastos de pele humana tratados com peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC). Quantificação colorimétrica (OD 450 nm) do (A) colágeno tipo I e (B) colágeno tipo III após o tratamento de HFF- 1 com 1% de peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC). Experimentos realizados em triplicata. Número de experimentos realizados (formação de esferoides, n=3). Barras representam ± médias e desvio padrão, teste utilizado ANOVA GraphPad.
[024] Figura 7. Cultura heterotípica com células endoteliais (HUVEC) e matriz biomimética na presença do peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN- GGRGDS-AMC) para formação de estruturas tubulares angiogênicas. Células endoteliais (4 x 103céls/poço) foram plaqueadas sobre uma camada de da matriz biomimética, composta de fibrina(ogênio), vitronectina e fibronectina e estimuladas com peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC) (1%). As imagens (duplicadas) foram tiradas pelo microscópio Luma Scope (Etaluma Inc, Carlsbad, CA, EUA), os círculos amarelos indicam as estruturas tubulares; e as setas na cor lilás indicam o ponto de ligação entre células endoteliais. Imagens em ampliação de 10X (barra de escala 50 μm) após 24 horas de cultura. Imagens representativas de três experimentos independentes.
[025] Figura 8. Cultura heterotípica com células endoteliais (HUVEC) e matriz biomimética na presença do peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN- GGRGDS-AMC) para formação de estruturas tubulares angiogênicas. Células endoteliais (4 x 103 céls/poço) foram plaqueadas sobre uma camada de da matriz biomimética, composta de fibrina(ogênio), vitronectina e fibronectina e estimuladas com peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC) (1%). As imagens (duplicadas) foram tiradas pelo microscópio Luma Scope (Etaluma Inc, Carlsbad, CA, EUA), os círculos amarelos indicam as estruturas tubulares; e as setas na cor lilás indicam o ponto de ligação entre células endoteliais, estruturas de diâmetro largo. Imagens em ampliação de 10X (barra de escala 50 μm) após 24 horas de cultura. Imagens representativas de três experimentos independentes.
[026] Figura 9. Géis representativos da extração de proteínas totais da cultura heterotípica HUVEC - Matriz biomimética tratadas com Peptídeo cartesiano - detecção de integrinas. As amostras celulares foram submetidas a extração de proteínas totais para posterior dosagem de proteínas totais utilizando o kit BCA para análise por Western Blotting. (A) Resultado para detecção as integrinas (diluição 1:1000) kit integrins cell signaling e anticorpo secundário human na diluição de 1:10000, das amostras da cultura heterotípica das Figuras 7 e 8. Normalizador GAPDH.
[027] Na presente invenção descrevemos sequências peptídicas biofuncionais miméticas às sequências motif do tipo integrina, como facilitadores dos fenômenos de adesão e migração celular, processos cruciais para garantir um reparo tecidual coordenado, coeso, com resultados em microcirculação. Experimentos de adesão celular, disseminação e especificidade do receptor exploraram independentemente a síntese de colágeno e os mensageiros nos processos de adesão, migração e organização celular, utilizando como modelos celulares queratinócitos e fibroblastos da pele, bem como linhagem estabelecida de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) que responderam às diferentes apresentações de sistemas multicomponentes, contendo as sequências RGD e PHSRN e moléculas de cumarina em sistema de nano- esferas.
[028] Visando uma aplicação tópica e incorporação a formulações dermocosméticas, inserimos o peptídeo biomimético ligado a cumarina, denominado cartesiano, a um sistema de delivery em nano-esferas nanopoliméricas a base de copolímero biocompatível, poloxamer. Ganhamos em eficiência de permeação, onde os peptídeos anfifílicos que mimetizam os domínios de adesão de proteínas extracelulares ligados a cumarina foram incorporados em um sistema de transporte de alta performance hidrofílico não iônico.
[029] Especificamente nesta invenção, usaremos sistemas de peptídeos multicomponentes contendo as sequências motif RGD e PHSRN, que detém sítios de sinergia principalemente, com a integrina alpha5 beta1, mimético a fibronectina III9, mas não exclusivamente, somado a ligação da cumarina às regiões amino (N-terminal) e carboxi (C-terminal) terminais, realizada através de duas reações 1) uma ligação amida e/ou 2) por uma cadeia alquilideno que liga a cumarina C-4 com o carbono α do aminoácido. Essas ligações da cumarina e as regiões terminais de peptídeos nós denominamos de fusão cartesiana.
[030] Nossos resultados demonstraram que essa interface de interação mais complexa é capaz de fornecer reconhecimento amplificado a integrina alpha5 beta1, com proeminente adesão mediada e instrutiva para as células aderirem, espalharem, diferenciarem, migrarem e mineralizarem de forma mais eficaz do que as sequências RGD e PHSRN sozinhas ou a cumarina na sua forma isolada.
[031] A invenção poderá ser melhor compreendida a partir dos exemplos, não limitantes, que seguem: Exemplo 1 - Adesão, migração e proliferação de HaCat e HFF-1 sob tratamento com peptídeo cartesiano, em plataforma cytation “time-lapse” As sequências motifs alvo desta invenção são: GGRGDS e PHSRN (SEQ ID N°3) com a ligação à cumarina nas extremidades N- e C- terminais dos peptídeos: MCA-GGRGDS-AMC (SEQ ID N°2) e/ou MCA-PHSRN-AMC (SEQ ID N°3) e/ou MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC (SEQ ID N°1). • peptídeo derivado das sequências motif de integrina ligadas a moléculas de cumarina (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC) SEQ ID N°1 = cartesiano
[032] A linhagem celular HaCat (Ha = human adult, Cat = Calcium temperature), queratinócitos normais de pele humana, foi mantida/cultivada em meio DMEM alta glicose (Invitrogen, EUA), suplementado com 10% de FBS e/ou com suplementação sintética e antibióticos (penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 μg/mL)). Por apresentar um índice de proliferação 3,8 em 48h, que corresponde a um alto nível de renovação celular, o meio das células foi substituído a cada subcultivo, e com as células aderidas a cada 2 dias. A linhagem de fibroblastos normais de pele humana, a HFF-1, foram mantidas/cultivadas em meio DMEM alta glicose (Invitrogen, EUA), suplementado com 10% de FBS e antibióticos (penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 μg/mL)). Já a linhagem HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) foi cultivada em meio cultura Roswell Park Memorial Institute (RPMI), suplementado com 10% de antibióticos (penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 μg/mL)). Todas as células foram cultivadas/mantidas a 37 °C sob tensão de 2,5% de CO2 e seguimos sempre com os subcultivos e monitoramento da morfologia a cada passagem celular. Cytation - “time lapse” - Sistema de Imageamento multi-modal para monitoramento da Adesão e Proliferação de queratinócitos e fibroblastos de pele humana (HaCat e HFF-1) tratadas com o peptídeo cartesiano, derivado das sequências motif de integrina ligadas a moléculas de cumarina (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC)
[033] As linhagens de queratinócitos e fibroblastos de pele humana, HaCat e HFF-1, foram descongeladas e em seguida colocadas em cultivo em uma contagem e meio de cultivo apropriados para a monitoramento em “time-lapse” em microscópio Cytation 5 (Biotek), a fim de acompanhar a sua sedimentação, aderência e proliferação iniciada pelo contato, por via de sinalização justacrina. O tratamento foi seguido da seguinte forma: i) controle da HaCat e HFF-1 com meios suplementados com 10% SFB; ii) células HaCat e HFF-1 foram tratadas com 1% do peptídeo denominado cartesiano; iii) células HaCat e HFF-1 foram tratadas com 1% do peptídeo cartesiano para monitoramento da aderência das células recém descongeladas e adicionadas ao cultivo celular apropriado. As imagens foram adquiridas a cada 10 minutos por 24 h.
[034] Na Figura 1 podemos observar queratinócitos (HaCat) e fibroblastos (HFF-1) de pele humana recém descongelados iniciando processos/eventos celulares, como a dinâmica de adesão e proliferação das células, com duas regiões bem definidas neste processo; i) filopodia ou "microspikes" (processo que as células usam para reconhecer seu ambiente, e envolve protrusões da membrana plasmática ricas em actina que funcionam como sensores de ambiente) e ii) o processo de lamellipodia (motilidade) bem identificado em queratinócitos. Com o tratamento estabelecido com o peptídeo cartesiano (peptídeo com sequências motifis de integrina e moléculas de cumarina), identificamos nas imagens a intensificação de formações nascentes de aderências, com decorrente formação de protrusões aceleradas na proliferação celular sob o tratamento com o peptídeo cartesiano (MCA-PHSRN-GGRGDS- AMC) (Figura 1 A-H). Podemos concluir com esses resultados que o peptídeo cartesiano é um indutor dos processos de adesão, migração, proliferação e renovação celular.
[035] As células HaCat (queratinócitos de pele normal) e células HFF-1 (fibroblastos da derme) foram plaqueadas na densidade de 5 x 103células/mL em placas de 96 poços (volume de plaqueamento por poço: 250 uL), suplementadas com 10% de SFB, e incubadas a 37o C, 5% de CO2 por 24 e 48h. Subsequentemente, a capacidade de redução do MTT pelas células (5 x 103 células/mL) foi analisada utilizando o kit da Promega. Foram avaliados os efeitos dos peptídeos derivados das sequências motif de integrina ligadas a moléculas de cumarina, sob a viabilidade das linhagens HaCat e HFF-1. Para isso, o meio foi removido e adicionado aos poços meio sem suplementação contendo MTT (0,5 mg/mL), seguindo as orientações do fabricante. Após incubação por 4h a 37°C, o meio foi removido cuidadosamente e então adicionado à solução de inativação e solubilização do formazan (100 μL). As placas foram agitadas por 10 min e a absorbância correspondente a cada poço foi lida em espectrofotômetro (Elx 800 BIO-TEK) em comprimento de onda de 570 nm. Os valores nos gráficos foram expressos em porcentagem de viabilidade celular. O SFB foi utilizado a título de comparação e a redução do MTT nessa condição, foi considerada como 100%.
[036] Para investigar o possível efeito tóxico do Peptídeo Cartesiano (MCA- PHSRN-GGRGDS-AMC) sob queratinócitos e fibroblastos de pele humana (linhagens HaCat e HFF-1, respectivamente), realizamos o ensaio de viabilidade celular por redução do MTT. Desta forma, as células tratadas com o peptídeo cartesiano a 1% (p/v) foram avaliadas sobre a capacidade de alterar a atividade metabólica das células, após 48h das células em cultura. Na Figura 2 podemos observar que os tratamentos com Cartesiano a 1% (p/v) não alterara a capacidade metabólica de ambas linhagens celulares de pele humana, mesmo quando essas células são expostas ao peptídeo assim que são colocadas em cultivo, utilizando como controle o SFB. Portanto, o peptídeo cartesiano preserva, de forma adequada, a morfologia/fenótipo e metabolismo celular das linhagens HaCat (queratinócitos) e HFF-1 (fibroblastos). Indicando um metabolismo celular ativo e regulado com células saudáveis, sem perda de viabilidade, após o tratamento com o peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN- GGRGDS-AMC) em ensaios in vitro em sistema de monocamada.
[037] As células HFF-1 (fibroblastos de pele normal) (5 x 104céls) foram cultivadas em placa de 24 poços (suplementadas SFB 10%) e mantidas em estufa até atingirem 100% de confluência. Em seguida as células foram lavadas com PBS (1x) e subsequente a lavagem foi feito um risco (“ferida”) com auxílio de uma ponteira de 1000 μL no centro de cada poço. O meio de cultivo foi reposto contendo 0,2% de SFB, para sincronizar o ciclo celular das células em questão. Nesta etapa as células HFF-1 foram tratadas com os peptídeos derivados das sequências motif de integrina ligadas a moléculas de cumarina (MCA-GGRGDS- AMC e/ou MCA-PHSRN-AMC e/ou MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC) a 1% (p/v). As células foram acompanhadas ao microscópio nos tempos 0, 24 h e 48 h ou até o fechamento da “ferida”. A eficiência de migração das células, ao longo de 24h e 48h, foi analisada em microscópio LumaScope (Etaluma Inc, Carlsbad, CA, USA) em 10X de magnificação. Barra de escala referente à 100 μm. A análise foi feita por software ImageJ (NIH, USA) e a área de migração foi quantificada em unidades arbitrárias (A.U.).
[038] O ensaio de migração celular por indução de formação de ferida (método “wound healing”) em fibroblastos de pele humana (linhagem HFF-1) foi executado, para posterior tratamento com o peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN- GGRGDS-AMC), a fim de observar a migração induzida pelo ativo. Como resultados representativos desse experimento mostramos as imagens do cultivo da linhagem HFF-1 sob o tratamento do peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN- GGRGDS-AMC) (1% p/v). A Figura 3 mostra que os fibroblastos normais de pele (HFF-1) tratados com o peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC) apresentaram maior habilidade de migração quando comparados com o controle com suplementação por SFB (soro fetal bovino). Observamos uma redução da ferida/aumento da cicatrização da ferida de 96% ± 4,5 na ferida formada na monocamada de fibroblastos de pele tratadas com peptídeo Cartesiano (MCA- PHSRN-GGRGDS-AMC) em 48h (Figura 3). Desta forma, concluímos que o peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC) (1%) acelera significativamente o processo regulado de migração celular, performance eficaz em células cruciais no processo de cicatrização.
[039] A preparação das amostras para o ensaio por SDS/Gelatin-PAGE foi iniciada com a preparação das amostras celulares da linhagem HUVEC tratadas com o peptídeo derivado das sequências motif de integrina ligadas a moléculas de cumarina (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC) a 1%. 100 μL do secretoma celular da linhagem HUVEC tratada com o peptídeo+cumarina foi submetido a dosagem de proteínas totais por kit BCA (Molecular Probes, USA), e estipulado o uso de 10 a 30 μg de proteína total. Dosagem realizada previamente a execução do gel de eletroforese. pós preparadas, as amostras foram aplicadas ao gel de entrada, com gel de separação de 15% de acrilamida/bis-acrilamida contendo 0,02% de gelatina (p/v). Após a corrida de eletroforese de 2 h, os géis foram incubados com 2,5% Triton X-100 em tampão acetato de sódio, pH 5.0 (contendo 20 mM NaCl e 5 mM CaCl2) por 16 h à 37 °C. O gel foi corado com Coomassie Brillant Blue R 250 0,5% (p/v) preparado em solução contendo metanol 4,35% (v/v), ácido acético 4,65% (v/v) em água e mantido sobre lenta agitação por 20 minutos. O excesso de corante foi removido e o gel foi lavado com solução de ácido acético 10% (v/v) em água por aproximadamente 30 min. O perfil eletroforético foi acompanhado utilizando um padrão comercial de proteínas. A atividade gelatinolítica foi observada quando o gel contendo as amostras do secretoma celular foi incubado com o tampão apropriado (Tris/HCl 50 mM, pH 7,6 com 5 mM de CaCl2 e 2uM de ZnCl2), para detecção da atividade de metaloproteases como a MMPs, MMP 2 e 9.
[041] A atividade Gelatinolítica de proteases secretadas pela linhagem HUVEC (células endoteliais humanas) é conhecida e utilizada como modelo para averiguar o processo de invasão de células transformadas. Mas a presença de proteases como as metaloproteases de matriz (MMPs) também estão relacionadas ao controle do processo de cicatrização, como um balanço/equilíbrio para que não ocorra um processo indesejado como o processo de fibrose. Neste contexto, realizamos o ensaio de zimografia para demonstrar que o peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC) foi capaz de manter a atividade dessas enzimas controladas, as MMPs 2 e 9 são necessárias para manter o balanço no processo de reparo tecidual. Comparamos os efeitos do peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC), com os efeitos da cumarina e da sequência motif derivada de regiões estratégicas de integrinas isoladamente. E pode-se observar na figura 4 que o peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC) funcionalizado com a ligação cartesiana de moléculas de cumarina foi capaz de manter a atividade dos MMPs 2 e 9 de maneira controlada e coordenada.
[042] Os esferoides fornecem um ambiente de organização 3D com intensas interações célula-célula. Como resultado de suas excelentes propriedades regenerativas e alto rendimento em sua produção, modelos celulares em esferoides são cada vez mais indicados para testes na medicina regenerativa.
[043] Modelos 3D tentam recapitular a complexa organização celular de um tecido (mesmo planar), como a pele. Ambas as adesões célula-célula [15] e interações célula-matriz, juntamente com a síntese de proteínas da matriz extracelular (MEC), contribuem para a geração de nutrientes e gradientes de sinais típicos de interações justacrina, intensificando as vias de sinalizações autócrina e parácrina, oferecendo assim um modelo de estudo clinicamente relevante. Por essas razões, os esferoides representam uma ferramenta útil para o rastreamento de drogas e mais especificamente no nosso projeto para a pesquisa de ingredientes ativos dermocosméticos. Na presente invenção, nos concentramos em ensaios de organização celular em esferoides 3D, e em “timelapse” (4D) para identificar “ondas” de proliferação e renovação celular promovidas pelo Peptídeo Cartesiano MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC (funcionalizado com moléculas de cumarina nas extremidades N- e C-terminais do peptídeo contendo sequência motif derivada de integrina, em seu sistema nanopolimérico bifásico, peptídeo cartesiano incorporado em nano-esferas), e como consequência analisar efeitos relacionados a biocompatibilidade e toxicidades desse promissor ingrediente ativo para formulações transdérmica dermocosméticas. Para os ensaios em 3D e 4D, utilizamos fibroblastos de pele humana (HFF-1) sob o tratamento do Peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN- GGRGDS-AMC) (1% p/v). (15) Altroff H, van der Walle CF, Asselin J, Fairless R, Cambell ID, Mardon HJ. The eighth FIII domain of human fibronectin promotes integrin a5b1 binding via stabilization of the ninth FIII domain. J BiolChem 2001;276:38885-92; (16)
[044] A linhagem HFF-1 foi mantida em cultivo em monocamada (até 80% de confluência) em meio DMEM alta glicose (Invitrogen, EUA), com suplementação de 10% de FBS e antibióticos [penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 μg/mL)], para posterior contagem e incubação (por ~ 16 h) em placas de cultivo sob a ação de nanopartículas com propriedades magnéticas, as NanoShuttle™- PL (Greiner Bio-One, Áustria) contendo nanopartículas de ouro, óxido de ferro e poli-L-lisina, na proporção de 1 μL para cada 104 células. No segundo dia, as células magnetizadas foram removidas e centrifugadas. Subsequentemente, as células 5,5 x 103 foram semeadas em placa “cell repelent” Greiner Bio-One de 96 poços de fundo plano. Na sequência a placa de ensaio foi encaixada na unidade/base magnética por 4 h, seguido de incubação por 16 h para permitir que as células formem estruturas 3D de organização em esferoides. Uma vez formado as unidades de esferoides (3D) a placa base magnética foi removida, e as células foram tratadas com os peptídeos derivados das sequências motif de integrina ligadas a moléculas de cumarina (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC) (1%). Os esferoides tratados foram monitorados por 7 dias, sobretudo observamos a i) agregação, ii) o aumento de tamanho (proliferação celular) e a iii) estabilização das estruturas 3D de fibroblastos de pele humana (HFF-1). Avaliamos a evolução dos esferoides tratados também em relação ao tempo (cultura 4D).
[045] As quantificações de colágenos tipo I e tipo III foram realizadas por método colorimétrico por kit abcam, seguindo as instruções do fabricante.
[046] As imagens de microscopia optica em campo claro (Figuras. 5) mostram uma evolução no tamanho e densidade dos esferoides no pós-tratamento com o Peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC). Esses resultados indicam um crescimento progressivo e compactação célula-célula (HFF-1) dos esferoides pós-tratamento com o peptídeo cartesiano (Figura 5). Observamos na Figura 5 que em 72 h da formação do esferoide de fibroblastos as células tratadas com Peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC) demonstraram um processo de proliferação celular mais ativo, desencadeando uma auto- montagem regulada dos fibroblastos da derme com aumento nítido da massa do esferoide de 201 ± 1 μm no controle para 276 ± 4 μm com o tratamento de 1% de peptídeo cartesiano. Observa-se também a agregação e compactação em 144 h, para a organização morfológica, indicando viabilidade metabólica e taxa de crescimento das células de 24 ± 3%, em relação ao controle sob suplementação do SFB. Vale destacar que a funcionalização do Peptídeo com sequências motif de integrina com moléculas de cumarina, é estratégica por ter a atuação do peptídeo mimético a sequências estratégicas de integrina e a cumarina, ambos atuantes nos processos de cicatrização e regeneração de tecidos. Na Figura 6 também observa-se que o peptídeo Cartesiano (MCA- PHSRN-GGRGDS-AMC) é capaz de induzir a síntese dos colágenos tipo I e tipo III em fibroblastos de pele (HFF-1), com resultados mais expressivos que os controles com TGF-B e PDGF. Tais resultados mostram que o Peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC), em seu sistema de delivery em nano-esferas, é um peptídeo biomimético promissor, demonstrando biocompatibilidade frente à exposição celular, induzindo o aumento da massa de esferoides de fibroblastos de pele humana, com metabolismo e proliferação celular ativos e regulados, resultados relacionados aos processos de renovação celular e regeneração tecidual.
[047] Células endoteliais humanas (HUVEC) na densidade de 3 x 104céls/poço, em meio RPMI, 10% de SFB, 1% de 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina, foram cultivadas em placa de 96 poços, contendo uma matriz biomimética contendo fibrina(ogênio), fibronectina e vitronectina, para formar uma cultura heterotípica. Após as células endoteliais atingirem confluência de ~60%, tratamos as células com o peptídeo derivado das sequências motif de integrina ligadas a moléculas de cumarina (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC) (1%). Após o tratamento com o peptídeo derivado das sequências motif de integrina ligadas a moléculas de cumarina (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC), a placa foi mantida na estufa a 37 °C e retirada apenas para a captura das imagens a cada 2 h, sendo a mais representativa a de 16 h. Para isso, as fotografias foram tiradas em microscópio de luz invertida utilizando as objetivas de 10x ou 4x. Todos os experimentos foram feitos com as células entre passagens 6 a 9. As imagens foram capturadas pelo microscópio Luma Scope (Etaluma Inc, Carlbad, CA, USA), aumento de 10x (escala de 100 μm) depois de 16 horas de cultivo.
[048] No contexto do processo de cicatrização de feridas e reparo de tecidos iniciamos procedimentos experimentais onde introduzimos à cultura celular tradicional 2D um elemento biomimético, um gel/matriz (Fibrin Merck), para uma cultura heterotípica com células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC), afim de investigar a formação de estruturas tubulares (processo de angiogênese) induzidas pelo peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC). Nas Figuras 7 e 8 observamos os resultados com o peptídeo Cartesiano (MCA- PHSRN-GGRGDS-AMC) que foi capaz de induzir remodelamento (rearranjo conformacional e organização do citoesqueleto) das células endoteliais, células que antes se encontravam em estado de quiescência, passando a responder a organização celular tubular. Observamos o comportamento das células endoteliais sob a matriz biomimética composta por fibrina(ogênio), vitronectina e fibronectina, onde claramente notamos pontos de ligação entre as células endoteliais (indicadas por setas na cor lilás) e formação de estruturas tubulares (representada por círculos amarelos). A Figura 8 mostra o conjunto de imagens da organização de estruturas tubulares com aspecto mais frouxo, característico de um processo de vasodilatação. Observou-se também a detecção da interação estratégica de integrinas como α5β1, αvβ3 e β2 (Figura 9). Integrinas são receptores heterodímeros de superfície celular que reconhecem em sua maioria a sequência motif RGD, e especificamente as integrinas α5β1 reconhecem a sequência motif derivado de fibronectina PHSRN. Esse reconhecimento é crucial e crítico para os processos de adesão, migração, proliferação e de transição celular de células endoteliais para sua organização em estruturas tubulares. A detecção dessas integrinas corroboram com os resultados apresentados ao longo da descrição da presente invenção.
[049] Utilizamos a imunodetecção de integrinas por western blotting para garantir a detecção da interação estratégica de integrinas como α5β1, αvβ3 e β2, uma vez que integrinas são receptores heterodímeros de superfície celular que reconhecem em sua maioria a sequência motif RGD (Figura 9). Especificamente as integrinas α5β1 reconhecem a sequência motif derivado de fibronectina PHSRN. Esse reconhecimento é crucial e crítico para os processos de adesão, migração, proliferação e de transição celular de células endoteliais para sua organização em estruturas tubulares. Para tal as células HUVEC receberam o tratamento com os peptídeos derivados das sequências motif de integrina ligadas a moléculas de cumarina (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC) (1%). Para os experimentos de western blotting as células submetidas ao tratamento com os mesmos peptídeos (1%) foram lisadas e submetidas a adição de inibidores de proteases e fosfatases (1 mM EGTA, 1μg/ml aprotinina, 1μg/ml leupeptina, 1mM PMSF e inibidores de fosfatase (2 mM ortovanadato de sódio 50 mM NaF, 10 mM pirofosfato de sódio)). O lisado total proteico foi submetido a dosagem de proteína por kit BCA (Merck-Sigma-Aldrich) e 60 μg de proteínas totais foram adicionados a cada poço do gel de poliacrilaminda (SDS) 10%. Os géis foram transferidos para uma membrana de nitrocelulose ou PVDF, e as membranas foram então incubadas com os anticorpos monoclonais específicos contra as proteínas alvo (anticorpos Cell Signaling). Após a incubação com o anticorpo primário, as membranas são conjugadas com o anticorpo secundário marcado com peroxidase (HRP). Para o processo de revelação das proteínas usaremos o sistema ECLTM ou Super SignalTM.
[050] Descrevemos a seguir (Tabelas 1, 2 e 3) os componentes das formulações spray, creme (oil-free) e gel, que foram selecionados de acordo com a estabilidade e compatibilidade com o peptídeo cartesiano em seu sistema nanopolimérico/nano-esferas. O peptídeo cartesiano em seu sistema nanopolimérico/nano-esferas atua em multicamadas da pele de maneira estável e segura. O objetivo nesta etapa, foi desenvolver preparações minimalistas e estáveis para a incorporação do peptídeo cartesiano para aplicações que melhorem a microcirculação local e reparo de tecido danificado com manifestações de quadros de celulite.
[051] Os resultados da incorporação do peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN- GGRGDS-AMC) refletem a estabilidade das preparações com uniformidade e ausência de formação de agregados. Observamos também a ação do peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC) em um sistema de delivery em nano-esferas, como modificador de propriedades sensoriais na formulação creme (emulsão oil-free) tendo como a fórmula base, a cera Polawax. O peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC) em seu sistema de delivery em nano-esferas pode conferir alterações sensoriais como intensificação de brilho e cremosidade. Tabela 1. Formulação em spray com o cartesiano em seu sistema nanopolimérico bifásico.
Tabela 2. Formulação em creme (oil-free) com o cartesiano em seu sistema nanopolimérico bifásico. *FO = Fase oleosa; **FA = Fase aquosa. Tabela 3. Gel
[052] Para os testes foram levados em consideração fatores que afetam a estabilidade como alterações físicas e físico-químicas, como: aspecto, odor, cor, alterações de pH e viscosidade aparente.
[053] Adotamos os seguintes critérios para avaliar possíveis alterações após a incorporação do peptídeo cartesiano, derivado das sequências motif de integrina ligadas a moléculas de cumarina (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC) nas formulações:
[054] Aspecto: a aparência e integridade das formulações mantendo o aspecto inicial em condições de armazenamento, com exceção em altas temperaturas, onde a percepção de pequena modificação foi aceita;
[055] Odor e cor: tais características foram monitoradas durante o armazenamento à luz solar indireta, onde espera-se normalidade. No entanto, em altas temperaturas espera-se leves modificações;
[056] Alterações de pH: variações superiores a ± 10% não foram aceitas, comparadas ao valor inicial de cada formulação, sob todas as condições de armazenamento;
[057] Viscosidade aparente: foram admitidas modificações, desde que não alterassem a percepção visual das amostras (ANVISA, 2004).
[058] Tais análises de estabilidade normal foram monitoradas por 90 dias, e as formulações foram mantidas em várias condições de temperatura: temperatura ambiente e luz solar indireta (25 °C ± 0,5); geladeira (5,0 °C ± 0,5); e estufa em duas temperaturas (37,0 °C ± 0,5 e 45 °C ± 0,5). Os resultados obtidos podem determinar o tempo de vida útil, shelf life do produto/formulação e avaliar a incorporação e compatibilidade da formulação em relação ao peptídeo cartesiano, derivado das sequências motif de integrina ligadas a moléculas de cumarina (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC). A periodicidade das leituras e observações nas condições de armazenamento das formulações com o peptídeo cartesiano foram, o tempo 0 (zero = t0) após 48 h de repouso de preparo, 1°, 7°, 15°, 30° e 90° dias (ANVISA, 2012). Empregamos a seguinte classificação para avaliar as formulações com o peptídeo cartesiano incorporado quanto ao aspecto, cor e odor: Normal - N; LM/A - levemente modificado/alterado; modificado - M e intensamente modificado - IM. As medidas de pH foram realizadas em pHmetro (Fisherbrand, USA). A viscosidade aparente foi avaliada em um viscosímetro spindle 10 (Fungilab). As análises foram realizadas a temperatura ambiente, 30 minutos após serem retiradas de suas condições de armazenamento. Seguimos os critérios de especificações organolépticas e físico-químicas das matérias-primas, segundo Guia de Estabilidade de Produtos Cosméticos, ANVISA, 2004.
[059] A avaliação preliminar da estabilidade demonstrou que, as formulações spray (por exemplo: para água micelar), creme (emulsão oil-free) e gel mantiveram aspetos normais nas condições impostas. Mudanças nas propriedades reológicas (propriedades físico-químicas) representam um fator crítico que indicam predisposição para a ocorrência de problemas, principalmente no caso de emulsões, que são sistemas termodinamicamente instáveis. Tais alterações podem interferir na homogeneidade do creme e na coalescência das gotículas oleosas. Desta forma, testes de estabilidade devem ser prioridade no desenvolvimento de formulações, bem como no desenvolvimento de novos ativos (nanoestruturados) para sua eficiente incorporação. Os resultados mais finos das análises, indicando a avaliação das características organolépticas, viscosidade e oscilações no pH, mostraram estabilidade das formulações quando o peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN- GGRGDS-AMC) foi introduzido na fase aquosa. Ao final de 60 e 90 dias, as formulações gel e creme apresentaram o aspecto minimamente modificado/alterado quando submetidas a altas temperaturas em estufa (37 °C à 45 °C), e ao final de 90 dias apresentaram o aspecto levemente modificado/alterado à luz solar. Na análise da viscosidade aparente (cP), não foram detectadas alterações (perceptíveis ou sob leitura no viscosímetro) nas quatro (4) condições de armazenamento, desde o início das análises em T0 até o final do tempo de estudo (90 dias). Concluímos assim, que a incorporação do peptídeo Cartesiano (MCA-PHSRN-GGRGDS-AMC) (em sistema de delivery em nano-esferas) as formulações, foi eficaz, sem alteração da estabilidade primária das formulações (gel, creme/emulsão e spray) nas condições acima descritas.
[060] Os resultados obtidos foram analisados com auxílio do software GraphPad Prism 8.0 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA). A análise estatística foi realizada usando Anova seguida de test-t, quando comparamos apenas 2 grupos distintos, e de teste de Turkey para comparações múltiplas. Todos os experimentos foram repetidos ao menos três vezes e expressos como média ± desvio padrão. Para todos os testes estatísticos utilizados no presente estudo, o nível de significância estabelecido foi de 5% (p<0,05).
Claims (8)
1- Peptídeos motifs caracterizados por consistirem das sequências representadas por SEQ ID n°1, SEQ ID n°2 e SEQ ID n°3 e serem funcionalizados com moléculas de cumarina.
2- Composições caracterizadas por compreenderem os peptídeos funcionalizados com moléculas de cumarina de SEQ ID n° 1 e/ou SEQ ID n° 2 e/ou SEQ ID n° 3 e excipientes dermo-farmacologicamente aceitáveis.
3- Composições, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadas por compreenderem os peptídeos motifs funcionalizados encapsulados em sistema nanopolimérico bifásico.
4- Composição, de acordo com as reivindicações 2 e 3, caracterizada por compreender Pantenol 0,1 a 50%, glicerina vegetal 0,1 a 50%, peptídeo representado por SEQ ID N°1 e/ou SEQ ID N°2 e/ou SEQ ID N° 3 de 0,01 a 80%, fenoxietanol 0,05% a 30%, Água deionizada.
5- Composição, de acordo com as reivindicações 2 e 3, caracterizada por compreender Cera Polawax (FO) 1 a 70%, TCM (FO) 0,5 a 50%, Glicerina Vegetal (FA) 0,5 a 50%, peptídeo representado por SEQ ID N°1 e/ou SEQ ID N°2 e/ou SEQ ID N° 3 0,01 a 80%, cafeína 0,1 a 40%, arnica 0,01 a 40%, Vitamina E (FO) 0,01 a 50%, EDTA 0,01 a 10%, Clorometilisotiazolinona/Metilsotiazolinona 0,01 a 50%, Fenoxietanol 0,1 a 40% e água deionizada (qsp 50g).
6- Composição, de acordo com as reivindicações 2 e 3, caracterizada por compreender Natrosol 0,1 a 50%, Pantenol 0,1 a 50%, peptídeo representado por SEQ ID N°1 e/ou SEQ ID N°2 e/ou SEQ ID N° 3 0,01 a 80%, glicerina vegetal 0,01 a 40%, Clorometilisotiazolinona/Metilisotiazolinona 0,01 a 40%, Fenoxietanol 0,01 a 40%, água deionizada.
7- Uso dos peptídeos funcionalizados, conforme descritos na reivindicação 1, caracterizado por ser na preparação de composições cicatrizantes e de regeneração tecidual.
8- Uso das composições, conforme descritas nas reivindicações de 2 a 6, caracterizado por ser na cicatrização e regeneração tecidual.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR102022019252A2 true BR102022019252A2 (pt) | 2024-04-09 |
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