BR102021024494A2 - DEVELOPMENT OF DUPLEX-QPCR FOR SIMULTANEOUS DETECTION OF XANTHOMONAS ALBILINEANS AND LEIFSONIA XYLI SUBSP. XYLI THAT ATTACK IN SUGARCANE - Google Patents
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Abstract
A presente invenção conjuga as funções de detectar simultaneamente ou separadamente a presença das bactérias Xanthomonas albilineans e/ou Leifsonia xyli subsp. xyli, e um controle endógeno por meio de PCR em tempo real (qPCR) pelo sistema TaqMan® (Xa-Lxx-qPCR). O produto gerado nessa invenção são dois pares de oligonucleotídeos para qPCR e duas sondas específicos para região única do DNA de duas distintas espécies de bactérias que causam as doenças conhecidas como Escaldadura das folhas e Raquitismo das soqueiras, respectivamente, na cultura da cana-de-açúcar. Para controle interno da reação foi desenhado mais um par de oligonucleotídeo e uma sonda especifica para anelar na enzima Rubisco presente abundantemente em qualquer tipo de material vegetal. Assim, a detecção ocorre por meio dos oligonucleotídeos e sondas específicas, que foram desenhadas especialmente para multiplexagem da PCR em tempo real, com intuito que não haja sobreposição e nem competição entre os alvos. A utilização dos produtos deste invento em laboratório de diagnóstico, proporcionará diagnósticos mais sensíveis e altamente específicos, melhorando a eficiência das técnicas já existentes e com a vantagem da redução de custo da reação de PCR em tempo real, já que a detecção acontecerá para dois alvos ao mesmo tempo, tornando o uso de qPCR mais rotineiramente factível a detecção em larga escala.The present invention combines the functions of simultaneously or separately detecting the presence of the bacteria Xanthomonas albilineans and/or Leifsonia xyli subsp. xyli, and an endogenous control through real-time PCR (qPCR) using the TaqMan® system (Xa-Lxx-qPCR). The product generated in this invention are two pairs of oligonucleotides for qPCR and two specific probes for a single region of the DNA of two different species of bacteria that cause the diseases known as leaf scald and stump rickets, respectively, in the culture of sugarcane. sugar. For internal control of the reaction, a pair of oligonucleotides and a specific probe were designed to ring the Rubisco enzyme, which is abundantly present in any type of plant material. Thus, detection occurs through oligonucleotides and specific probes, which were specially designed for real-time PCR multiplexing, with the intention that there is no overlapping or competition between the targets. The use of the products of this invention in the diagnostic laboratory will provide more sensitive and highly specific diagnoses, improving the efficiency of existing techniques and with the advantage of reducing the cost of the PCR reaction in real time, since the detection will take place for two targets at the same time, making the use of qPCR more routinely feasible for large-scale detection.
Description
[001] A invenção é um produto para uso na técnica de detecção de DNA em Biologia molecular, a PCR em tempo real (qPCR). Os DNAs alvos em questão, são de duas diferentes bactérias que causam doenças em plantas de cana-de-açúcar: Xanthomonas albilineans e Leifsonia xyli subsp. xyli. O produto gerado nesta invenção são dois pares de oligonucleotídeos para detecção das bactérias via qPCR, além de um terceiro par do controle endógeno da reação de qPCR. Cada par de oligonucleotídeo é inédito e específico para região única no DNA de cada um dos alvos. Portanto, o campo da invenção se enquadra na área de Fitopatologia (doenças de plantas) para uso rotineiro em laboratórios de análise de doenças de plantas na agricultura.[001] The invention is a product for use in the DNA detection technique in molecular biology, real-time PCR (qPCR). The target DNAs in question are from two different bacteria that cause diseases in sugarcane plants: Xanthomonas albilineans and Leifsonia xyli subsp. xyli. The product generated in this invention are two pairs of oligonucleotides for detection of bacteria via qPCR, in addition to a third pair of endogenous control of the qPCR reaction. Each pair of oligonucleotides is unique and specific to a unique region in the DNA of each of the targets. Therefore, the field of the invention falls within the field of Phytopathology (plant diseases) for routine use in laboratories for the analysis of plant diseases in agriculture.
[002] Os métodos para a detecção de Xanthomonas albilineans e Leifsonia xyli subsp. xyli já descritos fundamentam-se em ensaios de detecção de anticorpos e antígenos (ensaio de imunofluorescência, ensaio de imunoabsorção enzimática e Western blotting), isolamento em meio de cultura e ensaios moleculares baseados em Reação em Cadeia de Polimerase (PCR). Os ensaios de PCR em tempo real já descritos, são apresentados apenas para uma ou outra bactéria, nunca para as duas juntas em multiplexagem. Ensaios envolvendo anticorpos apresentam uma sensibilidade baixa que resulta em muitos resultados de falsos negativos. Isolamento em meio de cultura possui a desvantagem de ser um método demorado e não aplicável à bactéria Leifsonia xyli subsp. xyli por ser uma bactéria fastidiosa (necessita de meios extremamente ricos em nutrientes e com custo elevado).[002] Methods for the detection of Xanthomonas albilineans and Leifsonia xyli subsp. xyli already described are based on antibody and antigen detection assays (immunofluorescence assay, enzyme immunoabsorption assay and Western blotting), isolation in culture medium and molecular assays based on Polymerase Chain Reaction (PCR). The real-time PCR assays already described are presented only for one or the other bacteria, never for the two together in multiplexing. Assays involving antibodies have a low sensitivity that results in many false negative results. Isolation in culture medium has the disadvantage of being a time-consuming method and not applicable to the bacterium Leifsonia xyli subsp. xyli because it is a fastidious bacterium (it needs extremely nutrient-rich and expensive media).
[003] Os ensaios por PCR convencional são sensíveis e específicos para a detecção de X. albilineans e Leifsonia xyli subsp. xyli em amostras coletadas em campo apenas quando a planta está apresentando sintomas ou elevada concentração de bactérias nos tecidos vegetal. Assim uma das principais medidas de prevenção é a não introdução de mudas contaminadas em novos talhões de cultivo. Um diagnóstico sensível a pequenas concentrações destas bactérias em plantas assintomáticas conseguiria então promover essa prevenção evitando perdas devido a necessidade de adoção de medidas de erradicação e gastos com renovação precoce do canavial.[003] Conventional PCR assays are sensitive and specific for the detection of X. albilineans and Leifsonia xyli subsp. xyli in samples collected in the field only when the plant is showing symptoms or a high concentration of bacteria in plant tissues. Thus, one of the main preventive measures is not to introduce contaminated seedlings into new cultivation plots. A diagnosis sensitive to small concentrations of these bacteria in asymptomatic plants would then be able to promote this prevention, avoiding losses due to the need to adopt eradication measures and expenses with early renovation of the sugarcane field.
[004] E ainda, os ensaios de PCR convencional podem ser demorados e trabalhosos, particularmente ao testar separadamente a detecção de cada espécie bacteriana. O nosso ensaio utiliza Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real (qPCR) para detecção simultânea das duas espécies bacterianas, denominada de Lxx-Xa-duplexqPCR. A combinação de recursos multiplex com qPCR fornece um método de alto rendimento para a detecção de ambas as bactérias em um formato de ensaio de único. O invento desenvolve e a valida a técnica única de detecção de duas bacterioses simultaneamente (Lxx-Xa-duplex-qPCR) que é rápido e preciso para detecção de X. albilineans e L. xyli subsp. xyli em folhas de cana-de-açúcar.[004] Furthermore, conventional PCR assays can be time-consuming and labor-intensive, particularly when testing separately for detection of each bacterial species. Our assay uses Real Time Polymerase Chain Reaction (qPCR) for simultaneous detection of the two bacterial species, called Lxx-Xa-duplexqPCR. Combining multiplex capabilities with qPCR provides a high-throughput method for detecting both bacteria in a single-assay format. The invention develops and validates the unique technique for detecting two bacterial diseases simultaneously (Lxx-Xa-duplex-qPCR) which is fast and accurate for detection of X. albilineans and L. xyli subsp. xyli in sugarcane leaves.
[005] A presente invenção descreve uma solução diagnóstica rápida e de alta especificidade para detecção de Xanthomonas albilineans e Leifsonia xyli subsp. xyli, além de um controle endógeno (rubisco) da reação de PCR em tempo real, para diagnosticar as doenças Escaldadura-das-folhas e/ou Raquitismo-das-soqueiras, respectivamente, em plantas de cana-de-açúcar.[005] The present invention describes a fast and high specificity diagnostic solution for detection of Xanthomonas albilineans and Leifsonia xyli subsp. xyli, in addition to an endogenous control (rubisco) of the PCR reaction in real time, to diagnose the diseases Leaf scald and/or Stump rickets, respectively, in sugarcane plants.
[006] A tecnologia de qPCR é uma tecnologia de detecção de genes ultrassensível, na qual utilizamos de sua base para desenvolver (Lxx-Xa-duplex-qPCR) uma tecnologia funcional para detecção múltipla duas bacterioses e um alvo endógeno a partir de DNA total de cana-de-açúcar. Para tal, oligonucleotídeos e sondas, foram desenhados para permitir a detecção simultânea de X. albilineans e L. xyli subsp. xyli e do controle endógeno (Rubisco) dentro do sistema Taqman® para emissão de sinais fluorescentes em qPCR, para que não haja competição de sitio entre os alvos. Os primers foram escolhidos baseados nos genes de codificam para a toxina albicidina em X. albilineans e entre as regiões rRNA16S e rRNA23S de Leifsonia xyli subsp. xyli.[006] The qPCR technology is an ultrasensitive gene detection technology, in which we use its base to develop (Lxx-Xa-duplex-qPCR) a functional technology for multiple detection of two bacterial diseases and an endogenous target from total DNA of sugar cane. For this, oligonucleotides and probes were designed to allow the simultaneous detection of X. albilineans and L. xyli subsp. xyli and the endogenous control (Rubisco) inside the Taqman® system for the emission of fluorescent signals in qPCR, so that there is no site competition between the targets. The primers were chosen based on the genes coding for the albicidin toxin in X. albilineans and between the rRNA16S and rRNA23S regions of Leifsonia xyli subsp. xyli.
[007] Oligonucleotídeos específicos para amplificação do material genético. Os oligonucleotídeos desenvolvidos possuem sequências únicas do genoma de cada espécie como alvo de produto para amplificação. A tabela 1 abaixo apresenta os fitopatógenos alvos com seus respectivos oligonucleotídeos específicos. Vale ressaltar que a identificação de cada patógeno de dá por meio das sondas que emitem sinais fluorescentes em diferentes comprimentos de ondas para cada um dos alvos conforme especificado na tabela 1.
[008] As concentrações de seu uso também foram otimizadas para as reações de duplex qPCR e calibrada para: 20µL de volume final, 0,5 µL à 20mM de cada “foward” e “reverse” primers, 0,2 µL de cada sonda a 10mM e 10µL de TaqMan® Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems), seguindo os seguintes passos para ciclagem de tempo/temperatura em termociclador 7500 fast da marca Applied Biosystems para qPCR: pré-aquecimento de duas temperaturas: 50℃ por 2min, 95℃ por 10min, seguidos de 40 ciclos de dois passos: 95℃ por 15 segundos, anelamento e extensão com a mesma temperatura à 60℃ por 60 segundos.[008] The concentrations of its use were also optimized for duplex qPCR reactions and calibrated for: 20µL of final volume, 0.5 µL to 20mM of each “forward” and “reverse” primers, 0.2 µL of each probe to 10mM and 10µL of TaqMan® Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems), following the steps for time/temperature cycling in an Applied Biosystems 7500 fast thermocycler for qPCR: preheating at two temperatures: 50℃ for 2min, 95 ℃ for 10min, followed by 40 cycles of two steps: 95℃ for 15 seconds, annealing and extension at the same temperature at 60℃ for 60 seconds.
[009] Amostras de folhas de cana-de-açúcar de qualquer idade foram usadas para testar a detecção, e testes foram realizados tanto a partir de mudas quanto a partir de cana adulta, seguindo as seguintes etapas: amostragem de folhas, extração de DNA e calibração do material genético extraído total para 50ng/mL e reação de PCR em tempo real;[009] Samples of sugarcane leaves of any age were used to test the detection, and tests were performed both from seedlings and from adult cane, following the following steps: leaf sampling, DNA extraction and calibration of total extracted genetic material to 50ng/mL and real-time PCR reaction;
[010] Na etapa de amostragem e coleta, as folhas devem ser escolhidas aleatoriamente em qualquer parte da planta, arrancadas, ou se optar pelo corte, a tesoura deve ser desinfectada de uma amostra para outra, com amônia quaternária a 2%, as folhas coletadas devem ser embaladas em sacos plásticos, identificadas, colocadas sob temperaturas amenas ou em geladeira a 4º C. As amostras devem ser levadas ao laboratório em até 48hrs para processamento.[010] In the sampling and collection stage, the leaves must be randomly chosen from any part of the plant, plucked, or if you choose to cut, the scissors must be disinfected from one sample to another, with 2% quaternary ammonia, the leaves Samples collected must be packed in plastic bags, identified, placed under mild temperatures or in a refrigerator at 4º C. Samples must be taken to the laboratory within 48 hours for processing.
[011] A etapa de extração do material genético das bactérias pode ser feita a partir de qualquer protocolo já descrito na literatura ou com kits de extração de DNA para bactérias. O protocolo usado em todos os testes foi o de Doyle & Doyle, 1987.[011] The step of extracting the genetic material from bacteria can be done using any protocol already described in the literature or with DNA extraction kits for bacteria. The protocol used in all tests was that of Doyle & Doyle, 1987.
[012] A etapa de amplificação do material genético deve ser realizada seguindo padrão de calibração em que consta no item 008.[012] The genetic material amplification step must be performed following the calibration standard set out in item 008.
[013] Sensibilidade. Os testes já realizados com os conjuntos de oligonucleotídeos e sondas demonstraram que a sensibilidade da técnica apresentada no invento é 100x maior do que a técnica de PCR convencional e 1000x maior que técnicas de detecção sorológicas. Os ensaios de PCR em Tempo Real têm as vantagens de serem sensíveis, específicos e rápidos, principalmente quando comparados aos testes convencionais, levando de 2 a 3 horas para emitir o resultado e com a vantagem principal de não necessitar de uma etapa a mais (pós-PCR) para atingir o resultado como a corrida do gel de agarose na PCR convencional.[013] Sensitivity. Tests already carried out with sets of oligonucleotides and probes have shown that the sensitivity of the technique presented in the invention is 100x greater than the conventional PCR technique and 1000x greater than serological detection techniques. Real Time PCR assays have the advantages of being sensitive, specific and fast, especially when compared to conventional tests, taking 2 to 3 hours to issue the result and with the main advantage of not needing an extra step (post -PCR) to achieve the result like running the agarose gel in conventional PCR.
[014] Especificidade. Através de testes de qPCR in-silico utilizando a ferramenta disponível em http://insilico.ehu.es/user_seqs/ foi verificado que o produto gerado pela reação a partir do uso dos oligonucleotídeos correspondia às sequências específicas alvo. Além disso realizou o sequenciamento das amplificações dos oligonucleotídeos em PCR convencional, confirmando a especificidade dos primers na ferramenta Blast do NCBI.[014] Specificity. Through in-silico qPCR tests using the tool available at http://insilico.ehu.es/user_seqs/ it was verified that the product generated by the reaction from the use of oligonucleotides corresponded to the specific target sequences. In addition, he performed the sequencing of the oligonucleotide amplifications in conventional PCR, confirming the specificity of the primers in the NCBI Blast tool.
[015] Amplitude dos oligonucleotídeos para detecção de Xanthomonas albilineans. Como é comprovada uma alta variabilidade genética da bactéria Xanthomonas albilineans, a detecção dos oligonucleotídeos e sonda foram testadas contra isolados do mundo inteiro e verificamos a compatibilidade dos primers para todos eles.[015] Amplitude of oligonucleotides for detection of Xanthomonas albilineans. As a high genetic variability of the bacterium Xanthomonas albilineans is proven, the detection of the oligonucleotides and probe were tested against isolates from all over the world and we checked the compatibility of the primers for all of them.
[016] A curva padrão para amplificação dos alvos variou do CT13 para o CT30 antes e após estes valores a detecção deve ser melhor avaliada.[016] The standard curve for target amplification ranged from CT13 to CT30 before and after these values the detection should be better evaluated.
[017] As empresas do setor sucroalcooleiro necessitam saber se os campos de cultivos estão sadios principalmente quando precisam formar viveiros ou formar novos talhões comerciais de cana-de-açúcar. Há também empresas de produção de mudas de canade-açúcar, estas empresas precisam atestar e comprovar que estão vendendo mudas sadias. Portanto, a invenção é fundamental dentro deste processo. A invenção analisa a planta de cana-de-açúcar em qualquer idade que ela esteja, seja muda ou cana adulta, e atesta a sanidade da lavoura ou do lote de mudas, detectando ou não estas bacterioses em questão que poderiam estar prejudicando a produtividade do canavial, por meio de um processo tecnológico mais eficiente e econômico comparado aos protocolos já existentes.[017] Companies in the sugar and alcohol sector need to know if the fields of crops are healthy, especially when they need to form nurseries or form new commercial plots of sugarcane. There are also sugarcane seedling production companies, these companies need to attest and prove that they are selling healthy seedlings. Therefore, invention is fundamental within this process. The invention analyzes the sugarcane plant at whatever age it is, whether seedlings or adult sugarcane, and attests to the health of the crop or seedling lot, detecting or not these bacterial diseases in question that could be harming the productivity of the cane field, through a more efficient and economical technological process compared to existing protocols.
[018] A presente invenção pode ser aplicada: nas ações cotidianas de laboratórios de biologia molecular especializados em diagnosticar fitopatógenos de plantas; em estruturas ou órgãos governamentais responsáveis por prestarem auxílio a produtores rurais; em comércios especializado em venda de mudas certificadas e livres de patógenos. A associação de um método rápido e preciso como a multiplex PCR com a alta especificidade dos oligonucleotídeos desenvolvidos nessa invenção auxilia no correto diagnóstico do tipo da bactéria que está infectando o talhão, contribuindo no correto manejo da plantação, prevenção, controle e monitoramento da doença[018] The present invention can be applied: in the daily actions of molecular biology laboratories specialized in diagnosing plant phytopathogens; in government structures or bodies responsible for providing assistance to rural producers; in shops specializing in the sale of certified seedlings free of pathogens. The association of a fast and accurate method such as multiplex PCR with the high specificity of the oligonucleotides developed in this invention helps in the correct diagnosis of the type of bacteria that is infecting the plot, contributing to the correct management of the plantation, prevention, control and monitoring of the disease
Claims (5)
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| BR102021024494A2 true BR102021024494A2 (en) | 2023-06-20 |
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