BR102021018033A2 - Composição farmacêutica para tratamento de câncer e prevenção da mucosite contendo carreadores lipídicos nanoestruturados carregados com doxorrubicina, processo de obtenção e uso - Google Patents

Abstract

A presente tecnologia trata de uma composição farmacêutica compreendendo carreador lipídico nanoestruturado contendo doxorrubicina, seu processo de obtenção e seu uso para produzir medicamentos como estratégia para tratamento do câncer e prevenção da mucosite.

Description

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA TRATAMENTO DE CÂNCER E PREVENÇÃO DA MUCOSITE CONTENDO CARREADORES LIPÍDICOS NANOESTRUTURADOS CARREGADOS COM DOXORRUBICINA, PROCESSO DE OBTENÇÃO E USO

[01] A presente tecnologia trata de uma composição farmacêutica compreendendo carreador lipídico nanoestruturado contendo doxorrubicina, seu processo de obtenção e seu uso para produzir medicamentos como estratégia para tratamento do câncer e prevenção da mucosite.

[02] O tratamento quimioterápico gera efeitos tóxicos sobre as células tumorais, mas também afeta inúmeras células normais do organismo, especialmente aquelas que possuem alta taxa proliferativa, como as células da medula óssea e das mucosas em geral. Nesse contexto, a produção e circulação de células hematopoiéticas ficam reduzidas, resultando em aumento da incidência de infecções e hemorragias, que podem ser potencialmente fatais.

[03] Descrita como uma complicação frequente do tratamento antineoplásico, a mucosite oral e gastrointestinal ameaça a eficácia da terapia porque leva à redução de dose, aumenta os custos com a saúde e prejudica a qualidade de vida dos pacientes. Além disso, ao dificultar a deglutição, mastigação, fala e evacuação, causa dor considerável e dificulta a adesão ao tratamento. Casos mais graves de mucosite pode levar à hospitalização para permitir a alimentação enteral, o que aumenta ainda mais os custos hospitalares e dificulta o avanço do tratamento.

[04] Inicialmente a mucosite aparece como eritema e atrofia da mucosa, podendo progredir para ulcerações cobertas por uma pseudomembrana fibrinosa. Essas ulcerações podem se tornar secundariamente infectadas e levar a sangramento espontâneo.

[05] Dentre os quimioterápicos mais utilizados na clínica está a doxorrubicina (DOX), descoberta na década de 60. Classificada como um antibiótico da família das antraciclinas, foi desenvolvida a partir do preparado de Streptomyces peucetius var caesuis. É um fármaco muito indicado para o tratamento de leucemia, linfomas Hodgkin e non-Hodgkin, sarcomas, entre outros. Porém, apesar da eficácia nos tratamentos oncológicos, apresenta grande toxicidade, o que limita o seu uso.

[06] A toxicidade dos insumos farmacêuticos ativos (IFA) antineoplásicos está usualmente relacionada à não especificidade, fazendo com que atinjam células não-tumorais. Para aumentar a segurança na clínica é comum a utilização de ciclos periódicos, possibilitando que as células da medula óssea e da mucosa do trato gastrointestinal, por exemplo, possam se recuperar e renovar durante o intervalo dos ciclos. No entanto, evidências sugerem que ainda não há doses consideradas seguras para a DOX devido ao seu efeito cumulativo, que pode variar entre os tipos de câncer e gênero.

[07] A dose de DOX frequentemente recomendada para obtenção de uma eficácia tumoricida e toxicidade controlada é de aproximadamente 50 a 75 mg/m2 de superfície corpórea a cada 21 ou 28 dias. Entretanto, muitas vezes seu efeito é devastador, capaz de desencadear anorexia, vômitos, diarreia, sangramentos incomuns, náuseas, ulcerações na mucosa, entre outros sintomas que estão relacionadas à diminuição na qualidade e expectativa de vida dos pacientes durante o tratamento. Adicionalmente, apesar de ser utilizado há mais de 50 anos, seu mecanismo molecular ainda não está totalmente elucidado.

[08] Sistemas nanocarreadores de medicamentos têm recebido muita atenção nos últimos anos, especialmente para o tratamento do câncer. Além de melhorar a farmacocinética dos fármacos hidrofóbicos fracamente solúveis, solubilizando-os nos compartimentos hidrofóbicos, as nanopartículas permitiram a liberação específica de medicamentos antitumorais por fenômeno de direcionamento passivo para a área tumoral. Esta é uma razão que explica o fato das formulações nanoparticuladas serem capazes de melhorar a segurança, os perfis farmacocinéticos e a biodisponibilidade dos fármacos administrados, conduzindo a uma eficácia terapêutica melhorada em comparação com a terapia convencional.

[09] As nanopartículas lipídicas foram introduzidas nos primeiros anos da década de 1990, quando seus inventores publicaram as primeiras patentes e documentos. Elas podem ser definidas como partículas compostas de lipídios estabilizados por surfactantes. Essas nanopartículas lipídicas, de tamanho entre 40-50 e 1000 nm, permanecem sólidas na temperatura do corpo e na temperatura ambiente, funcionando como portadores coloidais de diferentes fármacos.

[010] As nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) são preparadas dispersando lipídios sólidos fundidos emulsionados e estabilizados em uma fase externa aquosa. Como nanocarreadores as NLS oferecem uma série de vantagens como: entrega controlada de medicamentos, baixa biotoxicidade, melhor biodisponibilidade de insumos farmacêuticos ativos (IFAs) pouco solúveis em água, melhor estabilidade e produção fácil e econômica em grande escala. Assim, desde o seu desenvolvimento, as NLS foram extensivamente avaliadas como sistemas de transporte para numerosos IFA antitumorais.

[011] O trabalho de Lages et al. (Eduardo Burgarelli Lages et al. (2020) Co-delivery of doxorubicin, docosahexaenoic acid, and α-tocopherol succinate by nanostructured lipid carriers has a synergistic effect to enhance antitumor activity and reduce toxicity. Biomed Pharmacother. 132:110876) trata de nanoestruturas contendo doxorrubicina e outros componentes, os quais apresentam efeito antitumoral. O artigo se difere do presente pedido por não descrever a prevenção da mucosite, além de não utilizar o ácido oleico como contra-íon para a formação do par iônico com a doxorrubicina.

[012] Em outro estudo, Zhang e colaboradores (Zhang J, Tang X, Huang C, Liu Z, Ye Y (2020). Oleic Acid Copolymer as A Novel Upconversion Nanomaterial to Make Doxorubicin-Loaded Nanomicelles with Dual Responsiveness to pH and NIR. Pharmaceutics, 12(7):680. doi: 10.3390/pharmaceutics12070680) descrevem a copolimerização do ácido oleico com o-nitrobenzil succinato (NBS) em polietilenoimina mPEGilada (mPEG-PEI) por reação de amidação e esse copolímero foi então conjugado com nanopartículas de NaYF4:Yb3+/Er3+ para conversão em nanomicelas que foram encapsuladas com doxorrubicina. Assim, a proposta de estabilização da doxorrubicina no sistema foi muito diferente da proposta da presente tecnologia, que trata de carreadores lipídicos nanoestruturados contendo doxorrubicina associada ao ácido oleico na forma de um par iônico. Ou seja, o desenho dessas duas formulações é bem diferente. A primeira utiliza polímeros associados ao ácido oleico formando nanomicelas, enquanto na nossa somente há constituintes lipídicos formando carreadores lipídicos nanoestruturados.

[013] No trabalho de Zhao et aí. (Shuangni Zhao, Le Van Minh, Na Li, Vasil M. Garamus, Ulrich A. Handge, Jianwen Liu, Rongguang Zhang, Regine Willumeit-Römer, Aihua Zou (2016). Doxorubicin hydrochloride-oleic acid conjugate loaded nanostructured lipid carriers for tumor specific drug release. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 145: 95-103. Doi: 10.1016/j.colsurfb.2016.04.027), o ácido oleico é utilizado como contra-íon para formação do par iônico com a doxorrubicina com o objetivo de aumentar a lipofilicidade do fármaco e a afinidade pela matriz lipídica. No entanto, a forma de obtenção do par iônico é diferente, resultando em uma capacidade de acomodação do fármaco (drug loading) 37,5% menor. Enquanto na formulação descrita na presente tecnologia é possível obter um drug loading de 55 mg/g (5,5%), sendo que no trabalho descrito o drug loading foi de 4%. Essa maior capacidade de carga pode impactar não somente na eficácia, como na segurança do sistema desenvolvido, o que pode justificar a inibição do processo de mucosite. A avaliação do processo de mucosite é um diferencial da presente tecnologia, visto que não há trabalhos descritos na literatura com carreadores lipídicos nanoestruturados contendo o par iônico ácido oleico-doxorrubicina. Importante ressaltar que a mucosite é provavelmente o efeito colateral doloroso mais comum da quimioterapia, afetando cerca de 40% de todos os pacientes com câncer e 90% dos pacientes com câncer de cabeça e pescoço. Pode levar a vários problemas, incluindo dores, problemas nutricionais, por causa da incapacidade de comer; aumento do risco de infecção, devido a feridas abertas na mucosa; e retardo no tratamento antineoplásico, resultando em redução da qualidade de vida, pior prognóstico e aumento dos custos de manejo do paciente.

[014] No estado da técnica não foi encontrada tecnologia similar à compreendida no presente documento, a qual trata da otimização da tecnologia de obtenção de um carreador lipídico nanoestruturado carregado com doxorrubicina utilizando a formação de par iônico entre a esta molécula e ácido oleico, aumentando a capacidade de carga e segurança do sistema. A principal vantagem da tecnologia pleiteada é a redução da toxicidade causada pela DOX no processo da mucosite. O carreador lipídico nanoestruturado contendo DOX (CLN-DOX) desenvolvido apresentou alta eficiência de encapsulação de DOX e baixo diâmetro médio de partículas. O CLN- DOX reduziu a perda de peso e melhorou os parâmetros de mucosite no que tange a arquitetura intestinal, como encurtamento da altura das vilosidades, profundidade da cripta e ulcerações quando comparado ao tratamento com solução de DOX livre. Além disso, o CLN- DOX preserva a permeabilidade intestinal e induz aumento da expressão de proteínas de junções firmes ZO-1 e Ocludina. A DOX livre é responsável pelos efeitos adversos drásticos sofridos pelos pacientes. No caso da formulação em nanocarreadores, onde a DOX é encapsulada na matriz lipídica, a mesma é liberada de forma controlada, sendo capaz de reduzir a toxicidade. A soma de todos estes fatores contribuiu muito para o aumento da segurança da formulação quando utilizada a tecnologia pleiteada. Dessa forma, a tecnologia tem potencial para minimizar o problema da mucosite promovida pela DOX convencional disponível atualmente no mercado.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[015] A Figura 1 é a representação gráfica das características de carreadores lipídicos nanoestruturados carregados com doxorrubicina (CLN-DOX). (A) Aspecto macroscópico da formulação CLN-DOX; (B) Avaliação do Potencial Zeta do CLN-DOX; (C) Distribuição de tamanho de partícula determinada por DLS; (D) Distribuição de tamanho de partícula determinada por NTA; (E) Avaliação morfológica por crio-microscopia eletrônica de transmissão; (F) Avaliação morfológica por microscopia eletrônica de transmissão. Abreviaturas: DOX: Doxorrubicina; CLN: carreadores lipídicos nanoestruturados; DLS: Espalhamento dinâmico de luz; NTA: análise de rastreamento de nanopartículas.

[016] A Figura 2 representa a caracterização do CLN e seus principais componentes. Curva de DSC da DOX pura, Compritol 888 ATO e CLN-DOX (A); Espectro de absorção FTIR para DOX (B), Compritol 888 ATO (C) e CLN-DOX (D). As setas representam os principais grupos funcionais das moléculas.

[017] A Figura 3 representa o perfil de liberação in vitro (saco de diálise) da DOX em carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN-DOX) e em solução de DOX livre (A). Aplicação do modelo cinético na liberação de DOX a partir da CLN-DOX (B). *p<0.0001. Os resultados são apresentados como média ± desvio padrão (n= 3).

[018] A Figura 4 é uma representação gráfica da perda de peso dos camundongos C57BL/6 no estudo da mucosite experimental. Randomização - Camundongos C57BL/6 foram alocados aleatoriamente em 3 grupos: Salina (controle), DOX livre e CLN-DOX (n=5/grupo). Projeto Experimental - Os animais foram submetidos ao protocolo experimental com uma duração total de 3 dias, onde no dia 0 os animais receberam por via i.p. DOX livre (10 mg/kg), CLN-DOX (10 mg/kg) ou 100 μL de solução salina, de acordo com o grupo alocado. A eutanásia ocorreu no terceiro dia. Variação do peso dos animais durante os 3 dias de acompanhamento. Os animais foram pesados diariamente, a primeira pesagem foi realizada no dia zero do protocolo e o peso médio por grupo analisado foi considerado para análise. A análise estatística foi realizada pelo teste ANOVA, seguido pelo pós-teste de Tukey. *p <0,05.

[019] A Figura 5 ilustra as imagens de Histologia do íleo. Cortes histológicos representativos dos grupos Salina, DOX e CLN-DOX. As lâminas histológicas foram coradas em hematoxilina e eosina, aumento de 20x. Nos cortes representados pelos grupos Salina e CLN-DOX (A, C) pode-se observar que a arquitetura das vilosidades intestinais se apresenta semelhante, íntegra, com monocamada epitelial organizada, presença de células caliciformes e camada muscular visível. Na imagem (B) que representa o grupo DOX observa-se a arquitetura das vilosidades diferenciada, com monocamada epitelial ‘em escova’, ausência de células caliciformes e afinamento da camada muscular - caracterizando a mucosite. Análise histomorfológica (D). Foi utilizado o software Image J® para quantificar o tamanho dos vilos, criptas e camada muscular. A análise estatística foi realizada pelo teste ANOVA, seguido pelo teste de Tukey, para comparação de todos os grupos entre si. Letras diferentes representam diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05).

[020] A Figura 6 demonstra os gráficos da avaliação da permeabilidade intestinal. A permeabilidade intestinal (A) foi determinada pela mensuração da radioatividade difundida no sangue dos camundongos após 4 horas da administração de ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA) com tecnécio 99m (99mTc). Expressão de Ocludina e ZO1. A expressão das tight junctions Ocludina e ZO-1 no íleo (B, C) foram feitas por qPCR. A análise estatística foi realizada pelo teste ANOVA, seguido pelo teste de Tukey, para comparação de todos os grupos entre si. Letras e símbolos diferentes representam diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05).

[021] A Figura 7 ilustra a representação gráfica da expressão de citocinas. O íleo dos camundongos dos grupos Salina, DOX e CLN-DOX foram retirados, pesados, homogeneizados em TRI reagente® (#T9424, Merck-Sigma) para retirada de mRNAs e convertidos em cDNA. As citocinas, IL-13 (A), IL-23 (B), IL-4 (C) IL-5 (D), IL-22 (E), IL- 25 (F), IL-33 (G), TSLP (H), foram quantificados por qPCR. A análise estatística foi realizada pelo teste ANOVA, seguido pelo teste de Tukey, para comparação de todos os grupos entre si. Letras diferentes representam diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA

[022] A presente tecnologia trata de uma composição farmacêutica compreendendo carreador lipídico nanoestruturado contendo doxorrubicina, seu processo de obtenção e seu uso para produzir medicamentos para tratamento do câncer e prevenção da mucosite.

[023] Mais especificamente, a composição farmacêutica é caracterizada por compreender:

• a) Doxorrubicina (0,05 a 0,15% p/V);
• b) Ácido oleico (0,1 a 0,3% p/V);
• c) Tensoativos (1,5 a 2,5% p/V);
• d) Lípides líquidos e sólidos (1 a 10% p/V, preferencialmente entre 1,5 a 2,5%, sendo, preferencialmente, 60% de lípides sólidos e 40% de lípides líquidos);
• e) Aminas, como trietanolamina (0,06 a 0,12% p/V).

[024] Os sistemas nanoestruturados contendo carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) apresentam tamanho inferior a 500 nm, variando de 10 a 100 nm nos CLN em questão. Os CLN podem conter concentração lipídica total de 1 a 10%, preferencialmente de 1 a 5%, sendo uma mistura de um material de natureza lipídica que seja um sólido à temperatura ambiente e um material de natureza lipídica que seja líquido à temperatura ambiente. A composição lipídica possui um total de 1,5 a 2,5% de lípides, incluindo a concentração de ácido oleico na mesma. A matriz lipídica dos CLNs constituir uma mistura de material de natureza lipídica que seja sólido a temperatura ambiente (trilaurina, tricaprina, tripalmitina, glicerídeos hidrogenados de coco, estearatos e palmitato de glicerila, ácido esteárico, decanóico e behênico, preferencialmente behenato de glicerila) e um material de natureza lipídica que seja líquido a temperatura ambiente (óleo de soja, de algodão, de sésamo, de milho, preferencialmente triglicerídeos de cadeia média - triglicerídeos dos ácidos cáprico e caprílico); preferencialmente, utiliza-se 60% de lípide sólido e 40% de lípide líquido.

[025] O processo para a obtenção da composição farmacêutica definida acima compreende as seguintes etapas:

• a. Aquecer a uma temperatura entre 80 °C e 85 °C a fase oleosa (FO) composta por ácido oleico (0,1 a 0,3% p/V), tensoativos (1,5 a 2,5% p/V) e lípides líquidos e sólidos (1,5 a 2,5% p/V), além de aminas, como trietanolamina (0,06 a 0,12% p/V) e agitar em agitador mecânico por 2 minutos;
• b. Separadamente, aquecer a uma temperatura entre 80 °C e 85 °C a fase aquosa (FA) constituída por água;
• c. Verter toda a FA pesada e aquecida conforme etapa “b” lentamente sobre toda a FO pesada e aquecida conforme etapa “b” e homogeneizar a emulsão formada por 10 minutos no ultrassom com sonda de alta potência (20 a 22% de amplitude) ou em um homogeneizador de alta pressão;
• d. Resfriar os CLN obtidos na etapa “c” sob agitação, para temperatura ambiente (20-25° C);
• e. Corrigir o pH da emulsão formada em “d” para 6,0 - 6,5 com ácido clorídrico (HCl) 0,1 M;
• f. Verter a emulsão formada em “e” em uma solução de DOX previamente preparada (0,05 a 0,15% de DOX solubilizada em um volume de água purificada que corresponde a 10 a 30% da FA total) sob agitação manual, magnética ou mecânica durante 25-30 minutos para que o par iônico DOX-ácido oleico seja formado e encapsulado nos carreadores lipídicos nanoestruturados.

[026] As etapas “a” a “f” levam à formação de par iônico através de reação química entre doxorrubicina e ácido oleico. Para essa etapa, a fase oleosa (FO) e a fase aquosa (FA) foram pesadas e aquecidas separadamente a 80 °C a 85 °C e levadas à agitação em um agitador mecânico, como Ultra Turrax, por 2 minutos. A FO é composta por ácido oleico (0,1 a 0,3% p/V), tensoativos (1,5 a 2,5% p/V) e lípides líquidos e sólidos (1,5 a 2,5% p/V), além de aminas, como trietanolamina (0,06 a 0,12% p/V). A FA é constituída por água purificada. A trietanolamina foi adicionada à FO para converter a DOX em base livre, para que a mesma possa interagir com o ácido oleico. Sendo assim, a FA foi vertida lentamente sobre a FO. A emulsão formada foi homogeneizada por 10 minutos no ultrassom com sonda de alta potência (20 a 21% de amplitude) e, finalizado esse tempo, os CLN foram resfriados sob agitação e o pH final corrigido para 6,0 a 6,5 com ácido clorídrico (HCl) 0,1 M. A emulsão formada foi então vertida no béquer contendo a solução de DOX (0,05 a 0,15% de DOX em 10 a 30% de água purificada da FA total), sob agitação manual, magnética ou mecânica, para a interação com o ácido oleico (AO), que reage com a carga positiva localizada no nitrogênio protonado da DOX, formando assim um par iônico.

[027] Na etapa “g” ocorre a incorporação do par iônico (ácido oleico e doxorrubicina) obtido em nanocarreadores lipídicos nanoestruturados. O AO, ao interagir com a carga positiva da DOX, forma um par iônico. Dessa forma, ao formar o par iônico, a DOX fica mais lipofílica e, com a agitação manual, magnética ou mecânica, consegue então interagir com a matriz lipídica, sendo carreada para a matriz lipídica dos CLNs.

[028] Na etapa de formação do par iônico, a fim de aumentar a lipofilicidade da doxorrubicina, que está na forma de cloridrato, a estratégia da formação do par iônico foi usada. A doxorrubicina na sua forma livre forma um par iônico com um ânion lipofílico, melhorando sua lipofilicidade e a afinidade pela matriz lipídica. Durante a produção do CLN, a carboxila do ácido oleico (AO), que tem carga negativa, reage com a carga eletrostática positiva localizada no nitrogênio protonado da doxorrubicina (pKa = 9,53), formando um par iônico, como foi descrito anteriormente.

[029] Na etapa de incorporação em CLN, com a formação do par iônico da doxorrubicina com o ácido oleico, há um aumento da cadeia carbônica, o que aumenta a lipofilicidade e, consequentemente, a maior afinidade do par iônico DOX-AO pela matriz lipídica dos CLN. Sendo assim, durante o preparo dos CLN, a DOX, ao interagir com o AO, consegue então ser carreada para o interior da matriz lipídica, sendo encapsulada, conforme descrito anteriormente.

[030] A composição farmacêutica da presente tecnologia pode ser utilizada para produzir medicamentos para o tratamento do câncer e a prevenção da mucosite.

[031] A presente tecnologia pode ser mais bem compreendida através dos exemplos que se seguem, não limitantes.

EXEMPLO 1. PREPARAÇÃO DOS CARREADORES LIPÍDICOS NANOESTRUTURADOS (CLN)

[032] Os CLN foram preparados pelo método de emulsificação -sonicação a quente, utilizando o agitador mecânico, como Ultra Turrax T-25 (Ika Labortechnik, Alemanha), e um equipamento capaz de produzir nanossistemas com baixo índice de dispersão, como uma sonda de ultrassom de alta potência (Ultra-cell 750 W; Sonics. Materials Inc., EUA). A fase oleosa (FO) e a fase aquosa (FA) foram pesadas e aquecidas separadamente a 80 °C a 85 °C. Imediatamente antes de iniciar a agitação (Ultra Turrax T- 25, 8.000 RPM) a trietanolamina (0,06% a 0,12% p\p) foi adicionada à FO com o objetivo de converter o cloridrato de doxorrubicina (DOX) em base livre. Na sequência, a FA foi vertida lentamente sobre a FO. Após 2 minutos de agitação no Ultra Turrax T-25, ou outro agitador mecânico adequado, a emulsão formada foi homogeneizada durante 10 minutos no ultrassom com sonda de alta potência (20 a 21% de amplitude), ou em um homogeneizador de alta pressão. Finalizado esse tempo, os CLN foram resfriados sob agitação e o pH final corrigido para a faixa de 6,0 a 6,5 com HCl 0,1 M. Em seguida, a emulsão formada foi vertida no béquer contendo a solução de DOX (0,05 a 0,15% de DOX em 10 a 30% de água purificada da FA total) sob agitação manual, magnética ou mecânica para a encapsulação do fármaco.

EXEMPLO 2. COMPOSIÇÃO DA FORMULAÇÃO DOS CARREADORES LIPÍDICOS NANOESTRUTURADOS (CLNS)

[033] As formulações foram preparadas de acordo com o método descrito no Exemplo 1, cuja composição é descrita na Tabela 1. Todas estas formulações foram caracterizadas quanto ao diâmetro médio, índice de polidispersão, potencial zeta, teor total e eficiência de encapsulação de DOX.

EXEMPLO 3. TAMANHO MÉDIO DE PARTÍCULA POR ESPALHAMENTO DINÂMICO DE LUZ (DLS) E POR RASTREAMENTO DE NANOPARTÍCULAS (NTA), POTÊNCIAL ZETA, CRIO-MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO (Cryo-MET) E MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO (MET)

[034] O diâmetro hidrodinâmico do CLN-DOX desenvolvido foi determinado por análise unimodal por espalhamento dinâmico de luz (DLS) e os dados relatados foram em média Z, avaliados como a intensidade. O diâmetro hidrodinâmico, o índice de polidispersão (PDI) e o potencial Zeta do CLN- DOX foram determinados por espalhamento dinâmico da luz e mobilidade eletroforética, usando um Zetasizer Nano-ZS90 (Malvern Instruments; Inglaterra) a um ângulo fixo de 90° e temperatura de 25 °C. Os CLN-DOX foram diluídos (1:100) em água Mili-Q previamente filtrada através de membrana de éster de celulose com 0,45 μm de diâmetro de poro (HAWPO4700, Millipore, EUA). Todas as medidas foram realizadas em triplicata. Como mostrado na Figura 1A, o CLN-DOX é uma suspensão vermelha clara e homogênea. O potencial Zeta, tamanho médio de partículas e índice de polidispersão por DLS foram, respectivamente, - 18,3 ± 5,1 mV, 69,7 ± 6,6 nm e 0,29 ± 0,07, conforme descrito nas Figuras 1B e C. Esse resultado sugere um sistema monodisperso, que é um aspecto importante a ser considerado para formulações parenterais (ANTON N, BENOIT J P, SAULNIER P. Design and production of nanoparticles formulated from nano-emulsion templates-a review. Journal of Controlled Release. 128(3): 185-199, 2008; ZHANG, J.; FAN, Y.; SMITH, E. Experimental design for the optimization of lipid nanoparticles. Journal of Pharmaceutical Sciences on ScienceDirect, 98(5): 1813-1819, 2009).

[035] Os experimentos de análise de tamanho por rastreamento de nanopartículas (NTA) foram realizados usando ο NanoSight NS300 (Malvern Instruments, Inglaterra), conforme Figura 1D. Após a diluição adequada dos CLN-DOX em água Mili-Q (Millipore, EUA), a amostra foi introduzida na câmara do equipamento através de uma seringa descartável. As amostras foram medidas em temperatura ambiente (25 °C) por 60 segundos com detecção automática. As partículas suspensas em um fluido foram irradiadas por um laser e a luz espalhada e as imagens foram capturadas por uma câmera acoplada ao equipamento. Foram realizadas cinco medições da amostra de CLN-DOX. O tamanho médio obtido na análise NTA foi ligeiramente menor (66 ± 18 nm), mas muito próximo do tamanho médio fornecido para o método DLS (69,7 ± 6,6 nm). O menor tamanho médio encontrado para o método NTA está de acordo com a literatura e corroborou a distribuição monodispersa (valores baixos de PDI) medida pelo DLS (Filipe, V.; Hawe, A.; Jiskoot, W. (2010). Criticai evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharm. Res., 27, 796-810, doi:10.1007/s11095-010-0073-2; Danaei, M.; Dehghankhold, M.; Ataei, S.; Hasanzadeh Davarani, F.; Javanmard, R.; Dokhani, A.; Khorasani, S.; Mozafar, M.R. (2018). Impact of Particle Size and Polydispersity Index on the Clinical Applications of Lipidic Nanocarrier Systems. Pharmaceutics, 10, 57, doi:10.3390/pharmaceutics10020057). Em relação às barras de erro da distribuição de tamanhos, elas são menores com o DLS, o que é consequência da grande quantidade de dados estatísticos coletados por esse método quando comparado ao NTA. No método NTA, as distribuições de tamanho são praticamente as mesmas, mas o software às vezes detecta um pouco mais ou um pouco menos de partículas entre cada medição da mesma amostra (Danaei, M.; Dehghankhold, M.; Ataei, S.; Hasanzadeh Davarani, F.; Javanmard, R.; Dokhani, A.; Khorasani, S.; Mozafar, M.R. (2018). Impact of Particle Size and Polydispersity Index on the Clinical Applications of Lipidic Nanocarrier Systems. Pharmaceutics, 10, 57, doi:10.3390/pharmaceutics10020057).

[036] Micrografias de Cryo-MET de CLN-DOX foram obtidas usando um um MET (Tecnai Spirit G2-12 Biotwin-FEI, City, CountryBrno, República Tcheca) operado a 120 kV (Figura 1E). As imagens foram gravadas no CCD Eagle (FEI), utilizando o software Serial EM. Antes do uso, as grades de cobre revestido com carbono de malha 300 (EMS) foram submetidas ao processo de descarga luminosa com gás argônio a uma corrente de 9,2 mA por 25 s. As amostras de Cryo-MET foram preparadas por congelamento por mergulho (Leica EM GP2). Para cada amostra, uma gota de 3 μL foi colocada no lado do carbono da grade, manchada por 5 s e imediatamente congelada em etano líquido, e então mantida em nitrogênio líquido até a crio-MET. As amostras foram montadas em Fischione cryo Holder (Modelo 2550) e analisadas no MET a -175 °C. As fotos foram processadas usando o software ImageJ (National Institutes of Health, Betesda, MD, EUA). As análises envolvendo crio-MET foram realizadas no Centro de Microscopia da UFMG (http://www.microscopia.ufmg.br). A morfologia dos CLN-DOX foi avaliada também por MET. Amostras coradas negativamente foram preparadas espalhando 3 μL da dispersão CLN-DOX (diluída 1:25) em uma grade de cobre revestida com um filme de carbono Lacey. Após 1 minuto de adsorção, o excesso de líquido foi removido com papel de filtro e as grades foram colocadas em uma gota de acetato de uranila aquoso a 2% (p / v) e drenado após 1 minuto. Os espécimes secos foram examinados usando um microscópio eletrônico de 120 kV (Tecnai-G2-Spirit-FEI / microscópio Quanta; Philips, Eindhoven, Holanda). As análises envolvendo MET foram realizadas no Centro de Microscopia da UFMG (http://www.microscopia.ufmg.br). As imagens obtidas por MET (76,7 ± 30 nm) e Crio-MET (78,8 ± 28 nm) mostraram partículas homogêneas com formato esférico e distribuição normal (teste de Shapiro-Wilk) em um nível de confiança de 95%.

EXEMPLO 4. CALORIMETRIA EXPLORATÓRIA DIFERENCIAL (DSC)

[037] As análises da calorimetria exploratória diferencial foram realizadas utilizando um Calorímetro Exploratório Diferencial DSC 2910 (TA Instruments, EUA). Para as medições de DSC, utilizou-se uma taxa de aquecimento de 10 °C/min a uma temperatura entre 0 °C e 400 °C, sob atmosfera de nitrogênio. O liofilizado dos CLN foi obtido utilizando um liofilizador (Modulyod-115, ThermoFisher, Asheville, USA, bomba Edwards E2M18, West Sussex, UK). As amostras foram liofilizadas durante 24 horas a uma temperatura de -45 °C. Após a liofilização, as amostras foram colocadas diretamente em panelas de alumínio para análise (aproximadamente 7 mg de lipídios).

[038] Nas curvas DSC mostradas na Figura 2A é possível observar o termograma da formulação CLN-DOX previamente liofilizada e os principais componentes separados, sendo DOX pura e Compritol 888 ATO. A alta eficiência de encapsulação e capacidade de carga de DOX na matriz lipídica de CLN pode ser o resultado de intensas interações entre os componentes da formulação. Na análise de DSC, o termograma da DOX apresentou três picos de fusão endotêrmicos (206,8, 218,4 e 237,3 °C). No entanto, nenhum pico de DOX foi observado no termograma CLN-DOX, sugerindo uma alta interação de fármaco com a matriz lipídica dos CLN. Essa alta afinidade pela matriz lipídica dos CLNs pode ser resultado da formação do par iônico entre DOX e ácido oleico (AO).

[039] A formação de um par iônico entre DOX e OA foi avaliada por diferentes autores como estratégia para melhorar a eficiência de encapsulação de DOX em nanopartículas lipídicas sem limitar sua eficácia (LI X, JIA X, NIU H (2018). Nanostructured lipid carriers co-delivering lapachone and doxorubicin for overcoming multidrug resistance in breast cancer therapy. International Journal of Nanomedicine, 13:4107-4119. Doi:10.2147/IJN.S163929; MUSSI, S V, SAWANT, R, PERCHE, F. et al. (2014). Novel Nanostructured Lipid Carrier Co-Loaded with Doxorubicin and Docosahexaenoic Acid Demonstrates Enhanced in Vitro Activity and Overcomes Drug Resistance in MCF-7/Adr Cells. Pharmaceutical Research, 31 (8): 1882-1892. Doi:10.1007/s11095-013-1290-2; OLIVEIRA, M S; MUSSI, S V; GOMES, D A; et al. (2016). α-Tocopherol Succinate Improves Encapsulation and Anticancer Activity of Doxorubicin Loaded in Solid Lipid Nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces on ScienceDirect, 1(140): 246-253. Doi: 10.1016/j.colsurfb.2015.12.019).

[040] Outro resultado importante a ser observado no termograma DSC do CLN-DOX é o pico endotérmico característico do Compritol 888 ATO, o principal componente da matriz lipídica do CLN-DOX. O pico endotérmico do Compritol 888 ATO permanece presente no termograma DSC do CLN-DOX, fornecendo e evidenciando que a matriz lipídica do CLN-DOX permanece sólida à temperatura ambiente. No entanto, este pico endotérmico é mais amplo e tem uma temperatura de fusão mais baixa (63,85 °C) quando comparado ao Compritol 888 ATO puro (69,79 °C). O pico mais amplo e a redução da temperatura de fusão da matriz lipídica sólida são evidências das interações dos componentes das formulações e dos lipídeos líquidos, resultando em um arranjo de rede menos ordenado da matriz sólida (JENNING V, MÄDER K, GOHLA S H (2000). Solid lipid nanoparticles (SLN) based on binary mixtures of liquid and solid lipids: a (1)H-NMR study. International Journal of Pharmaceutics, 205(1-2): 15-21. Doi: 10.1016/S0378-5173(00)00462-2; CASTELLI F, PUGLIA C, SARPIETRO M G, et al. (2005). Characterization of indomethacin-loaded lipid nanoparticles by differential scanning calorimetry. International Journal of Pharmaceutics, 304(1-2):231-238. Doi:10.1016/j.ijpharm.2005.08.011).

[041] O ponto de fusão reduzido observado para a matriz lipídica sólida também pode ser devido ao tamanho nanométrico do CLN-DOX (69,7 ± 7,4 nm), resultando em uma área de superfície elevada (SAKAI, H (1996). Surface-induced melting of small particles. Surface Science, 351(1-3), 285-291. Doi: 10.1016/0039-6028(95)01263-x; ANTONIAMMAL, P, & ARIVUOLI, D (2012). Size and Shape Dependence on Melting Temperature of Gallium Nitride Nanoparticles. Journal of Nanomaterials; Article ID 415797, 11 pages. Doi: 10.1155/2012/415797).

EXEMPLO 5. ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO COM TRANSFORMADA DE FOURIER (FTIR)

[042] A FTIR do CLN-DOX e seus componentes foram registrados em um espectrômetro Perkin Elmer FTIR, Model Spectrum One. Os espectros FTIR de DOX, CLN-DOX e Compritol 888 ATO fora apresentados na Figura 2B-D. O espectro do DOX (Figura 2B) mostra as bandas características do fármaco: bandas de 3525 e 3315 cm-1, atribuídas às vibrações de alongamento do grupo O-H e N-H; e uma banda de 1730 cm-1, devido ao alongamento de C = O. Além disso, existem bandas entre 1750-1540 cm-1, que se referem ao grupo funcional carbonil (C = O). Os espectros de FTIR para o Compritol 888 ATO (Figura 2C) mostraram picos característicos em 2915 cm-1 (alongamento de CH), 1737 cm-1 (alongamento de C = O) e 1465 cm-1 (flexão de CH). No espectro de CLN-DOX (Figura 2D) também é possível observar a banda do grupo N-H a 3315 cm-1, que pode ser atribuída à molécula de DOX; e duas bandas largas em 2915 e 2849 cm-1, que podem ser atribuídas à vibração de alongamento dos grupos C-H e C-H2 do Compritol 888 ATO. Quando comparamos os espectros FTIR de DOX, CLN-DOX e Compritol 888 ATO, observa-se que o CLN-DOX apresenta as bandas características de DOX, mas em menor intensidade de sinal. As bandas referentes ao Compritol 888 ATO também são visualizadas no CLN-DOX, sugerindo uma possível interação entre os componentes da formulação. Os resultados do FTIR corroboram os dados obtidos nas análises DSC. O espectro nos CLN-DOX mostrou bandas características do Compritol 888 ATO ® e algumas bandas do DOX, mas em menor extensão. Existem pequenas diferenças nas regiões de absorção, sugerindo uma maior afinidade entre DOX e matriz lipídica.

EXEMPLO 6. EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO DA DOX E CAPACIDADE DE CARGA

[043] A quantificação da DOX foi realizada por Espectrofotometria UV-VIS (UV-Vis Evolution 201, ThermoFisher, China), utilizando comprimento de onda λ = 480 nm. Para determinar a eficiência de encapsulação (EE) e a capacidade de carga (CC) da DOX nos CLNs foi utilizado o método de ultrafiltração descrito abaixo, sendo a EE (%) e a CC (mg/g) calculadas pelas seguintes fórmulas:
EE%=CT -CAP/CTx100
CC(mg/g)= MFN/MN

[044] A Onde: CT = concentração total de DOX nas formulações e CAP= concentração de DOX na fase aquosa (fármaco não encapsulado). MFN= massa de DOX em mg de DOX carregada nas nanopartículas e MN= massa em g de nanopartículas (lipídeos).

[045] A concentração da DOX solúvel foi avaliada após a ultrafiltração realizada com o sistema Amicon® 100 k (Milipore, USA) submetido à centrifugação (Heraus Multifuge XIR, Thermo Scientific, EUA) a 2400g por 10 minutos. Uma alíquota do ultrafiltrado foi transferida para um balão volumétrico de 10,0 mL e foram adicionados THF/MeOH 40:60 v/v, sendo a concentração de DOX solúvel analisada por espectrofotometria no UV-Vis (λ = 480 nm). Para a análise do teor total de DOX uma alíquota de CLN foi transferida para um balão volumétrico de 10 mL. Em seguida, adicionou-se 4 mL de THF para solubilização. Após homogeneização, o volume foi completado com MeOH e a dispersão centrifugada (Heraus Multifuge X1R, Thermo Scientific, EUA) a 2400g por 10 minutos para precipitação da massa lipídica. Em seguida, o sobrenadante foi analisado no UV-VIS (λ = 480 nm). O conteúdo total de DOX no CLN-DOX desenvolvido foi de 99,8 ± 1,5%, com uma eficiência de encapsulação alta (84,8 ± 4,6%). Além disso, a capacidade de carga foi elevada (55,2 ± 3,4 mg/g).

EXEMPLO 7. ESTUDOS DE LIBERAÇÃO IN VITRO

[046] A liberação de DOX do CLN-DOX foi realizada pelo método de diálise (Figura 3A). Sacos de diálise com tamanho de cut-off de 14.000 Da e diâmetro de 21 mm (membrana de éster de celulose; Sigma- Aldrich, St. Louis, EUA) foram preenchidos com 2 mL de CLN-DOX, selados e incubados com 50 mL de tampão fosfato (PBS) pH 7,4, durante 72 h a 37 °C, usando agitação com aquecimento (controle IKA® KS 4000 i; Werke, Alemanha) a 120 rpm. Uma solução aquosa de DOX na mesma concentração (1,5 mg/mL) foi usada como controle (DOX livre). Em diferentes intervalos de tempo predeterminados (1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h e 72 h), 2 mL do meio de liberação foram retirados e reabastecidos com um volume igual de PBS. Os valores foram plotados como uma porcentagem cumulativa de liberação de DOX.
DOX liberado (%) = RF / CD × 100

[047] Onde: RF = fração liberada de DOX para o meio externo e CD = concentração inicial de DOX dentro do saco de diálise.

[048] O perfil de liberação do fármaco foi plotado e a análise de regressão da liberação cumulativa da DOX no CLN-DOX foi avaliada. Diferentes modelos cinéticos foram avaliados (Figura 3B): ordem zero (Qt = Q0 + K0t), primeira ordem (In Qt = In Q0 +K1t), Higuchi (Qt = Kht1/2) e Korsmeyer-Peppas (Qt/Q∞ = Kktn); onde Qt é a quantidade de medicamento liberado no tempo t; Q0 é a quantidade do medicamento na solução no tempo zero e K é constante na cinética de liberação. O coeficiente de determinação (R2) foi utilizado como critério para definir o melhor modelo de cinética de liberação. O estudo de liberação do DOX também reflete a alta eficiência de encapsulação e as interações entre os componentes da formulação, observadas nos estudos de DSC e FTIR. O CLN-DOX apresentou uma liberação controlada e sustentada de DOX durante as 72 horas do estudo. Enquanto a solução DOX livre liberou aproximadamente 80% da DOX nas primeiras 4 horas, o CLN-DOX, no mesmo período, liberou menos de 20%. A avaliação da cinética de liberação in vitro de CLN-DOX seguiu o modelo cinético de ordem zero (R2 = 0,9862). Um modelo cinético de ordem zero também foi descrito para outros autores usando CLNs para carregar diferentes modelos de medicamentos (Rahman H S, Rasedee A, How C W, et ai. (2013). Zerumbone-loaded nanostructured lipid carriers: preparation, characterization, and antileukemic effect. International Journal of Nanomedicine. 8:2769-2781; Brito R A J, S, Chandrasekhar, K B & Reddy, K.B (2019). Formulation, in-vitro and in-vivo pharmacokinetic evaluation of simvastatin nanostructured lipid carrier loaded transdermal drug delivery system. Future Journal Pharmaceutical Sciences). No entanto, nenhum deles descreveu o desenvolvimento de um CLN-DOX com liberação controlada e sustentada, obedecendo a um modelo de ordem zero. O modelo de ordem zero descreve uma liberação constante de cargas úteis, ideal para alcançar a ação farmacológica desejada com efeitos colaterais reduzidos (COSTA & LOBO, 2001).

EXEMPLO 8. O TRATAMENTO COM CLN-DOX PREVINE A PERDA DE PESO EM CAMUNDONGOS C57BL/6

[049] Para comparar a evolução da imunopatologia da mucosite foi desenvolvido um protocolo com sacrifício no terceiro dia após tratamento (Protocolo n° 331/2012). Camundongos C57BL/6 fêmeas (6-8 semanas) foram divididas aleatoriamente em 3 grupos e inoculados i.p. com DOX (10mg/Kg), CLN-DOX (10mg/Kg) ou solução salina para o grupo controle. A mucosite severa é acompanhada, dentre os vários sintomas já descritos, de perda de peso. A fim de acompanharmos a evolução clínica da mucosite, após a inoculação das formulações de DOX (DOX livre e CLN-DOX) os camundongos foram pesados diariamente (Figura 4). Animais tratados com ambas as formulações de DOX tiveram perda de peso nas primeiras 24 horas, porém com maior avidez na formulação convencional. Entretanto, no terceiro dia de mucosite os animais tratados com CLN-DOX apresentaram recuperação no peso. Não foi observado sangue visível nas fezes ou diarreia em nenhum dos grupos.

EXEMPLO 9. A FORMULAÇÃO DE CLN-DOX PRESERVA ARQUITETURA DO INTESTINO, PREVINE ULCERAÇÕES COMPATÍVEIS COM MUCOSITE E AUMENTO DA PERMEABILIDADE INTESTINAL

[050] As análises histológicas (Figura 5) mostraram no grupo CLN-DOX ausência de áreas ulceradas e melhor preservação da integridade das vilosidades em comparação ao grupo DOX livre. Tal achado pode estar associado ã diminuição da toxicidade da formulação CLN-DOX quando comparada a DOX convencional. A Figura 5A ilustra a arquitetura da mucosa dos camundongos do grupo controle (salina). Observamos que a arquitetura da mucosa se encontra intacta. A monocamada de células epiteliais está preservada - sem ulcerações, bem como altura de vilo e profundidade de cripta. Abaixo da camada epitelial observamos a lâmina própria - GALT. Na porção mais externa do íleo encontra-se a camada muscular que envolve o intestino (Figura 5 A, B e C). Foi observada à histopatologia que o tratamento com DOX causa lesões multifocais com perda da camada epitelial, apresentando áreas de destruição de vilosidades e ulcerações (Figuras 5 B e D). Pode-se observar ainda que nos camundongos que receberam a formulação CLN-DOX (Figuras 5 C e D) a arquitetura da mucosa está preservada, com alto índice de células caliciformes e manutenção da camada muscular, sendo comparável ao grupo controle salina (Figuras 5 A e D).

EXEMPLO 10. PERMEABiLiDADE iNTESTiNAL E EXPRESSÃO DE OCLUDiNA E ZO1.

[051] A preservação da barreira intestinal está diretamente associada á permeabilidade e translocação bacteriana. Para averiguar quais os efeitos da administração da solução de DOX e CLN-DOX neste parâmetro, administramos ο complexo DTPA - 99mTc por gavagem e, após quatro horas, o sangue foi coletado a fim de determinar a radioatividade presente no mesmo. A permeabilidade intestinal dos animais que receberam a solução de DOX aumentou, enquanto nos animais tratados com CLN-DOX foi mantido o nível de permeabilidade igual ao grupo controle (salina), demonstrando que não há alteração deste parâmetro (Figura 6). Para entender melhor o perfil da permeabilidade intestinal, foi realizado qPCR para as duas principais proteínas de junções firmes (tight junctions) que atuam como proteínas associadas ã membrana responsáveis pela manutenção de junções de contato célula-célula: Ocludina (Figura 6B) e ZO1 (Figura 6C). Observamos que a expressão de ZO1 no grupo DOX, apesar do estímulo lesivo, é mantida igual ao grupo controle (salina), enquanto a expressão de Ocludina manteve-se intermediária no terceiro dia de mucosite. Por outro lado, observamos que os camundongos tratados com CLN-DOX apresentaram aumento de expressão tanto de ZO1 quanto de Ocludina, indicando uma resposta adequada da fisiologia intestinal para manter sua integridade diante do estímulo lesivo ao epitélio intestinal, i.e. DOX. Esses resultados corroboram aos resultados obtidos através da análise histopatologica, evidenciando a integridade epitelial da mucosa dos animais tratados com CLN-DOX, o que não acontece na formulação convencional (solução de DOX). Ainda que possa haver alguma lesão epitelial causada pelo fármaco a formulação de CLN-DOX apresentou toxicidade inferior ao grupo tratado com DOX convencional, com permeabilidade semelhante ao grupo controle (salina). Esse resultado é, sem dúvidas, um grande avanço, visto que a lesão epitelial causada pela formulação convencional provavelmente desencadeia a mucosite.

EXEMPLO 11. AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE CITOCINAS

[052] A expressão de citocinas (inflamatórias e homeostáticas) associadas à mucosite no íleo de camundongos também foi avaliada (Figura 7). Analisamos citocinas associadas à resposta pró- inflamatória tipo 2 (IL-4, IL-5, IL-13, IL-25, IL-33 e TSLP) e as citocinas envolvidas na regeneração tecidual e homeostase intestinal (IL-9 e Anfiregulina) (+, P, Henao-Mejia, J, Temann, A U, et al. (2013). Th9 Cells Drive Host Immunity against Gastrointestinal Worm Infection. Immunity, 39(4), 744-757; Turner J E, Morrison P J, Wilhelm C, et al. (2013). IL-9-mediated survival of type 2 innate lymphoid cells promotes damage control in helminth-induced lung inflammation. Journal of Experimental Medicine, 210(13):2951-2965; Wynn, T. (2015). Type 2 cytokines: mechanisms and therapeutic strategies. Nature Reviews Immunology, 15, p. 271-282).

[053] Surpreendentemente, nos animais tratados com a solução de DOX livre, foi observada inibição da expressão de IL-4, IL-13, TSLP e IL-9 em comparação ao grupo solução salina (p < 0,05). Esses resultados estão provavelmente associados ao grau intenso de dano tecidual local (Sonis, S T, Elting L S, Keefe D, et al. (2004). Perspectives on cancer therapy-induced mucosal injury: pathogenesis, measurement, epidemiology, and consequences for patients. Cancer, 100:1995-2025). Nos animais tratados com CLN-DOX, exceto para IL-25, onde foi observada maior expressão, ο mesmo padrão de expressão de citocinas foi observado em comparação ao grupo solução salina (p > 0,05). Este resultado está de acordo com os resultados da morfologia. Como o tratamento com CLN-DOX limitou o processo de mucosite, o padrão de expressão das citocinas foi mantido. Por fim, embora não tenha sido observada diferença entre o grupo DOX e o grupo CLN-DOX para IL-9, uma maior expressão de Anfirregulina foi observada para o grupo CLN-DOX (p < 0,05), apresentando maior capacidade de melhorar a regeneração tecidual, mesmo com um dano ao tecido inferior.

[054] No epitélio intestinal, citocinas como IL-9 e anfirregulina estão envolvidas com a regeneração de tecidos (Chen F, Liu Z, Wu W, et al. (2012). An essential role for TH2-type responses in limiting acute tissue damage during experimental helminth infection. Nature Medicine, 18:260266; Erpenbeck V J, Hohlfeld J M, Volkmann B, et al. (2003). Segmental allergen challenge in patients with atopic asthma leads to increased IL-9 expression in bronchoalveolar lavage fluid lymphocytes. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 111:1319- 1327; Turner J E, Morrison P J, Wilhelm C, et al. (2013). IL-9-mediated survival of type 2 innate lymphoid cells promotes damage control in helminth-induced lung inflammation. Journal of Experimental Medicine, 210:2951-2965; Yuan A, Yang H, Qi H, et al. (2015). IL-9 antibody injection suppresses the inflammation in colitis mice. Biochemical and Biophysical Research Communications, 468:921926; Zhang H W, Dang Q, Zhang Z W, et al. (2017). Development, characterization and evaluation of doxorubicin nanostructured lipid carriers for prostate cancer. Journal of the Balkan Union of Oncology, 22:102-111).

[055] Portanto, o encapsulamento de DOX em CLN pode não só ser capaz de melhorar a eficácia, conforme demonstrado em diferentes estudos (Mussi, S V, Sawant, R, Perche, F. et al. (2014). Novel Nanostructured Lipid Carrier Co-Loaded with Doxorubicin and Docosahexaenoic Acid Demonstrates Enhanced in Vitro Activity and Overcomes Drug Resistance in MCF-7/Adr Cells. Pharmaceutical Research, 31:1882-1892; Fernandes R S, Silva J O, Mussi S V, et a.l (2018). Nanostructured Lipid Carrier Coloaded with Doxorubicin and Docosahexaenoic Acid as a Theranostic Agent: Evaluation of Biodistribution and Antitumor Activity in Experimental Model. Molecular Imaging and Biology, 20:437-447), mas também reduzir a mucosite, que é um importante adverso efeito do tratamento DOX.

Claims (7)

1. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA TRATAMENTO DE CÂNCER E PREVENÇÃO DA MUCOSITE, caracterizada por compreender:

   • a) Doxorrubicina (0,05 a 0,15% p/V);
   • b) Ácido oleico (0,1 a 0,3% p/V);
   • c) Tensoativos (1,5 a 2,5% p/V);
   • d) Lípides líquidos e sólidos (1 a 10% p/V);
   • e) Aminas, como trietanolamina (0,06 a 0,12% p/V).
2. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA TRATAMENTO DE CÂNCER E PREVENÇÃO DA MUCOSITE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelos lípides líquidos e sólidos estarem na concentração de 1,5 a 2,5% p/V, sendo 60% de lípides sólidos e 40% de lípides líquidos.
3. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA TRATAMENTO DE CÂNCER E PREVENÇÃO DA MUCOSITE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender sistemas nanoestruturados contendo carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) com tamanho inferior a 500 nm, variando de 10 a 100 nm nos CLN em questão.
4. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA TRATAMENTO DE CÂNCER E PREVENÇÃO DA MUCOSITE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelos carreadores lipídicos nanoestruturados conterem concentração lipídica total de 1 a 10%, sendo uma mistura de um material de natureza lipídica que seja um sólido à temperatura ambiente, selecionado do grupo compreendendo trilaurina, tricaprina, tripalmitina, glicerídeos hidrogenados de coco, estearatos e palmitato de glicerila, ácido esteárico, decanóico e behênico, behenato de glicerila e um material de natureza lipídica que seja líquido à temperatura ambiente, selecionado do grupo compreendendo óleo de soja, de algodão, de sésamo, de milho, triglicerídeos de cadeia média, triglicerídeos dos ácidos cáprico e caprílico.
5. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA TRATAMENTO DE CÂNCER E PREVENÇÃO DA MUCOSITE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela composição lipídica possuir um total de 1,5 a 2,5% de lípides, incluindo a concentração de ácido oleico na mesma.
6. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA definida na reivindicação 1, caracterizado por compreender as seguintes etapas:

   • a. Aquecer a uma temperatura entre 80 °C e 85 °C a fase oleosa (FO) composta por ácido oleico (0,1 a 0,3% p/V), tensoativos (1,5 a 2,5% p/V) e lípides líquidos e sólidos (1,5 a 2,5% p/V), além de aminas, como trietanolamina (0,06 a 0,12% p/V) e agitar em agitador mecânico por 2 minutos;
   • b. Separadamente, aquecer a uma temperatura entre 80 °C e 85 °C a fase aquosa (FA) constituída por água;
   • c. Verter toda a FA pesada e aquecida conforme etapa “b” lentamente sobre toda a FO pesada e aquecida conforme etapa “b” e homogeneizar a emulsão formada por 10 minutos no ultrassom com sonda de alta potência (20 a 22% de amplitude) ou em um homogeneizador de alta pressão;
   • d. Resfriar os CLN obtidos na etapa “c” sob agitação, para temperatura ambiente (20-25° C);
   • e. Corrigir o pH da emulsão formada em “d” para 6,0 - 6,5 com ácido clorídrico (HCl) 0,1 M;
   • f. Verter a emulsão formada em “e” em uma solução de DOX previamente preparada (0,05 a 0,15% de DOX solubilizada em um volume de água purificada que corresponde a 10 a 30% da FA total) sob agitação manual, magnética ou mecânica durante 25-30 minutos.
7. USO da composição farmacêutica definida na reivindicação 1, caracterizado por ser para preparar medicamentos para o tratamento do câncer e para a prevenção da mucosite.

Images